WO2003033712A1 - Chemically inducible promoters from barley and use thereof - Google Patents

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WO2003033712A1
WO2003033712A1 PCT/EP2002/011330 EP0211330W WO03033712A1 WO 2003033712 A1 WO2003033712 A1 WO 2003033712A1 EP 0211330 W EP0211330 W EP 0211330W WO 03033712 A1 WO03033712 A1 WO 03033712A1
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WO
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bci
promoter
seq
expression
nucleic acid
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Application number
PCT/EP2002/011330
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Inventor
Karl-Heinz Kogel
Ulrich Beckhove
Uta Geldermann
Original Assignee
Basf Plant Science Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline

Definitions

  • the invention relates to methods for the chemically inducible expression of nucleic acid sequences, preferably in plants. Also included are new chemically-inducible promoters, functional equivalents and functionally equivalent parts thereof, as well as expression cassettes and vectors which comprise these promoter sequences.
  • the invention further relates to transgenic plants transformed with these expression cassettes or vectors, cultures derived therefrom, parts or transgenic propagation material, and the use thereof for the production of foodstuffs, animal feed, seeds, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • the invention further encompasses the use of these expression cassettes or vectors in methods for identifying substances which are able to induce pathogen resistance after exposure to plants.
  • the aim of plant biotechnology work is the generation of plants with advantageous novel properties, for example, to 'increase agricultural productivity, to improve quality of human foods or for producing specific chemicals or pharmaceuticals.
  • Promoters are important tools in plant biotechnology to control the expression of a specific gene in a transgenic plant and thus to achieve certain essential characteristics of the plant. It is desirable to be able to use a wide variety of promoters with different properties in order to optimally implement the expression of a particular gene in a particular cell, tissue or plant species.
  • Various promoters with activity in plants are known to the person skilled in the art.
  • a promoter can be constitutive, tissue-specific, developmental or inducible. Constitutive promoters such as the 35S CaMV promoter are permanently active regardless of the development stage and tissue of a plant and cause a continuous expression of the genes controlled by them. Such constitutive expression can adversely affect plant quality.
  • constitutive expression can have different effects at different stages of development and thus also have an adverse effect on the plant. Similar adverse effects of constitutive expression can also occur with expression in tissue or cell cultures and with fermentations, where, for example, they can negatively influence the growth rates and thus reduce the yields. ' ,
  • Tissue- or development-dependent promoters are only active at defined times or in defined tissues of a plant.
  • control of the time, extent and / or location of expression is particularly desirable.
  • inducible promoters are those whose transcription activity is regulated by one or more internal or external inducers.
  • Inducers can be chemical compounds such as certain metabolites (e.g. sugar, alcohols), growth regulators, herbicides, plant hormones, phenolic compounds, but also factors such as light or also physiological stress (heat, salt, lack of oxygen, injury, toxic elements). Indirectly can also be the effect of a pathogen or one Illness (such as a virus or fungus) cause induction.
  • WO 93/21334 describes the alcA / alcR expression system, which can be induced by various alcohols (e.g. ethanol).
  • the system consists of two components: the promoter sequence and the alcR protein, which stimulates the promoter as an inducer protein in the presence of the alcohol.
  • SA Salicylic acid
  • SAR systemic acquired resistance
  • LAR local acquired resistance
  • Jasmonic acid (JA) and its methyl ester (MeJA; JM) are important signal substances in plant defense mechanisms and have an additional hormone function for controlling plant metabolism (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopath 35: 235-270; Creelman RA and Mullet JE (1997) Ann Rev Plant
  • Physiol Plant Mol Biol 48: 355-381 The biosynthesis is based on membrane lipids, mostly from linolenic acid under the action of a lipoxygenase or unspecifically by membrane peroxidation, for example during a hypersensitive reaction (Sticher L ef al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270). SA antagonizes the production of JA (Penninckx IAMA (1996) Plant: Cell 8: 2309-2323).
  • Abscisic acid is required for signal transduction from systemin to JA (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270).
  • Ethylene can also modulate SAR, increase lignification and is presumably required for signal transduction between Systemin and Pinll (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270).
  • induced resistance encompasses a number of plant defense mechanisms, in each of which an increased resistance to a subsequent secondary infection or stimulation is triggered by a primary infection or stimulation with a pathogen or other stress factor (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270). Resistance can be local or systemic. The systemic resistance includes the accumulation of resistance proteins in areas that are further away from the site of primary infection or stimulation. Different classes of these proteins can be defined: hydrolases, especially the "pathogenesis related proteins” (PR proteins) (Stinzi A et al. (1993) Biochemie 75: 687-706), Defensine (Broekart WF et al.
  • PR proteins pathogenesis related proteins
  • SAR Systemic acquired resistance
  • SA salicylic acid
  • SAR reaction is mediated by endogenous messenger substances such as jasmonate (JA) or salicylic acid (SA). Exogenous application of these substances is capable of activating the corresponding PR genes and causing SAR (Ward et al. (1991) Plant Cell 3: 1085-1094; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4 (6 ): 645-656). Similar effects can also be achieved by synthetic compounds such as 2, 6-dichloroisonicotinic acid (DCINA) (Vernooij et al. (1995) Mol Plant Microbe Interact 8: 228-234) or benzo [1,2,3] thiadiazole-7-thiocarboxylic acid.
  • DCINA 2, 6-dichloroisonicotinic acid
  • DCINA realizes this without increasing the SA level at the same time, i.e. it acts at the same location or below in the signal transduction chain (Vernooij B et al. (1995) Mol Plant Microbe Interact 8: 228-234).
  • SA salicylic acid
  • BION ® the active substance (benzo [1, 2,3] thiadiazole-7-thiocarboxylic acid S-methyl ester; BTH) of which SA is structurally similar and how it triggers SAR.
  • the promoters of the PR genes are generally also induced indirectly, for example by pathogen attack and / or stress, using endogenous messenger substances such as SA.
  • pathogen-inducible promoters are the PRP1 promoter from potato (Martini N et al. (1993) Mol Gen Genet 263: 179-186), the Fisl promoter (WO 96/34949), the Betv 1 promoter (Swoboda I et al. (1995) Plant Cell and Env 18: 865-874), the Vstl promoter (Fischer R (1994) dissertation, Univ. Hohen- heim; Schubert R et al. (1997) Plant Mol Biol 34: 417-426) , the sesquiterpene cyclase promoter (Yin S et al. (1997) Plant Physiol 115: 437-451) and the gstAl promoter (Mauch F and Dudler R (1993) Plant Physiol 2: 1193-1201).
  • promoters are only insufficiently suitable as chemically inducible promoters, since they have a not inconsiderable constitutive activity and can also be unwantedly induced by natural pathogens instead of the chemical inducer.
  • a disadvantage of using these promoters for the transgenic expression of anti-pathogenic proteins is the fact that the promoters are only reactive.
  • Delay phase until sufficient defense potential has been reached can result in damage to the plant which can impair its value and its suitability as food or feed.
  • the BCI-3 promoter is induced by DCINA, BTH and weaker by SA. After BTH induction, the accumulation of BCI-3 is only detectable in the mesophyll and weaker in the epidermis. Expression of BCI-3 was not affected by ethylene and ABA, but induced by JA application and wounding. Inoculation of barley with C. sativus, the non-host pathogen Bgt or aphids (S. avenae) had no effect on the transcript accumulation. In contrast, BCI-3 is even repressed by infection with a virulent and avirulent breed of Bgh.
  • BCI-4 gene expression can only be induced with the resistance inducers DCINA and BTH and - weaker and more transient - with SA. Weak expression of BCI-4 was detected locally and systemically after infiltration of the pseudomonad strain PG4180. All other investigated inducers, various biotic and abiotic stress factors, as well as fungicide applications or injuries had no influence on the expression of BCI-4. This shows that BCI-4 is not expressed in general stress reactions, but is specifically regulated. BCI-4 shows a very low constitutive expression activity. An increased accumulation of BCI-4 transcript and protein in barley plants occurred exclusively in leaves (with the exception of the flag leaf) and only after chemical induction (BTH casting treatment), the accumulation remaining limited to the mesophyll.
  • An advantage of the promoters according to the invention is that gene expression in plants - especially in the important, monocotyledonous plants - can be specifically activated by applying a chemical. An unwanted activation by pathogens can be largely excluded. There are many possible uses. For example, it is possible to prevent an impending pathogen attack in a quasi-preventive manner.
  • the cDNA of the BCI-3 and BCI-4 genes is partially known (WO 00/71748; Besser K et al. (2000) Molecular Plant Pathology 1 (5): 277-286; GenBank Acc.No .: AJ250282 and AJ250283) , An EST
  • expression tag (“expressed sequence tag”) was found by means of an expression analysis following treatment of barley with SAR ("systemic acquired resistance") triggering chemicals. In addition to the BCI-3 and BCI-4 EST, numerous other sequences were identified. Surprisingly, however, the promoters according to the invention show strong induction only when stimulated with exogenously applied chemicals such as DCINA or BTH, but not in the case of pathogen attack. This expression specificity is particularly advantageous because only a low background activity in the absence of the chemical inducer (triggered, for example, by environmental factors or pathogen infestation) can be expected.
  • a first subject of the invention relates to a method for chemically inducible transgenic expression of nucleic acid sequences, characterized in that
  • an expression cassette consisting of a nucleic acid sequence to be expressed transgenically in functional linkage with a chemically inducible promoter selected from the group of sequences consisting of
  • the expression of the nucleic acid sequence is induced by treating the organism or the tissue, organ, part, cell culture or cell thereof with a chemical inducer.
  • Plant means all plant organisms as described below by way of example. Plants that play a role in agriculture and as feed or food are particularly preferred. Most preferred are cereals such as barley, wheat, rye, oats, triticale, rice and corn.
  • the invention further relates to the barley BCI-3 promoter according to SEQ ID NO: 1, the sequence complementary thereto, and functional equivalents or parts thereof which are functionally equivalent.
  • Another object of the invention relates to the barley BCI-4 promoter according to SEQ ID NO: 2, the sequence complementary thereto, and functional equivalents or parts thereof which are functionally equivalent.
  • “Functionally equivalent parts” means partial sequences of the promoters described by SEQ ID NO: 1 or 2, which essentially have the same promoter activity as the BCI-3 promoter described by SEQ ID NO: 1 or the BCI-4 promoters according to SEQ ID NQ: 2 exhibit. Partial sequences can be composed of one or more parts of the promoters described by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Functionally equivalent parts of a BCI-3 promoter preferably comprise the sequences described by SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7.
  • Functionally equivalent parts of a BCI-4 promoter preferably comprise the sequence described by SEQ ID NO: 8.
  • “Functional equivalents” means sequences which are derived from the BCI-3 promoter described by SEQ ID NO: 1 or the BCI-4 promoter according to SEQ ID NO: 2 and which have essentially the same promoter activity.
  • a promoter activity is said to be "essentially the same” if the transcription of a particular nucleic acid sequence to be expressed transgenically under the control of a promoter derived from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is not or only weakly by a chemical inducer can be activated by pathogens.
  • the maximum induction of expression by a chemical inducer is at least twice as high as the maximum induction by a pathogen, is preferred at least 5 times as high, very particularly preferably at least 10 times as high, most preferably at least 20 times as high.
  • Dichloroisonicotinic acid or benzo [1,2,3] thiadiazole-7-thiocarboxylic acid S-methyl ester (BTH) are preferably used as chemical inducers.
  • Barley powdery mildew (Blumeria [syn Erysiphe] graminis f.sp. hordei Speer, Bgh) is preferred as the pathogen; barley powdery mildew of breed A6 (BghA6) is particularly preferred.
  • Very particularly preferably, functionally equivalent promoters with essentially the same promoter activity are understood to be those which have a leaf-specific, particularly preferably a leaf-mesophyll-specific expression.
  • “specific" means that the expression in the conscious tissue is at least twice as high as in any other tissue. The expression is preferably at least 5 times as high, very particularly preferably at least 10 times as high.
  • the absolute level of expression after incubation with the chemical inducer can differ both downwards and upwards in comparison with the BCI-3 promoter according to SEQ ID NO: 1 or the BCI-4 promoter according to SEQ ID NO: 2.
  • the level of expression is measured in each case on the basis of the transcribed mRNA or the protein which has been translated as a result under otherwise unchanged conditions.
  • Preferred are promoter sequences whose expression level after induction receives a comparison value with the promoter described by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 by no more than 50%, preferably no more than 25%, particularly preferably no more than 10% below.
  • Sequences are particularly preferred whose expression level after induction receives a comparison value with one of the promoters described by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 by more than 50%, preferably 100%, particularly preferably 500%, very particularly preferably 1000% exceeds. Also particularly preferred are those sequences whose level of expression before induction does not receive a comparison value with a promoter described by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or does not exceed this by at least 10%, preferably at least 30%, particularly preferably at least 50%, most preferably falls below at least 90%. In general, induction is expected after 2 to 72 hours, preferably after 12 to 48 hours.
  • Preferred nucleic acid sequences to be expressed transgenically are those which allow easy quantification of the expression, ie in particular those whose transcription and translation results in so-called reporter proteins (Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13 (l): 29-44) such as beimés- as GFP ("green fluorescence protein"; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6: 325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques 23 (5): 912-8), chloramphenicol transferase, luciferase (Millar et al.
  • chemical inducer primarily includes compounds with a benzo-1, 2, 3-thiadiazole basic structure and includes, by way of example but not by way of limitation, benzo-1, 2, 3-thiadiazolecarboxylic acid, benzo-1, 2, 3-thiadiazolthiocarboxylic acid, cyanobenzo- 1,2,3-thia-diazole, benzo-1, 2, 3-thiadiazolecarboxamide, benzo-1, 2,3-thia-diazolecarboxylic acid hydrazide, benzo-1, 2, 3-thiadiazole-7 ⁇ -carboxylic acid, benzo-1, 2,3-thiadiazole-7-thiocarboxylic acid, 7-cyano-benzo-1,2,3-thiadiazole, benzo [1,2,3] thiadiazole-7-thiocarboxylic acid S-methyl ester, benzo-1,2 , 3-thiadiazole-7-carboxamide, benzo-1,2,3-thiouracil
  • inductors with a pyridinecarboxylic acid backbone such as isonicotinic acid and derivatives thereof; haloisonicotinic acids such as dichloroisonicotinic acid, 2,6-dichloroisonicotinic acid (DCINA) and derivatives thereof are particularly preferred.
  • haloisonicotinic acids such as dichloroisonicotinic acid, 2,6-dichloroisonicotinic acid (DCINA) and derivatives thereof are particularly preferred.
  • DCINA 2,6-dichloroisonicotinic acid
  • ben such as the lower alkyl esters (Cl to C6), especially the methyl ester.
  • inducers of PR genes or inducers of a SAR such as, for example, benzoic acid, salicylic acid (SA), jasmonic acid or jasmonic acid methyl ester, polyacrylic acid and substituted derivatives of the aforementioned inducers.
  • inducers are 2,6-dichloroisonicotinic acid (DCINA), benzo [1,2,3] thiadiazole-7-thiocarboxylic acid S-methyl ester, salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA) and jasmonic acid methyl ester (JM).
  • DCINA 2,6-dichloroisonicotinic acid
  • SA benzo [1,2,3] thiadiazole-7-thiocarboxylic acid S-methyl ester
  • SA salicylic acid
  • JA jasmonic acid
  • JM jasmonic acid methyl ester
  • the application of the inductors can be used in pure form, in solution or suspension, as powder or dust or in any other form of formulation customary in agriculture.
  • Solid as well as liquid auxiliaries or carriers can be used with which the inductor is mixed, for example to facilitate application to the plant,
  • Silicates, clays, polymers, alcohols, ketones, aliphatic or aromatic hydrocarbons and the like can be used, for example, as auxiliaries or carriers.
  • the inductor is used in the form of a conventional "wettable powder" or as a concentrate of an aqueous suspension or emulsion, the formulation can contain one or more surface-active, ionic or non-ionic compounds ("surfactants"), "wetting" agents or emulsifiers.
  • surfactants surface-active, ionic or non-ionic compounds
  • the inductor can be used individually or in combination with other suitable inductors (for example a combination of DCINA and BTH).
  • the inductor can also be used in combination with other compounds such as adjuvants, herbicides, fungicides, insecticides or growth regulators or fertilizers.
  • the inductor can preferably be applied as a spray to leaves, stems and / or branches of the plant or else to the seeds before sowing.
  • the quantity and time period of the inductor are adapted to the quantity required for an optimal induction.
  • inductors When applied to whole plants, inductors are generally used in a concentration of 0.1 to 1000 mg of active compound per liter of soil volume as part of a soil treatment process or in concentrations of 0.1 to 100 mg / 1 active compound per liter of liquid for spray application. Lower concentrations can also be used in cell or tissue cultures. In general induction is expected after 2 to 72 h, preferably after 12 to 48 h.
  • a functional equivalent is understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of the BCI-3 promoter according to SEQ ID NO: 1 or of the BCI-4 promoter according to SEQ ID NO: 2, as well as homologous sequences from other plant genera and species, which continue to be essentially the same Have promoter activity.
  • Mutations include substitutions, additions, deletions, inversions or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modifying the BCI-3 promoter sequence according to SEQ ID NO: 1 or the BCI-4 promoter sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • the aim of such a modification can e.g. further restricting the sequence contained therein to certain regulatory elements or e.g. also the insertion of further restriction enzyme interfaces, the removal of superfluous DNA or the addition of further sequences, for example further regulatory sequences.
  • the sequence can be limited to specific, essential regulatory regions - for example also for the production of functionally equivalent parts of the promoter sequences according to the invention - can also be carried out with the aid of a search routine for searching for promoter elements.
  • Certain promoter elements are often present in abundance in the regions relevant to promoter activity. This analysis can be carried out, for example, using computer programs such as the PLACE program ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") (Higo K et al. (1999) Nucl Acids Res 27 (1): 297-300).
  • the "PlantCARE” program which is available on the Internet, can be used in particular to find cis-acting regulatory elements (http: //sphinx.rüg. Ac .be: 8080 / PlantCARE / cgi / index.html).
  • Functional equivalents of the BCI-3 promoter derived from the BCI-3 promoter sequences according to the invention, for example by substitution, insertion or deletion of nucleotides, have a homology of at least 50%, preferably 60%, preferably at least 70%, particularly preferably at least 80%, entirely particularly preferably at least 90% of the promoter sequence according to SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent part thereof, preferably an equivalent part according to SEQ ID NO: 3, 4 5, 6 or 7 and are distinguished by essentially the same promoter activity in comparison the BCI-3 promoter sequence according to SEQ-ID NO: 1 or a functionally equivalent part thereof, preferably an equivalent part according to SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7.
  • Functional equivalents of the BCI-4 promoter derived from the BCI-4 promoter sequences according to the invention, for example by substitution, insertion or deletion of nucleotides, have a homology of at least 50%, preferably 60%, preferably at least 70%, particularly preferably at least 80%, entirely particularly preferably at least 90% of the promoter sequence according to SEQ ID NO: 2 or a functionally equivalent part thereof, preferably an equivalent part according to SEQ ID NO: 8, and are characterized by essentially the same promoter activity compared to the BCI-4 promoter sequence according to SEQ-ID NO: 2 or a functionally equivalent part thereof, preferably an equivalent part according to SEQ ID NO: 8.
  • GAP Garnier ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • Gap Weight 12 Length Weight: 4
  • An example is a sequence that has a homology of at least 50% on a nucleic acid basis with the sequence
  • SEQ ID NO: 1 understood a sequence which, when compared with the sequence SEQ ID NO: 1 according to the above program algorithm with the above parameter set, has a homology of at least 50%.
  • Further examples of the promoter sequences used in the expression cassettes or expression vectors according to the invention can easily be found, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, for example from Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthinum, by comparing homology from databases .
  • BCI-3 or BCI-4 gene or cDNA sequences for the production of probes for screening genomic libraries of other organisms.
  • homologous promoter sequences including functional equivalents, can also be found.
  • Functional equivalents furthermore means DNA sequences which, under standard conditions, have a nucleic acid sequence as described by SEQ ID NO: 1 or 2 or the functionally equivalent parts derived from them as described in SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 or 8 or hybridize the complementary nucleic acid sequences and which essentially have the same promoter activities as the nucleic acid sequences described by SEQ ID NO: 1 or 2 or the functionally equivalent parts derived from them according to SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, Have 7 or 8.
  • Standard hybridization conditions are to be understood broadly and mean stringent as well as less stringent hybridization conditions. Such hybridization conditions are described, inter alia, by Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al.
  • the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with approximately 2X SSC at 50 ° C.) and those with high stringency (with approximately 0.2X SSC at 50 ° C., preferably at 65 ° C. C) (20X SSC: 0.3 M sodium citrate, 3 M NaCl, pH 7.0).
  • the temperature during the washing step can be raised from low stringent conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can be kept constant and only the other can be varied. Denaturing agents such as formamide or SDS can also be used during hybridization. In counter If 50% formamide was used, the hybridization is preferably carried out at 42 ° C.
  • Ficoll 0.1% polyvinylpyrrolidone, 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mM sodium current at 42 ° C, or
  • Functional equivalents include - in addition to those which are "silent", ie which leave the promoter activity unchanged - also those promoter variants whose function is weakened or enhanced compared to the starting promoter.
  • a method for producing functional equivalents according to the invention preferably comprises the introduction of mutations into the BCI-3 promoter sequence according to SEQ ID NO: 1 or the BCI-4 promoter sequence according to SEQ ID NO: 2 or the functionally equivalent parts derived from these according to SEQ ID NO : 3, 4, 5, 6, 7 or 8.
  • Mutagenesis can be carried out in an undirected ("random") manner, the mutagenized sequences then being screened for their promoter activity according to a "trial-by-error" procedure.
  • partial sequences that are responsible for the promoter properties of the BCI-3 or BCI-4 promoter can be identified (e.g. using the above-mentioned computer algorithms).
  • Other related or unrelated nucleic acid sequences for example promoter sequences
  • non-essential sequences can be deleted without significantly impairing the promoter activity.
  • Methods for mutagenizing nucleic acid sequences include, for example, the use of oligonucleotides with one or more mutations in comparison to the region to be mutated (e.g. as part of a "site-specific mutagenesis").
  • primers with approximately 15 to approximately 75 nucleotides or more are used, preferably approximately 10 to approximately 25 or more nucleotide residues being located on both sides of the sequence to be changed.
  • the details and implementation of said mutagenesis methods are known to the person skilled in the art (Kunkel et al. (1987) Methods Enzy ol 154: 367-382; Tomic et al.
  • Mutagenesis can also be achieved by treating, for example, vectors which contain one of the nucleic acid sequences according to the invention with utagenizing agents such as hydroxylamine.
  • the invention further relates to transgenic expression cassettes which comprise one of the promoter sequences according to the invention. Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids are preferably claimed
  • a) or b) are functionally linked to a nucleic acid sequence to be expressed transgenically.
  • transgene means all such constructions which have been obtained by genetic engineering methods in which either a) the promoter of the BCI-3 gene according to SEQ ID No: 1 'or a functional equivalent or functional equivalent part of the same, preferably a functionally equivalent part according to SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7, or the promoter of the BCI-4 gene according to SEQ ID No: 2 or a functional equivalent or part of the same, preferably a functionally equivalent part according to SEQ ID NO: 8, or
  • nucleotide residues are not in their natural, genetic environment (i.e. at their natural chromosomal locus) or have been modified by genetic engineering methods, the modification being, for example, a substitution, addition, deletion, inversion or insertion of one or more nucleotide residues.
  • the expression of the nucleic acid sequence to be expressed can lead to the formation of sense RNA or anti-sense RNA.
  • the sense RNA can consequently be translated into certain polypeptides.
  • anti-sense RNA for example, the expression of certain genes can be down-regulated.
  • a functional link is understood to mean, for example, the sequential arrangement of one of the promoters according to the invention and a nucleic acid sequence to be expressed transgenically and, if appropriate, other regulatory elements such as a terminator in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function in the transgenic expression of the nucleic acid sequence, depending on the arrangement of the nucleic acid sequences to sense or anti-sense RNA. This does not necessarily require a direct link in the chemical sense. Genetic control sequences, such as, for example, enhancer sequences, can also perform their function on the target sequence from more distant positions or even from other IJNA molecules.
  • nucleic acid sequence to be expressed transgenically is positioned behind (ie at the 3 'end) the promoter sequence according to the invention, so that both sequences are covalently linked to one another.
  • the distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is preferably less than 200 base pairs, particularly preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
  • the expression cassette consisting of a linkage of promoter and nucleic acid sequence to be expressed, can preferably be integrated in a vector and inserted into a plant genome by, for example, transformation.
  • An expression cassette according to the invention is, however, also to be understood as such constructions in which one of the promoters according to the invention is introduced into a host genome, for example via a targeted homologous recombination or a random insertion, there takes over regulatory control over nucleic acid sequences then functionally linked with it and which controls transgenic expression thereof.
  • an expression cassette according to the invention is obtained which controls the expression of the specific polypeptide as a result of chemical induction.
  • the insertion of the promoter can also take place in such a way that antisense RNA is expressed to form the nucleic acid coding for a specific polypeptide.
  • the expression of the particular polypeptide is thus down-regulated or switched off as a result of chemical induction.
  • a nucleic acid sequence to be expressed transgenically - for example by means of a homologous recombination - can be placed behind an endogenous, natural promoter according to the invention (for example the BCI-3 or BCI-4 promoter), which likewise gives an expression cassette according to the invention.
  • Vectors according to the invention also contain the expression cassettes described above.
  • Vectors are recombinant DNA sequences into which the expression cassettes according to the invention can be inserted into a suitable host for the purpose of isolation, multiplication and transformation.
  • the vectors can preferably be propagated in a host such as E. coli and are suitable for the transformation of plant cells or of Agrobacterium.
  • Vectors can be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or also Agrobacterium.
  • nucleic acid sequences contained in the expression cassettes or vectors according to the invention can be linked to further genetic control sequences in addition to a promoter according to the invention.
  • genetic control sequences is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the formation or the function of the expression cassette according to the invention, the vector or a organism transformed with the aforementioned.
  • Genetic control sequences modify, for example, transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • the expression cassettes according to the invention preferably comprise 5 'upstream of the respective nucleic acid sequence to be expressed transgenically, one of the promoters according to the invention and 3' downstream a terminator sequence as an additional genetic control sequence and, if appropriate, further customary regulatory elements, in each case functionally linked to the transgene expressing nucleic acid sequence.
  • Genetic control sequences also include further promoters, promoter elements or minimal promoters that can modify the expression-controlling properties.
  • Corresponding elements are, for example, for water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH (1991) J Biol Chem 266 (26): 17131 -17135) and heat stress (Schöffl F et al. (1989) Mol Gen Genet 217 (2- 3): 246-53).
  • promoters can be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which enable expression in other plant tissues or in other organisms, such as E. coli bacteria.
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated regions, introns or non-coding 3' regions of genes, preferably the barley BCI-3 or BCI-4 gene. Also Sequences from other plant species, such as the Actin-1 or Actin-2 intron. It has been shown that these can play a significant role in regulating gene expression. It has been shown that 5 'untranslated sequences can increase the transient expression of heterologous genes.
  • the 5'-leader sequence from the tobacco mosaic virus may be mentioned as an example of such translation enhancers (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711).
  • Other 5 'untranslated sequences can promote tissue specificity (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440.).
  • the nucleic acid sequences given under SEQ ID N0: 1 and 2 each contain the 5 'untranslated region up to the ATG start codon of the BCI-3 or BCI-4 protein.
  • the expression cassette can advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable an increased transgenic expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the nucleic acid sequences to be expressed transgenically.
  • the nucleic acid sequences to be expressed transgenically can be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome.
  • homologous recombination for example, the natural promoter of a specific gene can be exchanged for a promoter according to the invention.
  • Methods such as cre / lox technology allow tissue-specific, possibly inducible, removal of the expression cassette from the genome of the host organism (Sauer B. Methods. 1998; 14 (4): 381-92).
  • certain flanking sequences are added to the target gene (lox sequences), which later enable removal by means of the cre recombinase.
  • the promoter to be introduced can be placed by means of homologous recombination in front of the target gene to be expressed transgenically, in that the promoter is linked to DNA sequences which are, for example, homologous to endogenous sequences which are upstream of the reading frame of the target gene. Such sequences are to be understood as genetic control sequences.
  • the two homologous sequences can interact and thus place the promoter sequence at the desired location in front of the target gene, so that the promoter sequence is now functionally linked to the target gene stands and forms an expression cassette according to the invention.
  • the selection of the homologous sequences determines the insertion site of the promoter.
  • the expression cassette can be generated by homologous recombination using a single or a double reciprocal recombination.
  • simple reciprocal recombination only a single recombination sequence is used and the entire DNA introduced is inserted.
  • double-reciprocal recombination the DNA to be introduced is flanked by two homologous sequences and this is done
  • Homologous recombination is a relatively rare event in higher eukaryotes, especially in plants. Random integrations into the host genome predominate. One way that happens randomly
  • Removing 20 integrated sequences and thus enriching cell clones with a correct homologous recombination consists in using a sequence-specific recombination system as described in US Pat. No. 6,110,736.
  • a variety of sequence specific recombination systems can be used, for example
  • the Cre / lox system 25 called the Cre / lox system, the FLP / FRT system, the gin recombinase, the pin recombinase from E. coli and the R / RS system of the pSRI plasmid.
  • the Pl Cre / lox and the FLP / FRT system are preferred.
  • the recombinase (Cre or FLP) interacts specifically with its respective recombination sequences (34 bp lox sequence or
  • Suitable polyadenylation signals as control sequences are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J
  • terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopalin synthase) terminator.
  • a functional linkage or an expression cassette according to the invention can be produced by means of common recombination and cloning techniques, as described, for example, in Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) and in Silhavy TJ, Berman ML and Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) and in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience or Gelvin et al.
  • sequences can also be positioned between the promoter according to the invention and the nucleic acid sequence to be expressed, which, for example, have the function of a linker with certain restriction enzyme interfaces or a signal or transit peptide.
  • the insertion of sequences can also lead to the expression of fusion proteins.
  • An expression cassette according to the invention is produced, for example, by fusing a promoter according to the invention with a nucleotide sequence to be expressed, and a terminator or polyadenylation signal.
  • the expression cassettes according to the invention and the vectors derived from them can contain further functional elements.
  • the term functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, reproduction or function of the expression cassettes, vectors or transgenic organisms according to the invention. Examples include, but are not limited to:
  • Selection markers which are resistant to a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456), antibiotics or biocides, preferably herbicides, such as, for example, kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, or phosphinotricin etc. to lend.
  • herbicides such as, for example, kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, or phosphinotricin etc. to lend.
  • Particularly preferred selection markers are those which confer resistance to herbicides. Examples include: DNA sequences which code for phosphinothricin acetyltransferases (PAT) and
  • Glyphosate ® N- (phosphonomethyl) glycine
  • the degrading enzyme for Glyphosat ® coding gox gene glyphosate oxidoreductase
  • the deh gene coding for a dehalogenase that inactivates dalapon
  • sulfonylurea imidazolinone inactivating acetolactate synthases (ALS) or acetohydroxy acid synthases (AHAS) as well as bxn genes that degrade nitrodynilase enzymes.
  • the selection marker allows one Selection of the transformed cells from untransformed (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • uidA uidA gene which encodes an enzyme for various chromogenic substrates
  • R-locus gene encodes a protein that inhibits the production of anthocyanin pigments (red color) in vegetable
  • the genes of the R gene complex from maize are particularly advantageous.
  • the R gene complex encodes a protein that regulates the production of anthocyanin pigments in most seeds and plant tissues.
  • Corn can have one to four R alleles that regulate pigmentation in a developmental and tissue dependent manner.
  • the transgenic expression of an R gene in a cell leads to the formation of a red pigment.
  • Corn lines that carry the dominant alleles of the genes of the anthocyanin biosynthetic pathways (C2, Al, A2, Bzl and Bz2), but have a recessive allele of the R locus, would result in red pigmentation when transformed and transgenically expressed.
  • the Wisconsin 22 line can be used, which contains the rg-Stadler allele and TR112, a K55 derivative which is r-g, b, Pl.
  • the alternative can be used, which contains the rg-Stadler allele and TR112, a K55 derivative which is r-g, b, Pl.
  • Genotype can be used as long as the Cl and R alleles are introduced together.
  • ⁇ -lactamase gene (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sei USA 75: 3737-3741): encodes an enzyme for various chromogenic substrates (e.g. PADAC, a chromogenic cephalosporin).
  • xylE gene (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80: 1101-1105): encodes a catechol dioxygenase that can convert chromogenic catechols. 5.
  • Alpha amylase gene (Ikuta et al. (1990) Bio / technol. 8: 241-242).
  • Tyrosinase gene (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703-2714): Coded for an enzyme that tyrosine too
  • ⁇ -galactosidase gene encoded for an enzyme for which various chromogenic substrates are available.
  • Luciferase (lux) gene (Ow et al. (1986) Science, 234: 856-859; Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324-414) allows bioluminescence detection. Luciferases such as the "firefly luciferase" enable quantification using X-ray films, scintillation counters, fluorescence spectrophometers, sensitive, photon-counting cameras or luminometers. Chromogenic substrates and other auxiliaries are used for this. The system can be used to screen
  • Aequoringen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259-1268): Can be used in calcium-sensitive bioluminescence detection.
  • GFP green fluorescent protein
  • GFP expression in a plant or cell can be visualized as a result of illumination with light of specific wavelengths.
  • Chloramphenicol acetyl transferase neomycin phosphotransferase (NPT), nopaline synthase (NOS), octopine synthase (OCS) can also be used as marker proteins.
  • NPT neomycin phosphotransferase
  • NOS nopaline synthase
  • OCS octopine synthase
  • origins of replication which ensure an increase in the expression cassettes or vectors according to the invention in, for example, E. coli.
  • origins of replication include ORI (origin of DNA replication), pBR322 ori or P15A ori (Sabrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • nucleic acid sequence to be expressed transgenically numerous advantageous forms of use for the promoters, vectors, expression cassettes according to the invention or organisms transformed with them are possible. Numerous possibilities of use are known to the person skilled in the art. In addition to improving plant properties (e.g. nutrient content or composition, taste, yield, etc.), other advantageous properties such as male or female sterility, increased stress tolerance and / or resistance (against e.g. drought, heat, salt, cold, frost, increased) can also be used Moisture, oxidative stress etc.) can be achieved.
  • the applications and nucleic acid sequences mentioned as a result are therefore to be understood as exemplary and not restrictive.
  • a plant's natural defense mechanisms against pathogens are often inadequate.
  • the introduction of foreign genes from plants, animals or microbial sources can strengthen the immune system. Examples are protection against insect damage in tobacco by expression of the Bacillus thuringiensis endotoxin (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) or protection of the tobacco against fungal attack by expression of a chitinase from the bean (Broglie et al. (1991 Science 254: 1194-1197).
  • Previous approaches have been based on constitutive overexpression of these genes. Desirably, however, these antibodies should only be expressed when the need arises as a result of a pathogen attack.
  • a constitutive overexpression - even when there is no need - can have an adverse effect on the growth, yield and other properties of the plant.
  • constitutive expression can increasingly switch off the transgene ("gene silencing").
  • Transgenic expression of certain polypeptides can lead to increased resistance to bacterial and fungal attack.
  • Preferred is the expression of so-called "peptide antibiotics", “pathogenesis related” (PR) proteins, toxin resistance, and of proteins which relate to the host-pathogen interaction.
  • Preferred peptide antibiotics count to the class of Cecropine or Magainine and inhibit the growth of different types of bacteria and fungi.
  • PR genes can also confer resistance to pests. These genes are naturally induced as a result of pest infestation and are divided into different classes (Bol et al. (1990) Annu Rev Phytopath 28: 113-138).
  • the PR proteins include ß-1, 3-glucanases, chitinases, osmotin and other proteins.
  • Resistance to, for example, fungi, insects, nematodes and diseases can be achieved through the targeted secretion or enrichment of certain metabolites or proteins.
  • examples include glucosinolates (defense against nematodes), lysozymes from non-plant sources such as, for example, T4 lysozyme or lysozyme from various mammals, arcelin, ⁇ -amylase inhibitor,
  • RNAsen or ribozymes as well as further nucleic acid sequences or proteins listed below.
  • Examples include:
  • Bt genes Bacillus thuringiensis crystal toxin genes (Bt genes; Watrud et al. (1985) In: Engineered Organisms and the Environment). Bt genes confer resistance to
  • BT genes Lepidopteran or Coleopteran parasites, such as the European corn borer (European Corn Borer (ECB)).
  • European corn borer European Corn Borer (ECB)
  • EBC European Corn Borer
  • Different BT genes coding for complete or truncated BT proteins are described.
  • BT genes are described in which the coding
  • protease inhibitors can also confer resistance to insect attack (Johnson et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86: 9871-9875).
  • the protease inhibitor II gene (pinII) from tomato or potato is particularly preferred. A combined one is very particularly preferred
  • Coexpression of a pinll gene with a Bt gene is also preferred.
  • cowpea trypsin inhibitor CpTI; Hilder VA et al. (1989) Plant Mol Biol 13 (6): 701-10.
  • genes which code for enzymes or cofactors which inhibit the digestive system of insects include its oryzacystatin and amylase inhibitors (e.g. from wheat or barley).
  • Lectins are multivalent carbohydrate-binding proteins with the ability to agglutinate red blood cells of different species. Lectins have insecticidal activity against a number of pests (Murdock et al. (1990) Phytochemistry 29: 85-89;
  • Lectingenes that can be used advantageously include phytohemagglutinin, snowdrop lectin, barley and wheat germ agglutinin (WGA), and rice agglutinins (Gatehouse et al. (1984) J Sei Food Agric 35: 373-380), with WGA being particularly preferred.
  • Genes that control the production of small or larger polypeptides with insecticidal activity are also included. Examples are juvenile hormone esterase (Hammock et al. (1990) Nature 344: 458-461) or compounds which impair the pupation of insects by inhibiting the expression or the activity of the ecdysteroid UDP-glucosyl transferase.
  • Genes coding for avermectin (avermectin and abamectin; Campbell WC (ed.), In: Avermectin and Aba ectin, 1989. Ikeda et al. (1987) J Bacteriol 169: 5615-5621), and genes coding for ribosome inactivating proteins (RIPs).
  • Enzymes that affect the integrity of the insect cover are also preferred. Examples include genes which code for chitinases (such as, for example, the chit42 endochitinase from Trichoderma harzianum; GenBank Acc.-No .: S78423) or glucanases, proteases or lipases, and also genes which code for the production of nikkomycin
  • genes are preferred which reduce the quality of the plant as insect food.
  • An insecticidal effect can be achieved by changing the sterol composition.
  • Lipoxygenase are also natural, plant-based enzymes, which can be assigned the property of reducing the suitability of a plant as an insect food.
  • Achieving insect defense or attraction for example by increasing the release of volatile fragrance or messenger substances by, for example, enzymes from terpene biosynthesis.
  • Expression of enzymes with a function in the biosynthesis of alkaloids such as is preferred
  • Benzophenanthridine alkaloids and indole alkaloids as well as of terpene biosynthesis enzymes such as monoterpenes and sesquiterpenes.
  • the overexpression of endoxyloglucan transferase may be mentioned as an example.
  • phenylammonylases and other enzymes of the phenylpropanoid pathway which are responsible for the biosynthesis of a large number of compounds based on the phenylpropane backbone, e.g. Lignin, phytoalexins, pterocarpones, furano-coumarins. Expression of is also preferred
  • Isoflavone-2-hydroxylases and of enzymes with a function in lignin polymerization such as anionic pe- roxidasen.
  • the expression of cell wall proteins such as glycine hydroxyproline-rich proteins (for example exlensins) is also preferred.
  • the transgenic expression of certain genes can provide resistance to virus attack.
  • virus infection can be prevented by expression of viral coat proteins (Cuozzo et al. (1988) Bio / Technology, 6: 549-553; Hemenway et al. (1988) EMBO J 7: 1273-1280; Abel et al. (1986) Science 232: 738-743).
  • antisense nucleic acid sequences of certain viral genes e.g. genes of the viral replication apparatus
  • ribozymes can also be used advantageously.
  • Other approaches include the use of satellite viruses.
  • An increase in the quality and / or quantity of the crop yield e.g. increased amount of fruit or seeds
  • influencing the rate of growth to faster or slower growth enabling growth outside the usual growth period
  • resistance to adverse weather conditions heat, dryness, wet, cold, Frost
  • Numerous methods, proteins etc. are known to the person skilled in the art, with the aid of which these properties can be achieved. Examples include:
  • Nucleic acids which code for the transcriptional activator CBF1 from Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No .: U77378) or the "antifreeze protein" from Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No .: AF306348) or functional equivalents thereof are particularly preferred.
  • nucleic acid sequences that confer such resistance are described above.
  • the combination of these sequences with one of the promoters according to the invention is particularly advantageous, since the resistance can only be generated in a constitutive manner if necessary (after induction with a chemical inductor).
  • the constitutive expression has further potentially negative consequences when it is approved under consumer acceptance.
  • Expression of resistance is required from a practical point of view - in the laboratory - only when producing a transgenic plant (using the resistance as a selection marker) or - in agriculture - only when herbicides are used. Especially in the latter case, the combination of herbicide and chemical inducer in one formulation would be seen as an advantageous application.
  • nucleic acid sequences that can act as reporters or marker genes are described above.
  • the combination of these sequences with the promoters according to the invention is a particularly preferred embodiment, since it enables the identification of further chemical inducers, for example as part of the screening of chemical substance libraries. Due to the expression behavior of the BCI-3 and BCI-4 genes, it can be assumed that chemical inducers of these genes also induce SAR.
  • Such chemical compounds are extremely interesting compounds for use in agriculture. Similar to the BION ⁇ , they have the potential to induce resistance to pathogens after application to the plant.
  • An object of the invention therefore includes methods for the identification of pathogen resistance-inducing compounds, characterized in that
  • an expression cassette consisting of a reporter gene in functional linkage with a chemically inducible promoter selected from the group of sequences consisting of
  • the organism or the tissue, organ, part, cell culture or cell thereof is treated with a chemical compound selected from a library of chemical compounds, and
  • an "antisense” nucleic acid initially means a nucleic acid sequence which is completely or partially complementary to at least part of the "sense" strand of a target protein to be repressed. It is known to the person skilled in the art that he can use alternative cDNA or the corresponding gene as a starting template for corresponding antisense constructs.
  • the “antisense” nucleic acid is preferably complementary to the coding region of the target protein or a part thereof. However, the “antisense” nucleic acid can also be complementary to the non-coding region or a part thereof.
  • an antisense nucleic acid can be designed in the manner familiar to the person skilled in the art, taking into account the base pair rules of Watson and Crick.
  • the antisense nucleic acid comprises ⁇ -anomeric 0 nucleic acid molecules.
  • ⁇ -Anomeric nucleic acid molecules form special double-stranded hybrids with complementary RNA in which, in contrast to the normal ⁇ units, the strands run parallel to one another (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6625-6641). 5
  • the antisense strategy can advantageously be coupled with a ribozyme method.
  • Ribozymes are catalytically active RNA sequences which, coupled to the antisense sequences, catalytically cleave the target sequences (Tanner NK (1999) FEMS 0 Microbiol Rev 23 (3): 257-75). This can increase the efficiency of an anti-sense strategy.
  • the expression of ribozymes to reduce certain proteins is known to the person skilled in the art (EP 291 533, EP 321 201, EP 360 257). Suitable target sequences and ribozymes can, for example, as described by Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. Eds, Academic Press, Inc.
  • RNA By expression of a sense RNA that is homologous to that of an endogenous transcript, the expression of the corresponding endogenous protein can also be reduced (co-suppression). It has been demonstrated in tobacco, tomato and petunia that the expression of sense RNA to an endogenous gene can reduce or switch off its expression, similar to that described for antisense approaches (Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88: 1770-1774; Smith et al. (1990) Mol ⁇ Gen Genet 224: 447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2: 291-99). The introduced construct can represent the gene to be reduced in whole or in part. The possibility of translation is not necessary. Corresponding methods are described (EP 465 572; EP 647 715; US 5,283,184; US 5,231,020).
  • dsRNAi double-stranded RNA interference
  • double-stranded RNA intererence The method of gene regulation using double-stranded RNA (“double-stranded RNA intererence") is very particularly preferred.
  • Corresponding processes are known to the person skilled in the art and are described in detail (for example Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364).
  • the simultaneous introduction of strand and counter strand results in highly efficient suppression of native genes.
  • Another object of the invention relates to transgenic organisms, transformed with at least one expression cassette according to the invention or a vector according to the invention, as well as cells, cell cultures, tissues, parts - such as leaves, roots etc. in plant organisms - or well propagated from such organisms.
  • Organism, starting or host organisms are understood to mean prokaryotic or eukaryotic organisms, such as, for example, microorganisms or plant organisms.
  • Preferred microorganisms are bacteria, yeast, algae or fungi.
  • Preferred bacteria are bacteria of the genus Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes or cyano-bacteria, for example of the genus Synechocystis.
  • microorganisms which are capable of infecting plants and thus of transmitting the constructs according to the invention.
  • Preferred microorganisms are those from the genus Agrobacterium and in particular from the type Agrobacterium turnefaciens.
  • Preferred yeasts are Candida, Saccharo yces, Hansenula or Pichia.
  • Preferred mushrooms are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria or others in Indian Chem Engr. Seetion B. Vol 37, No 1,2 (1995) on page 15, table 6 described mushrooms.
  • Plants are particularly preferred host or starting organisms as transgenic organisms. Included in the scope of the invention are all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Also included are the mature plants, seeds, sprouts and seedlings, as well as parts, propagation material and cultures derived from them, for example cell or callus cultures. Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development.
  • transgenic plants according to the invention are selected in particular from monocotyledonous crop plants, such as, for example, cereals of the genus Gramineae (such as rice, corn, wheat), in particular wheat, barley, millet, rye, triticale, corn, rice or oats and sugar cane.
  • the transgenic plants according to the invention are selected in particular from dicotyledonous crop plants, such as, for example
  • Brassicacae such as rapeseed, cress, Arabidopsis, turnip,
  • Leguminosae such as soy, alfalfa, pea, alfalfa, bean or peanut
  • Solanaceae such as potato, tobacco, tomato, or eggplant
  • Asteraceae such as sunflower, tagetes, lettuce or calendula, Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini, Rubiaceae such as Coffea arabica or Coffea liberica (coffee bush)
  • Theaceae such as Camillia sinensis or Thea sinensis
  • Plant organisms in the sense of the invention are further photosynthetically active capable organisms, such as algae or cyanobacteria, and mosses.
  • Preferred algae are green algae, such as algae of the genus Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox or Dunaliella.
  • the production of a transformed organism or a transformed cell requires that the corresponding DNA (for example one of the expression cassettes or vectors according to the invention) is introduced into the corresponding host cell.
  • a large number of methods are available for this process, which is referred to as transformation (see also Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 527-537).
  • the DNA can be introduced directly by microinjection or by bombardment with DNA-coated microparticles.
  • the cell can also be chemically permeabilized, for example with polyethylene glycol, so that the DNA can get into the cell by diffusion.
  • the DNA can also be obtained by protoplast fusion with other DNA-containing units such as minicells, cells, lysosomes or liposomes.
  • Electroporation is another suitable method for introducing DNA in which the cells are reversibly permeabilized by an electrical pulse.
  • Such and other methods are described, inter alia, by Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228: 104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208: 1265; Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al.
  • Suitable methods are above all protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun, the so-called particle bombardment method, electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution and microinjection.
  • transformation can also be carried out by bacterial infection using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes (Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229; Marton L (1984) Cell Culture and Somatic Ceil Genetics of Plants 1: 514-521).
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229; Marton L (1984) Cell Culture and Somatic Ceil Genetics of Plants 1: 514-521.
  • T-DNA transferred DNA
  • the Agrobacterium -mediated transformation is best suited for dicotyledonous, diploid plant cells, whereas the direct transformation techniques are suitable for every cell type.
  • the expression cassette is introduced by means of plasmid vectors.
  • Preferred vectors are those which enable stable integration of the expression cassette into the host genome.
