WO2004011655A1 - 致死遺伝子を用いた形質転換体選択用マーカー - Google Patents

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Haruhiko Masaki
Sumiko Kunihiro
Hiroko Hagiwara
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers

Definitions

  • the present invention relates to a DNA fragment useful as a marker for selecting a transformant, a vector into which the DNA fragment is inserted, and a marker for selecting a transformant comprising the DNA fragment.
  • a transformant is selected by detecting a change in the color of the colony based on the change in the structure of the chromogenic substance (Sanbrook et al. (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual-, 2nd ed, 1 85-1.86).
  • a lethal gene such as the toposomela zeocolysin E1 gene is used as a gene promoter (Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-139,955).
  • the expression of the lethal gene is suppressed by inserting the foreign gene into the translation region of the lethal gene, and only the clones carrying the foreign gene are selectively grown.
  • selection by color development using the galactosidase gene or the like requires not only the addition of a coloring substance such as X-gal to the medium, but also the growth of transformants that do not retain the inserted fragment. Separating many transformants required a large area of agar medium.
  • the transformant that does not retain the inserted fragment will die, so the area of the culture medium for isolating the transformant can be reduced, or selection using a liquid medium is possible. It is.
  • the lethality of the lethal gene is too high, (1) mutations are frequently inserted into the lethal gene during cultivation, and the lethality cannot be stably maintained. In order to control the toxicity of the lethal gene, it was necessary to use a host into which an inactivated gene or mutation had been introduced.
  • the lethality of the lethal gene is low, a promoter with high expression activity is required in order to exert lethality by overexpression.
  • complete cleavage using an excessive amount of restriction enzyme is important in order to improve the probability of the presence of the inserted fragment of a clone of the library.
  • complete cleavage with an excessive amount of restriction enzyme can reduce the number of independent clones constituting the library and reduce the number of terminal bases due to the mixture of other nuclease activities such as exonuclease activity mixed with the restriction enzyme. The loss results in false positives for the insertion marker for fragments such as lacZ. Therefore, in order to ensure the maximum number of independent clones constituting the library, it is often not possible to perform excessive restriction enzyme digestion.
  • the library can be constructed without reducing the probability of introducing the cloned inserted fragment.
  • the number of independent clones is large and high-quality libraries can be produced. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to use a lethal gene as a gene marker to achieve complete killing of a transformant that does not have a foreign gene and to stably amplify a vector containing the foreign gene in a host.
  • the aim is to provide markers for the selection of transformants, especially
  • An object of the present invention is to provide a simple means for appropriately controlling the activity of a lethal gene in accordance with the degree of resistance of E. coli, and to solve the above-mentioned problems of the prior art.
  • the present inventors can solve the above-mentioned problems by inserting one or more translation termination codons 5 ′ upstream of the lethal gene and using them as transformant selection markers. This has led to the completion of the present invention.
  • the present invention relates to the following (1) to (12).
  • a DNA fragment comprising a translation termination codon inserted upstream of the active site of a lethal gene at 5,
  • the active site is one encoding a colicin-derived polypeptide
  • a transformant selection marker comprising the DNA fragment according to any one of (1) to (8) above.
  • a lethal gene constituting a DNA fragment used as a marker for selection of a transformant for example, when the host is Escherichia coli, El, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8 of colicin , E9, la, lb, D, B, A, M, N, K, crocin DF13, clevisin Al, A2, A3, pyocin AP41, SI, S2, S3, S4, barnase, pemK, etc. it can.
  • the above-mentioned or the above-mentioned homolog is used for the same purpose also when the host is enterobacteria other than Escherichia coli, such as enterobacter, and Pseudomonas aeruginosa and Bacillus.
  • the neutralization genes corresponding to immunity E3 include the inhibitory genes corresponding to the lethal genes (each immunity gene for colicin, cloacin, clevicin, and pyocin, the barstar gene for barnase, and the barstar gene for peinK). Alternatively, the peml gene can be used.
  • chelate toxin For yeast, a gene encoding chelate toxin can be used, and for gram-positive bacteria such as lactic acid bacteria, small peptides of about 50 amino acids and phage-like bacteriocin can be used. A neutralizing gene for chelate toxin has not been identified, but its inactivating gene can be used for lactic acid bacteria bacteriocin.
  • the scope of the species to which the present invention can be applied is not limited to the above, but is applicable to all species in which a lethal gene can be used, such as microorganisms, fungi, plants, and animals other than the above. Can be done.
  • a gene obtained by artificially extracting only the active site of these lethal genes and reducing the gene size is used, and one or more translation termination codons (TAGs) are located at the upstream of the active site. , TGA, TAA) to obtain a DNA fragment for use as a marker for transformant selection.
  • TGA translation termination codons
  • the lethal activity of the above lethal gene is controlled by the number of translation stop codons inserted.
  • the number of translation stop codons is adjusted in accordance with the sublesser intensity to determine the most suitable marker for each host. Can be prepared. For example, when using a very lethal gene as a lethal gene, increase the number of translation stop codons to be inserted and increase the sublesser strength of the host to be transformed. Increase the number of stop codons. Conversely, even if the lethal activity of the lethal gene is high, the number of inserted translation stop codons should be reduced when using a host with low sublesser strength.
  • the number of translation termination codons to be inserted is determined from both the lethal activity of the inserted lethal gene and the strength of the suppressor activity of the host.
  • a neutralizing gene for the lethal gene may be further added in addition to the translation termination codon.
  • the retained DNA fragment may be prepared and used as a marker for transformant selection.
  • E. coli susceptible to the toxicity of the lethal gene can also be used as a host.
  • the means using this neutralizing gene is also effective when using a vector having a high expression of a lethal gene.
  • the insertion of the translation stop codon in the present invention gives particularly advantageous results when a gene having a high lethal activity such as colicin is used. That is, as described above, when such a lethal gene having a high lethal activity is used, the lethal gene is mutated at a high frequency during the culture, and the host becomes resistant to the host. And the selection efficiency of the target transformant by the selection marker decreases.
  • mutation of a lethal gene is suppressed and foreign genes are retained by inserting a translation termination codon and controlling the number of insertions. It is possible to artificially moderately suppress the lethal activity of the lethal gene so that a transformant that does not undergo the killing is completely killed.
  • the active site of the lethal gene which has a high lethal activity, is originally used, it is located downstream of a strong promoter to enhance the expression of the lethal gene, or fused with other peptides. It is not necessary to carry out the procedure, and it is possible to prepare the optimal DNA for the transformant for each host by simple means.
  • Colicin E3 is an antibacterial polypeptide produced by Escherichia coli, is a kind of bacteriocin, and its gene is on plasmid.
  • the full length gene of the plasmid (plamid ColE3-CA38) is shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing.
  • the base sequence at the position of 331 to 1986 is the structural gene portion of colicin E3, and the structural gene portion of the neutralizing gene (immunity gene) E3 is It is in the base sequence at positions 196 to 2253, and the structural gene portion of the neutralizing gene E8 is at position 2420 to 2677.
  • the amino acid sequence corresponding to the colicin E3 gene is shown in SEQ ID NO: 1 ⁇ .
