WO2004096195A2 - Utilisation d’agonistes de ppar-gamma comme agents anti-infectieux - Google Patents

Utilisation d’agonistes de ppar-gamma comme agents anti-infectieux Download PDF

Info

Publication number
WO2004096195A2
WO2004096195A2 PCT/FR2004/001018 FR2004001018W WO2004096195A2 WO 2004096195 A2 WO2004096195 A2 WO 2004096195A2 FR 2004001018 W FR2004001018 W FR 2004001018W WO 2004096195 A2 WO2004096195 A2 WO 2004096195A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
macrophages
pparγ
ligands
expression
agonist
Prior art date
Application number
PCT/FR2004/001018
Other languages
English (en)
Other versions
WO2004096195A3 (fr
WO2004096195A8 (fr
Inventor
Agnès COSTE
Bernard Pipy
Original Assignee
Universite Paul Sabatier Toulouse Iii
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Paul Sabatier Toulouse Iii filed Critical Universite Paul Sabatier Toulouse Iii
Priority to DE602004028116T priority Critical patent/DE602004028116D1/de
Priority to EP04742585A priority patent/EP1628646B1/fr
Publication of WO2004096195A2 publication Critical patent/WO2004096195A2/fr
Publication of WO2004096195A3 publication Critical patent/WO2004096195A3/fr
Publication of WO2004096195A8 publication Critical patent/WO2004096195A8/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/192—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having aromatic groups, e.g. sulindac, 2-aryl-propionic acids, ethacrynic acid 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a method for manufacturing a therapeutic composition, stimulating the innate immune response by induction and / or amplification of the expression of mannose receptors of macrophages.
  • the invention is advantageously part of the preventive or curative treatment of infectious diseases of bacterial, fungal, protozoan origin ... and is of particular interest in the medication of immunocompromised subjects.
  • the innate immune response essential in the body's defense mechanisms against infectious agents, is an early immune reaction that starts at the first moments of infection. Macrophages participate in this innate immune response by recognizing, phagocytosing and destroying the infectious agent.
  • the recognition phase consists of the identification of superficial biochemical structures characteristic of pathogens and involves a number of receptors on the surface of macrophages.
  • the mannose receptor (we also speak of a mannose receptor) allows the recognition, but also the fixation and phagocytosis, of a wide variety of pathogens, in particular pathogens of bacterial, fungal and protozoan origin. , which have on the outer face of their walls glycoproteins, polysaccharides and / or lipopolysaccharides having at their free ends mannosylated and / or fucosylated units. For simplification purposes, in the rest of the text, these pathogens will be designated by "pathogens with mannosylated and / or fucosylated motifs".
  • MMR macrophage mannose receptor
  • the main objective of the invention is to provide compounds capable of inducing and / or amplifying the expression of MMR.
  • biological medium means a medium of biological composition, that is to say comprising living matter, in particular monocellular and / or multicellular organisms.
  • a biological medium can be artificial (for example, a culture medium), or natural (for example, a living tissue, a blood composition, isolated or not from a multicellular organism -in particular a-primate-).
  • macrophage denotes any cell, essentially of tissue localization, resulting from the differentiation of monocytes (macrophages as such, dendritic cells, phagocytic neutrophil cells) as well as monocytes.
  • Macrophage in the sense of the invention thus generally designates any cell capable of expressing MMR and having the capacity to phagocyte.
  • the invention also aims to propose new perspectives in the therapeutic treatment of infectious diseases - in particular opportunistic diseases -, in particular in the context of the medication of immunocompromised subjects.
  • the invention therefore relates, firstly, to a method of stimulating the expression of mannose receptors of macrophages in which, an effective amount of at least one agonist ligand of PPAR ⁇ is treated, a biological, extracorporeal or intracorporeal medium , including macrophages.
  • effective amount means an amount capable of inducing and / or amplifying the expression of the mannose receptors of at least part of the macrophages of the target biological medium.
  • the invention is thus based on the surprising and hitherto unsuspected observation that the activation of the nuclear receptor PPAR ⁇ leads to gene induction and protein expression of MMR.
  • PPAR ⁇ receptors for peroxisome proliferators
  • PPAR ⁇ is implicated in adipogenesis phenomena, cell differentiation and regulation of certain anti-inflammatory reactions.
  • PPAR ⁇ has also been detected in macrophages.
  • At least one of the agonist ligands of PPAR ⁇ used to induce and / or amplify the expression of MMR according to the invention is chosen from the group of natural ligands: 15d-PGJ 2 , prostaglandins A1 and D2, acids 9- and 13-hydoxyoctadecanoic, LDL derivatives
  • 15d-PGJ 2 (15-deoxy- ⁇ 12 '14 - prostaglandin J 2 ), a metabolite of prostaglandin D2 (PGD2), is known to be one of the most powerful agonist ligands of PPAR ⁇ .
  • At least one of the agonist ligands of PPAR ⁇ from the group of synthetic ligands: troglitazone (Resulin®), rosiglitazone (Avandia®), pioglitazone (Actos®), ciglitazone, englitazone, GW 347845, KRP-297, JTT-501B, SB 213068, GI 262570, GW 1929, GW 7845, GW 0207, L-796449, indomethacin, ibuprofen.
  • troglitazone Resulin®
  • rosiglitazone Avandia®
  • pioglitazone Actos®
  • ciglitazone englitazone
  • GW 347845 KRP-297
  • JTT-501B SB 213068
  • GI 262570 GI 262570
  • GW 1929, GW 7845, GW 0207, L-796449 indome
  • Troglitazone, rosiglitazone, pioglitazone, ciglitazone, englitazone, GW 347845 belong to the family of thiazolidinediones and are commonly used in the medical field as lipid-lowering drugs for the treatment of certain diabetes.
  • indomethacin and ibuprofen are commonly used as non-steroidal anti-inflammatory drugs for the treatment of certain inflammatory diseases, such as atherosclerosis and osteoarthritis.
  • WO 03/059271 teaches the use of agonist compounds of PPAR ⁇ to treat or prevent inflammations, cancers, cardiovascular diseases ...
  • WO 03/059271 does not deal with MMR and as regards methods and the therapeutic compositions described, they are only envisaged as remedies for the symptoms of certain inflammations. There is neither described nor suggested any biological effect of the agonist ligands of PPAR ⁇ on the causes of these inflammations, in particular on possible infectious agents capable of generating some of these inflammatory reactions.
  • Candida albicans C. albicans
  • the inventors were able to determine that, beyond a simple modulation of the expression of MMR, the treatment of macrophages with an agonist ligand of PPAR ⁇ leads to a remarkable stimulation of the ability of macrophages to recognize and eliminate the pathogen, not only by phagocytosis, but also by an increased production of oxidizing agents.
  • the inventors have thus managed to demonstrate that the induction of the mannose receptor by the agonist ligands of PPAR ⁇ allows the elimination of a fungal infection of the gastrointestinal tract by C. albicans. This elimination takes place in the absence of antibodies or an adaptive immune response.
  • the anti-infectious effect of agonist ligands of PPAR ⁇ is the consequence, on the one hand, of the increase in phagocytosis of C. albicans mediated by the mannose receptor and, on the other hand, of the death of C. albicans caused by reactive oxygen intermediates (IROs).
  • IROs reactive oxygen intermediates
  • These are secreted by macrophages at during yeast phagocytosis.
  • SOD superoxide dismutase
  • the production of reactive oxygen species by macrophages is suppressed by the antisense of the messenger RNA coding for MMR (Coste A. et al, Immunity, 2003, 19: 329-339).
  • This capacity which the agonist ligands of PPAR ⁇ have to stimulate the expression of the mannose receptors and therefore, on the one hand, to reinforce the vigilance of the macrophages with regard to infectious microorganisms with mannosylated and / or fucosylated motifs and, on the other hand, to trigger the ⁇ effector functions of macrophages, when these are in the presence of this type of pathogen, can be advantageously used for the medication of subjects with immune deficiencies, innate or acquired.
  • induction and / or the amplification of the expression MMR would make it possible to effectively compensate for the insufficiency of their immune system, by improving not only the vigilance of the innate immune system with regard to numerous infectious microorganisms, but also by stimulating and amplifying the functions effectors of macrophages in order to obtain an effective immune response, of the Th2 type.
  • the induction and / or amplification of the expression of MMRs will make it possible to redirect the immune defense towards a Th2 type response to compensate for a possibly defective Th1 type response.
  • infectious agents targeted by the invention include: Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, pseudomonas aeruginosas, Legionella pneumophilla.
  • the stimulation of the immune system of an individual - in particular, an immunocompromised individual -, by amplification of the expression of MMR can be carried out by administering to the latter an effective amount of at least one agonist ligand of PPAR ⁇ , capable of inducing a distribution of ligand (s) in the target biological medium, at an effective concentration, that is to say capable of inducing and / or amplifying the expression of MMRs of at least part of the macrophages present in this medium - for example, a tissue or a composition of peripheral blood -.
  • This concentration is, in general, at least equivalent to 1 ⁇ C50 of the ligand (s) used (s).
  • the biological medium containing macrophages according to the invention corresponds, in this particular case, to a natural intracorporeal medium. Table 1 below presents the EC50 values for certain synthetic agonist ligands of PPAR ⁇ .
  • administration can be by oral, rectal, or parenteral (subcutaneous, transdermal, intravenous, intramuscular) route.
  • parenteral subcutaneous, transdermal, intravenous, intramuscular
  • the distribution of the active compound can flow to the target via the peripheral blood system, or reach it by topical administration (administration of the compound directly in contact with the cell site to be treated).
  • topical administration administration of the compound directly in contact with the cell site to be treated.
  • the dosage form and the doses to be administered will be chosen accordingly.
  • rosiglitazone may be prescribed at doses daily of the order of 4 to 8 mg for an adult weighing 70 kg.
  • rosiglitazone may be prescribed at doses daily of the order of 4 to 8 mg for an adult weighing 70 kg.
  • the biological medium comprising macrophages to be stimulated can be also extracorporeal.
  • the macrophages are then prepared from a blood sample from a patient, then are treated with an effective amount of at least one agonist ligand of PPAR ⁇ , before being reinjected into this same patient.
  • the macrophages can also come from a donor immunocompatible with the recipient patient.
  • the latter is affected by immune deficiencies, in particular a deficit in mature macrophages.
  • the invention extends to a method of treatment of a living tissue or a composition of peripheral blood, not isolated, of a living primate -in particular man-, in which is administered into a tissue or a peripheral blood composition of said primate, an effective amount of at least one agonist ligand of PPAR ⁇ , adapted to induce a distribution of ligand (s) in said tissue or said composition peripheral blood, at a therapeutically effective concentration, that is to say capable of inducing and / or amplifying the expression of the MMRs of the macrophages present in said tissue or said peripheral blood composition.
  • the invention relates to a process for the elimination, intracorporeal or extracorporeal, of microorganisms of bacterial, fungal or protozoan origin, having, on the external face of their walls, polysaccharides and / or lipopolysaccharides with mannosylated and / or fucosylated free ends.
  • an effective amount of at least one agonist ligand of PPAR ⁇ as an induction and / or amplification factor of the expression of mannose receptors of macrophages.
  • said microorganisms are chosen from: Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, pseudomon.
  • At least one of the agonist ligands of PPAR ⁇ is chosen from the group of natural ligands: 15d-PGJ 2 , prostaglandins Al and D2, 9- and 13-hydoxyoctadecanoic acids, derivatives of oxidized LDL .
  • This ligand can also be chosen from the group of synthetic ligands: troglitazone, rosiglitazone, pioglitazone, ciglitazone, englitazone, GW 347845, KRP-297, JTT-501 ⁇ , SB 213068, GI 262570 , GW 1929, GW 7845, GW 0207, L-796449, indomethacin and ibuprofen.
  • the use of a PPAR ⁇ agonist ligand to eliminate an infectious microorganism via stimulated macrophages may interest an infected artificial medium, for example a culture medium, or an infected natural medium, for example a living tissue or peripheral blood, isolated or not from a multicellular organism -in particular a primate, in particular living-.
  • the invention therefore also extends to a method of manufacturing a therapeutic composition comprising at least one ligand PPAR ⁇ agonist as active compound capable of inducing and / or amplifying the expression of mannose receptors of macrophages.
