WO2004022781A1 - Method for the detection of nucleic acids - Google Patents

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WO2004022781A1 PCT/EP2003/008836 EP0308836W WO2004022781A1 WO 2004022781 A1 WO2004022781 A1 WO 2004022781A1 EP 0308836 W EP0308836 W EP 0308836W WO 2004022781 A1 WO2004022781 A1 WO 2004022781A1
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction

Abstract

The invention relates to a method for detecting nucleic acids in a reaction mixture resulting from a PCR reaction, in which reassociation of nucleic acids is inhibited. The inventive method comprises the following steps: a) blocker molecules are added to the reaction mixture; b) double-stranded nucleic acid material is denatured so as to form two types of complementary single-stranded nucleic acid; c) the blocker molecules hybridize with at least one section and at least one of the two types of single-stranded nucleic acid resulting from the denaturing process; d) the reaction mixture is brought into contact with collector molecules; e) said collector molecules react with one section of a detectable nucleic acid so as to form target collector sequence hybrids; and f) formed target collector sequence hybrids are identified by means of detection.

Description

Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren Methods for the detection of nucleic acids
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren.The present invention relates to a method for the detection of nucleic acids.
Nukleinsäuren liegen normalerweise in Form doppelsträngiger Moleküle vor, die auch als Heteroduplexe bezeichnet werden und aus zwei Nukleinsäure-Molekülen zusammengesetzt sind. Setzt man Heteroduplexe einer Temperaturerhöhung aus, dissoziieren sie in zwei einzelsträngige Nukleinsäure-Moleküle. Bei einer Erniedrigung der Temperatur können diese zu einem Heteroduplex reassoziieren. Unter bestimmten Umständen können einzelsträngige Nukleinsäure-Moleküle auch mit sich selbst zu sogenannten Homoduplex-Molekülen reagieren. Die Hinreaktion zu Hetero- oder Homo-Duplexen bezeichnet man als Hybridisierung oder Rehybridisierung, bei Ho- moduplexen auch als Selbsthybridisierung. Hetero- und Homoduplexe werden auch als Hybride bezeichnet.Nucleic acids are usually in the form of double-stranded molecules, which are also called heteroduplexes and are composed of two nucleic acid molecules. If heteroduplexes are exposed to an increase in temperature, they dissociate into two single-stranded nucleic acid molecules. When the temperature is lowered, they can reassociate into a heteroduplex. Under certain circumstances, single-stranded nucleic acid molecules can also react with themselves to form so-called homoduplex molecules. The forward reaction to hetero- or homo-duplexes is referred to as hybridization or rehybridization, in the case of homo-duplexes also as self-hybridization. Hetero and homoduplexes are also called hybrids.
Die Dissoziation von Nukleinsäure-Doppelsträngen und ihre Reassoziation stellt ein chemisches Gleichgewichtssystem dar, das sich bei einer bestimmten Kenngröße, die als Schmelztemperatur Tm bezeichnet wird, in einem chemischen Gleichgewicht befindet bei dem die Hälfte aller Nukleinsäure-Moleküle in einer Lösung in doppelsträngiger Form, die andere Hälfte in Form von Einzelstrang-Molekülen vorliegt.The dissociation of nucleic acid double strands and their reassociation represents a chemical equilibrium system which is in a chemical equilibrium at a certain parameter, which is referred to as the melting temperature T m , in which half of all nucleic acid molecules are in a solution in double-stranded form, the other half is in the form of single-stranded molecules.
Nukleinsäuren sind Polymere der Nukleotide Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Ura- cil, Inosin (a, c, g, t, u, i), künstlicher oder modifizierter Nukleotide, die in dem Polymer wie Perlen an einer Perlenkette aneinandergereiht sind. Die Abfolge der Nukleotide in einem Nukleinsäure-Molekül ist für das jeweilige Nukleinsäure-Molekül spezifisch. Die Bildung von Doppelsträngen erfolgt über Wasserstoff-Brückenbindungen, die z. B. zwischen Einzelnukleotiden a und t, sowie c und g entstehen können, wenn auf einem Einzelstrang genügend Nukleotide aufeinander folgen, die auf ein jeweiliges Gegennukleotid auf einem anderen Einzelstrang - und dort in der entsprechenden Reihenfolge - treffen. In der Natur liegen Nukleinsäuren in Form solcher zueinander komplementärer Einzelstränge als Doppelstrang vor. Die jeweilige Zusammensetzung der Nukleinsäuren hat Einfluss auf das chemische Gleichgewicht, das zwischen Reassoziation und Dissoziation von Nukleinsäure-Doppelsträngen besteht. Prinzipiell kann man sagen, dass die Dissoziation von Nukleinsäure-Doppelsträngen primär nach einer Kinetik erster Ordnung erfolgt, während die Rückreaktion primär nach einer Kinetik zweiter Ordnung erfolgt, wobei sich das Gleichgewicht in Lösung sehr schnell einstellt, Hin- und Rückreaktion in Lösung also verhältnismäßig schnell erfolgen.Nucleic acids are polymers of the nucleotides adenine, cytosine, guanine, thymine, uracil, inosine (a, c, g, t, u, i), artificial or modified nucleotides, which are strung together in the polymer like pearls on a pearl chain. The sequence of the nucleotides in a nucleic acid molecule is specific for the respective nucleic acid molecule. The formation of double strands takes place via hydrogen bonds, the z. B. between individual nucleotides a and t, as well as c and g, if sufficient nucleotides follow one another on a single strand, which meet a respective counter nucleotide on another single strand - and there in the appropriate order. In nature, nucleic acids are in the form of such complementary single strands as a double strand. The particular composition of the nucleic acids influences the chemical equilibrium that exists between reassociation and dissociation of nucleic acid double strands. In principle, one can say that the dissociation of nucleic acid double strands primarily takes place according to first-order kinetics, while the reverse reaction takes place primarily according to second-order kinetics, whereby the equilibrium is established very quickly in solution, that is, the back and forth reaction in solution is relatively quick respectively.
Häufig steht man vor dem Problem, dass das Vorhandensein einer bestimmten Nu- kleinsäure in einem Reaktionsgemisch oder einer biologischen Probe (im folgenden unter dem Begriff „Reaktionsgemisch" zusammengefasst) nachgewiesen werden soll. Dies geschieht in der Regel durch den Einsatz von Fänger-Molekülen, die einzelsträngige Nukleinsäuren aufweisen, die mit einem einzelsträngigen oder partiell ein- zelsträngigen Nukleinsäure-Molekül, im folgenden Zielstrang, hybridisieren und der Nachweis des Hybrids erlaubt eine Aussage über das Vorhandensein des Zielstrangs. Da auf Nukleinsäuren bestimmte Sequenzen mehrmals vorkommen können bzw. mehrmals vorkommen, wird das Fänger-Molekül so ausgewählt, dass es vorzugsweise mit einer Zielsequenz reagiert, die einen Abschnitt der Gesamtsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt und für diese möglichst spezifisch ist. i Dabei versucht man in der Regel eine größtmögliche Stringenz der Fänger- Zielsequenz-Hybride und eine größtmögliche Spezifität beziehungsweise Einzigartigkeit der Zielsequenz für die betreffende Nukleinsäure zu gewährleisten.The problem often arises that the presence of a certain nucleic acid in a reaction mixture or a biological sample (hereinafter referred to as "reaction mixture") should be detected. This is usually done by using capture molecules. which have single-stranded nucleic acids which hybridize with a single-stranded or partially single-stranded nucleic acid molecule, in the following target strand, and the detection of the hybrid allows a statement to be made about the presence of the target strand. Since certain sequences can occur or occur several times on nucleic acids, the catcher molecule is selected so that it preferably reacts with a target sequence that represents a section of the total sequence of the nucleic acid to be detected and is as specific as possible for this.i As a rule, one tries to achieve the greatest possible stringency of the catcher-target sequence hybrid and one to ensure the greatest possible specificity or uniqueness of the target sequence for the nucleic acid in question.
Das Nachweisen von Nukleinsäuren mittels Fänger-Zielsequenz-Hybriden ist seit ) langem bekannt. Es hat sich aus dem sogenannten Southern Blot über viele Varianten bis hin zu Oligonukleotid-Chips entwickelt, bei denen auf wenigen Quadratzentimetern Tausende von Oligonukleotid-Sequenzen als Spots räumlich separiert an einer festen Phase vorgesehen sind und als Fänger-Moleküle fungieren. Viele dieser Spots ermöglichen zeitlich parallel eine qualitative und im begrenzten Umfang quantitative Antwort auf An- oder Abwesenheit bestimmter Sequenzen. Es gibt darüber hinaus eine Vielzahl von Variationen des Fänger-Zielsequenz-Hybrid- Nachweisprinzips, die der Fachwelt allgemein bekannt sind.The detection of nucleic acids using capture target sequence hybrids has long been known. It has evolved from the so-called Southern blot through many variants to oligonucleotide chips in which thousands of oligonucleotide sequences are provided as spots spatially separated on a solid phase on a few square centimeters and act as capture molecules. Many of these Spots allow a qualitative and, to a limited extent, quantitative response to the presence or absence of certain sequences. There are also a variety of variations of the capture target sequence hybrid detection principle that are well known to those in the art.
Um einen Nachweis eines Fänger-Zielsequenz-Hybrides zu ermöglichen, braucht man hierfür eine hinreichende Menge nachweisbarer Hybride.In order to enable detection of a catcher target sequence hybrid, a sufficient amount of detectable hybrids is required for this.
