WO2004087656A1 - Konjugate 2,4-ethano- und 2,4-propano-überbrückter 3,6,9-triaza-nonansäure-3n, 6n, 9,9n-tetraessigsäure- und entsprechender phosphorsäuremethylen-derivate und deren abkömmlinge mit biomolekülen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zur herstellung - Google Patents

Konjugate 2,4-ethano- und 2,4-propano-überbrückter 3,6,9-triaza-nonansäure-3n, 6n, 9,9n-tetraessigsäure- und entsprechender phosphorsäuremethylen-derivate und deren abkömmlinge mit biomolekülen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zur herstellung Download PDF

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Lutz Lehmann
Matthias Friebe
Thomas Brumby
Detlev Sülzle
Joahnnes Platzek
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    • C07D207/16—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals

Definitions

  • the invention relates to the objects characterized in the claims, that is, conjugates 2,4-ethano- and 2,4-propano-bridged 3,6,9-triaza-nonanoic acid- 3 N, 6 N, 9.9 N-tetraacetic acid - And corresponding phosphoric acid methylene derivatives and their derivatives with biomolecules, processes for their preparation and their use for the manufacture of pharmaceutical agents for radio diagnostics, radiotherapy or NMR diagnostics.
  • radiopharmaceuticals for diagnostic and therapeutic purposes has long been known in the field of biological and medical research.
  • radiopharmaceuticals are used to represent certain structures such as the skeleton, organs or tissues.
  • Diagnostic use presupposes the use of such radioactive agents that, after application, accumulate specifically in the structures in the patient that are to be examined. These locally accumulating radioactive agents can then be detected, recorded or scintigraphed by means of suitable detectors, such as, for example, scintillation cameras or other suitable recording methods.
  • suitable detectors such as, for example, scintillation cameras or other suitable recording methods.
  • the distribution and relative intensity of the detected radioactive agent identifies the location of a structure in which the radioactive agent is located and can represent the presence of abnormalities in structures and functions, pathological changes, etc.
  • radiopharmaceuticals can be administered to the patient as therapeutic agents to irradiate certain pathological tissues or areas. Such treatment requires the provision of radioactive therapeutic agents that accumulate in certain structures, organs or tissues.
  • a company of IDEC Pharmaceuticals Corp. developed radiopharmaceutical for the therapy of non-Hodgkin's lymphoma is Zevalin ® (see eg Cancer (2002) Feb 15; 94, (4 Suppl): 1349-57).
  • Radiant ions are 111-ln or 90-Y, which have a Chelator (methyl-substituted-diethylene-triamine-penta-acetic acid derivative (mx-DTPA) are bound to a tumor-specific antibody.
  • Nuclear magnetic resonance is a widely used method for medical diagnostics used in Vo imaging, which can be used to measure the magnetic properties of protons in body water, body vessels and body tissue (including tumors).
  • contrast agents are used, for example, which, by influencing certain NMR parameters of the body protons (for example the relaxation times T 1 and T 2 ), bring about a contrast enhancement in the resulting images or only make these images readable.
  • complexes come paramagnetic ions such as gadolinium-containing complexes (such as Magnevist ®) due to the effect of the paramagnetic ions on the shortening of the relaxation times.
  • EP-A-0 071 564 describes, inter alia, the meglumine salt of the gadolinium (III) complex of diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) as a contrast agent for NMR tomography.
  • DTPA diethylenetriaminepentaacetic acid
  • Magnevist ® This contrast medium is distributed extracellularly after intravenous administration and is excreted renally by glomerular secretion. A passage of intact cell membranes is practically not observed.
  • Magnevist ® is particularly well suited for the display of pathological areas (eg inflammation, tumors).
  • the known radiotherapeutics and contrast media cannot be used satisfactorily for all applications. Many of these agents are distributed throughout the extracellular space of the body. In order to increase the efficiency of these agents in in vivo diagnostics and therapy, attempts are being made to increase their specificity and selectivity, for example, to target cells or desired areas and structures of the body. These properties can be improved, for example, by coupling the metal complexes to biomolecules after "drug targeting". Principle. Plasma proteins, antibodies, their fragments, hormones, growth factors and substrates of receptors and enzymes are suitable as biomolecules (eg WO 97/12850, Institute for Diagnostic Research at the Free University of Berlin). So far, for example, the tumor specificity (tumor accumulation) has not yet been sufficiently high in many cases, which is an important goal, especially in radioimmunotherapy.
  • the retention in the tumor tissues or organs to be examined should be sufficient to achieve the quality of images or sufficient radiation required for efficient diagnosis and therapy with the lowest possible dosage.
  • the fastest and most complete elimination of the metals from the body should be guaranteed.
  • the NMR contrast media should show a high proton relaxivity and thus allow a reduction in the dose with an increase in the signal intensity.
  • Radiopharmaceutical Zevalin ® for the therapy of non-Hodgkin's lymphoma uses a DTPA derivative which is substituted at two defined positions.
  • US Pat. No. 5,28650 describes a DTPA in which one of the two ethylene radicals is part of a cyclohexane ring.
  • modified DTPA's sometimes have improved properties - e.g. increased complex stability compared to the unsubstituted DTPA - show, there is still a need to further increase the metal complex stability and to provide diagnostic and therapeutic agents that are as specific as possible.
  • DTPA derivatives in which an ethano or propano bridge is linked via one of the two outer nitrogen atoms, so that 2,5-substituted pyrrolidines or 2,6-substituted piperidines are formed, are more kinetic Stability in vivo and thus lower acute toxicity of the corresponding metal complexes.
  • the compounds according to the invention show increased relaxivity and / or water solubility and / or specificity, so that they are suitable as pharmaceutical agents, in particular for radio and NMR diagnostics and radiotherapy.
  • the invention thus relates to conjugates of the general formula I.
  • Z represents a hydrogen atom or a metal ion equivalent of an element of atomic numbers 21-29, 31, 32, 37-39, 42-44, 46, 47, 49, 58-71,
  • 75, 77, 82 or 83 stands for a group -COO-, a group -P (0) (OC C 6 -alkyl) -0- or a group -P (0) (OH) -0- stands for the digits 0 or 1,
  • R 1 - R 6 independently of one another for a hydrogen atom, a straight-chain or branched, saturated or unsaturated and optionally by one to six O atoms, phenylene, -NHCO-, -CONH-, -O- (CO) -
  • Ci - C 25 alkyl radical which optionally with one to six carboxyl groups, hydroxyl groups, amino groups and / or another functional binding group, which with a Biomolecule can be linked, substituted, or represent a phenyl -CC 25 alkyl group, the phenyl radical of which is optionally substituted with a nitro group, an amino group or another functional binding group which can be linked to a biomolecule, and their Salts with organic or inorganic bases, with the proviso that at least one of the substituents R 1 -R 6 does not represent H and that at least one of the substituents R 1 - R 6 contains a biomolecule linked via a functional group and at least two Z stand for a metal ion equivalent.
  • the carboazar ring is preferably c / s linked.
  • alkyl is preferably ethyl.
  • the compounds according to the invention contain at least three centers of chirality. Even if no distinction is made in the description and claims between the different enantiomers, the compounds mentioned always include both enantiomers and, in the presence of several stereocenters, also all possible diastereomers and mixtures thereof.
  • the radicals R 1 -R 6 can independently represent a hydrogen atom or an alkyl radical having 1-25 carbon atoms (at least one of the radicals contains a biomolecule bound via a functional group).
  • This alkyl radical can be straight-chain or branched, saturated or unsaturated (for example:
  • Azide acid chloride, hydroxide, sulfonyl chloride, vinyl sulfone, carbodiimide, maleimide,
  • Dioxo or other functional binding group e.g.
  • Ci - C 25 alkyl radical can optionally be replaced by one to six O atoms, phenylene
  • R -R 6 can also represent a phenyl-C 25 -aralkyl group, the phenyl radical of which, for example, with carboxyl, activated carboxyl, amino, nitro, isocyanate, isothiocyanate, hydrazine, semicarbazide, thiosemibarbazide, chloroacetamide, bromoacetamide, iodoacetamide, acrylic, acylamino , mixed anhydrides, azide, hydroxide, sulfonyl chloride, vinyl sulfone, carbodiimide, a maleimide, diazo (e.g.:
  • R 1 -R 6 substituents permit selective reaction with functional groups of the biomolecules in the optimal pH range, for example the addition to -SH groups (cysteine in the biomolecule), and exclusively of -SH groups, eg on maleimides ((2,5-dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl) compounds, see above) or bromoacetamides if the coupling takes place in the weakly acidic pH range.
  • Activated carboxyl groups are understood above to mean those carboxyl groups which are derivatized in such a way that they facilitate the reaction with a biomolecule. It is known which groups can be used for activation and reference can be made, for example, to M. and A. Bodanszky, "The Practice of Peptide Synthesis", Springer Verlag 1984. Examples are adducts of carboxylic acid with carbodiimides or activated esters such as hydroxybenzotriazole esters.
  • the activated carboxyl group is particularly preferably selected from
  • the activated esters of the compounds described above are prepared as known to those skilled in the art.
  • isothiocyanates or ⁇ -haloacetates the corresponding terminal amine precursors are reacted with thiophosgene or 2-halo-acetic acid halides using methods known from the literature.
  • the reaction with correspondingly derivatized esters of N-hydroxysuccinimide such as:
  • R 1 -R 6 substituents are an amide group, this is produced, for example, by reacting an activated carboxylic acid with an amine. The activation of the
  • Carboxylic acid is made according to the usual methods. Examples of suitable ones
  • Activating reagents are dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP) and 0- (benzotriazole-
  • HBTU 1, 3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate
  • O-nucleophilic catalysts such as N-hydroxysuccinimide (NHS) or N-hydroxybenzotriazole. If the substituent is a carboxylic acid function, it can be used in a protected form (for example in the form of the benzyl ester), and the protective group can then be split off by hydrogenolysis.
  • activated esters are preferably generated intermediately, which are then attacked by a nucleophilic group of the biomolecule. This creates a covalent link between the biomolecule and the compound of formula I.
  • Preferred activated esters are the esters of N-hydroxysuccinimide, the esters of paranitrophenol or the esters of pentafluorophenol.
  • a terminal amine is preferably used first, which, if necessary, can be provided with a suitable protective group.
  • Suitable protective groups are known from peptide chemistry. After the protective group has been split off, the isothiocyanate can be produced by reacting the primary terminal amine with thiophosgene. Nucleophilic groups of the biomolecule can be added to this.
  • the functional group is a maleimide which e.g. can react selectively with thiol functions of the biomolecule.
  • the functional group is a nucleophile (NH 2 , SH), which attacks a suitable functionality of the biomolecule (activated ester, maleimide, etc.).
  • a nucleophile NH 2 , SH
  • suitable functionality of the biomolecule activated ester, maleimide, etc.
  • Numerous biomolecules functionalized with maleimides are commercially available.
  • the conjugates are usually synthesized in such a way that a derivatized and functionalized ligand or chelate complex is first generated, which is then linked to the biomolecule.
  • the ligand or chelate complex according to the invention is incorporated into the biomolecule during the synthesis thereof. This can be done, for example, during the sequential synthesis of oligopeptides on the synthesis robot.
  • the protective groups customary in the synthesis of the corresponding biomolecule can be added to the inventive groups Connection will be introduced. These are then split off again in the course of the usual synthesis algorithms on the synthesizer.
  • the compounds according to the invention contain at least three centers of chirality. Even if no distinction is made in the description and claims between the different enantiomers, the compounds mentioned always include both enantiomers and, in the presence of several stereocenters, also all possible diastereomers and mixtures thereof.
  • biomolecule is understood to mean any molecule that either naturally occurs in the body, for example, or that was produced synthetically with an analogous structure. In addition, these include. Understand molecules that can interact with a biological, for example occurring in the body or a structure occurring there, so that, for example, the conjugates accumulate at certain desired locations on the body.
  • body is understood to mean any plant or animal body, animal and in particular human bodies being preferred.
  • Biomolecules are, in particular, the molecules that occur in living beings, which, as products of an evolutionary selection through orderly and complex interaction, fulfill specific tasks for the organism and form the basis of its life functions (metabolism and shape, reproduction, energy balance). Larger molecules (proteins, nucleic acids, polysaccharides, lipids, etc.) are usually built up in biomolecules from simple building blocks (amino acids, nucleobases, monosaccharides, fatty acids, etc.). Corresponding macromolecules are also referred to as biopolymers.
  • the biomolecule can advantageously have, for example, a polypeptide skeleton of amino acids with side chains which can react with the reactive group of the compounds of the formula I '(see below).
  • side chains include, for example, the carboxyl groups of aspartic acid and glutamic acid residues, the amino groups of lysine residues, the aromatic groups of tyrosine and histidine residues and the sulphhydryl groups of cysteine residues.
  • biomolecules are particularly suitable for forming the conjugates according to the invention:
  • Biopolymers proteins, such as proteins that have a biological function, HSA, BSA, etc., proteins and peptides that accumulate at certain points in the organism (e.g. on receptors, cell membranes, channels etc.), peptides that can be cleaved by proteases, peptides with synthetic breaking points (e.g.
  • labile esters, amides etc. peptides that are cleaved by metal prostheses, peptides with photo-cleavable linkers, peptides with oxidative agents (oxidases) cleavable groups, peptides with natural and unnatural amino acids, glycoproteins (glycopeptides), signal Proteins, antiviral proteins and apoctosis, synthetically modified biopolymers, such as biopolymers derivatized with linkers, modified metalloproteases and derivatized oxidase etc., carbohydrates (mono- to polysaccharides), such as derivatized sugars, sugars that can be split in the body, cyclodextrins and their derivatives, amino sugars, chitosan , Polysulfates and acetylneuraminic acid derivatives, antibodies such as monoclonal e Antibodies, antibody fragments, polyclonal antibodies, minibodies, single chains (also those that are linked to link
  • RNA and DNA also with unnatural bases
  • PNAs Hoechst
  • antisense ß- Amino acids
  • Seebach vector amines for infiltration into the cell
  • biogenic amines pharmaceuticals
  • oncological preparations synthetic polymers that are aimed at a biological target
  • metal chelates can also be bound to a single biomolecule (if it has several reactive groups).
  • the compounds of the formula I are furthermore suitable for conjugation to all those molecules which are reacted with fluorescent dyes in the prior art, for example in order to determine their localization by epifluorescence microscopy within the cell.
  • the compounds can also be conjugated with any medication in order to then follow the transport within the organism by the NMR technique after administration of the medication.
  • the conjugates according to the invention from the compounds of the formula I and the biomolecules contain further additional molecules which have been conjugated to the biomolecules. So with the term "biomolecule" in the sense of the invention includes all molecules that occur in biological systems and all molecules that are biocompatible (see also above).
  • the relaxivity of the complexes according to the invention and in particular their conjugates with biomolecules is so high that if they contain a paramagnetic ion they are particularly suitable for NMR diagnostics.
  • the compounds according to the invention surprisingly bind to proteins. This property enables them to stay in the bloodstream for longer, bound to plasma proteins, and thus to enable a representation of the vasal space.
  • locations of increased permeability such as those found in tumors, are also possible.
  • This increased vascular permeability continues to form the basis of tumor therapy with radioactive metal complexes.
  • the drug leaves the vessel within the tumor, remains in the tissue and exposes it to its therapeutically effective radiation.
  • the plasma protein binding also enables imaging diagnostics for the localization of infarcts or necrosis as a result of the accumulation of the substances according to the invention in the infarction or necrosis.
  • the myocardial infarction does not immediately result in an irretrievably inoperable tissue, but initiates a dynamic process that extends over a longer period (weeks to months).
  • the disease runs in about three phases, which are not sharply separated, but overlapping.
  • the first phase the development of myocardial infarction, comprises the 24 hours after the infarction, in which the destruction progresses like a shock wave (wave front phenomenon) from the subendocardium to the myocardium.
  • the second phase the already existing infarction, involves the stabilization of the area in which fiber formation (fibrosis) takes place as a healing process.
  • the third phase the healed infarction, begins after all destroyed tissue has been replaced by fibrous scar tissue. Extensive restructuring is taking place during this period.
  • Infarctions occur not only in the myocardium, but also in other tissues such as the brain or kidney. While the infarction is curable to a certain extent, only the harmful consequences for the rest of the organism can be prevented or at least alleviated in the case of necrosis, the locally limited tissue death. Necrosis can arise in many ways: from injuries, chemicals, oxygen deficiency or from radiation. As with an infarction, knowledge of the extent and type of necrosis is important for the further medical procedure.
  • Z ' represents a carboxyl protecting group and R -R 6 have the meaning given for R 1 -R 6 , but the functional groups contained therein are free, ie are not bound to a biomolecule, if appropriate after splitting off the protecting groups Z with a biomolecule and then (after the protective groups Z 'have been split off) the acids thus obtained in a manner known per se with at least one metal oxide or metal salt of an element of the atomic numbers. 21-29, 31, 32, 37-39, 42-44, 46, 47, 49, 58-71, 75, 77, 82 or 83 and then, if desired, acidic hydrogen atoms present with inorganic and / or organic or Amino acids converted into physiologically acceptable salts.
  • Lower alkyl, aryl and aralkyl groups are suitable as carboxyl protective groups Z ' , for example the methyl, ethyl, propyl, butyl, phenyl, benzyl, diphenylmethyl, triphenylmethyl, bis (4-nitrophenyl) methyl group and trialkylsilyl.
  • the protective groups Z ' are split off in a manner known per se, for example by hydrolysis, alkaline saponification of the esters, preferably with alkali in aqueous / alcoholic solution at temperatures from 0 ° C. to 50 ° C.
  • the compound 1 By alkaline saponification and subsequent ion exchange treatment, the compound 1 can be converted into the compound I ' with free carboxylic acids.
  • Compound 1, in which the carboxylic acids are still present as esters, can be obtained by catalytic oxidation of the benzyl compound of formula 2.
  • the oxidation is carried out analogously to the specification by Ishibashi et al., Tetrahedron, (1996), 13867-13880 with sodium periodate using ruthenium chloride as a catalyst.
  • the N-benzyl compound 2 is accessible by reducing the amide 3 with borane-tetrahydrofuran complex. The conditions are followed, as described, for example, in J. Arner. Chem. Soc, (1990), 9608.
  • the amide 3 is prepared from the nitrophenylalanine derivative 4 by reaction with N-benzylpyrrolidine -2,5-dicarboxylic acid monoethyl ester 5.
  • the formation of amide 3 follows according to the methods well known to the person skilled in the art, for example acid activation by:
  • Acid 5 is readily obtainable from diethyl 2,5-dibromadipate and benzylamine with subsequent enantioselective enzymatic saponification according to literature instructions (Colombo et al., Gazz, Chim. Ital. 126.8, 1996, 543-554).
  • Compound 4 is obtained by splitting off the protective group from compound 6.
  • the N-methoxybenzyl group can be easily oxidatively split off with cerammonium nitrate (CAN) (Smith et al. Tetrahedron Lett. (1991), 4859).
  • the compound 6 is in turn by alkylation of the 4-methoxybenzyl-4-nitrophenylalanine 7 with the N, N-bis (t-butyloxycarbonylmethyl) -2-bromethylamine 8 available from Rappoport under conditions buffered with phosphate, as is also described by Rappoport in J. Org. Chem., 58, 1151 (1993).
  • N-alkylation described by Rappoport
  • methods of N-alkylation which are well known to the person skilled in the art can also be used, for example Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry XI / 2 nitrogen compounds, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1957, p. 680; JE Rickman and TJJ Atkins, J. Am. Chem. Soc. 1974, 96, 2268.
  • the phenylalanine derivative 7 can be obtained by reductive amination of the 4-nitro-phenylalanine 9 with 4-nitrobenzaldehyde 10.
  • the reductive amination is carried out using sodium cyanoborohydride by the methods known to the person skilled in the art, for example as described in Eicher-Tietze, reactions and syntheses, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 2nd edition 1991, p. 85.
  • connection 10 is available as a commodity from Bachern or Fluka.
  • the nitro group contained in compound 1 serves directly as a binding site for biomolecules, for example via amide formation with the aid of activated esters or reductive amination with carbonyl groups or after conversion into selectively reacting groups.
  • These conversion reactions are well known to those skilled in the art.
  • Gansow (EP 484984) and Meares (US 4622420) describe the preparation of haloacetamides from acyclic complexing agents which are used for coupling with -SH groups or -NH 2nd groups.
  • the isothiocyanato group enables selective coupling with amino groups.
  • Their preparation and the reaction with amines to give the corresponding thioureas has been described, for example, in US Pat. No. 4,680,338 by Immunomedics.
  • the reaction with hydrazides to the thiosemicarbazides is described in the application WO 95/15335 by Neorx Corp. described ..
  • the introduction of the desired metal ions from complexes for the production of NMR diagnostics can take place in the manner as disclosed in the patents EP 71564, EP 130934 and DE-OS 34 01 052.
  • the metal oxide or a metal salt for example a chloride, mitrate, acetate, carbonate or sulfate
  • the desired element is dissolved or suspended in water and / or a lower alcohol (such as methanol, ethanol or isopropanol) and with the solution or suspension of the equivalent Amount of complexing agent according to the invention implemented.
  • any free carboxy groups still present are neutralized with the aid of inorganic bases (e.g. hydroxides, carbonates or bicarbonates) from e.g. Sodium, potassium, lithium, magnesium or calcium and / or organic bases such as primary, secondary and tertiary amines, e.g. Ethanolamine, morpholine, glucamine, N-methyl and N, N-dimethylglucamine, as well as basic amino acids, e.g. Lysine, arginine and ornithine or neutral or acidic amino acids originally from amides.
  • inorganic bases e.g. hydroxides, carbonates or bicarbonates
  • inorganic bases e.g. Sodium, potassium, lithium, magnesium or calcium and / or organic bases
  • primary, secondary and tertiary amines e.g. Ethanolamine, morpholine, glucamine, N-methyl and N, N-dimethylglucamine
  • basic amino acids e.g. Ly
  • the neutral complex compounds for example in acidic complex salts in aqueous solution or suspension, enough of the desired base can be added to achieve the neutral point.
  • the solution obtained can then be evaporated to dryness in vacuo.
  • water-miscible solvents such as lower alcohols (methanol, ethanol, isopropanol and others), lower ketones (acetone and others), polar ethers (tetrahydrofuran, dioxane, 1, 2- Dimethoxyethane and others) to precipitate and to obtain crystals that are easy to isolate and easy to clean.
  • water-miscible solvents such as lower alcohols (methanol, ethanol, isopropanol and others), lower ketones (acetone and others), polar ethers (tetrahydrofuran, dioxane, 1, 2- Dimethoxyethane and others) to precipitate and to obtain crystals that are easy to isolate and easy to clean.
  • the desired base already during the complex formation of the reaction mixture and thereby to save one process
  • the invention therefore also comprises a kit for the production of radiopharmaceuticals, comprising a compound of the formula I, in which Z represents a radioisotope.
  • the invention further relates to pharmaceutical compositions which contain at least one physiologically tolerable compound of the general formula I, optionally with the additives customary in galenics.
  • compositions according to the invention are prepared in a manner known per se by suspending or dissolving the complex compounds according to the invention - optionally with the addition of the additives customary in galenics - in an aqueous medium, and then optionally sterilizing the suspension or solution.
  • suitable additives are, for example, physiologically harmless buffers (such as tromethamine), additives of complexing agents or weak complexes (such as diethylenetriaminepentaacetic acid or the Ca complexes corresponding to the metal complexes according to the invention) or - if necessary - electrolytes such as e.g. Sodium chloride or, if necessary, antioxidants such as Ascorbic acid.
  • suspensions or solutions of the agents according to the invention in water or physiological saline solution are desired for enteral administration or other purposes, they are mixed with one or more auxiliary agents (eg methyl cellulose, lactose, mannitol) and / or surfactant (s) used in galenics. [eg lecithins, Tween ® , Myrj ® ] and / or flavoring (s) for flavor correction [eg essential oils] mixed.
  • auxiliary agents eg methyl cellulose, lactose, mannitol
  • surfactant eg lecithins, Tween ® , Myrj ®
  • flavoring (s) for flavor correction eg essential oils] mixed.
