WO2002097440A2 - Method for determining peptides or proteins, mass spectrometry for metals and determination of conductivity capacity - Google Patents

Method for determining peptides or proteins, mass spectrometry for metals and determination of conductivity capacity Download PDF

Info

Publication number
WO2002097440A2
WO2002097440A2 PCT/DE2002/001966 DE0201966W WO02097440A2 WO 2002097440 A2 WO2002097440 A2 WO 2002097440A2 DE 0201966 W DE0201966 W DE 0201966W WO 02097440 A2 WO02097440 A2 WO 02097440A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
proteins
sample
peptides
determination
metals
Prior art date
Application number
PCT/DE2002/001966
Other languages
German (de)
French (fr)
Other versions
WO2002097440A3 (en
Inventor
Reinhold Kiehl
Original Assignee
Reinhold Kiehl
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2001126697 external-priority patent/DE10126697A1/en
Application filed by Reinhold Kiehl filed Critical Reinhold Kiehl
Priority to AU2002344245A priority Critical patent/AU2002344245A1/en
Priority to EP02750770A priority patent/EP1397687A2/en
Publication of WO2002097440A2 publication Critical patent/WO2002097440A2/en
Publication of WO2002097440A3 publication Critical patent/WO2002097440A3/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon

Definitions

  • the invention is generally concerned with the determination of peptides / proteins.
  • the invention also relates to mass spectrometry for metals and conductivity detectors.
  • mass spectrometry for metals and conductivity detectors are disclosed in the present documents and within the scope of the invention, these are additionally independent inventions with, under certain circumstances, independent protection needs and protection options.
  • the invention relates to the measurement of certain peptides / proteins that can serve as evidence of allergies.
  • this aspect of the present invention is concerned with the measurement of gamma interferon. It has to be clarified how much active gamma interferon is still in the blood in order to be able to determine the amount of gamma interferon to be added from outside for a patient.
  • ⁇ EFN undifferentiated (active plus inactive degraded) ⁇ EFN (peptides, proteins) in cell cultures, cell lines from secretion assays with stimulated isolated cells. It is also known that the active ⁇ lFN (peptides, proteins) molecules relevant for patients / persons (species) are contained in their body fluids, e.g. Blood, are metabolized very quickly, are broken down and an exact allocation of the relevant active ⁇ lFN (peptide, protein) amounts is not possible with the conventional assays.
  • the invention aims to overcome the above drawbacks.
  • the invention aims to enable an exact allocation of the relevant active ⁇ IFN (peptide, protein) amounts.
  • the invention thus provides a method for determining peptides / proteins, characterized in that peptides / proteins at their C end, N end and / or their modified sites and in their entirety with specific antibodies, which are marked such that a later measurement is possible.
  • the basic idea of the invention is based on the measurement of peptides / proteins at their C-end, N-end, their modified sites, and in their entirety (comparison with conventional ⁇ IFN assays) with specific antibodies which are labeled such that a later measurement is possible.
  • the invention leads to new methods for the determination of peptides / proteins, for the detection of active ⁇ lFN (interleukins, cytokines) and their degradation products / metabolites in blood, in plasma, in serum (body) liquids, in tissues, and for the separation of active ⁇ lFN (interleukins, cytokines) and its degradation products / metabolites from these media.
  • therapies of I ranldieitssente ⁇ i / metabolic diseases urticaria, allergies, leukaemias, thromboses, atherosclerosis, rheumatism, rheumatoid arthritis, etc.
  • therapies of clinical pictures / metabolism can be achieved which are associated with the presence of active ⁇ lFN (Interleukins, cytokines) and their degradation products / metabolites are linked, developed, selected, facilitated or improved.
  • the present invention enables a determination of peptides / proteins, for the replacement of active ⁇ lFN (interleukins, cytokines) and its degradation products / metabolites in the absence of a quantity to the normal value.
  • the present invention also makes positive contributions to the development, selection, facilitation and improvement of therapies for clinical pictures / metabolic diseases which are associated with the lack of active ⁇ IFN (hiterleukins, cytokines) and their breakdown products / metabolites, and simultaneous (proportionate) evidence of the different ⁇ lFN / interleukins, cytokines (peptides / proteins) to one another and conclusions about the effect of this special molecule on the metabolism and on the triggering or therapy of derailments.
  • the invention also makes contributions to the explanation of the effect of ⁇ IFN (11-4, II's, cytokines) peptides / proteins on the therapy of various antitumor drugs / antagonist agonists (Cyt P 450 system etc.) to explain the Change in redox potential, etc.
  • the method further provides that a detection possibility (defection device) is coupled to the antibodies, which allows the amount of the antibody molecules to be determined via their concentration. le and thus to determine the quantity of molecules to be determined qualitatively and / or quantitatively.
  • a detection possibility is coupled to the antibodies, which allows the amount of the antibody molecules to be determined via their concentration. le and thus to determine the quantity of molecules to be determined qualitatively and / or quantitatively.
  • the detection or defect device is designed to duplicate or amplify the concentration to be measured. This can be further developed by either designing the detection possibility or the defect device itself to be very large and, in particular, breaking it down into smaller, preferably identical parts in such a way that their concentration can be assumed to be known and / or easily measured, or that the detection possibility or defect Device itself can be duplicated or amplified in such a way that measurement is easily possible using known methods.
  • this also relates to mass spectrometry for metals or metal determination in general, specifically in the form of a mass spectrometer and a method for metal determination with a mass spectrometer.
  • the starting point for this aspect of the invention is conventional mass spectrometry, in which an organic sample in the chamber of the mass spectrometer is bombarded with electrons or a LASER. The resulting positively charged cations are separated by a magnetic field according to mass and charge and recorded with a detector.
  • This conventional mass spectrometry relies on volatile substances.
  • the present invention provides a mass spectrometer, which is characterized in that a carrier gas source, in particular a CO source, is provided in order to bombard a sample with carrier gas, corresponding in particular CO, or that an enzyme solution container with / for an enzyme solution is provided for reaction with at least one metal.
  • a carrier gas source in particular a CO source
  • the aim of the invention is thus achieved by replacing the electron source, which is conventionally customary, for example, with a CO source or generally a carrier gas source, in particular metal-containing fluids being introduced into a sample chamber.
  • the Trä- Gas source or in particular CO source causes the metals contained in the fluids to volatilize in carbonyls and can thus be recorded by the detector.
  • Metal determination method which is characterized in that a sample is bombarded with carrier gas, in particular CO, from a carrier gas source, corresponding in particular with a CO source, or that an enzyme solution reacts with at least one sample metal.
  • Metal-containing fluids are preferably introduced into a sample chamber as part of this method.
  • Carrier gas or, in particular, CO radiation or carrier gas or, in particular, CO bombardment causes the metals contained in the fluids to evaporate in carbonyls and thus to be recorded by the detector.
  • inorganic cations Pt (2+), Pd (2+), Ni (2+), incl.
  • These metals can not or only insufficiently in low concentration with the currently common methods (AAS, etc.) be measured.
  • the measurement of these metals is particularly interesting with regard to various environmental diseases such as contact dermatitis, asthma or BSE, as well as the ozone hole and the greenhouse effect.
  • These metals usually have a low vapor pressure. The tendency of these metals to form volatile carbonyls is used, which makes these metals detectable in the mass spectrometer. Car exhaust gases can then also be measured directly, making the device and method suitable for technical inspections of motor vehicles, such as TÜV in Germany, as well as atmospheric metals and compounds (complexes) as well as organics etc. more.
  • the mass spectrometer and mass determination method according to the invention are designed to determine the concentration of the metals by determining contained and / or emerging peptides, amino acids, etc. This is preferably, but not limited to, e.g. PCR reaction or the methods described above according to the first aspect of the present invention.
  • the metals can also be determined by means of an enzymatic reaction.
  • these metals are introduced into corresponding enzyme solutions which react specifically with these metals, ie are activated (for example nickel-activated horse radical peroxidase, Me proteases, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, etc.).
  • this also relates to conductivity measurement and conductivity determination.
  • a biosensor with two electrodes, to which a constant voltage is applied is known.
  • Blood cells for example, are placed on the electrodes, the change in resistance being measured when the cells are added to the electrodes.
  • cell activity can also be measured when the blood cells are already on the electrodes and additional substances are added.
  • this method cannot be used to measure cells that are still alive. It should be noted that cells can still be measured for about half an hour under in vivo conditions after blood has been drawn.
  • the third aspect of the present invention aims to remedy this drawback.
  • a conductivity measurement according to the invention is characterized in that a blood sample is introduced into a measuring tube, which is surrounded by a plurality of electrodes, and that the electrodes are controlled crosswise with a frequency generator according to a predetermined scheme.
  • a measuring tube is provided for the introduction of a blood sample, which is surrounded by a plurality of electrodes which can be controlled crosswise with a frequency generator according to a predefinable scheme.
  • the invention in the context of the aspect dealt with here therefore consists in introducing the blood sample into a measuring tube which is surrounded by a multiplicity of electrodes.
  • the electrodes are controlled crosswise according to a certain scheme with a frequency generator.
  • this method it is possible, for example, to measure certain redox conditions; overall, it is possible to measure the patient's individual reaction to certain additives.
  • the drawing shows: 1 shows a molecule with modification sites on the example of ⁇ IFN in the context of the method according to the invention for the determination of peptides / proteins,
  • FIG. 3 shows an exemplary embodiment of a protein, peptide or ⁇ IFN with antibody with a defect device as detection means, within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins,
  • Fig. 4 shows another embodiment of a ⁇ lFN with antibody with a defect
  • FIG. 5 shows a diagrammatic representation of the separation of the defection device as detection means, within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins
  • FIG. 6 shows an exemplary embodiment of a conversion step in the context of the method according to the invention for determining peptides / proteins
  • FIG. 7 shows an exemplary embodiment of a detection step in the context of the method according to the invention for determining peptides / proteins
  • FIG. 8 shows an exemplary embodiment of a calculation step within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins
  • FIG. 8a shows an embodiment variant according to FIG. 8, but especially for a missing N end
  • 11 still exemplary embodiments of method variants within the scope of the method according to the invention for the determination of peptides / proteins
  • 12 shows another example of the implementation of process variants within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins
  • FIG. 17 schematically shows two exemplary embodiments of a conductivity measuring cell
  • FIG. 1 shows a molecule such as ⁇ IFN (identical to the notation gIFN) with different modification sites, with 0. the entire active molecule, 1. to 3. the degradation product, th and 4th to 6th correspond to the modification points.
  • Figure 2 shows a molecule like gIFN that lacks the N-terminus.
  • a monoclonal antibody AK specific for the C-end is added to the sample. Then shake for a few minutes.
  • Antibodies AK are preferably commercially available or newly manufactured. The principle applies in particular to every protein (molecule) to be measured, modified or changed.
  • ⁇ IFN identical to the notation gIFN
  • U / ml blood 2.5-25 ng / ml blood.
  • the corresponding detection possibility or Defection Device DD is preferably able to reproduce or amplify the concentration to be measured in such a way that the measurement of the unknown concentration is easily possible, for example also in normal blood samples is.
  • the determination method for peptides / proteins can provide that the detection possibility or Defection Device DD itself is designed to be very large and in particular can be broken down into smaller, preferably identical, parts such that their concentration can be assumed to be known and / or easily measured , In another variant it can be provided that this detection possibility or Defection Device DD itself can be reproduced or amplified in such a way that measurement is easily possible using known methods, for example by means of a subsequent PCR reaction.
  • the detection possibility or defect device DD can then be a magnetic particle, an RNA, a DNA, a polylysine, a polysaccharide, a polypeptide, etc., which is coupled via PCR, magnetically, electrically, electrophoretically (blotting) Dyes (UV, IR, luminescence, fluorescence, etc.) can be easily measured qualitatively and quantitatively.
  • a coupled DNA or RNA is e.g. easy to disassemble.
  • modified ⁇ lFN e.g. commercially available poly (Ad) or poly (G; T; C) chains (balls) are suitable, which would be coupled to an antibody AK in the context of the invention using any coupling method.
  • Ad poly (Ad) or poly (G; T; C) chains (balls) are suitable, which would be coupled to an antibody AK in the context of the invention using any coupling method.
  • These coupling methods are e.g. used routinely in DNA chip technology to couple these compounds to the biochip (see Figure 4).
  • This complex can now be detected in the sample (blood etc.) directly and / or after appropriate separation or washing (centrifugation, TLC plate, column means, inter alia, polyclonal AKs against the entire molecule and digestion of the entire molecule by proteases, peptidases) ,
  • DD ⁇ Poly (Ad) ⁇ is via a chip or a microtiter plate (or other possibilities) by e.g. easily isolate or separate hybidization from (T) covered / occupied surfaces from the sample.
  • the detection is carried out radioactively using labeled nucleotides, 125 J antibodies, etc. Or the detection is carried out by means of a coupled PCR reaction or after digestion of the DNA, RNA, poly (A) (chains) by means of acid bases, DNAases, RNAases, endonucleases etc., followed by an enzyme. Detection of the released nucleotides carried out (1st digestion with common methods to monophosphates).
  • the triphosphates / ATP formed are now detected, for example, by means of downstream enzymes.
  • a measurement of the kinase activity is also possible.
  • the most sensitive method, however, is the measurement using coupled luciferase via luminescence.
  • Detection is also possible using RNA-F, DNA-F, polyNu-F (polylysine-F, polysaccharide-F, etc.) labeled with fluorescent dye (cf. FIG. 7).
  • the concentration calculation is carried out, for example, in accordance with the embodiment shown in FIG. 8 as process component I.
  • process component II is missing for the C-terminus: analogous to L, but with an antibody AK specifically for the N end according to FIG. 8a.
  • a process component HI applies. analogously I. with antibodies AK specifically for these modified molecules, etc.
  • a process component IV applies to the modified molecule ( ⁇ IFN (identical to the notation gIFN)) with policlonal antibodies AK against the modified molecule.
  • the surfaces are coupled with the corresponding counter nucleotides, so that hybridization can take place.
  • the variant a) in FIG. 10 relates to a microtiter plate, etc. for separation or as proof.
  • the variant b) in FIG. 10 relates to a chip, a tube (advantageously, for example, in dialysis) or a column, etc. for separation or for detection.
  • polypeptides are detected using common assays, such as with ninhydrin (Edman degradation, etc.).
  • Evidence of poly sugar e.g. Chitisan, done by coupling with e.g. Dyes, degradation with chitobiose-chitobiase, detection as described (chelates, flocculants for metals).
  • Another way of determining the complex is achieved by means of atomic force microscopy (AFM) titration (cf. FIG. 11).
  • AFM atomic force microscopy
  • the isolated, labeled complexes are applied directly from the separation columns, using nanopipettes, etc. to a suitable sample holder (glass, paper, nylon, etc.) in such a way that a number of spots with increasing concentration arises, which after drying (+ fixation with e.g. formalin, coupling with isothiocyanates, epoxy (-D3), NHS, etc.) are measured orthographically using a CCD camera, scintillation counter, etc.
  • cytokines for testing and control, incubate for certain time intervals and then measure the concentration of cytokines, interferons, etc. ( ⁇ lFN, interleukin-1 (ß), IGF BPs, IGFI etc.) using the methods described.
  • a combination of the different assays on a microtiter plate or on a biochip is also possible.
  • FIG. 13 shows the structure of a conventional mass spectrometer 1 with an electron source 2, an accelerator 3, in particular with a negative potential, a magnet 4, a gap 5 and a collecting vessel 6. Furthermore, a line 14 to a vacuum pump (not shown) is shown and a feeder 15 for a sample (not shown).
  • valve 14 shows the representation of a mass spectrometer analogous to FIG. 1 with the configurations and arrangements according to the invention: valve / switch 7, heatable sample space with furnace 8, (air, gas) CO source / reservoir 9, valve 10 and valve 11 (three - directional valves).
  • the electron source 2 can be switched off according to the schematic illustration in FIG. 14 by means of the valve / switch 7 and the heatable sample space with sample 8 and CO (air, gas, carrier gas) source 9 by means of valves (in particular three-way valves) 10 and 11 connectable to the mass spectrometer 1.
  • Exhaust gases are also (Air, atmosphere, car exhaust gases) can be supplied via the valve 11.
  • the heatable sample space 8 can be opened by means of a closure 12 and can be loaded with a sample carrier / sample 13.
  • the sample space 8 with the sample e.g. Blood or other metal-containing fluids can be loaded with the aid of the closure 12.
  • the CO source 9 and the sample space 8 are connected to the sample 13 via the valves 10 and 11 with the mass spectrometer 1.
  • the sample is heated in the heatable sample room (e.g. to 300 ° C), whereby volatile metal carbonyls are formed which, by means of a vacuum pump and accelerator 3, pass through the magnet 4 and the gap 5 into the collecting vessel 6 after they have been detected.
  • Exhaust gases e.g. Car exhaust gases, air, atmosphere, etc. are introduced directly into the system via valve 11 and measured / detected.
  • the detection limit is preferably in the vicinity of 0.1 pmol / ⁇ l sample.
  • 15 shows the mass spectrogram of ethanol as an example.
  • 16 shows an example of the assumed mass peak of Pt 2+.
  • the metals can also be determined by means of an enzymatic reaction.
  • these metals are introduced into corresponding enzyme solutions which react specifically with these metals, i.e. activated (e.g. nickel-activated horse radical peroxidase, Me proteases, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, etc.).
  • activated e.g. nickel-activated horse radical peroxidase, Me proteases, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, etc.
  • the determination of the resulting peptides, amino acids, etc. using e.g. PCR reaction or the methods described above gives the concentration of the metals.
  • the specific inactivation of various enzymes by these metals can also be used to determine the metals (and vice versa), these are proteases, peptidases, transferases, etc.
  • a microtiter plate (e.g. a chip, etc.) covered with glutathione, metallothionine, transferrin, ferritin, dextrin (or another chelating agent, fusion protein, etc.) binds e.g. Nickel from a sample (liquid, air, etc.) (1), a recombinant horse radish peroxidase is activated (2) and can be removed using substrates such as e.g. Polyhistidine and PCR (among others) detection show the concentration of nickel in the sample.
  • substrates such as e.g. Polyhistidine and PCR (among others) detection show the concentration of nickel in the sample.
  • Aeroallergens such as metal ions
  • B SA filters / columns can be enriched via B SA filters / columns and then detected in / from these filters / columns using the methods described.
  • a conductivity determiner can then also be used to determine these ions, as is explained below in connection with yet another aspect of the present invention.
  • redox potentials in biol are defined by Me ions. Systems, among others.
  • the invention in the context of this aspect consists in introducing a blood sample into a measuring tube which is surrounded by a plurality of electrodes.
  • the electrodes are controlled crosswise according to a certain scheme with a frequency generator.
  • this method it is possible, for example, to measure certain redox conditions; overall, it is possible to measure the patient's individual reaction to certain additives.
  • this redox measuring cell / conductivity measuring cell enables the "ex vivo" (in vivo) measurement of the potential over a (biological) sample, blood sample (cell (s), over cell components, membranes - mitochondria, bacteria (etc.), Cell nucleus cytosol, solutions; blood and its components / serum, plasma; etc., with and without different compounds, under different treatments, conditions.
  • FIG. 17 shows an example for the construction of a conductivity measuring cell 100 with electrodes 102, an opening 103, and feed lines 104 for a frequency generator 105 (FIG. 18).
  • the conductivity measuring cell 100 is designed in Kugelfönn (FIG. 17, example a)), one side being open for the addition of various substances, additives, etc.
  • the total internal volume of the conductivity measuring cell 100 is preferably approximately 0.5 ml.
  • Suitable electrode material would be e.g. Gold.
  • An electromagnetic rotating field, in particular constantly circulating and / or oscillating, is generated by means of the frequency generator 105 (FIG. 18).
  • the conductivity measuring cell 100 is designed in a continuous form (FIG. 17, example b)), the conductivity measuring cell 100 being open at the top and bottom for the passage of liquids (such as, for example: blood). Openings 103 and 107 are provided with a network 106 and 108.
  • the conductivity measuring cell 100 can be used as a perfusion cell.
  • At least two conductivity measuring cells 100 are preferably connected in series, at least one conductivity measuring cell 100 acting as a control.
  • a computer controls voltage / current as well as the resistance and at the same time ensures the change between the measuring cells within an experiment.
  • the frequency generator 105 works as a current source with 4 output channels (I J to L) whose current or voltage phases are each shifted by 90 ° (ij to i 4 , with Oi to O 4 , 11), which leads to a rotating field that serves to stabilize the sample.
  • an amplifier 109 for tapping the voltage Uj at the frequency generator 105 is interposed in front of the computer 110.
  • the behavior (redox, etc.) of an individual species in the measuring cell can be measured with a known cell / particle number in the conductivity measuring cell 100.
  • redox potentials such as Fe 2 Fe 3+ ; ascorbate; glutathione, amino acids, etc.
  • cell biosystems including prion proteins, depending on various conditions (reference to BSE, Kreutzfeld-Jakob), from allergies, asthma in relation to the addition / effect of metals, ROS.

