ゥィルス性肝炎治療剤及び制癌剤 技術分野 Anti-diabetic hepatitis agent and anticancer drug
本発明は、 ウィルス性肝炎あるいは癌疾患に対するインターフェロンとの併用療 法剤に関する。 背景技術 The present invention relates to a combination therapy with interferon for viral hepatitis or cancer disease. Background art
肝炎の治療方法の主流として、 例えば C型慢性肝炎に対しては、 C型肝炎ウィル ス (HCV) の排除及ぴ肝機能改善を主体とした治療が進められている。 特にその中 で、 HCVの排除及ぴ肝機能改善作用を併せ持つィンターフェロンによる C型慢性肝 炎治療は、 ウィルスを排除する唯一の治療法とされるが、 HCVの完全排除効率は 20 〜30%程度と低く、 近年ではリバビリンゃァマンタジン等によるインターフェロン 併用療法が進められている。 インターフェロンの作用は、 感染細胞に直接働く抗ゥ ィルス作用と宿主免疫の賦活化作用に大別される。 As a mainstream treatment method for hepatitis, for example, for chronic hepatitis C, treatment mainly for eliminating hepatitis C virus (HCV) and improving liver function is being promoted. In particular, the treatment of chronic hepatitis C with interferon, which has both HCV elimination and liver function improving effects, is regarded as the only treatment to eliminate the virus, but the complete elimination efficiency of HCV is 20 to 30. In recent years, interferon combination therapy with ribavirin pamantadine has been promoted. The effects of interferon are broadly classified into antiviral effects that act directly on infected cells and activation of host immunity.
インターフェロンによる抗ウィルス作用は、 インターフェロンレセプターを介し たシグナル伝達によって生じ、 抗ウィルス因子の産生を誘導することによつて HCV の R Aの分解や翻訳阻害等を促進する。 また、 インターフェロンによる免疫の活性 化は、 細胞性免疫や液性免疫の活性化による生体の抗ウィルス状態の活性化及び維 持に関わる。 HCVに対するインターフェロン療法では、 HCVの血清型、 ウィルス量、 組織学的な進行度等の患者背景により、 その治療効果に差が生じる。 特にジ ノタ イブ I型や高ウィルス血症の症例においてその改善効果は低く、 ウィルスの排除率 も低いことが知られている。 この排除率の低さは、 ウィルス側の因子と患者の免疫 的な背景因子が関与していると考えられている。 The antiviral effect of interferon is caused by signal transduction via the interferon receptor, and promotes the degradation of HCV RA and the inhibition of translation by inducing the production of antiviral factors. In addition, activation of immunity by interferon is involved in activation and maintenance of the antiviral state of a living body by activating cellular immunity and humoral immunity. Interferon therapy for HCV has different therapeutic effects depending on patient characteristics such as HCV serotype, viral load, and histological progression. In particular, it is known that the improvement effect is low and the virus elimination rate is low in cases of ginotype I and hyperviremia. This low exclusion rate is thought to be related to viral factors and the patient's immunological background factors.
インターフェロンに対して、 抵抗性を示す患者に対しては、 グリチルリチン製剤 やインターフエ口ン等の免疫調節剤による肝機能改善が試みられているが、 グリチ ルリチン製剤投与終了後は速やかに肝機能が悪化する等、 インターフエ口ン抵抗性 C型慢性肝炎に対する肝細胞発癌抑制は達成されていないのが現状である。 Improving liver function with immunomodulators, such as glycyrrhizin and interphenic acid, has been attempted for patients who show resistance to interferon, but liver function is promptly improved after glycyrrhizin administration is completed. At present, hepatocellular carcinogenesis has not been suppressed against interfering oral resistant chronic hepatitis C due to worsening conditions.
現在、 最も有効な療法としてインターフェロンやぺグ化インターフェロンとリバ
ビリンとの併用であるが、 インターフェロンとリバビリンによる 1年間の併用治療 でもウィルスの完全排除率は 50%程度であり、 依然としてその有効性は完全ではな い(Nippon Shokakibyo Gakkai Zasshi. 1995; 92: 1929—1936)。 また、 インターフ ェ口ンが奏効しにくいと考えられる HCVのジェノタイプ 1型に対して依然として 50 %以下の奏効率しか期待できない。 また、 ジエノタイプ 1型に感染した難治性の高 ウィルス症例に対する奏功率は 40%程度であり、 臨床上の治療効果としては未だ不 十分である。 また、 リバビリンは高い体内蓄積性により溶血性貧血が多発すること が報告されている (N. Engl. J. Med. 2002; 347 : 975-982) 。 Currently, the most effective treatments are interferon and pegylated interferon Although combined with villin, the complete elimination rate of the virus is still about 50% even with 1 year of combined treatment with interferon and ribavirin, and its efficacy is still not complete (Nippon Shokakibyo Gakkai Zasshi. 1995; 92: 1929). —1936). In addition, a response rate of 50% or less can still be expected for HCV genotype 1 which is considered to be difficult to respond to the interface. The response rate for refractory high-virus cases infected with dienotype 1 is about 40%, which is still insufficient as a clinical therapeutic effect. Ribavirin has also been reported to frequently cause hemolytic anemia due to its high accumulation in the body (N. Engl. J. Med. 2002; 347: 975-982).
インターフェロンは、 癌に対する療法としても進められているが、 その投与はィ ンターフェロン単剤では慢性骨髄性白血病、 多発性骨髄腫、 非ホジキン悪性リンパ 腫、 腎細胞癌など、 インターフェロンと化学療法剤等との併用では肝細胞癌、 胃癌 、 降臓癌、 前立腺癌、 食道癌、 表在性膀胱癌などの限られた癌に限られている ( Am. J. Surg. 2000 ; 179: 367—371、 Prostate 1998 ; 35: 56 - 62、 Am. J. Clin. Oncol. 2002 ; 25 : 391-397) 。 その効果はインターフェロンによる細胞増殖抑制作 用と細胞性免疫の活性化作用によるものであると考えられているが、 治療効果は満 足なものとは言えない。 Interferon is also being promoted as a treatment for cancer, but is administered interferon alone as chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, non-Hodgkin's malignant lymphoma, renal cell carcinoma, etc. In combination with is limited to limited cancers such as hepatocellular carcinoma, stomach cancer, spleen cancer, prostate cancer, esophageal cancer, superficial bladder cancer (Am. J. Surg. 2000; 179: 367-371 Prostate 1998; 35: 56-62, Am. J. Clin. Oncol. 2002; 25: 391-397). The effect is thought to be due to the effects of interferon on cell growth suppression and the activation of cell-mediated immunity, but the therapeutic effect is not satisfactory.
従って、 細胞性免疫を活性化し、 インターフェロンの抗ウィルス作用を増強し、 且つ体内蓄積性等の問題のない安全性の高い薬剤が見いだされれば、 C型慢性肝炎 に非常に有用であるだけでなく、 癌に対しても有効な薬となる可能性が高い。 発明の開示 Therefore, if a highly safe drug that activates cell-mediated immunity, enhances the antiviral effect of interferon, and has no problems such as accumulation in the body is found, it will be very useful not only for chronic hepatitis C However, it is likely to be an effective drug for cancer. Disclosure of the invention
本発明の目的は、 インターフェロンと併用することにより肝炎ウィルス消失率及 ぴ癌細胞排除率、 特に C型肝炎ウィルス消失率および慢性骨髄性白血病、 多発性骨 髄腫、 骨髄異形性症候群、 真性多血症、 非ホジキン悪性リンパ腫、 肝細胞癌や胃癌 等の癌細胞排除率を向上させ、 且つ体内蓄積性がなく安全性の高い化合物を提供す る と し る。 It is an object of the present invention to provide a hepatitis virus elimination rate and a cancer cell elimination rate, especially a hepatitis C virus elimination rate and chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, and polycythemia in combination with interferon. It is intended to provide a compound which has an improved elimination rate of cancer cells such as non-Hodgkin's malignant lymphoma, hepatocellular carcinoma, and stomach cancer, and has no accumulation in the body and is highly safe.
本発明者らは、 前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 式 (1 ) で表され る化合物がインターフェロンと併用することによって、 抗ウィルス作用を増強する ことを見いだした。 更に、 当該抗ウィルズ作用増強作用の至適濃度域が化合物のィ
ンターフェロン一 γ産生を誘導 (産生増強) する濃度域と一致することを新たに見 いだし、 本発明を完成した。 The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that the compound represented by the formula (1) enhances the antiviral effect when used in combination with interferon. Furthermore, the optimal concentration range of the anti-Wilz effect enhancing action is The present inventors have newly found that the concentration corresponds to the concentration range in which interferon-γ production is induced (enhancement of production), and completed the present invention.
即ち、 本発明は式 (1) That is, the present invention relates to formula (1)
[式中、 R1 は水素原子、 窒素原子の保護基あるいは窒素原子の置換基を表し、 R 2は水素原子あるいは水酸基の保護基を表す。 ] で表される化合物またはその塩を 有効成分として含有する、 ウィルス性肝炎及び癌疾患に対して有効で安全なインタ 一フエロンとの併用剤に関する。 [In the formula, R 1 represents a hydrogen atom, a nitrogen atom protecting group or a nitrogen atom substituent, and R 2 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group protecting group. ] Or a salt thereof as an active ingredient, which is a combination drug with interferon which is effective and safe against viral hepatitis and cancer diseases.
本発明の要旨は、下記 (1) ― (49) の点にある。 The gist of the present invention resides in the following points (1) to (49).
(1) 式 (1) (1) Equation (1)
で表される化合物 (式中、 R1 および R2は前述と同じ意味を表す。 ) またはその 塩を有効成分とする、 ウィルス性肝炎あるいは癌疾患に対するインターフェロンと の併用療法剤、 (Wherein R 1 and R 2 have the same meanings as described above) or a salt thereof as an active ingredient, in combination with interferon for viral hepatitis or cancer disease,
(2) R1 の窒素原子の置換基が、 リボフラノシル基、 2—ヒドロキシエトキシメ チル基、 2—ヒドロキシメチルー 1、 3ーォキサチオランー 5—ィル基、 4ーヒド 口キシメチルー 2—シクロプロぺニル基、 [2—ヒ ドロキシ一 1一 (ヒドロキシメ チル) ェトキシ] メチル基、 テトラヒ ドロー 2 _フリル基、 n—へキシルカルバモ ィル基、 3—ヒドロキシメチルーテトラヒドロー 2—フリル基、 3—ヒドロキシメ
チル一 5—ヒドロキシーテトラヒドロー 2—フリル基、 3 _ヒドロキシメチルー 4 、 5—ジヒ ドロキシ一テトラヒドロー 2—フリル基、 3—ヒドロキシメチルー 4、 5—ジヒドロキシー 5—メチノレーテトラヒドロー 2—フリル基あるいは 3—ヒドロ キシメチルー 4一アジドーテトラヒドロー 2—フリル基であることを特徴とする、 (1) 記載のインターフェロンとの併用療法剤、 (2) The substituent of the nitrogen atom of R 1 is a ribofuranosyl group, a 2-hydroxyethoxymethyl group, a 2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl group, or a 4-hydroxymethyl-2-methylcyclopropyl Benzyl group, [2-hydroxy-11- (hydroxymethyl) ethoxy] methyl group, tetrahydroxy 2-furyl group, n-hexylcarbamoyl group, 3-hydroxymethyl-tetrahydro-2-furyl group, 3 —Hydroxyme Cyl-5-hydroxy-tetrahydro-2-furyl group, 3-hydroxymethyl-4,5-dihydroxy-1-tetrahydro-2-furyl group, 3-hydroxymethyl-4,5-dihydroxy-5-methinolatetetrahydro-2- The combination therapy with interferon according to (1), which is a furyl group or a 3-hydroxymethyl-4-azidotetrahydro-2-furyl group.
(3) R1 が水素原子あるいはリポフラノシル基であることを特徴とする (1) ま たは (2) 記載の剤、 (3) The agent according to (1) or (2), wherein R 1 is a hydrogen atom or a lipofuranosyl group.
(4) R 2が氷素原子であることを特徴とする (1) 〜 (3) いずれか記載の剤、(4) The agent according to any one of (1) to (3), wherein R 2 is a chromium atom.
(5) インターフェロンがインターフェロン一 αである (1) 〜 (4) いずれか記 載の剤、 (5) the interferon is alpha-interferon α (1) to (4), the agent according to any of the above,
(6) インターフェロンがインターフェロン一 αηΐである (1) 〜 (4) いずれか 記載の剤、 (6) The agent according to any one of (1) to (4), wherein the interferon is interferon-αηΐ.
(7) インターフェロンがスミフエロン、 イントロン Α、 アドパフェロン、 ぺグイ ントロンまたはぺガシスである (1) 〜 (4) いずれ力、記載の剤、 (7) The interferon is Sumiferon, Intron II, Adpaferon, Equinintron or Egasis (1) to (4)
(8) インターフェロンがインターフェロン一 /3である (1) 〜 (4) いずれか記 載の剤、 (8) Interferon is 1/3 of interferon (1) to (4)
(9) 前記剤が、 1回の投与量が 10 mg〜300 mgであって、 1日に 1〜3回投与され ることを特徴とする (1) 〜 (8) いずれか記載の剤、 (9) The agent according to any one of (1) to (8), wherein the dose of the agent is 10 mg to 300 mg, and is administered one to three times a day.