  • the invention therefore also relates to processes for the preparation of the complex compounds and their salts.
  • the final security is cleaning the isolated complex salt.
  • compositions according to the invention preferably contain 1 mol-1.3 mol / l of the complex salt and are generally dosed in amounts of 0.0001-5 mmol / kg. They are intended for enteral and parenteral administration.
  • the complex compounds according to the invention are used
  • Suitable ions are, for example, chromium (III), iron (II), cobalt (II), nickel (II), copper (II), praseodymium (III), neodymium (III), samarium (III) - and
  • Ytterbium (III) ion Because of their strong magnetic moment, gadolinium (III) -, terbium (III) -, dysprosium (III) -, holmium (III) -, erbium (III) -, manganese (II) - and are particularly preferred for NMR diagnosis iron (III) ion.
  • the agents according to the invention fulfill the diverse requirements for their suitability as contrast agents for magnetic resonance imaging. After oral or parenteral application, they are ideally suited to improve the meaningfulness of the image obtained with the aid of an MRI scanner by increasing the signal intensity. They also show the high effectiveness that is necessary to burden the body with the smallest possible amount of foreign substances and the good Compatibility, which is necessary to maintain the non-invasive character of the examinations.
  • the agents according to the invention make it possible to produce highly concentrated solutions, so that the volume of the circulatory system can be kept within reasonable limits and to compensate for the dilution with the body fluid, i.e. NMR diagnostics must be 100 to 1000 times more water soluble than for them NMR spectroscopy.
  • the agents according to the invention not only have a high stability in vitro, but also a surprisingly high stability in vivo, so that a release or an exchange of the ions which are not covalently bound in the complexes - in themselves toxic - within the time in which the new contrast medium are completely excreted again, takes place only extremely slowly.
  • the agents according to the invention for use as NMR diagnostics are dosed in amounts of 0.0001-5 mmol / kg, preferably 0.005-0.5 mmol / kg. Details of the application are e.g. in H.-J. Weinmann et al., Am. J. of Roentgenology 142, 619 (1984).
  • Low doses (below 1 mg / kg body weight) of organ-specific NMR diagnostics can be used, for example, to detect tumors and heart attacks.
  • Particularly low doses of the complexes according to the invention are suitable for use in radiotherapy and radio diagnostics.
  • Doses of 0.5 pM / kg - 5 ⁇ M / kg, preferably 50 pM / kg - 500 nmol / kg, are used for both therapeutic and diagnostic purposes.
  • About 100-100,000 times lower molar concentrations are usually used with regard to the radioactive metal ion than is the case for the chelators or chelator bioconjugates, so that the chelators or chelator bioconjugates are therefore present in excess.
  • the complex compounds according to the invention can advantageously be used as susceptibility reagents and as s ⁇ reagents for in v / Vo NMR spectroscopy. Because of their favorable radioactive properties and the good stability of the complex compounds they contain, the agents according to the invention are also suitable as radio-diagnostic and radiotherapeutic agents. Details of their use and dosage are described, for example, in "Radiotracers for Medical Applications", CRC-Press, Boca Raton, Florida, 1983, and in Eur. J. Nucl. Med. 17 (1990) 346-364 and Chem. Rev. 93 (1993) 1137-1156.
  • the complexes with the isotopes 111 ln and 99m Tc are suitable for SPECT.
  • positron emission tomography which uses positron-emitting isotopes such as 43 Sc, 44 Sc, 52 Fe, 55 Co, 68 Ga, 64 Cu, 86 Y and 94 Tc (Heiss, WD; Phelps, ME; Positron Emission Tomography of Brain, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1983).
  • the compounds according to the invention are surprisingly also suitable for differentiating malignant and benign tumors in areas without a blood-brain barrier.
  • the substances according to the invention accumulate in malignant tumors (no diffusion into healthy tissue, but high permeability of tumor vessels), they can also support the radiation therapy of malignant tumors. This differs from the corresponding diagnostics only in the amount and type of isotope used.
  • the aim is to destroy tumor cells by high-energy short-wave radiation with the shortest possible range. Interactions of the metals contained in the complexes (such as iron or gadolinium) with ionizing radiation (eg X-rays) or with neutron beams are used for this purpose. This effect significantly increases the local radiation dose where the metal complex is located (e.g. in tumors).
  • the metal complex conjugates according to the invention are therefore also suitable as Radiosensitizing substance in the radiation therapy of malignant tumors (eg taking advantage of Mössbauer effects or in neutron capture therapy).
  • Suitable ⁇ -emitting ions are, for example, 46 Sc, 47 Sc, 48 Sc, 72 Ga, 73 Ga, 90 Y, 67 Cu, 109 Pd, 111 Ag, 149 Pm, 153 Sm, 166 Ho, 177 Lu, 186 Re and 188 Re, with 90 Y, 177 Lu, 72 Ga, 153 Sm and 67 Cu being preferred.
  • Suitable D-emitting ions which have short half-lives are, for example, 211 At, 211 Bi, 212 Bi, 213 , Bi and 214 Bi, 212 Bi being preferred.
  • a suitable photon and electron-emitting ion is 58 Gd, which can be obtained from 157 Gd by neutron capture.
  • the central ion must be derived from a Mössbauer isotope such as 57 Fe or 151 Eu.
  • the therapeutic agents according to the invention can be used together with a suitable carrier such as e.g. Serum or physiological saline and together with another protein such as e.g. Human serum albumin can be administered.
  • a suitable carrier such as e.g. Serum or physiological saline
  • another protein such as e.g. Human serum albumin
  • the dosage depends on the type of cellular disorder, the metal ion used and the type of imaging method.
  • the therapeutic agents according to the invention are preferably administered parenterally, preferably IV.
  • radiotherapeutics are e.g. in R. W. Kozak et al. TIBTEC, October 1986, 262 (see also Bioconjugate Chem. 12 (2001) 7-34).
  • AAV stands for general working procedure
  • RP-18 denotes a “reversed phase” stationary chromatography phase.
  • the number of complexes per biomolecule was determined using scintigraphy or ICP (inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy).
  • the batch solution is filtered, the filtrate is ultrafiltered on an AMICON ® YM30 (cut off 30,000 Da), the retentate is chromatographed on a Sephadex ® G50 column and the product fractions are freeze-dried.
  • Washed sodium chloride solution dried with magnesium sulfate and concentrated.
  • the aqueous phase was extracted four times with 100 ml of diethyl ether each time.
  • the combined organic phases were washed with saturated aqueous sodium chloride solution, dried with magnesium sulfate and concentrated.
  • the crude product was purified by column chromatography (Si0 2 , hexane-ethyl acetate (5: 1)).
  • the desired product 8e was obtained in 69.7% yield (6.18 g; 9.97 mmol).
  • the aqueous phase was extracted four times with 100 ml dichloromethane each time.
  • the combined organic phases were washed with saturated aqueous sodium chloride solution, dried with magnesium sulfate and concentrated.
  • the crude product was purified by column chromatography (Si0 2 , hexane-ethyl acetate (2: 1)).
  • the intermediate was dissolved in 200 ml of dichloromethane and 73 g (279 mmol) of triphenylphosphine and 93 g (279 mmol) of tetrabromomethane in 100 ml of dichloromethane were added at 0 ° C.
  • the solution was Stirred overnight and poured onto 400 ml of stirred ice water.
  • the organic phase was separated.
  • the aqueous phase was extracted four times with 100 ml of diethyl ether each time.
  • the combined organic phases were washed with saturated aqueous sodium chloride solution, dried with magnesium sulfate and concentrated.
  • the crude product was taken up in 400 ml of hexane and stirred at 0 ° C. overnight.
  • the suspension was filtered.
  • the filtrate was concentrated and purified by column chromatography (Si0 2 , hexane-ethyl acetate (5: 1)).
  • Acidic ion exchanger IRA 120 was added until the pH was 3. The ion exchanger was separated by filtration. Dioxane was removed on a rotary evaporator, the aqueous solution was diluted with water and freeze-dried. The residue was taken up in 80 ml of dichloromethane and 30 g (263 mmol) of trifluoroacetic acid were added dropwise. The solution was stirred for 30 minutes at room temperature. The solution was concentrated on a rotary evaporator. Soaked in distilled water and freeze-dried. The residue was taken up in water again and freeze-dried again. The desired product 8g resulted in a yield of 67.9% (2.37 g; 4.56 mmol). MS-FAB (M + +1, 21): 519
  • the residue was taken up in 50 ml of dichloromethane, cooled to -5 ° C. and mixed with 50 ml of trifluoroacetic acid. The solution was warmed to room temperature and stirred for 2 hours. The reaction solution was quickly concentrated on a rotary evaporator. The residue was concentrated using an oil pump vacuum and taken up in 40 ml of dioxane. 50 ml of distilled water and 15 ml (30 mmol) of a 2N sodium hydroxide solution were added. The solution was stirred at 40 ° C for 2 hours. The solution was cooled. Acidic ion exchanger IRA 120 was added until the pH was 3. The ion exchanger was filtered off.
  • the antibody has 200 ⁇ g of an antibody with freely accessible thiol groups (for example HuM195 (cf. Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med.
  • the antibody has 200 ⁇ g of an antibody with freely accessible thiol groups (for example HuM195 (cf. Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; commercially available from Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) no freely accessible thiol groups, these can be generated by using 2-lminothiolan HCI (e.g. EP 0 607 222 B1)) were diluted in 1.2 ml borate buffer (50 miVi, pH 8.5) with 154 ⁇ g (240 nmol ) Product from Example 11, dissolved in 50 ⁇ l borate buffer (see above), added and stirred at 37 ° C. for 3 hours.
  • freely accessible thiol groups for example HuM195 (cf. Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; commercially available from Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA
  • 2-lminothiolan HCI e.g. EP 0 607 222
  • the borate buffer solution was exchanged for an acetate buffer by placing the sample solution three times for 1 hour in Slide-A-Lyzer 10000, Pierce MWCO (dialysis method) against 200 ml of NaOAc buffer 0.1 M (pH 6.0) , Finally, it was placed overnight against 400 ml of NaOAc buffer 0.1M (pH 6).
  • the solution was mixed with 80 ⁇ l (0.05M HCl) [ 11 In ] InCl 3 (27.88 MBq) and stirred for 30 min at room temperature. It was purified on a NAP-5 column (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, Mobile Phase: PBS).
  • Example 22 (1 ' R, 2R, 5S) -5 - ⁇ [ ⁇ 2 - [(5-amino-1-carboxy-pentyl) - (ethoxy-hydroxy-phosphorylmethyl) - amino] -ethyl ⁇ - (ethoxy-hydroxy-phosphorylmethyl ) -amino] -methyi ⁇ -1-carboxymethyl-pyrrolidine-2-carboxylic acid
  • a mixture of about 1 g of dried silica gel, 100 mg (1.0 mmol) of maleic anhydride, 550 mg (1.0 mmol) of 2 g and 35.6 mg (0.1 mmol) of tantalum (V) chloride were in the Microwave (300W) heated for 5 min.
  • the residue was eluted with methanol over a frit.
  • the filtrate was concentrated.
  • the residue was taken up in water.
  • the solution was freeze-dried. Part of the residue was purified by semipreparative RP-HPLC. Acetonitrile-water mixture (20:80).
  • the aqueous phase was extracted four times with 150 ml of dichloromethane each time.
  • the combined organic phases were washed with saturated aqueous sodium chloride solution, dried with magnesium sulfate and concentrated.
  • the crude product was purified by column chromatography (Si0 2 , hexane-ethyl acetate (4: 1)).
  • the desired product 25a was obtained in 68% yield (8.37 g, 11.3 mmol).
  • an antibody with freely accessible thiol groups for example HuM195 (cf. Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; commercially available from Protein Design Labs Inc, Mountainview, CA, USA) - if the antibody does not have any freely accessible thiol groups, these can be generated by using 2-lminothiolan HCl (e.g. EP 0 607 222 B1)) were placed in 1.2 ml borate buffer (50 mM, pH 8.5), diluted with 154 ⁇ g (240 nmol) product from Example 11, dissolved in 50 ⁇ l borate buffer (see above), and stirred at 37 ° C. for 3 hours.
  • 2-lminothiolan HCl e.g. EP 0 607 222 B1
  • the borate buffer solution was exchanged for an acetate buffer by dissolving the sample solution three times for 1 h in Slide-A-Lyzer 10000, Pierce, MWCO (dialysis method) against 200 ml of NaOAc buffer 0.1 M (pH 6.0). was asked. Finally, 0.1M (pH 6) was placed against 400 ml of NaOAc buffer overnight. The solution was mixed with 50 MBq [ 90 Y] YCI 3 and stirred for 30 min at room temperature. It was purified on a NAP-5 column (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, Mobile Phase: PBS).
  • the antibody has 200 ⁇ g of an antibody with freely accessible thiol groups (for example HuM195 (cf. Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; commercially available from Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) no freely accessible thiol groups, these can be generated by using 2-lminothiolan HCI (e.g. EP 0 607 222 B1)) were diluted in 1.2 ml borate buffer (50 mM, pH 8.5) with 154 ⁇ g (240 nmol ) Product from Example 11, dissolved in 50 ⁇ l borate buffer (see above), added and stirred at 37 ° C. for 3 hours.
  • freely accessible thiol groups for example HuM195 (cf. Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; commercially available from Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA
  • 2-lminothiolan HCI e.g. EP 0 607 222
  • the borate buffer solution was exchanged for an acetate buffer by placing the sample solution three times for 1 hour in Slide-A-Lyzer 10000, Pierce, MWCO (dialysis method) against 200 ml of NaOAc buffer 0.1 M (pH 6.0) has been. Finally, 0.1M (pH 6) was placed against 400 ml of NaOAc buffer overnight. The solution was mixed with [ 46 Sc] ScCI 3 [ 47 Sc] ScCI 3 or [ 48 Sc] ScCI 3 and stirred for 30 min at room temperature. It was purified on a NAP-5 column (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, Mobile Phase: PBS).

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Abstract

Die Erfindung betrifft Konjugate 2,4-Ethano- und 2,4-Propano- überbrückter 3,6,9-Triaza-nonansäure-N,N,N-tetraessigsäure- und entsprechender phosphorsäureestermethylen-Derivate der Formel (1) und deren Abkömmlinge mit Biomolekülen, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung als Kontrastmittel in der NMR- und Radiodiagnostik sowie für die Radiotherapie, wohin die Substituenten wie in Anspruch 1 definiert sind.

Description

Konjugate 2,4-Ethano- und 2,4-Propano- überbrückter 3,6,9-Triaza-nonansäure- 3N,6N,9,9N-tetraessigsäure- und entsprechender phosphorsäuremethylen-Derivate und deren Abkömmlinge mit Biomolekülen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Herstellung pharmazeutischer Mittel
Die Erfindung betrifft die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstände, das heißt, Konjugate 2,4-Ethano- und 2,4-Propano- überbrückter 3,6,9-Triaza- nonansäure-3N,6N,9,9N-tetraessigsäure- und entsprechender phosphorsäuremethylen- Derivate und deren Abkömmlinge mit Biomolekülen, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Herstellung pharmazeutischer Mittel für die Radiodiagnostik, Radiotherapie oder NMR-Diagnostik.
Die Anwendung von Radiopharmaka für diagnostische und therapeutische Zwecke ist seit langem im Bereich der biologischen und medizinischen Forschung bekannt. Insbesondere werden Radiopharmaka dazu benutzt, um bestimmte Strukturen wie beispielsweise das Skelett, Organe oder Gewebe darzustellen. Die diagnostische Anwendung setzt den Gebrauch solcher radioaktiver Mittel voraus, die sich nach Applikation spezifisch in den Strukturen im Patienten anreichern, die untersucht werden sollen. Diese sich lokal anreichernden radioaktiven Mittel können dann mittels geeigneter Detektoren, wie beispielsweise Szintillationskameras oder anderer geeigneter Aufnahmeverfahren, aufgespürt, aufgenommen oder szintigraphiert werden. Die Verteilung und relative Intensität des detektierten radioaktiven Mittels kennzeichnet den Ort einer Struktur, in dem sich das radioaktive Mittel befindet, und kann die Anwesenheit von Anomalien in Strukturen und Funktionen, pathologische Veränderungen etc. darstellen.
In ähnlicher Weise können Radiopharmaka als therapeutische Mittel dem Patienten verabreicht werden, um bestimmte krankhafte Gewebe oder Bereiche zu bestrahlen. Solche Behandlung erfordert die Bereitstellung radioaktiver therapeutischer Mittel, die sich in bestimmten Strukturen, Organen oder Geweben anreichern. Ein von der Firma IDEC Pharmaceuticals Corp. entwickeltes Radiopharmakon zur Therapie des non- Hodgkin-Lymphoms stellt Zevalin® dar (s. z.B. Cancer (2002) Feb 15; 94, (4 Suppl):1349-57). Strahlendes Ion sind hierbei 111-ln oder 90-Y, die über einen Chelator (Methylsubstituiertes-Diethylen-Triamin-Penta-Essigsäure-Derivat (mx-DTPA) an einen Tumor-spezifischen Antikörper gebunden sind.
Die kernmagnetische Resonanz (NMR oder MRI) ist heute eine breit angewandte, für die in Vo-Bildgebung ausgenutzte Methode der medizinischen Diagnostik, mit der über die Messung der magnetischen Eigenschaften der Protonen im Körperwasser, Körpergefäße und Körpergewebe (einschließlich Tumore) dargestellt werden können. Es werden hierzu z.B. Kontrastmittel eingesetzt, die durch Beeinflussung bestimmter NMR-Parameter der Körperprotonen (z.B. der Relaxationszeiten T1 und T2) eine Kontrastverstärkung in den resultierenden Bildern bewirken bzw. diese Bilder erst lesbar machen. Vor allem kommen Komplexe paramagnetischer Ionen, wie z.B. Gadolinium-enthaltende Komplexe (z.B. Magnevist®) aufgrund des Effekts der paramagnetischen Ionen auf die Verkürzung der Relaxationszeiten zur Anwendung.
Sowohl paramagnetische Ionen, wie z.B.: Gd3+, Mn2+, Cr3+, Fe3+ und Cu2+ als auch viele metallische Radionuklide können nicht in freier Form als Lösungen verabreicht werden, da sie hoch toxisch sind. Um diese Ionen für eine in wVo-Anwendung geeignet zu machen, werden sie in der Regel komplexiert. Beispielsweise wird in der EP-A-0 071 564 u.a. das Megluminsalz des Gadolinium(lll)-Komplexes der Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) als Kontrastmittel für die NMR-Tomographie beschrieben. Ein Präparat, das diesen Komplex enthält, wurde unter dem Namen Magnevist® weltweit als erstes NMR-Kontrastmittel zugelassen. Dieses Kontrastmittel verteilt sich nach intravenöser Applikation extrazellulär und wird durch glomeruläre Sekretion renal ausgeschieden. Eine Passage intakter Zellmembranen wird praktisch nicht beobachtet. Magnevist® ist besonders gut für die Darstellung pathologischer Bereiche (z.B. Entzündungen, Tumore) geeignet.
Die bekannten Radiotherapeutika und Kontrastmittel sind jedoch nicht für alle Anwendungsfälle befriedigend einzusetzen. So verteilen sich viele dieser Mittel im gesamten extrazellulären Raum des Körpers. Um die Effizienz dieser Mittel in der in vivo-Diagnostik und der Therapie zu steigern, wird versucht, deren Spezifität und Selektivität beispielsweise zu Targetzellen oder gewünschten Bereichen und Strukturen des Körpers zu erhöhen. Eine Verbesserung dieser Eigenschaften ist beispielsweise durch Kopplung der Metallkomplexe an Biomoleküle nach dem "Drug-Targeting"- Prinzip zu erreichen. Als Biomoleküle bieten sich Plasmaproteine, Antikörper, deren Fragmente, Hormone, Wachstumsfaktoren und Substrate von Rezeptoren und Enzymen an (z.B. WO 97/12850, Institut für Diagnostikforschung an der FU Berlin). Doch bislang ist z.B. die Tumorspezifität (Tumoranreicherung) in vielen Fällen noch nicht ausreichend hoch, was besonders bei der Radioimmuntherapie ein wichtiges Ziel ist.
Es ist weiterhin wünschenswert, Mittel für die Diagnostik und Therapie zur Verfügung zu stellen, die neben einer möglichst hohen Zielspezifität eine große in v/Vo-Stabilität hinsichtlich der zumeist toxischen komplexierten Metallionen besitzen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, neue Mittel für die Radio- und NMR-Diagnostik sowie die Radiotherapie zur Verfügung zu stellen, die die genannten Nachteile nicht aufweisen und insbesondere eine hohe in Vo-Stabilität, gute Verträglichkeit und vor allem organspezifische Eigenschaften aufweisen. Einerseits soll die Retention in den zu untersuchenden Tumorgeweben oder Organen ausreichend sein, um bei möglichst geringer Dosierung die für eine effiziente Diagnose und Therapie notwendige Qualität von Bildern bzw. ausreichende Bestrahlung zu erzielen. Andererseits aber soll anschließend eine möglichst schnelle und weitestgehend vollständige Ausscheidung der Metalle aus dem Körper gewährleistet sein. Ferner sollen die NMR-Kontrastmittel eine hohe Protonen-Relaxivität zeigen und damit bei einer Steigerung der Signalintensität eine Reduzierung der Dosis erlauben.
Es wurden verschiedene Versuche unternommen, Metallionen mit diagnostischem oder therapeutischem Nutzen zu komplexieren und somit in eine nicht-toxische Form zu überführen. Dabei haben sich zyklische und azyklische Polyaminocarbonsäuren als geeignete Chelatoren erwiesen.
Das oben genannte und von der Firma IDEC Pharmaceuticals Corp. entwickelte
Radiopharmakon Zevalin® zur Therapie des non-Hodgkin-Lymphoms nutzt ein DTPA- Derivat, welches an zwei definierten Positionen substituiert ist. In dem Patent US 528650 wird eine DTPA beschrieben, bei der einer der beiden Ethylenreste Bestandteil eines Cyclohexanringes ist.
Figure imgf000005_0001
In dem Patent US 4880008 wird ein weiterer Typ der DTPA beschrieben, bei dem der Cyclohexanring durch einen Benzolring ersetzt wird. In diesem Patent wird auch die Dibenzo-DTPA als für das MR-Imaging geeignete Verbindung genannt.
Figure imgf000005_0002
In dem Europäischen Patent EP 250350 wird nicht ein carbocyclischer, sondern ein Pipe-razinring als Strukturelement der DTPA verwendet, wobei der mittlere Stickstoff Teil dieses Ringes ist.
Figure imgf000005_0003
In J. Org. Chem. (2000), 65, 4048-57 beschreiben Pickersqill und Rapoport einen weiteren DTPA-Typ, bei dem eine der beiden Ethylengruppen Bestandteil eines 3- Amino-pyrrolidins ist.
Figure imgf000006_0001
a: Ra=-CH2-OH, Rb=H, RC=H b: Ra=H, Rb=-CH2-OH, RC=H c: Ra=H, Rb=H, Rc=-CH2-OH
Obwohl die modifizierten DTPA's mitunter verbesserte Eigenschaften - z.B. erhöhte Komplexstabilität verglichen mit der unsubstituierten DTPA - zeigen, besteht unverändert ein Bedarf, die Metallkomplexstabilität weiter zu erhöhen und Mittel für die Diagnose und die Therapie zur Verfügung zu stellen, die eine möglichst hohe Spezifität aufweisen.
Es wurde nun gefunden, dass überraschenderweise DTPA-Derivate, bei denen eine Ethano- bzw. Propanobrücke über einen der beiden äußeren Stickstoffe hinweg verknüpft ist, so dass 2,5-substituierte Pyrrolidine bzw. 2,6- substituierte Piperidine entstehen, eine größere kinetische Stabilität in vivo und somit geringere akute Toxizitat der entsprechenden Metallkomplexe aufweisen.
Weiterhin ist auch erstaunlich, dass durch die strukturelle Veränderung keine Verringerung der thermodynamischen Stabilität erfolgt. Darüber hinaus zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine erhöhte Relaxivität und/oder Wasserlöslichkeit und/oder Spezifität, so dass sie sich als pharmazeutische Mittel insbesondere für die Radio- und NMR-Diagnostik sowie Radiotherapie eignen.
