WO2004054657A1 - Combined antisense oligonucleotide cancer therapy - Google Patents

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WO2004054657A1
WO2004054657A1 PCT/EP2003/014043 EP0314043W WO2004054657A1 WO 2004054657 A1 WO2004054657 A1 WO 2004054657A1 EP 0314043 W EP0314043 W EP 0314043W WO 2004054657 A1 WO2004054657 A1 WO 2004054657A1
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    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • Cancer therapies traditionally include radiation and chemotherapy in addition to surgical tumor removal. While surgical removal and radiation therapy are only possible in the case of precisely localized diseases, chemotherapy can also be used to treat metastatic cancers. However, chemotherapy is generally not a very specific form of treatment, which on the one hand leads to strong or hardly tolerable side effects and on the other hand only has a limited effectiveness.
  • the inhibition of gene expression by asOe can be carried out in at least four ways:
  • the mRNA-DNA hybrids formed are cut up by RNase H, the polyadenylation or the transport of the finished mRNA into the cytoplasm can be inhibited by asOe, the initiation of mRNA translation can, for example, by Interference with the construction of the ribosomal complex can be inhibited and finally protein elongation can be sterically prevented by the bound asO.
  • the asOe in order to be able to develop their effects, the asOe must be stable enough to withstand early degradation in the organism and secondly they must be able to reach their place of action within the cell or within the cell nucleus.
  • genes against which asO therapy is already in clinical trials include c-Raf-1 kinase (ISIS 5132, ISIS / Novartis), Bcl-2 (G3139, Genta) and H-Ras (ISIS 2503, SIS ).
  • c-Raf-1 is a serine / threonine kinase that plays an important role in cell growth and survival.
  • Gokhale et al. (1999, Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 9, 191-201) report that treatment of tumors with asOen against c-Raf-1 leads to inhibition of tumor growth but not to regression of the tumors.
  • Plkl is overexpressed in over 90% of all human carcinomas, which is associated with increased mitotic activity and a poor prognosis (Wolf et. Al., 1997, Oncogene 14, 543-9; Knecht et al., 1999, Cancer Res. 59, 2794 -7). Impairment of Plkl function in cancer cells leads to abnormal mitosis with subsequent mitotic cell death (Lane and Nigg, 1995, J. Cell Biol. 2, 1701-13), therefore Plk-1 represents a potentially interesting target for asO cancer therapy. Elez et al. (2000, Biochem. Biophys. Res. Comm. 269, 352-6 and DE 100 11 530 A1) report a significant reduction in tumors in a human tumor xenograft mouse model after prolonged treatment with Plk1-asO. However, complete remission could not be achieved.
  • the corresponding antisense oligonucleotides can be administered simultaneously or alternately. When administered simultaneously, the corresponding antisense oligonucleotides can be present together in a pharmaceutical formulation or else can be formulated separately.
  • the corresponding antisense oligonucleotides are administered together twice a week.
  • the corresponding antisense oligonucleotides are administered alternately once a week, ie first the asO, a few days later the second, so that asOe are administered twice a week, but each individually and therefore once a week.
  • the asOe are preferably in one Amount of approximately 5 mg / kg body weight administered, it being clear that it is the responsibility of the doctor to adjust the dose and the number of administrations in each specific case depending on the patient, the disease or the medical history.
  • the antisense oligonucleotides are preferably short-chain deoxyribonucleic acids with a length of 10-55 bases, preferably 12-40 and very particularly preferably 15-30.
  • the antisense oligodeoxynucleotides are preferably modified against enzymatic degradation.
  • the substituents known in the prior art either individually or in combination, are suitable as modifications. Suitable modifications are the incorporation of phosphotriester, phosphoramide, methylphosphonate, phosphorothioate and peptide nucleic acid bonds into the structure of the oligonucleotides. Because of its increased stability and the ability to trigger RNase H activity, phosphorothioate-modified asOe are particularly preferred.
  • the asOe directed against Plkl are preferably directed against human Plkl.
  • the corresponding preferred gene according to the invention can be found at Genebank Acc. No .: NT_010604, from bp 635298 - 646820.
  • the corresponding mRNA sequence can be found under Genebank Acc. No .: X73458.
  • the asOe directed against Bcl-2 are preferably directed against human Bcl-2.
  • the corresponding gene preferred according to the invention can be found (complementarily) under the Genebank Acc. No .: NT_033907, bp 4363332 - 4559938.
  • the corresponding mRNA sequence can be found under Genebank Acc. No .: M13994, as well as M14745, the Genebank Acc. No. the splice variant a is NM_000633 and the splice variant ß is NM_000657.
  • the medicament according to the invention is preferably used for the therapy of cancer cells which overexpress Plkl, Bcl-2 or both genes.
  • FIG. 1 Antisense oligonucleotides down-regulate Plkl expression in A549 cells.
  • A549 cells were treated with Dotap lipofection with JWG160 (SEQ ID No .: 4) or JWG370 (SEQ ID No .: 6) antisense oligonucleotides (1 ⁇ M each). After 48 h of incubation, the total protein was extracted and examined by Western blot analysis. Control: untreated cells. Dotap: lipofection only. JWG160-MM and JWG370-MM: corresponding mismatch oligonucleotides (SEQ ID No .: 20 and SEQ ID No .: 21).
  • Figure 2 Inhibition of proliferation by anti-PIkl (JWG160; SEQ ID No .: 4) and anti-Bcl-2 (G3139; SEQ ID No .: 19) oligonucleotides.
  • Figure 3 Fluorescence micrographs of MDA-MB-435 xenografts with FITC-labeled antisense oligonucleotides.
  • Figure 4 Antitumor activity of anti-PIkl (JWG160; SEQ ID No .: 4) and anti-Bcl-2 (G3139; SEQ ID No .: 19) oligonucleotides in NMRI nude mice, the A549, MDA-MB-435, Detroit562 and primary abdominal cancer tumors.
  • Antisense oligonucleotides (G3139 and JWG160) were administered intravenously twice a week or as a successive combination in doses of 5 mg / kg by bolus injection. Five minutes after administration of the asOe, five high-voltage pulses were administered to the tumor (400 V / cm 2 , at 10 ms intervals). After four weeks of treatment, the mice were sacrificed, the tumors were prepared and the tumor mass was determined using a precision balance. (a) Inhibition of tumor growth of A549 tumors by therapy with G3139 and JWG160 asOen and electroporation. (b) Inhibition of tumor growth of Detroit562 tumors by therapy with G3139 and JWG160 asOen and electroporation.
  • FIG. 5 Electroporation-supported treatment with anti-PIkl (JWG160; SEQ ID No .: 4) and anti-Bcl-2 (G3139; SEQ ID No .: 19) oligonucleotides inhibits MDA-MB-435 tumor growth in vivo.
  • JWG160 Antisense against Plkl with electroporation (5 x 400 V / cm 2 for 10 ms, twice a week for 4 weeks).
  • JWG160 & G3139 combination therapy with asOen against Plkl and Bcl-2 using the identical electrical pulse regime, (a) photograph of the removed tumors after 4 weeks of electroporation-assisted antisense therapy. Control: untreated animals. Electro: electroporation without the use of asOen.
  • the protein extracts of each individual lane were obtained from different tumors and analyzed by means of anti-PIkl and anti-Bcl-2 immunoblotting and with anti-ß-actin reprobed.
  • the oligonucleotides were produced using an automatic DNA synthesizer (Perseptive 8909; BioSpring GmbH; Frankfurt) using a method known in the art.
  • the phosphorothiaot backbone of the oligonucleotides was completely modified.
  • the oligonucleotides were treated with concentrated ammonia for 16 hours at room temperature.
  • the oligonucleotides were then purified by "reverse phase” chromatography and lyophilized. The lyophilizate was precipitated twice with 1 M NaCl / ethanol and lyophilized again.
  • the radioactive labeling of the antisense strands was carried out with the following primers: PlklAs: 5'-TGA TGT TGG CAC CCT TTC AGC-3 ', GAPDH: sense: 5'-CAC CCA TGG CAA ATT CCA TG-3 ⁇ antisense: 5 -'CAT GGT TCA CAC CCA TGA CG-3 '.
  • Hybridization was carried out in QuickHyb solution (Stratagene, La Jolla, CA, USA) for 1 hour at 68 ° C.
  • the cellular proteins were used using 250 ⁇ l of Rl PA buffer (1 ⁇ PBS, 1% Nonidet P-0, 0.5% sodium deoxycholate,
  • the blots were incubated for 30 min at 50jC in stripping buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.7, 2% SDS and 100 mM ⁇ -mercaptoethanol), extensively with
  • Example 4 Treatment of human (cancer) cell lines with antisense oligonucleotides.
  • the human cancer cell lines A549, Detroit562 and MDA-MB-435 used in cell culture were acquired from the American Type Culture Collection (ATCC) and the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FCS heat-inactivated fetal calf serum
  • the oligonucleotide-containing medium was replaced by normal cell culture medium (10% FCS) and the cells were incubated for a further 24 or 48 hours.
  • the viability of the cells was determined by staining with trypan blue (0.1%), the number of trypan blue negative cells being determined by counting in a counting chamber.
  • Transfected cells treated only with Dotap showed 95 to 100% viability 24 hours after the transfection.
  • JWG370-MM 5'-GAT CAG TCC ACG TTG TG-3 '(SEQ ID No .: 21)
  • G3139-MM 5'-TCT CTC AGC ATG TGC TAT-3 '(SEQ ID No .: 22)
  • Effects directed against cell proliferation were determined by daily determination of the cell number and viability by direct counting using the trypan blue method.
  • the viability of the cells was determined daily for 4 days after treatment with the respective antisense oligonucleotide.
  • the cells were suspended in 0.1% trypan blue and counted. At each point in time, the mean was taken from three counts and the percentage of viable cells was calculated.
  • the animal studies were carried out in groups with 5-6 nude, eight to ten week old Athymie mice (nu / nu) NMRI (Harlan Winkelmann, Borchen). 2x10 6 A549, Detroit562, MDA-MB-435 and primary abdominal cancer cells were injected subcutaneously and subjected to at least three successive transplants before antisense treatment was started. Tumor fragments of approximately 20 to 25 mg were implanted subcutaneously into the left and right side of the animal under anesthetic with urethane. The antisense oligonucleotide treatments started when the tumors reached an average volume of 60 to 90 mm 3 (7 to 14 days after the transplant).