  • plasmid In the case of injection or electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements for the plasmid used. Simple plasmids such as the pUC series can be used. If complete plants are to be regenerated from the transformed cells, it is necessary that there is an additional selectable marker gene on the plasmid.
  • Transformation techniques are described for various monocot and dicotyledonous plant organisms. Furthermore, various possible plasmid vectors stand for the introduction of foreign ones Genes are available in plants, which usually contain an origin of replication for reproduction in E. coli and a marker gene for selection of transformed bacteria. Examples are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
  • the expression cassette can be inserted into the vector via a suitable restriction site.
  • the resulting plasmid is first introduced into E. coli. Correctly transformed E. coli are selected, grown and the recombinant plasmid obtained using methods familiar to the person skilled in the art. Restriction analysis and sequencing can be used to check the cloning step.
  • Transformed cells i.e. Those that contain the inserted DNA integrated into the DNA of the host cell can be selected by untransforced ones if a selectable marker is part of the inserted DNA. Any gene that can confer resistance to antibiotics or herbicides can act as a marker, for example. Transformed cells that express such a marker gene are able to survive in the presence of concentrations of a corresponding antibiotic or herbicide that kill an untransformed wild type. Examples are the bar gene that confers resistance to the herbicide phosphinotricin (Rathore KS et al.
  • the expression cassette must be integrated in special plasmids, either in an intermediate vector (English: shuttle or intermediate vector) or in a binary vector. If, for example, a Ti or Ri plasmid is to be used for the transformation, at least the right boundary, but mostly the right and the left boundary of the Ti or Ri plasmid T-DNA as flanking region, is connected to the expression cassette to be inserted.
  • Binary vectors are preferably used. Binary vectors can replicate in both E.coli and Agrobacterium.
  • the selection marker gene allows selection of transformed agrobacteria and is, for example, the nptll gene which confers resistance to kanamycin.
  • a host Agrobacterium that is functioning should already contain a plasmid with the vir region. This is necessary for the transfer of T-DNA to the plant cell.
  • An Agrobacterium transformed in this way can be used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and described (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam, Chapter V; Fraley RT et al. (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80 (15): 4803-7. And An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287).
  • Various binary vectors are known and some are commercially available, for example pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
  • plant explants are co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes Starting from infected plant material (e.g. parts of leaves, roots or stems, but also protoplasts or suspensions of plant cells), whole plants can be regenerated using a suitable medium that can contain, for example, antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants obtained can then be screened for the presence of the introduced DNA, here the expression cassette according to the invention.
  • the corresponding genotype is generally stable and the corresponding insertion is also found in the subsequent generations.
  • the integrated expression cassette contains a selection marker which gives the transformed plant resistance to a biocide (for example a herbicide) or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin etc.
  • the selection marker allows the selection of transformed cells from untransforced (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
  • the plants obtained can be in the usual
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens. Mieren, for example pBinl9 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711).
  • a whole plant can be obtained using methods known to those skilled in the art. This is based on the example of callus cultures. The formation of shoots and roots can be induced in a known manner from these still undifferentiated cell masses. The sprouts obtained can be planted out and grown.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed nucleic acids can be determined, for example, in vitro by sprout meristem propagation using one of the selection methods described above.
  • transgenic organisms described above cell cultures, parts - such as roots, leaves, etc. in transgenic plant organisms - and transgenic propagation material such as seeds or fruits.
  • Genetically modified plants according to the invention which can be consumed by humans and animals can also be used as food or feed, for example directly or after preparation known per se.
  • Another object of the invention relates to the use of the transgenic organisms according to the invention described above and the cells, cell cultures, parts derived therefrom - such as roots, leaves etc. in transgenic plant organisms - and transgenic propagation material such as seeds or fruits for the production of food or feed, pharmaceuticals or fine chemicals.
  • This process is widely applicable to fine chemicals such as enzymes, vitamins, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavors, aromas and colors.
  • the production of vitamins and vitamin precursors is particularly preferred, in particular tocopherols and tocotrienols and caro- tinoiden.
  • the transformed host organisms and the isolation from the host organisms or from the growth medium are cultivated using methods known to those skilled in the art.
  • the production of pharmaceuticals, such as antibodies or vaccines is described in Hood EE and Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10 (4): 382-6; Ma JK Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236 275-92.
  • SEQ ID NO: 1 promoter and 5 'untranslated region of the barley BCI-3 gene (1850 bp)
  • SEQ ID NO: 2 promoter and 5 'untranslated region of the BCI-4 gene from barley
  • SEQ ID NO: 5 "Prom900" deletion variant of the BCI-3 promoter from barley (898 bp)
  • SEQ ID NO: 6 "Prom1200" deletion variant of the BCI-3 promoter from barley (1173 bp)
  • SEQ ID NO: 7 "Proml700” variant of the BCI-3 promoter from barley (1772 bp)
  • SEQ ID NO: 8 "Prom900" variant of the BCI-4 promoter from barley (904 bp)
  • SEQ ID NO: 9 oligonucleotide primers M13-fwd 5 '-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
  • SEQ ID NO: 10 oligonucleotide primers Ml3-Rev 5 '-GGAAACAGCTATGACCATG-3'
  • SEQ ID NO: 11 oligonucleotide primers PPl-5 5'-CTC GCA GTT GGC CGG CAC CGT-3 '
  • SEQ ID NO: 12 oligonucleotide primers PPl-3 5 '-TGA CCC CAT GTA CTA CAT CGCCT-3'
  • SEQ ID NO: 13 oligonucleotide primers PP2-5 5'-CTT CCA GTC CCG CAC GTT GTA C-3 '
  • SEQ ID NO: 14 oligonucleotide primer PP2-3 5 '-GTC GGT TGC GGC TAT TTG ATT GC-3'
  • SEQ ID NO: 15 oligonucleotide primers PP3-5 5 '-AGC CAT CAT CCC TGC GGA TCC A-3' 16.
  • SEQ ID NO: 16 oligonucleotide primers PP3-3 5 '-GAG CGT CCG GGC GCG GCC TT-3'
  • SEQ ID NO: 17 oligonucleotide primer PP4-5 5'-GGA TCC AAG CGA GAT TTG AAC GGA-3 '
  • SEQ ID NO: 18 oligonucleotide primers PP4-3 5 '-GCG GCC TTG CCG GAC GCG GT-3'
  • SEQ ID NO: 19 oligonucleotide primer PP5-5 5 '-GTA TGC CGC TCC ATG TTA GAA GAT-3'
  • SEQ ID NO: 20 oligonucleotide primers PP5-3 5 '-ACA TTA CAG GCA GCG TCC GAC AC-3'
  • SEQ ID NO: 21 oligonucleotide primer PP6-5 5'-ACT CAT GCC GGT GCA GAT CTT CG-3 '
  • SEQ ID NO: 22 oligonucleotide primer PP6-3. - 5 '-ATG CGG GGA TGA GGA GGA CAT G-3'
  • SEQ ID NO: 23 oligonucleotide primer BCI3-5 5 '-aagcttcaccaactcccttcaaggtctaa-3'
  • SEQ ID NO: 24 oligonucleotide primer BCI3-3 5 '-ctgcagtgtgtgtgcttgctgtgatgc-3'
  • SEQ ID NO: 25 oligonucleotide primers P300-5
  • SEQ ID NO: 26 oligonucleotide primer P600-5 5 '-aag £ tttagctccgttcccatgatct-3'
  • SEQ ID NO: 27 oligonucleotide primer P900-5 5 '-aagcttggctaatatgcgcgtaaaa-3'
  • SEQ ID NO: 28 oligonucleotide primer P1200-5 5 '-aagcttcgtccaattctaggatgatgatgc-3' BCI3-3
  • SEQ ID NO: 29 oligonucleotide primer OPNl 5 '-TGA ATG GTC ATG GCT GCT TA-3'
  • SEQ ID NO: 30 oligonucleotide primers OPN2 5 '-GGC TCT GAA TCG CAC ATT CT-3' 31.
  • SEQ ID NO: 31 oligonucleotide primer OPN3 5 '-GTA CCT CTC CTC CCC GCT CAC T-3'
  • SEQ ID NO: 32 oligonucleotide primer OPN4 5 '-GCC TCG TTG TAA CGG GTA CT-3'
  • SEQ ID NO: 33 oligonucleotide primer OPN5 5 '-TCATGCATATCTATGTCTTTCTCTTC-3'
  • SEQ ID NO: 34 oligonucleotide primer OPN6 5'-AAA CGA TTC GCT GCA AAA AT-3 '
  • SEQ ID NO: 35 oligonucleotide primer OPN7 5 '-GTA CCT CTC CCC GCT CAC T-3'
  • SEQ ID NO: 36 oligonucleotide primer BCI4-5 5 '-agcgaatcgtttttcccttt-3'
  • SEQ ID NO: 37 oligonucleotide primer BCI4-3 5 '-cctgagtgtacggctctgagatg-3'
  • Fig. 1 Overview of the BCI-3 promoter-reporter constructs that were used for the transient assay.
  • Fig. 2 Induction of BCI3 promoter activity by BTH (BION). Eight leaf segments per experiment were evaluated.
  • the number of GFP-positive cells [GFP] is indicated on the y-axis.
  • the entire BCI3 promoter (BCI3-Prom 1700) and the different deletion variants (BCl3-Prom 300; BCI3-Prom 600; BCI3-Prom 900; BCl3-Prom 1200) are listed on the y axis.
  • the results are given in each case for leaves treated with BTH (white bars) or untreated sheets (black bars). Transformation with the pGFP blank vector did not result in GFP positive cells.
  • the high background activity in untreated cells is probably due to the injury to the cells due to the bombardment with the tungsten particles (see below).
  • Fig. 3 Induction of BCI3 promoter activity by jasmonate (JA). Eight leaf segments per experiment were evaluated. The number of GFP-positive cells [GFP] is on the y-axis. given. The y-axis shows the entire BCI3 promoter (BCI3-Prom 1700) and the various deletion variants (BCI3-Prom 300; BCI3-Prom 600; BCI3-Prom 900; BCI3-Prom 1200). The results are given in each case for sheets treated with JA (white bars) or untreated sheets (black bars). Transformation with the pGFP blank vector did not result in GFP positive cells. The high background activity in untreated cells is probably due to the injury to the cells due to the bombardment with the tungsten particles (see below).
  • Fig. 4 Repression of BCI3 promoter activity by sorbitol. Eight leaf segments per experiment were evaluated. The number of GFP-positive cells [GFP] is indicated on the y-axis. The entire BCI-3 promoter (BCI3-Prom 1700) and the various deletion variants (BCI3-Prom 300; BCl3-Prom 600; BCl3-Prom 900; BCI3-Prom 1200) are listed on the y axis. The results are given for leaves treated with sorbitol (white bars) and untreated leaves (black bars). Transformation with the pGFP blank vector did not result in GFP positive cells. The high background activity in untreated cells is probably due to the injury to the cells due to the bombardment with the tungsten particles (see below).
  • Fig. 5 Analysis of the BCI-3 and BCI-4 promoter properties by Northern blot analyzes.
  • RNA 100 mg / 1 SA based on the volume of the soil or poured with water (H0). Primary leaves of the barley plants were harvested at the times indicated on the x-axis (hours after induction) and total RNA was extracted. After gel electrophoretic separation (9 to 10 ⁇ g RNA per lane) and preparation of Northern blots, the mRNA was hybridized with probes from BCI-3 and BCI-4 under stringent conditions. The uniform RNA loading of the gel was checked using ethidium bromide-mediated fluorescence of the ribosomal RNA under UV light.
  • RNA separation (10 ⁇ g RNA per lane), Northern blots were hybridized with BCI-3 and BCI-4 transcript or DNA probes under stringent conditions. The uniform RNA loading of the gel was checked on the basis of ethidium bromide-mediated fluorescence of the ribosomal RNA under UV light. BCI-4 showed no differential expression after sorbitol treatment.
  • RNA loading of the gel was determined using ethidium bromide mean fluorescence of the ribosomal RNA checked under UV light.
  • Fig. 7 Analysis of the BCI-3 and BCI-4 promoter properties in wheat by Northern blot analysis.
  • the transcript accumulation of the BCI genes after BTH application or real wheat powdery mildew (Bgt) inoculation of wheat plants was examined.
  • Fourteen day old wheat plants cv. Registrars were sprayed with 100 mg / 1 BTH (BTH) or, as a control, with the empty formulation WP (K), or inoculated with powdery mildew (Bgt). Secondary leaves were harvested at the indicated times (dpt / dpi) and total RNA extracted. After gel electrophoretic separation (approx. 10 ⁇ g RNA per lane) and preparation of Northern blots, the mRNA was hybridized with probes from BCI-3 and BCI-4 under less stringent (60 ° C.) conditions than barley samples.
  • a watering treatment with 20 mg / 1 BTH ("+”) based on the soil volume was carried out three days before the harvest, or no treatment ("-").
  • Intercellular washing liquid (IWF) was two days after the application of 20 mg / 1 BTH ("+"), or the equivalent amount of the empty formulation (WP, "-") based on the soil volume from seven-day-old barley plants cv. Ingrid won.
  • oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the cloning steps carried out in the context of the present invention such as, for example, restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria Multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA are carried out as in Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6.
  • the barley variety Ingrid (Hordeum vulgäre L. cv Ingrid) comes from James McKey, University of Uppsala, Sweden.
  • the Golden Promise barley variety was provided by Paul Schulze-Lefert, Max Planck Institute for Plant Breeding Research, Cologne.
  • the seeds which had been pre-germinated in the dark on moist filter paper for 12 to 36 hours, were, unless otherwise stated, placed on the edge of a square pot (8x8cm) in Fruhstorfer earth of type P, 5 grains, covered with earth and regularly watered with tap water. All plants were grown in climate cabinets or chambers at 16 to 18 ° C, 50 to 60% relative humidity and a 16-hour light / 8-hour dark cycle with 3000 or 5000 lux (50 or 60 ⁇ ols - ⁇ - 2 photon flux density ) Cultivated for 5 to 8 days and used in the seedling stage in the experiments. In experiments in which applications were carried out on primary leaves, these were fully developed. Plants that were to be cultivated until the development of spikes were potted individually in Fruhstorfer Erde LD 80, watered regularly, repotted into larger pots if necessary and additionally illuminated in the greenhouse.
  • the epidermis of the abaxial leaf blade was removed from barley primary leaves at different harvest times and separated from the rest of the leaf tissue (mesophyll and epidermis of the adaxial leaf blade) in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
  • Conidiospores of Blumeria [syn Erysiphe] graminis f.sp. were used for the inoculation of barley plants with the real barley powdery mildew. Hordei spear of breed A6 (BghA ⁇ ) used (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148). This was provided by Jörn Pons-Kühne- mann, Institute for Biometry, JLU G devisen. The inoculum was grown in climatic chambers under the same conditions as described for the plants above, by transferring the conidia from infected plant material to regularly grown, 7-day-old barley plants cv. Golden Promise at a density of 100 Konidia / mm 2 .
  • BghA6 was inoculated using 7-day-old seedlings by shaking off the conidia of plants already infected in an inoculation tower with about 1 to 8 conidia / mm (unless stated otherwise).
  • Conidia from Blumeria graminis f.sp. were used to inoculate with the powdery mildew of wheat.
  • tritici spear (Bgt) used.
  • Bgt was a field isolate from Aachen, which was isolated from wheat in 1995 by Uli Beckhove, Institute for Phytopathology and Applied 5 Zoology (IPAZ) G collecten, and made available to the institute. In climatic chambers or cabinets, the isolate was exposed to wheat cv under the conditions mentioned above. Chancellor (seed breeding Engelen-Büchling oHG, Büchlingen / Oberschneiding).
  • Bacillus subtilis came from the culture collection of the Institute for Phytopathology and Applied Zoology (IPAZ), G corden, Germany.
  • the Pseudomonas strains were made available by Ina Budde and Dr Ullrich, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Marburg
  • RNA Extraction Buffer AChinsky RNA Extraction Buffer
  • the central primary leaf segment of 5 cm in length was harvested and homogenized in liquid nitrogen in mortars.
  • the homogenate was stored at -70 ° C. until the RNA extraction.
  • the frozen leaf material was extracted using an RNA
  • RNA was then dissolved in 50 ⁇ L DEPC water on ice, mixed and centrifuged for 5 min (see above). 40 ⁇ l of the supernatant was transferred as an RNA solution into a new microcentrifuge tube and stored at -70 ° C.
  • the concentration of the RNA was determined photometrically.
  • the concentrations of the RNA solutions were then adjusted to 1 ⁇ g / ⁇ L with DEPC water and checked in the agarose gel.
  • RNA concentrations in the horizontal agarose gel 1% agarose in 1 x MOPS buffer with 0.2 ⁇ g / mL ethidium bromide
  • 1 ⁇ L RNA solution with 1 ⁇ L 10 ⁇ MOPS, 1 ⁇ L color marker and 7 ⁇ L DEPC- Water added, separated according to their size at 120 V voltage in the gel in 1 x MOPS running buffer for 1.5 h and photographed under UV light. Any differences in concentration of the RNA extracts were compensated with DEPC water and the adjustment was checked again in the gel.
  • DEPC water bidistilled water, 0.1% [w / v] DEPC (diethyl pyrocarbonate), stir for at least 2 h, incubate overnight at 37 ° C, then autoclave.
  • RNA was separated in the agarose gel under denaturing conditions. A portion of RNA solution (corresponding to 6 to 15 ⁇ g RNA) was mixed with the same volume of sample buffer (with ethidium bromide), denatured for 5 min at 94 ° C., placed on ice for 5 min, briefly centrifuged and applied to the gel. The 1 x MOPS gel (1.5% agarose, ul tra pure) contained 5 volume percent concentrated formaldehyde solution (36.5% [v / v]). The RNA was separated at 100 V for 2 h and then blotted.
  • Northern blotting was carried out as an upward-directed RNA transfer in the capillary stream.
  • the gel was first swung in 25 mM sodium hydrogen / dihydrogenphosphate buffer (pH 6.5) and cut to size. Whatman paper was prepared so that it rested on a horizontal plate and protruded on two sides in a tub with 25 mM sodium hydrogen / dihydrogen phosphate buffer (pH 6.5). The gel was placed on this paper, leaving uncovered parts of the Whatman paper with a plastic film were covered. The gel was then covered with a positively charged nylon membrane (Boehringer-Mannheim) free of air bubbles, after which the membrane was again covered with absorbent paper in several layers about 5 cm high.
  • a positively charged nylon membrane Boehringer-Mannheim
  • the absorbent paper was weighed down with a glass plate and a 100 g weight. The blotting was carried out overnight at room temperature. The membrane was briefly distilled in A. swung and irradiated for RNA fixation with a light energy of 125 m in the crosslinker (biorad) UV light. The uniform RNA transfer to the membrane was checked on the UV light bench.
  • RNA from each sample were separated on an agarose gel and blotted onto a positively charged nylon membrane by capillary transfer. The detection was carried out with the DIG systems.
  • mRNA probes based on the BCI-3 (GenBank Acc.-No: AJ250282) and BCI-4 (GenBank Acc. -No.: AJ250283) cDNA sequences were prepared by first using the in the vector The cDNA fragments contained in pGEMT were amplified by the plasmid in such a way that a polymerase binding site was present at the 3 'end of the sequence, from which the antisense strand was then synthesized by in vitro transcription using a T7 or SP6 RNA polymerase with labeled UTPs could be. M13reverse and M13universal primers were used as primers in the PCR reaction. The probe was labeled with digogygenin or fluorescein or radioactive.
  • the insert of the individual vectors was amplified by PCR with flanking standard primers (M13 fwd and rev). The reaction proceeded with the following final concentrations in a total volume of 50 ⁇ L PCR buffer (Silverstar):
  • the amplificate was cleaned up using the High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer, Mannheim) according to the manufacturer's instructions and 4 ⁇ L were used as templates for the reaction with the corresponding DNA-dependent RNA polymerase (SP6 or T7 polymerase).
  • 4 ⁇ l of the purified PCR product were mixed with 2 ⁇ L of transcription buffer, 2 ⁇ l of NTP labeling mix, 2 ⁇ l of NTP mix and 10 ⁇ l of DEPC water. 2 ⁇ L of the T7 RNA polymerase solution were then pipetted in.
  • the reaction was then carried out at 37 ° C. for 2 h and then made up to 100 ⁇ L with DEPC water.
  • the RNA probe was detected in the ethidium bromide gel and stored at -20 ° C.
  • the reaction mixture (20 ⁇ L) for non-radioactive probes was mixed with 1 ⁇ digoxigenin or fluorescein-RNA labeling mix (Boehringer, Mannheim), that for radioactive probes with 1 mM ATP, GTP and CTP, as well as 25 ⁇ Ci a 32 P UTP , each with 40 u RNase inhibitor (Boehringer, Mannheim) and 40 u RNA polymerase in 1 x transcription buffer (Boehringer, Mannheim) incubated at 37 ° C for 2 h.
  • the reaction for the non-radioactive labeling was stopped by adding 80 ⁇ L of DEPC water and the result was checked in the agarose gel.
  • the approach for the radioactive labeling was mixed with 30 ⁇ L DEPC water, the probe was cleaned over MicroSpin G-25 columns (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg), and the number of radioactive decays measured in an aliquot (cpm, multipurpose Scintillation Counter, Coulter LS6500, Beckman, Kunststoff).
  • RNA polymerization, hybridization and immunodetection were largely carried out according to the manufacturer of the kit for non-radioactive RNA detection (BIG system User's Guide, DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim, Kogel et al. (1994) Plant Physiol 106: 1264-1277).
  • the membranes were first swung for 5 3 ⁇ 20 min at 68 ° C. in 2 ⁇ SSC (salt, sodium cations), 0.1% SDS buffer (sodium dodecyl sulfate). The membranes were then placed on the inner wall of 68 ° C. preheated hybridization tubes (Hybaid, Heidelberg) and 30 min with 10 mL Dig-üasy hybridization buffer in the preheated hybridization
  • RNA-RNA hybrids were washed strictly twice for 20 min each in 0.1% (w / v) SDS, 0.1 x SSC at 20 68 ° C.
  • the blots were first swirled twice for 5 min at RT in 2 x SSC, 0.1% SDS. This was followed by 2 stringent washing steps at 68 ° C in 0.1 x SSC, 0.1% SDS for
  • DEPC water Distilled water is treated overnight at 37 ° C with diethyl pyrocarbonate (DEPC, 0.1%, w / v) and then autoclaved.
  • DEPC diethyl pyrocarbonate
  • 10 x MOPS buffer 0.2 M MOPS (morpholine-3-propanesulfonic acid), 0.05 M sodium acetate, 0.01 M EDTA, pH adjusted to pH 7.0 with 10 M NaOH, 1% [v / v] DEPC, autoclave. A small amount of concentrated MOPS buffer was correspondingly diluted with autoclaved DEPC water from the stock solution.
  • RNA sample buffer 760 ⁇ L formamide, 260 ⁇ L formaldehyde, 100 ⁇ L ethidium bromide (10 mg / mL in DEPC water), 80 ⁇ L glycerol, 80 ⁇ L bromophenol blue (saturated), 160 ⁇ L 10 x MOPS, 100 ⁇ L water
  • 10 x wash buffer without tween 1.0 M maleic acid, 1.5 M NaCl; without DEPC, adjust to pH 7.5 with NaOH (solid, approx. 77 g) and 10 M NaOH.
  • Substrate buffer adjust 100 mM Tris (trishydroxymethylamino-methane), 150 mM NaCl with 4 M HCl to pH 9.5.
  • 10 x color markers 50% glycerol (v / v), 1.0 mM EDTA pH 8.0, 0.25% bromophenol blue (w / v), 0.25% xylenecanol (w / v).
  • the membrane was prehybridized for at least 30 min in 10 mL lx hybridization buffer.
  • a volume of the probe corresponding to approx. 300000-400000 cpm / mL was used in a hybridization tube after denaturation in hybridization buffer (5 min at 90 ° C).
  • the mixture was then washed twice for 5 min with 2x SSC, 0.1% SDS in the tube and then with 0.1 x SSC, 0.1% SDS in a water bath at hybridization temperature until no radioactive background could be detected with the hand monitor.
  • the membranes were wrapped in cling film or sealed in plastic bags and exposed to an X-ray film (Kodak X-OMAT AR, Röntgen Bender, Baden-Baden) or a phosphor screen (Kodak Imaging Screen-K, Bio-Rad, Kunststoff).
  • the X-ray films were developed after a variable exposure time (see above), the phosphor screens were read out in the phosphor imager (Molecular Imager FX, Bio-Rad, Kunststoff) and with the Quantity One-4.1.1 program (Bio-Rad, Kunststoff) in a resolution of 200 ⁇ m documented.
  • 5x hybridization buffer 1% BSA (bovine serum albumin) (w / v), 1% polyvinylpyrrolidone 10 to 40 kDa (w / v), 1% Ficoll 1400000 (w / v), 250 mM TrisCl pH 7.5 (0, 8 M stock solution, autoclaved), 0.5% tetra-sodium diphosphate decahydrate (w / v), 5% SDS (sodium dodecyl sulfate) (w / v), sterile filtered (0.45 ⁇ m), with autoclave. Fill up water, lx hybridization buffer is diluted from 5x hybridization buffer with DEPC water.
  • Membranes that had already been hybridized with one probe could be "stripped" again for hybridization with another probe.
  • Digoxigenin or fluorescein labeled probes were washed by washing in A. bidest. (1 min at RT) and subsequent incubation of the membranes with boiled 0.1% SDS (w / v) (10 min at RT) removed.
  • Radioactively labeled probes were completely detached from the membranes by washing in 1% SDS (w / v), 50% formamide (v / v) for 20 to 40 min at 80 ° C.
  • the promoter of the BCI-3 gene from barley was isolated by means of the inverse polymerase chain reaction (iPCR) starting from genomic DNA from barley (variety Ingrid).
  • iPCR inverse polymerase chain reaction
  • 400 to 500 mg of leaf material cv. Ingrig WT
  • AXG 500 nucleobond columns Macherey & Nagel
  • 750 ng of genomic DNA were cut with the restriction endonucleases EcoRV, Ncol, Rsal, Eco91I or BamHI (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany).
  • the DNA was incubated in a total volume of 5 100 ⁇ l with 30 units of enzyme in the buffer for 4 h at 37 ° C. according to the manufacturer's instructions. This was followed by precipitation of the DNA with 0.1 volume of 3 M sodium acetate buffer (pH 5.2) and 2.5 volumes of ethanol overnight at -20 ° C.
  • the ligation was followed by precipitation with 0.1 volume of sodium acetate buffer (pH 5.2) and 2.5 volume of ethanol. After centrifugation (30 min, 14000 rpm (20,000 g), 4 ° C.), the pellet was washed with ethanol (70%), dried and suspended in 80 ⁇ l H 2 0 resus 0. 3 ⁇ l of this was used as a template for the iPCR.
  • the iPCR was carried out as a standard PCR.
  • a PCR was carried out using the primer pair 1 (SEQ ID NO: 3 and 4) with Pfu polymerase (Promega).
  • Pfu polymerase Promega
  • 5 the amplificate was re-amplified with the Taq polymerase using the nested primer pair 2 (SEQ ID NO: 5 and 6).
  • the PCR product was then cloned into pGEM-T (Promega) and sequenced. Primer pairs 3 and 40 were derived from the sequence information.
  • ligated genomic DNA - the primer pairs 3 and 4 were used as described above and the PCR product was cloned into pGEM-T (Promega) and sequenced. Primer pairs 5 and 6 were derived from the sequence information.
  • ligated genomic DNA - the primer pairs 5 and 6 were used as described above.
  • the PCR product was isolated from an agarose gel and cloned into the pGEM-T vector (Promega, Mannheim, Germany) by means of T-overhang ligation.
  • the cDNAs were sequenced from the plasmid DNA using the "Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit" (Amersham, Freiburg, Germany).
  • Primer pair 1 PP1-5: 5 '-CTC GCA GTT GGC CGG CAC CGT-3' SEQ ID NO: 11 PP1-3: 5 '-TGA CCC CAT GTA CTA CAT CGCCT-3' SEQ ID NO: 12
  • Primer pair 2 PP1-5: 5 '-CTC GCA GTT GGC CGG CAC CGT-3' SEQ ID NO: 11 PP1-3: 5 '-TGA CCC CAT GTA CTA CAT CGCCT-3' SEQ ID NO: 12
  • Primer pair 2 Primer pair 2:
  • PP3-5 5'-AGC CAT CAT CCC TGC GGA TCC A-3 'SEQ ID NO: 15
  • PP3-3 5' -GAG CGT CCG GGC GCG GCC TT-3 'SEQ ID NO: 16
  • Primer pair 4 PP4-5: 5 '-GGA TCC AAG CGA GAT TTG AAC GGA-3' SEQ ID NO: 17 PP4-3: 5 '-GCG GCC TTG CCG GAC GCG GT-3' SEQ ID NO: 18
  • PP5-5 5 '-GTA TGC CGC TCC ATG TTA GAA GAT-3' SEQ ID NO: 19
  • PP5-3 5 '-ACA TTA CAG GCA GCG TCC GAC AC-3' SEQ ID NO: 20
  • composition of the PCR mix (25 ⁇ l):
  • the sequence of the BCI-3 promoter was composed using the computer program Genedoc align from the sequences obtained in each case and is reproduced under SEQ ID NO: 1.
  • the entire promoter sequence was amplified using the PCR conditions below. The following primers were used:
  • BCI3-5 (SEQ ID NO: 23): 5 '-aagcttcaccaactcccttcaaggtctaa-3'
  • BCI3-3 (SEQ ID NO: 24): 5 '-ctgcagtgtgtgtgcttgctgtgatgc-3' Composition of the PCR mixture: 3.00 ⁇ l template 2.50 ⁇ l 10 ⁇ buffer 2.50 ⁇ l dNTP s [2mM of each] 0.75 ⁇ l MgCl 2
  • the PCR product was cloned into TG overhang ligation in pGEM-T [Promega).
  • BCI3-3 (SEQ ID NO: 24: 5 '-ctacagtgtgtgtgcttgctgctgtgatgc-3'
  • the sequence of the BCI-4 promoter was elucidated using a BCI4-BAC (BAC No. 266D20; provided by IPK, Gatersleben, Germany).
  • the BAC clone was identified using the BCI-4 cDNA as a probe in a manner familiar to those skilled in the barley genomic BAC library.
  • the sequence of the BCI-4 promoter which is shown in SEQ ID NO: 2, was finally determined using the method of primer walking.
  • OPN1 5 '-TGA ATG GTC ATG GCT GCT TA-3' (SEQ ID NO: 29)
  • OPN2 5 '-GGC TCT GAA TCG CAC ATT CT-3' (SEQ ID NO: 30)
  • OPN3 5 '-GTA CCT CTC CTC CCC GCT CAC T-3 (SEQ ID NO: 31)
  • OPN5 5 '-TCATGCATATCTATGTCTTTCTCTTC-3' (SEQ ID NO: 33)
  • the following primer (e.g. 0PN2) was derived from the sequence information obtained using one primer (e.g. OPN1).
  • the sequence of the BCI-4 promoter was composed using the computer program Genedoc align from the sequences obtained in each case and is reproduced under SEQ ID NO: 2.
  • the entire promoter sequence was amplified using the PCR conditions below. The following primers were used:
  • BCI4-5 (SEQ ID NO: 36): 5 '-agcgaatcgtttttcccttt-3'
  • BCI4-3 (SEQ ID NO: 37): 5 '-cctgagtgtacggctctgagatg-3'
  • Composition of the PCR approach :
  • the PCR product was isolated from an agarose gel and cloned into the pGEM-T vector (Promega, Mannheim, Germany) by means of T-overhang ligation.
  • the cDNAs were sequenced from the plasmid DNA using the "Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit” (Amersham, Freiburg, Germany).
  • the PCR product was cloned and sequenced in pGEM-T (Promega) via T overhang ligation.
  • pGYl-GFP vector based on pUC18, CaMV 35S promoter / terminator cassette with inserted GFP gene; Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; provided by Dr P. Schweizer, Institute of Plant Genetics IPK, Gatersleben, Germany
  • the GFP gene was cut out with the restriction enzyme Kpnl and ligated into the vector pUC18.
  • the desired orientation of the reporter gene was determined using restriction digests.
  • the vector was named pGFP.
  • the BCI-4 promoter was cut out of pGEM-T as an Ncol / PstI fragment. It was first digested with Ncol and the Ncol site was filled in using the Klenow fragment. The following batch was pipetted together: 16 ul DNA (eluted from the gel), 2 ul T4 ligation buffer, 1 ul dNTP's [2 mM], 1 ul Klenow fragment. This approach was incubated at 37 ° C for 30 min. The reaction was then stopped at 65 ° C. for 10 minutes. subse- Send was digested with PstI and the fragment thus obtained was ligated into the pGFP (see below) digested with PstI and Smal.
  • the various BCI-3 promoter sequences were cut out of the pGEMT vectors with the BCI-3 promoter or the BCI-3 promoter deletion variants with HindiII and PstI, purified using a gel and inserted into the HindIII / PstI digested pGFP vector.
  • the various constructs are shown schematically in FIG. 1.
  • the induction of the BCI-3 promoter, the deletion variants and the BCI-4 promoter was examined using different stimuli.
  • the induction was either realized by means of Northern blot analysis with detection of the endogenous BCI-3 or BCI-4 mRNA, or was shown using the Pr ⁇ motor reporter constructs described above.
  • DCINA induction 2, 6-dichlorisonicotinic acid (DCINA, CGA41396, Syngenta, Basel, Switzerland) was formulated as a 25% active substance with wettable powder (WP) or after pre-dissolving the pure substance with prostitute hylformamide (DMF) in aqueous solution (1% DMF) adjusted to pH 7 with NaOH and applied in concentrations of 5 and 10 mg / 1 (corresponds to 0.02 or 0.04 M) based on the soil volume. Control plants were watered with WP or 1% DMF solution.
  • WP wettable powder
  • DMF prostitute hylformamide
  • BTH Benzo (1, 2, 3) thiadiazole-7-carbothionic acid S-methyl ester
  • BTH also Azibenzolar-S-methyl, CGA245704, Bion®, Syngenta, Basel, Switzerland
  • Soil application was carried out in concentrations of 20 and 50 mg / 1 (corresponds to 0.095 and 0.24 mM, respectively) based on the volume of the soil.
  • Salicylic acid induction Salicylic acid (SA) was dissolved directly in water or after pre-dissolving in DMF in aqueous solution
  • Ethylene induction primary leaves from seven-day-old plants were placed on moistened filter paper in gastight Erlenmeyer flasks with ethylene gas in concentrations of 0.001, 1, 10 and 100 ⁇ L / 1 (corresponds to 0.028, 28, 280 and 2800 ⁇ M) in a climatic chamber incubated (see above). Control sheets were gassed with air.
  • Abscisic acid (ABA) induction ABA was applied by spraying an aqueous solution of 50 ⁇ M to seven-day-old seedlings until they were evenly covered by fine droplets. Control plants were sprayed with water. Treated plants were incubated in climatic chambers (see above).
  • JA induction Induction with the phytohormone jasmonate (JA) (Sigma) was carried out by "floating" leaf segments on a solution of 45 ⁇ M JA in climatic chambers. Control sheets were “floated” on water. Treatment with jasmonic acid methyl ester (JM) was carried out in glass petri dishes by "floating" primary leaves of seven-day-old plants on a solution of 45 ⁇ M JM in climatic chambers (see above). Control sheets were "floated” on water.
  • JM jasmonic acid methyl ester
  • Sorbitol induction was carried out by "floating" leaf segments or primary leaves of seven-day-old seedlings for 4 h on a 1 M sorbitol solution (Fluka). The leaves were then “floated” on water overnight. Control sheets were “floated” on water.
  • Bacillus subtilis came from the culture collection of the Institute for Phytopathology and Applied Zoology (IPAZ), Giessen, Germany, the various Pseudomonas strains were provided by Ina Budde and Matthias Ullrich, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Marburg.
  • a wound was achieved by perforating the primary leaves of seven day old plants with 15 needles / cm 2 . Control plants remained uninjured and were further cultivated together with the wounded in the climate cabinet (see above).
  • the individual constructs were shot into chemically induced barley leaves (cv. Ingrid WT) with the aid of particle bombardment. 24 hours later, GFP cells were counted in the leaf segments. Tungsten particles with a diameter of 1.1 ⁇ m (particle density 25 mg / ml) were coated with plasmid DNA. For this purpose, 1 ⁇ g reporter plasmid was used for coating per shot (method according to Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact
  • microcarrier preparation 55 mg of tungsten particles (M 17, diameter 1.1 ⁇ ; Bio-Rad, Kunststoff) were washed twice with 1 ml of autoclaved distilled water and once with 1 ml of absolute ethanol, dried and in 1 ml of 50% strength Glycerin taken up (approx. 50 mg / ml stock solution). The solution was diluted to 25 mg / ml with 50% glycerol, mixed well before use and suspended in an ultrasonic bath.
  • plasmid 12.5 ⁇ l of tungsten particle suspension (25 mg / ml), 12.5 ⁇ l of 1 M Ca (N0 3 ) 2 solution (pH 10) were added dropwise with continuous mixing, 10 Leave at RT for min, centrifuge briefly and remove 20 ⁇ l from the supernatant. The rest with the tungsten particles is resuspended (ultrasonic bath) and used in the experiment.
  • the pressure in the chamber was reduced by 0.9 bar and the tungsten particles were shot at 9 bar helium gas pressure on the surface of the plant tissue.
  • the chamber was immediately ventilated.
  • the macro carrier was thoroughly cleaned with water. 24 h after the bombardment, GFP cells were counted in the leaf segments.
  • the empty vector ⁇ UC18 with GFP cloned in was shot into induced barley leaves as controls and a search for GFP cells was carried out under the microscope.
  • Example 11 Inducibility of the BCI-3 and BCI-4 promoter based on Northern blot experiments
  • the BCI-3 promoter is induced by DCINA, BTH and weaker by SA (Fig. 5, A, B, C).
  • the accumulation of BCI-3 was only detectable in mesophyll after BTH induction in Northern blot analyzes, however further investigations with the more sensitive detection method of RT-PCR showed an inducibility also in the epidermis.
  • Expression of BCI-3 was not influenced by ethylene and ABA, but induced by JA application (FIG. 5, D) and wounding (FIG. 6, B). In contrast to induction by JA application, BCI-3 was repressed with an increased endogenous JA content after sorbitol treatment (FIG. 6, A).
  • BCI-3 was affected by a virulent and avirulent race repressed by Bgh. As with sorbitol treatment (see above), this repression could be an expression of a changed metabolism in the interaction with the biotrophic pathogen, but this is probably not related to resistance, since the expression of BCI-3 was also repressed in the compatible interaction.
  • Gene expression after infiltration with bacteria was only slightly activated in one of two experiments carried out and therefore does not appear to be causally related to bacteria (FIG. 6, D).
  • the gene expression of BCI-4 can only be induced with the resistance inducers SA, DCINA and BTH ((FIG.
  • BCI-4 functions not in general Stressreak ⁇ is expressed, but s is regulated specifically.
  • BCI-4 shows a very low constitutive expression activity. Stenhold increased accumulation of BCI-4 transcript and protein in Ger ⁇ occurred exclusively in leaves (with the exception of the flag leaf), and only after chemical induction (BTH-G thinkbe- treatment) (s. Fig. 8), the accumulation of the mesophyll remained limited as Northern and Western analyzes show might ⁇ th. activation of the expression in compatible or inkompa ⁇ tiblen interactions with the barley powdery mildew fungus could (Northern analysis, RT-PCR) on the transcript can not be detected.

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Abstract

The invention relates to methods for the chemically inducible expression of nucleic acid sequences, preferably in plants. Said invention also relates to novel chemically inducible promoters, functional equivalents and functionally equivalent parts thereof as well as expression cassettes and vectors, which contain said promoter sequences. Said invention further relates to transgenic plants, transformed by means of the expression cassettes and vectors, cultures, parts or a transgenic breeding product derived therefrom and the use thereof in the production of foodstuffs, feedstuffs, seeds, pharmaceutical and fine chemical products. Said invention also relates to the use of said expression cassettes and vectors in methods for identifying substances which are able to induce a pathogen-resistance in plants.

Description

CHEMISCH- INDUZIERBARE PROMOTOREN AUS GERSTE UND DEREN VERWENDUNG CHEMICALLY INDUCABLE PROMOTORS FROM BARLEY AND THEIR USE
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft Verfahren zur chemisch-induzierbaren Expression von Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt in Pflanzen. Umfasst sind ferner neue chemisch-induzierbare Promotoren, funktioneile Äquivalente und funktionell äquivalente Teile derselben, sowie Expressionskassetten und Vektoren, die diese Promotorsequenzen umfassen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien. Ferner umfasst die Erfindung die Verwendung dieser Expressionskassetten oder Vektoren in Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die in der Lage sind, nach Einwirkung auf Pflanzen eine Pathogenresistenz zu induzieren.The invention relates to methods for the chemically inducible expression of nucleic acid sequences, preferably in plants. Also included are new chemically-inducible promoters, functional equivalents and functionally equivalent parts thereof, as well as expression cassettes and vectors which comprise these promoter sequences. The invention further relates to transgenic plants transformed with these expression cassettes or vectors, cultures derived therefrom, parts or transgenic propagation material, and the use thereof for the production of foodstuffs, animal feed, seeds, pharmaceuticals or fine chemicals. The invention further encompasses the use of these expression cassettes or vectors in methods for identifying substances which are able to induce pathogen resistance after exposure to plants.
Ziel biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteilhaften, neuen Eigenschaften zum Beispiel zur ' Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität, zur Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika.The aim of plant biotechnology work is the generation of plants with advantageous novel properties, for example, to 'increase agricultural productivity, to improve quality of human foods or for producing specific chemicals or pharmaceuticals.
Moderne Verfahren zur Modifikation von Pflanzen und zur Verbesserung ihrer Eigenschaften (wie beispielsweise Ertrag oder Qualität) erfordern oft die Expression bestimmter Gene. Die Mög- lichkeit dieser Expression hängt unter anderem von der Verfügbarkeit von Methoden (beispielsweise von geeigneten Promotoren) ab, die Expression der besagten Gene zu gewährleisten und/oder zu kontrollieren.Modern methods of modifying plants and improving their properties (such as yield or quality) often require the expression of certain genes. The possibility of this expression depends inter alia on the availability of methods (for example of suitable promoters) to ensure and / or to control the expression of the said genes.
Promotoren sind wichtige Werkzeuge in der Pflanzenbiotechnologie, um die Expression eines bestimmten Gens in einer transgenen Pflanze zu steuern und so bestimmte Wesensmerkmale der Pflanze zu erzielen. Dabei ist es wünschenswert, auf eine möglichst breite Vielfalt von Promotoren mit unterschiedlichen Eigenschaften zu- rückgreifen zu können, um die Expression eines bestimmten Genes in einer bestimmten Zelle, Gewebe oder Pflanzenart optimal zu realisieren. Verschiedene Promotoren mit Aktivität in Pflanzen sind dem Fachmann bekannt. Ein Promotor kann konstitutiv, gewebespezifisch, entwicklungsabhängig oder induzierbar sein. Konstitutive Promotoren wie beispielsweise der 35S CaMV Promotor sind unabhängig vom Entwicklungsstadium und Gewebe einer Pflanze permanent aktiv und bewirken eine kontinuierliche Expression der durch sie gesteuerten Gene. Eine solche konstitutive Expression kann sich nachteilig auf die Pflanzenqualität auswirken. Die kontinuierliche Überexpression eines Fremdproteins - auch zu Zeitpunkten wo diese gar nicht erforderlich wäre - führt zu einem unnötigen Energieverlust und damit zu reduziertem Pflanzenwuchs und Erträgen. Ferner kann die konstitutive Expression unterschied- liehe Effekte zu unterschiedlichen EntwicklungsStadien bewirken und so auch nachteilige Wirkung auf die Pflansie haben. Ähnlich nachteilige Effekte der konstitutiven Expression können auch bei Expression in Gewebe- oder Zellkulturen und bei Fermentationen aultreten, wo sie zum Beispiel die Wachstumsraten negativ beein- flussen können und so die Ausbeuten reduzieren. ',Promoters are important tools in plant biotechnology to control the expression of a specific gene in a transgenic plant and thus to achieve certain essential characteristics of the plant. It is desirable to be able to use a wide variety of promoters with different properties in order to optimally implement the expression of a particular gene in a particular cell, tissue or plant species. Various promoters with activity in plants are known to the person skilled in the art. A promoter can be constitutive, tissue-specific, developmental or inducible. Constitutive promoters such as the 35S CaMV promoter are permanently active regardless of the development stage and tissue of a plant and cause a continuous expression of the genes controlled by them. Such constitutive expression can adversely affect plant quality. The continuous overexpression of a foreign protein - even at times when this would not be necessary - leads to an unnecessary loss of energy and thus to reduced plant growth and yields. Furthermore, constitutive expression can have different effects at different stages of development and thus also have an adverse effect on the plant. Similar adverse effects of constitutive expression can also occur with expression in tissue or cell cultures and with fermentations, where, for example, they can negatively influence the growth rates and thus reduce the yields. ' ,
Gewebe- oder entwicklungsabhängige Promotoren sind jeweils nur zu ganz definierten Zeitpunkten bzw. in definierten Geweben einer Pflanze aktiv.Tissue- or development-dependent promoters are only active at defined times or in defined tissues of a plant.
Zahlreiche biotechnologische Ansätze zur Optimierung von Pflanzen bedürfen keiner permanenten Expression, sondern sind - im Gegenteil - vorteilhaft unter Verwendung einer gezielt induzierbaren Expression zu realisieren. Die Induktion einer Pathogenabwehr (beispielsweise durch Expression von insektiziden oder fungiziden Proteinen) wird vorteilhafterweise erst bei Befall und bei den Befall fördernden Witterungsbedingungen getätigt. Auch sollte die Expression von Proteinen, die eine toxische Wirkung auf die Pflanze haben (z.B. Pharmaproteine etc.) erst in der adulten Pflanze induziert werden, um eine hinreichende Expression zu gewährleisten. 'Numerous biotechnological approaches for optimizing plants do not require permanent expression, but - on the contrary - can advantageously be implemented using a specifically inducible expression. The induction of a pathogen defense (for example, by expression of insecticidal or fungicidal proteins) is advantageously carried out only in the case of infestation and weather conditions which promote the infestation. The expression of proteins that have a toxic effect on the plant (e.g. pharmaceutical proteins, etc.) should only be induced in the adult plant in order to ensure adequate expression. '
Unter diesen Gesichtspunkten ist es verständlich, das die Kontrolle von Zeit, Ausmaß und/oder Ort der Expression besonders wünschenswert ist.From these points of view, it is understandable that control of the time, extent and / or location of expression is particularly desirable.
Für diese Zwecke benötigt man induzierbare Promotoren, die eine gezielte, bedarfsorientierte Expression ermöglichen. Induzierbare Promotoren sind solche, deren Transkriptionsaktivität durch einen oder mehrere interne oder externe Induktoren reguliert wird. Induktoren können chemische Verbindungen wie beispielsweise bestimmte Metaboliten (z.B. Zucker, Alkohole), Wachstumsregulatoren, Herbizide, Pflanzenhormone, phenolischen Verbindungen, aber auch Faktoren wie Licht oder aber auch physiologischer Stress (Hitze, Salz, Sauerstoffmangel, Verwundung, toxische Elemente) sein. Indirekt kann auch die Wirkung eines Pathogens oder einer Krankheit (wie z.B. einem Virus oder Pilz) eine Induktion bewirken .For these purposes, inducible promoters are required which enable targeted, demand-oriented expression. Inducible promoters are those whose transcription activity is regulated by one or more internal or external inducers. Inducers can be chemical compounds such as certain metabolites (e.g. sugar, alcohols), growth regulators, herbicides, plant hormones, phenolic compounds, but also factors such as light or also physiological stress (heat, salt, lack of oxygen, injury, toxic elements). Indirectly can also be the effect of a pathogen or one Illness (such as a virus or fungus) cause induction.
