WO2004023120A1

WO2004023120A1 - 発光型ナノチャンネルセンサー

Info

Publication number: WO2004023120A1
Application number: PCT/JP2003/011384
Authority: WO
Inventors: Tatsuya Uchida; Norio Teramae; Yasuo Suto
Original assignee: Tokyo University Of Pharmacy And Life Science; Tokyo Instruments, Inc.
Priority date: 2002-09-05
Filing date: 2003-09-05
Publication date: 2004-03-18
Also published as: US20050274196A1; US20120156797A1

Abstract

酸化物層が界面活性剤ミセルを内包しているナノチャンネル体薄膜において、ナノチャンネル内での発光型認識試薬による標的物質の認識にともなう薄膜の発光強度により検体溶液中の標的物質の存在を検出し、ナノメートルサイズの細孔内の界面活性剤の存在が与える疎水場に着目し、センサー機能の新しい展開を可能とする。

Description

明細発光型- 技術分野

この出願の発明は、発光型- '—に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、生化学分析、微量成分分析等のためのセンサーとして、医学、衛生、産業、農業、さらには環境評価等の広範囲な領域において有用な、ナノメートルサイズの細孔（ナノチヤンネル）構造を利用した新しい発光型ナノチャンネルセンサ一に関するものである。背景技術

従来より、ナノメートルサイズの細孔に注目して、この細孔（メソポ一ラス）物質を作製することが検討されてきている。これらの従来の検討では、アルコキシシラン化合物の加水分解を界面活性剤の存在下に行うことで、界面活性剤を鎊型として細孔をもつ物質を形成している。たとえば、従来の技術としては、マイ力基板上へのメソポーラス物質の作製（文献 1 ) や溶媒の蒸発によるメソポ一ラス薄膜の作製（文献 2)、メソポ一ラス薄膜のパターニングとシランカップリング剤による機能化（文献 3) 等が報告されている。

文献 1： Hong Yang, et al. , Nature, Vol.379, 22 Feb. 1996, p.703-705 文献 2： Yun Feng Lu, et al. , Nature, Vol.389, 25 Sep.1997, p.364-368 文献 3： Hongyou Fan, et al. , Nature, Vol.405, 4 May.2000, p.56-60 しかしながら、たとえば以上のような検討にもかかわらず、ナノメ一トルサイズの細孔をもつ物質、その薄膜についての機能性材料としての技術的展開は、 pHセンサ一としての利用等について示唆されているものの、ほとんど進展していないのが実情である。たとえばナノメートルスケールの細孔構造を利用しての超微量分析等の実現が期待されるもののいまだに具体化されていない。

このようなこの理由の一つとしては、従来の技術においては、細孔形成のための鍀型として界面活性剤を使用しているが、この界面活性剤は焼成によって除去されており、界面活性剤による疎水場については着目されていないことがある。分析センサ一等としての機能の展開のためには、この疎水場はもつと注目されてよい。

そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、ナノメートルサイズの細孔をもつ物質について、その作製過程に用いられていた界面活性剤の存在が与る疎水場に着目し、その機能としてセンサーへの展開を可能にする新しい技術的手段を提供することを課題としている。発明の開示

この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第 1には、酸化物層が界面活性剤ミセルを内包しているナノチャンネル体の薄膜を有するナノチヤンネルセンサーであって、ナノチャンネル内での発光型認識試薬による標的物質の認識にともなう薄膜の発光強度により検体溶液中の標的物質の存在を検出することを特徴とする発光型ナノチヤンネルセンサーを提供する。

また、この出願の発明は、第 2には、ナノチャンネル体の酸化物層が珪素酸化物を主として構成されていることを特徴とする発光型ナノチヤンネルセンサーを、第 3には、発光型認識試薬と検体溶液とを混合し、発光型認識試薬とともにこれに認識された標的物質とをナノチャンネル内に抽出捕捉し、薄膜の発光強度により検体溶液中の標的物質の存在を検出することを特徴とする発光型ナノチャンネルセンサ一を、第 4には、発光型認識試薬をあらかじめナノチャンネル内に含浸させ、検体溶液中の標的物質を捕捉認識にともなう薄膜の発光強度により検体溶液中の標的物質の存在を検出することを特徴とする発光型ナノチャンネルセンサーを提供する。図面の簡単な説明

