WO2003052137A2 - Evaneszenz-basierendes multiplex-sequenzierungsverfahren - Google Patents

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WO2003052137A2
WO2003052137A2 PCT/EP2002/014490 EP0214490W WO03052137A2 WO 2003052137 A2 WO2003052137 A2 WO 2003052137A2 EP 0214490 W EP0214490 W EP 0214490W WO 03052137 A2 WO03052137 A2 WO 03052137A2
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nucleic acid
acid molecules
fluorescence
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immobilized
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PCT/EP2002/014490
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Rudolf Rigler
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Gnothis Holding Sa
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for an evanescence-based multiplex sequencing of nucleic acid molecules immobilized on a carrier.
  • the sequencing of the human genome consisting of approx. 3 x 1 0 9 bases or the genome of other organisms as well as the determination and comparison of individual sequence variants requires the provision of sequencing methods which are fast on the one hand and can be used routinely and at low cost on the other hand.
  • sequencing methods for example the enzymatic chain termination method according to Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1 977) 5463), in particular by automation (Adams et al., Automated DNA Sequencing and Analysis (1 994), New York, Academic Press) can currently only be a maximum 2,000 bases per day can be determined with a sequencer.
  • the object underlying the present invention was therefore to provide a method for sequencing nucleic acids which represents a further improvement over the prior art and which enables parallel determination of individual nucleic acid molecules in a multiplex format.
  • PCT / EP01 / 07462 proposes a multiplex sequencing method in which nucleic acid molecules which carry several fluorescent labeling groups are provided in immobilized form on a support, and the base sequence of several nucleic acid molecules simultaneously due to the time-dependent change in the fluorescence of the nucleic acid molecules or the nucleotide units which are split off / and the cleaved nucleotide building blocks is determined.
  • the present application relates to a method for sequencing nucleic acids, comprising the steps: (a) providing an at least partially optically transparent support with a large number of nucleic acid molecules immobilized thereon, the nucleic acid molecules bearing several fluorescent labeling groups, (b) progressive cleavage of individual nucleotide building blocks from the immobilized nucleic acid molecules and (c) simultaneous determination of the base sequence of several nucleic acid molecules due to the time-dependent change of the fluorescence of the nucleic acid molecules and / or of the cleaved ones caused by nucleotide building blocks
  • Nucleotide building blocks caused time-dependent change in the fluorescence of the nucleic acid molecules and / or the cleaved nucleotide building blocks, the fluorescence by irradiating light into the support and generating an evanescent excitation field by internal reflection on the support surface in the
  • the method according to the invention is a carrier-based multiplex sequencing method in which a large number of immobilized nucleic acid molecules are examined simultaneously.
  • the carrier used for the method can be any planar or structured carrier which is suitable for the immobilization of nucleic acid molecules and which, at least in the area of the immobilized nucleic acids, has sufficient optical transparency and suitable surface properties for evanescence-based detection of fluorescence.
  • suitable carrier materials are glass, quartz, plastic or composite materials containing these materials.
  • the design of the support can in principle be of any type, provided that a reaction space can be formed which enables the progressive cleavage of individual nucleotide building blocks from the nucleic acids immobilized on the support in a liquid reaction mixture.
  • the nucleic acid molecules are preferably immobilized on the support via their 5 'or 3' ends, whereby they can be in single-stranded form or in double-stranded form. In the case of double-stranded molecules, it must be ensured that labeled nucleotide building blocks can only be split off from a single strand.
  • the nucleic acid molecules can be bound to the support by covalent or non-covalent interactions. For example, the binding of the polynucleotides to the carrier can be mediated by high-affinity interactions between the partners of a specific binding pair, for example biotin / streptavidin or avidin, hapten / anti-hapten antibodies, sugar / lectin etc.
  • biotinylated nucleic acid molecules can be coupled to streptavidin-coated supports.
  • the nucleic acid molecules can also be bound to the support by adsorption.
  • nucleic acid molecules modified by incorporation of alkanethiol groups can be bound to metallic supports, for example gold supports.
  • covalent immobilization where the binding of the polynucleotides can be mediated via reactive silane groups on a silica surface.
  • nucleic acid molecules intended for sequencing are bound to a carrier.