(10) 前記剤が、 1回の投与量が 20 mg〜: 100 mgであって、 1日に 1〜3回投与さ れることを特徴とする (1) 〜 (8) いずれか記載の剤、 (10) The agent according to any one of (1) to (8), wherein the dose of the agent is 20 mg to: 100 mg, and is administered 1 to 3 times a day. ,
(1 1) 前記剤が濃度 10 μΜ以下で活性を示すという特徴を有するものである、 ( 1) 〜 (8) いずれか記載の剤、 (11) The agent according to any one of (1) to (8), wherein the agent has a characteristic of exhibiting activity at a concentration of 10 μΜ or less.
(1 2) 前記剤が濃度 1 μΜ〜8 μΜで活性を示すという特徴を有するものである、 (1) 〜 (8) いずれか記載の剤、 (1 2) The agent according to any one of (1) to (8), wherein the agent has a characteristic of exhibiting activity at a concentration of 1 μΜ to 8 μΜ.
(13) 前記剤が血中濃度 10 μΜ以下で活性を示すという特徴を有するものである (13) The agent is characterized in that it exhibits activity at a blood concentration of 10 μΜ or less.
、 (1) 〜 (8) いずれか記載の剤、 The agent according to any one of (1) to (8),
(14) 前記剤が血中濃度 1 μΜ〜8 μΜで活¾£を示すという特徴を有するものであ る、 (1) 〜 (8) いずれか記載の剤、 (14) The agent according to any one of (1) to (8), wherein the agent exhibits activity at a blood concentration of 1 μm to 8 μm.
(1 5) 前記ウィルス性肝炎が C型慢性肝炎である (1) 〜 (14) いずれか記載
の剤、 (15) The viral hepatitis is chronic hepatitis C (1) to (14). Agent
(16) 前記癌が、 慢性骨髄性白血病、 多発性骨髄腫、 骨髄異形性症候群、 真性多 血症、 非ホジキン悪性リンパ腫、 干細胞癌、 胃癌、 表在性膀胱癌、 膝臓癌、 腎細胞 癌、 前立腺癌や食道癌である (1) ~ (14) いずれ力記載の剤、 (16) The cancer is chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, polycythemia vera, non-Hodgkin's malignant lymphoma, dry cell cancer, gastric cancer, superficial bladder cancer, knee cancer, renal cell cancer , Prostate cancer or esophageal cancer (1) to (14)
(17) 式 (1) で表される化合物 (式中の R1 と R2 の定義は前述の通りである(17) A compound represented by the formula (1) (wherein R 1 and R 2 are as defined above.
。 ) またはその塩を有効成分とする、 インターフェロンと併用することを特徴とす る抗肝炎ウィルス剤、 . ) Or an anti-hepatitis virus agent comprising a salt thereof as an active ingredient, which is used in combination with interferon;
(18) 前記肝炎ウィルスが C型肝炎ウィルスである、 上記 (1 7) 記載の剤、 (18) the agent according to (17), wherein the hepatitis virus is hepatitis C virus;
(19) R1 の窒素原子の置換基が、 リボフラノシル基、 2—ヒ ドロキシエトキシ メチル基、 2—ヒドロキシメチルー 1、 3—ォキサチオラン一 5 ル基、 4ーヒ ドロキシメチルー 2—シクロプロぺニル基、 [2—ヒ ドロキシ一 1一 (ヒ ドロキシ メチル) エトキシ] メチル基、 テトラヒ ドロー 2—フリル基、 n—へキシルカルバ モイル基、 3—ヒ ドロキシメチルーテトラヒ ドロー 2 _フリル基、 3—ヒ ドロキシ メチルー 5—ヒ ドロキシ一テトラヒ ドロ一 2—フリノレ基、 3—ヒ ドロキシメチノレ一 4、 5—ジヒ ドロキシ一テトラヒ ドロー 2—フリル基、 3—ヒ ドロキシメチル一 4 、 5—ジヒドロキシ一 5—メチルーテトラヒドロ _ 2—フリル基あるいは 3—ヒド ロキシメチルー 4—アジドーテトラヒドロ一2—フリル基であることを特徴とする 、 (17) または (18) 記載の剤、 (19) The substituent for the nitrogen atom of R 1 is a ribofuranosyl group, 2-hydroxyethoxymethyl group, 2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolane-15-group, 4-hydroxymethyl-2-cyclopropenyl group , [2-hydroxy-1- (hydroxymethyl) ethoxy] methyl group, tetrahydroxy 2-furyl group, n-hexylcarbamoyl group, 3-hydroxymethyl-tetrahydroxy 2-furyl group, 3-hydroxy Doxymethyl-5-hydroxy-1-tetrahydro-2-furinole group, 3-hydroxymethynole-4,5-dihydroxy-1-tetrahydroxy 2-furyl group, 3-hydroxymethyl-14,5-dihydroxy-1-5-methyl-tetrahydro _ (2-) furyl or 3-hydroxymethyl-4-azidotetrahydro-12-furyl, (17) or (18) The agent according to the above,
(20) R1 が水素原子あるいはリポフラノシル基であることを特徴とする (17 ) 〜 (19) いずれか記載の剤、 (20) The agent according to any one of (17) to (19), wherein R 1 is a hydrogen atom or a lipofuranosyl group.
(21) R 2 が水素原子であることを特徴とする上記 (17) 〜 (20) いずれか 記載の剤、 (21) The agent according to any one of the above (17) to (20), wherein R 2 is a hydrogen atom,
(22) インターフェロンがインターフェロン一aである (17) 〜 (21) いず れか記載の剤、 (22) The agent according to any one of (17) to (21), wherein the interferon is interferon-a.
(23) インターフェロンがインターフェロン一 αηΐである (1 7) 〜 (21) い ずれか記載の剤、 (23) The agent according to any one of (17) to (21), wherein the interferon is interferon-αηΐ.
(24) インターフェロンがスミフエロン、 イントロン Α、 アドパフェロン、 ぺグ イントロンまたはぺガシスである (1 7) 〜 (21) いずれか記載の剤、 (24) The agent according to any one of (17) to (21), wherein the interferon is Sumiferon, Intron II, Adpaferon, Pug Intron or Pegasis
(25) インターフェロンがインターフェロン _ ]3である (17) 〜 (21) いず
れか記載の剤、 (25) The interferon is interferon _] 3 (17)-(21) The agent described in the
(26) 前記剤が、 1回の投与量が 10 mg〜300 mgであって、 1日に 1〜3回投与さ れることを特徴とする (17) 〜 (25) いずれ力、記載の剤、 (26) The agent according to any one of (17) to (25), wherein the agent has a single dose of 10 mg to 300 mg and is administered one to three times a day. ,
(27) 前記剤が、 1回の投与量が 20 mg〜100 mgであって、 1曰に 1〜3回投与さ れることを特徴とする (1 7) 〜 (25) いずれか記載の剤、 (27) The agent according to any one of (17) to (25), wherein the dose of the agent is 20 mg to 100 mg, and the agent is administered 1 to 3 times. ,
(28) 前記剤が濃度 10 μΜ以下で活性を示すという特徴を有するものである、 ( 17) 〜 (25) いずれか記載の剤、 (28) The agent according to any one of (17) to (25), wherein the agent has a characteristic of exhibiting activity at a concentration of 10 μΜ or less.
(29) 前記剤が濃度 1 μΜ~8 μΜで活性を示すという特徴を有するものである、 (17) 〜 (25) いずれか記載の剤、 (29) The agent according to any one of (17) to (25), wherein the agent has a characteristic of exhibiting activity at a concentration of 1 μΜ to 8 μΜ.
(30) 前記剤が血中濃度 10 μΜ以下で活性を示すという特徴を有するものである (30) The agent is characterized in that it exhibits activity at a blood concentration of 10 μΜ or less.
、 (17) 〜 (25) いずれ力、記載の剤、 , (17)-(25)
(31) 前記剤が血中濃度 1 μΜ〜8 μΜで活性を示すという特徴を有するものであ る、 (17) 〜 (25) いずれか記載の剤、 (31) the agent according to any one of (17) to (25), wherein the agent has an activity at a blood concentration of 1 μ 濃度 to 8 μΜ;
(32) ウィルス性肝炎患者にインターフェロンを投与すると共に、 上記 (17) 〜 (31) いずれかの抗肝炎ウィルス剤を併用することからなるウィルス性肝炎の 治療方法、 (32) A method for treating viral hepatitis, which comprises administering interferon to a patient with viral hepatitis and using any one of the above-mentioned (17) to (31) anti-hepatitis virus agents in combination.
(33) ウィルス性肝炎が C型肝炎である、 上記 (32) 記載の治療方法、 (33) The method according to the above (32), wherein the viral hepatitis is hepatitis C.
(34) 上記 (1 7) 〜 (31) いずれかの化合物を経口投与すると共に、 インタ 一フエロンを皮下投与することによる上記 (32) または (33) に記載の治療方 法。 (34) The treatment method according to (32) or (33), wherein the compound of any one of (17) to (31) is orally administered, and interferon is administered subcutaneously.
(35) 式 (1) で表される化合物 (式中、 R1 と R2の定義は前述の通りである 。 ) またはその塩を有効成分とする、 免疫活性化剤、 (35) an immune activator comprising a compound represented by the formula (1) (wherein R 1 and R 2 are as defined above) or a salt thereof as an active ingredient:
(36) 細胞性免疫活性化を特徴とする (35) 記載の剤、 (36) the agent according to (35), which is characterized by activation of cellular immunity;
(37) インターフェロン一 y産生誘導 (産生増強) を特徴とする (35) または (36) 記載の剤、 (37) The agent according to (35) or (36), which is characterized by inducing interferon-y production (enhancing production).
(38) R 1 の窒素原子の置換基が、 リポフラノシル基、 2—ヒドロキシェトキシ メチノレ基、 2—ヒ ドロキシメチルー 1、 3ーォキサチオラン一 5—ィル基、 4—ヒ ドロキシメチル _ 2—シクロプロぺ-ル基、 [2—ヒドロキシ一 1一 (ヒドロキシ メチル) エトキシ] メチル基、 テトラヒドロー 2—フリル基、 n—へキシルカルバ
モイル基、 3—ヒ ドロキシメチルーテトラヒ ドロー 2—フリル基、 3—ヒ ドロキシ メチノレー 5—ヒ ドロキシーテトラヒ ドロ一 2—フリノレ基、 3—ヒ ドロキシメチノレー 4、 5—ジヒ ドロキシーテトラヒ ドロー 2—フリル基、 3—ヒ ドロキシメチノレー 4 、 5—ジヒ ドロキシ一 5—メチルーテトラヒ ドロー 2—フリル基あるいは 3—ヒド ロキシメチルー 4—アジド一テトラヒドロ一 2 _フリル基であることを特徴とする 、 (35) 〜 (37) いずれ力、記載の剤、 (38) The substituent of the nitrogen atom of R 1 is a lipofuranosyl group, a 2-hydroxyethoxymethinole group, a 2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-1-yl group, or a 4-hydroxymethyl-2-cyclopropyl group. Group, [2-hydroxy-1- (hydroxymethyl) ethoxy] methyl group, tetrahydro-2-furyl group, n-hexylcarba Moyl group, 3-hydroxymethyl-tetrahydroxy 2-furyl group, 3-hydroxymethylinole 5-hydroxytetrahydro-1-furinole group, 3-hydroxymethylinoleate 4, 5-dihydroxy Tetrahydroxy 2-furyl group, 3-hydroxymethylenolate 4, 5-dihydroxy-15-methyl-tetrahydro-2-furyl group or 3-hydroxymethyl-4-furazide-tetrahydro-12-furyl group , (35)-(37) any force, the agent described,
(39) R 1 が水素原子あるいはリボフラノシル基であることを特徴とする (35 ) 〜 (38) いずれ力記載の剤、 (39) The agent according to any one of (35) to (38), wherein R 1 is a hydrogen atom or a ribofuranosyl group.
(40) R2が水素原子であることを特徴とする上記 (35) 〜 (39) いずれか 記載の剤、 (40) The agent according to any one of the above (35) to (39), wherein R 2 is a hydrogen atom,
(41) 前記剤が濃度 10 μΜ以下で活性を示すという特徴を有するものである、 ( 35) 〜 (40) いずれか記載の剤、 (41) The agent according to any one of (35) to (40), wherein the agent has a characteristic of exhibiting activity at a concentration of 10 μΜ or less.
(42) 前記剤が濃度 1 μΜ〜8 μΜで活性を示すという特徴を有するものである、 (35) 〜 (40) いずれか記載の剤、 (42) The agent according to any one of (35) to (40), wherein the agent has a characteristic of exhibiting activity at a concentration of 1 μΜ to 8 μΜ.
(43) 前記剤が血中濃度 10 μΜ以下で活性を示すという特徴を有するものである (43) The agent is characterized in that it exhibits activity at a blood concentration of 10 μΜ or less.
