WO2003050272A2 - Modele de developpement osseux - Google Patents

Modele de developpement osseux Download PDF

Info

Publication number
WO2003050272A2
WO2003050272A2 PCT/FR2002/004251 FR0204251W WO03050272A2 WO 2003050272 A2 WO2003050272 A2 WO 2003050272A2 FR 0204251 W FR0204251 W FR 0204251W WO 03050272 A2 WO03050272 A2 WO 03050272A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
bone
culture
differentiation
culture system
Prior art date
Application number
PCT/FR2002/004251
Other languages
English (en)
Other versions
WO2003050272A3 (fr
Inventor
Michel A. Bandelier
Pierre Denys
Philippe Denormandie
Rosa Sapena
Delphine Lepailleur-Enouf
Tayebeh Youssefian
Original Assignee
Sympathos
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sympathos filed Critical Sympathos
Priority to AU2002366579A priority Critical patent/AU2002366579A1/en
Publication of WO2003050272A2 publication Critical patent/WO2003050272A2/fr
Publication of WO2003050272A3 publication Critical patent/WO2003050272A3/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the cartilage is then resorbed to be replaced on the one hand by the bone, the matrix of which is synthesized by the osteoblasts and consists mainly of type I collagen, and on the other hand by the bone marrow (7).
  • Osteoblasts express the Cbfal gene, have alkaline phosphatase activity, and express the osteocalcin gene.
  • the culture system comprises at least one of the following populations: a set of undifferentiated chondrocytes expressing at least one marker from collagen type II, aggrecans, SOX9; a set of cells representative of the early stages of the formation of cartilage and of the growth plate, expressing at least one marker from Cbfal, alkaline phosphatase, osteocalcin; a set of hypertrophic chondrocytes, expressing at least one factor among type X collagen, MGP, VEGF a set of adipocytes expressing at least one marker among PPAR gamma, C / EBP alpha, G3PDH.
  • the invention relates to the use of cells extracted from a culture system as described above and / or from at least one active substance described above for the preparation of a medicament intended for the treatment of at least one of the following pathologies: - pathology of cartilage, excess bone formation, insufficient or abnormal; cardiovascular diseases involving ossification of the vessels; diseases requiring bone grafts.
  • the invention also relates to a method of therapeutic treatment of these diseases.
  • FIG. 3 PAL activity in situ, cells of the connective envelope on the right, of the osteoma on the right, in cell culture.
  • FIG. 4 Formation of mineralized nodules in culture: osteoma cells, von Kossa staining.
  • FIG. 7 Graphs representing cell proliferation.
  • A cells from the osteoma
  • B cells from the connective envelope of the osteoma.
  • A cells from the osteoma
  • B cells from the conjunctive envelope of the osteoma.
  • the cultures of cells derived from the osteoma represent a mixture of cell populations in which there are cartilage cells and a majority of osteoblastic cells. These cells indeed express the collagen type I gene, characteristic of bone, as well as Cbfal, a transcription factor for osteoblasts. They also exhibit alkaline phosphatase activity and form mineralized nodules in culture.
  • the tissue specimens were, upon excision, placed in a transport medium (Hank's Balanced Sait Solution) at 4 ° C.
  • the explants were cultured two to three hours after the specimens were collected.
  • the tissue fragments were cut into 1 to 2 mm side pieces, placed in 6-well culture dishes, at a rate of 20-25 pieces per well, and each covered with a drop of a drop of fetal serum. of veal, then placed in an incubator in a humid atmosphere, at 37 ° C and 5% CO 2 , for one hour, in order to allow good adhesion of the explants to the bottom of the culture dish.
  • the explants were then covered with the culture medium intended for the explants, namely DMEM + 20% FCS + penicillin / streptomycin.
  • the messenger RNAs were extracted using
  • Trizol (1 ml per well of 24-well dish). These were then reverse transcribed, then the products of this transcription were amplified by chain polymerization (PCR-Polymerase Chain Reaction) using primers
  • Cytochemical labeling of alkaline phosphatase activity was carried out on the wells fixed at 11 days, 21 days and 31 days, using the Sigma 85L1 kit (reaction to napthol phosphate in the presence of Fast Blue BB).
  • the culture medium was collected and the cell layer was washed with PBS, then removed in 0.4 ml of 0.5 M acetic acid.
  • IWAMOTO M., Yagami, K., Shapiro, I. M., Leboy, P. S., Adams, S. L., and Pacifici, M. Retinoic acid acid is a major regulator of chondrocyte maturation and matrix mineralization. Microscop Res Tech 28, 483-491. 1994.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un système de culture de cellules osseuses caractérisé en ce que les cellules osseuses mises en culture sont issues au moins en partie d'un tissu osseux hétérotopique de Para Ostéo Arthropie Neurogène (POAN).