  • the active site of colicin E3 is the alanine at position 442 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 (corresponding to the GCT at positions 1546-1656 in SEQ ID NO: 16) or the lysine at position 455 of SEQ ID NO: 16. (Corresponding to the 16th AAA to 1695th AAA) to the 55th 1st leucine (corresponding to 1968;! To 3rd CTT)
  • SEQ ID NOS: 18 and 19 show the amino acid sequences of the colicin active site starting from the above alanine and lysine, respectively.
  • nucleic acid having a nucleotide sequence encoding these amino acid sequences can be used.
  • nucleotide sequence one or more nucleic acids are deleted, substituted, or added. Can be used as long as it has a lethal activity on the host.
  • the translation stop codon (TAG; amber stop codon) is located 5 'of the above active site. It is provided upstream, and a restriction enzyme cleavage site is provided upstream of this stop codon and downstream of the last and third stop codon of the active site. If necessary, a neutralizing gene (immunity gene) is added downstream of the 3'-terminal restriction enzyme cleavage site.
  • the nucleotide sequence of the neutralizing gene for colicin E3 is shown in SEQ ID NO: 15. In this nucleotide sequence, even if one or more of the nucleic acids is deleted, substituted or added, it is used. Any substance having a neutralizing activity against the lethal gene can be used.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment used as a marker for transformant selection thus constructed is shown in SEQ ID NO: 20.
  • the translation termination codon (5, upstream of the above active site) TGA) are provided.
  • the sequences of the protruding ends of the Sfil restriction enzyme cleavage sites at the two sites are different.
  • the DNA fragment is introduced into E. coli or the like for the purpose of shortening the lethal gene to be used and adding a translation termination codon.
  • the neutralizing gene for the lethal gene it is necessary to allow the neutralizing gene for the lethal gene to be expressed in the Escherichia coli.
  • the neutralizing gene was coexistent with the vector used for introducing the lethal gene so that the neutralizing gene can be expressed, or the neutralizing gene was previously constructed so that the neutralizing gene could be expressed in the Escherichia coli. Brass med, etc. should be introduced.
  • a DNA fragment retaining the lethal gene is cut out with a restriction enzyme, and the DNA fragment is separated using an appropriate means such as electrophoresis. to recover.
  • This DNA fragment is finally ligated to the corresponding restriction enzyme site of a vector used for library production and the like, and transformed into Escherichia coli used for amplification.
  • Escherichia coli used for amplification may have a weaker sub-reducer mutation than Escherichia coli used finally as a host, such as for construction of a library, or It is necessary to have a gene that neutralizes the lethal gene in advance.
  • Escherichia coli used for amplification may be the same as Escherichia coli finally used as a host. In such a case, the expression intensity of the lethal gene on the vector is adjusted to an appropriate inducer (induction condition) or It is necessary to be able to control at the transfer level, etc., by controlling substances (suppression conditions).
  • the expression of the lethal gene is suppressed by the above-described method, or when the lethal gene is finally used for final purposes such as construction of a library, The method induces its expression.
  • the lethal gene into which a suitable number of stop codons have been introduced can be stably amplified by any of the methods described above, and is used for final purposes such as library construction. In this case, the host can be effectively lethal.
  • a vector using the DNA fragment of the present invention as a selection marker it is necessary to (1) similarly to a normal galactosidase fragment or the like, between the translation initiation codon of the DNA fragment and the active site or Introduce a unique restriction enzyme cleavage site into the active site, ligate it to the vector, and inactivate the selectable marker by introducing a foreign gene fragment into this insertion site; or (2) There is a method in which a DNA fragment of the present invention is inserted in advance into a cloning site where two different protruding ends have been cut by cutting at two locations, and an exogenous inserted fragment is replaced with this portion. Either of these methods can be used in the present invention.
  • the method (1) achieves a restriction enzyme cleavage site at one site, but is often mixed with the restriction enzyme.
  • deletion of one or more nucleotides may occur due to exonuclease activity.In this case, even if a foreign gene fragment is not inserted into the cloning site, the amino acid residue required for the frame shift translation activity is not required. In some cases, the deletion inactivates the marker gene, a lethal gene, resulting in false positives, making effective selection impossible.
  • the method (2) requires two restriction enzyme cleavage sites, but the method of (2) is more preferable because the problem of false positive due to the frame shift of translation does not occur.
  • the vector to be used may be any of plasmid, phage, cosmid, etc., and is not particularly limited.
  • the vector when the vector is constructed by introducing the above two restriction enzyme cleavage sites, continuity of translation from the upstream of the cleavage site is not required, and the lethal gene active site is contained in the DNA fragment of the present invention. Since both translation start and stop codons can be set, no translation initiation codon is required upstream of the cloning site. Therefore, when no translation initiation codon is provided upstream of the closing site. The expression of the cloned input fragment can be extremely low. Therefore, easy cloning can be realized even for foreign genes that are highly toxic to host cells.
  • a foreign gene may be expressed by providing a translation initiation codon at the cloning site.
  • the transformant having the vector into which the foreign gene is not inserted is killed, so that only the foreign gene is expressed. be able to.
  • all of the lethal gene sites according to the present invention are removed, so that biofunctional interference between the introduced gene and the selectable marker is eliminated.
  • the size of the vector after the gene transfer can be reduced, the efficiency of transformation and amplification in host cells is high.
  • the disadvantage of introducing two restriction enzyme cleavage sites is that if the amount of the inserted fragment is too large, the efficiency will be reduced. However, if the amount of the inserted fragment is reduced to prevent this, the number of clones holding the reconnected vector without inserting the foreign gene fragment will increase. In order to reduce the number of rebound clones, it is necessary to dephosphorylate by alkaline phosphatase treatment and to recover vector DNA fragments from the gel by electrophoresis.This can reduce the proportion of rebound clones. However, the number of independent clones that make up the library is generally greatly reduced.
  • the vector was constructed such that the protruding ends of the two restriction enzyme cleavage sites of the vector were different from each other, and the lethal gene was located in a fragment sandwiched between these restriction enzyme cleavage sites.
  • the reconnection clone generated when the foreign gene fragment is inserted into the vector does not contain the foreign gene fragment and contains the active site of the lethal gene.
  • the expression results in the death of the rejoined clone, which can be specifically removed.
  • this makes it possible to reduce the amount of the foreign gene inserted fragment and efficiently improve the probability of the presence of the clone into which the foreign gene has been inserted. There is no need to use an excessive amount of restriction enzyme to make it work.
  • a transformant having the inserted fragment When selecting a transformant having the inserted fragment, it is usually carried out by growing the transformant on an agar medium to form a colony. This is because it is necessary to determine the presence of the inserted fragment based on the presence or absence of coloration of the colony on an agar medium containing an appropriate drug. However, if a lethal gene is used, a transformant that does not retain the inserted fragment cannot grow.Therefore, it is not necessary to form a colony on a solid such as agar medium. Therefore, the selection may be made based on whether or not to grow. Therefore, even if it is impossible to form a colony on a solid such as an agar medium, for example, when selecting from 100,000 or more transformants, it is efficient to select only those that retain the imported fragment. It can be concentrated and sorted.