Lediglich chemisch induzierbare Promotoren ermöglichen eine Anwendung mit für die Landwirtschaft akzeptablem Aufwand. Als Induktoren der Genexpression fungieren hier bestimmte Chemikalien, die - beispielsweise durch Besprühen, Bestäuben, Ummanteln oder Beizen - auf Pflanzen oder Samen appliziert werden können. Diese Substanzen und die mit ihnen verbundenen Promotoren werden auch als "genetische Schalter" bezeichnet.Only chemically inducible promoters enable use with an acceptable level of effort for agriculture. Certain chemicals act here as inducers of gene expression, which can be applied to plants or seeds, for example by spraying, dusting, coating or pickling. These substances and the promoters associated with them are also referred to as "genetic switches".
Verschiedene chemisch induzierbare Promotoren bzw. Expressionssysteme zur Verwendung in Pflanzen sind beschrieben. Beschrieben ist beispielsweise ein Alkoholdehydrogenase-Promotor, der durch Ethanol induzierbar ist (Nagao RT et al . (1986) in Miflin BJVarious chemically inducible promoters or expression systems for use in plants have been described. For example, an alcohol dehydrogenase promoter is described which can be induced by ethanol (Nagao RT et al. (1986) in Miflin BJ
(ed.) Oxford Surveys of Plant Molecular and Gell Biology, Vol. 3, S. 384-438, Oxford Univ Press). WO 93/21334 beschreibt das alcA/alcR Expressionsystem, das durch verschiedene jAlkohole (z.B. Ethanol) induziert werden kann. Das System besteht aus zwei Komponenten: Der Promotorsequenz und dem alcR-Protein, das als Induktorprotein in Gegenwart des Alkohols den Promotor stimuliert .(ed.) Oxford Surveys of Plant Molecular and Gell Biology, Vol. 3, pp. 384-438, Oxford Univ Press). WO 93/21334 describes the alcA / alcR expression system, which can be induced by various alcohols (e.g. ethanol). The system consists of two components: the promoter sequence and the alcR protein, which stimulates the promoter as an inducer protein in the presence of the alcohol.
Ähnlich funktionieren Systeme, bei den die Induktion durch Gluco- cortikoide (Schena M et al . (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88(23) : 10421-5), Ecdyson (WO 96/37609), Tetrazyklin (Weinmann P et al . (1994) Plant J 5(4):559-69) oder Kupfer (Mett VL et al . (1993) Proc Natl Acad Sei USA 90 (10) : 4567-71) realisiert wird. Alle diese Ansätze haben den Nachteil, dass neben dem Promotor noch ein spezielles Induktorprotein in die Pflanze eingeführt werden muss. Dies erhöht den Arbeitsaufwand erheblich, erschwert die Zulassung der entsprechenden Pflanze und mindert gegebenenfalls Wert und/oder die Verbraucherakzeptanz. Auch kann die Befähigung zu Expression der Induktorproteine nicht in allen Pflanzenarten gewährleistet sein.Systems in which induction by glucocorticoids (Schena M et al. (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88 (23): 10421-5), Ecdyson (WO 96/37609), tetracycline (Weinmann P et al . (1994) Plant J 5 (4): 559-69) or copper (Mett VL et al. (1993) Proc Natl Acad Sei USA 90 (10): 4567-71). All these approaches have the disadvantage that in addition to the promoter, a special inducer protein has to be introduced into the plant. This increases the workload considerably, makes it more difficult to approve the corresponding plant and, if necessary, reduces the value and / or consumer acceptance. The ability to express the inducer proteins cannot be guaranteed in all plant species.
Die Effizienz einiger induzierbarer Promotoren wurde vergleichend beschrieben (Boetti H et al . (1999) Biotechnology & Bioengineering. 64(1):1-13).The efficiency of some inducible promoters has been compared (Boetti H et al. (1999) Biotechnology & Bioengineering. 64 (1): 1-13).
Die meisten der verwendeten Chemikalien (wie beispielsweise Kupfersalze, Alkohol, Tetrazyklin, Glucokortikoide, Ecdyson etc.) sind für eine Anwendung im Agrarbereich aus ökologischen, finanziellen oder applikationstechnischen Gründen ungeeignet und kön- nen nur unter Laborbedingungen sinnvoll genutzt werden. Beschrieben ist ferner ein Expressionssystem basierend auf dem GST-II Promotor (Sugita K et al . (2000) Plant J 22 (5) : 461-9 ; WO 90/01294; WO 90/08826; WO 97/11189; WO 93/01294). US 5,608,143 beschreibt Promotoren, die durch substituierte Benz- sulfonamide induziert werden können.Most of the chemicals used (such as copper salts, alcohol, tetracycline, glucocorticoids, ecdysone etc.) are unsuitable for use in the agricultural sector for ecological, financial or application-related reasons and can only be used effectively under laboratory conditions. An expression system based on the GST-II promoter (Sugita K et al. (2000) Plant J 22 (5): 461-9; WO 90/01294; WO 90/08826; WO 97/11189; WO 93 / 01294). No. 5,608,143 describes promoters which can be induced by substituted benzenesulfonamides.
Verschiedene natürliche, niedermolekulare Verbindungen sind beschrieben, die die Genexpression in Pflanzen steuern. Diese Wachstumsregulaturen umfassen beispielsweise Ethylen, Abscisin- säure (ABA) , Auxin, Jasmonsäure (JA) , Salicylsäure (SA) und weitere Pflanzenhormone. Diese Faktoren spielen vor allem bei der Abwehr der Pflanze gegen Pathogene oder bei der Stressantwort ("induzierte Resistenz") eine Rolle.Various natural, low molecular weight compounds have been described that control gene expression in plants. These growth regulations include, for example, ethylene, abscisic acid (ABA), auxin, jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA) and other plant hormones. These factors play a role particularly in the defense of the plant against pathogens or in the stress response ("induced resistance").
Salicylsäure (SA) ist ein wichtiger Botenstoff bei der Vermittlung von systemisch erworbenen Resistenz (SAR) und der lokalen, erworbenen Resistenz (LAR) (Vernooij B et 'al. (1994) Plant Cell 6:959-965; Sticher L et al . (1997) Annual Review of Phytopathology 35:235-270) .Salicylic acid (SA) is an important messenger in the mediation of systemic acquired resistance (SAR) and local acquired resistance (LAR) (Vernooij B et 'al. (1994) Plant Cell 6: 959-965; Sticher L et al. (1997) Annual Review of Phytopathology 35: 235-270).
Jasmonsäure (JA) und ihr Methylester (MeJA; JM) sind wichtige Signalstoffe bei pflanzlichen Abwehrmechanismen und haben eine darüberhinausgehende Hormonfunktion zur Steuerung des pflanzlichen Stoffwechsels (Sticher L et al . (1997) Ann Rev Phytopath 35:235- 270; Creelman RA und Mullet JE (1997) Ann Rev PlantJasmonic acid (JA) and its methyl ester (MeJA; JM) are important signal substances in plant defense mechanisms and have an additional hormone function for controlling plant metabolism (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopath 35: 235-270; Creelman RA and Mullet JE (1997) Ann Rev Plant
Physiol Plant Mol Biol 48:355-381). Die Biosynthese erfolgt ausgehend von Membranlipiden meist aus Linolensäure unter Einwirkung einer Lipoxygenase oder unspezifisch durch Membranperoxidierung beispielsweise während einer hypersensitiven Reaktion (Sticher L ef al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35:235-270). SA antagonisiert die Produktion von JA (Penninckx IAMA (1996) Plant: Cell 8:2309-2323) .Physiol Plant Mol Biol 48: 355-381). The biosynthesis is based on membrane lipids, mostly from linolenic acid under the action of a lipoxygenase or unspecifically by membrane peroxidation, for example during a hypersensitive reaction (Sticher L ef al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270). SA antagonizes the production of JA (Penninckx IAMA (1996) Plant: Cell 8: 2309-2323).
Abscisinsäure ist erforderlich für die Signaltransduktion vom Systemin zu JA (Sticher L et al . (1997) Ann Rev Phytopathol 35:235- 270) . Ethylen kann ebenfalls SAR modulieren, steigert die Lignifikation und ist vermutlich erforderlich für die Signaltransduktion zwischen Systemin und Pinll (Sticher L et al . (1997) Ann Rev Phytopathol 35:235-270).Abscisic acid is required for signal transduction from systemin to JA (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270). Ethylene can also modulate SAR, increase lignification and is presumably required for signal transduction between Systemin and Pinll (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270).
Der Begriff der "induzierten Resistenz" umfasst eine Reihe pflanzlicher Abwehrmechanismen, bei denen jeweils durch eine Primärinfektion oder -Stimulation mit einem Pathogen oder anderem Stressfaktor eine erhöhte Resistenz gegen eine nachfolgende Sekundärinfektion oder -Stimulation ausgelöst wird (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35:235-270). Die Resistenz kann lokal oder systemisch ausgeprägt sein. Die systemische Resistenz umfasst die Akkumulation von Resistenzproteinen auch in Bereichen, die vom Ort der Primärinfektion oder -Stimulation weiter entfernt sind. Verschiedene Klassen dieser Proteine können definiert werden: Hydrolasen, insbesonders die "pathogenesis related proteins" (PR-Proteine) (Stinzi A et al . (1993) Biochemie 75:687- 706), Defensine (Broekart WF et al. (1995) Plant Physiol 108: 1353-1358), Proteinaseinhibitoren (Schaller A und Ryan CA (1996) Bioessays 18:27-33) und Zellwandkomponenten (insbesondere Hydroxyprolin-reiche Glycoproteine (HRGP) sowie Lignin; Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35:235-270).The term "induced resistance" encompasses a number of plant defense mechanisms, in each of which an increased resistance to a subsequent secondary infection or stimulation is triggered by a primary infection or stimulation with a pathogen or other stress factor (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270). Resistance can be local or systemic. The systemic resistance includes the accumulation of resistance proteins in areas that are further away from the site of primary infection or stimulation. Different classes of these proteins can be defined: hydrolases, especially the "pathogenesis related proteins" (PR proteins) (Stinzi A et al. (1993) Biochemie 75: 687-706), Defensine (Broekart WF et al. (1995) Plant Physiol 108: 1353-1358), proteinase inhibitors (Schaller A and Ryan CA (1996) Bioessays 18: 27-33) and cell wall components (especially hydroxyproline-rich glycoproteins (HRGP) and lignin; Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270).
Bei der systemisch erworbenen Resistenz ("Systemic acquired resi- stence"; SAR) erfolgt eine hypersensitive Reaktion verbunden mit der Ausbildung von nekrotischen Läsionen und einem substantiellen Anstieg des endogenen Salicylsäure (SA) - Spiegels. Infolge erlangt die Pflanze eine Resistenz gegen verschiedene Pathogene . Das Phänomen ist mit der Expression verschiedener Klassen von Genen, den sogenannten "pathogenesis-related" (PR) Genen verbunden (Ward et al . (1991) Plant Cell 3:1085-1094; Vani Loon LC et.al. (1994) Plant Mol Biol Rep 12:245-264, Stinzi' A et al .Systemic acquired resistance (SAR) involves a hypersensitive reaction associated with the formation of necrotic lesions and a substantial increase in endogenous salicylic acid (SA) levels. As a result, the plant becomes resistant to various pathogens. The phenomenon is associated with the expression of various classes of genes, the so-called "pathogenesis-related" (PR) genes (Ward et al. (1991) Plant Cell 3: 1085-1094; Vani Loon LC et.al. (1994) Plant mol Biol Rep 12: 245-264, Stinzi 'A et al.
(1993) Biochemie 75:687-706). Die SAR-Reaktion wird durch endogene Botenstoffe wie Jasmonat (JA) oder Salicylsäure (SA) vermittelt. Eine exogene Applikation dieser Stoffe ist in der Lage, die entsprechenden PR-Gene zu aktivieren und eine SAR zu bewirken (Ward et al . (1991) Plant Cell 3:1085-1094; Uknes et al . (1992) Plant Cell 4 (6) : 645-656 ) . Ähnliche Effekte können auch durch synthetische Verbindungen wie 2, 6-Dichlorisonicotinsäure (DCINA) (Vernooij et al . (1995) Mol Plant Microbe Interact 8:228-234) oder Benzo- [1,2,3] thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methylester (BTH) (Friedrich et al . (1996) Plant J lO(l):61-70; Lawton et al . (1996) Plant J 10:71-82) bewirkt werden. DCINA realisiert dies, ohne zugleich die SA Spiegel zu erhöhen, wirkt also am gleichen Ort oder unterhalb in der Signaltranduktionkette (Vernooij B et al. (1995) Mol Plant Microbe Interact 8:228-234).(1993) Biochemistry 75: 687-706). The SAR reaction is mediated by endogenous messenger substances such as jasmonate (JA) or salicylic acid (SA). Exogenous application of these substances is capable of activating the corresponding PR genes and causing SAR (Ward et al. (1991) Plant Cell 3: 1085-1094; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4 (6 ): 645-656). Similar effects can also be achieved by synthetic compounds such as 2, 6-dichloroisonicotinic acid (DCINA) (Vernooij et al. (1995) Mol Plant Microbe Interact 8: 228-234) or benzo [1,2,3] thiadiazole-7-thiocarboxylic acid. S-methyl ester (BTH) (Friedrich et al. (1996) Plant J 10 (l): 61-70; Lawton et al. (1996) Plant J 10: 71-82). DCINA realizes this without increasing the SA level at the same time, i.e. it acts at the same location or below in the signal transduction chain (Vernooij B et al. (1995) Mol Plant Microbe Interact 8: 228-234).
Bereits Ende der 70iger Jahre wurde gezeigt, dass Salicylsäure (SA) wie auch Acetylsalicylsäure in Tabakpflanzen eine SAR gegenüber dem Tabakmosaikvirus auslösen kann. SA kommt vermutlich in allen höheren Pflanzen als Signalsubstanz für die SAR vor. Seit einiger Zeit wird durch die Firma Syngenta das Pflanzenbehandlungsmittel BION® vertrieben, dessen aktive Substanz (Benzo [1, 2,3] thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-Methylester ; BTH) der SA strukturell ähnlich ist und wie diese eine SAR auslöst.Already at the end of the 1970s it was shown that salicylic acid (SA) as well as acetylsalicylic acid in tobacco plants can trigger an SAR against the tobacco mosaic virus. SA is probably found in all higher plants as a signal substance for SAR. For some time now, Syngenta has been selling the plant treatment product BION ® , the active substance (benzo [1, 2,3] thiadiazole-7-thiocarboxylic acid S-methyl ester; BTH) of which SA is structurally similar and how it triggers SAR.
Verschiedene PR-Proteine sind für monokotyledone und dikotyledone Pflanzen beschrieben (Sticher L et al . (1997) Ann Rev Phytopathol 35:235-270; Alexander D et al . (1993) Proc Natl Acad Sei USA 90:7327-7331; Rich ond S et al . (1979) Physiol Plant Pathol 14: 329-338) . Die SAR wurde im Detail in Arabidopsis untersucht. Verschiedene PR-Gene sind hier beschrieben (Uknes S et al . (1992) Plant Cell ( 6) : 645-56) . Charakterisiert ist der PR-1 Promotor aus Tabak (Uknes et al . (1993) Mol Plant Microbe Interact 6:692-698), der Tabak PR-2d Promotor (Shah J und Klessig DF (1996) Plant J 10 (6) : 1089-101; Hennig J et al . (1993) Plant J 4(3) :481-93) . US 5,614,395 beschreibt das Arabidopsis PR-1 Gen und seinen chemisch induzierbaren Promotor. WO 98/03536 beschreibt Deletionsmutanten dieses Promotors. WO OO/65039 beschreibt weitere Deletionsvarianten und Promotorelemente dieses Promotors.Various PR proteins have been described for monocot and dicot plants (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270; Alexander D et al. (1993) Proc Natl Acad Sei USA 90: 7327-7331; Rich ond S et al. (1979) Physiol Plant Pathol 14: 329-338). The SAR has been examined in detail in Arabidopsis. Various PR genes are described here (Uknes S et al. (1992) Plant Cell (6): 645-56). The PR-1 promoter from tobacco (Uknes et al. (1993) Mol Plant Microbe Interact 6: 692-698) is characterized, the tobacco PR-2d promoter (Shah J and Klessig DF (1996) Plant J 10 (6): 1089-101; Hennig J et al. (1993) Plant J 4 (3): 481-93). US 5,614,395 describes the Arabidopsis PR-1 gene and its chemically inducible promoter. WO 98/03536 describes deletion mutants of this promoter. WO OO / 65039 describes further deletion variants and promoter elements of this promoter.
Die Promotoren der PR-Gene werden im allgemeinen außer durch die Applikation von chemischen SAR-Induktoren auch indirekt beispielsweise durch Pathogenbefall und/oder Stress unter Verwendung endogener Botenstoffe wie SA induziert.In addition to the application of chemical SAR inducers, the promoters of the PR genes are generally also induced indirectly, for example by pathogen attack and / or stress, using endogenous messenger substances such as SA.
Weitere Beispiele für pathogen-induzierbare Promotoren sind der PRP1 Promotor aus Kartoffel (Martini N et al . (1993) Mol Gen Genet 263:179-186), der Fisl Promotor (WO 96/34949), der Betv 1 Promotor (Swoboda I et al . (1995) Plant Cell and Env 18:865-874), der Vstl Promotor (Fischer R (1994) Dissertation, Univ. Hohen- heim; Schubert R et al . (1997) Plant Mol Biol 34:417-426), der Sesquiterpenzyklase-Promotor (Yin S et al . (1997) Plant Physiol 115:437-451) und der gstAl Promotor (Mauch F und Dudler R (1993) Plant Physiol 2:1193-1201).Further examples of pathogen-inducible promoters are the PRP1 promoter from potato (Martini N et al. (1993) Mol Gen Genet 263: 179-186), the Fisl promoter (WO 96/34949), the Betv 1 promoter (Swoboda I et al. (1995) Plant Cell and Env 18: 865-874), the Vstl promoter (Fischer R (1994) dissertation, Univ. Hohen- heim; Schubert R et al. (1997) Plant Mol Biol 34: 417-426) , the sesquiterpene cyclase promoter (Yin S et al. (1997) Plant Physiol 115: 437-451) and the gstAl promoter (Mauch F and Dudler R (1993) Plant Physiol 2: 1193-1201).
Als chemisch induzierbare Promotoren sind diese Promotoren nur unzureichend geeignet, da sie eine nicht unerhebliche konstitutive Aktivität aufweisen und zudem ungewollt durch natürliche Pathogene anstelle des chemischen Induktors induziert werden können. Nachteilig bei der Verwendung dieser Promotoren zur transgenen Expression von anti-pathogenen Proteinen ist die Tatsache, dass die Promotoren nur reaktiv tätig werden. DieThese promoters are only insufficiently suitable as chemically inducible promoters, since they have a not inconsiderable constitutive activity and can also be unwantedly induced by natural pathogens instead of the chemical inducer. A disadvantage of using these promoters for the transgenic expression of anti-pathogenic proteins is the fact that the promoters are only reactive. The
Verzögerungsphase bis zum Erreichen eines ausreichenden Abwehrpotentials kann Schäden an der Pflanze zur Folge haben, die ihren Wert und ihre Eignung als Nahrungs- oder Futtermittel beeinträchtigen .Delay phase until sufficient defense potential has been reached can result in damage to the plant which can impair its value and its suitability as food or feed.
Ein weiterer genereller Nachteil der meisten bislang identifizierten chemischen induzierbaren, pflanzlichen Promotoren ist, dass sie aus dikotylen Pflanzen isoliert wurden. Ihre Verwendbarkeit für monokotyle Pflanzen - zu denen die meisten wichtigen Ackerpflanzen wie beispielsweise die Getreidearten zählen - ist fraglich. Die Blätter der Pflanze sind als Hauptort der Fotosynthese von besonderer Bedeutung für Qualität und Quantität des Ernteertrages. Ferner stellen sie den Interaktionsort für zahlreiche pflanzliche Erkrankungen u.a. Pilzerkrankungen und/oder Insekten- frass dar. Moleküle und Strukturen innerhalb der Blätter spielen eine wesentliche Rolle in der Abwehr mikrobieller und pathogener Angriffe aber auch bei der Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren wie Hitze, Trockenheit, UV Strahlung, Kälte etc. Durch die Koevolution von Pflanzen und Schädlingen sind die Abwehrmechanis- men der Pflanze oft unzureichend. Die Einführung fremder Gene in Blattzellen könnte hier vorteilhaft sein. Nur wenige Promotoren mit Spezifität für Blätter (z.B. EP-A 917 583) sind beschrieben.Another general disadvantage of most chemical inducible plant promoters identified so far is that they have been isolated from dicotyledonous plants. Their usefulness for monocotyledonous plants - which include most important arable plants such as cereals - is questionable. As the main site of photosynthesis, the leaves of the plant are of particular importance for the quality and quantity of the harvest. They also represent the interaction site for numerous plant diseases, including fungal diseases and / or insectivores. Molecules and structures within the leaves play an important role in the defense against microbial and pathogenic attacks, but also in resistance to abiotic stress factors such as heat, dryness, UV Radiation, cold, etc. The plant's defense mechanisms are often inadequate due to the coevolution of plants and pests. The introduction of foreign genes into leaf cells could be advantageous here. Only a few promoters with specificity for leaves (for example EP-A 917 583) have been described.
Es bestand daher die Aufgabe, Promotoren zu identifizieren, die bei einer geringen konstitutiven Expression im nicht-induziertenIt was therefore the task of identifying promoters which, in the case of low constitutive expression, did not induce
Zustand eine möglichst starke und schnelle Induktion infolge eine chemischen Induktion aufweisen, durch Pathogene aber möglichst ι nur wenig oder gar nicht aktiviert werden. Die Promotoren sollten ihre Funktion in den wichtigen Nutzpflanzen erfüllen, also mög- liehst eine monokotyle Ackerpflanze als Ursprung haben und zudem eine Expression in Blättern, möglichst eine blattspezifische Expression ermöglichen. Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellung der Promotoren für das BCI-3 und das BCI-4 Gen aus Gerste gelöst (BCI = "barley chemically induced").Have a strong and rapid induction as a result of a chemical induction, but are activated as little or not as possible by pathogens. The promoters should fulfill their function in the important useful plants, that is to say that a monocotyledon arable plant should originate and also allow expression in leaves and, if possible, leaf-specific expression. This task was solved by providing the promoters for the BCI-3 and the BCI-4 gene from barley (BCI = "barley chemically induced").
Der BCI-3 Promotor wird durch DCINA, BTH und schwächer durch SA induziert. Die Akkumulation von BCI-3 ist nach BTH-Induktion nur im Mesophyll und schwächer in der Epidermis nachweisbar. Durch Ethylen und ABA wurde die Expression von BCI-3 nicht beeinflusst, durch JA-Applikation und Verwundung jedoch induziert. Inokulation von Gerste mit C. sativus, dem Nicht-Wirt-Pathogen Bgt oder Blattläusen (S. avenae) hatte keinen Einfluss auf die Transkriptakkumulation. Hingegen wird BCI-3 durch Befall mit einer virulenten und avirulenten Rasse von Bgh sogar reprimiert.The BCI-3 promoter is induced by DCINA, BTH and weaker by SA. After BTH induction, the accumulation of BCI-3 is only detectable in the mesophyll and weaker in the epidermis. Expression of BCI-3 was not affected by ethylene and ABA, but induced by JA application and wounding. Inoculation of barley with C. sativus, the non-host pathogen Bgt or aphids (S. avenae) had no effect on the transcript accumulation. In contrast, BCI-3 is even repressed by infection with a virulent and avirulent breed of Bgh.
Die Genexpression von BCI-4 ist nur mit den Resistenzinduktoren DCINA und BTH und - schwächer und transienter - mit SA induzierbar. Eine schwache Expression von BCI-4 wurde nach Infiltration des Pseudomonadenstammes PG4180 lokal und systemisch nachgewiesen . Alle anderen untersuchten Induktoren, verschiedenste biotische und abiotische Stressfaktoren, sowie Fungizidapplikationen oder Verwundung hatten keinen Einfluss auf die Expression von BCI-4. Dies zeigt, dass BCI-4 nicht bei allgemeinen Stressreaktionen exprimiert wird, sondern spezifisch reguliert ist. BCI-4 zeigt eine sehr geringe konstitutive Expressionsaktivität . Eine verstärkte Akkumulation von BCI-4-Transkript und -Protein in Gerstenpflanzen erfolgte ausschließlich in Blättern (mit Ausnahme des Fahnenblattes) und nur nach chemischer Induktion (BTH-Gieß- behandlung) , wobei die Akkumulation auf das Mesophyll begrenzt blieb.BCI-4 gene expression can only be induced with the resistance inducers DCINA and BTH and - weaker and more transient - with SA. Weak expression of BCI-4 was detected locally and systemically after infiltration of the pseudomonad strain PG4180. All other investigated inducers, various biotic and abiotic stress factors, as well as fungicide applications or injuries had no influence on the expression of BCI-4. This shows that BCI-4 is not expressed in general stress reactions, but is specifically regulated. BCI-4 shows a very low constitutive expression activity. An increased accumulation of BCI-4 transcript and protein in barley plants occurred exclusively in leaves (with the exception of the flag leaf) and only after chemical induction (BTH casting treatment), the accumulation remaining limited to the mesophyll.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Promotoren ist, dass man gezielt die Genexpression in Pflanzen - vor allem in den wichtigen, monokotylen Ackerpflanzen - durch Applikation einer Chemikalie aktivieren kann. Eine ungewollte Aktivierung durch Pathogene kann weitestgehend ausgeschlossen werden. Die Anwendungsmöglichkeiten sind vielfach. So kann man beispielsweise gezielt quasi prophylaktisch einem drohenden Pathogenbefall vorbeugen.An advantage of the promoters according to the invention is that gene expression in plants - especially in the important, monocotyledonous plants - can be specifically activated by applying a chemical. An unwanted activation by pathogens can be largely excluded. There are many possible uses. For example, it is possible to prevent an impending pathogen attack in a quasi-preventive manner.
Die cDNA der BCI-3 und BCI-4 Gene ist teilweise bekannt (WO 00/71748; Besser K et al . (2000) Molecular Plant Pathology 1(5) :277-286; GenBank Acc.No.: AJ250282 und AJ250283). Ein ESTThe cDNA of the BCI-3 and BCI-4 genes is partially known (WO 00/71748; Besser K et al. (2000) Molecular Plant Pathology 1 (5): 277-286; GenBank Acc.No .: AJ250282 and AJ250283) , An EST
("expressed sequence tag") wurde mittels eines Expressionsanalyse infolge einer Behandlung von Gerste mit SAR ("systemic acquired resistance") auslösenden Chemikalien gefunden. Neben dem BCI-3 und BCI-4 EST wurden zahlreiche weitere Sequenzen identifiziert. Überraschenderweise zeigen jedoch die erfindungsgemäßen Promotoren nur bei Stimulation mit exogen applizierten Chemikalien wie DCINA oder BTH eine starke Induktion, nicht jedoch bei Pathogenbefall. Diese Expressionsspezifität ist besonders vorteilhaft, weil so nur eine geringe Hintergrundktivität in Abwesenheit des chemischen Induktors (ausgelöst beispielsweise durch Umweltfaktoren oder Pathogenbefall) zu erwarten ist.("expressed sequence tag") was found by means of an expression analysis following treatment of barley with SAR ("systemic acquired resistance") triggering chemicals. In addition to the BCI-3 and BCI-4 EST, numerous other sequences were identified. Surprisingly, however, the promoters according to the invention show strong induction only when stimulated with exogenously applied chemicals such as DCINA or BTH, but not in the case of pathogen attack. This expression specificity is particularly advantageous because only a low background activity in the absence of the chemical inducer (triggered, for example, by environmental factors or pathogen infestation) can be expected.
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur chemisch induzierbaren transgenen Expression von Nukleinsäure- Sequenzen, dadurch gekennzeichnet, dassA first subject of the invention relates to a method for chemically inducible transgenic expression of nucleic acid sequences, characterized in that
a) eine Expressionskassette bestehend aus einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit einem chemisch induzierbaren Promotor ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen bestehend ausa) an expression cassette consisting of a nucleic acid sequence to be expressed transgenically in functional linkage with a chemically inducible promoter selected from the group of sequences consisting of
i) dem BCI-3 Promotor gemäß SEQ ID No : 1 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktioneil äquivalenteni) the BCI-3 promoter according to SEQ ID No: 1 or a functional equivalent or functionally equivalent
Teil desselben, undPart of the same, and
ii) dem BCI-4 Promotor gemäß SEQ ID No:2 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktioneil äquivalentenii) the BCI-4 promoter according to SEQ ID No: 2 or a functional equivalent or functionally equivalent
Teil desselbenPart of the same
in einen Organismus oder in ein Gewebe, Organ, Teil, eine Zellkultur oder Zelle desselben eingebracht wird, und b) die Expression der Nukleinsäuresequenz durch Behandlung des Organismus oder des Gewebes, Organs, Teils, Zellkultur oder Zelle desselben mit einem chemischen Induktor induziert wird.is introduced into an organism or into a tissue, organ, part, cell culture or cell thereof, and b) the expression of the nucleic acid sequence is induced by treating the organism or the tissue, organ, part, cell culture or cell thereof with a chemical inducer.
Bevorzugt wird die Expression in Pflanzen realisiert. "Pflanze" meint dabei alle pflanzlichen Organismen wie sie weiter unten beispielhaft beschrieben sind. Besonders bevorzugt sind dabei Pflanzen, die eine Rolle im Ackerbau sowie als Futter- oder Lebensmittel spielen. Am meisten bevorzugt sind Getreidearten wie Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis und Mais.Expression is preferably realized in plants. "Plant" means all plant organisms as described below by way of example. Plants that play a role in agriculture and as feed or food are particularly preferred. Most preferred are cereals such as barley, wheat, rye, oats, triticale, rice and corn.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft den BCI-3 Promotor aus Gerste gemäss SEQ ID NO: 1, die dazu komplementäre Sequenz, sowie funktioneile Äquivalente oder funktioneil äquivalenten Teile derselben.The invention further relates to the barley BCI-3 promoter according to SEQ ID NO: 1, the sequence complementary thereto, and functional equivalents or parts thereof which are functionally equivalent.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft den BCI-4 Promotor aus Gerste gemäss SEQ ID NO: 2, die dazu komplementäre Sequenz, sowie funktionelle Äquivalente oder funktioneil äquivalenten Teile derselben.Another object of the invention relates to the barley BCI-4 promoter according to SEQ ID NO: 2, the sequence complementary thereto, and functional equivalents or parts thereof which are functionally equivalent.
"Funktioneil äquivalente Teile" meint Teilsequenzen der durch SEQ ID NO : 1 oder 2 beschriebenen Promotoren, die im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie der BCI-3 Promotor beschrieben durch SEQ ID NO: 1 oder der BCI-4 Promotors gemäß SEQ ID NQ: 2 aufweisen. Teilsequenzen können sich aus ein oder mehreren Teilen der durch SEQ ID NO : 1 oder 2 beschriebenen Promotoren zusammensetzen. Funktioneil äquivalente Teile eines BCI-3 Promotors umfasst bevorzugt die durch SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 oder 7 be- schrieben Sequenzen. Funktionen äquivalente Teile eines BCI-4 Promotors umfasst bevorzugt die durch SEQ ID NO: 8 beschriebene Sequenz .“Functionally equivalent parts” means partial sequences of the promoters described by SEQ ID NO: 1 or 2, which essentially have the same promoter activity as the BCI-3 promoter described by SEQ ID NO: 1 or the BCI-4 promoters according to SEQ ID NQ: 2 exhibit. Partial sequences can be composed of one or more parts of the promoters described by SEQ ID NO: 1 or 2. Functionally equivalent parts of a BCI-3 promoter preferably comprise the sequences described by SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7. Functionally equivalent parts of a BCI-4 promoter preferably comprise the sequence described by SEQ ID NO: 8.
"Funktionelle Äquivalente" meint Sequenzen, die von dem BCI-3 Promotor beschrieben durch SEQ ID NO: 1 oder des BCI-4 Promotors gemäß SEQ ID NO: 2 abgeleitet sind und im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen.“Functional equivalents” means sequences which are derived from the BCI-3 promoter described by SEQ ID NO: 1 or the BCI-4 promoter according to SEQ ID NO: 2 and which have essentially the same promoter activity.
Eine Promotoraktivität wird als im "wesentlichen gleich" bezeich- net, wenn die Transkription einer bestimmten transgen zu expri- mierenden Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO : 2 abgeleiteten Promotors durch einen chemischen Induktor jedoch nicht oder nur schwach durch Pathogene aktiviert werden kann. Dabei ist die maximale Induktion der Expression durch einen chemischen Induktor mindestens 2mal so hoch wie die maximale Induktion durch ein Pathogen, bevorzugt mindestens 5mal so hoch, ganz besonders bevorzugt mindesten lOmal so hoch, am meisten bevorzugt mindestens 20mal so hoch.A promoter activity is said to be "essentially the same" if the transcription of a particular nucleic acid sequence to be expressed transgenically under the control of a promoter derived from SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is not or only weakly by a chemical inducer can be activated by pathogens. The maximum induction of expression by a chemical inducer is at least twice as high as the maximum induction by a pathogen, is preferred at least 5 times as high, very particularly preferably at least 10 times as high, most preferably at least 20 times as high.
Bevorzugt dienen dabei Dichloroisonicotinsäure (DCINA) oder Benzo[l,2,3] thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-Methylester (BTH) als chemische Induktoren. Als Pathogen ist der Gerstenmehltau (Blumeria [syn Erysiphe] graminis f.sp. hordei Speer, Bgh) bevorzugt, besonders bevorzugt ist der Gerstenmehltau der Rasse A6 (BghA6) . Ganz besonders bevorzugt sind als funktioneil äquiva- lente Promotoren mit einer im wesentlichen gleichen Promotoraktivität solche zu verstehen, die eine blattspezifische, besonders bevorzugt eine Blatt-Mesophyll spezifische Expression aufweisen. "Spezifisch" heißt in diesem Zusammenhang, dass die Expression in dem bewussten Gewebe mindestens doppelt so hoch ist wie in einem beliebigen anderen Gewebe. Bevorzugt ist die Expression mindestens 5mal so hoch, ganz besonders bevorzugt mindestens lOmal so hoch.Dichloroisonicotinic acid (DCINA) or benzo [1,2,3] thiadiazole-7-thiocarboxylic acid S-methyl ester (BTH) are preferably used as chemical inducers. Barley powdery mildew (Blumeria [syn Erysiphe] graminis f.sp. hordei Speer, Bgh) is preferred as the pathogen; barley powdery mildew of breed A6 (BghA6) is particularly preferred. Very particularly preferably, functionally equivalent promoters with essentially the same promoter activity are understood to be those which have a leaf-specific, particularly preferably a leaf-mesophyll-specific expression. In this context, "specific" means that the expression in the conscious tissue is at least twice as high as in any other tissue. The expression is preferably at least 5 times as high, very particularly preferably at least 10 times as high.
Die absolute Expressionshöhe nach Inkubation mit dem chemischen Induktor kann sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich mit dem BCI-3 Promotor gemäß SEQ ID NO:l oder dem BCI-4 Promotor gemäß SEQ ID NO : 2 abweichen. Die Expressionshöhe wird dabei jeweils anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge trans- latierten Protein unter ansonsten unveränderten Bedingungen gemessen. Bevorzugt sind dabei solche Promotorsequenzen, deren Expressionshöhe nach Induktion einem Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO : 1 oder SEQ ID NO: 2 beschriebenen Promotor um nicht mehr als 50 %, bevorzugt nicht mehr als 25 %, besonders bevorzugt nicht mehr als 10 % unterschreitet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren Expressionshöhe nach Induktion einen Vergleichswert erhalten mit einem der durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 beschriebenen Promotoren um mehr als 50 %, bevorzugt 100 %, besonders bevorzugt 500 %, ganz besonders bevorzugt 1000 % übersteigt. Besonders bevorzugt sind ferner solche Sequenzen, deren Expressionshöhe vor Induktion einen Vergleichswert erhalten mit einem der durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 beschriebenen Promotor nicht übersteigt oder diesen um mindestens 10 % bevorzugt mindestens 30 %, besonders bevorzugt mindestens 50 %, am meisten bevorzugt mindestens 90 % unterschreitet. Im allgemeinen wird eine Induktion nach 2 bis 72 h, bevorzugt nach 12 bis 48 h erwartet .The absolute level of expression after incubation with the chemical inducer can differ both downwards and upwards in comparison with the BCI-3 promoter according to SEQ ID NO: 1 or the BCI-4 promoter according to SEQ ID NO: 2. The level of expression is measured in each case on the basis of the transcribed mRNA or the protein which has been translated as a result under otherwise unchanged conditions. Preferred are promoter sequences whose expression level after induction receives a comparison value with the promoter described by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 by no more than 50%, preferably no more than 25%, particularly preferably no more than 10% below. Sequences are particularly preferred whose expression level after induction receives a comparison value with one of the promoters described by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 by more than 50%, preferably 100%, particularly preferably 500%, very particularly preferably 1000% exceeds. Also particularly preferred are those sequences whose level of expression before induction does not receive a comparison value with a promoter described by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or does not exceed this by at least 10%, preferably at least 30%, particularly preferably at least 50%, most preferably falls below at least 90%. In general, induction is expected after 2 to 72 hours, preferably after 12 to 48 hours.
Als transgen zu eprimierende Nukleinsäuresequenz sind solche bevorzugt, die eine leichte Quantifizierung der Expression ermög- liehen d.h. insbesondere solche deren Transkription und Translation in sogenannten Reporterproteinen resultiert (Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(l):29-44) wie beispiels- weise GFP ("green fluorescence protein"; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al . (1997) Biotechniques 23(5): 912-8), Chloramphenicoltransferase, Luziferase (Millar et al . (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414), ß-Galactosidase oder - be- sonders bevorzugt - ß-Glucuronidase (Jefferson et al . (1987) EMBO J 6:3901-3907). Weitere Reportergene sind unten beschrieben.Preferred nucleic acid sequences to be expressed transgenically are those which allow easy quantification of the expression, ie in particular those whose transcription and translation results in so-called reporter proteins (Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13 (l): 29-44) such as beispiels- as GFP ("green fluorescence protein"; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6: 325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques 23 (5): 912-8), chloramphenicol transferase, luciferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324-414), β-galactosidase or - particularly preferably - β-glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907). Other reporter genes are described below.
(Ansonsten unveränderte Bedingungen bedeutet beispielsweise, dass die einzige variable Komponente, die Promotorsequenz ist. Alle anderen Parameter wie Kulturbedingungen, Art des chemischen Induktors, Zeitpunkt der Induktionsmessung oder Art der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz (z.B. Art des Reportergens) bleiben konstant. Sind keine identischen Rahmenbedingungen verfügbar, um unveränderte Bedingungen zu gewährleisten - wie es beispielsweise im Falle der Pathogenart aufgrund spezifischer Pathogen-Wirt-Wechselwirkungen sein kann - so sind solche Bedingungen zu wählen, die den jeweils anderen möglichst nahe kommen. So kann beispielsweise anstatt der Inokulation von Gerste mit dem Gerstenmehltau (Blumeria [syn Erysiphe] graminis f.sp. hordei Speer, Bgh) bei dem entsprechenden funktionellen Äquivalent zu BCI-3 oder BCI-4 aus Weizen der Weizenmehltau (Blumeria graminis f.sp. tritici Speer, Bgt) herangezogen werden.(Otherwise unchanged conditions mean, for example, that the only variable component is the promoter sequence. All other parameters such as culture conditions, type of chemical inducer, time of induction measurement or type of nucleic acid sequence to be expressed (eg type of reporter gene) remain constant. Are not identical framework conditions To ensure that conditions remain unchanged - as can be the case, for example, in the case of the pathogen type due to specific pathogen-host interactions - conditions should be selected that come as close as possible to each other, for example, instead of inoculating barley with the Barley powdery mildew (Blumeria [syn Erysiphe] graminis f.sp. hordei Speer, Bgh) can be used for the corresponding functional equivalent to BCI-3 or BCI-4 from wheat powdery mildew (Blumeria graminis f.sp. tritici Speer, Bgt).
Verschiedene chemische Induktoren können im Rahmen des er- findungsgemäßen Verfahrens zum Einsatz kommen. Der Begriff des chemischen Induktors schließt vor allem Verbindungen mit einer Benzo-1, 2 , 3-thiadiazol Grundstruktur ein und umfasst beispielhaft jedoch nicht einschränkend Benzo-1, 2 , 3-thiadiazolcarbonsäure, Benzo-1, 2 , 3-thiadiazolthiocarbonsäure, Cyanobenzo- 1,2,3-thia- diazol, Benzo-1, 2 , 3-thiadiazolcarbonsäureamid, Benzo-1 ,2,3-thia- diazolcarbonsäurehydrazid, Benzo-1, 2, 3-thiadiazol-7ι-carbonsäure, Benzo-1, 2 , 3-thiadiazol-7-thiocarbonsäure, 7-Cyano-benzo-l, 2 , 3- thiadiazol , Benzo- [1,2,3] thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methyl- ester, Benzo-1, 2, 3-thiadiazol-7-carbonsäureamid, Benzo-1,2,3- thiadiazol-7-carbonsäurehydrazid, Alkylbenzo-1, 2, 3-thiadiazol- carboxylate in denen die Alkylgruppe ein bis 6 C-Atome umfasst, Methylbenzo-1, 2 , 3-thiadiazol-7-carboxylat, n-Propyl benzo-1, 2,3- thiadiazol-7-carboxylat , Benzylbenzo-1 , 2 , 3-thiadiazol-7-carboxy- lat, Benzo-1, 2 , 3-thiadiazole-7-carbonsäure-sec-butylhydrazid, sowie weitere geeignete Derivate der vorgenannten Induktoren wie beispielsweise in US 4,931,581 und US 5,229,384 beschrieben.Various chemical inductors can be used in the process according to the invention. The term chemical inducer primarily includes compounds with a benzo-1, 2, 3-thiadiazole basic structure and includes, by way of example but not by way of limitation, benzo-1, 2, 3-thiadiazolecarboxylic acid, benzo-1, 2, 3-thiadiazolthiocarboxylic acid, cyanobenzo- 1,2,3-thia-diazole, benzo-1, 2, 3-thiadiazolecarboxamide, benzo-1, 2,3-thia-diazolecarboxylic acid hydrazide, benzo-1, 2, 3-thiadiazole-7ι-carboxylic acid, benzo-1, 2,3-thiadiazole-7-thiocarboxylic acid, 7-cyano-benzo-1,2,3-thiadiazole, benzo [1,2,3] thiadiazole-7-thiocarboxylic acid S-methyl ester, benzo-1,2 , 3-thiadiazole-7-carboxamide, benzo-1,2,3-thiadiazole-7-carboxylic acid hydrazide, alkylbenzo-1,2,3-thiadiazole carboxylates in which the alkyl group comprises one to 6 carbon atoms, methylbenzo-1, 2, 3-thiadiazole-7-carboxylate, n-propyl benzo-1, 2,3-thiadiazole-7-carboxylate, benzylbenzo-1, 2, 3-thiadiazole-7-carboxy-lat, benzo-1, 2, 3 -thiadiazole-7-carboxylic acid sec-butyl hydrazide, as well as other suitable derivatives of v or inductors as described for example in US 4,931,581 and US 5,229,384.
Weiterhin bevorzugt sind Induktoren mit einem Pyridincarbonsäure- Grundgerüst wie Isonikotinsäure und Derivate derselben, besonders bevorzugt sind Haloisonikotinsäuren wie Dichloroisonicotinsäure bevorzugt 2, 6-Dichlorisonicotinsäure (DCINA) und Derivate dersel- ben wie beispielsweise die niederen Alkylester (Cl bis C6) , ganz besonders der Methylester.Also preferred are inductors with a pyridinecarboxylic acid backbone, such as isonicotinic acid and derivatives thereof; haloisonicotinic acids such as dichloroisonicotinic acid, 2,6-dichloroisonicotinic acid (DCINA) and derivatives thereof are particularly preferred. ben such as the lower alkyl esters (Cl to C6), especially the methyl ester.
Darüberhinaus sind alle Substanzen potentiell geeignet, die in Pflanzen als Induktoren von PR-Genen oder Induktoren einer SAR beschrieben worden sind, wie beispielsweise Benzoesäure, Salicylsäure (SA), Jasmonsäure oder Jasmonsäuremethylester, Polyacryl- säure sowie substituierte Derivate der vorgenannten Induktoren.In addition, all substances are potentially suitable which have been described in plants as inducers of PR genes or inducers of a SAR, such as, for example, benzoic acid, salicylic acid (SA), jasmonic acid or jasmonic acid methyl ester, polyacrylic acid and substituted derivatives of the aforementioned inducers.
Besonders bevorzugte Induktoren sind 2 , 6-Dichlorisonicotinsäure (DCINA) , Benzo- [1,2,3] thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methylester, Salicylsäure (SA) , Jasmonsäure (JA) und Jasmonsäuremethylester (JM) .Particularly preferred inducers are 2,6-dichloroisonicotinic acid (DCINA), benzo [1,2,3] thiadiazole-7-thiocarboxylic acid S-methyl ester, salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA) and jasmonic acid methyl ester (JM).
Die Applikation der Induktoren kann in Reinform, in Lösung oder Suspension, als Pulver oder Staub oder aber in jeder anderen in der Landwirtschaft üblichen Formulierungsform eingesetzt werden. Dabei können feste als auch flüssige Hilfs- oder Trägerstoffe verwendet werden, mit denen der Induktor gemischt wird, um bei- spielsweise eine erleichterte Applikation auf die Pflanze,The application of the inductors can be used in pure form, in solution or suspension, as powder or dust or in any other form of formulation customary in agriculture. Solid as well as liquid auxiliaries or carriers can be used with which the inductor is mixed, for example to facilitate application to the plant,
Gewebe, Zelle, Zellkultur, Samen o.a. zu gewährleisten, oder um Lagerfähigkeit, Handhabung, Transport zu verbessern'. Als Hilfsoder Trägerstoffe können dabei beispielhaft Silikate, Tone, Polymere, Alkohole, Ketone, aliphatische oder aromatische Kohlenwas- serstoffe und dergleichen verwendet werden. Wird der Induktor in Form eines konventionellen "wettable powder" oder als Konzentrat einer wässrigen Suspension oder Emulsion eingesetzt, so kann die Formulierung eine oder mehr oberflächenaktive, ionische oder nicht-ionische Verbindungen ( "surfactants") , "wetting" Agentien oder Emulgatoren beinhalten. Der Induktor kann einzeln oder aber auch Kombination mit anderen geeigneten Induktoren eingesetzt werden (Beispielsweise eine Kombination von DCINA und BTH) . Auch kann der Induktor in Kombination mit anderen Verbindungen wie Adjuvantien, Herbiziden, Fungiziden, Insektizide oder Wachstums- regulatoren oder Düngemitteln eingesetzt werden. Als flüssige Formulierung kann der Induktor bevorzugt als Spray auf Blätter, Stengel und/oder Zweige der Pflanze oder aber auf den Samen vor der Aussaat appliziert werden. Die Menge des Induktor wird bezüglich Menge und Zeitraum an die jeweils für eine optimale Induk- tion erforderliche Quantität angepasst. Bei Applikation auf ganze Pflanzen werden allgemein Induktoren in einer Konzentration von 0,1 bis 1000 mg aktiver Verbindung pro Liter Bodenvolumen im Rahmen eines Bodenbehandlungsprozesses oder aber in Konzentrationen von 0,1 bis 100 mg/1 aktive Verbindung pro Liter Flüssigkeit bei Sprayapplikation eingesetzt. In Zeil- oder Gewebekulturen können auch geringere Konzentrationen eingesetzt werden. Im allgemeinen wird eine Induktion nach 2 bis 72 h, bevorzugt nach 12 bis 48 h erwartet .To ensure tissue, cell, cell culture, seeds or the like, or to improve storage stability, handling, transport '. Silicates, clays, polymers, alcohols, ketones, aliphatic or aromatic hydrocarbons and the like can be used, for example, as auxiliaries or carriers. If the inductor is used in the form of a conventional "wettable powder" or as a concentrate of an aqueous suspension or emulsion, the formulation can contain one or more surface-active, ionic or non-ionic compounds ("surfactants"), "wetting" agents or emulsifiers. The inductor can be used individually or in combination with other suitable inductors (for example a combination of DCINA and BTH). The inductor can also be used in combination with other compounds such as adjuvants, herbicides, fungicides, insecticides or growth regulators or fertilizers. As a liquid formulation, the inductor can preferably be applied as a spray to leaves, stems and / or branches of the plant or else to the seeds before sowing. The quantity and time period of the inductor are adapted to the quantity required for an optimal induction. When applied to whole plants, inductors are generally used in a concentration of 0.1 to 1000 mg of active compound per liter of soil volume as part of a soil treatment process or in concentrations of 0.1 to 100 mg / 1 active compound per liter of liquid for spray application. Lower concentrations can also be used in cell or tissue cultures. In general induction is expected after 2 to 72 h, preferably after 12 to 48 h.
