WO2004065418A1

WO2004065418A1 - 抗pci中和抗体

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Publication number: WO2004065418A1
Application number: PCT/JP2004/000429
Authority: WO
Inventors: Takaki Koga; Naoki Kimura; Takeshi Yoshino; Koichiro Ono
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2003-01-20
Filing date: 2004-01-20
Publication date: 2004-08-05
Also published as: JPWO2004065418A1; US20060167230A1; EP1598368A1; EP1598368A4

Abstract

本発明は、プロテインCインヒビター（PCI）に対して中和作用を有する抗PCI抗体およびその利用を提供する。抗PCI抗体の製造およびスクリーニングにより、活性化プロテインＣ（aPC）の生成および活性を阻害するPCIの作用を阻害する抗PCI抗体を単離することに成功した。本発明の抗体は、PCIのaPC生成阻害作用および/またはaPC不活性化作用を抑制することを通して、aPCの活性を維持し、血液凝固系の活性化の抑制または抗炎症作用などのaPCの生理活性の効果を持続させるために使用することができる。また本発明は、血栓症および敗血症などのaPCによる治療における本発明の抗体の使用を提供する。aPC投与による治療において、本発明の抗体を投与することにより、治療効果を持続させることができる。本発明の抗体は、血栓症および敗血症などの治療および予防において利用される。

Description

抗 PCI中和抗体技術分野

本発明はプロテイン Cインヒビター（PCI) の中和抗体に関する。背景技術

静脈血栓症は、下肢関節置換術、あるいは開腹手術後に高頻度で発症する。現在その治療は主として低分子へパリンおょぴヮーファリンにより予防的に行われている。しかし低分子へパリンは連日の皮下投与が必要であり、ヮーフアリンは経口投与できるがタンパク結合率が非常に高いため他薬との相互作用が問題となつている。またいずれの薬物も出血傾向を呈する。

DIG (disseminated intravascular coagulation；播種性血管内凝固）は全身の血管内で血液凝固が進み、循環不全による臓器障害や、血液凝固因子の過剰な消費による出血症状を来す病態であり、白血病、固形腫瘍、感染症や産科疾患などが原因となる。その治療は抗凝固作用を期待して広くへパリン（静脈内投与ないし皮下投与）が使用されている力薬物そのものに出血助長作用があり、またアンチトロンビン III濃度低下により充分な作用が得られないなどの欠点がある。合成蛋白分解酵素阻害薬も処方されるが、有効性が必ずしも明確ではない。

敗血症では、感染した菌体成分が凝固反応を惹起し、 DICを発症することがある。しかし敗血症に対して有効な薬物は極めて少なく、これまでに aPC (activated P rotein C；活生化プロティン C) が米国で認可されているのみである。

その他の血液凝固系が関与する病態、例えば冠動脈症候群、末梢循環不全等においても、へパリンゃ合成抗トロンビン薬などの抗凝固薬が処方されるが、連日投与が必要なため患者の QOL (Quality of Life) は低い。したがって、作用が長時間 (数週間）持続し出血傾向を呈さない抗血栓薬は、血栓症を予防しかつ患者の Q0L を向上させることができる。

血拴は血小板と血液凝固系が活性化することにより形成され、一般には動脈血栓には血小板が、静脈血栓には凝固系が主として働くと考えられている。血液凝固系が活性ィ匕され生成されたトロンビンは血栓網の主体となるフィプリンを生成するとともに、血管内皮上に存在するトロンボモデュリンと結合して性質が変化し、 PC (Protein 0 を活性ィヒさせる。活性化された PC (aPC) は protein Sを補酵素として、 Factor Vaおよひ illaを不活ィ匕し凝固系の回転を抑制する方向に働く。さらに aPCは ΡΑΓ-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-l) や TAFI (Thrombin A ctivatable Fibrinolysis Inhibitor) などの線溶阻害物質抑制作用も有するため、線溶系を促進する。したがって aPCは活性ィ匕した血液凝固系に対するネガティブフィードパック機構として重要な働きをすると考えられており、実際、先天性 PC欠乏症、あるいは（Factor Va変異による） aPC不応症は血栓症の発現因子の一つであることからも aPCの血栓症における役割の重要性が裏付けられる。さらに近年では、 aPCが血管内皮に作用し抗炎症作用を有することが示唆されており（J. Biol.

Chem. 2001； 276: 11199-11203) 、また敗血症モデルにおいて死亡率を改善し（J.

Clin. Invest. 1987; 79:918-925) 、その作用は抗凝固作用だけでは説明できないことも報告されている（Blood 1991 ; 78 : 364 - 368) 。これらのことは、 aPCが血栓症および敗血症の治療おょぴ予防に有効であることを示している。

しかしながら aPCそのものを薬物として用いる場合、血中半減期が 20〜30分と非常に短いために静脈内持続投与あるいは長期にわたる連続投与が必要であり、医療経済学的に、また患者の Q0Lからも不都合である。半減期が短い理由は、 aPCが生体内の不活化物質、すなわち PCIや α ΐ-antitrypsin (AAT) などにより非可逆的に不活ィ匕されることである。これらのうち生理的に重要な役割を果たしているのは P CIと考えられており (Fibrinolysis & Proteolysis 2000; 14： 133-145) 、実際、 a PC/PCI複合体の血中濃度は、急性冠症候群、 DIC、深部静脈血栓症などの病態で上昇していることが報告されている (Blood Coagul. Fibrinolysis 2001； 12:503-5 10; Am. J. Hematol. 2000; 65 : 35-40; Thromb. Haemost. 2001 ; 86 : 1400-1408)

PCIは、 aPCとァシル酵素複合体を形成することにより非可逆的に酵素活性を阻害する（J. Biochem. 1984； 95： 187-195) 。それのみならず、 aPCの生成酵素であるトロンビン/ト口ンボモデュリン（Thr/TM) 複合体を阻害し、 aPCの生成を抑制する（Blood 1998; 91 : 1542-1547)。すなわち、 PCIは aPCの生成および活性の両方を阻害することによって aPCの働きを抑制している。したがって PCIの作用を阻害することにより、内因的に生成される aPC、あるいは外因的に投与される aPCの作用を増強することができ、効果的な抗血液凝固作用を得ることができる。発明の開示

本発明は、 aPCの生成おょぴ酵素活性を阻害する PCIに対し、中和作用を有する抗 PCI抗体おょぴその利用を提供することを課題とする。

PCI (Suzuki, K. et al. , J. Biol. Chem. 1983, 258 : 163 - 168; Suzuki, Κ·， F ibrinolysis Proteolysis 2000, 14： 133-145) は血中に存在する可溶' 1"生蛋白であり、その半減期は 23時間である。そこでこの蛋白に対する中和抗体を作製し、十分量投与すれば、長時間持続する抗血液凝固薬となる。

前述したように、 PCn¾ (1) Thr/TM複合体による aPC生成の阻害作用（すなわち PCの活性化阻害作用）、および（2) aPCの活性阻害作用を有する。そこで本発明者らは、 PCIに対するモノクローナル抗体を産生するハイリドーマを作製し、 PCI の二つの作用それぞれについて阻害作用のスクリーニングを行なった。その結果、 (1) 、 (2) それぞれについて阻害作用を有する抗体を単離することに成功し、その一部は両方の作用を阻害した。本発明の抗体は、 aPCの作用増強を通して血液凝固系の働きを抑制するため、血栓症の治療および予防のために極めて有用である。また本発明の抗体は、 aPCによる敗血症の治療等において、 aPCと併用して用いることにより、血中における aPCの不活ィヒを抑制することにより aPCの作用を増強する薬剤として利用することができる。

すなわち本発明は、 aPCの生成および酵素活性を阻害する PCIに対し、中和作用を有する抗 PCI抗体おょぴその利用に関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関する。なお本発明は、請求項の各項に記載の発明の 1つまたは複数 ( または全部）の所望の組み合わせからなる発明、特に、同一の独立項（他の項に記載の発明に包含されない発明に関する項）を引用する項（従属項）に記載の発明の 1つまたは複数（または全部）の所望の組み合わせからなる発明にも関する。各独立項に記載の発明には、その従属項の任意の組み合わせからなる発明も意図されている。すなわち本発明は、以下の発明を含む。

〔1〕抗 PCI抗体であって、（a ) 活性化プロテイン C (aPC) 活性に対するプロテイン Cインヒビター（PCI) の阻害作用を阻害する活性、または（b ) トロンビン/ トロンポモデュリン（Thr/TM) 複合体による活性ィ匕プロテイン C (aPC) 生成に対するプロテイン Cインヒビター（PCI) の阻害作用を阻害する活性、の少なくともいずれかを有する抗体、

〔2〕抗 PCI抗体であって、（a ) 活性ィ匕プロテイン C (aPC) 活性に対するプロテイン Cインヒビター（PCI) の阻害作用を阻害する活性、および（b ) トロンビン/ トロンボモデュリン（Thr/TM) 複合体による活性ィヒプロテイン C (aPC) 生成に対するプロテイン Cインヒビター（PCI) の阻害作用を阻害する活性、の両方を有する抗体、

〔3〕 PC19G8、 PC23A7、 PC23D8、 PC30G1、 PC31E2、 PC31F1、および PC39C6からなる群より選択される抗体の可変領域を含む抗体と、抗# ^識部位が競合する、〔1〕または〔2〕に記載の抗体、

〔4〕〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の抗体であって、以下の（a ) から（ f ) のいずれかのァミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有する抗体、 ( a ) 配列番号： 49、 50、および 51に記載のァミノ酸配列、

(b) 配列番号： 55、 56、および 57に記載のアミノ酸配列、

( c ) 配列番号： 52、 53、 54およびに記载のァミノ酸配列、

( d ) 配列番号： 58、 59、 60およびに記載のァミノ酸配列、

( e ) 配列番号： 25、 31、および 36に記載のァミノ酸配列、

( f ) 配列番号： 41、 45、および 48に記載のァミノ酸配列、

〔5〕抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体断片、一本鎖抗体、およぴダイアポディーからなる群より選択される、〔1〕から〔4〕のいずれかに記载の抗体、

〔6〕〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物、

〔7〕さらにプロテイン Cおよび/または活性ィヒプロテイン Cを含む、〔6〕に記載の組成物、

〔8〕活性ィ匕プロティン Cの活性の低下ないしは不足によって発症および/または進展する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物である、〔6〕または〔 7] に記載の組成物、

〔 9〕疾患が血液凝固反応の亢進およぴ Zまたは炎症反応の亢進によつて惹起される疾患である〔8〕に記載の組成物、

〔10〕血液凝固反応の亢進おょぴ Zまたは炎症反応の亢進によって惹起される疾患が、敗血症、.播種性血管内凝固症候群、動脈血栓症、および静脈血栓症からなる群より選択される、〔9〕に記載の組成物、

〔11〕活性ィ匕プロテイン Cの活性の低下ないしは不足によって発症おょぴまたは進展する疾患を予防または療する方法であって、（a) プロテイン Cおよびノまたは活性ィヒプロテイン C、並びに（b) 〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の抗体、を投与する工程を含む方法、

〔12〕活性ィ匕プロテイン Cの活性の低下ないしは不足によって発症おょぴまたは進展する疾患を予防または治療する方法であって、〔1〕力、ら〔5〕のいずれかに記載の抗体を投与する工程を含む方法、

〔1 3〕活性ィ匕プロテイン Cの活性の低下ないしは不足によって発症および/または進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（a ) 〔1〕力、ら〔5〕のいずれかに記載の抗体、および（b ) プロテイン C、活性化プロティン〇、またはその両方、を含むキット、