  • the introduction of a foreign DNA fragment into a host cell is intended to clarify the base sequence of the introduced MA fragment ⁇ the biological function of the DNA fragment.
  • the DNA fragment may be disrupted by chemical factors such as resistance to antibiotics, physical factors such as growth above normal culture temperatures, or any other configurable factors.
  • the biological effects of introducing the pieces need to be determined.
  • a DNA fragment having the desired biological function is selected by using the growth ability of the organism in the factor of interest as an index.In many cases, the above-mentioned DNA fragment is selected on a solid medium such as an agar medium. By setting factors, discrimination is made by forming a colony, and the DNA fragment retained by the colony is analyzed.
  • the above colonies should have at least as many colonies as expected, usually at least 10 to 100 times the number of colonies. Need to be analyzed by a method such as DNA sequence.
  • the genomic science analysis technology has advanced, it is possible to analyze a large number of DNA fragments at once.
  • the types of DNA fragments held by the colony differ by thousands or more. It can be analyzed using a DNA microarray having a base sequence. In this case, according to the conventional method, the following two methods are used for preparing the analysis sample.
  • a transformant is prepared in the form of a plasmid or the like containing an inserted DNA fragment, and after appropriate labeling such as fluorescent labeling, analysis is performed with the DNA microarray.
  • appropriate labeling such as fluorescent labeling
  • a large amount of DNA derived from a vector such as a plasmid that is unnecessary for analysis contains a large amount of unnecessary labeled DNA fragments. This causes a rise in knock ground, which leads to a reduction in signal-to-noise ratio.
  • large amounts of DNA must be separated and purified to ensure sufficient sensitivity.
  • PCR can be used to improve the problems of the first method.
  • a set of PCR primers sandwiching the inserted fragment is designed based on the base sequence derived from the vector near the inserted fragment, and all the inserted fragments are designated as ⁇ type DNA extracted from the colony population. Perform PCR all at once.
  • the DNA fragment, which is the PCR product is labeled with fluorescence or the like, and analyzed with a DNA microarray.
  • this method it is possible to minimize the amount of the MA portion derived from the enzyme to be mixed into the amplification product and to minimize the portion required for the PCR primers, and to minimize the amount of the MA. Noise ratio can be realized.
  • a vector that does not carry the insert fragment is also amplified as type III, but the amplified fragment is In general, the length of the DNA fragment is shorter than the amplified fragment derived from the vector carrying the DNA fragment by a fraction or less. In PCR amplification, short DNA fragments are amplified with higher efficiency than long DNA fragments.Therefore, the presence of vectors that do not retain the inserted fragment results in a large amount of short DNA fragments that cannot be analyzed. Causes contamination.
  • the substrate required for amplification by PCR is consumed for the amplification of useless short MA fragments that do not have an input fragment, which significantly hinders the amplification of the input fragment required for analysis.
  • both the signal-to-noise ratio and the detection sensitivity are impaired.
  • the selection marker is lethal, it can be selectively concentrated not only on a solid medium such as an agar medium, but also in a liquid culture state. Therefore, it is generally impossible to select a transformant on a solid medium.For example, it is possible to select a number of transformants of 100,000 or more. This makes it possible to perform comprehensive analysis on a large number of genes that were not possible before, such as screening from, and screening of cDNA derived from genes with low expression frequency.
  • Escherichia coli colicin E3 plasmid PSH350
  • PSH350 Escherichia coli colicin E3 plasmid
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 to obtain a DNA fragment containing the CRD region (ref.) Of colicin E3 as SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • DNA fragments containing the immunity (ref.) Of colicin E3 were each amplified by PCR.
  • PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: DNA fragment was obtained. The structure of this DNA fragment is shown below.
  • this DNA fragment was subjected to TA cloning using pGEM T easy vector (Promega), and a sequence pGEM-97col + imm having an inserted fragment having a correct nucleotide sequence was obtained by sequence analysis.
  • the colicin E3 immunity gene was used to stably maintain the CRD region of colicin E3 on plasmid.
  • PCI3A5 (Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Tsukuba, Ibaraki, Japan, 1-1, 1-Chuo No. 6), deposited as FE Thigh BP-8441 on July 24, 1995) Five types of plasmids were obtained. These have DNA fragments into which 1, 2, 3, 4, and 5 termination codons (TAG) have been inserted, respectively.
  • TAG termination codons
  • pBS2SKP-SfiI was constructed. After digesting this plasmid with Sfil, the plasmid was ligated with the colicin E3 CRD gene fragment having one to three amber termination codons and transformed into Escherichia coli XU-Blue by the electroporation method. The obtained E. coli suspension was spread on an agar medium containing 100 mg / 1 ampicillin and 0.1% glucose, and cultured overnight at 37. As a result, only when three amber stop codons were introduced, the agar medium A transformant was obtained above. The plasmid pBS-Sfi-a3col was recovered from the obtained transformant, transformed into XL-Blue, and the E. coli suspension was added to an agar medium containing 100 mg / 1 ampicillin + 0. And 100 mg / 1 ampicillin + 200 .M IPTG
  • the MA fragment obtained by Sfil cleavage shown in SEQ ID NO: 14 can function as a lethal marker for highly efficient cloning of a foreign DNA fragment, and plasmid containing this fragment
  • the vector was shown to be usable for cloning foreign DNA fragments.
  • Number of clones with or without inserted fragment The numbers in the table indicate the number of clones that retained the inserted fragment among the clones of the analyzed transformants, and the numbers in parentheses indicate the number of clones that had the inserted fragment. The number of clones that did not exist is shown.
  • the transformant selection marker of the present invention can be freely constructed and selected according to the degree of lethal activity of the lethal gene to be used and the strength of the sublesser mutation possessed by the host to be used. And the selection of the most efficient selectable marker can be prevented, and it is possible to prevent a decrease in selectivity based on increasing host resistance due to too strong lethal activity of the lethal gene, and to include the selectable marker.
  • the vector can be stably amplified in the host.
  • the present invention provides an extremely useful means for cloning a foreign inserted gene.