  • a therapeutic composition in particular an immunostimulatory composition - intended for the preventive or curative treatment of a pathology belonging to the group of pathologies induced by microorganisms, of bacterial origin. , fungal or protozoan which have mannosylated and / or fucosylated motifs on the outside of their walls, with the exception of Mycobacterium avium.
  • a therapeutically effective amount of at least one agonist ligand of the nuclear receptor PPAR ⁇ is used as an induction and / or amplification factor for the expression of MMRs.
  • these are microorganisms chosen from: Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Ciyptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, Pseudomonon.
  • PPAR ⁇ chosen from the group of natural ligands: 15d-PGJ 2 , prostaglandins Al and D2, 9- and 13-hydoxyoctadecanoic acids, derivatives of oxidized LDL.
  • this ligand can also be chosen from the group of synthetic ligands: troglitazone, rosiglitazone, pioglitazone, ciglitazone, englitazone, GW 347845, KRP- 297, JTT-501 ⁇ , SB 213068, GI 262570, GW 1929, GW 7845, GW 0207, L-796449, indomethacin and ibuprofen.
  • a therapeutic composition prepared in accordance with a method according to the invention is thus suitable for inducing and / or amplifying the expression of MMR. Also, it can be considered as an immunostimulatory composition, capable of improving the level of alertness of the system. immune to many infectious microorganisms, to stimulate the innate immune response and to amplify the effector functions of macrophages when the latter are placed in the presence of these microorganisms. Also, advantageously and according to the invention, it is intended for the medication of immunocompromised subjects.
  • a therapeutic composition obtained by a manufacturing process in accordance with the invention can also comprise one or more other active ingredients, in particular for providing a synergistic effect.
  • a PPAR ⁇ agonist ligand in addition to a PPAR ⁇ agonist ligand, it can advantageously contain a quantity of wall extract of a microorganism against which it is sought to defend itself.
  • the dosage form of a therapeutic composition in accordance with the invention is chosen according to the route of administration and can be produced by traditional techniques.
  • the invention also extends to a curative treatment of pathologies liable to be induced by microorganisms, of bacterial, fungal or protozoan origin, with mannosylated and / or fucosylated motifs.
  • microorganisms such as: Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, Pseudomonion aeruginosas.
  • the invention is intended for persons likely to be exposed to these infectious agents, or who have been infected by them. It is intended, in particular and preferably, for patients suffering from immune deficiencies, innate or acquired, and who are therefore particularly sensitive to so-called opportunistic diseases; diseases which are mainly caused by fungal pathogens (for example, candidiasis), which are known to have a large number of mannosylated and / or fucosylated patterns on their surface.
  • fungal pathogens for example, candidiasis
  • the elimination of the pathogen essentially involves recognition of the pathogen mediated by the mannose receptors of macrophages whose expression has been induced and / or amplified by a ligand agonist of PPAR ⁇ , natural or synthetic.
  • a ligand agonist of PPAR ⁇ natural or synthetic.
  • the patient is treated by administering an effective and suitable amount of at least one agonist ligand of PPAR ⁇ .
  • This amount is, in general, at least equivalent to 1 ⁇ C50 of the ligand (s) used (s).
  • a therapeutic composition is used, the manufacturing process of which has been presented above.
  • the patient is transferred to the macrophages having been previously isolated from an intracorporeal medium, for example from a blood sample from this same patient or from a donor immunocompatible with this one ; these macrophages are then treated with PPAR ⁇ agonists in an extracorporeal culture medium, before being reinjected into said patient.
  • an intracorporeal medium for example from a blood sample from this same patient or from a donor immunocompatible with this one ; these macrophages are then treated with PPAR ⁇ agonists in an extracorporeal culture medium, before being reinjected into said patient.
  • the invention also relates to a method of stimulating macrophages, a method of eliminating pathogens with mannosylated and / or fucosylated motifs, a method of manufacturing a therapeutic composition, characterized, in combination, by all or some of the characteristics below. above or below.
  • FIG. 1 is a graphic representation of the inhibitory effect of ligands agonists of PPAR ⁇ on the proliferation of C. albicans
  • FIG. 2 is a graphic representation of the capacity of macrophages to phagocyte C. albicans depending on whether PPAR ⁇ is or is not inhibited
  • - Figure 3 shows fluorescence distribution spectra reflecting the induction of the mannose receptor by various agonist ligands of PPAR ⁇ ,
  • FIG. 4 shows fluorescence distribution spectra reflecting the involvement of PPAR ⁇ in regulating the expression of MMR
  • FIG. 5 is a graphic representation of the involvement of PPAR ⁇ in the regulation of the expression of MMR
  • FIG. 6 is a graphic representation of the amplification effect of various PPAR ⁇ agonist ligands on the expression of MMR
  • FIG. 7 is a graphic representation of the in vivo effect of 15d-PGJ 2 on the ability of macrophages to produce oxidizing agents
  • FIG. 8 is a graphic representation of the level of expression of MMR in SWTSS and RAG-2 mice infected with C. albicans,
  • FIG. 9 is a graphic representation of the effect of the ligands agonists of PPAR ⁇ on the expression of MMR of homozygous (+ / +) and heterozygous (- / -) mice for the PPAR ⁇ gene,
  • FIG. 10 is a graphic representation of the in vivo effect of agonist ligands of PPAR ⁇ on the proliferation of C. albicans, in the gastrointestinal tract by C. albicans. • IN VITRO EXPERIMENTATIONS
  • the work carried out in vitro has made it possible to demonstrate a stimulation of the anti-infectious properties of macrophages vis-à-vis various microorganisms having on their surface mannosylated patterns - notably C. albicans-, via the increase in l phagocytic activity of macrophages and their ability to produce oxidizing agents.
  • C. albicans strains were isolated from blood samples from a patient with candidiasis, using standard techniques.
  • Macrophages for their part, come either from the peritoneum of SWISS female mice (Center d'Elevage, Etableau Janvier, France), or from the peripheral blood of healthy donors. These macrophages, mouse or human, are cultivated in an SFM culture medium ("serum-free medium") optimized for the culture of macrophages, marketed by the company GibcoBRL, France. The adhesion of the cells occurs after approximately 2 hours of culture at 37 ° C. under an atmosphere at 5% CO 2 . The cells which do not adhere to the culture dish are eliminated by rinsing with PBS (GibcoBRL, France). _
  • the adherent cells remaining on the dishes are stimulated by 15d-PGJ 2 , ciglitazone or rosiglitazone (MERCK-LIP ⁇ A, France) at different concentrations.
  • 15d-PGJ 2 ciglitazone or rosiglitazone
  • MERSHAM PHARMACIA BIOTECH France
  • the pellet is washed with PBS.
  • the radioactivity incorporated into the yeast RNA is counted with the BCS scintillation fluid (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, France).
  • the monolayers containing adherent or phagocytated yeasts are washed twice with PBS, then lysed with NaOH (IM) and neutralized with HCl (IM).
  • IM NaOH
  • IM neutralized with HCl
  • the scintillation liquid is then added to each flask and the radioactivity is counted using a Pharmacia LKB1217 counter. The number of decays by minute (dpm) allows to assess the level of proliferation of C. albicans for each of the trials.
  • yeasts previously labeled with [HJuracile are used. Three colonies of C. albicans are dispersed in 1 ml of Sabouraud broth containing 150 ⁇ Ci of [ 3 HJuracile. After 24 hours of culture at 37 ° C. with stirring, the labeled blastospores are centrifuged and resuspended in the SFM enriched with 1.8% glucose. For each test, the macrophage monolayers cultured on the 24-well plates are treated with PPAR ⁇ agonists for 20 hours, then infected with labeled and viable C.
  • albicans in a macropliage / yeast proportion of 1: 1) and left to incubate for 1 hour at 37 ° C, then 2 hours at 5 ° C. Submitted at 5 ° C, the phagocytosis mechanisms are blocked.
  • the culture medium is removed, the macrophage monolayers are rinsed twice with PBS. The rinsing solutions are kept. The monolayers are lysed with NaOH (IM) and then neutralized with HCl (IM).
  • the radioactivity of the supernatant and that of the rinsing solutions, as well as the radioactivity contained in the cell lysate are counted separately with the scintillation fluid BCS by means of a liquid scintillation counter.
  • the phagocytosis index is evaluated as follows:
  • the macrophages are rinsed with ice-cold PBS.
  • the labeling of the MMRs is carried out for one hour, in ice, in the manner of a specific ligand conjugated with mannosylated bovine albumin marked with fluorescein FITC (840 nM) (SIGMA, France).
  • fluorescein FITC 840 nM
  • staining with propidium iodide is carried out. All analyzes are performed by FACScalibur (Becton-Dickinson) using CellQuest software.
  • RNA sample is isolated from cells using reagent "Extract AU" (EUROBIO, France). The RNAs are reverse transcribed using the "First-Strand DNA Synthesis” kit (PROMEGA, France), during 30 amplification cycles (30 sec. At 95 ° C, 1 min at 48 ° C and 1 min at 68 ° VS). The primers sequences (sense MMR and antisense MMR) used to obtain the MMR cDNA are presented in Table 2.
  • the macrophages of the murine cell line RAW 267.4 are maintained in the exponential growth phase in DMEM supplemented with 10% PBS.
  • the day before transfection the cells are transferred to 6-well plates.
  • the medium is then replaced by DMEM devoid of serum and the cells are transiently transfected for 18 hours at 60-80% confluence with the transfection reagent FuGENE 6 (ROCHE, Switzerland) containing the vector to be transfected (CMV-luciferase or CMV-PPAR ⁇ ), in DNA / FuGENE 6 proportion of 1: 2, with a quantity of DNA of 3 ⁇ g.
  • the medium On the day of stimulation, the medium is replaced by the complete medium (DMEM + FBS 10%) containing the different molecules to be tested. The cells are collected 24 hours later and then analyzed by flow cytometry. The transfection of the CMV-luciferase vector (PROMEGA, France) serves as a control.
  • the sequence pCMX-mPPAR ⁇ (Forman B.M. et al, Cell, 1995, 83: 803-812) codes for the murine PPAR ⁇ nuclear receptor.
  • the medium is replaced by SFM containing the ODN antisense but without Lipofectin.
  • the cultures are incubated for 3 days with a daily change of the medium.
  • the concentration of the ODN antisense used does not cause any significant toxicity on the macrophages.
  • Untreated macrophages and macrophages treated with Lipofectin alone serve as controls.
  • the nucleic acid sequence of the ODN antisense is set out in table 2.
  • the same treatment is carried out with a non-specific antisense of the MMR mRNA, the ANS antisense whose nucleic sequence is set out in table 2.
  • the oxygen-dependent respiratory explosion of the macrophages treated by the PPAR ⁇ agonists is measured by chemiluminescence.
  • the macrophages (2.10 5 ) are transferred to culture dishes 5 mm in diameter.
  • the production of oxidizing agents by the macrophages is measured by chemiluminescence in the presence of luminol at 37 ° C.
  • the chemiluminescence emission is recorded continuously for 1 hour after incubation of the cells with luminol (66 ⁇ M).
  • the chemiluminescence is measured in the presence of SOD, a specific inhibitor of the production of superoxide anion.
  • SOD nitric oxide
  • chemiluminescence is measured in the presence of L-NMMA (NG-monomethyl-arginine, a specific competitor of L-arginine for the production of NO). None of the inhibitors affect viability at the concentrations used.
  • Statistical analyzes are based on the measurement of the area under the curve and are expressed in strokes x seconds.
  • Test 1 Stimulation of the candistatic activity of murine peritoneal macrophages by the specific ligands of PPAR ⁇ .
  • FIG. 1 shows the inhibition of proliferation (in%) of C. albicans in the presence of macrophages not treated (C) or treated (T) with 15d-PGJ 2 , ciglitazone (Cigli), and rosiglitazone (Rosi ).
  • Figure 1 shows that macrophages develop their own fungistatic activity, inhibiting the growth of C. albicans by 18%.
  • the macrophages In the presence of agonist ligands of PPAR ⁇ in the medium, the macrophages have a higher candistatic activity.
  • the inhibition of proliferation is multiplied approximately by three (compared to the control) when the macrophages are treated with different drugs.
  • PPAR ⁇ agonist ligands stimulate the candistatic activity of macrophages.
  • Trial 2 Increase in phagocytosis of C. albicans and in the production of oxidizing agents by ligands specific for PPAR ⁇ .
  • the defense mechanisms against C. albicans are essentially dependent on the capacity of macrophages to phagocyte yeasts and to exercise their fungicidal activity by producing toxic molecules (IROs and NO), the modulation of the phagocytosis of this yeast as well as the production oxidizing agents of macrophages treated with specific ligands of PPAR ⁇ , in the absence or presence of GW 9662 (CAYMAN CHEMICAL, Michigan, USA), an irreversible antagonist of PPAR ⁇ , were studied.
  • IROs and NO toxic molecules
