WO2004084135A2 - Method and device for determining quantitative histochemical and immunohistochemical parameters - Google Patents
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Abstract
The invention relates to a method of determining digital data relating to a cancer tumour. The inventive method consists in digitising an immunohistochemically-stained sample, for example, using a high-resolution slide scanner, in order to check for tumour cell differentiation or proliferation markers. According to the invention, the digitised image of the entire tumour piece is subjected to a treatment comprising the following steps consisting in: separating the background from the tissue by comparing the intensity of one colour component of the pixels with a threshold, the most intense pixels (16) corresponding to the epithelium and the stroma; and establishing a histogram of the intensity of at least one colour component of the pixels of the tissue and, in said histogram, determining an intensity separation threshold which essentially corresponds to the minimum of the histogram, in order to separate the epithelium from the stroma.
Description
PROCEDE ET DISPOSITIF DE DETERMINATION DE PARAMETRES QUANTITATIFS HISTOCHIMIQUES ET IMMUNOHISTOCHTMIQUES METHOD AND DEVICE FOR DETERMINING HISTOCHEMICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL QUANTITATIVE PARAMETERS
L' invention est relative à un procédé et à un dispositif de détermination de paramètres quantitatifs obtenus à partir de préparations tissulaires histochimiques et immuno- histochimiques . Elle concerne, de façon plus précise, un procédé et un dispositif permettant la quantification de structures et de marqueurs moléculaires, susceptibles de fournir une information sur l'évolution des tumeurs cancéreuses et leur réponse potentielle au traitement. On rappelle ici que la technique de marquage histochimique ou itrimunohistochimique consiste à appliquer, sur de très fines sections de tissu, un colorant ou un anticorps spécifique, qui permettent la mise en évidence sélective de certains éléments de l'échantillon. Ainsi, la coloration est directe ou constitue un marquage par une réaction enzymatique colorée du site de la réaction antigénique. Ces colorations peuvent être observées en lumière ordinaire ou en fluorescence. Dans ce qui suit, on considérera surtout des marqueurs repérables en lumière visible. Les colorations peuvent être appliquées à des sections de tissu congelé ou fixé et inclus en paraffine ou en résine plastique. Les procédés qui seront décrits ci-après, s'appliquent dans tous les cas. Toutefois, on préférera des coupes de tissu fixé et inclus en paraffine. L'analyse quantitative des structures tissulaires et cellulaires colorées permet de déterminer des paramètres d'évaluation de l'évolution de la maladie qui peuvent constituer eux-mêmes des aides à la prise de décision pour établir le traitement . Ainsi, le dénombrement des vaisseaux sanguins se trouvant dans une tumeur peut contribuer à établir le pronostic
de cette tumeur et justifier ou non la mise en route d'un traitement anti-angiogénique.The invention relates to a method and a device for determining quantitative parameters obtained from histochemical and immunohistochemical tissue preparations. It relates, more precisely, to a method and a device allowing the quantification of structures and molecular markers, capable of providing information on the evolution of cancerous tumors and their potential response to treatment. It is recalled here that the histochemical or itrimunohistochemical marking technique consists in applying, to very thin sections of tissue, a specific dye or antibody, which allows the selective highlighting of certain elements of the sample. Thus, the coloring is direct or constitutes a labeling by a colored enzymatic reaction of the site of the antigenic reaction. These colors can be observed in ordinary light or in fluorescence. In what follows, we will mainly consider markers identifiable in visible light. The colors can be applied to sections of frozen or fixed tissue and included in paraffin or plastic resin. The procedures which will be described below apply in all cases. However, we will prefer sections of tissue fixed and included in paraffin. The quantitative analysis of the colored tissue and cell structures makes it possible to determine parameters for evaluating the course of the disease which can themselves constitute decision-making aids in establishing the treatment. Thus, counting the blood vessels in a tumor can help establish the prognosis of this tumor and justify or not the initiation of an anti-angiogenic treatment.
Il peut être également indispensable de disposer d' informations sur la fraction volumique du stroma des tumeurs qui constitue le tissu de soutien et le tissu nourricier du cancer.It may also be essential to have information on the volume fraction of the stroma of the tumors which constitutes the supporting tissue and the nourishing tissue of cancer.
Dans certaines localisations tumorales telles que le cancer du sein, le cancer de l'ovaire ou de la prostate, le pathologiste doit aussi disposer d'informations sur des marqueurs de prolifération ou de différenciation cellulaires, notamment la proportion de cellules qui se multiplient ou la fraction de cellules cancéreuses équipées de récepteurs hormonaux.In certain tumor locations such as breast cancer, ovarian or prostate cancer, the pathologist must also have information on markers of cell proliferation or differentiation, in particular the proportion of cells that multiply or the fraction of cancer cells equipped with hormone receptors.
De façon plus précise, le pathologiste peut souhaiter disposer des informations suivantes :More specifically, the pathologist may wish to have the following information:
1. Informations relatives aux vaisseaux sanguins : a) le nombre moyen de vaisseaux par unité de surface de tissu tumoral, b) la surface des vaisseaux par unité de surface de tissu tumoral, et c) après identification des zones de concentration maximale, appelées " hot spots ", les valeurs moyennes et maximales du nombre de vaisseaux par unité de surface et de la surface des vaisseaux par unité de surface dans ces " hot spots " .1. Information relating to blood vessels: a) the average number of vessels per unit area of tumor tissue, b) the area of vessels per unit area of tumor tissue, and c) after identification of the areas of maximum concentration, called " hot spots ", the average and maximum values of the number of vessels per unit area and the area of vessels per unit area in these" hot spots ".
2. Informations relatives au stroma : le pourcentage de surface de stroma (ou à l'inverse le pourcentage de cellules cancéreuses) par rapport à la surface tumorale totale. 3. Informations relatives aux marqueurs cellulaires, et en particulier aux marqueurs localisés dans les noyaux: a) la densité de surface moyenne marquée sur l'ensemble des cellules cancéreuses de la section de tumeur,
b) après identification des zones de concentration maximale, la densité de surface de marquage moyenne et maximale, dans ces w hot spots " .2. Stroma information: the percentage of stroma surface (or conversely the percentage of cancer cells) in relation to the total tumor surface. 3. Information relating to cellular markers, and in particular to markers located in the nuclei: a) the average surface density marked on all of the cancer cells of the tumor section, b) after identification of the zones of maximum concentration, the average and maximum marking surface density in these w hot spots ".
Jusqu'à présent, les colorations histochimiques et immunohistochimiqu.es sont observées au microscope et les divers paramètres mentionnés ci-dessus sont le plus souvent estimés à partir d'une observation visuelle. Mais, les mesures obtenues de cette manière sont subjectives et peu reproductibles ; en outre, les tumeurs sont souvent hétérogènes et les informations extraites de l'observation de quelques champs microscopiques ne peuvent rendre compte du comportement global des lésions. De telles méthodes ne peuvent donc être introduites en routine de laboratoire d'analyse.Until now, histochemical and immunohistochemical stains have been observed under a microscope and the various parameters mentioned above are most often estimated from a visual observation. However, the measurements obtained in this way are subjective and not very reproducible; in addition, the tumors are often heterogeneous and the information extracted from the observation of a few microscopic fields cannot account for the overall behavior of the lesions. Such methods cannot therefore be introduced into routine laboratory analysis.
