WO2004082713A1 - Uso de inmunoglobulinas procedentes de yema de huevo para el tratamiento de infecciones causadas por parásitos tanto en animales como en el humano - Google Patents

Uso de inmunoglobulinas procedentes de yema de huevo para el tratamiento de infecciones causadas por parásitos tanto en animales como en el humano Download PDF

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Eduardo Lucio Decanini
José Andrés MORALES GARZON
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Investigación Aplicada, S.A. De C.V.
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    • C07K2317/23—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from birds

Definitions

  • the present invention consists in providing a new method of treatment and prevention of infections caused by parasites in animals (poultry, pigs, cattle and small species) or in man based on oral or parenteral administration of immunoglobulins obtained from egg yolk from hyperimmunized hens with these parasites.
  • the second form of protection also called passive immunity involves the transmission of specific antibodies against infectious agents to a host.
  • antibodies are made mainly in mammals and less frequently in birds.
  • the types of antibodies that are made are monoclonal and polyclonal in mammals and polyclonal in birds (Larsson, et al. 1993).
  • chicken In the case of birds, chicken is the only species from which antibodies are obtained in a more accessible and highly defined way.
  • the main serum antibody present in the chicken is IgG although IgG is transported to the egg in a manner similar to the transfer of mammalian IgG through the placenta.
  • IgG In the egg, IgG is found in higher concentration in the yolk, however small amounts of IgG are found in the white; and even their amounts are higher in the yolk than in the chicken's serum (Larsson, et al. 1993).
  • a layer has to produce approximately 5 to 6 eggs per week with a volume of yolk of approximately 15 ml, therefore, in one week a chicken produces antibodies in yolk equivalent to 90-100 ml of serum or 180-200 ml of blood complete. This could be compared with the 20 ml of whole blood granted by an immunized rabbit per week. Obviously, if larger animals such as horses or cows are used, the amount of serum and antibodies is greater than in the egg but is more expensive and more painful for the animals.
  • chicken egg yolk antibodies include:
  • IgG Due to its phylogenetic difference with mammalian antibodies, IgG shows no cross reaction with mammalian antibodies.
  • Ig's have been used as immunotherapy in different fields of science such as the administration of oral egg yolk immunoglobulins has prevented rotavirus infections in mice, cattle, and pigs among others (Ikemori , et al 1992, Kuroki, et al. 1994, Marquardt, et al 1998). They have also been used as antivenoms against snakes and scorpions which can be injected to neutralize toxins without the risk of common anaphylactic reactions found with antivenoms made in horses (Larsson, et al. 1993).
  • An object of the present invention is to provide a method of prevention and / or treatment of diseases caused by protozoa in animals and even for humans, by oral administration either through drinking water or in dry form. mixed with the food either parenterally of specific immunoglobulins against these parasites (coccidia, fasciolas, amoeba, isospores, or any other genus) obtained from the egg yolk of hyperimmunized hens.
  • Another object of the invention is to provide weight gain of animals treated with specific immunoglobulins against parasites of birds, pigs or cattle (coccidia, fasciolas, amoeba, Isospores, or any other genus of parasite).
  • the use of egg yolk immunoglobulins against parasites to eliminate or substantially reduce the signology, mortality and transmission in treated animals is claimed.
  • the invention is directed to a process for preparing a product based on specific immunoglobulins against parasites of animals or humans obtained from the egg yolk of hyper-munized hens.
  • the amount of protozoan oocysts in the digestive tract is reduced, in addition to improving the productive parameters of the animals.
  • the immunoglobulins obtained in powder are administered orally mixed with the food.
  • the present invention is based on the fact that immunoglobulins extracted from the aqueous phase of the egg yolk grant protection against viral and bacterial diseases.
  • the vaccination schedule may include oral, subcutaneous or any other administration of the parasites either alive or dead by any chemical method.
  • the parasites can be included in an oily, semi-oily or other vehicle in such a way as to guarantee an immune response in the hen.
  • the recommended dose is 0.5 ml in laying hens in the breeding stage at 8, 12 and 16 weeks of age. Obtaining the yolk immunoglobulins
  • the process was as follows.
  • the yolk is separated from the white and diluted 1: 2 with a solution of sodium azide at 0.005%, mixed perfectly with the help of a propeller. Once the yolk is diluted, it is dried using the Spry Dried method.
  • Quality control tests include: 1. Sterility test (verify that the product is free of contamination by bacteria, fungi and yeasts according to 9 Code of Federal Regulations of the United States of America. 2. Quantification of antibodies. ELISA techniques or any other techniques are used method for the detection of antibodies for each species.
  • the experimental design was carried out as follows: 5 groups of 3 week old broilers were formed. The first group received 0.5 mi of
  • group 5 was the control group without immunoglobulin treatment. All groups were fed with food without anticoccidian and at ten days after reception, that is, at 31 days of age, all groups were challenged with 200.00 oecysts of E.tenella, sacrificing at 7 days later to see injuries according to the Johnson and Reid scale.
  • Two groups of fattening birds were formed: one group was given 1 ml of immunoglobulins daily in the drinking water for 2 weeks, another group was not given any treatment being the control group. After two weeks of treatment the two groups were challenged with 150,000 sporulated oocysts of E.tenella. All animals were sacrificed after 7 days and blind injuries were scored according to Johnson and Reid. as well as the mortality record. The results are presented in Table 2. As can be seen there was a 28.3% decrease in mortality in the treated group with respect to the control group. Similarly, there was a decrease in weight of the blind in the treated group by 53.7% compared to the control group without treatment.
  • the parameters to be evaluated were weight gain, content of oocysts in cecal content and intestinal and conversion rate.
  • the results are presented in Table 3, where a weight gain of 68.5% can be seen in the group treated with immunoglobulins with respect to the control group.
  • a weight gain of 68.5% can be seen in the group treated with immunoglobulins with respect to the control group.
  • the count was 192,000 and 288,000 oocysts in the untreated control group.
  • a better conversion rate was seen in the group treated with immunoglobulins than in the group without treatment.
  • Table 2 Shows the results obtained with the use of 1 ml of Coccidia Immunoglobulins for 14 days orally in the drinking water.

