WO2003072699A2 - Device and method for determining relative synthesis capacity of individual cells and/or position coordinates - Google Patents

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WO2003072699A2
WO2003072699A2 PCT/DE2003/000682 DE0300682W WO03072699A2 WO 2003072699 A2 WO2003072699 A2 WO 2003072699A2 DE 0300682 W DE0300682 W DE 0300682W WO 03072699 A2 WO03072699 A2 WO 03072699A2
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position coordinates
nutrient solution
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Klaus Gärtner
Christoph Giese
Christian Demmler
Uwe Marx
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the invention relates to a device and a method for the non-invasive determination of the relative synthesis performance of secretory proteins of individual cells and / or the position coordinates of these cells.
  • the synthesis performance of individual cells with regard to the formation of monoclonal antibodies should be taken into account.
  • other proteins secreted by cells such as erythropoietin (EPO), tumor necrosis factors or enzymes, can also be determined and evaluated with regard to the synthesis performance of individual cells for such proteins.
  • EPO erythropoietin
  • tumor necrosis factors or enzymes can also be determined and evaluated with regard to the synthesis performance of individual cells for such proteins.
  • Monoclonal antibodies already have and will continue to play a major role in therapy in human and veterinary medicine.
  • the generation or formation of monoclonal antibodies by means of individual cells or cell clones makes it possible to provide certain monoclonal antibodies in identical form with greater yield and in a shorter time.
  • Such monoclonal antibody-producing cells are cultivated in vessels containing nutrient solution, microtiter plates known per se being frequently used as vessels.
  • Another aspect that has so far only been solved unsatisfactorily with such non-invasive techniques is the possibility of a short-term check as to whether certain selected cells are able to form certain monoclonal antibodies or other proteins.
  • both the respective positions of individual cells within a vessel the ability of the cells to form monoclonal antibodies and a qualitative evaluation of the synthesis performance of cells to form proteins, such as monoclonal antibodies, can be determined. be determined or made.
  • a suitable substance which is specific for the particular monoclonal antibodies or proteins formed, is added to the nutrient solution in the vessel in which the individual cells are also cultivated.
  • This substance specific for the respective protein can bind to the proteins formed by the cells and form precipitates around the cells.
  • This specific substance e.g. Immoglubin, a substance suitable for fluorescence excitation, is covalently bound.
  • An example of this is the so-called "green fluorescence protein".
  • the nutrient solution used, in which the cells are contained, should have a semisolid consistency. Such consistency is important from two points of view. Thus, the formation of precipitates, the secretory proteins, reaches the respective cell and, in particular, in the event that certain cells are to be selected with increased synthesis performance, the positions are maintained of the respective cells within the nutrient solution contained in the vessel over a longer period of time.
  • the semisolid consistency of the nutrient solution which apart from the protein-specific fluorophores already mentioned, can have a known composition, can be adjusted by adding suitable viscosity-increasing substances.
  • suitable viscosity-increasing substances Such substances which do not negatively influence the vitality of the cells can be biogenic, processed and / or synthetic substances. Examples are methyl cellulose, agar or agarose.
  • Such a nutrient solution with a semisolid consistency then reaches a viscosity that is at least 20 times higher than the viscosity of pure water.
  • the viscosity can also preferably be in the range from 20 to 100 times higher and beyond.
  • the monoclonal antibodies formed as an example of such proteins also referred to as precipitates, form a cloud-shaped structure around the respective individual cell, the spatial extent of which is proportional to the amount of monoclonal antibodies formed up to the corresponding point in time.
  • the monoclonal antibodies formed attach to the specific substance with the substance suitable for fluorescence excitation in a concentrated form and form precipitates, so that when illuminated with light suitable for fluorescence excitation in the precipitates (regions) an increased fluorescent light intensity and, accordingly, the monoclonal Antibody-forming individual cells can be detected locally.
  • the detectable fluorescence intensity is a meaningful measurement variable for the qualitative evaluation of the synthesis performance of the respective individual cells.
  • a fluorescence microscope in connection with a video system, e.g. a digital camera and electronic image processing.
  • a video system e.g. a digital camera and electronic image processing.
  • a two-dimensional image recording with a spatially resolved detection of the fluorescence intensity can be carried out in different planes.
  • These planes are preferably orthogonal to the optical axis of such a microscope and aligned parallel to one another.
  • the confocal two-dimensional image acquisition takes place at predeterminable distances between the individual planes, so that the image acquisition would be practically carried out in layers.
  • the individual levels should be selected at the same intervals as possible, the distance between adjacent levels preferably not less than 20 ⁇ m and not greater than 70 ⁇ m, preferably approximately 50 ⁇ m.
  • Fluorescence excitation can be achieved by microscope illumination. However, there is also the possibility, alone or in addition, of using a further light source which emits a limited wavelength spectrum, with at least the fluorescence excitation wavelength of the substance used in each case suitable for fluorescence excitation being contained in the wavelength spectrum of such a light source.
  • regions of increased fluorescence light intensity can, as already indicated above, within a cloud-shaped structure which is surrounded by a protein, e.g. monoclonal antibody-producing cell is formed, can be detected within the individual levels.
  • the position coordinates can be determined in three-dimensional form.
  • an electronically controlled micromanipulator can be used, which can be inserted into the vessel with the aid of correspondingly determined position coordinates in relation to a correspondingly selected cell and can take up the corresponding cell from the vessel.
  • At least one optical filter in a device according to the invention.
  • Such a filter should then be arranged between the vessel and the digital camera and be transparent at least for the wavelength range or a wavelength of the fluorescent light and block other wavelengths if possible in order to reduce stray light influences on the one hand and to simplify the evaluation by means of electronic image processing on the other can.
  • gray value formation should be carried out by means of electronic image processing.
  • an image correction can also be carried out alone or in addition (cf. FIG. 1).
  • Certain criteria should be set up and taken into account, in particular for the selection and selection of individual cells with increased synthetic performance.
  • Various input parameters xi can be taken into account.
  • the area and / or the diameter of the regions detected in the individual levels can be determined.
