WO2002088752A2 - Methode de detection de composes activateurs ou inhibiteurs des recepteurs de la famille du recepteur de l'insuline - Google Patents

Methode de detection de composes activateurs ou inhibiteurs des recepteurs de la famille du recepteur de l'insuline Download PDF

Info

Publication number
WO2002088752A2
WO2002088752A2 PCT/FR2002/001471 FR0201471W WO02088752A2 WO 2002088752 A2 WO2002088752 A2 WO 2002088752A2 FR 0201471 W FR0201471 W FR 0201471W WO 02088752 A2 WO02088752 A2 WO 02088752A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
receptor
heterodimer
insulin
cdna
fluorescent
Prior art date
Application number
PCT/FR2002/001471
Other languages
English (en)
Other versions
WO2002088752A3 (fr
Inventor
Tarik Issad
Karine Pernet
Nicolas Boute
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs
Priority to AU2002302699A priority Critical patent/AU2002302699A1/en
Publication of WO2002088752A2 publication Critical patent/WO2002088752A2/fr
Publication of WO2002088752A3 publication Critical patent/WO2002088752A3/fr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the subject of the present invention is a method for detecting compounds activating or inhibiting heterotetrameric receptors consisting of two ⁇ heterodimers, the ⁇ subunit of which comprises a tyrosine kinase domain, such as the receptors belonging to the insulin receptor family .
  • Said method implements a chimeric molecule of the receptor of which one of the subunits comprises a bioluminescent element and the other subunit comprises a fluorescent element.
  • the interactions of activating or inhibiting compounds with said chimeric receptor induce conformational changes which allow a detectable transfer of energy between the subunit comprising the bioluminescent element and the subunit comprising the fluorescent element and which faithfully reflect the receiver activation state.
  • the heterotetramer is composed of two extracellular alpha subunits which bind insulin and two beta subunits which have tyrosine kinase activity.
  • the binding of insulin to its receptor leads to autophosphorylation of the receptor on tyrosine residues.
  • This tyrosine kinase activity is therefore essential for the transmission of the biological effects of insulin. In situations of insulin resistance, this tyrosine kinase activity is decreased. The cellular mechanisms responsible for this decrease in tyrosine kinase activity remain poorly understood.
  • the active site of the receptor is occupied by an inhibitory tyrosine, tyrosine 1162.
  • the binding of insulin causes a change in conformation of the receptor, which must allow this inhibiting tyrosine to leave the active site.
  • IRR insulin receptor relates receptor
  • IGF-1 receptor insulin-like growth factor-I receptor
  • IGF-1 receptor insulin-like growth factor-I receptor
  • IGF-1 receptor insulin-like growth factor-I receptor
  • the methods used to analyze the effect of these molecules on the insulin receptor or on the various members of this family of receptors imply a rather laborious treatment of the samples on which these tests are carried out, such as the need to measure the level of receptor phosphorylation by immunological techniques using antibodies capable of recognizing the active form of the receptor (anti-phosphotyrosine antibody). These techniques imply that the receptors are immobilized on a solid support. After treatment with the different molecules tested, the receptors must be incubated with different primary antibodies, undergo a certain number of washing cycles, then optionally be incubated again with secondary antibodies capable of revealing the quantity of primary antibody fixed on the receptor. . A new wash cycle must then be carried out. The activity of the receptor can also be determined by measuring its capacity to phosphorylate an artificial substrate. In all cases, the process used involves several steps and therefore requires a long and complex procedure.
  • the inventors have developed a new method for detecting conformational changes in the insulin receptor, which, unlike the methods previously used and mentioned above, makes it possible to directly detect the effect of the compounds to be analyzed on activation of heterotetrameric insulin family receptors.
  • the invention uses hybrid molecules, whether or not conserving the activity of the receptor tyrosine kinase domain, consisting of a chimeric protein of which one of the two alpha-beta heterodimers which constitute the receptor is associated with a bioluminescent element.
  • BRET bioluminescence resonance energy transfer
  • FRET reactive fluorescence energy transfer
  • FRET resonant fluorescence energy transfer
  • the emission spectrum of the donor must sufficiently cover the excitation spectrum of the acceptor.
  • the distance between the donor and the acceptor must be less than 100 ⁇ .
  • the donor fluorophore is excited with light at a wavelength within the excitation spectrum of the donor. If the two fluorophores are sufficiently close and correctly oriented, the transfer of energy from the donor to the acceptor results in the emission of fluorescence by the acceptor, which can be detected at another length.
  • Fluorophores can be chemical molecules grafted directly or indirectly on the purified proteins that we are studying, or mutants of GFP, such as CFP (cyan fluorescent protein, (Clontech)) and YFP (yellow fluorescent protein) , or other mutants which are also on the market such as dSRed (Clontech).
  • CFP cyan fluorescent protein, (Clontech)
  • YFP yellow fluorescent protein
  • the method of detection of activating and / or inhibiting compounds of the receptor tyrosine kinase activity implemented in the context of the present invention is therefore based on the study of interactions between two partner proteins, in this case the two heterodimers [ ⁇ BIOL] and [ ⁇ FLUO] of the insulin receptor participating in the tyrosine kinase domain thereof.
  • - receptor a heterotetrameric molecule comprising two ⁇ heterodimers linked by disulfide bridges and having a tyrosine kinase activity carried by the ⁇ subunits, as well as the variants of said molecules such as for example those comprising alternative splices.
  • chimeric receptor a molecule of a receptor of the insulin receptor family, including all its natural variants, such as those comprising alternative splices, mutations or polymorphisms as well as its artificial variants comprising mutations, deletions , truncations, etc. , whose heterotetrameric structure comprises two ⁇ heterodimers of which at least one ⁇ heterodimer is associated with a first response element and a second ⁇ heterodimer is associated with a second response element different from the first.
  • chimeric receptor is also understood to mean a receptor such as that described above devoid of its transmembrane domain.
  • the response elements can be fluorescent or luminescent elements and can be inserted at the ends but also at different places inside the coding sequence of these receptors, for example, in the juxtamembrane domain, upstream of the kinase domain, downstream of the kinase domain, in place of the kinase domain, etc.
  • - isolated receptor a receptor isolated from the cell in which it is expressed. This isolation is carried out by any means known to those skilled in the art, either by rupture of the cell, the receptor then remaining fixed on its cell membrane, or by extraction in a detergent medium, the receptor is then extracted from the cell membrane, or by partial purification after extraction, such as for example by affinity chromatography on a column of wheat germ lectin coupled to Sepharose, either by purification by affinity chromatography using an antibody specific for the receptor or by means of immobilized insulin.
  • - variant of a receptor its natural variants comprising alternative splicing, natural mutations or polymorphisms as well as its artificial variants obtained by mutations, deletions, truncations, etc.
  • - control receptor a chimeric receptor as defined above, the two ⁇ heterodimers of which are associated with the first response element.
  • bioluminescent element BIOL any protein or fragment thereof capable of emitting bioluminescent energy in the presence of an adequate substrate.
  • - fluorescent element FLUO Any molecule, such as biomolecules such as proteins or fragments thereof, or even chemical compounds, capable of emitting fluorescent energy when it is subjected to an excitation at a wavelength adequate. It has been found that after having put these chimeric receptors in contact with their ligand, insulin, and after having added a specific substrate which activates the bioluminescent element, an energy transfer then takes place between the element activated bioluminescent and the fluorescent element which in turn emits a detectable signal, proving that a rimpedement of the two molecules was effectively induced by the conformational change subsequent to the activation of the receptor.
  • the inventors have demonstrated that the use of isolated chimeric receptors leads to better detection of compounds capable of modifying the tyrosine kinase activity of said receptors, compared to the use of living cells expressing the chimeric receptors on their membranes.
  • This isolation can be carried out, for example, by simple extraction of the receptors from the cells, using a detergent.
  • Semi-purified receptors can be obtained by affinity chromatography of the extracted receptors, on a wheat germ lectin column coupled to Sepharose (Sepharose — LGB) or by any means of purification of receptors known to man of the art. job.
  • the preparation of chimeric receptors [ ⁇ .FLOL] - [ ⁇ .FLU ⁇ ] or [ ⁇ .FLUO] - [ ⁇ .FLUO] isolated, purified or semi-purified according to the invention allows their long-term preservation, for example by freezing or by lyophilization and makes it possible to constitute large stocks of said chimeric receptors.
  • the isolated, purified or semi-purified chimeric receptors obtained in the context of the present invention also have the advantage of being able to be solubilized, they can therefore be used to coat any solid support such as microspheres, particles of organic polymers or metallic particles, natural or artificial membranes and thus used in the detection method of the invention and in particular, they can be easily distributed in plates of 96 to 384 wells and therefore are particularly suitable for carrying out screenings high throughput of molecules of interest.
  • the isolated, purified or semi-purified chimeric receptors are brought into contact with the various molecules to be tested.
  • the detection of the approximation or of a change in conformation of the two ⁇ heterodimer resulting from the possible interaction of said molecule to be tested with the receptor or part of the receptor is carried out by measuring the response of the second response element to a signal emitted by the first response element when activated.
  • the activation state of the receptor is measured in a few minutes in a luminometer / fluorimeter.
  • This test therefore lends itself perfectly to automation and makes it possible to screen, with a very high flow, molecules, mixtures of molecules or biological extracts, to search for agents stimulating or inhibiting the activity of the receptor having a tyrosine kinase activity on the receptor, as well as activating or inhibiting molecules derived from the expression of a library 'CDNA.
  • the detection method according to the invention also has the advantage that the ratio of the emitted energies measured at two different wavelengths and used to detect an active compound is independent of the quantity of isolated receptor involved during the production of the method.
  • the inventors were able to verify this invariability during their experimental work. It is due to the fact that the detected signal comes from an intramolecular energy transfer.
  • This characteristic is particularly interesting for the development of large-scale automated tests because the variations in the quantity of isolated chimeric receptor involved do not affect the final ratio of the energies measured.