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Abstract

　致死遺伝子の活性部位の５'上流側に、翻訳終止コドン挿入したＤＮＡ断片を得、これを形質転換体選択用マーカーとし、また、該マーカーが挿入されたベクター。この致死遺伝子を遺伝子マーカーとするものであって、外来遺伝子を保持しない形質転換体の完全な死滅を達成するとともに、宿主において外来遺伝子を含むベクターの安定な増幅が図れる形質転換体の選択用マーカーが得られる。また、DNAマイクロアレイなどの遺伝子解析をさらに正確、効率化しうるベクターが得られる。

Description

明細書 致死遺伝子を用いた形質転換体選択用マーカー 技術分野
本発明は、 形質転換体の選択用マ一カーとして有用な D N A断片、 該 D N A断片を挿入したベクター、及び該 D N A断片からなる形質転換体選択用マ —カーに関する。 背景技術
従来、 外来遺伝子をべクタ一に挿入し、 これにより宿主を形質転換させて 所定の形質転換体を得るに際し、 目的とする形質転換体のみを選択するため、 種々の遺伝子マーカーを使用している。例えば、 ?ガラク トシダーゼ遺伝子 をマーカ一とする場合には、該遺伝子と外来遺伝子とを接合してベクターに 挿入し、 これにより宿主を形質転換する。外来遺伝子を保持した形質転換体 は、 5ガラクトシダ一ゼ遺伝子が発現するのに対し、 これ以外のものは ;6"ガ ラク トシダーゼ遺伝子が発現しないので、；5ガラクトシダーゼ遺伝子の発現 を、培地に添加した発色物質の構造変化に基づくコロニーの色の変化として 検出することにより、 所定の形質転換体を選択するものである （Sanbrook et al . ( 1989 ) Molecular Cloning ― A Laboratory Manual -, 2nd ed, 1. 85 - 1.86 )。
また、 トポィソメラ一ゼゃコリシン E1遺伝子など、 致死遺伝子を遺伝子マ 一力一として利用する方法も知られている（特開昭 5 7— 1 3 9 0 9 5号公 報）。 この方法は、 致死遺伝子の翻訳領域に外来遺伝子が挿入されることに よって、 該遺伝子の発現が抑制され、 外来遺伝子を保持するクローンのみを 選択的に生育させるものである。 しかし、 ?ガラクトシダ一ゼ遺伝子などを 用いた発色による選択では、 培地に X- galなどの発色物質を添加する必要が あるばかりでなく、 挿入断片を保持しない形質転換体も生育することから、 多くの形質転換体を分離するためには広い寒天培地の面積を必要とした。一 方、 致死遺伝子を用いた場合には、 挿入断片を保持しない形質転換体は死滅 することから、 形質転換体を分離するための培地面積を減少したり、 液体培 地を用いた選択も可能である。 しかし、 致死遺伝子の致死性が高すぎる場合 には、 （ 1 )培養中に高い頻度で致死遺伝子に変異が挿入され、 致死性が安定 して保持できないこと、 ( 2 )ベクターを増幅するためには、 致死遺伝子の毒 性を調節するために、不活化遺伝子あるいは変異を導入した宿主を用いるな どの必要があった。 また、 致死遺伝子の致死性が低い場合には、 過剰発現に よって致死性を発揮させるために、発現活性の高いプロモー夕一が必要であ つ 7こ。
さらに、プラスミ ドベクターあるいはファージベクターなどでライブラリ —を構築する場合、ライブラリ一のクローンの揷入断片の存在確率を向上さ せるために、 過剰量の制限酵素を用いた完全な切断が重要である。 一方、 過 剰量の制限酵素による完全な切断は、制限酵素に混入するェクソヌクレア一 ゼ活性などの他のヌクレアーゼ活性の混在により、ライブラリ一を構成する 独立したクローン数の減少や、末端塩基の欠失によって lacZなどの断片の揷 入マーカ一の擬陽性を引起こす。従って、 ライブラリ一を構成する独立した クローンについて最大数を確保するためには、制限酵素による切断を過剰に 行えない場合が多い。 この様な場合には、 揷入断片を保持しないクローンを 確実に死滅させることが最も効果的であり、 これが達成されれば、 クローン の挿入断片の揷入確率を下げることなく、ライブラリーを構成する独立した クローンの数が大きく高品質なライブラリーを作製することが可能になる。 発明の開示
本発明の課題は、 致死遺伝子を遺伝子マーカーとするものであって、 外来 遺伝子を保持しない形質転換体の完全な死滅を達成するとともに、 宿主にお いて外来遺伝子を含むベクターの安定な増幅が図れる形質転換体の選択用 マ一カーを提供しょうとするものであり、 特に、 致死遺伝子に対する各宿主 の耐性の程度に応じて、 致死遺伝子の活性を適宜制御するための簡便な手段 を提供し、 上記従来技術の問題点を解消しょうとするものである。
本発明者等は、 鋭意研究の結果、 致死遺伝子の 5'上流側に翻訳終止コ ドン を 1または複数個挿入して、形質転換体の選択用マーカーとすることにより、 上記課題を解決しうることを見いだし本発明を完成させるに至ったもので ある。
すなわち本発明は以下の （ 1 ) 〜 （ 12 ) に関する。
( 1) 致死遺伝子の活性部位の 5，上流に、 翻訳終止コ ドンが挿入されてい ることを特徴とする DN A断片。
(2)両端側に制限酵素切断部位を有することを特徴とする上記 （ 1) に記 載の DNA断片。
(3)翻訳終止コ ドンが 1個または 2個以上挿入されていることを特徴とす る上記 （ 1) 〜 （3) のいずれかに記載の DN A断片。
(4)活性部位がコリシン由来のポリぺプチドをコ一ドするものである上記
( I) 〜 （3) のいずれかに記載の D NA断片。
( 5 )上記活性部位が配列番号 18または 1 9に示されるァミノ酸配列をコ —ドする塩基配列を有するものである （ 1) 〜 （4) のいずれかに記載の D NA断片。
(6) 配列番号 14で示される塩基配列を有する DN A断片。
(7) 致死遺伝子の活性部位の 3，下流側に、 中和遺伝子を接合したもので ある上記 （ 1 ) 〜 （6) のいずれかに記載の DNA断片。
(8) 中和遺伝子の塩基配列が配列番号 15に示されるものである （7) に 記載の DNA断片。
(9) 上記 （ 1) 〜 （8) のいずれかに記載の DN A断片からなることを特 徴とする形質転換体選択用マーカー。
( 10)形質転換体が大腸菌を形質転換させたものである上記（9) に記載 の形質転換体選択用マーカー。
( I I) 上記 （ 1 ) 〜 （8) のいずれかに記載の DN A断片が挿入された組 み換えベクター。
( 1 2 )致死遺伝子に対する発現プロモーターを含まないことを特徴とする 上記 （ 1 1 ) に記載の組み換えべクタ一。 発明を実施するための最良の形態
本発明において、形質転換体の選択用マーカーとして使用する D N A断片 を構成する致死遺伝子としては、 例えば宿主が大腸菌の場合には、 コリシン の El， E2, E3， E4, E5 , E6, E7, E8, E9， la, lb, D, B, A， M, N, K, クロ ァシン DF13、 クレビシンの Al， A2, A3、 ピオシンの AP41, SI, S2, S3, S4、 barnase、 pemK, 等が利用できる。 また、 宿主がェンテロパクターなどの大 腸菌以外の腸内細菌群、 緑膿菌、 バチルス族などについても、 上記あるいは 上記のホモログが同様の目的で利用される。ィミュニティ一 E3に対応する中 和遺伝子としては、 各致死遺伝子に対応するインヒビ夕一 （コリシン、 クロ ァシン、 クレビシン、 ピオシンに対しては各ィミュニティ一遺伝子、 barnase に対しては barstar遺伝子、 peinKに対しては peml遺伝子） を用いることがで きる。酵母に対しては、 キラートキシンをコードする遺伝子を、 乳酸菌など のグラム陽性バクテリアに対しては、 50アミノ酸程度の小型のぺプチドおよ びファージ様のバクテリオシンを用いることができる。キラートキシンに対 する中和遺伝子は特定されていないが、乳酸菌のバクテリオシンに対しては、 その不活化遺伝子を利用することができる。本発明が適用可能な生物種の範 囲についそは、 上記に限られるものではなく、 上記以外の微生物、 菌類、 植 物、 動物など、 致死性遺伝子を利用可能なあらゆる生物種に適用することが できる。