  • Figure 2 shows the phagocytosis capacity (expressed as a phagocytosis index) of peritoneal macrophages not treated (C) or treated with specific ligands of PPAR ⁇ (15d-PGJ 2 , ciglitazone and rosiglitazone) in the absence or presence of GW 9662 , faced with a one hour challenge with C. albicans under the conditions of a macrophage / yeast ratio of 1: 1.
  • FIG. 2 shows that there is a significant increase in the number of phagocytic yeasts when the macrophages are treated with the agonist ligands of PPAR ⁇ .
  • the number of yeasts internalized by macrophages is increased by 19% by treatment with 15d-PGJ 2 , by 13% with ciglitazone (Cigli), 10% with rosiglitazone (Rosi), compared to untreated macrophages (C) which have a phagocytosis index of 46%.
  • the chemiluminescence was measured - in the presence or not of SOD (enzyme metabolizing O 2 ⁇ into H 2 0 2 ) while the production of nitrogen monoxide is evaluated in the presence of an arginine competitor which is L-NMMA.
  • Table 3 Effect of PPAR ⁇ agonist ligands on the production of oxidizing agents by macrophages in the presence or absence of yeast. The evaluation of the production of oxidizing agents was determined on macrophages in culture by the chemiluminescence technique.
  • Table 3 shows that the macrophages, put in the presence of the different treatments, produce the same basal amount of oxidizing agents as the resident macrophages.
  • the specific ligands of PPAR ⁇ alone do not induce an increase in the production of oxidizing agents by macrophages.
  • PPAR ⁇ agonist ligands pre-activate the ability of macrophages to produce oxidizing agents.
  • macrophages in this activated state mainly produce superoxide anion.
  • SOD a specific inhibitor of production of superoxides
  • the production of oxidizing agents is significantly inhibited.
  • the chemiluminescence measured in the presence of L-NMMA is not inhibited.
  • macrophages in this activation state do not produce nitric oxide.
  • Test 3 Induction of the expression of mannose receptors by specific ligands of PPAR ⁇ .
  • the macrophages were cultured for 24 hours in the presence of 1 ⁇ M of 15d-PGJ 2 , 5 ⁇ M of ciglitazone or 5 ⁇ M of rosiglitazone.
  • the cells are then incubated in FITC-labeled mBSA and analyzed by flow cytometry. The distribution of the fluorescence of the cell population analyzed is shown in Figure 3.
  • FIG. 3 shows that the quantity of mannosylated bovine albumin labeled with fluorescein present on the macrophages is significantly increased when the cells are treated (T) with specific ligands of PPAR ⁇ in comparison with the untreated cells (C).
  • T the cells are treated
  • C the untreated cells
  • the specificity of mBSA for the mannose receptor suggests that the specific ligands of PPAR ⁇ induce the expression of mannose receptors on the surface of macrophages.
  • Test 4 Direct involvement of PPAR ⁇ in the regulation of the expression of mannose receptors by specific ligands of PPAR ⁇ .
  • RAW 264.7 cells were then cultured for 24 hours in the presence of 1 ⁇ M of 15d-PGJ 2 , 5 ⁇ M of ciglitazone or 5 ⁇ M of rosiglitazone.
  • the cells are incubated with FITC-labeled mBSA and analyzed by flow cytometry.
  • the distribution of the fluorescence of the cell population analyzed is shown in Figure 4 and the geometric mean of the corresponding fluorescence intensities, reported in Table 4 below.
  • Table 4 In a second step, the induction of the expression of the mannose receptor of murine peritoneal macrophages under the effect of the various treatments was studied by flow cytometry in the presence of an irreversible PPAR ⁇ antagonist, GW 9662.
  • FIG. 4 shows that in RAW cells 264.7 control
  • C cells transfected with CMV-luciferase, treatment with PPAR ⁇ ligands has no effect on the expression of mannose receptors. Furthermore, the transfection of RAW 264.7 cells with the vector CMV-PPAR ⁇ restores the effect of the various treatments on the induction of the expression of mannose receptors. This demonstrates that PPAR ⁇ is directly involved in the regulation of the expression of the mannose receptor by specific ligands for PPAR ⁇ .
  • FIG. 5 shows that the increase in the expression of the mannose receptor on the surface of the macrophages under the effect of 15d-PGJ 2 is antagonized by GW 9662.
  • the macrophages have were cultured 24 hours in the presence or absence of GW 9962 (0.1 ⁇ M), then incubated with mBSA labeled with FITC and analyzed by flow cytometry.
  • Test 5 The induction of the expression of the mannose receptor on the surface of macrophages under the effect of different PPAR ⁇ agonists is dependent on transcriptional regulation.
  • a first approach consisted in transfecting a specific antisense of the mannose receptor mRNA into macrophages and the mannose receptors present on the surface of the cells were quantified by flow cytometry.
  • another technique was used and consisted in directly quantifying the expression of the mRNAs of the mannose receptor, under the effect of the various treatments, by quantitative RT-PCR in real time. To do this, the macrophages were treated for 3 days with the antisense specific for the mannose receptor mRNA (ODN).
  • ODN antisense specific for the mannose receptor mRNA
  • Macrophages are cultured for 24 hours in the presence of 1 ⁇ M of 15d-PGJ 2 , 5 ⁇ M of ciglitazone, or 5 ⁇ M of rosiglitazone.
  • the cells were then incubated with FITC-labeled mBSA, and then analyzed by flow cytometry. The intensity of the fluorescence analyzed is shown in Figure 6.
  • FIG. 6 shows that in the presence of the antisense, the amount of fluorescence is significantly inhibited whatever the treatments used.
  • Table 5 Involvement of the mannose receptor in the production of oxidizing agents for macrophages treated with PPAR ⁇ ligands.
  • the production of oxidizing agents was determined on macrophages in culture by the chemiluminescence technique.
  • C x S strokes x seconds during lh.
  • Macrophages are incubated for 3 days with a specific antisense (ODN) or with a non-specific antisense (ANS) of the mannose receptor mRNA.
  • ODN specific antisense
  • ANS non-specific antisense
  • Table 4 shows that the increase in the production of oxidizing agents by macrophages induced by the treatments is antagonized by the specific antisense of the mannose receptor mRNA With the non-specific antisense of the mannose receptor (ANS) no effect on the inhibition of the production of oxidizing agents is observed. Thus, the production of oxygenated free radicals is correlated with the induction of the expression of mannose receptors.
  • Test 7 Effect of PPAR ⁇ ligands (rosiglitazone, ciglitazone, 15d-PGJ 2 ) on the expression of mannose receptors in human monocytes.
  • the monocytes were isolated from the mononuclear cells, by adhesion after 2 hours of culture at 37 ° C. and under an atmosphere containing 5% of CO 2 in a medium without serum for macrophages (SFM for macrophage from iNVITOGEN CORP., France) and supplemented with de_ la_ Lrglutamine ..
  • Non-adherent cells were removed - by two washes with Hanks saline.
  • the adherent cells (85% of the monocytes / macrophages) were cultured in SFM for macrophage.
  • phagocytosis of C. albicans has been shown to be increased in proportion to the induction of mannose receptors.
  • monocytes differentiated by PPAR ⁇ agonist ligands kill C. albicans by a mechanism dependent on the production of superoxide anions triggered during the interaction between C. albicans and mannose receptor.
  • the macrophages were then collected by washing the peritoneal cavity of the infected mice treated or not, either with 15d-PGJ 2 or with rosiglitazone.
  • the macrophagic suspension was adjusted to 10 / ml in SFM (GibcoBRL, France) supplemented with glutamine, penicillin and streptomycin and was distributed at a rate of 1 ml per well in the microplates of 24 wells. After a 2 hour incubation in an oven at 37 ° C, 5% CO 2 , the non-adherent cells were eliminated by two rinses in PBS. After these 2 hours, the cell mats in monolayers contain 95% of macrophages and are used to evaluate their phagocytosis capacity as well as their capacity to produce oxidizing agents.
  • the radioactivity measured in the lysate is proportional to the quantity of phagocytated yeasts and that that measured in the supernatants " is proportional to the quantity of external yeasts
  • the percentage of phagocytated yeasts in relation to the quantity of total yeasts will be determined according to the formula next :
  • Phagocytosis dp m lys a t + dpni supernatant
  • oxidizing agents oxygenated free radicals and nitrogen monoxide
  • the joint activities of NADPH oxidase and of the inducible NOsynthase are measured by chemiluminescence in the presence of '' a chemiluminogenic probe, Luminol (SIGMA, France): 5-amino2,3-diydro-l, 4-phthalazine-dione.
  • Luminol SIGMA, France
  • 5-amino2,3-diydro-l, 4-phthalazine-dione The production of chemiluminescence will be analyzed with a luminometer (Wallac Victor II, Finland) controlled by a computer.
  • the luminol allows, in the presence of oxidizing agents, the emission of photons captured by the photomultiplier of the dark room of the luminometer thermostatically controlled at 37 ° C and transformed into quantifiable electrical pulses.
  • the chemiluminescence values will be recorded continuously for 1 hour after incubation of the cells with luminol (66 ⁇ M) and in the presence or not of yeasts.
  • mice infected with C. albicans and treated or not in vivo, either with 15d-PGJ 2 or with rosiglitazone were collected by washing the peritoneal cavity of these mice.
  • the suspension is adjusted to 10 6 / ml in SFM and incubated for 1 hour at 4 ° C. with mannosylated bovine albumin (mBSA) labeled with fluorescein (14 ⁇ M).
  • mBSA mannosylated bovine albumin
  • fluorescein 14 ⁇ M
  • mice with PPAR ⁇ agonist ligands modify candidosal infection in several organs (esophagus, stomach, cecum, kidneys, liver).
  • the SWISS and RAG-2 mice were treated with 15d-PGJ 2 or with rosiglitazone, as previously described.
  • blood samples were taken in order to monitor the presence of yeasts in the blood of the mice. No samples showed the presence of yeasts in the blood, signifying that there was no spread of the fungal infection.
  • Test 8 Stimulation of phagocytosis of C. albicans and of the production of oxidizing agents for macrophages by in vivo treatment with 15d-PGJ 2 .
  • mice of the RAG-2 type which have a severe combined deficit of cell and humoral mediated immunity, do not have B and T lymphocytes treated or not, either by 15d-PGJ 2 or by rosiglitazone, then infected with C. albicans (culture, by the radiometric technique, facing a one hour challenge with C. albicans, in a 1: 1 ratio).
  • Table 5 shows the phagocytosis capacity of peritoneal macrophages taken from SWISS or RAG-2 mice infected with C. albicans, whether or not treated with 15d-PGJ 2 in vivo.
  • the results presented in this table show that the macrophages extracted from SWISS mice and RAG-2 mice, treated in vivo, either with 15d-PGJ 2 or with rosiglitazone, exhibit a much greater phagocytosis capacity than the macrophages extracted from mice not treated in vivo (control).
  • intraperitoneal administration of 15d-PGJ 2 or rosiglitazone increases the ability of macrophages to internalize C. albicans.
  • FIG. 7 shows that the macrophages extracted from SWISS and RAG-2 mice, treated in vivo with 15d-PGJ 2 produce the same basal amount of oxidizing agents as the macrophages extracted from control mice. Treatment of mice with 15d-PGJ 2 therefore does not induce an increase in the production of oxidizing agents by macrophages. However, the addition of yeasts increases the production of oxidizing agents.
  • Test 9 Amplification of the expression of mannose receptors by an in vivo treatment with 15d-PGJ 2 or with rosiglitazone.
  • mannose receptor is involved in the phagocytosis of many pathogenic microorganisms such as in particular
  • FIG. 8 shows that the quantity of mannosylated bovine albumin marked with fluorescein present on the macrophages is significantly increased when the cells are extracted from the mice treated in vivo with 15d-PGJ 2 or with rosiglitazone. This suggests that the treatment of SWISS and RAG-2 mice, with 15d-PGJ 2 or with rosiglitazone, induces an increase in the expression of mannose receptors on the surface of macrophages.
  • Figure 9 shows that the induction of the mannose receptor by PPAR ⁇ ligands is greatly reduced in mice having a zero allele for the gene for this nuclear receptor (heterozygous mice, PPAR ⁇ + / " ) compared to homozygous mice (PPAR ⁇ + / + ).
  • the effect of PPAR ⁇ ligands is more effective in mice which express the PPAR ⁇ gene on the two alleles of the chromosome, which suggests the role of PPAR ⁇ in the expression of the mannose receptor in vivo.
  • the regression analysis of the results set out in FIG. 8 and in Table 5 indicates a linear association between the quantity of MMR on the surface of the macrophages and the phagocytosis capacity of these cells after treatment of the mice with 15d-PGJ 2 or by rosiglitazone. This therefore demonstrates a real correlation between the expression of mannose receptors influenced by the treatments and the capacity of these cells to internalize C. albicans.
  • Test 10 Decrease in candidal infection by in vivo treatment with 15d-PGJ 2 or with rosiglitazone.
  • the two techniques for quantifying the number of yeasts show a significant reduction in the colonization of the various organs in mice treated, either with 15d-PGJ 2 or with rosiglitazone, compared with untreated mice (C). In the liver and kidneys, no colonization by yeast is observed, thus showing an absence of dissemination of the fungal infection.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

