WO2004089068A1 - Semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol - Google Patents

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Leonardo Velasco Varo
José M. FERNÁNDEZ MARTÍNEZ
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    • A01H6/1464—Helianthus annuus [sunflower]

Definitions

  • the invention is part of the agriculture sector, in the case of seeds with a high delta-tocopherol content.
  • the oil extracted from the seeds has great oxidative stability and is optimal for food and industrial uses (biofuels and lubricants). This oil and its by-products can be used for delta-tocopherol extraction, with numerous applications in the food, cosmetic and pharmaceutical industries.
  • Tocopherols are the main natural compounds with antioxidant properties present in seed oils. Being fat-soluble, they pass into the oil during the extraction process and exert an important antioxidant activity, both in packaged oil and in foods that contain vegetable oil (FB Padley et al., 1994; Occurrence and characteristics of oils and fats. The Lipid Handbook, ed. FD Gunstone, JL Har ood and FB Padley, London: Chapman & Hall, pp 47-223).
  • tocopherols that exist (alia-, beta-, gamma-, and delta-tocopherol)
  • the maximum antioxidant activity in vitro that is, outside the human organism, corresponds to beta-, gamma-, and delta- tocopherol
  • alpha-tocopherol has significantly lower in vitro activity than the other three tocopherols (G. Pongracz et al., Tocopherole, Antioxidanten der Natur. Fat Science and Technology 97: 90-104, 1995).
  • Standard sunflower seeds have a fraction of tocopherols dominated by alpha-tocopherol, which represents approximately 95% of the total tocopherols, the rest being made up of beta-tocopherol and gamma-tocopherol, which are present in proportions below 5% of total tocopherols (FB Padley et al., 1994, cited work). Due to the predominance of alpha-tocopherol in sunflower seeds, its oil has less protection against oxidation than other vegetable oils extracted from seeds that contain higher proportions of beta-, gamma-, and / or delta-tocopherol , which exert a greater antioxidant activity in vitro. Table 1 presents the tocopherol composition of the main seed oils. Table 1
  • beta-tocopherol Average content in beta-tocopherol.
  • LG-15 is developed in Russia (Y Demurin, 1993, cited work), while the second, called T589, was developed in Spain (L. Velasco et al., In press, cited work).
  • One of the objects of the present invention are sunflower seeds with high delta-tocopherol content, which present between 26% and 80% of the total tocopherols in the form of delta-tocopherol, and the following contents of other tocopherols: between 0.5% and 45% of the total tocopherols in the form of alpha-tocopherol; between 0% and 60% of the total tocopherols in the form of beta-tocopherol; between 0% and 70% of the total tocopherols in the form of gamma-tocopherol.
  • Some of these seeds have a delta-tocopherol content always above 50%, 65% and 75% of the total tocopherols in the seeds.
  • the high delta-tocopherol character of sunflower seeds is inheritable (being self-fertilized) and they are expressed stably, regardless of environmental conditions.
  • Another object of the present invention is sunflower oil extracted from these seeds, by any method, and which naturally presents, without any external addition, a high delta-tocopherol content (26-80% of the total tocopherols in the form of delta-tocopherol).
  • Another object of the present invention is sunflower plants (Helianthus annuus L.) which, when self-fertilized, produce seeds that have a high delta-tocopherol content (26-80% of the total tocopherols).
  • the present invention relates to a sunflower germplasm (Helianthus annuus L.) characterized by having a high delta-tocopherol content in the seeds.
  • This tocopherol represents between 26% and 80% of the total tocopherols in the seeds.
  • These high levels of delta-tocopherol are not produced in nature by sunflower plants and have been obtained through a complex process consisting of two cycles of artificial induction of mutations followed by identification of mule plants and fixation of the mutated character.
  • the high delta-tocopherol content object of the present invention is inheritable and is always produced independently of the culture conditions.