Häufig ist man mit geringen Probenmengen konfrontiert, die mittels einer PCR- Reaktion in mehreren Zyklen amplifiziert werden müssen. Jeder Zyklus einer PCR- Reaktion gleicht einem Kopiervorgang, wobei die Anzahl der Kopien mit jedem Schritt exponentiell zunimmt. Jeder Schritt kostet Zeit und Material, und je weiter der Kopiervorgang fortgeschritten ist, desto fehlerhafter können die Kopien ausfallen.Often one is confronted with small sample amounts, which have to be amplified in several cycles by means of a PCR reaction. Each cycle of a PCR reaction is like a copying process, with the number of copies increasing exponentially with each step. Each step costs time and material, and the further the copy process has progressed, the more faulty the copies can be.
Dadurch, dass nachweisbare Zielstränge einerseits mit Fänger-Molekülen hybridisieren können, aber andrerseits auch zu Doppelsträngen reassoziieren können, befinden sich die Reassoziation und die Ausbildung von Fänger-Zielsequenz-Hybriden in direkter Konkurrenz zueinander. Man kann daher in aller Regel nur einen Teil der eigentlich vorhandenen Nukleinsäure-Moleküle mittels Fänger-Zielsequenz-Hybriden nachweisen.Because detectable target strands can hybridize to catcher molecules on the one hand, but can also reassociate to double strands on the other hand, the reassociation and the formation of catcher-target sequence hybrids are in direct competition with one another. As a rule, therefore, only a part of the nucleic acid molecules actually present can be detected using capture target sequence hybrids.
Wenn man Fänger-Zielsequenz-Hybride an fester Phase erzeugt, wie z.B. bei Nachweisen mittels DNA-Arrays, kommt erschwerend hinzu, dass die Bildung von Fänger- Zielsequenz-Hybriden in Lösung schneller abläuft als an einer festen Phase.When creating solid phase catcher target sequence hybrids such as in the case of detection by means of DNA arrays, an additional complication is that the formation of catcher-target sequence hybrids in solution proceeds faster than on a solid phase.
Es bestehen somit erhebliche Nachteile in Bezug auf die Sensitivität und die Spezifi- tät herkömmlicher Nachweisverfahren von Nukleinsäuren.There are therefore considerable disadvantages with regard to the sensitivity and the specificity of conventional detection methods for nucleic acids.
Um den Nachweis von Nukleinsäuremolekülen sensitiver zu machen, sind mehrere Verfahren bekannt, mit deren Hilfe die Reassoziation von Einzelsträngen zu Doppelsträngen verhindert wird. Ein bekanntes Verfahren zur Verhinderung der Reassoziation ist der Strangabbau mit Hilfe eines Enzyms. Dabei hydrolysiert ein Enzym einen der beiden Einzelstränge, und es bleibt lediglich ein Einzelstrang zurück. Das Verfahren hat den Nachteil, umständlich und auch fehleranfällig zu sein, z.B. wenn das Enzym nicht zuverlässig arbeitet oder aber wenn das Enzym auch nachzuweisendes Material aus einem Reaktionsgemisch entfernt.In order to make the detection of nucleic acid molecules more sensitive, several methods are known by means of which the reassociation from single strands to double strands is prevented. A known method for preventing reassociation is strand degradation with the help of an enzyme. An enzyme hydrolyzes one of the two single strands, leaving only one single strand. The method has the disadvantage of being cumbersome and also prone to errors, for example if the enzyme does not work reliably or if the enzyme also removes material to be detected from a reaction mixture.
Ein anderes bekanntes Verfahren zur Erhöhung der Sensitivität besteht darin, dass einer der Einzelstränge der doppelsträngigen Nukleinsäure mit einer Markierung versehen wird, die eine Bindung der markierten Nukleinsäure an eine feste Phase ermöglicht. Auf diese Weise findet ein „Herausfiltern" der markierten Nukleinsäure aus der Lösung statt. Derartige Verfahren können zum Beispiel mit Hilfe von Magnetpartikeln durchgeführt werden, die an den markierten Strang binden und mit denen der markierte Strang mit Hilfe eines Magneten aus einem Reaktionsgemisch entfernt werden kann. Übrig bleibt dann der nicht markierte Einzelstrang, der nicht mehr zu einem Heteroduplex reassoziieren kann und entfernt wird. Auch dieses und ähnlich gestaltete Verfahren haben den Nachteil, umständlich zu sein.Another known method for increasing the sensitivity consists in that one of the single strands of the double-stranded nucleic acid is provided with a label which enables the labeled nucleic acid to bind to a solid phase. In this way, the labeled nucleic acid is “filtered out” from the solution. Such methods can be carried out, for example, with the aid of magnetic particles which bind to the labeled strand and with which the labeled strand can be removed from a reaction mixture with the aid of a magnet What remains is the unlabeled single strand, which can no longer be reassociated into a heteroduplex and is removed.This and similarly designed methods also have the disadvantage of being cumbersome.
Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die zyklische Denaturierung reassoziierter Stränge in einem externen Denaturierungsschritt. Hier wird mit jedem Zyklus Gelegenheit gegeben, noch freie Fänger-Moleküle zu besetzen. Die Reassoziation zu Heteroduplexen ist in solchen Verfahren allerdings nicht verhindert.Another known method is the cyclic denaturation of reassociated strands in an external denaturation step. With each cycle there is an opportunity to occupy free catcher molecules. The reassociation to heteroduplexes is not prevented in such processes.
Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die asymmetrische PCR, bei der durch stark unterschiedliche Konzentrationen der PCR-Edukte immer eine nicht mehr exponenti- elle Amplifikation vorgenommen wird, sondern eine lineare Vervielfältigung des auf Fänger-Moleküle zu hybridisierenden Zielstranges. Die Reassoziationskinetik wird hierbei zu Ungunsten dieses Stranges beeinflusst, weil der Zielstrang nach ca. 15 Zyklen allein linear vervielfältigt wird.Another known method is asymmetric PCR, in which strongly different concentrations of the PCR educts always result in an amplification that is no longer exponential, but rather a linear multiplication of the target strand to be hybridized to capture molecules. The reassociation kinetics are influenced to the disadvantage of this strand, because the target strand is multiplied linearly after about 15 cycles alone.
Aus DE 100 21 947, WO 97/44488, US 5,512,445 und US 5,030,557 sind Verfahren bekannt, bei denen Helferoligonukleotide dazu eingesetzt werden, eine Zielsequenz besser zugänglich zu machen, indem sie die Sekundär- und/oder Tertiärstruktur von Nukleinsäuren durch ihr Bindungsverhalten beeinflussen. Die Helferoligonukleotide binden dabei im allgemeinen an Bindungsstellen in der Nähe einer Zielsequenz und ermöglichen so eine weitgehend störungsfreie Hybridisierung der Zielsequenz mit einer Sonde. Beschrieben sind in-situ-Hybridisierungen an einzelsträngig vorliegender ribosomaler RNA, der im allgemeinen eine Anreicherung des Probenmaterials mittels Zellkulturen vorausgeht.Methods are known from DE 100 21 947, WO 97/44488, US Pat. No. 5,512,445 and US Pat. No. 5,030,557, in which helper oligonucleotides are used to make a target sequence more accessible by changing the secondary and / or tertiary structure of Affect nucleic acids through their binding behavior. The helper oligonucleotides generally bind to binding sites in the vicinity of a target sequence and thus enable a largely interference-free hybridization of the target sequence with a probe. In situ hybridizations on single-stranded ribosomal RNA are described, which are generally preceded by an enrichment of the sample material by means of cell cultures.
Die US 5,747,252 kombiniert diese Verfahren mit einem Verfahren zur Amplifikation, bei dem nur gewünschte, zu untersuchende Einzelstränge erhalten werden. Helferoligonukleotide dienen einer Verbesserung der Hybridisierungseigenschaften von Zielsequenzen auf dem einzelsträngig vorliegenden PCR-Produkt.No. 5,747,252 combines these methods with a method for amplification, in which only the desired single strands to be examined are obtained. Helper oligonucleotides serve to improve the hybridization properties of target sequences on the single-stranded PCR product.
Die bekannten Verfahren sind experimentell aufwändig wegen der erforderlichen zusätzlichen Reaktionsschritte, bzw. der benötigten speziellen Primer für Einzelstran- gamplifikationen, teuer durch die Einführung von Markierungen oder nur mit aufwändigen Maschinen zu betreiben.The known methods are experimentally complex because of the additional reaction steps required or the required special primers for single-strand amplifications, expensive to operate due to the introduction of markings or only with complex machines.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren zu schaffen, bei dem die Reassoziation von Nukleinsäuren auf einfache Art und Weise gehemmt wird.The object of the invention is therefore to provide a method for the detection of nucleic acids, in which the reassociation of nucleic acids is inhibited in a simple manner.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1.The object is achieved by a method according to claim 1.
Weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen eines erfindungsgemässen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further advantageous refinements of a method according to the invention result from the subclaims.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einem Reaktionsgemisch mit folgenden Schritten: a) dem Reaktionsgemisch werden Blocker-Moleküle hinzugefügt, b) doppelstrangiges Nukleinsäurematerial wird zu zwei Typen von komplementären Nukleinsaure-Einzelstrangen denaturiert, c) die Blocker-Moleküle hybridisieren mit zumindest einem Abschnitt von zumindest einem der beiden Typen von aus der Denaturierung resultierenden Nukleinsäure- Einzelsträngen, d) das Reaktionsgemisch wird mit Fänger-Molekülen in Verbindung gebracht, e) die Fänger-Moleküle reagieren jeweils mit einem Abschnitt einer detektierbaren Nukleinsäure zu Fänger-Zielsequenz-Hybriden, und f) gebildete Fänger-Zielsequenz-Hybride werden durch Detektion nachgewiesen.The object is achieved by a method for the detection of nucleic acids in a reaction mixture with the following steps: a) blocker molecules are added to the reaction mixture, b) double-stranded nucleic acid material is denatured into two types of complementary single nucleic acid strands, c) the blocker molecules hybridize with at least a section of at least one of the two types of nucleic acid resulting from the denaturation Single strands, d) the reaction mixture is associated with capture molecules, e) the capture molecules each react with a section of a detectable nucleic acid to capture-target sequence hybrids, and f) formed capture-target sequence hybrids are detected by detection.
