WO2004087909A1 - ２－ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドおよびその応用 - Google Patents

２－ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドおよびその応用 Download PDF

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dehydratase
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Shin-Ichi Ayabe
Tomoyoshi Akashi
Toshio Aoki
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Definitions

  • the present invention catalyzes the dehydration reaction of 3 ⁇ 4 2-hydroxy I soft mule / down 2- hydroxy CHILLY Sofura Bannon dehydratase, novel polynucleotide encoding the same, on the application of ⁇ benefactor.
  • Isoflavones and compounds derived from isoflavones are components unique to legumes and have recently attracted attention as health supplements. Isoflavonoids, including isoflavones, are known to play a crucial role in plants adapting to the biological environment as antibacterials and symbiotic signals. The simplest skeleton of isoflavonoids is isoflavones, a very early product of the isoflavonoid group formed by metabolism of flavonoids
  • Isoflavones and their glycosides accumulate in leguminous plant organs and are found in soybean seeds such as daidzein (7,4'-dihydroxyisoflavone) ⁇ genistin (5,7,4'-trihydroxyisoflavone) ) are known as phytoestrogens (phytoestrogens) that promote health and prevent disease.
  • Isoflavones are intermediates in the biosynthesis of biophysiologically active isoflavonoids, such as the antibacterial phytoalexins with pterocarpan and isoflavane skeletons. Approximately 50% of the isoflavonoids have functional groups derived from 4'-methoxyl, which are mainly found in 4'-methoxylated isoflavone formononetin (7-hydroxy-4'-methoxyisoflavone). Derived from.
  • the isoflavonoid skeleton is synthesized from 2-flavanone by the action of cytochrome P450 (P450) 3 ⁇ 4 , 2-hydroxyisoflavanone synthase (IFS). Is done. IFS catalyzes the hydroxylation of the carbon at position 2 of the flavonoid skeleton with 1,2-aryl rearrangement. The product, 2-hydroxyisoflavanone, is dehydrated to form isoflavones (see Figure 1).
  • Glycyrrhiza echinata (hereafter referred to as Kanzo ⁇ ⁇ ), a GD »U legume plant # 1 of IFS, has been identified from (Non-patent literature ⁇ Patent document 1) and soybean (Non-patent document 2, Non-patent document 3) I have.
  • a large amount of isoflavone was generated by spontaneous dehydration in addition to the initial product, 2-hydroxyisoflapanone (Non-patented).
  • Non-patent literature 3 Non-patent literature 3
  • IFS expressed in insect cells produces only isoflavones (Non-Patent Document 2).
  • isoflavone production can proceed non-enzymatically from the direct product of the IFS reaction, and it is the basis of IFS (2-flavanone is a common component of legumes and non-legumes. From this, it was speculated that by transforming non-leguminous plants containing no isoflavonoids with IFS, they could be converted to isoflavone-producing plants (Non-Patent Document 4, Non-Patent Document 5, Non-patent document 6).
  • Non-Patent Document 11 shows that dehydration of 2-hydroxyisoflavanone to isoflavone in plant cells is an enzyme (2-hydroxyisoflavanone dehydratase). ), Indicating that the enzyme has substrate specificity for 2-hydroxyisoflavanone with different substituents.
  • Non-Patent Document 5 o Nat Acaci.SA 991451453.cld S U788: 1- ygggjp gerlcaidat-ic enien of isofanelcoonus in Arabsis.for meolnivoteo- ..
  • An object of the present invention is to isolate a dehydrase that plays an important role in a process of producing isoflavones in a plant, and to elucidate an amino acid sequence and a nucleotide sequence encoding the same. More specifically, an object of the present invention is to determine the amino acid structure of 2-hydroxyisoflavanone dehydratase that catalyzes a dehydration reaction of 2-hydroxyisoflavanone to isoflavone, and to provide a gene encoding the same. . Still another object of the present invention is to apply the gene thus obtained to the production of isoflavone containing isoflavone.
  • the present inventors first investigated 2-hydroxysoflavanone dehydratase of extracts of canzo (forminonetin-producing plant) and soybean (daidzein-producing plant), and found species-specific dehydration. The presence of the enzyme was confirmed. Next, using the "functional expression fraction screening" new genetic black-learning method concerning cDMA biosynthetic enzyme (Non-patent Document 1 2) 2 3 ⁇ 4 Kanzou, 7-dihydroxy - 4'-methoxy iso flavanone 2, 3 -Dehydratase (formononetin synthase) ODNA encoding was isolated. Furthermore, from the sequence information, a similar enzyme having a different substrate specificity, that is, d) of soybean 2,7,4'-trihydroxyisoflavanone 2,3-dehydratase (daidzein synthase) was obtained.
  • the present invention relates to 2-hydroxyisoflavanone dehydratase contained in Canzo, especially 2,7-dihydroxy-4'-methoxyisoflavanone 2,3-dehydratase (forminonetin synthase) and the same.
  • the present invention relates to a nucleotide sequence encoding 2-Hydroxyisoflavanone dehydratase contained in Canzo contains the amino acid sequence of 1-328 shown in SEQ ID NO: 1.
  • the sequence of cDNA encoding the 2-hydroxyisoflavanone dehydratase of yeast is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also relates to a recombinant expressing the novel gene, and a transformant incorporating the gene.
  • yeast and £ ⁇ ⁇ ⁇ are preferable.
  • the £ co // K12 strain into which the gene has been introduced is an independent strain located at Chuo No. 6 at 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan. Deposited with the Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, under the accession number FE ⁇ ⁇ -19257 (deposit: March 20, 2003). It was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on March 15, 2004, and given the accession number FERM ⁇ -08662.
  • the present invention further provides isoforms by using a microorganism or plant such as yeast or yeast into which the gene or the gene and the gene encoding IFS have been simultaneously incorporated. It also relates to a method for producing isoflavonides containing lavones.
  • Preferred yeast transformed Saccharo yces cerevlsiae BJ2168 strain (- Tsu not Unless they already exist Ichinsha, N ippon Gene Co., Ltd.) pYES2 ( Invitrogen, I nv itrogen Corporat ion) as base Kuta one for 3 ⁇ 4 yeast 3 ⁇ 4 pESG—Europe (Stratagene, Stratagene ⁇ 3 ⁇ 4 pESC-TRP (Stratagene, Stratagene) 3 ⁇ 4 pESG-HIS (Stratagene, Stratagene).
  • the present invention also relates to 2,7,4'-trihydroxyisoflavanone dehydratase (daidzein synthase), which is 2-hydroxyisoflavanone dehydratase contained in soybean, and encodes the same. It also relates to nucleotide sequences.
  • 2-Hydroxyisoflavanone dehydratase contained in soybean is similar to 2-hydroxyisoflavanone dehydratase contained in kanzo, but benzoyl dehydratase uses the 4'-methoxy form of isoflavanone as a substrate. And using the 4'-hydroxy form as a substrate and comprising the amino acid sequence of 1319 shown in SEQ ID NO: 3.
  • the sequence of the cDNA encoding soybean 2-hydroxyisoflavanone dehydratase is shown in SEQ ID NO: 4. Furthermore, the present invention also relates to a recombinant expressing the novel gene and a transformant incorporating the gene.
  • yeast and Escherichia coli are preferable.
  • the £ 1K12 strain, which has been introduced, is deposited under the accession number FERM P-19256 at the Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan. (March 20, 1995). It was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on March 15, 2004, and given the accession number FERM BP-08661.
  • the present invention further relates to a method for producing isoflavonoids containing isoflavones, such as yeast or yeast, and isoflavone-containing isoflavones, in which the gene or the gene and the gene encoding IFS are simultaneously incorporated. It is.
  • ⁇ Lazy mother is SaGGhamj / ces cer ⁇ ei // 's /' se BJ2168 strain, Nippon-One, Nippon Gene Co., Ltd.
  • pYES2 is a yeast vector.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing a production pathway of isoflavonide from flapanone.
  • FIG. 2 is an illustration of the cloning of cDNA encoding 2-hydroxyisoflavanone dehydratase from Canzodia cells.
  • FIG. 3A shows the amino acid sequences of 2-hydroxyisoflavanone dehydratase from Canzo and soybean.
  • FIG. 3B shows a molecular phylogenetic tree of leguminous plant genes such as Candida.
  • FIG. 4 shows the HPLC profile of the 2-hydroxyisoflavanone dehydratase product.
  • FIG. 5 shows an RT-PCR analysis pattern showing gene expression levels.
  • Figure 6 shows the results of incubation of IFS and HIDH co-expressing yeast (upper), IFS-expressing yeast (middle), and control yeast (lower) in a medium containing naringenin.
  • the 2-hydroxyisoflavanone dehydratase protein of Canzodu is H IDM and the gene encoding it is soybean 2-hydroxyisoflavanone dehydratase protein is HIDH and the gene encoding it is / HIDM.
  • H IDM 2-hydroxyisoflavanone dehydratase protein
  • HIDH soybean 2-hydroxyisoflavanone dehydratase protein
  • ZW ZW
  • the present invention relates to 2-hydroxyisoflavanone dehydratase having substantially the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
  • J having an acid sequence substantially means that the amino acid sequence includes mutations such as deletion, substitution, addition and insertion as long as it has 2-hydroxyisoflavanone dehydratase activity.
  • the number of amino acids to be inserted may be, for example, "! -20, preferably 1-10, especially 1-5. There 3 ⁇ 4 typical such substitutions in those substituted with ⁇ Mi J residues of, Ala, between VAU Leu and lie between 3 ⁇ 4 Ser and Thr between Asp and Glu, between Asn Oyopi Gin, between Lys and Arg It is a substitution between Phe and Tyr.
  • the present invention relates to a polynucleotide substantially having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or ⁇ or a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence.
  • "" Means a polynucleotide comprising a sequence encoding 2-hydroxyisoflavanone dehydratase, a sequence difference due to the sequence and degeneracy, an appropriate sequence added to the 5 'end or 3' end or both ends. It is meant to include polynucleotides.
  • 2,7,4'-Trihydroxyisoflapanone (Non-Patent Document 13) and 2,7-dihydric oxy-4'-methoxyisoflavanone (Non-Patent Document 12) were prepared as follows. That is, 2,7,4'-trihydroxyisoflapanone was obtained by incubating yeast microsomal, Liquiritigenin, and DPH expressing GYP93C2 (IFS), extracting with DPH, extracting with ethyl acetate, and silica gel TLC. Separate and further reverse phase HP L Prepared by purifying with C.
  • 2,7-dihydroxy-4'-methoxyisoflavanone is adenosyl-L-methionine (SAM), 2,7,4'-trihydroxyisoflavanone, recombinant 2,7,4'-trihydroxyl-oxy Soflavanone 4'-0- ⁇ tyltransferraze
  • reaction mixture of ( ⁇ 4 ⁇ ) was extracted with ethyl acetate, separated by silica gel TLG, and purified by HPLG.
  • 2,5,7,4'-Tetrahydroxyisoflavanone was prepared by incubation with yeast microsom (Non-Patent Document 1) expressing GYP93G2 and (/?)-Naringenin DPH .
  • Soybean seeds (/ da c // 7e / »medium edible soybeans: Tohoku Ltd.) were immersed in water for 24 hours and spread on filter paper in a conical beaker. Soybean seedlings were grown for 1 week at room temperature with 12 hours light / 12 hours B tone.
  • the solution obtained by filtration was fractionated using ammonium sulfate, the 30% to 80% saturated fraction was desalted with a Sephadex G-25 column, and 100 ml containing 10% sucrose and 14 mM 2-mercaptoethanol. ⁇ Dissolved in potassium phosphate buffer solution (pH 7.5) and used for assay (about protein / ml).
  • the concentrated ethyl acetate extract was incubated with recombinant Kanzo HIDM (1j «g) at 30 ° G for 10 minutes.