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Abstract

La presente invención está relacionada, con el uso de inmunoglobulinas obtenidas de la yema de huevo de gallinas hiperinmunizadas con una mezcla de oocistos de diferentes especies de Eimerias, pero que puede extenderse para cualquier parásito de animales o de humanos. Las inmunoglobulinas se obtienen por la extracción de la fase acuosa de la yema mediante el uso de Hidroxipropilmetilcelulosaftalato a una concentración final de 0.05% y azida de sodio al 0.001 % como conservador. La invención también se relaciona con la administración de estas inmunoglobulinas en forma de polvo al alimento a razón de 0.5 kg por tonelada de alimento terminado. La administración de las inmunoglobulinas tanto en forma líquida come en polvo disminuyen la mortalidad, lesiones, cuentas, de oocistos de coccidias en los animales tratado. Por otro lado el uso de inmunoglobulinas producen una ganancia en peso de los animales tratados.

Description

USO DE ENIMUNOGLOBULINAS PROCEDENTES DE YEMA DE HUEVO PARA EL
TRATAMIENTO DE INFECCIONES CAUSADAS POR PARÁSITOS TANTO EN
ANIMALES COMO EN EL HUMANO.
Campo de la invención:
La presente invención consiste en proporcionar un nuevo método de tratamiento y prevención de infecciones causadas por parásitos en animales (aves, cerdos, ganado y pequeñas especies) o en el hombre en base a la administración oral o parenteral de inmunoglobulinas obtenidas de la yema de huevo provenientes de gallinas hiperinmunizadas con esos parásitos.
Antecedentes de la invención. Existen dos formas de protección contra agentes infecciosos en los animales: se les puede exponer a antígenos derivados de un agente infeccioso para estimular una reacción inmunitaria protectora o bien se les puede administrar un anticuerpo preformado que se haya obtenido de algún sujeto inmune. La primera forma se logra por medio de vacunas que pueden ser de diferentes clases: virus o bacterias vivas liofilizadas, virus o bacterias muertas en emulsiones oleosas, y recientemente la creación de vacunas clonadas y recombinantes. Cada una de ellas presentan ventajas y desventajas en cuanto protección, respuesta inmune y duración de la protección. Además, en algunos casos se presentan lesiones indeseadas en el huésped a causa del virus vacunal (Tizard, I.R. 1998).
La segunda forma de protección también llamada inmunidad pasiva involucra la transmisión de anticuerpos específicos contra agentes infecciosos a un huésped.
Tradicionalmente, a nivel investigación, los anticuerpos son elaborados principalmente en mamíferos y en menor frecuencia en aves. Los tipos de anticuerpos que se elaboran son monoclonales y policlonales en mamíferos y policlonales en aves (Larsson, et al . 1993).
En el caso de las aves, el pollo es la única especie de la cual se obtienen anticuerpos en forma más accesibles y altamente definido. El principal anticuerpo sérico presente en el pollo es la IgG aunque la IgG es transportada al huevo de una manera similar a la transferencia de la IgG de mamíferos a través de la placenta.
En el huevo la IgG se encuentra en mayores concentración en la yema, no obstante se encuentran pequeñas cantidades de IgG en la clara; e incluso sus cantidades son mayores en la yema que en el suero de la gallina (Larsson, et al. 1993).
Para darse una idea de la cantidad de anticuerpos elaborados en gallina se tiene que una ponedora produce aproximadamente de 5 a 6 huevos por semana con un volumen de yema de aproximadamente de 15 mi, por lo tanto, en una semana una gallina produce anticuerpos en yema equivalente a 90-100 mi de suero o 180-200 mi de sangre completa. Esto podría compararse con los 20 mi de sangre completa que otorga un conejo inmunizado por semana. Obviamente si se utiliza animales más grandes como caballos o vacas la cantidad de suero y de anticuerpos es mayor que en el huevo pero es más costoso y más doloroso para los animales.
Entre sus ventajas los anticuerpos de yema de huevo de gallina se encuentran:
1. No fijan el complemento.
2. No se unen a la Proteína A de Staphilococcus aureus . 3. No reacciona con el Factor Reumatoide.
4. Debido a su diferencia filogenética con los anticuerpos de mamíferos la IgG no muestra reacción cruzada con los anticuerpos de mamíferos.
