WO2003002989A1 - Microscope for coherent optical tomography - Google Patents

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WO2003002989A1
WO2003002989A1 PCT/FR2002/002231 FR0202231W WO03002989A1 WO 2003002989 A1 WO2003002989 A1 WO 2003002989A1 FR 0202231 W FR0202231 W FR 0202231W WO 03002989 A1 WO03002989 A1 WO 03002989A1
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WO
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lighting
coming
point
light
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PCT/FR2002/002231
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Vincent Lauer
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Vincent Lauer
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    • G01B9/00—Measuring instruments characterised by the use of optical techniques
    • G01B9/04—Measuring microscopes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G01N21/4795—Scattering, i.e. diffuse reflection spatially resolved investigating of object in scattering medium
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
    • G01N21/45—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length using interferometric methods; using Schlieren methods

Definitions

  • the invention relates to a microscope for coherent optical tomography, making it possible to obtain sectional images of an object to be observed.
  • the sample is scanned using a confocal microscope but the wave reflected by the sample returns to an optical fiber which also serves as a spatial filtering system. It is transmitted by optical fiber to a coupler by means of which it is made to interfere with a reference wave to detect on a detector a signal resulting from this interference.
  • a longitudinal scanning system makes it possible to modify the optical path traveled by the reference wave.
  • the signal received on the sensor is maximum when the reference wave and the wave coming from the object are in phase.
  • the uncontrolled vibrations of the galvanometric mirrors result in errors in the difference in optical path between the reference wave and the wave reflected by the object, which introduce a deterioration of image quality, mainly for systems with high resolution in the Z-axis direction.
  • the spatially coherent white light source (femtosecond laser) is expensive and can be replaced by a non-light source consistent as indicated in patent WO 02/35179.
  • a first object of the invention is to produce a microscope for coherent optical tomography which allows real-time imaging of a microscopic sample, with a high resolution along the optical axis.
  • the apparatus described in US Pat. No. 6,124,930 uses a galvanometric mirror for scanning a plane, which improves the scanning speed. It partly solves the problem of phase differences caused by the movement of the galvanometric mirror, by positioning the galvanometric mirror at an appropriate point in the lighting system.
  • the author supposes that the two scanning mirrors have a common center of rotation. This is an approximation which leads to deviations from the theory. In reality, the two mirrors have separate centers of rotation and when scanning an observed plane, the signal from the interferometer is not perfectly constant.
  • the author also neglects the phenomena of vibrations of the galvanometric mirror: a vibration of a few microns of the galvanometric mirror leads to a comparable imprecision of the interferometric system, in the direction of scanning in Z.
  • an optical system suitable, on the one hand, for focusing a light beam coming from the light source into at least one light point surrounded by an unlit area, said at least one light point being intended to light a point of the object to be observed belonging to an observed plane, and on the other hand, for focusing a light beam coming from the lighting point, into a light point in a first image plane, said optical system comprising a microscope objective focused on said observed plane of said object to be observed, crossed by said light beam before it reaches said object to be observed, collecting said light beam coming from said object to be observed, and remaining fixed relative to said object to be observed for the duration observation of said observed plane,
  • a first spatial filtering system arranged in the first image plane and suitable for filtering the light point to obtain a beam to be detected coming from the filtered light point
  • a scanning device placed on the path of said lighting beam between said light source and said at least one lighting point, and adapted so that said at least one lighting point scans the object to be observed along said plane observed,
  • an interferometric device suitable for generating a reference beam coming from said light source, which does not pass through the object to be observed, and which is superimposed on said light beam coming from the object to be observed, - at least one sensor for recording the superposition of said beam to be detected and of said reference beam, characterized in that said interferometric device is suitable for:
  • the spatial filtering system can be for example a microscopic hole, an array of microscopic holes, a sectioned end of optical fiber, or a “point” detector.
  • the scanning device can be constituted for example by one or two galvanometric mirrors, or by a rotating Nipkow disk.
  • the interferometric device can for example be an interferometric objective (Linnik, Mirau, or other).
  • the sensor can for example be a CCD matrix sensor or a photomultiplier tube.
  • the invention differs from the state of the art (patent number US 6,124,930) in that the interferometric device is placed between the scanning device and the object to be observed.
  • this solution makes it possible to make the phase differences between the light beam and the reference beam independent of the scanning mode used and the inaccuracies of the scanning device, insofar as the scanning device simultaneously affects the reference beam and the light beam coming from the object to be observed.
  • the system can be designed so that the image of a reflecting plane perpendicular to the optical axis of the microscope is a constant when the objective is focused on this plane.
  • this is obtained by means of a microscope also characterized in that said interferometric device comprises a reference mirror reflecting the reference wave, and conjugated to said first image plane.
  • said interferometric device and said microscope objective are combined into an interferometric objective.
  • said interferometric objective can be an interferometric objective of Linnik or of Mirau. Such configurations simplify the system.
  • the microscope also comprises means for moving said interferometric objective in the direction of the optical axis of the light beam reaching said object to be observed, outside the duration of observation of said observed plane, to modify the position of the plane observed in the object to be observed.
  • This allows a Z scanning of the sample without moving the sample or the microscope as a whole. This solution is useful when the object to be observed (eye, skin) can hardly be moved.
  • WO 02/35179 describes a solution consisting in using for example an arc lamp filtered by a hole as shown in FIG. 2 "kasten A" of this patent. If the hole is small enough (at the diffraction limit) the method is equivalent to using a spatially coherent source like a femtosecond laser, but with a very low available light intensity. If the size of the hole is increased, the light intensity increases, but the lateral resolution decreases because only one detector is used (single-point detector) while the illuminated area is several times larger than the diffraction limit.
  • the present invention proposes a solution to this problem which makes it possible to use a spatially incoherent source without losing resolution and by limiting as much as possible the loss of dynamics. According to a characteristic of the invention, this problem is solved by a microscope also characterized by the following facts:
  • said light source is an extended source of non-coherent light, it comprises a second device for filtering the beam coming from said light source, for dividing the lighting beam into a plurality of lighting sub-beams,
  • the optical system is adapted, on the one hand, to focus the plurality of lighting sub-beams at a plurality of corresponding lighting points on the observed plane of the object to be observed, and on the other hand, to focusing the plurality of light sub-beams from the plurality of light points into a plurality of light points on the first spatial filtering system
  • the first spatial filtering system is adapted to individually filter each light point coming from each illuminated point of the object to be observed in order to obtain a plurality of corresponding sub-beams to be detected.
  • the light source can for example be a white light source (halogen lamp or Xenon arc lamp), so as to optimize the resolution along the optical axis. It is also possible to use a mercury arc lamp, or a light-emitting diode, but these solutions are less favorable in terms of resolution.
  • the first and second beam filtering devices can be networks of microscopic holes, whether or not they are merged. This solution provides white light lighting at a much lower cost than a femtosecond laser and without the potential dangers of the femtosecond laser. The low intensity of the lighting in white light is compensated for by the use of a plurality of lighting points, which makes it possible to obtain a rapid scanning from a source of white light which is not very expensive.
  • the detector can for example be a CCD sensor coupled to scanning as in US patent 5,239, 178.
  • a CCD sensor coupled to scanning as in US patent 5,239, 178.
  • such a solution poses difficult synchronization problems between scanning and acquisition, and limits the image acquisition speed, which is mainly limited by the sensor acquisition speed.
  • this problem is solved when said optical system is adapted to focus the beam to be detected at at least one detection point, and said scanning device is adapted so that said beam to be detected scans a second image plane in which said at least one sensor is placed, when said at least one lighting point scans said observed plane.
  • the sensor can then integrate the entire image during the scanning time, and the image can then be read on the sensor.
  • the speed of acquisition of an image is therefore limited only by the scanning speed of the system, which makes it insensitive to possible movements of the sample. This is particularly important during a direct dermatological examination.
  • the image reading time is independent of the acquisition time and is therefore a limiting factor only when one seeks to obtain, for example, a three-dimensional image or a temporal sequence of images.
  • the sensor integration time sensor simply needs to be synchronized with the scan, which simplifies synchronization issues.
  • the scanning device can be a Nipkow disk.
  • the Nipkow disc system has the disadvantage that the instabilities of the disc quickly result in image defects, and that the circular trajectory of the scanning points results in great difficulty in obtaining homogeneous lighting. According to the invention, this problem is solved by means of a microscope in which:
  • said scanning device comprises at least one mobile mirror in rotation on which are reflected, on the one hand, the lighting beam to allow said at least one lighting point to scan the object to be observed along said observed plane, and on the other hand, said light beam coming from said illuminated point of the object to be observed to bring the light point to a fixed point on said first image plane,
  • said optical system and said first spatial filtering system are adapted to return said beam to be detected on said rotating mobile mirror
  • - said optical system is also suitable for focusing said beam to be detected, reflected on the mobile mirror, at a point to detecting in said second image plane to obtain, in said second image plane, a displacement of said point to be detected proportional to the displacement of said illuminated point in said observed plane of the object to be observed.
  • the reflection of said beam to be detected on said rotating mobile mirror can be carried out on the same face or on a different face of a mirror which may have one, two, or more faces.
  • the trajectory of the lighting points can be made rectilinear.
  • the microscope is also, according to a characteristic of the invention, characterized by the following facts: - said at least one mirror movable in rotation comprises an object face and an image face opposite to said object face,
  • the system then becomes very sensitive to the instabilities of the Nipkow disk and this type of device rarely reaches resolutions as high as it is desirable.
  • This problem can also be present in a galvanometric mirror system as described here, when for example the first and the second filtering system are one and the same array of microscopic holes.
  • the microscope is also characterized by the following facts:
  • said first spatial filtering system comprises at least one first microscopic hole
  • said second spatial filtering system is distinct from said first spatial filtering system and comprises at least one second microscopic hole
  • said optical system comprises a beam splitter for directing the light beam coming from said second spatial filtering system, towards said object side, and for directing the light beam coming in the opposite direction from said object face, towards said first spatial filtering system.
  • the displacement of a lighting point must be exactly reproduced, to within a scale factor, by the displacement of a corresponding point to be detected on the sensor. This is effectively the case when the microscope includes:
  • the microscope can be characterized by the following facts:
  • said scanning device comprises at least one object lens traversed by said light beam coming from said object to be observed directed towards said movable mirror
  • said scanning device comprises at least one image lens traversed by said beam to be detected coming from said movable mirror and directed towards said second image plane
  • the deformable links between the two frames make it possible to cut the transmission of vibrations, and the relative movements of the two frames, due to the optical configuration chosen, have only a marginal influence on the image formed in the plane. of the sensor.
  • heterodyne detection can be carried out by means of, for example, a piezoelectric mirror used to vary the phase of the reference wave. In this case it is necessary to successively acquire images corresponding to each phase shift.
  • This technique is very sensitive to vibrations which can affect the system between two image acquisitions.
  • An objective of the invention is to improve the robustness of the system with respect to vibrations. To this end, and according to a characteristic of the invention, the microscope is characterized by the following facts:
  • said optical system includes means for polarizing the light beam
  • said interferometric device comprises means for polarizing the reference beam, so that the respective polarizations of the light beam and the reference beam are orthogonal to one another when these beams are superposed.
  • the reference wave then being polarized orthogonally to the wave coming from the object, it is then possible to distinguish these two waves.
  • the reference wave and the wave coming from the object can have linear, circular or elliptical polarizations but these polarizations must be orthogonal between them so that it is possible to separate the two waves or to distinguish them.
  • This phase shift can for example be achieved using a retarder blade.
  • this retarding blade is achromatic.
  • several detectors can be used and a distinct phase shift is applied to the waves interfering with each sensor. According to a characteristic of the invention, this is achieved by means of a microscope also characterized by the following facts:
  • said microscope comprises three separate sensors, each of said sensors is preceded by a polarizer,
  • FIG. 1 represents a first embodiment of the invention.
  • Figure 2 shows an interferometric objective.
  • Figure 3 illustrates how the phase shifts between the reference wave and the reflected wave are generated.
  • FIG. 4 represents a second embodiment.
  • FIG. 5 represents a third embodiment.
  • FIG. 6 illustrates the scanning method used in the third embodiment.
  • FIG. 1 A broadband laser beam 601 polarized at 45 degrees from the plane of the figure constitutes the lighting beam FE.
  • This light beam FE therefore comes from a light source consisting for example of a pulsed femtosecond laser.
  • the lighting beam FE is reflected by the semi-transparent mirror 602. It is reflected by the galvanometric mirror 603 movable in rotation about an axis located in the plane of the figure. It is reflected by the galvanometric mirror 604 movable in rotation about an axis orthogonal to the plane of the figure.
  • These movable mirrors 603 and 604 constitute the scanning device.
  • the lighting beam FE then enters an interferometric objective 605.
  • the part of the lighting beam FE which passes through the interferometric objective 605 is then focused at a lighting point 620 of the object to be observed 606.
  • the light beam FD reflected or diffiracted by the sample is collected by the interferometric objective 605 which superimposes it on a reference beam FR coming from the lighting beam and generated by said interferometric objective.
  • the two beams FD and FR are reflected on the galvanometric mirrors 604 and 603, pass through the semi-transparent mirror 602, are focused, by a lens 607 on a microscopic hole 608 constituting a first spatial filtering system.
  • the microscopic hole 608 is in a focal plane of the lens 607.
  • the other focal plane of this lens is preferably merged with the image focal plane of the interferometric objective 605.
  • Figure 2 shows the detail of the interferometric objective 605, in a Linnik configuration.
  • the lighting beam FE reaches a polarizing beam splitter 170 which separates it into a beam of reference FR and a lighting beam FE.
  • the light beam FE passes through the objective 171 and reaches the sample or object to be observed 606 which diffracts and / or reflects it.
  • the light beam FD coming from the lighting point 620 of the object to be observed 606 crosses the objective 171 and the polarizing beam splitter 170, then leaving the interferometric objective.
  • the reference beam FR passes through the objective 173, is reflected by the reference mirror 174, crosses the objective 173, is reflected by the polarizing beam splitter 170, and then emerges from the interferometric objective.
  • the polarizing beam splitter 170, the objective 173, and the reference mirror 174 therefore constitute an interferometric device making it possible to generate a reference beam FR. Because a polarizing beam splitter is used, the beams FR and FD leaving the interferometric objective are polarized orthogonally to one another. The light beam FD having passed through the microscopic hole 608 will be called the beam to be detected
  • the beams FD1 and FR then reach a partially transparent mirror 609 which reflects a third of the incident power.
  • the part of the beams which passes through the partially transparent mirror 609 reaches a semi-transparent mirror 610.
  • the part of the beams which passes through the semi-transparent mirror 610 then crosses a third wave plate 613 then a polarizer 614 and arrives at a sensor 615.
  • the part of the beams which is reflected by the semi-transparent mirror 610 passes through a polarizer 611 and reaches a sensor 612.
  • the part of the beams which is reflected by the mirror 609 crosses a third wave plate 616 and a polarizer 617 then arrives at the sensor 618.
  • the polarizers 611, 614, 617 are oriented at 45 degrees from the plane of FIG. 1.