  • the mean value of the detected fluorescence intensity for individual regions can advantageously be taken into account.
  • the extent and / or the contour shape of the regions can also be determined as input parameters.
  • a determination of the contour shape is always necessary or sensible if the detected region has a contour that deviates from a rotationally symmetrical shape.
  • the detected fluorescence intensity in conjunction with the Area and / or the diameter of the respective region are to be preferred, a division into the synthesis performance, for example for monoclonal antibodies, classes taking into account individual cells.
  • Such a categorization for certain subpopulations can take place, for example, in “weak producers”, “medium producers”, “high producers” and “super producers”. After such a classification, it is then possible to select only cells that fall into the "super producer” class for further cultivation.
  • the classification can be carried out both in a sharp form with measured values of input parameters and in an unsharp form according to the linguistic model approach and a combination of sharp and unsharp forms, the linguistic input parameters xi with corresponding linguistic terms ⁇ ; j can be defined.
  • Such linguistic terms can be “small”, “medium” or “large” for the respectively detected area of a region, and “very weak”, “weak”, “medium”, “strong” or “very strong” for the fluorescence intensity .
  • Corresponding linguistic terms, as for the surface, can also be defined for a diameter range to be considered as an input parameter.
  • the corresponding linguistic terms can be "short”, “medium” or “long”.
  • Possible linguistic terms for a range can be defined in the same way as for the area or diameter.
  • the linguistic output variable y “synthesis power” can be described by the fuzzy classification as a linguistic output term description v k (fuzzy output description) and / or determined after defuzzification as a sharp initial value k (concrete class).
  • Figure 1 shows in schematic form the sequence of the acquisition, processing of two-dimensionally recorded images and the division of antibody-forming cells into different classes and
  • FIG. 2 shows the sequence for determining position codes ordinates of cells with increased synthesis performance and their targeted selection.
  • identical antibodies with a targeted and desired structure can be obtained from myeloma cells which are fused with B lymphocytes.
  • hybrid cells hybrid cells
  • clonal proliferation uses clonal proliferation to develop cell families (clones) that are genetically identical and thus produce absolutely structurally identical monoclonal antibodies with a uniform antigen specificity.
  • the high-molecular-weight antibody-antigen complex which is also referred to as such a precipitate, forms a cloud-like structure around each cell that is capable of producing antibodies.
  • a sterile fluorophore contained in the nutrient solution attaches to the proteins and after irradiation with appropriate light, fluorescence is stimulated.
  • a check can be carried out at intervals to determine whether monoclonal antibodies are actually formed by the cells, whether the synthesis performance of individual cells is qualitatively assessed and / or whether three-dimensional position coordinates are determined for such cells.
  • two-dimensional images are captured in the individual levels within the vessel and further processed by means of electronic image processing, such as is commercially available as suitable software from Soft Imaging System, DE, for example under the trade name “analySIS”, as is shown in the schematic Representation after Figure 1 can be seen in the upper area.
  • electronic image processing such as is commercially available as suitable software from Soft Imaging System, DE, for example under the trade name “analySIS”, as is shown in the schematic Representation after Figure 1 can be seen in the upper area.
  • Z corresponds to the respective level in which a two-dimensional image can be captured and evaluated.
  • the distance a between the individual planes in which two-dimensional images are recorded and taken into account is designated by a.
  • High producer determined, its three-dimensional position coordinates x, y, z and the precipitate diameter can be used for a selection of such a cell with the correspondingly high synthesis performance.

Abstract

The invention relates to a device and a method for the non-invasive determination of the relative synthesis capacity of secreted proteins of individual cells and/or the position coordinates of said cells, whereby especially the synthesis capacity of cells with respect to the production of monoclonal antibodies but also of other proteins is determined. The aim of the invention is to provide a method for rapidly determining the relative synthesis capacity and/or the position of such cells that are cultivated in a recipient in a nutrient solution. According to the invention, the nutrient solution has a semi-solid consistence and contains, in addition to the protein-producing cells, a fluorophore specific for the respective protein or for substances that specifically bind the protein and that can be induced by light to fluoresce. A three-dimensional determination of the position coordinates of regions of increased fluorescent light intensity within the recipient is carried out by means of a fluorescence microscope combined with a video system and electronic image processing. Said regions of increased fluorescent light intensity contain protein-secreting cells.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung der relativen Syntheseleistung einzelner Zellen und/oder von PositionskoordinatenDevice and method for determining the relative synthesis performance of individual cells and / or of position coordinates
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur nichtinvasiven Bestimmung der relativen Syntheseleistung von sekretorisch gebildeten Proteinen einzelner Zellen und/oder der Positionskoordinaten dieser Zellen. Insbesondere soll die Synthese- leistung einzelner Zellen bezüglich der Bildung von monoklonalen Antikörpern berücksichtigt werden. Es können aber auch andere sekretrorisch von Zellen gebildete Proteine, wie beispielsweise Erythropoetin (EPO) , Tumor-Nekrose-Faktoren oder auch Enzyme bezüg- lieh der Syntheseleistung einzelner Zellen für solche Proteine bestimmt und bewertet werden.The invention relates to a device and a method for the non-invasive determination of the relative synthesis performance of secretory proteins of individual cells and / or the position coordinates of these cells. In particular, the synthesis performance of individual cells with regard to the formation of monoclonal antibodies should be taken into account. However, other proteins secreted by cells, such as erythropoietin (EPO), tumor necrosis factors or enzymes, can also be determined and evaluated with regard to the synthesis performance of individual cells for such proteins.
Monoklonale Antikörper haben bereits und werden auch zukünftig eine große Rolle bei der Therapierung in der Human- und Veterinärmedizin spielen. Die Erzeugung bzw. Bildung monoklonaler Antikörper mittels einzelner Zellen bzw. Zeilklonen ermöglicht es, bestimmte monoklonale Antikörper in identischer Form mit größerer Ausbeute und in kürzerer Zeit zur Verfügung zu stellen. Dabei werden solche monoklonale Antikörper bildende Zellen in Nährlösung enthaltenden Gefäßen kultiviert, wobei als Gefäße häufig an sich bekannte Mikrotiterplatten Verwendung finden.Monoclonal antibodies already have and will continue to play a major role in therapy in human and veterinary medicine. The generation or formation of monoclonal antibodies by means of individual cells or cell clones makes it possible to provide certain monoclonal antibodies in identical form with greater yield and in a shorter time. Such monoclonal antibody-producing cells are cultivated in vessels containing nutrient solution, microtiter plates known per se being frequently used as vessels.