Abstract

The invention relates to a method for determining peptides or proteins. Said method is characterised in that peptides or proteins are measured at their C-end, N-end and/or their modified parts, in addition to in their entirety using specific antibodies, which are labelled in such a way that subsequent measurement is possible. The invention also relates to a mass spectrometry method and device, in which a carrier gas source, in particular a CO source is provided, in order to bombard a sample with a carrier gas, in particular CO, or in which an enzyme-solution container is provided with/for an enzyme solution for reaction with at least one metal. The invention also relates to a method and device for the measurement of conductivity capacity, in which a blood sample is introduced into a measuring tube, which is surrounded by a number of electrodes, said electrodes being controlled crosswise according to a predetermined pattern by means of a frequency generator.

Description

Verfahren zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen, Massenspektrometrie für Metalle und Leitfähigkeitsfeststellung Methods for the determination of peptides / proteins, mass spectrometry for metals and conductivity determination
Beschreibungdescription
Die Erfindung befaßt sich allgemein mit der Bestimmung von Peptiden/Proteinen. Insbesondere in diesem Zusammenhang, aber auch allgemein, befaßt sich die Erfindung auch mit Massenspektrometrie für Metalle und Leitfähigkeitsfeststellern. Soweit in den vorliegenden Unterlagen und im Rahmen der Erfindung Massenspektrometrie für Metalle und Leitfähigkeitsfest- steller offenbart sind, handelt es sich dabei zusätlich auch um jeweils eigenständige Erfindungen mit unter Umständen unabhängigen Schutzbedürfnissen und Schutzmöglichkeiten.The invention is generally concerned with the determination of peptides / proteins. In this context in particular, but also in general, the invention also relates to mass spectrometry for metals and conductivity detectors. Insofar as mass spectrometry for metals and conductivity detectors are disclosed in the present documents and within the scope of the invention, these are additionally independent inventions with, under certain circumstances, independent protection needs and protection options.
Insbesondere betrifft die Erfindung gemäß einem Aspekt die Messung von bestimmten Peptiden/Proteinen, die als Nachweis für Allergien dienen können. Speziell geht es gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung um die Vermessung von Gamma-Interferon. Zu klären ist dabei, wieviel aktives Gamma-Interferon sich noch im Blut befindet, um die von außen zuzugebende Menge von Gamma-Interferon für einen Patienten bestimmen zu können.In particular, in one aspect, the invention relates to the measurement of certain peptides / proteins that can serve as evidence of allergies. Specifically, this aspect of the present invention is concerned with the measurement of gamma interferon. It has to be clarified how much active gamma interferon is still in the blood in order to be able to determine the amount of gamma interferon to be added from outside for a patient.
Bekannt ist die Vermessung von undifferenziertem (aktiven plus inaktiven abgebauten) γEFN (Peptiden, Proteinen) in Zellkulturen, Zelllinien aus Sekretionsassays mit stimulierten isolierten Zellen. Bekannt ist auch, daß die für Patienten/Personen (Spezies) relevanten aktiven γlFN (Peptide, Proteine) -Moleküle in deren Körperflüssigkeiten, wie z.B. Blut, sehr schnell ver- stoffwechselt werden, abgebaut werden und somit eine genaue Zuordnung der relevanten aktiven γlFN (Peptid, Protein) Mengen mit den herkömmlichen Assays nicht möglich ist.It is known to measure undifferentiated (active plus inactive degraded) γEFN (peptides, proteins) in cell cultures, cell lines from secretion assays with stimulated isolated cells. It is also known that the active γlFN (peptides, proteins) molecules relevant for patients / persons (species) are contained in their body fluids, e.g. Blood, are metabolized very quickly, are broken down and an exact allocation of the relevant active γlFN (peptide, protein) amounts is not possible with the conventional assays.
Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung hat diese zum Ziel, die vorstehenden Nachteile zu beseitigen. Insbesondere strebt die Erfindung insoweit an, eine genaue Zuordnung der relevanten aktiven γlFN (Peptid, Protein) Mengen zu ermöglichen.According to the first aspect of the present invention, it aims to overcome the above drawbacks. In particular, the invention aims to enable an exact allocation of the relevant active γIFN (peptide, protein) amounts.
Dies wird mit einem Verfahren gemäß dem Anspruch 1 erreicht.This is achieved with a method according to claim 1.
Erfindungsgemäß wird somit geschaffen, ein Verfahren zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass Peptide/Proteine an deren C-Ende, N-Ende und/oder deren modifizierten Stellen sowie in ihrer Gesamtheit mit spezifischen Antikörpern vermessen werden, die derart markiert sind, dass eine spätere Vermessung möglich ist.The invention thus provides a method for determining peptides / proteins, characterized in that peptides / proteins at their C end, N end and / or their modified sites and in their entirety with specific antibodies, which are marked such that a later measurement is possible.
Die grundsätzliche Idee der Erfindung basiert auf der Vermessung von Peptiden/Proteinen an deren C-Ende, N-Ende, deren modifizierten Stellen, und in ihrer Gesamtheit (Vergleich mit gängigen γlFN-Assays) mit spezifischen Antikörpern, die derart markiert sind, daß eine spätere Vermessung möglich ist.The basic idea of the invention is based on the measurement of peptides / proteins at their C-end, N-end, their modified sites, and in their entirety (comparison with conventional γIFN assays) with specific antibodies which are labeled such that a later measurement is possible.
Die Erfindung führt zu neuen Verfahren zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen, zum Nachweis von aktivem γlFN (Interleukinen, Cytokinen) und dessen Abbauprodukten/Metaboliten im Blut, in Plasma, in Serum-(Kö er)flüssigkeiten, in Geweben, sowie zur Abtrennung von aktivem γlFN (Interleukinen, Cytokinen) und dessen Abbauprodukten/Metaboliten aus diesen Medien. Mit den Ergebnissen dieser Verfahren können in vorteilhafter Weise Therapien von I ranldieitsbildeπi/Stoffwechselerkrankuiigen (Urtikaria, Allergien, Leukämien, Thrombosen, Artheriosklerosen, Rheuma, Rheumatoide Arthritis, u.a.m.) sowie Therapien von Krankheits- bildern/Stoffwechselerl rankungen, die mit der Anwesenheit von aktivem γlFN (Interleukinen, Cytokinen) und dessen Abbauprodukten/Metaboliten verbunden sind, entwickelt, ausgewählt, erleichtert oder verbessert werden.The invention leads to new methods for the determination of peptides / proteins, for the detection of active γlFN (interleukins, cytokines) and their degradation products / metabolites in blood, in plasma, in serum (body) liquids, in tissues, and for the separation of active γlFN (interleukins, cytokines) and its degradation products / metabolites from these media. With the results of these methods, therapies of I ranldieitsbildeπi / metabolic diseases (urticaria, allergies, leukaemias, thromboses, atherosclerosis, rheumatism, rheumatoid arthritis, etc.) as well as therapies of clinical pictures / metabolism can be achieved which are associated with the presence of active γlFN (Interleukins, cytokines) and their degradation products / metabolites are linked, developed, selected, facilitated or improved.
Weiterhin ermöglicht die vorliegende Erfindung eine Bestimmung von Peptiden/Proteinen, zum Ersatz von aktivem γlFN (Interleukinen, Cytokinen) und dessen Abbauprodukten/Metaboliten bei fehlender Menge zum Normalwert. Auch insofern liefert die vorliegende Erfindung positive Beiträge für die Entwicklung, Auswahl, Erleichterung und Verbesserung von Therapien von Krankheitsbildem/Stoffwechselerkrankungen, die mit dem Fehlen von aktivem γlFN (hiterleukinen, Cytokinen) und dessen Abbauprodukten/Metaboliten verbunden sind, und gleichzeitige (verhältnismäßige) Nachweise der verschiedenen γlFN/Interleukine, Cytoki- ne (Peptide/Proteine) zueinander sowie Rückschluß auf die Wirkung dieses speziellen Moleküls am Stoffwechselgeschehen sowie an der Auslösung oder Therapie von Entgleisungen.Furthermore, the present invention enables a determination of peptides / proteins, for the replacement of active γlFN (interleukins, cytokines) and its degradation products / metabolites in the absence of a quantity to the normal value. In this respect, the present invention also makes positive contributions to the development, selection, facilitation and improvement of therapies for clinical pictures / metabolic diseases which are associated with the lack of active γIFN (hiterleukins, cytokines) and their breakdown products / metabolites, and simultaneous (proportionate) evidence of the different γlFN / interleukins, cytokines (peptides / proteins) to one another and conclusions about the effect of this special molecule on the metabolism and on the triggering or therapy of derailments.
Die Erfindung liefert ferner Beiträge zur Erklärung der Wirkung von γlFN (11-4, II 's, Cytoki- nen)-Peptiden/Proteinen auf die Therapie verschiedener Antitumor Drugs/Antagonisten-Ago- nisten (Cyt P 450 System u.a.) zur Erklärung der Änderung des Redoxpotentials u.a.m.The invention also makes contributions to the explanation of the effect of γIFN (11-4, II's, cytokines) peptides / proteins on the therapy of various antitumor drugs / antagonist agonists (Cyt P 450 system etc.) to explain the Change in redox potential, etc.
Gemäß einer bevorzugten und vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist bei dem Verfahren ferner vorgesehen, dass an den Antikörpern eine Nachweismöglichkeit (defection device) angekoppelt wird, die es erlaubt, über deren Konzentration die Menge der Antikörpermolekü- le und damit die der unbekannten zu bestimmenden Molekülmenge qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.According to a preferred and advantageous development of the invention, the method further provides that a detection possibility (defection device) is coupled to the antibodies, which allows the amount of the antibody molecules to be determined via their concentration. le and thus to determine the quantity of molecules to be determined qualitatively and / or quantitatively.
Eine andere bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung, wie vorstehend erläutert, sieht vor, dass die Nachweismöglichkeit oder Defection Device ausgelegt ist, die zu messende Konzentration so zu vervielfältigen oder amplifizieren. Die kann dadurch weitergebildet werden, dass entweder die Nachweismöglichkeit oder Defection Device selbst sehr groß ausgelegt wird und insbesondere in kleinere vorzugsweise gleiche Teile so zerlegt werden kann, dass deren Konzentration als bekannt vorausgesetzt und/oder leicht gemessen werden kann, oder dass die Nachweismöglichkeit oder Defection Device selbst so vervielfältigt oder amplifiziert werden kann, dass eine Vermessung leicht mit bekannten Methoden möglich ist.Another preferred embodiment of the invention, as explained above, provides that the detection or defect device is designed to duplicate or amplify the concentration to be measured. This can be further developed by either designing the detection possibility or the defect device itself to be very large and, in particular, breaking it down into smaller, preferably identical parts in such a way that their concentration can be assumed to be known and / or easily measured, or that the detection possibility or defect Device itself can be duplicated or amplified in such a way that measurement is easily possible using known methods.
Im Rahmen eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung betrifft diese auch Massenspektrometrie für Metalle oder allgemein Metallbestimmung, und zwar im Form eines Mas- senspektrometers und eines Verfahrens zur Metallbestimmung mit einem Massenspektrometer.In the context of a further aspect of the present invention, this also relates to mass spectrometry for metals or metal determination in general, specifically in the form of a mass spectrometer and a method for metal determination with a mass spectrometer.
Ausgangspunkt für diesen Aspekt der Erfindung ist die herkömmliche Massenspektrometrie, bei der eine organische Probe in der Kammer des Massenspektrometers mit Elektronen oder einem LASER beschossen wird. Die dadurch entstehenden positiv geladenen Kationen werden über ein Magnetfeld nach Masse und Ladung getrennt und mit einem Detektor aufgenommen. Diese herkömmliche Massenspetrometrie ist auf leicht flüchtige Substanzen angewiesen.The starting point for this aspect of the invention is conventional mass spectrometry, in which an organic sample in the chamber of the mass spectrometer is bombarded with electrons or a LASER. The resulting positively charged cations are separated by a magnetic field according to mass and charge and recorded with a detector. This conventional mass spectrometry relies on volatile substances.