  • the third wave plates 613 and 616 have the utility of introducing respective phase shifts of 120 degrees and -120 degrees between the reference wave constituted by the reference beam FR and the wave to be detected constituted by the beam to detect FD1 before these waves interfere.
  • Figure 3 shows the principle of this phase shift.
  • A represents the complex amplitude of the electric field vector of the beam to be detected FD1
  • B represents the complex amplitude of the electric field vector of the reference beam FR.
  • e J P which is illustrated by Figure 3 (b).
  • ⁇ ⁇ .
  • the polarizer projects these two vectors in a direction located at 45 degrees from each of them and adds them up, so that we obtain the vector illustrated by FIG. 3 (c) of complex amplitude A + Be ⁇ .
  • the third wave plates 613 and 616 are oriented relative to the polarizers 614 and 617 to correspond respectively to
  • the third wave blades used should be achromatic.
  • the signals from sensors 612, 615, 618 are sampled synchronously. From the intensities detected on each sensor at a given time, the complex amplitude of the beam to be detected FD1 is calculated by a computer or a dedicated circuit by applying the following formula:
  • the microscope also has a device 619, for example piezoelectric, for positioning the object to be observed 606 in the vertical direction. It is therefore possible to scan the object to be observed 606 in an observed plane using the galvanometric mirrors, and to scan it vertically using the positioning device 619. Alternatively, when it is not possible to move the he object to be observed, it is rather possible to move the interferometric object 605 as a whole along the vertical, so as to scan along the vertical without moving the object or the body of the microscope.
  • a confocal microscope of the most common type is similar to the present apparatus but uses a simple objective (non-interferometric) and has a single sensor placed behind the microscopic hole.
  • Each position of the galvanometric mirrors corresponds to a given intensity of the beam to be detected.
  • the computer From the set of intensities detected for each position of the galvanometric mirrors and for each position of the object to be observed 606 along the vertical, the computer reconstructs a real three-dimensional image of the object to be observed 606.
  • the operation of the present device is similar, but the detected intensities are replaced by the complex values S obtained for each position of the galvanometric mirrors 603, 604 and of the positioning device 619. From all of these complex values, the computer reconstructs a complex three-dimensional image of the object to be observed 606. It is then possible, if necessary, to extract the module from these complex values in order to obtain a real representation which can be viewed on a computer screen.
  • the complex three-dimensional representation obtained can be improved by deconvolution.
  • This deconvolution requires the prior measurement of the "Point Spread Function” (system response for a point object).
  • This PSF is complex and can be measured for example on a reflecting microbead.
  • the lighting beam FE comes from a non-coherent temporally extended light source 200, for example a halogen lamp, provided with a collector and / or a device for lighting by Kôhler.
  • the lighting beam FE crosses the polarizing beam splitter 206 and then reaches the scanning device consisting of a Nipkow 205 disc rotating around an axis 204.
  • the Nipkow 205 disc also plays the role of a second device here. filtering device for dividing the lighting beam FE into a plurality of lighting sub - beams. There is shown in Figure 4, in solid lines, the trajectory of a beam from a microscopic hole in the Nipkow disc 205.
  • the interferometric objective 208 is for example of the type shown in FIG. 2, but unlike the first embodiment the beam splitter 170 is not polarizing.
  • the assembly consisting of the objective 173 and the reference mirror 174 is movable in the direction of the optical axis of the objective 173. It can be positioned in this direction using a piezoelectric positioner .
  • the beam splitter 170 not being polarizing, the beams FR and FD have the same polarization at the output of the interferometric objective.
  • the phase difference between FR and FD can be modified by moving the assembly consisting of the objective 173 and the reference mirror 174, in the direction of the optical axis of the objective 173.
  • the FR and FD beams leaving the objective 208 pass through the quarter-wave plate 201 and the tube lens 207 which focuses them on the Nipkow disc 205 constituting a first spatial filtering system.
  • the light beam having crossed the Nipkow 205 disc will be called the beam to detect FDl.
  • the beams FR and FDl pass through the disc of Nipkow 205, are reflected by the polarizing beam splitter 206, and are focused by the tube lens 210 on the CCD sensor 212 at at least one detection point, and reach the CCD sensor 212 .
  • the microscope is also provided with a device 213 for vertical positioning of the object to be observed 209, for example piezoelectric.
  • a confocal image is formed on the CCD sensor 212.
  • This confocal image results from the interference between the reference beam FR and the beam to be detected FD 1 coming from the object to be observed.
  • the phase difference between these two beams is controlled by means of the mobile assembly consisting of the objective 173 and the reference mirror 174.
  • a first image is obtained for a phase difference ⁇ .
  • a second image is then obtained for a difference of n 2 ⁇ ⁇ 2 ⁇ phase ⁇ H.
  • a third image is then obtained for a phase difference ⁇ .
  • the module of the complex image thus obtained can possibly be calculated to obtain a real image which can be represented on a computer screen.
  • a series of complex images can be obtained for different depths in the object to be observed 209, the positioner 213 being used to successively focus the objective on different planes of the object to be observed 209. From this series d complex images, a three-dimensional image complex of the object to be observed 209 can be reconstructed. This three-dimensional image can be improved by deconvolution, as in the first embodiment.
  • the complex unconverted image, or its module, can be used to display a good quality image on a computer screen.
  • This third embodiment is represented by FIG. 5. It is based on a configuration similar to that used in the French patent application number 01/02254 of 20/2/01 concerning a fast confocal microscope, filed by V. Lauer.
  • the lighting beam FE comes from a temporally non-coherent extended light source 431, for example a halogen lamp provided with a collector 432 which generates a quasi-collimated beam 410. It crosses a polarizer 433 selecting a direction of orthogonal polarization in the plane of the figure, and reaches a second filtering device 409 consisting of a network of microscopic holes making it possible to divide the lighting beam FE into a plurality of lighting sub-beams.
  • the array of microscopic holes 409 is for example a square or hexagonal mesh array. The trajectory of a beam from a microscopic hole in the network 409 has been shown in thin lines.
  • the part of the FE lighting beam which crosses the array of microscopic holes 409 then crosses the lens 408 and is then reflected by the semi-transparent mirror 407.
  • This FE lighting beam is then reflected by the object face 406 (a) of the galvanometric mirror 406 which constitutes the scanning device. It then crosses the object lens 405 then passes through an image plane 404, crosses the tube lens 403 and reaches the interferometric objective 402 which is the same as that used in the first embodiment and represented in fig 2.
  • This interferometric objective is focused on an object to be observed 401 itself fixed on a positioner allowing positioning in the direction of the optical axis.
  • the lighting sub-beam FE coming from a microscopic hole in the network 409 is focused at a lighting point 434 of the object to be observed 401.
  • the light sub-beam FD coming from this point 434 then arrives at a point particular of the array of microscopic holes 413.
  • the reference beam FR reflected by the reference mirror of the interferometric objective arrives at the same point of the array 413.
  • the two arrays must be positioned so that the point reached by these beams FR , FD on network 413 or on a microscopic hole.
  • Networks 413 and 409 are therefore combined (network 413 is the image of network 409).
  • the light beam FD having passed through the array of microscopic holes 413 will be called the beam to detect FDl.
  • the beams FD1 and FR are then reflected by the redirection mirror 14 and pass through the control lenses 415 then 416. They are reflected by the redirection mirrors 417 and 418. They pass through the control lens 419 and are reflected by the image face 406 (b) of the galvanometric mirror 406. They then pass through the image lens 420.
  • the beams FD1 and FR then reach the partially transparent mirror 421 which reflects a third of the light intensity.
  • the part of the beam which passes through the mirror 421 then reaches the semi-transparent mirror 425.
  • the part of the beam which passes through the mirror 425 then passes through the polarizer 429 and reaches the sensor 430 at at least one detection point.
  • the part of the beam which is reflected by the semi-transparent mirror 425 then crosses the third wave plate 426 and the polarizer 427, and reaches the CCD sensor 428 at at least one detection point.
  • the part of the beam which is reflected by the partially transparent mirror 421 then crosses the third wave plate 422, the polarizer 423, and reaches the CCD sensor 424 at at least one detection point.
  • control lenses 411, 415, 416, 419 have the same focal length.
  • the lens 408 has a focal plane on the grating 409 and the other on the galvanometric mirror 406.
  • the control lens 411 has a focal plane on the mirror 406 and a focal plane on the grating 413.
  • the control lens 415 has a focal plane on the grating 413 and its other focal plane is also a focal plane of the control lens 416.
  • the second focal plane of the control lens 416 is also a focal plane of the control lens 419.
  • the second focal plane of the control lens 419 is on the galvanometric mirror 406.
  • the lens 405 has a focal plane in the plane 404 and the other on the mirror 406.
  • the lens 420 has a focal plane on the mirror 406 and a focal plane on the sensor 430.
  • the third wave plate 422 has its fast axis in the plane of the figure.
  • the third wave plate 426 has its slow axis in the plane of the figure.
  • the polarizers 423 and 427 have the same orientation, at 45 degrees from the plane of the figure.
  • the polarizer 429 is also oriented at 45 degrees from the plane of the figure.
  • the CCD sensors are in focal planes of the image lens 420. They are positioned so that the image of a point of the object to be observed 401 is on the same pixel of each of the sensors.
  • the galvanometric mirror 406 is movable in rotation about an axis orthogonal to the plane of the figure.
  • the array of microscopic holes 413 is oriented so that the image of a fixed point of the object to be observed 401 moves over the array of microscopic holes 413 along a path 500 shown in FIG. 6. In this way the entire observed area is scanned by all the points of the network of microscopic holes.
  • a confocal image of the object to be observed 401 would form on the sensor 430, similar to that which can be obtained using a Nipkow disc microscope. .
  • the image formed on the sensor 430 results from the coherent superposition of the beams FR and FDl.
  • the principle of using the wave plates and the polarizers in the detection device is the same as in the first embodiment, and therefore images are formed on the sensors 424 and 428 resulting from the interference of the beam of reference FR with the beam to be detected FD1 having undergone an offset of 120 degrees for the sensor 424 and -120 degrees for the sensor 428. From the three real images obtained, a complex image is obtained.
  • the value of the complex image in a given pixel is obtained by the formula: or I x is the intensity detected on the corresponding pixel of sensor number X.
  • the module of the complex image thus obtained can possibly be calculated to obtain a real image which can be represented on a computer screen.
  • a series of complex images can be obtained for different depths in the object to be observed 401, a piezoelectric positioner being used to successively focus the objective on different planes of the object to be observed 401. From this series d complex images, a complex three-dimensional image of the object to be observed 401 can be reconstructed. This three-dimensional image can be improved by deconvolution, as in the first embodiment.
  • the complex unconverted image, or its module can be used to display a good quality image on a computer screen.
  • the wave plates should preferably be achromatic.
  • This embodiment allows deconvolution under favorable conditions: in fact, the PSF is constant over the entire image, unlike the case of the Nipkow disc.
  • the sub-assembly 440 made up of the scanning and compensation system can be mounted on a frame different from the sub-assembly 441. This makes it possible not to transmit the vibrations generated by the galvanometric mirror to the object to be observed 401.
  • the present microscope can for example be used for the observation of skin sections or in ophthalmology for the observation of the eye.

Abstract

The invention concerns a microscope for coherent optical tomography, comprising: a light source, an optical system for focusing an illuminating beam (FE) in an illumination point (620) of a sample (606) and for focusing a light beam (FD) from an illuminating point in a light point in a first picture plane (P1), a spatial filtering system (608) arranged in the first picture plane (P1) to obtain a beam to be detected (FD1), a scanning device (603, 604) for scanning the sample; an interferometric device (605) to generate a reference beam (FR) which is superimposed to said light beam (FD); at least a sensor (612, 615, 618) for recording the superimposition of FD1 and FR, the interferometric device (605) being adapted to separate the illuminating beam (FE) derived from the scanning device and directed towards the sample into a light beam (FE) directed towards the sample and a reference beam (FR) which does not reach the sample and to superimpose FR to the light beam (FD) derived from the sample and directed towards the scanning device.

Description

Microscope pour la tomographie optique cohérente Microscope for coherent optical tomography
Domaine technique L'invention concerne un microscope pour la tomographie optique cohérente, permettant l'obtention d'images en coupe d'un objet à observer.Technical Field The invention relates to a microscope for coherent optical tomography, making it possible to obtain sectional images of an object to be observed.
Technique antérieure.Prior art.
Le microscope décrit dans la publication « In vivo retinal imaging », optics letters vol.18 no 21 p.1864, 1er novembre 1993, par Swanson & al., utilise la technique de la tomographie optique cohérente. L'échantillon est scanné au moyen d'un microscope confocal mais l'onde réfléchie par l'échantillon revient dans une fibre optique qui sert également de système de filtrage spatial. Elle est transmise par la fibre optique vers un coupleur au moyen duquel on la fait interférer avec une onde de référence pour détecter sur un détecteur un signal résultant de cette interférence. Un système de balayage longitudinal permet de modifier le chemin optique parcouru par l'onde de référence. Le signal reçu sur le capteur est maximal lorsque l'onde de référence et l'onde provenant de l'objet sont en phase. La détection de ce maximum permet de déterminer la réflectivité de l'objet à observer en un point qui balaye l'objet dans le sens de l'axe optique, le balayage étant produit par les variations de chemin optique parcouru par l'onde de référence. Par ailleurs, comme indiqué dans l'article « femtosecond transillumination optical cohérence tomography », Optics Letters vol.18 no 12 p.950 du 15 juin 1993 par Hee & al., l'obtention d'images de bonnes qualité d'un objet complexe nécessite l'utilisation d'une source de lumière blanche constituée par exemple par un laser femtoseconde, très coûteux. Le balayage horizontal de l'échantillon peut être effectué au moyen d'un miroir galvanométrique comme indiqué dans le brevet US 6,124,930. Dans le cas d'un système comme décrit dans le brevet US 6,124,930 les vibrations incontrôlées des miroirs galvanométriques se traduisent par des erreurs sur la différence de chemin optique entre l'onde de référence et l'onde réfléchie par l'objet, qui introduisent une dégradation de la qualité de l'image, principalement pour les systèmes ayant une résolution élevée dans le sens de l'axe des Z. La source spatialement cohérente de lumière blanche (laser femtoseconde) est coûteuse et peut être remplacée par une source de lumière non cohérente comme indiqué dans le brevet WO 02/35179.The microscope described in the publication "In vivo retinal imaging," Optics letters vol.18 p.1864 No. 21, November 1, 1993, by Swanson et al., Uses the technique of optical coherence tomography. The sample is scanned using a confocal microscope but the wave reflected by the sample returns to an optical fiber which also serves as a spatial filtering system. It is transmitted by optical fiber to a coupler by means of which it is made to interfere with a reference wave to detect on a detector a signal resulting from this interference. A longitudinal scanning system makes it possible to modify the optical path traveled by the reference wave. The signal received on the sensor is maximum when the reference wave and the wave coming from the object are in phase. The detection of this maximum makes it possible to determine the reflectivity of the object to be observed at a point which scans the object in the direction of the optical axis, the scanning being produced by the variations in optical path traveled by the reference wave. . Furthermore, as indicated in the article "femtosecond transillumination optical coherence tomography", Optics Letters vol.18 no 12 p.950 of June 15, 1993 by Hee & al., Obtaining good quality images of an object complex requires the use of a white light source constituted for example by a femtosecond laser, very expensive. The horizontal scanning of the sample can be carried out by means of a galvanometric mirror as indicated in US Pat. No. 6,124,930. In the case of a system as described in US Pat. No. 6,124,930, the uncontrolled vibrations of the galvanometric mirrors result in errors in the difference in optical path between the reference wave and the wave reflected by the object, which introduce a deterioration of image quality, mainly for systems with high resolution in the Z-axis direction. The spatially coherent white light source (femtosecond laser) is expensive and can be replaced by a non-light source consistent as indicated in patent WO 02/35179.