〔1 4〕活性ィ匕プロテイン Cの活性の低下ないしは不足によって発症および Zまたは進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（a ) プロティン〇、活性化プロテイン C、および〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の抗体、および（b ) (i)治療有効量のプロテイン Cおよび Zまたは活性化プロテイン C、並びに（ii)該抗体、を併用することの記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含むキット。

本発明は、 aPCの生成および/または酵素活性を阻害する PCIに対し、中和作用を有する抗 PCI抗体およびその利用を提供する。 PCIは、（1) Thr/TM複合体による aP C生成（すなわち PCの活性化）に対する阻害作用、および（2) aPCの活性阻害作用を有するが、本発明の抗体は、 PCIが持つこの（1)または (2)の活性のいずれか、より好ましくは（1)および (2)の両方の活性を有意に阻害する働きを有している。これらの活性の阻害は、例えば実施例に記載した方法またはその他の方法により測定することができる。具体的には、 PCIによる aPCの活性阻害作用は、 PCIを抗 PCI 抗体とインキュベートした後、これを aPC溶液に加えてィンキュベートし、 aPCの活性を測定する。 PCIを加えなかった場合（PCIによる阻害なしの条件下の aPC活性 ) およぴ抗 PCI抗体を加えなかった場合（PCIにより阻害した場合の aPC活性）の aP C活性の値を基に、抗 PCI^C体が PCIによる aPC活性の阻害作用を阻害した割合が決定される。抗体と PCIとのインキュベーションにより、抗体を加えなかった場合よりも aPC活性に対する PCIの阻害の程度が低下すれば、この抗体は PCIが持つ aPCの活性阻害作用を阻害する活性を有すると判断される。 aPCの活性としては抗血液凝固作用が挙げられ、例えば公知の方法により APTT (活性化部分トロンボプラスチン時間）を測定して定量することができる。あるいは発色基質 pyroGlu- Pro- Arg - pNA · HC1 (S-2366) などの低分子化合物を用いて aPC活性をァッセィすることも可能である（実施例参照）。

Thr/TM複合体による aPC生成に対する PCIによる阻害については、例えば PCI、抗 PCI抗体、トロンビン（Thr)、およびトロンポモデュリン（TM) をインキュベートし、その後、 PCを加えて aPCの生成反応を行う。その後、 aPC活性を測定して生成した aPC量を測定する。 PCIを加えなかった場合（PCIによる阻害なしの条件下の aPC 生成）および抗 PCI抗体を加えなかった場合（PCIにより阻害した場合の aPC生成）の aPC活性の値を基に、 PCIの「Thr/TM複合体による aPC生成に対する阻害作用」における抗 PCI抗体の阻害の割合が決定される。抗体の添加により、抗体を加えなかつた場合よりも aPC生成に対する PCIの阻害の程度が低下すれば、この抗体は PCIが持つ「Thr/TM複合体による aPC生成に対する阻害作用」を阻害する活性を有すると判断される。 aPCの活性は上記と同様に定量することができる。

また本発明は、 PCIに対して中和作用を有する抗 PCI抗体のスクリーニング方法であって、 i ) 抗 PCI抗体を結合させたまたはさせていない PCIの、 aPCの活性阻害作用を測定する工程、および ii) 該抗体を結合させていない PCIに比べ、該抗体を結合させた PCIの該阻害作用が抑制されるような抗体を選択する工程、を含む方法を提供する。また本発明は、 PCIに対して中和作用を有する抗 PCI抗体のスクリ一二ング方法であって、 i ) 抗 PCI抗体を結合させたまたはさせていない PCIの、 T hr/TM複合体による aPC生成に対する阻害作用を測定する工程、および ii) 該抗体を結合させていない PCIに比べ、該抗体を結合させた PCIの該阻害作用が抑制されるような抗体を選択する工程、を含む方法を提供する。また本発明は、これらのスクリーニング方法により得ることができる抗体を提供する。本発明の抗体は、血中における aPCの生成および/または活性の阻害を防止することにより、 aPCの生体内での生成量および/または寿命を延長させて活性を増強することが可能である本発明の抗 PCI抗体は、モノクローナル抗体 (全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、またはそれらの抗体の変異体であってもよい。均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。

本発明における「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が、天然において起こり得る少量で存在する変異体を除いては均一である抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して作用するものである。さらに、異なる抗原決定基 (ェピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む慣用なポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グ口プリンにより汚染されていないハイプリドーマ培養により合成される点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナノレ抗体を、例えばハイプリドーマ法 (Kohler and Milstein, Nature 256： 95 (19 75) ) 、または、組換え方法 (米国特許第 4, 816， 567号）により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライプラリーから単離してもよい（Clackson et al. , Nature 352： 624-628 (1991) ； Marks et a 1. , J. Mol. Biol. 222 : 581-597 (1991) ) 。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖（H鎖）及び/または軽鎖（L鎖）の一部が特定の種、または特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体 (免疫グロブリン）、抗体変異体、並びに抗体の断片が含まれる（米国特許第 4， 816， 567号； Morrison et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA 81 : 6851-6855 (1984) ) 。

本明において、「抗体変異体」とは、 1またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。例えば、抗体の可変領域を、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変することができる。このような改変は、部位特異的変異 (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82： 488 (1 985)参照）、 PCR変異、カセット変異等の方法により行うことができる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と少なくとも 70 %、より好ましくは少なくとも 75%、より好ましくは少なくとも 80%、さらに好ましくは少なくとも 85%、さらにより好ましくは少なくとも 90%、そして、最も好ましくは少なくとも 95%のァミノ酸配列の同一性を有する。本明細書において配列の同一性は、配列同一性が最大となるように必要に応じ配列を整列化し、適宜ギャップ導入した後、元となった抗体のアミノ酸配列の残基と同一の残基の割合として定義される。

具体的には、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 5873 - 5877, 1993) によつて決定することができる。このアルゴリズムに基づ 1/、て、 BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul et al. J. Mol. Biol. 215 : 40 3-410, 1990) 。 BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータ一は例えば score = 100、 wordlength = 12とする。また、 BLASTに基づ Vヽて BLASTXによってァミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えば _sco re = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（NCBI (National Center for Biotechnology Informati on) の BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) のウェブサイトを参照； ht tp： //www. ncbi. nlm. nih. gov) 。

ポリクローナル抗体おょぴモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。例えば以下の方法により作製することができる。

動物の免疫に用いる PCIとしては、組換え DNA法又は化学合成により調製した PCI のアミノ酸配列の全部若しくは一部のペプチドなどが挙げられる。ヒトおよびその他の哺乳動物の PCIのアミノ酸配列は公知である（Suzuki, K. et al.， J. Biol . Chem. 1987, 262 :611-616) 。哺乳動物の PCIとしては、例えばマウス、ラット、またはゥシなどの PCIを用いることができるがこれらに制限されない（Zechmeis ter-Machhart, M.， et. al. , Gene, 186，（1)， 61—66， 1997； Wakita, T. , et. a 1. , FEBS Lett. , 429, 263—268，（3)， 1998; Yuasa, J. , et. al. , Thromb. Haem ost. 83， (2) , 262-267, 2000) 。組み換え PCI蛋白質は、例えば実施例に記載したようにして調製することができる。抗原としては PCIまたはその部分べプチド自体を用いることもできるし、キヤリァー蛋白質に結合させて免疫することもできる。キャリアー蛋白質.を用いる場合は、例えば抗原である PCIをキャリアー蛋白質

(例えばサイログロプリン）に結合させた後、アジュバントを添加する。アジュパントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全なアジュパント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。

上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ハムスタ一、モルモット、ゥマ、サル、ゥサギ、ャギ、ヒッジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは 4〜21日間隔で免疫する。抗原蛋白質の免疫量は 1回にマウス 1匹当たり、例えば 10〜： ΙΟΟ μ g (例えば 20〜60 μ g) を用いることができる。 ·

初回免疫前おょぴ 2回目以降の免疫から 3〜7日後に動物から採血し、血清を抗体力価について分析する。また、免疫応答を増幅するため、ミヨウパン等の凝集剤が好ましくは用いられる。 .選択された哺乳動物抗体は通常、抗原に対して十分に強い結合親和性を有する。抗体の親和性は、飽和結合、酵素結合ィムノソルべント検定法 (ELISA)、及ぴ競合分析 (例えば、放射性免疫分析）により決定することができる。ポリクローナノレ抗体のスクリーユング法としては、 Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratoriey^ Harlow and David Lane edit. (1988 )) に記載されるような慣用の交窣結合分析を行うことができる。また、代わりに、例えば、ェピトープマッピング（Champe et al.， J. Biol. Chem. 270: 1388-13 94 (1995) ) を行つてもよい。ポリぺプチドまたは抗体の効力の測定方法として好ましいのは、抗体結合親和性の定量ィ匕を用いた方法であるが、その他の態様では、それに加えて、または結合親和性測定に代えて、抗体の 1若しくはそれ以上の生物学的特性を評価する方法を含む。このような分析法は特に、抗体の治療的な有効性を示すので有用である。通常、必ずしもではないが、このような分析において改善された特性を示す抗体はまた、結合親和性も増幅されている。

モノクローナル抗体の調製におけるハイプリドーマの作製は、例えば、ミルスティンらの方法 (Kohler, G. , and Milstein, C.， Methods Enzyraol. 1981, 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えば HAT培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に 8—ァザグァニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチンーグァニン一ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン .アミノプテリン .チミジン（HAT) 培地に生育できないものである。ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば P3x63Ag8. 653 (J. Immunol. (1979) 123： 1548-1550) 、 P3x63Ag8U. 1 (Curr ent Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81 : 1-7) 、 NS - 1 (Kohler,

G. and Milstein, C. , Eur. J. Immunol. (1976) 6 : 511-519) 、 MPC— 11 (Margu lies, D. H. et al. , Cell (1976) 8： 405—415) 、 SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature (1978) 276： 269—270) 、 F0 (de St. Groth, S. F. et al. , J. Immunol.

Methods (1980) 35 : 1—21) 、 S194 (Trowbridge, I. S.， J. Exp. Med. (1978) 148： 313-323) 、 R210 (Galfre, G. et al.， Nature (1979) 277： 131 - 133) 、 P3 Ul (J. Exp. Med. 1979 ; 150 : 580; Curr Top Microbiol. Immunol. 1978 ;81 : 1) 等が好適に使用される。また、ヒトミエローマ、及び、マウス -ヒト heteromycloma セルラインも、ヒトモノクローナ抗体の産生に用いることができる（Kozbar, J. I mmunol. 133 : 3001 (1984)； Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production T echniques and Application, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987) ) 。抗体産生細胞は、例えば最終の免疫日から 2〜3日後に犠牲死させた動物から採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。具体的には、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出又は採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物を PBS、 DM EM、 RPMI1640等の培地又は緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。

次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、 M EM、 DMEM、 RPMI- 1640培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比 1 :：!〜 1 :20で融合促進剤の存在下、 30〜37°Cで 1〜15分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量 1 ，000〜6, 000 (Da) のポリエチレングリコール、ポリビュルアルコール又はセンダィウィルスなどの融合促進剤や融合ウィルスを使用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。

細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ゥエルに選択; ^地（HAT培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイプリドーマとして得ることができるまた別の態様として、 McCaffertyら（Nature 348： 552-554 (1990) )により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより、抗体、または抗体断片を単離することができる。 Clacksonら（Nature 352 :624-628 (1991) )、及 O¾la rksら（J. Mol. Biol. 222： 581-597 (1991) )は、各々、ファージライプラリーを用いたマウス及びヒト抗体の単離について記載している。また、高親和性 (nM範囲）ヒト抗体のチェーンシャッフリングによる製造 (Marks et al. , Bio/Technology 10： 779-783 (1992))、そして、巨大なファージライプラリーを構築するための方法としてのコンビナトリアル感染、及ぴ in vivo組換え（Waterhouse et al. , Nucleic Acids Res. 21 : 2265-2266 (1993) )などが知られている。これらの技術も、モノクローナル抗体の単離のために従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代えて利用し得る。