  • the first process of mutagenesis or artificial induction of mutations consisted in the treatment of seeds of a standard variety of sunflower with a product with mutagenic properties, that is, capable of inducing mutations in the DNA of the plant. Due to the low frequency of expected mutations in the genes responsible for the biosynthetic pathway of tocopherols after mutagenic treatment, this was followed by a process of non-destructive analysis of the composition in tocopherols in several thousand individual seeds.
  • the mutations detected In order for the mutations detected to be of commercial utility, they must be inheritable and must be expressed independently of the environmental conditions under which They grow the plants. For this reason, a selection process was carried out to fix the imitating characters and verify their stability under different environmental conditions. After this process, several of the initially detected mutations were discarded, while an imitant with high gamma-tocopherol content (95% of the total tocopherols present in the seeds) was fixed. This mutant, called IAST-1, was shown to respond to a different genetic base than other lines with high gamma-tocopherol content.
  • Sunflower seeds of the Peredovik population variety with a composition in tocopherols in the seeds consisting of 96% alpha-tocopherol, 3% beta-tocopherol, and 1% gamma-tocopherol, were embedded for 4 hours in distilled water, at a temperature of 20 ° C. After this time, the seeds were transferred to a solution of the ethyl methylsulphonate mutagenic agent (EMS) with a 70 mM concentration in 0.1M phosphate buffer at pH 7.0 for 2 hours, maintaining a constant stirring of 60 rpm. After the mutagenic treatment, the seeds (Mi generation) were washed for 16 hours with running water and subsequently sown in the field.
  • EMS ethyl methylsulphonate mutagenic agent
  • Mi plants were harvested individually and their seeds (M 2 generation) were analyzed individually for composition in tocopherols by high efficiency liquid chromatography (HPLC), following the protocol developed by F. Goffman et al. (Quantitative determination of tocopherols in single seeds of rapeseed [Brassica napus l_._. Fett / Lipid 101: 142-145, 1999). Of a total of 1080 Mi plants analyzed, one of them presented segregation for high levels of gamma-tocopherol, with a maximum content of 95% of total tocopherols in the form of gamma-tocopherol. Seeds with these levels of gamma-tocopherol produced plants that expressed character uniformly.
  • HPLC high efficiency liquid chromatography
  • Sunflower seeds of the IAST-1 mutant with a composition in tocopherols in the seeds consisting of 5% alpha-tocopherol and 95% gamma-tocopherol, were embedded for 4 hours in distilled water, at a temperature of 20 ° C. After this time, the Seeds were transferred to a solution of the sodium azide mutagenic agent with a 4 mM concentration in 0.1 M sodium citrate buffer at pH 3.0 for 2 hours, maintaining a constant stirring of 60 rpm. After the mutagenic treatment, the seeds (Mi generation) were washed for 16 hours with running water and subsequently sown in the field.
  • Mi plants were harvested individually and their seeds (M 2 generation) were analyzed individually for composition in tocopherols by high efficiency liquid chromatography (HPLC), following the protocol developed by F. GofBnan et al. (cited work).
  • HPLC high efficiency liquid chromatography
  • a total of 1240 Mi plants analyzed one of them presented segregation for elevated levels of delta-tocopherol, with a maximum content of 55% of total tocopherols in the form of delta-tocopherol. Seeds with these levels of delta-tocopherol produced plants that expressed the character uniformly, with concentrations of delta-tocopherol between 26% and 80% of the total tocopherols present in the seeds. These levels were maintained in successive generations.
  • the new sunflower mutant line whose seeds produce levels of delta-tocopherol between 26% and 80% of the total tocopherols was called IAST-3.

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Abstract

La presente invención se refiere a semillas de girasol modificadas genéticamente a través de dos ciclos de inducción artificial de mutaciones seguidos en cada caso por procesos de identificación de individuos mutantes que poseen el carácter deseado. Estas semillas se caracterizan por poseer entre el 26% y el 80% de los tocoferoles en forma de delta-tocoferol. Esta elevada producción de delta-tocoferol esta determinada por el genotipo de las semillas, que ha sido modificado con este objetivo, y se produce siempre con independencia de las condiciones de cultivo, tratándose por tanto de un carácter heredable. No existen en la actualidad semillas de girasol que produzcan niveles de delta-tocoferol tan elevados. Las plantas de girasol modificadas genéticamente que al ser autofecundadas producen semillas con niveles elevados de delta-tocoferol y el aceite con elevada concentración natural de delta-tocoferol extraído de sus semillas constituyen asimismo objetos de la presente invención.