、 (35) ~ (40) いずれか記載の剤、 The agent according to any one of (35) to (40),
(44) 前記剤が血中濃度 1 μΜ〜8 μΜで活 1"生を示すという特徴を有するものであ る、 (35) 〜 (40) いずれか記載の剤、 (44) The agent according to any one of (35) to (40), wherein the agent has a characteristic of exhibiting active 1 "activity at a blood concentration of 1 μΜ to 8 μΜ.
(45) (35) 〜 (40) いずれか記載の製剤であって、 投与後の血中濃度が 10 μΜ以下になるように投与することを特徴とする、 経口投与用製剤、 (45) The preparation according to any one of (35) to (40), which is administered so that the blood concentration after administration is 10 μΜ or less,
(46) 投与後の血中濃度が 1 μΜ〜8 μΜになるように経口投与されることを特徵 とする、 (35) 〜 (40) いずれか記載の経口投与用製剤、 (46) The preparation for oral administration according to any of (35) to (40), which is orally administered so that the blood concentration after administration is 1 μΜ to 8 μΜ.
(47) ウィルス性肝炎患者に、 上記 (35) 〜 (46) いずれ力記載の剤を投与 することからなるウィルス性肝炎の治療方法、 (47) A method for treating viral hepatitis, which comprises administering the agent described in any one of (35) to (46) to a patient with viral hepatitis.
(48) ゥィルス性肝炎が C型肝炎である、 上記 (47) の治療方法、 (48) The method of (47) above, wherein the diarrhea hepatitis is hepatitis C.
(49) 癌疾患患者に、 上記 (35) 〜 (46) いずれ力、記載の剤を投与すること からなる癌疾患の治療方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 ミゾリビンがインターフェロン一 γを誘導することを示す図である。 脾細胞は無感作マウスから調製し、 培養上清にはス一パー抗原である (49) A method for treating a cancer disease, which comprises administering the agent described in any one of (35) to (46) to a cancer disease patient. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows that mizoribine induces interferon-γ. Splenocytes are prepared from naive mice and the culture supernatant contains sperm antigen
staphylococcal enterotoxin B (SEB)を 400 pg/mlの濃度で添加した。 培養液にミゾ リビンを添加することによって刺激を加え、 48時間培養後、 培養上清中のサイト力 ィンを ELISA法により測定した。 Staphylococcal enterotoxin B (SEB) was added at a concentration of 400 pg / ml. Stimulation was added by adding mizoribine to the culture solution, and after culturing for 48 hours, cytodynamics in the culture supernatant was measured by ELISA.
図 2は、 ミゾリビン投与時の体内動態を示す。 Figure 2 shows the pharmacokinetics when mizoribine was administered.
(A) は、 1回 50 mg、 1日 3回投与時の体内動態であり、 (B ) は、 1回 100 mg 、 1日 3回投与時の体内動態をしめす。 (A) shows the pharmacokinetics at the time of administration of 50 mg at a time, three times a day, and (B) shows the pharmacokinetics at the time of administration of 100 mg at a time, three times daily.
図 3は、 HLBI投^による HCVレプリコン由来 RNAの測定結果である。 FIG. 3 shows the results of measurement of RNA derived from HCV replicon by HLBI injection.
図 4は、 Ribavirin (RBV)と天然型インターフェロン一ひの併用によるレプリコン 腿の抑制効果を示す。 FIG. 4 shows the suppressive effect of replicon thighs by the combined use of Ribavirin (RBV) and natural interferon.
図 5は、 Mizoribine (MIZ) と天然型インターフェロン一 αの併用によるレプリ コン R Aの抑制効果を示す。 FIG. 5 shows the suppressive effect of replicon RA by the combined use of Mizoribine (MIZ) and natural interferon-α.
図 6は、 SM- 108と天然型インターフェロン一αの併用によるレプリコン R Aの抑 制効果を示す。 FIG. 6 shows the inhibitory effect of replicon RA by the combined use of SM-108 and natural interferon-1α.
図 7は、 天然型インターフェロン一 αの併用によるレプリコン RNAの抑制効果を 示す。 リアルタイム PCR法によって 2回測定されたコピー数の平均値とレプリコン RNAの減少量 (%)を示している。 リバビリン及ぴミゾリビンは 2回、 SM-108は 1回の 実験の結果を示している。 FIG. 7 shows the inhibitory effect of replicon RNA by the combined use of natural interferon-α. The average value of the copy number measured twice by the real-time PCR method and the reduction (%) of the replicon RNA are shown. Ribavirin and mizoribine show the results of two experiments, and SM-108 shows the results of one experiment.
図 8は、 HLBIとリバビリン併用によるレプリコン RNAの消失効果を示す。 各レー ンのサンプルは、 1 ; #50- 1細胞、 2 ~ 7 ; HLBI 3 IU/ml +リバビリン ( 2 ; 0 μΜ 、 3 ; 1 μΜ、 4 ; 3 μΜ、 5 ; 5 μΜ、 6 ; 10 μΜ、 7 ; 20 μΜ) である。 FIG. 8 shows the effect of HLBI and ribavirin in combination to eliminate replicon RNA. Samples from each lane were: 1; # 50-1 cells, 2-7; HLBI 3 IU / ml + ribavirin (2; 0 μΜ, 3; 1 μΜ, 4; 3 μΜ, 5; 5 μΜ, 6; 10 μΜ, 7; 20 μΜ).
(Α) 1%ァガロースゲル電気泳動による泳動パターンを示した図である。 (Β ) HCV腿を検出するプロ ^"ブを用いたノーザンハイプリダイゼーションの結果であ る (矢印はレプリコン RNAである) 。 ( C ) G3PDH mRNAを検出プローブを用いたノ 一ザンハイプリダイゼーションの結果である (矢印は G3PDH mRNAである) 。 (Α) is a diagram showing a migration pattern by 1% agarose gel electrophoresis. (Β) Northern hybridization using a probe that detects HCV thighs (arrow indicates replicon RNA). (C) Northern hybridization using G3PDH mRNA detection probe. (The arrow indicates G3PDH mRNA).
図 9は、 HLBIとミゾリビン併用によるレプリコン RNAの消失効果を示す。 各レー ンのサンプノレは、 1 ; #50- 1細胞、 2〜7 ; HLBI 3 IU/ml +ミゾリビン ( 2 ; 0 μΜ 、 3 ; 1 μΜ、 4 ; 3 μΜ、 5 ; 5 μΜ、 6 ; 10 μΜ、 7 ; 20 μΜ) である。
(A) 1%ァガロースゲル電気泳動による泳動パターンを示した図である。 (B ) HCV RNAを検出するプローブを用いたノーザンハイブリダィゼーシヨンの結果であ る (矢印はレプリコン醒である) 。 (C ) GSPDH mRNAを検出プローブを用いたノ ーザンハイブリダィゼーシヨンの結果である (矢印は G3PDH mRNAである) 。 FIG. 9 shows the elimination effect of replicon RNA by the combined use of HLBI and mizoribine. Samples in each lane were: 1; # 50-1 cells, 2-7; HLBI 3 IU / ml + mizoribine (2; 0 μΜ, 3; 1 μΜ, 4; 3 μΜ, 5; 5 μΜ, 6; 10 μΜ, 7; 20 μΜ). (A) is a view showing a migration pattern by 1% agarose gel electrophoresis. (B) The result of Northern hybridization using a probe for detecting HCV RNA (the arrow indicates that the replicon is awake). (C) Northern hybridization using a probe for detecting GSPDH mRNA (arrows indicate G3PDH mRNA).
図 1 0は、 HLBIと SM- 108併用によるレプリコン RNAの消失効果を示す。 各レーン のサンプルは、 N. C. ; Huh- 7細胞、 1 ; #50-1細胞、 2〜7 ; HLBI 3 IU/ral+SM- 108 ( 2 ; 0 μΜ、 3 ; 1 μΜヽ 4 ; 3 μΜ、 5 ; 5 μΜ、 6 ; 10 μΜ、 7 ; 20 μΜ) である。 (Α) 1%ァガロースゲル電気泳動による泳動パターンを示した図である。 (Β ) HCV R Aを検出するプローブを用いたノーザンハイブリダイゼーシヨンの結果であ る (矢印はレプリコン RNAである) 。 (C) G3PDH mRNAを検出プローブを用いたノ ーザンハイブリダィゼーシヨンの結果である (矢印は GI3PDH mRNAである) 。 FIG. 10 shows the effect of HLBI and SM-108 in combination to eliminate replicon RNA. Samples in each lane were NC; Huh-7 cells, 1; # 50-1 cells, 2-7; HLBI 3 IU / ral + SM-108 (2; 0 μΜ, 3; 1 μΜ ヽ 4; 3 μΜ, 5; 5 μΜ, 6; 10 μΜ, 7; 20 μΜ). (Α) is a diagram showing a migration pattern by 1% agarose gel electrophoresis. (Β) Northern hybridization results using a probe that detects HCV RA (arrows indicate replicon RNA). (C) Northern hybridization using a probe for detecting G3PDH mRNA (arrows indicate GI3PDH mRNA).
図 1 1は、 ノーザンハイブリダイゼーション角军析による HLBIとリバビリン併用に よるレプリコン R Aの消失効果を示す。 各リバビリン添加量における G3PDH遺伝子発 現量に対するレプリコン RNAの比を示す。 FIG. 11 shows the disappearance effect of replicon RA by combined use of HLBI and ribavirin by Northern hybridization angle analysis. The ratio of replicon RNA to the amount of G3PDH gene expression at each amount of ribavirin added is shown.
図 1 2は、 ノーザンハイプリダイゼーション角罕析による HLBIとミゾリビン併用に よるレプリコン R Aの消失効果を示す。 各ミゾリビン添加量における G3PDH遺伝子発 現量に対するレプリコン R Aの比を示す図である。 FIG. 12 shows the elimination effect of replicon RA by the combined use of HLBI and mizoribine by Northern hybridization angle-harvesting. FIG. 4 is a graph showing the ratio of replicon RA to the amount of G3PDH gene expression at each amount of mizoribine added.
図 1 3は、 ノーザンハイブリダイゼーション解析による HLBIと SM-108併用による レプリコン R Aの消失効果を示す。 各 SM- 108添加量における G3PDH遺伝子発現量に対 するレプリコン RNAの比を示す図である。 FIG. 13 shows the effect of elimination of replicon RA by the combined use of HLBI and SM-108 by Northern hybridization analysis. FIG. 3 is a view showing the ratio of replicon RNA to the amount of G3PDH gene expression in each amount of added SM-108.
図 1 4は、 スミフエロン、 ミゾリビンおよび SM-108の単独あるいは併用した場合 の抗 BVDV活性を示す (縦軸は細胞増殖の度合いを示し、 値が大きいほど薬剤処理に より細胞が抗ウィルス効果を示して増殖していることを示す) 。 Fig. 14 shows the anti-BVDV activity when sumiferon, mizoribine, and SM-108 were used alone or in combination (the vertical axis indicates the degree of cell proliferation, and the higher the value, the more effective the cell treatment with the drug. Indicating that they are growing).
(A) は、 スミフエロン 30 IU/ml、 ミゾリビンおよび SM-108は 0. 12 μΜ、 (Β ) は スミフエロン 10 IU/ml、 ミゾリビンおょぴ SM- 108は 0. 08 μΜ、 で単独あるいは併用 した場合の結果を示している。 (A) Sumiferon 30 IU / ml, mizoribine and SM-108 0.12 μΜ, (Β) Sumiferon 10 IU / ml, mizoribine SM-108 0.08 μΜ, used alone or in combination The result of the case is shown.
図 1 5は、 スミフエロン、 アドパフェロンあるいはイントロン Αを、 ミゾリビン あるいは SM - 108と併用した場合の抗 BVDV活性を示す。 FIG. 15 shows the anti-BVDV activity when Sumiferon, Adpaferon or Intron II was used in combination with Mizoribine or SM-108.
(A) は、 スミフエロンあるいはアドパフェロン 1 IU/ml、 ミゾリビン 1. 88 μΜを、
(B ) は、 スミフエロンあるいはアドパフェロン 10 IU/ml、 ミゾリビン 1. 88 μΜを 、 単独あるいは併用した場合の結果を示している。 ( C) はインターフェロン一 α としてスミフエロン、 イントロン Αあるいはアドパフェロンのそれぞれ 10 IU/ml、 および SM-108の 7. 5 μΜを単独あるいは併用した場合の結果を示している。 発明を実施するための最良の形態 (A) is 1 IU / ml of sumeferon or adpaferon, 1.88 μΜ of mizoribine, (B) shows the results obtained when using sumiferone or adpaferon at 10 IU / ml and mizoribine 1.88 μΜ alone or in combination. (C) shows the results when using interferon-α with 10 IU / ml each of sumiferon, intron II or adpaferon, and 7.5 μΜ of SM-108 alone or in combination. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明の第 1の態様は、 一般式 ( 1 ) で表される化合物またはそれらの塩に関す るインタ一フエロンとの併用療法剤である。 A first aspect of the present invention is a combination therapy with interferon for the compound represented by the general formula (1) or a salt thereof.