Des tentatives de quantification semi-automatique, plus rarement totalement automatiques, ont été effectuées, mais les procédés utilisés restent peu satisfaisants, car trop rudi entaires et trop dépendants des conditions de numérisation des images. Ils ne peuvent donc pas fournir des résultats reproductibles . L'invention a pour but de fournir un procédé de mesure, de préférence totalement automatique, d'au moins certains paramètres. Elle s'appuie sur l'utilisation d'une image numérique unique, de préférence en millions de couleur et codée sur 24 bits et non compressée de la préparation histologique complète de la tumeur, cette image étant obtenue par exemple avec un scanner à diapositives professionnel acceptant un passeur de lames histologiques et pour lequel les conditions d'acquisition, c'est-à-dire la résolution, les conditions d' éclairement et le rendu des couleurs sur l'écran, ont été précisément définies.Attempts at semi-automatic quantification, more rarely fully automatic, have been made, but the methods used remain unsatisfactory, since they are too rough and too dependent on the conditions for digitizing the images. They therefore cannot provide reproducible results. The invention aims to provide a measurement method, preferably fully automatic, of at least certain parameters. It is based on the use of a single digital image, preferably in millions of color and coded on 24 bits and uncompressed of the complete histological preparation of the tumor, this image being obtained for example with a professional slide scanner accepting a passer of histological slides and for which the acquisition conditions, that is to say the resolution, the lighting conditions and the color rendering on the screen, have been precisely defined.
Elle fait donc appel à des procédures d'analyse automatique d' images pour le dénombrement des sections vasculaires et/ou l'estimation de la fraction de stroma tumoral et/ou la quantification des structures cellulaires. - Vaisseaux intra-tumoraux.
Selon un premier aspect de l'invention, on effectue une succession de traitements numériques d'une image d'une section complète de tumeur, par exemple scannée à une résolution d'au moins 2700 points par pouce, avec des conditions d'acquisition prédéterminées, pour mesurer automatiquement les paramètres relatifs aux vaisseaux présents dans cette tumeur. Par exemple, le marquage vasculaire est obtenu au préalable par action d'un anticorps spécifique (facteur VIII ou facteur Von Willebrand) et le site de la réaction antigénique est révélé par la coloration brune de la diaminobenzidine (DAB) ou la coloration rouge de l'aminoéthylcarbazole (AEC) , et le tissu non marqué est contre-coloré en bleu par une laque nucléaire d'hématoxyline.It therefore uses automatic image analysis procedures for counting vascular sections and / or estimating the fraction of tumor stroma and / or quantifying cellular structures. - Intra-tumor vessels. According to a first aspect of the invention, a succession of digital processing operations is carried out on an image of a complete section of tumor, for example scanned at a resolution of at least 2700 dots per inch, with predetermined acquisition conditions. , to automatically measure the parameters relating to the vessels present in this tumor. For example, the vascular labeling is obtained beforehand by the action of a specific antibody (factor VIII or Von Willebrand factor) and the site of the antigenic reaction is revealed by the brown coloration of diaminobenzidine (DAB) or the red coloration of the aminoethylcarbazole (AEC), and the unlabeled tissue is counter-colored blue with a nuclear haematoxylin lacquer.
Le traitement d'images comporte une étape de détection du tissu tumoral, une étape d'élimination des zones de nécrose et/ou de mucus, une étape de détection des structures immunomarquées, une étape d'identification et de localisation des zones de plus forte concentration vasculaire et une étape de mesure. Pour identifier le tissu et l'isoler du fond de l'image, de préférence, on choisit une des composantes de couleur, par exemple le vert, pour lequel il offre un bon contraste, on porte cette image au carré et on lui applique un seuillage automatique adaptatif, basé sur le calcul du moment de la distribution des valeurs de gris de l'image, et contraint à se situer entre 90 et 100% de ces valeurs. On rappelle que porter une image au carré signifie porter au carré l'intensité de la composante de couleur choisie pour chaque pixel.Image processing includes a step of detecting tumor tissue, a step of eliminating areas of necrosis and / or mucus, a step of detecting immunolabelled structures, a step of identifying and locating the strongest areas vascular concentration and a measurement step. To identify the fabric and isolate it from the background of the image, preferably, we choose one of the color components, for example green, for which it offers a good contrast, we wear this image squared and we apply a automatic adaptive thresholding, based on the calculation of the moment of distribution of the gray values of the image, and constrained to be between 90 and 100% of these values. Remember that bringing an image squared means bringing the intensity of the color component chosen for each pixel to the square.
Cette étape peut être complétée par deux opérations de morphologie mathématique destinées à améliorer l'image résultat : une fermeture puis une ouverture géodésiques. L'opération de fermeture permet de boucher les trous et vallées et améliorer les contours tandis que l'opération d'ouverture supprime le bruit autour du tissu.
La seule étape interactive, c'est-à-dire manuelle, qui peut intervenir à ce niveau est celle de la détermination du dessin des limites du tissu tumoral lorsque subsiste, sur la section de tumeur, du tissu normal avoisinant ou des territoires indésirables constitués par des artefacts de préparation, tels que des plis de la coupe.This step can be completed by two operations of mathematical morphology intended to improve the result image: a closing then a geodetic opening. The closing operation closes the holes and valleys and improves the contours while the opening operation removes noise around the fabric. The only interactive step, that is to say manual, which can intervene at this level is that of determining the drawing of the limits of the tumor tissue when there remains, on the tumor section, the normal surrounding tissue or undesirable territories formed by preparation artifacts, such as folds of the cut.
Il est également utile d'éliminer les zones de nécrose et/ou de mucus de l'image de tissu à analyser, car ces zones ne présentent pas d' intérêt pour la quantification et leur coloration non spécifique fausse les résultats de la mesure. Pour éliminer ces zones, on part de la constatation que celles- ci sont colorées par les chromogènes sous forme de plages plus ou moins homogènes, étendues, de couleur rouge ou marron, alors que le tissu tumoral est à prédominante bleue (ou verte) . On caractérise et on isole ces régions par traitement d' images comme des plages de couleur " non bleue " . A cette fin, après un filtrage destiné à homogénéiser la texture et la couleur de ces plages, on calcule une image d'« excès de bleu », définie comme la différence entre, d'une part, le double de la valeur de la composante de couleur bleue et, d'autre part, la somme des composantes rouge et verte, les valeurs négatives étant conservées.It is also useful to remove the areas of necrosis and / or mucus from the image of tissue to be analyzed, since these areas are not of interest for quantification and their non-specific coloring distorts the results of the measurement. To eliminate these zones, we start from the observation that these are colored by the chromogens in the form of more or less homogeneous, extensive patches, of red or brown color, while the tumor tissue is predominantly blue (or green). These regions are characterized and isolated by image processing as "non blue" color areas. To this end, after a filtering intended to homogenize the texture and the color of these ranges, one calculates an image of “excess of blue”, defined as the difference between, on the one hand, the double of the value of the component blue in color and, on the other hand, the sum of the red and green components, the negative values being preserved.