図 1は、ナノチャンネル体の薄膜についてこれを模式的に示した図である。

図 2は、抽出型と含浸型のセンサ一について模式的に示した図である。図 3は、実施例におけるナノチャンネル体薄膜についての X線回析の結果を例示した図である。

図 4は、実施例における T E O S含有率と膜厚との関係を例示した図である。

図 5は、 8—キノタノ一ルー 5— 2スルホン酸（Q s ) の分子構造を示した図である。

図 6は、発光スペクトル（薄膜）のアルミニウム濃度依存性を例示した図である。

図 7は、発光型ナノチャンネルセンサー（抽出型）のアルミニウムィオンに対する応答性を例示した図である。

図 8は、 5 Mまでのアルミニウムイオン濃度に対しての発光強度の相対比を示した図である。

図 9は、ナノチヤンネル内ミセルによるアルミニウム—キノリノール錯体の抽出のメカニズムを示した図である。

図 1 0は、発光型ナノチャンネルセンサー（抽出型）のマグネシウムイオンに対する応答性を例示した図である。

図 1 1は、発光型ナノチャンネルセンサー（含浸型）のマグネシウムイオンに対する応答性を例示した図である。

図 1 2は、カリウムイオン、ナトリウム、イオンに対しての発光応答の測定結果を示した図である。

図 1 3は、センサ一アレイによる発光についてアルミニウムイオンの濃度と発光強度との対応を示した図である。

図 1 4は、センサ一アレイによる発光像を示した写真である。

図 1 5は、センサーアレイによる二元素（イオン）同時分析の発光像の例を示した写真である。発明を実施するための最良の形態

この出願の発明は上記のとおりの特徵をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。

なによりも特徴的なことは、この出願の発明においては、ナノチャンネルセンサ一の構造として、酸化物層が界面活性剤ミセルを内包してナノチャンネル内を疎水的な場として保持していることであり、また、この疎水的な場での発光型認識試薬による標的物質の認識にともなうナノチヤンネル体薄膜の発光強度により検体溶液中の標的物質の検出が行われることである。このような特異な構造とその作用を可能とするナノチャンネル体の薄膜は、シリカ層の場合として模式的に示すと、たとえば図 1の構成として考慮されるものである。

このナノチャンネル体は、好適には、まず、原料としての酸化物形成性アルコキシド化合物と界面活性剤含有の酸性アルコール溶液より、加熱もしくは乾燥によって、酸化物層が界面活性剤ミセルを内包するようにして作製することができる。一般的には、上記溶液の原料濃度が比較的希薄な場合は蒸発乾固の過程でミセルが形成され、それらが鎳型となつてナノチャンネル体が形成される。一方、原料濃度が濃厚な場合は高温加圧下で原料等が溶融し、その過程でナノチャンネル体が形成されるこの場合の酸化物形成性アルコキシド化合物としては、ナノチャンネル構造体の酸化物層を形成するものであれば各種のものであってよい。たとえば代表的には、珪素酸化物層を形成するものとして珪素アルコキシド化合物が挙げられるが、この他にも、チタン、ジルコニウム、ハフ二ゥム、タンタル、ニオブ、ガリウム、希土類元素等の各種のもののァルコキシドを考慮することができる。

これらのアルコキシド化合物とともに使用される界面活性剤については各種のものが考慮されてよく、たとえば代表的なものとしてはィォン性界面活性剤としての第四級アンモニゥム塩型の界面活性剤で挙げられる。また、スルホン酸型のものも挙げられる。ポリエーテル型ノニオン型界面活性剤であってもよい。ただ、なかでも好適なものの一つは、カチオン性の第四級アンモニゥム塩型のものである。