[式中、 R 1 は水素原子、 窒素原子の保護基あるいは窒素原子の置換基を表し、 R 2 は水素原子あるいは水酸基の保護基を表す。 ] [In the formula, R 1 represents a hydrogen atom, a nitrogen atom protecting group or a nitrogen atom substituent, and R 2 represents a hydrogen atom or a hydroxyl group protecting group. ]
本発明化合物の R 1 で示される置換基として、 例えば水素原子、 リポフラノシル 基、 2—ヒドロキシエトキシメチル基、 2—ヒドロキシメチルー 1 、 3—ォキサチ オラン一 5—ィノレ基、 4ーヒ ドロキシメチノレー 2—シクロプロぺニノレ基、 [ 2—ヒ ドロキシー 1一 (ヒドロキシメチル) エトキシ] メチル基、 テトラヒドロー 2—フ リル基、 η —へキシルカルバモイル基、 3—ヒ ドロキシメチルーテトラヒ ドロー 2 一フリル基、 あるいは 3—ヒドロキシメチル— 4一アジドーテトラヒドロー 2—フ リル基が挙げられ、 なかでも水素原子、 リボフラノシル基が好ましいものとして挙 げることができる。 Examples of the substituent represented by R 1 in the compound of the present invention include a hydrogen atom, a lipofuranosyl group, a 2-hydroxyethoxymethyl group, a 2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-1-inole group, and a 4-hydroxymethylino. Leh 2-cyclopropininole, [2-hydroxy-11- (hydroxymethyl) ethoxy] methyl, tetrahydro-2-furyl, η-hexylcarbamoyl, 3-hydroxymethyl-tetrahydryl 2-furyl And a 3-hydroxymethyl-4-azidotetrahydro-2-furyl group. Among them, a hydrogen atom and a ribofuranosyl group are preferable.
本発明化合物の R 1 で示される保護基として、 例えばメ トキシカルボニル基、 ェ トキシカルボニル基、 tーブトキシカルボ-ル基等の置換または無置換のアルコキ シカノレボニノレ基、 例えば p—エトロベンジ^ /レオキシカノレボェノレ基、 ベンジノレオキシ カルボ二ル基、 p—メ トキシベンジルォキシカルボニル基等の置換または無置換の ァリルォキシ力ルポニル基等が挙げられる。 また、 生体内で脱保護される保護基も
使用可能であり、 状況に応じて使用することができる。 Examples of the protective group represented by R 1 in the compound of the present invention include a substituted or unsubstituted alkoxycanoleboninole group such as a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a t-butoxycarbol group, etc., for example, p-etrobenzi ^ / reoxycanolevo And substituted or unsubstituted aryloxycarbonyl groups such as phenolic groups, benzylinoxycarbonyl groups, and p-methoxybenzyloxycarbonyl groups. Also, protecting groups that are deprotected in vivo It can be used and can be used depending on the situation.
本発明化合物の R 2 で示される置換基として、 水素原子あるいは水酸基の保護基 が挙げられる。 ここで、 水酸基の保護基とは、 例えば日本化学会実験化学講座 (丸 善) に記載のものが挙げられ、 化学的あるいは生物学的に切断されて水酸基に戻る ことができる保護基を言う。 例えば、 ァセチル基、 ベンゾィル基等のァシル基を挙 げることができる。 Examples of the substituent represented by R 2 in the compound of the present invention include a protecting group for a hydrogen atom or a hydroxyl group. Here, the hydroxyl-protecting group includes, for example, those described in The Chemical Society of Japan, Experimental Chemistry Course (Maruzen), and refers to a protecting group that can be chemically or biologically cleaved to return to a hydroxyl group. For example, acetyl groups such as acetyl group and benzoyl group can be mentioned.
さらに、 抗ウィルス活性を持つカルボキシル基を持つ化合物と縮合して、 エステ ル結合を形成して保護することもできる。 例えば、 カルボキシル基を持つ化合物が JTK- 003や BILN - 2061のような HCV RNAポリメラーゼ阻害剤であってもよい。 Furthermore, it can be protected by condensing with a compound having a carboxyl group having antiviral activity to form an ester bond. For example, the compound having a carboxyl group may be an HCV RNA polymerase inhibitor such as JTK-003 or BILN-2061.
上記塩としては、 薬学的に許容される塩が挙げられ、 例えば、 無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基性または酸性アミノ酸との塩 などが挙げられる。 無機塩基との塩の好適な例としては、 例えばナトリウム塩、 力 リゥム塩などのアルカリ金属塩;カルシウム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土 類金属塩;ならびにアルミニウム塩、 アンモ-ゥム塩などが挙げられる。 有機塩基 との塩の好適な例としては、 例えば、 トリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリ ジン、 ピコリン、 エタノーノレアミン、 ジエタノールァミン、 トリエタノ一ルァミン 、 ジシクロへキシルァミン、 N, N '—ジペンジノレエチレンジァミンなどとの塩が 挙げられる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸などとの塩が挙げられる。 有機酸との塩の好適な例としては、 例えば ギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 フマール酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 ク ェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 : —トノレ エンスルホン酸などとの塩が挙げられる。 塩基性アミノ酸との塩の好適な例として は、 例えばアルギニン、 リジン、 オル二チンなどとの塩が挙げられ、 酸性アミノ酸 との塩の好適な例としては、 例えばァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩が挙 げられる。 Examples of the salt include pharmaceutically acceptable salts, for example, a salt with an inorganic base, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, a salt with a basic or acidic amino acid And the like. Preferable examples of the salt with an inorganic base include, for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; and aluminum salt, ammonium salt and the like. Can be Preferable examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, N, N′-dipentinoleethylene. Salts with diamine and the like. Preferable examples of the salt with an inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like. Preferred examples of salts with organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, : — Salts with tonoren sulfonic acid and the like. Preferred examples of the salt with a basic amino acid include, for example, salts with arginine, lysine, orditin and the like. Preferred examples of the salt with an acidic amino acid include, for example, salts with aspartic acid, glutamic acid, etc. Are listed.
本発明において上記一般式 ( 1 ) の Rで示される置換基がリポフラノシル基であ る化合物はミゾリビンとして、 水素原子である化合物は SM - 108として公知である。 ミゾリビンは腎拒絶反応や慢性関節リゥマチ等に対する薬剤として上市されてい るが、 溶血性貧血等の重篤な副作用は、 臨床上殆ど現れていない。 ミゾリビンは、
特定の癌細胞細胞に対して、 増殖抑制作用を有すること (Cancer Res. 1975 ; 35 : 1643-1648) 、 抗ウィルス作用を有すること (Exp. Opin. Invest. Drug 2000; 9 : 221-235、 Antiviral Chemi. Chemother. 1994; 5: 366 - 371、 J Infect Dis 1993; 168: 641-64) が示されている。 免疫に関する作用として、 in vitroでは、 免疫の 刺激応答は維持されるが (Transplant. Pro 1992 ; 24: 2845-2846、 J. Clin.In the present invention, a compound in which the substituent represented by R in the above general formula (1) is a lipofuranosyl group is known as mizoribine, and a compound in which the substituent is a hydrogen atom is known as SM-108. Mizoribine is marketed as a drug for renal rejection and rheumatoid arthritis, but serious side effects such as hemolytic anemia have hardly appeared clinically. Mizoribine is It has an antiproliferative effect on specific cancer cell cells (Cancer Res. 1975; 35: 1643-1648), has an antiviral effect (Exp. Opin. Invest. Drug 2000; 9: 221-235, Antiviral Chemi. Chemother. 1994; 5: 366-371; J Infect Dis 1993; 168: 641-64). As an effect on immunity, the stimulatory response of immunity is maintained in vitro (Transplant. Pro 1992; 24: 2845-2846, J. Clin.
Invest. 1991 ; 87: 940-948) 、 T細胞や B細胞の増殖を抑制することが知られて おり (J. Clin. Invest. 1991; 87: 940-948、 J. Immunol. 1995; 155: 5175 - 5183 、 Clin. Exp. Immunol. 2000; 120: 448-453) 、 低濃度での免疫を活性化する作用 については知られていない。 また、 ミゾリビン添加により、 IMPDH - 2型遺伝子の発 現誘導が生じることが報告されている(Endocrinol. 2001 ; 142: 193 - 204)。 ミゾリ ビンの血中半減期は、 2時間程度と報告され、 蓄積性の無い薬剤である (リウマチ 科 1991 ; 5: 287-300) 。 Invest. 1991; 87: 940-948), and is known to suppress the proliferation of T cells and B cells (J. Clin. Invest. 1991; 87: 940-948; J. Immunol. 1995; 155: 5175-5183, Clin. Exp. Immunol. 2000; 120: 448-453), and its effect on activating immunity at low concentrations is not known. In addition, it has been reported that the addition of mizoribine induces the expression of IMPDH-2 type gene (Endocrinol. 2001; 142: 193-204). Mizoribine is reported to have a blood half-life of about 2 hours and is a non-accumulative drug (Rheumatology 1991; 5: 287-300).
SM-108は、 ミゾリビンの活性体のプロドラッグであり、 アデニン—ホスホリボシ ルトランスフェラーゼによって、 ミゾリビンに変換される化合物である (Cancer Res. 1982; 42: 1098-1102) 。 慢性骨髄性白血病、 骨髄異形性症候群、 真性多血症 等の造血器腫瘍や肺癌に対する単剤投与で臨床効果が認められ、 制癌剤としては極 めて安全性が高い薬剤であることが報告されている (癌と化学療法 1989 ; 16 : 123-130、 癌と化学療法 1989; 16: 113-121) 。 SM-108 is a prodrug of the active form of mizoribine, a compound that is converted to mizoribine by adenine-phosphoribosyltransferase (Cancer Res. 1982; 42: 1098-1102). It has been shown to be clinically effective when administered as a single agent against hematopoietic tumors such as chronic myelogenous leukemia, myelodysplastic syndrome, and polycythemia vera and lung cancer, and is reported to be an extremely safe drug as an anticancer drug. (Cancer and Chemotherapy 1989; 16: 123-130; Cancer and Chemotherapy 1989; 16: 113-121).
ミゾリビン及び SM- 108においては、 HCVに対する抗ウィルス作用やウィルス感染 細胞の排除能があるかについて、 C型慢性肝炎に投与されたことがなく、 その有効 性については不明である。 また、 インターフェロンとの併用で検討がなされたこと もない。 Mizoribine and SM-108 have not been administered to chronic hepatitis C as to whether they have an antiviral effect on HCV or the ability to eliminate virus-infected cells, and their efficacy is unknown. Nor has it been studied in combination with interferon.
本発明におけるウィルス性肝炎とは、 例えば、 C型肝炎ウィルス (HCV) や B型肝 炎ウィルス (丽) 等のウィルス感染による肝炎、 すなわち C型肝炎、 B型肝炎など をいう。 ウィルス性肝炎は、 急性肝炎、 劇症肝炎または慢性肝炎であってもよく、 慢性肝炎は肝硬変を伴っていてもよい。 ウィルス性肝炎は、 好ましくは、 C型慢性 肝炎や B型慢性活動性肝炎を挙げることができるが、 より好ましくは C型慢性肝炎 である。 The viral hepatitis in the present invention refers to, for example, hepatitis due to viral infections such as hepatitis C virus (HCV) and hepatitis B virus (丽), that is, hepatitis C, hepatitis B and the like. The viral hepatitis may be acute hepatitis, fulminant hepatitis or chronic hepatitis, and chronic hepatitis may be associated with cirrhosis. Viral hepatitis preferably includes chronic hepatitis C and chronic active hepatitis B, and more preferably chronic hepatitis C.
C型肝炎ウィルスには、 例えば、 ジエノタイプ l a、 l b、 2 a、 2 b、 3 a、
3 b等の遺伝子型が存在するが、 これら HCVの遺伝子型に限定されない。 Hepatitis C virus includes, for example, the dienotypes la, lb, 2a, 2b, 3a, There are genotypes such as 3b, but are not limited to these HCV genotypes.
本発明における癌疾患とは、 慢性骨髄性白血病、 多発性骨髄腫、 骨髄異形性症候 群、 真性多血症、 非ホジキン悪性リンパ腫、 ヘアリー細胞白血病、 皮膚 Tリンパ腫 を代表とする造血器系腫瘍や肝細胞癌、 胃癌、 表在性膀胱癌、 薛臓癌、 腎細胞癌、 前立腺癌、 食道癌、 メラノーマ、 AIDSに伴う力ポジ肉腫を代表とする固形癌を挙げ ることができるが、 好ましくは慢性骨髄性白血病、 多発性骨髄腫、 骨髄異形性症候 群、 真性多血症、 非ホジキン悪性リンパ腫、 肝細胞癌、 胃癌、 表在性膀胱癌、 膝臓 癌、 腎細胞癌、 前立腺癌や食道癌である。 The cancer diseases according to the present invention include chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome group, polycythemia vera, non-Hodgkin's malignant lymphoma, hairy cell leukemia, and hematopoietic tumors represented by cutaneous T lymphoma. Solid cancers such as hepatocellular carcinoma, gastric carcinoma, superficial bladder carcinoma, renal carcinoma, renal cell carcinoma, prostate carcinoma, esophageal carcinoma, melanoma, and lipopositive sarcoma associated with AIDS can be mentioned. Chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome group, polycythemia vera, non-Hodgkin's malignant lymphoma, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, superficial bladder cancer, knee cancer, renal cell cancer, prostate cancer and esophagus It is cancer.