5. Bajo costo de obtención. En años recientes se han empleado anticuerpos de yema de huevo (Inmunoglobulinas ) como herramientas de diagnóstico y terapia (Schmidt,et al. 1989. Así aprovechando su diferencia filogenética con las inmunoglobulinas de mamíferos, las Ig's han presentado varias ventajas cuando se han usado en inmunodiagnóstico. Por ejemplo, las Ig's de yema se han empleado para detectar varios virus mediante las técnicas de ELISA, inmunodifiísión, inmunofluorescencia y fijación de complemento. Dado su bajo punto isoeléctrico comparado con la Ig de humanos, se emplean en ensayos de electroforesis para la cuantificación de inmunoglobulinas en suero de varios animales (Altschuh, D. 1984, Larsson, et al. 1988, Larsson, et al. 1992, Larsson,et al. 1993, Schade.R. 1996).
En cuanto a su aplicación terapéutica, las Ig's se han empleado como inmunoterapia en diferentes campos de la ciencia como por ejemplo la administración de inmunoglobulinas de yema de huevo por vía oral ha prevenido infecciones por rotavirus en ratones, bovinos, y cerdos entre otros (Ikemori,et al 1992, Kuroki,et al. 1994, Marquardt,et al 1998). Asimismo se han empleado como antivenenos contra víboras y escorpiones los cuales se pueden inyectar para neutralizar las toxinas sin riesgo de las reacciones anafilácticas comunes encontradas con loa antivenenos elaborados en caballo (Larsson, et al. 1993).
Una aplicación más ha sido para prevenir la caries en humanos provocada por Streptococcus mutans (Hatta, H. Et al 1984).
Objetos, usos y ventajas de la presente invención
Un objeto de la presente invención, es el de proporcionar un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades ocasionadas por protozoarios en animales e inclusive para el humano, mediante la administración por vía oral ya sea a través de agua de bebida o en forma seca mezclada con el alimento o bien por vía parenteral de inmunoglobulinas específicas contra esos parásitos (coccidias, fasciolas, amibas, Isosporas, o cualquier otro género) obtenidas de la yema de huevo de gallinas hiperinmunizadas. Otro objeto de la invención es proporcionar ganancia en peso de los animales tratados con inmunoglobulinas específicas contra parásitos de aves, cerdos o en ganado (coccidias, fasciolas, amibas, Isosporas, o cualquier otro género de parásito).
Aún más, dentro de la invención, se reclama el uso de las inmunoglobulinas de yema de huevo contra parásitos para eliminar o reducir sustancialmente la signología , mortalidad y transmisión en los animales tratados. Finalmente, la invención se dirige a un procedimiento para preparar un producto a base de inmunoglobulinas específicas contra parásitos de animales o de humanos obtenidas a partir de la yema de huevo de gallinas hiperir-munizadas.
Por medio de la práctica de la invención, para el caso de animales se disminuye la cantidad de ooquistes de protozoarios en el tracto digestivo, además de que se mejoran los parámetros productivos de los animales. Las inmunoglobulinas obtenidas en polvo se administran por vía oral mezcladas con el alimento.
Descripción detallada de la invención
Los detalles característicos de esta novedosa invención se muestran claramente en la siguiente descripción.
La presente invención se fundamenta en el hecho de que las inmunoglobulinas extraídas de la fase acuosa de la yema de huevo otorgan protección contra enfermedades virales y bacterianas.
Programa de inmunkación de gallinas. Para la obtención de inmunoglobulinas (Igs) específicas contra parásitos de animales o de humano es necesario contar con un calendario de vacunación en una parvada de aves tipo SPF (Specific Pathogens Free).
El calendario de vacunación puede incluir la administración oral, subcutánea o por cualquier otra vía de los parásitos ya sean vivos o muertos por cualquier método químico. Los parásitos pueden incluirse en un vehículo oleoso, semioleoso o de otra naturaleza de tal manera que garantice una respuesta inmune en la gallina. La dosis recomendada es de 0.5 mi en gallinas de postura en la etapa de crianza a las 8, 12 y 16 semanas de edad. Obtención de las inmunoglobulinas de la yema en polvo