Description de l'inventionDescription of the invention
Un premier but de l'invention est de réaliser un microscope pour la tomographie optique cohérente qui permette l'imagerie en temps réel d'un échantillon microscopique, avec une résolution élevée suivant l'axe optique. L'appareil décrit dans le brevet US 6,124,930 utilise un miroir galvanométrique pour le balayage d'un plan, ce qui améliore la vitesse de balayage. Il résout en partie le problème des écarts de phase causés par le mouvement du miroir galvanométrique, en positionnant le miroir galvanométrique en un point approprié du système d'éclairage. Toutefois : - l'auteur suppose que les deux miroirs de balayage ont un centre de rotation commun. Ceci est une approximation qui entraîne des écarts par rapport à la théorie. En réalité, les deux miroirs ont des centres de rotation distincts et lors du balayage d'un plan observé, le signal de l'interféromètre n'est pas parfaitement constant. - l'auteur néglige également les phénomènes de vibrations du miroir galvanométrique : une vibration de quelques microns du miroir galvanométrique entraîne une imprécision comparable du système interférométrique, dans le sens du balayage en Z.A first object of the invention is to produce a microscope for coherent optical tomography which allows real-time imaging of a microscopic sample, with a high resolution along the optical axis. The apparatus described in US Pat. No. 6,124,930 uses a galvanometric mirror for scanning a plane, which improves the scanning speed. It partly solves the problem of phase differences caused by the movement of the galvanometric mirror, by positioning the galvanometric mirror at an appropriate point in the lighting system. However: - the author supposes that the two scanning mirrors have a common center of rotation. This is an approximation which leads to deviations from the theory. In reality, the two mirrors have separate centers of rotation and when scanning an observed plane, the signal from the interferometer is not perfectly constant. - the author also neglects the phenomena of vibrations of the galvanometric mirror: a vibration of a few microns of the galvanometric mirror leads to a comparable imprecision of the interferometric system, in the direction of scanning in Z.
Le dispositif décrit dans le brevet numéro US 6,124,930 est donc affecté par une imprécision suivant l'axe optique. Cette imprécision est tolérable dans certains cas (imagerie de la rétine par exemple) mais lorsque une définition élevée est recherchée cette imprécision doit être évitée. C'est le but de la présente invention. Le but recherché est atteint, dans la présente invention, au moyen d'un microscope optique destiné à permettre une visualisation d'un objet à observer éclairé par une source lumineuse, et comprenant :The device described in patent number US 6,124,930 is therefore affected by an imprecision along the optical axis. This imprecision is tolerable in certain cases (imaging of the retina for example) but when a high definition is sought this imprecision must be avoided. This is the object of the present invention. The aim sought after is achieved, in the present invention, by means of an optical microscope intended to allow visualization of an object to be observed illuminated by a light source, and comprising:
- un système optique adapté, d'une part, pour focaliser un faisceau d'éclairage provenant de la source lumineuse en au moins un point d'éclairage entouré par une zone non éclairée, ledit au moins un point d'éclairage étant destiné à éclairer un point de l'objet à observer appartenant à un plan observé, et d'autre part, pour focaliser un faisceau lumineux provenant du point d'éclairage, en un point lumineux dans un premier plan image, ledit système optique comportant un objectif de microscope focalisé sur ledit plan observé dudit objet à observer, traversé par ledit faisceau d'éclairage avant qu'il ne parvienne audit objet à observer, collectant ledit faisceau lumineux provenant dudit objet à observer, et restant fixe par rapport audit objet à observer pendant la durée d'observation dudit plan observé,an optical system suitable, on the one hand, for focusing a light beam coming from the light source into at least one light point surrounded by an unlit area, said at least one light point being intended to light a point of the object to be observed belonging to an observed plane, and on the other hand, for focusing a light beam coming from the lighting point, into a light point in a first image plane, said optical system comprising a microscope objective focused on said observed plane of said object to be observed, crossed by said light beam before it reaches said object to be observed, collecting said light beam coming from said object to be observed, and remaining fixed relative to said object to be observed for the duration observation of said observed plane,
- un premier système de filtrage spatial disposé dans le premier plan image et adapté pour filtrer le point lumineux pour obtenir un faisceau à détecter issu du point lumineux filtré,a first spatial filtering system arranged in the first image plane and suitable for filtering the light point to obtain a beam to be detected coming from the filtered light point,
- un dispositif de balayage, placé sur le chemin dudit faisceau d'éclairage entre ladite source lumineuse et ledit au moins un point d'éclairage, et adapté pour que ledit au moins un point d'éclairage balaye l'objet à observer suivant ledit plan observé,a scanning device placed on the path of said lighting beam between said light source and said at least one lighting point, and adapted so that said at least one lighting point scans the object to be observed along said plane observed,
- un dispositif interférométrique adapté pour générer un faisceau de référence issu de ladite source lumineuse, qui ne passe pas par l'objet à observer , et qui se superpose audit faisceau lumineux provenant de l'objet à observer , - au moins un capteur pour enregistrer la superposition dudit faisceau à détecter et dudit faisceau de référence, caractérisé par le fait que ledit dispositif interférométrique est adapté pour :- an interferometric device suitable for generating a reference beam coming from said light source, which does not pass through the object to be observed, and which is superimposed on said light beam coming from the object to be observed, - at least one sensor for recording the superposition of said beam to be detected and of said reference beam, characterized in that said interferometric device is suitable for:
- séparer le faisceau d'éclairage provenant dudit dispositif de balayage et dirigé vers ledit échantillon, en un faisceau d'éclairage dirigé vers ledit objet à observer, et en un faisceau de référence qui n'atteint pas l'objet à observer,- separating the light beam coming from said scanning device and directed towards said sample, into a light beam directed towards said object to be observed, and into a reference beam which does not reach the object to be observed,
- superposer ledit faisceau de référence au faisceau lumineux provenant dudit objet à observer et dirigé vers ledit dispositif de balayage, pour que ledit dispositif de balayage affecte simultanément, dans le sens source lumineuse vers objet à observer, le faisceau d'éclairage et le faisceau de référence non encore séparé du faisceau d'éclairage, et pour que ledit dispositif de balayage affecte simultanément, dans le sens objet à observer vers capteur, ledit faisceau lumineux et ledit faisceau de référence superposé au faisceau lumineux. Du fait que le dispositif de balayage affecte simultanément le faisceau lumineux et le faisceau de référence, ses imperfections ne modifient pas la différence de phase entre ces deux faisceaux et ne se traduisent donc pas par des erreurs concernant la profondeur de coupe ou par une perte de résolution verticale. Les imperfections du dispositif de balayage ne génèrent pas non plus un décalage entre les points de focalisation du faisceau lumineux et du faisceau de référence. Les problèmes mentionnés ci-dessus et concernant par exemple le système décrit dans le brevet US 6, 124,930 sont donc résolus par la présente invention.- superimposing said reference beam on the light beam coming from said object to be observed and directed towards said scanning device, so that said scanning device simultaneously affects, in the direction of light source towards object to be observed, the lighting beam and the reference beam not yet separated from the lighting beam, and so that said scanning device simultaneously affects, in the direction of the object to be observed towards the sensor, said light beam and said reference beam superimposed on the light beam. Since the scanning device simultaneously affects the light beam and the reference beam, its imperfections do not modify the phase difference between these two beams and therefore do not result in errors concerning the depth of cut or in a loss of vertical resolution. The imperfections of the scanning device also do not generate an offset between the focal points of the light beam and the reference beam. The problems mentioned above and relating for example to the system described in US Patent 6,124,930 are therefore resolved by the present invention.
Le système de filtrage spatial peut être par exemple un trou microscopique, un réseau de trous microscopiques, une extrémité sectionnée de fibre optique, ou un détecteur « ponctuel ».The spatial filtering system can be for example a microscopic hole, an array of microscopic holes, a sectioned end of optical fiber, or a “point” detector.
Le dispositif de balayage peut être constitué par exemple par un ou deux miroirs galvanométriques, ou par un disque de Nipkow en rotation.The scanning device can be constituted for example by one or two galvanometric mirrors, or by a rotating Nipkow disk.
Le dispositif interférométrique peut par exemple être un objectif interférométrique (Linnik, Mirau, ou autre).The interferometric device can for example be an interferometric objective (Linnik, Mirau, or other).
Le capteur peut par exemple être un capteur matriciel CCD ou un tube photomultiplicateur.The sensor can for example be a CCD matrix sensor or a photomultiplier tube.
L'invention se distingue de l'état de l'art (brevet numéro US 6,124,930) par le fait que le dispositif interférométrique est placé entre le dispositif de balayage et l'objet à observer. En particulier cette solution permet de rendre les différences de phase entre le faisceau lumineux et le faisceau de référence indépendantes du mode de balayage utilisé et des imprécisions du dispositif de balayage, dans la mesure ou le dispositif de balayage affecte simultanément le faisceau de référence et le faisceau lumineux provenant de l'objet à observer.The invention differs from the state of the art (patent number US 6,124,930) in that the interferometric device is placed between the scanning device and the object to be observed. In particular, this solution makes it possible to make the phase differences between the light beam and the reference beam independent of the scanning mode used and the inaccuracies of the scanning device, insofar as the scanning device simultaneously affects the reference beam and the light beam coming from the object to be observed.
Afin que la qualité d'image soit la meilleure possible sans traitements numériques complexes on peut concevoir le système de manière à ce que l'image d'un plan réfléchissant perpendiculaire à l'axe optique du microscope, soit une constante lorsque l'objectif est focalisé sur ce plan. Selon une caractéristique de l'invention, ceci est obtenu au moyen d'un microscope également caractérisé par le fait que ledit dispositif interférométrique comporte un miroir de référence réfléchissant l'onde de référence, et conjugué audit premier plan image. Selon une caractéristique de l'invention, ledit dispositif interférométrique et ledit objectif de microscope sont réunis en un objectif interférométrique. Par exemple, ledit objectif interférométrique peut être un objectif interférométrique de Linnik ou de Mirau. De telles configurations simplifient le système. Selon une caractéristique de l'invention le microscope comporte également des moyens pour déplacer ledit objectif interférométrique dans le sens de l'axe optique du faisceau d'éclairage parvenant audit objet à observer, en dehors de la durée d'observation dudit plan observé, pour modifier la position du plan observé dans l'objet à observer. Ceci permet d'effectuer un balayage en Z de l'échantillon sans déplacer pour autant l'échantillon ni le microscope dans son ensemble. Cette solution est utile lorsque l'objet à observer (œil, peau) peut difficilement être déplacé.So that the image quality is the best possible without complex digital processing, the system can be designed so that the image of a reflecting plane perpendicular to the optical axis of the microscope is a constant when the objective is focused on this plane. According to a characteristic of the invention, this is obtained by means of a microscope also characterized in that said interferometric device comprises a reference mirror reflecting the reference wave, and conjugated to said first image plane. According to a characteristic of the invention, said interferometric device and said microscope objective are combined into an interferometric objective. For example, said interferometric objective can be an interferometric objective of Linnik or of Mirau. Such configurations simplify the system. According to a characteristic of the invention, the microscope also comprises means for moving said interferometric objective in the direction of the optical axis of the light beam reaching said object to be observed, outside the duration of observation of said observed plane, to modify the position of the plane observed in the object to be observed. This allows a Z scanning of the sample without moving the sample or the microscope as a whole. This solution is useful when the object to be observed (eye, skin) can hardly be moved.
Toutefois, pour tirer pleinement parti de l'amélioration de précision liée à l'emploi de la technique ci-dessus, il est préférable d'utiliser une source large bande. Pour qu'un balayage monopoint soit possible, il faut que cette source soit ponctuelle. La solution usuelle consistant à utiliser un laser puisé femtoseconde est très coûteuse, nécessite des précautions d'utilisation et de mise en oeuvre importantes liées à la classe du laser, et présente également l'inconvénient d'être potentiellement délétère pour l'échantillon examiné, du fait de l'intensité élevée du faisceau. Ceci peut être gênant en particulier pour l'examen dermatologique direct des patients.However, to take full advantage of the improvement in precision associated with the use of the above technique, it is preferable to use a broadband source. For a single-point scan to be possible, this source must be punctual. The usual solution consisting in using a femtosecond pulsed laser is very expensive, requires considerable precautions for use and implementation related to the class of the laser, and also has the disadvantage of being potentially deleterious for the sample examined, due to the high beam intensity. This can be troublesome in particular for the direct dermatological examination of patients.
Le brevet WO 02/35179 décrit une solution consistant à utiliser par exemple une lampe à arc filtrée par un trou comme représenté sur la figure 2 « kasten A » de ce brevet. Si le trou est suffisamment petit ( à la limite de diffraction) la méthode est équivalente à l'utilisation d'une source spatialement cohérente comme un laser femtoseconde, mais avec une intensité lumineuse disponible très faible. Si la taille du trou est augmentée l'intensité lumineuse augmente, mais la résolution latérale diminue du fait qu'un seul détecteur est utilisé (détecteur monopoint) alors que la zone illuminée est de taille plusieurs fois supérieure à la limite de diffraction. Si le détecteur monopoint est remplacé par un CCD multipoint, une résolution acceptable est obtenue mais la dynamique de l'image formée est fortement diminuée du fait de la présence des faisceaux « parasites » provenant de points voisins de chaque point dont l'image est détectée. La présente invention propose une solution à ce problème qui permet d'utiliser une source spatialement incohérente sans perdre en résolution et en limitant au maximum la perte de dynamique. Selon une caractéristique de l'invention , ce problème est résolu par un microscope également caractérisé par les faits suivants :WO 02/35179 describes a solution consisting in using for example an arc lamp filtered by a hole as shown in FIG. 2 "kasten A" of this patent. If the hole is small enough (at the diffraction limit) the method is equivalent to using a spatially coherent source like a femtosecond laser, but with a very low available light intensity. If the size of the hole is increased, the light intensity increases, but the lateral resolution decreases because only one detector is used (single-point detector) while the illuminated area is several times larger than the diffraction limit. If the single-point detector is replaced by a multi-point CCD, an acceptable resolution is obtained but the dynamic range of the image formed is greatly reduced due to the presence of “stray” beams coming from points close to each point whose image is detected. . The present invention proposes a solution to this problem which makes it possible to use a spatially incoherent source without losing resolution and by limiting as much as possible the loss of dynamics. According to a characteristic of the invention, this problem is solved by a microscope also characterized by the following facts:
- ladite source lumineuse est une source étendue de lumière non cohérente, - il comporte un second dispositif de filtrage du faisceau issu de ladite source lumineuse, pour diviser le faisceau d'éclairage en une pluralité de sous-faisceaux d'éclairage,said light source is an extended source of non-coherent light, it comprises a second device for filtering the beam coming from said light source, for dividing the lighting beam into a plurality of lighting sub-beams,
- le système optique est adapté, d'une part, pour focaliser la pluralité de sous-faisceaux d'éclairage en une pluralité de points d'éclairage correspondants sur le plan observé de l'objet à observer, et d'autre part, pour focaliser la pluralité de sous-faisceaux lumineux provenant de la pluralité de points d'éclairage en une pluralité de points lumineux sur le premier système de filtrage spatialthe optical system is adapted, on the one hand, to focus the plurality of lighting sub-beams at a plurality of corresponding lighting points on the observed plane of the object to be observed, and on the other hand, to focusing the plurality of light sub-beams from the plurality of light points into a plurality of light points on the first spatial filtering system
- le premier système de filtrage spatial est adapté pour filtrer individuellement chaque point lumineux issu de chaque point éclairé de l'objet à observer afin d'obtenir une pluralité de sous-faisceaux à détecter correspondants.the first spatial filtering system is adapted to individually filter each light point coming from each illuminated point of the object to be observed in order to obtain a plurality of corresponding sub-beams to be detected.