  • the subject of the invention is a method for detecting molecules capable of modifying the tyrosine kinase activity of a receptor, characterized in that it comprises the following steps
  • the method of the invention based on the approximation of the two response elements makes it possible to detect not only the approximation but also a change in conformation of the two heterodimers ⁇ .
  • the method according to the invention comprises the following steps: a) bringing a molecule to be analyzed into contact with a receptor or part of receptor comprising a first ⁇ heterodimer associated with a first bioluminescent or fluorescent element and a second ⁇ heterodimer associated with a second fluorescent element different from the first, b) detecting the approximation or a change in conformation of the two ⁇ heterodimers resulting from the possible interaction of said molecule with the receptor or part of receptor by measuring the fluorescence emitted by the second fluorescent element in response to a signal emitted by the first response element when activated.
  • the method of the invention comprises the following steps: a) bringing a molecule to be analyzed into contact with a receptor or part of a receptor comprising a first heterodimer ⁇ associated with a bioluminescent element and a second ⁇ heterodimer associated with a fluorescent element, b) detecting the approximation or a change in conformation of the two ⁇ heterodimers resulting from the possible interaction of said molecule with the receptor or part of the receptor by measuring the fluorescence emitted by l fluorescent element in response to a signal emitted by the bioluminescent element when activated.
  • the detection of the approximation or of a change in conformation of the two ⁇ heterodimers, when the first ⁇ heterodimer is associated with a bioluminescent response element, is measured by bringing the receptor into contact with a substrate of said step. bioluminescent element.
  • the method of the invention comprises the following stages: a) bringing a molecule to be analyzed into contact with a receptor or part of receptor comprising a first heterodimer ⁇ associated with a first fluorescent element and a second ⁇ heterodimer associated with a second fluorescent element different from the first, b) detecting the approximation or a change in conformation of the two ⁇ heterodimers resulting from the possible interaction of said molecule with the receptor or part of the receptor by measuring the fluorescence emitted by the second fluorescent element in response to a signal emitted by the first fluorescent element when it is activated.
  • the detection of the approximation or of a change in conformation of the two heterodimers ⁇ , when each of them is associated with a fluorescent response element is measured by exposing in step (b) the receptor to a light source specific for the first fluorescent element.
  • the first and / or the second ⁇ heterodimer of the chimeric receptor is / (are) deleted (s) from the tyrosine kinase domain or from part or all of the domain intracellular and / or transmembrane of the receptor.
  • the first and / or the second ⁇ heterodimer comprise a tyrosine kinase domain.
  • the method according to the invention may include a step of comparing the measurement obtained in step (b) with that obtained by carrying out the said method under at least one of the following conditions:
  • the bioluminescent response element used in the method of the invention is luciferase or a bioluminescent fragment thereof.
  • the fluorescent element used in the method of the invention is chosen from fluorescent proteins or fluorescent chemical compounds.
  • the fluorescent protein is chosen from the group comprising green fluorescent protein (GFP) and its variants such as yellow fluorescent protein (EYFP), blue fluorescent protein (EBFP), cyano fluorescent protein (ECFP) or other fluorescent proteins such as Ds Red or fragments thereof.
  • GFP green fluorescent protein
  • EYFP yellow fluorescent protein
  • EBFP blue fluorescent protein
  • ECFP cyano fluorescent protein
  • Ds Red or fragments thereof.
  • the fluorescent chemical compound used in the method of the invention is chosen from Europium, allophycocyanin, etc.
  • the molecule capable of modifying the tyrosine kinase activity of the receptor detectable by the method of the invention is an activator of said receptor.
  • the molecule capable of modifying the tyrosine kinase activity of the receptor detectable by the method of the invention is an inhibitor of said receptor.
  • the molecule capable of modifying the tyrosine kinase activity of the receptor is a ligand, an agonist or an antagonist of said receptor.
  • the molecules to be analyzed are present in a natural biological medium and are brought into contact with the isolated chimeric receptor, in said natural medium.
  • the molecules to be analyzed are derived from the expression of a cDNA library.
  • the detection of the fluorescence emitted during step (c) of the method according to the invention is carried out by means of a luminometer / fluorimeter.
  • the method according to the invention uses a receptor having a tyrosine kinase domain chosen from the insulin receptor, the IGF-1 receptor, the IRR receptor or variants thereof.
  • Another subject of the invention is a receptor comprising two ⁇ heterodimers, one of the two ⁇ heterodimers of which is associated with a bioluminescent element or a first fluorescent element and the other ⁇ heterodimer of which is associated with a second fluorescent element different from the first.
  • the ⁇ heterodimer of the receptor of the invention is chosen from an ⁇ heterodimer of the insulin receptor, of the IGF-1 receptor or of the IRR receptor.
  • bioluminescent element and / or the fluorescent element associated with one or other of the ⁇ heterodimer of the receptor of the invention are proteins or fragments thereof.
  • the association between the heterodimer ⁇ and the bioluminescent element of the receptor of the invention is obtained by the fusion of the cDNA coding for said heterodimer ⁇ and the cDNA coding for the bioluminescent protein or a bioluminescent fragment of it.
  • the cDNA coding for said ⁇ heterodimer in the fusion protein is chosen from cDNA coding for an ⁇ heterodimer of the insulin receptor, of the receptor
  • IGF-1 or IRR receptor IGF-1 or IRR receptor.
  • the ⁇ heterodimer associated with the fluorescent element is obtained by the fusion of the cDNA coding for said ⁇ heterodimer and the cDNA coding for a fluorescent protein or a fluorescent fragment thereof.
  • the bioluminescent element associated with the first heterodimer ⁇ of the receptor according to the invention is the luciferase of
  • Renilla and the fluorescent element associated with the second ⁇ heterodimer of the receptor according to the invention is the
  • the fluorescent element is associated with one or the other or both ⁇ heterodimers of the receptor of the invention by covalent or non-covalent bonds.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising an isolated chimeric receptor comprising ⁇ heterodimers associated with response elements as defined above.
  • the subject of the invention is also a cDNA comprising the cDNA coding for an ⁇ heterodimer or a fragment thereof of a receptor of the insulin receptor family and a cDNA coding for a bioluminescent element.
  • the ⁇ heterodimer or a fragment thereof from a receptor of the insulin receptor family above is chosen from the cDNA coding for the ⁇ heterodimer of the insulin receptor, the cDNA coding for the ⁇ heterodimer of the IFG-1 receptor or the cDNA coding for the ⁇ heterodimer of the IRR receptor.
  • the invention relates to a cDNA comprising the cDNA coding for the ⁇ heterodimer or a fragment thereof of a receptor of the insulin receptor family and the cDNA coding for the Lucillaase from Renilla identified by SEQ ID No. 1 in the attached sequence list.
  • the invention also relates to an expression vector characterized in that it comprises a cDNA such as that defined above.
  • the invention relates to the expression vector identified by SEQ ID No. 2 in the annexed sequence list.
  • the subject of the invention is also a fusion protein obtained by expression in a cell of a cDNA as defined above.
  • the invention relates to the fusion protein obtained by expression in a cell of a cDNA comprising the cDNA coding for the insulin receptor and the cDNA coding for Renilla Luciferase identified by the sequence SEQ ID No. 3 in the attached sequence list.
  • the invention also relates to a cDNA comprising the cDNA coding for an ⁇ heterodimer or a fragment thereof of a receptor of the insulin receptor family and a cDNA coding for a fluorescent element.
  • the cDNA coding for an ⁇ heterodimer or a fragment thereof of a receptor of the above insulin receptor family is chosen from the cDNA coding for the ⁇ heterodimer of the receptor insulin, the cDNA coding for the ⁇ heterodimer of the IFG-1 receptor or the cDNA coding for the ⁇ heterodimer of the IRR receptor.
  • the invention relates to a cDNA comprising the cDNA coding for an ⁇ heterodimer or a fragment thereof from a receptor of the insulin receptor family and a cDNA coding for the yellow fluorescent protein (EYFP) identified by SEQ ID No. 4 in the annexed sequence list.
  • EYFP yellow fluorescent protein
  • the subject of the invention is also a vector for expression of a fusion protein by transfection into a cell comprising a cDNA as defined above.
  • the invention relates to the expression vector identified by SEQ ID No. 5 in the annexed sequence list.
  • the invention also relates to a fusion protein obtained by expression in a cell of a cDNA as defined above.
  • the subject of the invention is the fusion protein obtained by expression in a cell of a cDNA comprising the cDNA coding for the insulin receptor and the cDNA coding for yellow fluorescent protein (EYFP) identified by the sequence SEQ ID N ° 6 in the attached sequence list.
  • EYFP yellow fluorescent protein
  • the invention also relates to a cell genetically modified by transfection either with a first expression vector comprising the sequence of a cDNA comprising a cDNA coding for an ⁇ heterodimer or a fragment thereof of a receptor of the family of insulin receptors and a cDNA coding for a first response element either with a second expression vector comprising the sequence of a cDNA comprising the cDNA coding for an ⁇ heterodimer or a fragment thereof of a receptor of the insulin receptor family and a cDNA coding for a fluorescent element either with these two expression vectors.
  • the cell according to the invention is chosen from Chinese Hamster Ovary cells (CHO: Chinese Hamster Ovary cells), HEK 293 cells (Human Embryonic Kidney Cells - Human Embryonic Kidney Cells) or HeLa Human Cells.
  • CHO Chinese Hamster Ovary cells
  • HEK 293 cells Human Embryonic Kidney Cells - Human Embryonic Kidney Cells
  • HeLa Human Cells Chinese Hamster Ovary cells
  • the invention finally relates to the use of the above detection method for high-throughput screening of molecules useful for the prevention and / or treatment of pathologies linked to failures of the action of insulin on its target tissues or partial or total insulin secretion failures.