  • a carrier Preferably at least 100, particularly preferably at least 1,000 and particularly preferably at least 10,000 and up to more than 10 6 nucleic acid molecules are bound to the support.
  • the bound nucleic acid fragments have a length of preferably 200 to 2,000 nucleotides, particularly preferably 400 to 1,000 nucleotides.
  • the nucleic acid molecules bound to the support for example DNA molecules or RNA molecules, contain several fluorescent labeling groups, preferably at least 50%, particularly preferably at least 70% and most preferably essentially all, for example at least 90%, of the nucleotide building blocks of one base type Wear fluorescent label group.
  • Nucleic acids labeled in this way can be expressed by enzymatic primer extension a nucleic acid template using a suitable polymerase, for example a DNA polymerase such as Taq polymerase, a thermostable DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius or other thermostable organisms (Hopfner et al., PNAS USA 96 (1 999), 3600- 3605) or a mutated Taq polymerase (Patel and Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-5100) using fluorescence-labeled nucleotide building blocks.
  • a DNA polymerase such as Taq polymerase, a thermostable DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius or other thermostable organisms (Hopfner et al., PNAS USA 96 (1 999), 3600- 3605) or a mutated Taq polymerase (Patel and Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-5100
  • the labeled nucleic acid molecules can also be amplified by e.g. PCR.
  • PCR e.g. PCR-amplifying
  • Amplification products can be sequenced in double-stranded form. Nucleic acid fragments in which both strands are fluorescence-labeled are produced by symmetrical PCR. These two fluorescence-labeled strands can be separated and immobilized separately in single-stranded form, so that the sequence of one or both complementary strands can be determined separately. Alternatively, one of the two strands at the 3 'end can be modified in this way, e.g. by installing a PNA clamp, so that a cleavage of
  • nucleotide building blocks of at least two base types for example two, three or four base types, carry a fluorescent label, each base type advantageously carrying a different fluorescent label group.
  • the sequence can still be determined completely by parallel sequencing of several molecules.
  • the nucleic acid template, the sequence of which is to be determined can be selected, for example, from DNA templates such as genomic DNA fragments, cDNA molecules, plasmids etc., but also from RNA templates such as mRNA molecules.
  • the fluorescent labeling groups can be from known for labeling Biopo l y m e r e n, z.
  • Fluorescent labeling groups such as fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, Cy3, Cy5 or derivatives thereof, etc. can be selected.
  • the method according to the invention is based on the fact that fluorescent labeling groups built into nucleic acid strands interact with neighboring groups, for example with chemical groups of the nucleic acids, in particular nucleobases such as G, and / or neighboring fluorescent labeling groups, which lead to a change in the fluorescence, in particular the fluorescence intensity, compared to the fluorescent labeling groups in lead "isolated" form due to quenching and / or energy transfer processes.
  • the cleavage of individual nucleotide building blocks changes the total fluorescence, for example the fluorescence intensity of an immobilized nucleic acid strand, depending on the cleavage of individual nucleotide building blocks, ie depending on the time.
  • This temporal change in fluorescence can be recorded in parallel for a large number of nucleic acid molecules and correlated with the base sequence of the individual nucleic acid strands.
  • those fluorescent labeling groups are used which, when incorporated into the nucleic acid strand, are at least partially quenched, so that after the nucleotide building block containing the labeling group or an adjacent building block which causes quenching has been cleaved off, the fluorescence intensity is increased.
  • the sequencing reaction of the method according to the invention comprises the progressive cleavage of individual nucleotide building blocks from the immobilized nucleic acid molecules.
  • An enzymatic cleavage is preferably carried out using an exonuclease, single-strand or double-strand exonucleases which degrade in the 5 ' ⁇ 3' direction or 3 ' ⁇ 5' direction - depending on the type of immobilization of the nucleic acid strands on the support can be.
  • T7 DNA polymerase, E. coli exonuclease I or E. coli exonuclease III are particularly preferably used as exonucleases.
  • a change in the fluorescence intensity of the immobilized nucleic acid strand and / or of the cleaved nucleotide building block can be measured due to quenching or energy transfer processes. This change in the fluorescence intensity over time depends on the base sequence of the nucleic acid strand under investigation and can therefore be correlated with the sequence.
  • a plurality of nucleic acid strands labeled on different bases are preferably generated and immobilized on the support, preferably by enzymatic primer extension, as described above, the immobilization can take place at statistical locations of the wearer or also location-specifically.