Durch das erfindungsgemässe Verfahren entstehen Hybride aus Blocker-Molekülen und Nukleinsaure-Einzelstrangen, wodurch diese daran gehindert werden, zu Hetero- oder Homo-Duplexen zu reassoziieren und in hohem Umfang für die Bildung von Fänger-Zielsequenz-Hybriden zur Verfügung stehen. Die Sensitivität von Nukleinsäurenachweisen wird durch das erfindungsgemässe Verfahren so auf einfache und günstige Weise erheblich verbessert, so dass z.B. weniger Probenmaterial benötigt oder Nachweise spezifischer Sequenzen überhaupt möglich sind.The method according to the invention produces hybrids from blocker molecules and single nucleic acid strands, which prevent them from reassociating to hetero- or homo-duplexes and are available to a large extent for the formation of capture-target sequence hybrids. The sensitivity of nucleic acid detections is significantly and easily improved by the method according to the invention, so that e.g. less sample material is required or evidence of specific sequences is possible at all.
Nach einer weiteren Ausbildung des erfindungsgemässen Verfahrens, sind die Fänger-Moleküle auf einem DNA-Array angeordnet. Dabei können gleichzeitig viele erfindungsgemässe und hoch sensitive Nukleinsäurenachweise stattfinden.According to a further embodiment of the method according to the invention, the capture molecules are arranged on a DNA array. Many highly sensitive nucleic acid detections according to the invention can take place simultaneously.
Vorzugsweise werden in einem erfindungsgemässen Verfahren die Blocker-Moleküle im molaren Uberschuss, vorzugsweise in einem 10-100-fachen molaren Uberschuss, eingesetzt. Hierdurch wird eine mögliche Reassoziation von Einzelsträngen zu Hete- roduplexen fast vollständig ausgeschlossen.In a method according to the invention, the blocker molecules are preferably used in a molar excess, preferably in a 10-100-fold molar excess. This almost completely excludes a possible reassociation of single strands to heteroduplexes.
In einer weiteren Abwandlung eines erfindungsgemässen Verfahrens bilden die Blok- ker-Moleküle mit Nukleinsaure-Einzelstrangen Hybride aus, deren Bildung in Konkurrenz zu einer etwaigen Bildung von Sekundärstrukturen steht. Hierdurch wird die Bildung von Sekundärstrukturen verhindert, die sonst eine Bildung von Fänger- Zielsequenz-Hybriden behindern könnten. Stattdessen können sogar Strukturen ausgebildet werden, die vorteilhaft für eine Detektion sind.In a further modification of a method according to the invention, the blocker molecules form hybrids with single nucleic acid strands, the formation of which competes with any formation of secondary structures. This prevents the formation of secondary structures that could otherwise hinder the formation of catcher-target sequence hybrids. Instead, structures can be formed that are advantageous for detection.
Beim erfindungsgemässen Verfahren können ein oder mehrere unterschiedliche Blocker-Moleküle eingesetzt werden. Durch das Vorsehen mehrerer unterschiedlicher Blocker-Moleküle können die Blok- ker-Moleküle nach bestimmten Anforderungen ausgewählt werden und zusammen wirken. Zum Beispiel können vorgesehen sein und zusammenwirken: Blocker- Moleküle, die zur Verhinderung der Bildung von Homoduplexen ausgewählt sind, und Blocker-Moleküle, die zur Verhinderung der Ausbildung unerwünschter Sekundärstrukturen ausgewählt sindOne or more different blocker molecules can be used in the method according to the invention. By providing several different blocker molecules, the blocker molecules can be selected according to specific requirements and work together. For example, the following can be provided and interact: blocker molecules selected to prevent the formation of homoduplexes and blocker molecules selected to prevent the formation of undesirable secondary structures
Nach einer weiteren Ausbildung des erfindungsgemässen Verfahrens bestehen die Blocker-Moleküle aus synthetischen Oligonukleotiden. Diese können in beliebiger Zusammensetzung und Länge in hoher Reinheit zur Verfügung gestellt, wodurch erfindungsgemässe Verfahren besonders effektiv wirken.After a further development of the method according to the invention, the blocker molecules consist of synthetic oligonucleotides. These can be made available in high purity in any composition and length, as a result of which methods according to the invention act particularly effectively.
In einer weiteren Ausbildung des erfindungsgemässen Verfahren werden in die Nu- kleinsäure-Einzelstränge, die die Zielsequenz enthalten, Markierungsmittel eingebaut. Auf diese Weise wird eine Detektion gebildeter Hybride erleichtert.In a further embodiment of the method according to the invention, marking agents are incorporated into the single nucleic acid strands which contain the target sequence. In this way, detection of hybrids formed is facilitated.
Vorzugsweise werden in erfindungsgemässen Verfahren Blocker-Moleküle verwendet, die im wesentlichen keine Bindungen mit Fänger-Molekülen eingehen können, damit die Fänger-Moleküle nicht durch Blocker-Moleküle blockiert werden.Preferably blocker molecules are used in the method according to the invention, which essentially cannot form any bonds with catcher molecules, so that the catcher molecules are not blocked by blocker molecules.
Vorzugsweise werden in erfindungsgemässen Verfahren Blocker-Moleküle verwendet, die im wesentlichen keine Bindungen mit Abschnitten eines Nukleinsäure- Einzelstranges eingehen können, die mit Fänger-Molekülen reagieren können, damit diese Abschnitte nicht durch Blocker-Moleküle blockiert werden.Blocker molecules are preferably used in the methods according to the invention which essentially cannot form bonds with sections of a single nucleic acid strand which can react with capture molecules so that these sections are not blocked by blocker molecules.
Dem besseren Verständnis der Erfindung dienen die Figuren 1 - 2, in denen Fig. 1 ein Gleichgewichtssystem gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt,FIGS. 1-2 serve for a better understanding of the invention, in which FIG. 1 represents an equilibrium system according to the present invention,
Fig. 2 Draufsichten auf fluoreszenzangeregte Oberflächen von DNA-Chips darstellt.2 shows top views of fluorescence-excited surfaces of DNA chips.
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden zunächst Begriffe im Sinne der Erfindung definiert. PCR-Primer sind Oligonukleotide, die eine Amplifikation von Nukleinsäurematerial mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion ermöglichen.For a better understanding of the invention, terms are first defined in the sense of the invention. PCR primers are oligonucleotides that enable amplification of nucleic acid material using the polymerase chain reaction.
Nukleinsäure-Einzelstränge entstehen durch Dissoziation von Nukleinsäure- Doppelsträngen. Ein zu eliminierender Nukleinsäurestrang ist ein Nukleinsäure- Einzelstrang, der keine Hybride mit Fänger-Molekülen ausbilden soll. Ein detektier- barer Zielstrang ist ein Nukleinsäure-Einzelstrang, der Hybride mit Fänger- Molekülen ausbilden kann. Hierzu weist der detektierbare Zielstrang einen zum Fängermolekül komplementären Abschnitt auf, der als Zielsequenz bezeichnet wird. Beide oder einer der aus einem Nukleinsäuredoppelstrang resultierenden Nukleinsäure-Einzelstränge können detektierbare Zielstränge 3 sein.Single nucleic acid strands are created by dissociation of nucleic acid double strands. A nucleic acid strand to be eliminated is a single nucleic acid strand which is not intended to form hybrids with capture molecules. A detectable target strand is a single-stranded nucleic acid that can form hybrids with capture molecules. For this purpose, the detectable target strand has a section which is complementary to the catcher molecule and is referred to as the target sequence. Both or one of the nucleic acid single strands resulting from a nucleic acid double strand can be detectable target strands 3.
Fänger-Moleküle sind Moleküle, die dazu geeignet sind, mit bestimmten Molekülen so in Wechselwirkung zu treten, dass diese an die Fänger-Moleküle gebunden sind, z.B. mittels Hybridisierung. Dabei passen die Fänger-Moleküle zu diesen Molekülen wie ein Schlüssel zu einem Schloss, das heißt, dass man mit Hilfe der Fänger- Moleküle die Moleküle, die zu den jeweiligen Fängern passen, aus einer Vielzahl von Molekülen „einfangen kann". Die Fänger-Moleküle können an eine feste Phase gebunden sein, zum Beispiel an Oberflächen. Sie können sich aber auch in Lösung befinden und sie können auch an sogenannte magnetic beads gebunden sein.Catcher molecules are molecules that are capable of interacting with certain molecules in such a way that they are bound to the catcher molecules, e.g. using hybridization. The catcher molecules fit to these molecules like a key to a lock, which means that with the help of the catcher molecules, the molecules that match the respective catchers can be "captured" from a large number of molecules. Molecules can be bound to a solid phase, for example on surfaces, but they can also be in solution and they can also be bound to so-called magnetic beads.