  • the invention also relates to the use of the above method for the detection of molecules useful for the prevention and / or treatment of a pathology chosen from diabetes, obesity, pathologies linked to resistance to insulin.
  • Yet another object of the invention relates to an activator of a receptor capable of binding to the receptor of the invention and of bringing about the approximation or a change of conformation of its ⁇ heterodimers.
  • the invention also relates to the use of an activator of a receptor capable of binding to the receptor of the invention and of bringing about the bringing together or a change in conformation of its two heterodimers ⁇ for the preparation of a medicament intended for the treatment or prevention of diabetes.
  • the invention also relates to an inhibitor of a receptor capable of binding to the receptor of the invention and to bring about the bringing together or a change of conformation of its two heterodimers ⁇ .
  • Another subject of the invention relates to the use of a molecule capable of binding to the receptor of the invention and of bringing about the bringing together or a change of conformation of its two heterodimers ⁇ for the preparation of a medicament intended for treatment or prevention of human or animal pathology.
  • the invention also relates to the use of a molecule capable of binding to the isolated chimeric receptor of the invention and of bringing about the bringing together or a change of conformation of its two heterodimers ⁇ for the preparation of a medicament intended for cancer treatment.
  • the invention also relates to the use of a molecule capable of binding to the chimeric receptor of the invention and of bringing about the bringing together or a change of conformation of its two heterodimers ⁇ for the preparation of a medicament intended for tissue regeneration .
  • the subject of the invention is also the use of a molecule capable of binding to the chimeric receptor of the invention and of bringing about the bringing together or a change of conformation of its two heterodimers ⁇ for the preparation of growth factors for culture. cellular.
  • the invention also relates to a solid support on which is fixed a chimeric receptor according to the invention.
  • the receptor is fixed to said solid support by covalent or non-covalent bonds.
  • the solid support according to the invention is chosen from the group of supports comprising inorganic supports such as metal, glass, silicon and organic supports based on polymers or co-polymers such as polystyrene, polyethylene, polycarbonate, polyacrylamide, nylon or latex.
  • inorganic supports such as metal, glass, silicon and organic supports based on polymers or co-polymers such as polystyrene, polyethylene, polycarbonate, polyacrylamide, nylon or latex.
  • the solid support according to the invention is chosen from the group of supports in the form of particles including colloidal particles, strips, microplates, tubes.
  • the solid support of the invention is in a lyophilized form.
  • the solid support of the invention is in frozen form.
  • the invention relates to a kit for the detection of activators or inhibitors of receptors of the insulin receptor family comprising at least one solid support as defined above, optionally the substrate of a bioluminescent element, and instructions for use.
  • FIG. 1 shows that the chimeric insulin receptors are assembled correctly in HEK-293 cells transfected with fused cDNAs.
  • FIG. 1A illustrates the principle of the detection of conformational changes induced by insulin in the insulin receptor molecule using the BRET methodology.
  • FIG. 1B shows that the transfection of cDNA coding for EYPF in HEK-293 cells produces a fluorescent signal uniformly distributed in the cell, on the other hand, the transfection of cDNA coding for IR-EYFP or the co-transfection of CDNA encoding IR-Rluc and IR-EYPF leads to the localization of fluorescence in the plasma membrane.
  • FIG. 1C shows the self-phosphorylation on the tyrosines of the chimeric receptor detected by immunoblot using an anti-phosphotyrosine antibody (4G10).
  • the immunoblot is performed chimeric receptors from HEK cells co-transfected with cDNA encoding IR-Rluc alone, IR-EYPF alone or both simultaneously. The cells are incubated for 5 minutes in the presence of 100 nM insulin. The cells were extracted and the chimeric receptors were partially purified on LGB Sepharose.
  • Figure 2 illustrates the effect of insulin on the BRET signal.
  • Figure 2A shows the basal signal and the insulin-induced signal measured either on intact cells or on partially purified chimeric receptors as described in the "Materials and Methods" section. The results are expressed as the mean ⁇ wk of six experiments.
  • Figure 3 shows the effect of insulin on autophosphorylation and the BRET signal on partially purified chimeric receptors.
  • Figure 3A shows that
  • FIG. 3B shows the effect of insulin on autophosphorylation of the chimeric receptor by densitometric analysis. The results represent the mean ⁇ wk of 7 experiments.
  • FIG. 3C shows the BRET signals obtained when partially purified chimeric insulin receptors were preincubated for 45 minutes in the absence or in the presence of 100 nM insulin and then incubated for 2 minutes in the absence or in the presence of 100 ⁇ M ATP. The BRET signal was measured as described in the "Materials and Methods" section. The results correspond to the mean ⁇ wk of 3 experiments.
  • FIG. 4A and 4B illustrate the dose-response effect of insulin, IGF1 and EGF on partially purified chimeric receptors.
  • FIG. 4A shows the BRET signals obtained when partially purified chimeric receptors were incubated for 45 minutes in the presence of increasing doses of insulin, IGF1 or EGF.
  • the BRET signal was measured as described in the "Materials and Methods" section. The results are expressed as the mean ⁇ wk of three to nine experiments.
  • FIG. 4B shows the autophosphorylation of the partially purified chimeric receptors which is carried out as described in the section "Materials and methods" in the presence of increasing doses of insulin, IGF1 or EGF.
  • FIG. 5A shows the BRET signals obtained when partially purified chimeric receptors are incubated for 45 minutes in the presence of 100 nM insulin, one ng / ⁇ l of monoclonal antibody 83-14 or both.
  • the BRET signal is measured as described in the "Materials and Methods" section. The results are expressed as the mean ⁇ wk of seven to nine experiments. * P ⁇ 0.05 when the signal obtained is compared with the signal induced by insulin alone. (Student test).
  • FIG. 5B illustrates the autophosphorylation of the partially purified chimeric receptors carried out as described in the section "Materials and methods" in the presence of 100 nM of insulin, of an ng / ⁇ l of monoclonal antibody 83-14 or of both.
  • FIG. 5C shows the BRET signals obtained when partially purified chimeric receptors are incubated for 45 minutes in the presence of insulin (100 nM), the AK766 antibody (200 ng / ⁇ l) or both.
  • the BRET signals were measured as described in the section "Materials and methods. The results represent the mean ⁇ wk of three experiments. * P ⁇ 0.05 when compared to the signal induced by insulin alone (Student Test )
  • FIG. 5D shows the autophosphorylation of the partially purified chimeric receptors is carried out as described in the section "Materials and methods" in the presence of insulin (100 nM), of antibodies AK766 (200 ⁇ g / 1) or of both.
  • FIG. 6A and 6B show the plasmids used to obtain the fusion proteins IR-EYFP and IR-Luc.
  • - Figure 7 illustrates the displacement of the binding of radioactive insulin mono-iodine ([ 125 I] iodotyrosyl A 14 ) by non-radioactive insulin on transfected cells, expressing the different chimeric receptors: - the receptor of 1 normal human insulin
  • constructs are transfected together or separately in eukaryotic cells (HEK 293 cells for example) so as to produce hybrid molecules made up of a chimeric protein alpha-beta-luciferase associated with a chimeric protein alpha-beta-EYFP. After 48 hours of expression in HEK-293 cells, the cellular proteins are extracted.
  • Insulin receptors are isolated from transfected cells, and optionally purified using standard affinity chromatography techniques on wheat germ lectin (Sepharose LGB) columns. The receptor is eluted in a buffer containing N-acetylglucosamine. This solution containing the partially purified receptor is aliquoted and frozen. Aliquots stored at -80 ° C and can be thawed and used to test the effect of insulin and different molecules on changes in the conformation of the insulin receptor.
  • the cDNA coding for the complete insulin receptor sequence corresponding to the sequence identified under the number SEQ ID No. 1 in the list of sequences in the appendix without its stop codon has been subcloned in phase, either with the yellow variant of GFP (EYFP, Clontech), to obtain the coding sequence identified in the appendix under the number SEQ ID No. 2 or with the gene for Renilla Luciferase (Promega) to obtain the coding sequence identified under the number SEQ ID No. 3 in the sequence list in the appendix, in an expression vector pCDNA3 (Invitrogen).
  • Yellow Fluorescent Protein is identified in the appendix under the number SEQ ID N ° 4.
  • Lucillaase from Renilla is identified in the appendix under the number SEQ ID N ° 5.
  • BRET bioluminescence resonance energy transfer
  • the chimeric receptors are partially purified by chromatography on lectin of wheat germ coupled with Sepharose as described previously (Tavaré, JM and Denton, RM Studies on the autophosphorylation of the insulin receptor from human placenta. Analysis of the sites phosphorylated by two dimensional peptide mapping, Biochem, J. 252, 607-615 (1988)).
  • the cell extracts are centrifuged at 4 ° C for 5 min at 1000g to remove any insoluble debris.
  • the soluble cell extract (7.5 ml) is incubated with 2.5 ml of sepharose beads coupled with wheat germ lectin (LGB) for 2 h at 4 ° C. on a spinning wheel.
  • the mixture is then transferred to a column (2 cm in diameter) and washed with 100 ml of column washing buffer (identical to the extraction buffer but containing only 0.1% Triton X-100).
  • the glycoproteins are retained on the column while the non-glycosylated cellular proteins are eliminated during the washing.
  • the glycoproteins are then eluted from the column with 15 ml of elution buffer (identical to the washing buffer, but containing 0.3 M of
  • the eluate is collected in 15 fractions of 1 ml.
  • the presence of chimeric receptors in each of these fractions is quickly estimated by a direct measurement of BRET on 50 ⁇ l of eluate.
  • the three fractions containing the highest BRET signal activity are then combined and frozen at -80 ° C in the form of 50 ⁇ l aliquots for later use.
  • the protein concentration in partially purified receptor preparations is measured by a Bradford test.