本発明におけるインターフェロン (IFN) とは、 天然型 IFNまたは遺伝子組換型 IFNであり、 天然型 IFNはリンパ芽球由来、 白血球由来等の何れでもよく、 IFNの型 としては IFN- o;、 IFN - ] 3や IFN - ω等が挙げられる。 IFNは、 当該天然型 IFNと実質的 に同じ作用を有する限り、 そのアミノ酸配列中の 1もしくは複数のアミノ酸が置換 、欠失および Ζまたは付加された改変体、 DNA shuffl ing法等によりスクリーニング された改変体、 糖鎖が置換、欠失および Zまたは付加された改変体であってもよく 、 また同様に、 PEG化 IFNやアルブミン付力 UIFN等の持続性インターフェロン剤や組 織吸収性や組織移行性を高めた IFNの DDS製剤であってもよレヽ。 好ましくは、 天然型 もしくは遺伝子組換型 IFN- a、 天然型もしくは遺伝子組換型 IFN- コンセンサス IFN、 PEG化 IFNを挙げることができる。 前記 IFNは、 公知の市販の IFNを使用するこ とができる。 The interferon (IFN) in the present invention is a natural IFN or a recombinant IFN. The natural IFN may be derived from lymphoblasts, leukocytes, or the like. IFN-O; IFN-O; -] 3 and IFN-ω. IFN was screened by a DNA shuffling method, or the like, in which one or more amino acids in the amino acid sequence were substituted, deleted and / or modified, as long as they had substantially the same action as the natural IFN. The modified product may be a modified product in which the sugar chain is substituted, deleted, Z- or added, or similarly, a sustained interferon agent such as PEGylated IFN or albumin-forced UIFN, tissue absorption or tissue transfer. It may be a DDS formulation of IFN with enhanced properties. Preferable examples include natural or recombinant IFN-a, natural or recombinant IFN-consensus IFN, and PEGylated IFN. As the IFN, a known commercially available IFN can be used.
インターフェロン一a (IFN- a ) とは、 例えば、 天然型 IFN- α、 組換え IFN-ひ Interferon-a (IFN-a) includes, for example, natural IFN-α and recombinant IFN-α.
2aおよぴ組換え IFN- a 2b等を挙げることができ、 IFN- αであればいかなるサブタ ィプでもよい。 具体的には、 例えば、 天然型 IFN- 0!の IFN- α ηΐであるスミフエロン (住友製薬) 、 ォーアイエフ (大塚製薬) および IFN- αモチダ (持田製薬) 、 糸且換 え IFN- a 2aであるキャンフエロン Α (武田薬品) や口フエロン A (中外製薬) お よび組換え IFN - α 2bであるイントロン Α (シェリング ·プラウ) 等を挙げること ができるが、 これらに何ら限定されるものではない。 2a and recombinant IFN-a 2b and the like. Any subtype may be used as long as it is IFN-α. Specifically, for example, the natural forms of IFN-0 !, IFN-αηΐ, such as Sumiferon (Sumitomo Pharmaceutical), OIF (Otsuka Pharmaceutical) and IFN-α Mochida (Mochida Pharmaceutical), and Ito-Katari IFN-a2a Examples include, but are not limited to, certain canferon II (Takeda Pharmaceutical), mouth feron A (Chugai Pharmaceutical), and intron II (Schering-Plough), which is a recombinant IFN-α2b.
インターフェロン一] 3 (IFN- β ) とは、 例えば、 天然型 IFN- βや組換え IFN- β等 を挙げることができるが、 IFN- i3であればいかなるタイプでもよい。 具体的には、 例えば、 天然型 iFN- である iFN i3モチダ (持田製薬) やフエロン (東レ) 、 mm
え IFN- lbであるベタフエロン (日本シエーリング) 等を挙げることができるが、 これらに何ら限定されるものではない。 Interferon-1] (IFN-β) includes, for example, natural IFN-β and recombinant IFN-β, and any type of IFN-i3 may be used. Specifically, for example, iFN i3 Mochida (Mochida Pharmaceutical), Feron (Toray), mm For example, beta-feron (Nippon Schering), which is IFN-lb, can be mentioned, but is not limited thereto.
コンセンサスインターフェロン (コンセンサス IFN) とは、 コンセンサスシーク エンス理論に基づいて新たに開発された IFNであり、例えばインターフェロンァノレフ アコンー 1を挙げることができるが、 これに限定されるものではない。 インターフ ェ口ンァ /レフアコンー 1としては、 アドパフェロン (山之内製薬) が挙げられる。 持続性インターフェロン剤とは、 PEG (ポリエチレングリコール)、 マイクロ粒子 やナノ粒子、 ァテロコラーゲン、 シリコンその他の徐放性担体を用いて持続性を向 上させたィンターフェ口ン製剤のことであり、 PEG化 IFNとは、 PEG (ポリエチレング リコール)を IFN蛋白分子に結合させたものである。 持続性インターフェロン剤とは Consensus interferon (consensus IFN) is a newly developed IFN based on the consensus sequence theory and includes, but is not limited to, interferon-analfacon-1. Adfaferon (Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.) is an example of the interface / refacon-1. A long-acting interferon is an interferon formulation that uses PEG (polyethylene glycol), microparticles and nanoparticles, atelocollagen, silicon, and other sustained-release carriers to improve its sustainability. IFN is PEG (polyethylene glycol) bound to an IFN protein molecule. What is a long-acting interferon?
、 例えば PEG化 IFN - α 2aや PEG化 IFN-ひ 2bを挙げることができる力 IFNの種類は これらに限定されるものではない。 具体的には、 例えば、 PEG化 IFN-ひ 2aであるべ ガシス (ロシュ) や PEG化 IFN- α 2bであるぺグイントロン (シェリング 'ブラウ) 等を挙げることができる。 For example, PEGylated IFN-α 2a and PEGylated IFN-hi 2b can be mentioned. The types of IFN are not limited to these. Specific examples include Vegasis (Roche), which is PEGylated IFN-hi 2a, and Peguintron (Schering'Brow), which is PEGylated IFN-α2b.
組織吸収性を高めたインターフェロンの DDS製剤とは、 例えば、 マイクロ粒子、 ナノ粒子やその他の微粒子担体を用いて、 経肺や経鼻等の投与による、 肺、 気管支 Interferon DDS preparations with enhanced tissue absorption include, for example, pulmonary or nasal administration using microparticles, nanoparticles, or other fine particle carriers.
、 鼻粘膜等での吸収効率を向上させたィンターフェ口ン製剤を挙げることができる, Interferen preparations with improved absorption efficiency in the nasal mucosa, etc.
1 組織吸収性を高めたインターフェロン DDS製剤であればよく、 これらに何ら限 定されるものではない。 1 Interferon DDS preparations with enhanced tissue absorption may be used, and are not limited to these.
組織移行性を高めたインターフェロンの DDS製剤とは、 例えば、 糖鎖をァシァ口 化するなどの修飾により肝臓への親和性を高めたィンターフェ口ン製剤等が挙げら れる力 組織移行性を高めたインターフェロンの DDS製剤であればよく、 これらに 何ら限定されるものではない。 Interferon DDS preparations with improved tissue transport include, for example, interferon preparations that have improved affinity for the liver by modification, such as glycation of sugar chains, etc. It is sufficient if it is a DDS preparation of interferon, and it is not limited to these.
本発明におけるインターフェロン (IFN) としては、 好ましくはスミフエロン、 イントロン A、 アドパフェロン、 ぺグイントロンおよびぺガシス、 特に好ましくは スミフエロン、 イントロン Aおよびアドパフェロン、 更に好ましくはスミフエロン が挙げられる。 As the interferon (IFN) in the present invention, preferably, Sumiferon, Intron A, Adpaferon, Pguintron and Pegasis, particularly preferably Sumiferon, Intron A and Adpaferon, more preferably Sumiferon are used.
本発明における投与とは、 経口投与、 非経口投与 (直腸投与、 皮下注射、 静脈内 注射、 筋肉内注射、腹腔内注射などを含む) 等が挙げられるが、 これに限定されな
い。 投与は、 より好ましくは経口投与が挙げられる。 投与は、 投与形態、 患者の年 齢、 体重、 症状、 副作用の出現等により投与量、 投与回数を適宜調整して投与する ことができる。 The administration in the present invention includes, but is not limited to, oral administration, parenteral administration (including rectal administration, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.). No. Administration is more preferably oral administration. The administration can be carried out by appropriately adjusting the dose and the number of administrations according to the administration form, age, weight, symptoms, side effects, etc. of the patient.
1回の投与量は、 副作用を惹起する量以下であれば特に制限はないが、 例えば 10 mg〜500 mgであり、 好ましくは 10 mg〜300 mg、 更に好ましくは 20 mg〜: LOO mgであ るが、 これに限定されない。 The single dose is not particularly limited as long as it is not more than an amount that causes side effects, but is, for example, 10 mg to 500 mg, preferably 10 mg to 300 mg, and more preferably 20 mg to: LOO mg. But not limited to this.
投与回数は、 例えば、 1日に 1〜3回が挙げられるが、 これに限定されず、 隔日や 数日に 1回投与でも良い。 投与初期時には連日複数回投与、 その後継続して連日複 数回または 1回投与ないしは数日に 1回投与するのでもよい。 The number of administrations is, for example, 1 to 3 times a day, but is not limited thereto. The administration may be once every other day or several days. It may be administered several times daily at the beginning of administration, and then continuously several times or once daily or once every several days.
本発明における濃度とは、 剤投与後の剤の血中濃度をいう。 血中濃度とは、 剤投 与後の体内における剤の血液中の濃度であり、 副作用を惹起する濃度以下で、 且つ 有効な濃度であれば特に制限はされない。 血中濃度は、 例えば 10 μΜ以下であり、 好ましくは 1 μΜ〜8 μΜが挙げられる。 The concentration in the present invention refers to the blood concentration of the agent after administration of the agent. The blood concentration is the concentration of the agent in the blood in the body after administration of the agent, and is not particularly limited as long as it is lower than the concentration that causes side effects and is an effective concentration. The blood concentration is, for example, 10 μΜ or less, and preferably 1 μΜ to 8 μΜ.
本発明における活性とは、 抗ウィルス作用や免疫を活性化する作用であり、 イン ターフェロンと併用することによって抗ウィルス作用を増強する作用およびウィル ス感染細胞の排除能を増強する作用のことを言う。 The activity in the present invention is an activity of activating an antiviral action or immunity, and refers to an action of enhancing an antiviral action and an action of enhancing the ability to eliminate virus-infected cells when used in combination with interferon. .
本発明の第 2の態様は、 一般式(1 )で表わされる化合物またはそれらの塩を有効 成分とする免疫活性化剤である。 A second aspect of the present invention is an immunoactivator comprising a compound represented by the general formula (1) or a salt thereof as an active ingredient.
本発明における免疫活性化剤とは、 免疫を活性化する作用を有する剤のことであ り、 細胞性免疫活性化剤とは、 細胞性免疫を活性化する作用を有する剤のことであ る。 細胞性免疫とは、 免疫細胞自身が異物を攻撃排除する免疫機構であり、 細胞内 寄生菌、 真菌、 原虫などに対する殺作用といった細胞内寄生性の微生物の防御を担 うほか、 ウィルス感染細胞の破壌■除去や腫瘍細胞の破壌などに関わっており、 自 然免疫と獲得免疫がある。 The immunity activator in the present invention is an agent having an action of activating immunity, and the cell immunity activator is an agent having an action of activating cell immunity. . Cell-mediated immunity is an immune mechanism in which the immune cells themselves attack and eliminate foreign substances, and are responsible for defense against intracellular parasitic microorganisms, such as killing against intracellular parasites, fungi, and protozoa. It is involved in the elimination of ruptures and rupture of tumor cells, and has natural immunity and acquired immunity.
本発明の第 3の態様は、 一般式(1 )で表わされる化合物またはそれらの塩を有効 成分とするインターフェロン一 γ産生誘導 (産生増強)剤である。 A third aspect of the present invention is an interferon-γ production inducer (production enhancer) comprising a compound represented by the general formula (1) or a salt thereof as an active ingredient.