本発明の抗 PCI中和抗体は、好適には以下のスクリ一ユングにより選択することができる。

• 1次スクリーニング

抗体の結合特異性を、公知技術、例えば EIA (ェンザィムィムノアツセィ）、 RI A (ラジオィムノアツセィ）、 ELISA (酵素連結ィムノソルベントアツセィ）、 HTR F (homogenous time-resolved fluorescence; 、または资光免投法等 (Antibodie s A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, し old Spring harbor Laborato ry, 1988) により測定し、 PCIへ結合するものを選択する。

• 2次スクリーニング

aPC/PCIアツセィおよび/または Thr/TM/PCIアツセィを行い、 PCIに対する阻害の度合いが相対的に強い抗体を選択する。 aPC/PCIアツセィとは、上記した、 PCIが持つ aPCの活性阻害作用のアツセィであり、 Thr/TM/PCIアツセィとは、上記した、 PCIが持つ Thr/TM複合体による aPC生成（PCの活性化）に対する阻害作用のァッセィである。これらの PCIの作用に対する阻害の程度を測定し、その阻害の程度が相対的に高い抗体を選択する。例えば、ハイプリドーマなどの抗体産生細胞から得られた抗体を用いてアツセィしているならば、目的の活性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を同定し、クローンを限界希釈法によりサブクローユングし、標準的な方法により生育させる (Goding, Monoclonal Antibodies : Principals an P ractice, pp. 59-103, Academic Press, 1986) 。培養培地としては、例えば D - ME Mまたは RPIM- 1640培地を用いることができる。スクリーニングを繰り返して、より強い抗 PCI中和抗体を産生するハイプリドーマを選択することにより、ハイプリドーマのクローニングを行うことが可能である。本発明は、本発明の抗体を産生するハイプリドーマに関する。

ハイプリドーマ培養上清（1/5 (vol/vol) ) を用いた上記 aPC/PCIアツセィにおいては、 PCI非添力卩の場合の値を 100、ハイプリドーマ培養上清の代わりにハイブリドーマ培養のための培養液（例えば HAT培地）を用いた場合を 0とした PCI阻害活性の相対値で、好ましくは 45以上、より好ましくは 48以上、より好ましくは 50以上、より好ましくは 60以上、より好ましくは 70以上、より好ましくは 80以上、より好ましくは 90以上の阻害活性を示すものが選択される。本発明は、この aPC/PCI アツセィにおいて、培養上清（1/5 (vol/vol) ) 中の PCI活性阻害の相対値が好ましくは 45以上、より好ましくは 48以上、より好ましくは 50以上、より好ましくは 6 0以上、より好ましくは 70以上、より好ましくは 80以上、より好ましくは 90以上であるハイプリドーマを提供する。ハイプリドーマ培養上清の aPC/PCIアツセィは、例えば実施例に記載の方法に従って実施する。

ハイプリドーマ培養上清からは、常法により抗体を精製することができる。本発明の抗体は、抗体非添加の場合の値を 100%、 PCI非添加の場合を 0%とした aPC/PC Iァッセィにおいて、 50%阻害濃度が好ましくは 100 g/ml以下、より好ましくは 80 i g/ml以下、より好ましくは 60 // g/ml以下、より好ましくは 50 μ g/ml以下、より好ましくは 40 _§/ιη1以下、より好ましくは 25

より好ましくは 15 μ g/m 1以下、より好ましくは 12. 5 /i g/ml以下である。あるいは本発明の抗体は、この aP C/PCIァッセィにおいて、抗体濃度 25 μ g/mlにおける PCI阻害の相対値が、好ましくは 40%以上、より好ましくは 50%以上、より好ましくは 60%以上、より好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上である。精製抗体の aPC/PCIアツセィは、例えば実施例に記載の方法に従って実施する。 50%阻害濃度を決定するには、抗体濃度を変えてアツセィを行い、グラフを作成して 50%阻害に相当する抗体濃度を求めればよい。

また本発明の抗体は、好ましくは Thr/TM/PCIに対する阻害活性を有している。本発明の抗体は、抗体非添加の場合の値を 100%、 PCI非添加の場合を 0%とした Thr/ TM/PCIァッセィにおレ、て、 50%阻害濃度が好ましくは 200 μ g/ml以下、より好ましくは 150 μ g/ml以下、より好ましくは 100 μ g/ml以下、より好ましくは 80 μ g/ml以下、より好ましくは 50 μ g/ml以下、より好ましくは 30 μ g/ml以下、より好ましくは 25 /z g/ml以下である。あるいは本発明の抗体は、この Thr/TM/PCIアツセィにおいて、抗体濃度 25 t g/mlにおける PCI阻害の相対値が、好ましくは 10%以上、より好ましくは 20%以上、より好ましくは 30%以上、より好ましくは 40%以上、より好ましくは 50%以上である。精製抗体の Thr/TM/PCIアツセィは、例えば実施例に記載の方法に従って実施する。 50%阻害濃度を決定するには、抗体濃度を変えてアツセィを行レ、、グラフを作成して 50%阻害に相当する抗体濃度を求めればよ！/、。

本発明の抗体は、 PC/PCIアツセィにおける PCI阻害活性、または Thr/TM/PCIアツセィにおける PCI阻害活 1"生のどちらかを有していればよいが、より好ましくは、 aP C/PCIァッセィにおける PCI阻害活性、および Thr/TM/PCIァッセィにおける PCI阻害活性の両者を有している。すなわち本発明の抗体としては、上記の aPC/PCIアツセィおよび Thr/TM/PCIァッセィにおける 50°/。阻害濃度が、それぞれ好ましくは 100および 200 μ g/ml以下、より好ましくは 80および 150 g/ml以下、より好ましくは 60 および 100 μ g/ml以下、より好ましくは 50およぴ 80 μ g/ml以下、より好ましくは 40 および 50 g/ral以下、より野ましくは 25および 30 μ g/ml以下、より好ましくは 15 および 25 μ g/ml以下、より好ましくは 12. 5および 25 g/ml以下である抗体が含まれる。

本発明の抗体は、一般に、 PCIとの結合力が強いものほど好ましいと考えられる。本発明の抗体は、 PCIと相互作用における解離定数 (KD) 1S 好ましくは 50 nM 以下、より好ましくは 20 nM以下、より好ましくは 10 nM以下、より好ましくは 5 n M以下、より好ましくは 3 nM以下、より好ましくは 1 nM以下、より好ましくは 0. 8 nM以下、より好ましくは 0. 6 nM以下、より好ましくは 0. 4 nM以下、より好ましくは 0. 2 nM以下である。解離定数や、結合速度定数 (ka) 、解離速度定数 (kd) 、最大結合量（Rmax) などの結合速度論的パラメータ一は、例えば BIAC0REなどの表面プラズモン共鳴分析等により決定することができる。

また、本発明の抗体は、好ましくは血液による aPCの不活性化を抑制する活性を有している。本発明の抗体は、血液による aPCの不活性ィ匕を、好ましくは 10%以上、より好ましくは 15%以上、より好ましくは 20%以上、より好ましくは 25%以上、より好ましくは 30%以上抑制する抗体である。このような抑制レベルは不活性化抑制率 (%)と定義され、血液により不活性ィ匕した場合の aPCの活性と同レベルの a PC活性を 0%、しない場合の aPC活性と同レベルの aPC活性を 100%とした相対値で表される。

不活性化抑制率は適宜抗体の用量を変えながら至適条件で測定すればよく、具体的には、以下の手順で決定することができる。 10 /i g/mLの aPC (SIGMA, #P - 2200 ) 溶液 ΙΟ μ ίとの抗体溶液（ハイブリドーマのスクリーニングであれば、例えばハイブリドーマ培養上清）あるいはコントロールとして抗体を含まない溶液

(例えばミエ口一マ細胞の培養上清または HAT培地など）を混合し,、、室温で一定時間（例えば 60分）インキュベートする。この混合液に血漿（例えばヒト標準血漿 ) を 50 z L添加し、さらに室温で一定時間（例えば 60分）インキュベートする。 AP TT試薬（例えば DADE BEHRING、 GAA-200A) 50 を添加する。血漿とインキュべーションを行わない aPCの血液凝固時間は、 APTT試薬添加直前に血漿に加えて測定する。例えば 37°Cで 3分間インキュベートした後、 20 mmol/L CaCl₂ (例えば DAD E BEHRING, GMZ-310) 50 Lを添加し、凝固までの時間を測定する。血液凝固時間は、血液凝固自動測定装置（例えば Amelung、 KC-10A) などにより測定することができる。

血漿とインキュベートしなかった aPCを加えた場合の凝固時間（a) を 100%、コントロールとして抗体を含まない溶液（例えば上記のようにミエローマ細胞の培養上清または HAT培地など）とインキュベート後に血漿とインキュベートした aPC を加えた場合の凝固時間（b) を 0%とし、該ハイプリドーマ培養上清などの抗体溶液とインキュベート後に血漿とインキュベートした aPCを加えた場合の凝固時間 (c) 力、ハイプリドーマ培養上清などの抗体溶液の凝固時間延長に対する作用を求める（不活性化抑制率 (%) = { (c-b) / (a-b) } X 100) 。この値が大きいほど、 aPC不活性ィ匕に対する抑制作用が強いと判断される。 S-2366等の基質化合物を用いて aPC活性を測定する場合でも、上記と同様に抗体とインキュベートせずに血漿で不活性ィ匕させた aPC、および血漿とインキュベートしない aPCを比較に用いて aPC活性を測定し、不活性化抑制率 (%)を算出することができる。

本発明の抗体は、例えば aPCまたは Thrombinとの相互作用または選択性に関与する PCI部位に結合する抗体であってよレ、。 PCIが Thrombinおよび aPCと反応する部位は、シグナルペプチドが切断された後のヒト PCIにおける Arg³⁵⁴-Ser³⁵⁵ (Suzuki, K . et ah , J. Biol. Chem. 1987, 262： 611—616) である。また、 PCIの Thrombin への選択性に関与する部位は Phe³⁵³、 PCIの aPCへの選択性に関与する部位は Thr³⁵ ²である（Cooper、 S. T. et al. , Biochemistry 1995, 34： 12991—12997 ; Cooper , S. T. and Church, F. C. , Biochemica et Biophysica Acta, 1246, 29 - 33， 1995 ) 。本発明の抗体は、例えば PCI中のこれらのいずれかのアミノ酸あるいはその近傍（例えば 10アミノ酸以内の部位）に結合する抗体が含まれる。このような抗体を作製するには、目的の PCI部分を含むオリゴペプチドを合成し、それを抗原として動物に免疫して抗体を産生させればよい。

また、 PCIの作用の一つである aPCの活性阻害は Heparin依存的であり、 PCIの Arg ²⁷⁸、 Arg³⁶², および Lys²⁷⁶残基が、 iteparinを介した PCI- aPCの相互作用に関与している（Lei Shen, el al.， Thromb. Haemost. , 82, 72-79, 1999) 。従って、これらのアミノ酸またはその近傍に結合する抗体は、 PCIの aPC阻害を抑制する抗体の候補となる。