Es hat sich dabei herausgestellt, dass die Ausbeute an monoklonalen Antikörpern, aber auch anderer Proteine, also die Syntheseleistung der einzelnen Zellen sehr unterschiedlich ist.It turned out that the yield of monoclonal antibodies, but also of other proteins, that is the synthesis performance of the individual cells, is very different.
Da für das Klonen geeigneter Zellen üblicherweise ein Zeitraum von 4 bis 6 Wochen erforderlich ist und eine genetische Stabilität der geklonten Zellen ca. nach einem weiteren 1/2 Jahr erreicht werden kann, ist eine frühzeitig gezielte Selektion von Zellen mit erhöhter Syntheseleistung für monoklonale Antikörper oder andere Proteine wünschenswert .Since a period of 4 to 6 weeks is usually required for the cloning of suitable cells and a genetic stability of the cloned cells can be achieved after a further 1/2 year, targeted selection of cells with increased synthesis performance for monoclonal antibodies or other proteins desirable.
Ein weiterer Aspekt, der bisher bei solchen nichtin- vasiven Techniken ebenfalls nur unbefriedigend gelöst ist, besteht in der Möglichkeit einer kurzfristigen Überprüfung, ob bestimmte ausgewählte Zellen in der Lage sind, bestimmte monoklonale Antikörper oder andere Proteine bilden zu können.Another aspect that has so far only been solved unsatisfactorily with such non-invasive techniques is the possibility of a short-term check as to whether certain selected cells are able to form certain monoclonal antibodies or other proteins.
Es ist Aufgabe der Erfindung, Möglichkeiten zu schaffen, mit der die Position und/oder die Syntheseleistung für monoklonale Antikörper einzelner Zellen, die in einem Gefäß mit einer Nährlösung kultiviert wer- den, bereits nach kurzer Zeit bestimmt werden können. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einer Vorrichtung, die die Merkmale des Anspruchs 1 aufweist und mit einem Verfahren gemäß Anspruch 5 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungsformen und Weiterbildungen der Erfindung können mit den in den untergeordneten Ansprüchen bezeichneten Merkmalen erreicht werden.It is the object of the invention to create possibilities with which the position and / or the synthesis performance for monoclonal antibodies of individual cells, which are cultivated in a vessel with a nutrient solution, can be determined after a short time. According to the invention, this object is achieved with a device having the features of claim 1 and with a method according to claim 5. Advantageous refinements and developments of the invention can be achieved with the features specified in the subordinate claims.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der entsprechenden Verfahrensführung können sowohl die je- weiligen Positionen einzelner Zellen innerhalb eines Gefäßes, die Fähigkeit der Bildung monoklonaler Antikörper durch die Zellen, wie auch eine qualitative Bewertung der Syntheseleistung von Zellen zur Bildung von Proteinen, wie monoklonale Antikörper bestimmt, festgestellt bzw. vorgenommen werden.With the device according to the invention and the corresponding procedure, both the respective positions of individual cells within a vessel, the ability of the cells to form monoclonal antibodies and a qualitative evaluation of the synthesis performance of cells to form proteins, such as monoclonal antibodies, can be determined. be determined or made.
Hierzu wird eine geeignete Substanz, die für die jeweiligen gebildeten monoklonalen Antikörper oder Proteine spezifisch ist, der Nährlösung im Gefäß, in dem auch die einzelnen Zellen kultiviert werden, zugegeben. Diese für das jeweilige Protein spezifische Substanz kann an die von den Zellen gebildeten Proteine binden und um die Zellen Präzipitate bilden. An diese spezifische Substanz, z.B. Immoglubin, ist ein zur Fluoreszenzanregung geeigneter Stoff kovalent gebunden. Ein Beispiel hierfür ist das so genannte „Green Fluorescence Protein" .For this purpose, a suitable substance, which is specific for the particular monoclonal antibodies or proteins formed, is added to the nutrient solution in the vessel in which the individual cells are also cultivated. This substance specific for the respective protein can bind to the proteins formed by the cells and form precipitates around the cells. This specific substance, e.g. Immoglubin, a substance suitable for fluorescence excitation, is covalently bound. An example of this is the so-called "green fluorescence protein".
Die verwendete Nährlösung, in der die Zellen enthal- ten sind, soll eine semisolide Konsistenz aufweisen. Eine solche Konsistenz ist unter zwei Gesichtspunkten von Bedeutung. So kann die Präzipitatbildung, der sekretorisch gebildeten Proteine, um die jeweilige Zelle erreicht und insbesondere für den Fall, dass bestimmte Zellen mit erhöhter Syntheseleistung selektiert werden sollen, die Einhaltung der Positionen der jeweiligen Zellen innerhalb der im Gefäß enthaltenen Nährlösung über einen längeren Zeitraum gesichert werden.The nutrient solution used, in which the cells are contained, should have a semisolid consistency. Such consistency is important from two points of view. Thus, the formation of precipitates, the secretory proteins, reaches the respective cell and, in particular, in the event that certain cells are to be selected with increased synthesis performance, the positions are maintained of the respective cells within the nutrient solution contained in the vessel over a longer period of time.
Die semisolide Konsistenz der Nährlösung, die bis auf die bereits erwähnten proteinspezifischen Fluorophore eine an sich bekannte Zusammense zung aufweisen kann, kann durch Zugabe geeigneter viskositätserhöhender Substanzen eingestellt werden. Bei solchen die Vita- lität der Zellen nicht negativ beeinflussenden Substanzen kann es sich um biogene, prozessierte und/oder synthetische Substanzen handeln. Beispiele sind MethylZellulose, Agar oder Agarose.The semisolid consistency of the nutrient solution, which apart from the protein-specific fluorophores already mentioned, can have a known composition, can be adjusted by adding suitable viscosity-increasing substances. Such substances which do not negatively influence the vitality of the cells can be biogenic, processed and / or synthetic substances. Examples are methyl cellulose, agar or agarose.