  • the ethyl acetate extract of the mixture was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). HPLG for daidzein and formononetin analysis was performed at 40 ° G (flow rate 0.8 ml / min) using a Capcel Ipak C18 MG column (4.6 x 150 Sat; Shiseido Co., Ltd.). 1 2).
  • the elution solvents used were methanol and 3% aqueous acetic acid. Elution was carried out with a linear gradient to 35% to 55% in 40 minutes.
  • 5-Hydroxyisoflavone was prepared using a Capcell pak C18 IMG column (4.6 x 150 mm; Shiseido Go., Ltd.) in a 50% aqueous methanol solution (for genistein) or a 55% aqueous methanol solution (Bionin A). At 40 ° G (flow rate 0.8 ml / min). Purified recombinant protein (approximately 10 ng protein) with Kanzo and soybean
  • the isoflavone concentration was calculated from the peak area of HPLG of a standard sample of daidzein formononetin genistein.
  • Non-Patent Documents 12 Expression of the protein and preparation of a crude extract of Escherichia coli were performed as described previously (Non-Patent Documents 12).
  • Non-patent Document 12 A cDNA expression library (Non-patent Document 12) constructed from Kanzo cells treated with elicitor (6 hours and 12 hours) with a yeast extract was used for screening.
  • the AZapll cDNA library was used in Exassist helper fuzz (Stratagene, Stratagene Corporation) and f, ⁇ 3 ⁇ 43 ⁇ DH5Qf F 'IQ (Invitrogen, Invitrogen Corporation). It was converted into a reference amide by excision.
  • Phagemid was introduced into DH5ofF'lQ, and the cells were grown on Luria-Bertani (LB) / ampicillin (50 ig / ml) agar plates.
  • LB Luria-Bertani
  • ampicillin 50 ig / ml
  • Five independent cDNA fraction pools each containing about 30,000 E. coli transformants in LB / ampicillin culture from the mother plate were prepared.
  • the cells were cultured in an LB liquid medium containing 5 mM IPTG, and the cells were collected to prepare a crude enzyme solution.
  • the [M G] positive pool that generated the Fuorumononechin selected for subsequent screening was fractionated into 10 pools of small size (about 3, 000 clones / Boolean) min. The positive pool was fractionated and assayed four times, and clones showing 2,7-dihydroxy-4'-methoxyisoflavanone dehydratase activity
  • the plasmid was recovered, and the nucleotide sequence was determined using an auto sequencer (LIG-4000, Aloka, Aloka Co., Ltd.).
  • Poly (A) + RNA is isolated from soybean seedlings using the RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Qiagen Ltd.), and the cDNA is ready-to-go T-primed first strand kit.
  • the two PCR-specific primers containing the A site were designed from the coding region of TC98460 of soybean EST that specifies the start and stop codon sequences (TC98-Fow, GTCATATGGCGAAGGAGATAGT6AA (SEQ ID NO: 5); TC98-Rev, AGGGATCCATCAAACGAGAAMGA (SEQ ID NO: 6)).
  • GDNA HIDfl obtained by reverse transcription (RT) -PCR using soybean cDNA as the primer and type I was incorporated into pT7Blue T-vector (Novagen, Novagen Ltd.) and the nucleotide sequence was determined.
  • Two primers containing an Afctel or Ss ⁇ l site were designed from the coding region of Kanzo HI DM (GeDchy-F, GTCATATGGCTTCTTCAACCTCAAC (SEQ ID NO: 7); GeDehy-R, CTGGATCCTGAAAGAAGGAAG6AAG (SEQ ID NO: 8) ).
  • the / tofe ⁇ fragment of the PGR product obtained from Kanzo was cloned into the corresponding site of ET28a (Novagen Ltd.).
  • cloning The Nde ⁇ —BamH fragment of soybean cDNA ( ⁇ HIDH) was also subcloned into the corresponding site of pET28a.
  • Non-Patent Document 1 A vector (pYES-CYP93C2) for expressing IFS (CYP93C2) of Leguminosae campestris in yeast was described in Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 (GYP93G2 gene coding region, yeast expression vector (PYES2, Invitrogen Corporation), incorporated into Kpn ⁇ and EcoR ⁇ sites downstream of GAL1 inducible promoter GAL1).
  • a vector (pESG-HIDH) for expressing soybean 2-hydroxyisoflavanone dehydratase (HIDH) in yeast was prepared as follows.
  • Apa ⁇ two types of primers with a 7 ⁇ site (indicated by underlining) [HIDH-F1 (5'-GGGGCCCGGATCCATGGCGAA66A6ATAGTGAAAG-3 '(SEQ ID NO: 9)), HIDH-R1 (5, -6GGAGCTCGA6TCAAACCAGAAAAGAAGGG-3, No. 10))] was designed from the coding region of soybean 2-hydroxyisoflavanone dehydratase (HIDH).
  • control yeast pYES2 and pESG-Leu were introduced into strain BJ2168)
  • IFS-expressing yeast PYES-CYP93C2 and pESG-Leu were introduced into strain BJ2168)
  • IFS and 2-hydroxyisoflavanone dehydratase co-expressing yeast PYES-GYP93G2 and pESG-HIDH introduced into BJ2168 strain
  • Non-Patent Document 1 Kanzo cells cultured in suspension were treated with yeast extract and collected after 3, 6, 12, 24, and 48 hours.
  • mRMA was extracted using StraightA's mRMA isolation system (Novagen, Novagen Ltd.) to synthesize cDWA.
  • a specific primer designed from Rinzo H rat non-patent document 12) or (non-patent document 12) was used. The reaction is initiated by denaturation at 94 ° G for 1 minute, followed by 30 minutes of incubation (94 ° C, 1 minute; 55 ° C, 1 minute; 72 ° C, 1 minute). The cycle was repeated. The product was electrophoresed on a 1.2% (w / v) agarose gel and stained with bromide titanium. 2 shows the results of the present invention obtained by the above-mentioned materials and methods.
  • Kanzou cells Medical pin after Erishita treatment (4 '- storing methoxy reference iso
  • Flavobacterium isoprenoid Figure 1) 3 ⁇ 4 4' - hydroxyisobutyric hula Po isoprenoid is not an accumulation (. Nakamura et al 1999).
  • Soybean is known to produce daidzein, genistein and glycitin glycosides of isoflavones, all of which are 4'-hydroxylated forms (Dewick 1986, Dewick 1993, Aussenac 1998).
  • extracts of Canzodia cell and soybean seedlings have the activity to form formononetin and daidzein from appropriately substituted 2-hydroxyisoflavanones, respectively.
  • Table 1 shows the results obtained by examining the activity using HPLC.
  • Non-Patent Document 1 [ 14 G] SAM and affinity-purified recombinant Kanzo HI 4'0MT containing 6 histidines at the N-terminal (Non-patent Document 12) were used in combination, M C] -2,7-dihydroxy-4'-methoxyisoflavanone.
  • GD of dehydratase was screened using a cDMA expression library of Kanzo cells treated with a yeast extract (Non-patent Document 12).
  • the cDNA encoding the enzyme was recovered and sequenced using a sequencer.
  • the cDNA of HI DM (2-hydroxyisof I avanone dehydratase methoxy type) had 1,178 bp nucleotides and encoded 328 amino acids (FIG. 3A).
  • Protein-protein BLAST http: ⁇ ww.neb / nIm.nih.gov / BLAST / search showed that the deduced amino acid sequence of HIDM in Kanzo was similar to that of Arabidopsis thai iana (Arabidopsis thaliana).
  • Thr Hypothetical catalytic triads (Thr 173, Asp 272 and His 304) were found outside the lipoxyl esterase motif, although they were substituted for residues.
  • Fig. 3M virtual catalyst triads (Thr 173 3 ⁇ 4 Asp 272 and His 304) are marked with *.
  • the soybean EST sequence TG98460 has the predicted start and stop codons. Cloning the coding region of cDNA from soybean seedlings with RT-PGR,
  • Kanzo / Bunchyo soy / W was expressed in Escherichia coli, a recombinant protein having six histidine residues at the N-terminus was purified, and its activity on 2-hydroxyisoflavanone was measured.
  • formononetin was generated by incubation of Canzopo with 2,7-dihydroxy-4'- ⁇ toxyisoflapanone.
  • the identity of the product (formononetin) is determined by comparing the Rt value with the standard sample. Confirmed by comparison and electron impact mass spectrometry (molecular ion peak at m / z 268, retro-Die Is-AIder fragment peak at m / z 132).
  • Canzo produced a small amount of daidzein from 2,7,4'-trihydroxyisoflapanone.
  • the specific activity of Kanzo HIDM for 2,7-dihydroxy-4'-methoxyisoflapanone is 74 times higher than that for 2,7,4'-trihydroxyisoflapanone, indicating that the biochemical properties of the recombinant protein are high. This is consistent with that of Kanzo ⁇ cell-free extract (Table 1).
  • soybean HIDH When recombinant soybean HIDH was assayed with 2,7,4'-trihydroxyisoflapanone and 2,7-dihydroxy-l-oxy-4'-methoxyisoflavanone, peaks of daidzein and formononetin appeared on HPLG. It was confirmed (Fig. 4A). The chemical structure of isoflavone was reconfirmed by electron impact mass spectrometry. In addition, soybean HIDH catalyzed the production of genistein from 2,5,7,4'-tetrahydroxyisoflavanone ( Figure 4A).
  • Nitrophenylbutyric acid is a substrate commonly used in carboxylesterase atsey.
  • the recombinant lysozyme and soybean dehydratase showed weak activity against ditrophenylbutyrate (Table 1).
  • pig liver carboxyl esterase did not dehydrate 2,7,4'-trihydroxyisoflavanone (Table 1). (6) Gene expression in the formononetin pathway in Kanzo cells
  • RT-PGR analysis revealed that transcript levels of //// ⁇ 74 ' ⁇ 7 "and / in Kanzo cells increased 6 to 12 hours after treatment with yeast extract (Figure 5).
  • IFS-expressing yeast PYES-GYP93G2 and pESG-Leu
  • Each of the three yeasts was shake-cultured in 1.5 ml of SD minimum liquid medium [yeast nitrogen base without amino acids (6.7 g / l) glucose (20 g / l), tryptophan (20 mg / l)] (28) ° C). After collecting the cells by centrifugation, add 1 ig hemin to 3 ml of YPG liquid medium [yeast extract (10 g / l), peptone (20 g / l), galactose (20 g / l)]. The cells were suspended and cultured overnight to induce protein expression.
  • the cells were suspended in 0.5 ml of YPG liquid medium containing 50 g of naringenin (dissolved in 5 jtl teen 80 and 5 jU ethanol), and cultured in an incubator.
  • the cells were disrupted by adding glass beads to the culture, and extracted with ethyl acetate. After evaporating the extract to dryness, dissolving in methanol, HPLG [column: CAPCELL PAK C18 MG column (4,6 x 150 paintings; Shiseido Co., Ltd., Shiseido Co., Ltd.); G: 0.8 ml / min: solvent: 30% methanol (0 min) to 50% methanol (30 min). The amount of genistein in each sample was determined based on the peak area of the genistein sample.
  • the recombinant yeast (3) co-expressing IFS and 2-hydroxyisoflapanone synthase and the recombinant yeast (2) co-expressing IFS alone showed a The formation of nistin and 2,5,7,4'-tetrahydroxyisoflavanone was confirmed.
  • the control yeast ("I) did not produce either compound.
  • the yeast (3) which co-expressed IFS and 2-hydroxyisoflapanone synthase produced 3.2 ⁇ 0.2 jLig of genistein (3 experiments).
  • cDNA encoding 2-hydroxyisoflapanone dehydratase Kanzo HIDi / soybean / ZW, was cloned.
  • HIDM and HIDH show different substrate specificities for 2-hydroxyisoflavanones with 4'-methoxyl and 4'-hydroxyl substituents.