取得したハイプリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。細胞培養法においては、ハイプリドーマを 10〜20%ゥシ胎児血清含有 RPMI- 1640培地、 MEM培地、又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば 37°C、 5%C0₂濃度）で 2〜； 14 日間培養し、その培養上清から抗体を得する。腹水形成法においては、ミエ口一マ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイプリドーマを投与し、ハイプリドーマを大量に増殖させる。そして、 1〜4週間後に腹水又は血清を採取する。腹水形成を促進するために、例えばプリスタン（2， 6， 10， 14- tetramethylpentad ecane) などを予め腹腔内投与することができる。

本発明で使用される抗体は、プロテイン A-セファロース、プロテイン G-セファロース、ハイドロキシァパタイトクロマトグラフィー、硫黄塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。

また、本発明では、上記の方法にしたがって得られた抗体の遺伝子をハイプリドーマからクローユングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、 Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC M0N0CL ONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。具体的には、ハイプリドーマの mRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）の cDNAを合成する。目的とする抗体の V領域をコードする DNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体の V領域をコードする DNAを、抗体 C領域の DNAを含む発現べクタ一へ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。本発明は、本発明の抗体を発現する細胞を提供する。本発明の抗体を発現する細胞としては、このような抗体遺伝子で形質転換された細胞、およぴハイプリドーマが含まれる。

本発明の抗体として特に好適なのは、実施例において単離されたいずれかのモノクローナル抗体（PC19G8, PC23A7, PC23D8, PC30G1, PC31E2, PC31F1, または PC39C6) の可変領域を含む抗体と抗体結合部位が重複する（または同一の）抗体である。このような抗体を、本発明においては、該モノクローナル抗体（PC19G8, PC23A7, PC23D8, PC30G1, PC31E2, PC31F1, または PC39C6) の PCI結合部位と実質的に同じ部位に結合する抗体と呼ぶ。 2つの抗体が抗原蛋白質の同じ部位に結合するかどうかは、例えば競合実験により決定することができる。具体的には、第一の抗 PCI抗体と PCIとの結合が、第二の抗 PCI抗体によって競合阻害を受けるとき、第一の抗体と第二の抗体は同じ抗原部位に結合していると判断される。例えば、 PC19G8, PC23A7, PC23D8, PC30G1, PC31E2, PC31F1, または PC39C6の抗体、あるいは、配列番号： 8、 9、 10、 11、 12、 13、または 14に記載のアミノ酸配列を含む H鎖可変領域に対して、それぞれ配列番号： 15、 16、 17、 18、 19、 20、または 21に記載のァミノ酸配列を含む L鎖可変領域を組み合わせた抗体のいずれかと、抗体結合部位が競合する抗体は、本発明の抗体に含まれる。あるいは、上記のモノクローナル抗体のェピトープを、 PCIの部分ぺプチドなどを用いた公知のェピトープマツビング法により解析し、同定されたェピトープを含むぺプチドを抗原に用いて、これに結合する抗体を調製することにより、上記モノクローナル抗体の PCI 結合部位と実質的に同じ部位に結合する抗体を得ることもできる。このような抗体は、 aPC生成および/または aPC活性に対して実施例で単離した抗体と同様の阻害作用を発揮することが期待される。このように、実施例で単離した抗体の PCI結合部位と実質的に同じ部位に結合する抗体であって、 aPC活性に対する PCIの阻害作用を阻害する活性を有する抗体および/または Thr/TM複合体による aPC生成に対する PCIの阻害作用を阻害する活性を有する抗体は本発明に含まれる。

また本発明の抗体には、実施例において単離されたいずれかのモノクローナル抗体 (PC19G8, PC23A7, PC23D8, PC30G1, PC31E2, PC31F1, または PC39C6) の相捕性決定領域（CDRs) またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を含む抗体が含まれる。機能的こ同等とは、実施例において単離されたいずれかのモノクロ一ナル抗体の CDRsのァミノ酸配列と類似したァミノ酸配列を有し、 PCIに結合してその機能を阻害する作用を有することを言う。 CDRとは抗体の可変領域（V領域とも言う）に存在する抗原への結合の特異性を決定している領域であり、 H鎖と L鎖にそれぞれ 3箇所ずつ存在し、それぞれ N末端側から CDR1、 CDR2、 CDR3と命名されている。 CDRを挟むようにフレームワークと呼ばれるァミノ酸配列の保存性の高レヽ 4 つの領域が介在する。 CDRは他の抗体に移植することが可能であり、所望の抗体のフレームワークと組み合わせることにより組み換え抗体を作製することができる。また抗原に対する結合性を維持しながら 1または数個の CDRのァミノ酸を改変することが可能である。例えば、 CDR中の 1または数個のアミノ酸を、置換、欠失、および/または付加することができる。

変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) 、親水性アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E 、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、 A、 V、レ I、 P) 、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、 Τ、 Υ) 、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸

(C、 M) 、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、 N、 E、 Q) 、塩基含有側鎖を有するアミノ離、 K、 Η) 、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Η 、 F、 Y、 W) を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの各グループ内のアミノ酸の置換を保存的置換と称す。あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のァミノ酸残基の欠失、付加及ぴ Z又は他のァミノ酸による置換により修飾されたァミノ酸配列を有するポリぺプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81， 5662-5666、 Zoller, M. J. &arap ; Smith, M. Nucl eic Acids Research (1982) 10, 6487-6500、 Wang, A. et al.， Science 224, 1 431-1433、 Dalbadie-McFarland, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (198 2) 79, 6409-6413) 。変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、各 CDRのァミノ酸の 40%以内であり、好ましくは 35%以内であり、さらに好ましくは 30% 以内（例えば、 25%以内）である。アミノ酸配列の同一性は本明細書に記載したようにして決定すればよい。

本発明に含まれる抗体を例示すれば、例えば！) (T/Y) (F/Y) (M/I)H (配列番号： 4 9) 、 RID (Y/L) (V/E) (N/K) (G/V)N(T/I) (K/I) YDP (K/N) FQ (G/D) (配列番号： 50) 、および GGYDV(R/P) (E/S) FAY (配列番号： 51) (スラッシュで区切られたアミノ酸は、それらのいずれかのアミノ酸であることを表す）のアミノ酸配列からなる 3 つの CDRまたはこれらと機能的に同等の CDRを有する抗体が挙げられる。それぞれのアミノ酸配列は、抗体 H鎖の CDR1、 CDR2、および CDR3に対応する。これらの CDR を、所望の H鎖可変領域のフレームワークの間の CDR1、 CDR2、および CDR3に相当する位置に揷入すれば、本発明の PCI中和抗体を作製することができる。このような抗体の H鎖 CDRとして好ましいアミノ酸配列をより具体的に例示すれば、 CDR1としては DTFMH (配列番号： 22) または DYYIH (配列番号： 23) 、 CDR2としては RIDYVN GNTKYDPKFQG (配列番号： 26) 、 RIDLVNVNTKYDPNFQD (配列番号： 27) 、または RI DLEKGNIIYDPKFQG (配列番号： 28〉、 CDR3としては GGYDVREFAY (配列番号： 32) 、または GGYDVPSFAY (配列番号： 33) が用いられる。また、上記の各 CDRのアミノ酸は、適宜置換などにより改変してもよい。例えば、各 CDRのアミノ酸を保存的に置換することは本^明の範疇に含まれる。より具体的には、各 CDRは、モノクローナル抗体 PC23D8, PC19G8, PC23A7, または PC39C6 の H鎖の CDR1, 2, および 3 の糸且み合わせを用いることができる（図 5参照）。これらの抗体は、上記クローンと同等の PCI中和活性を有することが期待される。上記の H鎖 CDRを含む抗体には、適宜抗体 L鎖の可変領域を組み合わせて用いることができる。 L鎖 CDRとしては、例えば SA (T/S) SS (L/V) (I/S) YMH (配列番号： 55) 、 STSNLASGVPA (配列番号： 56) 、および RSSYPFT (配列番号： 57) のアミノ酸配列からなる CDRまたはこれらと機能的に同等の CDRを組み合わせることが好ましい。それぞれのアミノ酸配列は、抗体 L鎖の CDR1、 CDR2、および CDR3に対応する。また、これらの L鎖 CDRsは、上記の H鎖とは独立に用いてもよい。これらの CDRは、所望の L鎖可変領域のフレームワークの間の CDR1、 CDR2、および CDR3に相当する位置に挿入される。このような抗体の L鎖 CDRとして好ましいァミノ酸配列をより具体的に例示すれば、 CDR1としては SATSSLIYMH (配列番号： 37) または SASSSVSYMH ( 配列番号： 38) 、 CDR2としては STSNLASGVPA (配列番号： 42) 、 CDR3としては RS SYPFT (配列番号： 46) が用いられるが、これらに制限されない。

具体的には、本発明の抗体には、以下の H鎖相補性決定領域を有する抗体であつて、 Thr/TM複合体による aPC生成に対する PCIの阻害作用を阻害する活性および/または aPC活性に対する PCIの阻害作用を阻害する活性を有する抗体が含まれる。

( a ) 配列番号：49、 50、および 51に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( b ) 配列番号： 49、 50、および 51の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。

( c ) 配列番号： 49の 3個以内、配列番号： 50の 8個以内、および配列番号： 51の 5 個以内のアミノ酸が、置換、'欠失および/または付加されたァミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( d ) 配列番号： 49、 50、おょぴ 51とそれぞれ 70%以上の同一性を有するァミノ酸配列からなる補性決定領域。

( c ) におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号： 49の 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また好ましくは配列番号： 50の 7個以内、さらに好ましくは 6個以内、さらに好ましくは 5個以内、さらに好ましくは 4個以内、さらに好ましくは 3個以内である。また好ましくは配列番号： 51の 4個以內、さらに好ましくは 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また（d ) における同一性は、好ましくは 75%以上、さらに好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上である。

また本発明の抗体には、以下の L鎖相補性決定領域を有する抗体であって、 Thr/ TM複合体による aPC生成に対する PCIの阻害作用を阻害する活性および/または aPC 活性に対する PCIの阻害作用を阻害する活性を有する抗体が含まれる。

( a ) 配列番号： 55、 56, および ⁵7に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( b ) 配列番号： 55、 56、および 57の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。

( c ) 配列番号： 55の 5個以内、配列番号： 56の 5個以内、および配列番号： 57の 4 個以内のアミノ酸が、置換、欠失および/または付カ卩されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( d ) 配列番号： 55、 56、および 57とそれぞれ 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( c ) におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号： 55の 4個以内、さらに好ましくは 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また好ましくは配列番号： 56の 4個以内、さらに好ましくは 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また好ましくは配列番号： 57の 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また（d ) における同一性は、好ま'しくは 75%以上、さらに好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上である。特に、上記の H鎖相補性決定領域と L鎖相補性決定領域の両方を有する抗体は、本発明の抗体として好適である。また本発明の抗体としては、 RYWMS (配列番号： 52) 、 EINPDSSTI (N/T)YT (P/S) S LKD (配列番号： 53) 、および (F/ FYYGTPDY (配列番号： 54) のアミノ酸配列からなる CDRまたはこれらと機能的に同等の CDRを有する抗体が挙げられる。上記と同様に、それぞれのアミノ酸配列は、抗体 H鎖の CDR1、 CDR2、および CDR3に相当する。このような抗体の H鎖 CDRとして好ましいアミノ酸配列をより具体的に例示すれば、 CDR1としては RYWMS (配列番号： 24) 、 CDR2としては EI PDSSTINYTPSLKD ( 配列番号： 29) または EINPDSSTITYTSSLKD (配列番号： 30) 、 CDR3としては FFYY GTPDY (配列番号： 34) または LFYYGTPDY (配列番号： 35) が挙げられる。具体的には、モノクローナル抗体 PC30G1または PC31F1の H鎖の CDR1, 2, および 3の組み合わせを用いることができる。これらの抗体は、 PC30G1または PC31F1と同等の PCI 中和活性を有することが期待される。この場合は L鎖 CDRsとして、例えば KASQDVI (V/K) AVA (配列番号： 58) 、 S (A/T) SYRYTGVPD (配列番号： 59) 、およひ ¾YSSPPWT (配列番号： 60) のアミノ酸配列からなる CDRまたはこれらと機能的に同等の CDR を組み合わせることが好ましい。それぞれのアミノ酸配列は、抗体 L鎖の CDR1、 CD R2、および CDR3に対応する。また、これらの L鎖 CDRsは、上記の H鎖とは独立に用いてもよい。 L鎮 CDRとして好ましいアミノ酸配列をより具体的に例示すれば、 CDR 1としては KASQDVIVAVA (配列番号： 39) または KASQDVIKAVA (配列番号： 40) 、 C DR2としては SASYRYTGVPD (配列番号： 43) または STSYRYTGVPD (配列番号： 44) 、 CDR3としては HYSSPPWT (配列番号： 47) が用いられるが、これらの配列には制限されない。

具体的には、本発明の抗体には、以下の相補性決定領域を有する抗体であつて、 Thr/TM複合体による aPC生成に対する PCIの阻害作用を阻害する活性および/または aPC活性に対する PCIの阻害作用を阻害する活性を有する抗体が含まれる。

( a ) 配列番号： 52、 53、および 54に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。 .