本発明におけるインターフェロン一 γ産生誘導 (産生増強) 剤とは、 血液中また は/および生体組織内におけるインターフェロン一 γ (IFN- γ ) の濃度を上昇させ る剤のことである。 IFN- γは、 免疫細胞が認識する表面抗原提示に関与する HLAク
ラス I抗原、 HLAクラス II抗原、 ]3 2_ミクログロブリン、 TAP、 LMP等の分子の発現誘 導による抗原特異的な細胞障害性 Tリンパ球 (CTL) の活性化、 免疫グロブリン Fc レセプターの発現誘導によるエフェクタ一細胞による抗原特異的な獲得免疫を活性 化、 NK細胞の活性化、 およびマク口ファージの活性化等の作用を有する。 そのため 本剤は、 例えば、 細胞内寄生菌、 真菌、 原虫などの細胞内寄生性の微生物に対する 殺作用、 およびゥィルス感染細胞や腫瘍細胞の破壊 ·除去作用等を示す剤として有 効である。 The agent for inducing interferon-γ production (enhancing production) in the present invention is an agent for increasing the concentration of interferon-γ (IFN-γ) in blood or / and in living tissue. IFN-γ is an HLA protein involved in surface antigen presentation recognized by immune cells. Ras I antigen, HLA class II antigen,] 32_ Microglobulin, TAP, LMP, etc., induces antigen-specific activation of cytotoxic T lymphocytes (CTL), expression of immunoglobulin Fc receptor It has the effect of activating antigen-specific acquired immunity by effector cells by induction, activating NK cells, and activating macula phage. Therefore, this agent is effective as an agent showing a killing action against intracellular parasite microorganisms such as intracellular parasite bacteria, fungi and protozoa, and a destruction / elimination action of virus-infected cells and tumor cells.
本発明における式 (1 ) で表される化合物またはその塩は、 体内半減期が短く体 内蓄積性もなく、 インターフェロンとの組み合わせにより、 HCVに対するインター フエロンの抗ウィルス作用を増強するため、 動物とりわけ哺乳動物に対するウィル ス性肝炎または癌疾患の治療剤として有用である。 更に、 本発明における式 (1 ) で表される化合物またはその塩は、 免疫応答を増強する作用を有するため、 免疫活 性化剤として有用である。 The compound represented by the formula (1) or a salt thereof according to the present invention has a short half-life in the body, does not accumulate in the body, and enhances the antiviral effect of interferon on HCV by combination with interferon. It is useful as a therapeutic agent for viral hepatitis or cancer disease in mammals. Furthermore, the compound represented by the formula (1) or a salt thereof according to the present invention has an action of enhancing an immune response, and thus is useful as an immunoactivating agent.
一般式 (1 ) で表される化合物またはその塩は、 そのままもしくは自体公知の薬 学的に許容される担体 (賦形剤、 増量剤、 結合剤、 滑沢剤などが含まれる)、 †貫用の 添加剤などと混合した医薬組成物あるいは製剤 (例えば、 粉末、 顆粒、 錠剤、 ピル 剤、 カプセル剤、 散剤、 シロップ剤、 注射剤、 点滴剤、 外用剤、 坐剤、 ェマルジョ ン剤、 エンキシル剤)として調製し、 用いることができる。 実施例 The compound represented by the general formula (1) or a salt thereof may be used as it is or as a pharmaceutically acceptable carrier known per se (including excipients, bulking agents, binders, lubricants, etc.), Pharmaceutical compositions or formulations (e.g., powders, granules, tablets, pills, capsules, powders, syrups, injections, drops, topical preparations, suppositories, emulsions, enxyls) Agent) can be used. Example
次に、 本究明を実施例により更に具体的に説明する。 し力 し、 本発明はこれらの 実施例になんら限定されるものではない。 Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
実施例 1 Example 1
ミゾリビンの免疫調節作用の解析 Analysis of immunomodulatory effect of mizoribine
マウス (日本チヤ一ルス . リバ一社) から脾細胞を調製し、 培養液にミゾリビン Prepare spleen cells from a mouse (Nippon Charl. Riva Co.) and add mizoribine to the culture solution.
(Sigma社)を添加することによって刺激を加え、 48時間培養後、 培養上清中のサイ トカインを ELISA法により測定した。 コント口ールとしてリバビリン (Sigma社)刺激 を同様に行った。 実験の手法 '手順は、 Tam等の方法に準じて行った (Antimicrob. Agent. Cherao. 2000; 44: 1276-1283) 。
( 1 ) マウス脾細胞の調製 (Sigma) was added for stimulation, and after culturing for 48 hours, cytokines in the culture supernatant were measured by ELISA. Ribavirin (Sigma) stimulation was performed in the same manner as a control. Experimental Method The procedure was performed according to the method of Tam et al. (Antimicrob. Agent. Cherao. 2000; 44: 1276-1283). (1) Preparation of mouse splenocytes
脾細胞は無感作マウスから調製した。 マウス脾臓を摘出し、 5 mlの RPMI 1640培 地の入った 60匪シャーレに移し、 スライドガラスのブロスト部分にて擦り壊した 後、 セルストレイナー(FALCON 70 μιτι Nylon)を通して 50 ml遠沈管に回収した。 Splenocytes were prepared from naive mice. The mouse spleen was removed, transferred to a 60-ml petri dish containing 5 ml of RPMI 1640 medium, crushed with the blasted part of a slide glass, and collected in a 50 ml centrifuge tube through a cell strainer (FALCON 70 μιτι Nylon). .
1, 200 rpras 5分間遠心し、 細胞を回収した。 脾細胞のぺレットには溶血用 ACKバッ ファー (0. 15M NH4C1, ΙΟηιΜ KHC03, 0. IraM EDTA, pH7. 2 ― 7. 4) を加え、 室温、 5分間 静匱した後、 20 mlの培地を加え、 セルストレイナーを通して 50 ml遠沈管に回収し た。 1, 200 and centrifuged RPRA s 5 min, cells were collected. ACK buffer for hemolysis in pellets of splenocytes (0. 15M NH 4 C1, ΙΟηιΜ KHC0 3, 0. IraM EDTA, pH7 2 -. 7. 4) was added and after Shizu匱room temperature, 5 minutes, 20 ml of the medium was added, and collected in a 50 ml centrifuge tube through a cell strainer.
( 2 ) スーパー抗原による刺激 (2) Stimulation by superantigen
培養上清にはスーパー抗原である staphylococcal enterotoxin B (SEB ; Toxin technology社)を 400 pg/mlの濃度で添加した。 SEB 1 mgに PBSを 2. 5 ral添加後、 0. 2 μπιのフィルターを用いて濾過滅菌し、 400 ng/mlの濃縮液を調製した。 この溶液 0. 1 mlに 100 ml RPMI 1640培地 (1 % L-glutaraine, 10% Penicil lin- Streptomycin, 10% FCS)を添加して、 脾臓由来細胞ペレツトを 10 ml培地で 2回、 1, 200 rpm、 5分、 4°Cの遠心洗浄後、 SEB を含む RPMI 1640培地 5 mlに懸濁後、 細胞数を測定し、 2 X 106個/ mlになるように SEB を含む RPMI培地に懸濁して、 24 wellプレートに 1 mlず つ添加した。 Staphylococcal enterotoxin B (SEB; Toxin technology), a superantigen, was added to the culture supernatant at a concentration of 400 pg / ml. After adding 2.5 ral of PBS to 1 mg of SEB, the solution was sterilized by filtration using a 0.2 μπι filter to prepare a concentrated solution of 400 ng / ml. To 0.1 ml of this solution, 100 ml RPMI 1640 medium (1% L-glutaraine, 10% Penicil lin-Streptomycin, 10% FCS) was added, and the spleen-derived cell pellet was washed twice with 10 ml medium for 1,200 minutes. rpm, 5 minutes, after centrifugation washing 4 ° C, were suspended in RPMI 1640 5 ml of medium containing SEB, cell number determined, suspended in RPMI medium containing SEB to be 2 X 10 6 cells / ml The solution became turbid and 1 ml was added to a 24-well plate.
( 3 ) ミゾリビンによる免疫応答の検討 (3) Examination of immune response by mizoribine
各ゥエルに 1 raMミゾリビン溶液を培地に直接添加して 37°Cで 48時間培養後、 培養 上清中の IFN- γを測定した。 なお、 ミゾリビン刺激濃度は 0, 1, 2, 5, 10, 15, 20 μΜで行つた。 ミゾリビン(分子量 259. 2)は 10. 368 mgを PBS 400 μΐに溶解後、 リノ ビリン(分子量 244. 2)は 12. 21 mgを PBS 500 μΐに溶解後、 0. 2 μιηフィルターで濾過 滅菌後、 100 mM溶液とし、 PBSにより 10倍または 100倍に希釈して、 実験に供された ( 4 ) IFN- T/の測定 To each well, 1 raM mizoribine solution was directly added to the medium, and the cells were cultured at 37 ° C for 48 hours, and then IFN-γ in the culture supernatant was measured. The mizoribine stimulation concentration was 0, 1, 2, 5, 10, 15, 20 μΜ. Dissolve 10.368 mg of mizoribine (molecular weight 259.2) in 400 μ PBS of PBS, dissolve 12.21 mg of linobilin (molecular weight 244.2) in 500 μΐ of PBS, and filter with a 0.2 μιη filter. , 100 mM solution, diluted 10 times or 100 times with PBS, and used for experiments (4) Measurement of IFN-T /
IFN- γは培養上清を 10 μΐ用い、 Genztme/Techne社の AN'ALYZA (登録商標) For IFN-γ, use 10 μΐ of the culture supernatant, and use Genztme / Techne's AN'ALYZA (registered trademark).
Immunoassay system mouse IFN- γ kitにより測定した。 吸光度の測定は、 マイク 口プレートリーダー(BioRad、 モデル 3550 UV)を用いて 450 nmの吸光度をエンドポ イント法で測定した。 SoftMax (Molecular Device)を用いて 4- Parameterの回帰を
行い、 濃度を算出した。 測定結果を図 1に示した。 The measurement was performed using an Immunoassay system mouse IFN-γ kit. The absorbance was measured at 450 nm by an endpoint method using a microplate reader (BioRad, model 3550 UV). Perform 4-parameter regression using SoftMax (Molecular Device) The concentration was calculated. Fig. 1 shows the measurement results.
図 1の結果により、 インターフェロン一 γの誘導作用は、 1 μΜ力、ら 8 μΜのミゾ リビン濃度が適することが判明した。 この濃度は、 およそ 0. 25 g/ralから 2 |ig/ml に相当し、 体内動態に関する文献 (リゥマチ科 1991; 5: 287-300) に従えば、 1回 投与量は 50 mgから 100 mgで良い。 文献に記載されたミゾリビンの体内動態を図 2 に示した。 図 2に示される通り、 ミゾリビンの消失速度は速く (Τ1/2 = 2· 2時間) 、 薬剤蓄積性は認められない。 反復投与を行っても、 薬剤に対する反応性は維持され る。 また、 薬剤の蓄積性がないため、 投与回数は、 1日 1回から 3回でよい。 From the results shown in FIG. 1, it was found that the interferon-γ-inducing action was suitable at a 1 μΜ concentration and a mizoribine concentration of 8 μΜ. This concentration corresponds to approximately 0.25 g / ral to 2 | ig / ml, and according to the literature on pharmacokinetics (Rheumatology 1991; 5: 287-300), a single dose is 50 mg to 100 mg. Is good. Figure 2 shows the pharmacokinetics of mizoribine described in the literature. As shown in Fig. 2, mizoribine disappears at a high rate (Τ 1/2 = 2.2 hours), and no drug accumulation is observed. Repeated doses maintain drug responsiveness. In addition, since there is no accumulation of the drug, the frequency of administration may be once to three times a day.
インターフェロン一 α / ]3は、 抗ウィルス作用の他に、 T h 1細胞に対する分化 促進、 抗原特異的細胞傷害活性を持つ C D 8 + T細胞の増殖誘導、 N K細胞の分化 促進、 表面抗原提示分子の発現の促進等、 様々な免疫調節活性を有している。 ミゾ リビンや SM- 108による細胞性免疫活性化作用は、 ィンターフェロン一 α / ]3との併 用で C型慢性肝炎治療に有効であるばかりでなく、 本用量をもって癌細胞の排除に も有効であることが示された。 In addition to its antiviral effect, interferon-1 α /] 3 promotes differentiation of Th1 cells, induces proliferation of CD8 + T cells with antigen-specific cytotoxicity, promotes differentiation of NK cells, surface antigen presenting molecule It has various immunomodulatory activities, such as promotion of expression of. The cell-mediated immunity-activating effect of mizoribine and SM-108 is not only effective for the treatment of chronic hepatitis C in combination with interferon-α /] 3, but also at the same dose to eliminate cancer cells. It was shown to be effective.
実施例 2 Example 2
天然型ィンターフェロン一 αによる HCVレプリコン細胞に対する作用 Effects of natural interferon-α on HCV replicon cells
高用量のインターフェロン一 Q7 J3の存在化では、 併用薬剤添加による抗ウィル ス作用の増強を検討することは困難である。 そこで、 HCVレブリコン由来 R A量をお よそ 10 %にまで減少させる至適濃度を検討した。 In the presence of high doses of interferon-Q7 J3, it is difficult to examine the enhancement of antiviral activity by adding concomitant drugs. Therefore, the optimal concentration for reducing the amount of HCV-rebricon-derived RA to about 10% was examined.