  • Antisense oligonucleotides (G3139 and JWG160) were administered intravenously into the tail vein twice a week or as a successive combination in doses of 5 mg / kg by bolus injection (200 ⁇ l). Five minutes after administration of the asOe, five high voltage pulses were administered percutaneously to the tumor. For this purpose, two steel electrodes were placed percutaneously in parallel on opposite sides of the tumor using contact paste and 5 successive rectangular pulses of 400 V / cm 2 of 10 ms duration were administered to the tumor. There was an interval of 1 s between each pulse. After four weeks of treatment, the mice were sacrificed, the tumors were prepared and the tumor mass was determined using a precision balance.
  • the animals were monitored by general clinical examinations, body weight and tumor growth.
  • oligonucleotides bind to serum albumin and alpha 2 macroglobulin and show biphasic pharmacokinetics (Agrawal et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7595-99).
  • oligonucleotide biodistribution showed that intravenously, subcutaneously or intraperitoneally administered oligonucleotides accumulate mainly in the liver, kidneys or other organs of the reticuloendothelial system (Agrawal et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7595- 99).
  • Fluorescin isothiocyanate (FITC) labeled phosphorothioate oligonucleotides were injected intravenously into nude mice. After five minutes, the tumors were electropermeabilized as described in Example 6. 24 hours later, the tumors were dissected and frozen at -70jC. Five-micron sections were examined by fluorescence microscopy.
  • FITC Fluorescin isothiocyanate
  • Example 8 Immunohistochemical studies, apoptosis assay, mouse tissue and tumors from NMRI nude mice were examined histologically by hematoxylin and eosin staining. Proliferating cells were visualized by staining with Ki67 antibodies (DAKO, Hamburg) and blood vessels were stained with antibodies against von Willebrand factor (vWF). Frozen sections (5 ⁇ m) were fixed in acetone (-20jC, 2 min). The tissue sections were then washed in Tris-buffered saline (TBS) and incubated with the polyclonal rabbit anti-mouse Ki67 antibody (1:25) or the rabbit antiMaus vWF antibody (1: 100) for 60 s at 37 ° C.
  • Ki67 antibodies DAKO, Hamburg
  • vWF von Willebrand factor

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Abstract

The invention relates to a combined antisense oligonucleotide cancer therapy involving the use of an antisense oligodeoxynucleotide directed against polo-like kinase (Plk1) in conjunction with an antisense oligodeoxynucleotide directed against B-cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl-2) proto-oncogene.

Description

Kombinations-antisense-Oligonukleotid- rebstherapie Combination antisense oligonucleotide vine therapy
Krebs ist eine Krankheit, die auf mehreren genetischen Veränderungen der Zellen beruht. Im Laufe der Karzinogenese verlieren die Zellen die Kontrolle über die check-points des Zellzyklus, sowie die unabhängigen Mechanismen, die ungehindertes Wachstum unterbinden sollten, wie beispielsweise die Apoptose. Derartige genetische Fehler führen zu einer erhöhten Überlebensfähigkeit derCancer is a disease that is based on several genetic changes in the cells. In the course of carcinogenesis, the cells lose control over the check points of the cell cycle, as well as the independent mechanisms that should prevent unimpeded growth, such as apoptosis. Such genetic errors lead to increased survivability of the
Klone, Beschleunigung der Proliferation und weiterer genetischer Instabilität derClones, acceleration of proliferation and further genetic instability of the
Zellen.Cells.
Therapien gegen Krebs umfassen klassischerweise neben der chirurgischen Entfernung der Tumoren die Strahlen- und die Chemotherapie. Während die chirurgische Entfernung und die Strahlentherapie nur bei genau lokalisierten Erkrankungen in Frage kommen, lassen sich mit der Chemotherapie ev. auch metastasierende Krebsarten behandeln. Chemotherapien sind aber im Allgemeinen keine sehr spezifischen Behandlungsformen, was einerseits zu starken bis kaum zu tolerierenden Nebenwirkungen führt und andererseits zu einer nur begrenzten Wirksamkeit.Cancer therapies traditionally include radiation and chemotherapy in addition to surgical tumor removal. While surgical removal and radiation therapy are only possible in the case of precisely localized diseases, chemotherapy can also be used to treat metastatic cancers. However, chemotherapy is generally not a very specific form of treatment, which on the one hand leads to strong or hardly tolerable side effects and on the other hand only has a limited effectiveness.
Neuere Therapieformen umfassen die Behandlung mit antisense- Oligonukleotiden, die direkt und spezifisch in die molekulare Regulation der Zellen eingreifen und derart den genetischen Veränderungen der Zellen, die der Krankheit zu Grunde liegen, entgegenwirken können. Ein antisense-Oligonukleotid (asO) ist eine kurzkettige synthetische Nukleinsäure mit einer definierten Basensequenz, wobei die genaue Abfolge der Basen frei wählbar ist. Antisense-Oligonukleotide binden über komplementäre Basenpaarung an die entsprechende sense-Sequenz der mRNA des Zielproteins, dessen Expression negativ beeinflußt werden soll. Die Hemmung der Genexpression durch asOe kann auf mindestens vier Arten erfolgen: Die gebildeten mRNA-DNA Hybride werden durch RNase H zerschnitten, die Polyadenylierung oder der Transport der fertigen mRNA ins Zytoplasma können durch asOe gehemmt werden, die Initiation der mRNA-Translation kann beispielsweise durch Interferenz mit dem Aufbau des ribosomalen Komplexes gehemmt werden und schließlich kann die Proteinelongation durch das gebundene asO sterisch unterbunden werden.Newer forms of therapy include treatment with antisense oligonucleotides which directly and specifically intervene in the molecular regulation of the cells and can thus counteract the genetic changes in the cells on which the disease is based. An antisense oligonucleotide (asO) is a short-chain synthetic nucleic acid with a defined base sequence, the exact sequence of the bases being freely selectable. Antisense oligonucleotides bind via complementary base pairing to the corresponding sense sequence of the mRNA of the target protein, the expression of which is to be negatively influenced. The inhibition of gene expression by asOe can be carried out in at least four ways: The mRNA-DNA hybrids formed are cut up by RNase H, the polyadenylation or the transport of the finished mRNA into the cytoplasm can be inhibited by asOe, the initiation of mRNA translation can, for example, by Interference with the construction of the ribosomal complex can be inhibited and finally protein elongation can be sterically prevented by the bound asO.
Um aber ihre Wirkung entfalten zu können, müssen die asOe zum einen stabil genug sein, um einem zu frühen Abbau im Organismus zu widerstehen und andererseits müssen sie ihren Wirkungsort innerhalb der Zelle, bzw. innerhalb des Zellkerns überhaupt erreichen können.However, in order to be able to develop their effects, the asOe must be stable enough to withstand early degradation in the organism and secondly they must be able to reach their place of action within the cell or within the cell nucleus.
Chemische Modifikationen der asOe stellen eine Möglichkeit dar, eine ausreichende Stabilität dieser Moleküle gegenüber im Organismus allgegenwärtigen Exo- und Endonukleasen zu gewährleisten. Die wichtigsten dieser Modifikationen sind Phosphorothioat- und Methylphosphonat- Modifikationen. Dabei wird ein Sauerstoffatom im Phosphat durch ein Schwefelatom oder durch eine Methylgruppe ersetzt.Chemical modifications of the asOe represent a way of ensuring that these molecules are sufficiently stable against exo and endonucleases that are ubiquitous in the organism. The most important of these modifications are phosphorothioate and methylphosphonate modifications. An oxygen atom in the phosphate is replaced by a sulfur atom or by a methyl group.
Die nur geringe spontane Aufnahme der asOe durch die Zellen ist ein schwieriger zu lösendes Problem. Allerdings kann beispielsweise durch Verwendung bestimmter Träger-Lipide eine Verbesserung der Aufnahme und eine für die Wirkung der asOe günstigere intrazelluläre Pharmakokinetik und Verteilung erreicht werden.The low spontaneous uptake of asOe by the cells is a more difficult problem to solve. However, by using certain carrier lipids, for example, an improvement in the uptake and a more favorable intracellular pharmacokinetics and distribution for the effect of the asOe can be achieved.
Denkbare Ziele für eine asO-Krebstherapie umfassen Gene für die Zeilproliferation, Differenzierung, Reparatur und Apoptose. Beispielhaft seien Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, Zykline, zyklinabhängige Kinasen und ihre Inhibitoren und zytosolische Serin/Threonin Kinasen genannt.Conceivable goals for asO cancer therapy include genes for cell proliferation, differentiation, repair and apoptosis. Examples of growth factors and their receptors, transcription factors, cyclines, cyclin-dependent kinases and their inhibitors and cytosolic serine / threonine kinases may be mentioned.
Spezifische Beispiele für Gene gegen die sich eine bereits in klinischen Studien befindende asO Therapie richtet, umfassen c-Raf-1 Kinase (ISIS 5132, ISIS/Novartis), Bcl-2 (G3139, Genta) und H-Ras (ISIS 2503, SIS). c-Raf-1 ist eine Serin/Threonin Kinase, die eine wichtige Rolle beim Zellwachstum und -fberleben der Zellen spielt. Gokhale et al. (1999, Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 9, 191-201 ) berichten, dass eine Behandlung von Tumoren mit asOen gegen c-Raf-1 zu einer Inhibition des Tumor-Wachstums aber nicht zu einer Regression der Tumoren führt.Specific examples of genes against which asO therapy is already in clinical trials include c-Raf-1 kinase (ISIS 5132, ISIS / Novartis), Bcl-2 (G3139, Genta) and H-Ras (ISIS 2503, SIS ). c-Raf-1 is a serine / threonine kinase that plays an important role in cell growth and survival. Gokhale et al. (1999, Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 9, 191-201) report that treatment of tumors with asOen against c-Raf-1 leads to inhibition of tumor growth but not to regression of the tumors.
Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma 2 proto-oncogene) ist ein Gen dessen (krankhafte) Überexpression zu einem verhängnisvollen Schutz der Zellen gegen Apoptose führt. Die therapeutische Hemmung der Bildung von Bcl-2 durch asOe zielt daher auf eine Senkung der Schwelle der Tumorzellen für den programmierten Zelltod ab. Webb et al. (1997, Lancet 349, 1137-41 ) berichten von einer Studie mit einem asO gegen Bcl-2 an einer Gruppe von 9 Patienten mit Non-Hodgkin-Lymphom. Bei einem Patienten kam es zu einer kompletten Remission, bei einem weiteren zeigte sich immerhin eine Verringerung des Tumorvolumens.Bcl-2 (B-cell leukemia / lymphoma 2 proto-oncogene) is a gene of this (Pathological) overexpression leads to fatal protection of the cells against apoptosis. The therapeutic inhibition of the formation of Bcl-2 by asOe therefore aims to lower the threshold of the tumor cells for the programmed cell death. Webb et al. (1997, Lancet 349, 1137-41) report a study with an asO against Bcl-2 in a group of 9 patients with non-Hodgkin's lymphoma. In one patient there was a complete remission, in another there was at least a reduction in the tumor volume.
Viele Chemotherapeutika wirken über eine Induktion der Apoptose, daher erscheint eine Kombination von Chemotherapeutika mit einer Hemmung der Bcl-2 Expression erfolgversprechend. Jansen et al. (2000, Lancet 356, 1728-33) berichten von einer Kombinationstherapie mit einem asO gegen Bcl-2 mit Decarbazin. 6 von 14 derart behandelten Patienten zeigten eine antitumorale Antwort. Ein weiteres für die Zelizyklusregulation wichtiges Gen stellt die Polo-like Kinase 1 (Plkl ) dar. Es handelt sich dabei um eine Serin/Threonin Protein Kinase die insbesondere für den geordneten Eintritt der Zelle in die Mitose wichtig ist. In über 90% aller humaner Karzinome ist Plkl überexprimiert, was mit erhöhter mitotischer Aktivität und einer schlechten Prognose einhergeht (Wolf et. al., 1997, Oncogene 14, 543-9; Knecht et al., 1999, Cancer Res. 59, 2794-7). Beeinträchtigung der Plkl Funktion in Krebszellen führt zu abnormaler Mitose mit anschließendem mitotischem Zelltod (Lane and Nigg, 1995, J. Cell Biol. 2, 1701- 13), daher stellt Plk-1 ein potentiell interessantes Ziel für eine asO Krebstherapie dar. Elez et al. (2000, Biochem. Biophys. Res. Comm. 269, 352-6 und DE 100 11 530 A1) berichten von einer maßgeblichen Verkleinerung von Tumoren in einem humanen Tumor Xenotransplantat Mausmodell nach länger andauernder Behandlung mit Plk1-asO. Vollständige Remission konnte aber nicht erzielt werden.Many chemotherapy drugs work by inducing apoptosis, so a combination of chemotherapy drugs with an inhibition of Bcl-2 expression appears promising. Jansen et al. (2000, Lancet 356, 1728-33) report a combination therapy with an asO against Bcl-2 with decarbazine. 6 out of 14 patients treated in this way showed an antitumor response. Another gene important for cell cycle regulation is polo-like kinase 1 (Plkl). It is a serine / threonine protein kinase which is particularly important for the orderly entry of the cell into mitosis. Plkl is overexpressed in over 90% of all human carcinomas, which is associated with increased mitotic activity and a poor prognosis (Wolf et. Al., 1997, Oncogene 14, 543-9; Knecht et al., 1999, Cancer Res. 59, 2794 -7). Impairment of Plkl function in cancer cells leads to abnormal mitosis with subsequent mitotic cell death (Lane and Nigg, 1995, J. Cell Biol. 2, 1701-13), therefore Plk-1 represents a potentially interesting target for asO cancer therapy. Elez et al. (2000, Biochem. Biophys. Res. Comm. 269, 352-6 and DE 100 11 530 A1) report a significant reduction in tumors in a human tumor xenograft mouse model after prolonged treatment with Plk1-asO. However, complete remission could not be achieved.
Wenn auch - wie ausgeführt - vielversprechende Ansätze für eine antisense- Oligonukleotid Krebstherapie vorhanden sind, verbleibt es zu lösende Aufgabe, eine Therapie zu entwickeln, die in hohem Masse spezifisch und gleichzeitig vollständig zum Absterben der Krebszellen führt und dabei möglichst wenig Nebenwirkungen hervorruft. Die Möglichkeit einer einfachen Verabreichung und kosteneffizienter Produktion des Medikamentes wären ferner vorteilhaft.Even if - as stated - there are promising approaches for an antisense oligonucleotide cancer therapy, the task to be solved remains to develop a therapy that is highly specific and at the same time completely leads to the death of the cancer cells and causes as few side effects as possible. The possibility of simple administration and cost-effective production of the drug would also be advantageous.
Gelöst werden diese so wie weitere nicht explizit genannte Aufgaben, die jedoch aus den hierin einleitend diskutierten Zusammenhängen ohne weiteres ableitbar oder erschließbar sind, durch die Verwendung eines antisenseOligodesoxynukleotids gegen Polo-like Kinase 1 (Plkl ) in Kombination mit einem antisense-Oligodesoxynukleotid gegen B-cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl-2) proto- oncogene zur Herstellung eines Medikamentes für die Krebstherapie. Die Kombinationstherapie mit anti-PIkl und anti-Bcl-2 Oligonukleotiden erwies sich überrschenderweise als in hohem Masse synergistisch. Die Proliferation von krebsartigen Zellen wird durch die Kombination entsprechender asOe in höherem Maße inhibiert als durch einzelne asOe gegen die Gene. Besonders ausgeprägt tritt dieser Vorteil in-vivo zutage. Im humanen Xenotransplantat Mausmodell kam es bei der Behandlung von MDA-MB-435 Tomorxenotransplantaten im Gegensatz zur Therapie mit nur je einem asO bei der Kombinationstherapie in allen Fällen zur vollständigen Regression der Tumoren. Im Falle von Detroit.562 Xenotransplantaten kam es in 80% der Fälle zur vollständigen Regression und im Falle von primären Bauchkrebszellen kam es in 55% der Fälle zur vollständigen Regression der Tumoren. Derartig hohe Regressionsraten konnten bisher nicht erzielt werden. Die Konzentrationen der therapeutischen Oligonukleotide konnten so niedrig gewählt werden, dass keine meßbaren Nebenwirkungen auftraten.These and other tasks which are not explicitly mentioned, but which can easily be derived from the contexts discussed at the outset, are achieved by using an antisense oligodeoxynucleotide against polo-like kinase 1 (Plkl) in combination with an antisense oligodeoxynucleotide against B- cell leukemia / lymphoma 2 (Bcl-2) protoncogene for the manufacture of a medicament for cancer therapy. The combination therapy with anti-PIkl and anti-Bcl-2 oligonucleotides surprisingly proved to be highly synergistic. The proliferation of cancerous cells is inhibited to a greater extent by the combination of appropriate asOe than by individual asOe against the genes. This advantage is particularly pronounced in vivo. In the human xenograft mouse model, in the treatment of MDA-MB-435 tomorxen grafts, in contrast to the therapy with only one ASO in combination therapy, the tumors were completely regressed in all cases. In the case of Detroit. 562 xenografts, complete regression occurred in 80% of the cases and in the case of primary abdominal cancer cells, the tumor was completely regressed in 55% of the cases. Such high regression rates have so far not been achieved. The concentrations of the therapeutic oligonucleotides could be chosen so low that there were no measurable side effects.
Die entsprechenden antisense-Oligonukleotide können gleichzeitig verabreicht werden oder aber abwechselnd. Die entsprechenden antisense-Oligonukleotide können bei gleichzeitiger Verabreichung gemeinsam in einer pharmazeutischen Formulierung vorliegen, oder aber getrennt formuliert sein.The corresponding antisense oligonucleotides can be administered simultaneously or alternately. When administered simultaneously, the corresponding antisense oligonucleotides can be present together in a pharmaceutical formulation or else can be formulated separately.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die entsprechenden antisense-Oligonukleotide zweimal wöchentlich gemeinsam verabreicht. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die entsprechenden antisense-Oligonukleotide jeweils einmal wöchentlich abwechselnd verabreicht, d.h. zuerst das eine asO, wenige Tage später das zweite, so dass zweimal wöchentlich asOe verabreicht werden, aber jedes einzeln und daher einmal wöchentlich. Bevorzugterweise werden die asOe in einer Menge von ungefähr 5 mg/kg Körpergewicht verabreicht, wobei klar ist, dass es dem Arzt obliegt, in jedem spezifischen Falle abhängig vom Patienten, der Erkrankung, bzw. der Krankengeschichte, die Dosis und die Anzahl der Verabreichungen anzupassen. Erfindungsgemäß bevorzugt handelt es sich bei den antisense-Oligonukleotiden um kurzkettige Desoxyribonukleinsäuren mit einer Länge von 10 - 55 Basen, bevorzugt 12 - 40 und ganz besonders bevorzugt 15 - 30.In a preferred embodiment of the invention, the corresponding antisense oligonucleotides are administered together twice a week. In a further particularly preferred embodiment of the invention, the corresponding antisense oligonucleotides are administered alternately once a week, ie first the asO, a few days later the second, so that asOe are administered twice a week, but each individually and therefore once a week. The asOe are preferably in one Amount of approximately 5 mg / kg body weight administered, it being clear that it is the responsibility of the doctor to adjust the dose and the number of administrations in each specific case depending on the patient, the disease or the medical history. According to the invention, the antisense oligonucleotides are preferably short-chain deoxyribonucleic acids with a length of 10-55 bases, preferably 12-40 and very particularly preferably 15-30.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die antisense-Oligodesoxynukleotide gegen enzymatischen Abbau modifiziert. Als Modifikation kommen prinzipiell die in Stand der Technik bekannten Substituenten, entweder einzeln oder in Kombination in Frage. Geeignete Modifikationen stellen der Einbau von Phosphotriester-, Phosphoramid-, Methylphosphonat-, Phosphorothioat und Peptidnukleinsäure- bindungen in die Struktur der Oligonukleotide dar. Wegen seiner erhöhten Stabilität und der Fähigkeit RNase H Aktivität auszulösen, sind Phosphorothioat- modifizierte asOe besonders bevorzugt.According to the invention, the antisense oligodeoxynucleotides are preferably modified against enzymatic degradation. In principle, the substituents known in the prior art, either individually or in combination, are suitable as modifications. Suitable modifications are the incorporation of phosphotriester, phosphoramide, methylphosphonate, phosphorothioate and peptide nucleic acid bonds into the structure of the oligonucleotides. Because of its increased stability and the ability to trigger RNase H activity, phosphorothioate-modified asOe are particularly preferred.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die gegen Plkl gerichteten asOe gegen die humane Plkl gerichtet. Das entsprechende erfindungsgemäß bevorzugte Gen findet sich unter der Genebank Acc. No.: NT_010604, von bp 635298 - 646820. Die entsprechende mRNA Sequenz findet sich unter der Genebank Acc. No.: X73458. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die gegen Bcl-2 gerichteten asOe gegen humanes Bcl-2 gerichtet. Das entsprechende erfindungsgemäß bevorzugte Gen findet sich (komplementär) unter der Genebank Acc. No.: NT_033907, bp 4363332 - 4559938. Die entsprechende mRNA Sequenz findet sich unter der Genebank Acc. No.: M13994, sowie M14745, die Genebank Acc. No. der Splice- Variante a lautet NM_000633 und der Splice-Variante ß lautet NM_000657.According to the invention, the asOe directed against Plkl are preferably directed against human Plkl. The corresponding preferred gene according to the invention can be found at Genebank Acc. No .: NT_010604, from bp 635298 - 646820. The corresponding mRNA sequence can be found under Genebank Acc. No .: X73458. According to the invention, the asOe directed against Bcl-2 are preferably directed against human Bcl-2. The corresponding gene preferred according to the invention can be found (complementarily) under the Genebank Acc. No .: NT_033907, bp 4363332 - 4559938. The corresponding mRNA sequence can be found under Genebank Acc. No .: M13994, as well as M14745, the Genebank Acc. No. the splice variant a is NM_000633 and the splice variant ß is NM_000657.