( b ) 配列番号： 52、 53、および 54の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。

( c ) 配列番号： 52の 3個以内、配列番号： 53の 8個以内、およぴ配列番号： 54の 5 個以内のアミノ酸が、置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( d ) 配列番号： 52、 53、および 54とそれぞれ 70°/。以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( c ) におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号： 52の 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また好ましくは配列番号： 53の 7個以内、さらに好ましくは 6個以内、さらに好ましくは 5個以内、さらに好ましくは 4個以内、さらに好ましくは 3個以内である。また好ましくは配列番号： 54の 4個以内、さらに好ましくは 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また（d ) における同一性は、好ましくは 75%以上、さらに好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上である。

( a ) 配列番号： 58、 59、および 60に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( b ) 配列番号： 58、 59、および 60の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。

( c ) 配列番号： 58の 5個以内、配列番号： 59の 5個以内、および配列番号： 60の 4 個以内のアミノ酸が、'置換、欠失および/または付加されたァミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( d ) 配列番号： 58、 59、および 60とそれぞれ 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決領域。

( c ) におけるァミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号： 58の 4個以内、さらに好ましくは 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また好ましくは配列番号： 59の 4個以内、さらに好ましくは 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また好ましくは配列番号： 60の 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また（d ) における同一性は、好ましくは 75%以上、さらに好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上である。特に、上記の H鎖相補性決定領域と L鎖相補性決定領域の両方を有する抗体は、本発明の抗体として好適である。また本発明の抗体としては、 TYPIE (配列番号： 25) 、 KFHPDNDDTNYNEKFKG (配列番号： 31) 、および GHDYDYGMDY (配列番号： 36) のアミノ酸配列からなる CDRまたはこれらと機能的に同等の CDRを有する抗体が挙げられる。上記と同様に、それぞれのアミノ酸配列は、抗体 H鎖の CDR1、 CDR2、および CDR3に相当する。これらの抗体は、 PC31E2と同等の PCI中和活性を有することが期待される。この場合は L鎖 C DRとして、例えば KASQSVDYDGDSYLN (配列番号： 41) 、 GASNLESGTPA (配列番号： 45) 、および SNEDPPT (配列番号：48) のァミノ酸配列からなる CDRまたはこれらと機能的に同等の CDRを組み合わせることが好ましい。それぞれのァミノ酸配列は、抗体 L鎖の CDR1、 CDR2、および CDR3に対応する。

( a ) 配列番号： 25、 31、および 36に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( b ) 配列番号： 25、 31、および 36の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。

( c ) 配列番号： 25の 3個以内、配列番号： 31の 8個以内、および配列番号： 36の 5 個以内のアミノ酸が、置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( d ) 配列番号： 25、 31、および 36とそれぞれ 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。 ( c ) におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号： 25の 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また好ましくは配列番号： 31の 7個以内、さらに好ましくは 6個以内、さらに好ましくは 5個以内、さらに好ましくは 4個以内、さらに好ましくは 3個以内である。また好ましくは配列番号： 36の 4個以内、さらに好ましくは 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また（d ) における同一性は、好ましくは 75%以上、さらに好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上である。

( a ) 配列番号：41、 45、および 48に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( b ) 配列番号： 41、 45、および 48の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。

( c ) 配列番号： 41の 5個以内、配列番号： 45の 5個以内、および配列番号： 48の 4 個以内のアミノ酸が、置換、欠失および/または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( d ) 配列番号： 41、 45、および 48とそれぞれ 70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。

( c ) におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号： 41の 4個以内、さらに好ましくは 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また好ましくは配列番号： 45の 4個以内、さらに好ましくは 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また好ましくは配列番号： 48の 3個以内、さらに好ましくは 2個以内、さらに好ましくは 1個である。また（d ) における同一性は、好ましくは 75%以上、さらに好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上である。特に、上記の H鎖相補性決定領域と L鎖相補性決定領域の両方を有する抗体は、本発明の抗体として好適である。 CDRのァミノ酸配列を改変するには、例えばァミノ酸配列を改変した CDRを含む可変領域をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、これらを基に PCRにより可変領域をコードする核酸を生成させる。これを適当な発現ベクターに組み込んで発現させることにより、所望の CDRを有する抗体を得ることができる。例えば、オリゴヌクレオチドの合成時に塩基を混合させて、 CDRの特定の位置に様々なアミノ酸を有する抗体をコードする DNAライブラリーを作製する。このライプラリーから、 PCIに結合しその機能を抑制する抗体をコードするクローンを選択することによつて、本発明の抗体を得ることができる。本発明は、本発明の抗体をコードする核酸、該核酸を含むベクター、およぴ該核酸または該ベクターを含む宿主細胞に関する。核酸は DNAであっても RNAであってもよい。ベクターは、プラスミド、ファージ、ウィルスベクター等の公知の所望のベクターであってよい。宿主細胞は、パクテリア、酵母、昆虫、植物細胞、および哺乳動物細胞などが含まれる。

本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric) 抗体、ヒト化（Hum anized) 抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体などが挙げられ、例えばヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体が挙げられる。このような抗体は、マウス抗体の可変領域をコードする DNAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと連結し、これを発現べクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。

ヒト化抗体は、再構成 (reshaped) ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体などの非ヒト抗体の重鎖または軽鎖の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region) をヒト抗体の相捕个生決定領域に置き換えたものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（例えば、 Jones e t al. , Nature 321： 522—525 (1986) ; Reichmann et al. , Nature 332： 323 - 329 (1988) ; Presta Curr. Op. Struct. Biol. 2 : 593-596 (1992)参照）。具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域 (framework region； FR) を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。得られた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 23 9400、国際特許出願公開番号 W0 96/02576参照）。 CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体に導入させた CDRまたはフレームワーク配列のどちらにも含まれないアミノ酸残基を含んでいてもよい。通常、このようなァミノ酸残基の導入は、抗体の抗原認識 ·結合能力をより正確に至適ィ匕するために行われる。例えば必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851—856)。

また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球を in vitro で所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えば U266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平 1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の一部または全てのレパートリ一を有するトランスジヱ-ック（Tg) 動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（Nature Genetics 7 : 13-21 (19 94)； Nature Genetics 15 : 146 - 156 (1997)； Nature 368: 856-859 (1994)；国際特許出願公開番号 TO 93/12227, W0 92/03918, W0 94/02602, W0 94/25585, W0 96/3 4096, TO 96/33735参照）。このような Tg動物は、具体的には、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロプリン重鎖おょぴ軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体 (Yeast artificial chromosome, YAC)ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖およぴ軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックァゥト動物おょぴ Tg動物の作製、およびこれらの動物同士の掛け合わせにより作り出す。免疫グロブリン重鎖遺伝子座の機能的な不活性化には、例えば、 J領域または C領域 (例えば C /領域)の一部に障害を導入することにより達成でき、免疫グロプリン軽鎖 (例えば κ鎖）の機能的不活性ィ匕には、例えば、 J領域若しくは C領域の —部、または J領域及び C領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入することにより達成可能である。

また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードする cDNA、好ましくは該 cDNAを含むベクタ一により真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。ここで、該宿主は例えば所望の真核細胞、好ましくは CH0細胞、リンパ球やミエ口一マ等の哺乳動物細胞である。

さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンユングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv) としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現べクタ一を作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、 TO 92/01047, W0 92/20791, W 0 93/06213， WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, W0 95/15388を参考に実施することができる。

抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（1) 哺乳類細胞、例えば、 CHO, COS, ミエローマ、 BHK (ba by hamster kidney) , HeLa, Vero, (2) 両生類細胞、例えば、アフリカッメガエル卵母細胞、あるいは (3) 昆虫細胞、例えば、 Sf9, Sf21， Tn5など、あるいは力ィコなどの個体が挙げられる。植物細胞としては、ニコティアナ（Nicotiana) 属、例えばニコティアナ ·タパカム（Nicotiana tabacum) 由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス (Saccharomyces) 属、例えばサッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyce s serevisiae) 、糸状菌、例えば、ァスペルギルス（Aspergillus) 属、例えばァスぺスギルス '二ガー（Aspergillus niger) などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌 (E. co li) 、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞を in vitroで培養することにより抗体が得られる。

本発明の抗体のアイソタイプとしては制限はなく、例えば IgG (igGl, IgG2, I gG3, IgG4) 、 IgM、 IgA (IgAl, IgA2) 、 IgDあるいは IgE等が挙げられるが、好ましくは IgGまたは IgMである。また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の断片又はその修飾物であってもよい。「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合領域または可変領域を含む断片のことである。例えば、抗体の断片としては、 Fab、 F (ab' ) ₂、 Fv、または重鎖おょぴ軽鎖の Fvを適当なリンカーで連結させたシングルチェイン Fv (scFv) 、 diabody (diabodies) , 線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などが挙げられる。従来、抗体断片は天然の抗体のプロテアーゼによる消化により製造されてきたが、現在では、遺伝子工学的に且み換え抗体として発現させること方法も公知である（Morimoto et al. , Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)； Brennan et al. , Science 229: 81 (1985) ; Co, M. S. et al. , J. Immunol. , 19 94, 152, 2968-2976； Better, M. & Horwitz, A. H. , Methods in Enzymology, 1 989, 178, 476-496, Academic Press, Inc.； Plueckthun, A. & Skerra, A.， Met hods in Enzymology, 1989, 178, 476-496， Academic Press, Inc.； Laraoyi, E. , Methods in Enzymology, 1989, 121， 663-669; Bird, R. E. et al. , TIBTECH, 1991, 9， 132-137参照）。

「Fv」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含むものである。この領域は 1つの重鎖および軽鎖の可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである（V_H-V_Lダイマー）。各可変領域の 3つの相補性決定領域 ( CDR) が相互作用し、 V_H - ダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。即ち、重鎖と軽鎖をあわせて 6つの CDRが抗体の抗原結合部位として機能している。しかしながら、 1つの可変領域（または、抗原に特異的な 3つの CDRのみを含む Fvの半分）であっても、全結合部位を含む場合よりは低い親和性ではあるものの、抗原を認識し、結合する能力を有していることが知られている。従って、本発明における抗体断片は Fv断片が好ましいが、これに限定されるものではなく、重鎖または軽鎖の CDRが保存され抗原を認識し、結合する能力を有する抗体の断片を含むポリぺプチドであってよい。