Blocker-Moleküle sind Moleküle, die mit einem Nukleinsäureeinzelstrang eine Bindung derart eingehen können, dass der Nukleinsäureeinzelstrang nicht mit einem zu diesem komplementären Nukleinsäureeinzelstrang zu einem Doppelstrang hybridisieren kann. Blocker-Moleküle können bestehen aus: DNA, cDNA, RNA, tRNA, mRNA, LNA, PNA, aRNA oder Kombinationen daraus . Blocker-Moleküle sind insbesondere Oligonukleotide mit einer vorbestimmten Länge die komplementär zu Bereichen von Nukleinsäuresträngen sind. Vorzugsweise weisen Blocker-Moleküle Längen von 10- 30 Nukleotiden auf.Blocker molecules are molecules which can bind to a single strand of nucleic acid in such a way that the single strand of nucleic acid cannot hybridize to a single strand of nucleic acid which is complementary thereto. Blocker molecules can consist of: DNA, cDNA, RNA, tRNA, mRNA, LNA, PNA, aRNA or combinations thereof. Blocker molecules are in particular oligonucleotides with a predetermined length which are complementary to regions of nucleic acid strands. Blocker molecules preferably have lengths of 10-30 nucleotides.
Ein EHminationsblocker ist ein Blocker-Molekül, das mit einem zu eliminierenden Nukleinsäurestrang Hybride ausbilden kann. Ein Detektionsentblocker ist ein Blok- ker-Molekül, das mit dem zu detektierenden Zielstrang Hybride ausbilden kann. Glei- che oder unterschiedliche Blocker-Moleküle können als Eliminationsblocker oder Detektionsentblocker fungieren.An inhibitor is a blocker molecule that can form hybrids with a strand of nucleic acid to be eliminated. A detection deblocker is a blocker molecule that can form hybrids with the target strand to be detected. The same Different or different blocker molecules can act as elimination blockers or detection blockers.
Ein Reaktionsgemisch ist ein Gemisch, in dem sich nachweisbares Nukleinsäure- material befindet, das mit Fänger-Molekülen in Verbindung gebracht werden soll oder bereits mit diesen in Verbindung gebracht wurde, und dem Blocker-Moleküle zugesetzt werden können oder bereits zugesetzt wurden.A reaction mixture is a mixture in which there is detectable nucleic acid material which is to be associated with or has already been associated with capture molecules and to which blocker molecules can be added or have already been added.
Erfindungsgemäß werden einem Reaktionsgemisch Blocker-Moleküle hinzugefügt. Hierdurch entsteht ein Gleichgewichtssystem (Fig.1), das vier chemische Gleichgewichtsreaktionen (l)-(IV) umfasst.According to the invention, blocker molecules are added to a reaction mixture. This creates an equilibrium system (Fig. 1), which comprises four chemical equilibrium reactions (I) - (IV).
Die Gleichgewichtsreaktion (I) beschreibt die Dissoziation von Heteroduplexen bzw. Nukleinsäuredoppelsträngen 1 zu Nukleinsäureeinzelsträngen 2, 3 (Hinreaktion) und deren Reassoziation zu Nukleinsäuredoppelsträngen 1 (Rückreaktion). Bei der Schmelztemperatur Tm befindet sich diese Reaktion in einem chemischen Gleichgewicht, bei dem jede der Komponenten Nukleinsäuredoppelstränge 1 und Nukleinsäu- reeinzelstränge 2, 3 jeweils in gleicher Konzentration vorliegt. Bei einer Temperaturerhöhung verschiebt sich das Gleichgewicht hin zu höheren Konzentrationen an Nukleinsäureeinzelsträngen 2, 3 (Denaturierung durch Erhitzen). Eine Temperaturerniedrigung verschiebt das Gleichgewicht hin zu höheren Konzentrationen an Nukleinsäure-Doppelsträngen (Renaturierung). Die Nukleinsäureeinzelstränge können zu eliminierende Nukleinsäurestränge 2 und/oder die detektierbaren Zielstränge 3 sein. Zielstränge 3 sind detektierbare Moleküle, da sie eine spezifische Zielsequenz 4 aufweisen. Die Nukleinsäureeinzelstränge 2, 3 können auch in lediglich partiellen Bereichen einzelsträngig und in den übrigen Bereichen doppelsträngig vorliegen, was insbesondere bei langen Nukleinsäuremolekülen der Fall ist. Ein Gleichgewicht besteht dann zwischen partiell einzelsträngigen Nukleinsäureeinzelsträngen 2, 3 und (ggf. ebenso partiell) doppelsträngigen Nukleinsäuren 1.The equilibrium reaction (I) describes the dissociation of heteroduplexes or nucleic acid double strands 1 to nucleic acid single strands 2, 3 (forward reaction) and their reassociation to nucleic acid double strands 1 (reverse reaction). At the melting temperature T m , this reaction is in a chemical equilibrium in which each of the components of nucleic acid double strands 1 and nucleic acid single strands 2, 3 is present in the same concentration. When the temperature rises, the equilibrium shifts towards higher concentrations of nucleic acid single strands 2, 3 (denaturation by heating). A lowering of the temperature shifts the equilibrium towards higher concentrations of nucleic acid double strands (renaturation). The nucleic acid single strands can be nucleic acid strands 2 to be eliminated and / or the detectable target strands 3. Target strands 3 are detectable molecules because they have a specific target sequence 4. The nucleic acid single strands 2, 3 can also be single-stranded in only partial regions and double-stranded in the other regions, which is the case in particular with long nucleic acid molecules. There is then an equilibrium between partially single-stranded nucleic acid single strands 2, 3 and (possibly also partially) double-stranded nucleic acids 1.
Die Gleichgewichtsreaktion (II) beschreibt die Reaktion von vollständig oder partiell disoziierten Nukleinsäuresträngen 2 oder 3 zu Sekundärstrukturen 5 dieser Nukleinsäurestränge und die korrespondierende Rückreaktion. Bei Sekundärstrukturen kann die räumliche Ausrichtung der Zielsequenz 4 diese schwer zugänglich machen, wie in Fig. 1 anhand eines schematisierten Homoduplexes 5 dargestellt. Blocker-Moleküle 6, die als Detektionsentblocker 6d fungieren, können so ausgewählt sein, dass sie Sensitivität von Nukleinsäurenachweisen erhöhen. Es wird angenommen, dass mittels der Detektionsentblocker die Ausbildung von Sekundärstrukturen 5 ver- oder behindert wird, die ihrerseits die Ausbildung von Fänger-Zielsequenz-Hybriden 11 ver- oder behindern würden. Derartige ungünstige Sekundärstrukturen sind z.B. Faltungen oder Homoduplexe des detektierbaren Zielstranges. Es wird ferner angenommen, dass Detektionsentblocker dazu geeignet sind, die Sekundärstruktur des detektierbaren Einzelstrangs dahingehend zu beeinflussen, dass die Zielsequenz besonders leicht mit einem dazu passenden Fänger-Molekül hybridisieren kann, zum Beispiel indem die Detektionsentblocker eine gestreckte und darum leicht mit einem Fänger-Molekül hybridisierbare Sekundärstruktur im Bereich der Zielsequenz bewirken.The equilibrium reaction (II) describes the reaction of completely or partially disassociated nucleic acid strands 2 or 3 to secondary structures 5 of these nucleic acid strands and the corresponding reverse reaction. With secondary structures can the spatial alignment of the target sequence 4 make it difficult to access, as shown in FIG. 1 using a schematic homoduplex 5. Blocker molecules 6, which act as detection deblockers 6d, can be selected in such a way that they increase the sensitivity of nucleic acid detections. It is assumed that the formation of secondary structures 5 is prevented or hindered by means of the detection deblocker, which would in turn prevent or hinder the formation of catcher-target sequence hybrids 11. Such unfavorable secondary structures are, for example, folds or homoduplexes of the detectable target strand. It is also assumed that detection blockers are suitable for influencing the secondary structure of the detectable single strand in such a way that the target sequence can hybridize particularly easily with a matching catcher molecule, for example by the detection blockers having a stretched and therefore easily with a catcher molecule cause hybridizable secondary structure in the area of the target sequence.
Die Gleichgewichtsreaktion (III) beschreibt die Reaktion von vollständig oder partiell denaturierten bzw. disoziierten Nukleinsäureeinzelsträngen 2, 3 mit Blocker- Molekülen 6 zu Hybridmolekülen 7, 8 und die korrespondierende Rückreaktion. Hybridmoleküle 8 sind Moleküle, die eine Zielsequenz 4 aufweisen.The equilibrium reaction (III) describes the reaction of completely or partially denatured or disassociated single nucleic acid strands 2, 3 with blocker molecules 6 to form hybrid molecules 7, 8 and the corresponding reverse reaction. Hybrid molecules 8 are molecules that have a target sequence 4.
Bringt man Nukleinsäureeinzelstränge 3 oder Hybridmoleküle 8, die jeweils eine Zielsequenz 4 umfassen, mit Fänger-Molekülen in Verbindung, die eine Sequenz aufweisen, die zur Zielsequenz 4 komplementär ist, so bilden sich in beiden Fällen detektierbare Hybride zwischen den Fänger-Molekülen und den jeweiligen Zielsequenzen 4.If nucleic acid single strands 3 or hybrid molecules 8, each comprising a target sequence 4, are combined with capture molecules that have a sequence that is complementary to the target sequence 4, then in both cases detectable hybrids are formed between the capture molecules and the respective ones Target sequences 4.
Die Gleichgewichtsreaktion (IV) beschreibt diese Reaktion zu detektierbaren Fänger- Zielsequenz-Hybriden 11 für Hybridmoleküle 8 mit an einer festen Phase 9 befindlichen Fänger-Molekülen 10.The equilibrium reaction (IV) describes this reaction to detectable target-target sequence hybrids 11 for hybrid molecules 8 with capture molecules 10 located on a solid phase 9.