En forma resumida el proceso fue el siguiente. La yema se separa de la clara y se diluye 1:2 con una solución de azida de sodio al 0.005 % se mezclan perfectamente con la ayuda de una propela. Una vez diluida la yema se procede al secado mediante el método de Spry Dried. Las pruebas de control de calidad incluyen: 1. Prueba de esterilidad (verificar que el producto está libre de contaminación por bacterias, hongos y levaduras de acuerdo a 9 Code of Federal Regulations de los Estados Unidos de América. 2.Cuantificación de anticuerpos . Se utilizan técnicas de ELISA o de cualquier otro método para la detección de anticuerpos para cada especie.
Enseguida se presentan pruebas a manera de ejemplo no limitativos, que demuestran el uso de las inmunoglobulinas contra Coccidia en pollo de engorda objeto de esta invención.
Ejemplo 1.
El diseño experimental se llevó a cabo de la siguiente manera: se formaron 5 grupos de pollos de engorda de 3 semanas de edad. El primer grupo recibió 0.5 mi de
Inmunoglobulinas en forma de solución administradas por vía oral el día de recepción y una segunda toma a los 8 días después. El grupo 2 recibió 1 mi, el grupo 3 recibió 2 mi, el grupo 4 recibió 4 mi y el grupo 5 fue el grupo control sin tratamiento con inmunoglobulinas. Todos los grupos fueron alimentados con alimento sin anticcoccidiano y al los diez días después de la recepción, es decir a los 31 días de edad todos los grupos fueron desafiados con 200,00 ooquistes de E.tenella, sacrificándose a los 7 días después para ver lesiones según la escala de Johnson y Reid.
Los resultados son presentados en la tabla 1. Se puede observar que el tratamiento con inmunoglulinas contra coccidias disminuye la mortalidad y el peso de los ciegos a una concentración de 0.5 mi aún cuando el tratamiento solo fue de dos dosis con una diferencia de 7 días entre una dosis y otra.
Se formaron dos grupos de aves de engorda: a un grupo se les administró 1 mi de inmunoglobulinas diariamente en el agua de bebida durante 2 semanas, a otro grupo no se le dio tratamiento alguno siendo el grupo control. Después de las dos semanas de tratamiento los dos grupos se desafiaron con 150,000 ooquistes esporulados de E.tenella . Todos los animales se sacrificaron después de 7 días y se calificaron las lesiones de los ciegos de acuerdo a Johnson y Reid. así como el registro de la mortalidad. Los resultados son presentados en la Tabla 2. Como se puede apreciar hubo una disminución de la mortalidad en un 28.3 % en el grupo tratado con respecto al grupo control. De igual forma hubo una disminución de peso de los ciegos en el grupo tratado en un 53.7 % con respecto al grupo control sin tratamiento.
Ejemplo 3.
Se formaron 3 grupos de aves de engorda de 1 semana de edad, al primer grupo se le administró 2 mi de inmunoglobulinas contra coccidia (Supracox) en el agua de bebida en forma diaria durante 14 días y se alimentaron con alimento sin anticoccidiano, al segundo grupo se le dio alimento con un anticoccidiano (Maduramicina de amonio o clopidol), sin administrarle inmunoglobulinas y al último grupo no se le dio tratamiento con inmunoglobulmas y el alimento no contenía anticoccidiano designándose como grupo control negativo. Después del período de tratamiento con las inmunoglobulinas todos los grupos se desafiaron con 200,000 oocistos de una mezcla de Eimerias acervulina, E.brunetti, E. máxima y E.tenella .Los parámetros a evaluar fueron ganancia en peso, contenido de ooquistes en contenido cecal e intestinal y el índice de conversión. Los resultados son presentados en la Tabla 3 , en donde se puede apreciar una ganancia en peso del 68.5 % en el grupo tratado con las inmunoglobulinas con respecto al grupo control. En cuanto a la recuperación de ooquistes en el grupo tratado no se recuperaron mientras que en el grupo tratado con alimento con anticcoccidianos la cuenta fue de 192,000 y de 288,000 ooquistes en el grupo control sin tratar. De igual forma se vio un mejor índice de conversión en el grupo tratado con inmunoglobulinas que en el grupo sin tratamiento.
Relación de tablas
Tabla 1. Resultados con el empleo de inmunoglobulinas administradas en el agua de bebida.
Figure imgf000007_0001
Tabla 2. Muestra los resultados obtenidos con el uso de 1 mi de Inmunoglobulinas contra coccidia durante 14 días por vía oral en el agua de bebida.
Figure imgf000007_0002
Tabla 3. Resultados de una prueba comparativa utilizando Inmunoglobulinas contra coccidia en el agua de bebida y un alimento con anticoccidiano.
Figure imgf000008_0001
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Claims