Besonders bevorzugt sind als antisense-Oligodesoxynukleotide gegen Plkl : JWG90: 5'-GCT ATG TAA TTA GGA GTC CC-3' (SEQ ID No.: 1 ), JWG100: 5'-CCC AAT GGA CCA CAC ATC C-3' (SEQ ID No.: 2), JWG110: 5'-CGG GCA GGG ATA TAG CCA GA-3' (SEQ ID No.: 3), JWG160: 5*-CCC AAA AAG CGG CCC C-3Λ (SEQ ID No.: 4), JWG340: 5'-CCT CCG CAC CGC TCC GC-3 (SEQ ID No.: 5), JWG370: 5*-GAC CAG CCC ACG CTG CG-3Λ (SEQ ID No.: 6), JWG370/1 : δ'-CCC AAT GGA CCA CAC ATC C-3X (SEQ ID No.: 7), JWG408: 5'-CCT AAG TCT CTG CTG CTC AA -3' (SEQ ID No.: 8), JWG409: 5^-AGG ATC CTC AGC CTC CTC TT-3' (SEQ ID No.: 9), JWG410: 5X-GTG GAG CCG CCG CCG GAG CT-3 (SEQ ID No.: 10), JWG411 : 5^-GTG AAT GGA TAT TTC CAT GG-3 (SEQ ID No.: 11 ), JWG412: 5 -GGC TGG CCA GCT CCT TGC AG-3^ (SEQ ID No.: 12), JWG413: 5X-CTG GGG GGC ACA CTG CAG AC-3' (SEQ ID No.: 13), JWG414: 5^ -GGG GGA GGG GGA CAA G-3^ (SEQ ID No.: 14), JWG-as-ss: 5Λ-ATT ATA TTC AAT AAT AT-3' (SEQ ID No.: 15), JWG415 5^-TGT TAT CAC AGA GCT GAT AC-3X (SEQ ID No.: 16), JWG416 5'-ATT CAT ATG GTG GGG TT-3' (SEQ ID No.: 17) und JWG2000: 5'-CCT GAC CAG CCC ACG CTC C-3' (SEQ ID No.: 18), wobei SEQ ID No.: 4 (JWG160) ganz besonders bevorzugt ist.Particularly preferred antisense oligodeoxynucleotides against Plkl: JWG90: 5'-GCT ATG TAA TTA GGA GTC CC-3 '(SEQ ID No .: 1), JWG100: 5'-CCC AAT GGA CCA CAC ATC C-3' ( SEQ ID No .: 2), JWG110: 5'-CGG GCA GGG ATA TAG CCA GA-3 '(SEQ ID No .: 3), JWG160: 5 * -CCC AAA AAG CGG CCC C-3 Λ (SEQ ID No .: 4), JWG340: 5 ' -CCT CCG CAC CGC TCC GC-3 (SEQ ID No .: 5), JWG370: 5 * -GAC CAG CCC ACG CTG CG-3 Λ (SEQ ID No .: 6), JWG370 / 1: δ ' -CCC AAT GGA CCA CAC ATC C-3 X (SEQ ID No .: 7), JWG408: 5 ' -CCT AAG TCT CTG CTG CTC AA -3 ' (SEQ ID No .: 8), JWG409: 5 ^ - AGG ATC CTC AGC CTC CTC TT-3 '(SEQ ID No .: 9), JWG410: 5 X -GTG GAG CCG CCG CCG CCG GAG CT-3 (SEQ ID No .: 10), JWG411: 5 ^ -GTG AAT GGA TAT TTC CAT GG-3 (SEQ ID No .: 11), JWG412: 5 -GGC TGG CCA GCT CCT TGC AG-3 ^ (SEQ ID No .: 12), JWG413: 5 X -CTG GGG GGC ACA CTG CAG AC -3 ' (SEQ ID No .: 13), JWG414: 5 ^ -GGG GGA GGG GGA CAA G-3 ^ (SEQ ID No .: 14), JWG-as-ss: 5 Λ -ATT ATA TTC AAT AAT AT -3 ' (SEQ ID No .: 15), JWG415 5 ^ -TGT TAT CAC AGA GCT GAT AC-3 X (SEQ ID No .: 16), JWG416 5 ' -ATT CAT ATG GTG GGG TT-3 ' (SEQ ID No .: 17) and JWG2000: 5'-CCT GAC CAG CCC ACG CTC C-3 '(SEQ ID No .: 18), with SEQ ID No .: 4 (JWG160) being particularly preferred.
Als antisense-Oligodesoxynukleotid gegen Bcl-2 istAs an antisense oligodeoxynucleotide against Bcl-2
G3139: 5'-TCT CCC AGC GTG CGC CAT-3' (SEQ ID No.: 19) bevorzugt.G3139: 5'-TCT CCC AGC GTG CGC CAT-3 '(SEQ ID No .: 19) preferred.
Bevorzugterweise kommt das erfindungsgemäße Medikament für die Therapie von Krebszellen, die Plkl , Bcl-2 oder beide Gene überexprimieren zum Einsatz.The medicament according to the invention is preferably used for the therapy of cancer cells which overexpress Plkl, Bcl-2 or both genes.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die beschriebene Therapie für Hepatokarzinome eingesetzt. Gegen diese Art von Karzinomen gibt es bisher keine wirksame Therapie. Die Kombinationstherapie mit aOen gegen Plkl und Bcl-2 erlaubt erstmalig eine erfolgreiche Therapie dieses Krankheitsbildes. Weitere erfindungsgemäß bevorzugt therapierbare Krebsarten umfassen das Mammakarzinom und das Pancreaskarzinom.According to the invention, the therapy described is preferably used for hepatocarcinomas. There is currently no effective therapy for this type of cancer. The combination therapy with aOen against Plkl and Bcl-2 allows for the first time a successful therapy of this clinical picture. Other types of cancer which can preferably be treated according to the invention include breast cancer and pancreatic cancer.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung der Kombination von antisense- Oligodesoxynukleotiden wie vorstehend beschrieben zur Herstellung von Medikamenten für die Krebstherapie, wobei die Aufnahme der entsprechenden Medikamente durch Membranelektroporation verbessert werden kann. Eine derartige erfindungsgemäße in-vivo Elektroporation mit dem Ziel einer effizienten Aufnahme der asOe in die (Krebs-)Zellen, umfasst eine lokale Verabreichung elektrischer Pulse, welche transiente Transportporen in den Lipidanteilen der Zellmembranen hervorrufen. Diese Therapieform ist auch als Elektrochemotherapie (ECT) bekannt (Mir et al., 1991 , C. R. Acad. Sei. III. 313, 613-8, Heller et al., 1996, Cancer 77, 964-71 , Mir et al., 1998, Br. J. Cancer 77, 2336-42 und Heller ef al., 1998, Cancer 83, 148-57).According to the invention, preference is given to using the combination of antisense Oligodeoxynucleotides as described above for the production of drugs for cancer therapy, the uptake of the corresponding drugs being improved by membrane electroporation. Such an in vivo electroporation according to the invention with the aim of efficient absorption of the asOe into the (cancer) cells comprises local administration of electrical pulses which cause transient transport pores in the lipid portions of the cell membranes. This form of therapy is also known as electrochemotherapy (ECT) (Mir et al., 1991, CR Acad. Sci. III. 313, 613-8, Heller et al., 1996, Cancer 77, 964-71, Mir et al., 1998, Br. J. Cancer 77, 2336-42 and Heller ef al., 1998, Cancer 83, 148-57).