  • These enzymes using the most preferred substrates for each enzyme in their nomenclature, can be used to identify 2,7-dihydroxy-4'-methoxyisoflavanone-2,3-dehydratase (formononetin synthase) from Canzo and 2,2 from soybean. It can be called 7,4'-trihydroxyisoflavanone-2,3-dehydratase (daidzein synthase).
  • substrate specificity reflects the structure of the isoflavones (and isoflavonoids downstream of the biosynthetic pathway) in each plant species. Therefore, it is very likely that the production of isoflavones from 2-hydroxyisoflavanone in plant cells is enzyme dependent.
  • the specific activity of the 2-hydroxyisoflavanone dehydrogenase reaction by the recombinant kanzo HIDM protein is about 400 to 900 times higher than that of the crude extract of kanzo ⁇ , and both the recombinant protein and the crude extract are 2, 7, It showed extremely high selectivity for 2,7-dihydroxy-4'-methoxyisoflavanone over 4'-trihydroxyisoflavanone (see Table 1). This strongly suggests that the major activity of the crude extract is in the output DM protein.
  • the accumulation of HIDM mRNA in induced kanzo cells equivalent to that of IFS and ⁇ 4'0 ⁇ mRNA suggests that HI DM is involved in formononetin biosynthesis.
  • soybean extract catalyzed the dehydration activity of 2,7-dihydroxy-4'-methoxyisoflavanone and 2,7,4'-trihydroxyisoflavanone at a ratio of about 1: 1.
  • 2-hydroxyisoflavanone dehydratase is a protein having a sequence classified as carboxylesterase of the hydrolase family.
  • soybean HIDH had a weak carboxylesterase activity on nitrophenylbutyric acid (about 1/50 of pig liver enzyme) (see Table 1).
  • the present invention was the first to demonstrate that this family of proteins catalyze dehydration.
  • His is “I” one of the amino acids in the catalytic triad of carboxylesterase (Satoh and Hosokawa 1995, Wei et a 1999) «Therefore, 2-hydroxyisoflavanone dehydratase of P. It is also considered to be a protein of the xylesterase family.
  • dehydratase genes / proteins have been characterized from several types of plants. These include dehydroquinate dehydratase (Deka et al. 1994). 5-amino-levulinate dehydratase (Kaczor et al. 1994), imidazole glycerol phosphate dehydratase (Tada et al. 1994), and allenoxide synthase (Song et al. 1994). 1993). However, with these dehydratases No significant nucleotide and amino acid sequence homology was observed with HIDM / HIDH.
  • Proteins with a lipoxyl esterase motif somewhat homologous to HIDM / HIDH are widely distributed in the plant kingdom. Furthermore, in the biosynthesis of plant natural products, there are many dehydration reactions whose enzyme properties have not been determined. For example, there is the dehydration cyclization of 2'-hydroxyisoflapan-4-ol, which produces the pterocarpan skeleton (Bless and Barz 1988 , Guo et al. 1994a, Guo et al. 1994b).
  • Non-Patent Document 7 Non-Patent Document 8
  • the dry weight of soybean seeds is 1 g
  • about 4 mg to 10 tng of isoflavones (Aussenac et al. 1998) and about 3 mg of isoflavones per 1 g of fresh weight of lupine seedlings are produced (Katagiri et a). 2000).
  • Competition between the metabolic flow of flavanone to 2-hydroxyisoflavanone and another flow of 3-hydroxyflavanone is due to isoflavone production in transgenic Arabidopsis.
  • Botryt i s-respons i ve gene that has homology to the tobacco
  • Hormone- sensiti ve lipase is structurally ly re Iated to acetylcholinesterase, bile sa I. t-st imu I ated lipase, and several fungal lipases.Building of a three-dimensional model for the catalytic domain of hormone-sensitive lipase. J. Biol. Chem. 271: 31426-31430.
  • Doma innstructure ana I ys is of recombinant rat hormone-sensitive lipase. Biochem J. 319: 411-420.
  • cytochrome P4502-hydroxy i sof l avanone synthase Plant J. 31: 555-564. Song, WG, Funk, GD and Brash, AR (1993) Molecular cloning of an a 11 ene oxide synthase: a cytochrome P450 specialized for the metabo I is of fatty acid hydroperoxides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8519-8523.
  • a dehydrase that plays an important role in the step of producing isoflavones in a plant was isolated, and its amino acid sequence and a novel polynucleotide encoding the same could be provided. Furthermore, the present invention has made it possible to apply the gene thus obtained to the production of isoflavone-containing isoflavones.

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Abstract

カンゾウから配列番号１で表わされるアミノ酸配列を実質的に有する2-ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼが単離された。また、配列番号２の２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドが取得できた。さらに、ダイズからも2-ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼのアミノ酸配列を同定、２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドが取得できた。

Description

明 細 書
2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチド およびその応用
[技術分野]
本発明は ¾ 2—ヒドロキシィソフラバ/ンの脱水反応を触媒する 2—ヒドロキ シイソフラバノンデヒドラターゼ、 それをコードする新規ポリヌクレオチド、 及 びその応用に関する。
[背景技術]
イソフラボンおよびイソフラボンから誘導される化合物 （イソフラボノィド） は、 マメ科植物特有の成分で、 近年、 健康補助食品として注目されている。 そし て、 イソフラボンを含むイソフラボノイドは、 抗菌物質や共生シグナルとして植 物が生物環境に適応するために極めて重要な役割を果たすことが知られている。 イソフラポノィドの最も簡単な骨格はイソフラボンであって、 フラポノィド代 謝によって生成されるイソフラボノィドグループのきわめて初期の産物である
(図 1参照） 。 イソフラボンとそのグリコシド （配糖体） はマメ科植物の器官に 蓄積され、 ダイズの種子に含まれるダイゼイン （7, 4' -ジヒドロキシイソフラボ ン） ゃゲニスティン （5, 7, 4' -トリヒドロキシイソフラボン） の遊離体および配 糖体は健康を促進し、 疾病を予防するフィ卜エストロゲン （植物エストロゲン） として知られている。
イソフラボンは、 生態生理学的に活性のあるイソフラボノイド、 たとえば、 プ テロカルパンやイソフラバン骨格を有する抗菌性のフィトァレキシンが生合成さ れる場合の中間体である。 イソフラボノィドのうち約 50%は 4' -メ トキシルに由 来する官能基を有し、 これらは主として 4' -メ トキシル化されたイソフラボンで あるフオルモノネチン （7 -ヒドロキシ- 4' -メ トキシイソフラボン） に由来する。 イソフラボノイド骨格は、 シトクロム P450 (P450) ¾ すなわち 2 -ヒドロキシ イソフラバノンシンターゼ （I FS) の作用によって、 （2 -フラバノンから生合 成される。 I FSは 1 , 2 -ァリル基転位を伴うフラボノィド骨格の 2位の炭素のヒド 口キシル化を触媒する。 生成物である 2 -ヒドロキシイソフラバノンは脱水され てイソフラボンを形成する （図 1参照） 。
I FSの GD»U マメ科植 #1である Glycyrrhiza echinata (以下カンゾゥと記 載する。 ） （非特許文献^ 特許文献 1 ) およびダイズ（非特許文献 2、 非特許 文献 3 ) から同定されている。 酵母のミクロソー厶で過剰発現させた組換え I FS を用いたインビトロ検定では、 最初の生成物である 2-ヒドロキシイソフラパノ ンに加えて、 多量のイソフラボンが自発的な脱水によって生成した （非特許文献
1、 非特許文献 3 ) 。 さらに、 昆虫細胞で発現した I FSは、 イソフラボンのみを 生産することが報告された （非特許文献 2 ) 。 このように、 I FS反応の直接生成 物からイソフラボン生産を非酵素的に進めることができること、 および I FSの基 質である （2 -フラバノンはマメ科および非マメ科植物の共通の成分であるこ とから、 I FSを用いてイソフラボノィドを含まない非マメ科植物を形質転換する ことによって、 それらをイソフラボン産生植物に変換することができると推測さ れた （非特許文献 4、 非特許文献 5、 非特許文献 6 ) 。
このような知見に基づき、 イソフラボンを本来含有しない非マメ科植物 （シロ ィヌナズナゃタバコ） にダイズ I FS遺伝子を導入して非マメ科植物によるイソフ ラボン生産が試みられたが、 その生産量はダイズ種子の 1 /1000程度というわず かな量であった (非特許文献 3、 非特許文献 7、 非特許文献 8 )。 よって、 I FSの みでは、 イソフラボンの生産は効率的に行われないということが推測される。 一方、 2, 7， 4' -トリヒドロキシイソフラバノンをダイゼインに変換する 2-ヒド ロキシイソフラバノンデヒドラタ一ゼの酵素活性が/7" lobata (クズマ メ） の細胞で検出され、 そのタンパク質が精製された （非特許文献 9、 非特許文 献 1 0 ) 。 また、 本発明者らの実験によると、 カンゾゥの無細胞抽出物では、
2, 7-ジヒドロキシ- 4' -メトキシイソフラバノンはフオルモノネチンに変換された が 2, 7, 4' -トリヒドロキシイソフラバノンはダイゼインに変換されなかった
(非特許文献 1 1 ) 。 これらの結果は、 植物細胞での 2-ヒドロキシイソフラバ ノンからイソフラポンへの脱水が酵素 （2 -ヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ ーゼ） に依存しており、 酵素が置換基の異なる 2 -ヒドロキシイソフラバノンに 対して基質特異性を有していることを示している。
このように 従来の研究によって IFSのみでは イソフラボンの生産は効率 的に行えないこと 2-ヒドロキシイソフラパノンからイソフラボンへの脱水には 基質特異的酵素が重要な役割をしていることが解明されてきたが、 2 -ヒドロキシ イソフラバノンからイソフラボンへの脱水に闋与する酵素 （2-ヒドロキシイソフ ラバノンデヒドラターゼ） の詳細は不明であった。
【特許文献 1】
国際公開第 00/46356号パンフレツト
【非特許文献 1】
Akash i , Τ. , Aoki, Τ. and Ayabe, S. (1999) Cloning and functional
expression of a cytochrome P450 cDNA encoding 2 - hydroxy i sof I avanone synthase involved in biosynthesis of the isof lavonoid skeleton in
I i cor ice. Plant Physiol. 121： 821-828.
【非特許文献 2】
Steele, C.し.， Gijzen, . , Qutob, D. and Dixon, R. A. (1999) Molecular characterization of the enzyme catalyzing the ary I migration react i on of isof lavonoid biosynthesis in soybean. Arch. Biochem. B i ophys. 367： 146- 150.
【非特許文献 3】
Jung, W. , Yu, 0., Lau, S. M. , 0'Keefe, D. P., Odell, J. , Fader, 6. and McGonigle, B. (2000) Identification and expression of i sof I avone synthase, the key enzyme for biosynthesis of i sof I avones in legumes. Nature
Biotechnol. 18： 208-212.
[非特許文献 4】
Di on, R. A. and Steele, G.し. (1999) Flavonoids and i sof I avono i ds - a gold mine for metabolic engineering. Trends Plant Sci. 4： 394 - 400.
【非特許文献 5】 o Nat Acaci.SA 991451453.c.l.d. S U788:1- ygggjp gerlcaidat-ic enien of isofanelcoonus in Arabsis.for meolnivoteo- ..
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Akash i, T. , Sawada, Y. , Shi mada, N. , Sakura i , N. , Aok i , T. and Ayabe, S. (2003) cDWA cloning and b i ochem i ca I character i zat i on of 5-adenosy I -L- methionine:2, 7, 4' ~tr ί hydroxy ί sof I avanone 4' -^-methyl transferase, a cr i t i ca I enzyme of the legume isof lavonoid phytoa I ex i n pathway. Plant Cell Physiol. 44:103-112.
【非特許文献"！ 3】
Ayabe, S. , Akash i , T. and Aok ί， T. (2002) Cloning of cDMs encod i ng P450s in the f I avono i d/ i sof I avono i d pathwayfrom elicited leguminous cell cultures. Methods Enzymo I . 357： 360-369.