Description

« Modèle de développement osseux »
L'invention concerne un modèle récapitulant les phases successives du développement osseux humain en culture cellulaire. Plus précisément l'invention concerne notamment un système de culture de cellules ostéogéniques, chondrogéniques, d'adipocytes, à partir d'un tissu osseux hétérotopique de Para Ostéo Arthropathie Neurogène (POAN), et un procédé de sélection de composés actifs sur la différenciation de cellules ostéogéniques et/ou d'adipocytes.
Les pathologies liées à la formation de l'os, l'un des constituants majeurs de l'organisme des vertébrés, sont nombreuses et souvent lourdes, et elles font l'objet de nombreuses études. Une part de ces études vise à l'élucidation et au contrôle des phénomènes mis en jeu dans l'ossification. L'objectif est alors le plus souvent de trouver une solution aux problèmes posés par les manques ou les insuffisances de la formation osseuse, par exemple lors de la réparation des fractures, ou de favoriser l'incorporation de greffons osseux, ou de biomatériaux, dans ou sur l'os existant, ou bien encore de favoriser l'ostéogenèse dans des sites où l'os manquerait.
Une autre part s'intéresse aux maladies dégénératives atteignant le squelette, parmi lesquelles on peut citer, sans être exhaustif, lOstéoarthrite, l'arthrose, et bien entendu l'ostéoporose. La dernière part de ces études prend une importance croissante. Elle concerne les processus anormaux de formation osseuse dans des sites de l'organisme où elle ne devrait pas survenir. Les conséquences de telles affections peuvent être anodines, mais le plus souvent elles vont de la gêne fonctionnelle ou esthétique à la mort, comme dans la Fibro Dysplasie Ossifiante Progressive (1) (2) ("Maladie de l'homme de pierre"), en passant par différents types de troubles articulaires, vasculaires et nerveux. Un exemple de l'importance croissante de ces recherches peut être fourni par la découverte du rôle prédictif joué par la minéralisation de la plaque d'athérome dans le pronostic de l'athérosclérose. Il a été découvert que la plupart des gènes impliqués dans la formation osseuse étaient exprimés par les cellules de ces plaques (5) et que des cellules des vaisseaux étaient capables en culture de reproduire les différentes étapes de la formation osseuse in vitro (6).
Dans ce contexte, on s'intéresse tout particulièrement à l'étude et au contrôle du développement du tissu osseux. Aussi bien dans le développement que dans certaines pathologies caractérisées par des formations osseuses ectopiques, différentes étapes précèdent l'ossification proprement dite.
La formation du squelette chez les vertébrés est le résultat d'une succession de phases dont on connaît la chronologie (7) et un bon nombre de marqueurs (8).
Leurs caractéristiques en sont retrouvées dans des relations spatiales commodes à étudier dans la plaque de croissance epiphysaire, qui est le modèle animal de développement osseux le plus largement utilisé.
Au cours du développement, tout commence par la condensation de cellules d'origine mésenchymateuse qui expriment le gène du facteur de transcription Cbfal (9) et une activité phosphatase alcaline. Ces cellules se différencient alors en cellules cartilagineuses. Dans les premières étapes de leur différenciation, ces cellules expriment le gène du collagène de type II, dont le transcrit est traduit en protéine qui s'assemble en dehors de la cellule et se combine à des protéoglycanes de haut poids moléculaire pour former la matrice extracellulaire du cartilage (8). Les agrégats de protéoglycane possèdent des glycosaminoglycanes qui sont hautement sulfurés. Les marqueurs de ces cellules chondrocytiques sont typiquement le collagène de type II alpha 1 (COL2A1), des aggrécanes (AGP), SOX9.
Puis ces cellules s'organisent en colonnes, et poursuivent leur différenciation en devenant des cellules hypertrophiques. Ces chondrocytes hypertrophiques qui expriment notamment le gène du collagène de type X, dont le transcrit est traduit en protéine qui s'assemble en dehors de la cellule, expriment à nouveau celui de Cbfal, exhibent une activité phosphatase alcaline, et se trouvent au sein d'une matrice dont ils permettent la minéralisation. Les marqueurs de ces cellules hypertrophiques incluent également le collagène de type X et la protéine de matrice gla (MGP). Ces chondrocytes hypertrophiques synthétisent alors le facteur de croissance vasculaire endothélial -VEGF - Nascular Endothelial Growth Factor, qui provoque une invasion du cartilage mature par des vaisseaux sanguins (11). Le cartilage est alors résorbé pour être remplacé d'une part par l'os, dont la matrice est synthétisée par les ostéoblastes et constituée principalement de collagène de type I, et d'autre part par la moelle osseuse (7). Les ostéoblastes expriment le gène de Cbfal, ont une activité phosphatase alcaline, et expriment le gène de l'ostéocalcine.
Dans le même temps, des cellules situées à la périphérie de l'ébauche cartilagineuse subissent une différenciation en cellules ostéoblastiques, qui commencent à former un collier osseux métaphysaire.
Pour la plupart de tissus cartilagineux, les chondrocytes sont répartis de manière relativement étendue dans la matrice extra cellulaire ; la mitose se produit mais à un taux faible ; et, le tissu étant essentiellement non vascularisé, il est stable pendant longtemps. Aussi, lorsqu'il y a une altération du tissu, celui ci se répare lentement voir pas du tout. Dans les zones d'interface entre les cartilages et l'os, les chondrocytes continuent à mûrir poursuivant la voie endochondrale. Eventuellement, ils deviennent hypertrophiques, dégradent les agrégats de protéoglycane, et calcifient leur matrice. Ceci se produit à des vitesses variables, en fonction de la zone du tissu, de l'âge de l'animal, et de la présence de maladies ou d'une capacité anormale de différenciation.
Lors du vieillissement, le cartilage devient plus mince dans la zone d'interface entre le cartilage articulaire et l'os subchondral. Dans le cas d'une ostéoarthrite ce phénomène est accéléré. Dans la phase de croissance, les os longs grandissent en longueur du fait d'une prolifération accrue de chondrocytes mais après cette prolifération les cellules entrent au stade hypertrophique de différenciation. Cette transition se produit plus rapidement notamment en cas de fracture ou d'une greffe osseuse.
La plupart des facteurs de croissance connus utilisés pour le traitement du cartilage et de l'os sont utilisés pour leurs capacités à augmenter la formation osseuse soit par augmentation de la différenciation endochondrale soit directement en agissant sur les ostéoblastes. Ces facteurs de croissances ont de multiples effets. En particulier ils stimulent la différenciation des cellules mesenchymateuses. Par exemple le facteur de croissance TGF.beta peut induire la transformation in vitro ou in vivo des cellules mesenchymateuses en cellules du cartilage. Les BMPs induisent la différenciation des cellules mesenchymateuses en chondrocytes in vivo dans des tissus mésenchymateux qui normalement ne conduiraient pas à une formation d'une structure osseuse ou cartilagineuse.
Les facteurs de croissance peuvent également stimuler la différenciation de cellules déjà engagées dans leur différenciation. Par exemple le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF) ou le facteur bFGF n'affectent pas la différenciation des cellules mesenchymateuses en cellules du cartilage ou osseuses in vitro, mais in vivo ces facteurs stimulent l'expression de chondrocytes ou ostéoblastes matures calcifiant. Par exemple, les facteurs IGF, bFGF, TGF, BMP stimulent la différenciation de chondrocytes en cellules hypertrophiques. On comprend que l'action de tels facteurs de croissance est souhaitée pour stimuler la croissance osseuse, mais inversement néfaste dans le cas d'une croissance déjà excessive. Il est donc important de pouvoir identifier de façon précise les mécanismes d'action de tels facteurs, le stade auquel ils sont produits, leur mode d'action, et d'éventuels autres facteurs, pour le traitement de différentes maladies osseuses ou cartilagineuses. Des observations cliniques, combinées à des examens biologiques et physiologiques permettent une première approche de la physiologie et des pathologies, et des mécanismes mis en jeu. Cette approche doit être complétée par des analyses plus fines afin de découvrir les mécanismes cellulaires et moléculaires sur lesquels il pourrait être envisagé d'intervenir. Ces analyses requièrent des modèles.
Un besoin analogue existe pour l'étude de la différenciation d'adipocytes. Il est généralement admis que les cellules souches de moelle osseuse sont des fibroblastes mésenchymateux pluripotents, capables de conduire à des ostéoblastes, des chondrocytes, des adipocytes. Parmi les marqueurs connus d'adipocytes, on citera les facteurs de transcription PPAR gamma (peroxisome proliferator activated receptor gamma), et C/EBP alpha (CCAAT-enhancer binding proteins) impliqués dans la différenciation de pré-adipocytes et l'adipogenèse, ainsi que des facteurs associés à une différenciation tardive d'adipocytes tels que la G3PDH (glycerol 3 phosphate déshydrogénase) (Wu et al, 1999).