La source de lumière peut par exemple être une source de lumière blanche (lampe halogène ou lampe à arc au Xénon), de manière à optimiser la résolution suivant l'axe optique. On peut aussi utiliser une lampe à arc au mercure, ou une diode électroluminescente, mais ces solutions sont moins favorables en termes de résolution. Le premier et le second dispositif de filtrage du faisceau peuvent être des réseaux de trous microscopiques confondus ou non. Cette solution permet d'obtenir un éclairage en lumière blanche à un coût très inférieur à un laser femtoseconde et sans les dangers potentiels du laser femtoseconde. La faiblesse de l'intensité de l'éclairage en lumière blanche est compensée par l'utilisation d'une pluralité de points d'éclairage, ce qui permet l'obtention d'un balayage rapide à partir d'une source de lumière blanche peu coûteuse. Dans cette version multipoints de l'invention, le détecteur peut être par exemple un capteur CCD couplé au balayage comme dans le brevet US 5,239, 178. Toutefois une telle solution pose de difficiles problèmes de synchronisation entre le balayage et l'acquisition, et limite la vitesse d'acquisition d'une image, qui est principalement limitée par la vitesse d'acquisition du capteur.The light source can for example be a white light source (halogen lamp or Xenon arc lamp), so as to optimize the resolution along the optical axis. It is also possible to use a mercury arc lamp, or a light-emitting diode, but these solutions are less favorable in terms of resolution. The first and second beam filtering devices can be networks of microscopic holes, whether or not they are merged. This solution provides white light lighting at a much lower cost than a femtosecond laser and without the potential dangers of the femtosecond laser. The low intensity of the lighting in white light is compensated for by the use of a plurality of lighting points, which makes it possible to obtain a rapid scanning from a source of white light which is not very expensive. In this multi-point version of the invention, the detector can for example be a CCD sensor coupled to scanning as in US patent 5,239, 178. However, such a solution poses difficult synchronization problems between scanning and acquisition, and limits the image acquisition speed, which is mainly limited by the sensor acquisition speed.
Selon une caractéristique de l'invention, ce problème est résolu lorsque ledit système optique est adapté pour focaliser le faisceau à détecter en au moins un point de détection, et ledit dispositif de balayage est adapté pour que ledit faisceau à détecter balaye un second plan image dans lequel est placé ledit au moins un capteur, lorsque ledit au moins un point d'éclairage balaye ledit plan observé. En effet, le capteur peut alors intégrer l'ensemble de l'image pendant le temps de balayage, et l'image peut être lue ensuite sur le capteur. La vitesse d'acquisition d'une image est donc limitée seulement par la vitesse de balayage du système, ce qui la rend peu sensible aux mouvements éventuels de l'échantillon. Ceci est particulièrement important lors d'un examen dermatologique direct. Le temps de lecture de l'image est indépendant du temps d'acquisition et n'est donc un facteur limitatif que lorsque on cherche à obtenir par exemple une image tridimensionnelle ou une séquence temporelle d'images. De plus, le capteur temps d'intégration du capteur doit simplement être synchronisé avec le balayage, ce qui simplifie les problèmes de synchronisation. Par exemple le dispositif de balayage peut être un disque de Nipkow. Toutefois, le système à disque de Nipkow présente l'inconvénient que les instabilités du disque se traduisent rapidement par des défauts de l'image, et que la trajectoire circulaire des points de balayage se traduit par une grande difficulté à obtenir un éclairage homogène. Selon l'invention, ce problème est résolu au moyen d'un microscope dans lequel :According to a characteristic of the invention, this problem is solved when said optical system is adapted to focus the beam to be detected at at least one detection point, and said scanning device is adapted so that said beam to be detected scans a second image plane in which said at least one sensor is placed, when said at least one lighting point scans said observed plane. Indeed, the sensor can then integrate the entire image during the scanning time, and the image can then be read on the sensor. The speed of acquisition of an image is therefore limited only by the scanning speed of the system, which makes it insensitive to possible movements of the sample. This is particularly important during a direct dermatological examination. The image reading time is independent of the acquisition time and is therefore a limiting factor only when one seeks to obtain, for example, a three-dimensional image or a temporal sequence of images. In addition, the sensor integration time sensor simply needs to be synchronized with the scan, which simplifies synchronization issues. For example, the scanning device can be a Nipkow disk. However, the Nipkow disc system has the disadvantage that the instabilities of the disc quickly result in image defects, and that the circular trajectory of the scanning points results in great difficulty in obtaining homogeneous lighting. According to the invention, this problem is solved by means of a microscope in which:
- ledit dispositif de balayage comporte au moins un miroir mobile en rotation sur lequel sont réfléchis, d'une part, le faisceau d'éclairage pour permettre audit au moins un point d'éclairage de balayer l'objet à observer suivant ledit plan observé, et d'autre part, ledit faisceau lumineux provenant dudit point éclairé de l'objet à observer pour amener le point lumineux en un point fixe sur ledit premier plan image,said scanning device comprises at least one mobile mirror in rotation on which are reflected, on the one hand, the lighting beam to allow said at least one lighting point to scan the object to be observed along said observed plane, and on the other hand, said light beam coming from said illuminated point of the object to be observed to bring the light point to a fixed point on said first image plane,
- ledit système optique et ledit premier système de filtrage spatial sont adaptés pour renvoyer ledit faisceau à détecter sur ledit miroir mobile en rotation, - ledit système optique est également adapté pour focaliser ledit faisceau à détecter, réfléchi sur le miroir mobile, en un point à détecter dans ledit second plan image pour obtenir, dans ledit second plan image, un déplacement dudit point à détecter proportionnel au déplacement dudit point éclairé dans ledit plan observé de l'objet à observer. Cette solution permet d'obtenir, par exemple à l'aide de miroirs galvanométriques, un balayage simultané de l'échantillon et du capteur, et d'enregistrer l'image sur le capteur de manière analogue à ce que permet l'utilisation d'un disque de Nipkow. La réflexion dudit faisceau à détecter sur ledit miroir mobile en rotation peut s'effectuer sur la même face ou sur une face différente d'un miroir qui peut avoir une, deux, ou d'avantage de faces. La trajectoire des points d'éclairage peut être rendue rectiligne. Afin de limiter au maximum l'inertie du miroir et les contraintes sur la conception des éléments optiques, il est cependant préférable d'utiliser deux faces opposées d'un même miroir mobile, par exemple galvanométrique, pour réfléchir le faisceau lumineux et le faisceau à détecter. A cette fin le microscope est également, suivant une caractéristique de l'invention, caractérisé par les faits suivants : - ledit au moins un miroir mobile en rotation comprend une face objet et une face image opposée à ladite face objet ,- said optical system and said first spatial filtering system are adapted to return said beam to be detected on said rotating mobile mirror, - said optical system is also suitable for focusing said beam to be detected, reflected on the mobile mirror, at a point to detecting in said second image plane to obtain, in said second image plane, a displacement of said point to be detected proportional to the displacement of said illuminated point in said observed plane of the object to be observed. This solution makes it possible to obtain, for example using galvanometric mirrors, a simultaneous scanning of the sample and the sensor, and to record the image on the sensor in a manner analogous to that which the use of a Nipkow record. The reflection of said beam to be detected on said rotating mobile mirror can be carried out on the same face or on a different face of a mirror which may have one, two, or more faces. The trajectory of the lighting points can be made rectilinear. In order to limit to maximum the inertia of the mirror and the constraints on the design of the optical elements, it is however preferable to use two opposite faces of the same movable mirror, for example galvanometric, to reflect the light beam and the beam to be detected. To this end, the microscope is also, according to a characteristic of the invention, characterized by the following facts: - said at least one mirror movable in rotation comprises an object face and an image face opposite to said object face,
- ledit système optique est adapté pour- said optical system is suitable for
(i) diriger ledit faisceau lumineux provenant de l'objet à observer, vers ladite face objet,(i) directing said light beam coming from the object to be observed, towards said object face,
(ii) diriger ledit faisceau lumineux provenant de ladite face objet, vers ledit premier système de filtrage spatial,(ii) directing said light beam coming from said object face, towards said first spatial filtering system,
(iii) diriger ledit faisceau à détecter provenant dudit premier système de filtrage spatial, vers ladite face image,(iii) directing said beam to be detected coming from said first spatial filtering system, towards said image face,
(iv) diriger ledit faisceau à détecter provenant de ladite face objet, vers ledit second plan image.(iv) directing said beam to be detected coming from said object face, towards said second image plane.
Dans le cas du microscope à disque de Nipkow du type le plus courant, un problème est la « stray light » ou lumière d'éclairage partiellement réfléchie par le disque, qui se superpose au faisceau à détecter.In the case of the most common type of Nipkow disc microscope, a problem is the “stray light” or lighting light partially reflected by the disc, which is superimposed on the beam to be detected.
Ce problème peut être réglé en utilisant un double disque de Nipkow comme dans le brevet US 3,517,980.This problem can be solved by using a double Nipkow disc as in US patent 3,517,980.
Toutefois le système devient alors très sensible aux instabilités du disque de Nipkow et ce type d'appareil atteint rarement des résolutions aussi élevées qu'il est souhaitable. Ce problème peut également être présent dans un système à miroir galvanométriques comme décrit ici, lorsque par exemple le premier et le second système de filtrage sont un seul et même réseau de trous microscopiques. Afin d'éviter ce problème, et selon une caractéristique de l'invention, le microscope est également caractérisé par les faits suivants :However, the system then becomes very sensitive to the instabilities of the Nipkow disk and this type of device rarely reaches resolutions as high as it is desirable. This problem can also be present in a galvanometric mirror system as described here, when for example the first and the second filtering system are one and the same array of microscopic holes. In order to avoid this problem, and according to a characteristic of the invention, the microscope is also characterized by the following facts:
- ledit premier système de filtrage spatial comporte au moins un premier trou microscopique,said first spatial filtering system comprises at least one first microscopic hole,
- ledit second système de filtrage spatial est distinct dudit premier système de filtrage spatial et comporte au moins un second trou microscopique, - ledit système optique comporte un séparateur de faisceau pour diriger le faisceau d'éclairage provenant dudit second système de filtrage spatial, vers ladite face objet, et pour diriger le faisceau lumineux provenant en sens inverse de ladite face objet, vers ledit premier système de filtrage spatial.- said second spatial filtering system is distinct from said first spatial filtering system and comprises at least one second microscopic hole, - said optical system comprises a beam splitter for directing the light beam coming from said second spatial filtering system, towards said object side, and for directing the light beam coming in the opposite direction from said object face, towards said first spatial filtering system.
Pour former dans le plan du capteur une image de l'échantillon, le déplacement d'un point d'éclairage doit être exactement reproduit, à un facteur d'échelle près, par le déplacement d'un point à détecter correspondant sur le capteur. Ceci est effectivement le cas lorsque le microscope comprend :To form an image of the sample in the plane of the sensor, the displacement of a lighting point must be exactly reproduced, to within a scale factor, by the displacement of a corresponding point to be detected on the sensor. This is effectively the case when the microscope includes:
- au moins une première lentille de contrôle traversée par le faisceau lumineux entre ladite face objet du miroir mobile et ledit premier plan image,at least one first control lens crossed by the light beam between said object face of the movable mirror and said first image plane,
- au moins une seconde lentille de contrôle traversée par le faisceau à détecter entre ledit premier plan image et ladite face image du miroir mobile, - des miroirs de redirection redirigeant le faisceau lumineux ayant été réfléchi par ladite face objet, puis le faisceau à détecter, pour permettre le retour dudit faisceau à détecter vers ladite face image, et disposés pour que la direction du faisceau à détecter quittant ladite face image soit égale à la direction du faisceau lumineux incident sur ladite face objet. Des vibrations peuvent se transmettre du miroir mobile à l'objet à observer. Pour éviter la transmission de telles vibrations le microscope peut être caractérisé par les faits suivants :- at least one second control lens crossed by the beam to be detected between said first image plane and said image face of the movable mirror, - redirection mirrors redirecting the light beam having been reflected by said object face, then the beam to be detected, to allow the return of said beam to be detected towards said image face, and arranged so that the direction of the beam to be detected leaving said image face is equal to the direction of the light beam incident on said object face. Vibrations can be transmitted from the moving mirror to the object to be observed. To avoid the transmission of such vibrations, the microscope can be characterized by the following facts:
- ledit dispositif de balayage comprend au moins une lentille objet traversée par ledit faisceau lumineux provenant dudit objet à observer dirigé vers ledit miroir mobile, - ledit dispositif de balayage comprend au moins une lentille image traversée par ledit faisceau à détecter provenant dudit miroir mobile et dirigé vers ledit second plan image,- said scanning device comprises at least one object lens traversed by said light beam coming from said object to be observed directed towards said movable mirror, - said scanning device comprises at least one image lens traversed by said beam to be detected coming from said movable mirror and directed towards said second image plane,
- lesdites lentilles objet et image appartiennent à un premier sous - ensemble fixé sur un premier bâti,- said object and image lenses belong to a first sub-assembly fixed on a first frame,
- ledit miroir mobile, lesdites lentilles de contrôle et lesdits miroirs de redirection appartiennent à un second sous - ensemble fixé sur un second bâti, - ledit premier bâti et ledit second bâti sont liés l'un à l'autre par des liaisons déformables.- Said movable mirror, said control lenses and said redirection mirrors belong to a second sub-assembly fixed on a second frame, - said first frame and said second frame are linked to each other by deformable links.