Das Problem dieses herkömmlichen Massenspektrometers besteht deshalb darin, daß Metalle oder Metallsalze mit dieser Methode bisher nicht untersucht werden können. Entsprechend dem diesbezüglichen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es deren Ziel, Massenspektrometrie auch für Metalle oder Metallsalze zu ermöglichen.The problem with this conventional mass spectrometer is therefore that metals or metal salts cannot be investigated using this method. According to the relevant aspect of the present invention, its aim is to enable mass spectrometry also for metals or metal salts.
Dazu schafft die vorliegende Erfindung ein Massenspektrometer, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Trägergasquelle, insbesondere eine CO-Quelle, vorgesehen ist, um eine Probe mit Trägergas, entsprechend insbesondere CO, zu beschießen, oder dass ein Enzymlösungsbe- hälter mit/für eine Enzymlösung zur Reaktion mit wenigstens einem Metall vorgesehen ist.For this purpose, the present invention provides a mass spectrometer, which is characterized in that a carrier gas source, in particular a CO source, is provided in order to bombard a sample with carrier gas, corresponding in particular CO, or that an enzyme solution container with / for an enzyme solution is provided for reaction with at least one metal.
Das erfindungsgemäße Ziel wird somit dadurch erreicht, dass die beispielsweise herkömmlich übliche Elektronenquelle durch eine CO-Quelle oder allgemein Trägergasquelle ersetzt wird, wobei insbesondere metallhaltige Fluide in eine Probenkammer eingebracht werden. Die Trä- gergasquelle oder insbesondere CO-Quelle bewirkt, daß die in den Fluiden enthaltenen Metalle in Karbonyle verflüchtigt und damit vom Detektor aufgenommen werden können.The aim of the invention is thus achieved by replacing the electron source, which is conventionally customary, for example, with a CO source or generally a carrier gas source, in particular metal-containing fluids being introduced into a sample chamber. The Trä- Gas source or in particular CO source causes the metals contained in the fluids to volatilize in carbonyls and can thus be recorded by the detector.
Weiterhin schafft die Erfindung im Rahmen dieses Aspektes einFurthermore, the invention provides within this aspect
Metallbestimmungsverfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Probe mit Trägergas, insbesondere CO, von einer Trägergasquelle, entsprechend insbesondere einer CO-Quelle, beschossen wird, oder dass eine Enzymlösung mit wenigstens einem Probenmetall reagiert.Metal determination method, which is characterized in that a sample is bombarded with carrier gas, in particular CO, from a carrier gas source, corresponding in particular with a CO source, or that an enzyme solution reacts with at least one sample metal.
Vorzugsweise werden im Rahmen dieses Verfahrens metallhaltige Fluide in eine Probenkammer eingebracht. Die Trägergas- oder insbesondere CO-Bestrahlung oder der Trägergas- oder insbesondereCO-Beschuss bewirkt, daß die in den Fluiden enthaltenen Metalle in Karbonyle verflüchtigt und damit vom Detektor aufgenommen werden können.Metal-containing fluids are preferably introduced into a sample chamber as part of this method. Carrier gas or, in particular, CO radiation or carrier gas or, in particular, CO bombardment causes the metals contained in the fluids to evaporate in carbonyls and thus to be recorded by the detector.
Gemessen werden sollen vor allem anorganische Kationen, Pt (2+), Pd (2+), Ni (2+), inkl. Diese Metalle können in niederer Konzentration mit den zur Zeit gängigen Methoden (AAS, usw.) nicht oder nur unzureichend vermessen werden. Interessant ist die Vermessung dieser Metalle vor allem im Hinblick auf verschiedene Umwelterkrankungen, wie Kontaktdermatitis, Asthma oder BSE, sowie das Ozonloch und den Treibhauseffekt.Above all, inorganic cations, Pt (2+), Pd (2+), Ni (2+), incl. Are to be measured. These metals can not or only insufficiently in low concentration with the currently common methods (AAS, etc.) be measured. The measurement of these metals is particularly interesting with regard to various environmental diseases such as contact dermatitis, asthma or BSE, as well as the ozone hole and the greenhouse effect.
Diese Metalle weisen normalerweise einen kleinen Dampfdruck auf. Es wird die Tendenz dieser Metalle zur Bildung flüchtiger Carbonyle ausgenutzt, womit diese Metalle im Massenspektrometer detektierbar werden. Autoabgase können damit dann ebenfalls direkt vermessen werden, womit die Vorrichtung und Methode für technische Überprüfungen von Kraftfahrzeugen, wie in Deutschland den TÜV, geeignet sind, ebenso athmosphärische Metalle und Verbindungen (Komplexe) sowie auch Organika u.a. mehr.These metals usually have a low vapor pressure. The tendency of these metals to form volatile carbonyls is used, which makes these metals detectable in the mass spectrometer. Car exhaust gases can then also be measured directly, making the device and method suitable for technical inspections of motor vehicles, such as TÜV in Germany, as well as atmospheric metals and compounds (complexes) as well as organics etc. more.
Insbesondere sind das erfindungsgemäße Massenspektrometer und Massenbestimmungsverfahren dafür ausgelegt, die Konzentration der Metalle durch die Bestimmung von enthaltenen und/oder entstehenden Peptide, Aminosäuren, etc., zu ermitteln. Vorzugsweise, jedoch nicht beschränkt darauf erfolgt dies mittels z.B. PCR-Reaktion oder den Methoden, die vorstehend gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden erfindung beschrieben sind.In particular, the mass spectrometer and mass determination method according to the invention are designed to determine the concentration of the metals by determining contained and / or emerging peptides, amino acids, etc. This is preferably, but not limited to, e.g. PCR reaction or the methods described above according to the first aspect of the present invention.
Bei einer anderen Variante der Erfindung im Zusammenhang mit der Massensprktrometrie können die Metalle auch mittels enzymatischer Reaktion bestimmt werden. Dazu werden diese Metalle in entsprechende Enzymlösungen eingetragen, welche spezifisch mit diesen Metallen reagieren, d.h. aktiviert werden (z.B. Nickel aktivierte Horse radish Peroxidase, Me-Pro- teasen, Superoxiddismutase, Glutathione-Peroxidase, usw.). Im Rahmen noch eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung betrifft diese auch Leitfähigkeitsmessung und Leitfähigkeitsfeststeller.In another variant of the invention in connection with mass spectrometry, the metals can also be determined by means of an enzymatic reaction. For this purpose, these metals are introduced into corresponding enzyme solutions which react specifically with these metals, ie are activated (for example nickel-activated horse radical peroxidase, Me proteases, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, etc.). Within the scope of yet another aspect of the present invention, this also relates to conductivity measurement and conductivity determination.
Bekannt ist ein Biosensor mit zwei Elektroden, an denen eine konstante Spannung anliegt. Auf die Eletroden werden beispielsweise Blutzellen gegeben, wobei die Widerstandsänderung bei Zugabe der Zellen auf die Elektroden gemessen wird. Zusätzlich kann auch die Zellaktivität gemessen werden, wenn die Blutzellen sich bereits auf den Elektroden befinden und zusätzliche Stoffe zugegeben werden. Mit dieser Methode kann allerdings keine Messung von noch lebenden Zellen durchgeführt werden. Hierbei muß beachtet werden, daß Zellen nach Blutentnahme noch ca. eine halbe Stunde unter In-vivo-Bedingungen meßbar sind. Der dritte Aspekt dxer vorliegenden Erfindung hat und erreicht das Ziel, bei diesem Nachteil Abhilfe zu schaffen.A biosensor with two electrodes, to which a constant voltage is applied, is known. Blood cells, for example, are placed on the electrodes, the change in resistance being measured when the cells are added to the electrodes. In addition, cell activity can also be measured when the blood cells are already on the electrodes and additional substances are added. However, this method cannot be used to measure cells that are still alive. It should be noted that cells can still be measured for about half an hour under in vivo conditions after blood has been drawn. The third aspect of the present invention aims to remedy this drawback.
Eine erfindungsgemäße Leitfähigkeitsmessung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Blutprobe in einen Meßtubus eingeführt wird, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist, und dass die Elektroden nach einem vorgegebenen Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator angesteuert werden. Bei einem Leitfähigkeitsfeststeller nach der Erfindung ist vorgesehen, dass für die Einführung einer Blutprobe ein Meßtubus vorgesehen, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist, die nach einem vorgebbaren Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator ansteuerbar sind.A conductivity measurement according to the invention is characterized in that a blood sample is introduced into a measuring tube, which is surrounded by a plurality of electrodes, and that the electrodes are controlled crosswise with a frequency generator according to a predetermined scheme. In the case of a conductivity determiner according to the invention, it is provided that a measuring tube is provided for the introduction of a blood sample, which is surrounded by a plurality of electrodes which can be controlled crosswise with a frequency generator according to a predefinable scheme.
Die Erfindung im Rahmen des hier behandelten Aspektes somit besteht darin, die Blutprobe in einen Meßtubus einzuführen, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist. Die Elektroden werden nach einem bestimmten Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator angesteuert. Mit dieser Methode ist es beispielsweise möglich, bestimmte Redox-Zustände zu messen, insgesamt ist es möglich, die individuelle Reaktion des Patienten auf bestimmte Zugabestoffe zu messen.The invention in the context of the aspect dealt with here therefore consists in introducing the blood sample into a measuring tube which is surrounded by a multiplicity of electrodes. The electrodes are controlled crosswise according to a certain scheme with a frequency generator. With this method it is possible, for example, to measure certain redox conditions; overall, it is possible to measure the patient's individual reaction to certain additives.
Weitere vorzugsweise und oder vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen und deren Kombinationen sowie insbesondere auch aus den gesamten vorliegenden Unterlagen, in denen weitere kombiniert oder alleine schutzfähige und schutzwürdige Ausgestaltungen offenbart sind.Further preferred and or advantageous refinements of the invention result from the dependent claims and their combinations and in particular also from the entire available documents, in which further combinations or only defensible and protectable refinements are disclosed.
Anhand der nachfolgend beschriebenen und in den Zeichnungen dargestellten Ausfuhrungsund Anwendungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert. In der Zeichnung zeigen: Fig. 1 ein Molekül mit Modifikationsstellen am Besipiel von γlFN im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,The invention is explained in more detail with reference to the exemplary embodiments and application examples described below and shown in the drawings. The drawing shows: 1 shows a molecule with modification sites on the example of γIFN in the context of the method according to the invention for the determination of peptides / proteins,
Fig. 2 ein Molekül, dem der N-terminus fehlt, am Besipiel von γlFN im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,2 shows a molecule which lacks the N-terminus, for example γIFN in the context of the method according to the invention for determining peptides / proteins,
Fig. 3 ein Ausführungsbeispiel eines Proteins, Peptids oder γlFN mit Antikörper mit einer Defection Device als Nachweismittel, im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,3 shows an exemplary embodiment of a protein, peptide or γIFN with antibody with a defect device as detection means, within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins,
Fig. 4 ein weiteres Ausführungsbeispiel eines γlFN mit Antikörper mit einer DefectionFig. 4 shows another embodiment of a γlFN with antibody with a defect
Device als Nachweismittel in Verbindung mit einem Biochip, im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,Device as detection means in connection with a biochip, in the context of the method according to the invention for the determination of peptides / proteins,
Fig. 5 eine diagrammartige Darstellung der Abtrennung der Defection Device als Nachweismittel, im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,5 shows a diagrammatic representation of the separation of the defection device as detection means, within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins,