La majeure partie des résultats connus de l'homme du métier proviennent de modèles animaux, utilisés à toutes les phases du développement pré- et post-natal. Mais certaines des pathologies d'intérêt, ou des phénomènes qui les causent et/ou les accompagnent, ne sont pas observables chez l'animal, soit parce qu'ils ne s'y produisent pas, soit parce qu'on n'a pas encore trouvé le moyen de les y provoquer. Par ailleurs se pose le problème de l'interpolation à l'homme des résultats obtenus chez l'animal. Si ces modèles ont permis de découvrir les mécanismes mis en jeu, aussi bien aux niveaux biochimiques que génétiques, beaucoup reste à découvrir au sujet des régulations de ces mécanismes ; or, si les structures de la plupart des gènes impliqués sont voisines, c'est précisément au niveau des mécanismes de régulation de l'expression des gènes que subsistent les plus grandes différences entre l'homme et les autres espèces animales. Enfin, une opposition croissante à l'expérimentation animale se développant dans la plupart des pays, qu'elle s'exprime dans des textes réglementaires ou dans l'opinion publique, accentuera le besoin de recourir à des modèles alternatifs à l'expérimentation animale.
On cherche donc à obtenir des cultures cellulaires, alternatives à l'expérimentation animale. Celles-ci peuvent être menées soit à partir de lignées cellulaires, soit de cultures primaires ou issues de primaire. Les lignées cellulaires sont des lignées de cellules transformées, spontanément (cellules cancéreuses) ou artificiellement. Comme telles, elles présentent des différences notables dans la régulation de l'expression de leurs gènes. Les réponses aux différents agents hormonaux, facteurs de croissance et cytokines sont particulièrement altérées. Se pose donc à nouveau un problème d'extrapolation des résultats. Les cultures primaires sont obtenues à partir des tissus par dissociation du tissu, ou par migration. Les cultures issues de primaire (secondaire, tertiaire, à n passages...) sont issues de la multiplication et du passage en cultures subséquentes des populations cellulaires initiales. Qu'elles utilisent des milieux totalement définis ou du commerce, les cultures cellulaires permettent un contrôle fin des paramètres expérimentaux. Mais les cultures de cellules animales ne résolvent pas le problème posé lors de l'interpolation des résultats à l'espèce humaine.
Afin de pallier cet inconvénient, des cultures sont menées à partir de cellules humaines. Les cultures primaires ou issues de primaire chez l'homme sont, dans le domaine d'intérêt de l'invention, des cultures de cellules osseuses ou cartilagineuses obtenues le plus souvent lors de chirurgies orthopédiques. Le plus souvent, les indications de ces chirurgies ont été posées suite à des maladies ou à des traumatismes. Il s'agit donc de cellules issues de tissu déjà osseux. De nombreux travaux ont démontré que ces cellules, cultivées sous les conditions appropriées, exprimaient, selon leur état de différenciation, tout ou partie des gènes impliqués dans l'ossification. Etant donné qu'il est pratiquement impossible, pour des raisons éthiques, d'obtenir des tissus normaux pré-osseux d'embryon ou de foetus humain, ou d'enfant, il n'existait donc pas chez l'humain de modèle de culture dont le point de départ se trouve réellement en amont de la formation osseuse proprement dite.
Les inventeurs, afin de pallier les inconvénients de l'art antérieur, ont cherché à obtenir un modèle de développement osseux représentatif, en utilisant un système bien spécifique de culture de cellules ostéogéniques.
Les inventeurs ont également cherché à obtenir un modèle de développement d'adipocytes.
A cet effet, l'invention concerne selon un premier aspect un système de culture de cellules osseuses, dans lequel les cellules osseuses mises en culture sont issues au moins en partie d'un tissu osseux hétérotopique de Para Ostéo Arthropie Neurogène (PO AN). Selon un mode de réalisation, les cellules osseuses mises en culture sont des cellules d'ostéomes et de tissu conjonctif fibreux entourant l'ostéome.
Selon une réalisation, le système de culture comprend au moins un ensemble de cellules représentant un stade de différenciation des ostéomes qui sont mis en culture. Par ensemble de cellules, on entend au moins une cellule, ces cellules ayant les mêmes caractéristiques essentielles en terme de développement et de différenciation osseuse, se développant par zones plus ou moins éparses et étendues dans le milieu de culture.
Selon une variante, le système de culture comprend un ensemble de cellules osseuses, exprimant le collagène de type I, et un ensemble de cellules ostéoblastiques exprimant au moins un marqueur parmi le Cbfal, l'alkaline phosphatase, l'ostéocalcine. On notera que les marqueurs d'un état de différenciation cités dans la description ne sont pas limitatifs, d'autres marqueurs associés à un stade de différenciation donné peuvent être identifiés et utilisés pour repérer ce stade dans le système de culture. Selon une réalisation, le système de culture comprend au moins une des populations suivantes : un ensemble de chondrocytes non différenciés exprimant au moins un marqueur parmi le collagène de type II, des aggrécanes, SOX9 ; un ensemble de cellules représentatives des premiers stades de la formation du cartilage et de la plaque de croissance, exprimant au moins un marqueur parmi le Cbfal , l'alkaline phosphatase, l'ostéocalcine ; un ensemble de chondrocytes hypertrophiques, exprimant au moins un facteur parmi le collagène de type X, le MGP, le VEGF un ensemble d'adipocytes exprimant au moins un marqueur parmi le PPAR gamma, le C/EBP alpha, la G3PDH.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de détermination du stade de différenciation d'au moins un ensemble de cellules osseuses, comprenant une étape de mesure de l'expression d'au moins un facteur représentatif du stade de différenciation dudit ensemble dans le système de culture décrit précédemment. Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de culture de cellules osseuses comprenant les étapes : - prélèvement d'un tissu de Para Ostéo Arthropie Neurogène (PO AN) ; mise en culture du prélèvement dans un milieu de culture approprié pour la différenciation de cellules du prélèvement, le cas échéant, jusqu'à la formation de zones minéralisées. Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de sélection de substances actives sur le développement et/ou la différenciation de cellules osseuses et/ou d'adipocytes, à au moins un stade de différenciation, comprenant : la préparation d'un système de culture tel que décrit précédemment ; - l'addition d'au moins une substance testée au système de culture, à au moins un stade de différenciation des cellules mises en culture ; la mesure de l'effet de la substance sur le développement et /ou la différenciation des cellules aux différents stades de différenciation.
Selon une réalisation, on teste une seule substance à la fois et, le cas échéant, des dérivés ou analogues de cette substance. Selon une autre réalisation, on teste plusieurs substances simultanément pour étudier des éventuels effets synergiques ou antagonistes sur un ou plusieurs stades de différenciation.
Selon une réalisation, la substance active est une substance régulatrice du développement et/ou de la différenciation des cellules cultivées. De telles substances seront, selon une réalisation, choisies parmi des hormones, des facteurs de croissance et morphogènes, des drogues antiinflammatoires.
Selon une réalisation, la substance active est une substance modulant l'expression de gènes à au moins un stade du développement osseux. De telles substances seront, selon une réalisation, choisies parmi des hormones, des facteurs de croissance et morphogènes, des drogues antiinflammatoires.
Les anti-inflammatoires non stéroïdiens sont utilisés dans la prévention des ParaOstéoArthropathies neurogènes (17). Par ailleurs, il a été montré que l'indométhacine diminue ou supprime la formation osseuse (18).
Les corticoïdes, pour leur part, induisent des réponses différentes selon les populations cellulaires et le système de culture considéré : la dexaméthasone paraît favoriser l'ostéogenèse en culture (19;20) et, selon les cas, inhiber ou favoriser la maturation et la différenciation des chondrocytes en culture (21;22).
Enfin, le puissant morphogène qu'est l'acide rétinoïque montre lui aussi des effets différents dans des études in vitro. Dans certaines expérimentations, il favorise l'ossification enchondrale (23), induit la maturation et la minéralisation des chondrocytes en culture (24-26), alors que, pour d'autres auteurs, il les inhibe (27;28). Ces différences pourraient être dues à l'utilisation de populations cellulaires d'origines différentes : l'acide rétinoïque ail trans induit la différenciation et l'expression du collagène de type I chez des chondrocytes articulaires, et du messager du collagène de type II chez des chondrocytes sternaux (29).
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation de cellules extraites d'un système de culture tel que décrit précédemment et/ou d'au moins une substance active décrite précédemment pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'au moins une des pathologies suivantes : - pathologie du cartilage, d'une formation osseuse en excès, insuffisante ou anormale ; maladies cardio-vasculaires impliquant une ossification des vaisseaux ; maladies requérant des greffes osseuses. L'invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique de ces maladies.
En ce qui concerne plus précisément les récepteurs PPAR, l'invention vise notamment à cribler des ligands capables d'agir sur la synthèse ou l'activité de récepteurs PPAR. On sait que ces récepteurs, lorsqu'ils sont activés par des ligands spécifiques, se lient alors à des " éléments de réponse" (PPRE) localisés dans les promoteurs de nombreux gènes. La liaison des PPAR(s) activés à leurs PPRE stimule l'expression des gènes. Les 3 types de PPAR(s) connus à ce jour sont des récepteurs pour les acides gras alimentaires et certains éicosanoides. Les activateurs du PPARa améliorent le bilan lipidique et réduisent le risque coronaire chez les sujets dont le HDL-cholestérol est faible (gemfibrozil). Ils ralentissent aussi la progression de l'atherome chez les diabétiques de type 2. Des études récentes ont montré que l'activation de PPARa exerce des effets anti inflammatoires, particulièrement sur la paroi des vaisseaux. Elle diminue également la synthèse de facteurs vasoconstricteurs ou prothrombotiques et stimule le retour du cholestérol périphérique vers le foie (transport inverse du cholestérol), limitant ainsi le développement de l'athérosclérose. L'invention vise donc également l'utilisation de ligands de récepteurs PPAR testés sur le modèle obtenu par les inventeurs pour la prévention et le traitement de pathologies cardio-vasculaires. On testera en particulier des ligands déjà connus tels que des acides gras saturés et insaturés (acides palmitique, oléique, linoléique et arachidonique...), des ligands artificiels tels que des médicaments hypohpidémiants de la famille des fibrates.