En outre, l'identification et la localisation de ces zones de nécrose et/ou de mucus sont complétées par l'élimination des petites plages. Cette élimination s'effectue par une opération classique de morphologie mathématique portant le nom d'ouverture par reconstruction et consistant en une érosion suivie d'une dilatation géodésique.In addition, the identification and localization of these areas of necrosis and / or mucus are supplemented by the elimination of small areas. This elimination is carried out by a conventional operation of mathematical morphology bearing the name of opening by reconstruction and consisting of an erosion followed by a geodesic dilation.
Ensuite, pour détecter les vaisseaux dans la tumeur, on part de la constatation que les cellules tapissant ces vaisseaux peuvent n'être que partiellement colorées.Then, to detect the vessels in the tumor, we start from the observation that the cells lining these vessels may only be partially stained.
Par conséquent, pour isoler au mieux les sections de vaisseaux dans leur intégralité, de préférence, on combine deux étapes : on détecte le maximum de structures dans l' image et on ne reconstruit, pour les conserver, que les structures
partiellement ou totalement marquées par le chromogène brun ou rouge. Par « structures » présentes dans 1 ' image on entend ici des régions qui sont plus contrastées que leur environnement, au sein de la composante bleue de l'image en couleur. Elles sont isolées par une procédure de morphologie mathématique dite de « chapeau haut de forme » obtenue, par exemple, par la différence entre, d'une part, le résultat d'un filtrage passe- bas de la composante bleue et, d'autre part, l'image fermée (dilatation suivie d'érosion) de l'image filtrée. Les régions immunomarquées sont identifiées, sur une image couleur corrigée par référence au fond, par translation de couleur. Cette opération est effectuée soit par seuillage des valeurs basses d'une image résultant de la soustraction entre la composante bleue et la moitié de la composante verte de l'image couleur, soit par conservation des valeurs positives d'une image d'« excès de rouge » calculée comme le résultat de la différence entre, d'une part, le double de l'image rouge et, d'autre part, la somme de l'image verte et de l'image bleue. Ce résultat peut être combiné à un double seuil d'une image de teinte de l'espace couleur HSI (« Hue » ou teinte, Saturation, Intensité) qui ne conserve que les couleurs du spectre allant du violet au jaune en passant par le rouge. Par double seuil, on entend ici que la valeur de la gamme de teintes conservée doit se situer entre deux limites. Grâce à une opération de morphologie mathématique, dite de reconstruction géodésique, seules les structures comportant un ou plusieurs marqueurs de couleur rouge ou brune et correspondant aux vaisseaux que l'on veut détecter seront finalement retenues. Ces structures seront ensuite dénombrées et mesurées, à la fois dans la totalité de la zone d'intérêt correspondant au tissu tumoral et dans les zones de plus forte concentration de vaisseaux, appelées « hot spots ».Consequently, to best isolate the sections of vessels in their entirety, preferably, two stages are combined: one detects the maximum of structures in the image and one reconstructs, to preserve them, only the structures partially or totally marked with the brown or red chromogen. By "structures" present in the image is meant here regions which are more contrasted than their environment, within the blue component of the color image. They are isolated by a mathematical morphology procedure called a “top hat” obtained, for example, by the difference between, on the one hand, the result of a low-pass filtering of the blue component and, on the other part, the closed image (dilation followed by erosion) of the filtered image. The immunolabelled regions are identified, on a color image corrected by reference to the background, by color translation. This operation is carried out either by thresholding the low values of an image resulting from the subtraction between the blue component and half of the green component of the color image, or by preserving the positive values of an image of “excess of red ”calculated as the result of the difference between, on the one hand, double the red image and, on the other hand, the sum of the green image and the blue image. This result can be combined with a double threshold of a hue image of the HSI color space (“Hue” or hue, Saturation, Intensity) which retains only the colors of the spectrum going from purple to yellow through red. . By double threshold, it is meant here that the value of the range of colors retained must be between two limits. Thanks to a mathematical morphology operation, called geodetic reconstruction, only the structures comprising one or more markers of red or brown color and corresponding to the vessels that one wants to detect will be finally retained. These structures will then be counted and measured, both in the entire area of interest corresponding to the tumor tissue and in the areas with the highest concentration of vessels, called "hot spots".
Pour détecter ces « hot spots », on agrège les vaisseaux séparés par une distance inférieure à 200 μm grâce à une procédure de morphologie mathématique dite de fermeture. Du
point de vue théorique, on se base en effet sur le fait que la distance de perfusion des vaisseaux, c'est-à-dire la distance jusqu'à laquelle un vaisseau peut nourrir des cellules, est d'environ 100 μm. Seules les régions de forte concentration ayant une surface au moins égale à la taille d'un champ microscopique à faible grossissement (900 μma), habituellemnt observé par le pathologiste, sont conservées, grâce à une opération complémentaire d'érosion-reconstruction. Fraction strαmale des cancers. Selon un second aspect de l'invention, qui peut s'utiliser indépendamment de celui décrit ci-dessus, on effectue une succession de traitements numériques d'une image d'une section complète de tumeur, scannée à une résolution de, par exemple, 2700 points par pouce, avec des conditions d'acquisition prédéterminées, c'est-à-dire parfaitement définies, pour déterminer automatiquement la fraction de surface de stroma fibro-nourricier (ou inversement la fraction de cellules tumorales) dans cette tumeur.To detect these "hot spots", the vessels separated by a distance of less than 200 μm are aggregated using a mathematical morphology procedure called closure. Of theoretical point of view, it is based on the fact that the perfusion distance of the vessels, that is to say the distance to which a vessel can feed cells, is about 100 μm. Only the regions of high concentration having an area at least equal to the size of a microscopic field at low magnification (900 μm a ), usually observed by the pathologist, are preserved, thanks to an additional erosion-reconstruction operation. Stromal fraction of cancers. According to a second aspect of the invention, which can be used independently of that described above, a succession of digital processing operations is carried out on an image of a complete section of tumor, scanned at a resolution of, for example, 2700 points per inch, with predetermined acquisition conditions, that is to say perfectly defined, to automatically determine the surface fraction of fibro-nourishing stroma (or conversely the fraction of tumor cells) in this tumor.
Le marquage du stroma est, dans une réalisation, obtenu au préalable par action prolongée d'un colorant histochimique jaune, le safran, en solution alcoolique saturée. La contre coloration du tissu est obtenue par une laque d'hématoxyline qui colore en particulier les noyaux des cellules cancéreuses en bleu. Pour identifier le tissu et l'isoler du fond de l'image, de préférence, on choisit une des composantes de couleur, par exemple la composante bleue, pour lequel il offre un bon contraste, et on lui applique un seuil fixe. La seule étape interactive, c'est-à-dire manuelle, qui peut intervenir à ce niveau est celle du dessin des limites du tissu tumoral lorsque subsiste, sur la section de tumeur, du tissu normal avoisinant ou des territoires indésirables de mucus, de nécrose ou des artefacts de préparation, tels que des plis de la coupe.The marking of the stroma is, in one embodiment, obtained beforehand by prolonged action of a yellow histochemical dye, saffron, in saturated alcoholic solution. The counter staining of the tissue is obtained by a haematoxylin lacquer which colors in particular the nuclei of the cancer cells in blue. To identify the fabric and isolate it from the background of the image, preferably, one of the color components is chosen, for example the blue component, for which it offers good contrast, and a fixed threshold is applied to it. The only interactive step, that is to say manual, which can intervene at this level is that of the drawing of the limits of the tumor tissue when there remains, on the tumor section, the normal surrounding tissue or undesirable territories of mucus, necrosis or preparation artifacts, such as folds of the cut.