Description

TÍTULO
Semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol
SECTOR DE LA TÉCNICA La invención se enmarca en el sector de la agricultura, tratándose de semillas con elevado contenido en delta-tocoferol. El aceite extraído de las semillas posee una gran estabilidad oxidativa y es óptimo para usos alimentarios e industriales (biocombustibles y lubricantes). Este aceite y sus subproductos pueden emplearse para extracción de delta-tocoferol, con numerosas aplicaciones en las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los tocoferoles son los principales compuestos naturales con propiedades antioxidantes presentes en los aceites de semillas. Al ser liposolubles, pasan al aceite durante el proceso de extracción y ejercen una importante actividad antioxidante, tanto en el aceite envasado como en los alimentos que contienen aceite vegetal (F.B. Padley y col., 1994; Occurrence and characteristics of oils and fats. En The Lipid Handbook, ed. F.D. Gunstone, J.L. Har ood y F.B. Padley, London: Chapman & Hall, pp 47-223). De los cuatro tipos de tocoferoles que existen (alia-, beta-, gamma-, y delta-tocoferol), la máxima actividad antioxidante in vitro, es decir, fuera del organismo humano, corresponde a beta-, gamma-, y delta-tocoferol, mientras que alfa-tocoferol presenta una actividad in vitro notablemente inferior a los otros tres tocoferoles (G. Pongracz y col., Tocopherole, Antioxidanten der Natur. Fat Science and Technology 97: 90-104, 1995).
Las semillas de girasol estándar presentan una fracción de tocoferoles dominada por alfa-tocoferol, que representa aproximadamente el 95% del total de tocoferoles, estando el resto constituido por beta-tocoferol y gamma-tocoferol, que se encuentran presentes en proporciones inferiores al 5% del total de tocoferoles (F.B. Padley y col., 1994, obra citada). Debido a la predominancia de alfa-tocoferol en las semillas de girasol, su aceite presenta una menor protección frente a la oxidación que otros aceites vegetales extraídos a partir de semillas que contienen mayores proporciones de beta-, gamma-, y/o delta-tocoferol, que ejercen una mayor actividad antioxidante in vitro. La Tabla 1 presenta la composición en tocoferoles de los principales aceites de semillas. Tabla 1
Composición media en tocoferoles en los principales aceites de semillas
% Tocoferol
Aceite Alfa Beta Gamma Delta
Algodón 43 2 55 0
Cacahuete 44 2 52 2
Colza 26 9 64 1
Cártamo 90 8 2 0
Girasol 95 4 1 0
Lino 1 0 99 0
Maíz 20 3 73 4
Ricino 6 6 23 65
Soja 6 1 66 27
La predominancia de alfa-tocoferol en las semillas de girasol es prácticamente universal, habiéndose descrito únicamente cuatro líneas de girasol que presentan niveles modificados de tocoferoles, y que se pueden agrupar en dos clases:
a) Alto contenido en pamma-tocoferol. Se trata de dos líneas que poseen más del 85% de los tocoferoles en forma de gamma-tocoferol, siendo el resto alfa-tocoferol. Una de ellas, denominada LG-17, fue desarrollada en Rusia (Y. Demurin, Genetic variábiliry of tocopherol composition in sunflower seeds, Helia 16:59-62, 1993), mientras que la segunda fue desarrollada en España y se denominó T2100 (L. Velasco y col., Registration of T589 and T2100 sunflower germplasms with modified tocopherol profiles, Crop Science, en prensa).