D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui suit, illustrée par les figures :
- Figure 1 : Plan de la culture, où :
PAL = phosphatase alcaline en biochimie ; PROLIF = prolifération cellulaire ;
MMPs = métalloprotéinases matricielles ; MINERALISATION = coloration Von Kossa ;
PAL in situ = révélation cytochimique de l'activité PAL ;
OCN = extraction de l'ostéocalcine matricielle ; COLLA GENES = extraction des collagènes matriciels ;
SURNAGEANTS = prélèvement des surnageants. - Figure 2 : Activité phosphatase alcaline (PAL) en spectrophotométrie : enveloppe conjonctive à gauche, ostéome à droite en picomole de pnitophénol formé/minute /cellule.
- Figure 3 : Activité PAL in situ, cellules de l'enveloppe conjonctive à droite, de l'ostéome à droite, en culture cellulaire. - Figure 4 : Formation de nodules minéralisés en culture : cellules d'ostéome, coloration de von Kossa.
- Figure 5 : Formation de nodules minéralisés en culture : cellules de l'enveloppe conjonctive, coloration de von Kossa.
- Figure 6 : Gel sur lequel ont migré les produits de RT-PCR de culture secondaire de cellules de l'enveloppe fibreuse. Les pistes à l'extrême gauche et à l'extrême droite (1 et 7) sont celles qui portent les marqueurs de poids moléculaire en paires de bases. La piste 1 est celle de Cbfal, la 2 est celle de l'ostéocalcine, la 3 celle de la chaîne αl du collagène de type II, la 4 celle de la chaîne αl du collagène de type I, la 5 celle de la chaîne αl du collagène de type X, la 6 celle de VEGF, la 7 celle de la phosphatase alcaline.
- Figure 7 : Graphiques représentant la prolifération cellulaire. A : cellules issues de l'ostéome ; B : cellules issues de l'enveloppe conjonctive de l'ostéome.
- Figure 8 : Graphiques représentant l'évolution de l'activité phosphatase alcaline des cellules issues d'ostéome ou de l'enveloppe conjonctive de l'ostéome durant les 56 jours de culture.
PAL : Activité phosphatase alcaline en pmoles de p-nitrophénol formées par minute et par cellule.
A : cellules issues de l'ostéome ; B : cellules issues de l'enveloppe conj oncti ve de l 'ostéome.
EXEMPLES :
I. Validation expérimentale du modèle de culture selon l'invention :
Parmi les pathologies caractérisées par des formations ectopiques d'os, les inventeurs ont particulièrement étudié la Para-Ostéo-Arthropathie Neurogène (POAN).
Les Para-Ostéo-Arthopathies sont des affections au cours desquelles des masses osseuses importantes se forment en regard ou autour des principales articulations (dans l'ordre de fréquence : hanche, genou, coude, épaule), dont elles peuvent bloquer le fonctionnement normal (13). Elles sont susceptibles également de provoquer des compressions des éléments vasculaires et nerveux.
Une forme particulière de ces affections, les POAN, survient à la suite d'atteintes graves du système nerveux central. Compte tenu des données fournies par les observations cliniques de ces affections, ainsi que les observations qu'ils ont effectuées sur des préparations histologiques, les inventeurs ont formé l'hypothèse que les POAN récapitulaient les stades successifs de la formation du squelette telle qu'elle se produit lors du développement foetal puis embryonnaire.
Pour tester cette hypothèse, ils ont extrait les ARNm des deux différents tissus : l'ostéome et le tissu conjonctif entourant l'ostéome. Les transcrits de différents marqueurs exprimés séquentiellement dans les différentes phases du développement y ont été retrouvés. Parallèlement à cette étude, des cultures secondaires de cellules issues de ces deux tissus ont été menées. Ces cultures ont été menées sur 45 ou 56 jours, dans des conditions permettant la minéralisation.
Ces cultures ont fini par former des nodules qui minéralisaient comme indiqué par une coloration de Von Kossa. Par ailleurs, une activité phosphatase alcaline y était présente, présentant un pic à 45 jours de culture.
Enfin, les différents marqueurs indiqués ci-dessus y ont été retrouvés. L'expression du gène du collagène X dans les cultures de cellules de tissu fibreux augmente avec le temps, avec un maximum au moment de la minéralisation. L'ensemble de ces éléments a permis de conclure qu'un modèle complet du développement osseux est obtenu grâce à ces cultures.
En conclusion, les cultures de cellules du tissu fibreux seraient un mélange de populations de cellules cartilagineuses aux différents stades de maturation, qui, avec le temps de culture, verrait les moins différenciées continuer leur cycle de maturation vers les chondrocytes hypertrophiques, comme le montre l'augmentation de l'expression du gène de collagène de type X. En effet ces cellules en culture expriment le collagène de type II, caractéristique des chondrocytes - cellules cartilagineuses - non différenciées, ainsi que le Cbfal, facteur de transcription spécifique des premiers stades de la formation du cartilage de la plaque de croissance. Elles expriment également les facteurs de transcription du collagène de type X et du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), caractéristiques des chondrocytes hypertrophiques (cellules cartilagineuses terminalement différenciées dont l'apparition précède la formation de l'os, et qui se trouvent au sein d'une matrice minéralisée).
Les cultures de cellules issues de l'ostéome représentent un mélange de populations cellulaires dans lesquelles on trouve des cellules cartilagineuses et une majorité de cellules ostéoblastiques. Ces cellules expriment en effet le gène du collagène de type I, caractéristique de l'os, ainsi que de Cbfal, facteur de transcription des ostéoblastes. Elles exhibent par ailleurs une activité phosphatase alcaline et forment en culture des nodules minéralisés.
Il s'agit donc bien d'un modèle de développement osseux.
1. 1. Matériels et méthodes :
a) Cultures cellulaires : Les spécimens utilisés proviennent des chirurgies d'exérèse des ostéomes matures. Il s'agit de fragments de l'ostéome et du tissu conjonctif plus ou moins fibreux enrobant la partie minéralisée des POAN.
Les spécimens de tissu ont été, dès leur excision, placés dans un milieu de transport (Hank's Balanced Sait Solution) à 4°C. La mise en culture des explants survenait deux à trois heures après la collecte des spécimens. Les fragments de tissus ont été coupés en morceaux de 1 à 2 mm de côté, placés dans des boites de culture 6 puits, à raison de 20-25 morceaux par puits, et recouverts chacun d'une goutte d'une goutte de sérum foetal de veau, puis placés dans un incubateur en atmosphère humide, à 37°C et 5% CO2, pendant une heure, afin de permettre une bonne adhésion des explants au fond de la boite de culture. Puis les explants ont été recouverts du milieu de culture destiné aux explants, à savoir DMEM + 20% SVF + pénicilline/streptomycine. Le milieu de culture a été changé deux fois par semaine. Lorsque les cellules issues des explants avaient recouvert le fond du puits de culture, les explants ont été retirés, les cellules décollées à l'aide de trypsine, comptées, et ensemencées dans des boites de culture de 24 puits à raison de 2000 cellules par puits dans un milieu dit "de minéralisation" constitué de DMEM, 10% SVF, béta-glycérophosphate, L-acide ascorbique, pénicilline/streptomycine. Le milieu de culture a été changé deux fois par semaine.
À 10 jours, 20 jours, 30 jours, et 44 ou 55 jours, le milieu de culture dit "de minéralisation" a été remplacé pour 24 heures par du DMEM sans sérum foetal de veau, et à la fin de ces 24 heures, différentes opérations ont été réalisées dans les différents puits de culture (figure 1).
Dans certains puits, les cellules ont été comptées, puis lysées. Le lysat a été centrifugé, le surnageant congelé, décongelé, et l'activité phosphatase alcaline mesurée en spectrophotométrie à 405 nanomètres grâce à la réaction au p- nitrophénol phosphate. Sur d'autres puits, a été effectué soit un marquage cytochimique de l'activité phosphatase alcaline à l'aide de napthol phosphate et de Fast Blue BB, soit une coloration de Von Kossa identifiant les zones minéralisées.
Dans d'autres puits encore, les ARN messagers ont été extraits à l'aide de
Trizol (1 ml par puits de boîte de 24 puits). Ceux-ci ont alors subi une reverse transcription, puis les produits de cette transcription ont été amplifiés par polymérisation en chaîne (PCR-Polymerase Chain Reaction) à l'aide des amorces
(primers) appropriées à chacun des marqueurs précités.
b) Activité phosphatase alcaline : Les cellules ont été lysées à l'aide d'un tampon Tris lOmM, ImM MgCl2,