  • a "sequence identifier" ie a labeled nucleic acid of known sequence
  • a "sequence identifier" can also be added to the nucleic acid strand to be examined, for example by enzymatic reaction with ligase or / and terminal transferase, so that at the beginning of the sequencing, first a known fluorescence pattern and only then that of the unknown corresponding sequence of fluorescence to be examined is obtained.
  • 10 3 to 10 6 nucleic acid strands are preferably immobilized on a support.
  • a convection flow away from the carrier is preferably generated in the reaction space.
  • the flow rate can be in the range from 1 to 10 mm / s.
  • the detection comprises irradiating light into the carrier, preferably by means of a laser.
  • One or more laser beams e.g. an expanded laser beam with a cross section of approx. 1 -20 mm or / and multiple laser beams can be used.
  • an evanescent excitation field is generated, which excites the fluorescent labeling groups of the nucleic acid molecules immobilized on the support.
  • the reflection on the carrier surface is preferably a total internal reflection.
  • the fluorescence emission of several nucleic acid strands generated by evanescent excitation can be detected in parallel using a detector matrix which, for example, is an electronic detector matrix, e.g. a CCD camera or an avalanche photodiode matrix.
  • the detection can be carried out in such a way that fluorescence excitation and detection take place in parallel on all examined nucleic acid strands.
  • a part of the nucleic acid strands can be examined in several steps.
  • the detection is preferably carried out using fluorescent light which is emitted essentially orthogonally from the carrier surface.
  • Yet another object of the invention is a device for sequencing nucleic acids, comprising
  • an at least partially optically transparent support comprising a multiplicity of nucleic acid molecules immobilized thereon, the nucleic acid molecules being in single-stranded form and carrying several fluorescent labeling groups
  • reaction space for the progressive cleavage of individual nucleotide building blocks from the immobilized nucleic acid molecules
  • the method and the device according to the invention can be used, for example, for the analysis of genomes and transcriptomes or for differential analyzes, e.g. Studies on the difference in the genome or transcriptome of individual species or organisms within a species can be used.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of an optically transparent support (2) according to the invention with a large number of single-stranded labeled nucleic acid molecules (4) immobilized thereon.
  • a carrier with an area of 1 to 2 cm 2 can contain, for example, up to 10 6 nucleic acid strands.
  • FIG. 2 shows a first embodiment of the invention, with excitation light (6) from an expanded one in the optically transparent carrier (2) with nucleic acid molecules (4) immobilized thereon Laser is irradiated and after reflection on the glass surface in the area of the immobilized nucleic acid molecules (4) emerges again from the carrier (2).
  • the immobilized nucleic acid molecules (4) are excited to fluoresce by the evanescent excitation field.
  • the emission light (8) is directed through optics (10) onto a detector (1 2).
  • multiple reflections (1 4a, 1 4b, 1 4c) in the optically transparent carrier (2) generate evanescent excitation fields.
  • the evanescent excitation fields can e.g. in the form of strips (FIG. 3B) or dots (FIG. 3C).
  • diffractive optics e.g. disclosed in DE 1 01 26 083.0, can be irradiated into the carrier.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für eine Evaneszenz-basierende Multiplex-Sequenzierung von auf einem Träger immobilisierten Nukleinsäuremolekülen.

Description

Evaneszenz-basierendes Multiplex-Sequenzierungsverfahren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für eine Evaneszenz-basierende Multiplex-Sequenzierung von auf einem Träger immobilisierten Nukleinsäuremolekülen.
Die Sequenzierung des aus ca. 3 x 1 09 Basen bestehenden humanen Genoms oder des Genoms anderer Organismen sowie die Bestimmung und der Vergleich individueller Sequenzvarianten erfordert die Bereitstellung von Sequenziermethoden, die einerseits schnell sind und andererseits routinemäßig und mit geringen Kosten eingesetzt werden können. Obwohl große Anstrengungen unternommen worden sind, um gängige Sequenziermethoden, z.B. die enzymatische Kettenabbruchmethode nach Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 ( 1 977) 5463), zu beschleunigen, insbesondere durch Automatisierung (Adams et al., Automated DNA Sequencing and Analysis ( 1 994), New York, Academic Press) können derzeit maximal nur 2.000 Basen pro Tag mit einem Sequenziergerät bestimmt werden.