Unter einem funktionalen Äquivalent versteht man insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen des BCI-3 Promotors gemäß SEQ ID NO: 1 oder des BCI-4 Promotors gemäß SEQ ID NO: 2 sowie homologe Sequenzen aus anderen Pflanzengattungen und -arten, welche weiterhin eine im wesentlichen gleiche Promotoraktivität aufweisen.A functional equivalent is understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of the BCI-3 promoter according to SEQ ID NO: 1 or of the BCI-4 promoter according to SEQ ID NO: 2, as well as homologous sequences from other plant genera and species, which continue to be essentially the same Have promoter activity.
Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversionen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste . Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifika- tion der BCI-3 Promotorsequenz gemäss SEQ ID NO: 1 oder der BCI-4 Promotorsequenz gemäss SEQ ID NO: 2 erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der .darin enthaltenen Sequenz auf bestimmte regulatorische Elemente oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein.Mutations include substitutions, additions, deletions, inversions or insertions of one or more nucleotide residues. Thus, for example, the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modifying the BCI-3 promoter sequence according to SEQ ID NO: 1 or the BCI-4 promoter sequence according to SEQ ID NO: 2. The aim of such a modification can e.g. further restricting the sequence contained therein to certain regulatory elements or e.g. also the insertion of further restriction enzyme interfaces, the removal of superfluous DNA or the addition of further sequences, for example further regulatory sequences.
Die Eingrenzung der Sequenz auf bestimmte, essentielle regulatorische Regionen - beispielsweise auch zur Herstellung funktioneil äquivalenter Teile der erfindungsgemäßen Promotorsequenzen - kann auch mit Hilfe von Suchroutine zur Suche von Promotorelementen vorgenommen werden. Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen bestimmte Promotorelemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann beispielsweise mit Computerprogrammen wie dem Programm PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") vorgenommen werden (Higo K et al . (1999) Nucl Acids Res 27(1) :297- 300) . Insbesondere für das Auffinden cis-acting regulativer Elemente kann das über Internet verfügbare Programm "PlantCARE" verwendet werden (http: //sphinx.rüg. ac .be : 8080/PlantCARE/cgi/ index.html) .The sequence can be limited to specific, essential regulatory regions - for example also for the production of functionally equivalent parts of the promoter sequences according to the invention - can also be carried out with the aid of a search routine for searching for promoter elements. Certain promoter elements are often present in abundance in the regions relevant to promoter activity. This analysis can be carried out, for example, using computer programs such as the PLACE program ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") (Higo K et al. (1999) Nucl Acids Res 27 (1): 297-300). The "PlantCARE" program, which is available on the Internet, can be used in particular to find cis-acting regulatory elements (http: //sphinx.rüg. Ac .be: 8080 / PlantCARE / cgi / index.html).
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z.B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymeraseketten- reaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid- Primer kommen. Funktionelle Äquivalente des BCI-3 Promotors, abgeleitet der erfindungsgemäßen BCI-3 Promotorsequenzen zum Beispiel durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden, haben eine Homologie von mindestens 50 %, bevorzugt 60 %, vorzugsweise mindestens 70 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % zu der Promotorsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder einem funktioneil äquivalenten Teil derselben, bevorzugt einem äquivalenten Teil gemäss SEQ ID NO: 3, 4 5, 6 oder 7 und zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Promotoraktivität im Vergleich zu der BCI-3 PromotorSequenz gemäß SEQ-ID NO: 1 oder einem funktionell äquivalenten Teil derselben, bevorzugt einem äquivalenten Teil gemäss SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 oder 7 aus .Where insertions, deletions or substitutions, such as transitions and transversions, come into question, techniques known per se, such as in vitro mutagenesis, "primer repair", restriction or ligation can be used. Manipulations such as restriction, "chewing-back" or filling in overhangs for "blunt ends" can provide complementary ends of the fragments for the ligation. Analogous results can also be obtained using the polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide primers. Functional equivalents of the BCI-3 promoter, derived from the BCI-3 promoter sequences according to the invention, for example by substitution, insertion or deletion of nucleotides, have a homology of at least 50%, preferably 60%, preferably at least 70%, particularly preferably at least 80%, entirely particularly preferably at least 90% of the promoter sequence according to SEQ ID NO: 1 or a functionally equivalent part thereof, preferably an equivalent part according to SEQ ID NO: 3, 4 5, 6 or 7 and are distinguished by essentially the same promoter activity in comparison the BCI-3 promoter sequence according to SEQ-ID NO: 1 or a functionally equivalent part thereof, preferably an equivalent part according to SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7.
Funktionelle Äquivalente des BCI-4 Promotors, abgeleitet der erfindungsgemäßen BCI-4 Promotorsequenzen zum Beispiel durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden, haben eine Homologie von mindestens 50 %, bevorzugt 60 %, vorzugsweise mindestens 70 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, ganz be- sonders bevorzugt mindestens 90 % zu der Promotorsequenz gemäss SEQ ID NO: 2 oder einem funktionell äquivalenten Teil derselben, bevorzugt einem äquivalenten Teil gemäss SEQ ID NO: 8 und zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Promotoraktivität im Vergleich zu der BCI-4 Promotorsequenz gemäß SEQ-ID NO: 2 oder einem funktionell äquivalenten Teil derselben, bevorzugt einem äquivalenten Teil gemäss SEQ ID NO: 8 aus.Functional equivalents of the BCI-4 promoter, derived from the BCI-4 promoter sequences according to the invention, for example by substitution, insertion or deletion of nucleotides, have a homology of at least 50%, preferably 60%, preferably at least 70%, particularly preferably at least 80%, entirely particularly preferably at least 90% of the promoter sequence according to SEQ ID NO: 2 or a functionally equivalent part thereof, preferably an equivalent part according to SEQ ID NO: 8, and are characterized by essentially the same promoter activity compared to the BCI-4 promoter sequence according to SEQ-ID NO: 2 or a functionally equivalent part thereof, preferably an equivalent part according to SEQ ID NO: 8.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:Homology between two nucleic acids is understood to mean the identity of the nucleic acid sequence over the entire entire length of the sequence, which can be determined by comparison using the program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) with the following parameters is calculated:
Gap Weight: 12 Length Weight : 4Gap Weight: 12 Length Weight: 4
Average Match: 2,912 Average Mismatch: -2 , 003Average Match: 2,912 Average Mismatch: -2, 003
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 50 % auf Nukleinsäurebasis mit der SequenzAn example is a sequence that has a homology of at least 50% on a nucleic acid basis with the sequence
SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programm- algorithtαus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 50 % aufweist. • Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Expressionsvektoren zum Einsatz kommenden Promotorsequenzen lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthinum, durch Homologievergleiche aus Datenbanken leicht auffinden. Durch Verwendung der BCI-3 bzw. BCI-4 Gen oder cDNA-Sequenzen zur Herstellung von Sonden zur Durchmusterung genomischer Bibliotheken anderer Organismen können homologe Promotorsequenzen, umfasst als funktioneile Äquivalente, ebenfalls aufgefunden werden. So konnte im Rahmen dieser Erfindung gezeigt werden, dass auch in Weizen homologe BCI-3 und BCI-4 Gene vorhanden sind, deren Promotoren die gleichen Eigenschaften wie die erfindungsgemäßen Promotoren aus Gerste haben (s. Fig. 7 und Legende dazu) .SEQ ID NO: 1, understood a sequence which, when compared with the sequence SEQ ID NO: 1 according to the above program algorithm with the above parameter set, has a homology of at least 50%. • Further examples of the promoter sequences used in the expression cassettes or expression vectors according to the invention can easily be found, for example, from various organisms whose genomic sequence is known, for example from Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthinum, by comparing homology from databases , By using the BCI-3 or BCI-4 gene or cDNA sequences for the production of probes for screening genomic libraries of other organisms, homologous promoter sequences, including functional equivalents, can also be found. In the context of this invention, it was possible to show that homologous BCI-3 and BCI-4 genes are also present in wheat, the promoters of which have the same properties as the promoters from barley according to the invention (see FIG. 7 and the legend to this).
Funktionelle Äquivalente meint ferner DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz der beschrieben durch SEQ ID NO : 1 oder 2 oder den von ihnen abgeleiteten funk- tionell äquivalenten Teilen gemäss SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 beschriebenen oder den zu ihnen komplementären Nukleinsäure- sequenzen hybridisieren und die im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie die Nukleinsäurese uenzen beschrieben durch SEQ ID NO: 1 oder 2 oder die von ihnen abgeleiteten funktionell äquivalenten Teilen gemäss SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 haben. Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbe- dingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al . (1989) in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.Functional equivalents furthermore means DNA sequences which, under standard conditions, have a nucleic acid sequence as described by SEQ ID NO: 1 or 2 or the functionally equivalent parts derived from them as described in SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 or 8 or hybridize the complementary nucleic acid sequences and which essentially have the same promoter activities as the nucleic acid sequences described by SEQ ID NO: 1 or 2 or the functionally equivalent parts derived from them according to SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, Have 7 or 8. Standard hybridization conditions are to be understood broadly and mean stringent as well as less stringent hybridization conditions. Such hybridization conditions are described, inter alia, by Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al. (1989) in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3 .6. described.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3 M Natriumeitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Para- meter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegen- wart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt . Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:By way of example, the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited by those with low stringency (with approximately 2X SSC at 50 ° C.) and those with high stringency (with approximately 0.2X SSC at 50 ° C., preferably at 65 ° C. C) (20X SSC: 0.3 M sodium citrate, 3 M NaCl, pH 7.0). Furthermore, the temperature during the washing step can be raised from low stringent conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can be kept constant and only the other can be varied. Denaturing agents such as formamide or SDS can also be used during hybridization. In counter If 50% formamide was used, the hybridization is preferably carried out at 42 ° C. Some exemplary conditions for hybridization and washing step are given as a result:
(1) Hybridisierungbedingungen mit zum Beispiel(1) Hybridization conditions with, for example
a) 4X SSC bei 65°C, odera) 4X SSC at 65 ° C, or
b) 6X SSC bei 45°C, oderb) 6X SSC at 45 ° C, or
c) 6X SSC bei 68°C, 100 μg/ml denaturierter Fischsperma-DNA, oderc) 6X SSC at 68 ° C, 100 μg / ml denatured fish sperm DNA, or
d) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 68°C, oderd) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 μg / ml denatured, fragmented salmon sperm DNA at 68 ° C, or
e) 6X SSC, 0,5 % SDS, 100 μg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50 % Formamid bei 42°C. |e) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 μg / ml denatured, fragmented salmon sperm DNA, 50% formamide at 42 ° C. |
f) 50 % Formamid, 4X SSC bei 42°C, oderf) 50% formamide, 4X SSC at 42 ° C, or
g) 50 % (v/v) Formamid, 0,1 % Rinderseru albumin, 0,1 %g) 50% (v / v) formamide, 0.1% bovine serum albumin, 0.1%
Ficoll, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphat- puffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumeitrate bei 42°C, oderFicoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mM sodium current at 42 ° C, or
h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung) , oderh) 2X or 4X SSC at 50 ° C (weakly stringent condition), or
i) 30 % bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung) .i) 30% to 40% formamide, 2X or 4X SSC at 42 ° C (weakly stringent condition).
(2) Waschschritte mit zum Beispiel(2) washing steps with for example
a) 15 mM NaCl, 1,5 M Natriumeitrat, 0,1 % SDS bei 50°C; odera) 15 mM NaCl, 1.5 M sodium citrate, 0.1% SDS at 50 ° C; or
b) 0,1X SSC bei 65°C, oderb) 0.1X SSC at 65 ° C, or
c) 0,1X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C, oderc) 0.1X SSC, 0.5% SDS at 68 ° C, or
d) 0,1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C, oderd) 0.1X SSC, 0.5% SDS, 50% formamide at 42 ° C, or
e) 0,2X SSC, 0,1% SDS bei 42°C, odere) 0.2X SSC, 0.1% SDS at 42 ° C, or
f ) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung) . Funktionelle Äquivalente umfassen - neben solchen die "still" sind d.h. die Promotoraktivität unverändert lassen - auch solche Promotorvarianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangspromotor , abgeschwächt oder verstärkt ist .f) 2X SSC at 65 ° C (weakly stringent condition). Functional equivalents include - in addition to those which are "silent", ie which leave the promoter activity unchanged - also those promoter variants whose function is weakened or enhanced compared to the starting promoter.
Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer funktioneller Äquivalente umfasst bevorzugt die Einführung von Mutationen in die BCI-3 Promotorsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder die BCI-4 Promotorsequenz gemäß SEQ ID NO : 2 oder die von diesen abgeleitete funk- tionell äquivalente Teile gemäß SEQ ID NO : 3, 4, 5, 6, 7 oder 8.A method for producing functional equivalents according to the invention preferably comprises the introduction of mutations into the BCI-3 promoter sequence according to SEQ ID NO: 1 or the BCI-4 promoter sequence according to SEQ ID NO: 2 or the functionally equivalent parts derived from these according to SEQ ID NO : 3, 4, 5, 6, 7 or 8.
Eine Mutagenese kann ungerichtet ("random") erfolgen, wobei die mutagenisierten Sequenzen anschließend bezüglich ihrer Promotoraktivität nach einer "trial-by-error" Prozedur durchmustert werden. Alternativ können Teilsequenzen, die für die Promotoreigenschaften des BCI-3 oder BCI-4 Promotors verantwortlich sind identifiziert werden (z.B. unter Verwendung von obengenannten Computeralgorithmen) . In diese oder ähnliche Teilsequenzen können andere verwandte oder nicht-verwandte Nukleinsäuresequenzen (zum Beispiel Promotorsequenzen) eingeführt werden. Analog können nicht-essentielle Sequenzen deletiert werden ohne die Promotoraktivität signifikant zu beeinträchtigen.Mutagenesis can be carried out in an undirected ("random") manner, the mutagenized sequences then being screened for their promoter activity according to a "trial-by-error" procedure. Alternatively, partial sequences that are responsible for the promoter properties of the BCI-3 or BCI-4 promoter can be identified (e.g. using the above-mentioned computer algorithms). Other related or unrelated nucleic acid sequences (for example promoter sequences) can be introduced into these or similar partial sequences. Analogously, non-essential sequences can be deleted without significantly impairing the promoter activity.
Verfahren zur Mutagenisierung von Nukleinsäuresequenzen sind dem Fachmann bekannt und schließen beispielhaft die Verwendung von Oligonukleotiden mit einer oder mehr Mutationen im Vergleich zu der zu mutierenden Region ein (z.B. im Rahmen einer "Site-speci- fic mutagenesis" ) . Typischerweise kommen Primer mit ungefähr 15 bis ungefähr 75 Nukleotiden oder mehr zum Einsatz, wobei bevor- zugt ca. 10 bis ca. 25 oder mehr Nukleotidreste an beiden Seiten der zu verändernden Sequenz lokalisiert sind. Details und Durchführung besagter Mutageneseverfahren sind dem Fachmann geläufig (Kunkel et al . (1987) Methods Enzy ol 154:367-382; Tomic et al . (1990) Nucl Acids Res 12:1656; Upender, Raj , Weir (1995) Bio- teehniques 18 (1) : 29-30; US 4,237,224). Eine Mutagenese kann auch durch Behandlung von beispielsweise Vektoren, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten, mit utagenisieren- den Agentien wie Hydroxylamin realisiert werden.Methods for mutagenizing nucleic acid sequences are known to the person skilled in the art and include, for example, the use of oligonucleotides with one or more mutations in comparison to the region to be mutated (e.g. as part of a "site-specific mutagenesis"). Typically, primers with approximately 15 to approximately 75 nucleotides or more are used, preferably approximately 10 to approximately 25 or more nucleotide residues being located on both sides of the sequence to be changed. The details and implementation of said mutagenesis methods are known to the person skilled in the art (Kunkel et al. (1987) Methods Enzy ol 154: 367-382; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12: 1656; Upender, Raj, Weir (1995) Bio- teehniques 18 (1): 29-30; US 4,237,224). Mutagenesis can also be achieved by treating, for example, vectors which contain one of the nucleic acid sequences according to the invention with utagenizing agents such as hydroxylamine.
Als funktionell äquivalent sind ferner auch solche Sequenzen zu betrachten, die sich aus Sequenzen sowohl des BCI-3 Promotors gemäß SEQ ID NO : 1 und des BCI-4 Promotors gemäß SEQ ID NO: 2 oder Teilsequenzen derselben, bevorzugt Teilsequenzen gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 zusammensetzen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskassetten, die eine der erfindungsgemäßen Promotorsequenzen umfassen. Beansprucht sind bevorzugt Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren enthaltendSequences which are composed of sequences of both the BCI-3 promoter according to SEQ ID NO: 1 and the BCI-4 promoter according to SEQ ID NO: 2 or partial sequences thereof, preferably partial sequences according to SEQ ID NO: Assemble 3, 4, 5, 6, 7 or 8. The invention further relates to transgenic expression cassettes which comprise one of the promoter sequences according to the invention. Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids are preferably claimed
i) den BCI-3 Promotor gemäß SEQ ID No : 1 oder ein funktionellesi) the BCI-3 promoter according to SEQ ID No: 1 or a functional one
Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil desselben, oderEquivalent or functionally equivalent part of the same, or
ii) den BCI-4 Promotor gemäß SEQ ID No : 2 oder ein funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil desselbenii) the BCI-4 promoter according to SEQ ID No: 2 or a functional equivalent or a functionally equivalent part of the same
wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.wherein a) or b) are functionally linked to a nucleic acid sequence to be expressed transgenically.
"Transgen" meint in Bezug auf eine Expressionskassette, einen Vektor oder einen Organismus alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen, sich entweder a) der Promotor des BCI-3 Gens gemäß SEQ ID No: 1 'oder ein funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil desselben, bevorzugt ein funktionell äquivalentes Teil gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 oder 7, bzw. der Promotor des BCI-4 Gens gemäß SEQ ID No : 2 oder ein funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil desselben, bevorzugt ein funktionell äquivalentes Teil gemäß SEQ ID NO: 8, oderWith regard to an expression cassette, a vector or an organism, “transgene” means all such constructions which have been obtained by genetic engineering methods in which either a) the promoter of the BCI-3 gene according to SEQ ID No: 1 'or a functional equivalent or functional equivalent part of the same, preferably a functionally equivalent part according to SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7, or the promoter of the BCI-4 gene according to SEQ ID No: 2 or a functional equivalent or part of the same, preferably a functionally equivalent part according to SEQ ID NO: 8, or
b) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, oderb) the nucleic acid sequence to be expressed, or
c) (a) und (b)c) (a) and (b)
sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung (d.h. an ihrem natürlichen chromosomalen Locus) befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. >are not in their natural, genetic environment (i.e. at their natural chromosomal locus) or have been modified by genetic engineering methods, the modification being, for example, a substitution, addition, deletion, inversion or insertion of one or more nucleotide residues. >
Im Rahmen der erfindungsgemässen Expressionskassette kann die Expression der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz zur Bildung von sense-RNA oder anti-sense RNA führen. Die sense-RNA kann infolge in bestimmte Polypeptide translatiert werden Mit der anti-sense-RNA kann beispielsweise die Expression bestimmter Gene herunterreguliert werden.In the context of the expression cassette according to the invention, the expression of the nucleic acid sequence to be expressed can lead to the formation of sense RNA or anti-sense RNA. The sense RNA can consequently be translated into certain polypeptides. With the anti-sense RNA, for example, the expression of certain genes can be down-regulated.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung einer der erfindungsgemäßen Promotoren und einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf . weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen IJNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter (d.h. am 3 '-Ende) der erfindungsgemäßen Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.A functional link is understood to mean, for example, the sequential arrangement of one of the promoters according to the invention and a nucleic acid sequence to be expressed transgenically and, if appropriate, other regulatory elements such as a terminator in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function in the transgenic expression of the nucleic acid sequence, depending on the arrangement of the nucleic acid sequences to sense or anti-sense RNA. This does not necessarily require a direct link in the chemical sense. Genetic control sequences, such as, for example, enhancer sequences, can also perform their function on the target sequence from more distant positions or even from other IJNA molecules. Arrangements are preferred in which the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is positioned behind (ie at the 3 'end) the promoter sequence according to the invention, so that both sequences are covalently linked to one another. The distance between the promoter sequence and the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is preferably less than 200 base pairs, particularly preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.
Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promotor und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch - beispielsweise Transformation - in ein pflanzliches Genom insertiert werden.The expression cassette, consisting of a linkage of promoter and nucleic acid sequence to be expressed, can preferably be integrated in a vector and inserted into a plant genome by, for example, transformation.
Unter einer erfindungsgemäßen Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen einer der erfin- dunsgsgemäßen Promotoren zum Beispiel über eine gezielte homologe Rekombination oder eine zufällige Insertion in ein Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über mit ihm dann funktionell verknüpfte Nukleinsäuresequenzen übernimmt und die transgene Expression derselben steuert . Durch Insertion des Promotors - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - vor eine für ein bestimmtes Polypeptid kodierende Nukleinsäure erhält man eine erfindungsgemässe Expressionskassette, die die Expression des bestimmten Polypeptides infolge einer chemischen Induktion steuert . Ferner kann die Insertion des Promotors auch derart erfolgen, dass antisense-RNA zu der für ein bestimmtes Polypeptid kodierenden Nukleinsäure exprimiert wird. Damit wird die Expression des bestimmten Polypeptides infolge einer chemischen Induktion herunterreguliert oder ausgeschaltet.An expression cassette according to the invention is, however, also to be understood as such constructions in which one of the promoters according to the invention is introduced into a host genome, for example via a targeted homologous recombination or a random insertion, there takes over regulatory control over nucleic acid sequences then functionally linked with it and which controls transgenic expression thereof. By inserting the promoter - for example by homologous recombination - in front of a nucleic acid coding for a specific polypeptide, an expression cassette according to the invention is obtained which controls the expression of the specific polypeptide as a result of chemical induction. Furthermore, the insertion of the promoter can also take place in such a way that antisense RNA is expressed to form the nucleic acid coding for a specific polypeptide. The expression of the particular polypeptide is thus down-regulated or switched off as a result of chemical induction.
Analog kann auch eine transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - hinter einen endogenen, natürlichen erfindungsgemäßen Promotor (z.B. den BCI-3 oder BCI-4 Promotor) platziert werden, wodurch man ebenfalls eine erfindungsgemässe Expressionskassette erhält. Erfindungsgemäss sind ferner Vektoren, die die oben beschriebenen Expressionskassetten enthalten. Vektoren sind rekombinante DNA- Sequenzen, in die die er indungsgemäßen Expressionskassetten zum Zwecke der Isolation, Vermehrung und Transformation in einen geeigneten Wirt insertiert werden können. Bevorzugt können die Vektoren in einem Wirt wie E.coli vermehrt werden und eignen sich zur Transformation pflanzlicher Zellen oder von Agrobacterium. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacterium sein.Analogously, a nucleic acid sequence to be expressed transgenically - for example by means of a homologous recombination - can be placed behind an endogenous, natural promoter according to the invention (for example the BCI-3 or BCI-4 promoter), which likewise gives an expression cassette according to the invention. Vectors according to the invention also contain the expression cassettes described above. Vectors are recombinant DNA sequences into which the expression cassettes according to the invention can be inserted into a suitable host for the purpose of isolation, multiplication and transformation. The vectors can preferably be propagated in a host such as E. coli and are suitable for the transformation of plant cells or of Agrobacterium. Vectors can be, for example, plasmids, cosmids, phages, viruses or also Agrobacterium.
Die in den erfindungsgemässen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem erfindungsgemäßen Promotor verknüpft sein.The nucleic acid sequences contained in the expression cassettes or vectors according to the invention can be linked to further genetic control sequences in addition to a promoter according to the invention.
Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemässen Expressionskassette, des Vektors oder eines mit vorgenannten transformierten Wir sorganismus haben.The term “genetic control sequences” is to be understood broadly and means all those sequences which have an influence on the formation or the function of the expression cassette according to the invention, the vector or a organism transformed with the aforementioned.
Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryoti- schen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemässen Expressionskassetten 5 ' -stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen der erfindunsgs- gemäßen Promotoren und 3 ' -stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.Genetic control sequences modify, for example, transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms. The expression cassettes according to the invention preferably comprise 5 'upstream of the respective nucleic acid sequence to be expressed transgenically, one of the promoters according to the invention and 3' downstream a terminator sequence as an additional genetic control sequence and, if appropriate, further customary regulatory elements, in each case functionally linked to the transgene expressing nucleic acid sequence.
Genetische KontrollSequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteuernden Eigenschaften modifizieren können. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH (1991) J Biol Chem 266 (26) : 17131 -17135) und Hitze- stress (Schöffl F et al . (1989) Mol Gen Genet 217 (2-3 ): 246-53 ) beschrieben.Genetic control sequences also include further promoters, promoter elements or minimal promoters that can modify the expression-controlling properties. Corresponding elements are, for example, for water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH (1991) J Biol Chem 266 (26): 17131 -17135) and heat stress (Schöffl F et al. (1989) Mol Gen Genet 217 (2- 3): 246-53).
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen.Furthermore, other promoters can be functionally linked to the nucleic acid sequence to be expressed, which enable expression in other plant tissues or in other organisms, such as E. coli bacteria.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans- latierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3 ' -Region von Genen, bevorzugt des BCI-3 oder BCI-4 Gens aus Gerste. Auch Sequenzen aus anderen Pflanzenarten, wie beispielsweise das Actin-1 oder Actin-2 Intron. Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5' -untranslatierte Sequen- zen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für solche Translationsverstärker sei die 5'-Leader- sequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al . (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711). Andere 5 ' -untranslatierte Sequenzen können die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al . (1998) Plant J 15:435-440.). Die unter SEQ ID N0:1 und 2 angegebene Nukleinsäuresequenzen enthalten jeweils die 5 '-untranslatierte Region bis vor das ATG-Startcodon des BCI-3 bzw. BCI-4 Proteins .Genetic control sequences also include the 5 'untranslated regions, introns or non-coding 3' regions of genes, preferably the barley BCI-3 or BCI-4 gene. Also Sequences from other plant species, such as the Actin-1 or Actin-2 intron. It has been shown that these can play a significant role in regulating gene expression. It has been shown that 5 'untranslated sequences can increase the transient expression of heterologous genes. The 5'-leader sequence from the tobacco mosaic virus may be mentioned as an example of such translation enhancers (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711). Other 5 'untranslated sequences can promote tissue specificity (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440.). The nucleic acid sequences given under SEQ ID N0: 1 and 2 each contain the 5 'untranslated region up to the ATG start codon of the BCI-3 or BCI-4 protein.
Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 ' -Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteil- hafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Gen- konstrukt enthalten sein.The expression cassette can advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable an increased transgenic expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the nucleic acid sequences to be expressed transgenically. The nucleic acid sequences to be expressed transgenically can be contained in one or more copies in the gene construct.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen erfindungs- gemäßen Promotor ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox- Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des WirtsOrganismus (Sauer B. Methods. 1998; 14 (4) : 381-92) . Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen) , die später eine Entfernung mittels der cre-Re- kombinase ermöglichen.Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome. With homologous recombination, for example, the natural promoter of a specific gene can be exchanged for a promoter according to the invention. Methods such as cre / lox technology allow tissue-specific, possibly inducible, removal of the expression cassette from the genome of the host organism (Sauer B. Methods. 1998; 14 (4): 381-92). Here certain flanking sequences are added to the target gene (lox sequences), which later enable removal by means of the cre recombinase.
Der einzuführende Promotor kann mittels homologer Rekombination vor das transgen zu exprimierende Zielgen platziert werden, indem der Promotor mit DNA-Sequenzen verknüpft wird, die zum Beispiel zu endogenen Sequenzen homolog sind, die dem Leseraster des Zielgens vorgelagert sind. Derartige Sequenzen sind als genetische Kontrollsequenzen zu verstehen. Nachdem eine Zelle mit dem entsprechenden DNA-Konstrukt transformiert wurde, können die beiden homologen Sequenzen interagieren und so die Promotorsequenz an dem gewünschten Ort vor dem Zielgen plazieren, so dass die Promotorsequenz nun in funktioneller Verknüpfung mit dem Zielgen steht und eine erfindungsgemässe Expressionskassette bildet . Die Auswahl der homologen Sequenzen bestimmt den Insertionsort des Promotors. Hierbei kann die Expressionskassette durch homologe Rekombination mittels einer einfachen oder einer doppelten rezi- 5 proken Rekombination generiert werden. Bei der einfach reziproken Rekombination wird nur eine einzelne Rekombinationssequenz verwendet und es erfolgt Insertion der gesamten eingeführten DNA. Bei der doppelt-reziproken Rekombination ist die einzuführende DNA durch zwei homologe Sequenzen flankiert und es erfolgt dieThe promoter to be introduced can be placed by means of homologous recombination in front of the target gene to be expressed transgenically, in that the promoter is linked to DNA sequences which are, for example, homologous to endogenous sequences which are upstream of the reading frame of the target gene. Such sequences are to be understood as genetic control sequences. After a cell has been transformed with the corresponding DNA construct, the two homologous sequences can interact and thus place the promoter sequence at the desired location in front of the target gene, so that the promoter sequence is now functionally linked to the target gene stands and forms an expression cassette according to the invention. The selection of the homologous sequences determines the insertion site of the promoter. Here, the expression cassette can be generated by homologous recombination using a single or a double reciprocal recombination. In the case of simple reciprocal recombination, only a single recombination sequence is used and the entire DNA introduced is inserted. In the case of double-reciprocal recombination, the DNA to be introduced is flanked by two homologous sequences and this is done
10 Insertion des flankierten Bereiches. Letzteres Verfahren ist geeignet, um wie oben beschrieben den natürlichen Promotor eines bestimmten Gens gegen einen erfindunsgsgemäßen Promotor auszutauschen und so den Expressionsort und -Zeitpunkt dieses Gens zu modifizieren. Die funktionelle Verknüpfung stellt eine er-10 Insertion of the flanked area. The latter method is suitable, as described above, for exchanging the natural promoter of a specific gene for a promoter according to the invention and thus modifying the expression location and time of this gene. The functional link creates a
15 findungsgemässe Expressionskassette dar.15 expression cassette according to the invention.
Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufälligHomologous recombination is a relatively rare event in higher eukaryotes, especially in plants. Random integrations into the host genome predominate. One way that happens randomly
20 integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zellklone mit einer korrekten homologen Rekombination anzureichern, besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems wie in US 6,110,736 beschrieben. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sindRemoving 20 integrated sequences and thus enriching cell clones with a correct homologous recombination consists in using a sequence-specific recombination system as described in US Pat. No. 6,110,736. A variety of sequence specific recombination systems can be used, for example
25 das Cre/lox-System, das FLP/FRT System, die Gin Rekombinase, die Pin Rekombinase aus E. coli und das R/RS System des pSRl Plasmids genannt . Bevorzugt sind das Pl Cre/lox und das FLP/FRT System. Hier interagiert die Rekombinase (Cre oder FLP) spezifisch mit ihren jeweiligen Rekombinationssequenzen (34 bp lox-Sequenz bzw.25 called the Cre / lox system, the FLP / FRT system, the gin recombinase, the pin recombinase from E. coli and the R / RS system of the pSRI plasmid. The Pl Cre / lox and the FLP / FRT system are preferred. Here the recombinase (Cre or FLP) interacts specifically with its respective recombination sequences (34 bp lox sequence or
30 47 bp FRT-Sequenz) , um die zwischengelagerten Sequenzen zu dele- tieren oder zu invertieren. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinase- system wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al. (1990) Mol Gen Genet 223:369-378).30 47 bp FRT sequence) to delete or invert the intermediate sequences. The FLP / FRT and cre / lox recombinase system has already been used in plant systems (Odell et al. (1990) Mol Gen Genet 223: 369-378).
35 Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al . (1984) EMBO J35 Suitable polyadenylation signals as control sequences are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACHS (Gielen et al. (1984) EMBO J
40 3:835 ff) oder funktioneile Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete TerminatorSequenzen sind der OCS (Octopin- Synthase) -Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase) -Terminator .40 3: 835 ff) or functional equivalents thereof. Examples of particularly suitable terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopalin synthase) terminator.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung bzw. einer 45 erfindungsgemässen Expressionskassette kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) sowie in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) und in Ausubel FM et al . (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience oder Gelvin et al .A functional linkage or an expression cassette according to the invention can be produced by means of common recombination and cloning techniques, as described, for example, in Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) and in Silhavy TJ, Berman ML and Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) and in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience or Gelvin et al.
(1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen den erfindungsgemäßen Promotor und die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz können aber auch weitere Sequenzen positio- niert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signal- bzw. Transitpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen.(1990) In: Plant Molecular Biology Manual. However, further sequences can also be positioned between the promoter according to the invention and the nucleic acid sequence to be expressed, which, for example, have the function of a linker with certain restriction enzyme interfaces or a signal or transit peptide. The insertion of sequences can also lead to the expression of fusion proteins.
Die Herstellung einer erfindungsgemässen Expressionskassette erfolgt beispielsweise durch Fusion eines erfindungsgemäßen Promotors mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz , sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal .An expression cassette according to the invention is produced, for example, by fusing a promoter according to the invention with a nucleotide sequence to be expressed, and a terminator or polyadenylation signal.
Die erfindungsgemässen Expressionskassetten und die von ihnen abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemässen Expressionskassetten, Vekto- ren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:The expression cassettes according to the invention and the vectors derived from them can contain further functional elements. The term functional element is to be understood broadly and means all those elements which have an influence on the production, reproduction or function of the expression cassettes, vectors or transgenic organisms according to the invention. Examples include, but are not limited to:
a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) , Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphi- notricin etc. verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche, die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt: DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren unda) Selection markers which are resistant to a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456), antibiotics or biocides, preferably herbicides, such as, for example, kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, or phosphinotricin etc. to lend. Particularly preferred selection markers are those which confer resistance to herbicides. Examples include: DNA sequences which code for phosphinothricin acetyltransferases (PAT) and
Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen) , 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthase- gene) , die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N- (phosphono- methyl) glycin) verleihen, das für das Glyphosat® degradie- rende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase) , das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert) , Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen (ALS) oder Acetohydroxysäuresynthasen (AHAS) sowie bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilaseenzyme kodieren. Der Selektionsmarker erlaubt eine Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al . (1986) Plant Cell Reports 5:81-84).Inactivate glutamine synthase inhibitors (bar and pat gene), 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes (EPSP synthase genes), which confer resistance to Glyphosate ® (N- (phosphonomethyl) glycine), the degrading enzyme for Glyphosat ® coding gox gene (glyphosate oxidoreductase), the deh gene (coding for a dehalogenase that inactivates dalapon), sulfonylurea and imidazolinone inactivating acetolactate synthases (ALS) or acetohydroxy acid synthases (AHAS) as well as bxn genes that degrade nitrodynilase enzymes. The selection marker allows one Selection of the transformed cells from untransformed (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodie- ren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -Zeitpunktes gewährleisten (Schenborn E und Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13 (1) : 29-44) .b) Reporter genes, which code for easily quantifiable proteins and which, by means of their own color or enzyme activity, ensure an assessment of the transformation efficiency or the expression location or time (Schenborn E and Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13 (1): 29-44).
1. ß-Glucuronidase (GUS) oder das uidA Gen, das ein Enzym für verschiedene chromogene Substrate kodiert (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907).1. β-glucuronidase (GUS) or the uidA gene which encodes an enzyme for various chromogenic substrates (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907).
2. R-Locus Gen: Kodiert ein Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen2. R-locus gene: encodes a protein that inhibits the production of anthocyanin pigments (red color) in vegetable
Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al . (1988) In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-Tissue regulates and thus enables a direct analysis of the promoter activity without adding additional auxiliary substances or chromogenic substrates (Dellaporta et al. (1988) In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263-
282) . Besonders vorteilhaft sind die Gene des R-Genkom- plexes aus Mais. Der R-Genkomplex kodiert ein Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten in den meisten Samen und Pflanzengeweben reguliert. Mais kann ein bis vier R-Allele aufweisen, die die Pigmentation in einer entwicklungs- und gewebeabhängigen Weise regulieren. Die transgene Expression eines R-Gens in einer Zelle führt zur Bildung eines rotes Pigmentes. Maislinien die dominante Allele der Gene der Anthocyaninbiosynthese- wege tragen (C2, Al, A2 , Bzl und Bz2), aber ein rezessives Allel des R-Locus besitzen, würden bei ' Transformation und transgener Expression eine rote Pigmentation ergeben. Beispielhaft kann die Linie Wisconsin 22 verwendet werden, die das rg-Stadler Allel und TR112 , enthält , ein K55 Derivat, das r-g, b, Pl ist. Alternative kann der282). The genes of the R gene complex from maize are particularly advantageous. The R gene complex encodes a protein that regulates the production of anthocyanin pigments in most seeds and plant tissues. Corn can have one to four R alleles that regulate pigmentation in a developmental and tissue dependent manner. The transgenic expression of an R gene in a cell leads to the formation of a red pigment. Corn lines that carry the dominant alleles of the genes of the anthocyanin biosynthetic pathways (C2, Al, A2, Bzl and Bz2), but have a recessive allele of the R locus, would result in red pigmentation when transformed and transgenically expressed. For example, the Wisconsin 22 line can be used, which contains the rg-Stadler allele and TR112, a K55 derivative which is r-g, b, Pl. The alternative can
Genotyp verwendet werden, solange die Cl und R Allele gemeinsam eingeführt werden.Genotype can be used as long as the Cl and R alleles are introduced together.
3. ß-Lactamasegen (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sei USA 75:3737-3741): Kodiert ein Enzym für verschiedene chromogene Substrate (z.B. PADAC, eine chromogenes Cephalo- sporin) .3. β-lactamase gene (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sei USA 75: 3737-3741): encodes an enzyme for various chromogenic substrates (e.g. PADAC, a chromogenic cephalosporin).
4. xylE Gen (Zukowsky et al . (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80:1101-1105): Kodiert eine Catecholdioxygenase, die chromogene Catechole umsetzen kann. 5. Alpha-Amylase Gen (Ikuta et al . (1990) Bio/technol. 8:241-242) .4. xylE gene (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80: 1101-1105): encodes a catechol dioxygenase that can convert chromogenic catechols. 5. Alpha amylase gene (Ikuta et al. (1990) Bio / technol. 8: 241-242).
6. Tyrosinasegen (Katz et al.(1983) J Gen Microbiol 129:2703-2714): Kodiert für ein Enzym, das Tyrosin zu6. Tyrosinase gene (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703-2714): Coded for an enzyme that tyrosine too
DOPA und Dopaquinon oxidiert, die infolge das leicht nachweisbare Melanin bilden.DOPA and dopaquinone oxidized, which as a result form the easily detectable melanin.
7. ß-Galactosidasegen, kodiert für ein Enzym für das ver- schiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen.7. β-galactosidase gene, encoded for an enzyme for which various chromogenic substrates are available.
8. Luciferase (lux) Gen (Ow et al . (1986) Science, 234:856-859; Millar et al . (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414) erlaubt Bioluminescenzdetektion. Luciferasen wie beispielsweise die "firefly luciferase" ermöglichen eine Quantifizierung unter Verwendung von Röntgenfilmen, Scintillationszählern, Fluorescenzspektrophometern, sensitiven, photonenzählenden Kameras oder Luminometern. Dazu kommen chromogene Substrate und andere Hilfsstoffe zum Einsatz. Das System kann zur Durchmusterung von8. Luciferase (lux) gene (Ow et al. (1986) Science, 234: 856-859; Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324-414) allows bioluminescence detection. Luciferases such as the "firefly luciferase" enable quantification using X-ray films, scintillation counters, fluorescence spectrophometers, sensitive, photon-counting cameras or luminometers. Chromogenic substrates and other auxiliaries are used for this. The system can be used to screen
Populationen angewendet werden.Populations are applied.
9. Aequoringen (Prasher et al.(1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3 ): 1259-1268) : Kann in der Calcium-sensitiven Bioluminescenzdetektion verwendet werden.9. Aequoringen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259-1268): Can be used in calcium-sensitive bioluminescence detection.
10. GFP ("green fluorescent protein" ; Chui WL et al . (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al . (1997) Biotech- niques. 23(5):912-8; Sheen et al.(1995) Plant Journal 8 (5) :777-784; Haseloff et al.(1997) Proc Natl Acad Sei10. GFP ("green fluorescent protein"; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6: 325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques. 23 (5): 912-8; Sheen et al . (1995) Plant Journal 8 (5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sei
USA 94(6) :2122-2127; Reichel et al . (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93 (12) : 5888-5893; Tian et al . (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228). Die GFP-Expression in einer Pflanze oder Zelle kann infolge Illumination mit Licht bestimmter Wellenlängen visualisiert werden.USA 94 (6): 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93 (12): 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228). GFP expression in a plant or cell can be visualized as a result of illumination with light of specific wavelengths.
11. Chloramphenicolacetyltransferase, Neomycinphosphotrans- ferase (NPT) , Nopalinsynthase (NOS) , Octopinsynthase (OCS) können ebenfalls als Markerproteine verwendet werden.11. Chloramphenicol acetyl transferase, neomycin phosphotransferase (NPT), nopaline synthase (NOS), octopine synthase (OCS) can also be used as marker proteins.
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungs- gemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication) , der pBR322 ori oder der P15A ori (Sa - brook et al . : Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .c) origins of replication, which ensure an increase in the expression cassettes or vectors according to the invention in, for example, E. coli. Examples include ORI (origin of DNA replication), pBR322 ori or P15A ori (Sabrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobacterium vermittelte Pflanzen- transfor ation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.d) Elements which are necessary for an Agrobacterium-mediated plant transformation, such as, for example, the right or left border of the T-DNA or the vir region.
Abhängig von der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ermöglichen sich zahlreiche vorteilhafte Anwendungsformen für die erfindungsgemäßen Promotoren, Vektoren, Expressionskassetten oder mit denen transformierte Organismen. Dem Fachmann sind zahlreiche Möglichkeiten der Verwendung bekannt. Neben der Verbesserung pflanzlichen Eigenschaften (z.B. Nährstoffgehalt oder -Zusammensetzung, Geschmack, Ertrag etc.) können beispielsweise auch andere vorteilhafte Eigenschaften wie männliche oder weibliche Sterilität , erhöhte Stresstoleranz und/oder Resistenz (gegen z.B. Trockenheit, Hitze, Salz, Kälte, Frost, erhöhte Feuchtigkeit, oxidativen Stress etc.) erzielt werden. Die infolge genannten Anwendungen und Nukleinsäuresequenzen sind daher beispielhaft und nicht einschränkend zu verstehen.Depending on the nucleic acid sequence to be expressed transgenically, numerous advantageous forms of use for the promoters, vectors, expression cassettes according to the invention or organisms transformed with them are possible. Numerous possibilities of use are known to the person skilled in the art. In addition to improving plant properties (e.g. nutrient content or composition, taste, yield, etc.), other advantageous properties such as male or female sterility, increased stress tolerance and / or resistance (against e.g. drought, heat, salt, cold, frost, increased) can also be used Moisture, oxidative stress etc.) can be achieved. The applications and nucleic acid sequences mentioned as a result are therefore to be understood as exemplary and not restrictive.
1. Induktion einer Pathogenresistenz1. Induction of pathogen resistance
Die natürlichen Abwehrmechanismen einer Pflanze gegen Patho- gene sind oft unzureichend. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiel sind der Schutz gegen Insektenfrass in Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin (Vaeck et al . (1987) Nature 328:33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne (Broglie et al . (1991) Science 254:1194-1197). Bisherige Ansätze basierten auf einer konstitutive Überexpression dieser Gene. Wünschenswerterweise sollten aber diese Abwehrstoffe aber erst dann expri iert werden, wenn die Notwendigkeit infolge eines Pathogenbefalls besteht. Eine konstitutive Überexpression - auch bei fehlendem Bedarf - kann sich nachteilig auf Wachstum, Ertrag und andere Eigenschaften der Pflanze auswirken. Außerdem kann es durch eine konstitutive Expression verstärkt zum Abschalten des Trans- gens kommen ("gene silencing").A plant's natural defense mechanisms against pathogens are often inadequate. The introduction of foreign genes from plants, animals or microbial sources can strengthen the immune system. Examples are protection against insect damage in tobacco by expression of the Bacillus thuringiensis endotoxin (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) or protection of the tobacco against fungal attack by expression of a chitinase from the bean (Broglie et al. (1991 Science 254: 1194-1197). Previous approaches have been based on constitutive overexpression of these genes. Desirably, however, these antibodies should only be expressed when the need arises as a result of a pathogen attack. A constitutive overexpression - even when there is no need - can have an adverse effect on the growth, yield and other properties of the plant. In addition, constitutive expression can increasingly switch off the transgene ("gene silencing").
Eine transgene Expression bestimmter Polypeptide kann zu einer erhöhten Resistenz gegen Befall durch Bakterien und Pilze führen. Bevorzugt ist die Expression von sogenannten "Peptidantibiotika" , "Pathogenesis related" (PR) Proteinen, Toxinresistenz , sowie von Proteinen, die die Wirt-Pathogen Interaktion betreffen. Bevorzugte Peptid-Antibiotika zählen zur Klasse der Cecropine oder Magainine und inhibieren das Wachstum verschiedener Bakterien- und Pilzarten. Die Expression von PR-Genen kann ebenfalls eine Resistenz gegen Schädlinge verleihen. Diese Gene werden natürlicherweise in- folge eines Schädlingsbefalls induziert und si d in verschiedene Klassen unterteilt (Bol et al . (1990) Annu Rev Phytopath 28:113-138). Zu den PR-Proteinen zählen ß-1, 3-Glucanasen, Chitinasen, Osmotin und weitere Proteine. Andere Proteine zeigen eine fungizide Wirkung wie beispielsweise UDA (stinging nettle lectin) und Hevein (Broakaert et al . (1989) Science 245:1100- 1102; Barkai-Golan et al . (1978) Arch Microbiol 116:119-124). Verschiedene pflanzliche Erkrankungen werden durch Phytotoxine verursacht. Enzyme, die derartige Toxine abbauen, können vorteilhaft zur Bekämpfung derartiger Erkrankungen eingesetzt werden. Auch die Veränderung struktureller Eigenschaften der Pflanze - wie beispielsweise Wachsgehalt oder Stärke der Cuticula - können vorteilhaft bei der Abwehr von Pathogenen sein, indem sie das Eindringen derselben in das pflanzliche Gewebe verhindern. Eine Resistenz gegen z.B. Pilze, Insekten, Nematoden und Krankheiten kann durch gezielte Absonderung oder Anreicherung bestimmter Meta- boliten oder Proteine erreicht werden. Beispielhaft seien genannt Glucosinolate (Nematodenabwehr) , Lysozyme aus nichtpflanzlichen Quellen wie zum Beispiel T4 Lysozym oder Lysözm aus verschiedenenen Säugern, Arcelin, α-Amylaseinhibitor,Transgenic expression of certain polypeptides can lead to increased resistance to bacterial and fungal attack. Preferred is the expression of so-called "peptide antibiotics", "pathogenesis related" (PR) proteins, toxin resistance, and of proteins which relate to the host-pathogen interaction. Preferred peptide antibiotics count to the class of Cecropine or Magainine and inhibit the growth of different types of bacteria and fungi. The expression of PR genes can also confer resistance to pests. These genes are naturally induced as a result of pest infestation and are divided into different classes (Bol et al. (1990) Annu Rev Phytopath 28: 113-138). The PR proteins include ß-1, 3-glucanases, chitinases, osmotin and other proteins. Other proteins show a fungicidal activity such as UDA (stinging nettle lectin) and Hevein (Broakaert et al. (1989) Science 245: 1100-1102; Barkai-Golan et al. (1978) Arch Microbiol 116: 119-124). Various herbal diseases are caused by phytotoxins. Enzymes that break down such toxins can advantageously be used to combat such diseases. Changes in the structural properties of the plant - such as the wax content or strength of the cuticle - can also be advantageous in the defense against pathogens by preventing them from penetrating into the plant tissue. Resistance to, for example, fungi, insects, nematodes and diseases can be achieved through the targeted secretion or enrichment of certain metabolites or proteins. Examples include glucosinolates (defense against nematodes), lysozymes from non-plant sources such as, for example, T4 lysozyme or lysozyme from various mammals, arcelin, α-amylase inhibitor,
RNAsen oder Ribozyme sowie weitere unten aufgeführte Nukleinsäuresequenzen oder Proteine.RNAsen or ribozymes as well as further nucleic acid sequences or proteins listed below.
Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Proteinen bekannt, deren rekombinante Expression zur Abwehr von Pathogenen vorteilhaft sind (u.a. Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec Nθ:487-96) .A large number of proteins are known to the person skilled in the art, the recombinant expression of which are advantageous for the defense against pathogens (including Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec Nθ: 487-96).
1.1. Nukleinsäuresequenzen die eine Resistenz oder Toleranz gegen Insekten vermitteln:1.1. Nucleic acid sequences that confer resistance or tolerance to insects:
Beispielhaft seien zu nennen:Examples include:
Bacillus thuringiensis Kristalltoxin-Gene (Bt-Gene; Watrud et al . (1985) In: Engineered Organisms and the Environment) . Bt-Gene verleihen eine Resistenz gegenBacillus thuringiensis crystal toxin genes (Bt genes; Watrud et al. (1985) In: Engineered Organisms and the Environment). Bt genes confer resistance to
Lepidopteran oder Coleopteran Parasiten, wie beispielsweise den Maiszünsler (European Corn Borer (ECB) ) . Verschiedenen BT-Gene kodierend für vollständige oder verkürzte ( "truncated" ) BT-Proteine sind beschrieben. Ferner sind BT-Gene beschrieben, bei denen die kodierendeLepidopteran or Coleopteran parasites, such as the European corn borer (European Corn Borer (ECB)). Different BT genes coding for complete or truncated BT proteins are described. Furthermore, BT genes are described in which the coding
Sequenz hinsichtlich einer optimierten Expression in Nutzpflanzen angepasst wurde. Verfahren zu Herstellung derartigen künstlicher Gene sind dem Fachmann bekannt (US 5,500,365; US 5,689,052). Beispiele für derartig modifizierte Bt Toxigene schließen das synthetische Bt CryΙA(b) Gen (Perlak et al . (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88:3324-3328) und das synthetische CryΙA(c) GenSequence was adjusted with regard to an optimized expression in useful plants. Manufacturing process Such artificial genes are known to the person skilled in the art (US 5,500,365; US 5,689,052). Examples of such modified Bt toxigens include the synthetic Bt CryΙA (b) gene (Perlak et al. (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88: 3324-3328) and the synthetic CryΙA (c) gene
(WO 95/06128) ein. Zahlreiche dem Fachmann geläufige Beispiele für bevorzugte Bt-Gene sind beispielsweise unter der Internet-Adresse http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/ Neil_Crickmore/Bt/Index. html beschrieben.(WO 95/06128). Numerous examples of preferred Bt genes familiar to the person skilled in the art are, for example, at the Internet address http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/ Neil_Crickmore / Bt / Index. html described.
Proteaseinhibitoren können ebenfalls eine Resistenz gegen Insektenbefall gewähren (Johnson et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:9871-9875). Besonders bevorzugt ist das Proteaseinhibitor-II Gen (pinll) aus Tomate oder Kar- toffel . Ganz besonders bevorzugt ist eine kombinierteProtease inhibitors can also confer resistance to insect attack (Johnson et al. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86: 9871-9875). The protease inhibitor II gene (pinII) from tomato or potato is particularly preferred. A combined one is very particularly preferred
Koexpression eines pinll-Gens mit einem Bt-Gen. Bevorzugt ist ferner der "cowpea trypsin inhibitor" (CpTI; Hilder VA et al. (1989) Plant Mol Biol 13 (6) : 701-10) .Coexpression of a pinll gene with a Bt gene. Also preferred is the "cowpea trypsin inhibitor" (CpTI; Hilder VA et al. (1989) Plant Mol Biol 13 (6): 701-10).
Bevorzugt sind ferner Gene, die für Enzyme oder Kofakto- ren kodieren, die eine Inhibition des VerdauungsSystem von Insekten bewirken. Beispielhaft seinen Oryzacystatin und Amylaseinhibitoren (z.B. aus Weizen oder Gerste) genannt .Also preferred are genes which code for enzymes or cofactors which inhibit the digestive system of insects. Examples include its oryzacystatin and amylase inhibitors (e.g. from wheat or barley).
Lectine (Phytohemagglutinine) sind multivalente Kohlenhydrat-bindende Proteine mit der Fähigkeit rote Blutzellen verschiedener Spezies zu agglutinieren. Lectine haben Insektizide Wirkung gegen eine Reihe von Schäd- lingen (Murdock et al.(1990) Phytochemistry 29:85-89;Lectins (phytohemagglutinins) are multivalent carbohydrate-binding proteins with the ability to agglutinate red blood cells of different species. Lectins have insecticidal activity against a number of pests (Murdock et al. (1990) Phytochemistry 29: 85-89;
Czapla and Lang (1990) J Econ Entomol 83:2480-2485). Vorteilhaft einzusetzende Lectingene schließen Phyto- hemagglutinin, Schneeglöckchenlectin, Gersten- und Weizenkeimagglutinin (WGA) , sowie Reisagglutinine ein (Gatehouse et al . (1984) J Sei Food Agric 35:373-380), wobei WGA besonders bevorzugt ist .Czapla and Lang (1990) J Econ Entomol 83: 2480-2485). Lectingenes that can be used advantageously include phytohemagglutinin, snowdrop lectin, barley and wheat germ agglutinin (WGA), and rice agglutinins (Gatehouse et al. (1984) J Sei Food Agric 35: 373-380), with WGA being particularly preferred.
Gene die die Produktion kleiner oder größerer Polypeptide mit insektizider Wirkung (z.B. lytische Peptide, Peptid- hormone, Toxine oder Gifte) steuern sind ebenfalls umfasst. Beispiele sind die Juvenilhormon-Esterase (Hammock et al. (1990) Nature 344:458-461) oder Verbindungen, die die Verpuppung von Insekten durch Inhibition der Expression oder der Aktivität der Ecdysteroid-UDP-glucosyl- transferase beeinträchtigen. Vorteilhaft verwendbar sind auch Gene die für Avermectin kodieren (Avermectin und Abamectin; Campbell WC (ed.), In: Avermectin and Aba ectin, 1989. Ikeda et al . (1987) J Bacteriol 169:5615-5621), sowie Gene kodierend für Ribosomen- inaktivierende Proteine (RIPs) .Genes that control the production of small or larger polypeptides with insecticidal activity (eg lytic peptides, peptide hormones, toxins or poisons) are also included. Examples are juvenile hormone esterase (Hammock et al. (1990) Nature 344: 458-461) or compounds which impair the pupation of insects by inhibiting the expression or the activity of the ecdysteroid UDP-glucosyl transferase. Genes coding for avermectin (avermectin and abamectin; Campbell WC (ed.), In: Avermectin and Aba ectin, 1989. Ikeda et al. (1987) J Bacteriol 169: 5615-5621), and genes coding for ribosome inactivating proteins (RIPs).
Enzyme, die die Integrität der Insektenhülle beeinträchtigen, sind ebenfalls bevorzugt. Beispielhaft umfasst sind Gene, die für Chitinasen (wie z.B. die chit42 Endo- chitinase aus Trichoderma harzianum; GenBank Acc.-No.: S78423) oder Glucanasen, Proteasen oder Lipasen kodieren, als auch Gene, die für die Produktion von NikkomycinEnzymes that affect the integrity of the insect cover are also preferred. Examples include genes which code for chitinases (such as, for example, the chit42 endochitinase from Trichoderma harzianum; GenBank Acc.-No .: S78423) or glucanases, proteases or lipases, and also genes which code for the production of nikkomycin
(Inhibitor der Chitinsynthese) verantwortlich sind.(Inhibitor of chitin synthesis) are responsible.
Weiterhin sind Gene bevorzugt, die die Qualität der Pflanze als Insektennahrung reduzieren. Eine insektizide Wirkung kann durch Veränderung der Sterolzusammensetzung erzielt werden. Auch Lipoxygenase sind natürliche, pflanzliche Enzyme, denen die Eigenschaft zugeordnet werden kann, die Eignung einer Pflanze als Insektennahrung zu vermindern.Furthermore, genes are preferred which reduce the quality of the plant as insect food. An insecticidal effect can be achieved by changing the sterol composition. Lipoxygenase are also natural, plant-based enzymes, which can be assigned the property of reducing the suitability of a plant as an insect food.
Erreichen einer Insektenabwehr oder -anlockung zum Beispiel durch erhöhte Freisetzung flüchtiger Duft- oder Botenstoffe durch zum Beispiel Enzyme der Terpenbio- synthese. Bevorzugt ist die Expression von Enzyme mit einer Funktion in der Biosynthese von Alkaloiden wieAchieving insect defense or attraction, for example by increasing the release of volatile fragrance or messenger substances by, for example, enzymes from terpene biosynthesis. Expression of enzymes with a function in the biosynthesis of alkaloids such as is preferred
Benzophenanthridinalkaloiden und Indolealkaloiden sowie von Enzyme der Terpenbiosynthese wie Monoterpene und Sesquiterpene .Benzophenanthridine alkaloids and indole alkaloids as well as of terpene biosynthesis enzymes such as monoterpenes and sesquiterpenes.
Modifikation der Wachsesterbildung oder der Zusammensetzung der eingelagerten Oligosaccharide zur Verbesserung des Schutzes gegen Umwelteinflüsse oder zur Verbesserung der Verdaubarkeit beim Einsatz in Futteroder Nahrungsmitteln. Beispielhaft sein die Über- expression der Endoxyloglucantransferase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Endoxyloglucantransferase (EXGT-Al) aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.No: AF163819) kodieren.Modification of the wax ester formation or the composition of the stored oligosaccharides to improve protection against environmental influences or to improve digestibility when used in feed or food. The overexpression of endoxyloglucan transferase may be mentioned as an example. Preferred are nucleic acids which code for the endoxyloglucan transferase (EXGT-Al) from Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.No: AF163819).
Abwehr von Pathogenen durch Expression von Phenylammonia- lyasen und anderen Enzyme des Phenylpropanoidweges , die für die Biosynthese einer Vielzahl von Verbindungen basierend auf dem Phenylpropan-Grundgerüst verantwortlich sind wie z.B. Lignin, Phytoalexine , Pterocarpone, Furano- coumarine. Ebenso bevorzugt ist die Expression vonDefense against pathogens by expression of phenylammonylases and other enzymes of the phenylpropanoid pathway, which are responsible for the biosynthesis of a large number of compounds based on the phenylpropane backbone, e.g. Lignin, phytoalexins, pterocarpones, furano-coumarins. Expression of is also preferred
Isoflavon-2-hydroxylasen sowie von Enzymen mit einer Funktion in der Ligninpolymerisation wie anionische Pe- roxidasen. Ferner bevorzugt ist die Expression von Zellwandproteinen wie Glycinhydroxyprolinreiche-Proteine (z.B. Exlensine) .Isoflavone-2-hydroxylases and of enzymes with a function in lignin polymerization such as anionic pe- roxidasen. The expression of cell wall proteins such as glycine hydroxyproline-rich proteins (for example exlensins) is also preferred.
1.2. Nukleinsäuresequenzen, die eine Resistenz oder Toleranz gegen gegen Viren vermitteln:1.2. Nucleic acid sequences that confer resistance or tolerance to viruses:
Die transgene Expression bestimmter Gene kann eine Resistenz gegen Virusbefall gewähren. So kann beispielsweise der Virus- befall durch Expression viraler Hüllproteine verhindert werden (Cuozzo et al.(1988) Bio/Technology, 6:549-553; Hemenway et al. (1988) EMBO J 7:1273-1280; Abel et al . (1986) Science 232:738-743) . Auch die Expression von antisense Nukleinsäuresequenzen bestimmter viraler Gene (z.B. Gene des viralen Replikationsapparates) ist geeignet. Neben reinen antisense Ansätzen könne auch Ribozyme vorteilhaft eingesetzt werden. Weitere Ansätze umfassen die Verwendung von Satelliten-Viren.The transgenic expression of certain genes can provide resistance to virus attack. For example, virus infection can be prevented by expression of viral coat proteins (Cuozzo et al. (1988) Bio / Technology, 6: 549-553; Hemenway et al. (1988) EMBO J 7: 1273-1280; Abel et al. (1986) Science 232: 738-743). The expression of antisense nucleic acid sequences of certain viral genes (e.g. genes of the viral replication apparatus) is also suitable. In addition to pure antisense approaches, ribozymes can also be used advantageously. Other approaches include the use of satellite viruses.
2. Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren bzw. Steigerung der Qualität und/oder Quantität des Ernteertrages.2. Resistance to abiotic stress factors or increasing the quality and / or quantity of the crop yield.
Eine Steigerung der Qualität und/oder Quantität des Ernteertrages (z.B. erhöhte Menge an Früchten oder Samen), Beeinflussung der wachstumsgeschwindigkeit zu schnellerem oder langsameren Wuchs, Ermöglichung des Wachstums außerhalb der üblichen Wachstumszeit, Resistenz gegen widrige Witterungsbedingungen (Hitze, Trockenheit, Nässe, Kälte, Frost) sind beispielhaft als vorteilhafte Eigenschaften zu nennen. Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren, Proteine etc. bekannt, mit deren Hilfe diese Eigenschaften erzielen kann. Beispielhaft seien zu nennen:An increase in the quality and / or quantity of the crop yield (e.g. increased amount of fruit or seeds), influencing the rate of growth to faster or slower growth, enabling growth outside the usual growth period, resistance to adverse weather conditions (heat, dryness, wet, cold, Frost) are examples of advantageous properties. Numerous methods, proteins etc. are known to the person skilled in the art, with the aid of which these properties can be achieved. Examples include:
Verbesserter Schutz des pflanzlichen Embryos gegen abiotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Bei- spiel durch Überexpression von dem "antifreeze polypeptides aus Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512) , Myoxocephalus octo- decemspinosus , dem Arabidopsis thaliana Transkriptionsaktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240), einem späten Embryogenesegen (LEA) zum Beispiel aus Gerste (WO 97/13843), Calcium-abhängigen ProteinkinasegenenImproved protection of the plant embryo against abiotic stress factors such as drought, heat or cold, for example by overexpression of the "antifreeze polypeptides from Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalus octodecemspinosus, the Arabidopsis thaliana transcription activator CBF1, glasenamate (WOF1), glutamate 97/12983, WO 98/11240), a late embryogenesis gene (LEA), for example from barley (WO 97/13843), calcium-dependent protein kinase genes
(WO 98/26045), Calcineurinen (WO 99/05902), Farnesyltrans- ferasen (WO 99/06580), Pei ZM et al . , Science 1998, 282: 287-290), Ferritin (Deak M et al . , Nature Biotechnology 1999, 17:192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Bio- technology and Genetic Engeneering Reviews 1998, 15:1-32), DREBIA-Faktor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999, 17:276-286), Genen der Mannitol- oder Trehalosesynthese wie der Trehalosephosphat- synthase oder der Trehalosephosphatphosphatase (WO 97/42326) , oder durch Inhibition von Genen wie der Trehalase (WO 97/50561) . Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den transkriptioneilen Aktivator CBF1 aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U77378) oder das "antifreeze protein" aus Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No.: AF306348) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.(WO 98/26045), calcineurins (WO 99/05902), farnesyl transferases (WO 99/06580), Pei ZM et al. , Science 1998, 282: 287-290), ferritin (Deak M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 192-196), oxalate oxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Bio-technology and Genetic Engeneering Reviews 1998, 15: 1-32), DREBIA factor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 276-286), genes of Mannitol or trehalose synthesis such as trehalose phosphate synthase or trehalose phosphate phosphatase (WO 97/42326), or by inhibiting genes such as trehalase (WO 97/50561). Nucleic acids which code for the transcriptional activator CBF1 from Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No .: U77378) or the "antifreeze protein" from Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No .: AF306348) or functional equivalents thereof are particularly preferred.
3. Induktion einer Resistenz gegen Herbizide, Antibiotika oder andere Biozide.3. Induction of resistance to herbicides, antibiotics or other biocides.
Verschiedene Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, die derar- tige Resistenz verleihen sind oben beschrieben. Die Kombination dieser Sequenzen mit einem der erfindungsgemäßen Promotoren ist besonders vorteilhaft, da so die Resistenz lediglich im Bedarfsfall (nach Induktion mit einem chemischen Induktor) und nicht konstitutiv erzeugt werden kann. Die kon- stitutive Expression hat neben den nachteiligen Auswirkungen auf den Energiehaushalt der Pflanze weitere potentiell negative Konsequenzen bei der Zulassung unter Verbraucherakzep- tanz . Eine Expression der Resistenz ist unter praktischen Gesichtspunkten - im Labor - nur bei der Herstellung einer transgenen Pflanze (Verwendung der Resistenz als Selektionsmarker) oder - in der Landwirtschaft - nur während des Einsatzes von Herbiziden erforderlich. Vor allem im letzteren Fall wäre die Kombination von Herbizid und chemischen Induktor in einer Formulierung als vorteilhafte Anwendung zu sehen.Various examples of nucleic acid sequences that confer such resistance are described above. The combination of these sequences with one of the promoters according to the invention is particularly advantageous, since the resistance can only be generated in a constitutive manner if necessary (after induction with a chemical inductor). In addition to the adverse effects on the energy balance of the plant, the constitutive expression has further potentially negative consequences when it is approved under consumer acceptance. Expression of resistance is required from a practical point of view - in the laboratory - only when producing a transgenic plant (using the resistance as a selection marker) or - in agriculture - only when herbicides are used. Especially in the latter case, the combination of herbicide and chemical inducer in one formulation would be seen as an advantageous application.
4. Induktion der Expression von Reporter- oder Markergenen4. Induction of expression of reporter or marker genes
Verschiedene Nukleinsäuresequenzen, die als Reporter oder Markergen fungieren können, sind oben beschrieben. Die Kombination dieser Sequenzen mit den erfindungsgemäßen Promotoren ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform, ermöglicht sie doch - beispielsweise im Rahmen der Durchmusterung von chemischen Substanzbibliotheken - die Identifizierung weiterer chemischen Induktoren. Aufgrund des Expressionsver- haltens der BCI-3 und BCI-4 Gene kann vermutet werden, dass chemische Induktoren dieser Gene zugleich auch eine SAR induzieren. Solche chemischen Verbindungen sind außerordentlich interessante Verbindungen zum Einsatz in der Landwirtschaft. Ähnlich dem BION© haben sie das Potential, nach Applikation auf die Pflanze eine Resistenz gegen Pathogene zu induzieren. Ein Gegenstand der Erfindung umfasst daher Verfahren zur Identifizierung von Pathogenresistenz-induzierenden Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dassVarious nucleic acid sequences that can act as reporters or marker genes are described above. The combination of these sequences with the promoters according to the invention is a particularly preferred embodiment, since it enables the identification of further chemical inducers, for example as part of the screening of chemical substance libraries. Due to the expression behavior of the BCI-3 and BCI-4 genes, it can be assumed that chemical inducers of these genes also induce SAR. Such chemical compounds are extremely interesting compounds for use in agriculture. Similar to the BION © , they have the potential to induce resistance to pathogens after application to the plant. An object of the invention therefore includes methods for the identification of pathogen resistance-inducing compounds, characterized in that
a) eine Expressionskassette bestehend aus einem Reportergen in funktioneller Verknüpfung mit einem chemisch induzierbaren Promotor ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen bestehend ausa) an expression cassette consisting of a reporter gene in functional linkage with a chemically inducible promoter selected from the group of sequences consisting of
i) dem BCI-3 Promotor gemäß SEQ ID No : 1 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktionell äquivalenten Teil desselben, undi) the BCI-3 promoter according to SEQ ID No: 1 or a functional equivalent or part thereof, and
ii) dem BCI-4 Promotor gemäß SEQ ID No : 2 oder einem funk- tionellen Äquivalent oder funktionell äquivalentenii) the BCI-4 promoter according to SEQ ID No: 2 or a functional equivalent or functionally equivalent
Teil desselbenPart of the same
in einen Organismus oder in ein Gewebe, Organ, Teil, eine Zellkultur oder Zelle desselben eingebracht wird, undis introduced into an organism or into a tissue, organ, part, cell culture or cell thereof, and
b) der Organismus oder das Gewebe, Organ, Teil, Zellkultur oder Zelle desselben mit einer chemischen Verbindung ausgewählt aus einer Bibliothek chemischer Verbindungen behandelt wird, undb) the organism or the tissue, organ, part, cell culture or cell thereof is treated with a chemical compound selected from a library of chemical compounds, and
c) die Induktion der Expression des Reportergens gemessen wird.c) the induction of the expression of the reporter gene is measured.
Besonders vorteilhaft ist bei der Verwendung der erfindungs- gemäßen Promotoren mit den oben beschriebenen Nukleinsäuren und Verfahren, die Möglichkeit die gewünschten Eigenschaften zu einer bestimmten Zeit in einem bestimmten Ausmaß und in einem bestimmten Organ der Pflanze zu erzielen. Die Effizienz einer Pathogenresistenz (gg. Krankheiten oder Insekten) kann durch zeitliche Steuerung der Expression gesteigert werden (Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; Ward et al . (1991) Plant Cell 3:1085-1094; Gould (1988) Bioscience 38:26-33). Besonders die chemisch-induzierbare Regulation von Entwicklungsprozessen wie Homeosis, Keimen, Seitentriebbildung ( "tillering" ) , Aus- sprießen ( "sprouting") , Blühen, Anthesis, Fruchtreifung oder Welken bietet zahlreiche vorteilhafte Anwendungsformen.When using the promoters according to the invention with the nucleic acids and methods described above, it is particularly advantageous to be able to achieve the desired properties at a certain time to a certain extent and in a particular organ of the plant. The efficiency of pathogen resistance (against diseases or insects) can be increased by timing the expression (Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; Ward et al. (1991) Plant Cell 3: 1085-1094; Gould (1988) Bioscience 38: 26-33). In particular, the chemically-inducible regulation of development processes such as homeosis, germination, side shoot formation ("tillering"), sprouting ("sprouting"), flowering, anthesis, fruit ripening or wilting offers numerous advantageous forms of application.
Dem Fachmann ist bekannt, dass viele vorteilhafte Effekte nicht nur durch Expression von Fremd-Proteinen, sondern auch durch Reprimierung endogener Proteine erzielt werden können. Die Verfahren zur Reprimierung der Expression endogener Gene sind dem Fachmann geläufig. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien zu- nennen:It is known to the person skilled in the art that many advantageous effects can be achieved not only by expression of foreign proteins, but also by the repression of endogenous proteins. The methods for repressing the expression of endogenous genes are this Expert familiar. Examples include, but are not limited to:
I. Expression von antisense-Nukleinsäuresequenzen 5. Eine "antisense" Nukleinsäure meint zunächst eine Nukleinsäuresequenz die ganz oder teilweise zu zumindest einem Teil des "sense"-Stranges ein zu reprimierenden Zielproteins komplementär ist. Dem Fachmann ist bekannt, dass er alternative cDNA oder das korrespondierendes Gen als Ausgangsmatrize für 0 entsprechende antisense-Konstrukte verwenden kann. Bevorzugt ist die "antisense" Nukleinsäure komplementär zu dem kodierenden Bereich des Zielproteins oder einem Teil desselben. Das "antisense" Nukleinsäure kann aber auch zu der nicht-ko- dierenden Region oder einem Teil derselben komplementär sein. 5 Ausgehend von der Sequenzinformation zu einem Zielprotein, kann eine antisense Nukleinsäure unter Berücksichtigung der Basenpaarregeln von Watson und Crick in der dem Fachmann geläufigen Weise entworfen werden. Die antisense Nukleinsäure umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform α-anomere 0 Nukleinsäuremoleküle . α-Anomere Nukleinsäuremoleküle bilden besondere doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in denen im Unterschied zu den normalen ß-Einheiten die Stränge parallel zu einander verlaufen (Gaultier et al . (1987) Nucleic Acids Res 15:6625-6641). 5I. Expression of Antisense Nucleic Acid Sequences 5. An "antisense" nucleic acid initially means a nucleic acid sequence which is completely or partially complementary to at least part of the "sense" strand of a target protein to be repressed. It is known to the person skilled in the art that he can use alternative cDNA or the corresponding gene as a starting template for corresponding antisense constructs. The “antisense” nucleic acid is preferably complementary to the coding region of the target protein or a part thereof. However, the “antisense” nucleic acid can also be complementary to the non-coding region or a part thereof. 5 Starting from the sequence information for a target protein, an antisense nucleic acid can be designed in the manner familiar to the person skilled in the art, taking into account the base pair rules of Watson and Crick. In a preferred embodiment, the antisense nucleic acid comprises α-anomeric 0 nucleic acid molecules. α-Anomeric nucleic acid molecules form special double-stranded hybrids with complementary RNA in which, in contrast to the normal β units, the strands run parallel to one another (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6625-6641). 5
Vorteilhaft kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym- Verfahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Sequenzen, die gekoppelt an die antisense Sequenzen, die Zielsequenzen katalytisch spalten (Tanner NK (1999) FEMS 0 Microbiol Rev 23 (3):257-75). Dies kann die Effizienz einer anti-sense Strategie erhöhen. Die Expression von Ribozymen zur Verminderung bestimmter Proteine ist dem Fachmann bekannt (EP 291 533, EP 321 201, EP 360 257). Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei Steinecke (Ribo- 5 zymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al . eds, Academic Press, Inc. (1995), 449-460) beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol 18 (2 ): 353-361; Lloyd AM and Davis RW 0 et al. (1994) Mol Gen Genet 242 ( 6) : 653-657) . Beispielhaft sind "hammerhead"-Ribozyme zu nennen (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591) . Bevorzugte Ribozyme basieren auf Derivaten der Tetrahymena L-19 IVS RNA (US 4,987,071; US 5,116,742). Weitere Ribozyme mit Selektivität für eine 5 L119 mRNA können selektioniert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261:1411-1418). II . Kosuppression:The antisense strategy can advantageously be coupled with a ribozyme method. Ribozymes are catalytically active RNA sequences which, coupled to the antisense sequences, catalytically cleave the target sequences (Tanner NK (1999) FEMS 0 Microbiol Rev 23 (3): 257-75). This can increase the efficiency of an anti-sense strategy. The expression of ribozymes to reduce certain proteins is known to the person skilled in the art (EP 291 533, EP 321 201, EP 360 257). Suitable target sequences and ribozymes can, for example, as described by Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. Eds, Academic Press, Inc. (1995), 449-460), by secondary structure calculations of ribozyme and target RNA and their interaction can be determined (Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol 18 (2): 353-361; Lloyd AM and Davis RW 0 et al. (1994) Mol Gen Genet 242 (6): 653 -657). Examples include "hammerhead" ribozymes (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591). Preferred ribozymes are based on derivatives of the Tetrahymena L-19 IVS RNA (US 4,987,071; US 5,116,742). Additional ribozymes with selectivity for a 5 L119 mRNA can be selected (Bartel D and Szostak JW (1993) Science 261: 1411-1418). II. cosuppression:
Durch Expression einer sense-RNA die homolog zu der eines endogenen Transkriptes ist, kann ebenfalls die Expression des entsprechenden endogenen Proteins vermindert werden (Kosuppression) . In Tabak, Tomate und Petunie ist demonstriert worden, dass die Expression von sense-RNA zu einem endogenen Gen, die Expression desselben vermindern oder ausschalten kann, ähnlich wie es für antisense Ansätze beschrieben wurde (Goring et al . (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88:1770-1774; Smith et al . (1990) Mol ■ Gen Genet 224:447-481; Napoli et al . (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Krol et al . (1990) Plant Cell 2:291-99). Dabei kann eingeführte Konstrukt das zu vermindernde Gen ganz oder nur teilweise repräsentieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht erforderlich. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (EP 465 572; EP 647 715; US 5,283,184; US 5,231,020).By expression of a sense RNA that is homologous to that of an endogenous transcript, the expression of the corresponding endogenous protein can also be reduced (co-suppression). It has been demonstrated in tobacco, tomato and petunia that the expression of sense RNA to an endogenous gene can reduce or switch off its expression, similar to that described for antisense approaches (Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88: 1770-1774; Smith et al. (1990) Mol ■ Gen Genet 224: 447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2: 291-99). The introduced construct can represent the gene to be reduced in whole or in part. The possibility of translation is not necessary. Corresponding methods are described (EP 465 572; EP 647 715; US 5,283,184; US 5,231,020).
III. "double-stranded RNA Interference" (dsRNAi)III. "double-stranded RNA interference" (dsRNAi)
Ganz besonders bevorzugt ist das Verfahren der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("double-stranded RNA intererence" ) . Entsprechende Verf hren sind dem Fachmann bekannt und im Detail beschrieben (z.B. Matzke MA et al . (2000) Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Auf die in den ange- • gebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird ausdrücklich Bezug genommen. Hier wird durch gleichzeitige Einbringung von Strang- und Gegenstrang eine hocheffiziente Unterdrückung nativer Gene bewirkt .The method of gene regulation using double-stranded RNA ("double-stranded RNA intererence") is very particularly preferred. Corresponding processes are known to the person skilled in the art and are described in detail (for example Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Reference is expressly made to the procedures and methods described in the • quoted citations. Here, the simultaneous introduction of strand and counter strand results in highly efficient suppression of native genes.
Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass er die Genexpression auch unter Verwendung künstlicher Transkriptionsfaktoren beispielsweise vom Typ der Zinkfingerproteine regulieren kann (Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97 (4) : 1495-1500) . Diese Fak- toren lagern sich in den regulatorischen Bereichen der zu exprimierenden oder zu reprimierenden endogenen Gene an und bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder Repression des endogenen Gens .The skilled worker is also aware that he can also regulate gene expression using artificial transcription factors, for example of the zinc finger protein type (Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97 (4): 1495-1500). These factors accumulate in the regulatory areas of the endogenous genes to be expressed or repressed and, depending on the design of the factor, bring about expression or repression of the endogenous gene.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemässen Expressionskassette oder einem erfindungsgemässen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw.- oder Vermehrungs- gut abgeleitet von solchen Organismen. Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden pro- karyotische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.Another object of the invention relates to transgenic organisms, transformed with at least one expression cassette according to the invention or a vector according to the invention, as well as cells, cell cultures, tissues, parts - such as leaves, roots etc. in plant organisms - or well propagated from such organisms. Organism, starting or host organisms are understood to mean prokaryotic or eukaryotic organisms, such as, for example, microorganisms or plant organisms. Preferred microorganisms are bacteria, yeast, algae or fungi.
Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyano- bakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis . Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemässen Konstrukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agrobacterium turnefaciens .Preferred bacteria are bacteria of the genus Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes or cyano-bacteria, for example of the genus Synechocystis. Especially preferred are microorganisms which are capable of infecting plants and thus of transmitting the constructs according to the invention. Preferred microorganisms are those from the genus Agrobacterium and in particular from the type Agrobacterium turnefaciens.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharo yces , Hansenula oder Pichia.Preferred yeasts are Candida, Saccharo yces, Hansenula or Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr. Seetion B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze.Preferred mushrooms are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria or others in Indian Chem Engr. Seetion B. Vol 37, No 1,2 (1995) on page 15, table 6 described mushrooms.
Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem Pflanzen. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zelloder Kalluskulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.Plants are particularly preferred host or starting organisms as transgenic organisms. Included in the scope of the invention are all genera and species of higher and lower plants in the plant kingdom. Also included are the mature plants, seeds, sprouts and seedlings, as well as parts, propagation material and cultures derived from them, for example cell or callus cultures. Mature plants mean plants at any stage of development beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development.
Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzugte Wirtsorganismen für die Herstellung transgener Pflanzen. Die erfindungsgemässen transgenen Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten der Gattung Gramineae (wie Reis, Mais, Weizen) , insbesondere Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungsgemässen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter dikotylen Kulturpflanzen, wie zum BeispielAnnual, perennial, monocotyledonous and dicotyledonous plants are preferred host organisms for the production of transgenic plants. The transgenic plants according to the invention are selected in particular from monocotyledonous crop plants, such as, for example, cereals of the genus Gramineae (such as rice, corn, wheat), in particular wheat, barley, millet, rye, triticale, corn, rice or oats and sugar cane. Furthermore, the transgenic plants according to the invention are selected in particular from dicotyledonous crop plants, such as, for example
Brassicacae (Cruciferae) wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Rübe,Brassicacae (Cruciferae) such as rapeseed, cress, Arabidopsis, turnip,
Blumenkohl, Broccoli, Kohlarten oder Canola,Cauliflower, broccoli, cabbage or canola,
Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Luzerne, Bohnen- gewachsen oder ErdnussLeguminosae such as soy, alfalfa, pea, alfalfa, bean or peanut
Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oderSolanaceae such as potato, tobacco, tomato, or eggplant
Paprika, U belliferae wie Karotte oder Sellerie .Paprika, U belliferae like carrot or celery.
Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula, Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini, Rubiaceae wie Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch)Asteraceae such as sunflower, tagetes, lettuce or calendula, Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini, Rubiaceae such as Coffea arabica or Coffea liberica (coffee bush)
Theaceae wie Camillia sinensis oder Thea sinensisTheaceae such as Camillia sinensis or Thea sinensis
(Teestrauch)(Sinensis)
Sterculiaceae wie Theobroma cacao (Kakaostrauch)Sterculiaceae like Theobroma cacao (cocoa bush)
sowie Salat, Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinarten.as well as lettuce, flax, cotton, hemp, flax, red pepper, carrot, carrot, sugar beet and the various types of trees, nuts and wines.
Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis sowie alle Gattungen und Arten, die als Nahrungs- oder Futtermittel zum Einsatz kommen, wie die beschriebenen Getreidearten, oder sich zur Herstellung von Ölen eignen, wie Ölsaaten (wie zum Beispiel Raps) , Nussarten, Soja, Sonnenblume, Kürbis und Erdnuss.Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis and all genera and species that are used as food or feed, such as the cereals described, or are suitable for the production of oils, such as oilseeds (such as oilseed rape), are particularly preferred ), Types of nuts, soy, sunflower, pumpkin and peanut.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen oder Cyanobakterien, sowie Moose.Plant organisms in the sense of the invention are further photosynthetically active capable organisms, such as algae or cyanobacteria, and mosses.
Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus , Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella.Preferred algae are green algae, such as algae of the genus Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox or Dunaliella.
Die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer transformierten Zelle erfordert, dass die entsprechende DNA (z.B. eine der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren) in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (siehe auch Keown et al . (1990) Methods in Enzymology 185:527-537). So kann die DNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA- enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Solche und weitere Verfahren sind beschrieben u.a. bei Bilang et al . (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al . (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al . (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al . (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al . (1987) Nature 327:70-73; Howell et al . (1980) Science 208:1265; Horsch et al . (1985) Science 227:1229-1231; DeBlock et al . (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds . ) Academic Press Inc. .(1988); und Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989).The production of a transformed organism or a transformed cell requires that the corresponding DNA (for example one of the expression cassettes or vectors according to the invention) is introduced into the corresponding host cell. A large number of methods are available for this process, which is referred to as transformation (see also Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 527-537). For example, the DNA can be introduced directly by microinjection or by bombardment with DNA-coated microparticles. The cell can also be chemically permeabilized, for example with polyethylene glycol, so that the DNA can get into the cell by diffusion. The DNA can also be obtained by protoplast fusion with other DNA-containing units such as minicells, cells, lysosomes or liposomes. Electroporation is another suitable method for introducing DNA in which the cells are reversibly permeabilized by an electrical pulse. Such and other methods are described, inter alia, by Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228: 104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208: 1265; Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989).
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Trans- formation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentrans- formation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.In plants, the methods described for the transformation and regeneration of plants from plant tissues or plant cells for transient or stable transformation are used. Suitable methods are above all protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun, the so-called particle bombardment method, electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution and microinjection.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden (Horsch RB et al . (1985) Science 225:1229; Marton L (1984) Cell Culture and Somatic Ceil Genetics of Plants 1:514-521). Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid) , das auf die Pflanze nach Agrobacteriu -Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plas ids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert .In addition to these "direct" transformation techniques, transformation can also be carried out by bacterial infection using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes (Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229; Marton L (1984) Cell Culture and Somatic Ceil Genetics of Plants 1: 514-521). These strains contain a plasmid (Ti or Ri plasmid) which is transferred to the plant after Agrobacteriu infection. Part of this plasma, called T-DNA (transferred DNA), is integrated into the genome of the plant cell.
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen.The Agrobacterium -mediated transformation is best suited for dicotyledonous, diploid plant cells, whereas the direct transformation techniques are suitable for every cell type.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.In an advantageous embodiment, the expression cassette is introduced by means of plasmid vectors. Preferred vectors are those which enable stable integration of the expression cassette into the host genome.
Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet .In the case of injection or electroporation of DNA into plant cells, there are no special requirements for the plasmid used. Simple plasmids such as the pUC series can be used. If complete plants are to be regenerated from the transformed cells, it is necessary that there is an additional selectable marker gene on the plasmid.
Transformationstechniken sind für verschiedene monokotyle und dikotyle pflanzliche Organismen beschrieben. Ferner stehen verschiedene mögliche Plasmidvektoren für die Einführung fremder Gene in Pflanzen zur Verfügung, die in der Regel einen Replikati- onsursprung für eine Vermehrung in E.coli und ein Markergen für eine Selektion transformierter Bakterien enthalten. Beispiele sind pBR322, pUC Reihe, M13mp Reihe, pACYC184 etc.Transformation techniques are described for various monocot and dicotyledonous plant organisms. Furthermore, various possible plasmid vectors stand for the introduction of foreign ones Genes are available in plants, which usually contain an origin of replication for reproduction in E. coli and a marker gene for selection of transformed bacteria. Examples are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
Die Expressionkassette kann in den Vektor über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert , gezüchtet und das rekombi- nante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.The expression cassette can be inserted into the vector via a suitable restriction site. The resulting plasmid is first introduced into E. coli. Correctly transformed E. coli are selected, grown and the recombinant plasmid obtained using methods familiar to the person skilled in the art. Restriction analysis and sequencing can be used to check the cloning step.
Transformierte Zellen d.h. solche, die die eingeführte DNA inte- griert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untrans- for ierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide zu verleihen vermag. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden -Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformier- ten Wildtyp abtöten. Beispiel sind das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al . (1993) Plant Mol Biol 21 (5) : 871-884) , das nptll Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht.Transformed cells i.e. Those that contain the inserted DNA integrated into the DNA of the host cell can be selected by untransforced ones if a selectable marker is part of the inserted DNA. Any gene that can confer resistance to antibiotics or herbicides can act as a marker, for example. Transformed cells that express such a marker gene are able to survive in the presence of concentrations of a corresponding antibiotic or herbicide that kill an untransformed wild type. Examples are the bar gene that confers resistance to the herbicide phosphinotricin (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21 (5): 871-884), the nptll gene that confers resistance to kanamycin, the hpt gene that Confers resistance to hygromycin, or the EPSP gene, which confers resistance to the herbicide glyphosate.
Je nach Methode der DNA-Einführung können weitere Gene auf dem Vektorplasmid nützlich sein. Werden Agrobacterium verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: Shuttle or inter- mediate vector) oder einen binären Vektor. Wenn zum Beispiel ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren.Depending on the method of introducing DNA, additional genes on the vector plasmid may be useful. If Agrobacterium is used, the expression cassette must be integrated in special plasmids, either in an intermediate vector (English: shuttle or intermediate vector) or in a binary vector. If, for example, a Ti or Ri plasmid is to be used for the transformation, at least the right boundary, but mostly the right and the left boundary of the Ti or Ri plasmid T-DNA as flanking region, is connected to the expression cassette to be inserted. Binary vectors are preferably used. Binary vectors can replicate in both E.coli and Agrobacterium.
Sie enthalten- in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al . (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptll Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorga- nismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwen- det werden.They usually contain a selection marker gene and a linker or polylinker flanked by the right and left T-DNA restriction sequences. They can be transformed directly into Agrobacterium (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187). The selection marker gene allows selection of transformed agrobacteria and is, for example, the nptll gene which confers resistance to kanamycin. In this case as a host Agrobacterium that is functioning should already contain a plasmid with the vir region. This is necessary for the transfer of T-DNA to the plant cell. An Agrobacterium transformed in this way can be used to transform plant cells.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V. , Alblasserdam, Chapter V; Fraley RT et al . (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80(15) :4803-7. and An et al . (1985) EMBO J 4:277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBINl9 (Clontech Laboratories, Inc. USA) .The use of T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and described (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters BV, Alblasserdam, Chapter V; Fraley RT et al. (1983) Proc Natl Acad Sei USA 80 (15): 4803-7. And An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287). Various binary vectors are known and some are commercially available, for example pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
Für den Transfer der DNA auf die pflanzliche Zelle werden pflanzliche Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert . Ausgehend von infiziertem Pflanzenmaterial (z.B. Blatt-, Wurzel- oder Stengelteile, aber auch Protopla- sten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können ganze Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums , dass zum Beispiel Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierten Zellen enthalten kann, regeneriert werden. Die erhaltenen Pflanzen können dann auf die Präsenz der eingeführten DNA, hier der erfindungsge- mässen Expressionskassette, durchmustert werden. Sobald die DNA in das Wirtsgenom integriert ist, ist der entsprechende Genotyp in der Regel stabil und die entsprechende Insertion wird auch in den Nachfolgegenerationen wiedergefunden. In der Regel enthält die integrierte Expressionskassette einen Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid) oder ein Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc. verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransfor ierten (McCormick et al.(1986) Plant Cell Reports 5:81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicherTo transfer the DNA to the plant cell, plant explants are co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes. Starting from infected plant material (e.g. parts of leaves, roots or stems, but also protoplasts or suspensions of plant cells), whole plants can be regenerated using a suitable medium that can contain, for example, antibiotics or biocides for the selection of transformed cells. The plants obtained can then be screened for the presence of the introduced DNA, here the expression cassette according to the invention. As soon as the DNA is integrated into the host genome, the corresponding genotype is generally stable and the corresponding insertion is also found in the subsequent generations. As a rule, the integrated expression cassette contains a selection marker which gives the transformed plant resistance to a biocide (for example a herbicide) or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinotricin etc. The selection marker allows the selection of transformed cells from untransforced (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). The plants obtained can be in the usual
Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.To be bred and crossed in a wise manner. Two or more generations should be cultivated to ensure that genomic integration is stable and inheritable.
Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Teehniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus (1991) Ann Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225) beschrieben. Vorzugs- weise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor klo- niert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transfor- mieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:8711) .The methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al. , Teehniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R Wu, Academic Press (1993), 128-143 and in Potrykus (1991) Ann Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42 : 205-225). The construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens. Mieren, for example pBinl9 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711).
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden..Once a transformed plant cell has been made, a whole plant can be obtained using methods known to those skilled in the art. This is based on the example of callus cultures. The formation of shoots and roots can be induced in a known manner from these still undifferentiated cell masses. The sprouts obtained can be planted out and grown.
Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nukleinsäuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsme- thoden ermittelt werden.The effectiveness of the expression of the transgenically expressed nucleic acids can be determined, for example, in vitro by sprout meristem propagation using one of the selection methods described above.
Erfindungsgemäss sind ferner von den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.- , und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte.According to the invention are also derived from the transgenic organisms described above, cell cultures, parts - such as roots, leaves, etc. in transgenic plant organisms - and transgenic propagation material such as seeds or fruits.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemässe, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermit- tel verwendet werden.Genetically modified plants according to the invention which can be consumed by humans and animals can also be used as food or feed, for example directly or after preparation known per se.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemässen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc.- , und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.Another object of the invention relates to the use of the transgenic organisms according to the invention described above and the cells, cell cultures, parts derived therefrom - such as roots, leaves etc. in transgenic plant organisms - and transgenic propagation material such as seeds or fruits for the production of food or feed, pharmaceuticals or fine chemicals.
Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen wobei ein WirtsOrganismus mit einer der oben beschriebenen Expressionskassetten transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Fein- chemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Feinche- mikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungsmedium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Vitaminen und Vitaminvorstufen insbesonders Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Caro- tinoiden. Die Züchtung der transformierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakzinen ist beschrieben bei Hood EE und Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10(4) : 382-6; Ma JK Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236 275-92 . Also preferred is a process for the recombinant production of pharmaceuticals or fine chemicals in host organisms, wherein a host organism is transformed with one of the expression cassettes described above and this expression cassette contains one or more structural genes which code for the desired fine chemical or the biosynthesis of the desired fine chemical catalyze, the transformed host organism is grown and the desired fine chemical is isolated from the growth medium. This process is widely applicable to fine chemicals such as enzymes, vitamins, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavors, aromas and colors. The production of vitamins and vitamin precursors is particularly preferred, in particular tocopherols and tocotrienols and caro- tinoiden. The transformed host organisms and the isolation from the host organisms or from the growth medium are cultivated using methods known to those skilled in the art. The production of pharmaceuticals, such as antibodies or vaccines, is described in Hood EE and Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10 (4): 382-6; Ma JK Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236 275-92.