Erfindungsgemäß bevorzugt werden hierzu zwei parallele Stahlelektroden perkutan, auf gegenüberliegenden Seiten des Tumors unter Verwendung von Kontaktpaste plaziert und dem Tumor werden aufeinanderfolgende elektrische Pulse verabreicht. Bevorzugterweise erfolgen die Pulse rechteckig. Weiterhin bevorzugt werden zwischen einem und 10 aufeinanderfolgende Pulse von 200 bis 800 V/cm2 von jeweils 1 - 50 ms verabreicht, besonders bevorzugt 3 bis 7 Pulse von 300 - 700 V/cm2 von jeweils 5 - 25 ms, ganz besonders bevorzugt 4 bis 6 Pulse von 400 - 600 V/cm2 von jeweils 7,5 - 15 ms und am meisten bevorzugt 5 Pulse von 400 V/cm2 von jeweils 10 ms. Ein weiteres erfindungsgemäß bevorzugtes Verfahren zur Erhöhung der Aufnahme der therapeutischen asOe ist deren Verkapselung in Liposomen, wie beispielsweise von Gokhale et al. (1997, Gene Ther. 12, 1289-99; 2001 , Anticancer Res. 21 , 3313-21 und 2002, Clin. Cancer Res. 11 , 3611-21) offenbart.According to the invention, two parallel steel electrodes are preferably placed percutaneously on opposite sides of the tumor using contact paste and successive electrical pulses are administered to the tumor. The pulses are preferably rectangular. Furthermore, between one and 10 successive pulses of 200 to 800 V / cm 2 of 1 to 50 ms each are administered, particularly preferably 3 to 7 pulses of 300 to 700 V / cm 2 each of 5 to 25 ms, very particularly preferably 4 to 6 pulses of 400-600 V / cm 2 of 7.5-15 ms each and most preferably 5 pulses of 400 V / cm 2 of 10 ms each. Another preferred method according to the invention for increasing the absorption of the therapeutic asOe is its encapsulation in liposomes, as described, for example, by Gokhale et al. (1997, Gene Ther. 12, 1289-99; 2001, Anticancer Res. 21, 3313-21 and 2002, Clin. Cancer Res. 11, 3611-21).
Die Verabreichung des erfindungesgemäßen Medikamentes kann auch in Kombination mit weiteren asOen, bzw. bevorzugterweise mit einem oder mehreren Chemotherapeutika erfolgen. Beschreibung der Abbildungen:The medicament according to the invention can also be administered in combination with other ASOs, or preferably with one or more chemotherapeutic agents. Description of the pictures:
Abbildung 1 : Antisense-Oligonukleotide downregulieren die Plkl Expression in A549 Zellen. (a) A549 Zellen wurden mittels Dotap Lipofektion mit JWG160 (SEQ ID No.: 4), bzw. JWG370 (SEQ ID No.: 6) antisense Oligonukleotiden behandelt (jeweils 1 μM). Nach 48 h Inkubation wurde das Gesamtprotein extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse untersucht. Control: nichtbehandelte Zellen. Dotap: nur Lipofektion. JWG160-MM und JWG370-MM: entsprechende Mismatch- Oligonukleotide (SEQ ID No.: 20 und SEQ ID No.: 21). Gleichmäßige Beladung wurde durch Reybridisierung der Blots mit anti-ß-Aktin IgG überprüft, (b) Dosisabhängige Inhibition der Plkl mRNA-Expression in A549 Zellen durch JWG160 Plkl -antisense-Oligonukleotide. A549 Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen an asOen (0,5-2 μM) inkubiert. Nach 24 h wurde die Gesamt RNA extrahiert und mittels Northern-Blot-Analyse untersucht. Die Blots wurden mit einer radioaktiven Plkl Sonde und anschließend mit GAPDH hybridisiert, (c) Dosis-abhängige Inhibition der Plkl Proteinexpression in A549 Zellen durch JWG160 Plkl -antisense-Oligonukleotide. A549 Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen an asOen (0,5-2 μM) inkubiert. Nach 48 h wurde das Gesamt-Protein extrahiert und mittels Western-Blot-Analyse untersucht. Die Blots wurden mit anti-PIkl -Antikörpern und anschließend mit anti-ß-Aktin IgG hybridisiert.Figure 1: Antisense oligonucleotides down-regulate Plkl expression in A549 cells. (a) A549 cells were treated with Dotap lipofection with JWG160 (SEQ ID No .: 4) or JWG370 (SEQ ID No .: 6) antisense oligonucleotides (1 μM each). After 48 h of incubation, the total protein was extracted and examined by Western blot analysis. Control: untreated cells. Dotap: lipofection only. JWG160-MM and JWG370-MM: corresponding mismatch oligonucleotides (SEQ ID No .: 20 and SEQ ID No .: 21). Uniform loading was checked by re-hybridizing the blots with anti-ß-actin IgG, (b) dose-dependent inhibition of Plkl mRNA expression in A549 cells by JWG160 Plkl antisense oligonucleotides. A549 cells were incubated with the stated concentrations of asOen (0.5-2 μM). After 24 h the total RNA was extracted and examined by Northern blot analysis. The blots were hybridized with a radioactive Plkl probe and then with GAPDH, (c) dose-dependent inhibition of Plkl protein expression in A549 cells by JWG160 Plkl antisense oligonucleotides. A549 cells were incubated with the stated concentrations of asOen (0.5-2 μM). After 48 hours, the total protein was extracted and examined by Western blot analysis. The blots were hybridized with anti-PIkl antibodies and then with anti-ß-actin IgG.
Abbildung 2: Inhibition der Proliferation durch anti-PIkl (JWG160; SEQ ID No.: 4) und anti-Bcl-2 (G3139; SEQ ID No.: 19) Oligonukleotide.Figure 2: Inhibition of proliferation by anti-PIkl (JWG160; SEQ ID No .: 4) and anti-Bcl-2 (G3139; SEQ ID No .: 19) oligonucleotides.
Die Zellen wurden mit 1 μM asOen behandelt. Nach 48 h wurde die Zellzahl durch direktes Auszählen ermittelt, (a) Western Blot Analyse der Plkl und Bcl-2 Expression in A549, MDA-MB-435, Detroit562, primären Bauchkrebszellen und humanen, nicht-trans-formierten, primären Fibroblasten. (b) Inhibition der Proliferation von A549 Zellen nach der Behandlung mit JWG160 und G3139 asOen. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung, (c) Inhibition der Proliferation von MDA-MB-435 Zellen nach der Behandlung mit JWG160 und G3139 asOen. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung, (d) Unbeeinflußte Proliferation von normalen humanen Hautfibroblasten nach der Behandlung mit JWG160 und G3139 asOen. Dargestellt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung. Control: unbehandelte A549, MDA-MB-435 oder normale humane Fibroblasten. G3139: Bcl-2 antisense, JWG160: Plkl antisense, G3139 & JWG160 Bcl-2 antisense und Plkl antisense in Kombination, G3139-MM, JWG160-MM: entsprechende Mismatchkontrollen (SEQ ID No.: 20 und SEQ ID No.: 22).The cells were treated with 1 μM asOen. After 48 h the cell number was determined by direct counting, (a) Western blot analysis of the Plkl and Bcl-2 expression in A549, MDA-MB-435, Detroit562, primary abdominal cancer cells and human, non-transformed, primary fibroblasts. (b) Inhibition of A549 cell proliferation after treatment with JWG160 and G3139 asOen. The mean values +/- standard deviation are shown, (c) inhibition of Proliferation of MDA-MB-435 cells after treatment with JWG160 and G3139 asOen. The mean values +/- standard deviation are shown, (d) Unaffected proliferation of normal human skin fibroblasts after treatment with JWG160 and G3139 asOen. The mean values +/- standard deviation are shown. Control: untreated A549, MDA-MB-435 or normal human fibroblasts. G3139: Bcl-2 antisense, JWG160: Plkl antisense, G3139 & JWG160 Bcl-2 antisense and Plkl antisense in combination, G3139-MM, JWG160-MM: corresponding mismatch controls (SEQ ID No .: 20 and SEQ ID No .: 22) ,
Abbildung 3: Fluoreszenz Mikrographien von MDA-MB-435 Xenotransplantaten mit FITC markierten antisense-Oligonukleotiden.Figure 3: Fluorescence micrographs of MDA-MB-435 xenografts with FITC-labeled antisense oligonucleotides.
Verteilung der antisense-Oligonukleotide nach systemischer Verabreichung (5 mg/kg) und lokaler Elektroporation. Die FITC-konjugierten asOe wurden über die Schwanzvene verabreicht. Die Tumoren wurden 24 h später entnommen und mittels Fluoreszens-mikroskopie und photometrisch untersucht. (a) nichtelektroporierte Kontrolle, (b) Elektroporation (5 x 400 V/cm2 für jeweils 10 ms), (c) Elektroporation (5 x 600 V/cm2 für jeweils 10 ms), (d) starkeDistribution of the antisense oligonucleotides after systemic administration (5 mg / kg) and local electroporation. The FITC-conjugated asOe were administered via the tail vein. The tumors were removed 24 hours later and examined using fluorescence microscopy and photometry. (a) non-electroporated control, (b) electroporation (5 x 400 V / cm 2 for 10 ms each), (c) electroporation (5 x 600 V / cm 2 for 10 ms each), (d) strong
Vergrößerung von (b).Magnification of (b).
Abbildung 4: Antitumorale Aktivität von anti-PIkl (JWG160; SEQ ID No.: 4) und anti-Bcl-2 (G3139; SEQ ID No.: 19) Oligonukleotiden in NMRI nackten Mäusen, die A549, MDA-MB-435, Detroit562 und primäre Bauchkrebs Tumoren aufweisen.Figure 4: Antitumor activity of anti-PIkl (JWG160; SEQ ID No .: 4) and anti-Bcl-2 (G3139; SEQ ID No .: 19) oligonucleotides in NMRI nude mice, the A549, MDA-MB-435, Detroit562 and primary abdominal cancer tumors.