Die in Fig. 1 gezeigten Gleichgewichtsreaktionen befinden sich im Gleichgewicht, wenn die Konzentrationen der jeweils vorhandenen Komponenten konstant sind. Unter konstanten Bedingungen stellt sich ein solches Gleichgewicht nach einer be- stimmten Zeit immer ein. Gleichgewichtsreaktionen gehorchen dem von Le Chatelier formulierten Prinzip des kleinsten Zwangs, wonach ein im Gleichgewicht befindliches System einem Zwang ausweicht, und sich ein neues Gleichgewicht einstellt. Jede Änderung der Bedingungen ist ein solcher Zwang.The equilibrium reactions shown in FIG. 1 are in equilibrium if the concentrations of the components present in each case are constant. Under constant conditions, such a balance arises after a certain always agreed time. Equilibrium reactions obey the principle of least coercion formulated by Le Chatelier, according to which a system in equilibrium evades compulsion and a new equilibrium is established. Any change in conditions is such a constraint.
Durch hinzufügen von Blocker-Molekülen 6 zu einem Reaktionsgemisch, in dem ein Gleichgewicht (I) vorliegt, reagieren Blocker-Moleküle 6 mit disoziierten Nukleinsaure- Einzelstrangen 2 und/oder 3 zu Hybriden 7 und/oder 8, wodurch dem Gleichgewichtsystem Nukleinsäuren 2 und/oder 3 entzogen werden und das Gleichgewicht (I) sich infolgedessen hin auf die Seite der vereinzelten Nukleinsäurestränge 2, 3 verschiebt, und weniger Doppelstränge 1 vorliegen.By adding blocker molecules 6 to a reaction mixture in which an equilibrium (I) is present, blocker molecules 6 react with disassociated single nucleic acid strands 2 and / or 3 to form hybrids 7 and / or 8, which results in nucleic acids 2 and / or or 3 are withdrawn and the equilibrium (I) is consequently shifted to the side of the isolated nucleic acid strands 2, 3, and fewer double strands 1 are present.
Da sowohl Zielstränge 3 als auch die Hybridmoleküle 8 hybridisieren können, ist die Konzentration an detektierbaren Molekülen höher als vor Hinzufügen der Blocker- Moleküle 6, und es können demzufolge mehr Hybride zwischen Fänger-Molekülen 10 und Zielsequenzen 4 - in Form von Nukleinsäureeinzelsträngen 3 oder Hybridmolekülen 8 - ausgebildet werden, als dies ohne den Einsatz von Blocker-Molekülen bei ansonsten gleichen Bedingungen möglich wäre. So wird mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens die Sensitivität von Nukleinsäure-Nachweisen auf einfache Weise erhöht.Since both target strands 3 and the hybrid molecules 8 can hybridize, the concentration of detectable molecules is higher than before the blocker molecules 6 were added, and consequently more hybrids between catcher molecules 10 and target sequences 4 - in the form of single nucleic acid strands 3 or hybrid molecules 8 - be formed than would be possible without the use of blocker molecules under otherwise identical conditions. The method according to the invention thus increases the sensitivity of nucleic acid detections in a simple manner.
Nukleinsäure-Moleküle bestehen überwiegend aus einer bestimmten Abfolge der Nukleotide a, c, t und g, bzw. a, c, u und g. Andere Basen, wie z.B. Inosin oder modifizierte Nukleotide können auch darin vorkommen. Je kürzere Abschnitte eines Nu- kleinsäure-MoIeküls verwendet werden, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass andere Abschnitte mit identischer Basenabfolge bzw. komplementärer Basenfolge innerhalb dieses oder anderer Nukleinsäure-Moleküle vorkommen. Es werden deshalb die Blocker-Moleküle 6 so gewählt, dass sie eine Mindestlänge aufweisen, damit sie nicht an beliebigen Stellen mit Nukleinsäuren hybridisieren. Die Mindestlänge liegt typischerweise im Bereich von 6 bis 10 Nukleotiden.Nucleic acid molecules mainly consist of a certain sequence of nucleotides a, c, t and g, or a, c, u and g. Other bases, such as Inosine or modified nucleotides can also be found therein. The shorter sections of a nucleic acid molecule are used, the greater the likelihood that other sections with an identical base sequence or complementary base sequence will occur within this or other nucleic acid molecules. The blocker molecules 6 are therefore chosen so that they have a minimum length so that they do not hybridize with nucleic acids at any point. The minimum length is typically in the range of 6 to 10 nucleotides.
Die Schmelztemperatur Tm von Hybriden steigt mit der Länge der jeweiligen Hybride und ist ausserdem abhängig von der jeweiligen Zusammensetzung - so schmelzen gc-reiche Hybride bei anderen Temperaturen als gc-arme Hybride. Die Blocker- Moleküle 6 werden daher so gewählt, dass Hybride 7, 8 eine Schmelztemperatur Tm aufweisen, die im wesentlichen identisch mit oder höher als die Schmelztemperatur Tm der jeweiligen Fänger-Zielsequenz-Hybride 11 ist.The melting temperature T m of hybrids increases with the length of the respective hybrid and is also dependent on the respective composition - so melt gc-rich hybrids at different temperatures than gc-poor hybrids. The blocker molecules 6 are therefore chosen such that hybrids 7, 8 have a melting temperature T m which is essentially identical to or higher than the melting temperature T m of the respective catcher-target sequence hybrids 11.
Ein an sich detektierbarer Nukleinsäureeinzelstrang 3 kann eine ungünstige Sekundärstruktur 5 aufweisen, so dass es nicht mit einem Fänger-Molekül hybridisieren kann. Eine solche Sekundärstruktur ist beispielsweise eine Verdrillung der Zielsequenz 4. Ein Blocker-Molekül 6, das in der Nachbarschaft einer Zielsequenz 4 wirkt, kann die räumliche Ausrichtung der Zielsequenz 4 dahingehend beeinflussen, dass die Ausbildung detektierbarer Hybride 11 begünstigt wird, z.B. indem eine ursprünglich verdrillte Zielsequenz 4 nun in gestreckter, bzw. weniger verdrillter Form vorliegt. Ein Blocker-Molekül 6 ist dann so gewählt, dass es als Detektionsentblocker 6d ein Hybrid 8 ausbildet, dessen Schmelztemperatur Tm identisch mit oder vorzugsweise höher als die Schmelztemperatur eines möglichen benachbarten Hybrides 11 zwischen der Zielsequenz 4 und dem Fänger 10 ist. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass eine für einen Nachweis vorteilhaftere Sekundärstruktur - z.B. eine Streckung - der Zielsequenz 4 auch bei solchen Temperaturen tatsächlich vorliegt, die nur knapp um die oder über der Schmelztemperatur Tm der detektierbaren Hybride 11 liegt.A nucleic acid single strand 3, which can be detected per se, can have an unfavorable secondary structure 5, so that it cannot hybridize with a capture molecule. Such a secondary structure is, for example, a twisting of the target sequence 4. A blocker molecule 6, which acts in the vicinity of a target sequence 4, can influence the spatial orientation of the target sequence 4 in such a way that the formation of detectable hybrids 11 is favored, for example by an originally twisted one Target sequence 4 is now in a stretched or less twisted form. A blocker molecule 6 is then selected such that it forms a hybrid 8 as a detection deblocker 6d, the melting temperature Tm of which is identical to or preferably higher than the melting temperature of a possible neighboring hybrid 11 between the target sequence 4 and the catcher 10. In this way it is ensured that a secondary structure which is more advantageous for detection - for example an extension - of the target sequence 4 is actually present even at temperatures which are only slightly above or above the melting temperature T m of the detectable hybrids 11.
Durch Hinzufügen ausgewählter Blocker-Moleküle 6 lässt sich auch das Gleichgewicht (II) auf die Seite der vereinzelten Nukleinsäuren 3, die keine Sekundärstruktur 5 aufweisen, verschieben, was, wenn die Sekundärstruktur 5 für die Ausbildung detektierbarer Hybride 11 ungünstig ist, eine Erhöhung der Sensitivität eines erfindungsgemässen Verfahrens bewirkt.By adding selected blocker molecules 6, the equilibrium (II) can also be shifted to the side of the isolated nucleic acids 3, which have no secondary structure 5, which, if the secondary structure 5 is unfavorable for the formation of detectable hybrids 11, increases the sensitivity of a method according to the invention.
Die Einstellung eines solchen Gleichgewichtes wird durch das Vorsehen von ausgewählten Blockermolekülen 6 wesentlich beschleunigt, da diese eine Rehybridisierung von Nukleinsaure-Einzelstrangen im Bereich der Zielsequenz verhindern und ggf. eine für einen Nachweis räumlich vorteilhafte Sekundärstruktur induzieren. In Fällen, in denen eine Sekundärstruktur 5 eine Zielsequenz 4 für einen Nachweis mittels Fänger-Zielsequenz-Hybriden 11 unbrauchbar macht, haben die Blocker-Moleküle 6 darüber hinaus die Wirkung, die Sensitivität eines Nachweises erheblich zu erhöhen oder sogar erstmals einen Nachweis mittels Fänger-Zielsequenz-Hybriden zu ermöglichen.The establishment of such an equilibrium is significantly accelerated by the provision of selected blocker molecules 6, since these prevent re-hybridization of single nucleic acid strands in the region of the target sequence and possibly induce a secondary structure that is spatially advantageous for detection. In cases where a secondary structure 5 renders a target sequence 4 unusable for detection using catcher-target sequence hybrids 11, the blocker molecules 6 also have the effect of significantly increasing the sensitivity of a detection or even to enable detection for the first time using catcher-target sequence hybrids.