本発明においては、これら致死遺伝子の活性部位だけを人工的に取り出し て遺伝子サイズを短縮化したものを用い、 この活性部位の 5，上流側に 1個な いし複数個の翻訳終止コ ドン （T A G、 T G A， T A A ) を挿入して、 形質 転換体選択用マーカ一とするための D N A断片を得る。
上記致死遺伝子の致死性活性は、 揷入する翻訳終止コ ドンの数により、 調 節する。 さらに、 宿主の有する終止コ ドンに対するサブレッサー強度は様々 ではあるが、 このサブレッサー強度に応じて、 翻訳終止コ ドンの数を調節す ることにより、各々の宿主に対し最も好適なマーカ一を調製することができ る。例えば、 致死遺伝子として極めて強い致死性を有するものを使用する場 合においては、 挿入する翻訳終止コ ドンの数を多くし、 また、 形質転換しょ うとする宿主のサブレッサー強度も高ければ、さらに翻訳終止コ ドンの数を 増加させる。反対に致死遺伝子の致死活性が高くても、 サブレッサー強度が 低い宿主を用いる場合においては、揷入する翻訳終止コ ドンの数を少なくす る。 すなわち本発明においては、 揷入する致死遺伝子の致死活性と宿主のサ プレッサー活性強度の両面から揷入する翻訳終止コ ドンの数を決定する。 また、 本発明においては、 例えば、 コリシン等の極めて高い致死活性を有 する致死遺伝子の活性部位を用いる場合においては、翻訳終止コ ドンに加え て、 さらに致死遺伝子に対する中和遺伝子 （イミュニティー遺伝子） を保持 させた D N A断片を調製して形質転換体選択用マ一カーとしてもよい。この ような致死活性の低減化手段によりに、致死遺伝子の毒性に対して敏感な大 腸菌も宿主として用いることが可能となる。さらにこの中和遺伝子を用いる 手段は、 致死遺伝子の発現が高いベクターを用いる場合にも有効である。 ま た、 致死活性の低減化手段としては、 選択マーカとして揷入する D N A断片 に対する発現プロモー夕を用いないという手法も有効であり、この場合には、 翻訳の読み枠などのべク夕一 D N Aとの機能的な関連を考慮する必要がな く、 極めて自由度が高いベクタ一の設計が可能となる。
本件発明における翻訳終止コ ドンの挿入は、コリシン等の致死活性の高い 遺伝子を用いる場合に特に有利な結果を与える。すなわち、上記したように、 このような高い致死活性を有する致死遺伝子を用いると、培養中に致死遺伝 子に高い頻度で変異が生じ、 宿主の耐性化が生じ、 外来遺伝子を保持してい ない宿主も生育し、選択マーカ一による目的とする形質転換体の選択効率は 低下する。 しかし、 本発明の場合、 翻訳終止コドンの揷入及びその挿入する 数の調節により、 致死遺伝子の変異を抑制するとともに、 外来遺伝子を保持 しない形質転換体は完全な死滅させるように、致死遺伝子の致死活性を人為 的に適度に抑制することが可能となる。 また、 さらに、 もともと致死活性の 高い致死遺伝子の活性部位を用いているため、致死遺伝子の発現を増強させ るために強力なプロモー夕一の下流に位置させたり、他のぺプチドとの融合 化を行う必要もなく、 簡便な手段で各宿主毎に最適な、 形質転換体の選択マ 一力一 DNAを調製できる。
本発明の選択用マーカーに使用する DNA断片について、コリシン E 3遺 伝子を使用する場合を例に取り、さらに具体的に説明する。コリシン E 3は、 大腸菌が産生する抗菌性のポリペプチドであって、バクテリオシンの一種で あ り、 その遺伝子はプラス ミ ド上にある。 該プラス ミ ド （ plamid ColE3- CA38)の全長遺伝子を配列表の配列番号 1 6に示す。 該遺伝子中、 3 3 1〜 1 9 8 6 (終止コ ドンを含む）番目の塩基配列がコリシン E 3の構造 遺伝子部分であり、 中和遺伝子 （ィミュニティ一遺伝子） E 3の構造遺伝子 部分は、 1 9 9 6〜2 2 53番目の塩基配列にあり、 また、 中和遺伝子 E 8 の構造遺伝子部分は 24 2 0〜 2 6 7 7番目にある。
このコリシン E 3遺伝子に対応するアミノ酸配列を同配列番号 1 Ίに示 す。 コリシン E 3の活性部位は、 配列番号 1 7で示されるアミノ酸配列の 4 42番目のァラニン（配列番号 1 6の 1 6 54〜 1 6 5 6番目の GCTに対 応） ないしは同 455番目のリジン （同 1 6 9 3〜1 6 9 5番目 A A Aに対 応） から、 同 5 5 1番目のロイシン （同 1 9 8 ；!〜 3番目の CT Tに対応） に至る部分であり、 本発明においては、 このアミノ酸配列部分をコ一ドする DN Aをマーカ遺伝子として使用する。配列番号 1 8及び 1 9にそれぞれ上 記ァラニン、 リジンから始まるコリシン活性部位のアミノ酸配列を示す。本 発明においては、これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するもの であれば使用でき、 また、 該塩基配列においては、 核酸の一個または複数個 が欠失、 置換または付加されたものであっても、 宿主に対して致死性活性を 有するものであれば使用できる。
翻訳終止コ ドン （TAG ； アンバー終止コ ドン） は、 上記活性部位の 5 ' 上流に設け、 さらに、 この終止コ ドンの上流及び活性部位の 3，末の終止コ ドンの下流側に制限酵素切断部位を設ける。 また、 必要があれば、 中和遺伝 子 （イミュニティー遺伝子） を、 3 '末側の制限酵素切断部位の下流側に付 加する。このコリシン E 3に対する中和遺伝子の塩基配列を配列番号 1 5に 示すが、 該塩基配列においては、 核酸の一個または複数個が欠失、 置換また は付加されたものであっても、使用する致死遺伝子に対して中和活性を有す るものであればいずれのものでも使用できる。 このように構成された、 形質 転換体選択用マ一カーとして使用する D N A断片の塩基配列を配列番号 2 0に示すが、 該配列においては、 上記活性部位の 5，上流に翻訳終止コ ドン ( T G A ) を 3個設けており。 また、 2力所の Sfi l制限酵素切断部位の突出 末端の配列が異なるようにしている。
以上は、 コリシン E 3遺伝子を使用する例について説明したが、 本発明の 終止コ ドンを付加する手段は、 その原理から見て、 上記の例に限定されず広 い普遍性を有するものであることは容易に理解されよう。