アルコキシド化合物と界面活性剤との使用割合については、その両者の種類等によって相違し、特に限定的ではないが、一般的には、アルコキシド化合物に対する界面活性剤のモル比とじて、 0 . 0 1〜 0 . 5を目安とすることができる。

アルコキシド化合物と界面活性剤は酸性の水溶液中で混合し、加熱する。この際の加熱温度については、還流温度までとすることができる。酸性条件とするために、塩酸や硫酸、あるいは有機酸を混合することができる。また、水溶液中には、低沸点のエタノール、プロパノール、メタノール等のアルコールを共存させるのが好ましい。

加熱後にこの出願の発明におけるナノチヤンネル体が生成されるが、この際には、加熱溶液を固体基板上に展開するか、固体基板上で前記の溶液を加熱してもよい。こうすることによって、図 1に模式的に示したようなナノチャンネル体の薄状物が得られることになる。これは薄膜と呼ぶことができる。もちろん、固体基板は各種のものであってもよい。マイ力 ·アルミナ等のセラミックス基板やガラス基板でもよいし、金属や有機高分子の基板であってもよい。

たとえば以上のようなプロセスによって作製することのできる界面活性剤ミセルを酸化物層に内包しているナノチャンネル体薄膜によつて、この出願の発明.の発光型ナノチャンネルセンサーが構成される。その形態としては次の抽出型と含浸型のものとに大別される。図 2はその概要を模式的に示したものである。抽出型では、たとえば検体水溶液中に発光型認識試薬を溶解させ、これと標的物質との錯形成させつつ疎水性相互作用でナノチャンネル内に抽出し、薄膜の蛍光強度をもとに標的物質を検出する。一方、含浸型では予め発光性の認識試薬をその水溶液からナノチャンネル内に導入しておき、その後、検体水溶液中の標的物質をチャンネル内に存在する発光性認識試薬で捕集し、膜の蛍光強度をもとに標的物質を検出する。この含浸型は、異なる認識試薬を有するナノチヤンネル体薄膜を同一基板上にそれぞれ配置することによって、多種類の化学物質を一斉に検出することを可能にする。

以上のいずれの場合においても、発光型認試薬は各種のものであつてよく、標的物質との錯形成が可能なもの、あるいは反応による結合や、物理的な捕捉結合が可能なもの等の各種のものとすることができる。ナノチヤンネル内の疎水場においては、発光型認識試薬がその分子構造として各種の官能基をもつものであっても使用することが可能である。これらの発光型認識試薬については、発光機能は種々の方法によって可能としてよい。また、これらの試薬は、低分子化合物だけでなく、 D N A、タンパク質、酵素等の高分子や生物由来のものであってもよい。

また、この出願の発明においては、前記ナノチャンネル体の疎水性の保持のための方法として、前記ナノチャンネル体を水または水性溶液に浸漬すると、ナノチャンネル（細孔）に内包されている界面活性剤ミセルの一部が水または水性溶液中に溶出し、ナノチャンネル内の疎水性が時間とともに低下することがあることから、あらかじめナノチャンネル内壁を疎水化処理し、界面活性剤ミセルとこの内壁との疎水性相互作用を増すことで、水または水性溶液中への界面活性剤ミセルの溶出を抑えるようにすることも有効である。

このような疎水化処理には、ナノチャンネル体との親和性等を考慮しての疎水化処理剤を用いることができる。たとえばナノチャンネル体が珪素酸化物により構成されている場合には、適宜なシランカツプリング剤、より具体的にはメルカプト基を有するシランカツプリング剤を好適なものとして考慮される。

このような疎水化処理の条件については実験的に適宜に選定されてよい。より好適な方法としては、前記のようなこの出願の発明のナノチャンネル構造体あるいはナノチヤンネル薄膜の製造において、ナノチヤンネル体の形成時に前記疎水化処理剤を界面活性剤とともに添加して含有させておくことが考慮される。