Während der letzten Jahre sind neue Ansätze zur Überwindung der Beschränkungen konventioneller Sequenzierverfahren entwickelt worden, u.a. die Sequenzierung durch Rastertunnelmikroskopie (Lindsay und Phillip, Gen. Anal. Tech. Appl. 8 ( 1 991 ), 8-13), durch hochparallelisierte Kapillarelektrophorese (Huang et al., Anal. Chem. 64 ( 1 992), 2149-21 54; Kambara und Takahashi, Nature 361 ( 1 993), 565-566), durch Oligonukleotidhybridisierung (Drmanac et al., Genomics 4 ( 1 989), 1 1 4- 1 28; Khrapko et al., FEBS Let. 256 (1 989), 1 18-122; Maskos und Southern, Nucleic Acids Res. 20 (1 992), 1675-1 678 und 1 679-1 684) sowie durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisierungs- Massenspektroskopie (Hillenkamp et al., Anal. Chem. 63 (1 991 ), 1 1 93A- 1 203A) .
Ein weiterer Ansatz ist die Einzelmolekülsequenzierung (Dörre et al., Bioimaging 5 (1997), 139-1 52), bei der die Sequenz von Nukleinsäuren durch fortschreitenden enzymatischen Abbau von fluoreszenzmarkierten einzelsträngigen DNA-Molekülen und Nachweis der sequenziell freigesetzten Monomermoieküle in einem Mikrostrukturkanal erfolgt. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass nur ein einziges Molekül der Zielnukleinsäure für die Durchführung einer Sequenzbestimmung ausreicht.
Obwohl durch Anwendung der oben genannten Methoden bereits erhebliche Fortschritte erzielt wurden, besteht ein großes Bedürfnis nach weiteren Verbesserungen. Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, das eine weitere Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik darstellt und das eine parallele Bestimmung einzelner Nukleinsäuremoleküle in einem Multiplexformat ermöglicht.
In PCT/EP01 /07462 wird ein Multiplex-Sequenzierungsverfahren vorgeschlagen , wobei Nukleinsäuremoleküle, die mehrere Fluoreszenzmarkierungsgruppen tragen, in immobilisierter Form auf einem Träger bereitgestellt werden, und die Basenfolge mehrere Nukelinsäuremoleküle gleichzeitig aufgrund der bei Abspaltung von Nukleotidbausteinen hervorgerufenen zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz der Nukleinsäuremoleküle oder/und der abgespaltenen Nukleotidbausteine bestimmt wird.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines zumindest teilweise optisch transparenten Trägers mit einer Vielzahl von darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekülen, wobei die Nukleinsäuremoleküle mehrere Fluoreszenzmarkierungsgruppen tragen, (b) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen und (c) gleichzeitiges Bestimmen der Basenfolge mehrerer Nukleinsäuremoleküle aufgrund der bei Abspaltung von Nukleotidbausteinen hervorgerufenen zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz der Nukleinsäuremoleküle oder/und der abgespaltenen
Nukleotidbausteine hervorgerufenen zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz der Nukleinsäuremoleküle oder/und der abgespaltenen Nukleotidbausteine, wobei die Fluoreszenz durch Einstrahlen von Licht in den Träger und Erzeugen eines evaneszenten Anregungsfeldes durch interne Reflexion an der Trägeroberfläche im
Bereich der immobilisierten Nukleinsäuremoleküle bewirkt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine trägergestützte Multiplex- Sequenziermethode, bei der eine Vielzahl von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen gleichzeitig untersucht wird. Der für das Verfahren verwendete Träger kann ein beliebiger planarer oder strukturierter Träger sein, der zur Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen geeignet ist und der zumindest im Bereich der immobilisierten Nukleinsäuren eine ausreichende optische Transparenz und geeignete Oberflächenbeschaffenheit für einen Evaneszenz-basierenden Nachweis von Fluoreszenz hat. Beispiele für geeignete Trägermaterialien sind Glas, Quarz, Kunststoff oder diese Materialien enthaltende Verbundstoffe. Auch die Gestaltung des Trägers kann grundsätzlich beliebig sein, sofern ein Reaktionsraum gebildet werden kann, welcher das fortschreitende Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den auf dem Träger immobilisierten Nukleinsäuren in einem flüssigen Reaktionsgemisch ermöglicht. Die Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise über ihre 5'- oder 3'-Enden auf dem Träger immobilisiert, wobei sie in einzelsträngiger Form oder in doppelsträngiger Form vorliegen können. Bei doppelsträngigen Molekülen muss sichergestellt sein, dass markierte Nukleotidbausteine nur von einem einzigen Strang abgespalten werden können. Die Bindung der Nukleinsäuremoleküle an den Träger kann durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen erfolgen. Beispielsweise kann die Bindung der Polynukleotide an den Träger durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, z.B. Biotin/Streptavidin oder Avidin, Hapten/Anti-Hapten-Antikörper, Zucker/Lectin etc., vermittelt werden. So können biotinylierte Nukleinsäuremoleküle an Streptavidin-beschichtete Träger gekoppelt werden. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle auch adsorptiv an den Träger gebunden werden. So kann eine Bindung von durch Einbau von Alkanthiolgruppen modifizierten Nukleinsäuremolekülen an metallische Träger, z.B. Goldträger, erfolgen. Noch eine weitere Alternative ist die kovalente Immobilisierung, wobei die Bindung der Polynukleotide über reaktive Silangruppen auf einer Silika-Oberfläche vermittelt werden kann.
An einen Träger werden mehrere, für eine Sequenzierung vorgesehene Nukleinsäuremoleküle gebunden. Vorzugsweise werden mindestens 100, besonders bevorzugt mindestens 1 .000 und besonders bevorzugt mindestens 1 0.000 und bis zu mehr als 1 06 Nukleinsäuremoleküle an den Träger gebunden. Die gebundenen Nukleinsäurefragmente haben eine Länge von vorzugsweise 200 bis 2.000 Nukleotide, besonders bevorzugt 400 bis 1 .000 Nukleotide. Die an den Träger gebundenen Nukleinsäuremoleküle, z.B. DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, enthalten mehrere Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wobei vorzugsweise mindestens 50 %, besonders bevorzugt mindestens 70 % und am meisten bevorzugt im wesentlichen alle, z.B. mindestens 90 %, der Nukleotidbausteine von einem Basentyp eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe tragen. Derart markierte Nukleinsäuren können durch enzymatische Primerextension an einer Nukleinsäurematrize unter Verwendung einer geeigneten Polymerase, z.B. einer DNA-Polymerase wie etwa Taq-Polymerase, einer thermostabilen DNA-Polymerase von Thermococcus gorgonarius oder anderen thermostabilen Organismen (Hopfner et al., PNAS USA 96 ( 1 999), 3600- 3605) oder einer mutierten Taq-Polymerase (Patel und Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-5100) unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Nukleotidbausteine erzeugt werden.
Die markierten Nukleinsäuremoleküle können auch durch Amplifikationsreaktionen, z.B. PCR, hergestellt werden. So entstehen bei einer asymmetrischen PCR Amplifikationsprodukte, bei denen nur einziger
Strang Fluroeszenzmarkierungen enthält. Derartige asymmetrische
Amplifikationsprodukte können in doppelsträngiger Form sequenziert werden. Durch symmetrische PCR werden Nukleinsäurefragmente hergestellt, bei denen beide Stränge fluoreszenzmarkiert sind. Diese beiden fluoreszenzmarkierten Stränge können separiert und getrennt in einzelsträngiger Form immobilisiert werden, so daß die Sequenz eines oder beider Komplementärstränge separat bestimmt werden kann. Alternativ kann einer der beiden Stränge am 3'-Ende derart modifiziert werden, z.B. durch Einbau einer PNA-Klammer, sodass eine Abspaltung von
Monomerbausteinen nicht mehr möglich ist. In diesem Fall ist eine
Doppelstrangsequenzierung möglich.
Vorzugsweise tragen im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens zwei Basentypen, beispielsweise zwei, drei oder vier Basentypen, eine Fluoreszenzmarkierung, wobei jeder Basentyp günstigerweise eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungsgruppe trägt. Wenn die Nukleinsäuremoleküle nicht vollständig markiert sind, so kann durch parallele Sequenzierung von mehreren Molekülen dennoch die Sequenz vollständig bestimmt werden. Die Nukleinsäurematrize, deren Sequenz bestimmt werden soll, kann beispielsweise aus DNA-Matrizen wie genomischen DNA-Fragmenten, cDNA-Molekülen, Plasmiden etc., aber auch aus RNA-Matrizen wie mRNA- Molekülen ausgewählt werden.