  • the measurement of the BRET signal is carried out using 4.5 ⁇ l of eluate obtained from Wheat Germ lectin chromatography coupled with Sepharose (Sepharose-LGB) (containing approximately 2 ⁇ g of protein) preincubated in 96 microplates. well for 45 minutes at 20 ° C in a total volume of 60 ⁇ l containing 30 mM MOPS, 1 mM sodium tetravanadate and different concentrations of ligands.
  • Cf] / emission at 485 nm
  • Cf corresponds to the quotient (emission at 530 nm / emission at 485 nm) for the fusion protein Rluc alone under the same experimental conditions.
  • this corresponds to the emission obtained with the partially purified chimeric receptor from HEK-293 cells transfected with IR-Rluc alone.
  • the results are expressed in milliBRET Units (mBU), one mBRET unit corresponding to the BRET ratio multiplied by 1000.
  • mBU milliBRET Units
  • the insulin receptor coding sequence (SEQ ID No. 1) was merged with either that of Renilla Luciferase (SEQ ID No. 2) or that of EYFP (SEQ ID N ° 3).
  • 11.2 - Insulin stimulates the resonant transfer of bioluminescence energy between beta-IR-Rluc and beta-IR-EYFP in vitro.
  • IR-EYFP show that insulin has little effect on the BRET signal, which is barely higher than the basal level (Figure 2a).
  • the BASE BRET signal measured on partially purified chimeric receptor is two to three times lower than that of intact cells. A significant effect of insulin on the BRET signal is observed on partially purified chimeric receptors.
  • Figure 2a shows that the BRET approach can be used for in vitro monitoring of conformational changes of the insulin receptor, induced by insulin.
  • IR-Rluc and IR-EYFP Co-transfection with IR-Rluc and IR-EYFP can theoretically lead to the expression of three populations of chimeric receptors: [ ⁇ Rluc] 2, [ ⁇ EYFP] 2 and hybrid molecules [ ⁇ Rluc] - [ ⁇ EYFP]. Consequently, a BRET signal can in theory come from an intramolecular energy transfer inside the same molecule [ ⁇ Rluc] - [ ⁇ EYFP] or from an intermolecular mechanism between two chimeric receptors, for example, between [ ⁇ Rluc] 2 and [ ⁇ EYFP] 2.
  • FIG. 4A The effect of increasing insulin concentrations on the BRET signal is shown in Figure 4A.
  • the maximum effect is observed at a dose of 15 nM of insulin.
  • the half-maximal effect (EC50) is observed at a dose of 15 nM of insulin.
  • IGF1 also shows a dose-dependent BRET signal with an EC50 of about 200 nM. EGF has no effect on the BRET signal.
  • this antibody also fully activates the insulin receptors of an insulin resistant patient which cannot be activated by insulin as a consequence of a mutation which prevents the binding of insulin. (Krook A, Soos MA, Kumar S, Siddle K, O'Rahilly S (1996) Functional activation of mutant human insulin receptor by monoclonal antibody. Lancet 347: 1586-1590).
  • the combined incubation of the chimeric receptor according to the invention with insulin and with the antibody 83-14 also leads to a BRET signal which is higher than the maximum effect obtained with insulin alone.
  • the binding properties of the chimeric receptors were compared by displacement of the binding of radioactive mono-iodine insulin ([ 125 I] iodotyrosyl A 14 ) by non-radioactive insulin.
  • HEK-293 cells were transfected with cDNA encoding the normal human insulin receptor [IR] (#), cDNA encoding the insulin receptor fused to luciferase [IR-Rluc] ( #), the cDNA coding for the insulin receptor fused to the yellow fluorescent protein [IR-EYFP] ( ⁇ ), or co-transfected with both the cDNA coding for the insulin receptor fused to luciferase and cDNA coding for the insulin receptor fused to the yellow fluorescent protein [IR-Rluc] - [IR-EYFP] (O).
  • the receptors were partially purified by affinity chromatography on LGB as described above, then incubated overnight at 4 ° C. in the presence of radioactive insulin labeled with iodine 125 and increasing amounts. non-radioactive insulin.
  • the receptor-insulin complex [ 125 I] is precipitated with Polyethylene Glycol, and the radioactivity associated with the receptor is measured in a gamma counter.
  • the displacement curves of radioactive insulin binding by cold insulin indicate that the insulin binding properties are very similar for the different types of receptors.
  • the fusion of the beta subunit of the human insulin receptor with Rluc or EYFP does not modify the binding properties of insulin by the alpha subunit of this receptor.
  • This method based on the resonant transfer of bioluminescence energy, allows the monitoring of conformational changes of said receptor.
  • the BRET signal detected in this test faithfully reflects the activation stage of the receptor, and therefore it can be used to study the stimulatory or inhibitory effects of molecules on the activity of said receptor.
  • This method constitutes an adequate tool for the search for molecules having therapeutic properties with respect to pathologies linked to a decrease in the action of ligands of the receptor on its target tissues.
  • these may be pathologies linked to insulin resistance or to a decrease or even the absence of pancreatic secretion of insulin.

Abstract

La présente invention a pour objet une méthode de détection de composés activateurs ou inhibiteurs de récepteurs de la famille du récepteur de l'insuline au moyen d'un récepteur chimère isolé, comprenant un premier hétérodimère αβ, associé à un premier élément de réponse et un second hétérodimère αβ associé à un second élément de réponse différent du premier, ledit premier élément de réponse étant capable d'agir sur le second élément de réponse lorsque ceux-ci sont rapprochés. L'invention a également pour objet un tel récepteur chimère isolé, les compositions le contenant, ainsi que des ADNc de fusion, des vecteurs d'expression comprenant lesdits ADNc et des cellules génétiquement modifiées par transfection avec lesdits vecteurs d'expression pour exprimer ledit récepteur chimère dans une cellule. L'invention concerne aussi l'utilisation des composés activateurs ou inhibiteurs de récepteurs de la famille du récepteur de l'insuline capables de se lier audit récepteur chimère isolé pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou la prévention de pathologies humaines et/ou animales ou d'un médicament destiné à la régénération tissulaire ou encore pour la préparation de facteurs de croissance pour la culture cellulaire.

Description

METHODE DE DETECTION DE COMPOSES ACTIVATEURS OU INHIBITEURS DES RECEPTEURS DE LA FAMILLE DU RECEPTEUR DE L'INSULINE AU MOYEN D'UN RECEPTEUR CHIMERE ISOLE.
La présente invention a pour objet une méthode de détection de composés activateurs ou inhibiteurs de récepteurs hétérotétramériques constitués de deux hétérodimères αβ, dont la sous-unité β comporte un domaine tyrosine kinase, tels que les récepteurs appartenant à la famille de récepteurs de l'insuline.
Ladite méthode met en œuvre une molécule chimère du récepteur dont l'une des sous-unités comporte un élément bioluminescent et l'autre sous-unité comporte un élément fluorescent. Les interactions des composés activateurs ou inhibiteurs avec ledit récepteur chimère induisent des changements conformationnels qui permettent un transfert d'énergie détectable, entre la sous-unité comportant l'élément bioluminescent et la sous-unité comportant l'élément fluorescent et qui reflètent fidèlement l'état d'activation du récepteur.
Dans le cas du récepteur de l'insuline l'hétérotétramère est composé de deux sous-unités alpha extracellulaires qui lient l'insuline et de deux sous- unités béta qui possèdent une activité tyrosine kinase. La liaison de l'insuline à son récepteur entraîne 1 ' autophosphorylation du récepteur sur des résidus tyrosines.
Cette activité tyrosine kinase est ainsi indispensable à la transmission des effets biologiques de l'insuline. Dans les situations de résistance à l'insuline, cette activité tyrosine kinase est diminuée. Les mécanismes cellulaires responsables de cette diminution d'activité tyrosine kinase restent mal compris.
A l'état basai, le site actif du récepteur est occupé par une tyrosine inhibitrice, la tyrosine 1162. La liaison de l'insuline entraîne un changement de conformation du récepteur, qui doit permettre de faire sortir du site actif cette tyrosine inhibitrice. Il y a alors liaison de 1 'ATP et transphosphorylation d'une sous-unité béta par l'autre sous-unité béta, ce qui stabilise l'activité tyrosine kinase du récepteur, qui peut alors phosphoryler d'autres protéines intracellulaires et transmettre ainsi les effets de 1 ' hormone.
La liaison de l'insuline à son récepteur induit 1 ' auto-phosphorylation du récepteur sur des résidus tyrosine et de ce fait stimule son activité tyrosine kinase envers les substrats intracellulaires, tels qu'IRSl et Shc, qui jouent un rôle essentiel dans la transmission du signal. (White MF, Kahn CR (1994) The insulin signaling System. J. Biol. Chem. 269: 1-4) ; White MF (1997) The insulin signalling System and the 1RS proteins. Diabetologia: S2-17. Virkamaki A, Ueki K, Kahn CR (1999) Protein-protein interaction in insulin signaling and the molecular mechanisms of insulin résistance. J Clin Invest 103: 931-943.).
Des altérations dans la phosphorylation de la tyrosine du récepteur de l'insuline ont été décrites dans les situations de résistance à l'insuline, telles que le diabète et l'obésité (Combettes-Souverain M, Issad T (1998) Molecular basis of insulin action. Diabètes Metab 24: 477-489.)
Il est connu que la phosphorylation des tyrosines 1158, 1162 et 1163 localisées dans le domaine kinase du récepteur de l'insuline jouent un rôle critique dans la régulation de l'activité kinase du récepteur (Ellis L, Clauser E, Morgan DO, Edery M, Roth RA, Rutter WJ (1986) Replacement of insulin receptor tyrosine residues 1162 and 1163 compromises insulin-stimulated kinase activity and uptake of 2-deoxyglucose. Cell 45: 721-732. ; White MF, Shoelson SE, Keutmann H, Kahn CR (1988) A cascade of tyrosine autophosphorylation in the beta-subunit activâtes the phosphotransferase of the insulin receptor. J Biol Chem 263: 2969-2980). La détermination de la structure cristalline du domaine tyrosine kinase du récepteur de l'insuline humain a fourni une meilleure compréhension du mécanisme moléculaire impliqué dans la stimulation de l'activité kinase dudit récepteur. Au stade non-phosphorylé, la Tyr- 1162 est localisée dans le site actif de l'enzyme et joue un rôle auto-inhibiteur en concurrençant la liaison avec les protéines substrats. (Hubbard SR, Wei L, Elus L, Hendrickson WA (1994) Crystal structure of the tyrosine kinase domain of the human insulin receptor. Nature 372: 746-754) .