Fig. 6 ein Ausführungsbeispiel eines Umwandlungsschrittes im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,6 shows an exemplary embodiment of a conversion step in the context of the method according to the invention for determining peptides / proteins,
Fig. 7 ein Ausführungsbeispiel eines Nachweisschrittes im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,7 shows an exemplary embodiment of a detection step in the context of the method according to the invention for determining peptides / proteins,
Fig. 8 ein Ausführungsbeispiel eines Berechnungsschrittes im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,8 shows an exemplary embodiment of a calculation step within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins,
Fig. 8a eine Ausfuhrungsvariante gemäß Fig. 8, jedoch speziell für ein fehlendes N-Ende,8a shows an embodiment variant according to FIG. 8, but especially for a missing N end,
Fig. 9 ein Ausführungsbeispiel eines Auswertungsschrittes im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,9 shows an exemplary embodiment of an evaluation step within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins,
Fig. 10 zwei weitere Ausführungsbeispiele von Verfahrensvarianten im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,10 shows two further exemplary embodiments of method variants within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins,
Fig. 11 noch Ausfuhrungsbeispiele von Verfahrensvarianten im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen, Fig. 12 noch ein Ausfülirungsbeispiel von Verfahrensvarianten im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen,11 still exemplary embodiments of method variants within the scope of the method according to the invention for the determination of peptides / proteins, 12 shows another example of the implementation of process variants within the scope of the method according to the invention for determining peptides / proteins,
Fig. 13 schematisch den Aufbau eines herkömmlichen Massenspektrometers,13 schematically shows the structure of a conventional mass spectrometer,
Fig. 14 schematisch den Aufbau eines Massenspektrometers mit den erfindungsgemäßen Ausgestaltungen und Anordnungen,14 schematically shows the structure of a mass spectrometer with the configurations and arrangements according to the invention,
Fig. 15 ein Massenspektrogramm von Äthanol,15 is a mass spectrogram of ethanol,
Fig. 16 einen angenommenen Massenpeak von Pt 2+,16 an assumed mass peak of Pt 2+,
Fig. 17 schematisch zwei Ausführungsbeispiele einer Leitfähigkeitsmeßzelle, und17 schematically shows two exemplary embodiments of a conductivity measuring cell, and
Fig. 18 schematisch ein Ausführungsbeispiel eines Frequenzgenerators.18 schematically shows an embodiment of a frequency generator.
Gleiche Bezugszeichen in den einzelnen Figuren und Abbildungen der Zeichnungen bezeichnen gleiche oder ähnliche oder gleich oder ähnlich wirkende Komponenten. Anhand der Darstellungen in der Zeichnung werden auch solche Merkmale deutlich, die nicht mit Bezugszeichen versehen sind, unabhängig davon, ob solche Merkmale nachfolgend beschrieben sind oder nicht. Andererseits sind auch Merkmale, die in der vorliegenden Besclireibung enthalten, aber nicht in der Zeichnung sichtbar oder dargestellt sind, ohne weiteres für einen Fachmann verständlich.Identical reference symbols in the individual figures and illustrations of the drawings denote identical or similar or identically or similarly acting components. Features that are not provided with reference numerals also become clear on the basis of the representations in the drawing, regardless of whether such features are described below or not. On the other hand, features which are contained in the present description but which are not visible or not shown in the drawing are readily understandable to a person skilled in the art.
Einzelne Merkmale, die im Zusammenhang mit konkreten Ausführungsbeispielen angeben und/oder dargestellt sind, sind nicht auf diese Ausführungsbeispiele oder die Kombination mit den übrigen Merkmalen dieser Ausführungsbeispiele beschränkt, sondern können im Rahmen des technisch Möglichen, mit jeglichen anderen Varianten, auch wenn sie in den vorliegenden Unterlagen nicht gesondert behandelt sind, kombiniert werden.Individual features that specify and / or are shown in connection with specific exemplary embodiments are not limited to these exemplary embodiments or the combination with the other features of these exemplary embodiments, but can, within the scope of what is technically possible, with any other variants, even if they are shown in FIGS available documents are not treated separately, can be combined.
In den Fig. 1 bis 12 wird ein erster Aspekt der Erfindung zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen anhand von Ausfuhrungsbeispielen näher erläutert.1 to 12, a first aspect of the invention for the determination of peptides / proteins is explained in more detail using exemplary embodiments.
Die Fig. 1 zeigt ein Molekül, wie γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN), mit verschiedenen Modifikationsstellen, wobei 0. dem ganzen aktiven Molekül, 1. bis 3. den Abbauproduk- ten und 4. bis 6. den Modifikationsstellen entspricht. Die Fig. 2 zeigt ein Molekül, wie gIFN, dem der N-terminus fehlt.1 shows a molecule such as γIFN (identical to the notation gIFN) with different modification sites, with 0. the entire active molecule, 1. to 3. the degradation product, th and 4th to 6th correspond to the modification points. Figure 2 shows a molecule like gIFN that lacks the N-terminus.
Nachfolgend wird der Aspekt der Erfindung betreffend die Bestimmung von Peptiden/Proteinen anhand eines Ausführungsbeispiels für die Vermessung in Blut, Plasma, Serum, Flüssigkeiten unter Darstellung mehrerer Lösungsmöglichkeiten für die Erreichung des Zieles näher erläutert.The aspect of the invention relating to the determination of peptides / proteins is explained in more detail below on the basis of an exemplary embodiment for measurement in blood, plasma, serum, liquids, with the presentation of several possible solutions for achieving the goal.
Unter Bezugnahme auf die Fig. 3 wird ein monoklonaler Antikörper AK spezifisch für das C- Ende zu der Probe addiert. Daraufhin wird für einige Minuten geschüttelt. Diesem Antikörper AK ist eine Nachweismöglichkeit DD (= Defection Device) angekoppelt, die es erlaubt, über deren Konzentration die Menge der Antikörper-Molelcüle AK und damit die der unbekannten zu bestimmenden Molekühnenge (Protein, Peptide etc.) qualitativ und quantitativ zu bestimmen.Referring to Figure 3, a monoclonal antibody AK specific for the C-end is added to the sample. Then shake for a few minutes. A detection possibility DD (= Defection Device) is coupled to this antibody AK, which allows the amount of the antibody molecules AK and thus the quantity of the unknown molecule (protein, peptides etc.) to be determined qualitatively and quantitatively via their concentration.
Antikörper AK sind vorzugsweise käuflich zu erwerben oder neu herzustellen. Das Prinzip gilt insbesondere für jedes zu messende Protein (Molekül), modifiziert oder verändert. Insbesondere ist bei dem gezeigten Beispiel in der Fig. 3 der Normalwert von γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN) = 50 - 500 U/ml Blut = 2,5 - 25 ng/ml Blut.Antibodies AK are preferably commercially available or newly manufactured. The principle applies in particular to every protein (molecule) to be measured, modified or changed. In particular, in the example shown in FIG. 3, the normal value of γIFN (identical to the notation gIFN) = 50-500 U / ml blood = 2.5-25 ng / ml blood.
Da die unbekannte zu messende Konzentration der Verbindung, die modifiziert, abgebaut, usw. ist und der z.B. ein N-terminales Ende oder ein C-terminales Ende fehlt, hier für γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN), im femto- oder nanogramm Bereich (fg oder ng-Be- reich) oder kleiner erwartet wird, ist die entsprechende Nachweismöglichkeit oder Defection Device DD vorzugsweise in der Lage, die zu messende Konzentration so zu vervielfältigen oder amplifizieren, dass die Messung der unbekannten Konzentration leicht beispielsweise auch in normalen Blutproben möglich ist. Dazu kann bei dem Bestimmungs verfahren für Peptide/Proteine vorgesehen sein, dass die Nachweismöglichkeit oder Defection Device DD selbst sehr groß ausgelegt wird und insbesondere in kleinere vorzugsweise gleiche Teile so zerlegt werden kann, dass deren Konzentration als bekannt vorausgesetzt und/oder leicht gemessen werden kann. Bei einer anderen Variante kann vorgesehen sein, dass diese Nachweismöglichkeit oder Defection Device DD selbst so vervielfältigt oder amplifiziert werden kann, dass eine Vermessung leicht mit bekannten Methoden möglich wird z.B. durch eine nachgeschaltete PCR-Reaktion. Die Nachweismöglichkeit oder Defection Device DD kann dann ein Magnetpartikel, eine RNA, eine DNA, ein Polylysin, ein Polysaccharid, ein Polypeptid, etc., sein, welches über PCR, magnetisch, elektrisch, elektrophoretisch (Blotting), gekoppelte Farbstoffe (UV, IR, Lumineszenz, Fluoreszenz, usw.) leicht qualtitativ und quantitativ vermessen werden kann.Since the unknown concentration of the compound to be measured, which is modified, degraded, etc. and which, for example, lacks an N-terminal end or a C-terminal end, is here for γIFN (identical to the notation gIFN), in the femto- or nanogram range (fg or ng range) or smaller is expected, the corresponding detection possibility or Defection Device DD is preferably able to reproduce or amplify the concentration to be measured in such a way that the measurement of the unknown concentration is easily possible, for example also in normal blood samples is. For this purpose, the determination method for peptides / proteins can provide that the detection possibility or Defection Device DD itself is designed to be very large and in particular can be broken down into smaller, preferably identical, parts such that their concentration can be assumed to be known and / or easily measured , In another variant it can be provided that this detection possibility or Defection Device DD itself can be reproduced or amplified in such a way that measurement is easily possible using known methods, for example by means of a subsequent PCR reaction. The detection possibility or defect device DD can then be a magnetic particle, an RNA, a DNA, a polylysine, a polysaccharide, a polypeptide, etc., which is coupled via PCR, magnetically, electrically, electrophoretically (blotting) Dyes (UV, IR, luminescence, fluorescence, etc.) can be easily measured qualitatively and quantitatively.
Eine gekoppelte DNA oder RNA ist z.B. leicht in die Bestandteile zu zerlegen. Lediglich exemplarisch, aber mit Vorteil ist beispielsweise für die Vermessung einer unbekannten Menge an modifizierten γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN), sind z.B. käufliche Poly-(Ad) oder Poly-(G; T; C)-Ketten (-Knäuel) geeignet, die mit einer beliebigen Kopplungsmethode an einen Antikörper AK im Rahmen der Erfindung zu koppeln wären. Diese Kopplungsmethoden werden z.B. in der DNA-Chip-Technologie routinemäßig benutzt zur Kopplung dieser Verbindungen an den Biochip (siehe Fig. 4). Dieser Komplex kann in der Probe (Blut etc.) nun direkt und/oder nach entsprechendem Abtrennen oder Waschen (Zentrifugation, DC-Plat- te, Säule- mittels u.a. polyklonaler AK's gegen das Gesamtmolekül sowie Verdauung des Gesamtmoleküls durch Proteasen, Peptidasen) nachgewiesen werden.A coupled DNA or RNA is e.g. easy to disassemble. For example only, but with advantage for measuring an unknown amount of modified γlFN (identical to the spelling gIFN), e.g. commercially available poly (Ad) or poly (G; T; C) chains (balls) are suitable, which would be coupled to an antibody AK in the context of the invention using any coupling method. These coupling methods are e.g. used routinely in DNA chip technology to couple these compounds to the biochip (see Figure 4). This complex can now be detected in the sample (blood etc.) directly and / or after appropriate separation or washing (centrifugation, TLC plate, column means, inter alia, polyclonal AKs against the entire molecule and digestion of the entire molecule by proteases, peptidases) ,
Hierzu ist in der Fig. 5 ein Beispiel angegeben. DD∞ = Poly(Ad)∞ ist über eine Chip- oder eine Mikrotiterplatte (oder andere Möglichkeiten) durch z.B. Hybidisierung über (T) bedeckte/belegte Oberflächen leicht aus der Probe zu isolieren oder abtrennen.An example of this is given in FIG. 5. DD∞ = Poly (Ad) ∞ is via a chip or a microtiter plate (or other possibilities) by e.g. Easily isolate or separate hybidization from (T) covered / occupied surfaces from the sample.
Der Nachweis wird mittels markierter Nukleotide, 125 J- Antikörper, etc. radioaktiv durchgeführt. Oder aber der Nachweis wird mittels gekoppelter PCR-Reaktion oder aber nach Verdauung der DNA-, RNA-, Poly(A)- (Ketten) mittels Säuren-Basen, DNAasen, RNAasen, En- donukleasen etc., mit anschließendem Enzym. Nachweis der freigesetzten Nukleotide durchgeführt (1. Verdauung mit gängigen Methoden zu Monophosphaten).The detection is carried out radioactively using labeled nucleotides, 125 J antibodies, etc. Or the detection is carried out by means of a coupled PCR reaction or after digestion of the DNA, RNA, poly (A) (chains) by means of acid bases, DNAases, RNAases, endonucleases etc., followed by an enzyme. Detection of the released nucleotides carried out (1st digestion with common methods to monophosphates).