Antisense Oligonukleotide (G3139 und JWG160) wurden zweimal wöchentlich oder als aufeinanderfolgende Kombination jeweils in Dosen von 5 mg/kg mittels Bolus Injektion intravenös verabreicht. Fünf Minuten nach Verabreichung der asOe wurden dem Tumor fünf Hochspannungspulse verabreicht (400 V/cm2, in 10 ms Intervallen). Nach vierwöchiger Behandlung wurden die Mäuse getötet, die Tumoren präpariert und die Tumormasse mit einer Präzisionswaage bestimmt. (a) Inhibition des Tumorwachstums von A549 Tumoren durch Therapie mit G3139 und JWG160 asOen und Elektroporation. (b) Inhibition des Tumorwachstums von Detroit562 Tumoren durch Therapie mit G3139 und JWG160 asOen und Elektroporation. (c) Inhibition des Tumorwachstums von MDA-MB-435 Tumoren durch Therapie mit G3139 und JWG160 asOen und Elektroporation. (d) Inhibition des Tumorwachstums von primären Bauchkrebs Xenotransplantaten durch Therapie mit G3139 und JWG160 asOen und Elektroporation. Control: unbehandelte Tiere, electro: nur Elektroporation, G3139: Bcl-2 antisense, JWG160: Plkl antisense, G3139 & JWG160 Bcl-2 antisense und Plkl antisense in Kombination, G3139-MM, JWG160-MM: entsprechende Mismatchkontrollen (SEQ ID No.: 11 und SEQ ID No.: 9), electro: mit Elektroporation.Antisense oligonucleotides (G3139 and JWG160) were administered intravenously twice a week or as a successive combination in doses of 5 mg / kg by bolus injection. Five minutes after administration of the asOe, five high-voltage pulses were administered to the tumor (400 V / cm 2 , at 10 ms intervals). After four weeks of treatment, the mice were sacrificed, the tumors were prepared and the tumor mass was determined using a precision balance. (a) Inhibition of tumor growth of A549 tumors by therapy with G3139 and JWG160 asOen and electroporation. (b) Inhibition of tumor growth of Detroit562 tumors by therapy with G3139 and JWG160 asOen and electroporation. (c) Inhibition of tumor growth of MDA-MB-435 tumors by therapy with G3139 and JWG160 asOen and electroporation. (d) Inhibition of tumor growth of primary abdominal cancer xenografts by therapy with G3139 and JWG160 asOen and electroporation. Control: untreated animals, electro: electroporation only, G3139: Bcl-2 antisense, JWG160: Plkl antisense, G3139 & JWG160 Bcl-2 antisense and Plkl antisense in combination, G3139-MM, JWG160-MM: appropriate mismatch controls (SEQ ID No. : 11 and SEQ ID No .: 9), electro: with electroporation.
Abbildung 5: Elektroporationsunterstützte Behandlung mit anti-PIkl (JWG160; SEQ ID No.: 4) und anti-Bcl-2 (G3139; SEQ ID No.: 19) Oligonukleotiden inhibiert das MDA-MB-435 Tumorwachstum in-vivo.Figure 5: Electroporation-supported treatment with anti-PIkl (JWG160; SEQ ID No .: 4) and anti-Bcl-2 (G3139; SEQ ID No .: 19) oligonucleotides inhibits MDA-MB-435 tumor growth in vivo.
JWG160: Antisense gegen Plkl mit Elektroporation (5 x 400 V/cm2 für 10 ms, zweimal wöchentlich während 4 Wochen). JWG160 & G3139: Kombinationstherapie mit asOen gegen Plkl und Bcl-2 unter Verwendung des identischen elektrischen Puls-Regimes, (a) Fotografie der entnommenen Tumoren nach 4 wöchiger elektroporationsunterstützter Antisensetherapie. Control: unbehandelte Tiere. Electro: Elektroporation ohne Anwendung von asOen. (b) Plkl Proteinexpression in Tumoren nach elektroporationsunterstützter Antisensetherapie mit JWG160 (zweimal wöchentlich). Die Proteinextrakte jeder einzelnen Spur wurden von unterschiedlichen Tumoren gewonnen und mittels anti-PIkl immunoblotting analysiert und mit anti-ß-Aktin rehybridisiert, (c) Bcl-2 Proteinexpression in Tumoren nach elektroporationsunterstützter Antisensetherapie mit G3139 (zweimal wöchentlich). Die Proteinextrakte jeder einzelnen Spur wurden von unterschiedlichen Tumoren gewonnen und mittels anti-Bcl-2 immunoblotting analysiert und mit anti-ß-Aktin rehybridisiert, (d) Plkl und Bcl-2 Proteinexpression in Tumoren nach vierwöchiger elektroporationsunterstützter antisense-Kombinationstherapie mit beiden asOen (wobei jedes einmal wöchentlich einzeln verabreicht wurde). Die Proteinextrakte jeder einzelnen Spur wurden von unterschiedlichen Tumoren gewonnen und mittels anti-PIkl und anti-Bcl-2 immunoblotting analysiert und mit anti-ß-Aktin rehybridisiert. Control: unbehandelte Xenotransplantate, electro: nur Elektroporation, MM entsprechende Mismatch asOe.JWG160: Antisense against Plkl with electroporation (5 x 400 V / cm 2 for 10 ms, twice a week for 4 weeks). JWG160 & G3139: combination therapy with asOen against Plkl and Bcl-2 using the identical electrical pulse regime, (a) photograph of the removed tumors after 4 weeks of electroporation-assisted antisense therapy. Control: untreated animals. Electro: electroporation without the use of asOen. (b) Plkl protein expression in tumors after electroporation-assisted antisense therapy with JWG160 (twice a week). The protein extracts of each individual lane were obtained from different tumors and analyzed by anti-PIkl immunoblotting and rehybridized with anti-ß-actin, (c) Bcl-2 protein expression in tumors after electroporation-assisted antisense therapy with G3139 (twice a week). The protein extracts of each individual lane were obtained from different tumors and analyzed by means of anti-Bcl-2 immunoblotting and rehybridized with anti-ß-actin, (d) Plkl and Bcl-2 protein expression in tumors after four weeks of electroporation-assisted antisense combination therapy with both ASOs (where administered individually once a week). The protein extracts of each individual lane were obtained from different tumors and analyzed by means of anti-PIkl and anti-Bcl-2 immunoblotting and with anti-ß-actin reprobed. Control: untreated xenografts, electro: electroporation only, MM corresponding mismatch asOe.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken:The following examples serve to illustrate the invention without restricting the invention to these examples:
Beispiel 1 : OligonukleotidsynthesenExample 1: Oligonucleotide Synthesis
Die Herstellung der Oligonukleotide erfolgte mit einem automatischen DNA- Synthesizer (Perseptive 8909; BioSpring GmbH; Frankfurt) nach einem im Stand der Technik bekannten Verfahren. Das Phosphorothiaot-Rückgrat der Oligonukleotide war vollständig modifiziert. Zur Entschützung wurden die Oligonukleotide während 16 Stunden bei Raumtemperatur mit konzentriertem Ammoniak behandelt. Anschließend wurden die Oligonukleotide durch "reverse phase" Chromatographie gereinigt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde zweimal mit 1 M NaCI/Ethanol präzipitiert und ein weiteres Mal lyophilisiert.The oligonucleotides were produced using an automatic DNA synthesizer (Perseptive 8909; BioSpring GmbH; Frankfurt) using a method known in the art. The phosphorothiaot backbone of the oligonucleotides was completely modified. For deprotection, the oligonucleotides were treated with concentrated ammonia for 16 hours at room temperature. The oligonucleotides were then purified by "reverse phase" chromatography and lyophilized. The lyophilizate was precipitated twice with 1 M NaCl / ethanol and lyophilized again.
Beispiel 2: RNA-Isolierung und Northern-Blot AnalyseExample 2: RNA isolation and Northern blot analysis
Die Gesamt-RNA von kultivierten Zellen, bzw. homogenisierten Tumoren wurde mittels RNeasyMinikit (Qiagen AG, Hüten) isoliert. 20 μg Gesamt-RNA wurden mittels Elektrophorese in einem denaturierenden 1 % Agarose/Formaldehyd-Gel aufgetrennt, auf eine Nylon-Membran übertragen. Hybridisierung erfolgte mit einem radioaktiven, mittels PCR gewonnenem Plkl -Fragment als Sonde. Mit einem 380A DNA-Synthesizer von Applied Biosystems wurden Primer hergestellt. Die radioaktive Markierung der Sonde zur Hybridisierung der Northern Blots erfolgte nach einem Standard-PCR-Verfahren unter Verwendung von 150 μCi α-32P dCTP (6000 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech). Die radioaktive Markierung der Antisense-Stränge wurde mit den folgenden Primern durchgeführt: PlklAs: 5'-TGA TGT TGG CAC CCT TTC AGC-3', GAPDH: sense: 5'-CAC CCA TGG CAA ATT CCA TG-3\ antisense: 5-'CAT GGT TCA CAC CCA TGA CG-3'. Hybridisierung erfolgte in QuickHyb-Lösung (Stratagene, La Jolla, CA, USA) während 1 Stunde bei 68jC. Die Membranen wurden zweimal unter hoch- stringenten Bedingungen in 0,1 x SSC, 1% SDS bei 65jC für 20 Minuten gewaschen und über Nacht autoradiographiert (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, NY). Sodann wurden die Membranen von den Gensonden befreit und mit einer anderen radioaktiven markierten Sonde (GPDH, s.o.) zur Kontrolle der Qualität und Einheitlichkeit der mRNA-Beladung unter identischen Bedingungen rehybridisiert.The total RNA from cultured cells or homogenized tumors was isolated using the RNeasyMinikit (Qiagen AG, Hüten). 20 μg of total RNA were separated by electrophoresis in a denaturing 1% agarose / formaldehyde gel and transferred to a nylon membrane. Hybridization was carried out using a radioactive Plkl fragment obtained by PCR as a probe. Primers were made with an Applied Biosystems 380A DNA synthesizer. The radioactive labeling of the probe for hybridization of the Northern blots was carried out according to a standard PCR method using 150 μCi α- 32 P dCTP (6000 Ci / mmol, Amersham Pharmacia Biotech). The radioactive labeling of the antisense strands was carried out with the following primers: PlklAs: 5'-TGA TGT TGG CAC CCT TTC AGC-3 ', GAPDH: sense: 5'-CAC CCA TGG CAA ATT CCA TG-3 \ antisense: 5 -'CAT GGT TCA CAC CCA TGA CG-3 '. Hybridization was carried out in QuickHyb solution (Stratagene, La Jolla, CA, USA) for 1 hour at 68 ° C. The membranes were placed twice under high stringent conditions in 0.1 x SSC, 1% SDS at 65 ° C for 20 minutes and autoradiographed overnight (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, NY). The membranes were then freed from the gene probes and rehybridized with another radioactive labeled probe (GPDH, see above) to check the quality and uniformity of the mRNA loading under identical conditions.