A l'état basai cette tyrosine demeure sous forme non-phosphorylée, du fait que d'autres résidus de la boucle d'activation empêchent également la liaison à l'ATP. La cristallisation de la forme tri-phosphorylée du domaine kinase a montré que 1 ' auto-phosphorylation de ces trois tyrosines conduit à un changement de conformation important de la boucle d'activation. (Hubbard SR (1997) Crystal structure of the activated insulin receptor tyrosine kinase in complex with peptide substrate and ATP analog. Embo J 16: 5572-5581). Ce changement de conformation permet l'accès, sans restriction, de l'ATP et des substrats protéiques au site actif. Il a été considéré que les changements conformationnels induits par la liaison du ligand rapprochent étroitement les deux sous-unités béta du domaine kinase du récepteur et permettent par conséquent la trans-phosphorylation de la tyrosine 1162 et des tyrosines adjacentes dans la boucle d'activation.
La découverte d'agents pharmacologiques qui stimulent spécifiquement l'activité tyrosine-kinase du récepteur de l'insuline peut être d'une grande importance dans le traitement de patients résistants à l'insuline. Actuellement, les industries pharmaceutiques développent un nombre très important de molécules qui pourraient avoir des effets bénéfiques sur l'activité fonctionnelle des récepteurs ayant une strucuture hétérotetramérique transmembranaire et présentant une activité tyrosine kinase comme ceux de l'insuline.
Les industries pharmaceutiques développent également des inhibiteurs de l'activité du récepteur de l'IGF-1 qui joue un rôle important dans des nombreux cancers (Gri berg A. et al. J.Cell.Physiol. 2000 vol. 183 pages 1-9; Khandwaia HM et al. Endocr.Rev. 2000 vol 21, pages 215-244 ; Brodt, P. et al. Biochem.Pharmacol . 2000 vol 15, pages 1101-1107).
Il est également intéressant d'étudier l'activité de récepteurs tel que l'IRR (insulin receptor relates receptor) dont la structure moléculaire est très proche de celle du récepteur de l'insuline et présente un domaine tyrosine kinase. (Berthold H.J, et al. Horm. Metab.Research 1999 Feb-Mar; vol. 31 pages 477-79). A ce jour, on ne connaît pas de ligands de ce récepteur considéré de ce fait comme un récepteur orphelin (OR).
Cependant on sait que le récepteur IRR est impliqué dans la régulation de la masse cellulaire de cellules béta pancréatiques (Hirayama, I. et al. Diabètes 1999 Jun; vol. 48 (6) pages 1237-12444) et qu'il est également impliqué dans le développement de certaines tumeurs, tels que les neuroblastomes (Emlimger M.W. et al. Regul Pept. 1999 Octobre 22, Vol.84 (1-3) pages 37- 42.
Des méthodes permettant étudier l'activité de ce récepteur orphelin IRR et d'analyser ses ligands éventuels doivent permettre d'élucider ses mécanismes d'activation. Egalement, d'un point de vue pharmacologique il est important de pouvoir détecter des composés susceptibles de modifier l'activité dudit récepteur IRR et de les utiliser pour la préparation de médicaments utiles pour le traitement de pathologies pancréatiques ou tumorales .
D'autre part, des méthodes permettant d'étudier l'activité du récepteur IGF-1 (insulin-like growth factor-I receptor) qui possède également une structure moléculaire proche de celle du récepteur de l'insuline et comporte un domaine tyrosine kinase, peuvent être mis en œuvre pour la détection de molécules ayant une activité de facteur de croissance utiles pour les cultures cellulaires, ou pour la préparation de médicaments pour le traitement de tissus lésés.
Cependant, les méthodes utilisées pour analyser l'effet de ces molécules sur le récepteur de l'insuline ou sur les différents membres de cette famille de récepteurs, impliquent un traitement assez laborieux des échantillons sur lesquels ces tests sont réalisés, tels que la nécessité de mesurer le niveau de phosphorylation des récepteurs par des techniques immunologiques à l'aide d'anticorps capables de reconnaître la forme active du récepteur, (anticorps anti-phosphotyrosine) . Ces techniques impliquent que les récepteurs soient immobilisés sur un support solide. Après traitement avec les différentes molécules testées, les récepteurs doivent être incubés avec différents anticorps primaires , subir un certain nombre de cycles de lavages, puis éventuellement être à nouveau incubés avec des anticorps secondaires capables de révéler la quantité d'anticorps primaire fixé sur le récepteur. Un nouveau cycle de lavages doit alors être réalisé. L'activité du récepteur peut également être déterminée en mesurant sa capacité à phosphoryler un substrat artificiel. Dans tous les cas, le procédé utilisé implique plusieurs étapes et nécessite donc une procédure longue et complexe.
Afin de résoudre ces problèmes, les inventeurs ont développé une nouvelle méthode de détection des changements conformationnels du récepteur de l'insuline, qui, contrairement aux méthodes précédemment utilisées et mentionnées ci-dessus, permet de détecter directement l'effet des composés à analyser sur l'activation des récepteurs hétérotétramériques de la famille de l'insuline.
Ainsi l'invention met en œuvre des molécules hybrides, conservant ou non l'activité du domaine tyrosine kinase du récepteur, constituées d'une protéine chimère dont l'un des deux hétérodimères alpha-béta qui constituent le récepteur est associé à un élément bioluminescent ou fluorescent et l'autre hétérodimère alpha-béta est associé à un élément fluorescent, ci-après désignées [αβ.BlOL]-[αβ.FLUO] ou [αβ.FLUO]-[αβ.FLUO, puis a étudier le changement conformationnel induit sur lesdites molécules hybrides par des composés activateurs ou inhibiteurs de l'activité tyrosine kinase du récepteur en utilisant soit une technique de transfert résonant d'énergie bioluminescente (Bioluminescence résonance energy transfer (BRET), soit une technique de transfert résonant d'énergie fluorescente (FRET)
La technique de transfert résonant d'énergie de bioluminescence (Bioluminescence résonance energy transfer (BRET)) a récemment été décrite comme une méthodologie qui permet l'étude des interactions protéine-protéine (Xu Y, Piston DW, Johnson CH (1999) A bioluminescence résonance energy transfer (BRET) System: application to interacting circadian clock proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 151-156. ; Angers S, Salahpour A, Joly E, et al. (2000) Détection of beta 2-adrenergic receptor dimerization in living cells using bioluminescence résonance energy transfer (BRET). Proc Natl Acad Sci U S A 97: 3684-3689.) et qui a fait l'objet d'une demande de brevet internationale PCT N° WO 99/66324. La bioluminescence BRET est un phénomène naturel qui résulte du transfert d'énergie entre une protéine donneur luminescente et une protéine réceptrice fluorescente. La dépendance stricte dudit phénomène de la proximité moléculaire entre les donneurs et les accepteurs d'énergie en font un système de choix pour l'étude des changements dans l'interaction entre deux protéines.
Le FRET (transfert résonant d'énergie de fluorescence) correspond à un transfert non-radiatif d'énergie entre deux fluorophores . Il dépend des spectres d'émission et d'excitation du donneur et de l'accepteur : pour qu'un transfert d'énergie ait lieu, il faut que le spectre d'émission du donneur recouvre suffisamment le spectre d'excitation de l'accepteur. Il faut en outre que la distance entre le donneur et l'accepteur soit inférieure à 100 Â. Le fluorophore donneur est excité avec de la lumière à une longueur d'onde située dans le spectre d'excitation du donneur. Si les deux fluorophores sont suffisamment proches et correctement orientés, le transfert d'énergie du donneur vers l'accepteur entraîne l'émission de fluorescence par l'accepteur, que l'on pourra détecter à une autre longueur. Les fluorophores peuvent être des molécules chimiques greffées directement ou indirectement sur les protéines purifiées que l'on étudie, ou alors des mutants de la GFP, telles que la CFP (cyan fluorescent protein, (Clontech)) et la YFP (yellow fluorescent protein), ou d'autres mutants qui sont également sur le marché tel que la dSRed (Clontech) .
La méthode de détection de composés activateurs et/ou inhibiteurs de l'activité tyrosine kinase du récepteur mise en œuvre dans le cadre de la présente invention est donc basée sur l'étude des interactions entre deux protéines partenaires, en l'occurrence les deux hétérodimères [αβBIOL] et [αβFLUO] du récepteur de l'insuline participant au domaine tyrosine kinase de celui-ci.
Définitions
Dans le cadre de la présente invention on entend par :
- récepteur : une molécule hétérotétramérique comportant deux hétérodimères αβ liés par des ponts disulfure et ayant une activité tyrosine kinase portée par les sous-unités β, ainsi que les variantes desdites molécules comme par exemple celles comportant des epissages alternatifs.
récepteur chimère: une molécule d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline, y compris tous ses variantes naturelles, telles que celles comportant des epissages alternatifs, des mutations ou des polymorphismes ainsi que ses variantes artificielles comportant des mutations, des délétions, troncations, etc . , dont la structure hétérotétramérique comporte deux hétérodimères αβ dont au moins un hétérodimère αβest associé à un premier élément de réponse et un second hétérodimère αβ estassocié à un second élément de réponse différent du premier.
On entend également par récepteur chimère un récepteur tel que celui décrit ci-dessus dépourvu de son domaine transmembranaire .