本発明において、選択マーカーとして使用する D N A断片を調製するには、 使用する致死性遺伝子の短縮化および翻訳終止コ ドンを付加するなどの目 的で、 該致死性遺伝子を大腸菌などに導入する際には、 一般的に該大腸菌内 で該致死性遺伝子の中和遺伝子が発現できるようにしておく必要がある。こ のために、 該致死性遺伝子を導入するために用いるベクターに、 該中和遺伝 子が発現できるように共存させるか、 あるいは、 該大腸菌に、 あらかじめ中 和遺伝子が発現できるように構築されたブラスミ ドなどを導入しておく。好 適と思われる数の終止コ ドンが導入された致死遺伝子を構築した後、該致死 遺伝子を保持する D N A断片を制限酵素で切り出し、電気泳動などの適当な 手段を用いて該 D N A断片を分離回収する。 この D N A断片を、 最終的にラ イブラリーの作製などに用いるベクタ一の対応する制限酵素部位にリガ一 ゼなどで連結させ、 増幅に用いる大腸菌に形質転換する。
なお、 増幅に用いる大腸菌としては、 ライブラリ一の構築などの最終的に 宿主として用いる大腸菌よりも弱いサブレヅサー変異を有するか、あるいは、 該致死遺伝子を中和する遺伝子をあらかじめ保持している必要がある。また、 増幅に用いる大腸菌は、最終的に宿主として用いる大腸菌と同じものであつ ても良いが、 その場合には、 ベクター上の該致死遺伝子の発現強度が、 適当 な誘導物質 （誘導条件） あるいは抑制物質 （抑制条件） などにより、 転写レ ベルなどで制御ができる必要がある。 この場合、 ベクターを増幅するときに は、 該致死性遺伝子は、 上記の方法によってその発現が抑制されているか、 あるいは、最終的にライブラリ一の構築などの最終的な目的に用いる時には、 上記の方法によってその発現が誘導される。好適な数の終止コ ドンが導入さ れた該致死性遺伝子は、 上記の上記のいずれかの方法によって、 安定に増幅 することが可能であり、ライブラリーの構築などの最終的な目的に用いる際 には、 効果的に宿主を致死に至らしめることができる。
本発明の D N A断片を選択マ一カーとして使用してベクターを構築する には、 （1 )通常の.ガラクトシダーゼの.フラグメントなどと同様に、 該 D N A断片の翻訳開始コ ドンと活性部位の間あるいは活性部位の中に唯一の制 限酵素切断部位を導入してベクターに結合し、外来遺伝子断片をこの揷入部 位に導入することによって該選択マーカーを不活化させるか、 あるいは（2 ) ベクタ一を 2ケ所で切断し、 2つの異なる突出末端を生じさせたクローニング 部位に本発明の D N A断片をあらかじめ揷入しておき、外来揷入断片をこの 部分に置換える形で揷入する方法がある。本発明においてはこれらのいずれ の方法も使用できるが、 この 2種の方法のうち、 （1 )の方法は、 制限酵素の 切断部位が 1ケ所で実現されるが、 往々にして制限酵素に混入するェクソヌ クレアーゼ活性などによって 1塩基以上の欠失が生じることがあり、 この場 合、 クローニング部位に外来遺伝子断片が挿入されなくても、翻訳のフレー ムシフ トゃ活性に必要なァミノ酸残基の欠失によってマーカー遺伝子であ る致死性遺伝子が不活化されることによつて擬陽性が生じ、有効な選択が不 可能になる場合がある。 一方、 （2 )の方法では、 2ケ所の制限酵素切断部位が 必要であるが、 翻訳のフレームシフ トによる擬陽性の問題が生じないので、 ( 2 ) の方法の方が望ましい。 使用するべク夕一としては、 プラスミ ド、 ファージ、 コスミ ド等いずれの ものであってもよく特に制限されない。
また、 上記 2ケ所の制限酵素切断部位の導入によってべクタ一を構築する 場合においては、 切断部位上流からの翻訳の継続性を必要とせず、 本発明に おける D N A断片内に致死性遺伝子活性部位の翻訳の開始および終止コ ド ンの両方を設定することができるから、クローニング部位の上流に翻訳開始 コ ドンを必要としない。 したがって、 クロ一ニング部位の上流に翻訳開始コ ドンを設けない場合にあっては。クローニングされた揷入断片の発現を極め て低いレベルに抑えることも可能となる。 したがって、 宿主細胞に毒性が 強い外来遺伝子であっても、容易なクローニングが実現可能となる。しかし、 クローニング部位に翻訳開始コドンを設けて、外来遺伝子を発現させてもも ちろんよく、 この場合には、 外来遺伝子を挿入しないベクターを有する形質 転換体は死滅するから外来遺伝子のみを発現させることができる。 さらに、 所望する D N A断片がベクターに挿入されクローンとして取得された場合 には、 本発明による致死性遺伝子部位は全て除去されることから、 該導入遺 伝子と選択マーカーとの生物機能的な干渉がなく、ベクターを設計する際の 自由度が高い。 また、 該遺伝子導入後のベクターの大きさを縮小できること から、 形質転換や宿主細胞内での増幅の効率が高い。
一方、 2ケ所の制限酵素切断部位の導入によるデメリッ トは、 揷入断片の 量を入れすぎると効率が落ちることである。 しかし、 これを防ぐために揷入 断片量を減少させると、外来遺伝子断片が挿入されずに繋ぎ戻ったベクター を保持するクローンが増えてくる。繋ぎ戻りクローンの数を減少させるため には、 アルカリフォスファタ ゼ処理による脱リン酸化や、 ベクター DNA断 片を電気泳動によりゲルから回収する必要があるが、これにより繋ぎ戻りク ローンの比率は減らせても、一般的にライブラリーを構成する独立したクロ ーンの数が大幅に減少する。 一方、 本発明においては、 ベクターの 2ケ所の 制限酵素切断部位の突出末端が各々異なり、さらにこれら制限酵素切断部位 に挟まれた断片中に致死遺伝子が位置するようにベクターを構成したこと により、外来遺伝子断片を該ベクタ一に挿入する際に生じる繋ぎ戻りクロ一 ンは、 外来遺伝子断片を含まず、 かつ致死性遺伝子の活性部位を含むことに なるから、この致死遺伝子の活性部位の発現によって繋ぎ戻りクローンは死 減し、 これを特異的に除くことができる。 また、 このため、 外来遺伝子の揷 入断片量を少なく して効率的に外来遺伝子が挿入されたクローンの存在確 率を向上させることが可能となり、従来のように該クローンの存在確率を向 上させるために制限酵素を過剰量使う必要もない。
挿入断片を有する形質転換体を選択する場合には、 通常は、形質転換体を 寒天培地上に生育させコロニーを形成させることによって実施する。なぜな らば、 揷入断片の存在を、 適当な薬剤を含む寒天培地上でのコロニーの発色 の有無などで判定する必要があるからである。 しかし、 致死性の遺伝子を用 いれば、 挿入断片を保持しない形質転換体は生育できないことから、 寒天培 地などの固体上にコロニ一を形成させる必要はなく、単に液体培地で培養す ることにより、 生育するか否に基づいて選択すれば良い。従って、 寒天培地 などの固体上でにコロニーを形成させることが不可能な、例えば 10万個以上 の数の形質転換体から選択する場合であっても、揷入断片を保持するものの みを効率的に濃縮 ·選別することができる。
外来の DNA断片の宿主細胞への導入は、導入された MA断片の塩基配列ゃ該 DNA断片の有する生物学な機能を明らかにすることを目的としているが、 後 者については、 単に DNA断片を導入するだけではなく、 抗生物質に対する抵 抗性などの化学的要因、通常の培養温度よりも高い温度で生育できるなどの 物理的要因、 あるいはその他の何らかの設定可能な要因に対して、 該 DNA断 片を導入したことによる生物的な効果が判別される必要がある。この場合に は、 着目する要因における生物の増殖能力を指標として、 目的とする生物的 機能を有する DNA断片を選別することになるが、 多くの場合、 寒天培地など の固体培地上において、 上記の要因を設定することにより、 コロニーを形成 させることによって判別し、 該コロニーが保持する DNA断片の解析を行う。