On caractérise et on isole les zones de stroma par traitement d'images comme des plages de couleur jaune. A cette
fin, on applique un double seuil sur une image de teinte de l'espace couleur HSI (« Hue », c'est-à-dire teinte, Saturation, Intensité) qui ne conserve que les couleurs du spectre allant du rouge au jaune. Les pixels de stroma ainsi isolés seront ensuite dénombrés et rapportés au nombre de pixels de la totalité de la zone d'intérêt correspondant au tissu tumoral. Ce rapport constitue une estimation de la fraction de stroma tumoral.The stromal areas are characterized and isolated by image processing as yellow areas. At this Finally, a double threshold is applied to a hue image of the HSI color space (“Hue”, that is to say hue, Saturation, Intensity) which retains only the colors of the spectrum going from red to yellow. The stroma pixels thus isolated will then be counted and related to the number of pixels of the entire area of interest corresponding to the tumor tissue. This report is an estimate of the fraction of tumor stroma.
- Marqueurs cellulaires, et en particulier marqueurs localisés dans les noyaux: Selon un troisième aspect de l'invention, qui peut s'utiliser indépendamment de ceux décrits ci-dessus, on effectue une succession de traitements numériques d'une image d'une section complète de tumeur, scannée à une résolution de, par exemple, 4000 points par pouce, avec des conditions d'acquisition définies, pour déterminer automatiquement la fraction de cellules tumorales ou de noyaux de cellules tumorales marqués par la présence d'une substance particulière dans cette tumeur.- Cellular markers, and in particular markers located in the nuclei: According to a third aspect of the invention, which can be used independently of those described above, a succession of digital processing operations is carried out on an image of a section complete tumor, scanned at a resolution of, for example, 4000 dots per inch, with defined acquisition conditions, to automatically determine the fraction of tumor cells or tumor cell nuclei marked by the presence of a particular substance in this tumor.
La molécule recherchée est, par exemple, une protéine associée à la prolifération, un récepteur d'oestrogènes ou de progestérone, ou une protéine de différenciation cellulaire à localisation cytoplasmique ou membranaire. Le marquage de cette molécule est obtenu au préalable par action d'un anticorps spécifique, dont le site de fixation est mis en évidence, dans l'exemple, par une réaction enzymatique colorée dont la coloration brune finale est due à la diaminobenzidine. La contre coloration du tissu est alors obtenue, dans cette réalisation, par une laque d'hématoxyline qui colore en particulier les noyaux des cellules en bleu. Pour identifier le tissu et l'isoler du fond de l'image, de préférence, on choisit une des composantes de couleur pour lequel il offre un bon contraste et on lui applique un seuil fixe. Dans l'exemple, la composante de couleur sélectionnée est le vert. La seule étape interactive (manuelle) qui peut intervenir à ce niveau est celle du dessin des limites
du tissu tumoral lorsque subsiste, sur la section de tumeur, du tissu normal avoisinant ou des territoires indésirables tels des artefacts de préparation, notamment des plis de la coupe.The molecule sought is, for example, a protein associated with proliferation, an estrogen or progesterone receptor, or a cell differentiation protein with cytoplasmic or membrane localization. The labeling of this molecule is obtained beforehand by the action of a specific antibody, the binding site of which is demonstrated, in the example, by a colored enzymatic reaction whose final brown coloration is due to diaminobenzidine. The counter-coloring of the tissue is then obtained, in this embodiment, by a hematoxylin lacquer which in particular colors the nuclei of the cells in blue. To identify the fabric and isolate it from the background of the image, preferably, we choose one of the color components for which it offers good contrast and we apply a fixed threshold. In the example, the color component selected is green. The only interactive step (manual) that can intervene at this level is that of drawing the limits tumor tissue when there is, on the tumor section, neighboring normal tissue or undesirable territories such as preparation artifacts, in particular folds of the cut.
On cherche ensuite à distinguer les cellules cancéreuses du stroma au sein de la tumeur, pour ne rapporter ultérieurement le marquage qu'à ces seules cellules cancéreuses. On procède pour cela en trois étapes :We then try to distinguish the cancer cells from the stroma within the tumor, in order to report the labeling later only to these cancer cells. We do this in three steps:
- On tronque les valeurs hautes dans l'histogramme de l'image en couleur, puis on redynamise cet histogramme sur l'échelle de 0 à une valeur maximale, par exemple 255, afin de blanchir la composante stromale.- We truncate the high values in the histogram of the color image, then we revitalize this histogram on the scale from 0 to a maximum value, for example 255, in order to whiten the stromal component.
On recherche la valeur optimale permettant de séparer le stroma des cellules cancéreuses en appliquant un seuillage automatique adaptatif, basé sur le calcul du moment de la distribution des valeurs de gris de l'image dans la région d'intérêt représentée seulement par le tissu et, de préférence, contraint à se situer entre environ 33 et environ 90% de ces valeurs.We are looking for the optimal value for separating the stroma from cancer cells by applying an adaptive automatic thresholding, based on the calculation of the moment of distribution of the gray values of the image in the region of interest represented only by the tissue and, preferably constrained to be between about 33 and about 90% of these values.
- On applique ce seuil sur la totalité de l'image pour générer une image binaire des seules cellules cancéreuses.- This threshold is applied to the entire image to generate a binary image of only cancer cells.
On cherche ensuite à distinguer, les cellules ou les noyaux de cellules qui ont été marqués en brun- iolet par le marqueur immunohistochimique par rapport aux structures non marquées présentant une couleur bleue. A cet effet, selon une première réalisation, on fixe un double seuil sur l'image de teinte de l'espace couleur HSI qui ne conserve que les couleurs du spectre allant du violet au rouge .We then seek to distinguish the cells or nuclei of cells which have been marked in brown with the immunohistochemical marker compared to the unlabeled structures having a blue color. To this end, according to a first embodiment, a double threshold is fixed on the hue image of the HSI color space which retains only the colors of the spectrum going from purple to red.
On complète cette opération en conservant également les valeurs négatives d'une image « Excès de Bleu » résultant de la soustraction de la somme des images rouge et verte au double de la composante bleue. Cette dernière opération permet de détecter les pixels bruns.This operation is completed by also retaining the negative values of an “Excess of Blue” image resulting from the subtraction of the sum of the red and green images from twice the blue component. This last operation detects brown pixels.
Après ces diverses opérations, on peut déterminer de façon automatique le rapport entre les surfaces correspondant
aux cellules marquées, et la surface des cellules cancéreuses sur la totalité de la section de tumeur et dans les zones de plus forte concentration ou zones de « hot spots ».After these various operations, the ratio between the corresponding surfaces can be determined automatically. to labeled cells, and the surface of cancer cells over the entire tumor section and in areas of higher concentration or "hot spot" areas.
Pour identifier ou localiser les zones d' intérêt ou « hot spots », correspondant à une agrégation de cellules marquées sur une surface au moins égale à la taille d'un champ microscopique classiquement observé par les pathologistesTo identify or locate areas of interest or "hot spots", corresponding to an aggregation of marked cells on an area at least equal to the size of a microscopic field classically observed by pathologists
(900 μm2) , on détermine les zones dans lesquelles les cellules marquées sont séparées par une distance d'environ au plus 24 μm. Cette distance correspond sensiblement au diamètre d'une cellule.(900 μm 2 ), the zones in which the labeled cells are separated by a distance of approximately at most 24 μm are determined. This distance corresponds substantially to the diameter of a cell.