Eine solche Nährlösung mit semisolider Konsistenz erreicht dann eine Viskosität, die mindestens 20-fach höher als die Viskosität von reinem Wasser ist.Such a nutrient solution with a semisolid consistency then reaches a viscosity that is at least 20 times higher than the viscosity of pure water.
Die Viskosität kann auch bevorzugt im Bereich einer 20 bis 100-fach höheren und darüber hinausgehenden liegen.The viscosity can also preferably be in the range from 20 to 100 times higher and beyond.
Die als ein Beispiel für solche Proteine gebildeten monoklonalen Antikörper, auch als Präzipitat bezeich- net, bilden um die jeweilige einzelne Zelle ein wol- kenförmiges Gebilde, dessen räumliche Ausdehnung proportional zur Menge der bis zum entsprechenden Zeitpunkt gebildeten monoklonalen Antikörper ist.The monoclonal antibodies formed as an example of such proteins, also referred to as precipitates, form a cloud-shaped structure around the respective individual cell, the spatial extent of which is proportional to the amount of monoclonal antibodies formed up to the corresponding point in time.
An die gebildeten monoklonalen Antikörper lagert sich die für diese spezifische Substanz mit dem zur Fluoreszenzanregung geeignetem Stoff in konzentrierter Form an, und bilden Präzipitate, so dass bei Beleuchtung mit zur Fluoreszenzanregung geeignetem Licht in den Präzipiaten (Regionen) eine erhöhte Fluoreszenzlichtintensität und dementsprechend die monoklonalen Antikörper bildenden einzelnen Zellen lokal detek- tierbar sind.The monoclonal antibodies formed attach to the specific substance with the substance suitable for fluorescence excitation in a concentrated form and form precipitates, so that when illuminated with light suitable for fluorescence excitation in the precipitates (regions) an increased fluorescent light intensity and, accordingly, the monoclonal Antibody-forming individual cells can be detected locally.
Des Weiteren ist nicht nur die räumliche Ausdehnung des wolkenförmigen Gebildes, um eine monoklonale Antikörper bildende Zelle ein Parameter für die Bewertung der Syntheseleistung, sondern auch die Dichte der innerhalb eines solchen wolkenförmigen Gebildes vorhandenen monoklonalen Antikörper. Dementsprechend ist auch die detektierbare Fluoreszenzintensität eine aussagekräftige Messgrδße zur qualitativen Bewertung der Syntheseleistung der jeweiligen einzelnen Zellen.Furthermore, not only the spatial extent of the cloud-like structure around a cell forming monoclonal antibodies is a parameter for evaluating the synthesis performance, but also the density of the monoclonal antibodies present within such a cloud-like structure. Accordingly, the detectable fluorescence intensity is a meaningful measurement variable for the qualitative evaluation of the synthesis performance of the respective individual cells.
Da die einzelnen Zellen innerhalb der Nährlösung in einem Gefäß räumlich beliebig verteilt sind, ist insbesondere für die Selektion bestimmter einzelner Zellen, die eine erhöhte Syntheseleistung aufweisen, die Kenntnis der jeweiligen Position einer solchen Zelle innerhalb des Gefäßes erforderlich.Since the individual cells within the nutrient solution are spatially arbitrarily distributed in a vessel, knowledge of the respective position of such a cell within the vessel is necessary in particular for the selection of certain individual cells which have an increased synthesis capacity.
Für die Bestimmung der Positionskoordinaten der einzelnen Zellen in dreidimensionaler Form kann aus diesem Grund ein Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit einem Videosystem, z.B. einer Digitalkamera und einer elektronischen Bildverarbeitung eingesetzt werden. Dabei kann durch entsprechende Manipulation eines solchen Mikroskops eine zweidimensionale Bildaufnahme mit einer ortsaufgelösten Erfassung der Fluoreszenzintensität in verschiedenen Ebenen durchgeführt wer- den.For the determination of the position coordinates of the individual cells in three-dimensional form, a fluorescence microscope in connection with a video system, e.g. a digital camera and electronic image processing. By manipulating such a microscope, a two-dimensional image recording with a spatially resolved detection of the fluorescence intensity can be carried out in different planes.
Diese Ebenen sind bevorzugt orthogonal zur optischen Achse eines solchen Mikroskops und parallel zueinander ausgerichtet. Die konfokale zweidimensionale Bildaufnahme erfolgt weiter in vorgebbaren Abständen der einzelnen Ebenen zueinander, so dass die Bildauf- nähme quasi schichtweise durchgeführt wird. Die einzelnen Ebenen sollten in möglichst gleichen Abständen ausgewählt werden, wobei der Abstand jeweils benachbarter Ebenen möglichst nicht kleiner als 20 μm und nicht größer als 70 μm, bevorzugt bei ca. 50 μm liegen sollte.These planes are preferably orthogonal to the optical axis of such a microscope and aligned parallel to one another. The confocal two-dimensional image acquisition takes place at predeterminable distances between the individual planes, so that the image acquisition would be practically carried out in layers. The individual levels should be selected at the same intervals as possible, the distance between adjacent levels preferably not less than 20 μm and not greater than 70 μm, preferably approximately 50 μm.
Durch die Mikroskopbeleuchtung kann eine Fluoreszenzanregung erreicht werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, eine weitere Lichtquelle allein oder zusätzlich einzusetzen, die ein begrenztes Wellenlängenspektrum abstrahlt, wobei zumindest die Fluoreszenzanregungswellenlänge des jeweilig verwendeten zur Fluoreszenzanregung geeigneten Stoffes im Wellenlän- genspektrum einer solchen Lichtquelle enthalten ist.Fluorescence excitation can be achieved by microscope illumination. However, there is also the possibility, alone or in addition, of using a further light source which emits a limited wavelength spectrum, with at least the fluorescence excitation wavelength of the substance used in each case suitable for fluorescence excitation being contained in the wavelength spectrum of such a light source.