20μM ZnCl2, 0,02%(v/v) NaN3, 0,1% Triton XI 00. Le lysat a été centrifugé, le surnageant congelé, décongelé, et l'activité phosphatase alcaline mesurée sur le surnageant en spectrophotométrie à 405 nanomètres grâce à la réaction au p- nitrophénol phosphate. A cet effet, une quantité de surnageant correspondant à 5000 cellules a été incubée 10 minutes à 37°C en présence de p-nitro-phényl-phosphate (pnPP, Sigma) dans un tampon AMP (2-amino-2-méthyl-l-propanol) 0,5M pH 10 enrichi en MgCl 2mM (Sabobkar, A., et al., 1994, A rapid, quantitative assay for measuring alkaline phosphatase activity in osteoblastic cells in vitro, Bone Miner 27; 57-67). La réaction a été conduite dans des microplaques 96 puits et la densité optique du produit de la réaction a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre Microplate Reader Model 550 BioRad. Les résultats sont exprimés en pmoles de pnPP hydolysées par minute et par cellule. L'étude des cinétiques d'inactivation de l'enzyme par la chaleur et le lévamizole a permis de vérifier qu'il s'agit bien de l'isoforme de l'enzyme que l'on doit trouver dans les tissus osseux (15) (Nefussi, J.R., et al., 1985, Mineralization in vitro of matrix formed by osteoblasts isolated by collagenase digestion Differentiation 29; 160-168).
Un marquage cytochimique de l'activité phosphatase alcaline a été réalisé sur les puits fixés à 11 jours, 21 jours et 31 jours, à l'aide du kit Sigma 85L1 (réaction au napthol phosphate en présence de Fast Blue BB).
c) Essais de collagène :
A l'issue des périodes de culture, le milieu de culture a été collecté et la couche de cellule a été lavée avec du PBS, puis retirée dans 0, 4 ml d'acide acétique 0,5 M.
Les collagènes ont été obtenus des échantillons à l'aide d'une digestion limitée par la pepsine, dans de l'acide acétique 0,5 M pendant 16 heures à 4°C. Les solutions d'extraction ont été centrifugées à 21460 g pendant une heure et demi, et les surnageants contenant le collagène dissous ont été conservés à 4°C pendant 24 heures en présence de NaCl 1M, de manière à précipiter le complexe de collagène.
Ensuite, le complexe de collagène a été collecté par centrifugation.
La présence de collagène de type I dans le milieu de culture ou dans les échantillons d'extraction a été détectée par ELISA (Chondrex Kits).
La présence de collagène de type II et X dans le milieu de culture ou dans les échantillons d'extraction a été analysée à l'aide d'une électrophorèse avec gel de polyacrylamide (PAGE), en présence de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) selon la méthode de Laemmli, en utilisant un gel à 4 % ou un gel de séparation à 8 %. Les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose. Un anticorps non spécifique de liaison a été bloqué en utilisant du lait en poudre écrémé à 5 %> dans du PBS. La membrane a été incubée en présence d'un anti-corps monoclonal de souris, de collagène de type 2 (Microm, MS-235-PO, 200 μg/ml), ou d'un anticorps polyclonal de lapin, de collagène de type 10 (Calbiochem, 234196), dilué à 1/100 dans du tween PBS contenant 1 % BSA. Enfin, la membrane a été mise en présence de peroxidase-IgG conjugué (Bio-rad, 170-8237 et 170-8236 respectivement), dilué l/3000ème dans du tween PBS contenant 1% BSA, puis exposée à du H2O2 et du diaminobenzidine pour l'étude colorimétrique.
d) Minéralisation :
La présence de minéralisation à la fin de la culture (45 ou 56 jours) a été révélée grâce à une coloration de Von Kossa (application d'une solution aqueuse de nitrate d'argent à 5% une demi heure à l'abri de la lumière, rinçage à l'eau distillée, puis exposition aux TJV jusqu'à l'apparition de la coloration brun-noir caractéristique).
e) Biologie moléculaire : 1) Extraction des ARN totaux à partir de cellules
Les cellules de l'enveloppe conjonctive de l'ostéome ont été récupérées dans 1 ml de TRIzol Reagent (Gibco BRL). Puis 200 μl de chloroforme ont été ajoutés. Le tout a été agité pendant 15 secondes et mis à incuber à température ambiante pendant 2 à 3 minutes. Après centrifugation (15 minutes, 4°C, 12000g), l'ADN et les protéines restent dans la phase inférieure tandis que les ARN sont contenus dans la phase aqueuse supérieure. Cette phase a été délicatement reprise, traitée par 0.5 ml d'isopropanol 100% et mise à précipiter (10 minutes, 4°C, 12000g), ce culot a été décanté, séché (bain à sec 65°C), puis resuspendu dans 15 à 20 μl d'eau stérile. La qualité et la pureté des ARN ont été contrôlées par électrophorèse sur gel d'agarose 0.7% et leur concentration a été estimée par la densité optique mesurée par spectrophotométrie (260 nm). 2) Extraction des ARN totaux à partir du tissu
L'enveloppe conjonctive de l'ostéome a été congelée dans de l'azote liquide. Ce tissu a été broyé en fine poudre (Cryobroyeur à azote liquide, Certi Prep 6750) et 50-100 mg de poudre ont été homogénéisés dans 1 ml de TRIzol Reagent (Polytron). Après centrifugation de cet homogénat à 12000g pendant 10 minutes à 4°C, les échantillons ont été traités selon le protocole extraction des ARN totaux à partir de cellules, à l'exception près que la précipitation des ARN a été effectuée dans 0.25 ml d'isopropanol et 0.25 ml d'une solution 0.8 M de sodium citrate et 1.2 M de NaCl. 3) RT-PCR
L'expression des ARNm de l'ostéocalcine, du collagène de type I, de type II et de type X, de Cbfal -osf2 et du VEGF a été estimée grâce à une amplification en chaîne par une Taq ADN polymérase (Gibco BRL) après transcription inverse. Les ARNm ont été trancrits en ADN complémentaire par action d'une trancriptase inverse (M-MLV, Gibco BRL) en présence d'oligonucléotides poly-dT dans un volume final de 18 μl. 3 μl de la solution contenant l'ADN complémentaire ont été amplifiés par action d'une Taq ADN polymérase avec des amorces spécifiques des gènes de l'ostéocalcine, du collagène de type II et de type X, de Cbfal/osf2 et du VEGF. ostéocalcine, amorce sens : 5'-GGCAGCGAGGTAGTGAAGAG-3'
(SEQ ID N°1) ; amorce antisens : 5'-GGGAAGAGGAAAGAAGGGTG-3' (SEQ ID N°2); phosphatase alcaline, amorce sens : 5'- TGGGAGATGGGATGGGTGTC- 3'(SEQ ID N°3) ; amorce antisens : 5'- GGGTCAAGGGTCAGGAGTTC-3' (SEQ ID N°4) ; collagène de type I, amorce sens : 5'-CACCCACCGACCAAGAAACC-3' (SEQ ID N°5) ; amorce antisens : 5'-ATCCAAACCACTGAAACCTC-3' ( SEQ ID N°6); collagène de type II, amorce sens : 5'-TGGAGACTGGCGAGACTTGC-3' (SEQ ID N°7) ; amorce antisens : 5'-AATGATGGGGAGGCGTGAGG-3' (SEQ ID N°8); collagène de type X, amorce sens : 5'-GACACATTCTTCATTCCCT-3' (SEQ ID N°9) ; amorce antisens 5'-CCATTTTCACCTCTTTTTTCC-3' (SEQ ID N° 10); Cbfal, amorce sens : 5'-CTTCATTCGCCTCACAAACA-3'(SEQ ID N°l 1) ; amorce antisens : 5'-TGATGCCATAGTCCCTCCTT-3' (SEQ ID N°12);
VEGF, amorce sens : 5'-CCATGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3' (SEQ ID N°13) ; amorce antisens : 5'-CTCACCGCCTCGGCTTGTCAC-3' (SEQ ID N°14). Le milieu d'amplification contenait 10 mM de dNTP, du tampon PCR IX (10 mM de Tris HC1, pH8.3, 50 mM KC1), 1.5 mM de MgC12 et 1.25 U de Taq DNA polymérase (Gibco BRL). Les échantillons ont été incubés dans un thermocycleur (icycler, BIO RAD). Une étude préliminaire a permis de déterminer la quantité d'ARN transcrite pour obtenir un signal sur gel soit 500 ng d'ARN. Chaque cycle d'amplification était composé de 30 secondes de dénaturation à 95°C, d'une minute d'hybridation des amorces à 55°C pour les collagènes de type II et X et Cbfal/osf2, 58°C pour la G3PDH, 60°C pour l'ostéocalcine, l'ALP, le Cbfal, le COL1A1, l'AGC, le C/EBP alpha, le MGP, le PPAR gamma et le VEGF, et d'une minute à 72°C pour l'amplification. Les fragments amplifiés ont été séparés par une électrophorèse sur gel d'agarose à 1% et visualisés après incubation dans du bromure d'éthidium. La luminescence du bromure d'éthidium, qui correspond à l'amplification de chaque gène spécifique, a été intégrée par le Gel Doc 1000 System (BIO RAD) et est exprimée par nombre de pixels.
I. 2. RESULTATS
Les cellules issues des deux types de tissus ont proliféré en culture, puis ont fini par former des condensations cellulaires. Ces condensations, en forme de nodule dans les cultures d'ostéome, davantage polymorphes dans les cultures de l'enveloppe de l'ostéome, minéralisaient à partir de 45 jours de culture.
Une activité phosphatase alcaline était présente dans les cultures et révélée aussi bien par marquage de cette activité in situ que par mesure en spectrophotométri e . U est à noter que la minéralisation, qui s'effectue au sein des nodules formés par les cellules dans les cultures d'ostéome, prenait une forme composite dans les cultures d'enveloppe : elle était par endroits diffuse, bien que forte, et apparaissait également au sein de nodules cellulaires qui semblaient isolés de la couche cellulaire environnante. Les transcrits cités plus haut comme marqueurs des différents tissus retrouvés dans le processus d'ossification étaient retrouvés aussi bien dans les cultures primaires que dans les cultures issues de primaires.
Plus précisément, les principaux résultats ci-dessus s'analysent de la manière suivante. a) Cultures de cellules
Les cellules issues d'expiants d'ostéomes ont été cultivées dans du milieu MEM additionné de 20%FBS jusqu'à atteindre la confluence après 4 à 6 semaines de culture. Des cultures secondaires se sont développées dans du milieu MEM additionné de 10%FBS, 7 mM Beta-glycérophosphate et 50μg/ml d'acide ascorbique L. Les cellules se multipliaient environ 100 fois pendant les 56 jours de culture, et le premier doublement avait lieu dans les trois premiers jours. La morphologie des cellules était visible en microscopie, trois types cellulaires étant observés : des cellules allongées, des cellules larges et des cellules en forme d'étoile. Après 20 jours, la confluence était atteinte sur une couche, puis plusieurs couches étaient obtenues, formant des nodules.
b) Résultats histochimiques
La couche de cellules présentait un marquage positif à l'alcaline phosphatase après 31 jours de culture. Après 56 jours de culture, des dépôts noir argent étaient obtenus dans la couche cellulaire après marquage au Von Kossa, révélant un dépôt minéral extra cellulaire. La représentation morphologique de la minéralisation indiquait de petits nodules minéralisés.