ナノチャンネル体形成のためのアルコキシド化合物と界面活性剤に対する添加割合としては、たとえばシランカップリング剤等の疎水化処理剤を、前者に対してのモル比 0. 3〜 1. 2倍、後者に対してのモル比 3〜2 0倍程度とすることが考慮される。

前記のナノチャンネル体薄膜の発光強度の検出は、たとえば図 2にも示したように、励起光照射にともなう発光の強度変化を測定してもよいし、あるいは別の発光機構とその検出方法に基づくようにしてもよい。そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく発明の実施の形態について説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。実施例

1. ナノチャンネル体薄膜の作製

以下の手順に従って、界面活性分子集合体（ミセル）を铸型として、ナノメートルサイズの細孔（ナノチャンネル）構造を有するシリカ界面活性剤ナノチャンネル体薄膜を作製した。

ぐ薄膜作製用溶液の調製 >

•溶液の組成（モル比）を次のとおりとした。

TEO S ： E t OH : H₂0 : HC l ： C T AB = 1 ： 8. 8 ： 5. 0 : 0. 0 04 : 0. 0 7 5

CTAB ：セチルトリメチルアンモニゥムプロミド

TEO S ：オルトけぃ酸テトラェチル ① E t OH9. 7mL, TEOS 1 2. 3 mL, 2. 7 8 X

1 0 -³MHC l mLを混合し 6 0 で 9 0分還流した。

② 還流後の溶液に E t〇H 1 8. 4mL, CTAB 1. 5 1 9 g , 5. 48 X 1 0— ²MHC 1 4mLを加えて 3 0分攪拌した。

<薄膜作製 >

① 前記調製により得られた薄膜溶液 3 50 Lを、洗浄、乾燥したガラス基板上へ滴下し、

② 回転塗布（spin- coat法）（40 0 0 r pm， 3 0 s e c ) した。 <薄膜の乾燥 >

spin-coat した後、常温で 1時間乾燥した。

<アルカリ処理 > (薄膜にふくまれている HC 1の中和）

•使用するアルカリ緩衝液（NH₄C 1— NH₃)

0. 1 MNH₄C 1 と 0. 1 MNH₃ a qを混合（約 p H 1 0 )

① 乾燥させた薄膜をアルカリ緩衝液へ 20分浸積した。

② アルカリ緩衝液を超純水で置換しながらすすぎ、超純水に 2 0分浸積した。

2. 薄膜のキャラクタリゼーシヨン

ぐ X線回折 >

前記プロセスにより得られた薄膜について、図 3にはその X線回折の結果を示した。 2 0が 2. 0にピークがみられ、ナノメートルオーダ一の周期構造が薄膜内に形成されたことがわかる。ナノチャンネルは図 1 に示すようなハニカム類似構造をとつているものと考えられ、この 20 値から隣接したチャンネル間の距離は 5. l nmと算出される。シリカ壁の厚みを 1 nmとすると、チャンネルの孔径はおよそ 4 nmであると推定される。また X線回折と示差走査熱量の同時測定により、 3 0 0でまで界面活性分子がチヤンネル内に存在し、ミクロな秩序構造に顕著な変化がないことを確認した。 <膜厚 >

エリプソメトリー及び原子間力顕微鏡による段差測定によって得られた膜厚はほぼ同一であり、およそ 3 9 0 nmであった。次に、薄膜作製用溶液をエタノールで希釈し、薄膜の制御を試みた。図 4は、薄膜作製用溶液における TEO Sのモル分率に対して、膜厚をプロットしたものである。膜厚は TEO Sの含有量にほぼ比例していることが明らかとなった。