Die Fluoreszenzmarkierungsgruppen können aus bekannten zur Markierung v o n B i o p o l y m e r e n , z . B . N u k l e i n s ä u r e n , v e r w e n d ete n Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wie etwa Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin, Cy3, Cy5 oder Derivaten davon etc. ausgewählt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, dass in Nukleinsäurestränge eingebaute Fluoreszenzmarkierungsgruppen Wechselwirkungen mit benachbarten Gruppen, beispielsweise mit chemischen Gruppen der Nukleinsäuren, insbesondere Nukleobasen wie etwa G, oder/und benachbarten Fluoreszenzmarkierungsgruppen eingehen, die zu einer Änderung der Fluoreszenz, insbesondere der Fluoreszenzintensität gegenüber den Fluoreszenzmarkierungsgruppen in "isolierter" Form aufgrund von Quench- oder/und Energietransfer- Vorgängen führen. Durch das Abspalten einzelner Nukleotidbausteine verändert sich die Gesamtfluoreszenz, z.B. die Fluoreszenzintensität eines immobilisierten Nukleinsäurestranges abhängig von der Abspaltung einzelner Nukleotidbausteine, d.h. abhängig von der Zeit. Diese zeitliche Änderung der Fluoreszenz kann parallel für eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen erfasst und mit der Basenfolge der einzelnen Nukleinsäurestränge korreliert werden. Vorzugsweise werden solche Fluoreszenzmarkierungsgruppen verwendet, die, wenn sie in den Nukleinsäurestrang eingebaut sind, zumindest teilweise gequencht sind, so dass nach Abspaltung des die Markierungsgruppe enthaltenden Nukleotidbausteins oder eines benachbarten Bausteins, der ein Quenchen verursacht, die Fluoreszenzintensität erhöht wird. Die Sequenzierungsreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das fortschreitende Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen. Vorzugsweise erfolgt eine enzymatische Abspaltung unter Verwendung einer Exonuklease, wobei Einzelstrang- bzw. Doppelstrang-Exonukleasen, die in 5'→3'-Richtung oder 3'→5'-Richtung abbauen - je nach Art der Immobilisierung der Nukleinsäurestränge auf dem Träger - eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt werden als Exonukleasen T7 DNA-Polymerase, E.coli Exonuklease I oder E.coli Exonuklease III verwendet.
Während der fortschreitenden Abspaltung einzelner Nukleotidbausteine kann eine Änderung der Fluoreszenzintensität des immobilisierten Nukleinsäurestrangs oder/und des abgespaltenen Nukleotidbausteins aufgrund von Quench- oder Energietransfervorgängen gemessen werden. Diese zeitliche Änderung der Fluoreszenzintensität ist von der Basenfolge des untersuchten Nukleinsäurestrangs abhängig und kann daher mit der Sequenz korreliert werden. Zur vollständigen Sequenzbestimmung eines Nukleinsäurestrangs werden üblicherweise mehrere - an unterschiedlichen Basen, z.B. A, G, C und T bzw. Kombinationen von zwei verschiedenen Basen - markierte Nukleinsäurestränge vorzugsweise durch enzymatische Primerextension, wie zuvor beschrieben, erzeugt und auf dem Träger immobilisiert, wobei die Immobilisierung an statistischen Orten des Trägers oder aber auch ortsspezifisch erfolgen kann. Gegebenenfalls kann an den zu untersuchenden Nukleinsäurestrang noch ein "Sequenzidentifikator", d.h. eine markierte Nukleinsäure bekannter Sequenz, angefügt werden, z.B. durch enzymatische Reaktion mit Ligase oder/und Terminaler Transferase, sodass zu Beginn der Sequenzierung zunächst ein bekanntes Fluoreszenzmuster und anschließend erst das der unbekannten, zu untersuchenden Sequenz entsprechende Fluoreszenzmuster erhalten wird. Insgesamt werden auf einem Träger vorzugsweise 103 bis 1 06 Nukleinsäurestränge immobilisiert. Um die Entfernung abgespaltener Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleotidsträngen zu beschleunigen, wird im Reaktionsraum vorzugsweise ein Konvektionsfluss vom Träger weg erzeugt. Die Flussgeschwindigkeit kann dabei im Bereich von 1 bis 1 0 mm/s liegen.