En effet, les liaisons déformables entre les deux bâtis permettent de couper la transmission des vibrations, et les mouvements relatifs des deux bâtis, du fait de la configuration optique choisie, n'ont qu'une influence marginale sur l'image formée dans le plan du capteur.In fact, the deformable links between the two frames make it possible to cut the transmission of vibrations, and the relative movements of the two frames, due to the optical configuration chosen, have only a marginal influence on the image formed in the plane. of the sensor.
Pour que l'image obtenue soit une image complexe fiable, dont le module est indépendant d'un éventuel décalage de phase de l'onde de référence, et susceptible d'être déconvoluée, il est préférable d'utiliser une détection hétérodyne. La détection hétérodyne peut être réalisée au moyen par exemple d'un miroir piézoélectrique utilisé pour faire varier la phase de l'onde de référence. Dans ce cas il est nécessaire d'acquérir successivement des images correspondant à chaque décalage de phase. Cette technique est très sensible aux vibrations qui peuvent affecter le système entre deux acquisitions d'image. Un objectif de l'invention est d'améliorer la robustesse du système par rapport aux vibrations. A cette fin, et selon une caractéristique de l'invention, le microscope est caractérisé par les faits suivants :In order for the image obtained to be a reliable complex image, the module of which is independent of a possible phase shift of the reference wave, and capable of being deconvolved, it is preferable to use heterodyne detection. Heterodyne detection can be carried out by means of, for example, a piezoelectric mirror used to vary the phase of the reference wave. In this case it is necessary to successively acquire images corresponding to each phase shift. This technique is very sensitive to vibrations which can affect the system between two image acquisitions. An objective of the invention is to improve the robustness of the system with respect to vibrations. To this end, and according to a characteristic of the invention, the microscope is characterized by the following facts:
- ledit système optique comporte des moyens pour polariser le faisceau lumineux,said optical system includes means for polarizing the light beam,
- ledit dispositif interférométrique comporte des moyens pour polariser le faisceau de référence, de manière à ce que les polarisations respectives du faisceau lumineux et du faisceau de référence soient orthogonales entre elles lorsque ces faisceaux sont superposés.- Said interferometric device comprises means for polarizing the reference beam, so that the respective polarizations of the light beam and the reference beam are orthogonal to one another when these beams are superposed.
Ceci peut être obtenu par exemple à l'aide d'un objectif de Linnik comprenant un séparateur de faisceau polarisant. L'onde de référence étant alors polarisée orthogonalement à l'onde provenant de l'objet, il est possible ensuite de distinguer ces deux ondes. L'onde de référence et l'onde provenant de l'objet peuvent avoir des polarisations linéaires, circulaires ou elliptiques mais ces polarisations doivent être orthogonales entre elles afin qu'il soit possible de séparer les deux ondes ou de les distinguer. Dans le but de réaliser une détection hétérodyne on peut alors réaliser un décalage de phase entre ces deux ondes. Ce décalage de phase peut par exemple être réalisé à l'aide d'une lame retardatrice. Pour obtenir une image pouvant être déconvoluée dans les meilleures conditions et de la meilleure qualité possible, il est préférable que cette lame retardatrice soit achromatique. Pour utiliser un principe de détection hétérodyne, on peut utiliser plusieurs détecteurs et appliquer un décalage de phase distinct aux ondes interférant sur chaque capteur. Selon une caractéristique de l'invention, ceci est réalisé au moyen d'un microscope également caractérisé par les faits suivants :This can be achieved for example using a Linnik objective including a polarizing beam splitter. The reference wave then being polarized orthogonally to the wave coming from the object, it is then possible to distinguish these two waves. The reference wave and the wave coming from the object can have linear, circular or elliptical polarizations but these polarizations must be orthogonal between them so that it is possible to separate the two waves or to distinguish them. In order to achieve heterodyne detection, it is then possible to carry out a phase shift between these two waves. This phase shift can for example be achieved using a retarder blade. To obtain an image which can be deconvolved in the best conditions and of the best possible quality, it is preferable that this retarding blade is achromatic. To use a heterodyne detection principle, several detectors can be used and a distinct phase shift is applied to the waves interfering with each sensor. According to a characteristic of the invention, this is achieved by means of a microscope also characterized by the following facts:
- ledit microscope comporte trois capteurs distincts, - chacun desdits capteurs est précédé d'un polariseur,- said microscope comprises three separate sensors, each of said sensors is preceded by a polarizer,
- deux desdits polariseurs sont eux-même précédés d'une lame d'onde achromatique afin d'obtenir des décalages de phases entre ledit faisceau de référence provenant dudit objet à observer et ayant traversé ledit dispositif de filtrage. Cette solution permet une détection hétérodyne à trois phases sans qu'un élément mobile soit nécessaire, et en un seul cycle de balayage de l'échantillon, les trois images nécessaires au calcul de l'image finale étant obtenues simultanément sur les trois capteurs. Ceci limite la sensibilité aux vibrations. D'autres solutions existent pour effectuer simultanément la détection de plusieurs images avec des décalages de phase différents. Toutefois pour que de telles solutions soient envisageable il faut que le faisceau de référence et le faisceau lumineux soient polarisés orthogonalement l'un à l'autre pour que des décalages de phase puissent leur être appliqués séparément.- Two of said polarizers are themselves preceded by an achromatic wave plate in order to obtain phase shifts between said reference beam coming from said object to be observed and having passed through said filtering device. This solution allows heterodyne detection in three phases without the need for a mobile element, and in a single scan cycle of the sample, the three images necessary for the calculation of the final image being obtained simultaneously on the three sensors. This limits sensitivity to vibrations. Other solutions exist for simultaneously detecting several images with different phase offsets. However, for such solutions to be possible, the reference beam and the light beam must be polarized orthogonally to one another so that phase shifts can be applied to them separately.
Description rapide des figuresQuick description of the figures
La figure 1 représente un premier mode de réalisation de l'invention. La figure 2 représente un objectif interférométrique. La figure 3 illustre la manière dont sont générés les décalages de phase entre l'onde de référence et l'onde réfléchie. La figure 4 représente un second mode de réalisation. La figure 5 représente un troisième mode de réalisation. La figure 6 illustre la méthode de balayage employée dans le troisième mode de réalisation.FIG. 1 represents a first embodiment of the invention. Figure 2 shows an interferometric objective. Figure 3 illustrates how the phase shifts between the reference wave and the reflected wave are generated. FIG. 4 represents a second embodiment. FIG. 5 represents a third embodiment. FIG. 6 illustrates the scanning method used in the third embodiment.
Premier mode de réalisationFirst embodiment
Ce mode de réalisation est représenté par la figure 1. Un faisceau laser large bande 601 polarisé à 45 degrés du plan de la figure constitue le faisceau d'éclairage FE. Ce faisceau d'éclairage FE est donc issu d'une source lumineuse constitué par exemple d'un laser puisé femtoseconde. Le faisceau d'éclairage FE est réfléchi par le miroir semi-transparent 602. Il est réfléchi par le miroir galvanométrique 603 mobile en rotation autour d'un axe situé dans le plan de la figure. Il est réfléchi par le miroir galvanométrique 604 mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Ces miroirs mobiles 603 et 604 constituent le dispositif de balayage. Le faisceau d'éclairage FE entre ensuite dans un objectif interférométrique 605. La partie du faisceau d'éclairage FE qui traverse l'objectif interférométrique 605 est ensuite focalisée en un point d'éclairage 620 de l'objet à observer 606. Le faisceau lumineux FD réfléchi ou diffiracté par l'échantillon est collecté par l'objectif interférométrique 605 qui le superpose à un faisceau de référence FR issu du faisceau d'éclairage et généré par ledit objectif interférométrique. Les deux faisceaux FD et FR sont réfléchis sur les miroirs galvanométriques 604 et 603, traversent le miroir semi-transparent 602, sont focalisés, par une lentille 607 sur un trou microscopique 608 constituant un premier système de filtrage spatial. Le trou microscopique 608 est dans un plan focal de la lentille 607. L'autre plan focal de cette lentille est de préférence confondu avec le plan focal image de l'objectif interférométrique 605.This embodiment is represented by FIG. 1. A broadband laser beam 601 polarized at 45 degrees from the plane of the figure constitutes the lighting beam FE. This light beam FE therefore comes from a light source consisting for example of a pulsed femtosecond laser. The lighting beam FE is reflected by the semi-transparent mirror 602. It is reflected by the galvanometric mirror 603 movable in rotation about an axis located in the plane of the figure. It is reflected by the galvanometric mirror 604 movable in rotation about an axis orthogonal to the plane of the figure. These movable mirrors 603 and 604 constitute the scanning device. The lighting beam FE then enters an interferometric objective 605. The part of the lighting beam FE which passes through the interferometric objective 605 is then focused at a lighting point 620 of the object to be observed 606. The light beam FD reflected or diffiracted by the sample is collected by the interferometric objective 605 which superimposes it on a reference beam FR coming from the lighting beam and generated by said interferometric objective. The two beams FD and FR are reflected on the galvanometric mirrors 604 and 603, pass through the semi-transparent mirror 602, are focused, by a lens 607 on a microscopic hole 608 constituting a first spatial filtering system. The microscopic hole 608 is in a focal plane of the lens 607. The other focal plane of this lens is preferably merged with the image focal plane of the interferometric objective 605.
La figure 2 montre le détail de l'objectif interférométrique 605, dans une configuration de Linnik. Le faisceau d'éclairage FE atteint un séparateur de faisceau polarisant 170 qui le sépare en un faisceau de référence FR et un faisceau d'éclairage FE. Le faisceau d'éclairage FE traverse l'objectif 171 et parvient à l'échantillon ou objet à observer 606 qui le diffracte et/ou le réfléchit. Le faisceau lumineux FD provenant du point d'éclairage 620 de l'objet à observer 606 retraverse l'objectif 171 et le séparateur de faisceau polarisant 170, sortant alors de l'objectif interférométrique. Le faisceau de référence FR traverse l'objectif 173, est réfléchi par le miroir de référence 174, retraverse l'objectif 173, est réfléchi par le séparateur de faisceau polarisant 170, et ressort alors de l'objectif interférométrique. Le séparateur de faisceau polarisant 170, l'objectif 173, et le miroir de référence 174 constituent donc un dispositif interférométrique permettant de générer un faisceau de référence FR. Du fait qu'un séparateur de faisceau polarisant est utilisé, les faisceaux FR et FD sortant de l'objectif interférométrique sont polarisés orthogonalement l'un à l'autre. Le faisceau lumineux FD ayant traversé le trou microscopique 608 sera appelé faisceau à détecterFigure 2 shows the detail of the interferometric objective 605, in a Linnik configuration. The lighting beam FE reaches a polarizing beam splitter 170 which separates it into a beam of reference FR and a lighting beam FE. The light beam FE passes through the objective 171 and reaches the sample or object to be observed 606 which diffracts and / or reflects it. The light beam FD coming from the lighting point 620 of the object to be observed 606 crosses the objective 171 and the polarizing beam splitter 170, then leaving the interferometric objective. The reference beam FR passes through the objective 173, is reflected by the reference mirror 174, crosses the objective 173, is reflected by the polarizing beam splitter 170, and then emerges from the interferometric objective. The polarizing beam splitter 170, the objective 173, and the reference mirror 174 therefore constitute an interferometric device making it possible to generate a reference beam FR. Because a polarizing beam splitter is used, the beams FR and FD leaving the interferometric objective are polarized orthogonally to one another. The light beam FD having passed through the microscopic hole 608 will be called the beam to be detected
FD1. Les faisceaux FD1 et FR parviennent ensuite à un miroir partiellement transparent 609 qui réfléchit le tiers de la puissance incidente. La partie des faisceaux qui traverse le miroir partiellement transparent 609 parvient à un miroir semi-transparent 610. La partie des faisceaux qui traverse le miroir semi-transparent 610 traverse ensuite une lame tiers d'onde 613 puis un polariseur 614 et parvient à un capteur 615. La partie des faisceaux qui est réfléchie par le miroir semi-transparent 610 traverse un polariseur 611 et parvient à un capteur 612. La partie des faisceaux qui est réfléchie par le miroir 609 traverse une lame tiers d'onde 616 et un polariseur 617 puis parvient au capteur 618. Les polariseurs 611, 614,617 sont orientés à 45 degrés du plan de la figure 1.FD1. The beams FD1 and FR then reach a partially transparent mirror 609 which reflects a third of the incident power. The part of the beams which passes through the partially transparent mirror 609 reaches a semi-transparent mirror 610. The part of the beams which passes through the semi-transparent mirror 610 then crosses a third wave plate 613 then a polarizer 614 and arrives at a sensor 615. The part of the beams which is reflected by the semi-transparent mirror 610 passes through a polarizer 611 and reaches a sensor 612. The part of the beams which is reflected by the mirror 609 crosses a third wave plate 616 and a polarizer 617 then arrives at the sensor 618. The polarizers 611, 614, 617 are oriented at 45 degrees from the plane of FIG. 1.
Les lames tiers d'onde 613 et 616 ont pour utilité d'introduire des décalages de phase respectifs de 120 degrés et -120 degrés entre l'onde de référence constitué par le faisceau de référence FR et l'onde à détecter constitué par le faisceau à détecter FD1 avant que ces ondes n'interfèrent. La figure 3 montre le principe de ce décalage de phase. Sur la figure 3 (a) A représente l'amplitude complexe du vecteur champ électrique du faisceau à détecter FD1, et B représente l'amplitude complexe du vecteur champ électrique du faisceau de référence FR. Après traversée d'une lame tiers d'onde A est inchangé et B est multiplié par eJP , ce qui est illustré par la figure 3(b). Pour une lame tiers d'onde on a β = ± . Le polariseur projette ces deux vecteurs suivant une direction située à 45 degrés de chacun d'entre eux et les somme, de sorte que l'on obtient le vecteur illustré par la figure 3(c) d'amplitude complexe A + Be^ . Les lames tiers d'onde 613 et 616 sont orientées par rapport aux polariseurs 614 et 617 pour correspondre respectivement àThe third wave plates 613 and 616 have the utility of introducing respective phase shifts of 120 degrees and -120 degrees between the reference wave constituted by the reference beam FR and the wave to be detected constituted by the beam to detect FD1 before these waves interfere. Figure 3 shows the principle of this phase shift. In FIG. 3 (a) A represents the complex amplitude of the electric field vector of the beam to be detected FD1, and B represents the complex amplitude of the electric field vector of the reference beam FR. After crossing a third wave plate A is unchanged and B is multiplied by e J P, which is illustrated by Figure 3 (b). For a third wave plate we have β = ±. The polarizer projects these two vectors in a direction located at 45 degrees from each of them and adds them up, so that we obtain the vector illustrated by FIG. 3 (c) of complex amplitude A + Be ^. The third wave plates 613 and 616 are oriented relative to the polarizers 614 and 617 to correspond respectively to
_ 2π _ 2π p = et p = . Autant que possible, les lames tiers d'onde utilisées doivent être achromatiques._ 2π _ 2π p = and p =. Whenever possible, the third wave blades used should be achromatic.