Sequenzensequences
1. SEQ ID NO: 1 Promotor and 5 ' -untranslatierte Region des BCI-3 Gens aus Gerste (1850 bp)1. SEQ ID NO: 1 promoter and 5 'untranslated region of the barley BCI-3 gene (1850 bp)
2. SEQ ID NO: 2 Promotor and 5 '-untranslatierte Region des BCI-4 Gens aus Gerste2. SEQ ID NO: 2 promoter and 5 'untranslated region of the BCI-4 gene from barley
3. SEQ ID NO: 3 "Prom300" Deletionsvariante des BCI-3 Promotor aus Gerste (373 bp)3. SEQ ID NO: 3 "Prom300" deletion variant of the BCI-3 promoter from barley (373 bp)
4. SEQ ID NO: 4 "Prom600" Deletionsvariante des BCI-3 Promotor aus Gerste (645 bp)4. SEQ ID NO: 4 "Prom600" deletion variant of the BCI-3 promoter from barley (645 bp)
5. SEQ ID NO: 5 "Prom900" Deletionsvariante des BCI-3 Promotor aus Gerste (898 bp)5. SEQ ID NO: 5 "Prom900" deletion variant of the BCI-3 promoter from barley (898 bp)
6. SEQ ID NO: 6 "Proml200" Deletionsvariante des BCI-3 Promotor aus Gerste (1173 bp)6. SEQ ID NO: 6 "Prom1200" deletion variant of the BCI-3 promoter from barley (1173 bp)
7. SEQ ID NO: 7 "Proml700" Variante des BCI-3 Promotor aus Gerste (1772 bp)7. SEQ ID NO: 7 "Proml700" variant of the BCI-3 promoter from barley (1772 bp)
8. SEQ ID NO: 8 "Prom900" Variante des BCI-4 Promotor aus Gerste (904 bp)8. SEQ ID NO: 8 "Prom900" variant of the BCI-4 promoter from barley (904 bp)
9. SEQ ID NO: 9 Oligonukleotid-Primer M13-fwd 5 ' -GTAAAACGACGGCCAGTG-3 '9. SEQ ID NO: 9 oligonucleotide primers M13-fwd 5 '-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
10. SEQ ID NO: 10 Oligonukleotid-Primer Ml3-Rev 5 ' -GGAAACAGCTATGACCATG-3 '10. SEQ ID NO: 10 oligonucleotide primers Ml3-Rev 5 '-GGAAACAGCTATGACCATG-3'
11. SEQ ID NO: 11 Oligonukleotid-Primer PPl-5 5'-CTC GCA GTT GGC CGG CAC CGT-3 '11. SEQ ID NO: 11 oligonucleotide primers PPl-5 5'-CTC GCA GTT GGC CGG CAC CGT-3 '
12. SEQ ID NO: 12 Oligonukleotid-Primer PPl-3 5 ' -TGA CCC CAT GTA CTA CAT CGCCT-3 '12. SEQ ID NO: 12 oligonucleotide primers PPl-3 5 '-TGA CCC CAT GTA CTA CAT CGCCT-3'
13. SEQ ID NO: 13 Oligonukleotid-Primer PP2-5 5'-CTT CCA GTC CCG CAC GTT GTA C-3 '13. SEQ ID NO: 13 oligonucleotide primers PP2-5 5'-CTT CCA GTC CCG CAC GTT GTA C-3 '
14. SEQ ID NO: 14 Oligonukleotid-Primer PP2-3 5' -GTC GGT TGC GGC TAT TTG ATT GC-3 '14. SEQ ID NO: 14 oligonucleotide primer PP2-3 5 '-GTC GGT TGC GGC TAT TTG ATT GC-3'
15. SEQ ID NO: 15 Oligonukleotid-Primer PP3-5 5 ' -AGC CAT CAT CCC TGC GGA TCC A-3 ' 16. SEQ ID NO: 16 Oligonukleotid-Primer PP3-3 5 ' -GAG CGT CCG GGC GCG GCC TT-3 '15. SEQ ID NO: 15 oligonucleotide primers PP3-5 5 '-AGC CAT CAT CCC TGC GGA TCC A-3' 16. SEQ ID NO: 16 oligonucleotide primers PP3-3 5 '-GAG CGT CCG GGC GCG GCC TT-3'
17. SEQ ID NO: 17 Oligonukleotid-Primer PP4-5 5'-GGA TCC AAG CGA GAT TTG AAC GGA-3 '17. SEQ ID NO: 17 oligonucleotide primer PP4-5 5'-GGA TCC AAG CGA GAT TTG AAC GGA-3 '
18. SEQ ID NO: 18 Oligonukleotid-Primer PP4-3 5' -GCG GCC TTG CCG GAC GCG GT-3 '18. SEQ ID NO: 18 oligonucleotide primers PP4-3 5 '-GCG GCC TTG CCG GAC GCG GT-3'
19. SEQ ID NO: 19 Oligonukleotid-Primer PP5-5 5 ' -GTA TGC CGC TCC ATG TTA GAA GAT-3 '19. SEQ ID NO: 19 oligonucleotide primer PP5-5 5 '-GTA TGC CGC TCC ATG TTA GAA GAT-3'
20. SEQ ID NO: 20 Oligonukleotid-Primer PP5-3 5 ' -ACA TTA CAG GCA GCG TCC GAC AC-3 '20. SEQ ID NO: 20 oligonucleotide primers PP5-3 5 '-ACA TTA CAG GCA GCG TCC GAC AC-3'
21. SEQ ID NO: 21 Oligonukleotid-Primer PP6-5 5'-ACT CAT GCC GGT GCA GAT CTT CG-3 '21. SEQ ID NO: 21 oligonucleotide primer PP6-5 5'-ACT CAT GCC GGT GCA GAT CTT CG-3 '
22. SEQ ID NO: 22 Oligonukleotid-Primer PP6-3. - 5' -ATG CGG GGA TGA GGA GGA CAT G-3 '22. SEQ ID NO: 22 oligonucleotide primer PP6-3. - 5 '-ATG CGG GGA TGA GGA GGA CAT G-3'
23. SEQ ID NO: 23 Oligonukleotid-Primer BCI3-5 5 ' -aagcttcaccaactcccttcaaggtctaa-3 '23. SEQ ID NO: 23 oligonucleotide primer BCI3-5 5 '-aagcttcaccaactcccttcaaggtctaa-3'
24. SEQ ID NO: 24 Oligonukleotid-Primer BCI3-3 5 ' -ctgcagtgtgtgtgcttgctgtgatgc-3 '24. SEQ ID NO: 24 oligonucleotide primer BCI3-3 5 '-ctgcagtgtgtgtgcttgctgtgatgc-3'
25. SEQ ID NO: 25 Oligonukleotid-Primer P300-525. SEQ ID NO: 25 oligonucleotide primers P300-5
5 ' -aa cttcαcatccctaacatσ -3 ' BCI3-3 (SEQ ID NO: 24)5 '-aa cttcαcatccctaacatσ -3' BCI3-3 (SEQ ID NO: 24)
26. SEQ ID NO: 26 Oligonukleotid-Primer P600-5 5 ' -aag£tttagctccgttcccatgatct-3 '26. SEQ ID NO: 26 oligonucleotide primer P600-5 5 '-aag £ tttagctccgttcccatgatct-3'
27. SEQ ID NO: 27 Oligonukleotid-Primer P900-5 5 ' -aagcttggctaatatgcgcgtaaaa-3 '27. SEQ ID NO: 27 oligonucleotide primer P900-5 5 '-aagcttggctaatatgcgcgtaaaa-3'
28. SEQ ID NO: 28 Oligonukleotid-Primer P1200-5 5 ' -aagcttcgtccaattctaggatgatgatgc-3 ' BCI3-328. SEQ ID NO: 28 oligonucleotide primer P1200-5 5 '-aagcttcgtccaattctaggatgatgatgc-3' BCI3-3
29. SEQ ID NO: 29 Oligonukleotid-Primer OPNl 5 ' -TGA ATG GTC ATG GCT GCT TA-3 '29. SEQ ID NO: 29 oligonucleotide primer OPNl 5 '-TGA ATG GTC ATG GCT GCT TA-3'
30. SEQ ID NO: 30 Oligonukleotid-Primer OPN2 5' -GGC TCT GAA TCG CAC ATT CT-3 ' 31. SEQ ID NO: 31 Oligonukleotid-Primer OPN3 5 ' -GTA CCT CTC CTC CCC GCT CAC T-3 '30. SEQ ID NO: 30 oligonucleotide primers OPN2 5 '-GGC TCT GAA TCG CAC ATT CT-3' 31. SEQ ID NO: 31 oligonucleotide primer OPN3 5 '-GTA CCT CTC CTC CCC GCT CAC T-3'
32. SEQ ID NO: 32 Oligonukleotid-Primer OPN4 5' -GCC TCG TTG TAA CGG GTA CT-3'32. SEQ ID NO: 32 oligonucleotide primer OPN4 5 '-GCC TCG TTG TAA CGG GTA CT-3'
33. SEQ ID NO: 33 Oligonukleotid-Primer OPN5 5 ' -TCATGCATATCTATGTCTTTCTCTTC-3 '33. SEQ ID NO: 33 oligonucleotide primer OPN5 5 '-TCATGCATATCTATGTCTTTCTCTTC-3'
34. SEQ ID NO: 34 Oligonukleotid-Primer OPN6 5'-AAA CGA TTC GCT GCA AAA AT-3 '34. SEQ ID NO: 34 oligonucleotide primer OPN6 5'-AAA CGA TTC GCT GCA AAA AT-3 '
35. SEQ ID NO: 35 Oligonukleotid-Primer OPN7 5 ' -GTA CCT CTC CCC GCT CAC T-3 '35. SEQ ID NO: 35 oligonucleotide primer OPN7 5 '-GTA CCT CTC CCC GCT CAC T-3'
36. SEQ ID NO: 36 Oligonukleotid-Primer BCI4-5 5 ' -agcgaatcgtttttcccttt-3 '36. SEQ ID NO: 36 oligonucleotide primer BCI4-5 5 '-agcgaatcgtttttcccttt-3'
37. SEQ ID NO: 37 Oligonukleotid-Primer BCI4-3 5 ' -cctgagtgtacggctctgagatg-3 '37. SEQ ID NO: 37 oligonucleotide primer BCI4-3 5 '-cctgagtgtacggctctgagatg-3'
Abbi1düngenAbbi1düngen
Die folgenden Abbildungen zeigen in-si tu Hybridisierungen von unterschiedlichen pflanzlichen Organen zu unterschiedlichen Entwicklungszeitpunkten :The following figures show in-si tu hybridizations of different plant organs at different development times:
1. Fig. 1: Überblick über die BCI-3 Promotor-Reporter- Konstrukte, die für den transienten Assay verwendet wurden.1. Fig. 1: Overview of the BCI-3 promoter-reporter constructs that were used for the transient assay.
2. Fig. 2: Induktion der BCI3-Promotoraktivität durch BTH (BION) . Ausgewertet wurden 8 Blattseqmente pro Experiment.2. Fig. 2: Induction of BCI3 promoter activity by BTH (BION). Eight leaf segments per experiment were evaluated.
Auf der y-Achse ist die Anzahl der GFP-positiven Zellen [GFP] angegeben. Auf der y-Achse sind zum einen der gesamte BCI3-Promotor (BCI3-Prom 1700) sowie die verschiedenen Dele- tionsvarianten (BCl3-Prom 300; BCI3-Prom 600; BCI3-Prom 900; BCl3-Prom 1200) aufgeführt. Angegeben sind jeweils die Ergebnisse bei mit BTH behandelten Blättern (weiße Balken) bzw. unbehandelten Blättern (schwarze Balken) . Transformation mit dem pGFP Leervektor ergab keine GFP positiven Zellen. Die hohe Hintergrundaktivität bei unbehandelten Zellen ist vermutlich auf die Verletzung der Zellen infolge des Beschüsses mit den Wolframpartikeln zurückzuführen (s.u.).The number of GFP-positive cells [GFP] is indicated on the y-axis. The entire BCI3 promoter (BCI3-Prom 1700) and the different deletion variants (BCl3-Prom 300; BCI3-Prom 600; BCI3-Prom 900; BCl3-Prom 1200) are listed on the y axis. The results are given in each case for leaves treated with BTH (white bars) or untreated sheets (black bars). Transformation with the pGFP blank vector did not result in GFP positive cells. The high background activity in untreated cells is probably due to the injury to the cells due to the bombardment with the tungsten particles (see below).
3. Fig. 3: Induktion der BCI3-Promotoraktivität durch Jasmonat (JA). Ausgewertet wurden 8 Blattseqmente pro Experiment. Auf der y-Achse ist die Anzahl der GFP-positiven Zellen [GFP] an- gegeben. Auf der y-Achse sind zum einen der gesamte BCI3-Promotor (BCI3-Prom 1700) sowie die verschiedenen Deletionsva- rianten (BCI3-Prom 300; BCI3-Prom 600; BCI3-Prom 900; BCI3-Prom 1200) aufgeführt. Angegeben sind jeweils die Ergeb- nisse bei mit JA behandelten Blättern (weiße Balken) bzw. unbehandelten Blättern (schwarze Balken) . Transformation mit dem pGFP Leervektor ergab keine GFP positiven Zellen. Die hohe Hintergrundaktivität bei unbehandelten Zellen ist vermutlich auf die Verletzung der Zellen infolge des Beschüsses mit den Wolframpartikeln zurückzuführen (s.u.).3. Fig. 3: Induction of BCI3 promoter activity by jasmonate (JA). Eight leaf segments per experiment were evaluated. The number of GFP-positive cells [GFP] is on the y-axis. given. The y-axis shows the entire BCI3 promoter (BCI3-Prom 1700) and the various deletion variants (BCI3-Prom 300; BCI3-Prom 600; BCI3-Prom 900; BCI3-Prom 1200). The results are given in each case for sheets treated with JA (white bars) or untreated sheets (black bars). Transformation with the pGFP blank vector did not result in GFP positive cells. The high background activity in untreated cells is probably due to the injury to the cells due to the bombardment with the tungsten particles (see below).
4. Fig. 4: Repression der BCI3-Promotoraktivität durch Sorbitol. Ausgewertet wurden 8 Blattseqmente pro Experiment. Auf der y-Achse ist die Anzahl der GFP-positiven Zellen [GFP] angege- ben. Auf der y-Achse sind zum einen der gesamte BCI-3 Promotor (BCI3-Prom 1700) sowie die verschiedenen Deletionsvarian- ten (BCI3-Prom 300; BCl3-Prom 600; BCl3-Prom 900; BCI3-Prom 1200) aufgeführt. Angegeben sind jeweils die Ergebnisse bei mit Sorbitol behandelten Blättern (weiße Balken) bzw. unbe- handelten Blättern (schwarze Balken) . Transformation mit dem pGFP Leervektor ergab keine GFP positiven Zellen. Die hohe Hintergrundaktivität bei unbehandelten Zellen ist vermutlich auf die Verletzung der Zellen infolge des Beschüsses mit den Wolframpartikeln zurückzuführen (s.u.).4. Fig. 4: Repression of BCI3 promoter activity by sorbitol. Eight leaf segments per experiment were evaluated. The number of GFP-positive cells [GFP] is indicated on the y-axis. The entire BCI-3 promoter (BCI3-Prom 1700) and the various deletion variants (BCI3-Prom 300; BCl3-Prom 600; BCl3-Prom 900; BCI3-Prom 1200) are listed on the y axis. The results are given for leaves treated with sorbitol (white bars) and untreated leaves (black bars). Transformation with the pGFP blank vector did not result in GFP positive cells. The high background activity in untreated cells is probably due to the injury to the cells due to the bombardment with the tungsten particles (see below).
5. Fig. 5: Analyse der BCI-3 und BCI-4 Promotoreigenschaften durch Northernblot Analysen.5. Fig. 5: Analysis of the BCI-3 and BCI-4 promoter properties by Northern blot analyzes.
A: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach DCINA- Applikation.A: Transcript accumulation of the BCI genes after DCINA application.
Fünf Tage alte Gerstenkeimlinge der Mutante A89 wurden mit 5 mg/1 DCINA bezogen auf das Bodenvolumen oder mit der Leerformulierung WP gegossen. Primärblätter wurden zu den auf der x-Achse angegebenen angegebenen ZeitpunktenFive-day-old barley seedlings of mutant A89 were watered with 5 mg / 1 DCINA based on the soil volume or with the empty formulation WP. Primary sheets were made at the times indicated on the x-axis
(Stunden nach Induktion) geerntet und Gesamt-RNA extrahiert. Nach gelelektrophoretischer Trennung (10 μg RNA pro Spur) wurde die Expression der BCI-Gene in Northern- Blot-Analysen untersucht. Rechts ist die jeweilige abge- schätzte Transkriptgröße in Kilobasenpaaren • (kb) angegeben. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft. B: Transkriptakkumulation der BCI-Gene in Epidermis und Mesophyll nach BTH-Applikation.(Hours after induction) harvested and total RNA extracted. After gel electrophoretic separation (10 μg RNA per lane) the expression of the BCI genes was examined in Northern blot analyzes. The estimated transcript size in kilobase pairs • (kb) is shown on the right. The uniform RNA loading of the gel was checked using ethidium bromide-mediated fluorescence of the ribosomal RNA under UV light. B: Transcript accumulation of the BCI genes in epidermis and mesophyll after BTH application.
Sechs Tage alte Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden mit 20 mg/1 BTH bezogen auf das Bodenvolumen oder mit derSix day old barley seedlings cv. Ingrid were given 20 mg / 1 BTH based on the soil volume or with the
Leerformulierung WP gegossen. Primärblätter wurden zu den auf der x-Achse angegebenen angegebenen Zeitpunkten (Stunden nach Induktion) geerntet, die abaxiale Epidermis vom restlichen Blatt (Mesophyll) getrennt. Nach gelelek- trophoretischer Trennung (6,8 μg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit Fluore- scein- (BCI-4) oder radioaktiv markierten (BCI-3) Sonden unter stringenten Bedingungen hybridisiert . Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid- vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Empty formulation WP poured. Primary leaves were harvested at the times indicated on the x-axis (hours after induction), the abaxial epidermis separated from the rest of the leaf (mesophyll). After electrophoretic separation (6.8 μg RNA per lane) and preparation of Northern blots, the mRNA was hybridized with fluorescein (BCI-4) or radioactively labeled (BCI-3) probes under stringent conditions. The uniform RNA loading of the gel was determined using ethidium bromide-mediated fluorescence of the ribosomal RNA under UV
Licht überprüft .Light checked.
C: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach SA-Applikation.C: Transcript accumulation of the BCI genes after SA application.
Sieben Tage alte Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden mitSeven day old barley seedlings cv. Ingrid were with
100 mg/1 SA bezogen auf das Bodenvolumen oder mit Wasser (H0) gegossen. Primärblätter der Gerstenpflanzen wurden zu den auf der x-Achse angegebenen angegebenen Zeitpunkten (Stunden nach Induktion) geerntet und Gesamt-RNA ex- trahiert. Nach gelelektrophoretischer Trennung (9 bis 10 μg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Flu- oreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft.100 mg / 1 SA based on the volume of the soil or poured with water (H0). Primary leaves of the barley plants were harvested at the times indicated on the x-axis (hours after induction) and total RNA was extracted. After gel electrophoretic separation (9 to 10 μg RNA per lane) and preparation of Northern blots, the mRNA was hybridized with probes from BCI-3 and BCI-4 under stringent conditions. The uniform RNA loading of the gel was checked using ethidium bromide-mediated fluorescence of the ribosomal RNA under UV light.
D: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach JM-Applikation.D: Transcript accumulation of the BCI genes after JM application.
Primärblattsegment sieben Tage alter Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden auf 45 μM Jasmonsäuremethylester (JM) oderPrimary leaf segment of seven-day-old barley seedlings cv. Ingrid were on 45 μM jasmonic acid methyl ester (JM) or
Wasser (H0) "gefloatet". Blattproben wurden zu den auf der x-Achse angegebenen angegebenen Zeitpunkten (Stunden nach Induktion) entnommen und Gesamt-RNA extrahiert. Nach gelelektrophoretischer Trennung (9 bis 10 μg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert . Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft. Fig. 6: Analyse der BCI-3 und BCI-4 Promotoreigenschaften durch Northernblot Analysen.Water (H0) "floated". Leaf samples were taken at the times indicated on the x-axis (hours after induction) and total RNA extracted. After gel electrophoretic separation (9 to 10 μg RNA per lane) and preparation of Northern blots, the mRNA was hybridized with probes from BCI-3 and BCI-4 under stringent conditions. The uniform RNA loading of the gel was checked using ethidium bromide-mediated fluorescence of the ribosomal RNA under UV light. Fig. 6: Analysis of the BCI-3 and BCI-4 promoter properties by Northern blot analyzes.
A: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach Sorbit- applikation.A: Transcript accumulation of the BCI genes after sorbitol application.
Primärblattsegmente sieben Tage alter Gerstenkeimlinge cv. Ingrid (I) wurden auf 1 M Sorbit (S) oder Wasser (K) "gefloatet" . Blattproben wurden nach 48 h entnommen und Gesamt-RNA extrahiert. Nach gelelektrophoretischerPrimary leaf segments of seven-day-old barley seedlings cv. Ingrid (I) were "floated" on 1 M sorbitol (S) or water (K). Leaf samples were taken after 48 hours and total RNA extracted. After gel electrophoretic
Trennung (10 μg RNA pro Spur) wurden Northern Blots mit Transkript- oder DNA-Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-ver- mittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV- Licht überprüft. BCI-4 zeigte nach Sorbitbehandlung keine differentielle Expression.Separation (10 μg RNA per lane), Northern blots were hybridized with BCI-3 and BCI-4 transcript or DNA probes under stringent conditions. The uniform RNA loading of the gel was checked on the basis of ethidium bromide-mediated fluorescence of the ribosomal RNA under UV light. BCI-4 showed no differential expression after sorbitol treatment.
B: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach Verwundung der Primärblätter.B: Transcript accumulation of the BCI genes after wounding the primary leaves.
Primärblätter sieben Tage alter Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden mit Nadeln perforiert, Kontrollblätter blieben unverletzt. Nach Extraktion von Gesamt-RNA, gel- elektrophoretischer Trennung (9 μg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA Transkriptoder DNA-Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft. BCI-4 zeigte nach Verwundung keine differentielle Expression, BCI-3 hingegen eine schnelle und langanhaltende Induktion.Primary leaves of seven-day-old barley seedlings cv. Ingrid was perforated with needles, control sheets were not injured. After extraction of total RNA, gel electrophoretic separation (9 μg RNA per lane) and preparation of Northern blots, the mRNA transcript or DNA probes from BCI-3 and BCI-4 were hybridized under stringent conditions. The uniform RNA loading of the gel was checked using ethidium bromide-mediated fluorescence of the ribosomal RNA under UV light. BCI-4 showed no differential expression after wounding, BCI-3, however, showed a fast and long-lasting induction.
C: Transkriptakkumulation von BCI-4 in DCINA induzierten und Bgh inokulierten Primärblättern.C: Transcript accumulation of BCI-4 in DCINA-induced and Bgh-inoculated primary leaves.
Sieben Tage alte Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden mit 10 mg/1 DCINA, bzw. mit der Leerformulierung WP gegossen und drei Tage später mit BghA6 oder ock-inokuliertSeven day old barley seedlings cv. Ingrid was poured with 10 mg / 1 DCINA or with the empty formulation WP and three days later with BghA6 or ock-inoculated
(Zeitpunkt der Inokulation) . Nach Extraktion von Gesamt- RNA aus Primärblättern, gelelektrophoretischer Trennung (10 μg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit Transkriptsonden von BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige(Time of inoculation). After extraction of total RNA from primary leaves, gel electrophoretic separation (10 μg RNA per lane) and preparation of Northern blots, the mRNA was hybridized with transcript probes from BCI-4 under stringent conditions. The even
RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-ver- mittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft.RNA loading of the gel was determined using ethidium bromide mean fluorescence of the ribosomal RNA checked under UV light.
D: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach Injektion ver- schiedener Bakterien.D: Transcript accumulation of the BCI genes after injection of various bacteria.
Primär- und Sekundärblätter vierzehn Tage alter Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden mit Suspensionen von Pseudo- monas syringae pv. tomato (DC) , P.s. pv. syringae (Pss) , P.s. pv. glycinea (PG) , Bacillus subtilis (Bs) , bzw. mitPrimary and secondary leaves of barley seedlings fourteen days old cv. Ingrid was treated with suspensions of Pseudomonas syringae pv. Tomato (DC), P.s. pv. syringae (Pss), P.s. pv. glycinea (PG), Bacillus subtilis (Bs), or with
5 mM MgS04 (K) infiltriert. Die Blattproben wurden zu den angegeben Zeitpunkten geerntet und in oberen (o) , mittleren (m) und unteren (u) Bereich infiltrierter Blätter sowie nicht-infiltrierte Blätter (systemisch, s) unter- teilt. Nach Extraktion von Gesamt-RNA, gelelektrophoretischer Trennung (10 μg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit radioaktiv markierten Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft . BCI-4 zeigte nach Verwundung keine differentielle Expression.5 mM MgSO4 (K) infiltrated. The leaf samples were harvested at the indicated times and divided into upper (o), middle (m) and lower (u) areas of infiltrated leaves and non-infiltrated leaves (systemic, s). After extraction of total RNA, gel electrophoretic separation (10 μg RNA per lane) and preparation of Northern blots, the mRNA was hybridized with radiolabelled probes from BCI-3 and BCI-4 under stringent conditions. The uniform RNA loading of the gel was checked using ethidium bromide-mediated fluorescence of the ribosomal RNA under UV light. BCI-4 showed no differential expression after wounding.
7. Fig. 7: Analyse der BCI-3 und BCI-4 Promotoreigenschaften in Weizen durch Northernblot Analysen.7. Fig. 7: Analysis of the BCI-3 and BCI-4 promoter properties in wheat by Northern blot analysis.
Untersucht wurde die Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach BTH-Applikation oder Echtem Weizenmehltaupilz (Bgt) - Inokulation von Weizenpflanzen. Vierzehn Tage alte Weizenpflanzen cv. Kanzler wurden mit 100 mg/1 BTH (BTH) oder zur Kontrolle mit der Leerformulierung WP (K) besprüht, bzw. mit Echtem Weizenmehltaupilz (Bgt) inokuliert. Sekundärblätter wurden zu den angegebene Zeitpunkten (dpt/dpi) geerntet und Gesamt-RNA extrahiert. Nach gelelektrophoretischer Trennung (ca. 10 μg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter weniger stringenten (60°C) Bedingungen hybridisiert als Gerstenproben. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV- Licht überprüft. Man erkennt eine starke, schnelle Induktion von BCI-3 und BCI-4 infolge der BTH Applikation, die nicht infolge einer Pathogen (Bgh) Infektion zu beobachten ist. 8. Fig. 8: Gewebespezifische Expression von BCI-4The transcript accumulation of the BCI genes after BTH application or real wheat powdery mildew (Bgt) inoculation of wheat plants was examined. Fourteen day old wheat plants cv. Registrars were sprayed with 100 mg / 1 BTH (BTH) or, as a control, with the empty formulation WP (K), or inoculated with powdery mildew (Bgt). Secondary leaves were harvested at the indicated times (dpt / dpi) and total RNA extracted. After gel electrophoretic separation (approx. 10 μg RNA per lane) and preparation of Northern blots, the mRNA was hybridized with probes from BCI-3 and BCI-4 under less stringent (60 ° C.) conditions than barley samples. The uniform RNA loading of the gel was checked using ethidium bromide-mediated fluorescence of the ribosomal RNA under UV light. A strong, rapid induction of BCI-3 and BCI-4 can be seen as a result of the BTH application, which cannot be observed as a result of a pathogen (Bgh) infection. 8. Figure 8: Tissue specific expression of BCI-4
Folgende Gewebe wurden im Laufe der Entwicklung von Gerstenpflanzen cv. Ingrid geerntet: Embryo ("E", ein Tag vorge- keimt), Wurzel ("Wurzel", 10 Tage nach Aussaat), Primärblatt ("1. Bl."), Sekundärblatt ("2. Bl . " ) , Quartärblatt ("4. Bl . " , Beginn der Bestockung) ) , Fahnenblatt ("Fa.Bl.", 4 Monate nach Aussaat), Halm und Ähre ("Halm", "Ähre", Beginn des Ährenschiebens, 4 Monate nach Aussaat) .The following tissues were developed during the development of barley plants cv. Ingrid harvested: embryo ("E", one day pre-germinated), root ("root", 10 days after sowing), primary leaf ("1st leaf"), secondary leaf ("2nd leaf"), quaternary leaf ( "4th leaf", start of tillering)), flag leaf ("Fa.Bl.", 4 months after sowing), stalks and ears ("Halm", "ear", start of ear shifting, 4 months after sowing).
Jeweils drei Tage vor der Ernte erfolgte eine Gießbehandlung mit 20 mg/1 BTH ("+") bezogen auf das Bodenvolumen, oder keine Behandlung ("-"). Interzelluläre Waschflüssigkeit (IWF) wurde zwei Tage nach der Applikation von 20 mg/1 BTH ("+ ") , bzw. der äquivalenten Menge der Leerformulierung (WP, "-") bezogen aus das Bodenvolumen aus sieben Tagen alten Gerstenpflanzen cv. Ingrid gewonnen. Nach Extraktion von Gesamt-RNA, gelelektrophoretischer Trennung (10,5 μg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit BCI-4 Sonde hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft .A watering treatment with 20 mg / 1 BTH ("+") based on the soil volume was carried out three days before the harvest, or no treatment ("-"). Intercellular washing liquid (IWF) was two days after the application of 20 mg / 1 BTH ("+"), or the equivalent amount of the empty formulation (WP, "-") based on the soil volume from seven-day-old barley plants cv. Ingrid won. After extraction of total RNA, gel electrophoretic separation (10.5 μg RNA per lane) and preparation of Northern blots, the mRNA was hybridized with BCI-4 probe. The uniform RNA loading of the gel was checked using ethidium bromide-mediated fluorescence of the ribosomal RNA under UV light.
BeispieleExamples
Allgemeine Methoden:General methods:
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs- schritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektropho- rese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Frag- menten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al . (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluo- reszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor oder einem ABI-310 Se- quencers (ABI) nach der Methode von Sanger (Sanger et al . (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74:5463-5467) . Beispiel 1: Pflanzen, Pathogene und InokulationThe chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897). The cloning steps carried out in the context of the present invention, such as, for example, restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria Multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA are carried out as in Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6. The sequencing of recombinant DNA molecules is carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from Licor or an ABI-310 sequencer (ABI) according to the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sei USA 74: 5463-5467). Example 1: Plants, Pathogens and Inoculation
Die Gerstensorte Ingrid (Hordeum vulgäre L. cv Ingrid) stammt von James McKey, University of Uppsala, Schweden. Die Gerstensorte Golden Promise wurden von Paul Schulze-Lefert , Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung, Köln, zur Verfügung gestellt.The barley variety Ingrid (Hordeum vulgäre L. cv Ingrid) comes from James McKey, University of Uppsala, Sweden. The Golden Promise barley variety was provided by Paul Schulze-Lefert, Max Planck Institute for Plant Breeding Research, Cologne.
Das 12 bis 36 h im Dunkeln auf feuchtem Filterpapier vorgekeimte Saatgut wurde, wenn nicht anders beschrieben, zu je 5 Körnern an den Rand eines Vierkanttopfes (8x8cm) in Fruhstorfer Erde vom Typ P ausgelegt, mit Erde bedeckt und regelmäßig mit Leitungswasser gegossen. Alle Pflanzen wurden in Klimaschränken oder -kammern bei 16 bis 18°C, 50 bis 60 % relativer Luftfeuchte und einem 16-stündigen Licht / 8-stündigen Dunkelheitszyklus mit 3000 bzw. 5000 lux (50 bzw. 60 μ ols-^-2 Photonenflussdichte) 5 bis 8 Tage lang kultiviert und im Keimlingsstadium in den Versuchen verwendet. Bei Experimenten, in denen Applikationen an Primärblättern durchgeführt wurden, waren diese vollständig entwickelt. Pflanzen, die bis zur Entwicklung von Ähren kultiviert werden sollten, wurden einzeln in Fruhstorfer Erde LD 80 getopft, regelmäßig gegossen, bei Bedarf in größere Töpfe umgetopft und im Gewächshaus zusätzlich beleuchtet.The seeds, which had been pre-germinated in the dark on moist filter paper for 12 to 36 hours, were, unless otherwise stated, placed on the edge of a square pot (8x8cm) in Fruhstorfer earth of type P, 5 grains, covered with earth and regularly watered with tap water. All plants were grown in climate cabinets or chambers at 16 to 18 ° C, 50 to 60% relative humidity and a 16-hour light / 8-hour dark cycle with 3000 or 5000 lux (50 or 60 μ ols - ^ - 2 photon flux density ) Cultivated for 5 to 8 days and used in the seedling stage in the experiments. In experiments in which applications were carried out on primary leaves, these were fully developed. Plants that were to be cultivated until the development of spikes were potted individually in Fruhstorfer Erde LD 80, watered regularly, repotted into larger pots if necessary and additionally illuminated in the greenhouse.
Für die Untersuchung verschiedener Blattgewebe wurde zu verschie- denen Erntezeitpunkten die Epidermis der abaxialen Blattspreite von Gerstenprimärblättern abgezogen und getrennt vom restlichen Blattgewebe (Mesophyll und Epidermis der adaxialen Blattspreite) in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C aufbewahrt.For the investigation of different leaf tissues, the epidermis of the abaxial leaf blade was removed from barley primary leaves at different harvest times and separated from the rest of the leaf tissue (mesophyll and epidermis of the adaxial leaf blade) in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
Für die Inokulation von Gerstenpflanzen mit dem Echten Gersten- mehltaupilz wurden Konidiosporen von Blumeria [syn Erysiphe] graminis f.sp. hordei Speer der Rasse A6 (BghAδ) verwendet (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148). Dieser wurde vom Jörn Pons-Kühne- mann, Institut für Biometrie, JLU Gießen bereitgestellt. Die Nachzucht des Inokulums erfolgte in Klimakammern zu den gleichen Bedingungen, wie sie oben für die Pflanzen beschrieben sind, durch Übertragung der Konidien von befallenem Pflanzenmaterial auf regelmäßig angezogene, 7 Tage alte Gerstenpflanzen cv. Golden Promise bei einer Dichte von 100 Konidia/mm2.Conidiospores of Blumeria [syn Erysiphe] graminis f.sp. were used for the inoculation of barley plants with the real barley powdery mildew. Hordei spear of breed A6 (BghAδ) used (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148). This was provided by Jörn Pons-Kühne- mann, Institute for Biometry, JLU Gießen. The inoculum was grown in climatic chambers under the same conditions as described for the plants above, by transferring the conidia from infected plant material to regularly grown, 7-day-old barley plants cv. Golden Promise at a density of 100 Konidia / mm 2 .
Die Inokulation mit BghA6 erfolgte unter Verwendung von 7 Tagen alten Keimlingen durch Abschütteln der Konidien bereits befallener Pflanzen in einem Inokulationsturm mit ca. 1 bis 8 Koni- dien/mm (soweit nicht anders angegeben) . Für die Inokulation mit dem Echten Weizenmehltaupilz wurden Konidien von Blumeria graminis f.sp. tritici Speer (Bgt) verwendet. Bei Bgt handelte es sich um ein Feldisolat aus Aachen, das 1995 von Uli Beckhove, Instituts für Phytopathologie und Angewandte 5 Zoologie (IPAZ) Gießen, von Weizen isoliert und dem Institut zur Verfügung gestellt wurde. In Klimakammern bzw. -schränken wurde das Isolat unter den oben genannten Bedingungen auf Weizen cv. Kanzler (Saatzucht Engelen-Büchling oHG, Büchlingen/Oberschnei- ding) erhalten.BghA6 was inoculated using 7-day-old seedlings by shaking off the conidia of plants already infected in an inoculation tower with about 1 to 8 conidia / mm (unless stated otherwise). Conidia from Blumeria graminis f.sp. were used to inoculate with the powdery mildew of wheat. tritici spear (Bgt) used. Bgt was a field isolate from Aachen, which was isolated from wheat in 1995 by Uli Beckhove, Institute for Phytopathology and Applied 5 Zoology (IPAZ) Gießen, and made available to the institute. In climatic chambers or cabinets, the isolate was exposed to wheat cv under the conditions mentioned above. Chancellor (seed breeding Engelen-Büchling oHG, Büchlingen / Oberschneiding).
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Cochliobolus sativus Drechsler ex Dastur (anamorph: Bipolaris so- rokiniana [Sacc. in Sorok.] Shoemaker) Feldisolat KNl aus Bana- ras , Indien, wurde von Jagdish Kumar, Indian Council of Agricul- tural Research, Karnal, Indien, im April 1999 isoliert und zurCochliobolus sativus Drechsler ex Dastur (anamorphic: Bipolaris soerokiniana [Sacc. In Sorok.] Shoemaker) Feldisolat KNl from Bananas, India, was developed by Jagdish Kumar, Indian Council of Agricultural Research, Karnal, India, in April 1999 isolated and used
15 Verfügung gestellt. Ein anderes Cochliobolus sativus Feldisolat aus Bangladesh (Drechslera sorokiniana1 01) der Kulturensammlung des Instituts für Phytopathologie und Angewandte Zoologie (IPAZ) wurde von Ismail Hossain, Department of Plant Pathology, Agricul- tural University Mymensingh, Mymensingh, Bangladesh, 1998 von15 provided. Another Bangladeshi cochliobolus sativus field isolate (Drechslera sorokiniana 1 01) from the culture collection of the Institute for Phytopathology and Applied Zoology (IPAZ) was developed by Ismail Hossain, Department of Plant Pathology, Agricultural University Mymensingh, Mymensingh, Bangladesh, 1998 from
20 Weizen isoliert und dem Institut zur Verfügung gestellt. Beide Isolate wurden auf PDA (potato-dextrose-agar, Merck, Darmstadt) bei 25°C im Dunkeln kultiviert und alle drei bis vier Wochen auf frischen Agar überimpft . Durch Inkubation der Kulturplatten bei RT und Tageslicht kam es zur Sporulation.20 wheat isolated and made available to the institute. Both isolates were cultivated on PDA (potato-dextrose agar, Merck, Darmstadt) at 25 ° C in the dark and inoculated on fresh agar every three to four weeks. Incubation of the culture plates at RT and daylight resulted in sporulation.
2525
Von natürlich mit Rhynchosporium secalis Heinsen ex A.B. Frank befallenen Pflanzen einer japanischen Gerstenmischkultur wurden die jüngsten Blätter mit starken Symptomen Ende April 1999 im Freiland (Versuchsfeld Weilburger Grenze, Institut für Pflanzen-Of course with Rhynchosporium secalis Heinsen ex A.B. Plants of a Japanese mixed barley culture became the youngest leaves with strong symptoms in late April 1999 in the field (test field Weilburger Grenze, Institute for Plant-
30 Züchtung, JLU Gießen) geerntet.30 breeding, JLU Gießen).
Kulturen von Pseudomonas syringae pv. tomato (DC3000) , Pseudomo- nas syringae pv. glycinea (PG4180), Pseudomonas syringae pv. syringae (Pssδl) und Bacillus subtilis (Bs) wurden auf King'sCultures of Pseudomonas syringae pv. Tomato (DC3000), Pseudomonas syringae pv. Glycinea (PG4180), Pseudomonas syringae pv. Syringae (Pssδl) and Bacillus subtilis (Bs) were grown on King's
35 B-Agar bei 4°C im Dunkeln erhalten. Bacillus subtilis stammte aus der Kulturensammlung des Instituts für Phytopathologie und Angewandte Zoologie (IPAZ) , Gießen, Deutschland. Die Pseudomonas Stämme wurden von Ina Budde und Matthias Ullrich, Max-Planck-In- stitut für terrestrische Mikrobiologie, Marburg, zur VerfügungObtain 35 B agar at 4 ° C in the dark. Bacillus subtilis came from the culture collection of the Institute for Phytopathology and Applied Zoology (IPAZ), Gießen, Germany. The Pseudomonas strains were made available by Ina Budde and Matthias Ullrich, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Marburg
40 gestellt.40 posed.
King ' s B-Medium :King's B-Medium:
10 g Difco Proteose Pepton #3 (Becton Dickinson, Sparks , USA) 1,5 g KHP04 45 15 g Glycerin ad 1 L mit dest. Wasser, pH 7,0 mit HCI, autoklaviert 5 mM MgS04 King ' s B-Agar :10 g Difco Proteose Peptone # 3 (Becton Dickinson, Sparks, USA) 1.5 g KHP0 4 45 15 g glycerol ad 1 L with dist. Water, pH 7.0 with HCl, autoclaved 5 mM MgS0 4 King's B agar:
King's B-Medium (s.o.) mit 1,5 % Agar-Agar (Serva, Heidelberg), autoklaviert .King's B medium (see above) with 1.5% agar agar (Serva, Heidelberg), autoclaved.
5 Blattlausbefall von Gerste wurde mit der Großen Getreideblattlaus (Sitobion avenae F.) hervorgerufen, die von Stefan Vidal, Institut für Pflanzenpathologie, Georg-August-Universität Göttingen, zur Verfügung gestellt wurde. Die Nachzucht der Läuse erfolgte auf Gerstenpflanzen cv. Ingrid im Käfig unter Zusatzlicht bei ca. 10 25°C.5 Aphid infestation of barley was caused by the large cereal aphid (Sitobion avenae F.), which was made available by Stefan Vidal, Institute of Plant Pathology, Georg-August-Universität Göttingen. The lice were bred on barley plants cv. Ingrid in the cage under additional light at approx. 10 25 ° C.
Blumeria graminsBlumeria gramins
Primärblätter sieben Tage alter Keimlinge wurden durch Abschütteln der Konidien befallener Pflanzen in einem Inokulationsturm 15 mit 1 bis 8 Konidien/mm2 von BghA6 oder Bgt (Feldisolat) inokuliert und in Klimaschränken bzw. -kammern wie oben beschrieben inkubiert .Primary leaves of seven-day-old seedlings were inoculated by shaking off the conidia of infected plants in an inoculation tower 15 with 1 to 8 conidia / mm 2 of BghA6 or Bgt (field isolate) and incubated in climatic chambers or chambers as described above.
Beispiel 2 : RNA-Extraktion und Konzentrationsbestimmung 20Example 2: RNA extraction and concentration determination 20
Gesamt RNA wurde aus 8 bis 10 primären Blattsegmenten (Länge 5 cm) mittels "RNA Extraction Buffer" (AGS, Heidelberg, Germany) extrahiert .Total RNA was extracted from 8 to 10 primary leaf segments (length 5 cm) using "RNA Extraction Buffer" (AGS, Heidelberg, Germany).
25 Dazu wurden die zentrale Primärblattsegment von 5 cm Länge geerntet und in flüssigem Stickstoff in Mörsern homogenisiert. Das Homogenisat wurde bis zur RNA-Extraktion bei -70°C gelagert.25 For this purpose, the central primary leaf segment of 5 cm in length was harvested and homogenized in liquid nitrogen in mortars. The homogenate was stored at -70 ° C. until the RNA extraction.
Aus dem tiefgefrorenen Blattmaterial wurde mit Hilfe eines RNA-The frozen leaf material was extracted using an RNA
30 Extraktions-Kits (AGS, Heidelberg) Gesamt-RNA extrahiert. Dazu wurden 200 mg des tiefgefrorenen Blattmaterials in einem Mikro- zentrifugenröhrchen (2 mL) mit 1,7 mL RNA-Extraktionspuffer (AGS) überschichtet und sofort gut durchmischt. Nach Zugabe von 200 μL Chloroform wurde erneut gut gemischt und bei Raumtemperatur 4530 extraction kits (AGS, Heidelberg) extracted total RNA. For this purpose, 200 mg of the frozen leaf material was overlaid in a microcentrifuge tube (2 mL) with 1.7 mL RNA extraction buffer (AGS) and immediately mixed well. After adding 200 μL chloroform, the mixture was mixed again well and at room temperature 45
35 min auf einem Horizontalschüttler bei 200 U/min geschüttelt. Anschließend wurde zur Phasentrennung 15 min bei 20000 g und 4°C zentrifugiert, die obere wäßrige Phase in ein neues Mikrozentri- fugenröhrchen überführt und die untere verworfen. Die wäßrige Phase wurde erneut mit 900 μL Chloroform gereinigt, indem 3 malShaken for 35 min on a horizontal shaker at 200 rpm. The mixture was then centrifuged for 15 min at 20,000 g and 4 ° C., the upper aqueous phase was transferred to a new microcentrifuge tube and the lower one was discarded. The aqueous phase was cleaned again with 900 μL chloroform by 3 times
40 für 10 sec homogenisiert und erneut zentrifugiert (s.-o.) und abgehoben wurde. Zur Fällung der RNA wurde dann 850 μL 2-Propanol hinzugegeben, homogenisiert und für 30 bis 60 min auf Eis gestellt. Im Anschluss daran wurde für 20 min zentrifugiert (s.o), vorsichtig der Überstand dekantiert, 2 mL 70 %iges Ethanol (-20°C)40 homogenized for 10 sec and centrifuged again (see above) and was lifted off. To precipitate the RNA, 850 μL of 2-propanol was then added, homogenized and placed on ice for 30 to 60 min. Subsequently, centrifugation was carried out for 20 min (see above), the supernatant was carefully decanted, 2 mL 70% ethanol (-20 ° C)
45 hinzu pipettiert, durchmischt und erneut 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dann wiederum dekantiert und das Pelet vorsichtig mit einer Pipette von Flüssigkeitsresten befreit, bevor es an einem Reinluftarbeitsplatz im Reinluftstrom getrocknet wurde. Danach wurde die RNA in 50 μL DEPC-Wasser auf Eis gelöst, durchmischt und 5 min zentrifugiert (s.o.). 40 μl des Überstandes wurden als RNA-Lösung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen über- führt und bei -70°C gelagert.45 pipetted in, mixed and centrifuged again for 10 min. The supernatant was then decanted again and the pelet carefully removed with a pipette of liquid residues before it has been dried in a clean air flow in a clean air workplace. The RNA was then dissolved in 50 μL DEPC water on ice, mixed and centrifuged for 5 min (see above). 40 μl of the supernatant was transferred as an RNA solution into a new microcentrifuge tube and stored at -70 ° C.
Die Konzentration der RNA wurde photometrisch bestimmt. Dazu wurde die RNA-Lösung 1:99 (v/v) mit destilliertem Wasser verdünnt und die Extinktion (Photometer DU 7400, Beckman) bei 260 nm ge- messen (E26O nm = beι 40 M-ff RNA/mL) . Gemäß der errechneten RNA- Gehalte wurden die Konzentrationen der RNA-Lösungen anschließend mit DEPC-Wasser auf 1 μg/μL angeglichen und im Agarosegel überprüft .The concentration of the RNA was determined photometrically. For this purpose, the RNA solution was diluted 1:99 (v / v) with distilled water and the absorbance (photometer DU 7400, Beckman) measured at 260 nm (E26O nm = 40 M-ff RNA / mL). In accordance with the calculated RNA contents, the concentrations of the RNA solutions were then adjusted to 1 μg / μL with DEPC water and checked in the agarose gel.
Zur Überprüfung der RNA-Konzentrationen im horizontalen Agarosegel (1 % Agarose in 1 x MOPS-Puffer mit 0,2 μg/mL Ethidiu bromid) wurde 1 μL RNA-Lösung mit 1 μL 10 x MOPS, 1 μL Farbmarker und 7 μL DEPC-Wasser versetzt, nach Ihrer Größe bei 120 V Spannung im Gel in 1 x MOPS-Laufpuffer über 1,5 h aufgetrennt und unter UV-Licht fotographiert . Eventuelle Konzentrationsunterschiede der RNA-Ex- trakte wurden mit DEPC-Wasser ausgeglichen und die Anpassung erneut im Gel überprüft.To check the RNA concentrations in the horizontal agarose gel (1% agarose in 1 x MOPS buffer with 0.2 μg / mL ethidium bromide), 1 μL RNA solution with 1 μL 10 × MOPS, 1 μL color marker and 7 μL DEPC- Water added, separated according to their size at 120 V voltage in the gel in 1 x MOPS running buffer for 1.5 h and photographed under UV light. Any differences in concentration of the RNA extracts were compensated with DEPC water and the adjustment was checked again in the gel.
DEPC-Wasser: Bidestilliertes Wasser, 0,1 % [w/v] DEPC (Diethylpy- rocarbonat) , mind. 2 h rühren, über Nacht bei 37°C inkubieren, anschließend autoklavieren.DEPC water: bidistilled water, 0.1% [w / v] DEPC (diethyl pyrocarbonate), stir for at least 2 h, incubate overnight at 37 ° C, then autoclave.
Beispiel 3 : Northern-Blot AnalyseExample 3: Northern blot analysis
Zur Vorbereitung des Northern-Blottings wurde die RNA im Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt. Ein Teil RNA- Lösung (entsprechend 6 bis 15 μg RNA) wurde dazu mit gleichem Volumen Probenpuffer (mit Ethidiumbromid) gemischt, 5 min bei 94°C denaturiert, 5 min auf Eis gestellt, kurz zentrifugiert und aufs Gel aufgetragen. Das 1 x MOPS-Gel (1,5 % Agarose, ul tra pure) enthielt 5 Volumenprozent konzentrierte Formaldehydlösung (36,5 % [v/v] ) . Die RNA wurde bei 100 V 2 h lang aufgetrennt und anschließend geblottet.In preparation for Northern blotting, the RNA was separated in the agarose gel under denaturing conditions. A portion of RNA solution (corresponding to 6 to 15 μg RNA) was mixed with the same volume of sample buffer (with ethidium bromide), denatured for 5 min at 94 ° C., placed on ice for 5 min, briefly centrifuged and applied to the gel. The 1 x MOPS gel (1.5% agarose, ul tra pure) contained 5 volume percent concentrated formaldehyde solution (36.5% [v / v]). The RNA was separated at 100 V for 2 h and then blotted.