Die Erfindung betrifft somit Konjugate der allgemeinen Formel I
Figure imgf000007_0001
worin Z für ein Wasserstoffatom oder ein Metallionenäquivalent eines Elements der Ordnungszahlen 21-29, 31 , 32, 37-39, 42-44, 46, 47, 49, 58-71 ,
75, 77, 82 oder 83 steht, für eine Gruppe -COO- , eine Gruppe -P(0)(OC C6-aIkyl)-0- oder eine Gruppe -P(0)(OH)-0- steht, für die Ziffern 0 oder 1 steht,
R1 - R6 unabhängig voneinander für ein Wasserstoff atom, einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten und gegebenenfalls durch ein bis sechs O-Atome, Phenylen-, -NHCO-, -CONH-, -O-(CO)-
Figure imgf000007_0002
und/oder -NH-(C=S)-NH-Gruppen unterbrochenen Ci - C25 -Alkylrest, der gegebenenfalls an einer beliebigen Stelle mit ein bis sechs Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, Aminogruppen und/oder einer anderen funktioneilen bindenden Gruppe, die mit einem Biomolekül verknüpft sein kann, substituiert ist, oder für eine Phenyl-Cι-C25-alkylgruppe stehen, deren Phenylrest gegebenenfalls mit einer Nitrogruppe, einer Aminogruppe oder einer anderen funktioneilen bindenden Gruppe, die mit einem Biomolekül verknüpft sein kann, substituiert ist, sowie deren Salze mit organischen oder anorganischen Basen, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten R1-R6 nicht für H steht und dass mindestens einer der Substituenten R1- R6 ein über eine funktionelle Gruppe verknüpftes Biomolekül enthält und mindestens zwei Z für ein Metallionenäquivalent stehen. Der Carboazaring ist vorzugsweise c/s-verknüpft.
Wenn in der erfindungsgemäßen Verbindung Phosphorsäureester zum Einsatz kommen (-P(0)-(0-C C6)-alkyl-0— ), so steht Alkyl bevorzugt für Ethyl.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten mindestens drei Chiralitätszentren. Auch wenn in der Beschreibung und den Ansprüchen nicht zwischen den verschiedenen Enantiomeren unterschieden wird, umfassen die genannten Verbindungen immer beide Enantiomeren und bei Vorliegen mehrerer Stereozentren auch alle möglichen Diastereomeren sowie deren Mischungen.
Die Reste R1 - R6 können unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 - 25 Kohlenstoffatomen stehen (wobei mindestens einer der Reste ein über eine funktioneile Gruppe gebundenes Biomolekül enthält). Dieser Alkylrest kann geradkettig oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt sein (z.B.:
Figure imgf000008_0001
und ist gegebenenfalls an einer beliebigen Stelle mit ein bis sechs Carboxyl-, Hydroxyl-, und/oder Aminogruppen (z.B.:
Figure imgf000009_0001
oder mindestens einer anderen funklionellen bindenden Gruppe versehen, die mit einem Biomolekül verknüpft sein kann - wie z.B. Carboxyl, aktiviertem Carboxyl, Amino,
Nitro, Isocyanat, Isothiocyanat, Hydrazin, Semicarbazid, Thiosemibarbazid,
Chloracetamid, Bromacetamid, lodacetamid, Acryl, Acylamino, gemischten Anhydriden,
Azid, Säurechlorid, Hydroxid, Sulfonylchlorid, Vinylsulphon, Carbodiimid, Maleimid,
Dioxo oder einer anderen funktioneilen bindenden Gruppe (z.B.
Figure imgf000009_0002
Der Ci - C25 Alkylrest kann gegebenenfalls durch ein bis sechs O-Atome, Phenylen-
-NHCO-, -CONH-, -0-(CO)-NH-
Figure imgf000009_0003
und/oder -NH-(C=S)-NH-Gruppen unterbrochen sein (z.B. '°^^^0^\/0\/\NH
' N -/^"θ'^ / ^-^^0^^^ /^ H,
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
R -R6 kann auch für eine Phenyl-Cι-C25-aralkylgruppe stehen, deren Phenylrest z.B. mit Carboxyl, aktiviertem Carboxyl, Amino, Nitro, Isocyanat, Isothiocyanat, Hydrazin, Semicarbazid, Thiosemibarbazid, Chloracetamid, Bromacetamid, lodacetamid, Acryl, Acylamino, gemischten Anhydriden, Azid, Hydroxid, Sulfonylchlond, Vinylsulphon, Carbodiimid, einem Maleimid, Diazo (z.B.:
Figure imgf000011_0001
) oder einer anderen funktionellen bindenden Gruppen substituiert sein kann über die ein Biomolekül verknüpft ist..
Die Ethylenbrücke, die die Substituenten R3 und R4 trägt, kann unsubstituiert sein (R3=H und R4=H). Wenn sie aber substituiert ist, dann kommen vorzugsweise Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, Nitroben∑yl-, Hydroxymethyl- oder Aminobenzylgruppen in Betracht.
Eine Vielzahl der oben genannten R1-R6-Substituenten gestattet eine selektive Umsetzung mit funktionellen Gruppen der Biomoleküle im optimalen pH-Bereich, beispielsweise die Addition an -SH-Gruppen (Cystein im Biomolekül), und zwar ausschließlich von -SH-Gruppen, z.B. an Maleimide ((2,5-Dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1- yl)-Verbindungen, s.o.) oder Bromacetamide, wenn die Kopplung im schwach sauren pH-Bereich stattfindet.
Unter aktivierter Carboxylgruppe werden vorstehend solche Carboxylgruppen verstanden, die so derivatisiert sind, daß sie die Reaktion mit einem Biomolekül erleichtern. Welche Gruppen zur Aktivierung verwendet werden können, ist bekannt und es kann beispielsweise auf M. und A. Bodanszky, "The Practice of Peptide Synthesis", Springerverlag 1984 verwiesen werden. Beispiele sind Adukte der Carbonsäure mit Carbodiimiden oder aktivierter Ester wie z.B. Hydroxybenzotriazolester. Besonders bevorzugt wird die aktivierte Carboxylgruppe ausgewählt aus
Figure imgf000012_0001
Die aktivierten Ester der vorstehend beschriebenen Verbindungen werden wie dem Fachmann bekannt hergestellt. Für den Fall von Isothiocyanaten oder α-Halogen- acetaten werden die entsprechenden terminalen Aminvorstufen nach literaturbekannten Methoden mit Thiophosgen oder 2-Halo-Essigsäure-Halogeniden umgesetzt. Auch die Umsetzung mit entsprechend derivatisierten Estern von N- Hydroxysuccinimid wie beispielsweise:
Figure imgf000012_0002
ist möglich (Hai = Halogen).
Allgemein können für diesen Zweck alle üblichen Aktivierungsmethoden für Carbonsäuren verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Enthalten die
R1-R6-Substituenten eine Amidgruppe, so wird diese beispielsweise hergestellt, indem eine aktivierte Carbonsäure mit einem Amin umgesetzt wird. Die Aktivierung der
Carbonsäure erfolgt nach den üblichen Methoden. Beispiele für geeignete
Aktivierungsreagentien sind Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC), Benzotriazol-1- yloxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat (BOP) und 0-(Benzotriazol-
1-yl)-1 ,1 ,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), vorzugsweise DCC. Auch der Zusatz von O-nukleophilen Katalysatoren, wie z.B. N-Hydroxysuccinimid (NHS) oder N-Hydroxybenzotriazol ist möglich. Handelt es sich beim Substituenten um eine Carbonsäurefunktion, so kann diese in geschützter Form (z.B. in Form des Benzylesters) eingesetzt werden, die Abspaltung der Schutzgruppe kann dann hydrogenolytisch erfolgen.
Um diese Carbonsäurefunktion an eine geeignete funktionelle Gruppe eines geeigneten Biomoleküls (zur Beschreibung von Biomolelülen: s.u.) zu knüpfen, sollte diese im Regelfall zunächst aktiviert werden. Bevorzugt werden dazu aktivierte Ester intermediär erzeugt, welche dann von einer nukleophilen Gruppe des Biomoleküls angegriffen werden. Auf diese Weise entsteht eine kovalente Verknüpfung zwischen dem Biomolekül und der Verbindung der Formel I. Bevorzugte aktivierte Ester sind die Ester des N-Hydroxysuccinimids, die Ester des Paranitrophenols oder die Ester des Pentafluorphenols. Soll die funktionelle Gruppe in Form eines Isothiocyanats an das Biomolekül geknüpft werden, so wird bevorzugt zunächst ein terminales Amin verwendet, welches, wenn notwendig, mit einer geeigneten Schutzgruppe versehen sein kann. Geeignete Schutzgruppen sind aus der Peptidchemie bekannt. Nach Abspaltung der Schutzgruppe kann durch Umsetzung des primären terminalen Amins mit Thiophosgen das Isothiocyanat erzeugt werden. An dieses können nukleophile Gruppen des Biomoleküls addiert werden.
In einer Ausführungsform stellt die funktionelle Gruppe ein Maleinimid dar, welches z.B. selektiv mit Thiolfunktionen des Biomoleküls reagieren kann.
In einer anderen Ausführungsform ist die funktionelle Gruppe ein Nukleophil (NH2, SH), welches an einer geeigneten Funktionalität des Biomoleküls angreift (aktivierter Ester, Maleinimid, etc.). Zahlreiche mit Maleinimiden funktionalisierte Biomoleküle sind kommerziell erhältlich.
Die Synthese der Konjugate erfolgt in der Regel derart, dass zunächst ein derivatisierter und funktionalisierter Ligand oder Chelatkomplex erzeugt wird, welcher dann an das Biomolekül geknüpft wird. Es ist aber auch möglich, daß im Falle der Verwendung von synthetisch hergestellten Biomolekülen der erfindungsgemäße Ligand oder Chelatkomplex während der Synthese des Biomoleküls in dieses eingebaut wird. Dies kann beispielsweise während der sequentiellen Synthese von Oligopeptiden am Syntheseroboter erfolgen. Falls erforderlich, können dazu die in der Synthese des entsprechenden Biomoleküls üblichen Schutzgruppen in die erfindungsgemäße Verbindung eingeführt werden. Diese werden dann im Zuge der üblichen Synthesealgorithmen am Synthesizer wieder abgespalten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten mindestens drei Chiralitätszentren. Auch wenn in der Beschreibung und den Ansprüchen nicht zwischen den verschiedenen Enantiomeren unterschieden wird, umfassen die genannten Verbindungen immer beide Enantiomeren und bei Vorliegen mehrerer Stereozentren auch alle möglichen Diastereomeren sowie deren Mischungen.
Unter "Biomolekül" wird vorliegend jedes Molekül verstanden, das entweder natürlich beispielsweise im Körper auftritt oder mit analoger Struktur synthetisch hergestellt wurde. Darüber hinaus werden hierunter solche. Moleküle verstanden, die mit einem biologisch, beispielsweise im Körper auftretenden Molekül oder einer dort auftretenden Struktur in Wechselwirkung treten können, so daß sich beispielsweise die Konjugate an bestimmten, gewünschten Stellen des Körpers anreichern. Unter "Körper" wird vorliegend jeder pflanzliche oder tierische Körper verstanden, wobei tierische und insbesondere menschliche Körper bevorzugt sind.
Biomoleküle sind insbesondere die in Lebewesen auftretenden Moleküle, die als Produkte einer evolutionären Selektion durch geordnetes und komplexes Zusammenwirken spezifische Aufgaben für den Organismus erfüllen und die Grundlage seiner Lebensfunktionen (Stoff- und Formwechsel, Fortpflanzung, Energiehaushalt) ausmachen. In Biomolekülen sind zumeist aus einfachen Bausteinen (Aminosäuren, Nucleobasen, Monosacchariden, Fettsäuren, etc.) größere Moleküle (Proteine, Nucleinsäuren, Polysaccharide, Lipide, etc.) aufgebaut. Entsprechende Makromoleküle werden auch als Biopolymere bezeichnet.
Vorteilhaft kann das Biomolekül beispielsweise ein Polypeptidgerüst aus Aminosäuren mit Seitenketten aufweisen, die mit der reaktiven Gruppe der Verbindungen der Formel I' (S. weiter unten) eine Reaktion eingehen können. Solche Seitenketten schließen beispielsweise die Carboxylgruppen von Asparaginsäure- und Glutaminsäureresten, die Aminogruppen von Lysinresten, die aromatischen Gruppen von Tyrosin- und Histidinresten und die Sulphhydrylgruppen von Cysteinresten ein. Eine Übersicht über Biomoleküle mit zahlreichen Beispielen findet sich in dem Skriptum "Chemie der Biomoleküle" der TU-Graz (H. Berthold et al., Institut für Organische Chemie, TU-Graz, 2001), das auch über das Internet unter www.orgc.tu-graz.ac.at eingesehen werden kann. Der Inhalt dieses Dokuments wird durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.
Zur Bildung der erfindungsgemäßen Konjugate sind folgende Biomoleküle besonders geeignet:
Biopolymere, Proteine, wie Proteine, die eine biologische Funktion haben, HSA, BSA, etc., Proteine und Peptide, die sich an bestimmten Stellen im Organismus anreichern (z.B. an Rezeptoren, Zellmembranen, Kanälen etc.), durch Proteasen spaltbare Peptide, Peptide mit synthetischen Sollbruchstellen (z.B. labile Ester, Amide etc.), Peptide, die durch Metalloprotheasen gespalten werden, Peptide mit photospaltbaren Linkern, Peptide mit oxydativen Mitteln (Oxydasen) spaltbaren Gruppen, Peptide mit natürlichen und unnatürlichen Aminosäuren, Glycoproteine (Glycopeptide), Signal- Proteine, antivirale Proteine und Apoktosis, synthetisch modifizierte Biopolymere, wie mit Linkern derivatisierte Biopolymere, modifizierte Metalloproteasen und derivatisierte Oxydase etc., Kohlenhydrate (Mono- bis Polysaccharide), wie derivatisierte Zucker, im Organismus spaltbare Zucker, Cyclodextrine und dessen Derivate, Aminozucker, Chitosan, Polysulfate und Acetylneuraminsäure-Derivate, Antikörper, wie monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, polyklonale Antikörper, Minibodies, Single Chains (auch solche, die mit Linkern zu mehrfachen Fragmenten verknüpft sind), rote Blutkörperchen und andere Blutbestandteile, Cancermarker (z.B. CAA) und Zell- Adhäsions-Stoffe (z.B. Lewis X und Anti-Lewis X-Derivate), DNA und RNA Fragmente, wie derivatisierte DNAs und RNAs (z.B. solche, die durch das SELEX-Verfahren gefunden wurden), synthetische RNA und DNA (auch mit unnatürlichen Basen), PNAs (Hoechst) und Antisense, ß-Aminosäuren (Seebach), Vektoramine zur Einschleusung in die Zelle, biogene Amine, Pharmazeutika, onkologische Präparate, synthetische Polymere, die auf ein biologisches Target (z.B. Rezeptor) gerichtet sind, Steroide (natürliche und modifizierte), Prostaglandine, Taxol und dessen Derivate, Endotheline, Alkaloide, Folsäure und deren Derivate, bioaktive Lipide, Fette, Fettsäureester, synthetisch modifizierte Mono-, Di- und Triglyceride, Liposome, die an der Oberfläche derivatisiert sind, Micellen aus natürlichen Fettsäuren oder aus Perfluoralkyl- Verbindungen, Porphyrine, Texaphrine, erweitere Porphyrine, Cytochrome, Inhibitoren, Neuramidasen, Neuropeptide, Immunomodulatoren, wie FK 506, CAPE und Gliotoxin, Endoglycosidasen, Substrate, die durch Enzyme aktiviert werden wie Calmodolin Kinase, Casein-Kinase II, Gluthathion-S-Transferase, Heparinase, Matrix- Metalloprotheasen, ß-lnsulin-Rezeptor-Kinase, UDP-Galactose 4-Epimerase, Fucosidasen, G-Proteine, Galactosidasen, Glycosidasen, Glycosyltransferasen und Xylosidase, Antibiotika, Vitamin und Vitamin-Analoga, Hormone, DNA-Interkalatoren, Nucleoside, Nucleotide, Lektine, Vitamin B12, Lewis-X und Verwandte, Psoralene, Dientrienantibiotika, Carbacycline, VEGF (vascular endothelial growth factor), Somatostatin und dessen Derivate, Biotin-Derivate, Antihormone, tumorspezifische Proteine und Synthetika, Polymere, die sich in sauren oder basischen Bereichen des Körpers anreichern (pH-gesteuerte Verteilung), Myoglobine, Apomyoglobine etc., Neurotransmitter-Peptide, Tumornecrosefaktoren, Peptide, die sich in entzündetem Gewebe anreichern, Bloodpool-Reagenzien, Anionen und Kationen- Transporterproteine, Polyester (z.B. der Milchsäure), Polyamide und Polyphosphate.
Die meisten der vorgenannten Biomoleküle sind kommerziell beispielsweise bei Merck, Alderich, Sigma, Calibochem oder Bachern erhältlich.
Außerdem können als Biomoleküle alle in der WO 96/23526 und der WO 01/08712 offenbarten "Plasmaproteinbindungsgruppen" bzw. "Zielbindungsgruppen" eingesetzt werden. Der Inhalt dieser beiden Offenlegungsschriften wird daher durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.
Es können auch mehrere (z.B. 2 bis 12) Metallchelate an ein einziges Biomolekül (falls dieses mehrere reaktive Gruppen hat) gebunden sein.
Ferner eignen sich die Verbindungen der Formel I zur Konjugation an all diejenigen Moleküle, welche im Stand der Technik mit Fluoreszenzfarbstoffen umgesetzt werden, um beispielsweise ihre Lokalisation durch Epifluoreszenzmikroskopie innerhalb der Zelle zu bestimmen. Auch können die Verbindungen mit prinzipiell beliebigen Medikamenten konjugiert werden, um dann nach Verabreichung des Medikaments den Transport innerhalb des Organismus durch die NMR-Technik zu verfolgen. Ferner ist es möglich, daß die erfindungsgemäßen Konjugate aus den Verbindungen der Formel I und den Biomolekülen weitere zusätzliche Moleküle enthalten, die an die Biomoleküle konjugiert worden sind. Mit dem Begriff "Biomolekül" im Sinne der Erfindung sind also alle Moleküle umfasst, die in biologischen Systemen vorkommen und alle Moleküle, die biokompatibel sind (s. auch oben).
Die Relaxivität der erfindungsgemäßen Komplexe und insbesondere deren Konjugate mit Biomolekülen ist so hoch, dass sie sich, wenn sie ein paramagnetisches Ion enthalten, besonders gut für die NMR-Diagnostik eignen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen binden überraschenderweise an Proteine. Diese Eigenschaft ermöglicht es ihnen, gebunden an Plamaproteine, länger im Blutstrom zu verweilen und so eine Darstellung des Vasalraumes zu ermöglichen. Darüber hinaus wird auch eine Darstellung von Stellen erhöhter Permeabilität, wie sie beispielsweise in Tumoren zu finden ist, möglich. Diese erhöhte Gefäßpermeabilität ist weiterhin Grundlage der Tumortherapie mit radioaktiven Metallkomplexen. Das Pharmakon verlässt innerhalb des Tumors das Gefäß, bleibt im Gewebe und setzt dieses seiner therapeutisch wirksamen Strahlung aus. Die Plasmaproteinbindung ermöglicht auch eine bildgebende Diagnostik zur Lokalisation von Infarkten oder Nekrosen infolge der Anreicherung der erfindungsgemäßen Substanzen im Infarkt oder der Nekrose.
Detektion, Lokalisierung und Überwachung von Nekrosen oder Infarkten ist ein wichtiger Bereich in der Medizin. So resultiert der Myokardinfarkt nicht sofort in einem unwiederbringlich funktionsuntüchtigen Gewebe, sondern leitet einen dynamischen Prozess ein, der sich über einen längeren Zeitraum (Wochen bis Monate) erstreckt. Die Erkrankung verläuft in etwa drei Phasen, die nicht scharf voneinander getrennt, sondern überlappend sind. Die erste Phase, die Entwicklung des Myokardinfarktes, umfasst die 24 Stunden nach dem Infarkt, in denen die Zerstörung wie eine Stoßwelle (Wellenfrontphänomen) vom Subendokard zum Myokard fortschreitet. Die zweite Phase, der bereits bestehende Infarkt, umfasst die Stabilisierung des Bereiches, in dem Faserbildung (Fibröse) als Heilprozess erfolgt. Die dritte Phase, der ausgeheilte Infarkt, beginnt, nachdem alles zerstörte Gewebe durch fibröses Narbengewebe ersetzt ist. Während dieser Periode findet eine umfangreiche Restrukturierung statt.
Für die Beurteilung eines Myokardinfarktes ist es von entscheidender Bedeutung, zu wissen, wie groß der Anteil des bei dem Infarkt definitiv verlorenen Gewebes ist und an welcher Stelle der Verlust erfolgte, denn von dieser Kenntnis hängt die Art der Therapie ab. Infarkte erfolgen nicht nur im Myokard, sondern auch in anderen Geweben wie im Hirn oder in der Niere. Während der Infarkt in gewissem Umfang heilbar ist, können bei einer Nekrose, dem lokal begrenzten Gewebetod, nur die schädlichen Folgen für den Restorganismus verhindert oder wenigstens gemildert werden. Nekrosen können auf vielfache Weise entstehen: durch Verletzungen, Chemikalien, Sauerstoffdefizit oder durch Strahlung. Wie beim Infarkt ist die Kenntnis von Umfang und Art einer Nekrose wichtig für das weitere ärztliche Vorgehen.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate der allgemeinen Formel I erfolgt dadurch, dass man in an sich bekannter Weise in Verbindungen der allgemeinen Formel I'
Z'
Figure imgf000018_0001
worin Z' eine Carboxylschutzgruppe bedeutet und R -R6 die für R1-R6 angegebene Bedeutung haben, wobei jedoch die in ihnen enthaltenen funktionellen Gruppen frei, d.h. nicht an ein Biomolekül gebunden sind, gegebenenfalls nach Abspaltung der Schutzgruppen Z mit einem Biomolekül umsetzt und anschließend (nach Abspaltung der Schutzgruppen Z') die so erhaltenen Säuren in an sich bekannter Weise mit mindestens einem Metalloxid oder Metallsalz eines Elements der Ordnungszahlen. 21- 29, 31, 32, 37-39, 42-44, 46, 47, 49, 58-71, 75, 77, 82 oder 83 umsetzt und anschließend, falls gewünscht, vorhandene acide Wasserstoffatome mit anorganischen und/oder organischen oder Aminosäuren in physiologisch verträgliche Salze überführt.
Als Carboxylschutzgruppen Z' kommen niedere Alkyl-, Aryl- und Aralkylgruppen infrage, beispielsweise die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Phenyl-, Benzyl-, Diphenylmethyl-, Triphenylmethyl-, Bis(4-nitrophenyl)-methylgruppe sowie Trialkylsilylgruppen. Die Abspaltung der Schutzgruppen Z' erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Hydrolyse, alkalische Verseifung der Ester, vorzugsweise mit Alkali in wässrig -alkoholischer Lösung bei Temperaturen von 0° C bis 50° C oder im Falle von Benzylestern durch katalytische Hydrierung und im Falle von t-Butylestern durch saure Hydrolyse, beispielsweise mit Salz- oder Trifluoressigsäure (Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Edition, T.W. Greene and P.G. M. Wutz, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1991 ).
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I wird im folgenden am Beispiel der ausgewählten Verbindung 1 , erläutert.
Figure imgf000019_0001
Durch alkalische Verseifung und anschließende lonenaustauscherbehandlung kann die Verbindung 1 in die Verbindung I' mit freien Carbonsäuren überführt werden.
Die Verbindung 1 , in der die Carbonsäuren noch als Ester vorliegen, kann durch katalytische Oxidation der Benzylverbindung der Formel 2 erhalten werden.
Figure imgf000020_0001
Die Oxidation wird dabei analog der Vorschrift von Ishibashi et al., Tetrahedron, (1996), 13867 - 13880 mit Natriumperiodat unter Verwendung von Rutheniumchlorid als Katalysator durchgeführt.