3. 抽出型によるアルミニウムイオンの検出

前記プロセスに従って基板上に作製した界面活性分子集合体（ミセル）を含有するナノチャンネル体薄膜をガラス基板とともに図 5の 8 - キノリノール— 5—スルホン酸（Q s ) 2 0 を含む濃度の異なるァルミニゥム水溶液に 2 0分間浸漬し、風乾後、大気中で発光スペクトルおよび強度を測定した。図 6に発光スぺクトルのアルミニウム濃度依存性を図 7に発光強度の増幅率（アルミニウムイオンが存在しない場合を 1 ) をアルミニウムイオン濃度に対してプロットしたものを示した。発光強度はアルミニウムイオン濃度とともに増大し、 3 0 ζΜ付近でおよそ 7倍程度まで増大していることがわかる。

また、図 8は、 5 までのアルミニウムイオン濃度に対しての発光強度の相対比を示したものであって、これによれば 1 χΜ以下のアルミニゥムイオンの検出が可能であることがわかる。

以上のような結果は、図 9に示すように試料溶液中の Q s と A 1が錯体を形成しつつナノチャンネル内のミセルに捕集され、 A 1濃度に伴つてその量が増加することを示している。以上の結果は、

(およそ p p b) オーダー、さらには

以下のオーダーのアルミニウムイオンを極めて高感度かつ簡便に検出可能であることを実証している。

4. 抽出型によるマグネシウムイオンの検出

上記と同様の薄膜基板を所定の Q s ( l ^Mおよび Ι Ο ^Μ) を含む濃度の異なるマグネシウム水溶液に 2 0分間浸漬し、風乾後、大気中で蛍光スペクトルおよび強度を測定した。その結果を図 1 0に示した。いずれの Q s濃度の場合でも、 M g濃度が 3オーダー異なる範囲で、 M g 濃度にともなって発光強度が増大していることがわかる。このことから、この出願の発明のセンサーの測定濃度範囲が極めて広く、ダイナミックレンジの広い物質検出法であることが理解される。また、 M g濃度に対する発光強度の増幅率は Q s濃度が高い方が良好である。

5 . 含浸型によるマグネシウムイオンの検出

上記と同様の薄膜基板を用意し、 1 0 M， 2 0 0 M , 2 mMの Q s水溶液にそれぞれ 2 0分間浸漬した。これによつて、ナノチャンネル内に含浸される Q s量を制御した。これらの基板を濃度の異なる M g水溶液に 2 0分間浸潰し、風乾後、大気中で発光スペクトルおよび強度を測定した。その結果を図 1 1に示した。' Q s処理濃度がいずれの場合においても、増幅率は単調に増加せずに、ある M g濃度で極大を有することがわかる。さらにその極大を与える M g濃度は、 Q s処理濃度ともに増加している。この結果は、 Q s処理濃度を変えることで、マグネシゥムに対するセンサーの最適検出濃度範囲が制御可能であることを示している。このことは、検体に応じてセンサーの最適検出濃度を設定できることを意味する。また、最適検出濃度のことなるナノチャンネルセンサーを同一基板上に集積することにより、標的物質濃度が全く未知であつても他の予備測定を必要とせずにその濃度を決定することが可能である。さらに、異なる認識試薬を有するナノチャンネル薄膜を同一基板上にそれぞれ配置することによって、多種類の化学物質を一斉に検出することを可能にする。

6 . カリウムイオンの検出

前記 5 . の場合と同様に、含浸型センサーの薄膜を、蛍光性分子認識試薬の水溶液に浸漬.し、認識試薬をナノチヤンネル内に導入した。

認識試薬としては、

N - ( 9 - Anthrylie thyl ) monoaza 一 1 8 c rown - 6 を用いた。

その後、 K C し N a C 1の水溶液（p H 7 . 6に調整）に浸漬し、カリウム（K ) イオン、ナトリウム（N a ) イオンに対する発光応答を測定した。その結果を図 1 2に示した。

図 1 2の結果から、カリウムイオンの濃度に依存して蛍光強度が増大することと、ナトリゥムイオンにはほとんど応答しないことがわかる。つまり、カリゥムイオン選択性のセンサ一として優れたものであることがわかる。