【非特許文献 1 4】
Nakamura, K. , Akash i , T. , Aok i, Τ. , Kawaguch i , Κ. and Ayabe, S. (1999) . Induction of i sof I avono i d and retrocha I cone branches of the f lavonoid pathway in cultured Glycyrrhiza echinata ce 11 s treated withyeast extract. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63: 1618-1620.
[発明の開示]
本発明は、 植物体においてイソフラボンを生産する工程に重要な役割を果たす 脱水酵素を単離し、 そのアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列 を解明することを課題とする。 より詳細には、 本発明は、 2 -ヒドロキシイソフラ バノンからイソフラボンへの脱水反応を触媒する 2 -ヒドロキシイソフラバノン デヒドラターゼのアミノ酸構造を決定し、 それをコードする遺伝子を提供するこ とを課題とする。 さらにまた、 本発明は、 そのようにして得られた遺伝子をイソ フラボンを含むィソフラボノィドの生産に応用することを課題とする。
上記の課題を解決するために、 本発明者らは、 まず、 カンゾゥ （フオルモノネ チン生産植物） およびダイズ （ダイゼイン生産植物） 抽出物の 2—ヒドロキシィ ソフラバノンデヒドラターゼを調査し、 種特異的な脱水酵素の存在を確認した。 次に、 生合成酵素の cDMAに関する新しい遺伝子クロ一ニング法 「機能発現分画 スクリーニング」 を用いて （非特許文献 1 2) ¾ カンゾゥの 2, 7-ジヒドロキシ - 4'-メトキシイソフラバノン 2， 3-デヒドラターゼ （フオルモノネチン合成酵素） をコードする oDNAを単離した。 さらに、 配列情報から、 基質特異性の異なる相 似酵素、 すなわちダイズの 2, 7, 4' -トリヒドロキシイソフラバノン 2, 3-デヒドラ ターゼ （ダイゼイン合成酵素） の d) を得た。
2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ一ゼをコ一ドする新規な遺伝子を取 得したことで 該遺伝子を非マメ科の植翻に導入し、 イソフラボノイドの生産量 を増大できる可能性を提供できた。
また ¾ 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードする遺伝子と I FSをコードする遺伝子を同時形質転換した微生物を用いてイソフラポノィドを 生産できることを確認した。
さらに、 本発明者らは、 2-ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼのァミノ 酸配列には、 カルボキシルエステラーゼで知られているモチーフが含まれている ことを見出した。 相似タンパク質は高等植物に広く分布しており、 天然産物の生 合成における脱水の一部はこの酵素ファミリーによって介在されていることを示 唆している。
すなわち、 本発明は、 カンゾゥに含まれる 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒ ドラタ一ゼ、 特に、 2, 7 -ジヒドロキシ -4' -メトキシイソフラバノン 2, 3-デヒド ラタ一ゼ （フオルモノネチン合成酵素） およびそれをコードするヌクレオチド配 列に関するものである。 カンゾゥに含まれる 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒ ドラターゼは、 配列番号 1に表わす 1—3 2 8のアミノ酸配列を含んでいる。 力 ンゾゥの 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコ一ドする c DNAの配 列は、 配列番号 2に示した。 さらに、 本発明は、 該新規な遺伝子を発現する組換 え体、 該遺伝子を組み込んだ形質転換体にも関する。 形質転換体としては、 酵母、 £ ί ^〃（大腸菌） が好ましく、 該遺伝子を導入した £ co//K 1 2株は、 日本 国茨城県つくぱ市東 1丁目 1番地中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センターに受託番号 FE圆 Ρ-19257 (寄託曰平成 1 5年 3月 2 0 日） として寄託した。 そして、 平成 1 6年 3月 1 5曰にブダペスト条約に基づく 国際寄託へ移管され、 受託番号 FERM ΒΡ-08662が付されている。
本発明は さらにまた、 該遺伝子あるいは該遺伝子と I FSをコードする遺伝子 とを同時に組み込んだ酵母や £ 〃などの微生物あるいは植物により、 イソフ ラボンを含むイソフラボノィドを生産する方法にも関するものである。 形質転換 に好ましい酵母は Saccharo yces cerevlsiae BJ2168株 (―ッ不ンン一ン社， N ippon Gene Co. , Ltd. ) ¾ 酵母用べクタ一としては pYES2 (インビトロゲン社， I nv itrogen Corporat ion) ¾ pESG—し EU (ス卜ラタシ一ン社， Stratagene^ ¾ pESC-TRP (ストラタジーン社， Stratagene) ¾ pESG-H I S (ストラタジーン社， Stratagene) など力挙げられる。
本発明は、 また、 ダイズに含まれる 2—ヒドロキシイソフラパノンデヒドラタ ーゼである、 2, 7, 4' -トリヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ一ゼ （ダイゼィ ン合成酵素） およびそれをコ一ドするヌクレオチド配列にも関するものである。 ダイズに含まれる 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼは、 カンゾゥに 含まれる 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼと相似しているが、 カン ゾゥのデヒドラターゼがイソフラバノンの 4' -メトキシ体を基質とするのに対し て、 4' -ヒドロキシ体を基質とするものであって、 配列番号 3に表わす 1一 3 1 9のアミノ酸配列を含んでいる。 ダイズの 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒド ラターゼをコードする c DNAの配列は、 配列番号 4に示した。 さらに、 本発明は、 該新規な遺伝子を発現する組換え体、 該遺伝子を組み込んだ形質転換体にも関す るもので、 形質転換体としては、 酵母、 £ 〃（大腸菌） が好ましく、 該遺伝 子を導入した £ 〃 K 1 2株は、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一に受託番号 FERM P-19256 (寄託曰平成 1 5年 3月 2 0日） として寄託した。 そして、 平成 1 6年 3月 1 5曰にブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、 受託番号 FERM BP - 08661が付されている。
本発明は、 さらにまた、 該遺伝子あるいは該遺伝子と I FSをコードする遺伝子 とを同時に組み込んだ酵母や £： 〃などの微生物あるいは植物にょリ、 イソフ ラボンを含むイソフラボノィドを生産する方法にも関するものである。 形質転換 に好まし { 襟母は SaGGha mj/ces cer~ei//'s/'se BJ2168株 、二ッポンン一ン社， N i ppon Gene Co. , Ltd. )、 酵母用ベクターとしては、 pYES2 (インビトロゲン社， I n i trogen Corporat i on pESG一し EU Λ卜ラタン——ン f土, Stratagene) ¾ pESC-TRP (ストラタジーン社， Stratagene) 、 pESG-H I S (ストラタジーン社， Stratagene) などが挙げられる。 該遺伝子と I FSをコードする遺伝子とを同時に 組み込んだ酵母 Saccharomyces cerevisiae BJ2168株はブダぺス卜条約に基づ き曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地中央第 6所在の独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センターへ、 受託番号 FERM BP- 08663 (寄託曰平成 1 6年 3月 1 5曰） として寄託した。
[図面の簡単な説明]
図 1は、 フラパノンからイソフラボノィドの生成経路を示す説明図である。 図 2は、 カンゾゥ細胞の 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ一ゼをコ一 ドする cDNAクローニングの説明図である。
図 3 Aは、 カンゾゥおよびダイズの 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ —ゼのアミノ酸配列を示す。
図 3 Bは、 カンゾゥなどマメ科植物の遺伝子の分子系統樹を示す。 （G.
ech i nata Dehydratase =カンゾゥ H I DM， Soybean TC98460 =ダイズ H IDH)
図 4は、 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ一ゼ生成物の H P L Cプロ フィルを示す。
図 5は、 遺伝子発現レベルを示す RT-PCR分析パタ一ンを示す。
図 6は、 I FSと H IDH共発現酵母 (上段)， I FS発現酵母 （中段） ， コントロール 酵母 （下段） をナリンゲニンを含む培地でインキュベートし、 得られた抽出物の
HPLGクロマトグラムを示す。
[発明の実施するための最良の形態]
以下、 本発明を具体的に説明する。
本発明において、 カンゾゥの 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ一ゼた んぱく質を H IDM、 それをコードする遺伝子を瞧 ダイズの 2—ヒドロキシィ ソフラバノンデヒドラターゼたんぱく質を HIDH、 それをコードする遺伝子を /ZWと記することがある。
本発明は 配列番号 1あるいは 3で表わされるアミノ酸配列を実質的に有する 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼに関するが、 本発明で、 「ァミノ W
酸配列を実質的に有する J とは、 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ一ゼ 活性を有する限り、 当該アミノ酸配列に欠失、 置換 付加 挿入等の変異がある ものを含むことを意味する。 欠失、 置換 付加 揷入されるアミノ酸の数は、 例 えば、 "！〜 20個、 好ましくは 1〜10個 特に 1〜 5個であり得る。 特に、 ァ ミ J酸残基を同様の特性のァミ J酸残基で置換したものであリ ¾ 典型的なかかる 置換は、 Ala, VaU Leuおよび lie間 ¾ Serおよび Thr間 Aspおよび Glu間、 Asnおよぴ Gin間、 Lysおよび Arg間 Pheおよび Tyr間の置換である。
さらに、 本発明は 配列番号 2あるいは ·で表わされるヌクレオチド配列また は該ヌクレ才チド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレ ォチドに関するが、 本発明で、 「ヌクレオチド配列を実質的に有する」 とは、 2 ーヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードする配列からなるポリヌク レオチドのほか、 該配列と縮重による配列の相違、 5' 末端あるいは 3' 末端又 はその両末端に適当な配列が付加されたポリヌクレオチドを含む意味である。
【実施例】
以下に、 実施例によって、 本発明を詳細に説明するが、 本発明はそれに限定さ れるものではない。
<材料と方法 >
本発明において用いた材料と手法は次のとおりである。
( 1 ) 化学物質
ダイゼイン、 ゲニスティン、 ビォカニン Aは、 ェクストラシンテ一ス社
(Extrasynthese) から、 （ -ナリンゲニンおよび ニトロフ: τニル酪酸は シグマ社 （Sigma Corporation) から得た。 フオルモノネチンは本発明者らの研 究室のストツクから入手した。
2,7,4'-トリヒドロキシイソフラパノン （非特許文献 1 3) および 2, 7-ジヒド 口キシ- 4' -メトキシイソフラバノン （非特許文献 1 2) は次のように調製した。 すなわち、 2, 7， 4'-トリヒドロキシイソフラパノンは、 GYP93C2 (IFS) を発現す る酵母ミクロソ一ム、 リクイリチゲニン （Liquiritigenin) 、 DPHをインキュ ベー卜して、 酢酸ェチルで抽出、 シリカゲル T LCで分離し、 さらに逆相 HP L Cで精製して調製した。 2, 7 -ジヒドロキシ- 4' -メ トキシイソフラバノンは、 ァ デノシル -L-メチォニン （SAM) , 2,7,4'-トリヒドロキシイソフラバノン、 組み 換え 2, 7, 4' -トリヒド口キシィソフラバノン 4' -0-≠チルトランスフエラーゼ