Die Detektion umfasst ein Einstrahlen von Licht in den Träger, vorzugsweise mittels eines Lasers. Dabei können ein oder mehrere Laserstrahlen, z.B. ein aufgeweiteter Laserstrahl, mit einem Querschnitt von ca. 1 -20 mm oder/und multiple Laserstrahlen verwendet werden. Durch interne Reflexion an einer oder mehreren Positionen der Trägeroberfläche im Bereich von immobilisierten Nukleinsäuremolekülen wird ein evaneszentes Anregungsfeld erzeugt, das eine Anregung der Fluoreszenzmarkierungsgruppen der auf dem Träger immobilisierten Nukleinsäuremoleküle bewirkt. Vorzugsweise ist die Reflexion an der Trägeroberfläche eine totale interne Reflexion.
Die durch evaneszente Anregung erzeugte Fluoreszenzemission mehrerer Nukleinsäurestränge kann parallel unter Verwendung einer Detektormatrix nachgewiesen werden, die beispielsweise eine elektronische Detektormatrix, z.B. eine CCD-Kamera oder eine Avalanche- Fotodiodenmatrix, umfasst. Die Detektion kann derart erfolgen, dass Fluoreszenzanregung und Detektion an allen untersuchten Nukleinsäuresträngen parallel erfolgt. Alternativ dazu kann in mehreren Schritten jeweils ein Teil der Nukleinsäurestränge untersucht werden. Vorzugsweise erfolgt der Nachweis an Fluoreszenzlicht, das im Wesentlichen orthogonal von der Trägeroberfläche abgestrahlt wird.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend
(a) einen zumindest teilweise optisch transparenten Träger, umfassend eine Vielzahl von darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekülen, wobei die Nukleinsäuremoleküle in einzelsträngiger Form vorliegen und mehrere Fluoreszenzmarkierungsgruppen tragen,
(b) einen Reaktionsraum zum fortschreitenden Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen, (c) Mittel zum Anregen von Fluoreszenz durch Einstrahlen von Licht in den Träger und Erzeugen eines evaneszenten Anregungsfeldes durch interne Reflexion an der Trägeroberfläche im Bereich der immobilisierten Nukleinsäuremoleküle und
(d) Mittel zum gleichzeitigen Bestimmen der Basenfolge mehrerer Nukleinsäuremoleküle aufgrund der bei Abspaltung von
Nukleotidbausteinen hervorgerufenen zeitabhängigen Änderung der
Fluoreszenz der Nukleinsäuremoleküle oder/und der abgespaltenen
Nukleotidbausteine.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung können beispielsweise für die Analyse von Genomen und Transkriptomen bzw. für differenzielle Analysen, z.B. Untersuchungen bezüglich des Unterschieds im Genom bzw. Transkriptom einzelner Spezies oder Organismen innerhalb einer Spezies eingesetzt werden.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Figuren erläutert werden.
In Figur 1 ist die schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen optisch transparenten Trägers (2) mit einer Vielzahl von daran immobilisierten einzelsträngigen markierten Nukleinsäuremolekülen (4) gezeigt. Ein Träger mit einer Fläche von 1 bis 2 cm2 kann beispielsweise bis zu 106 Nukleinsäurestränge enthalten.
In Figur 2 ist eine erste Ausführungsform der Erfindung gezeigt, wobei in den optisch transparenten Träger (2) mit darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekülen (4) Anregungslicht (6) von einem aufgeweiteten Laser eingestrahlt wird und nach Reflexion an der Glasoberfläche im Bereich der immobilisierten Nukleinsäuremoleküle (4) wieder aus dem Träger (2) austritt. Durch das evaneszente Anregungsfeld werden die immobilisierten Nukleinsäuremoleküle (4) zur Fluoreszenz angeregt. Das Emissionslicht (8) wird durch eine Optik ( 10) auf einen Detektor ( 1 2) gelenkt.