L'invention concerne un procédé de fabrication d'une composition thérapeutique, stimulant la réponse immunitaire innée par induction et/ou amplification de l'expression des récepteurs mannose des macrophages. L'invention s'inscrit avantageusement dans le cadre des traitements préventifs ou curatifs de maladies infectieuses d'origine bactérienne, fongique, protozoaire... et présente un intérêt tout particulier, dans la médication des sujets immunodéprimés. Selon l'invention, pour induire et/ou amplifier l'expression du récepteur mannose des macrophages, on met au contact desdits macrophages une quantité efficace d'au moins un ligand agoniste du récepteur nucléaire PPARϜ.

Description

INDUCTION DE L'EXPRESSION DES RECEPTEURS MANNOSE DES MACROPHAGES, ET APPLICATIONS
L'invention concerne un procédé de fabrication d'une composition thérapeutique, stimulant la réponse immunitaire innée par induction et/ou amplification de l'expression des récepteurs mannose des macrophages. L'invention s'inscrit avantageusement dans le cadre des traitements préventifs ou curatifs de maladies infectieuses d'origine bactérienne, fongique, protozoaire... et présente un intérêt tout particulier, dans la médication de sujets immunodéprimés. La réponse immunitaire innée, essentielle dans les mécanismes de défense de l'organisme contre les agents infectieux, est une réaction immune précoce qui se déclenche dès les premiers instants de l'infection. Les macrophages, participent à cette réponse immunitaire innée en reconnaissant, en phagocytant et en détruisant l'agent infectieux. La phase de reconnaissance consiste en l'identification de structures biochimiques superficielles caractéristiques des pathogènes et fait intervenir nombre de récepteurs à la surface des macrophages.
• Parmi ces récepteurs, le récepteur mannose (on parle aussi de récepteur pour le mannose) permet la reconnaissance, mais également la fixation et la phagocytose, d'une grande diversité de pathogènes, en particulier des pathogènes d'origine bactérienne, fongique et protozoaire, qui présentent sur la face extérieure de leurs parois des glycoprotéines, des polysaccharides et/ou des lipopolysaccharides ayant à leurs extrémités libres des motifs mannosylés et/ou fucosylés. A des fins de simplification, dans le reste du texte, ces pathogènes seront désignés par "pathogènes à motifs mannosylés et/ou fucosylés". L'implication du récepteur mannose des macrophages (MMR) est ainsi essentielle dans les processus de défense de l'organisme. Elle n'est toutefois effective que si ce récepteur est fortement exprimé à la surface des macrophages.
Cependant, bien que le rôle du récepteur mannose des macrophages soit aujourd'hui bien défini, les voies de régulation de l'expression de ce récepteur restent encore mal connues. Il en est de même pour les acteurs biochimiques intervenant dans l'induction de l'expression de ce récepteur. Dans ce contexte, l'invention a pour principal objectif de proposer des composés capables d'induire et/ou d'amplifier l'expression des MMR.
Elle vise ainsi à mettre en évidence des composés capables d'améliorer la vigilance et/ou la réponse du système immunitaire, à l'égard de nombreux micro-organismes via une reconnaissance par les récepteurs mannose des macrophages.
Dans tout le texte, on entend par "milieu biologique", un milieu de composition biologique, c'est-à-dire comprenant de la matière vivante, notamment des organismes monocellulaires et/ou pluricellulaires. Un milieu biologique peut être artificiel (par exemple, un milieu de culture), ou naturel (par exemple, un tissu vivant, une composition sanguine, isolés ou non d'un organisme pluricellulaire -notamment un-primate-).
Par ailleurs, on désigne par "macrophage", toute cellule, de localisation essentiellement tissulaire, issue de la différenciation des monocytes (les macrophages en tant que tels, les cellules dendritiques, les cellules neutrophiles phagocytaires) ainsi que les monocytes. "Macrophage" au sens de l'invention désigne ainsi, de manière générale, toute cellule susceptible d'exprimer le MMR et ayant la capacité à phagocyter.
L'invention vise également à proposer de nouvelles perspectives dans le traitement thérapeutique de maladies infectieuses -notamment des maladies opportunistes-, en particulier dans le cadre de la médication de sujets immunodéprimés .
L'invention concerne donc, en premier lieu, un procédé de stimulation de l'expression de récepteurs mannose de macrophages dans lequel, on traite, par une quantité efficace d'au moins un ligand agoniste de PPARγ, un milieu biologique, extracorporel ou intracorporel, comprenant des macrophages. On entend par "quantité efficace", une quantité apte à induire et/ou à amplifier l'expression des récepteurs mannose d'au moins une partie des macrophages du milieu biologique cible.
L'invention repose ainsi sur la constatation, surprenante et jusqu'alors insoupçonnée, que l'activation du récepteur nucléaire PPARγ conduit à une induction génique et à une expression protéique du MMR. D'après Vamecq J. et Latruffe N., 1999 (The Lancet, 354:141- 148), un document récapitulatif des connaissances générales concernant les PPARs (récepteurs des proliférateurs de peroxisomes), PPARγ serait impliqué dans des phénomènes d'adipogénèse, de différenciation cellulaire et de régulation de certaines réactions anti-inflammatoires. Bien qu'étant essentiellement exprimé dans les cellules adipeuses, PPARγ a également été détecté dans les macrophages.
Les MMR ne sont pas abordés dans cette publication.
Ainsi, jusqu'à présent, rien ne permettait de soupçonner une quelconque implication de PPARγ dans les mécanismes de stimulation et/ou d'amplification de l'expression des MMR.
La mise en évidence par les inventeurs du lien fonctionnel existant entre le facteur de transcription PPARγ et l'expression du MMR, ouvre ainsi de nouvelles perspectives d'application aux ligands agonistes de PPARγ.
Avantageusement, au moins un des ligands agonistes de PPARγ utilisés pour induire et/ou amplifier l'expression du MMR selon l'invention, est choisi parmi le groupe des ligands naturels : la 15d-PGJ2, les prostaglandines Al et D2, les acides 9- et 13-hydoxyoctadécanoïques, les dérivés des LDL
(lipoprotéines de faible densité) oxydées.
Parmi ces ligands naturels, la 15d-PGJ2 (15-déoxy-Δ12'14- prostaglandine J2), un métabolite de la prostaglandine D2 (PGD2), est connue comme étant un des plus puissants ligands agonistes de PPARγ.
On peut également et avantageusement choisir au moins un des ligands agonistes de PPARγ parmi le groupe des ligands synthétiques : la troglitazone (Resulin®), la rosiglitazone (Avandia®), la pioglitazone (Actos®), la ciglitazone, l'englitazone, le GW 347845, le KRP-297, le JTT-501B, le SB 213068, le GI 262570, le GW 1929, le GW 7845, le GW 0207, le L-796449, l'indométhacine, l'ibuprofène.
La troglitazone, la rosiglitazone, la pioglitazone, la ciglitazone, l'englitazone, le GW 347845 appartiennent à la famille des thiazolidinediones et sont couramment utilisés dans le domaine médical comme médicaments hypolipidémiants pour le traitement de certains diabètes. De même, l'indométhacine et l'ibuprofène sont communément utilisés comme anti- inflammatoires non-stéroïdiens pour le traitement de certaines maladies inflammatoires, comme l'athérosclérose et l'arthrose.
En particulier, WO 03/059271 enseigne l'utilisation des composés agonistes de PPARγ pour traiter ou pour prévenir les inflammations, les cancers, les maladies cardiovasculaires... WO 03/059271 n'aborde pas les MMR et pour ce qui est des méthodes et des compositions thérapeutiques décrites, elles ne sont envisagées que comme remèdes aux symptômes de certaines inflammations. Il n'est décrit ni suggéré un quelconque effet biologique des ligands agonistes de PPARγ sur les causes de ces inflammations, notamment sur d'éventuels agents infectieux susceptibles-de générer certaines de ces réactions inflammatoires.
Ainsi, jamais encore, il n'a été envisagé d'utiliser ces mêmes composés pour stimuler et/ou amplifier l'expression des récepteurs mannose des macrophages et encore moins pour obtenir le déclenchement des fonctions effectrices des macrophages (phagocytose, synthèse des cytokines et des agents oxydants, présentation de l'antigène) contre des pathogènes d'origine bactérienne, fongique ou protozoaire.
En utilisant Candida albicans (C. albicans) comme modèle de micro-organisme sensible au MMR, les inventeurs ont pourtant pu déterminer que, au-delà d'une simple modulation de l'expression du MMR, le traitement des macrophages par un ligand agoniste de PPARγ conduit à une stimulation remarquable de la capacité des macrophages à reconnaître et à éliminer l'agent pathogène, non seulement par phagocytose, mais également par une production accrue d'agents oxydants. Les inventeurs sont ainsi parvenus à démontrer que l'induction du récepteur mannose par les ligands agonistes de PPARγ permet l'élimination d'une infection fongique du tractus gastro-intestinal par C. albicans. Cette élimination se fait en absence d'anticorps ou d'une réponse immune adaptative. L'effet anti-infectieux des ligands agonistes de PPARγ est la conséquence, d'une part, de l'accroissement de la phagocytose de C. albicans médiée par le récepteur mannose et, d'autre part, de la mort de C. albicans causée par les intermédiaires réactifs de l'oxygène (IROs). Ces derniers sont sécrétés par les macrophages au cours de la phagocytose de la levure. En effet, il a été démontré que la fonction candidicide des macrophages disparaît lorsque Fanion superoxyde est supprimé par la superoxyde dismutase (SOD) et que la production des espèces réactives de l'oxygène par les macrophages est supprimée par les antisens des ARN messagers codant pour le MMR (Coste A. et al, Immunity, 2003, 19:329-339). Ces enseignements qui découlent des travaux des inventeurs, ainsi que l'invention, sont totalement indépendants des propriétés anti-inflammatoires de PPARγ.
Cette capacité qu'ont les ligands agonistes de PPARγ à stimuler l'expression des récepteurs mannose et donc, d'une part, à renforcer la vigilance des macrophages à l'égard des micro-organismes infectieux à motifs mannosylés et/ou fucosylés et, d'autre part, à déclencher les~fonctions effectrices des macrophages, lorsque ceux-ci se trouvent en présence de ce type de pathogènes, peut être avantageusement mise à profit pour la médication de sujets atteints de déficits immunitaires, innés ou acquis. Pour certains sujets immunodéprimés, comme les sidéens ou les patients traités par chimiothérapie (par exemple, des patients atteints d'un cancer ou d'une hémopathie) ou par des immunosuppresseurs (par exemple, après une transplantation), l'induction et/ou l'amplification de l'expression MMR permettrait de pallier efficacement l'insuffisance de leur système immunitaire, en améliorant non seulement la vigilance du système immunitaire innée à l'égard de nombreux micro-organismes infectieux, mais également en stimulant et en amplifiant les fonctions effectrices des macrophages en vue d'obtenir une réponse immune efficace, de type Th2. Eventuellement, l'induction et/ou l'amplification de l'expression des MMR va(vont) permettre de réorienter la défense immunitaire vers une réponse de type Th2 pour compenser une réponse de type Thl éventuellement défectueuse.
Dans ce contexte de stimulation du système immunitaire via l'expression des MMR, l'invention s'adresse en particulier à des sujets immunodéprimés. Elle s'adresse également à des personnes susceptibles d'être exposées à des agents infectieux présentant sur la face extérieure de leurs parois des motifs mannosylés et/ou fucosylés, ou ayant été infectées par ces derniers. A titre d'exemples d'agents infectieux visés par l'invention, on peut citer : Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, pseudomonas aeruginosas, Legionella pneumophilla. La stimulation du système immunitaire d'un individu -en particulier, d'un individu immunodéprimé-, par amplification de l'expression du MMR, peut être réalisée en administrant à celui-ci une quantité efficace d'au moins un ligand agoniste de PPARγ, apte à induire une distribution de ligand(s) dans le milieu biologique cible, à une concentration efficace, c'est-à-dire apte à induire et/ou à amplifier l'expression des MMR d'au moins une partie des macrophages présents dans ce milieu -par exemple, un tissu ou une composition de sang périphérique-. Cette concentration est, en général, au moins équivalente à 1ΕC50 du(des) ligand(s) utilisé(s). Le milieu biologique contenant des macrophages selon l'invention correspond, dans ce cas particulier, à un milieu naturel intracorporel. Le tableau 1 ci-après présente les valeurs EC50 pour certains ligands agonistes synthétiques de PPARγ.
Figure imgf000007_0001
Tableau 1 : Activité transactivatrice des agonistes de PPARγ (CE IN - N°70, Mars/Avril 2002)
Selon le site visé, l'administration peut se faire par voie orale, rectale, ou parentérale (sous-cutanée, transdermique, intraveineuse, intramusculaire). Par ailleurs, selon le site visé, la distribution du composé actif peut circuler jusqu'à la cible via le système sanguin périphérique, ou l'atteindre par une administration topique (administration du composé directement au contact du site cellulaire à traiter). La forme galénique et les doses à administrer seront choisies en conséquence.
Compte tenu de la valeur EC50 de certains des ligands agonistes de PPARγ actuellement connus, on peut envisager, en particulier pour les composés cités précédemment, une utilisation à des doses efficaces sans risque de toxicité (par exemple, on peut prescrire la rosiglitazone à des doses journalières de l'ordre 4 à 8 mg pour un adulte de 70 kg). A noter que la plupart des ligands agonistes de PPARγ, en particulier ceux précédemment cités, ont déjà passé avec succès les tests de toxicité dans le cadre de l'obtention de l'autorisation de mise sur le marché, comme anti-inflammatoires ou hypolipidémiants.
Selon une variante de réalisation, conforme à l'invention et entrant également dans le cadre de la stimulation du système immunitaire par induction de l'expression du MMR chez un individu -en particulier immunodéprimé-, le milieu biologique comprenant des macrophages à stimuler peut être également extracorporel. Les macrophages sont alors préparés à partir d'un prélèvement sanguin d'un patient, puis sont traités avec une quantité efficace d'au moins un ligand agoniste de PPARγ, avant d'être réinjectés à ce même patient.
Eventuellement, les macrophages peuvent aussi provenir d'un donneur immunocompatible avec le patient receveur. En particulier, ce dernier est atteint de déficits immunitaires, notamment un déficit en macrophages matures.