Die N-Benzylverbindung 2 ist durch Reduktion des Amides 3 mit Boran- Tetrahydrofurankomplex zugänglich. Man folgt dabei den Bedingungen, wie sie beispielsweise in J. Arner. Chem. Soc, (1990), 9608 beschrieben werden.
Figure imgf000020_0002
Das Amid 3 wird aus dem Nitrophenylalaninderivat 4 durch Umsetzen mit N-Benzyl- pyrrolidin -2,5-dicarbonsäuremonoethylester 5 hergestellt. Die Bildung des Amides 3 er- folgt dabei nach den dem Fachmann wohlbekannten Methoden, beispielsweise der Säure-aktivierung durch:
- Oxalylchlorid: J. Org. Chem., 29: 843 (1964)
- Thionylchlorid: Helv., 42: 1653 (1959)
- Carbodiimide. Helv. 46: 1550 (1963)
- Carbodiimide/Hydroxysuccinimid:J. Am. Chem. Soc. 86: 1839 (1964) sowie J. Org. Chem. 53: 3583 (1988); Synthesis 453 (1972)
- Anhydridmethode:, 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1 ,2-dihydrochinolin:J. Am. Chem. Soc. 90:1651 (1986); Int. J. Pept. Prot. Res., 26:493 (1985); Am. Soc. 73: 3547 (1951)
- Imidazolid-Methode: Am. Soc.91 :2691 (1969)
J. Med. Chem.1996, 392596; Tetrahedron Letters 1994, 35, 5981 ; Bioorg. Med. Letters 1996, 6, 55; J. Chem. Soc. Commun. 1994, 201.
Figure imgf000021_0001
Die Säure 5 ist nach Literaturvorschriften (Colombo et al., Gazz, Chim. Ital. 126. 8, 1996, 543-554 ) leicht aus 2,5-Dibromadipinsäurediethylester und Benzylamin mit anschließender enantioselektiver enzymatischer Verseifung erhältlich. Die Verbindung 4 wird durch Abspalten der Schutzgruppe aus Verbindung 6 erhalten. Die N-Methoxybenzylgruppe ist bequem oxidativ mit Cerammoniumnitrat (CAN) abzuspalten (Smith et al. Tetrahedron Lett. (1991), 4859).
Figure imgf000022_0001
Die Verbindung 6 ihrerseits wird durch Alkylierung des 4-Methoxybenzyl- 4- nitrophenylalanins 7 mit dem nach Rappoport erhältlichen N,N-Bis-(t-butyloxy- carbonylmethyl)-2-bromethylamin 8 unter mit Phosphat gepufferten Bedingungen, wie sie ebenfalls Rappoport in J. Org. Chem., 58,1151 (1993) beschreibt, dargestellt.
Die von Rappoport beschriebene Form der N-Alkylierung kann hier angewendet werden. Prinzipiell sind aber auch die dem Fachmann wohlbekannten Methoden der N-Alkylierung anwendbar, beispielsweise Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie XI/2 Stickstoffverbindungen, Georg Thieme Verlag.Stuttgart, 1957 S. 680; J. E. Rickman and T. J. J. Atkins, J. Am. Chem. Soc. 1974, 96 2268 .
Figure imgf000023_0001
Das Phenylalaninderivat 7 ist durch reduktive Aminierung des 4-Nitro-phenylalanins 9 mit 4-Nitrobenzaldehyd 10 erhältlich. Die reduktive Aminierung erfolgt mit Natriumcyanoborhydrid nach den dem Fachmann bekannten Methoden, beispielsweise wie sie in Eicher-Tietze, Reaktionen und Synthesen, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 2. Auflage 1991 , S. 85, beschrieben sind.
Figure imgf000023_0002
10
Die Verbindung 10 ist als Kaufware bei Bachern oder Fluka erhältlich.
Die in Verbindung 1 enthaltene Nitrogruppe dient nach ihrer Umwandlung in die Amino-gruppe unmittelbar als Bindungsstelle für Biomoleküle, beispielsweise über eine Amidbildung mit Hilfe aktivierter Ester oder reduktive Aminierung mit Carbonylgruppen oder nach Umwandlung in selektiv reagierende Gruppen. Diese Umwandlungsreaktionen sind dem Fachmann wohlbekannt. So beschreiben Gansow (EP 484984) und Meares (US 4622420) die Darstellung von Halogenacetamiden von acyclischen Komplexbildnern, die zur Kopplung mit -SH- Gruppen oder -NH2.-Gruppen Verwendung finden.
Eine selektive Kopplung mit Aminogruppen ermöglicht die Isothiocyanatogruppe. Ihre Darstellung und die Umsetzung mit Aminen zu den entsprechenden Thioharnstoffen ist beispielsweise in dem Patent US 4680338 von Immunomedics beschrieben worden. Die Umsetzung mit Hydraziden zu den den Thio-semicarbaziden wird in der Anmeldung WO 95/15335 der Neorx Corp. geschildert..
Eine selektive Umsetzung mit -SH-Gruppen ermöglichen Maleimide. Ihre Darstellung und Umsetzung werden beispielsweise in den Patenten US 5273743 und EP 446071 von Hybritech oder in EP 345723 von Nihon-Medi Physics beschrieben.
Die Einführung der gewünschten Metallionen von Komplexen für die Herstellung von NMR-Diagnostika kann in der Weise erfolgen, wie sie in den Patentschriften EP 71564, EP 130934 und DE-OS 34 01 052 offenbart worden ist. Dazu wird das Metalloxid oder ein Metallsalz (beispielsweise ein Chlorid, Mitrat, Acetat, Carbonat oder Sulfat) des gewünschten Elements in Wasser und/oder einem niederen Alkohol (wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol) gelöst oder suspendiert und mit der Lösung oder Suspension der äquivalenten Menge des erfindungsgemäßen Komplexbildners umgesetzt.
Die Neutralisation eventuell noch vorhandener freier Carboxygruppen erfolgt mit Hilfe anorganischer Basen (z.B. Hydroxyden, Carbonaten oder Bicarbonaten) von z.B. Natrium, Kalium, Lithium, Magnesium oder Calcium und/oder organischer Basen wie unter anderem primärer, sekundärer und tertiärer Amine, wie z.B. Ethanolamin, Morpholin, Glucamin, N-Methyl- und N,N-Dimethylglucamin, sowie basischer Aminosäuren, wie z.B. Lysin, Arginin und Ornithin oder von Amiden ursprüngliche neutraler oder saurer Aminosäuren.
Zur Herstellung der neutralen Komplexverbindungen kann man beispielsweise in sauren Komplexsalzen in wässriger Lösung oder Suspension soviel der gewünschten Base zusetzen, dass der Neutralpunkt erreicht wird. Die erhaltene Lösung kann anschließend im Vakuum zur Trockne eingeengt werden. Häufig ist es von Vorteil, die gebildeten Neutralsalze durch Zugabe von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie z.B. niederen Alkoholen (Methanol, Ethanol, Isopropanol und andere), niederen Ketonen (Aceton und andere), polaren Ethern (Tetrahydrofuran, Dioxan, 1 ,2- Dimethoxyethan und andere) auszufällen und so leicht zu isolierende und gut zu reinigende Kristallisate zu erhalten. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, die gewünschte Base bereits während der Komplexbildung der Reaktionsmischung zuzusetzen und dadurch einen Verfahrensschritt einzusparen, Sollen die Komplexbildner zur Herstellung von Radiodiagnostika oder -therapeutika Verwendung finden, kann die Herstellung der Komplexe aus den Komplexbildnern nach den in "Radiotracers for Medical Applications", Vol I, CRC Press, Boca Raton, Florida (1983) beschriebenen Methoden erfolgen.
Es kann wünschenswert sein, den Komplex erst kurz vor seiner Verwendung herzustellen, insbesondere, wenn er als Radiopharmakon eingesetzt werden soll. Daher umfasst die Erfindung auch einen Kit zur Herstellung von Radiopharmaka, umfassend eine Verbindung der Formel I, worin Z für ein Radioisotop steht. Gegenstand der Erfindung sind ferner pharmazeutische Mittel, die mindestens eine physiologisch verträgliche Verbindung der allgemeinen Formel I enthalten, gegebenenfalls mit den in der Galenik üblichen Zusätzen.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen - gegebenenfalls unter Zugabe der in der Galenik üblichen Zusätze - in wässrigem Medium suspendiert oder löst, und anschließend die Suspension oder Lösung gegebenenfalls sterilisiert. Geeignete Zusätze sind beispielsweise physiologisch unbedenkliche Puffer (wie z.B. Tromethamin), Zusätze von Komplexbildnern oder schwachen Komplexen (wie z.B. Diethylentriaminpentaessigsäure oder die zu den erfindungsgemäßen Metallkomplexen korrespondierenden Ca-Komplexe) oder - falls erforderlich - Elektrolyte wie z.B. Natriumchlorid oder - falls erforderlich - Antioxidantien wie z.B. Ascorbinsäure.
Sind für die enterale Verabreichung oder andere Zwecke Suspensionen oder Lösungen der erfindungsgemäßen Mittel in Wasser oder physiologischer Salzlösung erwünscht, werden sie mit einem oder mehreren in der Galenik üblichen Hilfsstoff(en) [z.B. Methylcellulose, Lactose, Mannit] und/oder Tensid(en) [z.B. Lecithine, Tween®, Myrj®] und/oder Aromastoff(en) zur Geschmackskorrektur [z.B. ätherischen Ölen] gemischt. Prinzipiell ist es auch möglich, die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel auch ohne Isolierung der Komplexsalze herzustellen. In jedem Fall muss besondere Sorgfalt darauf verwendet werden, die Chelatbildung so vorzunehmen, dass die erfindungsgemäßen Salze und Salzlösungen praktisch frei sind von nicht komplexierten toxisch wirkenden Metallionen.
Dies kann beispielsweise mit Hilfe von Farbindikatoren wie Xylenolorange durch Kontrolltitrationen während des Herstellungsprozesses gewährleistet werden. Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung der Komplexverbindungen und ihrer Salze. Als letzte Sicherheit bleibt eine Reinigung des isolierten Komplexsalzes.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel enthalten vorzugsweise 1 fMol- 1,3 Mol/I des Komplexsalzes und werden in der Regel in Mengen von 0,0001- 5 mMol/kg dosiert. Sie sind zur enteralen und parenteralen Applikation bestimmt. Die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen kommen zur Anwendung
1. für die NMR-Diagnostik in Form ihrer Komplexe mit den paramagnetischen Ionen der Elemente mit den Ordnungszahlen 21-29, 42, 44 und 58-70. Geeignete Ionen sind beispielsweise das Chrom(lll)-, Eisen(ll)-, Cobalt(ll), Nickel(ll)-, Kupfer(ll)-, Praseodym(lll)-, Neodym(lll)-, Samarium(lll)- und
Ytterbium(lll)-ion. Wegen ihres starken magnetischen Moments sind für die NMR-Diagnostik besonders bevorzugt das Gadolinium(lll)-, Terbium(lll)-, Dysprosium(lll)-, Holmium(lll)-, Erbium(lll)-, Mangan(ll)- und Eisen(lll)-ion.
2. für die Radiodiagnostik und Radiotherapie in Form ihrer Komplexe mit den
Radioisotopen der Elemente mit den Ordnungszahlen 26, 27, 29, 31 , 32, 37-39, 43, 46, 47, 49, 61 , 62, 64, 67, 70, 71 , 75, 77, 82 und 83.
Die erfindungsgemäßen Mittel erfüllen die vielfältigen Voraussetzungen für die Eignung als Kontrastmittel für die Kernspintomographie. So sind sie hervorragend dazu geeignet, nach oraler oder parenteraler Applikation durch Erhöhung der Signalintensität das mit Hilfe des Kernspintomographen erhaltene Bild in seiner Aussagekraft zu verbessern. Ferner zeigen sie die hohe Wirksamkeit, die notwendig ist, um den Körper mit möglichst geringen Mengen an Fremdstoffen zu belasten, und die gute Verträglichkeit, die notwendig ist, um den nichtinvasiven Charakter der Untersuchungen aufrechtzuerhalten.
Die gute Wasserlöslichkeit und geringe Osmolalität der erfindungsgemäßen Mittel erlaubt es, hochkonzentrierte Lösungen herzustellen, damit die Volumenbelastung des Kreislaufs in vertretbaren Grenzen zu halten und die Verdünnung durch die Körperflüssigkeit auszugleichen, das heißt NMR-Diagnostika müssen 100- bis 1000fach besser wasserlöslich sein als für die NMR-Spektroskopie. Weiterhin weisen die erfindungsgemäßen Mittel nicht nur eine hohe Stabilität in vitro auf, sondern auch eine überraschend hohe Stabilität in vivo, so dass eine Freigabe oder ein Austausch der in den Komplexen nicht kovalent gebundenen - an sich giftigen - Ionen innerhalb der Zeit, in der die neuen Kontrastmittel vollständig wieder ausgeschieden werden, nur äußerst langsam erfolgt.
Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Mittel für die Anwendung als NMR- Diagnostika in Mengen von 0,0001-5 mMol/kg, vorzugsweise 0,005-0,5 mMol/kg, dosiert. Details der Anwendung werden z.B. in H.-J. Weinmann et al., Am. J. of Roentgenology 142, 619 (1984) diskutiert.
Niedrige Dosierungen (unter 1 mg/kg Körpergewicht) von organspezifischen NMR- Diagnostika sind zum Beispiel zum Nachweis von Tumoren und von Herzinfarkt einsetzbar. Besonders niedrige Dosierungen der erfindungsgemäßen Komplexe sind für die Anwendung in der Radiotherapie und Radiodiagnostik geeignet. So kommen sowohl für therapeutische wie auch diagnostische Zwecke Dosierungen von 0,5 pM/kg - 5 μM/kg, vorzugsweise 50 pM/kg - 500 nMol/kg zur Anwendung. Üblicherweise werden hinsichtlich des radioaktiven Metallions ca. 100 - 100.000-fach geringere molare Konzentrationen verwendet als dies für die Chelatoren bzw. Chelator- Biokonjugate der Fall ist, so dass also die Chelatoren bzw. Chelator-Biokonjugate im Überschuss vorliegt.
Ferner können die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen vorteilhaft als Suszeptibilitäts-Reagenzien und als s ϊ-Reagenzien für die in v/Vo-NMR- Spektroskopie verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Mittel sind aufgrund ihrer günstigen radioaktiven Eigenschaften und der guten Stabilität der in ihnen enthaltenen Komplexverbindungen auch als Radiodiagnostika und Radiotherapeutika geeignet. Details ihrer Anwendung und Dosierung werden z.B. in "Radiotracers for Medical Applications", CRC-Press, Boca Raton, Florida, 1983, sowie in Eur. J. Nucl. Med. 17 (1990) 346-364 und Chem. Rev. 93 (1993) 1137-1156 beschrieben.
Für SPECT geeignet sind die Komplexe mit den Isotopen 111ln und 99mTc.
Eine weitere bildgebende Methode mit Radioisotopen ist die Positronen-Emissions- Tomographie, die positronenemittierende Isotope wie z.B. 43Sc, 44Sc, 52Fe, 55Co, 68Ga, 64Cu, 86Y und 94 Tc verwendet (Heiss, W.D.; Phelps, M.E.; Positron Emission Tomography of Brain, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1983). i Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind überraschenderweise auch zur Differenzierung von malignen und benignen Tumoren in Bereichen ohne Blut-Hirn- Schranke geeignet.
Sie zeichnen sich auch dadurch aus, dass sie vollständig aus dem Körper eliminiert werden und somit gut verträglich sind.
Da sich die erfindungsgemäßen Substanzen in malignen Tumoren anreichern (keine Diffusion in gesunde Gewebe, aber hohe Durchlässigkeit von Tumorgefäßen), können sie auch die Strahlentherapie von malignen Tumoren unterstützen. Diese unterscheidet sich von der entsprechenden Diagnostik nur durch die Menge und Art des verwendeten Isotops. Ziel ist dabei, die Zerstörung von Tumorzellen durch energiereiche kurzwellige Strahlung mit einer möglichst geringen Reichweite. Hierzu werden Wechselwirkungen der in den Komplexen enthaltenen Metalle (wie z.B. Eisen oder Gadolinium) mit ionisierenden Strahlungen (z.B. Röntgenstrahlen) oder mit Neutronenstrahlen ausgenutzt. Durch diesen Effekt wird die lokale Strahlendosis am Ort, wo sich der Metallkomplex befindet (z.B. in Tumoren) signifikant erhöht. Um die gleiche Strahlendosis im malignen Gewebe zu erzeugen, kann bei Anwendung solcher Metallkomplexe die Strahlenbelastung für gesunde Gewebe erheblich reduziert und damit belastende Nebenwirkungen für die Patienten vermieden werden. Die erfindungsgemäßen Metallkomplex-Konjugate eignen sich deshalb auch als radiosensibilisierende Substanz bei der Strahlentherapie von malignen Tumoren (z.B. Ausnutzen von Mössbauer-Effekten oder bei Neutroneneinfangtherapie). Geeignete ß- emittierende Ionen sind z.B. 46Sc, 47Sc, 48Sc, 72Ga, 73Ga, 90Y, 67Cu, 109Pd, 111Ag, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re und 188Re, wobei 90Y, 177Lu, 72Ga, 153Sm und 67Cu bevorzugt werden. Geeignete geringe Halbwertzeiten aufweisende D-emittierende Ionen sind z.B. 211At, 211Bi, 212Bi, 213, Bi und 214Bi, wobei 212Bi bevorzugt ist. Ein geeignetes Photonen- und Elektronen-emittierendes Ion ist 58Gd, das aus 157Gd durch Neutroneneinfang erhalten werden kann.
Ist das erfindungsgemäße Mittel zur Anwendung in der von R. L. Mills et al. [Nature Vol. 336, (1988), S. 787] vorgeschlagenen Variante der Strahlentherapie bestimmt, so muß sich das Zentralion von einem Mößbauer-Isotop wie beispielsweise 57Fe oder 151 Eu ableiten.
Bei der in wVo-Applikation der erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel können diese zusammen mit einem geeigneten Träger wie z.B. Serum oder physiologischer Kochsalzlösung und zusammen mit einem anderen Protein wie z.B. Human Serum Albumin verabreicht werden. Die Dosierung ist dabei abhängig von der Art der zellulären Störung, dem benutzten Metallion und der Art der bildgebenden Methode.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel werden vorzugsweise parenteral, bevorzugt i.V., appliziert.
Details der Anwendungen von Radiotherapeutika werden z.B. in R. W. Kozak et al. TIBTEC, Oktober 1986, 262, diskutiert (s. a. Bioconjugate Chem. 12 (2001) 7-34).
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung des Erfindungsgegenstands: Die Bespiele 20, 21 , 27, 29 und 30 beschreiben Konjugate mit Antikörpern. Konjugate mit anderen Biomolekülen können nach folgenden allgemeinen Arbeitsvorschriften hergestellt werden:
Hierin steht "AAV" für allgemeine Arbeitsvorschrift, "RP-18" bezeichnet eine "reversed phase" stationäre Chromatographiephase. Die Anzahl der Komplexe pro Biomolekül wurde mittels Szinitiegraphie oder ICP (inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy) bestimmt.
Allgemeine Arbeitsvorschrift (AAV) I: Albumin-Amid-Konjugate
3 mmol der Säure werden in 15 mL DMF gelöst, unter Eiskühlung mit 380 mg (3,3 mmol) N-Hydroxysuccinimd und 681 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 1 Stunde im Eis voraktiviert. Die Aktivestermischung wird innerhalb von 30 Minuten in eine Lösung von 16,75 g (0,25 mmol) Rinderserumalbumin (BSA) in 150 mL Phosphatpuffer (pH 7,4) eingetropft und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Ansatzlösung wird filtriert, das Filtrat über eine AMICON® YM30 (cut off 30.000 Da) ultrafiltriert, das Retentat über eine Sephadex® G50 -Säule ehromatographiert und die Produktfraktionen gefriergetrocknet.
Allgemeine Arbeitsvorschrif (MM) II: Albumin-Malβimid-E€onjugate
0,0438 mmol des Maleimids in 1 mL DMF werden zu 0,84 g (0,0125 mmol) Rinderserumalbumin (BSA), gelöst in 15 mL Phosphatpuffer (pH 7,4), gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Ansatzlösung wird filtriert, das Filtrat über eine AMICON® YM30 (cut off 30.000 Da) ultrafiltriert, das Retentat über eine Sephadex® G50 -Säule ehromatographiert und die Produktfraktionen gefriergetrocknet.
Allgemeine Arbeitsvorschrift (AAV) III: Herstellung von Amid-Konjugaten
3 mmol der Säure werden in 15 mL DMF gelöst, unter Eiskühlung mit 380 mg (3,3 mmol) N-Hydroxysuccinimd und 681 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 1 Stunde im Eis voraktiviert. Die Aktivestermischung wird in eine Lösung von 2,5 mmol Aminkomponente in 15-150 mL DMF eingetropft und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Ansatzlösung wird filtriert und an Kieselgel ehromatographiert. Allgemeine Arbeitsvorschrift (AAV) IV: Herstellung von Maleimido-SH-Konjugaten
3 mmol des Maleimids in 15 mL DMF werden zu 2,5 mmol SH-Komponente in 15-150 mL DMF eingetropft und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Ansatzlösung wird filtriert, das Filtrat über eine AMICON® YM30 (cut off 30.000 Da) ultrafiltriert, das Retentat über eine Sephadex® G50 -Säule ehromatographiert und die Produktfraktionen gefriergetrocknet.
Allgemeine Arbeitsvorschrift (AAV) V: Herstellung von Halogenacetamido-SH- Konjugaten
3 mmol des Halogenacetamids in 15 mL DMF werden zu 2,5 mmol SH-Komponente in 15-150 mL DMF eingetropft und acht Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Ansatzlösung wird filtriert, das Filtrat über eine AMICON® YM30 (cut off 30.000 Da) ultrafiltriert, das Retentat über eine Sephadex® G50 -Säule ehromatographiert und die Produktfraktionen gefriergetrocknet.