Dans ce cas, le paramètre à mesurer sur ces zones d' intérêt sera le rapport moyen et maximal de la surface des cellules marquées à la surface de la totalité des cellules tumorales.In this case, the parameter to be measured on these areas of interest will be the average and maximum ratio of the surface of the labeled cells to the surface of all the tumor cells.
Ainsi, l'invention concerne, selon un premier aspect, un procédé de détermination de données numériques relatives à une tumeur cancéreuse, dans lequel on numérise, par exemple à l'aide d'un scanner de diapositives haute résolution, un échantillon coloré par immunohistochimie, en vue de rechercher des marqueurs de différenciation ou de prolifération des cellules tumorales, qui est caractérisé en ce qu'on fait subir à l'image numérisée de la totalité de la coupe tumorale, un traitement comprenant les étapes suivantes : - on sépare le fond du tissu par comparaison de l'intensité d'au moins une composante de couleur des pixels, avec un seuil, les pixels d'un côté du seuil correspondant au fond, par exemple les pixels de plus grande intensité, et les pixels d' intensité inférieure au seuil correspondant à l'épithélium et au stroma,Thus, the invention relates, according to a first aspect, to a method for determining digital data relating to a cancerous tumor, in which a sample stained by immunohistochemistry is digitized, for example using a high-resolution slide scanner , with a view to searching for markers of differentiation or proliferation of tumor cells, which is characterized in that the digitized image of the entire tumor section is subjected to a treatment comprising the following steps: - the background of the fabric by comparison of the intensity of at least one color component of the pixels, with a threshold, the pixels on one side of the threshold corresponding to the background, for example the pixels of greatest intensity, and the pixels of intensity below the threshold corresponding to the epithelium and stroma,
- on établit un histogramme de l'intensité d'au moins une composante de couleur des pixels du tissu et, dans cet histogramme, on détermine un seuil de séparation en intensité correspondant sensiblement à un minimum de l'histogramme, et
- on identifie les pixels se trouvant d'un côté du seuil comme correspondant au stroma et on identifie les pixels se trouvant de l'autre côté du seuil comme correspondant à l'épithélium, les pixels du stroma ayant, par exemple, les intensités les plus élevées.a histogram of the intensity of at least one color component of the pixels of the tissue is established and, in this histogram, a threshold of separation in intensity corresponding substantially to a minimum of the histogram is determined, and - the pixels on one side of the threshold are identified as corresponding to the stroma and the pixels on the other side of the threshold are identified as corresponding to the epithelium, the pixels of the stroma having, for example, the intensities higher.
De préférence, pour augmenter le contraste, on affecte au fond, qui correspond aux plus grandes valeurs de luminance, la valeur maximale de luminance de façon à ce que les luminances correspondant à l'épithélium et au stroma, occupent toute la dynamique restante.Preferably, to increase the contrast, the maximum luminance value is assigned to the background, which corresponds to the largest luminance values, so that the luminances corresponding to the epithelium and to the stroma occupy all the remaining dynamics.
Dans une réalisation, on limite la zone de recherche du minimum d'intensité entre la zone d' epithelium et la zone de stroma en éliminant de cette zone de recherche, les valeurs les plus faibles et les valeurs les plus élevées d'intensité. Dans ce cas, la zone de recherche du minimum peut être limitée aux valeurs d'intensité comprises entre environ 33 à 90 % de la zone d'intensité dans laquelle se trouvent l'épithélium et le stroma.In one embodiment, the search area of the minimum intensity between the epithelium area and the stroma area is limited by eliminating from this search area the lowest values and the highest intensity values. In this case, the search zone of the minimum can be limited to the intensity values comprised between approximately 33 to 90% of the intensity zone in which the epithelium and the stroma are found.
Selon un mode de réalisation dans l'épithélium tumoral détecté, on identifie les noyaux des cellules marquées par détection de la différence de couleur entre les noyaux marqués et les noyaux non marqués.According to one embodiment in the detected tumor epithelium, the nuclei of the labeled cells are identified by detection of the color difference between the labeled nuclei and the unlabeled nuclei.
Dans ce cas, on peut coder les teintes de couleurs et les noyaux des cellules marquées sont alors identifiées comme étant celles se trouvant dans une gamme prédéterminée de teintes, la gamme de teintes étant comprise, par exemple, entreIn this case, the hues of colors can be coded and the nuclei of the marked cells are then identified as being those which are in a predetermined range of hues, the range of hues being included, for example, between
4,3 et 6.4.3 and 6.
On peut affecter à chaque pixel de l'épithélium tumoral une fonction de l'intensité de chaque composante de couleur afin que cette fonction ait un signe déterminé pour les noyaux des cellules marquées et le signe opposé pour les noyaux des cellules non marquées.One can assign to each pixel of the tumor epithelium a function of the intensity of each color component so that this function has a determined sign for the nuclei of the marked cells and the opposite sign for the nuclei of the unmarked cells.
Dans un exemple, les cellules non marquées présentent une couleur bleue et la fonction est le double de 1 ' intensité de la composante bleue duquel on soustrait, d'une part, l'intensité
correspondant au rouge et, d'autre part, l'intensité correspondant au vert.In one example, the unmarked cells have a blue color and the function is twice the intensity of the blue component from which we subtract, on the one hand, the intensity corresponding to red and, on the other hand, the intensity corresponding to green.
Dans une réalisation, on identifie les zones dans lesquelles les cellules marquées sont séparées par une distance d'environ au plus 24 μm et dont la surface est au moins égale à un seuil prédéterminé de préférence de l'ordre de 900 μm2.In one embodiment, the zones in which the marked cells are separated by a distance of approximately at most 24 μm and whose surface is at least equal to a predetermined threshold, preferably of the order of 900 μm 2, are identified .
L'invention concerne aussi un procédé dans lequel, pour déterminer des paramètres relatifs aux vaisseaux sanguins dans une tumeur, on effectue un traitement d'une image numérisée d'une section complète de tumeur qui comporte les étapes suivantes :The invention also relates to a method in which, in order to determine parameters relating to the blood vessels in a tumor, a digitized image of a complete section of tumor is processed, which comprises the following steps:
- on détecte les tissus tumoraux,- tumor tissue is detected,
- on élimine les nécroses,- the necrosis is eliminated,
- on détecte les structures immunomarquées, et - on identifie et on localise des zones de concentrâtion.- we detect the immunolabelled structures, and - we identify and localize areas of concentration.
Pour identifier le tissu tumoral, on peut choisir une composante de couleur, ou une combinaison de composantes de couleurs, correspondant au tissu, les pixels correspondant au tissu étant ceux pour lesquels l'intensité de cette composante ou combinaison de composantes, dépasse un seuil prédéterminé.To identify the tumor tissue, one can choose a color component, or a combination of color components, corresponding to the tissue, the pixels corresponding to the tissue being those for which the intensity of this component or combination of components exceeds a predetermined threshold. .