Durch die elektronische Bildaufnahme, bei gleichzeitiger Fluoreszenzanregung können, wie bereits vorab angedeutet, Regionen erhöhter Fluoreszenzlichtinten- sität, innerhalb eines wolkenförmigen Gebildes, das um eine Proteine, wie z.B. monoklonale Antikörper bildende Zelle ausgebildet ist, innerhalb der einzelnen Ebenen detektiert werden.Due to the electronic image acquisition, with simultaneous fluorescence excitation, regions of increased fluorescence light intensity can, as already indicated above, within a cloud-shaped structure which is surrounded by a protein, e.g. monoclonal antibody-producing cell is formed, can be detected within the individual levels.
Hierzu ist es zweckmäßig, mindestens einen Schwellwert für eine zu berücksichtigende Fluoreszenzintensität, der innerhalb einer solchen Region erreicht werden soll, vorzugeben.For this purpose, it is expedient to specify at least one threshold value for a fluorescence intensity to be taken into account which is to be achieved within such a region.
Mit den so innerhalb einer Ebene zweidimensional de- tektierten Koordinaten solcher Regionen und unter Kenntnis der Lage der jeweiligen Ebene können die Positionskoordinaten in dreidimensionaler Form bestimmt werden .With the coordinates of such regions detected two-dimensionally within a plane and with knowledge of the position of the respective plane, the position coordinates can be determined in three-dimensional form.
Diese Kenntnis ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn, wie bereits angedeutet, eine Selektion bestimmter ausgewählter Zellen durchgeführt werden soll . Hierzu kann ein elektronisch gesteuerter Mikromanipu- lator eingesetzt werden, der mit Hilfe von entspre- chend bestimmten Positionskoordinaten in Bezug zu einer entsprechend ausgewählten Zelle in das Gefäß eingeführt und die entsprechende Zelle aus dem Gefäß aufnehmen kann .This knowledge is particularly important if, as already indicated, a selection of certain selected cells is to be carried out. For this purpose, an electronically controlled micromanipulator can be used, which can be inserted into the vessel with the aid of correspondingly determined position coordinates in relation to a correspondingly selected cell and can take up the corresponding cell from the vessel.
Es kann außerdem sinnvoll sein, bei einer erfindungs- gemäßen Vorrichtung mindestens ein optisches Filter einzusetzen. Ein solches Filter sollte dann zwischen Gefäß und Digitalkamera angeordnet werden und zumindest für den Wellenlängenbereich bzw. eine Wellenlän- ge des Fluoreszenzlichtes transparent sein und möglichst andere Wellenlängen zu sperren, um zum einen Streulichteinflüsse zu reduzieren und zum anderen die Auswertung mittels einer elektronischen Bildverarbeitung vereinfachen zu können.It can also make sense to use at least one optical filter in a device according to the invention. Such a filter should then be arranged between the vessel and the digital camera and be transparent at least for the wavelength range or a wavelength of the fluorescent light and block other wavelengths if possible in order to reduce stray light influences on the one hand and to simplify the evaluation by means of electronic image processing on the other can.
Zumindest wenn auf solche optische Filter verzichtet wird, sollte mittels der elektronischen Bildverarbeitung eine Grauwertbildung durchgeführt werden.At least if such optical filters are dispensed with, gray value formation should be carried out by means of electronic image processing.
Neben der Grauwertbildung kann aber auch allein oder zusätzlich eine Bildkorrektur durchgeführt werden (vgl . Figur 1) .In addition to the gray value formation, an image correction can also be carried out alone or in addition (cf. FIG. 1).
Insbesondere für die Auswahl und Selektion einzelner Zellen mit erhöhter Syntheseleistung sollten bestimmte Kriterien aufgestellt und berücksichtigt werden. Dabei können verschiedene Eingangsparameter xi berücksichtigt werden.Certain criteria should be set up and taken into account, in particular for the selection and selection of individual cells with increased synthetic performance. Various input parameters xi can be taken into account.
So sollten neben der bereits erwähnten Fluoreszenzintensität auch die Fläche und/oder der Durchmesser der in den einzelnen Ebenen detektierten Regionen bestimmt werden. Vorteilhaft kann der Mittelwert der detektierten Fluoreszenzintensität für einzelne Regionen berücksichtigt werden.In addition to the fluorescence intensity already mentioned, the area and / or the diameter of the regions detected in the individual levels can be determined. The mean value of the detected fluorescence intensity for individual regions can advantageously be taken into account.
Zusätzlich können als Eingangsparameter auch der Umfang und/oder die Konturform der Regionen bestimmt werden. Eine Bestimmung der Konturform ist immer dann erforderlich bzw. sinnvoll, wenn die detektierte Re- gion eine von einer rotationssymmetrischen Form abweichende Kontur aufweist.In addition, the extent and / or the contour shape of the regions can also be determined as input parameters. A determination of the contour shape is always necessary or sensible if the detected region has a contour that deviates from a rotationally symmetrical shape.
Insbesondere für den Fall, dass ausgewählte Zellen aus dem Gefäß selektiv entfernt werden sollen, ist es günstig auch die Abstände der einzelnen Regionen, in denen Zellen angeordnet sind, zueinander zu bestimmen, wobei diese Abstandsbestimmung möglichst auch in dreidimensionaler Form durchgeführt werden sollte. Dadurch kann vermieden werden, dass in unerwünschter Form zwei oder mehrere Zellen aus dem Gefäß aufgenommen werden, wobei dann auch Zellen mit relativ geringer Syntheseleistung selektiert werden würden.In particular in the event that selected cells are to be selectively removed from the vessel, it is also advantageous to determine the distances between the individual regions in which cells are arranged, this distance determination should also be carried out in three-dimensional form if possible. In this way it can be avoided that two or more cells are taken up from the vessel in an undesired form, cells with relatively low synthesis output then also being selected.