c) Expression des marqueurs Les cellules ostéomes exprimaient, après 11 jours de culture : des marqueurs de la lignée ostéoblastique : ALP, collagène de type I (COL1A1), ostéocalcine en quantité étonnamment importante, Cbfal, VEGF ; des marqueurs cartilage-spécifiques de la transcription tels que SOX9 ; des marqueurs précoces et tardifs de la lignée des chondrocytes tels que le MGP, l'AGC le collagène de type X alpha 1 (COL10A1), le collagène de type II alpha 1 (COL2A1).
De plus, les transcrits de différents marqueurs caractéristiques de la lignée des adipocytes étaient retrouvés après 11 jours de culture : C/EBPalpha, G3PDH
d) Résultats biochimiques
1) Caractérisation de l'alkaline phosphatase.
Comme indiqué sur la figure 4, les cellules dérivées d'ostéomes présentaient une activité phosphatase alcaline. On a observé une forte variation de l'activité phosphatase alcaline des ostéomes dérivés de cellules de différents patients. Le niveau moyen d'activité alcaline phosphatase de 14 cultures augmentait jusqu'au 21eme jour jusqu'à une valeur de 0,1 pmole de p-nitrophenol par minute et par cellule, puis restait relativement constant. Néanmoins, pour chaque spécimen, le niveau d'alcaline phosphatase augmentait jusqu'au Heme jour, avec un pic d'inactivation, se produisant aux jours 21, 31 ou plus tard. Plus de 90 % de l'activité alcaline phosphatase des lysats cellulaires d'ostéomes était perdue lorsque les incubations étaient effectuées en présence de 1 mM de lévamisole. L'alcaline phosphatase était thermolabile à 56 °C. L'activité alcaline phosphatase du lysat cellulaire diminuait de 50 % par rapport au niveau initial de base après 30 minutes de préincubation à 56 °C puis tombait jusqu'à moins de 20 % du niveau initial de base après 60 minutes de préincubation.
2) Essais de caractérisation du collagène et de l'ostéocalcine.
Les collagènes produits par les cellules dérivées d'ostéomes ont été caractérisés par ELISA (Collagène de type 1) ou Western blot (Collagène de type 2 et 10). L'examen de collagène de type 1 par ELISA, et des collagènes de type 2 et 10 par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS et immunomarquage, à l'aide d'anti- corps spécifiques, a indiqué leur présence dans la couche cellulaire ainsi que dans le milieu de culture après 56 jours de culture. On a constaté la diminution des collagènes de type 1 sécrétés dans le milieu, parallèlement à l'augmentation de l'accumulation de collagène.
1 .3. Avantages du modèle de culture selon l'invention :
A la lumière des résultats ci-dessus, le modèle obtenu par les inventeurs présente de nombreux avantages.
Ce modèle permet l'étude fondamentale du développement osseux, ainsi que des interactions cellulaires et tissulaires qui le contrôlent. Il permet d'aborder enfin directement chez l'homme l'étude des éléments qui président à la détermination des cellules dans la voie de la formation du cartilage, puis de l'os, afin de maîtriser les processus de formation osseuse et cartilagineuse par des voies nouvelles et, à l'inverse, d'empêcher les formations indésirables. Ce modèle permet d'évaluer l'effet de toute substance sur l'expression des gènes de chacune des phases du développement osseux, et sur les éléments qui en orchestrent la régulation, et d'identifier et de contrôler les processus régulateurs du développement osseux. Cet enjeu apparaît comme encore plus important au moment où élargissant son horizon au delà de la traumatologie, la médecine considère comme un objectif maintenant possible le traitement curatif des maladies ostéoarticulaires dégénératives et des anomalies génétiques du développement osseux embryonnaire ou post embryonnaire. L'intérêt émergent pour les maladies orphelines telles que la terrible Dysplasie Ossifiante Progressive souligne la volonté de la recherche de pénétrer le plus en amont possible des phénomènes observés. La maîtrise du modèle permet d'effectuer la mise au point de traitements pour diverses maladies ou anomalies, qu'il s'agisse d'influer : sur les formations osseuses en excès : « trop d'os » : ankyloses, réparations osseuses vicieuses, Para-Osteo-Arthropathies Neurogènes (POAN) ; sur les insuffisances de formation osseuse : « manque d'os », chirurgie des prothèses et complications post-opératoires afférentes ; sur les pathologies touchant le cartilage ; sur les reconstructions maxillaires et bucco-dentaire ; - sur un grand nombre d'affections voisines, impliquant des formations osseuses anormales :
- d'origine traumatique
- d'origine génétique (maladie de l'homme de pierre)
- associées à diverses maladies générales d'origine infectieuse (tétanos, poliomyélite et autres infections) sur certaines maladies cardio-vasculaires qui présentent une ossification des artères, telles que celles trouvées dans les cas d'athérosclérose, première cause de mortalité dans les pays développés.
De plus, la culture de cellules issues de POA permet d'obtenir des cellules osseuses stables utilisables pour les applications ci-dessus. En effet, les différentes formes d'ossifications hétérotopiques, et plus particulièrement parmi celles-ci les POA constituent les seules circonstances où l'os obtenu se maintient quelles que soient les conditions : toutes les formes d'os obtenues par induction, par exemple à l'aide de protéine morphogénique osseuse -BMP, Bone Moφhogenetic Protein - recombinante sont résorbées dans le temps dès que disparaît l'agent inducteur ou le stimulus mécanique approprié. Le modèle développé par les inventeurs permet en outre de mieux comprendre les processus permettant le maintien de l'os obtenu, et d'obtenir la prévention, ou l'arrêt des maladies osseuses dégénératives. Comme indiqué plus haut, la progression séquentielle des étapes inclut la prolifération des cellules, leur hypertrophie, l'invasion vasculaire, la mort cellulaire des chondrocytes hypertrophiques (ou leur transdifférenciation), la minéralisation de la matrice extracellulaire, et le remplacement du cartilage par l'os et la moelle. Ainsi, les chondrocytes représentent une part importante de l'ossification enchondrale. La moφhogenèse du cartilage est le point clé du développement de l'os du squelette, et de la plupart des formations osseuses ectopiques, mais malheureusement le phénotype cartilagineux est éphémère dans les épiphyses, et sauf à envisager de prélever un fragment de membre chez un embryon ou une jeune enfant, ou encore un cal de fracture chez un adulte, ce qui est éthiquement inconcevable, ces phénomènes ne peuvent être étudiés chez l'homme. Dans les POA, une part des tissus apparaît "figée" aux différentes étapes du développement osseux. Le modèle permet ainsi l'étude des mécanismes qui contrôlent la progression de la maturation des tissus. Il est possible désormais par exemple d'étudier la possibilité d'empêcher le remplacement du cartilage par de l'os, comme dans l'arthrose, ou bien encore de bloquer la voie de différenciation des cellules vasculaires dans les plaques d'athérome.
De plus, les résultats décrits supra (voir 1.2, ci-dessus) permettent de généraliser l'étude des phénomènes mis en jeu à d'autres modèles pathologiques, notamment ceux liés aux vaisseaux. Les observations déjà effectuées permettent de postuler l'existence d'une étroite relation entre les phénomènes étudiés et un développement particulier de la micro circulation. On peut ainsi disposer d'un modèle supplémentaire dédié à l'étude de processus mis en jeu dans la vascularisation. Les études effectuées sur le cartilage ont en effet depuis longtemps fourni des résultats importants concernant le contrôle de l'angiogenèse.
Compte tenu du lien étroit entre l'athérosclérose et la formation osseuse, le modèle obtenu sera également utile pour ces études.
Le modèle sera également utile pour étudier chez l'homme le lien des pathologies sources du modèle obtenu avec les lésions du système nerveux central permet d'étudier les relations entre le développement osseux et le développement du système nerveux. De telles études dans des modèles animaux ont montré que des neuromédiateurs étaient capables d'exercer des actions variées sur la formation osseuse.
I Réponse du modèle selon l'invention à différents agents :
La réponse du modèle de culture objet de l'invention a été testée vis-à-vis de trois agents, à savoir l'indométhacine, la dexaméthasone et l'acide rétinoïque. II.l Matériels et méthodes :
a) Cultures cellulaires :
Le protocole décrit dans la partie I.l.a) précédente a été suivi jusqu'après l'adhésion.
Lorsque les cellules issues des explants avaient recouvert le fond du puits de culture, les explants ont été retirés, les cellules ont été décollées à l'aide de trypsine puis comptées. Des boîtes de culture de 6 puits ont été ensemencées à raison de 10000 cellules par puits dans un milieu dit "de minéralisation" constitué de DMEM, 10%o SVF, 5 mM β-glycérophosphate, 50 μg/ml L- acide ascorbique, pénicilline/streptomycine en présence des agents à étudier (dexaméthasone 0.1 μM, indométhacine 1.4 μg/ml ou acide rétinoïque 0.5 μM). Le milieu de culture a été changé deux fois par semaine.
À 11 jours, 21 jours, 31 jours, 41 jours et 56 jours, les différents prélèvements ont été effectués. Dans certains puits, les cellules ont été décollées, comptées, puis lysées, afin de permettre la mesure de l'activité phosphatase alcaline. Sur d'autres puits, les ARN messagers ont été extraits. b) Activité phosphatase alcaline :
Les cellules ont été lysées à l'aide d'un tampon Tris 10 mM, MgCl2 1 mM,
ZnCl2 20 μM, NaN3 0,02 % (v/v), Triton XI 00 0,1 % et de 2 cycles de congélation/décongélation. L'activité phosphatase alcaline du lysat cellulaire a été mesurée par spectrophotométrie à 405 nm grâce au suivi de la formation de p- nitrophénol. A cet effet, une quantité de lysat cellulaire correspondant à 5000 cellules a été incubée 30 minutes à 37°C en présence de p-nitro-phényl-phosphate (pNPP,