b) Contenido medio en beta-tocoferol. Se trata de dos líneas que poseen entre el 30% y el 50% de los tocoferoles de la semilla en forma de beta-tocoferol, siendo el resto alfa- T. Una de ellas, denominada LG-15, fríe desarrollada en Rusia (Y. Demurin, 1993, obra citada), mientras que la segunda, denominada T589, fue desarrollada en España (L. Velasco y col., en prensa, obra citada). Mediante cruzamiento entre las líneas LG-15 y LG-17, investigadores rusos y yugoslavos obtuvieron recombinantes con niveles ligeramente elevados de delta- tocoferol, siendo el máximo nivel obtenido de este tocoferol del 25% de todos los tocoferoles presentes en la semilla (Y. Demurin y col. Genetic variability of tocopherol composition m sunflower seeds as a basis of breeding for improved oil quality. Plant Breeding 115:33-36, 1996). En resumen, los niveles máximos de tocoferoles individuales que existen hoy día en semillas de girasol son: " 95% alfe-tocoferol (composición natural)
• 50% beta-tocoferol " 95% gamma-tocoferol
• 25% delta-tocoferol
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Uno de los objetos de la presente invención son las semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol, que presentan entre el 26% y el 80% del total de tocoferoles en forma de delta-tocoferol, y los siguientes contenidos de otros tocoferoles: entre el 0.5% y el 45% del total de tocoferoles en forma de alfa-tocoferol; entre el 0% y el 60% del total de tocoferoles en forma de beta-tocoferol; entre el 0% y el 70% del total de tocoferoles en forma de gamma-tocoferol. Algunas de estas semillas presentan un contenido en delta-tocoferol siempre superior al 50%, 65% y 75% del total de tocoferoles en las semillas. El carácter de alto contenido en delta-tocoferol de las semillas de girasol es heredable (al ser autofecundadas) y se expresan de forma estable, independientemente de las condiciones ambientales.
Constituye otro objeto de la presente invención el aceite de girasol extraído de estas semillas, por cualquier procedimiento, y que presenta de forma natural, sin ningún tipo de adición externa, un alto contenido en delta-tocoferol (26-80% del total de los tocoferoles en forma de delta-tocoferol).
Asimismo constituye otro objeto de la presente invención las plantas de girasol (Helianthus annuus L.) que al ser autofecundadas producen semillas que presentan un elevado contenido en delta-tocoferol (26-80% del total de los tocoferoles). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un germoplasma de girasol (Helianthus annuus L.) caracterizado por poseer un elevado contenido de delta-tocoferol en las semillas. Este tocoferol representa entre el 26% y el 80% del total de tocoferoles en las semillas. Estos elevados niveles de delta-tocoferol no son producidos en la naturaleza por plantas de girasol y ha sido obtenido mediante un proceso complejo consistente en dos ciclos de inducción artificial de mutaciones seguidos de identificación de plantas mulantes y fijación del carácter mutado. El elevado contenido en delta-tocoferol objeto de la presente invención es heredable y se produce siempre con independencia de las condiciones de cultivo.
Para la obtención de las plantas modificadas genéticamente cuyas semillas poseen una elevada concentración de delta-tocoferol, se ha llevado a cabo un largo proceso de mejora genética dirigido a alterar genéticamente la ruta biosintética de tocoferoles. Este proceso ha consistido en cuatro etapas: (1) Inducción de mutaciones artificiales en semillas de una variedad estándar de girasol; (2) Identificación de individuos con alteraciones en la ruta biosintética de tocoferoles producto de las mutaciones inducidas y fijación de los caracteres imitados; (3) Nuevo proceso de inducción de mutaciones artificiales sobre individuos que ya presentaban un primer nivel de alteración en la ruta de biosíntesis de tocoferoles; (4) Identificación de individuos con alteraciones en la ruta biosintética de tocoferoles diferentes a las alteraciones que presentaban los individuos de partida, seguida de fijación del nuevo carácter imitante.