(ΗΙ4ΌΜΤ) の反応混合物を酢酸ェチルで抽出し シリカゲル TLGで分離 さら に HPLGで精製して調製した。
2， 5， 7， 4'-テトラヒドロキシイソフラバノンは GYP93G2を発現する酵母のミ クロソ一ム （非特許文献 1 ) と （/?） -ナリンゲニンおょぴ DPHとのインキュ ベ一シヨンによって調製した。 生成物 （Rf 0.30) は、 シリカゲル薄層クロマト グラフィー (TLC) [Kieselgel F254 (メルク社, Merck Ltd. ) ；溶媒はトルェ ン：酢酸ェチル：メタノール:石油エーテル =6:4: 1:3]によって精製した。
(2) 植物材料
カンゾゥの培養細胞 （Ak- 1系） は文献 （非特許文献 1 ) に従って、 カンゾゥ の葉及び葉柄から作製した。 一ナフタレン酢酸 (l/ g/ml) 及び N6—ベンジル アデニン （1 g/m I ) を含有する 1 /2濃度の Murash i e-Skoog培地 （0. 3% (w/v) ジエランガムで固化） 中、 12時間光照射 （6,000ルクス） Z12時間暗所サイク ルで培養し、 ェリシター処理した細胞より GDNAライブラリ一を構築した。 懸濁 培養物は 2, 4—ジクロロフエノキシ酢酸 （0.1 /g/ml) と力イネチン
(0.1 g/ml) 添加 Murashige - Skoog培地中、 暗所で維持した。 ェリシター処理 は 0.2% (w/v培養液） の酵母抽出物 （インビトロゲン社， Invitrogen
Corporation) を使用して行った （非特許文献 1 4) 。
ダイズの種子 （ /ダ c//7e /» し中生枝豆： トーホク社， Tohoku Ltd.) は、 水 に 24時間浸漬し、 コニカルビーカ一内の濾紙の上に撒いた。 ダイズの実生は、 明 12時間/ B音 12時間という条件で室温で 1週間成長させた。
(3) 無細胞抽出物の調製
操作はすべて 4°Gで行った。 ェリシター処理 （24時間） 後のカンゾゥ細胞 （10 g) あるいは 1週齡のダイズの実生 （10 g) は、 10%スクロースおよぴ 14 mM 2- メルカプトエタノールを含む 100 mMリン酸カリウム緩衝液 （pH 7.5) 10 mlお よび海砂 （2.5 g) を用いて乳鉢でホモジェナイズした。 ホモジェネートはガ一 ゼで濾過し 10, 000gで 10分間遠心分離した。 上清を 2.5gの Dowex 1- X2 (100 mMリン酸カリウム緩衝液で平衡化 pH 7.5) と混合し 20分間放置した。 濾過 によって得られた溶液は 硫酸アンモニゥムを用いて分画し、 30%〜80%飽和画 分を Sephadex G-25カラムで脱塩し 10%スクロースおよび 14 mM 2-メルカプ トエタノールを含む 100 m|¾リン酸カリウム緩衝液 （pH 7.5) に溶解しアツセィ に用いた （約 タンパク質/ ml) 。
(4) 2-ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼのアツセィ
2,7,4'-卜リヒドロキシイソフラバノン、 2, 7-ジヒドロキシ -4'-メトキシイソ フラバノンまたは 2,5,7， 4'-テトラヒドロキシイソフラバノン （各 5 nmol) を含 む 2-メ トキシエタノールに酵素調製液を加え （総容量： 100 l) 、 30°Gで 10分 間インキュベートした。
2, 5, 7 -トリヒドロキシ- 4'-メ トキシイソフラバノンデヒドラターゼ （ビ才力二 ン A合成酵素） のアツセィは以下のように行った。 2 -メ トキシエタノールに溶解 した 2,5， 7， 4'-テトラヒドロキシイソフラバノン （10 nmol) を、 カンゾゥ HI 4' 0MT (1jUg) 、 1 imol アデノシル -L -メチォニン （SAM) とともに 30°Cで 15分間インキュベートした。
濃縮した酢酸ェチル抽出物を組換えカンゾゥ HIDM (1j«g) と 30°Gで 10分間 インキュベートした。 混合物の酢酸ェチル抽出物を、 高速液体クロマトグラフィ ― (HPLC) で分析した。 ダイゼインおよびフオルモノネチン分析の HPLGは、 Capcel I pak C18 MG カラム （4.6x 150薩；資生堂社， Shiseido Co. , Ltd. ) を 用いて 40°G (流量 0.8ml/min) で行った （非特許文献 1 2) 。 溶出溶媒はメタノ ールと 3 %酢酸水を用いた。 40分の間に 35%〜55%になるように直線ダラジェン 卜で溶出させた。 5-ヒドロキシイソフラボンは、 Capcell pak C18 IMGカラム (4.6x150 mm；資生堂社， Shiseido Go.， Ltd.) を用いて 50%メタノール水 溶液 （ゲニスティンの場合） または 55%メタノール水溶液 （ビォ力ニン Aの場 合） によって 40°G (流量 0.8 ml/分) で分析した。 精製した組換えタンパク質 （約 10 ngタンパク質） とカンゾゥおよびダイズ
(約 10jtigタンパク質） の無細胞抽出物を用いて比活性を測定した。 イソフラボ ン濃度は、 ダイゼイン フオルモノネチン ゲニスティンの標準試料の HPLGピ ーク面積から算出した。
(5) カンゾゥ細胞の 2， 7-ジヒドロキシ- 4' -メトキシイソフラバノンデヒドラ ターゼをコードする cD! {MIDAl) のクロ一ニング
タンパク質の発現および大腸菌の粗抽出物の調製は既報のように行った （非特 許文献 1 2) 。
酵母抽出物でェリシター処理 （6時間および 12時間） したカンゾゥ細胞から 構築した cDNA発現ライブラリー （非特許文献 1 2) をスクリーニングに使用し た。
カンゾゥ AZapll cDNAライブラリーを Exassistヘルパーファ一ジ （ス 卜ラタジーン社， Stratagene Corporation) と f, <¾3〃 DH5Qf F' IQ (インビトロ ゲン社， I nv i trogen Corporation) を用 Ι て in 。 excisionによリファ一ジ ミドに変換した。
ファ一ジミドは DH5of F' lQに導入され、 £ 〃細胞は、 Luria- Bertani (LB)/ アンピシリン （50 ig/ml) 寒天プレート上で増殖した。 母プレートから LB/ァ ンピシリン培養液中に約 30, 000の大腸菌 （£ coli) 形質転換体をそれぞれ含む 5つの独立した cDNA分画プールを調製した。 5mM IPTGを含む LB液体培地で培養 し、 細胞を回収後、 粗酵素液を調製した。
2-メトキシエタノール 2jW Iに溶解した 2, 7, 4 '-トリヒドロキシイソフラバノ ン （0.4 nmol) に組換えカンゾゥ ΗΙ4'0ΜΤ (50 ng) を加え （非特許文献 1 2) , 0.4 nmol S-アデノシルー L- [メチルー14 G]メチォニン （[14G]SAM、 2,26 GBq/mtnoU /マンャ バっォサ エンスネェ Amersham Biosciences Corporation) の存在 下で 30°Cで 3分間プレインキュペートした （総容量： 50 I) 。 次に、 大腸菌プ —ルの粗抽出物 （100 l) を混合物に加え、 30°Gでさらに 10分間インキュベー 卜した。 酢酸ェチルを加えて反応を停止させた後 ¾ 混合物の酢酸ェチル抽出物を シリ力ゲル TLG [LK6DF (ワットマン社， Whatman Ltd. ) ；溶媒はク口口ホルム： アセトン: 25%アンモニア水 =70:29:1 ; 2, 7-ジヒドロキシ- 4' -メトキシイソフラ バノン （Rf 0.15) 、 フオルモノネチン （Rf 0.30) ]で展開し 画像分析装置
(Typhoon 8600 アマシャム バイオサイエンス社， Amersham B I osc I ences Corporation) によって分析した。 [MG]フオルモノネチンを生成した陽性プール を次のスクリーニングのために選択し、 小さいサイズ （約 3, 000クローン/ブー ル） の 10プールに分画した。 陽性プールの分画と検定は 4回繰リ返し、 2, 7-ジ ヒドロキシ -4' -メトキシイソフラバノンデヒドラターゼ活性を示すクローン
{ lDi) を単離した。 （図 2参照）
プラスミドを回収し、 オートシーケンサー（LIG - 4000, ァロカ社， Aloka Co. , Ltd.)を用いてヌクレオチド配列を決定した。
(6) WZWと相同のダイズ cDNA {HIDH) のクローニング
ポリ （A) + RNAを RNeasy Plant Mini Kit (キアゲン社, Qiagen Ltd.) を用 いてダイズの実生から単離し、 cDNAを Ready- To- Go T- Primed First Strand Kit
(アマシャムバイオサイエンス社， Amersham Biosciences Corporation) を用 いて合成した。 隠ま†こは A部位 (下線で示す） を含む 2つの PCR特異プ ライマーは、 開始コドンおよび終止コドン配列を指定するダイズ ESTの TC98460 のコード領域から設計した （TC98-Fow、 GTCATATGGCGAAGGAGATAGT6AA (配列番号 5) ； TC98-Rev、 AGGGATCCATCAAACGAGAAMGA (配列番号 6) ) 。 プライマ一およ ぴ錶型としてダイズ cDNAを用いた逆転写 (RT) - PCRによって得られた GDNA HIDfl) は、 pT7Blue T-ベクター （ノバゲン社， Novagen Ltd. ) に組み込み、 ヌクレオチド配列を決定した。
(7) 大腸菌におけるカンゾゥ およびダイズ〃〃 Wの異種発現
Afctelまたは Ss ^l部位 （下線で示す） を含む 2つのプライマ一は、 カンゾゥ HI DMのコード領域から設計した （GeDchy - F、 GTCATATGGCTTCTTCAACCTCAAC (配列 番号 7) ； GeDehy - R、 CTGGATCCTGAAAGAAGGAAG6AAG (配列番号 8) ) 。 カンゾゥ から得られた PGR生成物の/ tofe卜 ^¾ フラグメントは、 ET28a (ノバゲン 社 Novagen Ltd. ) の対応する部位にクローニングした。 さらに、 クローニング したダイズ cDNA (^HIDH) の Nde\—BamH フラグメントは、 pET28aの対応する部位 にもサブクローニングした。 遺伝子組換え 2-ヒドロキシイソフラバノンデヒド ラターゼの発現おょぴ精製は 次の方法で行った （非特許文献 1 2) 。 各べクタ —とー緖に形質転換された £∞//BL21 (DE3)細胞は 30°Gで 2 Oml 050 /ml カナマイシンあるいはアンピシリン添加の LB/アンシピリン培地中で 0D600=0.4 まで培養された。 IPTGが最終濃度 1. OmMになるように添加され ¾ 6時間 30°C でインキュベートされた。 カンゾゥ HIMおよびダイ HIDH は HisTrap Kit (アマシャム/、ィ才サイエンス社， Amersham Biosciences Corporation) ¾·用 いて および 発現 E. 〃の粗抽出物から精製された。
(8) 2—ヒドロキシイソフラバノンシンタ一ゼ（IFS)と 2—ヒドロキシイソフラ バノンデヒドラターゼを共発現させた組換え酵母の調製
マメ科カンゾゥの I FS (CYP93C2)を酵母で発現させるためのベクタ一（pYES - CYP93C2)は非特許文献 1と特許文献 1に記載したものを用いた（GYP93G2遺伝子 のコード領域を、 酵母発現ベクター（pYES2, インピトロゲン社， Invitrogen Corporation)のガラク 1 ^一ス誘導性プロモータ GAL1の下流の Kpn\ と EcoR\サイ 卜に組み込んだもの)。
ダイズの 2-ヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ一ゼ (HI DH)を酵母で発現さ せるためのベクター（pESG-HIDH)は以下のようにして作成した。 Apa\、 7σΙ部 位 （下線で示す） を付加した 2種のプライマー [HIDH- F1 (5' - GGGGCCCGGATCCATGGCGAA66A6ATAGTGAAAG-3 ' (配列番号 9) )， HIDH-R1 (5， - 6GGAGCTCGA6TCAAACCAGAAAAGAAGGG-3， （配列番号 1 0 ) )]を、 ダイズ 2—ヒドロ キシイソフラバノンデヒドラターゼ (HIDH)のコード領域から設計した。 プライ マーと K0Dポリメラーゼ （東洋紡， Toyobo Go. , Ltd. ) , さらに錶型としてダイ ズ HIDH cDNAを用いて PGR (98°Cで 15秒， 60°Gで 15秒， 74°Gで 30秒を 15サイ クル） を行った。 増幅産物を ^ で処理し、 酵母発現べクタ一 (pESG- Leu, ストラタジーン社， Stratagene)のガラク I ^一ス誘導性プロモータ GAL1の 下流 © oalと Xhdサイトに組み込んだベクタ一（pESG- HIDH)を作製した。 エレクト口ポレーシヨン装置 （Gel Iject Duo, サーモエレクトロン社， Thermo