Beispiel 1
a) c/s-1-Benzyl-piperidin-2,6-dicarbonsäure dimethyl ester
Zu 1000 ml gerührtem Methanol wurden bei -5° C 236 g (2,00 mol) Thionylchlorid hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 40 min gerührt. Es wurden tropfenweise 83,6 g (0,50 mol) 2,6-Dicarboxypyridin, gelöst in 150 ml Methanol, hinzugefügt. Die Lösung wurde für 2 h gerührt und am Rotationsverdampfer bei vermindertem Druck und 40° C eingeengt. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung für die folgende Umsetzung eingesetzt. Die folgende Hydrierung und Alkylierung mit Benzylbromid wurden analog zu einer bekannten Synthese (Syn. Let , 8, (1999), 1292-1294) vorgenommen. Es wurden 77,21 g (265 mmol) 1a in 53% Ausbeute erhalten. MS-FAB (M+ +1 , 21): 292
b) (2R,6S)-1-Benzyl-piperidin-2,6-dicarbonsäure-2-methyl ester
In Anlehnung zu einer Literatur bekannten Synthesevorschrift (Gazz. Chim. Hai., 126, 8, (1996), 543-545) wurden 58,27 g (200 mmol) 1a in 4,5 I Phosphatpuffer (pH = 7) mit 900 mg Schweineleberesterase (Fluka) für 5,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde durch eine Membranfiltration (< 10.000 U) vom Enzym befreit und mit verdünnter wässriger HCI-Lösung auf pH = 6 eingestellt. Die wässrige Phase wurde mit einem Dichlormethan-Isopropanolgemisch (10:1) extrahiert, mit MgS04 getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde einer Kieselgelfiltration unterzogen (Dichlormethan-Methanol 10:1 ). Es ergaben sich 44.92 g (162 mmol) des gewünschten Produkts 1b in 81% Ausbeute mit einem Enantiomerenüberschuss von 94 % ee (bestimmt durch Analyse mittels enantioselektiver HPLC). MS-FAB (M+ +1 , 21): 278
c) (2R,6S)-1-Benzyl-6-{t.ert-butoxycarbonylmethyl-[2-(t.erf-butoxycarbonylmethyl-amino)- ethyl]-carbamoyl}-piperidin-2-carbonsäure methyl ester
41 ,60 g (150 mmol) 1b wurden in 400 ml trockenem Dichlormethan bei 0° C mit 3,57 g (170 mmol) Diisopropylethylamin und 23 g (170 mmol) HOBT versetzt. Es wurden 108 g (375 mmol) 1 ,2-Diessigsäure-tetf-butylester-ethylen-diamin (J. Med. Chem., 29, 7, (1986), 1231-1237) in 50 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Es wurden 62 g (300 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 50 ml trockenem Dichlormethan hinzugegeben. Die Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 500 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 200 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan- Essigester (1 :1 )) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 1c mit 82,7 % Ausbeute (67,9 g, 124 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 548
d) (2R,6S,2'R)-1-Benzyl-6-(tert-butoxycarbonylmethyl-{2-[terf-butoxycarbonylmethyl-(1- ethoxycarbonyl-2-propionyloxy-ethyl)-amino]-ethyl}-carbamoyl)-piperidin-2-carbonsäure methyl ester
Zu einer gerührten Lösung von 66,8 g (122 mmol) 1c in 400 ml trockenem Dichlormethan wurden 47 g (146 mmol) 3-Propionyloxy-2-trifluoromethanesulfonyloxy- propionsäure ethyl ester (Angew. Chem., 95, 1 , (1983), 50) welches in 100 ml trockenem Dichlormethan gelöst worden war, bei -65° C hinzugetropft. Die Lösung wurde für 2h gerührt, über 5h langsam auf Raumtemperatur erwärmt und weitere 8 h gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 400 ml heftig gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 200 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit Gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung . gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (2:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 1d mit 69,0 % Ausbeute (60,6 g, 84,2 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 720
e) (2R,2'R,6S) 1 -Benzyl-6-[(ferf-butoxycarbonylmethyl-{2-[ferf-butoxycarbonylmethyl-(1 - ethoxycarbonyl-2-propionyloxy-ethyl)-amino]-ethyl}-amino)-methyl]-piperidin-2- carbonsäure methyl ester
Analog zu J. Am. Chem. Soc, 112, 26, (1990): Zu einer Lösung von 40 g (55,6 mmol)
1d in 150 ml trockenem THF wurden 389,2 ml (389,2 mmol) BH3-THF-Lösung (1M) hinzugetropft. Die Lösung wurde unter Rückfluss erhitzt und für 2h gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in 600 ml Methanol aufgenommen und für 2h unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Si02, Hexan-Essigester (3:1)). Es ergab sich das gewünschte Produkt 1e mit 71 ,0 % Ausbeute (27,9 g, 39,5 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 706
f) (2R,2'R,6S)-6-[(tetf-Butoxycarbonylmethyl-{2-[ferf-butoxycarbonylmethyl-(1- ethoxycarbonyl-2-propionyloxy-ethyl)-amino]-ethyl}-amino)-methyl]-1-carboxymethyl- piperidin-2-carbonsäure methyl ester
Analog zu Tetrahedron, 52, 44, (1996), 13867-13880: Zu einer Lösung von 26,8 g (38,0 mmol) in 150 ml CCI und 150 ml Acetonitril wurden ~ 200 mg Rutheniumdioxid monohydrat und 163 g (0,76 mol) Natriumperiodat in 220 ml Wasser hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 3 Tage gerührt. Die Lösung wurde mit verdünnter HCI- Lösung au pH = 6 eingestellt und dreimal mit je 250 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit Gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (1 :1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 1e mit 72,0 % Ausbeute (18.46 g, 27,4 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 674
g) (2R,2'R,6S)-6-[({2-[(1-Carboxy-2-hydroxy-ethyl)-carboxymethyl-amino]-ethyl}- carboxymethyl-amino)-methyl]-1-carboxymethyl-piperidin-2-carbonsäure
16,87 g (25 mmol) 1f wurden in 200 ml MeOH bei 0° C mit 100 ml (200 mmol) Natronlauge (2N) versetzt. Die Lösung wurde auf 40° C erwärmt und für 14 Std. gerührt. Die Lösung wurde mit lonenaustauscherharz (IR 120) versetzt bis der pH-Wert 3 erreichte. Das Harz wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde gefriertrocknet. Es ergab sich das gewünschte Produkt 1g mit 76 % Ausbeute (8,81 g, 19 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 464 Beispiel 2
a) (R)-2-(4-Methoxy-benzylamino)-3-(4-nitro-phenyl)-propionsäure methyl ester
Zu einer Lösung von 29,1 g (112 mmol) p-Nitro-phenylalanin-methylester hydrochlorid und 15,51 g (120 mmol) Di-/so-propyl-ethylamin in 250 ml trockenem THF wurden bei 0°C 15,25 g (112 mmol) Anisaldehyd in etwas THF hinzugetropft. Die Lösung wurde für 3h bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 5,04 g (80 mmol) NaBH3CN versetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und auf ein Viertel des Volumens eingeengt. Es wurden 300 ml Gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung hinzugegeben. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 200 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit Gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (2:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 2a mit 68 % Ausbeute (26,23 g, 76,16 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 345
b) (R)-2-[[2-(Bis-terf-butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]-(4-methoxy-benzyl)-amino]-3- (4-nitro-phenyl)-propionsäure methyl ester
Zu einer Lösung von 49,3 g (140 mmol) [(2-Bromo-ethyl)-tert-butoxycarbonylmethyl- amino]-essigsäure tetf-butyl ester (Synth. Commun., 30, (2000), 3755) in 150 ml Acetonitril und 150 ml Phosphatpuffer (pH = 8) wurden 22,38 g (65 mmol) 2a hinzugefügt. Die Lösung wurde für 10 h bei Raumtemperatur gerührt und auf 300 ml eiskalte Gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gegossen. Die wässrige Phase wurde mehrmals mit Diethylether extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit Gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (3:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 2b mit 85 % Ausbeute (34,0 g, 55,25 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 616
c) (R)-2-[2-(Bis-t.e/ -butoxycarbonylmethyl-amino)-ethylaminp]-3-(4-nitro-phenyl)- propionsäure methyl ester - Zu einer Lösung von 32 g (52,0 mmol) 2b in 180 ml Acetonitril und 20 ml Wasser wurden bei -10° C 82,23 g (150 mmol) Cer-(IV)-ammoniumnitrat hinzugefügt. Die Lösung wurde für 1 ,5 h bei Raumteperatur gerührt. Die Lösung wurde auf 300 ml eiskalte Gesättigter, wässriger Natπ'umchloridlösung gegossen. Die wässrige Phase wurde mehrmals mit Essigester extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit Gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (1 ,5:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 2c mit 83 % Ausbeute (21 ,4 g, 43,2 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 43): 496
d) (1 'R,2R,5S)-1 -Benzyl-5-{[2-(bis-terf-butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]-[1 - methoxycarbonyl-2-(4-nitro-phenyl)-ethyl]-carbamoyl}-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
11 ,4 g (41 mmol) (2r?,5S)-1-Benzyl-pyrrolidin-2,5-dicarbonsäure-2-ethylester (Gazz.Chim.lial. 126, 8, (1996), 543-554) in 150 ml trockenem Dichlormethan wurden bei 0° C mit 5,82 g (45 mmol) Diisopropylethylamin und 6,1 g (45 mmol) HOBT versetzt. Es wurden 20,0 g (40,4 mmol) 2c in 100 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Es wurden 16,5 g (80 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 50 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 300 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 150 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (4:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 1d mit 80,4 % Ausbeute (24,5 g, 32,5 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 755
e) (1 'R,2R,5S)-1 -Benzyl-5-({[2-(bis-ferf-butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]-[1 - methoxycarbonyl-2-(4-nitro-phenyl)-ethyl]-amino}-methyl)-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester Analog zu J. Am. Chem. Soc, V\2, 26, (1990): Zu einer Lösung von 24,0 g (31 ,8 mmol) 2d in 100 ml trockenem THF wurden 223 ml (223 mmol) BH3-THF-Lösung (1M) hinzugetropft. Die Lösung wurde unter Rückfluss erhitzt und für 2h gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in 400 ml Methanol aufgenommen und für 2h unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Si02, Hexan-Essigester (3:1)). Es ergab sich das gewünschte Produkt 2e mit 70,0 % Ausbeute (18,84 g, 25,4 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 741
f) (1 'R,2R,5S)-5-({[2-(Bis-terf-butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]-[1 -methoxycarbonyl- 2-(4-nitro-phenyl)-ethyl]-amino}-methyl)-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Analog zu Tetrahedron, 52, 44, (1996), 13867-13880: Zu einer Lösung von 18,5 g (25,0 mmol) 2e in 150 ml CCI4 und 150 ml Acetonitril wurden 150 mg (1 ,13 mmol) Rutheniumdioxid monohydrat und 107 g (500 mmol) Natriumperiodat in 220 ml Wasser hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 3 Tage gerührt. Die Lösung wurde mit verdünnter HCI-Lösung auf pH = 6 eingestellt und dreimal mit je 250 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (1 ,5:1 )) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 2f mit 69,0 % Ausbeute (12,2 g, 17,3 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 709
g) (1 'R,2R,5S)-5-({[2-(Bis-carboxymethyl-amino)-ethyl]-[1 -carboxy-2-(4-nitro-phenyl)- ethyl]-amino}-methyl)-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
16,3 g (23 mmol) 1f wurden in 200 ml Dioxan bei 0° C mit 115 ml (230 mmol) Natronlauge (2N) versetzt. Die Lösung wurde auf 40° C erwärmt und für 14 Std. gerührt. Die Lösung wurde mit lonenaustauscherharz (IR 120) versetzt bis der pH=3 betrug, lonenaustauscherharz wurde abfiltriert. Dioxan wurde im Vakuum entfernt. Das Filtrat wurde mit Wasser verdünnt und durch Gefriertrocknung konzentriert. Es ergab sich das gewünschte Produkt 2g mit 78 % Ausbeute (9,95 g 17,9 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 555
Beispiel 3
a) (2R,5S)-1 -Benzyl-5-{[2-(bis-terf-butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]-tet - butoxycarbonylmethyl-carbamoyl}-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
11.4 g (41 mmol) (2R,5S)-1-Benzyl-pyrrolidin-2,5-dicarbonsäure-2-ethylester (Gazz.Chim.ltal. 126, 8, (1996), 543-554) in 150 ml trockenem Dichlormethan wurden bei 0° C mit 5,82 g (45 mmol) Diisopropylethylamin und 6,1 g (45 mmol) HOBT versetzt. Es wurden 16,3 g (40,4 mmol) {tet -Butoxycarbonylmethyl-[2-(ferf- butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]-amino}-essigsäure ferf-butyl ester (J. Org. Chem., 65, 5, (2000), 1562-1565) in 100 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Es wurden
16.5 g (80 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 50 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die
Reaktionslösung wurde auf 300 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 150 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan- Essigester (3,5:1 )) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 3a mit 83,3 % Ausbeute (22,3 g, 33,7 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 662
b) (2R,5S)-1 -Benzyl-5-({[2-(bis-tert-butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]-terf- butoxycarbonylmethyl-amino}-methyl)-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Analog zu J. Am. Chem. Soc, 112. 26, (1990): Zu einer Lösung von 21 ,05 g (31 ,8 mmol) 3a in 100 ml trockenem THF wurden 223 ml (223 mmol) BH3-THF-Lösung (1 M) hinzugetropft. Die Lösung wurde unter Rückfluss erhitzt und für 2h gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt Der Rückstand wurde in 400 ml Methanol aufgenommen und für 2h unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Si02, Hexan-Essigester (3:1 )). Es ergab sich das gewünschte Produkt 3b mit 69,1 % Ausbeute (14,24 g, 22,0 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 648
c) (2R,5S)-5-({[2-(Bis-tert-butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]-fer.- butoxycarbonylmethyl-amino}-methyl)-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Zu einer Lösung von 14,1 g (21 ,8 mmol) 2b in 200 ml /so-Propanol wurden 2 g Pd/C (10%) hinzugefügt. Die Atmosphäre über der Reaktionslösung wurde mit Wasserstoff gesättigt. Die Reaktionslösung wurde für 6 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde eingeengt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 3c mit 11 ,9 g (21 ,36 mmol) und 98% Rohausbeute. 3c wurde ohne Reinigung für die folgende Reaktion eingesetzt. MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 558
d) (rR,2R,5S)-1-(1-Benzyloxycarbonyl-5-terf-butoxycarbonylamino-pentyl)-5-({[2-(bis- tet -butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]-tetf-butoxycarbonylmethyl-amino}-methyl)- pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Zu einer Lösung von 11 ,7 g (21 ,0 mmol) 3c in 300 ml Dichlormethan wurden bei -20° C 9,86 g (21 mmol) 6-fer -Butoxycarbonylamino-2-trifluoromethansulfonyloxy-hexansäure- benzylester (der entsprechende Alkohol, dessen Synthese in JOC [2000] 7667 beschrieben ist, wurde zuvor mit Triflatanhydrid (2eq.) und Pyridin (2,2 eq.) in Dichlormethan bei -20° C in das Triflat umgewandelt) in 100 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Lösung wurde für 2 Std. gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 5 Stunden gerührt. Die Lösung wurde auf heftig gerührtes Eiswasser gegossen. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 150 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (4:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 3d mit 78,8 % Ausbeute (14,51 g, 16,55 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 878
e) (rR,2R,5S)-1-(5-Amino-1-carboxy-pentyl)-5-({[2-(bis-carboxymethyl-amino)-ethyl]- carboxymethyl-amino}-methyl)-pyrrolidin-2-carbonsäure Zu einer Lösung von 14,0 g (16,0 mmol) 3d in 220 ml /so-Propanol wurden 2,2 g Pd/C (10%) hinzugefügt. Die Atmosphäre über der Reaktionslösung wurde mit Wasserstoff gesättigt. Die Reaktionslösung wurde für 5 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde eingeengt Der Rückstand wurde in 150 ml Dichlormethan aufgenommen, auf -5 °C abgekühlt und mit 150 ml Trifluoressigsäure versetzt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und für 2 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde am Rotationsverdampfer zügig eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Ölpumpenvakuum konzentriert und in 200 ml Dioxan aufgenommen. Es wurden 100 ml destilliertes Wasser und 25 ml (50 mmol) einer 2N Natriumhydroxydlösung hinzugefügt. Die Lösung wurde für 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt. Es wurde saurer Ionenaustauscher IRA 120 hinzugegeben bis der pH-Wert bei 3 lag. Der Ionenaustauscher wurde abfiltriert. Dioxan wurde am Rotationsverdampfer entfernt, die wässrige Lösung mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Es ergab sich das gewünschte Produkt 3e mit 72,0 % Ausbeute (5,56 g; 11 ,5 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 491
Beispiel 4
a) (S)-2-(Bis-tet -butoxycarbonylmethyl-amino)-3-(4-nitro-phenyl)-propionsäure methyl ester
100 g (446 mmol) (S)-p-Nitro-phenylalaninmethylester wurden in 500 ml Acetonitril und 500 ml dest. Wasser gelöst und mit 281 g (2,23 mol) Kaliumcarbonat versetzt. Es wurden 347 g (1 ,78 mol) Bromessigsäure-tetf-butylester hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde über Nacht bei 70° C gerührt. Die Reaktionslösung wurde abgekühlt und mit 500 ml Diethylether verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 200 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (3:1 )) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 4a mit 73,2 % Ausbeute (148 g, 326 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 453 b) (S)-{tett-Butoxycarbonylmethyl-[2-hydroxy-1-(4-nitro-benzyl)-ethyl]-amino}- essigsäure terf-butyl ester
Zu einer Suspension von 80 g (177 mmol) 4a in 200 ml THF und 10,0 g (265 mmol) Natriumborhydrid wurden bei 0° C 300 ml Methanol tropfenweise hinzugegeben. Die
Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung wurde vorsichtig am Rotationsverdampfer auf ein Viertel des Volumens eingeengt. Es wurden
400 ml Wasser und 400 ml Diethylether hinzugegeben. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 300 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger
Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das
Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (1 ,5:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 4b mit 76,8 % Ausbeute (57,7 g, 136 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 425
c) (S)-{tett-Butoxycarbonylmethyl-[1-(4-nitro-benzyl)-2-oxo-ethyl]-amino}-essigsäure fe/f-butyl ester
Analog zu Synthesis (1981), 165-185: Zu einer gerührten Lösung von 8,9 g (70,7 mmol) Oxalylchlorid in 800 ml trockenem Dichlormethan wurden bei -65° C 11 g (141 mmol) Dimethylsulfoxid in 50 ml Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 20 min gerührt. Es wurden 20 g (47,1 mmol) 4b in 100 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Lösung wurde 45 Minuten bei -60°C gerührt. Es wurden 28,6 g (283 mmol) Triethylamin hinzugegeben. Die Lösung wurde für 30 Minuten gerührt und langsam auf 0° C erwärmt. Die Lösung wurde auf 500 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde dreimal mit je 200 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt (18 g) wurde ohne weitere Reinigung für die folgende Reaktion eingesetzt. MS-FAB (M+ +1 , 21): 423
d) (S)-{tetτ-Butoxycarbonylmethyl-[2-(tetf-butoxycarbonylmethyl-amino)-1-(4-nitro- benzyl)-ethyl]-amino}-essigsäure fert-butyl ester Zu einer gerührten Lösung von 18 g Rohprodukt 4c in 200 ml Methanol wurden bei 0° C 4,22 g (42,6 mmol) t-Bu-0-Gly-NH2 (Bachern) in 30 ml Methanol hinzugetropft. Es wurden 4,03 g (63,9 mmol) Natriumcyanoborhydrid hinzugegeben. Die Reaktionslösung wurde für 6 Stunden gerührt. Es wurde auf 200 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die methanolisch-wässrige Phase wurde viermal mit je 200 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan- Essigester (1 :2)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 4d mit 16,0 g (29,7 mmol; 63,1 % Ausbeute bezogen auf 4b). MS-FAB (M+ +1 , 21): 538
e) (2R,5S,2'S)-1-Benzyl-5-{[2-(bis-fferf-butoxycarbonylmethyl-amino)-3-(4-nitro-phenyl)- propyl]-fett-butoxycarbonylmethyl-carbamoyl}-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
7,62 g (27,4 mmol) (2R,5S)-1-Benzyl-pyrrolidin-2,5-dicarbonsäure-2-ethylester (Gazz.Chim.lial. 126. 8, (1996), 543-554) in 100 ml trockenem Dichlormethan wurden bei 0° C mit 3,89 g (30,1 mmol) Diisopropylethylamin und 4,1 g (30,1 mmol) HOBT versetzt. Es wurden 14,5 g (27,0 mmol) 4d in 100 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft Es wurden 11 ,0 g (53,5 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 30 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 200 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (3:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 4e mit 76,9 % Ausbeute (16,5 g, 20,8 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 798
f) (2R,5S,2'S)-1-Benzyl-5-({[2-(bis- erf-butoxycarbonylmethyl-amino)-3-(4-nitro-phenyl)- propyl]-t.ert-butoxycarbonylmethyl-amino}-methyl)-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester Analog zu J. Am. Chem. Soc, 112, 26, (1990): Zu einer Lösung von 14,3 g (18 mmol) 4e in 60 ml trockenem THF wurden 126 ml (126 mmol) BH3-THF-Lösung (1 M) hinzugetropft. Die Lösung wurde unter Rückfluss erhitzt und für 2h gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in 230 ml Methanol aufgenommen und für 2h unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Si02, Hexan-Essigester (3:1 )). Es ergab sich das gewünschte Produkt 4f mit 72,0 % Ausbeute (10,1 g, 13,0 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 782
g) (2R,5S,2'S)-5-({[2-(Bis-ter -butoxycarbonylmethyl-amino)-3-(4-nitro-phenyl)-propyl]- fet -butoxycarbonylmethyl-amino}-methyl)-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Analog zu Tetrahedron, 52, 44, (1996), 13867-13880: Zu einer Lösung von 9,40 g (12,0 mmol) 4f in 50 ml CCI und 50 ml Acetonitril wurden ~ 100 mg Rutheniumdioxid monohydrat und 51 ,5 g (0,24 mol) Natriumperiodat in 80 ml Wasser hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 3 Tage gerührt. Die Lösung wurde mit verdünnter HCI- Lösung auf pH = 6 eingestellt und dreimal mit je 80 ml Dichlormethan-/so-Propanol- Gemisch (10:1 ) extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan- Essigester (1 :2)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 4g mit 74,0 % Ausbeute (6,67 g, 8,88 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 751
h) (2R,5S,2'S)-5-({[2-(Bis-carboxymethyl-amino)-3-(4-nitro-phenyl)-propyl]- carboxymethyl-amino}-methyl)-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
6,01 g (8,00 mmol) 4g wurden in 90 ml MeOH bei 0° C mit 40 ml (80 mmol) Natronlauge (2N) versetzt. Die Lösung wurde auf 40° C erwärmt und für 14 Std. gerührt. Die Lösung wurde mit lonenaustauscherharz (IR 120) versetzt bis der Wert pH=3 erreicht wurde. Der Ionenaustauscher wurde abfilriert. Das Filtrat wurde durch Gefriertrocknung konzentriert. Es ergab sich das gewünschte Produkt 4h mit 77,5 % Ausbeute (3,44 g; 6,20 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 555
Beispiel 5
a) (2R,5S)-1 -Benzyl-5-{terf-butoxycarbonylmethyl-[2-(fert-butoxycarbonylmethyl- amino)-ethyl]-carbamoyl}-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
12,9 g (46,3 mmol) (2f?,5S)-1-Benzyl-pyrrolidin-2,5-dicarbonsäure-2-ethylester (Gazz.Chim.ltal. 126, 8, (1996), 543-554) in 170 ml trockenem Dichlormethan wurden bei 0° C mit 6,58 g (50,9 mmol) Diisopropylethylamin und 6,9 g (50,9 mmol) HOBT versetzt. Es wurden 29,3 g (101 ,7 mmol) [2-(tert-Butoxycarbonylmethyl-amino)- ethylamino]-essigsäure tert-butyl ester in 100 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Es wurden 18,6 g (90,4 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 60 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 350 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 200 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (1 :1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 5a mit 72,5 % Ausbeute (18,4 g, 33,6 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 548
b) ( R,2R,5S)-1-Benzyl-5-({2-[(1-benzyloxycarbonyl-5-fert-butoxycarbonylamino- pentyl)-tetf-butoxycarbonylmethyl-amino]-ethyl}-tert-butoxycarbonylmethyl-carbamoyl)- pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Zu einer Lösung von 18,2 g (33,2 mmol) 5a in 300 ml Dichlormethan wurden bei -20° C 15,6 g (33,2 mmol) 6-.ert-Butoxycarbonylamino-2-trifluoromethansulfonyloxy- hexansäure-benzylester (der entsprechende Alkohol, dessen Synthese in J. Org. Chem. (2000) 7667 beschrieben ist, wurde zuvor mit
Trifluoromethansulfonsäureanhydrid (2eq.) und Pyridin (2,2 eq.) in Dichlormethan bei - 20° C in das entsprechende Triflat umgewandelt) in 150 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Lösung wurde für 2 Std. gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Die Lösung wurde auf heftig gerührtes Eiswasser gegossen. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 150 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (4:1 )) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 5b mit 76,4 % Ausbeute (22,0 g, 25,4 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 868
c) (1 'R,2R,5S)-1 -Benzyl-5-[({2-[(1 -benzyloxycarbonyl-5-tert.-butoxycarbonylamino- pentyl)-t.ert-butoxycarbonylmethyl-amino]-ethyl}-tetf-butoxycarbonylmethyl-amino)- methyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Analog zu J. Am. Chem. Soc, 112, 26, (1990): Zu einer Lösung von 21 ,8 g (25,1 mmol) 5b in 150 ml trockenem THF wurden 176 ml (176 mmol) BH3-THF-Lösung (1M) hinzugetropft. Die Lösung wurde unter Rückfluss erhitzt und für 2h gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in 300 ml Methanol aufgenommen und für 2h unter Rückfluss erhitzt Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Si02, Hexan-Essigester (3:1)). Es ergab sich das gewünschte Produkt 5c mit 75,7 % Ausbeute (16,2 g, 19,0 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 854
d) (rR,2R,5S)-5-[({2-[(1-Benzyloxycarbonyl-5-terf-butoxycarbonylamino-pentyl)-ferf- butoxycarbonylmethyl-amino]-ethyl}-terf-butoxycarbonylmethyl-amino)-methyl]-1- carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Analog zu Tetrahedron, 52, 44, (1996), 13867-13880: Zu einer Lösung von 15,9 g (18,6 mmol) 5c in 80 ml CCI und 80 ml Acetonitril wurden ~ 250 mg Rutheniumdioxid monohydrat und 79,8 g (372 mmol) Natriumperiodat in 105 ml Wasser hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 3 Tage gerührt. Die Lösung wurde mit verdünnter HCI- Lösung auf pH = 6 eingestellt und dreimal mit je 250 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit Gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (1 :1 )) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 5d mit 76,7 % Ausbeute (11 ,7 g, 14,3 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 822
e) (1 'R,2R,5S)-5-[({2-[(5-te/ϊ-Butoxycarbonylamino-1 -carboxy-pentyl)-carboxymethyl- amino]-ethyl}-carboxymethyl-amino)-methyl]-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
9,0 g (11 ,0 mmol) 5d wurden in 110 ml MeOH bei 0° C mit 55 ml (110 mmol) Natronlauge (2N) versetzt. Die Lösung wurde auf 40° C erwärmt und für 14 Std. gerührt. Die Lösung wurde mit lonenaustauscherharz (IR 120) versetzt bis der Wert pH=3 erreicht wurde. Der Ionenaustauscher wurde abfilriert. Das Filtrat wurde durch Gefriertrocknung konzentriert. Es ergab sich das gewünschte Produkt 5e mit 81 ,2 % Ausbeute (5,26 g; 8,90 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 591
f) (1 'R,2R,5S)5-[({2-[(5-Amino-1 -carboxy-pentyl)-carboxymethyl-amino]-ethyl}- carboxymethyl-amino)-methyl]-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
Zu einer Lösung von 5,0 g (8,46 mmol) 5e in 110 ml Dichlormethan wurden 60g (526 mmol) Trifluoressigsäure hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. In destilliertem Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde erneut in Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet Es ergab sich das gewünschte Produkt 5f in 88,4 % Ausbeute (3,67 g; 7,48 mmol) MS-FAB (M+ +1 , 21): 491
Beispiel 6
(rs,2R,5S)-5-[({2-[(1-Benzyloxycarbonyl-5-fetτ-butoxycarbonylamino-pentyl)-fert- butoxycarbonylmethyl-amino]-ethyl}-tetf-butoxycarbonylmethyl-amino)-methyl]-1- (diethoxy-phosphorylmethyl)-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Zu einer Lösung von 9,60 g (12,6 mmol) 5c in 120 ml iso-Propanol wurden 0,5 g Palladium auf Kohle (10%) hinzugegeben. Die Atmosphäre über der Reaktionslösung wurde mit Wasserstoff gesättigt. Die Reaktionslösung wurde 5 Stunden gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt. Die Lösung wurde in Toluol aufgenommen. Mit 1 ,8 g (13 mmol) Diethylphosphit, 2,72 g (27 mmol) Triethylamin und 450 g (15 mmol) Paraformaldehyd versetzt. Die Lösung wurde für 10 h am Wasserabscheider azeotrop destilliert. Die Reaktionslösung wurde eingeengt. Der Rückstand wurde in Dietylether aufgenommen, mit MgS04 getrocknet und erneut eingeengt. Der Rückstand wurde über Kieselgel gereinigt. (Si02, Hexan-Essigester (1 :1)). Es ergab sich das gewünschte Produkt 6a mit 61 % Ausbeute (6,33 g, 7,7 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 27): 824
b) (1 'R,2R,5S)-5-[({2-[(5-Amino-1 -carboxy-pentyl)-carboxymethyl-amino]-ethyl}- carboxymethyl-amino)-methyl]-1-(ethoxy-hydroxy-phosphorylmethyl)-pyrrolidin-2- carbonsäure
6,3 g (7,7 mmol) 6a wurden mit 30 ml Dichlormethan und 30 ml Trifluoressigsäure versetzt. Die Lösung wurde für 1 h gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 50 ml Dioxan aufgenommen und mit 30 ml (60 mmol) Natronlauge (2N) versetzt. Die Reaktionslösung wurde für 26 Stunden bei 40° C gerührt. Die Lösung wurde abgekühlt. Es wurde saurer Ionenaustauscher IRA 120 hinzugegeben bis der pH-Wert bei 3 lag. Der Ionenaustauscher wurde abfiltriert. Dioxan wurde am Rotationsverdampfer entfernt, die wässrige Lösung mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Es ergab sich das gewünschte Produkt 6b in 68,3 % Ausbeute (2,94 g; 5,26 mmol) MS-FAB (M+ +1 , 23): 555
Beispiel 7
(2R,5S)-1-Benzyl-5-((diethoxy-phosphorylmethyl)-{2-[(diethoxy-phosphorylmethyl)- amino]-ethyl}-carbamoyl)-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
5,70 g (20,5 mmol) (2R,5S)-1-Benzyl-pyrrolidin-2,5-dicarbonsäure-2-ethylester (Gazz.Chim.ltal. 126, 8, (1996), 543-554) in 80 ml trockenem Dichlormethan wurden bei 0° C mit 2,91 g (22,5 mmol) Diisopropylethylamin und 3,1 g (22,5 mmol) HOBT versetzt. Es wurden 7,21 g (20,2 mmol) ({2-[(Diethoxy-phosphorylmethyl)-amino]- ethy!amino}-methyl)-phosphorsäure diethyl ester (beschrieben in: Bull.Acad.Sci.USSR Div.Chem.Sci. - Engl.Transl. (1960), 616-621) in 100 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Es wurden 8,25 g (40 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 20 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 150 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (2:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 7a mit 79,8 % Ausbeute (9,99 g, 16,1 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 620
b) (1 'R,2R,5S)-1 -Benzyl-5-[{2-[(1 -benzyloxycarbonyl-5- ert-butoxycarbonyIamino- pentyl)-(diethoxy-phosphorylmethyl)-amino]-ethyl}-(diethoxy-phosphorylmethyl)- carbamoyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Zu einer Lösung von 9,91 g (16,0 mmol) 7a in 300 ml Dichlormethan wurden bei -20° C 7,52 g (16,0 mmol) 6-£er£-Butoxycarbonylamino-2-trifluoromethansuϊfonyloxy- hexansäure-benzylester (der entsprechende Alkohol, dessen Synthese in J. Org.