( 1 ) HCVレプリコン細胞の構築及び培養 (1) Construction and culture of HCV replicon cells
HCVレプリコンの構築、 培養細胞 (Huh- 7) への導入、 株化細胞 (#50-1) の樹立 、 細胞培養に関しては、 文献に従った (Biochem. Biophys. Res. Comm. 2002; 293: 993-999、 J. Virol. 2001; 75: 1437-1449) 。 The construction of HCV replicon, introduction into cultured cells (Huh-7), establishment of established cells (# 50-1), and cell culture were performed according to the literature (Biochem. Biophys. Res. Comm. 2002; 293: 993-999, J. Virol. 2001; 75: 1437-1449).
( 2 ) 天然型インターフェロン一 による HCVレプリコン由来 RNAの残存量の検討 細胞培養は 1 2穴プレートの各ゥエルに 2〜3 x 104細胞となるように #50- 1細胞を 用意した。 30、 100、 300、 1000、 3000、 10000 IU/mlの天然型インターフェロン一 a (スミフエロン; HLBI:住友製薬) 溶液を作り、 1ゥェル ( 1 ml) あたり ΙΟ μΙ ずつ加えて、 0. 3、 1、 3、 10、 30、 100 IU/mlとした。 (2) Examination of residual amount of HCV replicon-derived RNA by natural interferon # 1 For cell culture, # 50-1 cells were prepared so that 2-3 × 10 4 cells were contained in each well of a 12-well plate. Make a solution of 30, 100, 300, 1000, 3000, 10000 IU / ml of natural interferon-a (Smiferon; HLBI: Sumitomo Pharmaceutical), add ΙΟμΙ per 1 ml (1 ml), and add 0.3, 1 , 3, 10, 30, and 100 IU / ml.
1週間培養後、 細胞を回収し、 セパゾール RNA 1 Super (ナカライテスク社) を
用い、 説明書通りの方法で RNA抽出を行った。 RNAの定量は、 分光光度計で測定し、 濃度を 50 ng/μΐになるように調製した。 After culturing for one week, the cells are collected and separated with Sepasol RNA 1 Super (Nacalai Tesque, Inc.). RNA was extracted according to the instructions. RNA was quantified using a spectrophotometer and adjusted to a concentration of 50 ng / μΐ.
( 3 ) リアルタイム P C Rによる HCVレプリコン由来 RNAの測定 (3) Measurement of RNA derived from HCV replicon by real-time PCR
機器は PE Applied Biosystems社のもの (7700 Sequence Detector) を使用した 。 リアルタイム P C Rの反応条件は文献 (Biochem. Biophys. Res. Comm. 2002; The instrument used was PE Applied Biosystems (7700 Sequence Detector). Reaction conditions for real-time PCR are described in the literature (Biochem. Biophys. Res. Comm. 2002;
293 : 993-999) に従い、 上記 RNA 2 μΐずつをテンプレートにした。 用いたプライマ 一配列のうち、 レプリコン RNAの 130〜146番目の塩基を forward primerとし、 レプ リコン RNAの 290- 272番目の塩基を revers primerとして用いた。 293: 993-999), 2 μΐ each of the above RNA was used as a template. Of the primer sequences used, bases 130 to 146 of the replicon RNA were used as forward primers, and bases 290 to 272 of the replicon RNA were used as revers primers.
また、 TaqManでの検出用に標識されたプローブとして、 レプリコン RNAの 148 - 168 番目の塩基からなるオリゴヌクレオチド (DNA) を TaqMan Kit (口シュ社)で標識し た。 用いたプライマー及びプローブは、 Forward primerは酉 S列番号 1、 Reverse primerは配列番号 2、 Probeは配列番号 3に示す塩基配列である。 In addition, as a probe labeled for detection with TaqMan, an oligonucleotide (DNA) consisting of bases 148 to 168 of the replicon RNA was labeled with TaqMan Kit (Kuchisha). The primers and probes used were the base sequence shown in Seq. ID No. 1 for the forward primer, SEQ ID NO. 2 for the reverse primer, and SEQ ID NO. 3 for the Probe.
リアルタイム P C Rによる測定はサンプル毎に 2回行い、 その平均値を求めた。 平均の測定値と測定結果を図 3に示した。 HCVレプリコン由来 R Aの残存量が 10%程 度となる、 即ち、 3 IU/mlの HLBI濃度が併用薬剤の評価に適切と考えられた。 The measurement by real-time PCR was performed twice for each sample, and the average value was obtained. Figure 3 shows the average measured values and the measurement results. The residual amount of RA derived from HCV replicon was about 10%, that is, an HLBI concentration of 3 IU / ml was considered to be appropriate for the evaluation of concomitant drugs.
( 4 ) インターフェロン一 存在下での併用薬剤の抗ウイルス作用 (4) Antiviral effect of concomitant drug in the presence of interferon
リバビリン、 ミゾリビン、 SM- 108の各々を P B Sに溶かし、 0. 5、 1、 2、 5、 10 mM溶液を作製し、 2 x l04細胞/ wellとした 2 4穴プレートの各ゥエルに 10 μΐずつ薬 剤を添加し、 最終的に 0, 5, 10, 20 μΜとした。 また、 HLBIの添加量は 0、 3 IU/ml となるように添加した。 実施例 2と同様に培養 1週間後、 リアルタイム P C R法に より残存 HCVレプリコン由来 RNA量を測定した。 リバビリン及びミゾリビンの HLBI併 用における実験は各々 2回、 SM-108の HLBI併用における実験は 1回行い、 各併用実 験の測定結果を 1例ずつ、 図 4、 図 5、 及び図 6に示した。 Ribavirin, mizoribine, SM- 108 dissolved each in PBS of, 0. 5, 1, 2, 5, 10 mM solution was prepared, 10 to 2 x l0 4 each Ueru cells / well and the 2 4 well plates μΐ Drugs were added in increments of 0, 5, 10, 20, and 20 µl. HLBI was added so that the addition amount was 0, 3 IU / ml. One week after culturing in the same manner as in Example 2, the amount of residual HCV replicon-derived RNA was measured by real-time PCR. Experiments with ribavirin and mizoribine in combination with HLBI were performed twice each, and experiments with SM-108 in combination with HLBI were performed once.The measurement results for each combination experiment are shown in Figs. 4, 5, and 6, respectively. Was.
本結果によれば、 3 IU/ml HLBI存在下で 5 μΜ前後の比較的低用量の薬剤添加にお いて、 何れの薬剤でも一過的な HCVレプリコン由来 RNAの減少が観察された。 RNA消 失率は、 リバビリン併用で 18〜35%、 ミゾリビン併用で 53〜61%、 SM- 108併用で 59 %と、 インターフェロンとミゾリビンあるいは SM - 108との併用はリバビリンとの併 用より上回っていた。 従って、 薬剤の血中濃度が 5 μΜの場合、 ミゾリビンあるいは SM- 108併用投与における HCVに対する作用は、 リバビリン併用投与に劣らず、 また
、 リバビリンの C型慢性肝炎の血中濃度が 10 μΜを超えていることから、 慢性 C型 肝炎におけるインターフエ口ンの併用薬剤として、 ミゾリビン及ぴ SM- 108はリバビ リンより有用であると判断された。 According to these results, a transient decrease in HCV replicon-derived RNA was observed for all drugs when a relatively low dose of about 5 μ 添加 was added in the presence of 3 IU / ml HLBI. The RNA loss rate was 18-35% with ribavirin, 53-61% with mizoribine, and 59% with SM-108.The combination of interferon with mizoribine or SM-108 was higher than that with ribavirin. Was. Therefore, when the blood concentration of the drug is 5 μΜ, the effect on HCV in the combination administration of mizoribine or SM-108 is not less than that in the combination administration of ribavirin, and Since the blood concentration of ribavirin in chronic hepatitis C exceeds 10 μΜ, it is concluded that mizoribine and SM-108 are more useful than ribavirin as a concomitant drug with interferon in chronic hepatitis C. Was done.
( 5 ) ノーザンブロット解析によるインターフェロン一 a存在化での併用薬剤の抗 ウィルス作用の検討 (5) Northern blot analysis of antiviral effects of concomitant drugs in the presence of interferon-a
細胞培養は 6穴プレートの各ゥエルに I x lO5細胞となるように #50- 1細胞を用意 した。 3 IU/mlの HLBIとリバビリン、 ミゾリビン、 SM- 108の各々を添カ卩し、 最終的 に 0, 1, 3, 5, 10, 20 μΜとした。 1週間培養後、 細胞を回収し、 セパゾール RNA 1 Superを用い、 RNA抽出を行った。 得られた RNAは分光光度計で定量され、 MOPS bufferを用いた 1%ァガロースゲル電気泳動に供した。 常法に従って、 メンプレンフ ィルターに RNAをトランスファーし、 HCVレプリコンを含むプラスミドから得られた DNA断片及び Glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (G3PDH)遺伝子の DNA断片 を用いてプローブを作製し、 ハイプリダイゼーシヨンを行った。 For cell culture, # 50-1 cells were prepared in each well of a 6-well plate so that I x lO 5 cells were obtained. HLBI at 3 IU / ml, ribavirin, mizoribine, and SM-108 were each added to the mixture to obtain 0, 1, 3, 5, 10, 20, and 20 μ 20. After culturing for one week, the cells were collected, and RNA extraction was performed using Sepasol RNA 1 Super. The obtained RNA was quantified with a spectrophotometer and subjected to 1% agarose gel electrophoresis using MOPS buffer. According to a conventional method, RNA is transferred to a membrane filter, a probe is prepared using a DNA fragment obtained from a plasmid containing an HCV replicon and a DNA fragment of a Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) gene, and hybridization is performed. Was.
プローブ作製の具体的な方法として、 HCVゲノムが組み込まれ、 制限酵素 EcoT22I で切断されたプラスミド pNNRz2 DNA (Biochera. Biophys. Res. Comm. 2002; 293: 993-999) を錄型として、 プライマー XN7-4R (配列番号 4 ) と32 P-dCTPを用いて、 1本鎖 DNAプローブ (NS5B上流の約 300bp) を作製すればよレ、。 用いたプローブを配 列番号 5に示す。 As a specific method for preparing a probe, the plasmid pNNRz2 DNA (Biochera. Biophys. Res. Comm. 2002; 293: 993-999) into which the HCV genome was integrated and digested with the restriction enzyme EcoT22I was used as a primer type XN7- A single-stranded DNA probe (about 300 bp upstream of NS5B) can be prepared using 4R (SEQ ID NO: 4) and 32 P-dCTP. The probe used is shown in SEQ ID NO: 5.
また、 G3PDH遺伝子を検出するプローブは、 プライマー GAPDH S (配列番号 6 ) とプライマー GAPDH R (配列番号 7 ) を用いて増幅された約 250bpの PCR断片を、 ラ ンダムプライマー法を用いて32 P- dCTPで標識すれば良い。 上記何れかのプローブを 含む ULTRAhyb溶液 (Ambion社) を用いて、 42°Cでー晚加温し、 ハイプリダイゼーシ ヨンを行い、 フィルターを洗浄後、 バイオイメージングアナライザー BAS-5000 (富 士フィルム社) で解析を行った。 In addition, a probe for detecting the G3PDH gene was prepared by using a PCR primer of about 250 bp amplified using primers GAPDH S (SEQ ID NO: 6) and GAPDH R (SEQ ID NO: 7) to 32 P- Label with dCTP. Using an ULTRAhyb solution (Ambion) containing one of the above probes, heat at -42 ° C, perform hybridization, wash the filter, and use the bio-imaging analyzer BAS-5000 (Fujifilm). The analysis was performed by.
HLBI存在下でリバビリン、 ミゾリビン、 SM- 108を添カ卩した場合の、 ァガロースゲ ルによる電気泳動のパターン、 HCV及び G3PDHをプローブとしてハイブリダィゼーシ ヨンを行った結果を、 各々図 8、 図 9、 図 1 0に示した。 また、 検出されたバンド の強度をデンシトメ一ターで測定し、 恒常的に発現する G3PDH遺伝子の発現を基準 にして、 レブリコン RNAの残存量を数値化した結果を、 リバビリンは表 1と図 1 1
、 ミゾリビンは表 2と図 1 2、 SM - 108は表 3と図 1 3に示した。 表 2、 表 3、 図 1 2及び図 1 3に示されるように、 低用量のミゾリビンと SM - 108は共に、 3 IU/mlの インターフェロン一 α存在下で、 レプリコン RNAを相乗的に減少させることが確認 できた。 Figure 8 shows the electrophoresis pattern of agarose gel when ribavirin, mizoribine and SM-108 were added in the presence of HLBI, and the results of hybridization using HCV and G3PDH as probes. 9, shown in Figure 10. The intensity of the detected band was measured with a densitometer, and the remaining amount of replicon RNA was quantified based on the expression of the constantly expressed G3PDH gene. Mizoribine is shown in Table 2 and Figure 12, and SM-108 is shown in Table 3 and Figure 13. As shown in Table 2, Table 3, Figures 12 and 13, both low doses of mizoribine and SM-108 synergistically reduce replicon RNA in the presence of 3 IU / ml of interferon-α. This was confirmed.