Pour éliminer les zones de nécrose, selon une réalisation, on isole les zones qui n'ont pas une composante prédominante de couleur correspondant au tissu, par exemple les zones qui n'ont pas de couleur prédominante bleue.To eliminate the areas of necrosis, according to one embodiment, the areas which do not have a predominant color component corresponding to the tissue are isolated, for example the areas which do not have a predominant blue color.
Dans ce cas, pour détecter les zones de nécrose, à chaque pixel on peut affecter une fonction de l'intensité de chaque composante de couleurs afin que les zones de nécrose correspondent à un signe déterminé de cette fonction et les autres zones correspondent au signe opposé.In this case, to detect the areas of necrosis, each pixel can be assigned a function of the intensity of each color component so that the areas of necrosis correspond to a determined sign of this function and the other areas correspond to the opposite sign .
Dans une réalisation, les zones de nécrose ne sont identifiées que pour les plages individuelles dont la surface dépasse un seuil de taille prédéterminée. Les plages de surface inférieure au seuil sont, par exemple, éliminées par une
opération de morphologie mathématique qui comprend une érosion suivie d'une dilatation géodésique.In one embodiment, the areas of necrosis are only identified for the individual areas whose surface exceeds a predetermined size threshold. Surface areas below the threshold are, for example, eliminated by a operation of mathematical morphology which includes an erosion followed by a geodesic dilation.
Dans une réalisation, pour détecter des vaisseaux sanguins dans une tumeur, on détecte, d'une part, les contours plus sombres que l'environnement dans une composante de couleur déterminée, par exemple le bleu, on détecte les zones colorées correspondant au marquage recherché dans les vaisseaux, et on identifie les vaisseaux comme étant les structures sombres comportant au moins une zone colorée correspondant au marquage recherché .In one embodiment, to detect blood vessels in a tumor, on the one hand, the contours darker than the environment are detected in a determined color component, for example blue, the colored zones corresponding to the mark sought are detected in the vessels, and the vessels are identified as being the dark structures comprising at least one colored zone corresponding to the marking sought.
Les zones colorées correspondant au marquage recherché dans les vaisseaux sont, par exemple, détectées par comparaison à un seuil appliqué sur une image résultant d'une translation de couleur et/ou par sélection d'une gamme de teintes. De préférence, on détecte les zones de concentration dans lesquelles les vaisseaux sont séparés par une distance au plus égale à environ 200 μm et qui présentent une superficie au moins égale à 900 μm2 environ.The colored zones corresponding to the marking sought in the vessels are, for example, detected by comparison with a threshold applied to an image resulting from a translation of color and / or by selection of a range of hues. Preferably, the concentration zones are detected in which the vessels are separated by a distance at most equal to approximately 200 μm and which have an area at least equal to approximately 900 μm 2 .
L'invention concerne aussi un procédé dans lequel, pour déterminer, dans une tumeur, la fraction de surface de stroma fibro-nourricier, ou la fraction de cellules tumorales, on détecte les zones de stroma par identification de leur couleur, les zones de stroma correspondant aux pixels dont l' image de teinte est comprise dans une gamme prédéterminée, par exemple les couleurs du spectre allant du rouge au jaune.The invention also relates to a method in which, in determining, in a tumor, the surface fraction of fibro-nourishing stroma, or the fraction of tumor cells, the zones of stroma are detected by identification of their color, the zones of stroma corresponding to pixels whose hue image is within a predetermined range, for example the colors of the spectrum from red to yellow.
Le marquage du stroma peut être obtenu par l'action prolongée d'un colorant histochimique jaune, tel que le safran, en solution alcoolique saturée, et la contre-coloration du tissu peut être obtenue par une laque d'hématoxiline qui colore les noyaux des cellules cancéreuses en bleu.The marking of the stroma can be obtained by the prolonged action of a yellow histochemical dye, such as saffron, in saturated alcoholic solution, and the counter-staining of the tissue can be obtained by a haematoxilin lacquer which colors the nuclei of the cancer cells in blue.
Quel que soit son mode de réalisation, les images numérisées présentent de préférence des millions de couleurs et sont codées sur 24 bits et sont non compressées.Whatever its embodiment, the digitized images preferably have millions of colors and are coded on 24 bits and are uncompressed.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront avec la description de certains de ses modes de
réalisation, celle-ci étant effectuée en se référant aux dessins ci-annexés sur lesquels :Other characteristics and advantages of the invention will appear with the description of some of its modes of realization, this being carried out with reference to the attached drawings in which:
- La figure 1 montre un détail d'une image d'une tumeur, - la figure 2 est un diagramme illustrant une étape du procédé selon l'invention.- Figure 1 shows a detail of an image of a tumor, - Figure 2 is a diagram illustrating a step in the method according to the invention.
La figure 1 représente un détail de la composante verte de l'image couleur obtenue à l'aide d'un scanner de diapositives de la coupe d'un cancer de l'ovaire. On distingue sur ce détail d'image, d'une part, un fond clair 10 qui ne contient pas d'informations utiles pour le pathologiste, d'autre part, une zone 12 de stroma nourricier du cancer et, d'autre part, enfin, des zones sombres 14 d' epithelium (tissu) cancéreux. Un premier aspect du procédé de traitement d'image conforme à l'invention est basé sur les valeurs distinctes de luminance qu'on peut attribuer au fond, au stroma et à l'épithélium cancéreux.Figure 1 shows a detail of the green component of the color image obtained using a slide scanner of the ovarian cancer section. We distinguish on this detail of image, on the one hand, a light background 10 which does not contain useful information for the pathologist, on the other hand, an area 12 of cancer nourishing stroma and, on the other hand, finally, dark areas 14 of cancerous epithelium (tissue). A first aspect of the image processing method according to the invention is based on the distinct luminance values which can be assigned to the background, to the stroma and to the cancerous epithelium.
La figure 2 est un histogramme sur lequel on a porté en abscisses des valeurs de luminance, valeurs de gris codées de 0 à 255 (8 bits) et, en ordonnées, la fréquence, c'est-à-dire le nombre de pixels qui présentent chaque valeur de luminance (ou intensité) de la composante verte de l'image couleur. Sur ce diagramme, on peut distinguer trois zones. La première zone 16 de fond correspond aux luminances comprises entre 240 et 255. La seconde zone 18 correspond au stroma, les luminances étant comprises entre environ 200 et 240 dans cet exemple. Enfin la troisième zone 20 pour laquelle les valeurs de luminance sont inférieures à 200, correspond à l'épithélium cancéreux. Etant donné que le fond présente une accumulation de pixels à proximité de la valeur de luminance 255, les pixels du fond peuvent être aisément séparés du reste des autres pixels à l'aide d'un simple seuil. Ainsi, dans l'exemple, on considère que tous les pixels de luminance supérieure ou égale à 230 correspondent au fond.