Wenn man einem Gleichgewichtssystem, das die Gleichgewichte (I), (II), (l)-(ll), (II)- (III), oder (l)-(lll) umfasst, einen molaren Uberschuss, vorzugsweise einen 10-100- fachen molaren Uberschuss an Blocker-Molekülen 6 hinzufügt, verschiebt sich dieses Gleichgewichtssystem hin zu höheren Konzentrationen an Hybridmolekülen 7 und/oder 8, und bei einem z.B. mehr als 100-fachen molaren Uberschuss an Blocker- Molekülen 6 liegen nach Einstellung eines Gleichgewichts überwiegend oder fast ausschließlich Hybridmoleküle 7 und/oder 8 vor, und damit eine besonders hohe Konzentration an Molekülen die eine Zielsequenz 4 enthalten und die mit einem jeweiligen Fänger-Molekül 10 Fänger-Zielsequenz-Hybride 11 gemäss Gleichgewichtsreaktion (IV) ausbilden können.If a balance system comprising the equilibria (I), (II), (I) - (II), (II) - (III), or (I) - (III), a molar excess, preferably a 10- Adds 100-fold molar excess of blocker molecules 6, this equilibrium system shifts to higher concentrations of hybrid molecules 7 and / or 8, and in one example After an equilibrium, more than 100-fold molar excess of blocker molecules 6 are predominantly or almost exclusively hybrid molecules 7 and / or 8, and thus a particularly high concentration of molecules which contain a target sequence 4 and which have a respective capture molecule 10 Catcher target sequence hybrids 11 according to the equilibrium reaction (IV).
Durch eine hohe Spezifität der Fänger-Moleküle 10 und den Grad der Einzigartigkeit der Zielsequenzen 4 kann die Spezifität von Fänger-Zielsequenz-Hybriden 11 für den Nachweis bestimmter Nukleinsäuren in einem Reaktionsgemisch besonders gut gewährleistet werden.Due to the high specificity of the capture molecules 10 and the degree of uniqueness of the target sequences 4, the specificity of capture-target sequence hybrids 11 can be ensured particularly well for the detection of certain nucleic acids in a reaction mixture.
Blocker-Moleküle 6, die nicht komplementär zu Fänger-Molekülen 10 sind, können im wesentlichen keine Bindungen mit Fänger-Molekülen 10 eingehen, und die Bindungsstellen der Fänger-Moleküle 10 bleiben im wesentlichen frei für die Bildung von Fänger-Zielsequenz-Hybriden 11.Blocker molecules 6, which are not complementary to capture molecules 10, are essentially unable to bind to capture molecules 10, and the binding sites of the capture molecules 10 remain essentially free for the formation of capture target sequence hybrids 11.
Blocker-Moleküle 6, die nicht komplementär zu Zielsequenzen 4 sind, können im wesentlichen keine Bindungen mit der Zielsequenz 4 auf einem detektierbaren Zielstrang 3 eingehen und sind nicht identisch mit Fänger-Molekülen, und die Bindungsstellen der Zielsequenzen 4 bleiben im wesentlichen frei für die Bildung von Fänger- Zielsequenz-Hybriden 11.Blocker molecules 6 that are not complementary to target sequences 4 are essentially unable to bind to target sequence 4 on a detectable target strand 3 and are not identical to capture molecules, and the binding sites of target sequences 4 remain essentially free for formation catcher target sequence hybrids 11.
Im wesentlichen keine Bindungen ausbilden oder eingehen bedeutet im Rahmen der Erfindung, dass von einer Komplementarität zwischen den jeweiligen Sequenzen derart stark abgewichen wird, dass kein stabiles Hybrid möglich ist. Andererseits be- deutet komplementär nicht, dass eine perfekte Komplementarität vorliegen muss, so dass eine Komplementarität zwischen Sequenzen weitgehend nicht gegeben ist, dass aber dennoch eine teilweise Komplementarität vorliegen kann.In the context of the invention, essentially forming or entering into no bonds means that the complementarity between the respective sequences is deviated to such an extent that a stable hybrid is not possible. On the other hand, does not complementarily indicate that there must be perfect complementarity, so that there is largely no complementarity between sequences, but that there can still be partial complementarity.
Blocker-Moleküle 6, die mit detektierbaren Strängen 3 Hybridmoleküle 8 ausbilden, in denen die darin eingegangenen Blocker-Moleküle die Zielsequenz 4 in eine räumliche Ausrichtung zwingen, die eine Reaktion mit Fänger-Molekülen 10 erleichtern, sind besonders vorteilhaft im Rahmen der Erfindung.Blocker molecules 6, which form hybrid molecules 8 with detectable strands 3, in which the blocker molecules entered therein force the target sequence 4 into a spatial orientation, which facilitate a reaction with catcher molecules 10, are particularly advantageous within the scope of the invention.
Durch einzelne oder mehrere der oben genannten Maßnahmen kann das Gleichgewichtssystem im Sinne der Erfindung positiv beeinflusst werden.The balance system in the sense of the invention can be positively influenced by one or more of the above-mentioned measures.
Die jeweiligen Blocker-Moleküle 6 können vor oder nach einer PCR-Reaktion einem Reaktionsgemisch hinzugefügt werden. Wenn Blocker-Moleküle 6 vor Durchführung einer PCR-Reaktion einem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, sind die Blocker- Moleküle derart modifiziert, dass sie an der Reaktion nicht teilnehmen, zum Beispiel in dem als 3'-endige Base ein Didesoxynukleotid-Molekül vorgesehen ist, damit der Blocker nicht als Primer wirkt, und am 5'-Ende eine entsprechende Modifikation vorgesehen ist, die ein eventuelles Strang-Displacement verhindert.The respective blocker molecules 6 can be added to a reaction mixture before or after a PCR reaction. If blocker molecules 6 are added to a reaction mixture before carrying out a PCR reaction, the blocker molecules are modified such that they do not take part in the reaction, for example in which a dideoxynucleotide molecule is provided as the 3'-end base, so that the blocker does not act as a primer, and a corresponding modification is provided at the 5 'end, which prevents a possible strand displacement.
Weil in erfindungsgemässen Verfahren insgesamt weniger Probenmaterial ausreicht, um Nukleinsäuren nachzuweisen, werden bei vorgeschalteten PCR-Reaktionen weniger Zyklen benötigt, wodurch das zur Verfügung stehende, zu analysierende Material weniger fehlerbehaftet ist. Dies stellt eine Verbesserung der Spezifität, bzw. eine Verringerung der Fehleranfälligkeit solcher Nachweisreaktionen dar.Because less sample material is sufficient to detect nucleic acids in the method according to the invention, fewer cycles are required in the case of upstream PCR reactions, as a result of which the available material to be analyzed is less prone to errors. This represents an improvement in the specificity or a reduction in the susceptibility to error of such detection reactions.
Darüber hinaus kann ein Waschen, wie es bei herkömmlichen Verfahren in der Regel unumgänglich ist, entfallen, wodurch Online-Messungen ermöglicht werden.In addition, washing, which is usually unavoidable with conventional methods, can be dispensed with, which enables online measurements.
Die gebildeten Fänger-Zielsequenz-Hybride 11 werden dann mittels allgemein üblicher Detektionsmethoden, z.B. spektroskopischer Methoden wie der Fluoreszenzspektroskopie, oder anderer Methoden wie der Radiometrie oder der Elektrophorese nachgewiesen. Zu Detektionszwecken können die Nukleinsäurestränge 2 und/oder 3 mit Markierungen versehen sein, die der jeweiligen Detektionsmethode dienlich ist. Dies kann durch Einbau entsprechend markierter Nukleotidbausteine während einer PCR-Amplifikation von Nukleinsaure-Einzelstrangen geschehen, oder durch Verwendung entsprechend markierter Primer und nicht markierter Primer im Rahmen einer PCR-Amplifikation der Nukleinsäure-Einzelstränge. An fester Phase ausgebildete Hybride lassen sich ferner grundsätzlich auch durch elektronische Impedanzmessungen nachweisen. Dem Fachmann steht hier eine Vielzahl von Verfahren und ggf. notwendigen Markierungen zur Verfügung.The capture target sequence hybrids 11 formed are then detected by means of generally customary detection methods, for example spectroscopic methods such as fluorescence spectroscopy, or other methods such as radiometry or electrophoresis. Nucleic acid strands 2 and / or 3 can be used for detection purposes be provided with markings that are useful for the respective detection method. This can be done by incorporating appropriately labeled nucleotide building blocks during a PCR amplification of single nucleic acid strands, or by using appropriately labeled primers and unlabeled primers as part of a PCR amplification of the single nucleic acid strands. Hybrids formed on a solid phase can also be fundamentally detected by means of electronic impedance measurements. A large number of methods and any necessary markings are available to the person skilled in the art.
Zum besseren Verständnis der Erfindung wird diese im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiel näher erläutert.For a better understanding of the invention, it is explained in more detail below using an exemplary embodiment.
AusführunqsbeispielWorking Example
Im folgenden Ausführungsbeispiel wird Bezug auf das Sequenzprotokoll genommen, das Teil der Beschreibung ist, und in dem ein Abschnitt des Plasmids pGEM3-Zf, (Seq.-Nr. 1), zwei Primer (Seq.-Nr. 2 und 3), zwei Blocker-Moleküle (Seq.-Nr. 4 und 5) und eine Fänger-Molekülsequenz (Seq.-Nr. 6) angegeben sind.In the following embodiment, reference is made to the sequence listing, which is part of the description, and in which a section of the plasmid pGEM3-Zf, (Seq.No. 1), two primers (Seq.No. 2 and 3), two Blocker molecules (SEQ No. 4 and 5) and a scavenger molecule sequence (SEQ No. 6) are specified.