Beispiel 3: Protein-Isolierung und Western-Blot AnalyseExample 3: Protein Isolation and Western Blot Analysis
Für die Western Blot-Analyse wurden die zellulären Proteine unter Verwendung von 250 μl Rl PA-Puffer (1 x PBS, 1% Nonidet P-0, 0,5% Natriumdesoxycholat,For the Western blot analysis, the cellular proteins were used using 250 μl of Rl PA buffer (1 × PBS, 1% Nonidet P-0, 0.5% sodium deoxycholate,
0,1 % SDS) pro T25 Zellkulturflasche extrahiert. 20 μg Protein wurden elektrophoretisch in einem 12% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf0.1% SDS) extracted per T25 cell culture bottle. 20 μg protein were separated and opened electrophoretically in a 12% SDS polyacrylamide gel
Nitrocellulose-Membranen übertragen. Die Blots wurden mit anti-PIkl-, anti-Bcl-2-Transfer nitrocellulose membranes. The blots were labeled with anti-PIkl-, anti-Bcl-2-
(Transduction Laboratories, Lexington, KY) und anti-ß-Aktin-Antikörpern (Sigma, St. Louis, MO, USA) wurden Plkl und Aktin inkubiert. Durch Einsatz von geeigneten mit Meerrettich Peroxidase konjugierten sekundären IgG (Jackson(Transduction Laboratories, Lexington, KY) and anti-ß-actin antibodies (Sigma, St. Louis, MO, USA), Plkl and actin were incubated. By using suitable secondary IgG conjugated with horseradish peroxidase (Jackson
Immuno Research) und dem Chemolumineszenz-System (Amersham-PharmaciaImmuno Research) and the chemiluminescence system (Amersham-Pharmacia
Biotech) wurden die Immunkomplexe sichtbar gemacht. Für eine re-Biotech) the immune complexes were made visible. For a re
Hybridisierung wurden die Blots für 30 min bei 50jC in Stripping-Puffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,7, 2% SDS und 100 mM ß-Merkaptoethanol) inkubiert, extensiv mitHybridization, the blots were incubated for 30 min at 50jC in stripping buffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6.7, 2% SDS and 100 mM β-mercaptoethanol), extensively with
PBS gewaschen, geblockt und re-Hybridisiert.PBS washed, blocked and re-hybridized.
Beispiel 4: Behandlung menschlicher (Krebs-)zelllinien mit antisense- Oligonukleotiden Die in Zellkultur verwendeten menschlichen Krebszelllinien A549, Detroit562 und MDA-MB-435 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bzw. der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen erworben.Example 4: Treatment of human (cancer) cell lines with antisense oligonucleotides. The human cancer cell lines A549, Detroit562 and MDA-MB-435 used in cell culture were acquired from the American Type Culture Collection (ATCC) and the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures.
2,5 x 105 Zellen wurden in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS), Antibiotika und 2 mM L-Glutamin suspendiert, in T25 Kulturflaschen ausgesät und bei 37jC in 5% CO2/95% Luft2.5 x 10 5 cells were suspended in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) with 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS), antibiotics and 2 mM L-glutamine, seeded in T25 culture bottles and at 37jC in 5% CO 2 /95% air
Atmosphäre in einem angefeuchteten Brutschrank inkubiert. Nach 24 h wurden die Zellen (mit einer Konfluenz von 50 - 60%) mit den jeweiligen, in sterilem entionisiertem Wasser für Zellkulturen gelösten Oligonukleotiden in Gegenwart des monokationischen Lipids N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethyl- ammoniummethylsulfat (Dotap, Röche Diagnistics, Mannheim) in 20 mM HEPES- Puffer (pH 7,4 mit NaOH) und OptiMem-Medium (Life Technologies, Rockville, MD, USA) behandelt. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37jC wurde das oligonukleotidhaltige Medium durch normales Zellkultur-Medium (10% FCS) ersetzt und die Zellen wurden für weitere 24 oder 48 Stunden inkubiert. Die Lebensfähigkeit ("viability") der Zellen wurde durch Anfärben mit Trypanblau (0,1%) bestimmt, wobei die Anzahl der Trypanblau-negativen Zellen durch Auszählen in einer Zählkammer ermittelt wurde. Transfizierte und nur mit Dotap behandelte Zellen wiesen 24 h nach der Transfektion eine 95 bis 100%ige Lebensfähigkeit auf.Incubated atmosphere in a humidified incubator. After 24 h the cells (with a confluence of 50-60%) with the respective oligonucleotides dissolved in sterile deionized water for cell cultures in the presence of the monocationic lipid N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N- trimethylammonium methyl sulfate (Dotap, Röche Diagnistics, Mannheim) in 20 mM HEPES buffer (pH 7.4 with NaOH) and OptiMem medium (Life Technologies, Rockville, MD, USA). After 4 hours of incubation at 37 ° C, the oligonucleotide-containing medium was replaced by normal cell culture medium (10% FCS) and the cells were incubated for a further 24 or 48 hours. The viability of the cells was determined by staining with trypan blue (0.1%), the number of trypan blue negative cells being determined by counting in a counting chamber. Transfected cells treated only with Dotap showed 95 to 100% viability 24 hours after the transfection.
Mismatch Oligonukleotide zur Kontrolle: JWG160-MM: 5'-CTC AAG AAG TGG CTC C-3' (SEQ ID No.: 20)Control mismatch oligonucleotides: JWG160-MM: 5'-CTC AAG AAG TGG CTC C-3 '(SEQ ID No .: 20)
JWG370-MM: 5'-GAT CAG TCC ACG TTG TG-3' (SEQ ID No.: 21 )JWG370-MM: 5'-GAT CAG TCC ACG TTG TG-3 '(SEQ ID No .: 21)
G3139-MM: 5'-TCT CTC AGC ATG TGC TAT-3' (SEQ ID No.: 22)G3139-MM: 5'-TCT CTC AGC ATG TGC TAT-3 '(SEQ ID No .: 22)
Beispiel 5: Bestimmung der Zytotoxizität, bzw. des Einflusses von antisense- Oligonukleotiden auf die ZeilproliferationExample 5: Determination of the cytotoxicity or the influence of antisense oligonucleotides on cell proliferation
Gegen die Zeil-Proliferation gerichtete Effekte wurden durch tägliche Bestimmung der Zellzahl und der Lebensfähigkeit durch direktes Auszählen unter Einsatz des Trypanblau-Verfahrens ermittelt.Effects directed against cell proliferation were determined by daily determination of the cell number and viability by direct counting using the trypan blue method.
Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde täglich für 4 Tage nach Behandlung mit dem jeweiligen antisense-Oligonukleotid ermittelt. Die Zellen wurden in 0,1 % Trypanblau suspendiert und ausgezählt. Zu jedem Zeitpunkt wurde der Mittelwert aus drei Zählungen genommen und der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen berechnet.The viability of the cells was determined daily for 4 days after treatment with the respective antisense oligonucleotide. The cells were suspended in 0.1% trypan blue and counted. At each point in time, the mean was taken from three counts and the percentage of viable cells was calculated.
Beispiel 6: Antisense-Oligonukleotid-Therapie von humanen Xenotransplatat Tumoren in MäusenExample 6: Antisense oligonucleotide therapy of human xenotransplatate Tumors in mice
Die Tierstudien erfolgten an Gruppen mit 5-6 nackten, acht bis zehn Wochen alten Athymie-Mäusen (nu/nu) NMRI (Harlan Winkelmann, Borchen). 2x106 A549- , Detroit562-, MDA-MB-435- sowie primäre Bauchkrebs-Zellen wurden subkutan injiziert und vor Beginn der Antisense-Behandlung einer Passage von mindestens drei aufeinanderfolgenden Transplantationen unterworfen. Unter Betäubung mit Urethan wurden Tumorfragmente von ca. 20 bis 25 mg subkutan in die linke und rechte Seite des Tieres implantiert. Die antisense-Oligonukleotid-Behandlungen begannen, wenn die Tumoren ein durchschnittliches Volumen von 60 bis 90 mm3 erreicht hatten (7 bis 14 Tage nach der Transplantation). Antisense Oligonukleotide (G3139 und JWG160) wurden zweimal wöchentlich oder als aufeinanderfolgende Kombination jeweils in Dosen von 5 mg/kg mittels Bolus Injektion intravenös in die Schwanzvene verabreicht (200 μl). Fünf Minuten nach Verabreichung der asOe wurden dem Tumor perkutan fünf Hochspannungspulse verabreicht. Hierzu wurden perkutan zwei Stahlelektroden parallel auf gegenüberliegenden Seiten des Tumors unter Verwendung von Kontaktpaste plaziert und dem Tumor 5 aufeinanderfolgende rechteckige Pulse von 400 V/cm2 von 10 ms Dauer verabreicht. Zwischen den Pulsen lag jeweils ein Intervall von 1 s. Nach vierwöchiger Behandlung wurden die Mäuse getötet, die Tumoren präpariert und die Tumormasse mit einer Präzisionswaage bestimmt.The animal studies were carried out in groups with 5-6 nude, eight to ten week old Athymie mice (nu / nu) NMRI (Harlan Winkelmann, Borchen). 2x10 6 A549, Detroit562, MDA-MB-435 and primary abdominal cancer cells were injected subcutaneously and subjected to at least three successive transplants before antisense treatment was started. Tumor fragments of approximately 20 to 25 mg were implanted subcutaneously into the left and right side of the animal under anesthetic with urethane. The antisense oligonucleotide treatments started when the tumors reached an average volume of 60 to 90 mm 3 (7 to 14 days after the transplant). Antisense oligonucleotides (G3139 and JWG160) were administered intravenously into the tail vein twice a week or as a successive combination in doses of 5 mg / kg by bolus injection (200 μl). Five minutes after administration of the asOe, five high voltage pulses were administered percutaneously to the tumor. For this purpose, two steel electrodes were placed percutaneously in parallel on opposite sides of the tumor using contact paste and 5 successive rectangular pulses of 400 V / cm 2 of 10 ms duration were administered to the tumor. There was an interval of 1 s between each pulse. After four weeks of treatment, the mice were sacrificed, the tumors were prepared and the tumor mass was determined using a precision balance.