Selon cette même perspective de stimulation de l'expression du MMR, l'invention s'étend à un procédé de traitement d'un tissu vivant ou d'une composition de sang périphérique, non isolés, d'un primate vivant -notamment de l'homme-, dans lequel on administre dans un tissu ou dans une composition de sang périphérique dudit primate, une quantité efficace d'au moins un ligand agoniste de PPARγ, adaptée pour induire une distribution de ligand(s) dans ledit tissu ou ladite composition de sang périphérique, à une concentration thérapeutiquement efficace, c'est-à-dire apte à induire et/ou à amplifier l'expression des MMR des macrophages présents dans ledit tissu ou ladite composition de sang périphérique.
Selon un autre aspect, l'invention a trait à un procédé d'élimination, intracorporel ou extracorporel, de micro-organismes d'origine bactérienne, fongique ou protozoaire, ayant, sur la face extérieure de leurs parois, des polysaccharides et/ou lipopolysaccharides avec des extrémités libres mannosylés et/ou fucosylés. Selon l'invention, qu'on place, dans un milieu infecté par lesdits micro-organismes et au contact de macrophages, une quantité efficace d'au moins un ligand agoniste de PPARγ à titre de facteur d'induction et/ou d'amplification de l'expression des récepteurs mannose des macrophages.
Avantageusement et selon' l'invention, lesdits microorganismes sont choisis parmi : Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, pseudomonas aeruginosas, Legionella pneumophilla.
Avantageusement et selon l'invention, au moins un des ligands agonistes de PPARγ est choisi parmi le groupe des ligands naturels : la 15d- PGJ2, les prostaglandines Al et D2, les acides 9- et 13-hydoxyoctadécanoïques, les dérivés des LDL oxydées. Ce ligand peut également être choisi parmi le groupe des ligands synthétiques : la troglitazone, la rosiglitazone, la pioglitazone, la ciglitazone, l'englitazone, le GW 347845, le KRP-297, le JTT-501β, le SB 213068, le GI 262570, le GW 1929, le GW 7845, le GW 0207, le L-796449, l'indométhacine et l'ibuprofène. Selon l'invention, l'utilisation d'un ligand agoniste de PPARγ pour éliminer un micro-organisme infectieux via des macrophages stimulés, peut intéresser un milieu artificiel infecté, par exemple un milieu de culture, ou un milieu naturel infecté, par exemple un tissu vivant ou le sang périphérique, isolé ou non d'un organisme pluricellulaire -notamment un primate, notamment vivant-. L'invention s'étend en conséquence également à un procédé de fabrication d'une composition thérapeutique comprenant au moins un ligand agoniste de PPARγ à titre de composé actif apte à induire et/ou à amplifier l'expression des récepteurs mannose des macrophages.
Plus particulièrement, il s'agit d'un procédé de fabrication d'une composition thérapeutique -notamment une composition immunostimulante- destinée au traitement préventif ou curatif d'une pathologie appartenant au groupe des pathologies induites par des micro-organismes, d'origine bactérienne, fongique ou protozoaire qui ont, sur la face extérieure de leurs parois, des motifs mannosylés et/ou fucosylés, à l'exception de Mycobacterium avium.
Selon l'invention, on utilise une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un ligand agoniste du récepteur nucléaire PPARγ à titre de facteur d'induction et/ou d'amplification de l'expression des MMR.
Avantageusement et selon l'invention, il s'agit de microorganismes choisis parmi : Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Ciyptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, Pseudomonas aeruginosas, Legionella pneumophilla.
Avantageusement et selon l'invention, on utilise pour la fabrication de ladite composition thérapeutique au moins un ligand agoniste de
PPARγ choisi parmi le groupe des ligands naturels : la 15d-PGJ2, les prostaglandines Al et D2, les acides 9- et 13-hydoxyoctadécanoïques, les dérivés des LDL oxydées.
Pour la fabrication d'une composition thérapeutique conforme à l'invention, on peut également choisir ce ligand parmi le groupe des ligands synthétiques : la troglitazone, la rosiglitazone, la pioglitazone, la ciglitazone, l'englitazone, le GW 347845, le KRP-297, le JTT-501β, le SB 213068, le GI 262570, le GW 1929, le GW 7845, le GW 0207, le L-796449, l'indométhacine et l'ibuprofène.
Une composition thérapeutique préparée conformément à un procédé selon l'invention, est ainsi adaptée pour induire et/ou amplifier l'expression du MMR. Aussi, elle peut être considérée comme une composition immunostimulante, capable d'améliorer le niveau de vigilance du système immunitaire vis-à-vis de nombreux micro-organismes infectieux, de stimuler la réponse immunitaire innée et d'amplifier les fonctions effectrices des macrophages lorsque ces derniers sont placés en présence de ces micro-organismes. Aussi, avantageusement et selon l'invention, elle est destinée à la médication de sujets immunodéprimés.
Avantageusement, une composition thérapeutique obtenue par un procédé de fabrication conforme à l'invention, peut également comprendre un ou plusieurs autres principes actifs, notamment pour procurer un effet synergique. En particulier, outre un ligand agoniste de PPARγ, elle peut avantageusement renfermer une quantité d'extrait de paroi d'un micro-organisme vis-à-vis duquel on cherche à se défendre.
La forme galénique d'une composition thérapeutique conforme à l'invention est choisie en fonction de la voie d'administration et peut être réalisée par les techniques traditionnelles. L'invention s'étend également à un traitement curatif de pathologies susceptibles d'être induites par des micro-organismes, d'origine bactérienne, fongique ou protozoaire, à motifs mannosylés et/ou fucosylés. Il s'agit notamment de micro-organismes tels que : Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, Pseudomonas aeruginosas, Legionella pneumophilla.
L'invention s'adresse aux personnes susceptibles d'être exposées à ces agents infectieux, ou ayant été infectées par ces derniers. Elle s'adresse, en particulier et de préférence, aux patients atteints de déficits immunitaires, innés ou acquis, et qui de ce fait sont particulièrement sensibles aux maladies dites opportunistes ; des maladies qui sont essentiellement causées par des pathogènes fongiques (par exemple, des candidoses), connus pour présenter, à leur surface, un grand nombre de motifs mannosylés et/ou fucosylés.
Dans un procédé de traitement selon l'invention, l'élimination du pathogène implique essentiellement une reconnaissance du pathogène médiée par les récepteurs mannose des macrophages dont l'expression a été induite et/ou amplifiée par un ligand agoniste de PPARγ, naturel ou synthétique. Dans un 2004/096195 - - - . «-
11 procédé de traitement selon l'invention, on met avantageusement en œuvre un procédé de stimulation de l'expression du MMR comme décrit précédemment.
En particulier, on traite le patient en lui administrant une quantité, efficace et adaptée, d'au moins un ligand agoniste de PPARγ. Cette quantité est, en général, au moins équivalente à 1ΕC50 du(des) ligand(s) utilisé(s).
Avantageusement, on utilise une composition thérapeutique dont le procédé de fabrication a été ci-dessus présenté.
Selon une autre variante de mise en œuvre de l'invention, on transfert au patient, des macrophages ayant été préalablement isolés d'un milieu intracorporel, par exemple à partir d'un prélèvement sanguin de ce même patient ou d'un donneur immunocompatible avec celui-ci ; ces macrophages sont ensuite traités par des agonistes de PPARγ dans un milieu de culture extracorporel, avant d'être réinjectés audit patient.
L'invention concerne aussi un procédé de stimulation de macrophages, un procédé d'élimination de pathogènes à motifs mannosylés et/ou fucosylés, un procédé de fabrication d'une composition thérapeutique, caractérisés, en combinaison, par tout ou partie des caractéristiques ci-dessus ou ci-après.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des essais expérimentaux suivants qui se réfèrent aux figures annexées, dans lesquelles :
- la figure 1 est une représentation graphique de l'effet d'inhibition des ligands agonistes de PPARγ sur la prolifération de C. albicans,
- la figure 2 est une représentation graphique de la capacité des macrophages à phagocyter C. albicans selon que PPARγ soit ou non inhibé, - la figure 3 montre des spectres de distribution de fluorescence reflétant l'induction du récepteur mannose par divers ligands agonistes de PPARγ,
- la figure 4 montre des spectres de distribution de fluorescence reflétant l'implication de PPARγ dans la régulation de l'expression du MMR, - la figure 5 est une représentation graphique de l'implication de PPARγ dans la régulation de l'expression du MMR,
- la figure 6 est une représentation graphique de l'effet d'amplification de divers ligands agonistes de PPARγ sur l'expression du MMR, - la figure 7 est une représentation graphique de l'effet in vivo de la 15d-PGJ2 sur la capacité des macrophages à produire des agents oxydants,
- la figure 8 est une représentation graphique du niveau d'expression des MMR chez des souris SWTSS et RAG-2 infectées par C. albicans,
- la figure 9 est une représentation graphique de l'effet des ligands agonistes de PPARγ sur l'expression du MMRde souris homozygotes (+/+) et hétérozygotes (-/-) pour le gène de PPARγ,
- la figure 10 est une représentation graphique de l'effet in vivo des ligands agonistes de PPARγ sur la prolifération de C. albicans, au niveau du tractus gastrointestinal par C. albicans. • EXPERIMENTATIONS IN VITRO
Les travaux menés in vitro ont permis de mettre en évidence une stimulation des propriétés anti-infectieuses des macrophages vis-à-vis de différents micro-organismes présentant à leur surface des motifs mannosylés -notamment C. albicans-, via l'augmentation de l'activité phagocytaire des macrophages et de leur capacité à produire des agents oxydants.
Il a été également montré que le récepteur associé à l'augmentation de la phagocytose de C. albicans par les macrophages traités par les ligands spécifiques de PPARγ était bien le MMR. De plus, l'utilisation d'un antisens spécifique du récepteur mannose a permis de montrer une implication directe de l'induction de l'expression de ce récepteur dans l'augmentation du métabolisme oxydatif des macrophages. Enfin, des expériences de transfection d'un vecteur rapporteur CMV-PPARγ dans des cellules RAW 264.7, connues pour exprimer faiblement PPARγ, ont révélé une régulation de l'expression des MMR par une voie de signalisation particulière dans laquelle est impliqué le récepteur nucléaire PPARγ.
Le matériel et les méthodes utilisés sont présentés ci-après. Les souches de C. albicans ont été isolées à partir d'échantillons de sang d'un patient atteint de candidose, selon des techniques classiques.
Les macrophages, quant à eux, proviennent soit du péritoine de souris femelles SWISS (Centre d'élevage, Etablissement Janvier, France), soit du sang périphérique de donneurs sains. Ces macrophages, de souris ou d'humain, sont cultivés dans un milieu de culture SFM ("serum-free médium") optimisé pour la culture des macrophages, commercialisé par la société GibcoBRL, France. L'adhésion des cellules se produit après environ 2 heures de culture à 37°C sous atmosphère à 5 % de CO2. Les cellules n'adhérant pas à la boîte de culture sont éliminées par rinçage au PBS (GibcoBRL, France). _
Pour les différents tests, les cellules adhérentes restant sur les boîtes sont stimulées par la 15d-PGJ2, la ciglitazone ou la rosiglitazone (MERCK- LIPΗA, France) à différentes concentrations. Pour étudier la prolifération de C. albicans, des mesures d'incorporation de [ HJuracile (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, France) dans les ARN sont effectuées avec des cellules en cours de multiplication.
Pour chaque essai, 2.105 macrophages par puits sont cultivés pendant 2 heures sur des plaques Falcon® de 96 puits, dans du SFM à 37°C et sous atmosphère à 5 % de CO2. Les macrophages sont stimulés par les agonistes de PPARγ pendant 24 heures, puis infectés par des blastoconidies de C. albicans dans une proportion macrophages/levures de 1:200, pendant 6 heures à 37°C, sous atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Pour certains tests, l'uracile tritié (1 μCi) est ajouté à chaque puits. Après un challenge de 6 heures, les surnageants des puits contenant les blastospores non- adhérents sont collectés et centrifugés. Le culot est lavé au PBS. La radioactivité incorporée dans les ARN de levure est comptée avec le fluide de scintillation BCS (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, France). Les monocouches contenant des levures adhérentes ou phagocytées sont lavées deux fois au PBS, puis lysées avec NaOH (IM) et neutralisées par HCl (IM). Le liquide de scintillation est alors ajouté à chaque fiole et la radioactivité est comptée au moyen d'un compteur Pharmacia LKB1217. Le nombre de désintégrations par minute (dpm) permet d'apprécier le niveau de prolifération de C. albicans pour chacun des essais.
Pour étudier le mécanisme d'ingestion de C. albicans par les macrophages, des levures préalablement marquées par [ HJuracile sont utilisées. Trois colonies de C. albicans sont dispersées dans 1 ml de bouillon Sabouraud contenant 150 μCi de [3HJuracile. Après 24 heures de culture à 37°C sous agitation, les blastospores marqués sont centrifugés et resuspendus dans le SFM enrichi avec 1,8 % de glucose. Pour chaque essai, les monocouches de macrophages cultivées sur les plaques 24 puits sont traitées avec les agonistes de PPARγ pendant 20 heures, puis infectées avec C. albicans marqué et viable (dans une proportion macropliages/levures de 1:1) et laissées à incuber pendant 1 heure à 37°C, puis 2 heures à 5°C. Soumis à 5°C, les mécanismes de phagocytose sont bloqués. Au terme de chacune des périodes d'incubation (1 heure ou 2 heures), le milieu de culture est prélevé, les monocouches de macrophages sont rincées deux fois au PBS. Les solutions de rinçage sont conservées. Les monocouches sont lysées par NaOH (IM) puis neutralisées par HCl (IM). La radioactivité du surnageant et celle des solutions de rinçage, ainsi que la radioactivité contenue dans le lysat cellulaire sont comptées séparément avec le fluide de scintillation BCS au moyen d'un compteur de scintillation de liquide. L'index de phagocytose est évalué de la manière suivante :
n , , Δ(37 o C _ 5 o C)dpmmonocouc es
% Phagocytose :
Δ(35°C - 5°C) mmθnocouches + Φmsurnageant
Pour les essais de cytométrie en flux, les macrophages sont rincés au PBS glacé. Le marquage des MMR est réalisé pendant une heure, dans la glace, à la manière d'un ligand spécifique conjugué avec de l'albumine bovine mannosylée marquée à la fluorescéine FITC (840 nM) (SIGMA, France). Afin de faciliter la sélection des populations de cellules viables, une coloration à l'iodure de propidium est réalisée. Toutes les analyses sont effectuées par le FACScalibur (Becton-Dickinson) en utilisant le logiciel CellQuest.
Les analyses de l'ADNc des MMR par RT-PCR sont menées de la manière suivante. Les ARN totaux sont isolés des cellules au moyen du réactif "Extract AU" (EUROBIO, France). Les ARN sont reverse-transcrits en utilisant le kit "First-Strand DNA Synthesis" (PROMEGA, France), durant 30 cycles d'amplification (30 sec. à 95°C, 1 min à 48°C et 1 min à 68°C). Les séquences des amorces (MMR sens et MMR antisens) utilisées pour obtenir l'ADNc du MMR sont présentées dans le tableau 2.