Electron Corporation) ¾·用レゝて酵母 <&i?c7sr£¾?7 ces cerevis
Figure imgf000016_0001
68 ¼ (a； prd-407, prbl-1122, pep4-3, Ieu2, trpl, ura3-52) (二ツボンジーン社， Nippon Gene Co. , Ltd. )を形質転換した。 エレクト口ポレーシヨンはサ一モエレクト口 ン社 （Thermo Electron Corporation) が推奨する方法に つて行った。 形質転 換係 ίま， east nitrogen base without amino acids (6.7 g/l , インヒ卜ロケ ン社， I nv I trogen Corporat ion) ¾ グルコ一ス（20 g/ 1 )， トリプ卜ファン（20 mg/l), 寒天 (20 g/l)を含む培地で選択した。 以下の 3種の組換え酵母を作成し た： （1)コントロール酵母 （pYES2と pESG- Leuを BJ2168株に導入） 、 （2) IFS 発現酵母 (PYES-CYP93C2と pESG - Leuを BJ2168株に導入） 、 （3) IFSと 2—ヒド ロキシイソフラバノンデヒドラターゼ共発現酵母 （PYES-GYP93G2と pESG-HIDH を BJ2168株に導入）
(9) カルボキシルエステラーゼ活性の測定
組換えカンゾゥ HIDMおよびダイズ HIDHタンパク質の特異的カルポキシルェ ステラ一ゼ活性は、 150 mM NaCIおよび 750 nmol 二トロフエニル酪酸を含む 50 mM Tris-HCI緩衝液 （pH 9.0) 1.5 ml中における吸光度 400 nmで 30°Cで測定 した 7~ニトロフエノールの生成速度から算出した （Heymann 1981) 。 市販のブ タ肝臓カルボキシルエステラーゼ （シグマ社， Sigma Corporation) を陽性対照 として用いた。 熱変性（100°G、 10分間） させたカンゾゥ HIDM、 ダイズ HIDH、 ブタ肝臓カルボキシルエステラーゼタンパク質を陰性対照として分析した。
(1 0) RT-PCR分析
懸濁培養したカンゾゥ細胞は、 酵母抽出物で処理し、 3、 6、 12、 24、 48時間 後に収集した （非特許文献 1 ) 。 mRMAは Straight A' s mRMA単離システム （ノ バゲン社， Novagen Ltd. ) を用いて抽出し、 cDWAを合成した。 RT - PGRには、 力 ンゾゥ H鼠 非特許文献 1 2) 、 (非特許文献 1 2) から設計し た特異プライマ一を使用した。 反応は 94°Gで 1分間の変性によって開始し、 3ェ 程のィンキュベ一シヨン （94°C、 1分間； 55°C、 1分間； 72°C、 1分間） を 30サ ィクル繰り返した。 生成物は、 1. 2% (w/v) ァガロースゲルの電気泳動にかけ、 臭化工チジゥムで染色した。 上記の材料おょぴ方法によつて得られた本発明の結果を示す。
( 1 ) カンゾゥ細胞おょぴダイズの実生における 2-ヒドロキシイソフラパノン デヒドラターゼ活性
カンゾゥ細胞はェリシター処理後にメディカルピン （4' -メトキシイソフラボ ノイド 図 1参照） を蓄積するが ¾ 4' -ヒドロキシイソフラポノイドは蓄積しな い (Nakamura et a l . 1999) 。 ダイズはイソフラボンの、 ダイゼイン、 ゲニステ ィン、 グリシティン配糖体を産生することが知られており、 それらはいずれも 4' -ヒドルキシル化体である （Dewi ck 1986, Dewi ck 1993, Aussenac 1998) 。 し たがって、 カンゾゥ細胞およびダイズの実生の抽出物には、 それぞれ適切に置換 された 2 -ヒドロキシイソフラバノンからフォルモノネチンおよびダイゼィンを 生成する活性が存在すると推測される。 HPLCを用いて活性を調べた結果を表 1 に示す。
カンゾゥ HIDMとダイズ HIDHの比活性
Figure imgf000018_0001
(a)平均土 SD(3実験)
(b)比活性はイソフラボンと p -:!トロフ -ル生成物の生成量から計算した
(c) 0.2%酵母抽出物で 24時間ェリシター処理したカンゾゥ細胞 (Ak-1系）あるいはダイズ実生の無細胞抽出物の硫酸 アンモニゥ厶（30%~80%飽和）沈殿物
(d)精製組換えたんばく質
(e)来解析
(f) 熱処理 (100°C、 10分)されたたんぱく質と p-:iトロフ ル酪酸とのアツセィでは、酵素的脱水活性を示さなかった
表 1から分かるとおり、 2, 7-ジヒドロキシ -4 ' -メトキシイソフラバノンをカン ゾゥの無細胞抽出物とインキュベートした場合では、 フオルモノネチンが生成し た。 カンゾゥ抽出物による 2, 7， 4' -トリヒドロキシイソフラバノンからのダイゼ ィンの生成も少量認められたが、 その活性はフオルモノネチンの生成よ 約 160 倍低かった。
ダイズ実生の無細胞抽出物では、 2, 7 -ジヒドロキシ- 4' -メトキシイソフラ /《ノ ン （フオルモノネチンを産生） および 2， 7， 4' -トリヒドロキシイソフラバノン (ダイゼインを産生） からほぼ 1 ： 2のフオルモノネチンとダイゼインの生成が 検出された。 さらに、 ダイズ抽出物は、 ダイゼインの生成の約 1/10のレベルで、 2, 5, 7, 4' -テトラヒドロキシイソフラバノンからのゲニスティンの生成を触媒し
—方、 2 -ヒドロキシイソフラバノンの自発的な脱水は、 中性緩衝液 （pH 7. 5) における 50 Mの基質濃度による実験条件では無視し得るものであった。 これら の結果は、 植物細胞でイソフラボンを形成する 2-ヒドロキシイソフラバノンの 脱水は酵素触媒反応であることを強く示唆している。 さらに、 カンゾゥおよびダ ィズの 2-ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼの基質特異性は異なること が推定される。
( 2 ) 機能発現分画スクリーニングによるカンゾゥの 2-ヒドロキシイソフラバ ノンデヒドラターゼ GDNAの取得
2， 7 -ジヒドロキシ- 4' -メ トキシイソフラバノンからフオルモノネチンへの変換 の特異的かつ高感度の検出は、 酵母の遺伝子組換え I FSによって調製した精製 2, 7, 4' -トリヒドロキシイソフラバノン （非特許文献 1 ) 、 [14G]SAMおよびァフ ィニティ精製した N末端に 6個のヒスチジンを含む組換えカンゾゥ H I 4' 0MT (非 特許文献 1 2 ) を組み合わせて用い、 検定前に [MC] - 2, 7-ジヒドロキシ- 4' -メト キシイソフラバノンを産生することによって可能になった。 酵母抽出物で処理し たカンゾゥ細胞の cDMA発現ライブラリー （非特許文献 1 2 ) を用いてデヒドラ ターゼの GD のスクリーニングを行った。 最初のスクリーニングは、 5つの cDNAプール （形質変換体 30， 000 /プール） で実施した。 大腸菌プールの抽出物は、 [|40]-2,7-ジヒドロキシ- 4' -メ トキシイソフラバノンを産生させた上記の混合物 と反応させ、 反応混合極の酢酸ェチル抽出物を TLGォートラジオグラフィーによ つて分析した。 2つのプールが [14G]フオルモノネチンを産生することが判明し、 任意に選択した陽性プールの一方を小さいサイズ（約 3,000クローン/プール） の 10プールに分画した。 タンパク質の発現おょぴ分析を再ぴ行い、 10プールの うちの 1つの陽性プールを同定した。 陽性プールの分画おょぴ分析を繰り返した。
10プールのラちの 1つの陽性プールを、 3回目 （約 300クローン/プール） 4 回目 （30クローン/プール） および 5回目 （3クローン/プール） のスクリーニン グで繰り返し同定した。 最後に、 2, 7 -ジヒドロキシ- 4'-メトキシイソフラバノン デヒドラターゼ活性を示す単一の大腸菌クローンを単離した （図 2参照） 。
酵素をコ一ドする cDNAを回収し、 シーケンサーを用いて配列決定を行った。 HI DM (2-hydroxyisof I avanone dehydratase methoxy type) の cDNAは 1，178 bp のヌクレオチドを有し、 328のアミノ酸をコードしていた （図 3A) 。 タンパク 質-タンパク質 BLAST (http: 〃 ww. nebに n I m. nih.gov/BLAST/)検索では、 カンゾ ゥの HIDMの推定ァミノ酸配列は Arabidopsis thai i ana (シロイヌナズナ) の推 定タンパク質と 40%の同一性 （受入れ番号 At1g47480、 AT3g48690、 At3g48690) 、 Nlcotiana tabacum (タバコ） hsr203Jと 34%の同一性 （受入れ番号 X77136) (Pontier et al 1994) 、 ェンドウマメ E86と 31%の同一性 （受入れ番号
AB026296) (lchinose et al. 2001) 、 Archaeog I obus fulgidus (好熱性硫黄細 菌） のカルボキシルエステラーゼと 32%の同一性 (受入れ番号 1JJIA) (Manco et al. 2000) を示すことが明らかになった。 また、 カンゾゥ HIDMはカルボキ シルエステラーゼで記録された保存配列のモチーフを有していた （N末端から約 40〜180アミノ酸） 。
リパーゼおよびエステラーゼとともに才キシァニオンホールを形成する保存配 列 (His 85-Gly 86- Gly 87：図 3Aにおいて枠で囲んだ配列) は、 カルボキシル エステラーゼのモチーフに存在していた （Gontreras et al, 1996, Laurel I et al. 2000, Hosokawa 2002) 。 カンゾゥ HIDMタンパク質では、 一般的なリパーゼ およびエステラ一ゼの触媒トライァ一ドに保存された Ser残基 （Oster I und et a I 1996, Contreras et al. 1996, Manco et al. 2000， Hosokawa 2002) 力 Thr 残基に置換されているものの、 仮想の触媒トライァード （Thr 173、 Asp 272お よび His 304) が力ルポキシルエステラーゼモチーフの外側に認められた。 図 3 Mこおいて、 仮想の触媒トライァ一ド （Thr 173¾ Asp 272および His 304) には *を付した。
(3) マメ科植物ライブラリ一におけるカンゾゥデヒドラタ一ゼの相同 GD陽の 撿索
イス、http： I /www. t i gr. org/tdb/tg i /gmg i /) ¾ Medicago truncatula (タルゥ マゴャン j (http： / /www. t i gr. org/ tdb/tg i /mtg i /)、 Lotus japonicus (ミヤコグ サ) (http: //www. kazusa. or. jp/cn/plant/lotus/EST/) (Asamizu et al. 2000) のエクスプレスドシーケンスタグ （EST) データベースの検索から、 これらの植 物にカンゾゥ // と相同 （アミノ酸同一性 >50%) の cDNAが存在することが 明らかになった。 しかし、 これらの配列はすべて仮想タンパク質としてのみ注釈 が付けられていた。 分子系統樹では、 ダイズ ΒΜΠ7194、 L japonicus TC3332, M. truncatula TC43540タンパク質が、 力ンゾゥのデヒドラタ一ゼと同じ分枝を 形成 （アミノ酸レベルでの同一性 >80%) することが示された （図 3B) 。 ダイ ズ TC98460タンパク質は 4種類のタンパク質と >60%の同一性を有し、
i z/7i¾ii//a BG456496と密接な分枝を形成した （図 3B) 。
(4) カンゾゥとダイズの遺伝子組換え 2-ヒドロキシイソフラバノンデヒドラ タ一ゼの特性決定
ダイズの EST配列 TG98460は、 予測された開始コドンおよび終止コドンを有し ている。 cDNAのコード領域をダイズ実生から RT-PGRでクロ一ニングし、
N/DN(2-hydroxy i sof I avanone dehydratase hydroxy type)と命名 LT0