REIVINDICACIONESAl haber descrito la presente invención, ésta se considera como una novedad, por ue se reclama lo contenido en las siguientes reivindicaciones.
1. El uso de inmunoglobulinas para el tratamiento de infecciones ocasionadas por protozoarios en animales y en el humano, obtenidas por la vacunación exhaustiva de aves ponedoras ligeras tipo SPF con una suspensión de huevéenlos de parásitos vivos o muertos administradas por vía oral, o parenteral.
2. Las inmunoglobulinas de la reivindicación 1 obtenidas por medio de la extracción de la fase acuosa de la yema de huevo.
3. Las inmunoglobulinas de la reivindicación 1, las cuales son obtenidas por el uso de azida de sodio a una concentración del 0.001 % e Hidroxipropilmetilcelulosaftalato a una concentración de 5 % .
4. Las inmunoglobulinas de la reivindicación 1, las cuales también pueden ser deshidratadas por un método de Spray Dried para ser administradas en el alimento a razón de 0.5 kg por tonelada de alimento.
5. Las inmunoglobulinas de la reivindicación 1, disminuyen la mortalidad ocasionada por el desafío con Eimeria de una o varias especies.
6. Las inmunoglobulinas de la reivindicación 1 disminuyen las lesiones ocasionadas por las especies de Eimerias donde se hace la administración en agua a razón de 2 mi diarios por ave.
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