Sigma) dans un tampon AMP (2-amino-2-méthyl-l-propanol) 0,5 M pH 10 enrichi en MgCl2 2 mM. La réaction a été conduite et la densité optique du produit de la réaction mesurée comme indiqué dans la partie 1.1.b) ci-dessus.
c) Biologie moléculaire :
- L'extraction des ARN totaux à partir de cellules a été effectuée dans les conditions décrites dans la partie I.l .e).2 .
- RT-PCR en temps réel. L'expression des ARNm des collagènes de type II alpha 1 (COL2A1), de type X alpha 1 (COLlOAl) et de type I alpha 1 (COLIAI) et de CBFA1 dans les cellules en culture issues de l'enveloppe conjonctive de l'ostéome a été estimée grâce à une amplification en chaîne en temps réel après transcription inverse. 500 ng d'ARNm ont été transcrits en ADN complémentaire par action d'une transcriptase inverse (M-MLV, Gibco BRL) en présence d'oligonucléotides poly-dT dans un volume final de 18 μl. Les ADN complémentaires ont ensuite été dilués au dixième et amplifiés par action d'une iTaq ADN polymérase avec des amorces spécifiques des gènes des collagènes de type II alpha 1 (COL2A1), de type X alpha 1 (COLlOAl) et de type I alpha 1 (COLIAI), de CBFA1 et de GAPDH (COL2A1, amorce sens : 5'-GAGCAGCAAGAGCAAGGAGAAG-3' (SEQ ID N°15), amorce antisens : 5'- TGGACAGCAGGCGTAGGAAG-3' ( SEQ ID N°16); COLlOAl, amorce sens : 5'-GCAGTAAGAGGAGAGCAAGG-3' (SEQ ID N°17), amorce antisens : 5'- TCCAGGACTTCCGTAGCC-3' (SEQ ID N°18) ; COLIAI, amorce sens : 5'- GTGAACCTGGTGCTCCTG-3' (SEQ ID N°19), amorce antisens : 5'- CCTCGCTTTCCTTCCTCTC-3' (SEQ ID N°20); CBFA1, amorce sens : 5'- CGGAATGCCTCTGCTGTTAT-3' (SEQ ID N°21), amorce antisens : 5'TTCCCGAGGTCCATCTACTG-3' (SEQ ID N°22); GAPDH, amorce sens : 5'- CATGTTCCAATATGATTCCAC-3' (SEQ ID N°23), amorce antisens : 5'- CCTGGAAGATGGTGATG-3' (SEQ ID N°24). Le milieu d'amplification contenait 50 mM KC1, 20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 0.2 mM de chaque dNTP (dATP, dCTP, dGTP et dTTP), 25 unités/ml de iTaq DNA polymérase, 3mM MgCl2, SYBR Green I et 20 nM de fluorescein. Les échantillons ont été incubés dans un thermocycleur i-cycler iQ (Biorad). Chaque cycle d'amplification était composé de 30 secondes de dénaturation à 95°C, de 30 secondes d'extension à 55°C . La valeur Ct pour chaque réaction reflète le nombre de cycles nécessaire pour détecter le gène cible. Le gène de la GAPDH a été utilisé pour normaliser la quantité d'ARN utilisée. ΔCt correspond à la différence de Ct entre l'échantillon traité et l'échantillon contrôle. Le ΔΔCt est la différence entre le ΔCt de l'échantillon traité et celui de l'échantillon contrôle. La quantité relative d'expression des gènes est exprimée en 2"ΔΔ '.
II.2. Résultats :
a) Biologie moléculaire
La dexaméthasone à 0.1 μM induisait de manière significative une diminution d'expression des transcrits du collagène de type II à 11 (51.7% versus 100%), p = 0.0036) et 21 jours (37.5% versus 100%, p = 0.0232) et du collagène de type X à 11 jours de culture (10.6% versus 100%>, p = 0.0003). Une diminution d'expression non significative des messagers du collagène de type I était observée à 1 1 (69%> versus 100%, p = 0.232) et 21 jours de culture (41.7% versus 100%o, p = 0.0552).
L'indométhacine à 1.4 μg/ml diminuait l'expression du messager du collagène de type X à 11 jours de culture (71.2% versus 100%, p = 0.0009).
Aucune modification significative d'expression des messagers étudiés n'était observée quand les cellules issues de l'enveloppe conjonctive de l'ostéome étaient incubées en présence d'acide rétinoïque à 0.5 μM. Cependant une augmentation d'expression proche de la significativité des transcrits du collagène de type était constatée à 11 jours de culture (163% versus 100%), p = 0.0864).
b) Prolifération cellulaire :
Aucune modification significative de la prolifération cellulaire n'a été observée après traitement des cellules issues de l'ostéome ou de l'enveloppe conjonctive de l'ostéome par la dexaméthasone 0.1 μM, l'indométhacine 1.4 μg/ml ou l'acide rétinoïque 0.5 μM.
c) Activité phosphatase alcaline :
La dexaméthasone à 0.1 μM induisait de manière significative une augmentation de l'activité phosphatase alcaline des cellules issues d'ostéome à 1 1 (p = 0.0039), 21 (p = 0.0098) et 31 (p = 0.0352) jours de culture et des cellules issues de l'enveloppe conjonctive de l'ostéome à 1 1 (p < 0.0001) et 21 (p = 0.0013) jours de culture.
Aucune modification significative de l'activité phosphatase alcaline n'était détectée quand les cellules issues d'ostéome ou de l'enveloppe conjonctive de l'ostéome étaient traitées par l'indométhacine à 1.4 μg/ml.
L'acide rétinoïque à 0.5 μM induisait une diminution significative de l'activité phosphatase alcaline des cellules issues d'ostéome à 21 jours de culture (p = 0.0026).
Le tableau I ci-dessous dresse le bilan des résultats obtenus. En particulier, ce tableau montre l'effet de la dexaméthasone (0.1 μM), de l'indométhacine (1.4 μg/ml) et de l'acide rétinoïque (0.5 μM) sur l'expression des ARNm des collagènes de type II alpha 1 (COL2A1), de type X alpha 1 (COLlOAl) et de type I alpha 1 (COLIAI) et de CBFAl dans les cellules en culture issues de l'enveloppe conjonctive de l'ostéome à 11 et 21 jours.
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0002
Figure imgf000030_0003
p < 0.05 versus valeur contrôle 100%>. Bibliographie
1) KAPLAN F.S., GANNON F.H., HAHN G.V., WOLLNER N., PRAUNER R. Pseudomalignant heterotopic ossification, Clin. Orthop. Rel. Res. 1998; 346: 134- 140
2) COHEN R.B., HAHN G.V., TABAS J.A., PEEPERS J., LEVITZ CL, SANDO A., SANDO N., ZASLOFF M., KAPLAN F.S, The natural history of heterotopic ossification in patients who hâve ibrodysplasia Ossificans Progressiva, J. Bone Joint Surg. 1193;75-A:215-219 3) DEJERINE A., CELLIER A.,Para-Ostéo-Arthropathies des paraplégiques par lésion médullaire, Annales de Médecine 5;497-535
4) DELLA SANTA D.R., REUST P., Para-ostéoarthropathies et syndrome compressif du nerf cubital au coude, Ann. Chir. Main Membre Sup. 1990; 9:38-41
5) SHANAHAN CM., CARY N.R.B., METCALFE J.C., WEISSBERG P.L., High expression of gènes for calcification-regulating proteins in human atherosclerofic plaques, J. Clin. Invest. 1994; 93:2393-2402
6) SCHOR A.M., ALLEN T.D., CANFIELD A.E., SLOAN P., SCHOR S.L.,Pericytes derived from the retinal microvasculature undergo calcification in vitro, J. Cell. Sci. 1990; 97:449-461 7) CAPLAN A.I., bone developmentin Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissues, Ciba Foundation Symposium n°136, J Wiley & Sons, pp 3-21
8) SCUTT A., MAYER H. & WINGENDER E., new perspectives in the differentiation of bone forming cells, Biofactors 1992;4:1-13
9) KOMORI K., KISHIMOTO T., Cbfal in bone development, Curr. Op. Gen. Develop. 1998; 8:494-499
11) GERBER H.P., VU T.H., RYAN A.M., KOWALSKI J., WERB Z., FERRARA N., VEGF couples hypertrophie cartilage remodeling, ossification, and angiogenesis during endochondral bone formation, Nature Med. 1999;5:623-628 12) BERESFORD J.N., GRAVES S.E., SMOOTHY C.A., Formation of mineralized nodules by bone derived cells in vitro: a model for bone formation?, Am. J. Med. Gen. 1993;45:163-178
13) PELISSIER J., MINAIRE P., CHANTRAINE A., Les para-ostéo-arthropafhies neurogènes, Collection de Pathologie Locomotrice 31 , Paris, Masson
14) SABOKBAR A., MILLETT P.J., MYER B., RUSHTON N.
A rapid, quantitative assay for measuring alkaline phosphatase activity in osteoblastic cells in vitro, Bone Min. 1994;27:57-67
15) NEFUSSI J.R., BOY-LEFEVRE M.L., BOULEKBACHE H, FOREST N. Mineralization in vitro of matrix formed by osteoblasts isolated by collagenase digestion, Differentiation 1985;29:160-168
16) KAPLAN F.S., SHORE E.M., Encrypted moφhogens of skeletogenesis, Biochem. Pharmacol. 1998;55:373-382
17) BANOVAC, K., Williams, J. M., Patrick, L. D., and Haniff, Y. M. Prévention of heterotopic ossification after spinal cord injury with indomethacin. Spinal Cord
39, 370-374. 2001.
18) WLODARSKI, K. H. Indomethacin influences Moloney's sarcoma and associated periosteal osteogenesis in the mouse. Acta Orthop Scand 61, 427-430. 1990.
19) TENENBAUM, H. C and Heersche, J. N. (1985) Endocrinology 117, 2211- 2217.
20) BELLOWS, C. G., Aubin, J. E., and Heersche, J. N. (1987) Endocrinology 121, 1985-1992.
21) GRIGORIADIS, A. E., Aubin, J. E., and Heersche, N. M. Effects of dexaméthasone and vitamin D3 on cartilage differentiation in a clonal chondrogenic cell population. Endocrinology 125, 2103-2110. 1989. 22) SILBERMANN, M., von der, M. K., Maor, G., and Menxel, M. Dexaméthasone impairs growth and collagen synthesis in condylar cartilage in vitro. Bone Minerai 2, 87. 1987.
23) TAKASE, T., Imai, S., Maeda, T., Inoue, K., and Hukuda, S. (1999) J Rheumatol. 26, 156-165.
24) IWAMOTO, M., Yagami, K., Shapiro, I. M., Leboy, P. S., Adams, S. L., and Pacifici, M. Retinoic acid acid is a major regulator of chondrocyte maturation and matrix mineralization. Microscop Res Tech 28, 483-491. 1994.
25) CANCEDDA, R., Descalzi Cancedda, F., and Castagnola, P. Chondrocyte differentiation. Int Rev Cytol 159, 265-358. 1995.
26) KOYAMA, E., Golden, E. B., Kirsch, T., Adams, S. L., and Chandraratna, j. j. Retinoic acid is required for chondrocyte maturation and endochondral bone formation during limb skeletogenesis. Dev Biol 208, 375-391. 1999.
27) BALLOCK, R. T., Heydemann, A., Wakelfield, L. M., Flander, K. C, and Roberts, A. B. Inhibition of the chondrocyte phenotype by retinoic acid involves upregulation of metelloprotease gènes independent of TGF-β. J Endocrinol 159, 340-346. 1994.
28) De LUCA, F., Uyeda, j. A., Mericq, V., Mancilla, E. E., Yanovski, J. A., Barnes, K. M., Zile, M. H., and Baron, J. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology 141, 346-353. 2000.
29) MANDUCA, P. and Abelmoschi, M. L. Retinoic acid, hemin and hexamethylen bisacetamide interférence with "in vitro" differentiation of chick embryo chondrocytes. Cell Biol Int Rep 16, 73-82. 1992.