カンゾゥ //房おょぴダイズ 〃 Wは大腸菌で発現させ、 N末端に 6つのヒスチ ジン残基を持つ組換えタンパク質を精製し、 2 -ヒドロキシイソフラバノンに対す る活性を測定した。 図 4Aに示すように、 カンゾゥ 0 と2，7-ジヒドロキシ- 4' -≠トキシイソフラパノンとのインキュベーションによってフオルモノネチン が生成された。 生成物 （フオルモノネチン） の同定は標準サンプルとの Rt値の 比較および電子衝撃質量分析法 （m/z 268の分子イオンピーク、 m/z 132の retro - Die Is-AI derフラグメントピーク） によって確認した。 さらに カンゾゥ によって 2， 7， 4 '-トリヒドロキシイソフラパノンから少量のダイゼインが産 生された。 カンゾゥ HIDMの 2, 7 -ジヒドロキシ- 4' -メ卜キシイソフラパノンに対 する比活性は 2, 7, 4'-トリヒドロキシイソフラパノンに対するものよ 74倍高 く 組換えタンパク質の生化学的特性がカンゾゥ無細胞抽出物のものと一致する ことを示している （表 1) 。
組換えダイズ HIDHを 2， 7， 4'-トリヒドロキシイソフラパノンと 2, 7 -ジヒド 口キシ- 4'-メトキシイソフラバノンを用いてアツセィすると HPLG上で、 ダイゼ インとフオルモノネチンのピークが現われることを確認した （図 4A) 。 イソフ ラボンの化学構造は電子衝撃質量分析法によって再確認した。 さらに、 ダイズ HIDHは、 2, 5, 7, 4'-テトラヒドロキシイソフラバノンからのゲニスティンの生成 を触媒した （図 4A) 。 表 1に示すように、 HIDHの比活性は 2, 7, 4'-トリヒドロ キシイソフラバノンに対して最も高かったが、 別の 4'-ヒドロキシル化された基 質に対しては比較的低く （約 1/10) 、 4'-メトキシ基を持つ基質に対してはきわ めて低かった。
さらに、 カンゾゥ HI4'0MTと 2,5， 7， 4'-テトラヒドロキシイソフラバノンおよ ぴ SAMとのインキュベーションによって得られた 2， 5, 7-トリヒドロキシ- 4'-メ トキシイソフラバノンと予想される化合物をカンゾゥ HIDMとインキュベートし た場合には、 HPLGでビォカニン Aが検出された （図 4B) 。
(5) 遺伝子組換えカンゾゥおよびダイズの 2-ヒドロキシイソフラバノンデヒ ドラターゼのカルポキシルエステラーゼ活性
ニトロフエニル酪酸は、 カルボキシルエステラーゼアツセィで一般に用いら れる基質である。 遺伝子組換えカンゾゥおよびダイズのデヒドラターゼは 二 トロフエニル酪酸に弱い活性を示した （表 1) 。 これに対して ブタ肝臓カルボ キシルエステラーゼは 2,7, 4'-トリヒドロキシイソフラバノンを脱水しなかった (表 1) 。 (6) カンゾゥ細胞のフオルモノネチン経路における遺伝子発現
RT- PGR分析から、 カンゾゥ細胞の////现 Λ74'ί¾ί7"および / の転写レベルは 酵母抽出物による処理から 6〜12時間後に増加することが明らかになった （図 5) 。
(7) 2-ヒドロキシイソフラパノンシンタ一ゼ（IFS)と 2-ヒドロキシイソフラ パノンデヒドラターゼを共発現させた組換え酵母でのイソフラボン生産
前記 2-ヒドロキシイソフラパノンシンターゼ（IFS)と 2—ヒドロキシイソフ ラバノンデヒドラターゼを共発現させた組換え酵母の調製の項で説明した 3種の 組換え酵母、 すなわち、 （1)コントロール酵母 （pYES2と pESC-Leuを酵母
BJ2168株に導入） 、 （2) IFS発現酵母 （PYES-GYP93G2と pESG - Leuを酵母
BJ2168株に導入） 、 （3) IFSと 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ一ゼ共 発現酵母 （pYES- GYP93G2と pESG- HIDHを酵母 BJ21S8株に導入） を用いてイソフ ラボン生産能を比較した。
3種の酵母をそれぞれ 1.5 ml の SD最小液体培地 [yeast nitrogen base without amino acids (6.7 g/l) グルコース（20 g/l)、 トリプトファン（20 mg/l)] でー晚振とう培養 (28°C)した。 遠心によリ菌体を回収後、 1 igへミンを 含む 3 ml の YPG液体培地 [イーストエキストラクト（10 g/l), ペプトン（20 g/l)、 ガラクトース (20 g/l)]に菌体を懸濁し、 一晩培養してタンパク質発現を 誘導させた。 遠心によリ菌体を回収後、 50 gナリンゲニン （5jti l t een 80 と 5 jU l エタノールに溶解） を含む 0.5 ml YPG液体培地に菌体を懸濁し、 ー晚 培養した。 培養液にガラスビーズを加えて細胞を破砕し、 酢酸ェチルで抽出した。 抽出液を乾固後、 メタノールに溶解し、 HPLG [カラム： CAPCELL PAK C18 MG column (4,6 x 150画; 資生堂社， Shiseido Co. , Ltd.); 40。G: 0.8 ml/min:溶 媒 30%メタノール (0分）〜50%メタノール (30分）になるように直線グラジェン卜] で分析した。 ゲニスティン標品のピーク面積を基に、 各サンプルのゲニスティン 量を求めた。
その結袅 IFSと 2-ヒドロキシイソフラパノンシンタ一ゼを共発現させた組 換え酵母 （3) と、 IFSを単独で発現させた組換え酵母 （2) では、 HPLC上でゲ ニスティンと 2,5,7,4' -テトラヒドロキシイソフラバノンの生成が確認された。 コントロール酵母 （"I ) では両化合物の生成は見られなかった。 IFSと 2-ヒド ロキシイソフラパノンシンターゼを共発現させた酵母 （3) ではゲニスティンを 3.2±0.2 jLig (3回の実験） 生産した。 IFSを単独で発現させた組換え酵母での ゲニスティン生成量は 0.8±0.1 Ug (3回の実験） であリ IFSと 2-ヒドロキ シイソフラパノンシンターゼを共発現させるとイソフラボン生産量が増加するこ とがわかった （國 6参照） 。 以上の結果から、 次のことが明らかになった。
本発明では、 2-ヒドロキシイソフラパノンデヒドラターゼをコードする cDNA、 カンゾゥ HIDi/ ダイズ /ZWをクロ一ニングした。 HIDMおよび HIDHは 4'-メト キシルおよび 4'-ヒドロキシル置換基を有する 2-ヒドロキシイソフラバノンに対 して異なった基質特異性を示す。 これらの酵素は、 命名法に各酵素の最も好まし い基質を用いて、 カンゾゥの 2, 7-ジヒドロキシ- 4' -メトキシイソフラバノン - 2,3 -デヒドラターゼ （フオルモノネチン合成酵素） およびダイズの 2， 7, 4'-トリ ヒドロキシイソフラバノン- 2,3 -デヒドラターゼ （ダイゼイン合成酵素） と呼ぶ ことができる。 重要なことは、 基質特異性は各植物種に含まれるイソフラボンの 構造 （さらには生合成経路の下流のイソフラポノィド） を反映していることであ る。 したがって、 植物細胞の 2 -ヒドロキシイソフラバノンからのイソフラボン の生成は酵素に依存している可能性が非常に高い。
遺伝子組換えカンゾゥ HIDMタンパク質による 2-ヒドロキシイソフラバノン脱 水酵素反応の比活性は、 カンゾゥの粗抽出物よりも約 400〜900倍高く、 遺伝子 組換えタンパク質および粗抽出物はいずれも 2， 7, 4 '-トリヒドロキシィソフラバ ノンよりも 2， 7-ジヒドロキシ- 4' -メトキシイソフラバノンに対して極めて高い 選択性を示した （表 1参照） 。 これは、 粗抽出物の主要な活性が出 DMタンパク 質にあることを強く示唆している。 さらに、 誘導したカンゾゥ細胞の HIDM mRNA が IFSと ΗΙ4'0ΜΤの mRNAと同等に蓄積することは、 HI DMがフオルモノネチンの 生合成に関与していることを示唆している。 一方、 ダイズ抽出物は 2, 7 -ジヒドロキシ- 4' -メ トキシイソフラバノンおよび 2, 7, 4' -トリヒドロキシィソフラバノンに対する脱水活性を約 1 :1の割合で触媒 した。 これに対して ¾ 遺伝子組換えダイズ HIDHタンパク質の活性は 2 -ヒドロキ シイソフラバ/ンの 4'-ヒドロキシル化体にきわめて特異的であった （表 1参 照） 。 これらのことから ダイズの 4'-ヒドロキシル化イソフラボンの生成は HIDHに起因している可能性が高い。
本発明で、 さらに興昧深い所見は 2-ヒドロキシイソフラバノンデヒドラター ゼは加水分解酵素フアミリーのカルボキシルエステラーゼに分類される配列を有 するタンパク質であるということである。 実際に、 ダイズ HIDHは ニトロフエ ニル酪酸に対して弱いカルボキシルエステラーゼ活性を有していた （ブタ肝臓酵 素の約 1/50) (表 1参照） 。 本発明は、 このファミリーのタンパク質が脱水を 触媒することを最初に実証したものである。
P. lobata (クズマメ） で報告された 2-ヒドロキシィソフラバノンデヒドラタ —ゼの特性はダイズ HIDHの特性と一致する （Hakamatsuka et al. 1998) 。 P. /o&a のタンパク質の分子量 （38 kDa) はダイズ HIDHの計算値 （35,115) と近 い。 さらに、 2， 7， 4'-トリヒドロキシイソフラバノンに対する /3, iobataの宁ヒ ドラタ一ゼの比活性 （56.8 mkatal /kgタンパク質） は、 遺伝子組換えダイズ
HIDHの活性 (43.6 mkatal /mg) とほぼ同様である。 非常に興味深いことに、 P. lobataの ンパク質の His残基は活性に重要であることが報告されておリ
(Hakamatsuka et al. 1998) 、 Hisはカルボキシルエステラーゼの触媒トライ ァードのアミノ酸の "I つである （Satoh and Hosokawa 1995, Wei et aに 1999) « したがって、 P. の 2-ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼはカルボ キシルエステラーゼファミリーのタンパク質でもあると考えられる。
いくつかのデヒドラターゼ遺伝子/タンパク質は、 数種類の植物から特性が決 定されている。 これらにはデヒドロキナ酸デヒドラターゼ （Deka et al. 1994) . 5 -ァミノレブリン酸デヒドラターゼ（Kaczor et al. 1994) 、 イミダゾールグ リセロールリン酸デヒドラターゼ （Tada et al. 1994) 、 アレンォキシド合成酵 素 （Song et al. 1993) が含まれる。 しかし、 これらのデヒドラターゼと HIDM/HIDHとの間ではヌクレオチドおよびアミノ酸配列の有意な相同性は認めら れていない。
HIDM/HIDHとある程度相同の力ルポキシルエステラーゼモチーフを有するタン パク質は植物界に広く分布している。 さらに 植物性天然産物の生合成では酵素 の特性が決定されていない多くの脱水反応があリ たとえばプテロカルパン骨格 を生じる 2'-ヒドロキシイソフラパン- 4-オールの脱水環化がある （Bless and Barz 1988, Guo et al. 1994a, Guo et al. 1994b) 。 ヒョコマメおよぴタ 1 "ィズ のそれぞれのィソフラポノィドの生合成では各植物のミク口ソームの実験から、 メチレンジ才キシ環の生成おょぴフエノール環のプレニル置換基の環化は P450 によるものである （Clemens and Barz 1996, Welle and Grisebach 1988) 。 し かし、 P450とともにデヒドラターゼがこれらの反応に関与している可能性もあ リ、 その酵素タンパク質はカルボキシルエステラーゼファミリーに分類されるか もしれない。 また、 触媒機能が未同定のこの種のタンパク質をコードするいくつ かの植物遺伝子が病原体に反応して誘導されることが報告されている （Pontier et al. 1994, Walden et al. 1999, lchinose et al. 2001, Tronchet et aに 2001, Bezier et al. 2002) 。 これらは、 防御に関わる化合物の生合成に関与す るデヒドラターゼであることも考えられる。
2-ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ遺伝子の同定は、 マメ科および非 マメ科植物の代謝エンジニアリングにきわめて重要である。 これまでのところ、 非マメ科植物でイソフラポノィドを生成するために、 ダイズ IFSを過剰発現する 形質転換型 Arabidopsis tha I iana ίί J: Nicotiana iatoc が構築されている が（非特許文献 3、 非特許文献 7、 非特許文献 3) 、 形質転換体のイソフラボノ イドの生産性は満足できるものではない。 典型的な場合では、 シロイヌナズナの 生重量 1 gあたり約 2 ng~4 ngのゲニスティンが生産されるのに対して （非特 許文献 7、 非特許文献 8) 、 ダイズ種子の乾重量 1 gあたリ約 4 mg〜10 tng相当 のイソフラボン （Aussenac et al. 1998) およびルーピン実生の生重量 1 gあた リ約 3 mgのイソフラボンが生産される （Katagiri et a). 2000) 。 フラバノン から 2-ヒドロキシイソフラパノンへの代謝フローと 3 -ヒドロキシフラバノンに 至る別のフローとの競合は、 形質転換型シロイヌナズナにおけるイソフラボン生 産のボトルネックになると思われ、 実際に IFSで形質変換したシロイヌナズナの フラバノン 3 -ヒドロキシル化酵素変異体におけるイソフラボン生産は 6〜31倍 に増加している （Liu et al. 2002) 。