Les signaux provenant des capteurs 612, 615, 618 sont échantillonnés de manière synchrone. A partir des intensités détectées sur chaque capteur à un instant donné, l'amplitude complexe du faisceau à détecter FD1 est calculée par un ordinateur ou un circuit dédié par application de la formule suivante:The signals from sensors 612, 615, 618 are sampled synchronously. From the intensities detected on each sensor at a given time, the complex amplitude of the beam to be detected FD1 is calculated by a computer or a dedicated circuit by applying the following formula:
^ = (/612 - 618 - 615) + y 3(/6ι8 - /615) ou I χ est l'intensité détectée sur le capteur numéro X. Le microscope dispose en outre d'un dispositif 619, par exemple piézoélectrique, de positionnement de l'objet à observer 606 dans le sens vertical. Il est donc possible de balayer l'objet à observer 606 dans un plan observé en utilisant les miroirs galvanométriques, et de le balayer suivant la verticale en utilisant le dispositif de positionnement 619. Alternativement, lorsqu'il n'est pas possible de déplacer l'objet à observer, il est possible de déplacer plutôt lObjetctif interférométrique 605 dans son ensemble suivant la verticale, de manière à balayer suivant la verticale sans déplacer l'objet ni le corps du microscope.^ = ( / 612 - 618 - 615) + y 3 (/ 6 ι 8 - / 615 ) or I χ is the intensity detected on the sensor number X. The microscope also has a device 619, for example piezoelectric, for positioning the object to be observed 606 in the vertical direction. It is therefore possible to scan the object to be observed 606 in an observed plane using the galvanometric mirrors, and to scan it vertically using the positioning device 619. Alternatively, when it is not possible to move the he object to be observed, it is rather possible to move the interferometric object 605 as a whole along the vertical, so as to scan along the vertical without moving the object or the body of the microscope.
Un microscope confocal du type le plus courant est similaire au présent appareil mais utilise un objectif simple (non interférométrique) et dispose d'un capteur unique disposé derrière le trou microscopique. A chaque position des miroirs galvanométriques correspond une intensité donnée du faisceau à détecter. A partir de l'ensemble des intensités détectées pour chaque position des miroirs galvanométriques et pour chaque position de l'objet à observer 606 suivant la verticale, l'ordinateur reconstruit une image tridimensionnelle réelle de l'objet à observer 606.A confocal microscope of the most common type is similar to the present apparatus but uses a simple objective (non-interferometric) and has a single sensor placed behind the microscopic hole. Each position of the galvanometric mirrors corresponds to a given intensity of the beam to be detected. From the set of intensities detected for each position of the galvanometric mirrors and for each position of the object to be observed 606 along the vertical, the computer reconstructs a real three-dimensional image of the object to be observed 606.
Le fonctionnement du présent appareil est similaire, mais les intensités détectées sont remplacées par les valeurs complexes S obtenues pour chaque position des miroirs galvanométriques 603, 604 et du dispositif de positionnement 619. A partir de l'ensemble de ces valeurs complexes, l'ordinateur reconstruit une image tridimensionnelle complexe de l'objet à observer 606. Il est ensuite possible, si nécessaire, d'extraire le module de ces valeurs complexes afin d'obtenir une représentation réelle visualisable sur un écran d'ordinateur. La représentation tridimensionnelle complexe obtenue peut être améliorée par une déconvolution.The operation of the present device is similar, but the detected intensities are replaced by the complex values S obtained for each position of the galvanometric mirrors 603, 604 and of the positioning device 619. From all of these complex values, the computer reconstructs a complex three-dimensional image of the object to be observed 606. It is then possible, if necessary, to extract the module from these complex values in order to obtain a real representation which can be viewed on a computer screen. The complex three-dimensional representation obtained can be improved by deconvolution.
Cette déconvolution nécessite la mesure préalable de la "Point Spread Function" (réponse du système pour un objet ponctuel). Cette PSF est complexe et peut être mesurée par exemple sur une microbille réfléchissante.This deconvolution requires the prior measurement of the "Point Spread Function" (system response for a point object). This PSF is complex and can be measured for example on a reflecting microbead.
Deuxième mode de réalisation.Second embodiment.
Ce deuxième mode de réalisation est représenté par la figure 4. Le faisceau d'éclairage FE est issu d'une source lumineuse 200 étendue temporellement non cohérente, par exemple une lampe halogène, munie d'un collecteur et/ou d'un dispositif d'éclairage de Kôhler. Le faisceau d'éclairage FE traverse le séparateur de faisceau polarisant 206 puis parvient au dispositif de balayage constitué d'un disque de Nipkow 205 tournant autour d'un axe 204. Le disque de Nipkow 205 joue également ici le rôle d'un second dispositif de filtrage permettant de diviser le faisceau d'éclairage FE en une pluralité sous - faisceaux d'éclairage. On a représenté sur la figure 4, en traits pleins, la trajectoire d'un faisceau issu d'un trou microscopique du disque de Nipkow 205. EN pointillés on a représenté la trajectoire du faisceau issu d'un second trou microscopique du disque de Nipkow. Une partie du faisceau est absorbée ou réfléchie par le disque de Nipkow 205. La partie du faisceau d'éclairage FE qui traverse le disque de Nipkow 205 traverse ensuite la lentille de tube 207 puis la lame quart d'onde 201 dont l'axe neutre est à 45 degrés du plan de la figure, et entre dans un objectif interférométrique 208. La partie du faisceau d'éclairage FE qui traverse l'objectif interférométrique 208 est ensuite focalisée en un point particulier 214 de l'objet à observer 209. Le faisceau FD réfléchi ou diffracté par l'échantillon est collecté par l'objectif interférométrique 208 qui le superpose au faisceau de référence FR.This second embodiment is represented by FIG. 4. The lighting beam FE comes from a non-coherent temporally extended light source 200, for example a halogen lamp, provided with a collector and / or a device for lighting by Kôhler. The lighting beam FE crosses the polarizing beam splitter 206 and then reaches the scanning device consisting of a Nipkow 205 disc rotating around an axis 204. The Nipkow 205 disc also plays the role of a second device here. filtering device for dividing the lighting beam FE into a plurality of lighting sub - beams. There is shown in Figure 4, in solid lines, the trajectory of a beam from a microscopic hole in the Nipkow disc 205. IN dotted lines we have shown the trajectory of the beam from a second microscopic hole in the Nipkow disc . Part of the beam is absorbed or reflected by the Nipkow 205 disc. The part of the FE lighting beam which crosses the Nipkow 205 disc then passes through the tube lens 207 and then the quarter-wave plate 201 whose neutral axis is 45 degrees from the plane of the figure, and enters an interferometric objective 208. The part of the lighting beam FE which crosses the interferometric objective 208 is then focused at a particular point 214 of the object to be observed 209. The FD beam reflected or diffracted by the sample is collected by the interferometric objective 208 which superimposes it on the reference beam FR.
L'objectif interférométrique 208 est par exemple du type représenté sur la figure 2, mais contrairement au premier mode de réalisation le séparateur de faisceau 170 n'est pas polarisant. Par contre, l'ensemble constitué de l'objectif 173 et du miroir de référence 174 est mobile dans la direction de l'axe optique de l'objectif 173. Il peut être positionné dans cette direction à l'aide d'un positionneur piézoélectrique. Le séparateur de faisceau 170 n'étant pas polarisant, les faisceaux FR et FD ont même polarisation en sortie de l'objectif interférométrique. La différence de phase entre FR et FD peut être modifiée en déplaçant l'ensemble constitué de l'objectif 173 et du miroir de référence 174 , dans la direction de l'axe optique de l'objectif 173.The interferometric objective 208 is for example of the type shown in FIG. 2, but unlike the first embodiment the beam splitter 170 is not polarizing. By cons, the assembly consisting of the objective 173 and the reference mirror 174 is movable in the direction of the optical axis of the objective 173. It can be positioned in this direction using a piezoelectric positioner . The beam splitter 170 not being polarizing, the beams FR and FD have the same polarization at the output of the interferometric objective. The phase difference between FR and FD can be modified by moving the assembly consisting of the objective 173 and the reference mirror 174, in the direction of the optical axis of the objective 173.
Les faisceaux FR et FD sortant de l'objectif 208 traversent la lame quart d'onde 201 et la lentille de tube 207 qui les focalise sur le disque de Nipkow 205 constituant un premier système de filtrage spatial. Le faisceau lumineux ayant traversé le disque de Nipkow 205 sera appelé faisceau à détecter FDl. Les faisceau FR et FDl traversent le disque de Nipkow 205, sont réfléchis par le séparateur de faisceau polarisant 206, et sont focalisés par la lentille de tube 210 sur le capteur CCD 212 en au moins un point de détection, et parviennent au capteur CCD 212.The FR and FD beams leaving the objective 208 pass through the quarter-wave plate 201 and the tube lens 207 which focuses them on the Nipkow disc 205 constituting a first spatial filtering system. The light beam having crossed the Nipkow 205 disc will be called the beam to detect FDl. The beams FR and FDl pass through the disc of Nipkow 205, are reflected by the polarizing beam splitter 206, and are focused by the tube lens 210 on the CCD sensor 212 at at least one detection point, and reach the CCD sensor 212 .
Le microscope est également muni d'un dispositif 213 de positionnement vertical de l'objet à observer 209, par exemple piézoélectrique.The microscope is also provided with a device 213 for vertical positioning of the object to be observed 209, for example piezoelectric.
Lorsque le disque de Nipkow tourne, une image confocale se forme sur le capteur CCD 212. Cette image confocale résulte de l'interférence entre le faisceau de référence FR et le faisceau à détecter FD 1 provenant de l'objet à observer. La différence de phase entre ces deux faisceaux est contrôlée au moyen de l'ensemble mobile constitué de l'objectif 173 et du miroir de référence 174 . Une première image est obtenue pour une différence de phase θ . Une deuxième image est ensuite obtenue pour une différence de n 2π Λ 2π phase θ H . Une troisième image est ensuite obtenue pour une différence de phase θ . On noteWhen the Nipkow disc rotates, a confocal image is formed on the CCD sensor 212. This confocal image results from the interference between the reference beam FR and the beam to be detected FD 1 coming from the object to be observed. The phase difference between these two beams is controlled by means of the mobile assembly consisting of the objective 173 and the reference mirror 174. A first image is obtained for a phase difference θ. A second image is then obtained for a difference of n 2π Λ 2π phase θ H. A third image is then obtained for a phase difference θ. We notice
I x l'intensité mesurée en un point du capteur CCD 212 pour une différence de phase X . A partir des trois images réelles obtenues successivement une image complexe est calculée par un ordinateur ou un circuit dédié. En chaque point du capteur, la valeur complexe S de cette image est obtenue par la formule suivante:I x the intensity measured at a point of the CCD 212 sensor for a phase difference X. From the three real images obtained successively, a complex image is calculated by a computer or a dedicated circuit. At each point of the sensor, the complex value S of this image is obtained by the following formula:
Figure imgf000013_0001
Le module de l'image complexe ainsi obtenue peut éventuellement être calculé pour obtenir une image réelle pouvant être représentée sur un écran d'ordinateur.
Figure imgf000013_0001
The module of the complex image thus obtained can possibly be calculated to obtain a real image which can be represented on a computer screen.
Une série d'images complexes peut être obtenue pour des profondeurs différentes dans l'objet à observer 209, le positionneur 213 étant utilisé pour focaliser successivement l'objectif sur des plans différents de l'objet à observer 209. A partir de cette série d'images complexes, une image tridimensionnelle complexe de l'objet à observer 209 peut être reconstituée. Cette image tridimensionnelle peut être améliorée par déconvolution, comme dans le premier mode de réalisation. L'image complexe déconvoluée, ou son module, peut être utilisée pour afficher une image de bonne qualité sur un écran d'ordinateur.A series of complex images can be obtained for different depths in the object to be observed 209, the positioner 213 being used to successively focus the objective on different planes of the object to be observed 209. From this series d complex images, a three-dimensional image complex of the object to be observed 209 can be reconstructed. This three-dimensional image can be improved by deconvolution, as in the first embodiment. The complex unconverted image, or its module, can be used to display a good quality image on a computer screen.
Troisième mode de réalisation (mode préféré)Third embodiment (preferred mode)
Ce troisième mode de réalisation est représenté par la figure 5. Il est basé sur une configuration similaire à celle utilisée dans la demande de brevet français numéro 01/02254 du 20/2/01 concernant un microscope confocal rapide, déposée par V.Lauer.This third embodiment is represented by FIG. 5. It is based on a configuration similar to that used in the French patent application number 01/02254 of 20/2/01 concerning a fast confocal microscope, filed by V. Lauer.
Le faisceau d'éclairage FE est issu d'une source lumineuse 431 étendue temporellement non cohérente, par exemple une lampe à halogène munie d'un collecteur 432 qui génère un faisceau quasi collimaté 410. Il traverse un polariseur 433 sélectionnant une direction de polarisation orthogonale au plan de la figure, et parvient à un second dispositif de filtrage 409 constitué d'un réseau de trous microscopiques permettant de diviser le faisceau d'éclairage FE en une pluralité de sous - faisceaux d'éclairage. Le réseau de trous microscopiques 409 est par exemple un réseau à maille carrée ou hexagonale. On a représenté en traits fins la trajectoire d'un faisceau issu d'un trou microscopique du réseau 409.The lighting beam FE comes from a temporally non-coherent extended light source 431, for example a halogen lamp provided with a collector 432 which generates a quasi-collimated beam 410. It crosses a polarizer 433 selecting a direction of orthogonal polarization in the plane of the figure, and reaches a second filtering device 409 consisting of a network of microscopic holes making it possible to divide the lighting beam FE into a plurality of lighting sub-beams. The array of microscopic holes 409 is for example a square or hexagonal mesh array. The trajectory of a beam from a microscopic hole in the network 409 has been shown in thin lines.
La partie du faisceau d'éclairage FE qui traverse le réseau de trous microscopiques 409 traverse ensuite la lentille 408 puis est réfléchie par le miroir semi-transparent 407. Ce faisceau d'éclairage FE est ensuite réfléchi par la face objet 406(a) du miroir galvanométrique 406 qui constitue le dispositif de balayage. Il traverse ensuite la lentille objet 405 puis passe par un plan image 404, traverse la lentille de tube 403 et parvient à l'objectif interférométrique 402 qui est le même que celui utilisé dans le premier mode de réalisation et représenté sur la figue 2. Cet objectif interférométrique est focalisé sur un objet à observer 401 lui-même fixé sur un positionneur permettant un positionnement dans le sens de l'axe optique. Le faisceau lumineux FD provenant de l'objet à observer 401 et le faisceau de référence FR, polarisés orthogonalement l'un par rapport à l'autre, ressortent ensuite de l'objectif interférométrique 402, traversent la lentille de tube 403 et le plan image 404, puis traversent la lentille objet 405 et sont réfléchis par le miroir galvanométrique 406. Ils traversent le séparateur de faisceau constitué du miroir semi - transparent 407 et la lentille de contrôle 411, sont réfléchis par le miroir de redirection 412,et parviennent au réseau de trous microscopiques 413 qui constitue le premier système de filtrage spatial.The part of the FE lighting beam which crosses the array of microscopic holes 409 then crosses the lens 408 and is then reflected by the semi-transparent mirror 407. This FE lighting beam is then reflected by the object face 406 (a) of the galvanometric mirror 406 which constitutes the scanning device. It then crosses the object lens 405 then passes through an image plane 404, crosses the tube lens 403 and reaches the interferometric objective 402 which is the same as that used in the first embodiment and represented in fig 2. This interferometric objective is focused on an object to be observed 401 itself fixed on a positioner allowing positioning in the direction of the optical axis. The light beam FD coming from the object to be observed 401 and the reference beam FR, polarized orthogonally to one another, then emerge from the interferometric objective 402, pass through the tube lens 403 and the image plane 404, then pass through the object lens 405 and are reflected by the galvanometric mirror 406. They pass through the beam splitter consisting of the semi-transparent mirror 407 and the control lens 411, are reflected by the redirection mirror 412, and reach the network of microscopic holes 413 which constitutes the first spatial filtering system.