表 2 Table 2
表 3 Table 3
天然型インターフェロン一 αであるスミフエロン (HLBI;住友製薬) を 3〜6 MIU 投与した場合、 投与 6〜7時間後に血中 Cmaxがおよそ 50〜80 IU/mlとなり、 投与 2日後に数 IU/mlにまで低下する。 本発明では、 3 IU/mlの HLBI存在下で有用性が見 出せたが、 高用量ィンターフェロン一 α投与でも併用薬剤の相乗効果が付与される と考えられた。
ミゾリビンの場合、 おおよそ 10 μΜ (約 2. 5 μg/ml) 以下の血中濃度を達成でき れば、 インターフェロンの抗ウィルス作用を増強すると思われた。 図 2に従えば、 1回投与量は 50 tngから 100 mgでよく、 その投与量は、 免疫活性化が期待される血 中濃度 (1〜8 μΜ) と一致した。 SM- 108の場合も、 血中濃度は 10 μΜ以下で、 スミ フエロンの抗ウィルス作用を増強すると考えられた。 また、 ミゾリビンの免疫活性 化と抗ウィルス作用の増強がほぼ同じ濃度で達成されていることから、 ミゾリビン 一 1ーリン酸のプロドラッグである SM- 108の免疫活性化が期待される血中濃度も、 10 μΜ以下と判断された。 When the natural interferon-α, Sumiferon (HLBI; Sumitomo Pharmaceutical) is administered at 3 to 6 MIU, the blood Cmax becomes approximately 50 to 80 IU / ml 6 to 7 hours after administration, and several IU / ml 2 days after administration. To fall. In the present invention, although usefulness was found in the presence of HLBI at 3 IU / ml, it was considered that the synergistic effect of the concomitant drug was imparted even by administration of high-dose interferon-α. In the case of mizoribine, achieving a blood concentration of approximately 10 μΜ (approximately 2.5 μg / ml) or less would enhance the antiviral effect of interferon. According to FIG. 2, the single dose may range from 50 tng to 100 mg, and the dose was consistent with the blood concentration (1-8 μΜ) at which immune activation was expected. In the case of SM-108, too, the blood concentration was 10 μΜ or less, which was considered to enhance the antiviral effect of Sumiferon. In addition, since the activation of mizoribine immune activity and the enhancement of antiviral effect were achieved at almost the same concentration, the blood concentration at which immunostimulation of SM-108, a prodrug of mizoribine monophosphate, is expected to increase. , Was determined to be 10 μΜ or less.
また、 癌治療においても、 本用量をもって癌細胞の排除に有効と考えられた。 Also, in cancer treatment, this dose was considered to be effective in eliminating cancer cells.
今回の検討で示されたミゾリビンの投与量は、 臨床的に重篤な副作用が出現しな いことが確認されている用量であり、 リバビリン投与で問題となっている溶血性貧 血は生じないと考えられた。 The dose of mizoribine shown in this study is a dose that has been confirmed to have no clinically significant side effects, and does not cause the hemolytic anemia that is problematic with ribavirin administration It was considered.
また、 SM- 108の場合、 1日あたり 400 rag/ra2 (約 520 rag) 投与でヘモグロビン値が 若干下がる程度である。 SM- 108の血中濃度が 10 μΜ以下となる投与量は、 およそ 20 mg/m2〜60 mg/ra2になると考えられ (癌の臨床: 1985; 31: 757 - 766) 、 この値は、 1 回投与量として、 およそ 26 mgから 78 mgに相当するため、 溶血性貧血は発生しない と判断された。 In the case of SM-108, the administration of 400 rag / ra 2 (about 520 rag) per day slightly reduced the hemoglobin level. The dose at which the blood concentration of SM-108 is less than 10 μΜ is considered to be approximately 20 mg / m 2 to 60 mg / ra 2 (clinical cancer: 1985; 31: 757-766). Since this corresponds to a single dose of approximately 26 to 78 mg, it was determined that hemolytic anemia would not occur.
投与量は、 患者の年齢、 性別、 体重、 排泄速度等の要因の影響を受けることも考 慮しなければならない。 SM-108の場合、 高投与量では血中の濃度持続時間が長くな る傾向にあることが示されているが (癌の臨床: 1985; 31: 757- 766) 、 高投与量 であっても、 1日後には血中から排除されることが予想される。 そのため高用量の SM-108投与は、 ィンターフェロンとの併用で相乗効果が生み出される濃度範囲を長 時間にわたって維持することができると考えられる。 The dose should also be considered to be influenced by factors such as the patient's age, gender, weight, and excretion rate. In the case of SM-108, it has been shown that the blood concentration tends to be longer at higher doses (clinical cancer: 1985; 31: 757-766). It is expected that they will be eliminated from the blood one day later. Therefore, administration of high doses of SM-108 may maintain the concentration range in which synergistic effects can be produced in combination with interferon over a long period of time.
従って、 インターフェロンと併用する SM- 108は高用量でも有効であり、 SM- 108を 高用量投与する場合は、 1日 1回投与あるいは隔日投与等でも可能であると考えら れる。 ミゾリビンについても同様であると考えられる。 そのため、 投与量は、 副作 用を惹起する濃度以下の有効濃度であればよく、 100 mg以上であってもよい。 Therefore, SM-108 used in combination with interferon is effective even at a high dose, and it is considered that high dose SM-108 can be administered once a day or every other day. It is thought that the same applies to mizoribine. Therefore, the dose may be any effective concentration that is lower than the concentration that induces side effects, and may be 100 mg or more.
実施例 3 Example 3
ゥシウィルス性下痢ウィルス (BVDV : Bovine Viral Diarrhea Virus) に対する
殖抑制効果 ゥ Against Civil Virus Diarrhea Virus (BVDV: Bovine Viral Diarrhea Virus) Multiplication control effect
インターフェロンと併用薬のゥシウィルス性下痢ウィルス (BVDV: Bovine Viral Diarrhea Virus) に対する増殖抑制効果を検討した。 We investigated the effect of interferon and concomitant drugs on the growth inhibition of bovine viral diarrhea virus (BVDV).
96- well plateにゥシ腎細胞 (MDBK: Madin-Darby Bovine Kidney細胞, 大日本製 薬より購入) を 8xl03 cells/Veilで播種し、 37°C, 5% C02存在下で 24時間培養した 。 培地 (10% FBS (抗 BVDV抗体陰性) 含有 Ham's F - 12培地) を除き、 新しい培地 0. 1 m 1 /wellで細胞を洗浄後、 同培地で希釈した BVDVウィルス (BVDV KS- WS株、 住 友製薬にて調製) 液 0. 1 m l /wellを接種し、 37°C, 5% C02存在下で 2時間培養した 。 培地で希釈したスミフエロン (住友製薬, Lot. F-018) 、 ミゾリビン (SIGMA社製 , Lot. 047H4087) および SM- 108 (住友製薬, Lot. 030219) 、 あるいはスミフエロン に代えてィントロン A (シェリング .プラゥ、 Lot. B307E) 、 アドパフェロン (山 之内製薬、 Lot. L008Y01) 、 ぺガシス (ロシュ、 Lot. K0013Yl) 、 を 0. 05 m 1 /well ずつで添加し、 37°C, 5% C02存在下で 4日間培養した。 96-well plate in © Shi kidney cells: (MDBK Madin-Darby Bovine Kidney cells, manufactured by Dainippon agents purchased from) were seeded at 8xl0 3 cells / Veil, 37 ° C, 5% C0 24 hours at 2 presence did . Except for the medium (Ham's F-12 medium containing 10% FBS (anti-BVDV antibody negative)), wash the cells with 0.1 ml / well of new medium, and then dilute the BVDV virus (BVDV KS-WS strain, inoculated with Sumitomo Pharma at preparation) was 0. 1 ml / well, incubated for 2 hours at 37 ° C, 5% C0 2 presence. Sumiphelon (Sumitomo Pharmaceutical, Lot. F-018), Mizoribine (SIGMA, Lot. 047H4087) and SM-108 (Sumitomo Pharmaceutical, Lot. , Lot. B307E), Adopaferon (inner pharmaceutical Noriyuki mountains, Lot. L008Y01), Bae Gashisu (Roche, Lot. K0013Yl), was added portionwise to 0. 05 m 1 / well, 37 ° C, 5% C0 2 Cultured for 4 days in the presence.
培地を除去して同培地 0. 1 ral/wellで細胞を洗浄し、 新しい培地を添加後、 ァラ マーブル一 (和光純薬, Lot. 141937SA) を添カ卩した。 37°C, 5% C02存在下で 4時間 培養した後、 蛍光光度計 (フルォロスキャンアセント Type374 : Labsystems社製 ) を用いて蛍光強度 (;i ex=544 nm, λ em=590 nm) を測定した。 After removing the medium, the cells were washed with the same medium at 0.1 ral / well. After adding a new medium, the cells were added with Alla Marble I (Wako Pure Chemical, Lot. 141937SA). 37 ° C, 5% C0 2 was cultured for 4 hours in the presence, fluorometer (Full O b Scan Ascent Type374: Labsystems, Inc.) fluorescence intensity using a (; i ex = 544 nm, λ em = 590 nm) Was measured.
BVDVウィルスが細胞内で増殖すると感染細胞の増殖の程度は低くなる。 そのため 、 抗 BVDV活性の指標として、 薬剤と BVDVウィルスを添加した被験細胞の細胞増殖の 程度を、 BVDVウィルスを添加していないコントロール細胞の増殖を対照として求め た。 As the BVDV virus grows in cells, the extent of growth of infected cells is reduced. Therefore, as an index of the anti-BVDV activity, the degree of cell growth of the test cells to which the drug and the BVDV virus were added was determined using the control cells without the BVDV virus as a control.
実験結果を図 1 4およぴ図 1 5に示した。 図 1 4に示すように、 ミゾリビンまた は SM- 108が薬剤単独では低い抗 BVDV活性しか示さない濃度において、 スミフエロン と併用すると、 スミフエロン単独の活性に比べて 2倍以上の抗 BVDV活性の増強が認 められ、 スミフエロンはミゾリビンあるいは SM-108との組み合わせで強い併用効果 を示すことが判明した。 また図 1 5に示すように、 この併用効果はスミフエロンだ けではなく、他の組換え型ィンターフェロン一αであるイントロン Aあるいはァド バフエロンにおいても認められた。 The experimental results are shown in FIGS. 14 and 15. As shown in Figure 14, at the concentration at which mizoribine or SM-108 shows only low anti-BVDV activity with the drug alone, when used in combination with sumiferon, the activity of anti-BVDV activity is more than doubled compared to the activity of sumiferone alone. Sumiferon was found to show a strong combination effect when combined with mizoribine or SM-108. In addition, as shown in FIG. 15, this combined effect was observed not only with Sumiferon, but also with other recombinant interferon-α, Intron A or Advbhaferon.
これらの結果から、 このようなミゾリビンあるいは SM-108とインターフェロンと
の併用効果は、 スミフエロンに限らず、 現在 C型肝炎治療に用いられている他のィ ンターフェロンでも認められることが確認できた。 産業上の利用可能性 These results indicate that mizoribine or SM-108 and interferon It was confirmed that the combined effect of is also not only limited to Sumiferon but also to other interferons currently used for the treatment of hepatitis C. Industrial applicability
本発明によれば、 ゥィルス性肝炎または癌疾患に対するインターフェロンとの併 用剤が提供される。 本剤は体内蓄積性がなく、 細胞性免疫をより活性化し、 インタ 一フエロンと併用することにより相乗効果を示すという特徴を有する。 そのため特 に、 インターフェロン等が有効とされる c型肝炎、 慢性骨髄性白血病、 多楽性骨髄 腫、 骨髄異形 症候群、 真性多血症、 非ホジキン悪性リンパ腫、 肝細胞癌、 胃癌、 表在性膀胱癌、 膝臓癌、 腎細胞癌、 前立腺癌、 食道癌にとって、 非常に有効な併用 療剤となり得る。 配列表フリーテキスト According to the present invention, a concomitant drug with interferon for diarrhea hepatitis or cancer disease is provided. This drug has no accumulation in the body, activates cell-mediated immunity, and has a synergistic effect when used in combination with interferon. Hepatitis c, chronic myelogenous leukemia, polymyeloma myeloma, myelodysplastic syndrome, polycythemia vera, non-Hodgkin's malignant lymphoma, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, superficial bladder, for which interferon is effective It can be a very effective combination for cancer, knee, renal cell, prostate and esophageal cancer. Sequence listing free text
配列番号 1に記載の塩基配列は Forward primerである。 The base sequence described in SEQ ID NO: 1 is a forward primer.
配列番号 2に記載の塩基酉己列は Reverse priraerである。 The base sequence described in SEQ ID NO: 2 is Reverse priraer.
配列番号 3に記載の塩基配列は Probeである。 The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is Probe.
配列番号 4に記載の塩基配列はプライマー XN7- 4Rである。 The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is primer XN7-4R.
配列番号 5に記載の塩基配列は Probeである。 The base sequence described in SEQ ID NO: 5 is Probe.
配列番号 6に記載の塩基配列はプライマー GAPDH Sである c The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 is a primer GAPDH S c
配列番号 7に記載の塩基配列はプライマー GAPDH Rである t
The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 is a primer GAPDH R t