Das Sequenzprotokoll enthält folgenden freien Text nach WIPO-Standard Nr. 25: <210> 1The sequence listing contains the following free text according to WIPO Standard No. 25: <210> 1
<223> primer binding site on complementary Strand - binding to unmodified primer (Bindungsstelle für Primer am komplementären Strang - bindet an den nicht modifizierten Primer)<223> primer binding site on complementary Strand - binding to unmodified primer (binding site for primers on the complementary strand - binds to the unmodified primer)
<223> primer binding site - binding to modified primer <223> complement to target sequence (Komplement zur Zielsequenz)<223> primer binding site - binding to modified primer <223> complement to target sequence
<223> blocker binding site on both detectable and 2nd Strand (Bindungsstelle für Blocker-Molekül sowohl am detektierbaren als auch am 2. Strang) <210> 2<223> blocker binding site on both detectable and 2nd strand (binding site for blocker molecule both on the detectable and on the 2nd strand) <210> 2
<223> primer sequence/unmodified (Sequenz des nicht modifizierten Primers) <210> 3 <223> primer sequence/modified (Sequenz des modifizierten Primers)<223> primer sequence / unmodified (sequence of the unmodified primer) <210> 3 <223> primer sequence / modified (Sequence of modified primer)
<210> 4<210> 4
<223> blocker-molecule sequence<223> blocker-molecule sequence
<210> 3<210> 3
(Blocker-Molekül-Sequenz)(Blocker molecule sequence)
<210> 5<210> 5
<223> blocker-molecule sequence<223> blocker-molecule sequence
(Blocker-Molekül-Sequenz)(Blocker molecule sequence)
<210> 6<210> 6
<223> catching sequence<223> catching sequence
(Fänger-Molekül-Sequenz)(Capture molecule sequence)
Um einen Abschnitt aus der DNA des Plasmids pGEM3_Zf nachzuweisen, dessen einer Strang die Sequenz mit der Sequenzidentitätsnummer (Seq.-Nr.) 1 des Sequenzprotokolls hat, wird entsprechendes Nukleinsäurematenal aus dem Plasmid mit einem nicht modifizierten und einem modifizierten Primer umgesetzt.In order to detect a section from the DNA of the plasmid pGEM3_Zf, one strand of which has the sequence with the sequence identity number (Seq.No.) 1 of the sequence listing, the corresponding nucleic acid material from the plasmid is converted with an unmodified and a modified primer.
Der Primer mit der Seq.-Nr. 2 ist ein nicht modifizierter Primer. Er bindet an zu der ersten in Seq.-Nr.1 (2901 ... 2921) gekennzeichneten Primerbindungsstelle komplementäre Stellen.The primer with Seq.No. 2 is an unmodified primer. It binds to sites that are complementary to the first primer binding site identified in SEQ. No.1 (2901 ... 2921).
Der Primer mit der Seq.-Nr. 3 ist ein modifizierter Primer. Er bindet an zu der zweiten in Seq.-Nr.1 (3109 ... 3131) gekennzeichneten Primerbindungsstelle identische Stellen. Der modifizierte Primer ist mit einer Cy-3-Markierung versehen.The primer with Seq.No. 3 is a modified primer. It binds to sites identical to the second primer binding site identified in SEQ. No. 1 (3109 ... 3131). The modified primer is labeled with a Cy-3 label.
Es wird eine PCR-Reaktion durchgeführt, aus der ein markiertes und ein nicht markiertes Amplifikationsprodukt resultieren. Das markierte Amplifikationsprodukt weist eine Zielsequenz (3068 ... 3087)auf, die komplementär zu der im Sequenzprotokoll bezeichneten Stelle der Seq.-Nr. 1 ist. Beide Amplifikationsprodukte weisen Blocker- Molekül-Bindungsstellen auf, die identisch mit oder komplementär zu der im Sequenzprotokoll bezeichneten Stelle der Seq.-Nr. 1 (3037 ... 3066)sind. Die Amplifikationsprodukte werden in folgenden Konzentrationen mit Blocker- Molekülen mit den Sequenzen Seq.-Nr. 4 und Seq.-Nr. 5 versetzt, die aus synthetischen Oligonukleotiden bestehen:A PCR reaction is carried out, resulting in a labeled and an unlabeled amplification product. The labeled amplification product has a target sequence (3068 ... 3087) that is complementary to the position of Seq.-Nr. 1 is. Both amplification products have blocker-molecule binding sites which are identical to or complementary to the site of Seq. 1 (3037 ... 3066). The amplification products are in the following concentrations with blocker molecules with the sequences Seq.-Nr. 4 and Seq.No. 5 offset, which consist of synthetic oligonucleotides:
Beispiel Nr.Example No.
1 250 ng PCR-Produkt/keine Blocker-Moleküle1 250 ng PCR product / no blocker molecules
2 250 ng PCR-Produkt/500 ng Blocker-Moleküle2 250 ng PCR product / 500 ng blocker molecules
3 500 ng PCR-Produkt keine Blocker-Moleküle3 500 ng PCR product no blocker molecules
4 500 ng PCR-Produkt/500 ng Blocker-Moleküle4,500 ng PCR product / 500 ng blocker molecules
5 500 ng PCR-Produkt/1000 ng Blocker-Moleküle5 500 ng PCR product / 1000 ng blocker molecules
Die Reaktionsgemische 1-5 werden auf DNA-Arrays aufgetragen, wie sie in Figur 2a- e dargestellt sind. Die DNA-Arrays enthalten in Spalten und Reihen angeordnete Spots. Die Spalten sind von links nach rechts von 1-3 und die Reihen von oben nach unten von 1-3 nummeriert. Auf die jeweiligen Spots wird unter der Angabe Kolonne/Reihe Bezug genommen. Der Spot in 3/1 jedes Arrays ist ein Kontrollspot, der bei entsprechender Anregung durch Licht immer fluoresziert. Er enthält fluoreszierendes Oligonukleotidmaterial, das bereits bei der Herstellung des jeweiligen Arrays aufgespottet wird. Die Spots 2/3 und 3/3 jedes Arrays enthalten Fänger-Moleküle in einer Menge, die größenordnungsmäßig der Menge an Material entspricht, wie sie in den Kontrollspots aufgetragen ist.The reaction mixtures 1-5 are applied to DNA arrays as shown in Figure 2a-e. The DNA arrays contain spots arranged in columns and rows. The columns are numbered 1-3 from left to right and the rows are numbered 1-3 from top to bottom. The respective spots are referred to under the column / row specification. The spot in 3/1 of each array is a control spot that always fluoresces when stimulated by light. It contains fluorescent oligonucleotide material that is spotted during the manufacture of the respective array. Spots 2/3 and 3/3 of each array contain capture molecules in an amount that is on the order of the amount of material as shown in the control spots.
Die Fänger-Moleküle umfassen eine Fänger-Sequenz mit der Seq.-Nr.6, die Hybride mit im Sequenzprotokoll unter der Seq.-Nr.1 als „complement to target sequence" komplementären Sequenzen ausbilden kann. Diese Sequenzen sind Zielsequenzen, die im markierten PCR-Produkt enthalten sind. Die Entstehung von Hybriden zwischen Fänger-Molekülen und Zielsequenzen lässt sich daher durch Fluoreszenzmessung nachweisen. Die Grössenordnung der Intensitätswerte der jeweiligen Fluoreszenz in einem Spot lässt eine Aussage über die relative Quantität der gebildeten Hybride zu.The catcher molecules comprise a catcher sequence with SEQ. No. 6, which can form hybrids with sequences complementary in the sequence listing under SEQ. No. 1 as "complement to target sequence". These sequences are target sequences which are described in the The formation of hybrids between capture molecules and target sequences can therefore be demonstrated by fluorescence measurement. The magnitude of the intensity values of the respective fluorescence in a spot allows a statement to be made about the relative quantity of the hybrids formed.
Die Fluoreszenzintensitäten in den relevanten Spots betragen folgende Werte: Beispiel 1 (Fiα.2a) Beispiel 2 (Fiα.2b)The fluorescence intensities in the relevant spots are as follows: Example 1 (Fiα.2a) Example 2 (Fiα.2b)
Spot 1/3 63311 Spot 1/3 32917Spot 1/3 63311 Spot 1/3 32917
Spot 2/3 1169 Spot 2/3 17993Spot 2/3 1169 Spot 2/3 17993
Spot 3/3 1561 Spot 3/3 19917Spot 3/3 1561 Spot 3/3 19917
Beispiel 3 (Fiα.2c) Beispiel 4 (Fig. 2d) Beispiel 5 (Fiq.2e)Example 3 (Fiα.2c) Example 4 (Fig. 2d) Example 5 (Fiq.2e)
Spot 1/3 56297 Spot 1/3 52115 Spot 1/3 32937Spot 1/3 56297 Spot 1/3 52115 Spot 1/3 32937
Spot 2/3 16865 Spot 2/3 14356 Spot 2/3 48151Spot 2/3 16865 Spot 2/3 14356 Spot 2/3 48151
Spot 3/3 19161 Spot 3/3 14672 Spot 3/3 46875Spot 3/3 19161 Spot 3/3 14672 Spot 3/3 46875
Die angegebenen Helligkeitswerte sind relative Größen, wie sie von der Messelektronik ausgegeben werden. Je größer der Wert ist, desto höher ist die jeweilige Intensität.The specified brightness values are relative values as they are output by the measuring electronics. The larger the value, the higher the intensity.