Chem. (2000) 7667 beschrieben ist, wurde zuvor mit
Trifluoromethansulfonsäureanhydrid (2eq.) und Pyridin (2,2 eq.) in Dichlormethan bei -
20° C in das entsprechende Triflat umgewandelt) in 80 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Lösung wurde für 2 Std. gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Die Lösung wurde auf heftig gerührtes Eiswasser gegossen. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si0 , Hexan-Essigester (3:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 7b mit 78,3 % Ausbeute (11 ,8 g, 12,5 mmol).
MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 940
c) (1 'R,2R,5S)-1 -Benzyl-5-{[{2-[(1 -benzyloxycarbonyl-5-terf-butoxycarbonylamino- pentyl)-(diethoxy-phosphorylmethyl)-amino]-ethyl}-(diethoxy-phosphorylmethyl)-amino]- methyl}-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Analog zu J. Am. Chem. Soc, 11_2, 26, (1990): Zu einer Lösung von 11 ,7 g (12,5 mmol) 7b in 150 ml trockenem THF wurden 87,2 ml (87,2 mmol) BH3-THF-Lösung (1M) hinzugetropft. Die Lösung wurde unter Rückfluss erhitzt und für 2h gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in 200 ml Methanol aufgenommen und für 2h unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Si02, Hexan-Essigester (2:1)). Es ergab sich das gewünschte Produkt 7c mit 64,2 % Ausbeute (7,40 g, 8,00 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 926
d) (rR,2R,5S)-5-{[{2-[(1-Benzyloxycarbonyl-5-ferf-butoxycarbonylamino-pentyl)- (diethoxy-phosphorylmethyl)-amino]-ethyl}-(diethoxy-phosphorylmethyl)-amino]-methyl}- 1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Analog zu Tetrahedron, 52, 44, (1996), 13867-13880: Zu einer Lösung von 7,39 g (7,99 mmol) 7c in 40 ml CCI4 und 40 ml Acetonitril wurden ~ 150 mg Rutheniumdioxid monohydrat und 34,3 g (0,16 mol) Natriumperiodat in 60 ml Wasser hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 3 Tage gerührt. Die Lösung wurde mit verdünnter HCI- Lösung auf pH = 6 eingestellt und dreimal mit je 60 ml Dichlormethan-/so-Propanol- Gemisch (10:1 ) extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan- Essigester (1 :2,5)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 7d mit 72,4 % Ausbeute (5,16 g, 5,78 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 893
e) (rR,2R,5S)-5-{[{2-[(5-Amino-1-carboxy-pentyl)-(ethoxy-hydroxy-phosphorylmethyl)- amino]-ethyl}-(ethoxy-hydroxy-phosphorylmethyl)-amino]-methyl}-1-carboxymethyl- pyrrolidin-2-carbonsäure
Zu einer gerührten Lösung von 6,50 g (7,83 mmol) 7d in 100 ml iso-Propanol wurden 1 ,1 g Palladium auf Kohle (5%) hinzugegeben. Die Atmosphäre über der Reaktionslösung wurde bei Normaldruck mit Wasserstoff gesättigt. Die Reaktionslösung wurde für 6 Stunden gerührt und anschließend filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt. Der Rückstand wurde in 70 ml Dioxan aufgenommen und mit 40 ml (80 mmol) Natronlauge (2N) versetzt. Die Reaktionslösung wurde für 6 Stunden bei 40° C gerührt. Die Lösung wurde abgekühlt. Es wurde saurer Ionenaustauscher IRA 120 hinzugegeben bis der pH-Wert bei 3 lag. Der Ionenaustauscher wurde abfiltriert. Dioxan wurde am Rotationsverdampfer entfernt, die wässrige Lösung mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in 80 ml Dichlormethan aufgenommen und tropfenweise mit 30 g (263 mmol) Trifluoressigsäure versetzt. Die Lösung wurde für 30 Minuten bei Raumtempratur gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. In destilliertem Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde erneut in Wasser aufgenommen und wieder gefriergetrocknet. Es ergab sich das gewünschte Produkt 7e in 71 ,7 % Ausbeute (3,47 g; 5,61 mmol) MS-FAB (M+ +1 , 21): 619
Beispiel 8
a) (4-Methoxy-benzylamino)-essigsäure terf-butyl ester
Zu einer gut gerührten Lösung von 25,0 g (185 mmol) Glycin terf-butyl ester (Bachern) in 250 ml Methanol wurden 25,2 g (185 mmol) Anisaldehyd in 50 ml Methanol hinzugetropft. Es wurden 16,9 g (278 mmol) Natriumcyanoborhydrid in fester Form hinzugegeben. Die Lösung wurde für 5 Stunden gerührt, eingeengt und mit Wasser und Essigester (je 450 ml) versetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 100 ml Essigester extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (1 :1)) gereinigt Es ergab sich das gewünschte Produkt 8a mit 73,7 % Ausbeute (34,3 g, 136 mmol).
b) (2R,5S)-1-Benzyl-5-[ter.-butoxycarbonylmethyl-(4-methoxy-benzyl)-carbamoyl]- pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
17,5 g (63,0 mmol) (2r?,5S)-1-Benzyl-pyrrolidin-2,5-dicarbonsäure-2-ethylester (Gazz.Chim.ltal. 126, 8, (1996), 543-554) in 220 ml trockenem Dichlormethan wurden bei 0° C mit 8,95 g (69,2 mmol) Diisopropylethylamin und 9,34 g (69,2 mmol) HOBT versetzt. Es wurden 15,6 g (62,1 mmol) 8a in 220 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Es wurden 25,3 g (123 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 80 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 500 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 250 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (3:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 8b mit 71 ,8 % Ausbeute (22,8 g, 44,6 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21 ):511
c) (2R,5S)-1-Benzyl-5-{[tett-butoxycarbonylmethyl-(4-methoxy-benzyl)-amino]-methyl}- pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Analog zu J. Am. Chem. Soc, V 2, 26, (1990): Zu einer Lösung von 22,5 g (44,1 mmol) 8b in 150 ml trockenem THF wurden 308 ml (308 mmol) BH3-THF-Lösung (1M) hinzugetropft. Die Lösung wurde unter Rückfluss erhitzt und für 2h gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in 250 ml Methanol aufgenommen und für 2h unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Si02, Hexan-Essigester (2:1)). Es ergab sich das gewünschte Produkt 8c mit 61 ,8 % Ausbeute (13,5 g, 27,3 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 497
d) (2R,5S)-1-Benzyl-5-[(tetf-butoxycarbonylmethyl-amino)-methyl]-pyrrolidin-2- carbonsäure ethyl ester
Zu einer gerührten Lösung von 6,8 g (30 mmol) 2,3-Dichloro-5,6-dicyanbenzochinon in 120 ml Dichlormethan und 7,5 ml Wasser wurden 9,39 g (20 mmol) 8c in 30 ml Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 2 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 100 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan- Essigester (1 ,5:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 8d mit 72,4 % Ausbeute (5,45 g, 14,5 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 377
e) (2R,2'R,2"R,5S)-1-Benzyl-5-[({2-[bis-(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]-ethyl}-fert- butoxycarbonylmethyl-amino)-methyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Zu einer gerührten Suspension von 30 ml Acetonitril, 30 ml Phosphatpuffer (pH = 8) und 5,40 g (14,3 mmol) 8d wurden 4,63 g (14,3 mmol) 2-[(2-Bromo-ethyl)-(1- ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]-propionsäure ethyl ester (dessen Darstellung im nächsten Absatz beschrieben wird) in 10 ml Acetonitril hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 10 Stunden gerührt. Der Suspension wurden 100 ml Diethylether und 100 ml Eiswasser hinzugesetzt. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 100 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (5:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 8e mit 69,7 % Ausbeute (6,18 g; 9,97 mmol).
Synthese von 2-f(2-Bromo-ethyl)-(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-amino1-propionsäure ethyl
Zu einer Lösung von 17,0 g (279 mmol) Aminoethanol in 200 ml Dichlormethan wurden bei -20° C 140g g (558 mmol) 2-Trifluoromethansulfonyloxy-propionsäure-ethylester (der entsprechende Alkohol (Aldrich) wurde zuvor mit Triflatanhydrid (2eq.) und Pyridin (2,2 eq.) in Dichlormethan bei -20° C in das Triflat umgewandelt) gelöst in 80 ml Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 2 Stunden bei -20° C und 6 Stunden bei 0° C gerührt. Die Lösung wurde auf 300 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (2:1)) gereinigt. Das Zwischenprodukt wurde in 200 ml Dichlormethan gelöst und bei 0° C mit 73 g (279 mmol) Triphenylphosphin und 93 g (279 mmol) Tetrabrommethan in 100 ml Dichlormethan, versetzt. Die Lösung wurde über Nacht gerührt und auf 400 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 100 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde in 400 ml Hexan aufgenommen und über Nacht bei 0° C gerührt. Die Suspension wurde filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt und durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (5:1 )) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 2-[(2-Bromo-ethyl)-(1 -ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]-propionsäure ethyl ester mit 63,5 % Ausbeute (57 g, 177 mmol).
f) (1 '"R,2R,2'R,2"R,5S)- 1-(1-Benzyloxycarbonyl-5-tert-butoxycarbonylamino-pentyl)- 5-[({2-[bis-(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]-ethyl}-tert-butoxycarbonylmethyl-amino)- methyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Zu einer gerührten Lösung von 6,10 g (9,84 mmol) 8e in 70 ml iso-Propanol wurden 0,5 g Palladium auf Kohle (10%) hinzugegeben. Die Atmosphäre über der Reaktionslösung wurde mit Wasserstoff gesättigt. Die Reaktionslösung wurde 5 Stunden gerührt und dann filtriert. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt Der Rückstand wurde in 80 ml Dichlormethan aufgenommen und bei -20° C mit 4,62 g (9,84 mmol) 6-tett-Butoxycarbonylamino-2-trifluoromethansulfonyloxy-hexansäure- benzylester (der entsprechende Alkohol, dessen Synthese in J. Org. Chem. (2000) 7667 beschrieben ist, wurde zuvor mit Trifluoromethansulfonsäureanhydrid (2eq.) und Pyridin (2,2 eq.) in Dichlormethan bei -20° C in das entsprechende Triflat umgewandelt) in 30 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Lösung wurde für 2 Std. gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Die Lösung wurde auf heftig gerührtes Eiswasser gegossen. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (6:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 8f mit 69,3 % Ausbeute (4,97 g, 6,82 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 729
g) (1 '"R,2R,2'R,2"R,5S)- 1-(5-Amino-1-carboxy-pentyl)-5-[({2-[bis-(1-carboxy-ethyl)- amino]-ethyl}-carboxymethyl-amino)-methyl]-pyrrolidine-2-carboxylic acid 4,90 g (6,72 mmol) 8f wurden in 70 ml Dioxan gelöst und mit 40 ml (80 mmol) Natronlauge (2N) versetzt. Die Reaktionslösung wurde für 6 Stunden bei 40° C gerührt. Die Lösung wurde abgekühlt. Es wurde saurer Ionenaustauscher IRA 120 hinzugegeben bis der pH-Wert bei 3 lag. Der Ionenaustauscher wurde durch Filtration abgetrennt. Dioxan wurde am Rotationsverdampfer entfernt, die wässrige Lösung mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in 80 ml Dichlormethan aufgenommen und tropfenweise mit 30 g (263 mmol) Trifluoressigsäure versetzt. Die Lösung wurde für 30 Minuten bei Raumtempratur gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. In destilliertem Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde erneut in Wasser aufgenommen und wieder gefriergetrocknet. Es ergab sich das gewünschte Produkt 8g in 67,9 % Ausbeute (2,37 g; 4,56 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 519
Beispiel 9
a) (R)-2-{tert-Bufoxycarbonylmethyl-[2-(tert-butoxycarbonylmethyl-amino)-ethyl]- amino}-propionsäure ethyl ester
Eine -40° C kalten, gerührten Lösung von 28,8 g (100 mmol) 1 ,2-Diessigsäure-ferf- butylester-ethylen-diamin (J. Med. Chem., 29, 7, (1986), 1231-1237), 7,4 g (57 mmol) Diisopropyl-ethylamin und 250 ml Dichlormethan wurde tropfenweise mit 6,1 g (28 mmol) 2-Trifluoromethansulfonyloxy-propionsäure-ethylester (um das Rohprodukt dieser Verbindung zu erhalten wurde (-)-Milchsäureethylester mit Triflatanhydrid (2eq.) und Pyridin (2,2 eq.) in Dichlormethan bei -20° C in das entsprechende Triflat umgewandelt) in 20 ml Dichlormethan versetzt. Die Lösung wurde für 1 Std. gerührt und langsam auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 2 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (2:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 9a mit 70,4 % Ausbeute (7,66 g, 19,7 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 389
b) (1 'R,2R,5S)-1 -Benzyl-5-(tert-butoxycarbonylmethyl-{2-[tert-butoxycarbonylmethyl-(1 ■ ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]-ethyl}-carbamoyl)-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Eine Lösung von 5,7 g (20 mmol) (2R,5S)-1-Benzyl-pyrrolidin-2,5-dicarbonsäure-2- ethylester (Gazz.Chim.ltal. 126, 8, (1996), 543-554) in 80 ml trockenem Dichlormethan wurde bei 0° C mit 2,84 g (22 mmol) Diisopropylethylamin und 3 g (22 mmol) HOBT versetzt. Es wurden 7,60 g (19,6 mmol) 9a in 50 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Es wurden 8,3 g (40 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 300 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 150 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (4:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 9b mit 78,2 % Ausbeute (9,93 g, 15,3 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 648
c) (1 'R,2R,5S)-5-(tert-ButoxycarbonyImethyl-{2-[terf-butoxycarbonylmethyl-(1 - ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]-ethyl}-carbamoyl)-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Zu einer gerührten Lösung von 9,85 g (15,2 mmol) 9b in 100 ml /so-Propanol wurden 1 ,5 g Pd/C (10%) hinzugefügt. Die Atmosphäre über der Reaktionslösung wurde mit Wasserstoff gesättigt. Die Reaktionslösung wurde für 6 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde filtriert und eingeengt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 9c mit 8,25 g (14,8 mmol) und 97,4 % Rohausbeute. 9c wurde ohne Reinigung für die folgende Reaktion eingesetzt. MS-FAB (M+ +1 , 21): 558 d) (1 'R,2R,5S)-1 -(1 -Benzyloxycarbonyl-5-tert-butoxycarbonylamino-pentyl)-5-(tetτ- butoxycarbonylmethyl-{2-[tert-butoxycarbonylmethyl-(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]- ethyl}-carbamoyl)-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Zu einer Lösung von 8,10 g (14,5 mmol) 9c in 80 ml Dichlormethan wurden bei -30° C 8,45 g (18 mmol) 6-fe/?-Butoxycarbonylamino-2-trifluoromethansulfonyloxy-hexansäure- benzylester (der entsprechende Alkohol, dessen Synthese in J. Org. Chem. [2000] 7667 beschrieben ist, wurde zuvor mit Triflatanhydrid (2eq.) und Pyridin (2,2 eq.) in Dichlormethan bei -20° C in das Triflat umgewandelt) in 50 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Lösung wurde für 2 Std. gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 5 Stunden gerührt. Die Lösung wurde auf heftig gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 150 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (4:1 )) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 9d mit 75,6 % Ausbeute (9,61 g, 11 ,0 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 878
e) (1 'R,2R,5S)-1 -(1 -Benzyloxycarbonyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-pentyl)-5-[(tert.- butoxycarbonylmethyl-{2-[fe/ -butoxycarbonylmethyl-(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]- ethyl}-amino)-methyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Analog zu J. Am. Chem. Soc, 112. 26, (1990): Zu einer Lösung von 9,5 g (10,8 mmol) 9d in 50 ml trockenem THF wurden 70 ml (70 mmol) BH3-THF-Lösung (1 M) hinzugetropft. Die Lösung wurde unter Rückfluss erhitzt und für 2h gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in 100 ml Methanol aufgenommen und für 2h unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Si02, Hexan-Essigester (5:2)). Es ergab sich das gewünschte Produkt 9e mit 73,8 % Ausbeute (6,90 g, 7,99 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 864
f) (1 'R,2R,5S)-1 -(5-Amino-1 -carboxy-pentyl)-5-[({2-[(1 -carboxy-ethyl)-carboxymethyl- amino]-ethyl}-carboxymethyl-amino)-methyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure Zu einer Lösung von 6,8 g (7,88 mmol) 9e in 80 ml /so-Propanol wurden 1 g Pd/C (10%) hinzugefügt. Die Atmosphäre über der Reaktionslösung wurde mit Wasserstoff gesättigt. Die Reaktionslösung wurde für 5 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde in 50 ml Dichlormethan aufgenommen, auf -5 °C abgekühlt und mit 50 ml Trifluoressigsäure versetzt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und für 2 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde am Rotationsverdampfer zügig eingeengt. Der Rückstand wurde mittels Ölpumpenvakuum konzentriert und in 40 ml Dioxan aufgenommen. Es wurden 50 ml destilliertes Wasser und 15 ml (30 mmol) einer 2N Natriumhydroxydlösung hinzugefügt. Die Lösung wurde für 2 Stunden bei 40° C gerührt. Die Lösung wurde abgekühlt. Es wurde saurer Ionenaustauscher IRA 120 hinzugegeben bis der pH-Wert bei 3 lag. Der Ionenaustauscher wurde abfiltriert. Dioxan im Filtrat wurde am Rotationsverdampfer entfernt, die wässrige Lösung mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Es ergab sich das gewünschte Produkt 9f mit 74,1 % Ausbeute (2,95 g; 5,83 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 505
Beispiel 10
a) (rR,2R)-2-(Benzyl-{2-[benzyl-(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]-ethyl}-amino)- propionsäure ethyl ester
Zu einer Lösung von 12,0 g (50 mmol) N,N-Dibenzyl-ethan-1 ,2-diamin in 150 ml Dichlormethan wurden 26,1 g (120 mmol) 2-Trifluoromethansulfonyloxy-propionsäure- ethylester (um das Rohprodukt dieser Verbindung zu erhalten wurde (-)- Milchsäureethylester mit Triflatanhydrid (2eq.) und Pyridin (2,2 eq.) in Dichlormethan bei -20° C in das entsprechende Triflat umgewandelt) in 40 ml Dichlormethan hinzugefügt. Die Lösung wurde für 1 Std. gerührt und langsam auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 2 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (4:1 )) gereinigt Es ergab sich das gewünschte Produkt 10a mit 72,7 % Ausbeute (16,0 g, 36,4 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 441
b) (1 'R,2R)-2-[2-(1-Ethoxycarbonyl-ethylamino)-ethylamino]-propionsäure ethyl ester
Zu einer gerührten Lösung von 15,5 g (35,2 mmol) 10a in 100 ml /'so-Propanol wurden 2,5 g Pd/C (10%) hinzugefügt. Die Atmosphäre über der Reaktionslösung wurde mit Wasserstoff gesättigt. Die Reaktionslösung wurde für 6,5 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde filtriert und eingeengt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 10b mit 8,71 g (33,5 mmol) und 95,1 % Rohausbeute. 10b wurde ohne Reinigung für die folgende Reaktion eingesetzt.