Das Northern-Blotting erfolgte als aufwärtsgerichteter RNA-Trans- fer im Kapillarstrom. Das Gel wurde dazu zunächst 30 min in 25 mM Natriumhydrogen/dihydrogenphosphat-Puffer (pH 6,5) geschwenkt und zurechtgeschnitten. Ein Whatmanpapier wurde so vorbereitet, dass es auf einer horizontalen Platte auflag und auf 2 Seiten in eine Wanne mit 25 mM Natriumhydrogen/dihydrogenphosphat-Puffer (pH 6,5) ragte. Auf dieses Papier wurde das Gel aufgelegt, wobei nicht bedeckte Teile des Whatmanpapiers mit einer Plastikfolie abgedeckt wurden. Das Gel wurde dann mit einer positiv geladenen Nylonmembran (Boehringer-Mannheim) luftblasenfrei abgedekt, wonach die Membran wiederum mit saugfähigem Papier in mehreren Lagen etwa 5 cm hoch bedeckt wurde. Das saugfähige Papier wurde noch mit einer Glasplatte und einem 100 g Gewicht beschwert. Das Blotting erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Die Membran wurde kurz in A. bidest. geschwenkt und zur RNA-Fixierung mit einer Lichtenergie von 125 m im Crosslinker (Biorad) UV-Licht bestrahlt. Die Überprüfung des gleichmäßigen RNA-Transfers auf die Membran erfolgte auf der UV-Lichtbank.Northern blotting was carried out as an upward-directed RNA transfer in the capillary stream. For this purpose, the gel was first swung in 25 mM sodium hydrogen / dihydrogenphosphate buffer (pH 6.5) and cut to size. Whatman paper was prepared so that it rested on a horizontal plate and protruded on two sides in a tub with 25 mM sodium hydrogen / dihydrogen phosphate buffer (pH 6.5). The gel was placed on this paper, leaving uncovered parts of the Whatman paper with a plastic film were covered. The gel was then covered with a positively charged nylon membrane (Boehringer-Mannheim) free of air bubbles, after which the membrane was again covered with absorbent paper in several layers about 5 cm high. The absorbent paper was weighed down with a glass plate and a 100 g weight. The blotting was carried out overnight at room temperature. The membrane was briefly distilled in A. swung and irradiated for RNA fixation with a light energy of 125 m in the crosslinker (biorad) UV light. The uniform RNA transfer to the membrane was checked on the UV light bench.
Zur Detektion von Gersten mRNA wurden 10 μg Gesamt-RNA aus jeder Probe über ein Agarosegel aufgetrennt und mittels Kapillartransfer auf eine positiv-geladene Nylonmembran geblottet . Die Detek- tion erfolgte mit dem DIG-Systeme.To detect barley mRNA, 10 μg of total RNA from each sample were separated on an agarose gel and blotted onto a positively charged nylon membrane by capillary transfer. The detection was carried out with the DIG systems.
Zur Überprüfung einer differentiellen Genexpression in Northern- Analysen wurden mRNA Sonden ausgehend von den BCI-3 (GenBank Acc.-No: AJ250282) und BCI-4 (GenBank Acc . -No. : AJ250283) cDNA Sequenzen hergestellt indem zunächst die in dem Vektor pGEMT enthaltenen cDNA-Fragmente so vom Plasmid amplifiziert wurden, dass jeweils am 3 ' -Ende der Sequenz eine Polymerase-Bindestelle vorlag, von der ausgehend anschließend der antisense-Strang durch in vitro-Transkription mittels einer T7 oder SP6 RNA Polymerase mit markierten UTPs synthetisiert werden konnte. In der PCR-Reaktion wurden als Primer M13reverse und M13universal Primer verwendet. Die Markierung der Sonde erfolgte mit Digogygenin oder Fluores- zein bzw. radioaktiv.To check differential gene expression in Northern analyzes, mRNA probes based on the BCI-3 (GenBank Acc.-No: AJ250282) and BCI-4 (GenBank Acc. -No.: AJ250283) cDNA sequences were prepared by first using the in the vector The cDNA fragments contained in pGEMT were amplified by the plasmid in such a way that a polymerase binding site was present at the 3 'end of the sequence, from which the antisense strand was then synthesized by in vitro transcription using a T7 or SP6 RNA polymerase with labeled UTPs could be. M13reverse and M13universal primers were used as primers in the PCR reaction. The probe was labeled with digogygenin or fluorescein or radioactive.
Das Insert der einzelnen Vektor wurde über PCR mit flankierenden Standard-Primern (M13 fwd und rev) amplifiziert. Die Reaktion lief dabei mit folgenden Endkonzentrationen in einem Gesamtvolumen von 50 μL PCR-Puffer (Silverstar) ab:The insert of the individual vectors was amplified by PCR with flanking standard primers (M13 fwd and rev). The reaction proceeded with the following final concentrations in a total volume of 50 μL PCR buffer (Silverstar):
M13-fwd: 5 ' -GTAAAACGACGGCCAGTG-3 ' (SEQ ID NO: 9)M13-fwd: 5 '-GTAAAACGACGGCCAGTG-3' (SEQ ID NO: 9)
M13-Rev: 5 ' -GGAAACAGCTATGACCATG-3 ' (SEQ ID NO : 10)M13-Rev: 5 '-GGAAACAGCTATGACCATG-3' (SEQ ID NO: 10)
10 % Dimethylsulfoxid (v/v) je 2 ng/μL Primer (M13 forward und reversed)10% dimethyl sulfoxide (v / v) each 2 ng / μL primer (M13 forward and reversed)
1,5 mM MgCl2,1.5 mM MgCl 2 ,
0,2 mM dNTPs,0.2 mM dNTPs,
4 Units Taq-Polymerase (Silverstar) ,4 units Taq polymerase (Silverstar),
2 ng/μL Plasmid-DNA. Die Amplifikation verlief in einem Thenaocycler (Perkin-Elmar 2400) temperaturgesteuert:2 ng / µL plasmid DNA. The amplification was temperature controlled in a thenaocycler (Perkin-Elmar 2400):
94°C 3 min Denaturierung94 ° C 3 min denaturation
30 Zyklen mit 94°C 30 sek (Denaturierung)30 cycles at 94 ° C for 30 seconds (denaturation)
58°C 30 sek (Annealing) ,58 ° C 30 sec (annealing),
72°C 1,2 min (Extension) ,72 ° C 1.2 min (extension),
72°C 5 min abschließende Extension72 ° C 5 min final extension
4°C Kühlung bis zur Weiterverarbeitung4 ° C cooling until further processing
Der Erfolg der Reaktion wurde im 1 %igen Agarosegel überprüft . Die Produkte wurden anschließend mit einem "High Pure PCR-Product Purification Kit" (Boehringer-Mannheim) aufgereinigt . Man erhielt etwa 40 μL Säuleneluat, das erneut im Gel überprüft und bei -20°C gelagert wurde.The success of the reaction was checked in a 1% agarose gel. The products were then purified using a "High Pure PCR Product Purification Kit" (Boehringer-Mannheim). About 40 μL column eluate was obtained, which was checked again in the gel and stored at -20 ° C.
Das Amplifikat wurde mit dem High Pure PCR-Product Purification Kit (Boehringer, Mannheim) nach Herstellerangaben aufgereingt und je 4 μL als Template für die Reaktion mit der entsprechenden DNA- abhängigen RNA-Polymerase (SP6- oder T7-Polymerase) eingesetzt. 4 μl gereinigtes PCR-Produkt wurden mit 2 μL Transskriptionspuf- fer, 2 μl NTP-Markierungsmix, 2 μl-NTP-Mix und 10 μl DEPC-Wasser versetzt. Anschließend wurden 2 μL der T7-RNA-Polymeraselösung zu pipettiert. Die Reaktion wurde dann 2 h bei 37°C durchgeführt und anschließend mit DEPC-Wasser auf 100 μL aufgefüllt. Die RNA-Sonde wurde im Ethidiumbromidgel detektiert und bei -20°C gelagert.The amplificate was cleaned up using the High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer, Mannheim) according to the manufacturer's instructions and 4 μL were used as templates for the reaction with the corresponding DNA-dependent RNA polymerase (SP6 or T7 polymerase). 4 μl of the purified PCR product were mixed with 2 μL of transcription buffer, 2 μl of NTP labeling mix, 2 μl of NTP mix and 10 μl of DEPC water. 2 μL of the T7 RNA polymerase solution were then pipetted in. The reaction was then carried out at 37 ° C. for 2 h and then made up to 100 μL with DEPC water. The RNA probe was detected in the ethidium bromide gel and stored at -20 ° C.
Der Reaktionsansatz (20 μL) für nicht-radioaktive Sonden wurde mit lx Digoxigenin- oder Fluorescein-RNA-Labeling Mix (Boehringer, Mannheim) , der für radioaktive Sonden mit je 1 mM ATP, GTP und CTP, sowie 25 μCi a 32P UTP, jeweils mit 40 u RNase-Inhibitor (Boehringer, Mannheim) und 40 u RNA-Polymerase in lx Transkripti- onspuffer (Boehringer, Mannheim) 2 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion für die nicht-radioaktive Markierung wurde durch Zugabe von 80 μL DEPC-Wasser abgestoppt und das Ergebnis im Agarosegel überprüft. Der Ansatz für die radioaktive Markierung wurde mit 30 μL DEPC-Wasser versetzt, die Sonde über MicroSpin G-25 Säulen (Amers- ham Pharmacia Biotech, Freiburg) aufgereinigt , und die Anzahl der radioaktiven Zerfälle in einem Aliquot gemessen (cpm, Multipur- pose Scintillation Counter, Coulter LS6500, Beckman, München) .The reaction mixture (20 μL) for non-radioactive probes was mixed with 1 × digoxigenin or fluorescein-RNA labeling mix (Boehringer, Mannheim), that for radioactive probes with 1 mM ATP, GTP and CTP, as well as 25 μCi a 32 P UTP , each with 40 u RNase inhibitor (Boehringer, Mannheim) and 40 u RNA polymerase in 1 x transcription buffer (Boehringer, Mannheim) incubated at 37 ° C for 2 h. The reaction for the non-radioactive labeling was stopped by adding 80 μL of DEPC water and the result was checked in the agarose gel. The approach for the radioactive labeling was mixed with 30 μL DEPC water, the probe was cleaned over MicroSpin G-25 columns (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg), and the number of radioactive decays measured in an aliquot (cpm, multipurpose Scintillation Counter, Coulter LS6500, Beckman, Munich).
Die RNA Polymerisation, die Hybridisierung und die Immunodetek- tion wurden weitestgehend nach Angaben des Herstellers des Kits zur nicht-radioaktiven RNA-Detektion durchgeführt (BIG System User's Guide, DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mann- heim, Kogel et al . (1994) Plant Physiol 106:1264-1277).The RNA polymerization, hybridization and immunodetection were largely carried out according to the manufacturer of the kit for non-radioactive RNA detection (BIG system User's Guide, DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim, Kogel et al. (1994) Plant Physiol 106: 1264-1277).
Zur Vorbereitung der Hybridisierung wurden die Membranen zunächst 5 3x 20 min bei 68°C in 2 x SSC { Sal t, Sodiumci räte) , 0,1 % SDS- Puffer ( Sodiumdodecylsulfate) geschwenkt. Die Membranen wurden anschließend an die Innenwand auf 68°C vorgeheizter Hybridisie- rungsröhren (Hybaid, Heidelberg) angelegt und 30 min mit 10 mL Dig-üasy-Hybridisierungspuffer im vorgeheizten Hybridisierungs-To prepare for the hybridization, the membranes were first swung for 5 3 × 20 min at 68 ° C. in 2 × SSC (salt, sodium cations), 0.1% SDS buffer (sodium dodecyl sulfate). The membranes were then placed on the inner wall of 68 ° C. preheated hybridization tubes (Hybaid, Heidelberg) and 30 min with 10 mL Dig-üasy hybridization buffer in the preheated hybridization
10 ofen inkubiert. Währenddessen wurden 10 μL Sondenlösung in 80 μL Hybridisierungspuffer bei 94°C für 5 min denaturiert, anschließend auf Eis gestellt und kurz zentrifugiert. Zur Hybridisierung wurde die Sonde dann in 10 mL 68°C warmem Hybridisierungspuffer überführt, und der Puffer in der Hybridisierungsröhre durch diesen10 ovens incubated. In the meantime, 10 μL probe solution in 80 μL hybridization buffer was denatured at 94 ° C. for 5 min, then placed on ice and briefly centrifuged. For hybridization, the probe was then transferred to 10 ml of 68 ° C. warm hybridization buffer, and the buffer in the hybridization tube through this
15 Sondenpuffer ersetzt. Die Hybridisierung erfolgte dann ebenfalls bei 68°C über Nacht.15 probe buffers replaced. The hybridization then also took place at 68 ° C. overnight.
Vor Immundetektion von RNA-RNA Hybriden wurden die Blots strin- gent zweimal für jeweils 20 min in 0.1 % (w/v) SDS, 0.1 x SSC bei 20 68°C gewaschen.Before immunodetection of RNA-RNA hybrids, the blots were washed strictly twice for 20 min each in 0.1% (w / v) SDS, 0.1 x SSC at 20 68 ° C.
Zur Immunodetektion wurden die Blots zunächst zweimal für 5 min bei RT in 2 x SSC, 0,1 % SDS geschwenkt. Anschließend erfolgten 2 stringente Waschschritte bei 68°C in 0,1 x SSC, 0,1 % SDS fürFor immunodetection, the blots were first swirled twice for 5 min at RT in 2 x SSC, 0.1% SDS. This was followed by 2 stringent washing steps at 68 ° C in 0.1 x SSC, 0.1% SDS for
25 je 15 min. Die Lösung wurde anschließend durch Waschpuffer ohne Tween ersetzt. Es wurde 1 min geschüttelt und die Lösung durch Blockingreagenz ausgetauscht. Nach weiteren 30 min Schütteln wurden 10 μL Anti-Fluoreszein-Antikörperlösung hinzugefügt und weitere 60 min geschüttelt. Es folgten zwei 15 minütige Wasch-25 each 15 min. The solution was then replaced with wash buffer without tween. It was shaken for 1 min and the solution was replaced by a blocking reagent. After shaking for a further 30 min, 10 μL of anti-fluorescein antibody solution were added and shaken for a further 60 min. This was followed by two 15 minute washing
30 schritte in Waschpuffer mit Tween. Die Membran wurde anschließend 2 min in Substratpuffer äquilibriert und nach Abtropfen auf eine Kopierfolie überführt. Auf der "RNA-Seite" der Membran wurde dann ein Gemisch aus 20 μL CDP-Star™ und 2 mL Substratpuffer gleichmäßig verteilt. Im Anschluss wurde die Membran mit einer zweiten30 steps in wash buffer with tween. The membrane was then equilibrated in substrate buffer for 2 min and, after dripping, transferred to a copy film. A mixture of 20 μL CDP-Star ™ and 2 mL substrate buffer was then evenly distributed on the “RNA side” of the membrane. The membrane was then replaced with a second
35 Kopierfolie abgedeckt und an den Rändern mit Hitze luftblasenfrei und wasserdicht verschweißt. Die Membran wurde dann in einer Dunkelkammer für 10 min mit einem Röntgenfilm bedeckt und dieser anschließend entwickelt. Je nach Stärke der Lumineszenzreaktion wurde die Belichtungszeit variiert.35 Copy film covered and heat-sealed at the edges with air bubbles and watertight. The membrane was then covered with an X-ray film in a dark room for 10 min and then developed. The exposure time was varied depending on the strength of the luminescence reaction.
4040
Durch Exposition eines Röntgenfilms (Kodak X-OMAT AR, Röntgen Bender, Baden-Baden) mit der eingeschweißten Membran wurde die Akkumulation des Transkriptes durch Schwärzung des Filmes nach dessen Entwicklung sichtbar (Entwickler G 153 A, SchnellfixierbadBy exposing an X-ray film (Kodak X-OMAT AR, Röntgen Bender, Baden-Baden) to the welded-in membrane, the accumulation of the transcript became visible through blackening of the film after its development (developer G 153 A, rapid fixer
45 G 354, Agfa, Röntgen Bender, Baden-Baden). Wenn nicht extra gekennzeichnet waren die Lösungen im Lieferumfang des Ki ts enthalten {DIG-Luminescence detection Ki t , Boehringer-Mannheim) . Alle anderen wurden aus folgenden Stammlösungen durch Verdünnung mit autoklaviertem, destilliertem Wasser hergestellt. Alle Stammlösungen wurden, wenn nicht anders spezifiziert, mit DEPC (wie DEPC-Wasser) angesetzt und anschließend autoklaviert .45 G 354, Agfa, Röntgen Bender, Baden-Baden). If not specifically marked, the solutions were included in the scope of delivery of the kit (DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim). All others were prepared from the following stock solutions by dilution with autoclaved, distilled water. Unless otherwise specified, all stock solutions were prepared with DEPC (like DEPC water) and then autoclaved.
DEPC-Wasser: Destilliertes Wasser wird über Nacht bei 37°C mit Diethylpyrokarbonat (DEPC, 0,1 %, w/v) behandelt und anschließend autoklaviert.DEPC water: Distilled water is treated overnight at 37 ° C with diethyl pyrocarbonate (DEPC, 0.1%, w / v) and then autoclaved.
10 x MOPS-Puffer: 0,2 M MOPS (Morpholin-3-propansulfonsäure) , 0,05 M Natriumacetat, 0,01 M EDTA, pH mit 10 M NaOH auf pH 7,0 eingestellt, 1 % [v/v] DEPC, autoklavieren. Geringer konzentrierter MOPS-Puffer wurde aus der stock-Lösung entsprechend mit autoklaviertem DEPC-Wasser verdünnt.10 x MOPS buffer: 0.2 M MOPS (morpholine-3-propanesulfonic acid), 0.05 M sodium acetate, 0.01 M EDTA, pH adjusted to pH 7.0 with 10 M NaOH, 1% [v / v] DEPC, autoclave. A small amount of concentrated MOPS buffer was correspondingly diluted with autoclaved DEPC water from the stock solution.
20 x SSC (Natriumchlorid-Natriumcitrat, Sal t-Sodiumci trate) : 3 M NaClo, 0.3 M triNatriumcitrat x 2 H20, pH mit 4 M HCI auf pH 7 , 0 eingestellt.20 x SSC (sodium chloride-sodium citrate, Sal t-sodium citrate): 3 M NaClo, 0.3 M trisodium citrate x 2 H 2 0, pH adjusted to pH 7 with 4 M HCl.
1 % SDS (Natriumdodecylsufat, SodiumdodecyIsu2.fate) Natriumdo- decylsulfat (w/v) , ohne DEPC1% SDS (sodium dodecyl sulfate, sodium dodecy isu2.fate) sodium decyl sulfate (w / v), without DEPC
RNA-Probenpuffer : 760 μL Formamid, 260 μL Formaldehyd, 100 μL Ethidiumbromid (10 mg/mL in DEPC-Wasser), 80 μL Glycerol, 80 μL Bromphenolblau (gesättigt) , 160 μL 10 x MOPS, 100 μL WasserRNA sample buffer: 760 μL formamide, 260 μL formaldehyde, 100 μL ethidium bromide (10 mg / mL in DEPC water), 80 μL glycerol, 80 μL bromophenol blue (saturated), 160 μL 10 x MOPS, 100 μL water
10 x Waschpuffer ohne Tween: 1,0 M Maleinsäure, 1,5 M NaCl; ohne DEPC, mit NaOH (fest, ca. 77 g) und 10 M NaOH auf pH 7 , 5 einstellen.10 x wash buffer without tween: 1.0 M maleic acid, 1.5 M NaCl; without DEPC, adjust to pH 7.5 with NaOH (solid, approx. 77 g) and 10 M NaOH.
- Waschpuffer mit Tween: aus Waschpuffer ohne Tween mit Tween (0,3 %, v/v)- Wash buffer with tween: from wash buffer without tween with tween (0.3%, v / v)
- 10 x Blockingreagenz : 50 g Blockingpulver (Boehringer-Mannheim) in 500 mL Waschpuffer ohne Tween suspendieren.- 10 x blocking reagent: Suspend 50 g blocking powder (Boehringer-Mannheim) in 500 mL wash buffer without Tween.
- Substratpuffer : 100 mM Tris (Trishydroxymethylamino-methan) , 150 mM NaCl mit 4 M HCI auf pH 9 , 5 einstellen.- Substrate buffer: adjust 100 mM Tris (trishydroxymethylamino-methane), 150 mM NaCl with 4 M HCl to pH 9.5.
10 x Farbmarker: 50 % Glycerol (v/v), 1,0 mM EDTA pH 8,0, 0,25 % Bromphenolblau (w/v), 0,25 % Xylencyanol (w/v). Für radioaktive Northern-Analysen erfolgte die Prähybridisierung der Membran mindestens 30 min in 10 mL lx Hybridisierungspuffer . Für die Hybridisierung wurde jeweils ein Volumen der Sonde entsprechend ca. 300000-400000 cpm/mL nach Denaturierung in Hybridi- sierungs-Puffer (5 min bei 90°C) in einer Hybridisierungsröhre eingesetzt. Anschließend wurde erst 2x 5 min mit 2x SSC, 0,1 % SDS in der Röhre und dann solange mit 0 , lx SSC, 0,1 % SDS im Wasserbad bei Hybridisierungstemperatur gewaschen, bis kein radioaktiver Hintergrund mehr mit dem Handmonitor zu detektieren war. Die Membranen wurden in Frischhaltefolie geschlagen oder in Plastikbeutel eingeschweißt und mit einem Röntgenfilm (Kodak X-OMAT AR, Röntgen Bender, Baden-Baden) oder einem Phosphorscreen (Kodak Imaging Screen-K, Bio-Rad, München) exponiert. Die Röntgenfilme wurden nach variabler Expositionszeit entwickelt (s.o.), die Phosphorscreens im Phosphorimager (Molecular Imager FX, Bio-Rad, München) ausgelesen und mit dem Programm Quantity One-4.1.1 (Bio- Rad, München) in einer Auflösung von 200 μm dokumentiert.10 x color markers: 50% glycerol (v / v), 1.0 mM EDTA pH 8.0, 0.25% bromophenol blue (w / v), 0.25% xylenecanol (w / v). For radioactive Northern analyzes, the membrane was prehybridized for at least 30 min in 10 mL lx hybridization buffer. For the hybridization, a volume of the probe corresponding to approx. 300000-400000 cpm / mL was used in a hybridization tube after denaturation in hybridization buffer (5 min at 90 ° C). The mixture was then washed twice for 5 min with 2x SSC, 0.1% SDS in the tube and then with 0.1 x SSC, 0.1% SDS in a water bath at hybridization temperature until no radioactive background could be detected with the hand monitor. The membranes were wrapped in cling film or sealed in plastic bags and exposed to an X-ray film (Kodak X-OMAT AR, Röntgen Bender, Baden-Baden) or a phosphor screen (Kodak Imaging Screen-K, Bio-Rad, Munich). The X-ray films were developed after a variable exposure time (see above), the phosphor screens were read out in the phosphor imager (Molecular Imager FX, Bio-Rad, Munich) and with the Quantity One-4.1.1 program (Bio-Rad, Munich) in a resolution of 200 μm documented.
5x Hybridisierungspuffer : 1 % BSA (bovine serum albumin) (w/v) , 1 % Polyvinylpyrrolidon 10 bis 40 kDa (w/v) , 1 % Ficoll 1400000 (w/v), 250 mM TrisCl pH 7,5 (0,8 M Stammlösung, autoklaviert), 0,5 % Tetra-Na-diphosphat-Decahydrat (w/v), 5 % SDS (sodiumdode- cylsulfate) (w/v), sterilfiltriert (0,45 μm) , mit autoklav. Wasser auffüllen, lx Hybridisierungspuffer wird aus 5x Hybridisie- rungspuffer mit DEPC-Wasser verdünnt.5x hybridization buffer: 1% BSA (bovine serum albumin) (w / v), 1% polyvinylpyrrolidone 10 to 40 kDa (w / v), 1% Ficoll 1400000 (w / v), 250 mM TrisCl pH 7.5 (0, 8 M stock solution, autoclaved), 0.5% tetra-sodium diphosphate decahydrate (w / v), 5% SDS (sodium dodecyl sulfate) (w / v), sterile filtered (0.45 μm), with autoclave. Fill up water, lx hybridization buffer is diluted from 5x hybridization buffer with DEPC water.
Membranen, die bereits mit einer Sonde hybridisiert worden waren, konnten durch "strippen" erneut für eine Hybridisierung mit einer weiteren Sonde verwendet werden. Digoxigenin- oder Fluorescein- markierte Sonden wurden durch Waschen in A. bidest. (1 min bei RT) und anschließende Inkubation der Membranen mit aufgekochtem 0,1 %igem SDS (w/v) (10 min bei RT) entfernt. Radioaktiv markierte Sonden wurden durch Waschen in 1 % SDS (w/v) , 50 % Formamid (v/v) für 20 bis 40 min bei 80°C vollständig von den Membranen gelöst.Membranes that had already been hybridized with one probe could be "stripped" again for hybridization with another probe. Digoxigenin or fluorescein labeled probes were washed by washing in A. bidest. (1 min at RT) and subsequent incubation of the membranes with boiled 0.1% SDS (w / v) (10 min at RT) removed. Radioactively labeled probes were completely detached from the membranes by washing in 1% SDS (w / v), 50% formamide (v / v) for 20 to 40 min at 80 ° C.
Beispiel 4: Klonierung des Promotors der BCI-3 Gens aus GersteExample 4: Cloning of the promoter of the BCI-3 gene from barley
Der Promotor des BCI-3 Gens aus Gerste wurde mittels der inversen Polymerasekettenreaktion (iPCR) ausgehend von genomischer DNA aus Gerste (Sorte Ingrid) isoliert. Zur Gewinnung der genomischen DNA wurden 400 bis 500 mg Blattmaterial (cv. Ingrig WT) mit flüssigen Stickstoff gemörsert und die genomische DNA dann mit Nucleobond- Säulen AXG 500 (Macherey & Nagel) extrahiert. Vor der PCR wurden zunächst jeweils 750 ng genomische DNA (aus der Gerstensorte cv. Ingrid) mit den Restriktionsendonukleasen EcoRV, Ncol, Rsal, Eco91I oder BamHI (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) geschnitten. Dazu wurde in einem Gesamtvolumen von 5 100 μl die DNA mit 30 units Enzym im Puffer nach Herstellerangaben für 4 h bei 37°C inkubiert. Im Anschluss folgte eine Fällung der DNA mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat-Puffer (pH 5,2) und 2,5 Volumen Ethanol über Nacht bei -20°C. Nach Zentrifugation (30' min, 14.000 rpm (20.000 g) , 4°C) wurde das Pellet mit Ethanol (70 %) 0 gewaschen, getrocknet und in 50 μl H20 resuspendiert. Für den anschließenden Ligationsansatz in einem Gesamtvolumen von 400 μl wurde zu den 50 μl geschnittener DNA noch 310 μl H20, 40 μl lOx Ligationspuffer und 1 μl T4 Ligase [3 Weiss units/μl] (Promega) hinzugegeben. Dieser Ansatz wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. 5 Anschließend wurde die Ligase bei 65°C für 10 min inaktiviert. An die Ligation schloss sich wieder eine Fällung mit 0,1 Volumen Natriumacetat-Puffer (pH 5,2) und 2,5 Volumen Ethanol an. Nach Zentrifugation (30 min, 14000 rpm (20000 g) , 4°C) wurde das Pellet mit Ethanol (70 %) gewaschen, getrocknet und in 80 μl H20 resus- 0 pendiert. 3 μl hiervon wurde für die iPCR als Template verwendet.The promoter of the BCI-3 gene from barley was isolated by means of the inverse polymerase chain reaction (iPCR) starting from genomic DNA from barley (variety Ingrid). To obtain the genomic DNA, 400 to 500 mg of leaf material (cv. Ingrig WT) were ground with liquid nitrogen and the genomic DNA was then extracted with AXG 500 nucleobond columns (Macherey & Nagel). Before the PCR, 750 ng of genomic DNA (from the barley variety cv. Ingrid) were cut with the restriction endonucleases EcoRV, Ncol, Rsal, Eco91I or BamHI (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany). For this purpose, the DNA was incubated in a total volume of 5 100 μl with 30 units of enzyme in the buffer for 4 h at 37 ° C. according to the manufacturer's instructions. This was followed by precipitation of the DNA with 0.1 volume of 3 M sodium acetate buffer (pH 5.2) and 2.5 volumes of ethanol overnight at -20 ° C. (30 'min, 14,000 rpm (20,000 g), 4 ° C) After centrifugation, the pellet was washed with ethanol (70%) 0 washed, dried and resuspended in 50 ul H 2 0th For the subsequent ligation batch in a total volume of 400 μl, 310 μl H20, 40 μl lOx ligation buffer and 1 μl T4 ligase [3 Weiss units / μl] (Promega) were added to the 50 μl cut DNA. This approach was incubated overnight at 4 ° C. 5 The ligase was then inactivated at 65 ° C. for 10 min. The ligation was followed by precipitation with 0.1 volume of sodium acetate buffer (pH 5.2) and 2.5 volume of ethanol. After centrifugation (30 min, 14000 rpm (20,000 g), 4 ° C.), the pellet was washed with ethanol (70%), dried and suspended in 80 μl H 2 0 resus 0. 3 μl of this was used as a template for the iPCR.
Die iPCR wurde als Standard-PCR durchgeführt. Dazu wurde zunächst im ersten Schritt eine PCR unter Verwendung des Primerpaars 1 (SEQ ID NO : 3 und 4) mit Pfu-Polymerase (Promega) durch geführt. 5 Das Amplifikat wurde in einem zweiten Schritt unter Verwendung des innenliegenden ("nested") Primerpaars 2 (SEQ ID NO : 5 und 6) mit der Taq-Polymerase erneut amplifiziert. Nachfolgend wurde das PCR-Produkt in pGEM-T (Promega) einkloniert und sequenziert. Von der Sequenzinformation ausgehend wurden die Primerpaare 3 und 4 0 abgeleitet. Für die nächste PCR wurden - wieder unter Einsatz der verdauten, ligierten genomischen DNA - die Primer-Paare 3 und 4 wie oben beschrieben eingesetzt und das PCR-Produkt in pGEM-T (Promega) einkloniert und sequenziert. Von der Sequenzinformation ausgehend wurden die Primerpaare 5 und 6 abgeleitet . Für die nächste PCR wurden - wieder unter Einsatz der verdauten, ligierten genomischen DNA - die Primer-Paare 5 und 6 wie oben beschrieben eingesetzt. Das PCR-Produkt wurde aus einem Agarosegel isoliert und in den pGEM-T-Vektor (Promega, Mannheim, Deutschland) mittels T-Überhang-Ligation kloniert. Die cDNAs wurden ausgehend von der Plasmid-DNA unter Verwendung des "Thermo Sequenase Fluo- rescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit" (Amersham, Freiburg, Deutschland) sequenziert.The iPCR was carried out as a standard PCR. For this purpose, in the first step a PCR was carried out using the primer pair 1 (SEQ ID NO: 3 and 4) with Pfu polymerase (Promega). 5 In a second step, the amplificate was re-amplified with the Taq polymerase using the nested primer pair 2 (SEQ ID NO: 5 and 6). The PCR product was then cloned into pGEM-T (Promega) and sequenced. Primer pairs 3 and 40 were derived from the sequence information. For the next PCR - again using the digested, ligated genomic DNA - the primer pairs 3 and 4 were used as described above and the PCR product was cloned into pGEM-T (Promega) and sequenced. Primer pairs 5 and 6 were derived from the sequence information. For the next PCR - again using the digested, ligated genomic DNA - the primer pairs 5 and 6 were used as described above. The PCR product was isolated from an agarose gel and cloned into the pGEM-T vector (Promega, Mannheim, Germany) by means of T-overhang ligation. The cDNAs were sequenced from the plasmid DNA using the "Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit" (Amersham, Freiburg, Germany).
Primerpaar 1 : PP1-5: 5 ' -CTC GCA GTT GGC CGG CAC CGT-3 ' SEQ ID NO: 11 PP1-3: 5' -TGA CCC CAT GTA CTA CAT CGCCT-3 ' SEQ ID NO: 12 Primerpaar 2 :Primer pair 1: PP1-5: 5 '-CTC GCA GTT GGC CGG CAC CGT-3' SEQ ID NO: 11 PP1-3: 5 '-TGA CCC CAT GTA CTA CAT CGCCT-3' SEQ ID NO: 12 Primer pair 2:
PP2-5: 5'-CTT CCA GTC CCG CAC GTT GTA C-3 ' SEQ ID NO: 13PP2-5: 5'-CTT CCA GTC CCG CAC GTT GTA C-3 'SEQ ID NO: 13
PP2-3: 5' -GTC GGT TGC GGC TAT TTG ATT GC-3 ' SEQ ID NO: 14PP2-3: 5 '-GTC GGT TGC GGC TAT TTG ATT GC-3' SEQ ID NO: 14
Primerpaar 3 :Primer pair 3:
PP3-5: 5'-AGC CAT CAT CCC TGC GGA TCC A-3 ' SEQ ID NO: 15 PP3-3: 5 '-GAG CGT CCG GGC GCG GCC TT-3 ' SEQ ID NO: 16PP3-5: 5'-AGC CAT CAT CCC TGC GGA TCC A-3 'SEQ ID NO: 15 PP3-3: 5' -GAG CGT CCG GGC GCG GCC TT-3 'SEQ ID NO: 16
Primerpaar 4 : PP4-5 : 5 ' -GGA TCC AAG CGA GAT TTG AAC GGA-3 ' SEQ ID NO: 17 PP4-3 : 5 ' -GCG GCC TTG CCG GAC GCG GT-3 ' SEQ ID NO: 18Primer pair 4: PP4-5: 5 '-GGA TCC AAG CGA GAT TTG AAC GGA-3' SEQ ID NO: 17 PP4-3: 5 '-GCG GCC TTG CCG GAC GCG GT-3' SEQ ID NO: 18
Primerpaar 5 :Primer pair 5:
PP5-5: 5' -GTA TGC CGC TCC ATG TTA GAA GAT-3 ' SEQ ID NO: 19 PP5-3: 5 ' -ACA TTA CAG GCA GCG TCC GAC AC-3 ' SEQ ID NO: 20PP5-5: 5 '-GTA TGC CGC TCC ATG TTA GAA GAT-3' SEQ ID NO: 19 PP5-3: 5 '-ACA TTA CAG GCA GCG TCC GAC AC-3' SEQ ID NO: 20
Primerpaar 6 :Primer pair 6:
PP6-5: 5'-ACT CAT GCC GGT GCA GAT CTT CG-3 ' SEQ ID NO: 21PP6-5: 5'-ACT CAT GCC GGT GCA GAT CTT CG-3 'SEQ ID NO: 21
PP6-3: 5' -ATG CGG GGA TGA GGA GGA CAT G-3 ' SEQ ID NO: 22PP6-3: 5 '-ATG CGG GGA TGA GGA GGA CAT G-3' SEQ ID NO: 22
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (25 μl) :Composition of the PCR mix (25 μl):
3, 00 μl Template3, 00 ul template
2,50 μl 10 x Puffer (Pfu- bzw. Taq-Puffer)2.50 μl 10 x buffer (Pfu or Taq buffer)
2,50 μl dNTP^s [2 mM of each] 0,75 μl MgCl2 2.50 µl dNTP ^ s [2 mM of each] 0.75 µl MgCl 2
1,25 μl 5 '-Primer (10 pmol/μL)1.25 μl 5 'primer (10 pmol / μL)
1,25 μl 3 '-Primer (10 pmol/μL)1.25 μl 3 'primer (10 pmol / μL)
0,15 μl Pfu- bzw. Taq-Polymerase0.15 ul Pfu or Taq polymerase
PCR-Programm:PCR program:
Anfangsdenaturierung für 4 min bei 95°C. 35 Zyklen mit 1,0 min 95°C, 0,5 min 70°C und 3,0 min 72°C. Abschließende Extention von 5 min bei 72°C.Initial denaturation for 4 min at 95 ° C. 35 cycles with 1.0 min 95 ° C, 0.5 min 70 ° C and 3.0 min 72 ° C. Final extension of 5 min at 72 ° C.
Die Sequenz des BCI-3 Promotors wurde mit Hilfe des Computer- Programms Genedoc alignt aus den jeweils erhaltenen Sequenzen zusammengesetzt und ist unter SEQ ID NO: 1 wiedergegeben. Die gesamte Promotorsequenz wurde unter Verwendung der untengenannten PCR-Bedingungen amplifiziert. Dabei kamen nachfolgende Primer zum Einsatz :The sequence of the BCI-3 promoter was composed using the computer program Genedoc align from the sequences obtained in each case and is reproduced under SEQ ID NO: 1. The entire promoter sequence was amplified using the PCR conditions below. The following primers were used:
BCI3-5 (SEQ ID NO: 23): 5 ' -aagcttcaccaactcccttcaaggtctaa-3 'BCI3-5 (SEQ ID NO: 23): 5 '-aagcttcaccaactcccttcaaggtctaa-3'
BCI3-3 (SEQ ID NO : 24): 5 ' -ctgcagtgtgtgtgcttgctgtgatgc-3 ' Zusammensetzung des PCR-Ansatzes: 3, 00 μl Template 2,50 μl 10 x Puffer 2,50 μl dNTP s [2mM of each] 0,75 μl MgCl2 BCI3-3 (SEQ ID NO: 24): 5 '-ctgcagtgtgtgtgcttgctgtgatgc-3' Composition of the PCR mixture: 3.00 μl template 2.50 μl 10 × buffer 2.50 μl dNTP s [2mM of each] 0.75 μl MgCl 2
1,25 μl BCI3-5 (10 pmol/μL) 1,25 μl BCI3-3 (10 pmol/μL) 0,15 μl 0,2 μl QiagenTAG (5 u/μL)1.25 μl BCI3-5 (10 pmol / μL) 1.25 μl BCI3-3 (10 pmol / μL) 0.15 μl 0.2 μl QiagenTAG (5 u / μL)
PCR-Programm:PCR program:
Anfangsdenaturierung für 4 min bei 95°C. 35 Zyklen mit 0,5 min 95°C, 0,5 min 62°C und 2 min 72°C. Abschließende Extention von 5 min bei 72°C.Initial denaturation for 4 min at 95 ° C. 35 cycles with 0.5 min 95 ° C, 0.5 min 62 ° C and 2 min 72 ° C. Final extension of 5 min at 72 ° C.
Das PCR-Produkt über T-Überhangsligation in pGEM-T [Promega) kloniert .The PCR product was cloned into TG overhang ligation in pGEM-T [Promega).
Beispiel 5 : Herstellung von Deletionsvarianten des BCI-3 PromotorsExample 5: Preparation of deletion variants of the BCI-3 promoter
Die Deletionsvarianten wurden mit Hilfe von PCR (Standard-PCR) hergestellt. Hierfür dienten Primer mit Schnittstellen (unterstrichene Bereiche = Schnittstellen) , um so das umklonieren zu erleichtern. Folgende Primer wurden verwendet:The deletion variants were produced using PCR (standard PCR). Primers with interfaces (underlined areas = interfaces) were used to facilitate the recloning. The following primers were used:
Zur Amplifikation der "300bp"-Promotordeletionsvariante :To amplify the "300bp" promoter deletion variant:
P300-5 (SEQ ID NO: 25 : 5 ' -aagcttcgcatccctaacatgg-3 ' BCI3-3 (SEQ ID NO: 24 : 5 ' -ctg^cagtgtgtgtgcttgctgctgtgatgc-3 'P300-5 (SEQ ID NO: 25: 5 '-aagcttcgcatccctaacatgg-3' BCI3-3 (SEQ ID NO: 24: 5 '-ctg ^ cagtgtgtgtgcttgctgctgtgatgc-3'
Zur Amplifikation der "600bp"-Promotordeletionsvariante: P600-5 (SEQ ID NO: 26 : 5' -aag_ctttagctccgttcccatgatct-3 ' BCI3-3 (SEQ ID NO: 24 5 ' -ctjcag.tgtgtgtgcttgctgctgtgatgc-3 'To amplify the "600bp" promoter deletion variant: P600-5 (SEQ ID NO: 26: 5 '-aag_ctttagctccgttcccatgatct-3' BCI3-3 (SEQ ID NO: 24 5 '-ctjcag.tgtgtgtgcttgctgctgtgatgc-3'
Zur Amplifikation der "90Obp"-Promotordeletionsvariante : P900-5 (SEQ ID NO: 27 : 5 ' -aagcttggctaatatgcgcgtaaaa-3 'To amplify the "90Obp" promoter deletion variant: P900-5 (SEQ ID NO: 27: 5 '-aagcttggctaatatgcgcgtaaaa-3'
BCI3-3 (SEQ ID NO: 24 : 5 ' -ctacagtgtgtgtgcttgctgctgtgatgc-3 'BCI3-3 (SEQ ID NO: 24: 5 '-ctacagtgtgtgtgcttgctgctgtgatgc-3'
Zur Amplifikation der "1200bp"-Promotordeletionsvariante : P1200-5 (SEQ ID NO: 28): 5 ' -aacrcttccrtccaattctaqcratαatcratqc-3 ' BCI3-3 (SEQ ID NO: 24): 5 ' -ctgcagtgtgtgtgcttgctgctgtgatgc-3 'To amplify the "1200bp" promoter deletion variant: P1200-5 (SEQ ID NO: 28): 5 '-aacrcttccrtccaattctaqcratαatcratqc-3' BCI3-3 (SEQ ID NO: 24): 5 '-ctgcagtgtgtgtgcttgctgctgtgatgc-3'
Zusammensetzung des PCR-Ansatzes :Composition of the PCR approach:
3,00 μl Template3.00 ul template
2,50 μl 10 x Puffer 2,50 μl dNTPxs [2mM of each]2.50 μl 10 x buffer 2.50 μl dNTP x s [2mM of each]
0,75 μl MgCl2 0.75 µl MgCl 2
1,25 μl 5 '-Primer (10 pmol/μL) 1,25 μl 3 '-Primer (10 pmol/μL) 0,15 μl 0,2 μl QiagenTAG (5 u/μL)1.25 μl 5 'primer (10 pmol / μL) 1.25 μl 3 'primer (10 pmol / μL) 0.15 μl 0.2 μl QiagenTAG (5 u / μL)
PCR-Programm:PCR program:
Anfangsdenaturierung für 4 min bei 95°C. 35 Zyklen mit 0,5 min 95°C, 0,5 min 58°C und 2 min 72°C. Abschließende Extention von 5 min bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden dann in pGEM-T kloniert.Initial denaturation for 4 min at 95 ° C. 35 cycles with 0.5 min 95 ° C, 0.5 min 58 ° C and 2 min 72 ° C. Final extension of 5 min at 72 ° C. The PCR products were then cloned into pGEM-T.
Beispiel 6 : Klonierung es BCI-4 PromotorsExample 6: Cloning of the BCI-4 promoter
Die Sequenz des BCI-4 Promotors wurde mit Hilfe eines BCI4-BAC (BAC-Nr. 266D20; zur Verfügung gestellt durch IPK, Gatersleben, Deutschland) aufgeklärt. Der BAC-Klon wurde unter Verwendung der BCI-4 cDNA als Sonde in der dem Fachmann vertrauten Weise in einer genomischen Gersten BAC-Bibliothek identifiziert. Durch Anwendung der Methode des Primerwalkings wurde schließlich die Sequenz des BCI-4 Promotors ermittelt, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.The sequence of the BCI-4 promoter was elucidated using a BCI4-BAC (BAC No. 266D20; provided by IPK, Gatersleben, Germany). The BAC clone was identified using the BCI-4 cDNA as a probe in a manner familiar to those skilled in the barley genomic BAC library. The sequence of the BCI-4 promoter, which is shown in SEQ ID NO: 2, was finally determined using the method of primer walking.
Für die Sequenzierung wurden nachfolgende Primer verwendet:The following primers were used for sequencing:
OPN1 5 ' -TGA ATG GTC ATG GCT GCT TA-3 ' ( SEQ ID NO : 29 ) OPN2 5' -GGC TCT GAA TCG CAC ATT CT-3 ' ( SEQ ID NO : 30 ) OPN3 5' -GTA CCT CTC CTC CCC GCT CAC T-3 ( SEQ ID NO : 31 ) OPN4 5 ' -GCC TCG TTG TAA CGG GTA CT-3 ' ( SEQ ID NO : 32 ) OPN5 5 ' -TCATGCATATCTATGTCTTTCTCTTC-3 ' ( SEQ ID NO : 33 ) OPN6 5'-AAA CGA TTC GCT GCA AAA AT-3 ' ( SEQ ID NO : 34 ) OPN7 5 ' -GTA CCT CTC CCC GCT CAC T-3 ' ( SEQ ID NO : 35 )OPN1 5 '-TGA ATG GTC ATG GCT GCT TA-3' (SEQ ID NO: 29) OPN2 5 '-GGC TCT GAA TCG CAC ATT CT-3' (SEQ ID NO: 30) OPN3 5 '-GTA CCT CTC CTC CCC GCT CAC T-3 (SEQ ID NO: 31) OPN4 5 '-GCC TCG TTG TAA CGG GTA CT-3' (SEQ ID NO: 32) OPN5 5 '-TCATGCATATCTATGTCTTTCTCTTC-3' (SEQ ID NO: 33) OPN6 5'-AAA CGA TTC GCT GCA AAA AT-3 '(SEQ ID NO: 34) OPN7 5' -GTA CCT CTC CCC GCT CAC T-3 '(SEQ ID NO: 35)
Dabei wurde aus den Sequenzinformationen die unter Verwendung des einen Primers (z.B. OPN1) erhalten wurden, jeweils der nachfolgende Primer (z.B. 0PN2) abgeleitet.The following primer (e.g. 0PN2) was derived from the sequence information obtained using one primer (e.g. OPN1).
Die Sequenz des BCI-4 Promotors wurde mit Hilfe des Computer- Programms Genedoc alignt aus den jeweils erhaltenen Sequenzen zusammengesetzt und ist unter SEQ ID NO : 2 wiedergegeben. Die gesamte Promotorsequenz wurde unter Verwendung der unten genannten PCR-Bedingungen amplifiziert. Dabei kamen nachfolgende Primer zum Einsatz:The sequence of the BCI-4 promoter was composed using the computer program Genedoc align from the sequences obtained in each case and is reproduced under SEQ ID NO: 2. The entire promoter sequence was amplified using the PCR conditions below. The following primers were used:
BCI4-5 (SEQ ID NO: 36): 5 ' -agcgaatcgtttttcccttt-3 ' BCI4-3 (SEQ ID NO: 37): 5 ' -cctgagtgtacggctctgagatg-3 ' Zusammensetzung des PCR-Ansatzes :BCI4-5 (SEQ ID NO: 36): 5 '-agcgaatcgtttttcccttt-3' BCI4-3 (SEQ ID NO: 37): 5 '-cctgagtgtacggctctgagatg-3' Composition of the PCR approach:
3,00 μl Template3.00 ul template
2,50 μl 10 x Puffer 2,50 μl dNTP^s [2mM of each]2.50 μl 10 x buffer 2.50 μl dNTP ^ s [2mM of each]
0,75 μl MgCl2 0.75 µl MgCl 2
1,25 μl BCI4-5 (10 pmol/μL)1.25 μl BCI4-5 (10 pmol / μL)
1,25 μl BCI4-3 (10 pmol/μL)1.25 μl BCI4-3 (10 pmol / μL)
0,15 μl 0,2 μl QiagenTAG (5 u/μL)0.15 μl 0.2 μl QiagenTAG (5 u / μL)
PCR-Progra m:PCR program:
Anfangsdenaturierung für 4 min bei 95°C. 35 Zyklen mit 0,5 min 95°C, 0,5 min 58°C und 1 min 72°C. Abschließende Extention von 5 min bei 72°C.Initial denaturation for 4 min at 95 ° C. 35 cycles with 0.5 min 95 ° C, 0.5 min 58 ° C and 1 min 72 ° C. Final extension of 5 min at 72 ° C.
Das PCR-Produkt wurde aus einem Agarosegel isoliert und in den pGEM-T-Vektor (Promega, Mannheim, Deutschland) mittels T-Über- hang-Ligation kloniert. Die cDNAs wurden ausgehend von der Plas- mid-DNA unter Verwendung des "Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit" (Amersham, Freiburg, Deutschland) sequenziert.The PCR product was isolated from an agarose gel and cloned into the pGEM-T vector (Promega, Mannheim, Germany) by means of T-overhang ligation. The cDNAs were sequenced from the plasmid DNA using the "Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit" (Amersham, Freiburg, Germany).