Figure imgf000016_0001
Tableau 2
Pour les tests de transfection, les macrophages de la lignée cellulaire murine RAW 267.4 (QBiogene, France) sont maintenus en phase de croissance exponentielle dans du DMEM complémenté avec 10 % de PBS. La veille de la transfection, les cellules sont transférées sur des plaques de 6 puits. Le milieu est alors remplacé par du DMEM dépourvu de sérum et les cellules sont transfectées de manière transitoire pendant 18 heures à 60-80 % de confluence avec le réactif de transfection FuGENE 6 (ROCHE, Suisse) contenant le vecteur à transfecter (CMV- luciférase ou CMV-PPARγ), en proportion ADN/FuGENE 6 de 1 :2, avec une quantité d'ADN de 3 μg. Le jour de la stimulation, le milieu est remplacé par le milieu complet (DMEM + FBS 10 %) contenant les différentes molécules à tester. Les cellules sont collectées 24 heures plus tard puis analysées par cytométrie en flux. La transfection du vecteur CMV-luciférase (PROMEGA, France) sert de contrôle. La séquence pCMX-mPPARγ (Forman B.M. et al, Cell, 1995, 83:803- 812) code pour le récepteur nucléaire PPARγ murin.
Concernant le traitement à l'antisens ODN, une séquence complémentaire à la région 3' non traduite de l'ARNm du MMR (Yamamoto et al, Infect Immun, 1997, 65:1077-82), on incube l'antisens ODN (100 nM) avec 10 μg de lipide cationique Lipofectin (GBBCO, France) à 37°C pendant 5 min selon la méthode Capacciolis et al. (Biochem Biophys Res Commun, 1998, 197:818-25) puis on l'ajoute aux macrophages cultivés dans le DMEM sans sérum. Les cellules sont incubées pendant 4 heures à 37°C avec 5 % de CO2 atmosphérique. Le milieu est remplacé par du SFM contenant l'antisens ODN mais sans Lipofectin. Les cultures sont incubées pendant 3 jours avec un changement journalier du milieu. La concentration de l'antisens ODN utilisée n'entraîne aucune toxicité significative sur les macrophages. Les macrophages non traités et les macrophages traités avec la Lipofectin seule servent de contrôle. La séquence nucléique de l'antisens ODN est exposée dans le tableau 2. Le même traitement est réalisé avec un antisens non spécifique de l'ARNm du MMR, l'antisens ANS dont la séquence nucléique est exposée dans le tableau 2.
Pour les tests de production d'agents oxydants, l'explosion respiratoire oxygène-dépendante des macrophages traités par les agonistes de PPARγ est mesurée par chimiluminescence. Les macrophages (2.105) sont transférés sur des boîtes de culture de 5 mm de diamètre. Après activation des cellules, la production d'agents oxydants par les macrophages, en présence ou en absence de C. albicans, est mesurée par chimiluminescence en présence de luminol à 37°C. L'émission de chimiluminescence est enregistrée en continu pendant 1 heure après incubation des cellules avec le luminol (66 μM). Pour évaluer la production de l'anion superoxyde (O2 ~), la chimiluminescence est mesurée en présence de SOD, un inhibiteur spécifique de la production d'anion superoxyde. Pour évaluer la production d'oxyde nitrique (NO), la chimiluminescence est mesurée en présence de la L-NMMA (NG-monométhyl-arginine, un compétiteur spécifique de la L-arginine pour la production de NO). Aucun des inhibiteurs n'affecte la viabilité aux concentrations utilisées. Les analyses statistiques se basent sur la mesure de la surface sous la courbe et sont exprimées en coups x secondes.
Essai 1 : Stimulation de l'activité candistatique des macrophages péritonéaux murins par les ligands spécifiques des PPARγ.
L'action des macrophages traités par les ligands spécifiques de PPARγ dans l'inhibition de prolifération de C. albicans est étudiée face à un challenge in vitro de 6 heures avec la souche 98-26135 (Coste A. et al, J. Antimicrobial Chemotherapy, 2002, 49:731-740). La prolifération de C. albicans a été déterminée en présence de macrophages cultivés selon la technique radiométrique. La figure 1 expose l'inhibition de la prolifération (en %) de C. albicans en présence de macrophages non traités (C) ou traités (T) par la 15d-PGJ2, la ciglitazone (Cigli), et la rosiglitazone (Rosi).
La figure 1, montre que les macrophages développent une activité fongistatique propre, inhibant de 18 % la croissance de C. albicans. En présence des ligands agonistes de PPARγ dans le milieu, les macrophages possèdent une activité candistatique plus importante. En effet, l'inhibition de prolifération est multipliée environ par trois (par rapport au contrôle) quand les macrophages sont traités par es différentes drogues. Les ligands agonistes de PPARγ stimulent l'activité candistatique des macrophages.
Essai 2 : Augmentation de la phagocytose de C. albicans et de la production d'agents oxydants par les ligands spécifiques des PPARγ. Comme les mécanismes de défense contre C. albicans sont essentiellement dépendants de la capacité des macrophages à phagocyter les levures et à exercer leur activité fongicide en produisant des molécules toxiques (IROs et NO), la modulation de la phagocytose de cette levure ainsi que la production d'agents oxydants des macrophages traités par les ligands spécifiques de PPARγ, en absence ou présence du GW 9662 (CAYMAN CHEMICAL, Michigan, USA), un antagoniste irréversible de PPARγ, ont été étudiées.
La figure 2 fait état de la capacité de phagocytose (exprimée en index de phagocytose) des macrophages péritonéaux non traités (C) ou traités par des ligands spécifiques de PPARγ (15d-PGJ2, ciglitazone et rosiglitazone) en absence ou présence du GW 9662, face à un challenge d'une heure avec C. albicans dans les conditions d'un rapport macrophages/levures de 1:1.
La figure 2 montre qu'il existe une augmentation significative du nombre de levures phagocytées quand les macrophages sont traités par les ligands agonistes de PPARγ. Le nombre de levures internalisées par les macrophages est augmenté de 19 % par le traitement avec la 15d-PGJ2, de 13 % avec la ciglitazone (Cigli), de 10 % avec la rosiglitazone (Rosi), comparé aux macrophages non traités (C) qui ont un index de phagocytose de 46 %.
De plus, l'augmentation de la capacité de phagocytose des macrophages traités par les agonistes de PPARγ est inhibée par le GW 9662. La capacité des macrophages à produire de Fanion superoxyde et du monoxyde d'azote et leur modulation par la 15d-PGJ2 ont été également étudiées par la méthode de chimiluminescence qui permet d'évaluer non seulement la production d'anions superoxydes mais aussi celle du peroxynitrite produit au cours de l'interaction entre le monoxyde d'azote et l'anion superoxyde. Afin d'évaluer la production d'anion superoxyde, la chimiluminescence a été mesurée- en présence ou non de SOD (enzyme métabolisant O2 ~ en H202) alors que la production de monoxyde d'azote est évaluée en présence d'un compétiteur de l'arginine qui est la L-NMMA.
Figure imgf000019_0001
Tableau 3 : Effet des ligands agonistes de PPARγ sur la production d'agents oxydants par les macrophages en présence ou en absence de levure. L'évaluation de la production d'agents oxydants a été déterminée sur des macrophages en culture par la technique de chimiluminescence.
Le tableau 3 montre que les macrophages, mis en présence des différents traitements, produisent la même quantité basale d'agents oxydants que les macrophages résidents. Les ligands spécifiques de PPARγ seuls (en l'absence de C. albicans) n'induisent pas d'augmentation de la production des agents oxydants par les macrophages.
Par contre, l'ajout des levures augmente la production d'agents oxydants. Les ligands agonistes de PPARγ pré-activent la capacité des macrophages à produire les agents oxydants. En réponse à une infection par C. albicans, les macrophages dans cet état d'activation produisent principalement de l'anion superoxyde. En effet, en présence de SOD, un inhibiteur spécifique de la production des superoxydes, la production d'agents oxydants est sigmficativement inhibée. A l'inverse, la chimiluminescence mesurée en présence de la L-NMMA n'est pas inhibée. Ainsi, les macrophages dans cet état d'activation ne produisent pas du monoxyde d'azote. Ces résultats qui montrent que l'antagoniste de PPARγ bloque les effets candistatiques des ligands de PPARγ suggèrent que PPARγ est impliqué dans l'augmentation de l'activité fongicide des macrophages sous l'effet des différents traitements.
Essai 3 : Induction de l'expression des récepteurs mannose par les ligands spécifiques de PPARγ.
Comme le récepteur mannose est impliqué dans la phagocytose C. albicans ainsi que de nombreux autres micro-organismes pathogènes présentant sur la face extérieure de leurs parois des résidus mannosylés, l'expression de ce récepteur à la surface des macrophages traités par les ligands agonistes de PPARγ a été étudiée par cytométrie en flux grâce à la fixation de molécules d'albumine bovine mannosylée (mBSA) marquées à la fluorescéine (FITC, fluorothioisocyanate).
Les macrophages ont été cultivés pendant 24 heures en présence de 1 μM de 15d-PGJ2, de 5 μM de ciglitazone ou de 5 μM de rosiglitazone. Les cellules sont ensuite incubées dans la mBSA marquée au FITC et analysées par cytométrie en flux. La distribution de la fluorescence de la population cellulaire analysée est représentée à la figure 3.
La figure 3 montre que la quantité d'albumine bovine mannosylée marquée à la fluorescéine présente sur les macrophages est sigmficativement augmentée quand les cellules sont traitées (T) par les ligands spécifiques de PPARγ en comparaison avec les cellules non traitées (C). La spécificité de la mBSA pour le récepteur mannose suggère que les ligands spécifiques de PPARγ induisent l'expression des récepteurs mannose à la surface des macrophages. L'analyse de régression des résultats exposés aux figures 2 et
3 indique une association linéaire entre la quantité de MMR et la capacité de phagocytose après traitement par les différents ligands de PPARγ des macrophages, démontrant ainsi une vraie corrélation entre l'expression des récepteurs mannose influencée par les différents traitements et la capacité de ces cellules à internaliser C. albicans (r = 0,942).
Essai 4 : Implication directe, de PPARγ dans la régulation de l'expression des récepteurs mannose par les ligands spécifiques des PPARγ.
Afin de déterminer si le facteur de transcription PPARγ est impliqué dans la sur-expression du récepteur mannose induite par les ligands spécifiques de PPARγ, deux approches différentes ont été utilisées. Tout d'abord, nous avons transfecté (pendant 18 heures) deux vecteurs rapporteurs, CMV- luciférase et CMV-PPARγ, où le gène de la luciférase et le gène de PPARγ sont sous la dépendance d'un promoteur fort, celui du cytomégalo virus. Nous avons effectué ces transfections dans la lignée RAW 264.7, connue pour exprimer faiblement PPARγ. Après traitement avec les ligands spécifiques de PPARγ les récepteurs mannose présents à la surface des cellules ont été quantifiés par cytométrie en flux.
Les cellules RAW 264.7 ont ensuite été cultivées pendant 24 heures en présence d'1 μM de 15d-PGJ2, de 5 μM de ciglitazone ou de 5 μM de rosiglitazone. Les cellules sont incubées avec la mBSA marquée au FITC et analysées par cytométrie en flux. La distribution de la fluorescence de la population cellulaire analysée est représentée à la figure 4 et la moyenne géométrique des intensités de fluorescence correspondantes, reportées dans le tableau 4 ci-après.
Figure imgf000021_0001
Tableau 4 Dans une deuxième étape, l'induction de l'expression du récepteur mannose des macrophages péritonéaux murins sous l'effet des différents traitements a été étudiée par cytométrie de flux en présence d'un antagoniste irréversible de PPARγ, le GW 9662. La figure 4 montre que dans les cellules RAW 264.7 contrôle
(C), cellules transfectées avec CMV-luciférase, le traitement avec les ligands de PPARγ n'a aucun effet sur l'expression des récepteurs mannose. Par ailleurs, la transfection des cellules RAW 264.7 avec le vecteur CMV-PPARγ restaure l'effet des différents traitements sur l'induction de l'expression des récepteurs mannose. Ceci démontre que PPARγ est directement impliqué dans la régulation de l'expression du récepteur mannose par les ligands spécifiques de PPARγ.
Ces résultats sont confirmés par la figure 5 qui montre que l'augmentation de l'expression du récepteur mannose à la surface des macrophages sous l'effet de la 15d-PGJ2 est antagonisée par le GW 9662. Pour ce faire, les macrophages ont été cultivés 24 heures en présence ou en absence du GW 9962 (0,1 μM), puis incubées avec la mBSA marquée au FITC et analysées par cytométrie en flux.
Ces deux expériences montrent l'implication de PPARγ dans la sur-expression des récepteurs mannose à la surface des macrophages. Essai 5 : L'induction de l'expression du récepteur mannose à la surface des macrophages sous l'effet de différents agonistes de PPARγ est dépendante d'une régulation transcriptionnelle.
Afin de déterminer si l'activation de PPARγ conduit à une induction transcriptionnelle du récepteur mannose deux techniques différentes ont été réalisées en parallèle. Dans cet objectif, une première approche a consisté à transfecter un antisens spécifique de l'ARNm des récepteurs mannose dans des macrophages et les récepteurs mannose présents à la surface des cellules ont été quantifiés par cytométrie en flux. Parallèlement, une autre technique a été utilisée et a consisté à quantifier directement l'expression des ARNm du récepteur mannose, sous l'effet des différents traitements, par RT-PCR quantitative en temps réel. Pour ce faire, les macrophages ont été traités pendant 3 jours avec l'antisens spécifique de l'ARNm du récepteur mannose (ODN). Les macrophages sont cultivés 24 heures en présence d'1 μM de 15d-PGJ2, 5 μM de ciglitazone, ou 5 μM de rosiglitazone. Les cellules ont été ensuite incubées avec la mBSA marquée au FITC, puis analysées par cytométrie en flux. L'intensité de la fluorescence analysée est représentée à la figure 6.
La figure 6 montre qu'en présence de l'antisens, la quantité de fluorescence est significativement inhibée quel que soient les traitements utilisés. Ces résultats indiquent d'une part que l'augmentation de la quantité de mBSA fixée sur les macrophages résulte bien d'une induction de l'expression des récepteurs mannose et, d'autre part, que cette sur-expression est le reflet direct d'une augmentation de l'expression des ARNm du récepteur mannose.
Essai 6 : Le récepteur mannose est impliqué dans la modulation des fonctions oxydatives des macrophages par les ligands de PPARγ. Cette étude a été réalisée afin de déterminer si l'augmentation de la production d'agents oxydants sous l'effet des agonistes de PPARγ dépendait ou non de la modulation des récepteurs mannose par ces différents traitements. Dans cet objectif, la modulation de la production d'agents oxydants par les macrophages transfectés par l'antisens spécifique des ARNm des récepteurs mannose a été étudiée. Après traitement avec les agonistes de PPARγ, le dosage de la quantité d'agents oxydants produits par les macrophages transfectés a été réalisé par chimiluminescence. Les résultats sont présentés dans le tableau 5.