Weiterhin liegt im Rahmen des erfindungsgemäßen Peptid/Protein-Bestimmungsverfahrens eine Umwandlung mit Pi-Transferasen zu Di- und Triphosphaten, z.B.Furthermore, within the scope of the peptide / protein determination method according to the invention there is a conversion with pi-transferases to di- and triphosphates, e.g.
- mit Phosphorsäuren, Polyphosphaten zu Diphosphaten, mit Kinasen zu Triphosphaten; oder- With phosphoric acids, polyphosphates to diphosphates, with kinases to triphosphates; or
- mit Adeylatkinasen zu Diphosphaten, e.g. mit Myokinasen zu Diphosphaten (vgl. Fig. 6).- with adeylate kinases to diphosphates, e.g. with myokinases to diphosphates (see Fig. 6).
Der Nachweis der entstandenen Triphosphate/ATP erfolgt nun beispielsweise mittels nachgeschalteter enzym. (ATPase-) Messung mittels Biolumineszens (Luciferase/Luminometer). Ebenfalls ist eine Messung über die Kinasen- Aktivität möglich. Die sensitivste Methode ist aber die Vermessung mittels gekoppelter Luciferase über Lumineszenz. Der Nachweis ist auch möglich über mit Fluoreszenz-Farbstoff-markierter RNA-F, DNA-F, polyNu-F (polyly- sin-F, polysaccharid-F, etc.) (vgl. Fig. 7). Die Konzentrationsberechnung erfolgt z.B. gemäß der Ausführung entsprechend der Darstellung in der Fig. 8 als Verfahrensbestandteil I. Weiterhin gilt als Verfahrensbestandteil II. für C-Terminus fehlend: analog L, aber mit einem Antikörper AK speziell für das N-Ende gemäß Fig. 8a. Für fehlendes X, Y, (S) Z = Zucker gilt ein Verfahrensbestandteil HI. analog I. mit Antikörpern AK speziell für diese modifizierten Moleküle, usw. Ein Verfahrensbestandteil IV. gilt für das modifizierte Molekül (γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN)) mit po- liklonalen Antikörpern AK gegen das modifiziere Molekül. Ein Verfahrensbestandteil V. ergibt für das ganze Molekül als Kontrolle = 0.The triphosphates / ATP formed are now detected, for example, by means of downstream enzymes. (ATPase) measurement using bioluminescence (luciferase / luminometer). A measurement of the kinase activity is also possible. The most sensitive method, however, is the measurement using coupled luciferase via luminescence. Detection is also possible using RNA-F, DNA-F, polyNu-F (polylysine-F, polysaccharide-F, etc.) labeled with fluorescent dye (cf. FIG. 7). The concentration calculation is carried out, for example, in accordance with the embodiment shown in FIG. 8 as process component I. Furthermore, process component II is missing for the C-terminus: analogous to L, but with an antibody AK specifically for the N end according to FIG. 8a. For missing X, Y, (S) Z = sugar, a process component HI applies. analogously I. with antibodies AK specifically for these modified molecules, etc. A process component IV applies to the modified molecule (γIFN (identical to the notation gIFN)) with policlonal antibodies AK against the modified molecule. A process component V. gives the whole molecule as control = 0.
Resultat: Qualität und Quantität - 0. = unverändertes ganzes Molekül 1. - 3. Abbau-Produkte/Moleküle 4. - 6. modifizierte Produkte/MoleküleResult: quality and quantity - 0. = unchanged whole molecule 1. - 3. degradation products / molecules 4. - 6. modified products / molecules
z.B.: 0./1. Und 3. γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN) (Konz.)e.g .: 0./1. And 3. γlFN (identical to the spelling gIFN) (conc.)
Die Auswertung erfolgt analog Fig. 9 unter Anwendung entsprechender Mathematik und (Computer)-Berechnung anhand der erhaltenen Kurven, Werte und/oder auch mittels Kompe- titivem Assay!The evaluation is carried out analogously to FIG. 9 using appropriate mathematics and (computer) calculation based on the curves, values obtained and / or also by means of a competitive assay!
Wenn bekannt ist, daß z.B. bei γlFN (identisch mit der Schreibweise gIFN) nur ein Ende fehlt => I + π ergibt: abgebaut + abgebaut plus (gesamtes) ganzes γlFN => Diff. = Intaktes γlFNIf it is known that e.g. with γlFN (identical to spelling gIFN) only one end is missing => I + π results: degraded + degraded plus (entire) whole γlFN => diff. = Intact γlFN
Für die verschiedenen nachzuweisenden Moleküle, wie γIFNc, γIFNN, γIFNx, γIFNY, γIFNz können verschiedene Nachweismöglichkeiten oder Defection Devices DD, oder anders ausgedrückt insbesondere Amplifier benutzt werden, was eine weitere Vereinfachung bringt: Für γIFNc = gIFN = (Ad)poly, γIFNN = gIFN = (T)poly, γIFNx = gIFN = (G)poly, γTFNY = gIFN = (C)poly, γIFNz = gIFN = usw. Die Oberflächen werden mit den entsprechenden Gegennukleotiden gekoppelt, so daß die Hybridisierung stattfinden kann. Dann erfolgt ebenso der Nachweis, wie aufgezeigt (Fig. 10). Damit kann insbesondere realisiert werden vom einfachen ELISA zur Platte zum Chip = Proteinchip. Die Variante a) in der Fig. 10 betrifft eine Mikrotiterplatte, etc. zur Trennung oder zum Nachweis. Die Variante b) in der Fig. 10 betrifft einen Chip, einen Schlauch (vorteilhaft z.B. bei der Dialyse) oder eine Säule, etc. zur Trennung oder zum Nachweis.For the different molecules to be detected, such as γIFN c , γIFN N , γIFN x , γIFN Y , γIFN z , different detection options or Defection Devices DD, or in other words amplifiers in particular, can be used, which further simplifies: For γIFN c = gIFN = ( Ad) poly, γIFN N = gIFN = (T) poly, γIFN x = gIFN = (G) poly, γTFN Y = gIFN = (C) poly, γIFN z = gIFN = etc. The surfaces are coupled with the corresponding counter nucleotides, so that hybridization can take place. Then there is also the detection, as shown (Fig. 10). This can be used in particular from simple ELISA to plate to chip = protein chip. The variant a) in FIG. 10 relates to a microtiter plate, etc. for separation or as proof. The variant b) in FIG. 10 relates to a chip, a tube (advantageously, for example, in dialysis) or a column, etc. for separation or for detection.
Nachweise der Polypeptide erfolgen nach Verdauung über gängige Assays, wie z.B. mit Nin- hydrin (Edman- Abbau, usw.). Nachweise der Polyzucker, wie z.B. Chitisan, erfolgen durch Koppeln mit z.B. Farbstoffen, Abbau mit Chitobiose-Chitobiase, Nachweis wie beschrieben (Chelate, Flockungsmittel für Metalle).After digestion, the polypeptides are detected using common assays, such as with ninhydrin (Edman degradation, etc.). Evidence of poly sugar, e.g. Chitisan, done by coupling with e.g. Dyes, degradation with chitobiose-chitobiase, detection as described (chelates, flocculants for metals).
Eine weitere Möglichkeit der Bestimmung des Komplexes, wie z.B. die weiter oben erläuterte Version mit DNA oder RNA wird mittels Atomic Force Mikroskopie (AFM)-Titration erreicht (vgl. Fig. 11). Hier werden die isolierten markierten Komplexe (eine Abtrennung ist auch über eine Immunfällung möglich) direkt aus den Trennsäulen, mittels Nanopipetten, usw. auf einen geeigneten Probenträger (Glas, Papier, Nylon, etc.) aufgebracht und zwar so, daß eine Reihe von Spots mit aufsteigender Konzentration entsteht, die nach Antrocknung (+-Fixierung mit z.B. Formalin, Kopplung mit Isothiocyanaten, Epoxy (-D3), NHS, usw.) mittels CCD-Kamera, Scintilationszähler, usw. und/oder mittels einer AFM-Nadel orthographisch vermessen und integriert werden können. Mit entsprechenden Standards kann dann eine direkte Konzentrationszugehörigkeit zur unbekannten Probe vorgenommen werden. Es ist damit möglich einige wenige Komplexe (Moleküle) direkt nachzuweisen und auf deren Konzentration in der ursprünglichen Probe (Blut, Serum, Plasma, etc.) zurückzurechnen.Another way of determining the complex, e.g. the version with DNA or RNA explained above is achieved by means of atomic force microscopy (AFM) titration (cf. FIG. 11). Here, the isolated, labeled complexes (separation is also possible by immunoprecipitation) are applied directly from the separation columns, using nanopipettes, etc. to a suitable sample holder (glass, paper, nylon, etc.) in such a way that a number of spots with increasing concentration arises, which after drying (+ fixation with e.g. formalin, coupling with isothiocyanates, epoxy (-D3), NHS, etc.) are measured orthographically using a CCD camera, scintillation counter, etc. and / or using an AFM needle and can be integrated. Appropriate standards can then be used to directly belong to the concentration of the unknown sample. It is thus possible to directly detect a few complexes (molecules) and to calculate their concentration in the original sample (blood, serum, plasma, etc.).
Nachfolgend wird noch ein Ausführungsbeispiel betreffend Collagenase, Gelatinase- Aktivitätsnachweis im Blut, Serum, etc. erläutert. Addiere die Proteasen (u.a. MMP-l^Collagenase, MMP-2=GelatinaseA, MMP-3 (Stromelysin 1) und MMP-9 (Gelatinase B)An exemplary embodiment relating to collagenase, gelatinase activity detection in blood, serum, etc. is explained below. Add the proteases (including MMP-1 ^ collagenase, MMP-2 = GelatinaseA, MMP-3 (Stromelysin 1) and MMP-9 (Gelatinase B)
1. zur Probe und Kontrolle, inkubiere für bestimmte Zeitintervalle und messe anschließend mit den beschriebenen Methoden die Konzentration der Cytokine, Interferone, etc. (γlFN, Interleukin-l(ß), IGF BPs, IGFI usw.)1. for testing and control, incubate for certain time intervals and then measure the concentration of cytokines, interferons, etc. (γlFN, interleukin-1 (ß), IGF BPs, IGFI etc.) using the methods described.
2. zur Probe oder Kontrolle mit Inhibitor oder Aktivator der Protenasen zur Vermessung der Wirkung der Inhibitoren oder Aktivatoren = zum Screenen von neuen Inhibitoren oder Aktivatoren = Therapie Kontrolle für diese Wirkstoffe zur Testung der Aktivität der Proteasen selbst und/oder zum Nachweis der Proteasen- Wirkung zum Nachweis der Cytokin- Wirkung, Nachweis der Wirkung auf die Zeil-Oberfläche und deren Rezeptoren (Befreiung von z.B. TNF-α und FasL (MMP-7)).2. for a sample or control with inhibitor or activator of the protenases for measuring the effect of the inhibitors or activators = for screening new inhibitors or activators = therapy control for these active substances for testing the activity of the proteases themselves and / or for demonstrating the protease activity for the detection of the cytokine effect, detection of the effect on the cell surface and its receptors (exemption from eg TNF-α and FasL (MMP-7)).
Es ist auch eine Kombination der verschiedenen Assays auf einer Mikrotiterplatte oder auf einem Biochip möglich. Weiterhin besteht die Möglichkeit der Bestimmung der verschiedenen Proteine, Peptide mittels monoklonalen Antikörpern gegen diese verschiedenen Moleküle, die an Glas, -Chip, Nylon, Gold, also irgendeinen geeigneten Träger gekoppelt sind. Diese Moleküle werden so aus den Proben (Blut, Seren, Plasmen, etc.) herausgefiltert. Zugabe von polyklonalen Antikörpern mit den Nachweismöglichkeiten oder Defection Devices DD, Waschen und Zugabe von Pep- tidasen, Proteasen, führt wiederum, wie beschrieben, zur Bestimmung der unbekannten Moleküle (vgl. Fig. 12).A combination of the different assays on a microtiter plate or on a biochip is also possible. There is also the possibility of determining the various proteins, peptides by means of monoclonal antibodies against these various molecules, which are coupled to glass, chip, nylon, gold, that is to say any suitable carrier. These molecules are filtered out of the samples (blood, sera, plasmas, etc.). Adding polyclonal antibodies with the detection options or Defection Devices DD, washing and adding peptidases, proteases, leads again, as described, to the determination of the unknown molecules (cf. FIG. 12).
Das Abtrennen und Zählen der Partikel-Nachweismöglichkeiten oder -Defection Devices DD ist auch über die Flow-Cytometrie möglich. Dies gilt allgemein für die bis hierher beschriebenen Methoden.The separation and counting of particle detection options or detection devices DD is also possible using flow cytometry. This generally applies to the methods described so far.
Die direkte Abtrennung von "defekten" Molekülen, ein Zuviel an Molekülen in den beschriebenen biologischen Systemen (Personen, Tieren, etc.), ist über angeschlossene Dialyse-Systeme oder entsprechende Bypass-Systeme (die z.B. direkt in den Blutkreislauf implantiert werden ) mit den beschriebenen Methoden möglich.The direct separation of "defective" molecules, too many molecules in the described biological systems (people, animals, etc.) can be done with the connected dialysis systems or corresponding bypass systems (which are, for example, implanted directly into the bloodstream) described methods possible.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele zum zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung betreffend Massenspektrometrie unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert.Exemplary embodiments of the second aspect of the present invention relating to mass spectrometry are explained in more detail below with reference to the drawing.