Das PCR-Produkt über T-Überhangsligation in pGEM-T (Promega) kloniert und sequenziert.The PCR product was cloned and sequenced in pGEM-T (Promega) via T overhang ligation.
Beispiel 7: Konstruktion der Promotor-Reporter-Konstrukte .Example 7: Construction of the promoter-reporter constructs.
Aus dem Plasmid pGYl-GFP (Vektor auf pUC18-Basis, CaMV 35S- Promoter/Terminator-Kassette mit insertiertem GFP-Gen; Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; zur Verfügung gestellt von Dr. P. Schweizer, Institut für Pflanzengenetik IPK, Gatersleben, Deutschland) wurde das GFP-Gen mit dem Restriktionsenzym Kpnl herausgeschnitten und in den Vektor pUC18 ligiert . Die gewünschte Orientierung des Reportergens wurde mit Hilfe von Restriktionsverdaus bestimmt. Der Vektor erhielt die Bezeichnung pGFP.From the plasmid pGYl-GFP (vector based on pUC18, CaMV 35S promoter / terminator cassette with inserted GFP gene; Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; provided by Dr P. Schweizer, Institute of Plant Genetics IPK, Gatersleben, Germany) the GFP gene was cut out with the restriction enzyme Kpnl and ligated into the vector pUC18. The desired orientation of the reporter gene was determined using restriction digests. The vector was named pGFP.
Der BCI-4 Promotor wurde als Ncol/Pstl-Fragment aus pGEM-T aus- geschnitten. Dabei wurde zunächst mit Ncol verdaut und die Ncol- Site wurde mit Hilfe des Klenow-Fragments aufgefüllt. Folgender -Ansatz wurde dazu zusammenpipettiert : 16 μl DNA (aus dem Gel eluiert) , 2 μl T4 Ligations-Puffer, 1 μl dNTP's [2 mM] , 1 μl Klenow-Fragment . Dieser Ansatz wurde 30 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Reaktion bei 65°C für 10 min gestoppt. Anschlie- Send wurde mit PstI verdaut und das so erhaltene Fragment in den mit PstI und Smal verdauten pGFP (s.u.) ligiert.The BCI-4 promoter was cut out of pGEM-T as an Ncol / PstI fragment. It was first digested with Ncol and the Ncol site was filled in using the Klenow fragment. The following batch was pipetted together: 16 ul DNA (eluted from the gel), 2 ul T4 ligation buffer, 1 ul dNTP's [2 mM], 1 ul Klenow fragment. This approach was incubated at 37 ° C for 30 min. The reaction was then stopped at 65 ° C. for 10 minutes. subse- Send was digested with PstI and the fragment thus obtained was ligated into the pGFP (see below) digested with PstI and Smal.
Die verschiedenen BCI-3 Promotorsequenzen wurden aus den pGEMT- Vektoren mit dem BCI-3 Promotor bzw. den BCI-3 Promotor Deletionsvarianten mit HindiII und PstI herausgeschnitten, über ein Gel gereinigt und in den Hindlll/Pstl-verdauten pGFP Vektor inser- tiert . Die verschiedenen Konstrukte sind schematisch in Fig. 1 dargestellt .The various BCI-3 promoter sequences were cut out of the pGEMT vectors with the BCI-3 promoter or the BCI-3 promoter deletion variants with HindiII and PstI, purified using a gel and inserted into the HindIII / PstI digested pGFP vector. The various constructs are shown schematically in FIG. 1.
Beispiel 9 : Induktion des BCI-3 und BCI-4 PromotersExample 9: Induction of the BCI-3 and BCI-4 Promoters
Die Induktion des BCI-3 Promotors, der Deletionsvarianten und des BCI-4 Promotors wurde unter Verwendung verschiedener Stimuli untersucht . Die Induktion wurde entweder mittels Northern-Blot- analyse unter Detektion der endogenen BCI-3 bzw. BCI-4 mRNA realisiert, oder unter Verwendung der oben beschriebenen Prσmotor- Reporter-Konstrukte gezeigt.The induction of the BCI-3 promoter, the deletion variants and the BCI-4 promoter was examined using different stimuli. The induction was either realized by means of Northern blot analysis with detection of the endogenous BCI-3 or BCI-4 mRNA, or was shown using the Prσmotor reporter constructs described above.
Alle Behandlungen wurden an 5 bis 8 Tage alten Gerstenkeimlingen (cv. Ingrid WT) durchgeführt. Behandelte Pflanzen (je 5 in einem Topf) wurden in Klimaschränken oder -kammem weiter kultiviert (s.o) .All treatments were carried out on 5 to 8 day old barley seedlings (cv. Ingrid WT). Treated plants (5 in a pot each) were further cultivated in climatic chambers or chambers (see above).
a) DCINA-Induktion: 2, 6-Dichlorisonikotinsäure (DCINA, CGA41396, Syngenta, Basel, Schweiz) wurde als Formulierung von 25 % aktiver Substanz mit wettable powder (WP) oder nach Vorlösen der Reinsubstanz mit Dirne hylformamid (DMF) in wässriger Lösung (1 % DMF) mit NaOH auf pH 7 eingestellt und in Kon- zentrationen von 5 und 10 mg/1 (entspricht 0,02 bzw. 0,04 M) bezogen auf das Bodenvolumen über den Boden appliziert . Kontrollpflanzen wurden mit WP- oder 1 %iger DMF-Lösung gegossen.a) DCINA induction: 2, 6-dichlorisonicotinic acid (DCINA, CGA41396, Syngenta, Basel, Switzerland) was formulated as a 25% active substance with wettable powder (WP) or after pre-dissolving the pure substance with prostitute hylformamide (DMF) in aqueous solution (1% DMF) adjusted to pH 7 with NaOH and applied in concentrations of 5 and 10 mg / 1 (corresponds to 0.02 or 0.04 M) based on the soil volume. Control plants were watered with WP or 1% DMF solution.
b) Benzo (1, 2 , 3 ) thiadiazol-7-carbothionsäure-S-methylester (BTH, auch Azibenzolar-S-methyl, CGA245704, Bion®, Syngenta, Basel, Schweiz) wurde als Formulierung von 50 % aktiver Substanz mit WP in Wasser in Konzentrationen von 63, 100, 125 und 250 mg/1 (entspricht 0,3, 0,48, 0,6 bzw. 1,2 mM) gesprüht, bis die Blätter gleichmäßig von feinen Tröpfchen bedeckt, waren. Eine Bodenapplikation erfolgte in Konzentrationen von 20 und 50 mg/1 (entspricht 0,095 bzw, 0,24 mM) bezogen auf das Bodenvolumen. Pflanzen wurden außerdem durch "Floaten" von Blattsegmenten auf einer Lösung von 5 mg/1 induziert. Als Kontrolle wurden gleiche Behandlungen mit wettable powder (WP) , der Leerformulierung durchgeführt. c) Salicylsäure-Induktion: Salicylsäure (SA) wurde direkt in Wasser gelöst oder nach Vorlösen in DMF in wässriger Lösungb) Benzo (1, 2, 3) thiadiazole-7-carbothionic acid S-methyl ester (BTH, also Azibenzolar-S-methyl, CGA245704, Bion®, Syngenta, Basel, Switzerland) was formulated as a 50% active substance with WP sprayed in water at concentrations of 63, 100, 125 and 250 mg / l (equivalent to 0.3, 0.48, 0.6 and 1.2 mM, respectively) until the leaves were evenly covered by fine droplets. Soil application was carried out in concentrations of 20 and 50 mg / 1 (corresponds to 0.095 and 0.24 mM, respectively) based on the volume of the soil. Plants were also induced by "floating" leaf segments on a 5 mg / l solution. As a control, the same treatments were carried out with wettable powder (WP), the empty formulation. c) Salicylic acid induction: Salicylic acid (SA) was dissolved directly in water or after pre-dissolving in DMF in aqueous solution
(1 % DMF) mit NaOH auf pH 6 bis 7 eingestellt und in Konzentrationen von 50 und 100 mg/1 (entspricht 0,36 bzw. 0,72 mM) bezogen auf das Bodenvolumen über den Boden appli- ziert. Kontrollpflanzen wurden mit Wasser oder 1 %iger DMF- Lösung gegossen.(1% DMF) adjusted to pH 6 to 7 with NaOH and applied in concentrations of 50 and 100 mg / 1 (corresponds to 0.36 or 0.72 mM) based on the volume of the soil. Control plants were watered with water or 1% DMF solution.
d) Ethylen-Induktion: Primärblätter' sieben Tage alter Pflanzen wurden auf angefeuchtetem Filterpapier in gasdichten Erlen- meyerkolben mit Ethylengas in Konzentrationen von 0,001, 1, 10 und 100 μL/1 (entspricht 0,028, 28, 280 bzw. 2800 μM) im Klimaschrank inkubiert (s.o). Kontrollblätter wurden mit Luft begast .d) Ethylene induction: primary leaves from seven-day-old plants were placed on moistened filter paper in gastight Erlenmeyer flasks with ethylene gas in concentrations of 0.001, 1, 10 and 100 μL / 1 (corresponds to 0.028, 28, 280 and 2800 μM) in a climatic chamber incubated (see above). Control sheets were gassed with air.
e) Abscisinsäure (ABA) Induktion: ABA wurde durch Sprühen einer wässrigen Lösung von 50 μM auf sieben Tage alte Keimlinge appliziert, bis sie gleichmäßig von feinen Tröpfchen bedeckt waren. Kontrollpflanzen wurden mit Wasser besprüht. Be- handelte Pflanzen wurden in Klimakammern inkubiert (s.o) .e) Abscisic acid (ABA) induction: ABA was applied by spraying an aqueous solution of 50 μM to seven-day-old seedlings until they were evenly covered by fine droplets. Control plants were sprayed with water. Treated plants were incubated in climatic chambers (see above).
f) JA Induktion: Die Induktion mit dem Phytohormon Jasmonat (JA) (Sigma) erfolgte durch "Floaten" von Blattsegmenten auf einer Lösung von 45 μM JA in Klimakammern. Kontrollblätter wurden auf Wasser "gefloatet". Behandlung mit Jasmonsäuremethylester (JM) erfolgte in Glaspetrischalen durch "Floaten" von Primärblättern sieben Tage alter Pflanzen auf einer Lösung von 45 μM JM in Klimakammern (s.o) . Kontrollblätter wurden auf Wasser "gefloatet" .f) JA induction: Induction with the phytohormone jasmonate (JA) (Sigma) was carried out by "floating" leaf segments on a solution of 45 μM JA in climatic chambers. Control sheets were "floated" on water. Treatment with jasmonic acid methyl ester (JM) was carried out in glass petri dishes by "floating" primary leaves of seven-day-old plants on a solution of 45 μM JM in climatic chambers (see above). Control sheets were "floated" on water.
g) Sorbit-Induktion: Sorbit-Induktion erfolgte durch "Floaten" von Blattsegmenten bzw. von Primärblättern sieben Tage alter Keimlinge für 4 h auf einer 1 M Sorbit-Lösung (Fluka) . Danach wurden die Blätter über Nacht auf Wasser "gefloatet" . Kon- trollblätter wurden auf Wasser "gefloatet".g) Sorbitol induction: Sorbitol induction was carried out by "floating" leaf segments or primary leaves of seven-day-old seedlings for 4 h on a 1 M sorbitol solution (Fluka). The leaves were then "floated" on water overnight. Control sheets were "floated" on water.
h) Für die Inokulation mit Cochliobolus-Konidien wurde von Kulturplatten mit sporulierende Pilz vorsichtig Oberflächen- rαycel abgeschabt, durch Mull gefiltert und eine Suspension in 0,02 %iger wässriger Tween20-Lösung hergestellt. Nachh) For inoculation with cochliobolus conidia, surface rαycel was carefully scraped from culture plates with sporulating fungus, filtered through gauze and a suspension in 0.02% aqueous Tween20 solution was prepared. To
Besprühen von Blattsegmenten sieben Tage alter Pflanzen mit 20000 Konidien/ml wurden diese auf 0,5 %igen Wasseragar mit 20 bis 40 mg/1 Benzimidazol ausgelegt und in verschlossenen Schalen im Klimaschrank bei 25°C und 16 h Lichtperiode bis zur Aufarbeitung der Blattsegmente inkubiert . Alternativ wurde eine Sprühinokulation sieben Tage alter Gerstenpflanzen mit 60.000 bis 90.000 Konidien/ml durchgeführt und die Pflanzen anschließend in befeuchteten und verschlossenen durchsichtigen Plastikboxen (60 x 40 x 36 cm) in einer Klimakammer bei 23°C, 70 % relativer Luftfeuchte und 16 h Lichtperiode bis zur Aufarbeitung der Blätter gehalten.Spraying leaf segments of seven-day-old plants with 20,000 conidia / ml, these were laid out on 0.5% water agar with 20 to 40 mg / 1 benzimidazole and incubated in closed dishes in a climate cabinet at 25 ° C. and 16 h light period until the leaf segments were worked up , Alternatively, spray inoculation of seven-day-old barley plants with 60,000 to 90,000 conidia / ml was carried out and the Plants then kept in moist and closed transparent plastic boxes (60 x 40 x 36 cm) in a climatic chamber at 23 ° C, 70% relative humidity and 16 h light period until the leaves were processed.
i) Die Inokulation mit Bakterien erfolgte durch Druckinfiltration von max. 100 μl der Bakteriensuspensionen mittels einer Infiltrationszange (Hagborg WAF (1970) Can J Bot 48:1135-1136.) in Primär- und Sekundärblätter sieben bzw. vierzehn Tage alter Pflanzen. Dazu wurde King's B-Mediumi) The inoculation with bacteria was carried out by pressure infiltration of max. 100 μl of the bacterial suspensions using an infiltration forceps (Hagborg WAF (1970) Can J Bot 48: 1135-1136.) In primary and secondary leaves of plants that are seven or fourteen days old. This became King's B medium
(s.o.) mit den verschiedenen Stämmen angeimpft und über Nacht bei 28°C im Dunkeln geschüttelt. Nach Pelletieren der Suspension und zweimaligem Waschen mit dem Infiltrationsmedium (5 mM MgS04) wurden die Bakterien in diesem resuspendiert und auf eine optische Dichte ODgoonm von 0,2 (entspricht ca. 107 Bakterien) eingestellt. Zur Kontrolle wurde das Infiltrationsmedium alleine infiltriert. Die Pflanzen wurden anschließend in Klimaschränken gehalten (s.o.). Bezüglich der Bakterien wurden Versuche mit Pseudomonas syringae pv. to ato (DC3000) , Pseudomonas syringae pv. glycinea (PG4180) , Pseudomonas syringae pv. syringae (Pssδl) und Bacillus subtilis (Bs) durchgeführt. Bacillus subtilis stammte aus der Kulturensammlung des Instituts für Phytopathologie und Angewandte Zoologie (IPAZ) , Giessen, Deutschland, die verschiedenen Pseudomonas Stämme wurden von Ina Budde und Matthias Ullrich, Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie, Marburg, zur Verfügung gestellt.(see above) inoculated with the different strains and shaken overnight at 28 ° C in the dark. After pelleting the suspension and washing twice with the infiltration medium (5 mM MgSO 4 ), the bacteria were resuspended in this and adjusted to an optical density ODgoo n m of 0.2 (corresponds to approx. 10 7 bacteria). As a control, the infiltration medium was infiltrated alone. The plants were then kept in climate cabinets (see above). With regard to the bacteria, tests were carried out with Pseudomonas syringae pv. To ato (DC3000), Pseudomonas syringae pv. Glycinea (PG4180), Pseudomonas syringae pv. Syringae (Pssδl) and Bacillus subtilis (Bs). Bacillus subtilis came from the culture collection of the Institute for Phytopathology and Applied Zoology (IPAZ), Giessen, Germany, the various Pseudomonas strains were provided by Ina Budde and Matthias Ullrich, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, Marburg.
j) Zur Simulation eines Blattlausbefalls wurden Primärblätter acht Tage alter Keimlinge mit je drei ungeflügelten L4-Sta- dien von Sitobion avenae F. besetzt und in Käfigen bei 25°C und 16 h Lichtperiode gehalten.j) To simulate aphid infestation, primary leaves of eight-day-old seedlings were populated with three wingless L4 stages of Sitobion avenae F. and kept in cages at 25 ° C and 16 h light period.
k) Eine Verwundung wurde durch Perforation der Primärblätter sieben Tage alter Pflanzen mit 15 Nadeln/cm2 erreicht. Kontrollpflanzen blieben unverletzt und wurden zusammen mit den Verwundeten im Klimaschrank weiter kultiviert (s.o.) .k) A wound was achieved by perforating the primary leaves of seven day old plants with 15 needles / cm 2 . Control plants remained uninjured and were further cultivated together with the wounded in the climate cabinet (see above).
Beispiel 10: Transiente TransformationExample 10: Transient transformation
Zur Bestimmung der Induzierbarkeit des BCI-3 und BCI-4 Promoters bzw. der Deletionsvarianten des BCI-3 Promotors wurden die einzelnen Konstrukte mit Hilfe von Particle Bombardment in chemisch induzierte Gerstenblätter (cv. Ingrid WT) geschossen. 24 h danach wurden GFP-Zellen in den Blattsegmenten ausgezählt . Wolframpartikel mit einem Durchmesser von 1,1 μm (Partikeldichte 25 mg/ml) wurden mit Plasmid-DNA beschichtet. Dazu wurden pro Schuss 1 μg Reporterplasmid zur Beschichtung verwendet (Verfahren nach Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe InteractTo determine the inducibility of the BCI-3 and BCI-4 promoter or the deletion variants of the BCI-3 promoter, the individual constructs were shot into chemically induced barley leaves (cv. Ingrid WT) with the aid of particle bombardment. 24 hours later, GFP cells were counted in the leaf segments. Tungsten particles with a diameter of 1.1 μm (particle density 25 mg / ml) were coated with plasmid DNA. For this purpose, 1 μg reporter plasmid was used for coating per shot (method according to Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact
12:647-54; Schweizer P et al . (2000) Plant J 2000 24: 895-903). Für Microcarrier-Präparation wurden 55 mg Wolframpartikel (M 17, Durchmesser 1,1 μ ; Bio-Rad, München) zweimal mit 1 ml autoklaviertem destilliertem Wasser und einmal mit 1 mL absolutem Etha- nol gewaschen, getrocknet und in 1 ml 50 %igem Glycerin aufgenommen (ca. 50 mg/ml Stammlösung) . Die Lösung wurde mit 50 %igem Glycerin auf 25 mg/ml verdünnt, vor Gebrauch gut gemischt und im Ultraschallbad suspendiert. Zur Microcarrier-Beschichtung wurden pro Schuss 1 μg Plasmid, 12,5 μl Wolframpartikel-Suspension (25 mg/ml), 12,5 μl 1 M Ca(N03) 2-Lösung (pH 10) tropfenweise unter ständigem Mischen zusammengegeben, 10 min bei RT stehengelassen, kurz zentrifugiert und 20 μl vom Überstand abgenommen. Der Rest mit den Wolframpartikel wird resuspendiert (Ultraschallbad) und ins Experiment eingesetzt .12: 647-54; Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). For microcarrier preparation, 55 mg of tungsten particles (M 17, diameter 1.1 μ; Bio-Rad, Munich) were washed twice with 1 ml of autoclaved distilled water and once with 1 ml of absolute ethanol, dried and in 1 ml of 50% strength Glycerin taken up (approx. 50 mg / ml stock solution). The solution was diluted to 25 mg / ml with 50% glycerol, mixed well before use and suspended in an ultrasonic bath. For the microcarrier coating, 1 μg of plasmid, 12.5 μl of tungsten particle suspension (25 mg / ml), 12.5 μl of 1 M Ca (N0 3 ) 2 solution (pH 10) were added dropwise with continuous mixing, 10 Leave at RT for min, centrifuge briefly and remove 20 μl from the supernatant. The rest with the tungsten particles is resuspended (ultrasonic bath) and used in the experiment.
Es wurden ca. 4 cm lange Segmente von Gerstenprimärblättern verwendet. Die Gewebe wurden auf 0,5 % Phytagar (GibcoBRL™ Life Technologies™ , Karlsruhe) mit 20 μg/ml Benzimidazol in Petrischa- len (6,5 cm Durchmesser) gelegt und direkt vor dem Partikelbe- schuss an den Rändern mit einer Schablone mit einer rechteckigen Aussparung von 2,2 cm x 2,3 cm abgedeckt. Die Schalen wurden nacheinander auf den Boden der Vakuumkammer (Schweizer P et al . (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54) gestellt, über dem ein Nylonnetz (Maschenweite 0,2 mm, Millipore, Eschborn) als Dif- fusor auf einer Lochplatte eingeschoben war (5 cm über dem Boden, 11 cm unterhalb des Macrocarriers, s.u.), um Partikelklumpen zu zerstreuen und den Partikelstrom abzubremsen. Der oben an der Kammer angebrachte Macrocarrier (Plastik-Sterilfilterhalter, 13 mm, Gel an Sciences, Swinney, UK) wurde je Schuss mit 5,8 μL DNA-beschichteten Wolframpartikeln (312 μg Wolframpartikel; Mi- crocarrier, s.u.) beladen. Mit einer Membranvakuumpumpe (Vacuum- brand, Wertheim) wurde der Druck um 0,9 bar in der Kammer reduziert und die Wolframpartikel mit 9 bar Heliumgasdruck auf die Oberfläche des Pflanzengewebes geschossen. Sofort danach wurde die Kammer belüftet . Vor dem Schießen eines anderen Plasmids wurde der Macrocarrier jeweils gründlich mit Wasser gereinigt. 24 h nach dem Beschuss wurden GFP-Zellen in den Blattsegmenten ausgezählt . Zusätzlich wurden als Kontrollen auch der Leervektor ρUC18 mit einkloniertem GFP (über die Kpnl-Schnittstelle) in induzierte Gerstenblätter geschossen und unter dem Mikroskop nach GFP-Zellen gesucht .Approximately 4 cm long segments of barley primary leaves were used. The tissues were placed on 0.5% Phytagar (GibcoBRL ™ Life Technologies ™, Karlsruhe) with 20 μg / ml benzimidazole in petri dishes (6.5 cm diameter) and with a template directly before the particle bombardment at the edges a rectangular cut-out of 2.2 cm x 2.3 cm. The dishes were placed one after the other on the bottom of the vacuum chamber (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54), over which a nylon net (mesh size 0.2 mm, Millipore, Eschborn) was used as a diffuser a perforated plate (5 cm above the floor, 11 cm below the Macrocarrier, see below) to disperse clumps of particles and to slow down the particle flow. The macrocarrier (plastic sterile filter holder, 13 mm, Gel an Sciences, Swinney, UK) attached to the top of the chamber was loaded with 5.8 μL DNA-coated tungsten particles (312 μg tungsten particles; Microcarrier, see below) per shot. With a membrane vacuum pump (Vacuum brand, Wertheim), the pressure in the chamber was reduced by 0.9 bar and the tungsten particles were shot at 9 bar helium gas pressure on the surface of the plant tissue. The chamber was immediately ventilated. Before shooting another plasmid, the macro carrier was thoroughly cleaned with water. 24 h after the bombardment, GFP cells were counted in the leaf segments. In addition, the empty vector ρUC18 with GFP cloned in (via the Kpnl interface) was shot into induced barley leaves as controls and a search for GFP cells was carried out under the microscope.
Beispiel 11: Induzierbarkeit des BCI-3 und BCI-4 Promoters anhand von Northern-Blot ExperimentenExample 11: Inducibility of the BCI-3 and BCI-4 promoter based on Northern blot experiments
Der BCI-3 Promotor wird durch DCINA, BTH und schwächer durch SA induziert (Fig. 5, A, B, C) . Die Akkumulation von BCI-3 war nach BTH-Induktion in Northern Blot-Analysen nur im Mesophyll nachweisbar, weitere Untersuchungen mit der sensitiveren Nachweismethode der RT-PCR zeigten jedoch eine Induzierbarkeit auch in der Epidermis. Durch Ethylen und ABA wurde die Expression von BCI-3 nicht beeinflusst, durch JA-Applikation (Fig. 5, D) und Verwundung (Fig. 6, B) jedoch induziert. Im Gegensatz zur Induktion durch JA-Applikation wurde BCI-3 bei erhöhtem endogenen JA-Gehalt nach Sorbitbehandlung reprimiert (Fig. 6, A) . Dieser gegensätzliche Effekt war nicht nur auf Transkriptebene sichtbar, sondern auch in den ExpressionsStudien mit BCI-3-Promoter:GFP-Reporter Konstrukten. Nach transienter Transformation von Gerstenblättern wurde die GFP-Fluoreszenz durch exogenes JM. verstärkt und durch endogen erhöhte JA-Gehalte reprimiert. Der -Anstieg des endogenen JA-Gehaltes durch "Floaten" auf Sorbit wird durch starken osmoti- sehen Stress hervorgerufen, der zusätzlich einen Anstieg des ABA- Gehaltes verursacht, so dass andere Mechanismen als die Akkumulation von JA zur Repression von BCI-3 führen könnten. Während die Inokulation von Gerste mit C. sativus, Infiltration des toxischen Kulturfiltrates des Pilzes, die Inokulation mit dem Nicht-Wirt- Pathogen Bgt sowie der Schädling S. avenae keinen Einfluss auf die Transkriptakkumulation hatte, wurde BCI-3 durch Befall mit einer virulenten und avirulenten Rasse von Bgh reprimiert. Diese Repression könnte ebenso wie bei der Sorbitbehandlung (s.o.) Ausdruck eines geänderten Stoffwechsels in der Interaktion mit dem biotrophen Pathogen sein, der aber wahrscheinlich nicht im Zusammenhang mit Resistenz steht, da die Expression von BCI-3 auch in der kompatiblen Interaktion reprimiert wurde. Die Genexpression nach Infiltration mit Bakterien war nur in einem von zwei durchgeführten Experimenten geringfügig aktiviert und scheint daher nicht in kausalem Zusammenhang mit Bakterien zu stehen (Fig. 6, D) . Die Genexpression von BCI-4 ist nur mit den Resistenzinduktoren SA, DCINA und BTH induzierbar ((Fig. 5, A, B, C) , wobei die schwächere und transiente Expression nach SA-Applikation mit der geringeren Ausprägung der Resistenz korrelierte. Nach JM-Applika- tion konnte nur in einem Genotyp eine transiente und schwache Transkriptakkumulation detektiert werden, die daher wahrschein¬ lich nicht kausal mit der JM-Applikation verknüpft ist, zumal bei endogen erhöhtem JA-Gehalt ebenfalls keine Akkumulation erfolgte. Eine schwache aber reproduzierbare Expression von BCI-4 wurde nach Infiltration des Pseudomonadenstammes PG4180 lokal und systemisch nachgewiesen und korrelierte mit einer Resistenzinduk- tion gegenüber Bgh. Alle anderen untersuchten Induktoren, verschiedenste biotische und abiotische Stressfaktoren, sowie Fungi¬ zidapplikationen hatten keinen Einfluss auf die Expression von BCI-4. Dies zeigt, dass BCI-4 nicht bei allgemeinen Stressreak¬ tionen exprimiert wird, sondern spezifisch reguliert ist. BCI-4 zeigt eine sehr geringe konstitutive Expressionsaktivität . Eine verstärkte Akkumulation von BCI-4-Transkript und -Protein in Ger¬ stenpflanzen erfolgte ausschließlich in Blättern (mit Ausnahme des Fahnenblattes) und nur nach chemischer Induktion (BTH-Gießbe- handlung) (s. Fig. 8), wobei die Akkumulation auf das Mesophyll begrenzt blieb, wie Northern- und Western-Analysen zeigen konn¬ ten. Eine Aktivierung der Expression in kompatiblen oder inkompa¬ tiblen Interaktionen mit dem Echten Gerstenmehltaupilz konnte auf Transkriptebene (Northern-Analyse, RT-PCR) nicht nachgewiesen werden. In der durch das Resistenzgen Mlg-vermittelten Interak¬ tion mit Bgh konnte BCI-4 weder auf Protein- noch auf Transkrip¬ tebene (RT-PCR) in Epidermis oder Mesophyll detektiert werden. Ging der Inokulation jedoch eine chemische Induktion voraus, so wurde die BCI-4~Expression acht Stunden nach der Inokulation zu¬ sätzlich erhöht (priming) , was auf eine Bedeutung von BCI-4 in der Interaktion mit dem Pathogen, bzw. für Abwehrreaktionen hin¬ deuten könnte (Fig. 6, C) . Eine entsprechende induzierbare BCI-4 Promotoraktivität konnte auch in Weizen detektiert werden. Auch hier war - völlig analog zu der Situation in Gerste - der Promo¬ tor durch BTH aber nicht durch Weizenmehltau (Bgt) induzierbar. Tab. 1 Expressionsprofil von BCI-4The BCI-3 promoter is induced by DCINA, BTH and weaker by SA (Fig. 5, A, B, C). The accumulation of BCI-3 was only detectable in mesophyll after BTH induction in Northern blot analyzes, however further investigations with the more sensitive detection method of RT-PCR showed an inducibility also in the epidermis. Expression of BCI-3 was not influenced by ethylene and ABA, but induced by JA application (FIG. 5, D) and wounding (FIG. 6, B). In contrast to induction by JA application, BCI-3 was repressed with an increased endogenous JA content after sorbitol treatment (FIG. 6, A). This opposite effect was not only visible at the transcript level, but also in the expression studies with BCI-3 promoter: GFP reporter constructs. After transient transformation of barley leaves, the GFP fluorescence was exogenous by JM. intensified and repressed by endogenously increased JA contents. The increase in the endogenous JA content by "floating" on sorbitol is caused by strong osmotic stress, which additionally causes an increase in the ABA content, so that mechanisms other than the accumulation of JA could lead to the repression of BCI-3 , While barley inoculation with C. sativus, infiltration of the toxic culture filtrate of the fungus, inoculation with the non-host pathogen Bgt and pest S. avenae had no effect on the transcript accumulation, BCI-3 was affected by a virulent and avirulent race repressed by Bgh. As with sorbitol treatment (see above), this repression could be an expression of a changed metabolism in the interaction with the biotrophic pathogen, but this is probably not related to resistance, since the expression of BCI-3 was also repressed in the compatible interaction. Gene expression after infiltration with bacteria was only slightly activated in one of two experiments carried out and therefore does not appear to be causally related to bacteria (FIG. 6, D). The gene expression of BCI-4 can only be induced with the resistance inducers SA, DCINA and BTH ((FIG. 5, A, B, C), the weaker and transient expression after SA application correlating with the lower expression of resistance tion -Applika- no accumulation could only in a genotype of a transient and weak transcript are detected, therefore probable ¬ Lich not causally with the JM-application is associated, especially in endogenous increased JA-content was also determined. a weak but reproducible expression of BCI-4 was detected locally and systemically by infiltration of Pseudomonadenstammes PG4180 and correlated with a Resistenzinduk- tion against bGH. All other tested inductors, various biotic and abiotic stresses, as well as fungi ¬ had zidapplikationen not affect the expression of BCI-4. These shows that BCI-4 functions not in general Stressreak ¬ is expressed, but s is regulated specifically. BCI-4 shows a very low constitutive expression activity. Stenpflanzen increased accumulation of BCI-4 transcript and protein in Ger ¬ occurred exclusively in leaves (with the exception of the flag leaf), and only after chemical induction (BTH-Gießbe- treatment) (s. Fig. 8), the accumulation of the mesophyll remained limited as Northern and Western analyzes show might ¬ th. activation of the expression in compatible or inkompa ¬ tiblen interactions with the barley powdery mildew fungus could (Northern analysis, RT-PCR) on the transcript can not be detected. In the switched-Mlg by the resistance gene Interak ¬ tion with Bgh could BCI-4 neither protein nor Transkrip ¬ tebene (RT-PCR) can be detected in epidermis or mesophyll. However, the inoculation was preceded by a chemical induction, the BCI-4 ~ expression turned eight hours after the inoculation ¬ additionally increased (priming), which indicates a significance of BCI-4 in the interaction with the pathogen, or for defense reactions ¬ could indicate (Fig. 6, C). A corresponding inducible BCI-4 promoter activity could also be detected in wheat. Was here - completely analogous to the situation in barley - the Promo ¬ tor by BTH but not inducible by wheat mildew (Bgt). Tab. 1 Expression profile of BCI-4
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Figure imgf000071_0001
++ Aktivierung, + schwache Aktivierung, / nicht differentiell, Repremierung .++ activation, + weak activation, / not differential, representation.
Tab.2 Expressionsprofil von BCI-3 und BCI-4Tab. 2 Expression profile of BCI-3 and BCI-4
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++ Aktivierung, + schwache Aktivierung, / nicht differentiell, - Repremierung . Beispiel 12: Expressionsverhalten von BCI-3-Promotor und BCI-3 Promotordeletionsvarianten++ activation, + weak activation, / not differential, - representation. Example 12: Expression behavior of BCI-3 promoter and BCI-3 promoter deletion variants
In Funktionsanalysen zeigte sich, dass der Promotor in jasmonat- und bioninduzierten Gerstenpflanzen eine höhere Aktivität aufwies verglichen mit Kontrollen (unbehandelter , beschossene Blätter) . In Kontrollen beidenen eine Transfektion mit dem pGFP-Leervektor durchgeführt wurde, wurde kein GFP-Fluoreszenz detektiert. Die Tatsache, dass sowohl bei behandelten als auch bei unbehandelten Blattsegmenten eine recht hohe Hintergrundaktivität zu beobachten ist, ist vermutlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass der BCI-3 Promotor (im Unterschied zum BCI-4 Promotor) durch Verwundung aktivierbar ist und eine solche zwangsläufig bei jeder erfolgreich mittels Partikel-Beschuss transfizierten Zelle auf- tritt. Stabile Transfektionselemente werden hier deutliche Ergebnisse zeigen.Functional analyzes showed that the promoter was more active in jasmine and bion-induced barley plants compared to controls (untreated, bombarded leaves). In controls that were transfected with the pGFP empty vector, no GFP fluorescence was detected. The fact that a fairly high background activity can be observed in both treated and untreated leaf segments is probably due to the fact that the BCI-3 promoter (in contrast to the BCI-4 promoter) can be activated by wounding and inevitably occurs in every cell successfully transfected by particle bombardment. Stable transfection elements will show clear results here.
Interessant ist auch die Wirkung von Sorbitol (= Erhöhung des endogenen Jas onatspiegels) , das die Bildung von endogenem Jasmonat in der Pflanze hervorruft. Hierdurch wird der BCI-3 Promotor heruntergeregelt, wie auch schon in Northern Studien für das Gen BCI3 gezeigt wurde (s.o.). Nach Sorbitolinduktion wurde eine geringere BCI-3 Promotoraktivität nachgewiesen als in den Kontrollen (Fig. 4) . Exogen appliziertes Jasmonat oder BTH bewirkt eine hohe BCI-3 Promotorresponsivität , die durch Partikel Bombardment im Transienten Assay und Anzahl der GFP-Zellen gemessen wurde (Fig. 2 und Fig. 3) . Es ist zu sehen, dass auch das 300 bp-Frag- ment noch eine hohe Aktivität aufweist . The effect of sorbitol (= increasing the endogenous jasonate level), which causes the formation of endogenous jasmonate in the plant, is also interesting. This lowers the BCI-3 promoter, as has also been shown in Northern studies for the BCI3 gene (see above). After sorbitol induction, a lower BCI-3 promoter activity was detected than in the controls (FIG. 4). Exogenously applied jasmonate or BTH causes a high BCI-3 promoter responsiveness, which was measured by particle bombardment in the transient assay and number of GFP cells (FIGS. 2 and 3). It can be seen that the 300 bp fragment is still very active.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur chemisch induzierbaren transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass1. A method for chemically inducible transgenic expression of nucleic acid sequences, characterized in that
a) eine Expressionskassette bestehend aus einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit einem chemisch induzierbaren Promotor aus- gewählt aus der Gruppe der Sequenzen bestehend ausa) an expression cassette consisting of a nucleic acid sequence to be expressed transgenically in functional association with a chemically inducible promoter selected from the group of sequences consisting of
i) dem BCI-3 Promotor gemäß SEQ ID No:l oder einem funktionellen Äquivalent oder funktionell äquivalenten Teil desselben, undi) the BCI-3 promoter according to SEQ ID No: 1 or a functional equivalent or part of the same, and
ii) dem BCI-4 Promotor gemäß SEQ ID No:2 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktionell äquivalenten Teil desselbenii) the BCI-4 promoter according to SEQ ID No: 2 or a functional equivalent or part of the same
in einen Organismus oder in ein Gewebe, Organ, Teil, eineinto an organism or into a tissue, organ, part, a
Zellkultur oder Zelle desselben eingebracht wird, undCell culture or cell of the same is introduced, and
b) die Expression der Nukleinsäuresequenz durch Behandlung des Organismus oder des Gewebes, Organs, Teils, Zell- kultur oder Zelle desselben mit einem chemischen Induktor induziert wird.b) the expression of the nucleic acid sequence is induced by treating the organism or the tissue, organ, part, cell culture or cell thereof with a chemical inducer.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das funktionell äquivalente Teil eines BCI-3 Promotors durch SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 oder 7 beschrieben ist.2. The method according to claim 1, wherein the functionally equivalent part of a BCI-3 promoter is described by SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 or 7.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das funktionell äquivalente Teil eines BCI-4 Promotors durch SEQ ID NO: 8 beschrieben ist .3. The method of claim 1, wherein the functionally equivalent part of a BCI-4 promoter is described by SEQ ID NO: 8.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , wobei der Organismus ein pflanzlicher Organismus ist.4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the organism is a plant organism.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der chemische Induktor ausgewählt ist aus der Verbindungen mit einer Benzo-1, 2 , 3-thiadiazol (BTH) Grundstruktur, Pyridin- carbonsäure Grundstruktur, Haloisonikotinsäuren5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the chemical inductor is selected from the compounds with a benzo-1, 2, 3-thiadiazole (BTH) basic structure, pyridine carboxylic acid basic structure, haloisonicotinic acids
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , wobei der chemische Induktor ausgewählt ist aus der Gruppe der6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the chemical inductor is selected from the group of
Verbindungen bestehend aus Benzo-1, 2 , 3-thiadiazolcarbonsäure, Benzo-1, 2, 3-thiadiazolthiocarbonsäure, Cyanobenzo- 1,2,3- thiadiazol, Benzo-1, 2 , 3-thiadiazolcarbonsäureamid, Benzo- 1,2, 3-thiadiazolcarbonsäurehydrazid, Benzo-1, 2 , 3-thia- diazol-7-carbonsäure, Benzo-1, 2 , 3-thiadiazol-7-thiocarbon- säure, 7-Cyano-benzo-l, 2 , 3-thiadiazol , Benzo-1, 2, 3-thia- 5 diazol-7-carbonsäureamid, Benzo-1, 2 , 3-thiadiazol-7-carbon- säurehydrazid, Alkylbenzo-1, 2 , 3- thiadiazolcarboxylate in denen die Alkylgruppe ein bis 6 C-Atome umfasst, Methyl- benzo-1, 2 , 3-thiadiazol-7-carboxylat , n-Propyl benzo-1,2,3- thiadiazol-7-carboxylat, Benzylbenzo-1, 2 , 3-thiadiazol-7-Compounds consisting of benzo-1, 2, 3-thiadiazolecarboxylic acid, benzo-1, 2, 3-thiadiazolthiocarboxylic acid, cyanobenzo- 1,2,3- thiadiazole, benzo-1,2,3-thiadiazolecarboxamide, benzo-1,2,3-thiadiazolecarboxylic acid hydrazide, benzo-1,2,3-thiadiazole-7-carboxylic acid, benzo-1,2,3-thiadiazol-7- thiocarboxylic acid, 7-cyano-benzo-l, 2,3-thiadiazole, benzo-1,2,3-thia-5-diazole-7-carboxamide, benzo-1,2,3-thiadiazole-7-carbon acid hydrazide , Alkylbenzo-1, 2, 3-thiadiazole carboxylates in which the alkyl group comprises one to 6 carbon atoms, methyl benzo-1, 2, 3-thiadiazole-7-carboxylate, n-propyl benzo-1,2,3-thiadiazole -7-carboxylate, benzylbenzo-1, 2, 3-thiadiazole-7-
10 carboxylat, Benzo-1, 2 , 3-thiadiazole-7-carbonsäure-sec-butyl- hydrazid, Dichloroisonicotinsäure (DCINA) , Dichloroiso- nicotinsäuremethylester, Benzoesäure, Salicylsäure (SA) , Acetylsalicylsäure und Polyacrylsäure, sowie Derivaten der vorgenannten .10 carboxylate, benzo-1, 2, 3-thiadiazole-7-carboxylic acid sec-butyl hydrazide, dichloroisonicotinic acid (DCINA), dichloroisonicotinic acid methyl ester, benzoic acid, salicylic acid (SA), acetylsalicylic acid and polyacrylic acid, and derivatives of the aforementioned.
1515
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe von Nukleinsäuren kodierend für Selektionsmarker, Reportergene und Genen die eine Resistenz gegen Pathogene7. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the transgenic nucleic acid sequence to be expressed is selected from the group of nucleic acids coding for selection markers, reporter genes and genes which have a resistance to pathogens
20 oder biotischen oder abiotischen Stress verleihen.20 or biotic or abiotic stress.
8. Nukleinsäuresequenz kodierend für den BCI-3 Promotor aus Gerste gemäß SEQ ID No : 1 , funktioneile Äquivalente oder funktionell äquivalenten Teile desselben.8. Nucleic acid sequence coding for the barley BCI-3 promoter according to SEQ ID No: 1, functional equivalents or functionally equivalent parts thereof.
2525
9. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8, wobei das funktionell äquivalente Teil eines BCI-3 Promotors durch SEQ ID NO : 4, 5, 6 oder 7 beschrieben ist .9. The nucleic acid sequence according to claim 8, wherein the functionally equivalent part of a BCI-3 promoter is described by SEQ ID NO: 4, 5, 6 or 7.
30 10. Nukleinsäuresequenz kodierend für den BCI-4 Promotor aus Gerste gemäß SEQ ID No : 2 , funktioneile Äquivalente oder funktionell äquivalenten Teile desselben.30 10. Nucleic acid sequence coding for the barley BCI-4 promoter according to SEQ ID No: 2, functional equivalents or functionally equivalent parts thereof.
11. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10, wobei das funktionell 35 äquivalente Teil eines BCI-4 Promotors durch SEQ ID NO: 8 beschrieben ist.11. The nucleic acid sequence according to claim 10, wherein the functionally equivalent part of a BCI-4 promoter is described by SEQ ID NO: 8.
12. Transgene Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11.12. Transgenic expression cassette containing a nucleic acid sequence according to one of claims 8 to 11.
4040
13. Transgene Expressionskassette nach Anspruch 12, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einer weiteren, transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpft ist.13. The transgenic expression cassette according to claim 12, wherein the nucleic acid sequence is functionally linked to a further nucleic acid sequence to be expressed transgenically.
45 45
14. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz14. Transgenic expression cassette according to one of claims 12 or 13, characterized in that the nucleic acid sequence to be expressed transgenically
a) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins ermöglicht, odera) allows expression of a protein encoded by said nucleic acid sequence, or
b) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierter sense oder anti-sense-RNA ermöglicht.b) enables expression of a sense or anti-sense RNA encoded by said nucleic acid sequence.
15. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe von Nukleinsäuren kodierend für Selektionsmarker, Reportergene, Genen die eine Resistenz gegen Pathogene, biotischen oder abiotischen Stress verleihen und Genen, die das Wachstum von Pflanzen verändern.15. Expression cassette according to one of claims 12 to 14, wherein the nucleic acid sequence to be expressed transgenically is selected from the group of nucleic acids coding for selection markers, reporter genes, genes which confer resistance to pathogens, biotic or abiotic stress and genes which promote the growth of plants change.
16. Transgener Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11 oder eine Expressionskassette gemäss den Ansprüchen 12 bis 15.16. Transgenic vector containing a nucleic acid sequence according to one of claims 8 to 11 or an expression cassette according to claims 12 to 15.
17. Transgener Organismus transformiert mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, einer Expressionskassette gemäß einem der Ansprüchen 12 bis 15 oder einem Vektor gemäß Anspruch 16.17. Transgenic organism transformed with a nucleic acid sequence according to one of claims 8 to 11, an expression cassette according to one of claims 12 to 15 or a vector according to claim 16.
18. Transgener Organismus nach Anspruch 17 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen und pflanzlichen Organismen.18. Transgenic organism according to claim 17 selected from the group consisting of bacteria, yeast, fungi, animal and plant organisms.
19. Transgener Organismus nach einem der Ansprüche 17 oder 18 ausgewählt aus den monokotylen oder dikotylen Pflanzen.19. Transgenic organism according to one of claims 17 or 18 selected from the monocot or dicot plants.
20. Transgener Organismus nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Pflanze Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Mais, Reis, Weizen oder Triticale ist.20. Transgenic organism according to one of claims 17 to 19, wherein the plant is wheat, rye, barley, oats, corn, rice, wheat or triticale.
21. Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut abgeleitet von einem transgenen Organismus nach den Ansprüchen 17 bis 20.21. Cell cultures, parts or transgenic propagation material derived from a transgenic organism according to claims 17 to 20.
22. Verwendung eines transgenen Organismus nach einem der22. Use of a transgenic organism according to one of the
Ansprüche 17 bis 20 oder von diesem abgeleitete Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut nach Anspruch 21 zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien. Claims 17 to 20 or cell cultures, parts or transgenic reproductive material derived therefrom according to Claim 21 for the production of food, animal feed, seeds, pharmaceuticals or fine chemicals.
23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei die Feinchemikalien Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, natürlicher oder synthetische Geschmacks-, Aroma- oder Farbstoffe sind.23. Use according to claim 22, wherein the fine chemicals are enzymes, vitamins, amino acids, sugars, saturated or unsaturated fatty acids, natural or synthetic flavors, flavorings or colorants.
24. Verwendung von Nukleinsäuresequenzen gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, Expressionskassetten gemäß einem der Ansprüchen 12 bis 15, Vektoren gemäß Anspruch 16 oder transgenen Organismen gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20 in Verfahren zur Identifizierung von Pathogenresistenz- induzierenden Verbindungen.24. Use of nucleic acid sequences according to one of claims 8 to 11, expression cassettes according to one of claims 12 to 15, vectors according to claim 16 or transgenic organisms according to one of claims 17 to 20 in methods for identifying pathogen resistance-inducing compounds.
25. Verfahren zur Identifizierung von Pathogenresistenz-in- duzierenden Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass25. A method for identifying compounds which induce pathogen resistance, characterized in that
a) eine Expressionskassette bestehend aus einem Reportergen in funktioneller Verknüpfung mit einem chemisch induzierbaren Promotor ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen bestehend ausa) an expression cassette consisting of a reporter gene in functional linkage with a chemically inducible promoter selected from the group of sequences consisting of
i) dem BCI-3 Promotor gemäß SEQ ID No : 1 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktionell äquivalenten Teil desselben, undi) the BCI-3 promoter according to SEQ ID No: 1 or a functional equivalent or part thereof, and
ii) dem BCI-4 Promotor gemäß SEQ ID No .- 2 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktionell äquivalenten Teil desselbenii) the BCI-4 promoter according to SEQ ID No. 2 or a functional equivalent or part of the same
in einen Organismus oder in ein Gewebe, Organ, Teil, eine Zellkultur oder Zelle desselben eingebracht wird, undis introduced into an organism or into a tissue, organ, part, cell culture or cell thereof, and
b) der Organismus oder das Gewebe, Organ, Teil, Zellkultur oder Zelle desselben mit einer chemischen Verbindung ausgewählt aus einer Bibliothek chemischer Verbindungen behandelt wird, undb) the organism or the tissue, organ, part, cell culture or cell thereof is treated with a chemical compound selected from a library of chemical compounds, and
c) die Induktion der Expression des Reportergens gemessen wird. c) the induction of the expression of the reporter gene is measured.
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