El primer proceso de mutagénesis o inducción artificial de mutaciones consistió en el tratamiento de semillas de una variedad estándar de girasol con un producto con propiedades mutagénicas, esto es, capaz de inducir mutaciones en el ADN de la planta. Debido a la baja frecuencia de mutaciones esperables en los genes responsables de la ruta biosintética de los tocoferoles tras el tratamiento mutagénico, éste fue seguido de un proceso de análisis no destructivo de la composición en tocoferoles en varios miles de semillas individuales.
Para que las mutaciones detectadas resulten de utilidad comercial, deben ser heredables y deben expresarse con independencia de las condiciones ambientales en las que se cultivan las plantas. Por este motivo, se realizó un proceso de selección conducente a fijar los caracteres imitantes y a verificar su estabilidad bajo diferentes condiciones ambientales. Tras este proceso, varias de las mutaciones inicialmente detectadas fueron descartadas, mientras que un imitante con elevado contenido en gamma-tocoferol (95% del total de los tocoferoles presentes en las semillas) fue fijado. Este mutante, denominado IAST-1, demostró responder a una base genética diferente a la que poseen otras líneas con elevado contenido en gamma-tocoferol. Así, mientras que los cruzamientos de las líneas LG-17 y T2100 con líneas de composición estándar en tocoferoles producen progenies F2 que no segregan para niveles intermedios de gamma- tocoferol (Demurin y col., obra citada; L. Velasco y J.M. Fernández-Martínez, Identification and genetic characterization of new sources of beta- and gamma- tocopherol in sunflower germplasm, Helia, en prensa), las progenies F2 procedentes de cruces entre el mutante IAST-1 y líneas de composición estándar en tocoferoles segregaron ampliamente para niveles intermedios de gamma-tocoferol.
Tras el aislamiento genético del mutante IAST-1, se realizó un segundo proceso de mutagénesis sobre semillas de este mutante, con el objetivo de generar variación adicional para niveles elevados de otros tocoferoles. Este segundo ciclo de mutagénesis estuvo asimismo seguido de un proceso analítico a gran escala para identificación de imitantes, así como de un proceso de fijación de imitantes y confirmación de su expresión con independencia de las condiciones de cultivo. En este segundo ciclo de mutagénesis se identificó y fijó el mutante objeto de la presente invención, que se caracteriza porque sus semillas contienen elevadas concentraciones de delta-tocoferol, comprendidas entre el 26% y el 80% del total de tocoferoles en las semillas. Esta elevada proporción de delta-tocoferol en las semillas es un carácter heredable y se expresa de forma estable independientemente de las condiciones de cultivo de las plantas. MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Primer ciclo de mutagénesis
Semillas de girasol de la variedad población Peredovik, con una composición en tocoferoles en las semillas consistente en 96% alfa-tocoferol, 3% beta-tocoferol, y 1% gamma-tocoferol, se embebieron durante 4 horas en agua destilada, a una temperatura de 20 °C. Pasado este tiempo, las semillas se transfirieron a una solución del agente mutagénico metilsulfonato de etilo (EMS) con una concentración 70 mM en tampón fosfato 0.1M a pH 7.0 durante 2 horas, manteniendo una agitación constante de 60 rpm. Tras el tratamiento mutagénico, las semillas (generación Mi) se lavaron durante 16 horas con agua corriente y posteriormente se sembraron en el campo.
Las plantas Mi se cosecharon individualmente y sus semillas (generación M2) se analizaron individualizadamente para composición en tocoferoles mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), siguiendo el protocolo desarrollado por F. Goffman y col. (Quantitative determination of tocopherols in single seeds of rapeseed [Brassica napus l_._. Fett/Lipid 101:142-145, 1999). De un total de 1080 plantas Mi analizadas, una de ellas presentó segregación para niveles elevados de gamma-tocoferol, con un máximo contenido de 95% de los tocoferoles totales en forma de gamma- tocoferol. Semillas con estos niveles de gamma-tocoferol produjeron plantas que expresaron el carácter uniformemente. Al cruzar plantas procedentes de semillas con 95% de gamma-tocoferol con plantas de variedades estándar de girasol, se observó un amplia segregación para contenido en gamma-tocoferol en semillas F2, que incluyó niveles de gamma-tocoferol intermedios entre ambos parentales. Esta segregación tan amplia fue completamente inesperada, debido a que materiales con niveles similares de gamma-tocoferol desarrollados previamente (Demurin y col., obra citada; L. Velasco y J.M. Fernández-Martínez, obra citada) no habían producido segregación para niveles intermedios de gamma-tocoferol tras ser cruzadas con variedades estándar de girasol. El mutante así obtenido se denominó IAST-1.