また、 Fab断片（F (ab)とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常領域および重鎖の定常領域 (CH1)を含む。例えば抗体のパパイン消化により、 Fab断片と呼ばれる、 1 つの抗原結合部位を形成する重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合断片、及ぴ、残りの容易に結晶化するために「Fc」と呼ばれる断片が生じる。 Fab'断片は、抗体のヒンジ領域の 1またはそれ以上のシスティンを含む重鎖 CH1領域のカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点で Fab断片と異なるが、 1つの抗原結合部位を形成する重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合断片である点で構造的に Fabと同等である。本発明においては、プロテアーゼによる消化で生成した抗体断片と同一でなくても、ノ、。パイン消化により得られるものと同等な、 1つの抗原結合部位を形成する重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合断片を Fab様抗体と称する。 Fab' - SHとは、定常領域の 1またはそれ以上のシスティン残基が遊離のチオール基を有する Fab'を示すものである。 F (ab' )断片は、 F (ab' ) ₂のヒンジ部のシスティンにおけるジスルフィド結合の切断により製造される。化学的に結合されたその他の抗体断片も当業者には知られている。抗体をペプシンで消化すると、 2つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得る F (ab' ) ₂断片、及び、残りの別な断片 (pFc'と呼ばれる）が得られる。本発明において、ペプシン消化により得られるのも同等な、 2つの抗原結合部位を有し抗原を交差結合し得る抗体断片を F ( ab' ) ₂様抗体と称する。例えば、これらの抗体断片は組換技術により製造することも可能である。例えば、上述の抗体ファージライプラリーから抗体断片を単離することもできる。また、大腸菌等の宿主より直接 F (ab，）₂-SH断片を回収し、 F (ab' )₂断片の形態に化学的結合させることもできる（Carter et al. , Bio/Technology 10：163-167 (1992) )。さらにまた別の方法としては、 F (ab，）₂断片を直接、組換宿主培養物から単離することもできる。

さらに、本発明で使用される抗体は多特異性抗体であってもよい。多特異性抗体は、少なくとも 2種類の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。通常このような分子は 2個の抗原を結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体 (bisp ecific antibody) ) 、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上 (例えば、 3 種類)の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片 (例えば、 F (ab' ) ₂二特異性抗体 )であり得る。二重特異性抗体は 2種類の抗体の重鎖と軽鎖（HL対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる（Millst ein et al. , Nature 305 : 537 - 539 (1983))。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも能である。具体的には、結合特異性を有する抗体の可変領域を免疫グロブリンの定常ドメィン配列に融合する。該定常ドメィン配列は、好ましくば免疫グロブリンの重鎖の定常領域の内、ヒンジ、 CH2及ぴ CH3 領域の一部を少なくとも含むものである。好ましくは、さらに軽鎖との結合に必要な重鎖の CHI領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖融合体をコードする DNA、及ぴ、所望により免疫グロプリン軽鎖をコードする DNAをそれぞれ別々の発現べクタ一に挿入し、適当な宿主生物に形質転換する。別々の発現ベクターに各遺伝子を揷入することにより、それぞれの鎖の存在割合が同じでない方が、得られる抗体の収量が上がる場合に、各鎖の発現割合の調節が可能となり都合が良いが、当然ながら、複数の鎖をコードする遺伝子を一つのベクターに挿入して用いることも可能である。

ダイアポディ（diabody; Db) は、遺伝子融合により構築された二価 (bivalent) の抗体断片を指す (P. Holliger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90： 6444-644 8 (1993)、 EP404, 097号、 W093/11161号等）。一般にダイァボディは、 2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中で軽鎖可変領域 ( )及び重鎖可変領域 (V_H)が、互いに結合できない位に短い、例えば、 5残基程度のリンカ一により結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされる V_Lと V_Hとは、その間のリンカ一が短いため単鎖 V領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、ダイァボディは 2つの抗原結合部位を有することとなる。このとき 2つの異なる抗原 (a、 b)に対する V_Lと V_Hを V_La-V_Hbと V_Lb - V_Haの組合わせで 5残基程度のリンカーで結んだものを同時に発現させると二種特異性 Db として分泌される。本発明の抗体としては、このような Dbであってもよい。

一本鎖抗体（scFvとも記載する）は、抗体の重鎖 V領域と軽鎖 V領域とを連結することにより得られる。 scFvの総説については、 Pluckthun『The Pharmacology o I Monoclonal Antibodiesj Vol. 113 (Rosenburg及ぴ Moore編、 Springer Verlag, N ew York, pp. 269- 315 (1994))参照。一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、国特許第 4， 946, 778号、米国特許第 5， 260， 203号、米国特許第 5, 091， 513号、米国特許第 5， 455， 030号等を参照)。この scFvにおいて、重鎖 V領域と軽鎖 V領域は、リンカ一、好ましくはポリペプチドリンカ一を介して連結される（Huston, J. S. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1988， 85, 587 9-5883) 。 scFvにおける重鎖 V領域および軽鎖 V領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。 V領域を連結するペプチドリンカ一としては、例えば 12〜19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。 scFvをコードする DNAは、前記抗体の重鎖または重鎖 V領域をコードする DNA、およぴ軽鎖または軽鎖 V領域をコードする DNAのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のァミノ酸配列をコードする DNA部分を铸型とし、その両端を規定するプライマー対を用いて PCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカ一部分をコードする DNA、およびその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一且 scFvをコードする DNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、およぴ該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従って scFvを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG) 等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。

得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精す Oこと力 Sでさる (Strategies for Protein Purification and Charcterizat ion: A Laboratoy Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds. , Cold Spring

Harbor Laboratory Press (1996) ； Antibodies ： A Laboratory Manual. Ed Har low and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) カ、これらに限定されるものではない。クロマトグラフィーとしては、ァフィ二ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水 1"生クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーは、 HPLCや FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。ァフィ二ティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プ口ティン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙げられる。例えばプロテイン Aカラムを用いたカラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) 等が挙げられる。また抗原を固定ィ匕した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。

本発明は、本発明の抗体を含む、 PCIの活性の阻害剤を提供する。また本発明は、本発明の抗体の、 PCIの活性の阻害のための使用に関する。また本発明は、本発明の抗体と PCIとを接触させる工程を含む、 PCIの活性を阻害する方法に関する。本発明の抗体を PCIと接触させることにより、 PCIによる aPC生成の阻害および/または PCIによる aPC活性の阻害を抑制することができる。また本発明は、本発明の抗体を含む、 aPCの生成おょぴまたは活性の増強剤を提供する。また本発明は、本発明の抗体の、 aPCの生成および/または活性の増強のための使用に関する。本発明の抗体を PCIと接触させる工程により、 PCIの阻害を通して、内在性または外来の PCの活性ィ匕の低下および/または aPC活性の低下を抑制することが可能である。本発明の抗体を投与する場合、抗体は単独で投与することも可能であり、また、 PCおよび/または aPCと併用することも可能である。

aPCは血液凝固および炎症を抑制する作用が知られており、本発明の PCI中和抗体を投与する工程により、血液凝固または炎症を抑制する aPCの効果を高めることが可能となる。本発明は、本発明の抗体を投与する工程を含む、血液凝固または炎症を抑制する方法に関する。該方法においては、さらに PCおよび/または aPCを投与する工程を食んでもよい。この場合、 PCおよび/または aPCと本発明の抗体とを予め混合しておき、それを投与することができるし、別々に投与してもよい。本発明の抗体を有効成分とし含有する医薬製剤を用いることにより、 aPCによる処置（例えば血栓症およぴ敗血症等の予防およぴ治療）における aPCの効果をより高めることが可能となる。なお本発明の抗体を「有効成分として含有する」とは、本発明の抗体を活性成分の少なくとも 1つとして含むという意味であり、本発明の抗体の含有率を制限するものではない。本発明の抗体は、活性化プロテイン C の活 1 "生の低下ないしは不足によって発症および/または進展する疾患の予防または治療に有用であり、その中でも血液凝固反応の亢進および/または炎症反応の亢進によって惹起される疾患の予防および/または治療に特に有効である。そのような疾患としては、具体的には例えば動脈血栓症、静脈血栓症、播種性血管内凝固（D isseminated Intravascular Coagulation; DIG) 正候群、敗血；/正等挙げられるまた本明は、（a ) 本発明の抗体、および（b ) PCおよび/または aPCを含むキットを提供する。このキットは、活性ィ匕プロテイン Cの活性の低下ないしは不足によって発症および/または進展する疾患の予防または治療に使用することができる。さらに本発明は、活性ィ匕プロテイン Cの活性の低下ないしは不足によって発症および/または進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（a ) PC、 aPC、およぴ本発明の抗体からなる群から選択される少なくとも一つ、および（ b ) 治療有効量の PCおよび/または aPCと該抗体とを併用することの記载または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含むキットを提供する。このような疾患としては、上記のように血液凝固反応の亢進および/または炎症反応の亢進によつて惹起される疾患が挙げられ、具体的には動脈血栓症、静脈血栓症、 DIC、敗血症等が含まれる。本キットは、内因的 aPCあるいは生体外から投与した PCまたは aPC の体内における活性を相対的に上昇させるために有用であり、これにより上記疾患の予防おょぴ治療を行うことができる。記録媒体としては、紙およびプラスチックなどの印刷媒体、フレキシブルデイスク（FD) 、コンパクトディスク（CD) 、デジタルビデオディスク（DVD) 、半導体メモリ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体など所望の記録媒体が挙げられる。典型的には、キットに添付される指示書などが挙げられ、そこに治療有効量の PCおよび/または aPCと本努明の抗体とを併用することが記載されているものであってよい。リンクとは、直接には治療有効量の PCおよび/または aPCと該抗体とを併用することは記載されていないが、印などによって該記載と関連付けられていることを言い、その印を通して該記载にたどり着ける場合である。例えば指示書には別紙または URLなどを参照するように指示または示唆する記載があり、別紙または URLに該記載がある場合などが含まれる。このようなリンクは、 3回までの参照（リンクの深さが 3以内）で該記載までたどり着けることが好ましく、より好ましくは 2回の参照（リンクの深さが 2 ) 、より好ましくは 1回の参照（リンクの深さが 1) である。

本発明の抗体は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重 1 kgあたり 0. 0001 mgから 1000 mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり 0. 001~100000 mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗体はこれらの投与量に制限されるものではない。

本発明の抗体は、常法に従って製剤化することができ（例えば、 Remington' s P harmaceutical Science, latest edition, Mark PuDiishing Company, Easton, U . S. A) 、医薬的に許容される担体および/または添加物を供に含むものであってもよい。例えば界面活个生剤 (PEG, Tween等）、賦形剤、酸化防止剤（ァスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クニン酸、他の有機酸等）、キレート剤（EDTA等) 、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケィ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビュルァセタールジェチルァミノアセテート、ポリビュルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリダリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸を含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、 D-ソルビトール、 D-マンノース、 D -マンニトール、塩化ナトリゥムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、 PEG等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート 80、 HC0-50) 等と併用してもよい。