Figure imgf000023_0001
Tableau 5 : Implication du récepteur mannose dans la production d'agents oxydants des macrophages traités par les ligands de PPARγ. La production d'agents oxydants a été déterminée sur des macrophages en culture par la technique de chimiluminescence. C x S : coups x secondes pendant lh. Les macrophages sont incubés pendant 3 jours avec un antisens spécifique (ODN) ou avec un antisens non spécifique (ANS) de l'ARNm du récepteur mannose.
Le tableau 4 montre que l'augmentation de la production d'agents oxydants par les macrophages induite par les traitements est antagonisée par l'antisens spécifique de l'ARNm du récepteur mannose Avec l'antisens non spécifique du récepteur mannose (ANS) aucun effet sur l'inhibition de la production d'agents oxydants n'est observé. Ainsi, la production de radicaux libres oxygénés est corrélée avec l'induction de l'expression des récepteurs mannose. Essai 7 : Effet des ligands de PPARγ (rosiglitazone, ciglitazone, 15d-PGJ2) sur l'expression des récepteurs mannose de monocytes humains.
L'étude a été réalisée sur des monocytes humains en culture, préparés à partir de cellules mononuclées de sang périphérique de donneurs sains. La séparation des cellules mononuclées a été réalisée à partir de poches de résidus de cytophérèse, par une méthode standard de gradient de Ficoll-Hypaque (Bureau et al, J. Biol. Chem., 2001, 276:23077-23083). Les monocytes ont été isolés des cellules mononucléées, par adhésion après 2 heures de culture à 37°C et sous atmosphère à 5 % de C02 dans un milieu sans sérum pour macrophages (le SFM pour macrophage d'iNVITOGEN CORP., France) et complémenté avec de_ la_ Lrglutamine.. Les cellules-non- adhérentes ont été éliminées - par deux lavages avec une solution saline de Hanks. Les cellules adhérentes (85 % des monocytes/macrophages) ont été cultivées dans du SFM pour macrophage.
Il a pu être établi, sur ces cultures de monocytes, que les ligands agonistes de PPARγ induisent l'expression du récepteur mannose après 18 heures de culture.
De plus, il a été montré que la phagocytose de C. albicans est augmentée proportionnellement à l'induction des récepteurs mannose.
Enfin, il a été établi que les monocytes différenciés par les ligands agonistes de PPARγ tuent C. albicans par un mécanisme dépendant de la production d'anions superoxydes déclenché lors de l'interaction C. albicans- récepteur mannose.
• EXPERIMENTATIONS IN VIVO Suite aux travaux menés obtenus in vitro qui montraient que le traitement des macrophages avec les ligands de PPARγ stimulait l'activité antifongique via PPARγ, des travaux ont été menés in vivo en vue de valider ces résultats. L'étude in vitro a été réalisée sur des lots de 10 souris, soit immunocompétentes (SWISS) ou immunodéficientes (RAG-2), qui ont été infectées par C. albicans. Ces souris ont été traitées, ou non, par la 15d-PGJ2 ou par la rosiglitazone.
Dans un premier temps, il a été vérifié que les différents traitements réalisés in vivo modifiaient bien la capacité de phagocytose des macrophages.
Dans un deuxième temps, l'expression du récepteur mannose à la surface des macrophages extraits des souris, traitées in vivo par la 15d-PGJ2 ou par la rosiglitazone, a été étudiée par cytométrie en flux. Les souris immunodéficientes type RAG-2 (Centre d'élevage du CNRS, Orléans, France) possédant un déficit combiné sévère de l'immunité à médiation cellulaire et humorale, n'ont pas de lymphocytes B et T, sont utilisées en pathologie virale type SIDA/HIV.
Dans ce modèle utilisant des RAG-2, il a été possible de reproduire une candidose orogastrointestinale identique à celle observée chez les patients immunodéprimés. Nous avons ainsi examiné, in vivo, l'efficacité antifongique de cette nouvelle stratégie thérapeutique. En parallèle, ce même protocole a été réalisé sur des souris SWISS immunocompétentes (Centre d'élevage - Etablissement Janvier, France). Les souris hébergées dans des cages stériles ont été infectées par gavage de 500 μl d'une suspension de levures (2.107 cfu.mT1). Cette quantité de levure est suffisante pour établir des candidoses orogastrointestinales chez toutes les souris.
Des doses pharmacologiques de 15d-PGJ2 (0,01 μmoles) ou de rosiglitazone (0,1 μmoles) ont été injectées par voie intra-péritonéale un jour avant l'infection par C. albicans. Ces injections ont été renouvelées tous les jours durant 5 jours. 2004/096195
25
Les macrophages ont été ensuite recueillis par lavage de la cavité péritonéale des souris infectées traitées, ou non, soit par la 15d-PGJ2 soit par la rosiglitazone. La suspension macrophagique a été ajustée à 10 /ml dans du SFM (GibcoBRL, France) complémenté de glutamine, de pénicilline et de streptomycine et a été distribuée à raison de 1 ml par puits dans les microplaques de 24 puits. Après une incubation de 2 heures à l'étuve à 37°C, 5 % CO2, les cellules non adhérentes ont été éliminées par deux rinçages en PBS. A la suite de ces 2 heures, les tapis cellulaires en monocouches contiennent 95 % de macrophages et sont utilisés en vue d'évaluer leur capacité de phagocytose ainsi que leur capacité à produire des agents oxydants.
Afin d'évaluer la capacité des macrophages à phagocyter C. albicans, une technique basée sur l'incorporation de nucléotides radioactifs (Uracile tritié) au niveau de TARN des levures en voie de multiplication a été réalisée. Les levures pré-marquées sont déposées sur les tapis macrophagiques et mises à incuber à 37°C sous 5 % C02. A l'issue d'une heure d'incubation, la radioactivité des surnageants et des produits de rinçage des puits, ainsi que celle contenue dans les lysats cellulaires obtenus par lyse avec du NaOH (IN) seront mesurées indépendamment. Sachant que la radioactivité mesurée dans le lysat est proportionnelle à la quantité de levures phagocytées et que celle mesurée dans les surnageants" est proportionnelli Tïa quantité de levures externes, le pourcentage de levures phagocytées par rapport à la quantité de levures totales sera déterminé selon la formule suivante :
dpmiysat % Phagocytose = dpmlysat + dpnisurnageant
Afin d'évaluer la production d'agents oxydants (radicaux libres oxygénés et monoxyde d'azote) par les macrophages après la mise en culture des macrophages, les activités conjointes de la NADPH oxydase et de la NOsynthase inductible sont mesurées par chimiluminescence en présence d'une sonde chimiluminogène, Luminol (SIGMA, France) : 5-amino2,3-diydro-l,4- phtalazine-dione. La production de chimiluminescence sera analysée avec un luminomètre (Wallac Victor II, Finlande) piloté par un ordinateur. Le luminol permet, en présence d'agents oxydants, l'émission de photons captés par le photomultiplicateur de la chambre noire du luminomètre thermostaté à 37°C et transformés en impulsions électriques quantifiables. Les valeurs de chimiluminescence seront enregistrées continuellement pendant 1 heure après incubation des cellules avec le luminol (66 μM) et en présence ou non de levures.
Pour le MMR, les macrophages des souris infectées par C. albicans et traitées ou non in vivo, soit par la 15d-PGJ2 soit par la rosiglitazone, ont été recueillis par lavage de la cavité péritonéale de ces souris. La suspension est ajustée à 106/ml dans du SFM et mise à incuber pendant 1 heure à 4°C avec de l'albumine bovine mannosylée (mBSA) marquée à la fluorescéine (14 μM). La quantité de molécule de mBSA fixée, reflet directrde" la quantité de récepteurs mannose présente sur les cellules, a été analysée à l'aide d'un cytomètre en flux (FACScalibur, Becton Dickinson).
Par la suite, il a été établi que les traitements des souris par les ligands agonistes de PPARγ modifiaient l'infection candidosique au niveau de plusieurs organes (œsophage, estomac, caecum, reins, foie). Pour ce faire, après infection par C. albicans, les souris SWISS et RAG-2 ont été traitées par la 15d-PGJ2 ou par la rosiglitazone, comme précédemment décrit. En cours et en fin d'expérimentation, des prélèvements sanguins ont été effectués afin de suivre la présence des levures dans le sang des souris. Aucun échantillon n'a montré la présence de levures dans le sang, signifiant ainsi qu'il n'y a eu aucune dissémination de l'infection fongique. Au terme du protocole, les souris ont été euthanasiées et les différents organes ont été prélevés stérilement en vue de quantifier le nombre de levures présentes dans les différents organes par CFU et PCR quantitative en temps réel.
Pour quantifier le nombre de levures présentes dans les différents organes par CFU, après homogénéisation de chaque tissu, plusieurs dilutions sont réalisées et ensemencées dans des boîtes de culture. Les boîtes sont incubées à 35°C pendant 24 à 48 heures et le nombre de colonies est alors compté. Pour quantifier le nombre de levures présentes dans les différents organes par PCR, après homogénéisation des différents organes, l'ADN total est extrait par la méthode phénol/chloroforme et soumis à une Q-PCR en temps réel. La quantification d'ADN de C. albicans est réalisée sur automate LightCycler (ROCHE MOLECULAR BlOCHEMICALS, Suisse). Les amorces utilisées ont été choisies sur les régions conservées du gène codant pour l'ARNr 18S fongique. La détection se fait par hybridation de deux sondes marquées spécifiques de C. albicans (transfert de fluorescence).
Essai 8 : Stimulation de la phagocytose de C. albicans et de la production d'agents oxydants des macrophages par un traitement in vivo par la 15d-PGJ2.
L'étude a été réalisée sur des souris immunocompétentes ou immunodéficientes de type RAG-2, (souris qui possèdent un déficit combiné sévère de l'immunité à médiation cellulaire et humorale, n'ont pas de lymphocytes B et T) traitées ou non, soit par le 15d-PGJ2 soit par la rosiglitazone, puis infectées par C. albicans (culture, par la technique radiométrique, face à un challenge d'une heure avec C. albicans, dans un rapport 1:1).
Le tableau 5, ci-après, fait état de la capacité de phagocytose des macrophages péritonéaux prélevés sur des souris SWISS ou RAG-2 infectées par C. albicans, traités ou non in vivo par la 15d-PGJ2. Les résultats présentés dans ce tableau montrent que les macrophages extraits des souris SWISS et des souris RAG-2, traitées in vivo, soit par la 15d-PGJ2 soit par la rosiglitazone, présentent une capacité de phagocytose beaucoup plus importante que les macrophages extraits des souris non traitées in vivo (contrôle). Ainsi, l'administration par voie intra- péritonéale de la 15d-PGJ2 ou de la rosiglitazone augmente la capacité des macrophages à internaliser C. albicans.
Figure imgf000028_0001
Tableau 5
La capacité des macrophages à produire des agents oxydants a été ensuite déterminée, ainsi que la modulation de cette production par le traitement in vivo avec de la 15d-PGJ2 ou de la rosiglitazone. L'évaluation de la production d'agents oxydants par les macrophages, en présence ou en absence de la levure, a été déterminée sur des macrophages en culture par la technique de chimiluminescence. La figure 7 expose les résultats obtenus, en nombre de coups secondes (C x S) comptabilisés pendant 1 heure, pour chaque test.
La figure 7 montre que les macrophages extraits des souris SWISS et RAG-2, traitées in vivo par la 15d-PGJ2 produisent la même quantité basale d'agents oxydants que les macrophages extraits des souris contrôles. Le traitement des souris avec la 15d-PGJ2 n'induit donc pas une augmentation de la production des agents oxydants par les macrophages. Néanmoins, l'ajout des levures augmente- la production d'agents oxydants.
Essai 9 : Amplification de l'expression des récepteurs mannose par un traitement in vivo avec la 15d-PGJ2 ou avec la rosiglitazone.
Comme le récepteur mannose est impliqué dans la phagocytose de nombreux micro-organismes pathogènes comme en particulier
C. albicans, l'expression de ce récepteur à la surface des macrophages extraits des souris traitées in vivo, par la 15d-PGJ2 ou par la rosiglitazone, a été étudiée par cytométrie en flux.
La figure 8 montre que la quantité d'albumine bovine mannosylée marquée à la fluorescéine présente sur les macrophages est sigmficativement augmentée quand les cellules sont extraites des souris traitées in vivo par la 15d-PGJ2 ou par la rosiglitazone. Ceci suggère que le traitement des souris SWISS et RAG-2, avec la 15d-PGJ2 ou avec la rosiglitazone, induit une augmentation de l'expression des récepteurs mannose à la surface des macrophages. La figure 9 montre que l'induction du récepteur mannose par les ligands de PPARγ est largement diminuée dans des souris ayant un allèle nul pour le gène de ce récepteur nucléaire (souris hétérozygotes, PPARγ+/") par rapport aux souris homozygotes (PPARγ+/+). Ainsi, l'effet des ligands de PPARγ est plus efficace sur des souris qui expriment le gène de PPARγ sur les deux allèles du chromosome ce qui suggère le rôle de PPARγ dans l'expression du récepteur mannose in vivo. L'analyse de régression des résultats exposés à la figure 8 et au tableau 5 indique une association linéaire entre la quantité de MMR à la surface des macrophages et la capacité de phagocytose de ces cellules après traitement des souris, par la 15d-PGJ2 ou par la rosiglitazone. Ceci démontre donc une vraie corrélation entre l'expression des récepteurs mannose influencée par les traitements et la capacité de ces cellules à internaliser C. albicans.
Essai 10 : Diminution de l'infection candidosique par un traitement in vivo avec la 15d-PGJ2 ou avec la rosiglitazone.
Dans une deuxième étape, il a été établi que les traitements modifiaient l'infection candidosique au niveau de plusieurs organes (œsophage, estomac, caecum, reins, foie). Pour ce faire, après infection par C. albicans, les souris SWISS et RAG-2 ont été traitées soit par la 15d-PGJ2 soit par la rosiglitazone. En cours et en fin d'expérimentation, des prélèvements sanguins ont été effectués afin de suivre la présence des levures dans le sang des souris. Aucun échantillon n'a montré la présence de levures dans le sang, signifiant ainsi qu'il n'y a eu aucune dissémination de l'infection fongique. Au terme du protocole, les souris ont été euthanasiées et les différents organes ont été prélevés stérilement en vue de quantifier le nombre de levures présente dans les différents organes par CFU et PCR quantitative en temps réel. Les résultats obtenus sur l'œsophage (Œs.), l'estomac (St.), et le caecum (Cas.), sont présentés à la figure 10.
Les deux techniques de quantification du nombre de levures montrent une diminution significative de la colonisation des différents organes chez les souris traitées, soit par la 15d-PGJ2 soit par la rosiglitazone, par rapport aux souris non traitées (C). Au niveau du foie et des reins, aucune colonisation par la levure n'est observée montrant ainsi une absence de dissémination de l'infection fongique.