Le sous-faisceau d'éclairage FE issu d'un trou microscopique du réseau 409 est focalisé en un point d'éclairage 434 de l'objet à observer 401. Le sous-faisceau lumineux FD issu de ce point 434 parvient ensuite en un point particulier du réseau de trous microscopiques 413. Le faisceau de référence FR réfléchi par le miroir de référence de l'objectif interférométrique parvient au même point du réseau 413. Les deux réseaux doivent être positionnés de manière à ce que le point atteint par ces faisceaux FR, FD sur le réseau 413 soit sur un trou microscopique. Les réseaux 413 et 409 sont donc conjugués (le réseau 413 est l'image du réseau 409).The lighting sub-beam FE coming from a microscopic hole in the network 409 is focused at a lighting point 434 of the object to be observed 401. The light sub-beam FD coming from this point 434 then arrives at a point particular of the array of microscopic holes 413. The reference beam FR reflected by the reference mirror of the interferometric objective arrives at the same point of the array 413. The two arrays must be positioned so that the point reached by these beams FR , FD on network 413 or on a microscopic hole. Networks 413 and 409 are therefore combined (network 413 is the image of network 409).
Le faisceau lumineux FD ayant traversé le réseau de trous microscopiques 413 sera appelé faisceau à détecter FDl. Les faisceaux FDl et FR sont ensuite réfléchis par le miroir de redirection 14 et traversent les lentilles de contrôle 415 puis 416. Ils sont réfléchis par les miroirs de redirection 417 et 418. Ils traversent la lentille de contrôle 419 et sont réfléchis par la face image 406(b) du miroir galvanométrique 406. Ils traversent ensuite la lentille image 420.The light beam FD having passed through the array of microscopic holes 413 will be called the beam to detect FDl. The beams FD1 and FR are then reflected by the redirection mirror 14 and pass through the control lenses 415 then 416. They are reflected by the redirection mirrors 417 and 418. They pass through the control lens 419 and are reflected by the image face 406 (b) of the galvanometric mirror 406. They then pass through the image lens 420.
Les faisceaux FDl et FR parviennent ensuite au miroir partiellement transparent 421 qui réfléchit le tiers de l'intensité lumineuse. La partie du faisceau qui traverse le miroir 421 parvient ensuite au miroir semi-transparent 425. La partie du faisceau qui traverse le miroir 425 traverse ensuite le polariseur 429 et parvient au capteur 430 en au moins un point de détection. La partie du faisceau qui est réfléchi par le miroir semi-transparent 425 traverse ensuite la lame tiers d'onde 426 et le polariseur 427, et parvient au capteur CCD 428 en au moins un point de détection. La partie du faisceau qui est réfléchi par le miroir partiellement transparent 421 traverse ensuite la lame tiers d'onde 422, le polariseur 423, et parvient au capteur CCD 424 en au moins un point de détection.The beams FD1 and FR then reach the partially transparent mirror 421 which reflects a third of the light intensity. The part of the beam which passes through the mirror 421 then reaches the semi-transparent mirror 425. The part of the beam which passes through the mirror 425 then passes through the polarizer 429 and reaches the sensor 430 at at least one detection point. The part of the beam which is reflected by the semi-transparent mirror 425 then crosses the third wave plate 426 and the polarizer 427, and reaches the CCD sensor 428 at at least one detection point. The part of the beam which is reflected by the partially transparent mirror 421 then crosses the third wave plate 422, the polarizer 423, and reaches the CCD sensor 424 at at least one detection point.
Sur le schéma, les lentilles de contrôle 411, 415, 416, 419 ont même distance focale. La lentille 408 a un plan focal sur le réseau 409 et l'autre sur le miroir galvanométrique 406. La lentille de contrôle 411 a un plan focal sur le miroir 406 et un plan focal sur le réseau 413. La lentille de contrôle 415 a un plan focal sur le réseau 413 et son autre plan focal est également un plan focal de la lentille de contrôle 416. Le second plan focal de la lentille de contrôle 416 est également un plan focal de la lentille de contrôle 419. Le second plan focal de la lentille de contrôle 419 est sur le miroir galvanométrique 406. La lentille 405 a un plan focal dans le plan 404 et l'autre sur le miroir 406. La lentille 420 a un plan focal sur le miroir 406 et un plan focal sur le capteur 430.In the diagram, the control lenses 411, 415, 416, 419 have the same focal length. The lens 408 has a focal plane on the grating 409 and the other on the galvanometric mirror 406. The control lens 411 has a focal plane on the mirror 406 and a focal plane on the grating 413. The control lens 415 has a focal plane on the grating 413 and its other focal plane is also a focal plane of the control lens 416. The second focal plane of the control lens 416 is also a focal plane of the control lens 419. The second focal plane of the control lens 419 is on the galvanometric mirror 406. The lens 405 has a focal plane in the plane 404 and the other on the mirror 406. The lens 420 has a focal plane on the mirror 406 and a focal plane on the sensor 430.
La lame tiers d'onde 422 a son axe rapide dans le plan de la figure. La lame tiers d'onde 426 a son axe lent dans le plan de la figure. Les polariseurs 423 et 427 ont même orientation, à 45 degrés du plan de la figure. Le polariseur 429 est également orienté à 45 degrés du plan de la figure. Les capteurs CCD sont dans des plans focaux de la lentille image 420. Ils sont positionnés de manière à ce que l'image d'un point de l'objet à observer 401 se trouve sur le même pixel de chacun des capteurs.The third wave plate 422 has its fast axis in the plane of the figure. The third wave plate 426 has its slow axis in the plane of the figure. The polarizers 423 and 427 have the same orientation, at 45 degrees from the plane of the figure. The polarizer 429 is also oriented at 45 degrees from the plane of the figure. The CCD sensors are in focal planes of the image lens 420. They are positioned so that the image of a point of the object to be observed 401 is on the same pixel of each of the sensors.
Le miroir galvanométrique 406 est mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de la figure. Le réseau de trous microscopiques 413 est orienté de manière à ce que l'image d'un point fixe de l'objet à observer 401 se déplace sur le réseau de trous microscopiques 413 suivant une trajectoire 500 représentée sur la figure 6. De cette manière l'ensemble de la zone observée est balayé par l'ensemble des points du réseau de trous microscopiques.The galvanometric mirror 406 is movable in rotation about an axis orthogonal to the plane of the figure. The array of microscopic holes 413 is oriented so that the image of a fixed point of the object to be observed 401 moves over the array of microscopic holes 413 along a path 500 shown in FIG. 6. In this way the entire observed area is scanned by all the points of the network of microscopic holes.
Si l'objectif utilisé n'était pas un objectif interférométrique, il se formerait sur le capteur 430 une image confocale de l'objet à observer 401, similaire à celle qui peut être obtenue à l'aide d'un microscope à disque de Nipkow. Du fait que l'objectif est interférométrique, l'image formée sur le capteur 430 résulte de la superposition cohérente des faisceaux FR et FDl. Le principe d'utilisation des lames d'onde et des polariseurs dans le dispositif de détection est le même que dans le premier mode de réalisation, et il se forme donc sur les capteurs 424 et 428 des images résultant de l'interférence du faisceau de référence FR avec le faisceau à détecter FDl ayant subi un décalage de 120 degrés pour le capteur 424 et -120 degrés pour le capteur 428. A partir des trois images réelles obtenues on obtient une image complexe. La valeur de l'image complexe en un pixel donné est obtenue par la formule:
Figure imgf000016_0001
ou I x est l'intensité détectée sur le pixel correspondant du capteur numéro X. Le module de l'image complexe ainsi obtenue peut éventuellement être calculé pour obtenir une image réelle pouvant être représentée sur un écran d'ordinateur. Une série d'images complexes peut être obtenue pour des profondeurs différentes dans l'objet à observer 401, un positionneur piézoélectrique étant utilisé pour focaliser successivement l'objectif sur des plans différents de l'objet à observer 401. A partir de cette série d'images complexes, une image tridimensionnelle complexe de l'objet à observer 401 peut être reconstituée. Cette image tridimensionnelle peut être améliorée par déconvolution, comme dans le premier mode de réalisation. L'image complexe déconvoluée, ou son module, peut être utilisée pour afficher une image de bonne qualité sur un écran d'ordinateur. Pour que la déconvolution se fasse dans les meilleures conditions, les lames d'onde doivent de préférence être achromatiques. Ce mode de réalisation permet une déconvolution dans des conditions favorables: en effet, la PSF est constante sur l'ensemble de l'image, contrairement au cas du disque de Nipkow. On peut monter le sous - ensemble 440 constitué du système de balayage et de compensation sur un bâti différent du sous - ensemble 441. Cela permet de ne pas transmettre les vibrations engendrées par le miroir galvanométrique à l'objet à observer 401. On peut pour cela monter par exemple le sous - ensemble 441 sur la même table antivibrations que le microscope, et le sous - ensemble 440 sur un second bâti qui peut être fixé directement au sol , ou solidarisé d'une seconde table antivibrations, indépendante de la première.If the objective used was not an interferometric objective, a confocal image of the object to be observed 401 would form on the sensor 430, similar to that which can be obtained using a Nipkow disc microscope. . Because the objective is interferometric, the image formed on the sensor 430 results from the coherent superposition of the beams FR and FDl. The principle of using the wave plates and the polarizers in the detection device is the same as in the first embodiment, and therefore images are formed on the sensors 424 and 428 resulting from the interference of the beam of reference FR with the beam to be detected FD1 having undergone an offset of 120 degrees for the sensor 424 and -120 degrees for the sensor 428. From the three real images obtained, a complex image is obtained. The value of the complex image in a given pixel is obtained by the formula:
Figure imgf000016_0001
or I x is the intensity detected on the corresponding pixel of sensor number X. The module of the complex image thus obtained can possibly be calculated to obtain a real image which can be represented on a computer screen. A series of complex images can be obtained for different depths in the object to be observed 401, a piezoelectric positioner being used to successively focus the objective on different planes of the object to be observed 401. From this series d complex images, a complex three-dimensional image of the object to be observed 401 can be reconstructed. This three-dimensional image can be improved by deconvolution, as in the first embodiment. The complex unconverted image, or its module, can be used to display a good quality image on a computer screen. For the deconvolution to take place in the best conditions, the wave plates should preferably be achromatic. This embodiment allows deconvolution under favorable conditions: in fact, the PSF is constant over the entire image, unlike the case of the Nipkow disc. The sub-assembly 440 made up of the scanning and compensation system can be mounted on a frame different from the sub-assembly 441. This makes it possible not to transmit the vibrations generated by the galvanometric mirror to the object to be observed 401. It is possible to this, for example, mounting the sub-assembly 441 on the same anti-vibration table as the microscope, and the sub-assembly 440 on a second frame which can be fixed directly to the ground, or secured to a second anti-vibration table, independent of the first.
Applications industrielles:Industrial applications:
Le présent microscope peut par exemple être utilisé pour l'observation de coupes de peau ou en ophtalmologie pour l'observation de l'œil. The present microscope can for example be used for the observation of skin sections or in ophthalmology for the observation of the eye.

Claims

1 -Microscope optique destiné à permettre une visualisation d'un objet à observer (401 ; 606 ; 209) éclairé par une source lumineuse (431 ; 601 ; 200), et comprenant : - un système optique adapté, d'une part, pour focaliser un faisceau d'éclairage (FE) provenant de la source lumineuse en au moins un point d'éclairage (434 ; 620 ; 214) entouré par une zone non éclairée, ledit au moins un point d'éclairage étant destiné à éclairer un point de l'objet à observer (401 ; 606 ; 209) appartenant à un plan observé, et d'autre part, pour focaliser un faisceau lumineux (FD) provenant du point d'éclairage (434 ; 620 ; 214), en un point lumineux dans un premier plan image (PI), ledit système optique comportant un objectif de microscope (171) focalisé sur ledit plan observé dudit objet à observer (401 ; 606 ; 209), traversé par ledit faisceau d'éclairage (FE) avant qu'il ne parvienne audit objet à observer (401 ; 606 ; 209), collectant ledit faisceau lumineux (FD) provenant dudit objet à observer (401 ; 606 ; 209), et restant fixe par rapport audit objet à observer (401 ; 606 ; 209) pendant la durée d'observation dudit plan observé,1 - Optical microscope intended to allow a visualization of an object to be observed (401; 606; 209) illuminated by a light source (431; 601; 200), and comprising: - an adapted optical system, on the one hand, for focusing an illumination beam (FE) coming from the light source at at least one lighting point (434; 620; 214) surrounded by an unlit area, said at least one lighting point being intended to illuminate a point of the object to be observed (401; 606; 209) belonging to an observed plane, and on the other hand, to focus a light beam (FD) coming from the lighting point (434; 620; 214), at a point light in a first image plane (PI), said optical system comprising a microscope objective (171) focused on said observed plane of said object to be observed (401; 606; 209), crossed by said lighting beam (FE) before '' it does not reach said object to be observed (401; 606; 209), collecting said light beam (FD) from ant of said object to be observed (401; 606; 209), and remaining fixed relative to said object to be observed (401; 606; 209) for the duration of observation of said observed plane,
- un premier système de filtrage spatial (413 ; 608 ; 205) disposé dans le premier plan image (PI) et adapté pour filtrer le point lumineux pour obtenir un faisceau à détecter (FD 1) issu du point lumineux filtré,- a first spatial filtering system (413; 608; 205) arranged in the first image plane (PI) and adapted to filter the light point to obtain a beam to be detected (FD 1) coming from the filtered light point,
- un dispositif de balayage, placé sur le chemin dudit faisceau d'éclairage (FE) entre ladite source lumineuse (431 ; 601 ; 200) et ledit au moins un point d'éclairage, et adapté pour que ledit au moins un point d'éclairage balaye l'objet à observer (401 ; 606 ; 209) suivant ledit plan observé,- a scanning device, placed on the path of said lighting beam (FE) between said light source (431; 601; 200) and said at least one lighting point, and adapted so that said at least one point of lighting scans the object to be observed (401; 606; 209) along said observed plane,
- un dispositif interférométrique (170, 173, 174) adapté pour générer un faisceau de référence (FR) issu de ladite source lumineuse (431 ; 601 ; 200), qui ne passe pas par l'objet à observer (401 ; 606 ; 209), et qui se superpose audit faisceau lumineux (FD) provenant de l'objet à observer (401 ; 606 ; 209),- an interferometric device (170, 173, 174) adapted to generate a reference beam (FR) coming from said light source (431; 601; 200), which does not pass through the object to be observed (401; 606; 209 ), and which is superimposed on said light beam (FD) coming from the object to be observed (401; 606; 209),
- au moins un capteur pour enregistrer la superposition dudit faisceau à détecter (FDl) et dudit faisceau de référence (FR), caractérisé par le fait que ledit dispositif interférométrique (170, 173, 174) est adapté pour : - séparer le faisceau d'éclairage (FE) provenant dudit dispositif de balayage et dirigé vers ledit échantillon, en un faisceau d'éclairage (FE) dirigé vers ledit objet à observer, et en un faisceau de référence (FR) qui n'atteint pas l'objet à observer,- at least one sensor for recording the superposition of said beam to be detected (FDl) and said reference beam (FR), characterized in that said interferometric device (170, 173, 174) is adapted to: - separate the beam from lighting (FE) coming from said scanning device and directed towards said sample, in a lighting beam (FE) directed towards said object to be observed, and in a reference beam (FR) which does not reach the object to be observed ,
- superposer ledit faisceau de référence (FR) au faisceau lumineux (FD) provenant dudit objet à observer et dirigé vers ledit dispositif de balayage, pour que ledit dispositif de balayage affecte simultanément, dans le sens source lumineuse vers objet à observer, le faisceau d'éclairage (FE) et le faisceau de référence non encore séparé du faisceau d'éclairage, et pour que ledit dispositif de balayage affecte simultanément, dans le sens objet à observer vers capteur, ledit faisceau lumineux et ledit faisceau de référence superposé au faisceau lumineux.superimposing said reference beam (FR) on the light beam (FD) coming from said object to be observed and directed towards said scanning device, so that said scanning device simultaneously affects, in the direction of light source towards object to be observed, the beam of lighting (FE) and the reference beam not yet separated from the lighting beam, and so that said scanning device simultaneously affects, in the direction of the object to be observed towards the sensor, said light beam and said reference beam superimposed on the light beam .