Unter Berücksichtigung der Annahme, dass innerhalb einer entsprechend detektierten Region eine Proteine, z.B. monoklonale Antikörper bildende Zelle angeordnet ist, kann deren Position innerhalb der entsprechend detektierten Region durch Berechnung eines Fluoreszenzintensitätsschwerpunktes bzw. des Flächenschwer- punktes dieser Region mit erhöhter Genauigkeit bestimmt werden.Taking into account the assumption that a protein, e.g. monoclonal antibody-forming cell is arranged, its position within the correspondingly detected region can be determined with increased accuracy by calculating a center of fluorescence intensity or the center of area of this region.
Mit einer elektronischen Datenverarbeitungsanlage kann unter Berücksichtigung von mindestens zwei der vorab bezeichneten Eingangsparameter, wobei die detektierte Fluoreszenzintensität in Verbindung mit der Fläche und/oder dem Durchmesser der jeweiligen Region zu bevorzugen sind, eine Einteilung in die Syntheseleistung, z.B. für monoklonale Antikörper, einzelner Zellen berücksichtigende Klassen vorgenommen werden.With an electronic data processing system, taking into account at least two of the input parameters described above, the detected fluorescence intensity in conjunction with the Area and / or the diameter of the respective region are to be preferred, a division into the synthesis performance, for example for monoclonal antibodies, classes taking into account individual cells.
Eine solche Klasseneinteilung für bestimmte Subpopu- lationen kann beispielsweise in „Schwachproduzenten", „mittlere Produzenten", „Hochproduzenten" und „Super- produzenten" erfolgen. Es besteht dann nach einer solchen Klassifizierung die Möglichkeit, lediglich in die Klasse „Superproduzenten" fallende Zellen für die weitere Kultivierung zu selektieren.Such a categorization for certain subpopulations can take place, for example, in "weak producers", "medium producers", "high producers" and "super producers". After such a classification, it is then possible to select only cells that fall into the "super producer" class for further cultivation.
Die Klassifizierung kann sowohl in scharfer Form mit Messwerten von Eingangsparametern, als auch in unscharfer Form nach dem linguistischen Modellansatz sowie einer Kombination scharfer mit unscharfer Form durchgeführt werden, wobei die linguistischen Eingangsparameter xi mit entsprechenden linguistischen Termen μι;j definiert werden können.The classification can be carried out both in a sharp form with measured values of input parameters and in an unsharp form according to the linguistic model approach and a combination of sharp and unsharp forms, the linguistic input parameters xi with corresponding linguistic terms μι ; j can be defined.
Solche linguistischen Terme können für die jeweils detektierte Fläche einer Region „klein", „mittel" o- der „groß", für die Fluoreszenzintensität „sehr schwach", „schwach", „mittel", „stark" oder „sehr stark" sein. Für einen zu berücksichtigenden Durchmesserbereich als Eingangsparameter können ebenfalls entsprechende linguistische Terme, wie bei der Fläche definiert werden.Such linguistic terms can be “small”, “medium” or “large” for the respectively detected area of a region, and “very weak”, “weak”, “medium”, “strong” or “very strong” for the fluorescence intensity , Corresponding linguistic terms, as for the surface, can also be defined for a diameter range to be considered as an input parameter.
Für die Bestimmung des Abstandes zum nächsten Nachbarproduzenten als linguistischer Eingangsparameter können die entsprechenden linguistischen Terme „kurz", „mittel" oder „lang" sein.For the determination of the distance to the nearest neighboring producer as a linguistic input parameter, the corresponding linguistic terms can be "short", "medium" or "long".
Mögliche linguistische Terme für einen Bereichsumfang können wieder analog wie für die Fläche bzw. den Durchmesser definiert werden.Possible linguistic terms for a range can be defined in the same way as for the area or diameter.
Bei dem Eingangsparameter Konturform können linguis- tische Terme, wie „kreisförmig", „mittel" oder „elliptisch" definiert werden.With the input parameter contour shape, linguistic terms such as "circular", "medium" or "elliptical" can be defined.
In dieser Form kann eine Fuzzifizierung und Umwandlung in entsprechend geeignete unscharfe Mengen durchgeführt werden, um gegebenenfalls nachfolgendIn this form, fuzzification and conversion into appropriately suitable unsharp amounts can be carried out, if necessary subsequently
Entscheidungsmuster in Form von unscharfen Regeln aus den ermittelten Bilddaten extrahieren zu können.To be able to extract decision patterns in the form of fuzzy rules from the determined image data.
Unter Berücksichtigung der verschiedenen Eingangspa- rameter xi und der durch Fuzzyfizierung der linguistischen Eingangsvariablen in geeignete unscharfe Mengen erzeugten unscharfen Terme μι,j kann die linguistische Ausgangsvariable y „Syntheseleistung" durch die bereits erwähnte unscharfe Klassifikation als linguistische Ausgangstermbeschreibung vk (unscharfe Ausgangsbeschreibung) und/oder nach Defuzzyfizierung als scharfer Ausgangswert k (konkrete Klasse) bestimmt werden.Taking into account the various input parameters xi and the fuzzy terms μι, j generated by fuzzifying the linguistic input variables into suitable fuzzy sets, the linguistic output variable y “synthesis power” can be described by the fuzzy classification as a linguistic output term description v k (fuzzy output description) and / or determined after defuzzification as a sharp initial value k (concrete class).
Nachfolgend soll die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below by way of example.
Dabei zeigen:Show:
Figur 1 in schematischer Form den Ablauf der Erfassung, Verarbeitung von zweidimensional aufgenommenen Bildern sowie zur Einteilung von Antikörper bildenden Zellen in verschiedene Klassen undFigure 1 shows in schematic form the sequence of the acquisition, processing of two-dimensionally recorded images and the division of antibody-forming cells into different classes and
Figur 2 den Ablauf zur Ermittlung von Positionsko- ordinaten von Zellen mit erhöhter Syntheseleistung und deren gezielter Selektion.FIG. 2 shows the sequence for determining position codes ordinates of cells with increased synthesis performance and their targeted selection.