そして、溶液内に共存する高濃度なナトリゥムイオンの影響は極めて小さい。以上のことから、この例のセンサーば、血液、. 尿などの生体試料分析に利用可能である。

7 . センサーアレイ

前記同様に、ガラス基板上に薄膜作製溶液を複数箇所で滴下して風乾し、複数の円形スポット状（約 3 πιπι φ ) のナノチャンネル薄膜が配列したアレイ構成体とした。次いで、このものを発光性分子認識試薬としての前記 Q s の水溶液中に浸漬し、このものをナノチャンネル内に導入した。

得られたセンサ一アレイを用いて、各々のスポット状ナノチャンネル薄膜に、濃度の異なるアルミニウムイオン（A l ^{3 +} ) 含有の水溶液を滴下し、円形スポットでの発光を測定した。

励起波長 3 6 5 mmで、 1 / 3カラ一 C C Dカメラ検出器による検出結果を図 1 3に示した。また、センサーアレイの蛍光像を図 1 4に示した。

この結果から、センサ一アレイの構成とすることにより、複数の試料溶液を瞬時に測定することができ、たとえば、図 1 3のようにして、標準溶液を用いた検量線作成および試料の定量分析を 1回の測定で完了できることがわかる。そして、ナノチャンネルの傑出した物質捕集特性により、分子認識試薬等を高濃度に捕集しているために蛍光が強いことから、高価で大規模な検出器を必要とせず、小型で省電力な CCDカメラ、 CMO Sカメラあるいは民生用カメラ付き携帯電話を利用でき、可動性の高い微小な測定装置を構築できる。

そして、機能の異なる蛍光生分子認識試薬を同一基板上の薄膜スポットにそれぞれ含浸させることにより、複数化学種の一斉検出も可能とされる。

図 1 5はその例を示したものである。 A l ³⁺イオンと K +イオンの同時分析を行った結果を示した写真である。 A l ³⁺検出列では、 A l ^{3 +} 溶液に対して蛍光が増大し、 K +溶液に対しては応答していない。これにより A 1 ^{3 +}の選択的検出が確認される。一 ¾、 K+検出列では、 K + 溶液に対して蛍光が増大し、 A 1³⁺溶液に対しては応答していない。

K +の選択的検出が確認される。

そして、 A 1 ^{3 +}と K +共存溶液に対しては、対応するそれぞれの検出サイ卜の発光が増大し、このことから同時検出が確認される。産業上の利用可能性

この出願の発明によって、以上詳しく説明したとおり、ナノメートルサイズの細孔をもつナノチャンネルが内包する界面活性剤の存在が与える疎水場に'着目し、センサーとしての機能の新しい展開を可能にすることができる。—

Claims

請求の範囲

1 . 酸化物層が界面活性剤ミセルを内包しているナノチヤンネル体の薄膜を有するナノチャンネルセンサーであって、ナノチャンネル内での発光型認識試薬による標的物質の認識にともなう薄膜の発光強度により検体溶液中の標的物質の存在を検出することを特徴とする発光型ナノチヤンネルセンサー。

2 . ナノチャンネル体の酸化物層が珪素酸化物を主として構成されていることを特徵とする請求項 1の発光型ナノチヤンネルセンサー。

3 . 発光型認識試薬と検体溶液とを混合し、'発光型認識試薬とともにこれに認識された標的物質とをナノチャンネル内に抽出捕捉し、薄膜の発光強度により検体溶液中の標的物質の存在を検出することを特徴とする請求項 1または 2の発光型ナノチャンネルセンサー。

4 . 発光型認識試薬をあらかじめナノチャンネル内に含浸させ、検体溶液中の標的物質を捕捉認識にともなう薄膜の発光強度により検体溶液中の標的物質の存在を検出することを特徴とする請求項 1または 2 の発光型ナノチャンネルセンサ一。