Segundo ciclo de mutagénesis
Semillas de girasol del mutante IAST-1, con una composición en tocoferoles en las semillas consistente en 5% alfa-tocoferol y 95% gamma-tocoferol, se embebieron durante 4 horas en agua destilada, a una temperatura de 20 °C. Pasado este tiempo, las semillas se transfirieron a una solución del agente mutagénico azida sódica con una concentración 4 mM en tampón 0.1 M citrato sódico a pH 3.0 durante 2 horas, manteniendo una agitación constante de 60 rpm. Tras el tratamiento mutagénico, las semillas (generación Mi) se lavaron durante 16 horas con agua corriente y posteriormente se sembraron en el campo.
Las plantas Mi se cosecharon individualmente y sus semillas (generación M2) se analizaron individualizadamente para composición en tocoferoles mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), siguiendo el protocolo desarrollado por F. GofBnan y col. (obra citada). De un total de 1240 plantas Mi analizadas, una de ellas presentó segregación para niveles elevados de delta-tocoferol, con un máximo contenido de 55% de los tocoferoles totales en forma de delta-tocoferol. Semillas con estos niveles de delta-tocoferol produjeron plantas que expresaron el carácter uniformemente, con concentraciones de delta-tocoferol comprendidas entre el 26% y el 80% del total de tocoferoles presentes en las semillas. Estos niveles se mantuvieron en sucesivas generaciones. La nueva línea mutante de girasol cuyas semillas producen niveles de delta-tocoferol comprendidos entre el 26% y el 80% del total de tocoferoles se denominó IAST-3.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol, caracterizadas porque poseen entre el 26% y el 80% del total de tocoferoles en forma de delta-tocoferol.
2.- Semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol según la reivindicación 1, caracterizadas porque presentan los siguientes contenidos de otros tocoferoles: entre el 0.5% y el 45% del total de tocoferoles en forma de alfa-tocoferol; entre el 0% y el 60% del total de tocoferoles en forma de beta-tocoferol; entre el 0% y el 70% del total de tocoferoles en forma de gamma-tocoferol.
3.- Semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizadas porque el contenido en delta-tocoferol es siempre superior al 50% del total de tocoferoles en las semillas.
4.- Semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol según la reivindicación 3, caracterizadas porque el contenido en delta-tocoferol es siempre superior al 65% del total de tocoferoles en las semillas.
5.- Semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol según la reivindicación 4, caracterizadas porque el contenido en delta-tocoferol es siempre superior al 75% del total de tocoferoles en las semillas.
6.- Semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol según las reivindicaciones 1-5, caracterizadas porque al ser sometidas a cualquier procedimiento de extracción de aceite producen un aceite que contiene entre un 26% y un 80% de delta-tocoferol.
7.- Semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol según las reivindicaciones 1-6, caracterizadas porque expresan de forma estable al ser autofecundadas la característica de alto contenido en delta-tocoferol, independientemente de las condiciones ambientales
8.- Aceite de girasol extraído mediante cualquier procedimiento a partir de semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol según las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque posee de forma natural, sin ningún tipo de adición externa, un contenido natural en delta-tocoferol entre 26% y 80% de los tocoferoles totales.
9.- Plantas de girasol (Helianthus annuus L.) que al ser autofecundadas producen semillas que presentan un elevado contenido en delta-tocoferol, según las reivindicaciones 1-7.
PCT/ES2004/070019 2003-04-10 2004-04-07 Semillas de girasol con alto contenido en delta-tocoferol WO2004089068A1 (es)

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