c) (1 'R,1 "R,2R,5S)-1-Benzyl-5-{(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-[2-(1-ethoxycarbonyl- ethylamino)-ethyl]-carbamoyl}-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
15,3 g (55,0 mmol) (2f?,5S)-1-Benzyl-pyrrolidin-2,5-dicarbonsäure-2-ethylester (Gazz.Chim.lial. 126, 8, (1996), 543-554) in 180 ml trockenem Dichlormethan wurden bei 0° C mit 7,81 g (60,4 mmol) Diisopropylethylamin und 8,1 g (60,4 mmol) HOBT versetzt. Es wurden 20,8 g (80 mmol) 10b in 120 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft Es wurden 22,7 g (110 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 70 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 300 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 150 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (4:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 10c mit 79,3 % Ausbeute (22,6 g, 43,6 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 520
d) (1 'R,1 "R,1 '"R,2R,5S)-1-Benzyl-5-[{2-[(1-benzyloxycarbonyl-5-ter - butoxycarbonylamino-pentyl)-(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]-ethyl}-(1-ethoxycarbonyl- ethyl)-carbamoyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester Zu einer Lösung von 13,0 g (25,0 mmol) 10c in 120 ml Dichlormethan wurden bei -30° C 12,7 g (27,0 mmol) 6-terf-Butoxycarbonylamino-2-trifluoromethansulfonyloxy- hexansäure-benzylester (der entsprechende Alkohol, dessen Synthese in J. Org. Chem. [2000] 7667 beschrieben ist, wurde zuvor mit Triflatanhydrid (2eq.) und Pyridin (2,2 eq.) in Dichlormethan bei -20° C in das Triflat umgewandelt) in 70 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Lösung wurde für 2 Std. gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 5 Stunden gerührt. Die Lösung wurde auf heftig gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 200 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (3,5:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 10d mit 72,9 % Ausbeute (15,3 g, 18,23 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 840
e) (1 'R,1 "R,1 '"R,2R,5S)-5-[{2-[(1-Benzyloxycarbonyl-5-tert-butoxycarbonylamino- pentyl)-(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]-ethyl}-(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-carbamoyl]- pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Analog zu J. Am. Chem. Soc, 112. 26, (1990): Zu einer Lösung von 15,0 g (17,9 mmol) 10d in 150 ml trockenem THF wurden 125 ml (125 mmol) BH3-THF-Lösung (1 M) hinzugetropft. Die Lösung wurde unter Rückfluss erhitzt und für 2h gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in 600 ml Methanol aufgenommen und für 2h unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Si02, Hexan-Essigester (3:1)). Es ergab sich das gewünschte Produkt 10e mit 59,7 % Ausbeute (8,79 g, 10,7 mmol).
f) (1 'R,1 "R,1 '"R,2R,5S)- 5-{[{2-[(1-Benzyloxycarbonyl-5-tert-butoxycarbonylamino- pentyl)-(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]-ethyl}-(1-ethoxycarbonyl-ethyl)-amino]-methyl}- 1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
Analog zu Tetrahedron, 52, 44, (1996), 13867-13880: Zu einer Lösung von 14,0 g (16,5 mmol) 10d in 60 ml CCI4 und 60 ml Acetonitril wurden katalytische Mengen (ca. 0,5 g) Rutheniumdioxid-monohydrat und 71 ,6 g (0,334 mol) Natriumperiodat in 100 ml Wasser hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 3 Tage gerührt. Die Lösung wurde mit verdünnter HCI-Lösung auf pH = 6 eingestellt und dreimal mit je 100 ml Dichlormethan-/so-Propanol-Gemisch (10:1) extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (1 :1 ,5)) gereinigt Es ergab sich das gewünschte Produkt 10f mit 73 % Ausbeute (9,85 g, 12,0 mmol). MS-FAB: 794 (M+ +1 , 35)
g) (1 'R,1 "R,1 '"R,2R,5S)-5-[{2-[(5-Amino-1-carboxy-pentyl)-(1-carboxy-ethyl)-amino]- ethyl}-(1-carboxy-ethyl)-carbamoyl]-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
4,92 g (6,0 mmol) 10f wurden in 30 ml Trifluoressigsäure gelöst und für 4 Std. gerührt. Die Lösung wurde eingeengt und mit 15 ml (30 mmol) 2N Lithiumhydroxidlösung versetzt. Die Lösung wurde auf 40° C erwärmt und über Nacht gerührt. Die Lösung wurde abgekühlt. Es wurde mit verdünnter Salzsäure neutralisiert. Das Methanol im Filtrat wurde am Rotationsverdampfer entfernt, die wässrige Lösung mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet Es ergab sich das gewünschte Produkt 10g nach RP- Chromatographie mit Wasser-Acetonitril-Gemisch (9:1 → 4:1) mit 70,1 % Ausbeute (4,2 mmol).
MS-FAB: 533 (M+ +1 , 38)
Beispiel 11
(1 'R,2R,5S)-5-({[2-({1 -Carboxy-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1 -yl)-propionylamino]- pentyl}-carboxymethyl-amino)-ethyl]-carboxymethyl-amino}-methyl)-1-carboxymethyl- pyrrolidin-2-carbonsäure
Zu einer gerührten Lösung von 981 mg (2 mmol) 5f und 774 mg (6 mmol) Diisopropylethylamin in 20 ml DMF wurden bei 0° C 800 mg (3 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5- dihydro-pyrrol-1-yl)-propionsäure 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl ester (Aldrich) hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde für 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde tropfenweise auf 120 ml heftig gerührten Diethylether gegeben. Die Suspension wurde für 30 Minuten gerührt und filtriert. Der Rückstand wurde an der Ölpumpe getrocknet. Ein Teil des Rückstands wurde durch semipräparative RP-HPLC gereinigt. MS-FAB: 642 (M+ +1 , 11)
Beispiel 12
(rR,2R,5S)-5-({[2-(4-Amino-phenyl)-1-carboxy-ethyl]-[2-(bis-carboxymethyl-amino)- ethyl]-amino}-methyl)-1-carboxymethyl-pyrrolidine-2-carbonsäure
Zu einer Lösung von 1 ,11 g (2,0 mmol) 2g in 20 ml /so-Propanol und 5 ml dest. Wasser wurden 300 mg Pd/C (10%) hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde für 7 Stunden unter Wasserstoffatmosphäre gerührt. Der Katalysator wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde mit Wasser verdünnt. /so-Propanol wurde weitgehend am Rotationsverdampfer entfernt. Die wässrige Lösung wurde gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde als Rohprodukt für nachfolgende Reaktionen eingesetzt: 1 ,03 g (1 ,96 mmol) mit 98 % Ausbeute. MS-FAB: 525 (M+ +1 , 23)
Beispiel 13
( R,2R,5S)-5-({[2-(Bis-carboxymethyl-amino)-ethyl]-[1-carboxy-2-(4-isothiocyanato- phenyl)-ethyl]-amino}-methyl)-1-carboxymethyl-pyrrolidin-carbonsäure
Zu einem heftig gerührten Zwei-Phasen-System aus 0,53 g (1 mmol) 12, 3 ml Wasser, 605 mg (6 mmol) Triethylamin und 3 ml Chloroform wurden bei 0° C 114 mg (1 mmol) Thiophosgen in wenig Chloroform hinzugetropft. Die Lösung wurde für 3 Stunden gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die organische Phase wurde zweimal mit Wasser extrahiert. Die vereinigten, wässrigen Phasen wurden mit Dichlormethan gewaschen, mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Die Substanz wurde per HPLC auf Reinheit überprüft: HyPurity C18 (5Dm, 150 x 3,0 mm) mit Acetonitril- : Wasser- : Trifluoressigsäure-Gradient (3 : 96,9 : 0,1 → 99,9 : 0 : 0,1). Es ergab sich das gewünschte Produkt 13 mit 91% Ausbeute (520 mg, 910 mmol). MS-FAB: 571 (M+ +1 , 37)
Beispiel 14 (1 'R,2R,5S)-5-[([2-(Bis-carboxymethyl-amino)-ethyl]-{2-[4-(2-bromo-acetylamino)- phenyl]-1-carboxy-ethyl}-amino)-methyl]-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
Zu einer Lösung von 0,53 g (1 mmol) 12 und 606 mg (6 mmol) Triethylamin in 10 ml DMF wurden 202 mg (1 ,1 mmol) Bromessigsäurebromid hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde für eine Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde auf heftig gerührten Diethylether gegossen. Der Niederschlag wurde abfiltriert, in Wasser aufgenommen und unverzüglich gefriergetrocknet. Die Substanz wurde per HPLC auf Reinheit überprüft: HyPurity C18 (5Dm, 150 x 3,0 mm) mit Acetonitril- : Wasser- : Trifluoressigsäure-Gradient (3 : 96,9 : 0,1 → 99,9 : 0 : 0,1). Es ergab sich das gewünschte Produkt mit 82 % Ausbeute (520 mg, 820 Dmol). MS-FAB: 635 (M+ +1 , 37)
Beispiel 15
(1 'R,2R,5S)-5-[([2-(Bis-carboxymethyl-amino)-ethyl]-{1-carboxy-2-[4-(2-iodo- acetylamino)-phenyl]-ethyl}-amino)-methyl]-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
Zu einer Lösung von 0,53 g (1 mmol) 12 und 606 mg (6 mmol) Triethylamin in 10 ml DMF wurden 274 mg (1 ,1 mmol) lodessigsäurebromid hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde für eine Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde auf heftig gerührten Diethylether gegossen. Der Niederschlag wurde abfiltriert, in Wasser aufgenommen und unverzüglich gefriergetrocknet. Die Substanz wurde per HPLC auf Reinheit überprüft: HyPurity C18 (5Dm, 150 x 3,0 mm) mit Acetonitril- : Wasser- : Trifluoressigsäure-Gradient (3 : 96,9 : 0,1 → 99,9 : 0 : 0,1). Es ergab sich das gewünschte Produkt mit 88 % Ausbeute ( mg, 880 Dmol). MS-FAB: 682 (M+ +1 , 29)
Beispiel 16
(rR,2R,5S)-5-{[(2-{[5-(2-Bromo-acetylamino)-1-carboxy-pentyl]-carboxymethyl-amino}- ethyl)-carboxymethyl-amino]-methyl}-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure Zu einer Lösung von 0,49 g (1 mmol) 5 und 606 mg (6 mmol) Triethylamin in 10 ml DMF wurden 202 mg (1 ,1 mmol) Bromessigsäurebromid hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde für eine Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde auf heftig gerührten Diethylether gegossen. Der Niederschlag wurde abfiltriert, in Wasser aufgenommen und unverzüglich gefriergetrocknet. Die Substanz wurde per HPLC auf Reinheit überprüft: HyPurity C18 (5Dm, 150 x 3,0 mm) mit Acetonitril- : Wasser- : Trifluoressigsäure-Gradient (3 : 96,9 : 0,1 → 99,9 : 0 : 0,1). Es ergab sich das gewünschte Produkt mit 69 % Ausbeute (423 mg, 690 Dmol). MS-FAB: 613 (M+ +1 , 27)
Beispiel 17
(1 'R,2R,5S)-5-({[2-(Bis-carboxymethyl-amino)-ethyl]-[1-carboxy-2-(4-{3-[2-(2,5-dioxo- 2,5-dihydro-pyrrol-1-yl)-ethyl]-thioureido}-phenyl)-ethyl]-amino}-methyl)-1- carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
Zu einer gerührten Lösung von 570 mg (1 mmol) 13 in 5 ml DMF wurde eine Lösung von 154 mg (1 ,1 mmol) 1-(2-Amino-ethyl)-pyrrol-2,5-dion in 2 ml Dioxan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde über Nacht gerührt und zu 80 ml heftig gerührten Diethylether tropfenweise hinzugegeben. Der Niederschlag wurde abfiltriert und in Wasser aufgenommen. Die Lösung wurde gefriergetrocknet. Ein Teil des Rückstands wurde durch semipräparative RP-HPLC gereinigt. Acetonitril-Wasser-Gemisch (20:80). Die Substanz wurde per HPLC auf Reinheit überprüft: HyPurity C18 (5Dm, 150 x 3,0 mm) mit Acetonitril- : Wasser- : Trifluoressigsäure-Gradient (3 : 96,9 : 0,1 → 99,9 : 0 : 0,1). Es ergab sich das gewünschte Produkt mit 0,11 g (0,15 mmol) in hoher Reinheit. MS-FAB: 707 (M+ +1 , 13)
Beispiel 18
(2'R,2R,6S)-1-Carboxymethyl-6-{[carboxymethyl-(2-{carboxymethyl-[1-carboxy-2-(4- nitro-phenylcarbamoyloxy)-ethyl]-amino}-ethyl)-amino]-methyl}-piperidin-2-carbonsäure
Zu einer Lösung von 4 g (8,6 mmol) 1g in 50 ml DMF wurden 879 mg (8,7 mmol) Triethylamin hinzugegeben. Die Lösung wurde für 20 min gerührt. Es wurden 1 ,48 g (9 mmol) 1-lsocyanato-4-nitro-benzol (J.Med.Chem.; 40; 11 ; (1997); 1755-1761) in 5 ml DMF hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 8 h bei 60°C gerührt. Die Lösung wurde auf 600 ml gerührten Ether getropft. Der Niederschlag wurde abfiltriert. Ein Teil des Rückstands wurde durch semipräparative RP-HPLC gereinigt (Acetonitril-Wasser- Gemisch (15:85)). Die Substanz wurde per HPLC auf Reinheit überprüft: HyPurity C18 (5Dm, 150 x 3,0 mm) mit Acetonitril- : Wasser- : Trifluoressigsäure-Gradient (3 : 96,9 : 0,1 → 99,9 : 0 : 0,1). Es ergab sich das gewünschte Produkt mit 103 mg (0,15 mmol) in 98 % Reinheit. MS-FAB: 628 (M+ +1 , 13).
Beispiel 19
(2'R,2R,6S)-6-{[(2-{[1-Carboxy-2-(4-isocyanato-phenylcarbamoyloxy)-ethyl]- carboxymethyl-amino}-ethyl)-carboxymethyl-amino]-methyl}-1-carboxymethyl-piperidin- 2-carbonsäure
Zu einer Lösung von 4 g (8,6 mmol) 1g in 50 ml DMF wurden 879 mg (8,7 mmol) Triethylamin hinzugegeben. Die Lösung wurde für 20 min gerührt. Es wurden 12,8 g (80 mmol) 1 ,4-Diisocyanato-benzol (J.Org.Chem.; 41 ; 1976; 2070-2071) in 10 ml DMF in einem Schuss zur Reaktionslösung hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde für 8 h bei 60°C gerührt. Die Lösung wurde auf 600 ml gerührten Ether getropft. Der Niederschlag wurde abfiltriert. Ein Teil des Rückstands wurde durch semipräparative RP-HPLC gereinigt (Acetonitril-Wasser-Gemisch (15:85)). Die Substanz wurde per HPLC auf Reinheit überprüft: HyPurity C18 (5Dm, 150 x 3,0 mm) mit Acetonitril- : Wasser- : Trifluoressigsäure-Gradient (3 : 96,9 : 0,1 → 99,9 : 0 : 0,1). Es ergab sich das gewünschte Produkt mit 103 mg (0,15 mmol) in 98 % Reinheit. MS-FAB: 624 (M+ +1 , 22).
Beispiel 20
Antikörperkonjugat von (1 'R,2R,5S)-5-({[2-({1-Carboxy-5-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- pyrrol-1-yl)-propionylamino]-pentyl}-carboxymethyl-amino)-ethyl]-carboxymethyl- amino}-methyl)-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure 200 μg eines Antikörpers mit freizugänglichen Thiolgruppen (z.B. HuM195 (vgl. Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; im Handel erhältlich bei Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - besitzt der Antikörper keine frei zugänglichen Thiolgruppen, können diese durch die Verwendung von 2-lminothiolan HCI erzeugt werden (z.B. EP 0 607 222 B1)) wurden in 1 ,2 ml Boratpuffer (50 mM, pH 8,5) verdünnt, mit 154 μg (240 nmol) Produkt aus Beispiel 11, gelöst in 50 μl Boratpuffer (s.o.), versetzt und 3 Stunden bei 37°C gerührt. Es wurde über eine NAP-5-Säule (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, Mobile Phase: PBS) gereinigt.
Beispiel 21
Indiumkomplex des Antikörperkonjugats von (1 'R,2R,5S)-5-({[2-({1-Carboxy-5-[3-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl)-propionylamino]-pentyl}-carboxymethyl-amino)-ethyl]- carboxymethyl-amino}-methyI)-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
200 μg eines Antikörpers mit freizugänglichen Thiolgruppen (z.B. HuM195 (vgl. Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; im Handel erhältlich bei Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - besitzt der Antikörper keine frei zugänglichen Thiolgruppen, können diese durch die Verwendung von 2-lminothiolan HCI erzeugt werden (z.B. EP 0 607 222 B1)) wurden in 1 ,2 ml Boratpuffer (50 miVi, pH 8,5) verdünnt, mit 154 μg (240 nmol) Produkt aus Beispiel 11, gelöst in 50 μl Boratpuffer (s.o.), versetzt und 3 Stunden bei 37°C gerührt. Die Borat-Pufferlösung wurde gegen einen Acetatpuffer ausgetauscht, indem die Probelösung dreimal für 1h im Slide-A- Lyzer 10000, Pierce MWCO (Dialyse-Verfahren) gegen jeweils 200 ml NaOAc-Puffer 0,1 M (pH 6,0) gestellt wurde. Abschließend wurde über Nacht gegen 400 ml NaOAc- Puffer 0,1M (pH 6) gestellt Die Lösung wurde mit 80 μl (0.05M HCI) [11 ln]lnCI3 (27,88 MBq) versetzt und für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde über eine NAP-5- Säule (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, Mobile Phase: PBS) gereinigt.
Beispiel 22 (1 'R,2R,5S)-5-{[{2-[(5-Amino-1-carboxy-pentyl)-(ethoxy-hydroxy-phosphorylmethyl)- amino]-ethyl}-(ethoxy-hydroxy-phosphorylmethyl)-amino]-methyi}-1-carboxymethyl- pyrrolidin-2-carbonsäure
Zu einer gerührten Lösung von 6,50 g (7,83 mmol) 7d in 100 ml iso-Propanol wurden 1 ,1 g Palladium auf Kohle (5%) hinzugegeben. Die Atmosphäre über der Reaktionslösung wurde bei Normaldruck mit Wasserstoff gesättigt. Die Reaktionslösung wurde für 6 Stunden gerührt und anschließend filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt. Der Rückstand wurde in 70 ml Dioxan aufgenommen und mit 10 ml (20 mmol) Lithiumhydroxydiösung (2N) versetzt. Die Reaktionslösung wurde für 16 Stunden bei 45° C gerührt. Die Lösung wurde abgekühlt. Es wurde saurer Ionenaustauscher IRA 120 hinzugegeben bis der pH-Wert bei 3 lag. Der Ionenaustauscher wurde abfiltriert. Dioxan wurde am Rotationsverdampfer entfernt, die wässrige Lösung mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in 80 ml Dichlormethan aufgenommen und tropfenweise mit 30 g (263 mmol) Trifluoressigsäure versetzt. Die Lösung wurde für 30 Minuten bei Raumtempratur gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. In destilliertem Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde erneut in Wasser aufgenommen und wieder gefriergetrocknet. Es ergab sich das gewünschte Produkt 22 in 65,3 % Ausbeute (3,5 g; 5,11 mmol) MS-FAB (M+ +1 , 21): 619
Beispiel 23
(1 'R,2R,5S)-5-[([2-(Bis-carboxymethyl-amino)-ethyl]-{1 -carboxy-2-[4-(2,5-dioxo-2,5- dihydro-pyrrol-1-yl)-phenyl]-ethyl}-amino)-methyl]-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2- carbonsäure
In Anlehnung an Tetrahedron Lett.; 38; 46; 1997; 8089-8092: Ein Gemisch aus ca. 1 g getrocknetem Kieselgel, 100 mg (1 ,0 mmol) Maleinsäureanhydrid, 550 mg (1 ,0 mmol) 2g und 35,6 mg (0,1 mmol) Tantal-(V)-chlorid wurden in der Mikrowelle (300W) für 5 min erhitzt. Der Rückstand wurde über einer Fritte mit Methanol eluiert. Das Filtrat wurde eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen. Die Lösung wurde gefriergetrocknet. Ein Teil des Rückstands wurde durch semipräparative RP-HPLC gereinigt. Acetonitril-Wasser-Gemisch (20:80). Die Substanz wurde per HPLC auf Reinheit überprüft: HyPurity C18 (5Dm, 150 x 3,0 mm) mit Acetonitril- : Wasser- : Trifluoressigsäure-Gradient (3 : 96,9 : 0,1 → 99,9 : 0 : 0,1 ). Es ergab sich das gewünschte Produkt 23 mit 99 mg (0,16 mmol) in 96 % Reinheit. MS-FAB: 605 (M+ +1 , 21)
Beispiel 24
(1 'R,2R,5S)-5-{[(2-{[1-Carboxy-5-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl)-pentyl]- carboxymethyl-amino}-ethyl)-carboxymethyl-amino]-methyl}-1-carboxymethyl-pyrrolidin- 2- carbonsäure
In Anlehnung an Tetrahedron Lett.; 38; 46; 1997; 8089-8092:
Ein Gemisch aus ca. 1 g getrocknetem Kieselgel, 100 mg (1 ,0 mmol) Maleinsäureanhydrid, 550 mg (1 ,0 mmol) 2g und 35,6 mg (0,1 mmol) Tantal-(V)-chlorid wurden in der Mikrowelle (300W) für 5 min erhitzt. Der Rückstand wurde über einer Fritte mit Methanol eluiert. Das Filtrat wurde eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen. Die Lösung wurde gefriergetrocknet. Ein Teil des Rückstands wurde durch semipräparative RP-HPLC gereinigt. Acetonitril-Wasser-Gemisch (20:80). Die Substanz wurde per HPLC auf Reinheit überprüft: HyPurity C18 (5Dm, 150 x 3,0 mm) mit Acetonitril- : Wasser- : Trifluoressigsäure-Gradient (3 : 96,9 : 0,1 - 99,9 : 0 : 0,1). Es ergab sich das gewünschte Produkt 23 mit 85 mg (0,15 mmol) in 96 % Reinheit. MS-FAB: 572 (M+ +1 , 21)
Beispiel 25
a) (1 'R,2R,5S)-1 -Benzyl-5-{[tert-butoxycarbonylmethyl-(2-{tert-butoxycarbonylmethyl- [1-methoxycarbonyl-2-(4-nitro-phenyl)-ethyl]-amino}-ethyl)-amino]-methyl}-pyrrolidine-2- carbonsäureethyl ester
Zu einer Lösung von 9,1 g (16,6 mmol) 5a in 150 ml Dichlormethan wurden bei -20° C
5,93 g (16,6 mmol) (S)-3-(4-Nitro-phenyl)-2-trifluoromethanesulfonyloxy-propionsäure methylester (der entsprechende Alkohol, dessen Synthese in J.Chem.Soc.Perkin Trans.1; 24; 1996; 2895-2900 beschrieben ist, war zuvor mit Trifluoromethansulfonsäureanhydrid (2eq.) und Pyridin (2,2 eq.) in Dichlormethan bei - 20° C in das entsprechende Triflat umgewandelt worden) in 150 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Lösung wurde für 2 Std. gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Die Lösung wurde auf heftig gerührtes Eiswasser gegossen. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 150 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (4:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 25a mit 68 % Ausbeute (8,37 g, 11 ,3 mmol).