Pour augmenter le contraste de l'image couleur, afin de pouvoir mieux distinguer le stroma de l'épithélium tumoral, on affecte la valeur de luminance maximale (255) aux pixels dont la luminance initiale est comprise entre 235 et 255 sur les trois composantes de couleur : rouge, verte et bleue et on recalcule les valeurs de luminance des pixels restants de façon à ce qu'ils occupent toute la dynamique, c'est-à-dire que leur luminance soit comprise entre 0 et 255.FIG. 2 is a histogram on which the luminance values, gray values coded from 0 to 255 (8 bits) have been plotted on the abscissa and, on the ordinate, the frequency, that is to say the number of pixels which present each luminance (or intensity) value of the green component of the color image. On this diagram, we can distinguish three zones. The first background zone 16 corresponds to the luminances between 240 and 255. The second zone 18 corresponds to the stroma, the luminances being between approximately 200 and 240 in this example. Finally, the third zone 20 for which the luminance values are less than 200, corresponds to the cancerous epithelium. Since the background has an accumulation of pixels near the luminance value 255, the background pixels can be easily separated from the rest of the other pixels using a simple threshold. Thus, in the example, it is considered that all the pixels of luminance greater than or equal to 230 correspond to the background. To increase the contrast of the color image, in order to be able to better distinguish the stroma from the tumor epithelium, the maximum luminance value (255) is assigned to the pixels whose initial luminance is between 235 and 255 on the three components of color: red, green and blue and the luminance values of the remaining pixels are recalculated so that they occupy all the dynamics, that is to say that their luminance is between 0 and 255.
Après transformation de l'histogramme de cette manière pour distinguer l'épithélium tumoral du stroma, on recherche le minimum de luminance entre les zones 20 et 18.After transforming the histogram in this way to distinguish the tumor epithelium from the stroma, the minimum luminance between zones 20 and 18 is sought.
Dans une réalisation, pour s'adapter à tous les types d'images, les proportions relatives de stroma, de cellules cancéreuses et de fond étant variables, on limite la zone d'exploration aux valeurs comprises entre 33 et 90 % de la distribution des valeurs de luminance de la composante verte de l'image en couleur et on ne calcule la valeur du seuil automatique par moment, qu'à la seule région de tissu tumoral identifiée au départ. Le seuil obtenu sera par contre appliqué à la totalité de l'image.In one embodiment, to adapt to all types of images, the relative proportions of stroma, cancer cells and background being variable, the exploration area is limited to values between 33 and 90% of the distribution of luminance values of the green component of the color image and the automatic threshold value per moment is calculated only for the only region of tumor tissue identified at the start. The threshold obtained will however be applied to the entire image.
Après identification de l'épithélium tumoral, il est nécessaire, pour fournir une estimation du rapport de la surface occupée par les cellules cancéreuses marquées par immunohistochimie, sur la totalité de l'épithélium, de détecter les cellules marquées. Dans l'exemple, les noyaux des cellules présentent une couleur brun-violet alors que les noyaux non marqués présentent une couleur bleue.After identification of the tumor epithelium, it is necessary, in order to provide an estimate of the ratio of the surface occupied by the cancer cells marked by immunohistochemistry, over the whole of the epithelium, to detect the marked cells. In the example, the nuclei of the cells have a brown-purple color while the unlabeled nuclei have a blue color.
Dans l'exemple, on procède comme décrit ci-dessus, à savoir qu'on combine un procédé d'établissement d'un seuil sur une image de teinte et d'un autre seuil établi sur le résultat d'une translation des composantes de couleurs.
In the example, we proceed as described above, namely that we combine a method of establishing a threshold on a tint image and another threshold established on the result of a translation of the components of colors.
Claims
1. Procédé de détermination de données numériques relatives à une tumeur cancéreuse, dans lequel on numérise, par exemple à l'aide d'un scanner de diapositives haute résolution, un échantillon coloré par histochimie ou immunohistochimie, en vue de rechercher des marqueurs de différenciation ou de prolifération des cellules tumorales, caractérisé en ce qu'une image numérique unique en millions de couleurs de l'échantillon étant obtenue, on fait subir à l'image numérisée de la totalité de la coupe tumorale, un traitement comprenant les étapes suivantes :1. Method for determining digital data relating to a cancer tumor, in which a sample stained by histochemistry or immunohistochemistry is scanned, for example using a high resolution slide scanner, in order to search for markers of differentiation or proliferation of tumor cells, characterized in that a single digital image in millions of colors of the sample being obtained, the digitized image of the entire tumor section is subjected to a treatment comprising the following steps:
- on sépare le fond (10) du tissu par comparaison de l'intensité d'au moins une composante de couleur des pixels, avec un seuil, les pixels (16) d'un côté du seuil correspondant au fond, par exemple les pixels de plus grande intensité, et les pixels (18, 20) d'intensité inférieure au seuil correspondant à l'épithélium et au stroma,- the background (10) of the fabric is separated by comparison of the intensity of at least one color component of the pixels, with a threshold, the pixels (16) on one side of the threshold corresponding to the background, for example the pixels of greater intensity, and the pixels (18, 20) of intensity less than the threshold corresponding to the epithelium and the stroma,
- on établit un histogramme de l'intensité d'au moins une composante de couleur des pixels du tissu et, dans cet histogramme, on détermine un seuil de séparation en intensité correspondant sensiblement à un minimum de l'histogramme, eta histogram of the intensity of at least one color component of the pixels of the tissue is established and, in this histogram, a threshold of separation in intensity corresponding substantially to a minimum of the histogram is determined, and
- on identifie les pixels se trouvant d'un côté du seuil comme correspondant au stroma et on identifie les pixels se trouvant de l'autre côté du seuil comme correspondant à l'épithélium, les pixels du stroma ayant, par exemple, les intensités les plus élevées.- the pixels on one side of the threshold are identified as corresponding to the stroma and the pixels on the other side of the threshold are identified as corresponding to the epithelium, the pixels of the stroma having, for example, the intensities higher.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que, pour augmenter le contraste, on affecte au fond, qui correspond aux plus grandes valeurs de luminance, la valeur maximale de luminance de façon à ce que les luminances correspondant à l'épithélium et au stroma, occupent toute la dynamique restante.2. Method according to claim 1 characterized in that, to increase the contrast, the maximum luminance value is assigned to the background, which corresponds to the largest luminance values, so that the luminances corresponding to the epithelium and to the stroma, occupy all the remaining dynamics.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'on limite la zone de recherche du minimum d'intensité entre la zone d' epithelium et la zone de stroma en éliminant de cette zone de recherche, les valeurs les plus faibles et les valeurs les plus élevées d'intensité.3. Method according to claim 1 or 2 characterized in that one limits the search area of the minimum intensity between the epithelium area and the stroma area in eliminating from this search area, the lowest values and the highest intensity values.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la zone de recherche du minimum est limitée aux valeurs d'intensité comprises entre environ 33 à 90 % de la zone d'intensité dans laquelle se trouvent l'épithélium et le stroma.4. Method according to claim 3, characterized in that the search zone of the minimum is limited to the intensity values comprised between approximately 33 to 90% of the intensity zone in which the epithelium and the stroma are found.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que dans l'épithélium tumoral détecté, on identifie les noyaux des cellules marquées par détection de la différence de couleur entre les noyaux marqués et les noyaux non marqués .5. Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that in the detected tumor epithelium, the nuclei of the labeled cells are identified by detection of the color difference between the labeled nuclei and the unlabeled nuclei.
6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'on code les teintes de couleurs et en ce que les noyaux des cellules marquées sont identifiées comme étant celles se trouvant dans une gamme prédéterminée de teintes.6. Method according to claim 5 characterized in that the color hues are coded and in that the nuclei of the marked cells are identified as being those which are in a predetermined range of hues.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les cellules marquées ayant la couleur violette, la gamme de teintes est comprise entre 4,3 et 6.7. Method according to claim 6, characterized in that the marked cells having the purple color, the range of hues is between 4.3 and 6.