élément de réponse : Toute molécule susceptible d'effectuer un transfert d'énergie lorsqu'elle est activée.
Les éléments de réponse peuvent être des éléments fluorescents ou luminescents et peuvent être insérés aux extrémités mais également à différents endroits à l'intérieur de la séquence codante de ces récepteurs, par exemple, dans le domaine juxta- membranaire, en amont du domaine kinase, en aval du domine kinase, à la place du domaine kinase, etc.
- récepteur isolé: un récepteur isolé de la cellule dans laquelle il est exprimé. Cet isolement est effectué par tout moyen connu de l'homme du métier, soit par rupture de la cellule, le récepteur restant alors fixé sur sa membrane cellulaire, soit par extraction en milieu détergent, le récepteur est alors extrait de la membrane cellulaire, soit par purification partielle après extraction, comme par exemple par chromatographie d'affinité sur une colonne de Lectine de germe de blé couplée à de la Sépharose, soit par purification par chromatographie d'affinité au moyen d'un anticorps spécifique du récepteur ou au moyen de l'insuline immobilisée.
- variante d'un récepteur : ses variants naturels comportant des epissage alternatifs, des mutations naturelles ou des polymorphismes ainsi que ses variants artificiels obtenues par des mutations, délétions, troncations, etc.
- récepteur témoin : un récepteur chimère comme défini ci-dessus, dont les deux hétérodimères αβ sont associés au premier élément de réponse.
élément bioluminescent BIOL : toute protéine ou fragment de celle-ci capable d'émettre une énergie bioluminescente en présence d'un substrat adéquat .
- élément fluorescent FLUO : Toute molécule, telle que des biomolécules comme des protéines ou des fragments de celles-ci, ou encore des composés chimiques, susceptibles d'émettre une énergie fluorescente lorsqu'elle est soumise à une excitation à une longueur d'onde adéquate . Il a été constaté, qu'après avoir mis en contact ces récepteurs chimères avec leur ligand, l'insuline, et après y avoir ajouté un substrat spécifique qui active l'élément bioluminescent, un transfert d'énergie se produit alors entre l'élément bioluminescent activé et l'élément fluorescent lequel émet à son tour un signal détectable, prouvant qu'un rapprochement des deux molécules a été effectivement induit par le changement conformationnel subséquent à l'activation du récepteur.
Les mesures du signal fluorescent émis permettent ainsi de suivre in vitro les changements conformationnels des récepteurs chimères [αβ.BIOL]-
[αβ.FLUO] ou [αβ.FLUO]-[αβ.FLUO]
Il apparaît que la méthode selon l'invention permet de mesurer très rapidement l'effet d'une molécule sur l'état d'activation du récepteur.
De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que l'utilisation de récepteurs chimères isolés conduit à une meilleure détection de composés susceptibles de modifier l'activité tyrosine kinase desdits récepteurs, par rapport à l'utilisation de cellules vivantes exprimant les récepteurs chimères sur leurs membranes.
Cet isolement peut être effectué, par exemple, par simple extraction des récepteurs à partir des cellules, au moyen d'un détergent. Des récepteurs semi-purifiés peuvent être obtenus par chromatographie d'affinité des récepteurs extraits, sur une colonne de lectine de germe de blé couplée à de la Sépharose (Sepharose—LGB) ou par tout moyen de purification de récepteurs connu de l'homme du métier. La préparation de récepteurs chimères [αβ.BlOL]-[αβ.FLUθ] ou [αβ.FLUO]-[αβ.FLUO] isolés , purifiés ou semi-purifiés selon l'invention autorise leur conservation à long terme, par exemple par congélation ou par lyophilisation et permet de constituer des stocks importants desdits récepteurs chimères.
Les récepteurs chimères isolés, purifiés ou semi-purifiés obtenus dans le cadre de la présente invention, présentent aussi l'avantage de pouvoir être solubilisés, ils peuvent donc être utilisés pour revêtir tout support solide tel que des microsphères, des particules de polymères organiques ou des particules métalliques, des membranes naturelles ou artificielles et utilisés ainsi dans la méthode de détection de l'invention et en particulier, ils peuvent être aisément distribués dans des plaques de 96 à 384 puits et de ce fait sont particulièrement adaptés pour la réalisation de criblages à haut débit de molécules d'intérêt.
Les récepteurs chimères isolés, purifiés ou semi-purifiés sont mis en présence des différentes molécules à tester. La détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimère αβ résultant de l'interaction éventuelle de ladite molécule à tester avec le récepteur ou partie de récepteur est effectuée par mesure de la réponse du second élément de réponse à un signal émis par le premier élément de réponse lorsqu'il est activé.
Après un temps de préincubation nécessaire pour que l'interaction entre la molécule d'intérêt et le récepteur se fasse, l'état d'activation du récepteur est mesuré en quelques minutes dans un luminomètre /fluorimètre .
Ce test se prête donc parfaitement à une automatisation et permet de cribler, avec un très haut débit, des molécules, mélanges de molécules ou extraits biologiques, pour rechercher des agents stimulateurs ou inhibiteurs de 1 ' activité du récepteur ayant une activité tyrosine kinase su récepteur, ainsi que des molécules activatrices ou inhibitrices issues de l'expression d'une banque d'ADNc .
La méthode de détection selon l'invention présente en outre l'avantage que le rapport des énergies émises mesurées à deux longueurs d'onde différents et servant à détecter un composé actif est indépendant de la quantité de récepteur isolé mis en jeu lors de la réalisation de la méthode.
En effet, les inventeurs ont pu vérifier cette invariabilité lors de ses travaux expérimentaux. Elle est due au fait que le signal détecté est issu d'un transfert d'énergie intramoléculaire.
Cette caractéristique est particulièrement intéressante pour le développement de tests automatisés à grande échelle car les variations de la quantité de récepteur chimère isolé mise en jeu n'ont pas d'incidence sur le rapport final des énergies mesurées.
Plus précisément l'invention a pour objet une méthode de détection de molécules susceptibles de modifier l'activité tyrosine kinase d'un récepteur, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes
a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur purifié comprenant un premier hétérodimère αβ associé à un premier élément de réponse et un second hétérodimère αβ associé à un second élément de réponse différent du premier, ledit premier élément de réponse étant capable d'agir sur le second élément de réponse lorsque ceux-ci sont rapprochés, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères αβ résultant de l'interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la réponse du second élément de réponse à un signal émis par le premier élément de réponse lorsqu'il est activé. Ainsi, la méthode de l'invention fondée sur le rapprochement des deux éléments de réponses permet de détecter non seulement le rapprochement mais aussi un changement de conformation des deux hétérodimères αβ .
Avantageusement, la méthode selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère αβ associé à un premier élément bioluminescent ou fluorescent et un second hétérodimère αβ associé à un second élément fluorescent différent du premier, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères αβ résultant de l'interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par le second élément fluorescent en réponse à un signal émis par le premier élément de réponse lorsqu'il est activé.
Selon un première mise en œuvre particulière, la méthode de 1 ' invention comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère αβ associé à un élément bioluminescent et un second hétérodimère αβ associée à un élément fluorescent, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères αβ résultant de l'interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par l'élément fluorescent en réponse à un signal émis par l'élément bioluminescent lorsqu'il est activé . Avantageusement la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères αβ, lorsque le premier hétérodimère αβ est associé à un élément de réponse bioluminescent, est mesurée en mettant en contact à l'étape (b) le récepteur avec un substrat dudit élément bioluminescent.
Selon une deuxième mise en oeuvre particulière, la méthode de l'invention comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère αβ associée à un premier élément fluorescent et un second hétérodimère αβ associée à un second élément fluorescent différent du premier, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères αβ résultant de l'interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par le second élément fluorescent en réponse à un signal émis par le premier élément fluorescent lorsqu'il est activé.
Avantageusement, la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères αβ, lorsque chacun d'entre eux est associé à un élément de réponse fluorescent, est mesurée en exposant à l'étape (b) le récepteur à une source lumineuse spécifique du premier élément fluorescent.
Selon un mode particulier de réalisation de la méthode selon l'invention, le premier et /ou le second hétérodimère αβ du récepteur chimère est/(sont) délétée(s) du domaine tyrosine kinase ou d'une partie ou de la totalité du domaine intracellulaire et/ou transmembranaire du récepteur. Selon une autre mode particulier de réalisation de la méthode selon l'invention, le premier et/ou le second hétérodimère αβ comprennent un domaine tyrosine kinase.
La méthode selon l'invention peut comporter une étape de comparaison de la mesure obtenue à l'étape (b) avec celle obtenue en réalisant la dite méthode dans l'une au moins des conditions suivantes:
- en l'absence de la molécule à tester,
- avec une molécule témoin, en présence ou en absence de la molécule à tester,
- avec un excipient, en présence ou en absence de la molécule à tester,
- avec un récepteur témoin à la place du récepteur ou partie de récepteur isolé.
Avantageusement, l'élément de réponse bioluminescent mis en œuvre dans la méthode de l'invention est la luciférase ou un fragment bioluminescent de celle-ci.
Avantageusement, l'élément fluorescent mis en œuvre dans la méthode de l'invention est choisi parmi des protéines fluorescentes ou des composé chimiques fluorescents.
De préférence, la protéine fluorescente est choisie parmi dans le groupe comprenant la Protéine verte fluorescente (GFP) et ses variantes comme la Protéine jaune fluorescente (EYFP), la Protéine Bleue fluorescente (EBFP), la Protéine cyano fluorescente (ECFP) ou d'autres protéines fluorescentes telle la Ds Red ou des fragments de celles-ci.
De manière préférentielle, le composé chimique fluorescent mis en œuvre dans la méthode de l'invention est choisi parmi l'Europium, l'allophycocyanine, etc.
Avantageusement la molécule susceptible de modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur détectable par la méthode de l'invention est un activateur dudit récepteur.