IFSを単独で発現させた組換え酵母と比べて、 IFSと HIDHを同時に発現させた 組換え酵母ではイソフラボン生産量が増加したことから、 非マメ科植物で IFSと HIDHを同時に発現させることにより、 イソフラボン生産量が増大する可能性も 期待できる。
さらに、 ///^/およぴガ /詹を導入遺伝子に用いた遺伝子工学によって、 マメ料 植物のイソフラボノィド経路を修正することも実現可能である。
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[産業上の利用の可能性]
以上、 本発明では、 植物体においてイソフラボンを生産する工程に重要な役割 を果たす脱水酵素を単離し、 そのアミノ酸配列およびそれをコードする新規なポ リヌクレオチドを提供することができた。 さらにまた、 本発明は、 そのようにし て得られた遺伝子をイソフラボンを含むイソフラボノィドの産生に応用すること を可能とした。
[寄託された生物材料への言及]
(1 ) ィ. 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称およびあて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター
あて名：曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 口. ィの機関に寄託した日付
平成 1 5年 3月 20曰 （原寄託曰）
平成 1 6年 3月 1 5曰 （ブタペスト条約に基づく寄託への移管曰） ハ. ィの機関が寄託について付した寄託番号
FERM BP-08661 ( 2 ) ィ. 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称およびあて名
名称：独立行政法人產業技術総合研究所
特許生物寄託センター
あて名：曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 口. ィの機関に寄託した日付
平成 1 5年 3月 2 0曰 （原寄託曰）
平成 1 6年 3月 1 5日 （ブタペスト条約に基づく寄託への移管曰） ハ. ィの機関が寄託について付した寄託番号
FERM BP-08662
( 3 ) ィ. 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称およびあて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター
あて名：曰本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 口. ィの機関に寄託した曰付
平成 1 6年 3月 1 5曰 （ブタペスト条約に基づく寄託曰） ハ. ィの機関が寄託について付した寄託番号
FERM BP-08663

Claims

請 求 の 範 囲
1 - 配列番号 1で表わされる 1— 3 2 8のァミノ酸配列を実質的に有する 2—ヒ ド口キシィソフラバ/ンデヒドラターゼ。
2 . 2， 7—ジヒドロキシー 4， ーメ トキシイソフラバノンあるいは 2， 5 , 7—トリヒドロキシー 4 ' —メトキシイソフラバノンに作用してフオルモネチン あるいはピオ力ニン Aを生成するための脱水反応を促進する請求項 1記載の 2— ヒドロキシイソフラパノンデヒドラターゼ。
3 . 請求項 1または 2に記載の 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ一ゼを コードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド 配列を実質的に有するポリヌクレオチド。
4 . 配列番号 2で表わされる 1一 1 1 7 8個の塩基からなる 2—ヒドロキシイソ フラパノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチド。
5 . 配列番号 2に含まれるヌクレオチド配列に対して 5 0 %以上の相同性を有し、 且つ 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレ才チ ド、。
6 . Glycyrrhiza echlnata (力ンゾゥ） からクローニングされた請求項 3〜 5の いずれかに記載のポリヌクレオチド。
7 . 配列番号 2のヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレ ォチド配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも一部にハイブリダィズするポ リヌクレオチド。
8 . 配列番号 2の少なくとも 1 5個の連続した配列またはこれに相補的なヌクレ ォチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダィズしうる、 2—ヒドロキシ イソフラバノンデヒドラターゼをコ一ドするヌクレオチド配列または 2—ヒドロ キシイソフラバノンデヒドラターゼの c D N Aのプライマーまたはプローブとし て機能しうるポリヌクレオチド。
9 . 請求項 3 ~ 6のいずれかに記載のポリヌクレオチドでコードされる 2—ヒド 口キシィソフラパノンデヒドラターゼ。
1 0. 請求項 3 ~ 6のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコ一ドするたんぱく 質を用い、 2—ヒドロキシイソフラバノンを脱水する方法。
1 1. 少なくともフラパノン 2—ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ （ I F S) と請求項 3 ~ 6のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコ一ドするたんぱく 質を用いてイソフラボノィドを生産する方法。
1 2. 請求項 3〜6のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたぺク ター。
1 3. 宿主細胞中で、 請求項 3〜 6のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを 発現しうる発現系を含む組換え体 D N Aまたは R N A。
1 . 請求項 1.2に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
1 5. 宿主細胞が酵母である請求項 1 4に記載の形質転換された宿主細胞。
1 6. 寄託番号 FERM B P— 08662の組換え大腸菌細胞である請求項 1 4に記載の宿主細胞。
1 7. 請求項 1 4〜1 6のいずれかに記載された宿主細胞を培養することを含む 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼの製造方法。
1 8. 請求項 1 4~1 6のいずれかに記載された宿主細胞を用いるイソフラボノ ィドの生産方法。
1 9. 請求項 3〜6のいずれかに記載されたポリヌクレオチドおよび 2—ヒドロ キシイソフラバノンシンタ一ゼ （ I FS) をコードするポリヌクレオチドで形質 転換された宿主細胞を用いるイソフラボノィドの生産方法。
20. 請求項 3〜6のいずれかに記載されたポリヌクレ才チドが導入されたトラ ンスジエニック植物。
21.マメ科植物である請求項 20に記載のトランスジヱニック植物。
22. 請求項 20または 21に記載の植物を用いるイソフラポノィドの生成方法。
23. 請求項 20または 21に記載の植物を用いるイソフラポノィドの改変方法。
24. 配列番号 3で表わされる 1一 31 9のアミノ酸配列を実質的に有する 2— ヒドロキシイソフラパノンデヒドラターゼ。
25. 2, 7, 4' 一トリヒドロキシイソフラパノンあるいは 2， S, 7， 4， ーテトラヒドロキシイソフラバノンに作用してダイゼインあるいはゲニスティン を生成するための脱水反応を促進する請求項 2 4記載の 2—ヒドロキシイソフラ
/《ノン丁ヒドラターゼ。
2 6 . 請求項 2 4または 2 5に記載の 2—ヒドロキシイソフラパノンデヒドラタ ーゼをコ一ドするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレ ォチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド。
2 7 . 配列番号 4で表わされる 1一 9 6 0の塩基からなる 2—ヒドロキシイソフ ラバノンデヒドラターゼをコ一ドするポリヌクレオチド。
2 8 . 配列番号 4に含まれるヌクレオチド配列に対して 5 0 %以上の相同性を有 し、 且つ 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラタ一ゼをコードするポリヌクレ ォチド。
2 9 . ダイズからクローニングされた請求項 2 6 ~ 2 8のいずれかに記載のポリ ヌクレオチド。
3 0 . 配列番号 4のヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌク レオチド配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも一部にハイブリダィズする ポリヌクレオチド。
3 1 . 配列番号 4の少なくとも 1 5個の連続した配列またはこれに相補的なヌク レオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダィズしうる、 2—ヒドロキ シイソフラバノンデヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列または 2—ヒド ロキシイソフラバノンデヒドラターゼの c D N Aのプライマーまたはプローブと して機能しうるポリヌクレオチド。
3 2. 請求項 2 6 - 2 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドでコ一ドされる 2 —ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ。
3 3. 請求項 2 6〜 2 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコ一ドするたん ばく質を用い、 2—ヒドロキシイソフラバノンを脱水する方法。
3 4. 少なくともフラバノン、 2—ヒドロキシイソフラバノンシンタ一ゼ （ I F S ) と請求項 2 6〜2 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコ一ドするたん ばく質を用いてイソフラボノィドを生産する方法。
3 5. 請求項 2 6〜 2 9のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが揷入された ベクター。
36. 宿主細胞中で、 請求項 26 ~29のいずれかに記載されたポリヌクレオチ ドを発現しうる発現系を含む組換え体 D N Aまたは R M A。
37. 請求項 35に記載のぺクタ一によリ形質転換された宿主細胞。
38. 宿主銦胞が酵母である請求項 37に記載の形質転換された宿主細胞。
39. 寄託番号 FERM BP— 08661の組換え大腸菌細胞である請求項 3 7に記載の宿主細胞。
40. 2—ヒドロキシイソフラパノンシンターゼ（ I FS) をコードするポリヌ クレドチドが揷入されたベクターおよび請求項 26〜29のいずれかに記載され たポリヌクレオチドが挿入されたベクターによリ形質転換された宿主細胞。
41. 宿主細胞が酵母である請求項 40に記載の形質転換された宿主細胞。
42. 寄託番号 FERM BP— 08663の組換え酵母である請求項 41に記 載の宿主細胞。
43. 請求項 37〜42のいずれかに記載された宿主細胞を培養することを含む 2—ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼの製造方法。
44. 請求項 37〜 42のいずれかに記載された宿主細胞を用いるィソフラボノ ィドの生産方法。
45. 請求項 26〜29のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが導入された トランスジエニック植物。
46. マメ科植物である請求項 45に記載のトランスジエニック植物。
47. 請求項 45または 46に記載の植物を用いるイソフラポノィドの生成方法。
48. 請求項 45または 46に記載の植物を用いるイソフラボノィドの改変方法。
9. 力ルポキシルエステラーゼのモチーフを持ち脱水反応を触媒する酵素をコ —ドするポリヌクレオチド。
50. 力ルポキシルエステラーゼのモチーフを持ち 2—ヒドロキシイソフラバノ ンの脱水反応を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチド。
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