MS-FAB (M+ +1 , 21): 741
b) (rR,2R,5S)-5-{[tert-Butoxycarbonylmethyl-(2-{tert-butoxycarbonylmethyl-[1- methoxycarbonyl-2-(4-nitro-phenyl)-ethyl]-amino}-ethyl)-amino]-methyl}-1- carboxymethyl-pyrrolidine-2-carbonsäureethyl ester
Analog zu Tetrahedron, 52, 44, (1996), 13867-13880: Zu einer Lösung von 2,82 g (3,8 mmol) 25a in 15 ml CCI und 15 ml Acetonitril wurden -50 mg Rutheniumdioxid monohydrat und 16,3 g (76 mmol) Natriumperiodat in 22 ml Wasser hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde für 3 Tage gerührt. Die Lösung wurde mit verdünnter HCI- Lösung auf pH = 6 eingestellt und dreimal mit je 250 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (2:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 25b mit 70,0 % Ausbeute (1 ,88 g, 2,66 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 21): 709
c) (1 'R,2R,5S)-1 -Carboxymethyl-5-{[carboxymethyl-(2-{carboxymethyl-[1 -carboxy-2-(4- nitro-phenyl)-ethyl]-amino}-ethyl)-amino]-methyl}-pyrrolidin-2-carbonsäure
1 ,60 g (2,26 mmol) 25b wurden in 10 ml Dichlormethan und 3 ml Anisol gelöst. Es wurden 2 ml Trifluoressigsäure hinzugefügt. Die Reaktionslösung wurde für 5 Stunden gerührt und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Der Rückstand wurde in 20 ml MeOH bei 0° C mit 10 ml (20 mmol) Natronlauge (2N) versetzt. Die Lösung wurde auf 40° C erwärmt und für 14 Std. gerührt. Die Lösung wurde mit lonenaustauscherharz (IR 120) versetzt bis der pH-Wert 3 erreichte. Das Harz wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde mit Wasser verdünnt und gefriertrocknet. Ein Teil des Rückstands wurde durch semipräparative RP-HPLC gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 25c in 123 mg (0,22 mmol). Die Substanz wurde per HPLC auf Reinheit überprüft: HyPurity C18 (5Dm, 150 x 3,0 mm) mit Acetonitril- : Wasser- : Trifluoressigsäure-Gradient (3 : 96,9 : 0,1 → 99,9 : 0 : 0,1). MS-FAB (M+ +1 , 21 ): 555
Beispiel 26
a) (2R,5S)-1 -Benzyl-5-(2-tert-butoxycarbonylamino-propylcarbamoyl)-pyrrolidin-2- carbonsäure ethyl ester
11 ,4 g (41 mmol) (2R,5S)-1-Benzyl-pyrrolidin-2,5-dicarbonsäure-2-ethylesler (Gazz.Chim.ltal. 126, 8, (1996), 543-554) in 150 ml trockenem Dichlormethan wurden bei 0°C mit 5,82 g (45 mmol) Diisopropylethylamin und 6,1 g (45 mmol) HOBT versetzt. Es wurden 7 g (40 mmol) (2-Amino-1-methyl-ethyl)-carbaminsäure lert-butyl ester (WO 00/51976) in 100 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Es wurden 16,5 g (80 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 50 ml trockenem Dichlormethan hinzugetropft. Die Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde auf 300 ml gerührtes Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 150 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan- Essigester (4:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 26a mit 78 % Ausbeute (24,5 g, 13,5 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 41): 434
b) (2R,5S)-5-[(2-Amino-propylamino)-methyl]-1 -benzyl-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester 20 g (46,2 mmol) 2a wurden in 100 ml Dichlormethan gelöst und mit 100 ml Trifluoressigsäure versetzt. Es wurde für eine Stunde gerührt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in 150 ml THF aufgenommen und mit 150 ml (150 mmol) Borandimethylsulfid-Komplex versetzt. Die Lösung wurde für 3 Stunden bei 40°C gerührt. Die Lösung wurde eingeengt und mit 200 ml HCI-Gas gesättigtem Essigester versetzt. Das Hydrochlorid der obengenannten Verbindung fiel als weißer Niederschlag aus und wurde filtriert und an der Ölpumpe getrocknet. Es ergab sich das gewünschte Produkt als Dihydrochlorid mit 82% (14,8 g, 37,9 mmol). MS-FAB (M+ +1, 38): 320
c) (2R,5S)-1-Benzyl-5-({[2-(bis-tert-butoxycarbonylmethyl-amino)-propyl]-tert- butoxycarbonylmethyl-amino}-methyl)-pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
14 g (36 mmol) 2b wurden in 150 ml Acetonitril und 150 ml dest. Wasser gelöst und mit 19,9 g (144 mmol) Kaliumcarbonat versetzt Es wurden 28,1 g (144 mol) Bromessigsäure-tert-butylester hinzugelropft. Die Reaktionslösung wurde über Nacht bei 70° C gerührt. Die Reaktionslösung wurde abgekühlt und mit 500 ml Diethylether verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde viermal mit je 200 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (2:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 26c mit 73 % Ausbeute (17,4 g, 26,3 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 43): 663
d) (1 'R,2R,5S)-5-[({2-[Bis-(2-tert-butoxy-ethyl)-amino]-propyl}-tert- butoxycarbonylmethyl-amino)-methyl]-1-[1-methoxycarbonyl-2-(4-nitro-phenyl)-ethyl]- pyrrolidin-2-carbonsäure ethyl ester
17 g (25,8 mmol) 26 c wurden in 200 ml iso-Propanol gelöst mit 0,8 g Pd/C (10%) versetzt. Die Atmosphäre über der Reaktionslösung wurde mit Wasserstoff gesättigt. Die Reaktionslösung wurde für 6 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wurde filtriert und eingeengt. Es ergab sich das gewünschte Zwischenprodukt, welches in 150 ml Dichlormethan aufgenommen wurde und bei -20°C mit 10,7 g (30 mmol) 3-(4-Nitro- phenyl)-2-trifluoromethanesulfonyloxy-propionsäure methyl ester, welches aus 2- Hydroxy-3-(4-nitro-phenyl)-propionsäure methyl ester (J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 ; 24; 1996; 2895-2900) mit Triflatanhydrid (2eq.) und Pyridin (2,2 eq.) in Dichlormethan bei - 20° C erhalten worden war, versetzt wurde. Die Lösung wurde langsam auf 0°C erwärmt. Die Lösung wurde über Nacht nachgerührt. Die Lösung wurde auf 200 ml Eiswasser gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt. Die wässrige Phase wurde mehrmals mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten, organischen Phasen wurden mit gesättigter, wässriger Natriumchloridlösung gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (Si02, Hexan-Essigester (2:1)) gereinigt. Es ergab sich das gewünschte Produkt 26d mit 69 % Ausbeute (13.9 g, 17,8 mmol).
MS-FAB (M+ +1 , 24): 780
e) (rR,2R,5S)-5-({[2-(Bis-carboxymethyl-amino)-propyl]-carboxymethyl-amino}- methyl)-1-[1-carboxy-2-(4-nitro-phenyl)-ethyl]-pyrrolidin-2-carbonsäure
Zu einer Lösung von 9,20 g (11 ,8 mmol) 26d in 50 ml MeOH und 50 ml Wasser wurden 40 ml (80 mmol) einer 2M LiOH Lösung hinzugetropft. Die Lösung wurde für 12 h bei 40°C gerührt. Die Lösung wurde mit Wasser verdünnt und mit lonenaustauscherharz (IR 120) versetzt bis der pH-Wert 3 erreichte. Das Harz wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde gefriertrocknet. Es ergab sich das gewünschte Produkt 26e mit 74 % Ausbeute (8,81 g 8,73 mmol). MS-FAB (M+ +1 , 35): 569
Beispiel 27
Yttriumkomplex des Antikörperkonjugats von (1 'R,2R,5S)-5-({[2-({1 -Carboxy-5-[3-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl)-propionylamino]-pentyl}-carboxymethyl-amino)-ethyl]- carboxymethyl-amino}-methyl)-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
200 μg eines Antikörpers mit freizugänglichen Thiolgruppen (z.B. HuM195 (vgl. Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; im Handel erhältlich bei Protein Design Labs Inc, Mountainview, CA, USA) - besitzt der Antikörper keine frei zugänglichen Thiolgruppen, können diese durch die Verwendung von 2-lminothiolan HCI erzeugt werden (z.B. EP 0 607 222 B1)) wurden in 1 ,2 ml Boratpuffer (50 mM, pH 8,5) verdünnt, mit 154 μg (240 nmol) Produkt aus Beispiel 11 , gelöst in 50 μl Boratpuffer (s.o.), versetzt und bei 3 Stunden bei 37° C gerührt. Die Borat-Pufferlösung wurde gegen einen Acetatpuffer ausgetauscht, indem die Probelösung dreimal für 1 h im Slide-A-Lyzer 10000, Pierce, MWCO (Dialyse-Verfahren) gegen jeweils 200 ml NaOAc- Puffer 0,1 M (pH 6,0) gestellt wurde. Abschließend wurde über Nacht gegen 400 ml NaOAc-Puffer 0,1M (pH 6) gestellt. Die Lösung wurde mit 50 MBq [90Y]YCI3 versetzt und für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde über eine NAP-5-Säule (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, Mobile Phase: PBS) gereinigt .
Beispiel 28
Gadolinium-Komplex von (1 'R,2R,5S)-5-[({2-[(5-Amino-1 -carboxy-pentyl)- carboxymethyl-amino]-ethyl}-carboxymethyl-amino)-methyl]-1-carboxymethyl-pyrrolidin- 2-carbonsäure
122,8 mg (0,25 mmol) 5f wurden in 4 ml destilliertem Wasser suspendiert, auf 80°C erwärmt und in Lösung gebracht. Es wurde portionsweise mit 45,3 mg (0,125 mmol)
Gd203 versetzt. Die Suspension wurde auf 80° C erwärmt und für eine Stunde gerührt.
Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Natronlauge (1M) auf pH=7 eingestellt Es wurde das Wasser durch Gefriertrocknung entfernt. Es ergab sich das gewünschte mit 161 ,1 mg (0,25 mmol, 99,8%). MS-FAB (M+ +1 , 21): 645
Beispiel 29
Lutetiumkomplex des Antikörperkonjugats von (1 'R,2R,5S)-5-({[2-({1 -Carboxy-5-[3-
(2,5-dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl)-propionylamino]-pentyl}-carboxymethyl-amino)-ethyl]- carboxymethyl-amino}-methyl)-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
200 μg eines Antikörpers mit freizugänglichen Thiolgruppen (z.B. HuM195 (vgl. Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; im Handel erhältlich bei Protein Design Labs Inc, Mountainview, CA, USA) - besitzt der Antikörper keine frei zugänglichen Thiolgruppen, können diese durch die Verwendung von 2-lminothiolan HCI erzeugt werden (z.B. EP 0 607 222 B1)) wurden in 1 ,2 ml Boratpuffer (50 mM, pH 8,5) verdünnt, mit 154 μg (240 nmol) Produkt aus Beispiel 11 , gelöst in 50 μl Boratpuffer (s.o.), versetzt und bei 3 Stunden bei 37° C gerührt. Die Borat-Pufferlösung wurde gegen einen Acetatpuffer ausgetauscht, indem die Probelösung dreimal für 1 h im
Slide-A-Lyzer 10000, Pierce, MWCO (Dialyse-Verfahren) gegen jeweils 200 ml NaOAc- Puffer 0,1 M (pH 6,0) gestellt wurde. Abschließend wurde über Nacht gegen 400 ml NaOAc-Puffer 0,1M (pH 6) gestellt. Die Lösung wurde mit 50 MBq [177Lu]LuCI3 versetzt und für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde über eine NAP-5-Säule (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, Mobile Phase: PBS) gereinigt .
Beispiel 30
Scandiumkomplex des Antikörperkonjugats von (1 'R,2R,5S)-5-({[2-({1-Carboxy-5-[3- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl)-propionylamino]-pentyl}-carboxymethyl-amino)-ethyl]- carboxymethyl-amino}-methyl)-1-carboxymethyl-pyrrolidin-2-carbonsäure
200 μg eines Antikörpers mit freizugänglichen Thiolgruppen (z.B. HuM195 (vgl. Michael R. McDevitt, J. Nuc. Med. 40, 1999, 1722; im Handel erhältlich bei Protein Design Labs Inc., Mountainview, CA, USA) - besitzt der Antikörper keine frei zugänglichen Thiolgruppen, können diese durch die Verwendung von 2-lminothiolan HCI erzeugt werden (z.B. EP 0 607 222 B1)) wurden in 1 ,2 ml Boratpuffer (50 mM, pH 8,5) verdünnt, mit 154 μg (240 nmol) Produkt aus Beispiel 11 , gelöst in 50 μl Boratpuffer (s.o.), versetzt und bei 3 Stunden bei 37° C gerührt. Die Borat-Pufferlösung wurde gegen einen Acetatpuffer ausgetauscht, indem die Probelösung dreimal für 1h im Slide-A-Lyzer 10000, Pierce, MWCO (Dialyse-Verfahren) gegen jeweils 200 ml NaOAc- Puffer 0,1 M (pH 6,0) gestellt wurde. Abschließend wurde über Nacht gegen 400 ml NaOAc-Puffer 0,1M (pH 6) gestellt. Die Lösung wurde mit [46Sc]ScCI3 [47Sc]ScCI3 oder [48Sc]ScCI3 versetzt und für 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde über eine NAP-5-Säule (Amersham Pharmacia Biotech AB, Sephadex G-25, Mobile Phase: PBS) gereinigt .

Claims

Patentansprüche
1. Konjugate der allgemeinen Formel I
Figure imgf000074_0001
worin
Z für ein Wasserstoffatom oder ein Metallionenäquivalent eines Elements der Ordnungszahlen 21-29, 31 , 32, 37-39, 42-44, 46, 47, 49, 58-71 ,
75, 77, 82 oder 83 steht,
A für eine Gruppe -COO- , eine Gruppe -P(0)(OC1-C6-alkyl)-0- oder eine Gruppe -P(0)(OH)-0- steht, n für die Ziffern 0 oder 1 steht,
R1 - R6 unabhängig voneinander für ein Wasserstoff atom, einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten und gegebenenfalls durch ein bis sechs O-Atome, Phenylen-, -NHCO-, -CONH-, -O-(CO)-
Figure imgf000074_0002
und/oder -NH-(C=S)-NH-Gruppen unterbrochenen C^ - C25 -Alkylrest, der gegebenenfalls an einer beliebigen Stelle mit ein bis sechs Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, Aminogruppen und/oder einer anderen funktionellen bindenden Gruppe, die mit einem Biomolekül verknüpft sein kann, substituiert ist, oder für eine
Phenyl-Cι-C25-alkylgruppe stehen, deren Phenylrest gegebenenfalls mit einer Nitrogruppe, einer Aminogruppe oder einer anderen funktionellen bindenden Gruppe, die mit einem Biomolekül verknüpft sein kann, substituiert ist, sowie deren Salze mit organischen oder anorganischen Basen, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Substituenten R1-R6 nicht für H steht und dass mindestens einer der Substituenten R1-R6 ein über eine funktionelle Gruppe verknüpftes Biomolekül enthält und mindestens zwei Z für ein Metallionenäquivalent stehen.
2. Konjugate nach Anspruch 1 , worin mindestens zwei der Reste Z für ein
Metallionenäquivalent eines paramagnetischen Elements der Ordnungszahlen 21- 29, 42, 44 und 58-70 stehen.
3. Konjugate nach Anspruch 1 , worin mindestens zwei der Reste Z für ein
Metallionenäquivalent eines radioaktiven Elements der Ordnungszahlen 26, 27, 29, 31 , 32, 37-39, 43, 46, 47, 49, 61 , 62, 64, 70, 71 , 75, 77, 82 und 83 stehen.
4. Konjugate nach Anspruch 1 , worin die Reste R1- R6 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
Figure imgf000075_0001
,COOH OOH ^ „COOH OOH
Figure imgf000075_0002
Figure imgf000076_0001
' -/ "θ/ χ/ s-/ "0'^ ^' ^^^NH,
Figure imgf000076_0002
Figure imgf000076_0003
5. Konjugate nach Anspruch 1 , worin die in R1-R6 enthaltene funktionelle Gruppe Carboxyl, aktiviertes Carboxyl, Amino, Nitro, Isocyanat, Isothiocyanat, Hydrazin, Semicarbazid, Thiosemibarbazid, Chloracetamid, Bromacetamid, lodacetamid, Acryl, Acylamino, gemischten Anhydrid, Azid, Säurechlorid, Säurebromid, Hydroxid, Sulfonylchlond, Vinylsulphon, Carbodiimid, Maleimid oder Diazo ist über die ein Biomolekül verknüpft ist.
6. Verbindungen nach Anspruch 5, worin die aktivierte Carboxylgruppe ausgewählt ist aus
Figure imgf000077_0001
7. Verbindungen nach Anspruch 1 , worin die Reste R3 und R4 ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff ato , Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, Nitrobenzyl-, Hydroxymethyl- und Aminobenzylgruppe.
8. Konjugate nach Anspruch 1, worin das Biomolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Biopolymere, Proteine, wie Proteine, die eine biologische Funktion haben, HSA, BSA, etc., Proteine und Peptide, die sich an bestimmten Stellen im Organismus anreichern (z.B. an Rezeptoren, Zellmembranen, Kanälen etc.), durch Proteasen spaltbare Peptide, Peptide mit synthetischen Sollbruchstellen (z.B. labile Ester,
Amide etc.), Peptide, die durch Metalloprotheasen gespalten werden, Peptide mit photospaltbaren Linkern, Peptide mit oxydativen Mitteln (Oxydasen) spaltbaren Gruppen, Peptide mit natürlichen und unnatürlichen Aminosäuren, Glycoproteine (Glycopeptide), Signal-Proteine, antivirale Proteine und Apoktosis, synthetisch modifizierte Biopolymere, wie mit Linkern derivatisierte Biopolymere, modifizierte
Metalloproteasen und derivatisierte Oxydase etc., Kohlenhydrate (Mono- bis Polysaccharide), wie derivatisierte Zucker, im Organismus spaltbare Zucker, Cyclodextrine und dessen Derivate, Aminozucker, Chitosan, Polysulfate und Acetylneuraminsäure-Derivate, Antikörper, wie monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, polyklonale Antikörper, Minibodies, Single Chains (auch solche, die mit Linkern zu mehrfachen Fragmenten verknüpft sind), rote Blutkörperchen und andere Blutbestandteile, Cancermarker (z.B. CAA) und Zell- Adhäsions-Stoffe (z.B. Lewis X und Anti-Lewis X-Derivate), DNA und RNA Fragmente, wie derivatisierte DNAs und RNAs (z.B. solche, die durch das SELEX- Verfahren gefunden wurden), synthetische RNA und DNA (auch mit unnatürlichen Basen), PNAs (Hoechst) und Antisense, ß-Aminosäuren (Seebach), Vektoramine zur Einschleusung in die Zelle, biogene Amine, Pharmazeutika, onkologische Präparate, synthetische Polymere, die auf ein biologisches Target (z.B. Rezeptor) gerichtet sind, Steroide (natürliche und modifizierte), Prostaglandine, Taxol und dessen Derivate, Endotheline, Alkaloide, Folsäure und deren Derivate, bioaktive Lipide, Fette, Fettsäureester, synthetisch modifizierte Mono-, Di- und Triglyceride, Liposome, die an der Oberfläche derivatisiert sind, Micellen aus natürlichen Fettsäuren oder aus Perfluoralkyl-Verbindungen, Porphyrine, Texaphrine, erweitere
Porphyrine, Cytochrome, Inhibitoren, Neuramidasen, Neuropeptide, Immunomodulatoren, wie FK 506, CAPE und Gliotoxin, Endoglycosidasen, Substrate, die durch Enzyme aktiviert werden wie Calmodolin Kinase, Casein- Kinase II, Gluthathion-S-Transferase, Heparinase, Matrix-Metalloprotheasen, ß- Insulin-Rezeptor-Kinase, UDP-Galactose 4-Epimerase, Fucosidasen, G-Proteine,
Galactosidasen, Glycosidasen, Glycosyltransferasen und Xylosidase, Antibiotika, Vitamin und Vitamin-Analoga, Hormone, DNA-Interkalatoren, Nucleoside, Nucleotide, Lektine, Vitamin B12, Lewis-X und Verwandte, Psoralene, Dientrienantibiotika, Carbacycline, VEGF (vascular endothelial growth factor), Somatostatin und dessen Derivate, Biotin-Derivate, Antihormone, tumorspezifische
Proteine und Synthetika, Polymere, die sich in sauren oder basischen Bereichen des Körpers anreichern (pH-gesteuerte Verteilung), Myoglobine, Apomyoglobine etc., Neurotransmitter-Peptide, Tumornecrosefaktoren, Peptide, die sich in entzündetem Gewebe anreichern, Bloodpool-Reagenzien, Anionen und Kationen- Transporterproteine, Polyester (z.B. der Milchsäure), Polyamide und
Polyphosphate.
9. Verfahren zur Herstellung von Konjugaten der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man in an sich bekannter Weise Verbindungen der allgemeinen Formel I'
Figure imgf000079_0001
worin Z' eine Carboxylschutzgruppe bedeutet und R1'-R6 die für R >1'- DR6D angegebene Bedeutung haben, wobei jedoch die in ihnen enthaltenen funktionellen Gruppen frei, d.h. nicht an ein Biomolekül gebunden sind,
gegebenenfalls nach Abspaltung der Schutzgruppen Z' mit einem Biomolekül umsetzt und anschließend (nach Abspaltung der Schutzgruppen Z) die so erhaltenen Säuren in an sich bekannter Weise mit mindestens einem Metalloxid oder Metallsalz eines Elements der Ordnungszahlen 21-29, 31 , 32, 37-39, 42-44,
46, 47, 49, 58-71 , 75, 77, 82 oder 83 umsetzt und anschließend, falls gewünscht, vorhandene acide Wasserstoffatome mit anorganischen und/oder organischen oder Aminosäuren in physiologisch verträgliche Salze überführt.
10. Pharmazeutische Mittel enthaltend mindestens eine physiologisch verträgliche Verbindung nach Anspruch 2.
11. Pharmazeutische Mittel enthaltend mindestens eine physiologisch verträgliche Verbindung nach Anspruch 3.
12. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 2 zur Herstellung von Mitteln für die NMR-Diagnostik.
13. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 3 zur Herstellung von Mitteln für die Radiodiagnostik oder Radiotherapie.
4. Kit zur Herstellung von Radiopharmaka, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 , worin Z ein Wasserstoffatom ist, und eine Verbindung eines radioaktiven Elements der Ordnungszahlen 26, 27, 29, 31 , 32, 37-39, 43, 46, 61 , 62, 64, 67, 70, 71 , 75, 77, 82 lund 83.
PCT/EP2004/003003 2003-04-03 2004-03-20 Konjugate 2,4-ethano- und 2,4-propano-überbrückter 3,6,9-triaza-nonansäure-3n, 6n, 9,9n-tetraessigsäure- und entsprechender phosphorsäuremethylen-derivate und deren abkömmlinge mit biomolekülen, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zur herstellung Ceased WO2004087656A1 (de)

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