2- Microscope selon la revendication 1, également caractérisé par le fait que ledit dispositif interférométrique comporte un miroir de référence réfléchissant l'onde de référence, et conjugué audit premier plan image. 3- Microscope selon la revendication 2, également caractérisé par le fait que ledit dispositif interférométrique et ledit objectif de microscope sont réunis en un objectif interférométrique.2- Microscope according to claim 1, also characterized in that said interferometric device comprises a reference mirror reflecting the reference wave, and conjugated to said first image plane. 3- Microscope according to claim 2, also characterized in that said interferometric device and said microscope objective are combined in an interferometric objective.
4- Microscope selon la revendication 3, caractérisé par le fait qu'il comporte des moyens pour déplacer ledit objectif interférométrique dans le sens de l'axe optique du faisceau d'éclairage parvenant audit objet à observer, en dehors de la durée d'observation dudit plan observé, pour modifier la position du plan observé dans l'objet à observer.4- Microscope according to claim 3, characterized in that it comprises means for moving said interferometric objective in the direction of the optical axis of the light beam reaching said object to be observed, outside the observation period of said observed plane, to modify the position of the observed plane in the object to be observed.
5- Microscope selon une des revendications 3 ou 4, caractérisé par le fait que ledit objectif interférométrique est un objectif interférométrique de Linnik ou de Mirau.5- Microscope according to one of claims 3 or 4, characterized in that said interferometric objective is an interferometric objective of Linnik or Mirau.
6- Microscope selon une des revendications 1 à 5, caractérisé par les faits suivants : - ledit système optique comporte des moyens pour polariser le faisceau lumineux,6- Microscope according to one of claims 1 to 5, characterized by the following facts: - said optical system comprises means for polarizing the light beam,
- ledit dispositif interférométrique (170, 173, 174) comporte des moyens pour polariser le faisceau de référence (FR), de manière à ce que les polarisations respectives du faisceau lumineux (FD) et du faisceau de référence (FR) soient orthogonales entre elles lorsque ces faisceaux sont superposés.- said interferometric device (170, 173, 174) comprises means for polarizing the reference beam (FR), so that the respective polarizations of the light beam (FD) and of the reference beam (FR) are orthogonal to one another when these beams are superimposed.
7- Microscope selon la revendication 6, caractérisé par les fait suivants :7- Microscope according to claim 6, characterized by the following facts:
- ledit microscope comporte trois capteurs distincts (424, 428, 430 ; 612, 615, 618),- said microscope comprises three separate sensors (424, 428, 430; 612, 615, 618),
- chacun desdits capteurs est précédé d'un polariseur (423, 427, 429 ; 611, 614, 617),each of said sensors is preceded by a polarizer (423, 427, 429; 611, 614, 617),
- deux desdits polariseurs sont eux-même précédés d'une lame d'onde achromatique (422, 426 ; 613, 616) afin d'obtenir des décalages de phases entre ledit faisceau de référence (FR) provenant dudit objet à observer (401 ; 606) et ayant traversé ledit dispositif de filtrage (413 ; 608).- two of said polarizers are themselves preceded by an achromatic wave plate (422, 426; 613, 616) in order to obtain phase shifts between said reference beam (FR) coming from said object to be observed (401; 606) and having passed through said filtering device (413; 608).
8- Microscope suivant une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que ledit système optique est adapté pour focaliser le faisceau à détecter (FDl) en au moins un point de détection, et ledit dispositif de balayage est adapté pour que ledit faisceau à détecter (FDl) balaye un second plan image (P2) dans lequel est placé ledit au moins un capteur, lorsque ledit au moins un point d'éclairage balaye ledit plan observé. 9- Microscope selon la revendication 8, caractérisé par les faits suivants :8- Microscope according to one of claims 1 to 7, characterized in that said optical system is adapted to focus the beam to be detected (FDl) at at least one detection point, and said scanning device is adapted so that said beam to detecting (FDl) scans a second image plane (P2) in which said at least one sensor is placed, when said at least one lighting point scans said observed plane. 9- Microscope according to claim 8, characterized by the following facts:
- ledit dispositif de balayage comporte au moins un miroir mobile en rotation (406) sur lequel sont réfléchis, d'une part, le faisceau d'éclairage (FE) pour permettre audit au moins un point d'éclairage de balayer l'objet à observer (401) suivant ledit plan observé, et d'autre part, ledit faisceau lumineux (FD) provenant dudit point éclairé (434) de l'objet à observer (401) pour amener le point lumineux en un point fixe sur ledit premier plan image (PI),- Said scanning device comprises at least one mobile mirror in rotation (406) on which are reflected, on the one hand, the lighting beam (FE) to allow said at least one lighting point to scan the object to observe (401) along said observed plane, and on the other hand, said light beam (FD) coming from said illuminated point (434) of the object to be observed (401) to bring the light point to a fixed point on said first plane image (PI),
- ledit système optique et ledit premier système de filtrage spatial (413) sont adaptés pour renvoyer ledit faisceau à détecter (FDl) sur ledit miroir mobile en rotation (406), - ledit système optique est également adapté pour focaliser ledit faisceau à détecter (FDl), réfléchi sur le miroir mobile (406), en un point à détecter dans ledit second plan image (P2) pour obtenir, dans ledit second plan image (P2), un déplacement dudit point à détecter proportionnel au déplacement dudit point éclairé (434) dans ledit plan observé de l'objet à observer (401).- said optical system and said first spatial filtering system (413) are adapted to return said beam to be detected (FDl) to said movable mirror in rotation (406), - said optical system is also adapted to focus said beam to be detected (FDl ), reflected on the movable mirror (406), at a point to be detected in said second image plane (P2) to obtain, in said second image plane (P2), a displacement of said point to be detected proportional to the displacement of said illuminated point (434 ) in said observed plane of the object to be observed (401).
10- Microscope selon la revendication 9 caractérisé par les faits suivants :10- Microscope according to claim 9 characterized by the following facts:
- ledit au moins un miroir mobile en rotation (406) comprend une face objet (406a) et une face image 406(b) opposée à ladite face objet (406a),said at least one movable mirror in rotation (406) comprises an object face (406a) and an image face 406 (b) opposite said object face (406a),
- ledit système optique est adapté pour- said optical system is suitable for
(i) diriger ledit faisceau lumineux (FD) provenant de l'objet à observer (401), vers ladite face objet (406a), (ii) diriger ledit faisceau lumineux (FD) provenant de ladite face objet (406a), vers ledit premier système de filtrage spatial (413),(i) directing said light beam (FD) coming from the object to be observed (401), towards said object face (406a), (ii) directing said light beam (FD) coming from said object face (406a), towards said first spatial filtering system (413),
(iii) diriger ledit faisceau à détecter (FDl) provenant dudit premier système de filtrage spatial (413), vers ladite face image (406b),(iii) directing said beam to be detected (FD1) coming from said first spatial filtering system (413), towards said image face (406b),
(iv) diriger ledit faisceau à détecter (FDl) provenant de ladite face objet (406a), vers ledit second plan image (P2).(iv) directing said beam to be detected (FD1) coming from said object face (406a), towards said second image plane (P2).
11- Microscope selon la revendication 10 caractérisé par le fait que ledit système optique comporte :11- Microscope according to claim 10 characterized in that said optical system comprises:
- au moins une première lentille de contrôle (411) traversée par le faisceau lumineux (FD) entre ladite face objet (406a) du miroir mobile (406) et ledit premier plan image (PI), - au moins une seconde lentille de contrôle (415) traversée par le faisceau à détecter (FDl) entre ledit premier plan image (PI) et ladite face image (406b) du miroir mobile (406),- at least a first control lens (411) traversed by the light beam (FD) between said object face (406a) of the movable mirror (406) and said first image plane (PI), - at least a second control lens ( 415) crossed by the beam to be detected (FDl) between said first image plane (PI) and said image face (406b) of the movable mirror (406),
- des miroirs de redirection (412, 414, 417, 418) redirigeant le faisceau lumineux (FD) ayant été réfléchi par ladite face objet (406a), puis le faisceau à détecter (FDl), pour permettre le retour dudit faisceau à détecter (FDl) vers ladite face image (406b), et disposés pour que la direction du faisceau à détecter quittant ladite face image (406b) soit égale à la direction du faisceau lumineux incident sur ladite face objet (406a). 12- Microscope suivant la revendication 11, caractérisé par les faits suivants :- redirection mirrors (412, 414, 417, 418) redirecting the light beam (FD) having been reflected by said object face (406a), then the beam to be detected (FDl), to allow the return of said beam to be detected ( FDl) towards said image face (406b), and arranged so that the direction of the beam to be detected leaving said image face (406b) is equal to the direction of the light beam incident on said object face (406a). 12- Microscope according to claim 11, characterized by the following facts:
- ledit dispositif de balayage comprend au moins une lentille objet (405) traversée par ledit faisceau lumineux (FD) provenant dudit objet à observer (401) dirigé vers ledit miroir mobile (406),said scanning device comprises at least one object lens (405) crossed by said light beam (FD) coming from said object to be observed (401) directed towards said movable mirror (406),
- ledit dispositif de balayage comprend au moins une lentille image (420) traversée par ledit faisceau à détecter (FDl) provenant dudit miroir mobile (401) et dirigé vers ledit second plan image (P2),said scanning device comprises at least one image lens (420) crossed by said beam to be detected (FD1) coming from said movable mirror (401) and directed towards said second image plane (P2),
- lesdites lentilles objet (405) et image (420) appartiennent à un premier sous - ensemble (441) fixé sur un premier bâti, - ledit miroir mobile (406), lesdites lentilles de contrôle (411, 415, 416, 419) et lesdits miroirs de redirection (412, 414, 417, 418) appartiennent à un second sous - ensemble (440) fixé sur un second bâti,- said object (405) and image (420) lenses belong to a first sub-assembly (441) fixed on a first frame, - said movable mirror (406), said control lenses (411, 415, 416, 419) and said redirection mirrors (412, 414, 417, 418) belong to a second subassembly (440) fixed on a second frame,
- ledit premier bâti et ledit second bâti sont liés l'un à l'autre par des liaisons déformables.- Said first frame and said second frame are linked to each other by deformable links.
13 - Microscope selon une des revendications 1 à 12, également caractérisé par les faits suivants : - ladite source lumineuse (431 ; 200) est une source étendue de lumière non cohérente,13 - Microscope according to one of claims 1 to 12, also characterized by the following facts: - said light source (431; 200) is an extended source of non-coherent light,
- il comporte un second dispositif de filtrage (409 ; 205) du faisceau issu de ladite source lumineuse (431 ; 200), pour diviser le faisceau d'éclairage (FE) en une pluralité de sous-faisceaux d'éclairage,- it comprises a second filtering device (409; 205) of the beam coming from said light source (431; 200), for dividing the lighting beam (FE) into a plurality of lighting sub-beams,
- le système optique est adapté, d'une part, pour focaliser la pluralité de sous-faisceaux d'éclairage en une pluralité de points d'éclairage correspondants sur le plan observé de l'objet à observer (401 ; 209), et d'autre part, pour focaliser la pluralité de sous-faisceaux lumineux provenant de la pluralité de points d'éclairage en une pluralité de points lumineux sur le premier système de filtrage spatial (413 ; 205),the optical system is adapted, on the one hand, to focus the plurality of lighting sub-beams at a plurality of corresponding lighting points on the observed plane of the object to be observed (401; 209), and d on the other hand, to focus the plurality of light sub-beams coming from the plurality of lighting points into a plurality of light points on the first spatial filtering system (413; 205),
- le premier système de filtrage spatial (413 ; 205) est adapté pour filtrer individuellement chaque point lumineux issu de chaque point éclairé de l'objet à observer (401 ; 209) afin d'obtenir une pluralité de sous- faisceaux à détecter correspondants.- The first spatial filtering system (413; 205) is adapted to individually filter each light point coming from each illuminated point of the object to be observed (401; 209) in order to obtain a plurality of corresponding sub-beams to be detected.
14- Microscope suivant la revendication 13, caractérisé par les faits suivants :14- Microscope according to claim 13, characterized by the following facts:
- ledit premier système de filtrage spatial (413) comporte au moins un premier trou microscopique,said first spatial filtering system (413) comprises at least one first microscopic hole,
- ledit second système de filtrage spatial (409) est distinct dudit premier système de filtrage spatial (413) et comporte au moins un second trou microscopique, - ledit système optique comporte un séparateur de faisceau (407) pour diriger le faisceau d'éclairage (FE) provenant dudit second système de filtrage spatial (409), vers ladite face objet (406a) , et pour diriger le faisceau lumineux (FD) provenant en sens inverse de ladite face objet (406a), vers ledit premier système de filtrage spatial (413). - said second spatial filtering system (409) is distinct from said first spatial filtering system (413) and comprises at least one second microscopic hole, - said optical system comprises a beam splitter (407) for directing the lighting beam ( FE) coming from said second spatial filtering system (409), towards said object face (406a), and for directing the light beam (FD) coming in the opposite direction from said object face (406a), towards said first spatial filtering system ( 413).
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