しかし、該コロニ一を形成させ得る MA断片の種類が多数存在し、例えば、 数十から数百種類の異なる DNA断片の獲得が期待される場合には、 前記のコ ロニ一について、 期待される種類の数以上、 通常はその数の 10倍から 100倍 以上の数のコロニーについて、 DNAシークェンスなどの方法で解析する必要 がある。 一方、 ゲノム科学的な解析技術が進んだ近年では、 多数の DNA断片 を一括して解析することが可能であり、例えば、前記コロニーが保持する DNA 断片について、 その種類を数千種以上の異なる塩基配列を有する DNAマイク ロアレイを用いて解析することができる。 この場合、 解析試料の調製方法に ついては、 従来法によれば、 以下の 2種類の方法が利用される。
第一の方法は、 形質転換体よりプラスミ ドなどの形で挿入 DNA断片を含ん だ状態で調製し、 蛍光標識などの適当な標識を施した後に、 該 DNAマイクロ アレイで解析する。 この場合には、 DNAマイクロアレイのハイブリダィゼー シヨンに必要な揷入断片以外に、解析に不必要なプラスミ ドなどのベクター に由来する DNAを多量に含むため、不必要な標識 DNA断片が多量に混在するこ とにより、 ノ ックグラウンドの上昇を引起こし、 シグナル ' ノイズ比の減少 につながる。 また、 十分な感度を確保するために、 多量の DNAの分離精製が 必要となる。
第二の方法は、 第一の方法の問題点を改善するために、 PCRを用いること ができる。 この場合、 挿入断片近傍のベクタ一由来の塩基配列に基づいて、 揷入断片を挟む 1組の PCRプライマ一を設計し、前記コロニーの集団より抽出 した DNAを錶型として、 全ての挿入断片を一括して PCRを行う。 PCR反応と平 行して、あるいは PCR反応後に、 PCR産物である DNA断片を蛍光などで標識し、 DNAマイクロアレイで解析する。 この方法によれば、 増幅産物に混入するべ ク夕一由来の MA部分は、 前記 PCRプライマーに必要な部分を最小として、極 めて少量に限定することが可能であることから、 高いシグナル ·ノィズ比を 実現することができる。 また、 この方法によれば、 PCIUこよる増幅が可能で あることから、 前記コロニーの集団からの DNAの調製は少量でよく、 簡便に 高い検出感度を実現することができる。 しかし、 前記 PCRでは、 挿入断片を 保持しないベクターも錶型として増幅されるが、 その増幅断片は、 挿入断片 を保持するベクターに由来する増幅断片に比較して、一般的に数分の一以下 の長さの短い DNA断片となる。 PCRによる増幅では、 短い DNA断片は、 長い DNA 断片に比較して高い効率で増幅されることから、挿入断片を保持しないべク 夕一の存在により、 解析の対象とならない短い DNA断片の大量の混入を引起 こす。 また、 PCRによる増幅に必要な基質が、 揷入断片を有しない無駄な短 い MA断片の増幅に消費されることにより、 解析に必要な揷入断片の増幅を 著しく妨げることになる。 この結果、 シグナル · ノイズ比、 および検出感度 のいずれも損なわれることになる。
本発明によるベクターを用いれば、揷入断片を有しない形質転換体をほぼ 完全に除去することができる。従って、 従来法による第二の方法における問 題点である、シグナル ·ノィズ比および検出感度の減少のいずれについても、 大幅に改善することができる。 また、 本発明では選択マーカーは致死性であ ることから、 寒天培地などの固体培地上だけではなく、 液体培養の状態でも 選択的に濃縮することが可能である。 従って、 形質転換体の選択について、 固体培地上では一般的に不可能である、例えば 10万個以上の数の形質転換体 を選択することも可能であり、ヒトのような大きなゲノムサイズの生物から のスクリーニングや、低い発現頻度の遺伝子に由来する c D N Aのスクリ一 ニングなど、これまで不可能であった多数の遺伝子についての網羅的な解析 の実施を実現することができる。
実施例 1
大腸菌コリシン E3プラスミ ド （PSH350 ) 、 （独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託セン夕一（日本国茨城県つくば巿 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) 宛、 平成 1 5年 7月 2 5日 FE腿 BP- 8436として寄託） より、 配列番号 1および配列番号 2で示されるプライマーを用いて、 コリシン E3の CRD領域 (ref . ) を含む DNA断片を、 配列番号 3および配列番号 4で示されるプライ マ一を用いて、 コリシン E3のイミュニティー （ref . ) を含む DNA断片を、 そ れそれ、 PCRによって増幅した。次に、両断片が融合した断片を鐯型として、 配列 5および配列 6で示されるプライマーを用いて PCRを行い、 配列マで示 される DNA断片を得た。 この D N A断片の構造を以下に示す。
Figure imgf000014_0001
次いで、 この D N A断片を pGEM T easy vector (プロメガ社）を用いて TA クロ一ニングを行い、シークェンス解析によって正しい塩基配列の揷入断片 を有するプラスミ ド pGEM-97col + immを得た。 なお、 コリシン E3イミュニティ 一遺伝子は、 コリシン E3の CRD領域をプラスミ ド上に安定に保持するために 用いた。
次に、 上記プラスミ ドを錡型として、 配列番号 8と配列番号 6で示される プライマ一で増幅した断片を、 さらに、 配列 9から配列 1 3の各々と配列 6 で示されるプライマ一を用いて PCRを行うことにより、コリシン E3の CRD領域 の上流直近に 1から 5個の amber終止コ ドン （T A G ) を有し、 下流に前記コ リシン E3ィ ミュニティ一遺伝子を有する DNA断片を得た。 このうち 3個の amber終止コドンを挿入した D N A断片 （配列番号 1 4 ) の構造を以下に示 す。 T JP2003/009543
Figure imgf000015_0001
この 1 5個の amber終止コ ドンを有する各 D N A断片を pGEM T easy vector (プロメガ社）を用いて TAクローニングを行い、 シークェンス解析に よって正しい塩基配列の挿入断片を有する PCI3A1 (独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託セン夕一（日本国茨城県つくば巿 1丁目 1番地 1 中 央第 6 ) 宛、 平成 1 5年 7月 2 4日 FERM BP- 8437として寄託） 、 pCI3A2
(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕ー（日本国茨城県つ くば巿 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) 宛、 平成 1 5年 7月 2 4日 FERM. BP-8438として寄託） 、 PCI3A3 (独立行政法人産業技術総合研究所特許生物 寄託センター （曰本国茨城県つくば巿 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) 宛、 平成
1 5年 7月 2 4日 FERM BP-8439として寄託） 、 pCI3A4 (独立行政法人産業 技術総合研究所特許生物寄託セン夕一（日本国茨城県つくば巿 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) 宛、 平成 1 5年 7月 2 4日 FEM BP- 8440として寄託） 、 T JP2003/009543