Die Fig. 13 zeigt den Aufbau eines herkömmlichen Massenspektrometers 1 mit einer Elektronenquelle 2, einem Beschleuniger 3, insbesondere mit negativem Potential, einem Magneten 4, einem Spalt 5 sowie einem Auffanggefäß 6. Weiterhin sind gezeigt eine Leitung 14 zu einer Vakuumpumpe (nicht gezeigt) und eine Zuführung 15 für eine Probe (nicht gezeigt).13 shows the structure of a conventional mass spectrometer 1 with an electron source 2, an accelerator 3, in particular with a negative potential, a magnet 4, a gap 5 and a collecting vessel 6. Furthermore, a line 14 to a vacuum pump (not shown) is shown and a feeder 15 for a sample (not shown).
Die Fig. 14 zeigt die Darstellung eines Massenspektrometers analog Figur 1 mit den erfindungsgemäßen Ausgestaltungen und Anordnungen: Ventil/Schalter 7, heizbarer Probenraum mit Ofen 8, (Luft, Gas-)CO-Quelle/Reservoir 9, Ventil 10 sowie Ventil 11 (Drei- Wege-Ventile).14 shows the representation of a mass spectrometer analogous to FIG. 1 with the configurations and arrangements according to the invention: valve / switch 7, heatable sample space with furnace 8, (air, gas) CO source / reservoir 9, valve 10 and valve 11 (three - directional valves).
Von besonderem Vorteil ist bei der vorliegenden Erfindung, dass ein herkömmliches Massenspektrometer mit den erfindungsgemäßen Merkmalen erweitert werden kann und damit einen optimalen Funktions- und Wirkungsumfang zum Einsatz für jegliche Messungen bietet. Bei einer solchen Ausführung ist die Elektronenquelle 2 entsprechend der schematischen Darstellung in der Fig. 14 mittels des Ventils/Schalters 7 abschaltbar und der beheizbare Probenraum mit Probe 8 und CO (Luft, Gas, Trägergas) -Quelle 9 mittels Ventilen (insbesondere Dreiwegeventilen) 10 und 11 an das Massenspektrometer 1 anschließbar. Ebenso sind Abgase (Luft, Atmosphäre, Autoabgase) über das Ventil 11 zuführbar. Der beheizbare Probenraum 8 ist mittels eines Verschlusses 12 zu öffnen und mit einem Probenträger/einer Probe 13 beladbar.It is particularly advantageous in the present invention that a conventional mass spectrometer can be expanded with the features according to the invention and thus offers an optimal range of functions and effects for use in any measurement. In such an embodiment, the electron source 2 can be switched off according to the schematic illustration in FIG. 14 by means of the valve / switch 7 and the heatable sample space with sample 8 and CO (air, gas, carrier gas) source 9 by means of valves (in particular three-way valves) 10 and 11 connectable to the mass spectrometer 1. Exhaust gases are also (Air, atmosphere, car exhaust gases) can be supplied via the valve 11. The heatable sample space 8 can be opened by means of a closure 12 and can be loaded with a sample carrier / sample 13.
Alternativ oder zusätzlich kann vorgesehen sein, dass der Probenraum 8 mit der Probe, wie z.B. Blut oder anderen metallhaltigen Fluiden unter Zuhilfenahme des Verschlusses 12 beladen werden kann. Weiter kann vorgesehen sein, dass die CO-Quelle 9 sowie der Probenraum 8 mit der Probe 13 über die Ventile 10 und 11 mit dem Massenspektrometer 1 verbunden werden. Die Probe wird im beheizbaren Probenraum aufgeheizt (z.B. auf 300°C), wobei sich flüchtige Metallcarbonyle bilden, die mittels Vakuumpumpe und Beschleuniger 3 durch den Magneten 4 sowie den Spalt 5 in das Auffanggefäß 6 gelangen, nachdem sie detektiert wurden. Abgase, wie z.B. Autoabgase, Luft, Atmosphäre, usw. werden über Ventil 11 direkt in das System eingeleitet und vermessen/detektiert.Alternatively or additionally, it can be provided that the sample space 8 with the sample, e.g. Blood or other metal-containing fluids can be loaded with the aid of the closure 12. It can further be provided that the CO source 9 and the sample space 8 are connected to the sample 13 via the valves 10 and 11 with the mass spectrometer 1. The sample is heated in the heatable sample room (e.g. to 300 ° C), whereby volatile metal carbonyls are formed which, by means of a vacuum pump and accelerator 3, pass through the magnet 4 and the gap 5 into the collecting vessel 6 after they have been detected. Exhaust gases, e.g. Car exhaust gases, air, atmosphere, etc. are introduced directly into the system via valve 11 and measured / detected.
Zur Eichung wird eine bekannte Menge an Me-Carbonyl, oder Me plus CO unter identischen Bedingungen eingegeben und vermessen, und zwar mit oder ohne die unbekannte Probe: Eichung: I) bekannte Menge Me-CarbonylFor the calibration, a known amount of Me carbonyl or Me plus CO is entered and measured under identical conditions, with or without the unknown sample: Calibration: I) known amount of Me carbonyl
II) bekannte Menge Me plus COII) Known amount of Me plus CO
Uf) unbekannte ProbeUf) unknown sample
IV) unbekannte Probe plus bekannte Menge an MeIV) unknown sample plus known amount of Me
Die Detektionsgrenze liegt vorzugsweise in der Nähe von 0,1 pmol/μl Probe.The detection limit is preferably in the vicinity of 0.1 pmol / μl sample.
Die Fig. 15 zeigt als Beispiel das Massenspektrogramm von Äthanol. Die Fig. 16 zeigt als Beispiel den angenommenen Massenpeak von Pt 2+.15 shows the mass spectrogram of ethanol as an example. 16 shows an example of the assumed mass peak of Pt 2+.
Analog zur Bildung und Vermessung von flüchtigen Metallcarbonylen können auch andere flüchtige Metallverbindungen in diesem beschriebenen System, nach Austausch der CO-Quelle gegen andere Gase/Trägergase, gebildet und vermessen/detektiert werden. So sind damit auch atmosphärische Gase, Metallverbindungen, -komplexe leicht detektierbar. Das heißt, kompakte Leichtbaugeräte können mittels meteorologischen Wettersonden (Radiosonden) und deren Auswertegeräten (Bodenstationen) für Zustands großen der Luft in Höhen bis z.B. 45 km eingesetzt werden und ein Zustandsbild der Atmosphäre liefern. Zusammen mit den Bodenmessungen ergibt sich so ein Gesamtzustand unserer Lufthülle mit Austausch. Der Einfluß der Metalle auf die Entstehung des O3 -Loches, sowie der Entstehung des Treibhauseffektes kann damit exakt vermessen und bestimmt werden. Schuld an diesen Effekten haben u.a. diese in die Atmosphäre geblasenen Metalle, was hiermit leicht und kostensparend nachgewiesen werden kann. Der Einsatz von ICP-MS-Geräten, welche sehr kostenintensiv und aufwendig sind, wird damit überflüssig.Analogous to the formation and measurement of volatile metal carbonyls, other volatile metal compounds can also be formed and measured / detected in this system after exchanging the CO source for other gases / carrier gases. This means that atmospheric gases, metal compounds and complexes can also be easily detected. This means that compact lightweight devices can be used with meteorological weather probes (radio probes) and their evaluation devices (ground stations) for large states of the air at heights of up to 45 km, for example, and provide a state image of the atmosphere. Together with the soil measurements, this results in an overall condition of our air envelope with exchange. The influence of the metals on the formation of the O3 hole and the development of the greenhouse effect can thus be measured and determined exactly. These effects are caused by these metals, which are blown into the atmosphere, which can be easily and cost-effectively proven can be. The use of ICP-MS devices, which are very cost-intensive and complex, is therefore superfluous.
Die Metalle können auch mittels enzymatischer Reaktion bestimmt werden. Dazu werden diese Metalle in entsprechende Enzymlösungen eingetragen, welche spezifisch mit diesen Metallen reagieren, d.h. aktiviert werden (z.B. Nickel aktivierte Horse radish Peroxidase, Me-Pro- teasen, Superoxiddismutase, Glutathione-Peroxidase, usw.). Die Bestimmung der entstehenden Peptide, Aminosäuren, etc., mittels z.B. PCR-Reaktion oder den Methoden die weiter oben beschrieben wurden, ergibt die Konzentration der Metalle. Auch die spezifische Inakti- vierung verschiedener Enzyme, durch diese Metalle kann zur Bestimmung der Metalle benutzt werden (und umgekehrt), es sind dies Proteasen, Peptidasen, Transferasen, usw.The metals can also be determined by means of an enzymatic reaction. For this purpose, these metals are introduced into corresponding enzyme solutions which react specifically with these metals, i.e. activated (e.g. nickel-activated horse radical peroxidase, Me proteases, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, etc.). The determination of the resulting peptides, amino acids, etc., using e.g. PCR reaction or the methods described above gives the concentration of the metals. The specific inactivation of various enzymes by these metals can also be used to determine the metals (and vice versa), these are proteases, peptidases, transferases, etc.
Durch Mutation und Rekombination können für einzelne Metalle spezifische Enzyme kombiniert und hergestellt werden, welche nur mit einem bestimmten Metall reagieren und damit zu deren Bestimmung geeignet sind. Sofern diese Enzyme einen Chromophor tragen, welcher sich dabei in seinen Eigenschaften ändert, kann die Konzentration des Moleküls hiermit direkt vermessen werden:By mutation and recombination, specific enzymes can be combined and produced for individual metals, which only react with a certain metal and are therefore suitable for their determination. If these enzymes carry a chromophore, which changes its properties, the concentration of the molecule can be measured directly:
Eine Mikrotiterplatte (z.B. ein Chip, etc.), die mit Glutathion, Metallothionin, Transferrin, Ferritin, Dextrin (oder einem anderen Chelatbildner, Fusionsprotein, etc.) bedeckt ist, bindet z.B. Nickel aus einer Probe (Flüßigkeit, Luft, u.a.) (1), eine rekombinante Horse radish Peroxidase wird aktiviert (2), und kann mittels Substraten, wie z.B. Polyhistidin und PCR (u.a.)-Detektion die Konzentration von Nickel in der Probe ergeben.A microtiter plate (e.g. a chip, etc.) covered with glutathione, metallothionine, transferrin, ferritin, dextrin (or another chelating agent, fusion protein, etc.) binds e.g. Nickel from a sample (liquid, air, etc.) (1), a recombinant horse radish peroxidase is activated (2) and can be removed using substrates such as e.g. Polyhistidine and PCR (among others) detection show the concentration of nickel in the sample.
Aeroallergene, wie Metallionen, können über B SA-Filter/Säulen angereichert werden und in/aus diesen Filtern/Säulen dann mit den beschriebenen Methoden detektiert werden.Aeroallergens, such as metal ions, can be enriched via B SA filters / columns and then detected in / from these filters / columns using the methods described.
Zur Bestimmung dieser Ionen kann dann auch ein Leitfähigkeitsfeststeller dienen, wie er nachfolgend im Zusammenhang mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung erläutert wird. Insbesondere werden dabei durch Me-Ionen definiert Redoxpotentiale in biol. Systemen, u.a., vermessen.A conductivity determiner can then also be used to determine these ions, as is explained below in connection with yet another aspect of the present invention. In particular, redox potentials in biol are defined by Me ions. Systems, among others.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele zum dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung betreffend Leitfähigkeitsmessung und Leitfähigkeitsfeststeller unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Die Erfindung im Rahmen dieses Aspektes besteht darin, eine Blutprobe in einem Meßtubus einzuführen, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist. Die Elektroden werden nach einem bestimmten Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator angesteuert. Mit dieser Methode ist es beispielsweise möglich, bestimmte Redox-Zustände zu messen, insgesamt ist es möglich, die individuelle Reaktion des Patienten auf bestimmte Zugabestoffe zu messen.Exemplary embodiments relating to the third aspect of the present invention relating to conductivity measurement and conductivity determiner are explained in more detail below with reference to the drawing. The invention in the context of this aspect consists in introducing a blood sample into a measuring tube which is surrounded by a plurality of electrodes. The electrodes are controlled crosswise according to a certain scheme with a frequency generator. With this method it is possible, for example, to measure certain redox conditions; overall, it is possible to measure the patient's individual reaction to certain additives.
Die Entwicklung dieser Redox-Meßzelle/-Leitfähigkeitsmeßzelle ermöglicht die äex vivo" (in vivo)- Vermessung des Potentials über einer (biol.) Probe, Blutprobe (Zelle(n), über Zellbestandteilen, Membranen - Mitochondrien, Bakterien (etc.), Zellkernen-Cytosol, Lösungen; Blut und dessen Bestandteilen/Serum, Plasma; etc., mit und ohne verschiedene Verbindungen, unter verschiedenen Behandlungen, Bedingungen.The development of this redox measuring cell / conductivity measuring cell enables the "ex vivo" (in vivo) measurement of the potential over a (biological) sample, blood sample (cell (s), over cell components, membranes - mitochondria, bacteria (etc.), Cell nucleus cytosol, solutions; blood and its components / serum, plasma; etc., with and without different compounds, under different treatments, conditions.