Bei der in Figur 3A gezeigten Ausführungsform werden durch multiple Reflexionen ( 1 4a, 1 4b, 1 4c) im optisch transparenten Träger (2) evaneszente Anregungsfelder erzeugt. Die evaneszenten Anregungsfelder können z.B. in Form von Streifen (Figur 3B) oder Punkten (Figur 3C) vorliegen.
Alternativ können auch mehrere Foci des Laserlichts, die durch Verwendung einer diffraktiven Optik, wie z.B. in DE 1 01 26 083.0 offenbart, in den Träger eingestrahlt werden.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung erreichbaren Vorteile bestehen insbesondere darin, dass Fluoreszenzanregung und -messung auf verschiedenen Seiten erfolgen. Dies bewirkt eine geringere Hintergrundstrahlung und somit eine höhere Messsensitivität.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines zumindest teilweise optisch transparenten Trägers mit einer Vielzahl von darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekülen, wobei die Nukleinsäuremoleküle mehrere Fluoreszenzmarkierungsgruppen tragen, (b) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen, und gleichzeitiges Bestimmen der Basenfolge mehrerer Nukleinsäuremoleküle aufgrund der bei Abspaltung von Nukleotidbausteinen hervorgerufenen zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenzder Nukleinsäuremoleküle oder/und der abgespaltenen
Nukleotidbausteine, wobei die Fluoreszenz durch Einstrahlen von Licht in den Träger und Erzeugen eines evaneszenten Anregungsfeldes durch interne Reflexion an der Trägeroberfläche im Bereich der immobilisierten Nukleinsäuremoleküle bewirkt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man einen Träger aus Glas, Kunststoffen, Quarz oder eines mehrere dieser Materialien enthaltenden Verbundwerkstoffs verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine totale interne Reflexion an der Trägeroberfläche erzeugt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuremoleküle derart markiert sind, dass mindestens 50 % aller Nukleotidbausteine von einem Basentyp eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe tragen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von einem Basentyp eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe tragen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Abspalten einzelner Nukleotidbausteine durch eine Exonuklease erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass T7 DNA-Polymerase, E.coli Exonuklease I oder E.coli Exonuklease IM verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das evaneszente Feld durch Einstrahlen von Licht mit einem aufgeweiteten Laser erzeugt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das evaneszente Feld an multiplen Bereichen des Trägers durch Einstrahlen multipler Laserstrahlen oder/und durch multiple interne
Reflexionen erzeugt wird.
0. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen der Basenfolge eine Detektion der Fluoreszenzemission mehrerer Nukleinsäurestränge durch eine Detektionsmatrix umfasst.
1 . Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine CCD-Kamera oder eine Avalanche-Fotodiodenmatrix verwendet wird.
2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Fluoreszenzanregung und -detektion an allen untersuchten Nukleinsäuresträngen parallel erfolgt.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass Fluoreszenzanregung und -detektion in mehreren Schritten jeweils an einen Teil der untersuchten Nukleinsäurestränge erfolgt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass während der Bestimmung ein Konvektionsfluss vom Träger weg erzeugt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wenn sie in die Nukleinsäurestränge eingebaut sind, zumindest teilweise gequencht sind, und dass nach Abspaltung die Fluoreszenzintensität erhöht wird.
6. Vorrichtung zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend
(a) einen zumindest teilweise optisch transparenten Träger umfassend eine Vielzahl von darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekülen, wobei die Nukleinsäuremoleküle in e i nzelsträ ng i ger Fo rm vo rl i e ge n u n d meh re re
Fluoreszenzmarkierungsgruppen tragen,
(b) einen Reaktionsraum zum fortschreitenden Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen, (c) Mittel zum Anregen von Fluoreszenz durch Einstrahlen von
Licht in den Träger und Erzeugen eines evaneszenten Anregungsfeldes durch interne Reflexion an der Trägeroberfläche im Bereich der immobilisierten Nukleinsäuremoleküle und (d) Mittel zum gleichzeitigen Bestimmen der Basenfolge mehrerer
Nukleinsäuremoleküle aufgrund der bei Abspaltung von Nukleotidbausteinen hervorgerufenen zeitabhängigen Änderung der Fluoreszenz der Nukleinsäuremoleküle oder/und der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
7. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 1 6 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 5.
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Figur 1
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Figur 2
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Figur 3
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