PCI3A5 (独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨 城県つくば巿 1丁目 1番地 1 中央第 6 )宛、 平成 1 5年 7月 2 4日 FE腿 BP- 8441として寄託） の 5種類のプラスミ ドを得た。 なお、 これらはそれぞれ 順に 1、 2、 3、 4、 5個の終止コ ドン （T A G ) を揷入した D N A断片を 有 ^る。
一方、 ベクタ一については、 配列 2 1と配列 2 2で示される 2本の合成一 本鎖オリゴヌクレオチドをァニールし、 生じた二本鎖 DNA断片を
pBluscriptll SK( + )の BamHIと EcoRIとの間に挿入して、 突出末端の配列が異 なる 2つの Sfi l切断部位 （下線で示した） を導入したプラスミ ド
pBS2SKP-SfiIを構築した。 このプラスミ ドを Sfi lで消化した後、 前記 1から 3 個の amber終止コ ドンを有するコリシン E3 CRD遺伝子断片とライゲ一シヨン し、 エレクロトポレーシヨン法によって大腸菌 XU- Blueに形質転換した。得 られた大腸菌懸濁液を 100 mg/1アンピシリンおよび 0.1%グルコースを含む 寒天培地に塗布し、 37. で一昼夜培養した結果、 amber終止コ ドンが 3個揷入 された場合にのみ、 寒天培地上に形質転換体が得られた。得られた形質転換 体からプラスミ ド pBS-Sfi- a3colを回収し、 XL卜 Blueに形質転換した後、 大 腸菌懸濁液を 100 mg/1アンピシリン + 0. グルコースを含む寒天培地、 およ び 100 mg/1アンピシリン + 200 . M IPTG
( isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside を含む寒天培地に塗布し、 37. で一昼夜培養したところ、 グルコースを含む培地で培養した場合のみ、 多数 のコロニーの形成が見られ、 IPTGを含む培地上には、 コロニーの形成が全く 見られなかった。
実施例 2
配列 2 3および 2 4で示された、 GAL4DBDおよび EN0APLの 2種類の二本鎖 DNA断片を作製し、実施例 1で作製したプラスミ ド pBS- Sfi- a3colを S Iで切 断した DNA断片と混合して DMリガーゼによって連結反応を行い、 大腸菌 XL卜 Blue株に形質転換した。得られた形質転換体のクローンを任意に選択し、 プラスミ ドを回収して挿入された DNA断片を解析したところ、 グルコース存 3 在下では揷入断片を保持していないクローンが 1 0〜 3 0 %存在していた のに対し、 IPTG存在下で生育させた場合には、 揷入断片を保持しないクロー ンは全く検出されなかった。ベクターに挿入されたコリシン E3の改変による 致死性遺伝子の発現は、その上流に位置する調節可能なプロモーターにより、 グルコース存在下では抑制され、 IPTG存在下では誘導される。 従って、 該致 死性遺伝子が発現できる状態にしておくことにより、揷入断片を有しないク ローンを完全に排除することができることが示された。 なお、 本発明による 終止コ ドンを揷入されていない場合には、本実施例による転写制御レベルで の調節は不可能であり、 グルコースを存在させても、 宿主である大腸菌に安 定して保持させることはできなかった。 この場合には、 ベクター DNAを増幅 するためには、ィ ミュニティー E3遺伝子を保持させた大腸菌を用いるなどの 手間が必要になる。
以上より、配列番号 1 4で示された Sfil切断による MA断片は、 外来の DNA 断片を高効率でクロ一ニングするための致死性マーカーとして機能しうる こと、 およびこの断片を組込んだプラスミ ドベクターは、 外来 DNA断片のク ローニング用として利用できることが示された。
Figure imgf000017_0001
揷入断片を有するあるいは有しないクローンの数 表中の数値は、 解析した形質転換体のクローンの中で、 挿入断片を保持して いたクローンの数を、括弧内は揷入断片を保持していなかったクローンの数 を示す。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 コリシンなどの致死遺伝子を用いて、 形質転換の際に、 外来挿入遺伝子断片を有するクローンを効率的に選択するための極めて有 効な手段を提供できる。特に本発明の形質転換体選択用マーカーは、 使用す る致死遺伝子の致死活性の程度及び利用する宿主が有するサブレッサ一変 異の強度に応じて、 自由に構築および選択が可能であり、利用する宿主に対 して最も効率的な選択マーカーを構築及び選択することが可能となり、致死 遺伝子の致死活性が強すぎるための宿主の耐性化に基づく選択性の低下を 防止できるとともに、 該選択マーカーを含むベクターは宿主中において、 安 定的に増幅することが可能である。 また、 ィミュニティ一などの致死遺伝子 に対する耐性化遺伝子をさらに致死遺伝子の活性部分に付加するか、あるい はこのような耐性化遺伝子を保持するプラスミ ドをあらかじめ宿主大腸菌 に保持させておくことにより、 同様に安定的に増幅することが可能である。 したがって、 本発明は、外来挿入遺伝子のクローニング手段として極めて有 用な手段を提供する。

Claims

請求の範囲
1 .致死遺伝子の活性部位の 5 '上流側に、翻訳終止コ ドンが揷入されてい ることを特徴とする D N A断片。
2 . 両端側に制限酵素切断部位を有することを特徴とする請求の範囲第 1 項に記載の D N A断片。
3 . 翻訳終止コドンが 1個または 2個以上挿入されていることを特徴とす る請求の範囲第 2項または第 3項に記載の D N A断片。
4 . 活性部位がコリシン由来のポリべプチドをコードするものである請求 の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の D N A断片
5 . 上記活性部位が配列番号 1 8または 1 9で示されるアミノ酸配列をコ 一ドする塩基配列を有するものである請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれ かに記載の D N A断片。
6 - 配列番号 1 4で示される塩基配列を有する D N A断片。
7 .致死遺伝子の活性部位の 3，下流側に、致死遺伝子に対する中和遺伝子 を接合したものである請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれかに記載の D N A断片。
8 . 中和遺伝子の塩基配列が配列番号 1 5に示されるものである請求の範 囲第 7項に記載の D N A断片。
9 . 請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれかに記載の D N A断片からなるこ とを特徴とする形質転換体選択用マーカー。
1 0 . 形質転換体が大腸菌を形質転換させたものである請求の範囲第 9項 に記載の形質転換体選択用マーカー。
1 1 . 請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれかに記載の D N A断片が揷入さ れた組み換えベクター。
1 2 . 致死遺伝子に対する発現プロモー夕一を含まないことを特徴とする 請求の範囲第 1 1項に記載の組み換えベクター。
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