8. Procédé selon l'une des revendications 5 à 7 caractérisé en ce qu'on affecte à chaque pixel de l'épithélium tumoral une fonction de l'intensité de chaque composante de couleur afin que cette fonction ait un signe déterminé pour les noyaux des cellules marquées et le signe opposé pour les noyaux des cellules non marquées. 8. Method according to one of claims 5 to 7 characterized in that a function of the intensity of each color component is assigned to each pixel of the tumor epithelium so that this function has a determined sign for the nuclei of the marked cells and the opposite sign for nuclei of unlabeled cells.
9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que les cellules non marquées présentant une couleur bleue, la fonction est le double de l'intensité de la composante bleue duquel on soustrait, d'une part, l'intensité correspondant au rouge et, d'autre part, l'intensité correspondant au vert. 9. Method according to claim 8 characterized in that the unlabeled cells having a blue color, the function is twice the intensity of the blue component from which we subtract, on the one hand, the intensity corresponding to red and, on the other hand, the intensity corresponding to green.
10. Procédé selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisé en ce qu'on identifie les zones dans lesquelles les cellules marquées sont séparées par une distance d'environ au plus 24 μm et dont la surface est au moins égale à un seuil prédéterminé de préférence de l'ordre de 900 μm2. 10. Method according to one of claims 5 to 9, characterized in that the zones in which the marked cells are separated by a distance of approximately at most 24 μm are identified and whose surface is at least equal to a threshold preferably predetermined on the order of 900 μm 2 .
11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que pour déterminer des paramètres relatifs aux vaisseaux sanguins dans une tumeur, on effectue un traitement d'une image numérisée d'une section complète de tumeur qui comporte les étapes suivantes :11. Method according to one of the preceding claims, characterized in that to determine parameters relating to the blood vessels in a tumor, a digitized image of a complete section of tumor is carried out which comprises the following steps:
- on détecte les tissus tumoraux,- tumor tissue is detected,
- on élimine les nécroses,- the necrosis is eliminated,
- on détecte les structures immunomarquées, et- the immunostained structures are detected, and
- on identifie et on localise des zones de concentration.- we identify and locate areas of concentration.
12. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que pour identifier le tissu tumoral, on choisit une composante de couleur, ou une combinaison de composantes de couleurs, correspondant au tissu, les pixels correspondant au tissu étant ceux pour lesquels l'intensité de cette composante ou combinaison de composantes, dépasse un seuil prédéterminé.12. The method of claim 11 characterized in that to identify the tumor tissue, one chooses a color component, or a combination of color components, corresponding to the tissue, the pixels corresponding to the tissue being those for which the intensity of this component or combination of components, exceeds a predetermined threshold.
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12 caractérisé en ce que, pour éliminer les zones de nécrose, on isole les zones qui n'ont pas une composante prédominante de couleur correspondant au tissu, par exemple les zones qui n'ont pas de couleur prédominante bleue.13. The method of claim 11 or 12 characterized in that, to eliminate the areas of necrosis, the areas which do not have a predominant color component corresponding to the tissue are isolated, for example the areas which have no color predominantly blue.
14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que, pour détecter les zones de nécrose, à chaque pixel on affecte une fonction de l'intensité de chaque composante de couleurs afin que les zones de nécrose correspondent à un signe déterminé de cette fonction et les autres zones correspondent au signe opposé.14. Method according to claim 13 characterized in that, to detect the areas of necrosis, each pixel is assigned a function of the intensity of each color component so that the areas of necrosis correspond to a determined sign of this function and the other zones correspond to the opposite sign.
15. Procédé selon l'une des revendications 11 à 14 caractérisé en ce que les zones de nécrose ne sont identifiées que pour les plages individuelles dont la surface dépasse un seuil de taille prédéterminée.15. Method according to one of claims 11 to 14 characterized in that the areas of necrosis are identified only for individual areas whose surface exceeds a predetermined size threshold.
16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que les plages de surface inférieure au seuil sont éliminées par une opération de morphologie mathématique qui comprend une érosion suivie d'une dilatation géodésique. 16. Method according to claim 15 characterized in that the surface areas below the threshold are eliminated by an operation of mathematical morphology which comprises an erosion followed by a geodesic expansion.
17. Procédé selon l'une des revendications 11 à 16 caractérisé en ce que pour détecter des vaisseaux sanguins dans une tumeur, on détecte, d'une part, les contours plus sombres que l'environnement dans une composante de couleur déterminée, par exemple le bleu, on détecte les zones colorées correspondant au marquage recherché dans les vaisseaux, et on identifie les vaisseaux comme étant les structures sombres comportant au moins une zone colorée correspondant au marquage recherché.17. Method according to one of claims 11 to 16 characterized in that to detect blood vessels in a tumor, one detects, on the one hand, the contours darker than the environment in a determined color component, for example blue, the colored zones corresponding to the mark sought in the vessels are detected, and the vessels are identified as being the dark structures comprising at least one colored zone corresponding to the mark sought.
18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que les zones colorées correspondant au marquage recherché dans les vaisseaux sont détectées par comparaison à un seuil appliqué sur une image résultant d'une translation de couleur et/ou par sélection d'une gamme de teintes.18. The method of claim 17 characterized in that the colored areas corresponding to the marking sought in the vessels are detected by comparison with a threshold applied to an image resulting from a translation of color and / or by selection of a range of shades .
19. Procédé selon l'une des revendications 11 à 18 caractérisé en ce qu'on détecte les zones de concentration dans lesquelles les vaisseaux sont séparés par une distance au plus égale à environ 200 μm et qui présentent une superficie au moins égale à 900 μm2 environ.19. Method according to one of claims 11 to 18 characterized in that the concentration zones are detected in which the vessels are separated by a distance at most equal to approximately 200 μm and which have an area at least equal to 900 μm 2 approx.
20. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que pour déterminer, dans une tumeur, la fraction de surface de stroma fibro-nourricier, ou la fraction de cellules tumorales, on détecte les zones de stroma par identification de leur couleur, les zones de stroma correspondant aux pixels dont l'image de teinte est comprise dans une gamme prédéterminée, par exemple les couleurs du spectre allant du rouge au jaune.20. Method according to one of the preceding claims, characterized in that to determine, in a tumor, the surface fraction of fibro-nourishing stroma, or the fraction of tumor cells, the zones of stroma are detected by identification of their color, the stroma zones corresponding to the pixels whose hue image is within a predetermined range, for example the colors of the spectrum going from red to yellow.
21. Procédé selon la revendication 20 caractérisé en ce que le marquage du stroma est obtenu par l'action prolongée d'un colorant histochimique jaune, tel que le safran, en solution alcoolique saturée, et en ce que la contre-coloration du tissu est obtenue par une laque d'hématoxiline qui colore les noyaux des cellules cancéreuses en bleu.21. The method of claim 20 characterized in that the marking of the stroma is obtained by the prolonged action of a yellow histochemical dye, such as saffron, in saturated alcoholic solution, and in that the counter-coloring of the tissue is obtained by a haematoxilin lacquer which colors the nuclei of cancer cells in blue.
22. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les images numérisées présentent des millions de couleurs, sont codées sur 24 bits et sont non compressées. 22. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the digitized images have millions of colors, are 24-bit coded, and are uncompressed.
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