Claims

REVENDICATIONS
1. Système de culture de cellules osseuses caractérisé en ce que les cellules osseuses mises en culture sont issues au moins en partie d'un tissu osseux hétérotopique de Para Ostéo Arthropie Neurogène (POAN).
2. Système de culture selon la revendication 1 caractérisé en ce que les cellules osseuses mises en culture sont des cellules d'ostéomes et de tissu conjonctif fibreux entourant l'ostéome.
3. Système de culture selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ensemble de cellules représentant un stade de différenciation des ostéomes mis en culture.
4. Système de culture selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'il comprend un ensemble de cellules osseuses, exprimant le collagène de type I, et un ensemble de cellules ostéoblastiques exprimant au moins un marqueur parmi le Cbfal , l'alkaline phosphatase, l'ostéocalcine.
5. Système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ensemble de cellules représentant un stade de différenciation du tissu fibreux mis en culture.
6. Système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une des populations suivantes : un ensemble de chondrocytes non différenciés exprimant au moins un marqueur parmi le collagène de type II, des aggrécanes, SOX9 ;
- un ensemble de cellules représentatives des premiers stades de la formation du cartilage et de la plaque de croissance, exprimant au moins un marqueur parmi le Cbfal, l'alkaline phosphatase, l'ostéocalcine ; un ensemble de chondrocytes hypertrophiques, exprimant au moins un facteur parmi le collagène de type X, le MGP, le VEGF - un ensemble d'adipocytes exprimant au moins un marqueur parmi le PPAR gamma, le C/EBPalpha, le G3PDH.
7. Procédé de détermination du stade de différenciation d'au moins un ensemble de cellules osseuses du système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce qu'il comprend une étape de mesure de l'expression d'au moins un facteur représentatif du stade de différenciation dudit ensemble.
8. Procédé de culture de cellules osseuses caractérisée en ce qu'il comprend les étapes : - prélèvement d'un tissu osseux atteint de Para Ostéo Arthropie Neurogène
(POAN) ; mise en culture du prélèvement dans un milieu de culture approprié pour la différenciation de cellules du prélèvement, le cas échéant jusqu'à la formation de zones minéralisées.
9. Procédé de sélection de substances actives sur le développement et/ou l'activité de cellules osseuses et/ou d'adipocytes, à au moins un stade de différenciation, caractérisé en ce qu'il comprend : la préparation d'un système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ; - l'addition d'au moins une substance testée au système de culture, à au moins un stade de différenciation des cellules mises en culture ; la mesure de l'effet de la substance sur le développement et /ou la différenciation des cellules aux différents stades de différenciation.
10. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que la substance est une substance régulatrice du développement et/ou de la différenciation des cellules cultivées.
11. Procédé selon la revendications 1 caractérisé en ce que la substance est une substance modulant l'expression de gènes à au moins un stade du développement osseux.
12. Utilisation de cellules extraites d'un système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et/ou d'une substance active obtenue par un procédé selon la revendication 9, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie du cartilage, d'un formation osseuse en excès, insuffisante ou anormale.
13. Utilisation de cellules extraites d'un système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et/ou d'une substance active obtenue par un procédé selon la revendication 9, pour la préparation d'un médicament destiné à la reconstruction maxillaire et bucco-dentaire.
14. Utilisation de cellules extraites d'un système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et/ou d'une substance active obtenue par un procédé selon la revendication 9, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies cardio-vasculaires impliquant une ossification des vaisseaux.
15. Utilisation de cellules extraites d'un système de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie requérant des greffes osseuses.
PCT/FR2002/004251 2001-12-10 2002-12-10 Modele de developpement osseux WO2003050272A2 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002366579A AU2002366579A1 (en) 2001-12-10 2002-12-10 Bone development model

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0115908A FR2833270B1 (fr) 2001-12-10 2001-12-10 Modele de developpement osseux
FR01/15908 2001-12-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2003050272A2 true WO2003050272A2 (fr) 2003-06-19
WO2003050272A3 WO2003050272A3 (fr) 2003-12-24

Family

ID=8870274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2002/004251 WO2003050272A2 (fr) 2001-12-10 2002-12-10 Modele de developpement osseux

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU2002366579A1 (fr)
FR (1) FR2833270B1 (fr)
WO (1) WO2003050272A2 (fr)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996040873A1 (fr) * 1995-06-07 1996-12-19 Co.Don Gmbh Gesellschaft Für Molekulare Medizin Und Biotechnologie CULTURES DE CELLULES OSTEOBLASTES PRIMAIRES ET STANDARDISEES PRELEVEES SUR DES PATIENTS ATTEINTS D'OSTEOPOROSE, LEUR UTILISATION DANS LES DIAGNOSTICS D'OSTEOPOROSE ET LES TESTS DE TRAITEMENTS DE l'OSTEOPOROSE
FR2771102A1 (fr) * 1997-11-14 1999-05-21 Biocoral Inc Procede pour induire la differenciation osteoblastique de cellules de tissu adipeux extramedullaire humain
DE19752900A1 (de) * 1997-11-28 1999-06-02 Biotechnolog Forschung Gmbh Knochenmatrix und/oder osteogene Zellen, deren Verwendung, therapeutische Zubereitung und Kit
WO2001082773A2 (fr) * 2000-04-28 2001-11-08 The Regents Of The University Of California Structures utiles dans le genie osseux et procedes

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996040873A1 (fr) * 1995-06-07 1996-12-19 Co.Don Gmbh Gesellschaft Für Molekulare Medizin Und Biotechnologie CULTURES DE CELLULES OSTEOBLASTES PRIMAIRES ET STANDARDISEES PRELEVEES SUR DES PATIENTS ATTEINTS D'OSTEOPOROSE, LEUR UTILISATION DANS LES DIAGNOSTICS D'OSTEOPOROSE ET LES TESTS DE TRAITEMENTS DE l'OSTEOPOROSE
FR2771102A1 (fr) * 1997-11-14 1999-05-21 Biocoral Inc Procede pour induire la differenciation osteoblastique de cellules de tissu adipeux extramedullaire humain
DE19752900A1 (de) * 1997-11-28 1999-06-02 Biotechnolog Forschung Gmbh Knochenmatrix und/oder osteogene Zellen, deren Verwendung, therapeutische Zubereitung und Kit
WO2001082773A2 (fr) * 2000-04-28 2001-11-08 The Regents Of The University Of California Structures utiles dans le genie osseux et procedes

Also Published As

Publication number Publication date
FR2833270A1 (fr) 2003-06-13
FR2833270B1 (fr) 2004-02-27
AU2002366579A1 (en) 2003-06-23
WO2003050272A3 (fr) 2003-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kunimatsu et al. Comparative characterization of stem cells from human exfoliated deciduous teeth, dental pulp, and bone marrow–derived mesenchymal stem cells
Vukicevic et al. BMP-6 and mesenchymal stem cell differentiation
Ferguson et al. Does adult fracture repair recapitulate embryonic skeletal formation?
Maeda et al. Mineral trioxide aggregate induces bone morphogenetic protein-2 expression and calcification in human periodontal ligament cells
Papagerakis et al. Investigation of osteocalcin, osteonectin, and dentin sialophosphoprotein in developing human teeth
Papagerakis et al. Expression of amelogenin in odontoblasts
Wu et al. Downregulated expression of the secreted glycoprotein follistatin-like 1 (Fstl1) is a robust hallmark of preadipocyte to adipocyte conversion
Luo et al. Runx1 regulates osteogenic differentiation of BMSCs by inhibiting adipogenesis through Wnt/β-catenin pathway
Asparuhova et al. Bone-conditioned medium contributes to initiation and progression of osteogenesis by exhibiting synergistic TGF-β1/BMP-2 activity
EP3303556B1 (fr) Compositions destinées au traitement de troubles ostéo-cartilagineux
Ruiz et al. TGFβi is involved in the chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells and is dysregulated in osteoarthritis
Qu et al. Distal-less homeobox 2 promotes the osteogenic differentiation potential of stem cells from apical papilla
Fu et al. Matrigel scaffolding enhances BMP9-induced bone formation in dental follicle stem/precursor cells
Groeneveldt et al. The bone-forming properties of periosteum-derived cells differ between harvest sites
Ha et al. MSM promotes human periodontal ligament stem cells differentiation to osteoblast and bone regeneration
Zhao et al. Hypoxia enhanced bone regeneration through the HIF-1α/β-catenin pathway in femoral head osteonecrosis
Bertolo et al. Physiological testosterone levels enhance chondrogenic extracellular matrix synthesis by male intervertebral disc cells in vitro, but not by mesenchymal stem cells
Jian et al. 20-hydroxyecdysone-induced bone morphogenetic protein-2-dependent osteogenic differentiation through the ERK pathway in human periodontal ligament stem cells
Perinpanayagam et al. Alveolar bone osteoblast differentiation and Runx2/Cbfa1 expression
Lu et al. The SIRT1 activator SRT2104 promotes BMP9-induced osteogenic and angiogenic differentiation in mesenchymal stem cells
EP2504707B1 (fr) Utilisation d&#39;une isoforme d&#39;hla-g comme marqueur de l&#39;osteogenese
Li et al. Quantitative determination of matrix Gla protein (MGP) and BMP-2 during the osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells
Karlström et al. Localization and expression of prothrombin in rodent osteoclasts and long bones
Liu et al. NF-κB activation impedes the transdifferentiation of hypertrophic chondrocytes at the growth plate of mouse embryos in diabetic pregnancy
Chen et al. Gli1+ osteogenic progenitors contribute to condylar development and fracture repair

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)