Claims

REVENDICATIONS 1/ Procédé de fabrication d'une composition thérapeutique destinée au traitement préventif ou curatif d'une pathologie appartenant au groupe des pathologiës induites par des micro-organismes, d'origine bactérienne, fongique ou protozoaire, qui ont, sur la face extérieure de leurs parois, des polysaccharides et/ou des lipopolysaccharides ayant à leurs extrémités libres des motifs mannosylés et/ou fucosylés -à l'exception de Mycobacterium avium-, caractérisé en ce qu'on utilise une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un ligand agoniste du récepteur nucléaire PPARγ à titre de facteur d'induction et/ou d'amplification de l'expression des récepteurs mannose des macrophages.
2/ Procédé de fabrication d'une composition thérapeutique selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits micro-organismes sont choisis parmi : Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, Pseudomonas aeruginosas, Legionella pneumophilla.
3/ Procédé de fabrication d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'au moins un des ligands agonistes de PPARγ est choisi parmi le groupe des ligands naturels : la 15d-PGJ2, les prostaglandines Al et D2, les acides 9- et 13-hydoxyoctadécanoïques, les dérivés des LDL oxydées.
4/ Procédé de fabrication d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'au moins un des ligands agonistes de PPARγ est choisi parmi le groupe des ligands synthétiques : la troglitazone, la rosiglitazone, la pioglitazone, la ciglitazone, l'englitazone, le GW 347845, le KRP-297, le JTT-501β, le SB 213068, le GI 262570, le GW 1929, le GW 7845, le GW 0207, le L-796449, l'indométhacine et l'ibuprofène.
5/ Procédé de fabrication d'une composition thérapeutique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite composition thérapeutique est destinée à la médication de sujets immunodéprimés. 6/ Procédé de stimulation de l'expression de récepteurs mannose de macrophages dans lequel, on traite, par une quantité efficace d'au moins un ligand agoniste de PPARγ, un milieu biologique comprenant des macrophages.
Il Procédé de stimulation selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'au moins un des ligands agonistes de PPARγ est choisi parmi le groupe des ligands naturels : la 15d-PGJ2, les prostaglandines Al et D2, les acides 9- et 13-hydoxyoctadécanoïques, les dérivés des LDL oxydées.
8/ Procédé de stimulation selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'au moins un des ligands agonistes de PPARγ est choisi parmi le groupe des ligands synthétiques : la troglitazone, la rosiglitazone, la pioglitazone, la ciglitazone, l'englitazone, le GW 347845, le KRP-297, le JTT-501β, le SB 213068, le GI 262570, le GW 1929, le GW 7845, le GW 0207, le L-796449, l'indométhacine et l'ibuprofène.
9/ Procédé de stimulation selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que ledit milieu biologique contenant des macrophages correspond à un milieu intracorporel d'un patient.
10/ Procédé de stimulation selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'on traite un milieu biologique extra-corporel.
11/ Procédé de stimulation selon la revendication 10, caractérisé en ce que les macrophages dudit milieu biologique sont préparés à partir d'un prélèvement sanguin d'un patient, puis sont traités avec une quantité efficace d'au moins un ligand agoniste de PPARγ, avant d'être réinjectés à ce même patient.
12/ Procédé de stimulation selon l'une des revendications 9 ou 11, caractérisé en ce que ledit patient est atteint de déficits immunitaires. 13/ Procédé de stimulation selon l'une des revendications 9,
11 ou 12, caractérisé en ce que ledit patient est soumis à un traitement préventif ou curatif d'une pathologie induite par des micro-organismes, d'origine bactérienne, fongique ou protozoaire, qui ont sur la face extérieure de leurs parois des polysaccharides et/ou des lipopolysaccharides ayant à leurs extrémités libres des motifs mannosylés et/ou fucosylés. 14/ Procédé de stimulation selon la revendication 13, caractérisé en ce que lesdits micro-organismes sont choisis parmi : Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, Pseudomonas aeruginosas, Legionella pneumophilla.
15/ Procédé d'élimination de micro-organismes, d'origine bactérienne, fongique ou protozoaire, ayant, sur la face extérieure de leurs parois des polysaccharides et/ou lipopolysaccharides avec des extrémités libres mannosylés et/ou fucosylés, caractérisé en ce qu'on place, dans un milieu infecté par lesdits micro-organismes et au contact de macrophages, une quantité efficace d'au moins un ligand agoniste de PPARγ à titre de facteur d'induction et/ou d'amplification de l'expression des récepteurs mannose des macrophages.
16/ Procédé d'élimination selon la revendication 15, caractérisé en ce que lesdits micro-organismes sont choisis parmi : Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, Pseudomonas aeruginosas, Legionella pneumophilla. 17/ Procédé d'élimination selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce qu'au moins un des ligands agonistes de PPARγ est choisi parmi le groupe des ligands naturels : la 15d-PGJ2, les prostaglandines Al et D2, les acides 9- et 13-hydoxyoctadécanoïques, les dérivés des LDL oxydées.
18/ Procédé d'élimination selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisé en ce qu'au moins un des ligands agonistes de PPARγ est choisi parmi le groupe des ligands synthétiques : la troglitazone, la rosiglitazone, la pioglitazone, la ciglitazone, l'englitazone, le GW 347845, le KRP-297, le JTT-501β, le SB 213068, le GI 262570, le GW 1929, le GW 7845, le GW 0207, le L-796449, l'indométhacine et l'ibuprofène. 19/ Procédé de traitement curatif d'une pathologie induite par des micro-organismes, d'origine bactérienne, fongique ou protozoaire, qui ont, sur la face extérieure de leurs parois, des polysaccharides et/ou des lipopolysaccharides avec à leurs extrémités libres des motifs mannosylés et/ou fucosylés, dans lequel on favorise une élimination dudit micro-organisme par une reconnaissance de l'antigène médiée par les récepteurs mannose des macrophages dont l'expression a été induite et/ou a été amplifiée par un ligand agoniste de PPARγ.
20/ Procédé de traitement curatif selon la revendication 19, caractérisé en ce que lesdits micro-organismes sont choisis parmi : Streptococcus pneumoniae, Klebsellia pneumoniae, Ciyptococcus neoformans, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Leishmania donovani, Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzi, Aspergillus fumigatus, Pseudomonas aeruginosas, Legionella pneumophilla.
21/ Procédé de traitement curatif selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce qu'on met en œuvre un procédé de stimulation selon l'une des revendications 6 à 14.
22/ Procédé de traitement curatif selon l'une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce qu'on met en œuvre un procédé d'élimination selon l'une des revendications 15 à 18.
23/ Procédé de traitement curatif selon l'une des revendications 19 à 22, caractérisé en ce qu'on utilise une composition thérapeutique fabriquée conformément à un procédé selon l'une des revendications l à 5.
PCT/FR2004/001018 2003-04-28 2004-04-27 Utilisation d’agonistes de ppar-gamma comme agents anti-infectieux WO2004096195A2 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE602004028116T DE602004028116D1 (de) 2003-04-28 2004-04-27 Verwendung von ppar-gamma-agonisten als mittel gegen infektionen
EP04742585A EP1628646B1 (fr) 2003-04-28 2004-04-27 Utilisation d'agonistes de ppar-gamma comme agents anti-infectieux

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR03/05188 2003-04-28
FR0305188A FR2854078B1 (fr) 2003-04-28 2003-04-28 Procede de fabrication d'une composition therapeutique immuno-stimulante.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2004096195A2 true WO2004096195A2 (fr) 2004-11-11
WO2004096195A3 WO2004096195A3 (fr) 2005-03-24
WO2004096195A8 WO2004096195A8 (fr) 2005-09-01

Family

ID=33104447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2004/001018 WO2004096195A2 (fr) 2003-04-28 2004-04-27 Utilisation d’agonistes de ppar-gamma comme agents anti-infectieux

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1628646B1 (fr)
DE (1) DE602004028116D1 (fr)
FR (1) FR2854078B1 (fr)
WO (1) WO2004096195A2 (fr)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8722710B2 (en) 2007-09-26 2014-05-13 Deuterx, Llc Deuterium-enriched pioglitazone
WO2014152843A1 (fr) 2013-03-14 2014-09-25 Deuterx, Llc 2,4-thiazolidinediones enrichies en deutérium et méthodes de traitement
ES2831326T3 (es) 2014-01-15 2021-06-08 Poxel Sa Métodos para tratar trastornos neurológicos, metabólicos y otros mediante el uso de pioglitazona enantiopura enriquecida con deuterio
WO2016153952A1 (fr) * 2015-03-20 2016-09-29 Deuterx, Llc Méthodes de traitement d'infections bactériennes et d'infections fongiques à l'aide de pioglitazone enrichie en deutérium énantiopure
US11767317B1 (en) 2020-06-30 2023-09-26 Poxel Sa Methods of synthesizing enantiopure deuterium-enriched pioglitazone
US11319313B2 (en) 2020-06-30 2022-05-03 Poxel Sa Crystalline forms of deuterium-enriched pioglitazone

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998057631A1 (fr) * 1997-06-18 1998-12-23 The General Hospital Corporation UTILISATION D'AGONISTES DE PPARη POUR INHIBER LA PRODUCTION DE CYTOKINE INFLAMMATOIRE
WO2001028532A2 (fr) * 1999-10-19 2001-04-26 Kain Kevin C Procedes et compositions pour prevoir, diagnostiquer et traiter la lipodystrophie
GB2373725A (en) * 2001-03-30 2002-10-02 Novartis Ag Use of a PPAR gamma agonist in the production of a medicament for the prevention or treatment of diseases associated with IL-10 production
WO2002080956A2 (fr) * 2001-04-04 2002-10-17 Centre Hospitalier Et Universitaire De Lille Utilisation de composes modulant l'activite de l'heterodimere rxr-ppar a titre de medicament pour le traitement de l'hepatite c
WO2002089790A1 (fr) * 2001-05-03 2002-11-14 Cornell Research Foundation, Inc. Traitement de maladies causees par le papillomavirus humain (hpv)
WO2003059271A2 (fr) * 2002-01-14 2003-07-24 Pharmacia Corporation Compositions et procedes de traitement comprenant des agonistes gamma du recepteur active du proliferateur du peroxysome et des inhibiteurs selectifs de la cyclooxygenase 2.

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998057631A1 (fr) * 1997-06-18 1998-12-23 The General Hospital Corporation UTILISATION D'AGONISTES DE PPARη POUR INHIBER LA PRODUCTION DE CYTOKINE INFLAMMATOIRE
WO2001028532A2 (fr) * 1999-10-19 2001-04-26 Kain Kevin C Procedes et compositions pour prevoir, diagnostiquer et traiter la lipodystrophie
GB2373725A (en) * 2001-03-30 2002-10-02 Novartis Ag Use of a PPAR gamma agonist in the production of a medicament for the prevention or treatment of diseases associated with IL-10 production
WO2002080956A2 (fr) * 2001-04-04 2002-10-17 Centre Hospitalier Et Universitaire De Lille Utilisation de composes modulant l'activite de l'heterodimere rxr-ppar a titre de medicament pour le traitement de l'hepatite c
WO2002089790A1 (fr) * 2001-05-03 2002-11-14 Cornell Research Foundation, Inc. Traitement de maladies causees par le papillomavirus humain (hpv)
WO2003059271A2 (fr) * 2002-01-14 2003-07-24 Pharmacia Corporation Compositions et procedes de traitement comprenant des agonistes gamma du recepteur active du proliferateur du peroxysome et des inhibiteurs selectifs de la cyclooxygenase 2.

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAYES M. M. ET AL.: "Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists inhibit HIV-1 replication in macrophages by transcriptional and post-transcriptional effects." J. BIOL. CHEM., vol. 277, no. 19, 10 mai 2002 (2002-05-10), pages 16913-16919, XP002275557 *
PICA F ET AL: "12-PROSTAGLANDIN J2 IS A POTENT INHIBITOR OF INFLUENZA A VIRUS REPLICATION" ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 44, no. 1, janvier 2000 (2000-01), pages 200-204, XP002909741 ISSN: 0066-4804 *
SKOLNIK P.R. ET AL.: "Stimulation of peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma blocks HIV-1 production in acutely infected primary blood cells, chronically infected U1 cells, alveolar macrophages from HIV-infected subjects." JAIDS, vol. 31, 1 septembre 2002 (2002-09-01), pages 1-10, XP009028634 *
VAMECQ J ET AL: "Medical significance of peroxisome proliferator-activated receptors" LANCET, XX, XX, vol. 354, no. 9173, 10 juillet 1999 (1999-07-10), pages 141-148, XP004266618 ISSN: 0140-6736 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004096195A3 (fr) 2005-03-24
FR2854078B1 (fr) 2008-01-11
WO2004096195A8 (fr) 2005-09-01
EP1628646A2 (fr) 2006-03-01
FR2854078A1 (fr) 2004-10-29
DE602004028116D1 (de) 2010-08-26
EP1628646B1 (fr) 2010-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Küng et al. Different mechanisms of endothelial dysfunction with aging and hypertension in rat aorta
Bai et al. Novel anti-inflammatory action of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside with protective effect in dextran sulfate sodium-induced acute and chronic colitis
FR2877350A1 (fr) IDENTIFICATION ET UTILISATION DE miRNAs IMPLIQUES DANS LA DIFFERENCIATION DE CELLULES ISSUES D'UNE LEUCEMIE MYELOIDE
Noorian et al. Pyomelanin produced by Vibrio cholerae confers resistance to predation by Acanthamoeba castellanii
Pohl Recent advances and opportunities in the study of Candida albicans polymicrobial biofilms
WO2014082773A1 (fr) Utilisation de microorganismes pour diminuer le taux de triméthylamine dans une cavité du corps humain, notamment pour le traitement de la triméthylaminurie ou d'une vaginose bactérienne et la prévention des maladies cardiovasculaires
US10869834B2 (en) Treatment of inflammatory bowel disease
Srimaneepong et al. Efficacy of low‐molecular weight chitosan against Candida albicans biofilm on polymethyl methacrylate resin
EP1628646B1 (fr) Utilisation d'agonistes de ppar-gamma comme agents anti-infectieux
Kang et al. Myeloid cell expression of LACC1 is required for bacterial clearance and control of intestinal inflammation
EP3897682B1 (fr) Souche de levure saccharomyces cerevisiae pour le traitement et/ou la prévention de candidoses oropharyngées
Choudhury et al. Expression of inducible nitric oxide synthase and nitric oxide production in the mud-dwelled air-breathing singhi catfish, Heteropneustes fossilis under condition of water shortage
Tsutsumi-Arai et al. Inhibitory effect of 405-nm blue LED light on the growth of Candida albicans and Streptococcus mutans dual-species biofilms on denture base resin
US20090123512A1 (en) Quorum Sensing Modulators
WO2011020957A1 (fr) Composition alimentaire antibacterienne
TWI569802B (zh) 氧化鐵奈米粒子於抑制困難梭狀芽孢桿菌之孢子發芽的用途
Shetty et al. Dental Microbial Biofilms: Control and Treatment Through Nanotechnology Approaches
CN108685911B (zh) 2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮在制药中的应用
Nadirah et al. The Effect of Heat Stress on the Oxidative Status of Red Hybrid Tilapia (Oreochromis sp.) Infected With Streptococcus Agalactiae.
EP3930741A1 (fr) Utilisation de peptides cycliques fongiques de type destruxine comme agents antibactériens actifs contre clostridium perfringens
FR3094207A1 (fr) Utilisation de la gentamicine pour inhiber/ empecher la formation de biofilm
EP1523312A1 (fr) Elevation du taux d' heme oxygynase avec des derives de la rheine
EP3979834B1 (fr) Composition comprenant une levure pour la prevention de la cystite simple et/ou recidivante
FR3008317A1 (fr) Utilisation de microorganismes pour diminuer le taux de trimethylamine dans une cavite du corps humain, notamment pour le traitement de la trimethylaminurie ou d'une vaginose bacterienne et la prevention des maladies cardiovasculaires
Dingsdag METABOLISM OF A DEUTEROPORPHYRIN-NITROIMIDAZOLE ADDUCT BY GASTROINTESTINAL BACTERIA

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
CFP Corrected version of a pamphlet front page

Free format text: UNDER (54) PUBLISHED TITLE REPLACED BY CORRECT TITLE; UNDER (57) PUBLISHED ABSTRACT REPLACED BY CORRECT ABSTRACT

CFP Corrected version of a pamphlet front page

Free format text: UNDER (57) PUBLISHED ABSTRACT REPLACED BY CORRECT ABSTRACT

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004742585

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004742585

Country of ref document: EP

DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)