Beispielsweise können identische Antikörper mit einer gezielten und gewünschten Struktur aus Myelomzellen, die mit B-Lymphozyten verschmolzen sind, gewonnen werden. Diese Hybridzellen (Hybridom-Zellen) entwickeln auf dem Wege der klonalen Proliferation Zellfamilien (Klone) , die genetisch identisch sind und da- mit absolut strukturgleiche monoklonale Antikörper mit einer einheitlichen Antigenspezifizität produzieren.For example, identical antibodies with a targeted and desired structure can be obtained from myeloma cells which are fused with B lymphocytes. These hybrid cells (hybridoma cells) use clonal proliferation to develop cell families (clones) that are genetically identical and thus produce absolutely structurally identical monoclonal antibodies with a uniform antigen specificity.
Der von solchen Zellen, auch als Präzipitat bezeich- nete hochmolekulare Antikörper-Antigen-Komplex bildet um jede Zelle, die zur Antikörperbildung in der Lage ist, ein wolkenförmiges Gebilde. Ein in der Nährlösung enthaltender steriler Fluorophor lagert sich an den Proteinen an und nach Bestrahlung mit entspre- chend geeignetem Licht, wird Fluoreszenz angeregt.The high-molecular-weight antibody-antigen complex, which is also referred to as such a precipitate, forms a cloud-like structure around each cell that is capable of producing antibodies. A sterile fluorophore contained in the nutrient solution attaches to the proteins and after irradiation with appropriate light, fluorescence is stimulated.
Nach Ablauf einer vorgegebenen Zeit bzw. auch nach Ablauf von bestimmten Zeiten kann intervallweise eine Überprüfung vorgenommen werden, ob von den Zellen tatsächlich monoklonale Antikörper gebildet werden, die Syntheseleistung einzelner Zellen qualitativ bewertet und/oder für solche Zellen dreidimensionale Positionskoordinaten ermittelt werden.After a predetermined time or after certain times have elapsed, a check can be carried out at intervals to determine whether monoclonal antibodies are actually formed by the cells, whether the synthesis performance of individual cells is qualitatively assessed and / or whether three-dimensional position coordinates are determined for such cells.
Hierzu werden in den einzelnen Ebenen innerhalb des Gefäßes zweidimensionale Bilder erfasst und mittels einer elektronischen Bildverarbeitung, wie sie beispielsweise unter der Handelsbezeichnung „analySIS" von der Firma Soft Imaging System, DE als geeignete Software kommerziell erhältlich ist, weiter verarbeitet, wie dies in der schematischen Darstellung nach Figur 1 im oberen Bereich ersichtlich ist. Im folgenden wird dann eine Auswahl, die die Syntheseleistung einzelner Zellen berücksichtigt, durchgeführt.For this purpose, two-dimensional images are captured in the individual levels within the vessel and further processed by means of electronic image processing, such as is commercially available as suitable software from Soft Imaging System, DE, for example under the trade name “analySIS”, as is shown in the schematic Representation after Figure 1 can be seen in the upper area. In the following, a selection is made that takes into account the synthesis performance of individual cells.
Mit Figur 2 soll schematisch die Vorgehensweise für eine differenzierte Selektion von so genannten Hochproduzenten HPn verdeutlicht werden.The procedure for a differentiated selection of so-called high producers HP n is to be illustrated schematically with FIG.
Dabei entspricht z- der jeweiligen Ebene in der ein zweidimensionales Bild erfasst und ausgewertet werden kann. Mit a ist der Abstand der einzelnen Ebenen voneinander, in denen zweidimensionale Bilder aufgenommen und berücksichtigt werden, bezeichnet.Z corresponds to the respective level in which a two-dimensional image can be captured and evaluated. The distance a between the individual planes in which two-dimensional images are recorded and taken into account is designated by a.
Wird nunmehr in einer bestimmten Ebene ein solcherNow becomes one at a certain level
„Hochproduzent" ermittelt, können dessen dreidimensionale Positionskoordinaten x, y, z sowie der Präzipi- tatdurchmesser für eine Selektion einer solchen Zelle mit der entsprechend hoher Syntheseleistung genutzt werden. "High producer" determined, its three-dimensional position coordinates x, y, z and the precipitate diameter can be used for a selection of such a cell with the correspondingly high synthesis performance.