Die Tiere wurden durch allgemeine klinische Untersuchungen, Bestimmung des Körpergewichtes und des Tumorwachstums überwacht.The animals were monitored by general clinical examinations, body weight and tumor growth.
Zur Bestimmung von Plkl-, bzw. Bcl-2 Proteinexpression in Tumorxenotrans- plantaten wurde aus herausgeschnittenen Tumoren das Gesamt-Protein isoliert und wie oben beschrieben mittels Western-Blot-Analyse in Bezug auf Plkl und Bcl-2 Protein untersucht.In order to determine Plkl or Bcl-2 protein expression in tumor xenografts, the total protein was isolated from cut-out tumors and, as described above, examined for Plkl and Bcl-2 protein by means of Western blot analysis.
Beispiel 7: Fluoreszenz-mikroskopische UntersuchungExample 7: Fluorescence microscopic examination
Studien an intravenös verabreichten nichtmodifizierten (phosphodiester) Oligonukleotiden zeigten, dass die Plasma Halbwertszeit dieser Verbindungen ungefähr 5 min beträgt. Eine Phosphorothioat Modifikation führt zu einer maßgeblichen Verlängerung der Plasma Halbwertszeit auf 30 - 60 min. Phosphorothioat Oligonukleotide binden an Serumalbumin und alpha2 Makroglobulin und zeigen eine biphasische Pharmakokinetik (Agrawal et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 7595-99). Tierstudien der Oligonukleotid Bioverteilung zeigten, dass intravenös, subkutan oder intraperitoneal verabreichte Oligonukleotide hauptsächlich in der Leber, den Nieren oder anderen Organen des Reticuloendothelialen Systems akkumulieren (Agrawal et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 7595-99).Studies on intravenously administered unmodified (phosphodiester) oligonucleotides showed that the plasma half-life of these compounds is approximately 5 minutes. A phosphorothioate modification leads to a significant extension of the plasma half-life to 30 - 60 min. Phosphorothioate oligonucleotides bind to serum albumin and alpha 2 macroglobulin and show biphasic pharmacokinetics (Agrawal et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7595-99). Animal studies of oligonucleotide biodistribution showed that intravenously, subcutaneously or intraperitoneally administered oligonucleotides accumulate mainly in the liver, kidneys or other organs of the reticuloendothelial system (Agrawal et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7595- 99).
Fluorescin-Isothiocyanat (FITC) markierte Phosphorothioat Oligonukleotide wurden intravenös in nackte Mäuse injiziert. Nach fünf Minuten wurden die Tumoren elektropermeabilisiert wie in Beispiel 6 beschrieben. 24 h später wurden die Tumoren präpariert und bei -70jC tiefgefroren. Fünf-Mikrometer-Schnitte wurden Fluoreszenz-mikroskopisch untersucht.Fluorescin isothiocyanate (FITC) labeled phosphorothioate oligonucleotides were injected intravenously into nude mice. After five minutes, the tumors were electropermeabilized as described in Example 6. 24 hours later, the tumors were dissected and frozen at -70jC. Five-micron sections were examined by fluorescence microscopy.
Beispiel 8: Immunhistochemische Untersuchungen, Apoptose-Assay Mausgewebe und Tumoren aus NMRI nackten Mäusen wurden histologisch durch Hematoxylin und Eosin-Färbung untersucht. Proliferierende Zellen wurden durch Anfärbung mit Ki67-Antikörpern (DAKO, Hamburg) sichtbar gemacht und Blutgefäße wurden mit Antikörpern gegen von Willebrand Faktor (vWF) angefärbt. Gefrorene Schnitte (5 μm) wurden in Aceton fixiert (-20jC, 2 min). Dann wurden die Gewebeschnitte in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) gewaschen und mit dem polyklonalen Hasen anti-Maus Ki67 Antikörper (1 :25) bzw. dem Hasen antiMaus vWF Antikörper (1 :100) für 60 s bei 37jC in feuchter Atmosphäre inkubiert. Die Objektträger wurden drei mal in TBS gewaschen und mit Meerrettich Peroxidase markierten anti-Hase Antikörpern inkubiert. Sichtbarmachung von programmiertem Zelltod in gefrorenen Tumorschnitten wurde mittels "TdT-mediated dUTP nick-end labelling assay for apoptosis" (TUNEL, Röche Diagnostics, Mannheim, D) durchgeführt. Example 8: Immunohistochemical studies, apoptosis assay, mouse tissue and tumors from NMRI nude mice were examined histologically by hematoxylin and eosin staining. Proliferating cells were visualized by staining with Ki67 antibodies (DAKO, Hamburg) and blood vessels were stained with antibodies against von Willebrand factor (vWF). Frozen sections (5 μm) were fixed in acetone (-20jC, 2 min). The tissue sections were then washed in Tris-buffered saline (TBS) and incubated with the polyclonal rabbit anti-mouse Ki67 antibody (1:25) or the rabbit antiMaus vWF antibody (1: 100) for 60 s at 37 ° C. in a moist atmosphere. The slides were washed three times in TBS and incubated with horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit antibodies. Visualization of programmed cell death in frozen tumor sections was carried out using "TdT-mediated dUTP nick-end labeling assay for apoptosis" (TUNEL, Röche Diagnostics, Mannheim, D).

Claims

Patentansprüche: claims:
1. Verwendung eines antisense-Oligodesoxynukleotids gegen Polo-like Kinase 1 (Plkl ) in Kombination mit einem antisense- Oligodesoxynukleotid gegen B-cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl-2) proto- oncogene zur Herstellung von Medikamenten für die Krebstherapie.1. Use of an antisense oligodeoxynucleotide against polo-like kinase 1 (Plkl) in combination with an antisense oligodeoxynucleotide against B-cell leukemia / lymphoma 2 (Bcl-2) protoncogenic for the manufacture of medicaments for cancer therapy.
2. Die Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Plkl um humane Plkl und bei Bcl-2 um humanes Bcl-2 handelt.2. The use according to claim 1, characterized in that the Plkl is human Plkl and Bcl-2 is human Bcl-2.
3. Die Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das antisense-Oligodesoxynukleotid gegen Plkl ausgewählt ist aus der Gruppe: SEQ ID No: 1 , SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11 , SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16, SEQ ID No: 17 oder SEQ ID No: 18 und das antisense-Oligodesoxynukleotid gegen Bcl-2 SEQ ID No: 19 ist.3. The use according to claim 2, characterized in that the antisense oligodeoxynucleotide against Plkl is selected from the group: SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16, SEQ ID No: 17 or SEQ ID No: 18 and the antisense oligodeoxynucleotide against Bcl-2 is SEQ ID No: 19.
4. Die Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das antisense-Oligodesoxynukleotid gegen Plkl 5'-CCC AAA AAG CGG CCC C-3" ist und das antisense-Oligodesoxynukleotid gegen Bcl-2 5'- TCT CCC AGC GTG CGC CAT-3' ist.4. The use according to claim 3, characterized in that the antisense oligodeoxynucleotide against Plkl 5'-CCC AAA AAG CGG CCC C-3 "and the antisense oligodeoxynucleotide against Bcl-2 5'- TCT CCC AGC GTG CGC CAT- 3 'is.
5. Die Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die antisense-Oligodesoxynukleotide gegen enzymatischen Abbau modifiziert sind.5. The use according to any one of the preceding claims, characterized in that the antisense oligodeoxynucleotides are modified against enzymatic degradation.
6. Die Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die antisense-Oligodesoxynukleotide durch Einbau von Phosphorothioat gegen enzymatischen Abbau modifiziert sind.6. The use according to claim 5, characterized in that the antisense oligodeoxynucleotides are modified by incorporation of phosphorothioate against enzymatic degradation.
7. Die Verwendung der Kombination von antisense- Oligodesoxynukleotiden nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Herstellung von Medikamenten für die Therapie von Krebszellen, die Plkl , Bcl-2 oder beide Gene überexprimieren.7. The use of the combination of antisense-oligodeoxynucleotides according to one of the preceding claims for the manufacture of medicaments for the therapy of cancer cells, the Plkl, Bcl-2 or both overexpress genes.
8. Die Verwendung der Kombination von antisense- Oligodesoxynukleotiden nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Herstellung von Medikamenten für die Therapie von Hepatokarzinom, Mammakarzinom oder Pancraeskarzinom.8. The use of the combination of antisense oligodeoxynucleotides according to one of the preceding claims for the manufacture of medicaments for the therapy of hepatocarcinoma, breast cancer or pancreatic cancer.
9. Die Verwendung der Kombination von antisense- Oligodesoxynukleotiden nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Herstellung von Medikamenten für die Therapie von Krebszellen, wobei die verschiedenen antisense-Oligodesoxynukleotide jeweils getrennt in einer pharmazeutischen Formulierung vorliegen.9. The use of the combination of antisense oligodeoxynucleotides according to one of the preceding claims for the manufacture of medicaments for the therapy of cancer cells, the different antisense oligodeoxynucleotides each being present separately in a pharmaceutical formulation.
10. Die Verwendung der Kombination von antisense- Oligodesoxynukleotiden nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Herstellung von Medikamenten für die Therapie von Krebszellen, wobei die verschiedenen antisense-Oligodesoxynukleotide gemeinsam in einer pharmazeutischen Formulierung vorliegen.10. The use of the combination of antisense-oligodeoxynucleotides according to one of the preceding claims for the manufacture of medicaments for the therapy of cancer cells, the various antisense-oligodeoxynucleotides being present together in a pharmaceutical formulation.
11. Die Verwendung der Kombination von antisense- Oligodesoxynukleotiden nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Herstellung von Medikamenten für die Krebstherapie, wobei die Aufnahme der entsprechenden Medikamente durch Membranelektroporation verbessert werden kann. 11. The use of the combination of antisense-oligodeoxynucleotides according to one of the preceding claims for the production of medicaments for cancer therapy, wherein the uptake of the corresponding medicaments can be improved by membrane electroporation.
PCT/EP2003/014043 2002-12-13 2003-12-11 Combined antisense oligonucleotide cancer therapy WO2004054657A1 (en)

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