また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセル口ース、ゼラチン、ポリ [メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リボソーム、アルブミンミクロスフヱァ、マイクロエマルジヨン、ナノ粒子及ぴナノカプセル等）とすることもできる（ "Remington s Pharmaceutical Science 16^th edition , Oslo Ed. (1980)等参照) 。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の抗体に適用し得る（Langer et al. , J. Biomed. Mater. Res. 15： 167—277 (1981) ; Langer, C hem. Tech. 12： 98-105 (1982)；米国特許第 3, 773， 919号;欧州特許出願公開（EP)第 58， 481号; Sidraan et al. , Biopolymers 22： 547-556 (1983) ;ΕΡ第 133， 988号）。また、本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与方法としては、 nakedプラスミドによる直接投与の他、リボソーム等にパッケージングするか、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、ボックスウィルスべクター、アデノ随伴ウィルスベクター、 HVJベクター等の各種ウィルスベクターとして形成するか（Adolph『ウィルスゲノム法』 , CRC Press, Florid (1996)参照）、または、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆 (W093/17706等）して投与することができる。し力しながら、生体内において抗体が発現され、その作用を発揮できる限りいかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路（静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、添鼻薬等粘膜経路を介する方法等）により十分な量が投与される。 ex vivoにおいてリポソームトランスフエクシヨン、粒子衝撃法（米国特許第 4， 945, 050号）、またはウィルス感染を利用して細胞に投与し、該細胞を動物に再導入することにより本発明の抗体をコードする遺伝子を投与してもよい。図面の簡単な説明 ,

図 1は、 PCI cDNAの塩基配列（タグなし）を示す図である。全長 PCI遺伝子の塩基配列を示した。動物細胞用発現ベクター（pCHOI) の EcoRI- BamHI間に挿入する目的で 5'末端おょぴ 3'末端にそれぞれ EcoRIおよび BaraHI認識配列（下線）を、さらに転写効率を上げるために開始コドンの手前に Kozak配列を付加してある。塩基配列を配列番号： 4、アミノ酸配列を配列番号： 5とした。

図 2は、 PCI cDNAの塩基配列（FLAGタグ付き）を示す図である。 Flagタグ付きの PCI遺伝子の塩基配列を示した。動物細胞用発現ベクター（pCH02-FLAG) の EcoR I- BamHI間に全長 PCIをコードする cDNAを挿入することにより、全長 PCI遺伝子の 3' 側に Flag配列（波線）を付加した。塩基配列を配列番号： 6、アミノ酸配列を配列番号： 7とした。

図 3は、 PCI- Flag: ^よび PCIの SDS - PAGEとウェスタンプロッティングによる分析結果を示す写真である。（A) PCI-Flag (レーン 1および 2) 、または（B) タグなしの PCI (レーン 3および 4) を SDS - PAGEにより分離し、クマシ一プル一染色（レーン 1および 3) または抗 PCI抗体を用いたウェスタンプロッティング（レーン 2および 4 ) により検出した。 .

図 4は、各抗 PCI抗体の aPC/PCIおよぴ Thr/TM/PCIァッセィにおける中和活性の比較を示す図である。白い円は aPC/PCIアツセィ、黒い円は Thr/TM/PCIアツセィの結果を表す。 PCI非添加時を 100%とし、 PCI添加で抗体非添加時を 0%とした時の相対値で示した。

図 5は、各抗 PCI中和抗体の H鎖のアミノ酸配列を示す図である。 CDR1、 2および 3を囲みで示した。図中のアミノ酸配列は上から順に配列番号： 8〜： 14とした。図 6は、各抗 PCI中和抗体の L鎖のアミノ酸配列を示す図である。 CDR1、 2および 3を囲みで示した。図中のアミノ酸配列は上から順に配列番号： 15〜21とした。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、全て本明細書の一部として組み込まれる。

[実施例 1 ] PCI発現べクターの構築

1. 1 PCI遺伝子のクローニング

全長 PCI遺伝子のクローニングは以下のプライマーを用いた PCR法によって行つた。

PCI-up : 5' - ACG AAT TCC ACC ATG CAG CTC TTC CTC (配列番号： 1 )

PCI- low: 5"- CTG GAT CCT CAG GGG CGG TTC ACT TTG C (配列番号： 2 ) Human kidney marathon ready cDNA (Clontech) を铸型にして上言己プライマ一により PCRを行い、 5'末端に EcoRI配列、 3'末端に BamHI配列を持つ全 0RFを含むヒト PCI遺伝子を増幅した。増幅された DNA断片を EcoRIと BamHIで消化し、動物細胞発現ベクターである pCHOIの EcoRIと BamHI切断部位に揷入した。ベクター中の PCI 遺伝子について塩基配列を解析し、正しい配列を有したプラスミドを選別することで pCHOI - PCIベクター構築を完了した。（図 1 ) また、 Flagタグ付き PCI (PCI- Flag) 発現ベクターの構築は以下のとおり行った。 pCHOI- PCIベクターを鏡型にして、 PCI- up及ぴ PCI- low2プライマーを用いて PCR を行！/、PCI遺伝子の増幅を行つた。

PCI-low2: 5，— TTG GAT CCG GGG TTC ACT TTG CCA AG (配列番号： 3 ) この DNA断片を EcoRIと BamHIで消化し、クローニングサイトの直後に Flagタグを動物細胞発現ベクター pCHOII- Flagの EcoRIと BamHI切断部位に挿入した。塩基配列を確認し、 pCHOII- PCI- Flagの構築を完了した。（図 2 )

1. 2 PCIおよび PCI- Flag産生細胞株の撤立

pCHOI-PCI, pCHOII- PCI- Flagをそれぞれ Pvulで切断し、直鎖化を行った。この D NA 30 gを CH0細胞（DXB11株）にエレクト口ポレーシヨン法により導入した。その後、細胞を 5 % FBS (GIBCO BRL CAT#10099-141) を添加した ο; (-) MEM (核酸未含有）（GIBCO BRL CAT# 12561 - 056) で培養し、 PCIあるいは PCI- Flag産生株の選抜を行った。この段階で得られた細胞株を、終濃度 50 nMとなるように MTXを加えた同培地で培養し、高産生細胞株を樹立した。 PCIおよび PCI-Flagの発現は抗 PCI 抗体（Affinity Biologicals CAT#GAPCI-IG) を用いて確認した。

[実施例 2 ] PCト Flagの精製

PCI- Flag高発現 CH0株を、ローラーボトル（1700 cm²) を用いて、 5 % FBSを添加した（-) MEM (核酸未含有）培地中で培養を行った。細胞がコンフルェントになるまで培養（37°C、 0. 5 rpm) した後、培地除去および PBSによる洗浄を行い、 C H0 - S- SFMII培地（GIBCO BRL CAT#12052_098) を添加し 72時間培養した。得られた培養上清は、遠心分離により細胞破碎物を除去後、 0. 45 μ ιηフィルターによりろ過して以下の精製に用いた。培養上清を 0. 05% Tween20を含む 50 mMトリス緩衝液 (_PH 7. 0)で平衡化した CM sepharose Fast Flowカラム（Amersham CAT# 17-0719-01)に添加し、洗浄後、 400 mM NaClを含む同緩衝液により溶出した。溶出画分を NaCl濃度が ²00 mMとなるよう希釈し、 150 mM NaClと 0. 05% Tween20を含む 50 mMトリス緩衝液 (pH7. 4)で平衡ィ匕した Ant i - Flag M2 agarose affinity gel カラム（SIGMA CA T#A-2220) に添カ卩した。溶出は 0. 05% Tween20を含む 100 mM グリシン緩衝液 (pH3 . 5)により行い、溶出画分は 1 M トリス緩衝液 (pH8. 0)にて、直ちに中和した。次に、 PCI- Flagを含む画分を 0. 05% Tween20を含む 50 mM リン酸緩衝液 (pH7. 0)で平衡化した CM sepharose Fast Flowカラムに添加後、 400 mMの NaClを含む同緩衝液で溶出を行うことにより溶媒置換を行った。さらに Centricon YM-3 (Ami con) による限外ろ過濃縮を行い、 PCI- Flagを調製した。精製タンパクは SDS-PAGEにより分離したのち、クマシ一染色、および PVDF膜へ転写し、抗 PCI抗体によるウェスタン解析により確認した。（図 3 A)

[実施例 3 ] PCIの精製

PCI高発現 CH0株を、上記同様の方法にてローラーボトル（1700 cm²) を用い、培養上清を調製した。培養上清を 0. 05% Tween20を含む 50 mMトリス緩衝液 (_PH7. 0) で平衡化した CM sepharose Fast Flowに添カ卩し、洗浄後、 400 mM NaClを含む同緩衝液により溶出した。次に、 PCIを含む画分を 0. 05% Tween20を含む 10 mM リン酸緩衝液 (PH7. 0)で平衡ィ匕した HiTrap Heparin HP (Amersham CAT# 17-0407- 01)カラムに添加し、段階的に NaCl濃度（0 mMから 1000 ）を上昇させることにより溶出を行った。溶出画分を Superdex 200 26/60カラム（Amersham CAT# 17-1071-01) に添加し、分子量に従って分画した。溶媒には 0. 01% Tween 20を含む PBS (PBS-T ) を用いた。これを 2回繰り返し、 PCIを精製した。精製タンパクは SDS- PAGEにより分離したのち、クマシー染色および PVDF膜へ転写し抗 PCI抗体によるウェスタン解析で確認した _ώ (図 3 Β) +

[実施例 4 ] PCIに対する中和活性を持つ抗 PCI抗体の作製

4. 1 免疫及ぴハイブリドーマの作製

PCI- Flagを免疫抗原として、 Balbんマウス（雌、 13週齢、日本チャールズリバ一） 5匹に定法に従い免疫を行った。初回免疫には抗原を lOO /z g/headとなるように調製し、 FCA {フロイント完全アジュパント（H37 Ra) 、Difco (3113-60) ベタトンディッキンソン（cat#231131) } を用いてェマルジヨン化したものを皮下に投与し、 2週間後に 50 /z _g/headとなるように調製したものを FIA {フ口イント不完全アジュパント、 Difco (0639- 60) 、ベタトンディッキンソン（cat#263910) } でェマルジヨン化したものを皮下に投与した。以降、 2週間間隔で追加免疫を合計 5 回行い、最終免疫については 50 /z g/headとなるように PBSに希釈し尾静脈内または皮下に投与した。 PCIを 0. 5 μ _§/ηι1， ΙΟΟ μ Ι/wellでコートしたィムノプレートを用いた ELISAにより PCIに対する血清中の抗体価が上昇しているのを確認後、 No. 2マウスは尾静脈内、 No. 4マウスは皮下に最終免疫を施し、定法に従い、マウスミエローマ細胞 P3U1とマウス脾臓細胞を混合し、 PEG1500 (ロシュ ·ダイァグノスティック、 cat#783 641) により細胞融合を行った。それぞれマウス由来のハイブリド一マは 96穴培養プレート 16枚ずつ培養した。フュージョン翌日より HAT培地 {10% FBS I RPMI1640 / 1 x HAT media supplement (SIGMA CAW H- 0262) I 4% BM-Con dimed HI Hybridoma cloning supplement (Roche CAT# 1088947) } で選択を開台し、フュージョン後 10日目に培養上清を回収し ELISAスクリーニングを行った。 EL ISAスクリ一二ングは前述の抗体価測定と同様に PCIを 0. 5 μ g/ml， 100 1/wellでコートしたィムノプレートを用いて行った。

4. 2 スクリーニング

4. 2. 1 ELISA

PCIを用いた ELISAスクリ一-ングにより陽 1生ゥエルを選択した。選択した陽个生ゥエルは 24ゥエルプレートに拡大した後、限界希釈法（ 1陽性ゥエルの細胞 100個を 96ゥヱルプレート 1枚に播き込む）によりクローニングした。クローユングしたハイプリドーマを拡大培養し、培養上清から抗体の精製を行った。 290個の陽性ゥエルを選択し 24ゥエルプレートに拡大した後、 1次スクリーニングで 0D値の高かつた方から 111個を選ぴ、 P 界希釈法によりクローニングを行った。限界希釈を行わなかった 179個は培養上清を回収し、細胞の保存のみを行った。 111個の限界希釈を行ったゥエルから最終的に抗体を安定に産生する 81クローンを樹立した。