Wie anhand der Figuren und der dazugehörenden Messwerte ersichtlich ist, sind die Spots 2/3 und 3/3 in den Beispielen 2 und 5 relativ zu den Beispielen 1 , 3 und 4 am hellsten. In den Beispielen 1 und 3 wurden keine Blocker-Moleküle eingesetzt, in Beispiel 4 wurde eine im Vergleich zu Beispiel 5 geringe Menge Blocker-Moleküle, jeweils bezogen auf eine bestimmte Menge PCR-Produkt, eingesetzt. Man erkennt deutlich, dass die Intensitäten und damit die Mengen an nachweisbaren Hybriden in den Beispielen 2 und 5 am höchsten sind. Dies sind die Beispiele, in denen das erfindungsgemässe Verfahren angewandt wurde, und zwar bei einer jeweils vorgegebenen Menge PCR-Produkt. As can be seen from the figures and the associated measured values, spots 2/3 and 3/3 in examples 2 and 5 are the brightest relative to examples 1, 3 and 4. No blocker molecules were used in Examples 1 and 3; in Example 4, a small amount of blocker molecules compared to Example 5 was used, in each case based on a certain amount of PCR product. It can clearly be seen that the intensities and thus the amounts of detectable hybrids are highest in Examples 2 and 5. These are the examples in which the method according to the invention was used, specifically for a given amount of PCR product.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in einem aus einer PCR-Reaktion resultierenden Reaktionsgemisch, bei dem die Reassoziation von Nukleinsäuren gehemmt wird, wobei: a) dem Reaktionsgemisch Blocker-Moleküle (6) hinzugefügt werden, b) doppelstrangiges Nukleinsäurematenal (1) zu zwei Typen von komplementären Nukleinsaure-Einzelstrangen denaturiert wird, c) die Blocker-Moleküle (6) mit zumindest einem Abschnitt von zumindest einem der beiden Typen von aus der Denaturierung resultierenden Nukleinsaure- Einzelstrangen hybridisieren, d) das Reaktionsgemisch mit Fänger-Molekülen (10) in Verbindung gebracht wird, e) die Fänger-Moleküle (10) jeweils mit einem Abschnitt (4) einer zu delektierenden Nukleinsäure (3) zu Fänger-Zielsequenz-Hybriden (11) reagieren, und f) gebildete Fänger-Zielsequenz-Hybride (11) durch Detektion nachgewiesen werden.1. A method for the detection of nucleic acids in a reaction mixture resulting from a PCR reaction, in which the reassociation of nucleic acids is inhibited, whereby: a) blocker molecules (6) are added to the reaction mixture, b) double-stranded nucleic acid material (1) to two Types of complementary single nucleic acid strands are denatured, c) the blocker molecules (6) hybridize with at least a portion of at least one of the two types of single stranded nucleic acid resulting from the denaturation, d) the reaction mixture with capture molecules (10) in Is connected, e) the catcher molecules (10) each react with a section (4) of a nucleic acid to be detected (3) to catcher-target sequence hybrids (11), and f) formed catcher-target sequence hybrids (11) can be detected by detection.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass viele unterschiedliche Nukleinsäuren zugleich nachgewiesen werden.2. The method according to claim 1, characterized in that many different nucleic acids are detected at the same time.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fänger-Moleküle (10) an einer festen Phase (9) gebunden sind.3. The method according to any one of claims 1-2, characterized in that the capture molecules (10) are bound to a solid phase (9).
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Phase (9) und die darauf befindlichen Fänger-Moleküle (10) einen DNA-Array ausbilden. 4. The method according to claim 3, characterized in that the solid phase (9) and the catcher molecules (10) located thereon form a DNA array.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Fänger-Moleküle (10) in Lösung befinden.5. The method according to any one of claims 1-2, characterized in that the capture molecules (10) are in solution.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fänger-Moleküle (10) an magnetic beads gebunden sind.6. The method according to claim 5, characterized in that the catcher molecules (10) are bound to magnetic beads.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die Blocker-Moleküle (6) im molaren Uberschuss zu den Nukleinsäureeinzelsträngen eingesetzt werden.7. The method according to any one of claims 1-6, characterized in that the blocker molecules (6) are used in molar excess to the single nucleic acid strands.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Uberschuss an Blocker-Molekülen (6) so gross ist, dass im wesentlichen keine Nukleinsäure-Doppelstränge (1) in dem Reaktionsgemisch mehr vorliegen.8. The method according to claim 7, characterized in that the excess of blocker molecules (6) is so large that essentially no nucleic acid double strands (1) are present in the reaction mixture.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Bildung von Hybriden (8) aus Blocker- Molekülen (6) und detektierbaren Nukleinsaure-Einzelstrangen (3) in Konkurrenz zu einer Bildung von Sekundärstrukturen (5) der Nukleinsäure-Einzelstränge (3) steht.9. The method according to claim 7, characterized in that the formation of hybrids (8) from blocker molecules (6) and detectable nucleic acid single strands (3) in competition with the formation of secondary structures (5) of the single nucleic acid strands (3) stands.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass darin lediglich gleiche Blocker-Moleküle eingesetzt werden.10. The method according to any one of claims 1-9, characterized in that only the same blocker molecules are used therein.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass darin mehrere unterschiedliche Blocker-Moleküle eingesetzt werden.11. The method according to any one of claims 1-9, characterized in that several different blocker molecules are used therein.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Blocker-Moleküle (6) Blocker-Moleküle (6e) umfassen, die Hybride (7) mit zu eliminierenden Nukleinsaure-Einzelstrangen (2) ausbilden.12. The method according to any one of claims 1-11, characterized in that the blocker molecules (6) blocker molecules (6e) comprise, which form hybrids (7) with nucleic acid single strands (2) to be eliminated.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass die Blocker-Moleküle (6) Blocker-Moleküle (6d) umfassen, die Hybride (8) mit detektierbaren Nukleinsaure-Einzelstrangen (3) ausbilden.13. The method according to any one of claims 1-12, characterized in that the blocker molecules (6) comprise blocker molecules (6d) which form hybrids (8) with detectable nucleic acid single strands (3).
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Durchführung des Verfahrens verwendete Reaktionsgemisch aus einer PCR-Reaktion resultiert.14. The method according to any one of claims 1-13, characterized in that the reaction mixture used to carry out the method results from a PCR reaction.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgemisch nach Durchführung von Schritt b) einer PCR-Reaktion unterworfen wird, in der das doppelsträngige Nukleinsäurematenal (1) amplifiziert wird.15. The method according to any one of claims 1-14, characterized in that the reaction mixture after performing step b) is subjected to a PCR reaction in which the double-stranded nucleic acid material (1) is amplified.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, dass die Blocker-Moleküle (6) aus Nukleinsäurematenal ausgebildet sind.16. The method according to any one of claims 1-15, characterized in that the blocker molecules (6) are formed from nucleic acid material.
17. Verfahren nach Anspruch 1-16, dadurch gekennzeichnet, dass die Blocker-Moleküle (6) aus synthethischen Oli- gonukleotiden ausgebildet sind.17. The method according to claim 1-16, characterized in that the blocker molecules (6) are formed from synthetic oligonucleotides.
18. Verfahren nach Anspruch 1-17, dadurch gekennzeichnet, dass die Blocker-Moleküle (6) aus DNA, cDNA, RNA, tRNA, mRNA, LNA, aRNA oder PNA ausgebildet sind.18. The method according to claim 1-17, characterized in that the blocker molecules (6) from DNA, cDNA, RNA, tRNA, mRNA, LNA, aRNA or PNA are formed.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, dadurch gekennzeichnet, dass die Blocker-Moleküle (6) aus Aminosäuren aufgebaut sind. 19. The method according to any one of claims 1-18, characterized in that the blocker molecules (6) are made up of amino acids.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Blocker-Moleküle (6) auch Nukleinsäuren aufweisen.20. The method according to claim 19, characterized in that the blocker molecules (6) also have nucleic acids.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-20, dadurch gekennzeichnet, dass in die Nukleinsäure-Einzelstränge (2, 3) Markierungsmittel eingebaut sind.21. The method according to any one of claims 1-20, characterized in that in the nucleic acid single strands (2, 3) are incorporated marker.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-21 , dadurch gekennzeichnet, dass in die Nukleinsäure-Einzelstränge (3), die Fänger-Zielsequenz-Hybride (11) ausbilden, Markierungsmittel eingebaut sind.22. The method according to any one of claims 1-21, characterized in that in the nucleic acid single strands (3) that form catcher-target sequence hybrids (11), marker are built.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Markierungsmitteln um fluoreszierende Mittel, magnetische Mittel, radioaktive Mittel, und/oder mittels Massen- spektrometrischer Methoden nachweisbare Mittel handelt.23. The method according to any one of claims 19 or 22, characterized in that the marking agents are fluorescent agents, magnetic agents, radioactive agents, and / or agents detectable by means of mass spectrometric methods.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungsmittel mittels eines entsprechenden Verfahrens nachgewiesen werden.24. The method according to any one of claims 19 or 22, characterized in that the marking means are detected by means of a corresponding method.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mittels Fluoreszenzmikroskopie, Magnetometrie, Messung oder Detektion von Radioaktivität, oder mittels Massen- spektrometrie erfolgt.25. The method according to any one of claims 19 or 22, characterized in that the detection is carried out by means of fluorescence microscopy, magnetometry, measurement or detection of radioactivity, or by means of mass spectrometry.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-23, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mittels elektrischer Messung erfolgt.26. The method according to any one of claims 1-23, characterized in that the detection is carried out by means of electrical measurement.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Blocker-Moleküle (6) im wesentlichen keine Bindungen mit Fänger-Molekülen (10) eingehen können.27. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the blocker molecules (6) essentially none Bonds with scavenger molecules (10) can enter.
28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Blocker-Moleküle (6) im wesentlichen keine Bindungen mit Abschnitten (4) auf einem Nukleinsäure-Einzelstrang eingehen können, die mit Fänger-Molekülen (10) reagieren können. 28. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the blocker molecules (6) can enter into essentially no bonds with sections (4) on a single nucleic acid strand which can react with capture molecules (10).
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