Claims

Patentansprücheclaims
1. Vorrichtung zur Bestimmung der relativen Synthe- seleistung von Zellen und/oder der Positionskoordinaten dieser Zellen, wobei die sekretorisch Proteine bildenden Zellen in einer Nährlösung in einem Gefäß enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, dass in der Nährlösung mit semisolider Konsistenz ein für das jeweilige1. Device for determining the relative synthetic performance of cells and / or the position coordinates of these cells, the cells forming secretory proteins being contained in a nutrient solution in a vessel, characterized in that in the nutrient solution with a semisolid consistency for the respective
Protein spezifischer Fluorophor enthalten ist undProtein specific fluorophore is included and
ein Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit einem Videosystem und einer elektronischen Bildverarbeitung zur dreidimensionalen Bestimmung der Positionskoordinaten von Regionen erhöhter Fluoreszenzlichtintensität innerhalb des Gefäßes vorhanden sind.a fluorescence microscope in connection with a video system and electronic image processing for three-dimensional determination of the position coordinates of regions of increased fluorescence light intensity are present within the vessel.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein elektronisch gesteuerter Mikromanipulator zur selektiven Aufnahme einzelner Zellen aus dem Gefäß, unter Berücksichtigung der bestimmten Positionskoordina- ten vorhanden ist.2. Device according to claim 1, characterized in that an electronically controlled micromanipulator for selectively picking up individual cells from the vessel is present, taking into account the determined position coordinates.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Nährlösung eine mindestens zwanzigfach höhere Viskosität als reines Wasser aufweist.3. Device according to claim 1 or 2, characterized in that the nutrient solution has an at least twenty times higher viscosity than pure water.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der Nährlösung zur Einstellung der semisoliden Konsistenz vis- kositätserhöhende Substanzen enthalten sind. Verfahren zur Bestimmung der relativen Syntheseleistung von Zellen und/oder der Positionskoordinaten, bei dem die sekretorisch Proteine bildenden Zellen in einer Nährlösung mit semisolider Konsistenz in einem Gefäß enthalten sind, in die Nährlösung ein für das jeweilige Protein spezifisch bindende Substanzen eingebracht und mit Licht eine Fluoreszenzanregung erreicht wird;4. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the nutrient solution to adjust the semisolid consistency contains viscosity-increasing substances. Method for determining the relative synthesis performance of cells and / or the position coordinates, in which the cells forming secretory proteins are contained in a nutrient solution with a semisolid consistency in a vessel, a substance specifically binding for the respective protein is introduced into the nutrient solution and a fluorescence excitation is introduced with light is achieved;
außerdem eine zweidimensionale Bildaufnahme mit einer ortsaufgelösten Erfassung der Fluoreszenzlichtintensität in verschiedenen parallel zueinander ausgerichteten und in vorgebbaren Abstän- den zueinander angeordneten Ebenen, zur Bestimmung dreidimensionaler Positionskoordinaten von Regionen erhöhter Fluoreszenzintensität innerhalb des Gefäßes ausgeführt wird.in addition, a two-dimensional image recording with a spatially resolved detection of the fluorescent light intensity in different planes aligned parallel to one another and arranged at predeterminable distances from one another is carried out for determining three-dimensional position coordinates of regions of increased fluorescence intensity within the vessel.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass lediglich die Positionskoordinaten für Regionen, die einen vorgebbaren Schwellwert einer Fluoreszenzintensität übersteigen, berücksichtigt werden.Method according to Claim 5, characterized in that only the position coordinates for regions which exceed a predeterminable threshold value of a fluorescence intensity are taken into account.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6 , dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzintensität innerhalb der Regionen ortsaufgelöst bestimmt wird.A method according to claim 5 or 6, characterized in that the fluorescence intensity is determined spatially resolved within the regions.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Eingangsparame- ter neben der Fluoreszenzintensität auch dieMethod according to one of claims 5 to 7, characterized in that in addition to the fluorescence intensity, the input parameter
Fläche und/oder der Durchmesser der einzelnen Regionen innerhalb einer Ebene bestimmt werden. Area and / or the diameter of the individual regions within a plane can be determined.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Eingangsparameter der Umfang und/oder die Konturform der Regionen bestimmt wird.9. The method according to any one of claims 5 to 8, characterized in that the extent and / or the contour shape of the regions is determined as the input parameter.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass für eine Selektion als Eingangsparameter die Abstände einzelner Regionen zueinander bestimmt werden.10. The method according to any one of claims 5 to 9, characterized in that the distances between individual regions are determined for a selection as an input parameter.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzintensitätsschwerpunkt oder der Flächenschwerpunkt einer fluoreszierenden Region bestimmt wird.11. The method according to any one of claims 5 to 10, characterized in that the center of fluorescence intensity or the center of area of a fluorescent region is determined.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass für die Regionen unter Berücksichtigung zumindest der Eingangsparameter Fluoreszenzintensität, Fläche und/oder Durchmesser der einzelnen Bereiche, eine Einteilung, in Klassen vorgenommen wird und dabei verschiedene Syntheseleistung von Zellen den Klas- sen zugeordnet sind.12. The method according to any one of claims 5 to 11, characterized in that for the regions, taking into account at least the input parameters fluorescence intensity, area and / or diameter of the individual areas, a division is made into classes and different synthesis performance of cells according to the class. are assigned.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Einteilung mittels vorgebbarer linguistischer Terme für die ausgewählten Eingangs- und/oder Ausgangsparame- ter vorgenommen wird.13. The method according to claim 12, characterized in that the division is carried out by means of predefinable linguistic terms for the selected input and / or output parameters.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einteilung und Auswahl bestimmter Bereiche mit Zellen, deren Syntheseleistung vorgebbare Parameter erfüllen, mittels scharfer und/oder unscharfer Klassifikation durchgeführt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass mittels der bestimmten Positionskoordinaten innerhalb ausgewählter Regionen angeordnete Zellen, mittels ei- nes elektronisch gesteuerten Mikromanipulators aus dem Gefäß aufgenommen werden.14. The method according to any one of claims 5 to 13, characterized in that a division and selection of certain areas with cells, the synthesis performance meet predetermined parameters, is carried out by means of sharp and / or unsharp classification. Method according to one of claims 5 to 14, characterized in that cells arranged within selected regions by means of the determined position coordinates are picked up from the vessel by means of an electronically controlled micromanipulator.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der relativen Syntheseleistung der Zellen nach einem oder mehreren vorgebbaren Zeitabstand/ -abständen durchgeführt wird.Method according to one of claims 5 to 15, characterized in that the determination of the relative synthesis performance of the cells is carried out after one or more predetermined time interval (s).
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass mittels einer e- lektronischen Bildverarbeitung eine Bildkorrek- tur und/oder eine Grauwertbildung durchgeführt wird.Method according to one of claims 5 to 16, characterized in that an image correction and / or a gray value formation is carried out by means of electronic image processing.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die zweidimensionale Bildaufnahme in Ebenen, deren Abstand jeweils im Bereich von 20 bis 70 μm liegen, durchgeführt wird.Method according to one of claims 5 to 17, characterized in that the two-dimensional image recording is carried out in planes, the spacing of which is in the range from 20 to 70 μm.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung an monoklonale Antikörper bildenden Zellen durchge- führt wird.Method according to one of claims 5 to 18, characterized in that the determination is carried out on cells producing monoclonal antibodies.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die semisolide Konsistenz der Nährlösung durch Zugabe viskositäts- erhöhender Substanzen auf eine mindestens zwan- zigfach höhere Viskosität als reines Wasser eingestellt wird. Method according to one of claims 5 to 19, characterized in that the semisolid consistency of the nutrient solution is adjusted to an at least twenty times higher viscosity than pure water by adding viscosity-increasing substances.
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