4. 2. 2 aPC/PCIアツセィ aPC/PCIアツセィによる PCIに対する中和活性の測定法は、反応液（50 mM Tris- HC1 (pH8. 0) , 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 0. 1% BSA, 5 U/ral Heparin) にハイプリドーマの培養上清または精製抗体、及び ^ g/ml PCIを添加して 37°C、 30分加温した。 0. 25 t g/ml aPCを添加してさらに 37°C、 30分力卩温した。 0. 4 mM Spectrozym e aPC (American Diagnostica Inc. ) を添加し室温で 2時間反応させた後、 405 nm で比色した。（以上、表示濃度はすべて最終濃度）。単一クローン化したハイブリドーマの培養上清 81検体について、 aPC/PCIアツセィを行い、 PCI活性が中和されることにより aPC活性が回復されるクローンの選抜を行った。 PCIに対する中和活性が強かったクローンから順番に 16クローンを選択し、培養上清から Protein G カラムにて抗体の精製を行った。精製した抗体を用いて、 aPC/PCIアツセィを行つたところ、 16クローン中 8クローンに抗体の用量に依存した強い中和活性が確認された。これらのうち 7クローンの用量依存曲線を図 4に示した。

4. 2. 3 Thrombin (Thr) /Thrombomodulin (TM) /PCIァッセィ

Thrombin (Thr) /Thrombomodulin (TM) /PCIァッセィによる PCIに対する中和活性の測定法は、反応液（50 mM Tris-HCl (pH8. 0) , 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 0. 1% B SA, 5 U/ml Heparin) に精製抗体、 5 z g/ml PCI、 2 nM Thr, 10 nM TMを添カロして 37°C、 30分加温した。 0. 73 /i g/ml PCを添加してさらに 37°C、 50分加温した後、 0. 875 μ g/ml argathrobanを加えて反応を停止した。 0. 4 mM Spectrozyme aPCを添加し室温で 2時間反応させた後、 405 nmで比色した。（以上、表示濃度はすべて最終濃度）。 ' ·

精製した抗体で aPC/PCIァッセィにて中和活性が確認された 7クローンについて T hr/TM/PCIアツセィを行った。その結果、 7クローン中 3クローン（PC31E2、 PC31F1 、および PC30G1) ίこついて用量に依存した強い中和活 1"生が確認された（図 4 ) 。

4. 3 抗体精製

アイソタイプが IgGl、 IgG2a、 IgG2bであった抗体は、それぞれハイプリドーマ培養上清を 20 mM リン酸緩衝液 (pH7. 0) で平衡ィヒした Hi Trap Protein G HP (Am ersham CAT# 17 - 0404-01) に添加し、洗浄後、 0. 1 M グリシン緩衝液 (pH2. 7) で溶出することにより精製した。溶出画分は 1 M トリス緩衝液 (pH9. 0) で直ちに中和を行った。抗体を含む画分をプールした後、 0. 05% Tween20を含む PBSで一昼夜、透析を行レ、溶媒置換後、 0. 02%となるように NaN₃を添加した。

4. 4 抗 PCI抗体のアイソタイプ解析

抗 PCI抗体のァイソタイピングは、 I匪 unoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit II (PIERCE CAT# 37502) を用い、方法は添付のマニュアルに従った。樹立した抗 PCI抗体 81クローンについてアイソタイプ解析をしたところ、 IgGlが 70ク口ーン、 IgG2aが 6クローン、 IgG2bが 4クローン、 IgMが 1クローンであった。

4. 5 BIACOREによる抗 PCI抗体の速度論的解析

10 MM酢酸ナトリウム（_ΡΗ5· 0) で 25 g/mlに希釈した PCI- Flagを用いて、アミンカップリングキット（BIACORE社、 BR- 1000-50) に記載された方法にて、センサ一チップ CM5 (BIACORE社、 BR- 1000-14) にァミンカップリングした。この操作にて約 3000 RUの PCI-Flagが、 CM5チップ上に固定化された。このセンサーチップを用いて BIAC0RE2000により以下の速度論的解析を行った。各抗 PCI抗体を HBS- EP緩衝液（BIACORE社、 BR-1001-88) にて希釈して、 1. 25、 2. 5、 5、 10、 20 / g/mlになるように調製した。チップを HBS- EP緩衝液で平衡化後、流速 20 μ 1/ηΰηにて各濃度の抗体 40 1を添カ卩した。抗体を添カ卩中の 2分間を結合相とし、その後 HBS- ΕΡ緩衝液に切り換え、 2分間を解離相とした。解離相終了後、 40 μ 1の 10 raM塩酸、及ぴ 40 1の 0. 05% SDSを連続して添加することにより、センサーチップを再生した。この操作により得られたセンサーグラムを重ね書きし、データ解析用ソフト（B IAevaluation , ver. 3. 0) にて結合速度定数 (ka) 、解離速度定数（kd) 、解離定数（KD) 、最大結合量（Rmax) を算出した。

精製抗体を用いた aPC/PCIァッセィにて PCIに対する強い中和活性の認められた 8 つのクローンについて BIACOREによる速度論的解析を行った結果、解離定数が 10_⁹ 〜10— ^1Q Mで比較的高親和性の抗体が多く含まれていることが明らかとなった。表に得られたクローンの抗 PCI抗体の性質をまとめた。表 1 中和抗体の性質

[実施例 5 ] 抗 PCI中和抗体の H鎖及び L鎖の解析

各抗体を産生するハイプリドーマ約 I X 10⁷個の細胞より R easy Plant Mini Ki ts (QIAGEN、 Cat. No. 74904) を用いて total RNAの抽出を行った。 SMART RACE c DNA Amplification Kit (Clontech、 Cat. No. K1811-1)を用いて、 total RNAから cDNAの合成を行った。 PC19G8、 PC30G1、 PC31E2、 PC31F1、 PC39C6は IgGlの定常領域特異的なプライマー、また PC23A7、 PC23D8は IgG2aの定常領域特異的なプライマ一を用いて Advantage2 PGR Kitにて 5， -RACEによる PCRを行い、 H鎖及ぴ L鎖の増幅を行った。増幅された H鎖及ぴ L鎖の DNA断片は pGEM- T easy vector (Promega, Cat . No. A1360)を用いてクローニングし、塩基配列の決定を行った。

得られた塩基配列を解析した結果、 H鎖及ぴ L鎖の可変領域のァミノ酸配列はそれぞれ図 5及び 6に示したようになった。 PC19G8、 PC23D8はァミノ酸配列が一致したことから、同一クローン由来の抗体であることが予測された。ただし、 Isoty peは、 PC19G8は IgGlで PC23D8は IgG2aであったので、クラススィッチが起きたと考えられた。 PC23A7及び PC39C6は上記 2クローンの抗体に類似した配列を有しており、これら 4クローンの抗体のェピトープが近傍にあることが予測された。一方、 PC30G1と PC31F1の配列は、前述の 4クローンの抗体との類似性は低かったが、これら 2クローンは類似の配列を有していたのでお互いのェピトープは近いことが予測された。 PC31E2の配列に関しては他の 6クローンとは類似性が低、ことが明らかとなった。 PC19G8、 PC23A7、 PC23D8 、 PC39C6は aPC - PCI系のみ、また PC30G 1、 PC31E2、 PC31F1は aPC - PCI系及ぴ Thr - TM - PCI系の両方を抑制することから、配列上のグループ分けが PCIに対する中和活性の様式にほぼ反映していることが推察された。産業上の利用の可能性

本発明により、 PCIに対し中和作用を有する抗 PCI抗体が提供された。本発明の抗体は、 aPCの生成および酵素活性を阻害する PCIに対して、その活性を阻害するように働くことを通して aPCの活性を維持し、血液凝固系の活性ィ匕の抑制または抗炎症作用などの aPCの生理活性の効果を持続させる働きを有する。本発明の抗体は、活性化プロティン Cの活性の低下ないしは不足によって発症および/または進展する疾患または傷害の予防または治療に用いることができ、特に血栓症おょぴ敗血症などの aPCによる予防おょぴ治療におレ、て有用である。

Claims

請求の範囲

1. 抗 PCI抗体であって、（a) 活性ィ匕プロテイン C (aPC) 活性に対するプロティン Cインヒビター（PCI) の阻害作用を阻害する活性、または（b) トロンビン/トロンボモデュリン（Thr/TM) 複合体による活性ィ匕プロテイン C (aPC) 生成に対するプロテイン Cインヒビター（PCI) の阻害作用を阻害する活十生、の少なくともいずれかを有する抗体。

2. 抗 PCI抗体であって、（a) 活性ィ匕プロテイン C (aPC) 活性に対するプロティン Cインヒビター（PCI) の阻害作用を阻害する活性、および（b) トロンビン/トロンボモデュリン（Thr/TM) 複合体による活性化プロテイン C (aPC) 生成に対するプロテイン Cインヒビター（PCI) の阻害作用を阻害する活生、の両方を有する f几体。

3. PC19G8、 PC23A7、 PC23D8、 PC30G1、 PC31E2、 PC31F1、および PC39C6からなる群より選択される抗体の可変領域を含む抗体と、抗体認識部位が競合する、請求項 1または 2に記載の抗体。

4. 請求項 1または 2に記載の抗体であって、以下の（a) から（f) のいずれかのァミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有する抗体。

( a ) 配列番号： 49、 50、および 51に記載のァミノ酸配列。

(b) 配列番号： 55、 56、および 57に記載のアミノ酸配列。

( c ) 配列番号： 52、 53、 54およびに記載のァミノ酸配列。

( d ) 配列番号： 58、 59、 60およびに記載のァミノ酸配列。

( e ) 配列番号： 25、 31、および 36に記載のァミノ酸配列。

( f ) 配列番号： 41、 45、および 48に記載のァミノ酸配列。

5. 抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体断片、一本鎖抗体、およびダイアポディーからなる群より選択される、請求項 1または 2に記載の抗体。

6 . 請求項 1または 2に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物

7 . さらにプロテイン Cおよび/または活性ィ匕プロテイン Cを含む、請求項 6に記載の組成物。

8 . 活性化プロティン Cの活性の低下ないしは不足によって発症および/または進展する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物である、請求項 6に記載の組成物。

9 . 疾患が血液凝固反応の亢進および _ または炎症反応の亢進によって惹起される疾患である請求項 8に記載の組成物。

1 0 . 血液凝固反応の亢進および/または炎症反応の亢進によって惹起される疾患が、敗血症、播種性血管内凝固症候群、動脈血栓症、および静脈血栓症からなる群より選択される、請求項 9に記載の組成物。

1 1 . 活性化プロテイン Cの活性の低下ないしは不足によって発症および/または進展する疾患を予防または治療する方法であって、（a ) プロテイン Cおよび/ または活性ィ匕プロテイン C、並びに（b ) 請求項 1または 2に記載の抗体、を投与する工程を含む方法。

1 2 . 活性化プロテイン Cの活性の低下ないしは不足によって発症および Zまたは進展する疾患を予防または治療する方法であって、請求項 1または 2に記載の抗体を投与する工程を含む方法。

1 3 . 活性化プ πティン Cの活性の低下ないしは不足によって発症および/または進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（a ) 請求項 1または 2に記載の抗体、および（b ) プロテイン C、活性化プロテイン C、またはその両方、を含むキット。

1 4 . 活性ィ匕プロテイン Cの活性の低下ないしは不足によって発症おょぴ Zまたは進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（a ) プロテイン C、活性化プロテイン C、および請求項 1または 2に記載の抗体、および（b ) ( i)治療有効量のプロテイン Cおよび Zまたは活性ィ匕プロテイン C、並びに（ii)該抗体、を併用することの記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含むキッ卜。