Avantageusement la molécule susceptible de modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur détectable par la méthode de l'invention est un inhibiteur dudit récepteur.
Avantageusement la molécule susceptible de modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur est un ligand, un agoniste ou un antagoniste dudit récepteur.
Selon une mise en œuvre particulière de la méthode de l'invention, les molécules à analyser sont présentes dans un milieu biologique naturel et sont mises en contact avec le récepteur chimérique isolé, dans ledit milieu naturel.
Selon un mode de réalisation préférée de la méthode de l'invention, les molécules à analyser sont issues de l'expression d'une banque d'ADNc.
Avantageusement, la détection de la fluorescence émise lors de l'étape (c) de la méthode selon l'invention est effectuée au moyen d'un luminomètre/fluorimètre .
De manière tout à fait préférentielle, la méthode selon l'invention met en œuvre un récepteur ayant un domaine tyrosine kinase choisi parmi le récepteur de l'insuline, le récepteur IGF-1, le récepteur IRR ou des variantes de ceux-ci. L'invention a également pour objet un récepteur comportant deux hétérodimères αβ, dont l'un des deux hétérodimères αβ est associé à un élément bioluminescent ou un premier élément fluorescent et l'autre hétérodimère αβ est associé à un second élément fluorescent différent du premier.
Avantageusement 1 ' hétérodimère αβ du récepteur de l'invention est choisi parmi un hétérodimère αβ du récepteur de l'insuline, du récepteur IGF-1 ou du récepteur IRR.
Avantageusement, l'élément bioluminescent et/ou l'élément fluorescent associés à l'un ou l'autre des hétérodimère αβ du récepteur de l'invention sont des protéines ou des fragments de celles-ci.
De manière préférentielle, l'association entre 1 ' hétérodimère αβ et l'élément bioluminescent du récepteur de l'invention est obtenue par la fusion de l'ADNc codant pour ledit hétérodimère αβ et l'ADNc codant pour la protéine bioluminescente ou un fragment bioluminescent de celle-ci.
De manière tout à fait préférentielle, l'ADNc codant pour ledit hétérodimère αβ dans la protéine de fusion, est choisi parmi l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ du récepteur de l'insuline, du récepteur
IGF-1 ou du récepteur IRR.
De manière tout à fait préférentielle 1' hétérodimère αβ associé à l'élément fluorescent est obtenu par la fusion de l'ADNc codant pour ledit hétérodimère αβ et l'ADNc codant pour une protéine fluorescente ou un fragment fluorescent de celle-ci. Selon un mode de mise en œuvre particulier, l'élément bioluminescent associé au premier hétérodimère αβ du récepteur selon l'invention est la luciférase de
Renilla et l'élément fluorescent associé au second hétérodimère αβ du récepteur selon l'invention est la
Protéine Fluorescente Jaune.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'élément fluorescent est associé à l'un ou l'autre ou les deux hétérodimères αβ du récepteur de l'invention par des liaisons covalentes ou non covalentes.
L'invention concerne également une composition comprenant un récepteur chimère isolé comportant des hétérodimères αβ associés à des éléments de réponse comme défini ci dessus.
L'invention a également pour objet un ADNc comprenant l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour un élément bioluminescent.
De préférence l'ADNc codant pour
1 'hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline ci- dessus est choisi parmi l'ADNc codant pour 1 ' hétérodimère αβ du récepteur de l'insuline, l'ADNc codant pour 1' hétérodimère αβ du récepteur IFG-1 ou l'ADNc codant pour 1 ' hétérodimère αβ du récepteur IRR.
Tout préférentiellement l'invention concerne un ADNc comprenant l'ADNc codant pour l' hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et l'ADNc codant pour la Luciférase de Renilla identifié par la SEQ ID N° 1 dans la liste de séquences en annexe.
L'invention concerne aussi un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comporte un ADNc tel que celui défini précédemment.
Tout préférentiellement l'invention a pour objet le vecteur d'expression identifié par la SEQ ID N° 2 dans la liste de séquences en annexe.
L'invention a également pour objet une protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc tel que défini précédemment.
Plus particulièrement l'invention concerne la protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc comprenant l'ADNc codant pour le récepteur de l'insuline et l'ADNc codant pour la Luciférase de Renilla identifiée par la séquence SEQ ID N° 3 dans la liste de séquences en annexe.
L'invention concerne également un ADNc comprenant l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour un élément fluorescent.
De préférence l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline ci-dessus est choisi parmi l'ADNc codant pour l' hétérodimère αβ du récepteur de l'insuline, l'ADNc codant pour 1' hétérodimère αβ du récepteur IFG-1 ou l'ADNc codant pour 1 ' hétérodimère αβ du récepteur IRR.
Tout préférentiellement l'invention concerne un ADNc comprenant l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour la protéine fluorescente jaune (EYFP) identifié par la SEQ ID N° 4 dans la liste de séquences en annexe.
L'invention a aussi pour objet un vecteur d'expression d'une protéine de fusion par transfection dans une cellule comportant un ADNc tel que défini ci- dessus.
Tout préférentiellement l'invention a pour objet le vecteur d'expression identifié par la SEQ ID N° 5 dans la liste de séquences en annexe.
L'invention concerne également une protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc tel que défini ci-dessus.
Plus particulièrement l'invention a pour objet la protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc comprenant l'ADNc codant pour le récepteur de l'insuline et l'ADNc codant pour protéine fluorescente jaune (EYFP) identifiée par la séquence SEQ ID N° 6 dans la liste de séquences en annexe.
L'invention concerne aussi une cellule génétiquement modifiée par transfection soit avec un premier vecteur d'expression comportant la séquence d'un ADN c comprenant un ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour un premier élément de réponse soit avec un second vecteur d'expression comportant la séquence d'un ADNc comprenant l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour un élément fluorescent soit avec ces deux vecteurs d'expression. De préférence, la cellule selon la l'invention est choisie parmi des cellules ovariennes de Hamster Chinois (CHO : Chinese Hamster Ovary cells), des cellules HEK 293 (Human Embryonic Kidney Cells — Cellules embryonnaires Humaines de Rein ) ou des Cellules humaines HeLa.
L'invention se rapporte enfin à l'utilisation de la méthode de détection ci-dessus pour le criblage à haut débit des molécules utiles pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées aux défaillances de l'action de l'insuline sur ses tissus cibles ou aux défaillances partielles ou totales de sécrétion d'insuline.
L'invention a également pour objet l'utilisation de la méthode ci-dessus pour la détection de molécules utiles pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie choisie parmi le diabète, l'obésité, les pathologies liées à la résistance à l'insuline.
Encore, un autre objet de l'invention se rapporte à un activateur d'un récepteur capable de se lier au récepteur de l'invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation des ses hétérodimères αβ.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un activateur d'un récepteur capable de se lier au récepteur de l'invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation de ses deux hétérodimères αβ pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention du diabète.
L'invention a aussi pour objet un inhibiteur d'un récepteur capable de se lier au récepteur de l'invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation des ses deux hétérodimères αβ.
Un autre objet de l'invention concerne à l'utilisation d'une molécule capable de se lier au récepteur de 1 ' invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation de ses deux hétérodimères αβ pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une pathologie humaine ou animale.
L'invention se rapporte également à l'utilisation d'une molécule capable de se lier au récepteur chimère isolé de l'invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation de ses deux hétérodimères αβ pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer.
L'invention concerne encore l'utilisation d'une molécule capable de se lier au récepteur chimère de l'invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation de ses deux hétérodimères αβ pour la préparation d'un médicament destiné à la régénération tissulaire.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une molécule capable de se lier au récepteur chimère de l'invention et de provoquer le rapprochement ou un changement de conformation de ses deux hétérodimères αβ pour la préparation de facteurs de croissance pour la culture cellulaire.
Enfin l'invention a également pour objet un support solide sur lequel est fixé un récepteur chimère selon l'invention. Selon un mode de réalisation préféré, le récepteur est fixé sur ledit support solide par des liaisons covalentes ou non covalentes.
De préférence, le support solide selon l'invention est choisi parmi le groupe de supports comprenant les supports inorganiques tels que le métal, le verre, le silicium et les supports organiques à base de polymères ou de co-polymères tels que le polystyrène, le polyethylene, le polycarbonate, la polyacrylamide, le nylon ou le latex.
Avantageusement le support solide selon l'invention est choisi parmi le groupe des supports sous forme de particules y compris des particules colloïdales, des bandelettes, de microplaques, des tubes.
Préférentiellement le support solide de l'invention est sous une forme lyophilisée.
Avantageusement le support solide de l'invention est sous une forme congelée.
Enfin l'invention concerne un kit pour la détection d' activateurs ou d'inhibiteurs des récepteurs de la famille du récepteur de l'insuline comprenant au moins un support solide comme défini ci-dessus, éventuellement le substrat d'un élément bioluminescent, et une notice d'utilisation.
D'autres avantages et applications de l'invention apparaîtront à la lecture des travaux expérimentaux et des résultats que les inventeurs ont effectués afin de vérifier que la méthode selon l'invention permet de suivre in vitro un changement conf ormationnel du récepteur chimère qui reflète fidèlement l'état d'activation du récepteur. Ces travaux sont illustrés par les figures jointes en annexe dans lesquelles:
- La figure 1 montre que les récepteurs de l'insuline chimères sont assemblés correctement dans les cellules HEK-293 transfectées avec les ADNc fusionnés..
- La figure 1A illustre le principe de la détection des changements conformationnels induits par l'insuline dans la molécule du récepteur de l'insuline en utilisant la méthodologie BRET.
- la figure 1B montre que la transfection d'ADNC codant pour EYPF dans des cellules HEK-293 produit un signal fluorescent uniformément distribué dans la cellule, par contre, la transfection d'ADNc codant pour IR-EYFP ou la co-transfection d'ADNc codant pour IR-Rluc et IR-EYPF conduit à la localisation de la fluorescence dans la membrane plasmatique.