Die Fig. 17 zeigt ein Bespiel für den Aufbau einer Leitfähigkeitsmeßzelle 100 mit Elektroden 102, einer Öffnung 103, sowie Zuleitungen 104 für einen Frequenzgenerator 105 (Fig. 18).FIG. 17 shows an example for the construction of a conductivity measuring cell 100 with electrodes 102, an opening 103, and feed lines 104 for a frequency generator 105 (FIG. 18).
Die Leitfähigkeitsmeßzelle 100 wird in Kugelfönn (Fig. 17, Beispiel a)) ausgelegt, wobei eine Seite für die Addition verschiedener Substanzen, Zusatzstoffe, etc., offen ist. Das innere Gesamtvolumen der Leitfahigkeitsmeßzelle 100 beträgt vorzugsweise ca. 0,5 ml betragen. Geeignetes Elektrodenmaterial wäre z.B. Gold. Ein elektromagnetisches Drehfeld, insbesondere konstant zirkulierend und/oder oszilierend, wird mittels des Frequenzgenerators 105 (Fig. 18) erzeugt.The conductivity measuring cell 100 is designed in Kugelfönn (FIG. 17, example a)), one side being open for the addition of various substances, additives, etc. The total internal volume of the conductivity measuring cell 100 is preferably approximately 0.5 ml. Suitable electrode material would be e.g. Gold. An electromagnetic rotating field, in particular constantly circulating and / or oscillating, is generated by means of the frequency generator 105 (FIG. 18).
Alternativ ist die Leitfahigkeitsmeßzelle 100 in Durchlaufform (Fig. 17, Beispiel b)) ausgelegt, wobei die Leitfahigkeitsmeßzelle 100 für den Durchlauf von Flüssigkeiten (wie z.B: Blut) oben und unten offen ist. Öffnungen 103 und 107 sind mit einem Netz 106 und 108 versehen. Die Leitfahigkeitsmeßzelle 100 kann als Perfussionszelle benutzt werden.Alternatively, the conductivity measuring cell 100 is designed in a continuous form (FIG. 17, example b)), the conductivity measuring cell 100 being open at the top and bottom for the passage of liquids (such as, for example: blood). Openings 103 and 107 are provided with a network 106 and 108. The conductivity measuring cell 100 can be used as a perfusion cell.
Es werden vorzugsweise mindestens 2 Leitfähigkeitsmeßzellen 100 in Serie geschaltet, wobei mindestens eine Leitfahigkeitsmeßzelle 100 als Kontrolle fungiert. Ein Computer (PC) kontrolliert Spannung/Strom sowie den Widerstand und sorgt gleichzeitig für den Wechsel zwischen den Meßzellen innerhalb eines Experiments.At least two conductivity measuring cells 100 are preferably connected in series, at least one conductivity measuring cell 100 acting as a control. A computer (PC) controls voltage / current as well as the resistance and at the same time ensures the change between the measuring cells within an experiment.
Die Fig. 18 zeigt in einem groben Meßaufbau die Kopplung der Leitfahigkeitsmeßzelle 100 an den Frequenzgenerator 105 über die einzelnen Elektroden 102. Wobei die jeweils gegenüberliegenden Elektroden als Elektrodenpaare (plus und minus) an den Generator 105 angekoppelt sind. Insgesamt sind 4 solcher Elektrodenpaare vorhanden, die so an den Generator angeschlossen sind ( Ij bis L). Die Strom-/Spannungsermittlung erfolgt per PC 110, und aus diesen Ergebnissen wird die Impedanz R = UJ/IJ (Gleichstromwiderstand) ermittelt. Der Strom wird durch die Stromquelle (105) konstant gehalten (z.B. bei 1mA), so daß nur die Spannung vom PC aufgezeichnet werden muß. Es wird ein repräsentativer Kanal in die Messung aufgenommen (Ui). Der Frequenzgenerator 105 arbeitet als Stromquelle mit 4 Ausgangskanälen (IJ bis L) dessen Strom- bzw. Spannungs-Phasen jeweils um 90° verschoben sind (ij bis i4, mit Oi bis O4, 11) was zu einem Drehfeld führt, das zur Stabilisierung der Probe dient. Zur Verstärkung der Signale/der Spannung Ui wird vor den Computer 110 ein Verstärker 109 zum Abgriff der Spannung Uj am Frequenzgenerator 105 zwischengeschaltet. Mit bekannter Zell-/Partikelzahl in der Leitfahigkeitsmeßzelle 100 kann das Verhalten (Redox, usw.) einer einzelnen Spezies in der Meßzelle ausgemessen werden.18 shows in a rough measurement setup the coupling of the conductivity measuring cell 100 to the frequency generator 105 via the individual electrodes 102. The opposite electrodes are coupled as pairs of electrodes (plus and minus) to the generator 105. There are a total of 4 such electrode pairs, which are connected to the generator in this way (Ij to L). The current / voltage is determined by PC 110, and from this Results, the impedance R = U J / I J (DC resistance) is determined. The current is kept constant by the current source (105) (eg at 1mA), so that only the voltage has to be recorded by the PC. A representative channel is included in the measurement (Ui). The frequency generator 105 works as a current source with 4 output channels (I J to L) whose current or voltage phases are each shifted by 90 ° (ij to i 4 , with Oi to O 4 , 11), which leads to a rotating field that serves to stabilize the sample. To amplify the signals / the voltage Ui, an amplifier 109 for tapping the voltage Uj at the frequency generator 105 is interposed in front of the computer 110. The behavior (redox, etc.) of an individual species in the measuring cell can be measured with a known cell / particle number in the conductivity measuring cell 100.
Es kann die Vermessung verschiedener Redoxpotentiale (wie Fe2 Fe3+; Ascorbat; Glutathion, Aminosäuren, etc.) erfolgen und damit standartisiert werden für die Ausmessung der einzelnen (Zellen)Biosysteme u.a. auch von Prionen-Proteinen, in Abhängigkeit verschiedener Bedingungen (Bezug zu BSE, Kreutzfeld- Jakob), von Allergien, Asthma in Bezug zur Addition/Wirkung von Metallen, ROS.Various redox potentials (such as Fe 2 Fe 3+ ; ascorbate; glutathione, amino acids, etc.) can be measured and thus standardized for the measurement of the individual (cell) biosystems, including prion proteins, depending on various conditions (reference to BSE, Kreutzfeld-Jakob), from allergies, asthma in relation to the addition / effect of metals, ROS.
Die Erfindung ist anhand der Ausführungsbeispiele in der Beschreibung und in den Zeichnungen lediglich exemplarisch dargestellt und nicht darauf beschränlct, sondern umfaßt alle Variationen, Modifikationen, Substitutionen und Kombinationen, die der Fachmann den vorliegenden Unterlagen insbesondere im Rahmen der Ansprüche und der allgemeinen Darstellungen in der Einleitung dieser Beschreibung sowie der Beschreibung der Ausfuhrungsbeispiele und deren Darstellungen in der Zeichnung entnehmen und mit seinem fachmännischen Wissen sowie dem Stand der Technik insbesondere unter Einbeziehung der vollständigen Offenbarungsgehalte der am Anfang dieser Beschreibung angegebenen älteren Anmeldungen kombinieren kann. Insbesondere sind alle einzelnen Merkmale und Ausgestaltungsmöglichkeiten der Erfindung und ihrer Ausführungsbeispiele kombinierbar. The invention is shown by way of example in the description and in the drawings only by way of example and is not limited thereto, but rather includes all variations, modifications, substitutions and combinations which the person skilled in the art will understand in the introduction, in particular within the scope of the claims and the general representations this description and the description of the exemplary embodiments and their representations in the drawing and can combine with his specialist knowledge and the prior art, in particular including the full disclosure content of the older applications specified at the beginning of this description. In particular, all individual features and configuration options of the invention and its exemplary embodiments can be combined.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen, Massenspektrometrie für Metalle und LeitfähigkeitsfeststellungAnsprüche Methods for the determination of peptides / proteins, mass spectrometry for metals and conductivity determination
1. Verfahren zur Bestimmung von Peptiden/Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass Peptide/Proteine an deren C-Ende, N-Ende und/oder deren modifizierten Stellen sowie in ihrer Gesamtheit mit spezifischen Antikörpern vermessen werden, die derart markiert sind, dass eine spätere Vermessung möglich ist.1. A method for the determination of peptides / proteins, characterized in that peptides / proteins are measured at their C-end, N-end and / or their modified sites and in their entirety with specific antibodies which are labeled such that a later one Surveying is possible.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadruch gekennzeichnet, dass an den Antikörpern eine Nachweismöglichkeit (Defection Device) angekoppelt wird, die es erlaubt, über deren Konzentration die Menge der Antikörpermoleküle und damit die der unbekannten zu bestimmenden Molekülmenge qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.2. The method according to claim 1, characterized in that a detection device (detection device) is coupled to the antibodies, which allows the amount of the antibody molecules and thus the quantity of the unknown molecule to be determined qualitatively and / or quantitatively determined via their concentration.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweismöglichkeit (Defection Device) ausgelegt ist, die zu messende Konzentration so zu vervielfältigen oder amplifizieren.3. The method according to claim 2, characterized in that the detection device (Defection Device) is designed to duplicate or amplify the concentration to be measured.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweismöglichkeit (Defection Device) selbst sehr groß ausgelegt wird und insbesondere in kleinere vorzugsweise gleiche Teile so zerlegt werden kann, dass deren Konzentration als bekannt vorausgesetzt und/oder leicht gemessen werden kann.4. The method according to claim 3, characterized in that the detection possibility (Defection Device) itself is designed to be very large and in particular can be broken down into smaller, preferably identical, parts such that their concentration can be assumed to be known and / or easily measured.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nachweismöglichkeit (Defection Device) selbst so vervielfältigt oder amplifiziert werden kann, dass eine Vermessung leicht mit bekannten Methoden möglich ist.5. The method according to claim 3, characterized in that the detection possibility (Defection Device) itself can be reproduced or amplified so that a measurement is easily possible using known methods.
6. Massenspektrometer, dadurch gekennzeichnet, dass eine Trägergasquelle, insbesondere eine CO-Quelle, vorgesehen ist, um eine Probe mit Trägergas, entsprechend insbesondere CO, zu beschießen, oder dass ein Enzymlösungsbehälter mit/für eine Enzymlösung zur Reaktion mit wenigstens einem Metall vorgesehen ist. 6. mass spectrometer, characterized in that a carrier gas source, in particular a CO source, is provided in order to bombard a sample with carrier gas, corresponding in particular CO, or that an enzyme solution container is provided with / for an enzyme solution for reaction with at least one metal ,
7. Metallbestimmungsverfaliren, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe mit Trägergas, insbesondere CO, von einer Trägergasquelle, entsprechend insbesondere einer CO-Quelle, beschossen wird, oder dass eine Enzymlösung mit wenigstens einem Probenmetall reagiert.7. metal determination process, characterized in that a sample with carrier gas, in particular CO, is bombarded from a carrier gas source, correspondingly in particular a CO source, or that an enzyme solution reacts with at least one sample metal.
8. Leitfähigkeitsmessung, dadurch gekennzeichnet, dass eine Blutprobe in einen Meßtubus eingeführt wird, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist, und dass die Elektroden nach einem vorgegebenen Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator angesteuert werden.8. Conductivity measurement, characterized in that a blood sample is introduced into a measuring tube, which is surrounded by a plurality of electrodes, and that the electrodes are controlled crosswise according to a predetermined scheme with a frequency generator.
9. Leitfähigkeitsfeststeller, dadurch gekennzeichnet, dass für die Einfuhrung einer Blutprobe ein Meßtubus vorgesehen, der von einer Vielzahl von Elektroden umgeben ist, die nach einem vorgebbaren Schema kreuzweise mit einem Frequenzgenerator ansteuerbar sind. 9. conductivity detector, characterized in that a measuring tube is provided for the introduction of a blood sample, which is surrounded by a plurality of electrodes which can be controlled crosswise with a frequency generator according to a predefinable scheme.
PCT/DE2002/001966 2001-05-29 2002-05-28 Method for determining peptides or proteins, mass spectrometry for metals and determination of conductivity capacity WO2002097440A2 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002344245A AU2002344245A1 (en) 2001-05-29 2002-05-28 Method for determining peptides or proteins, mass spectrometry for metals and determination of conductivity capacity
EP02750770A EP1397687A2 (en) 2001-05-29 2002-05-28 Method for determining peptides or proteins, mass spectrometry for metals and determination of conductivity capacity

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10126696.0 2001-05-29
DE2001126697 DE10126697A1 (en) 2001-05-29 2001-05-29 Detecting peptides and proteins by reaction with labeled antibodies, useful e.g. for diagnosing allergies, and a mass spectrometer and conductivity meter for carrying out the test
DE10126695.2 2001-05-29
DE10126697.9 2001-05-29
DE10126696 2001-05-29
DE10126695 2001-05-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2002097440A2 true WO2002097440A2 (en) 2002-12-05
WO2002097440A3 WO2002097440A3 (en) 2003-11-06

Family

ID=27214451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2002/001966 WO2002097440A2 (en) 2001-05-29 2002-05-28 Method for determining peptides or proteins, mass spectrometry for metals and determination of conductivity capacity

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1397687A2 (en)
AU (1) AU2002344245A1 (en)
WO (1) WO2002097440A2 (en)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666865A (en) * 1984-01-13 1987-05-19 Centocor, Inc. Immunoassay for biologically active human interferon-gamma employing unique monoclonal antibodies
US4792521A (en) * 1985-08-15 1988-12-20 Immunomedics, Inc. Non-enzymatic immunohistochemical staining system and reagents
US5910418A (en) * 1993-03-19 1999-06-08 The Johns Hopkins University Antibodies and assay for detecting mutant APC proteins
DE19918141A1 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Diagnosing transmissible spongiform encephalopathy, particularly before appearance of clinical symptoms, by detecting specific markers in blood cells
WO2001004158A1 (en) * 1999-07-12 2001-01-18 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method for determining dna double-stranded breaks

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666865A (en) * 1984-01-13 1987-05-19 Centocor, Inc. Immunoassay for biologically active human interferon-gamma employing unique monoclonal antibodies
US4792521A (en) * 1985-08-15 1988-12-20 Immunomedics, Inc. Non-enzymatic immunohistochemical staining system and reagents
US5910418A (en) * 1993-03-19 1999-06-08 The Johns Hopkins University Antibodies and assay for detecting mutant APC proteins
DE19918141A1 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Diagnosing transmissible spongiform encephalopathy, particularly before appearance of clinical symptoms, by detecting specific markers in blood cells
WO2001004158A1 (en) * 1999-07-12 2001-01-18 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method for determining dna double-stranded breaks

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Bioanalytik" 1998 , LOTTSPEICH / SORBAS, SPEKTRUM LEHRBUCH , HEIDELBERG, BERLIN XP002229189 siehe insbesonders Seite 92 / Fig. 5.18 und die Erl{uterunge hierzu im Text Seite 89, letzter Absatz -Seite 93, letzter Absatz *
AKDIS A C ET AL: "Cytokine immunotrapping: an assay to study the kinetics of production and consumption or degradation of human interferon-gamma" JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V.,AMSTERDAM, NL, Bd. 182, Nr. 2, 9. Juni 1995 (1995-06-09), Seiten 251-261, XP004021173 ISSN: 0022-1759 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002097440A3 (en) 2003-11-06
AU2002344245A1 (en) 2002-12-09
EP1397687A2 (en) 2004-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yin et al. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry
Sutherland et al. Determination of Al, Cu, Fe, Mn, Pb and Zn in certified reference materials using the optimized BCR sequential extraction procedure
Huang et al. Comparison of ionic selectivity of batrachotoxin-activated channels with different tetrodotoxin dissociation constants.
Braasch et al. The changing dielectric properties of CHO cells can be used to determine early apoptotic events in a bioprocess
DE10112505C1 (en) Sensor arrangement and device for amperometric and / or potentiometric, pharmacological site and / or drug testing and method for amperometric and / or potentiometric, pharmacological site and / or drug testing
JP2002506200A (en) Biosensor array containing cell populations confined in micropores
EP2179053B1 (en) Determination of the activity of proteases
EP3081652B1 (en) Rapid testing of resistances by means of mass spectrometry
DE112018007705T5 (en) Magnetic bead nucleic acid aptamer multitarget molecule simultaneous detection method and kit
WO1997000969A1 (en) Process and device for determining the activity of enzymes in liquids, or the concentration and/or activity of inhibitors in liquids
DE69928250T2 (en) ANALYTICAL PROCEDURE USING MULTIPELVIRUS MARKING
Wu et al. Antibiotic resistance genes in Chishui River, a tributary of the Yangtze River, China: Occurrence, seasonal variation and its relationships with antibiotics, heavy metals and microbial communities
WO2002097440A2 (en) Method for determining peptides or proteins, mass spectrometry for metals and determination of conductivity capacity
WO2013026808A1 (en) Novel poc test system and method
DE102010060498B4 (en) Isolation and functional identification of whole cells
Berthold et al. Ultrastructural, biochemical, and cell-culture studies of a presumed extraskeletal Ewing's sarcoma with special reference to differential diagnosis from neuroblastoma
EP2959297B1 (en) New poc test system and method
DE10126697A1 (en) Detecting peptides and proteins by reaction with labeled antibodies, useful e.g. for diagnosing allergies, and a mass spectrometer and conductivity meter for carrying out the test
Mee et al. Monitoring of cyclosporine concentrations by using dry blood‐spot samples
EP3409783B1 (en) Invention relating to detection and quantification of colistin resistance in gram-positive bacteria
DE10244129A1 (en) Identifying active agent complexes that modify proton pump proteins, useful as pharmaceuticals, from their effect on the potential at an electrode that carries the protein
EP0787989A2 (en) Method for the preparation of a standardised plasma pool for diagnostic purposes
DE102004048391B4 (en) Type PepT1 protein assay
Spagnoli et al. New screening method for the rapid identification of blocked mutants and their products: Application to erythromycin and oleandomycin producing strains
DE19719001A1 (en) Immunoassay for detection of active insulin-like growth factor binding proteins

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002750770

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002750770

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2002750770

Country of ref document: EP