- la figure 1C montre l' auto-phosphorylation sur les tyrosines du récepteur chimère détectée par immunoblot en utilisant un anticorps anti-phospho- tyrosine (4G10). L' immunoblot est effectué récepteurs chimères provenant de cellules HEK co-transfectées avec l'ADNc codant pour IR-Rluc seul, IR-EYPF seul ou les deux simultanément. Les cellules sont incubées durant 5 minutes en présence de 100 nM d'insuline. Les cellules ont été extraites et les récepteurs chimères ont été partiellement purifiés sur de la Sepharose LGB.
- La figure 2 illustre l'effet de l'insuline sur le signal BRET. La figure 2A montre le signal basai et le signal induit par l'insuline mesurés soit sur des cellules intactes soit sur des récepteurs chimères partiellement purifiés selon décrit dans la section " Matériel et méthodes ". Les résultats sont exprimées comme la moyenne ± sem de six expériences.
- La figure 3 montre l'effet de l'insuline sur 1 ' autophosphorylation et le signal BRET sur des récepteurs chimères partiellement purifiés. la figure 3A montre que
1 ' autophosphorylation des récepteurs chimères partiellement purifiés effectuée comme décrit dans la section " Matériel et méthodes ", en absence ou en présence de 100 nM d'insuline.
- la figure 3B montre l'effet de l'insuline sur 1 ' autophosphorylation du récepteur chimère par analyse densitométrique. Les résultats représentent la moyenne ± sem de 7 expériences . - la figure 3C montre les signaux BRET obtenus lorsque des récepteurs de l'insuline chimères partiellement purifiés ont été preincubés durant 45 minutes en absence ou en présence de 100 nM insuline et ensuite incubés durant 2 minutes en absence ou en présence de 100 μM ATP. Le signal BRET a été mesuré comme décrit dans la section " Matériel et méthodes ". Les résultats correspondent à la moyenne ± sem de 3 expériences.
- Les figures 4A et 4B illustrent l'effet dose-réponse de l'insuline, l'IGFl et l'EGF sur les récepteurs chimères partiellement purifiés.
La figure 4A montre les signaux BRET obtenus lorsque des récepteurs chimères partiellement purifiés ont été incubés durant 45 minutes en présence de doses croissantes d'insuline, d'IGFl ou d'EGF. Le signal BRET a été mesuré selon décrit dans la section " Matériel et méthodes " . Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± sem de trois à neuf expériences.
La figure 4B montre 1 ' autophosphorylation des récepteurs chimères partiellement purifiés qui est effectuée comme décrit dans la section " Matériel et méthodes " en présence de doses croissantes d'insuline, d'IGFl ou d'EGF.
- Les figures 5A à 5D montrent l'effet d'anticorps anti-récepteur sur le signal BRET.
- La figure 5A montre les signaux BRET obtenus lorsque des récepteurs chimères partiellement purifiés sont incubés durant 45 minutes en présence de 100 nM insuline , d'un ng/μl d'anticorps monoclonal 83-14 ou des deux. Le signal BRET est mesuré selon décrit dans la section " Matériel et méthodes ". Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± sem de sept à neuf expériences. * P<0,05 lorsque le signal obtenu est comparé avec le signal induit par l'insuline seule. (Test de Student) .
- la figure 5B illustre l' autophosphorylation des récepteurs chimères partiellement purifiés effectuée comme décrit dans la section " Matériel et méthodes " en présence de 100 nM d'insuline, d'un ng/μl d'anticorps monoclonal 83-14 ou des deux. la figure 5C montre les signaux BRET obtenus lorsque des récepteurs chimères partiellement purifiés sont incubés durant 45 minutes en présence d'insuline (100 nM), de l'anticorps AK766 (200 ng/μl) ou des deux. Les signaux BRET ont été mesurés comme décrit dans la section " Matériel et méthodes. Les résultats représentent la moyenne ± sem de trois expériences. * P<0,05 lorsqu'il est comparé au signal induit par l'insuline seule (Test de Student)
- La figure 5D montre l' autophosphorylation des récepteurs chimères partiellement purifiés est effectuée comme décrit dans la section " Matériel et méthodes " en présence d'insuline (100 nM) , d'anticorps AK766 (200 μg/1) ou des deux.
- Les figures 6A et 6B montrent les plasmides utilisés pour obtenir les protéines de fusion IR-EYFP et IR-Luc . - La figure 7 illustre le déplacement de la liaison de l'insuline radioactive mono-iodée ( [ 125 I] iodotyrosyl A14) par de l'insuline non-radioactive sur des cellules transfectées , exprimant les différents récepteurs chimériques : - le récepteur de 1 ' insuline humain normal
[IR] (*),
- le récepteur de l'insuline fusionné à la luciférase [IR-Rluc] (#), - le récepteur de l'insuline fusionné à la protéine fluorescente jaune [IR-EYFP] (Θ),
- le récepteur de 1 ' insuline fusionné à la luciférase avec le récepteur de l'insuline fusionné à la protéine fluorescente jaune [IR-Rluc] -[IR-EYFP] (O).
I - MATERIEL ET METHODES
Description générale : La fusion des séquences d'ADN codant pour le récepteur de l'insuline avec, d'une part, la séquence d'ADN codant pour la luciférase de Renilla (Construction IR-Rluc), et d'autre part avec la séquence codant pour la protéine fluorescente EYFP (Construction IR-EYFP) a été effectuée.
Ces constructions sont transfectées ensemble ou séparément dans des cellules eucaryotes, (cellules HEK 293 par exemple) de façon à produire des molécules hybrides constituées d'une protéine chimère alpha-béta- luciférase associée à une protéine chimère alpha-béta- EYFP. Après 48h d'expression dans des cellules HEK-293, les protéines cellulaires sont extraites.
Les récepteurs de l'insuline sont isolés à partir des cellules transfectées, et éventuellement purifiés en utilisant les techniques classiques de chromatographie d'affinité sur des colonnes de lectine de germe de blé (Sepharose LGB). Le récepteur est élue dans un tampon contenant du N-acétylglucosamine . Cette solution contenant le récepteur partiellement purifié est aliquotée et congelée. Les aliquots conservés à —80°C et peuvent être décongelés et utilisés pour tester l'effet de l'insuline et de différentes molécules sur les changements de conformation du récepteur de l'insuline.
1.1 - Séquences d'ADNc.
L'ADNc codant pour la séquence complète du récepteur de l'insuline correspondant à la séquence identifiée sous le numéro SEQ ID N°l dans la liste de séquences en annexe sans son codon stop a été sous-cloné en phase, soit avec la variante jaune de la GFP (EYFP, Clontech), pour obtenir la séquence codante identifiée en annexe sous le numéro SEQ ID N° 2 soit avec le gène de la Renilla Luciférase (Promega)pour obtenir la séquence codante identifiée sous le numéro SEQ ID N°3 dans la liste de séquences en annexe, dans un vecteur d'expression pCDNA3 (Invitrogen) .
Le séquence de la protéine de fusion obtenue entre la sous-unité αβ du récepteur de l'insuline et la
Protéine Fluorescente Jaune est identifiée en annexe sous le numéro SEQ ID N°4.
La séquence de la protéine de fusion obtenue entre la sous-unité αβ du récepteur de l'insuline et la
Luciférase de Renilla est identifiée en annexe sous le numéro SEQ ID N°5.
1.2 - Culture cellulaire, transfection et purification des protéines de fusion du récepteur de 1' insuline.
Des cellules HEK-293 maintenues dans du milieu DMEM supplémenté avec 4,5 g/1 de glucose et 10% sérum de veau (Gibco Life Science) ont été ensemencées à une densité de 1,2 x 106 cellules/boîte de diamètre 100 mm. La transfection transitoire est effectuée un jour plus tard en utilisant du FuGene 6 (Roche), soit avec 0,3 μg d'ADNc d' IR-Rluc et 0,3 μg du vecteur vide, soit avec 0,3 μg d'ADNc d' IR-Rluc et 0,3 μg d'ADNc d' IR-EYPF. Dans certaines expériences, (Figure 2A image de gauche) les mesures de BRET ont été effectuées sur des cellules intactes comme décrit précédemment (Angers S, Salahpour A, Joly E, et al. (2000) Détection of beta 2-adrenergic receptor dimerization in living cells using bioluminescence résonance energy transfer (BRET). Proc Natl Acad Sci U S A 97: 3684-3689). Dans la plupart des expériences, les mesures BRET ont été effectuées en utilisant des récepteurs de l'insuline chimères purifiés. Deux jours après la transfection, les cellules ont été extraites dans un tampon contenant 1% (Poids/volume) de Triton X-100, 20 mM MOPS, 2,5 mM benzamidine, 1 mM EDTA, 1 mM AEBSF, et 1 μg/ml de chacun des anti-protéases suivants : aprotinine, pepstatine, antipaïne et leupeptine (Sigma).
Les récepteurs chimères sont partiellement purifiés par chromatographie sur de la lectine de germe de blé couplée à de la Sepharose comme décrit précédemment (Tavaré,J.M. et Denton,R.M. Studies on the autophosphorylation of the insulin receptor from human placenta. Analysis of the sites phosphorylated by two dimensional peptide mapping. Biochem.J. 252, 607-615 (1988) ) .
Les extraits cellulaires sont centrifugés à 4°C pendant 5 min à 1000g pour éliminer d'éventuels débris insolubles. L'extrait cellulaire soluble (7,5 ml) est incubé avec 2,5 ml de billes de sepharose couplée avec de la lectine de germe de blé (LGB) pendant 2 h à 4°C sur une roue en rotation. Le mélange est ensuite transvasé dans une colonne (2 cm de diamètre) et lavé avec 100 ml de tampon de lavage de colonne (identique au tampon d'extraction mais ne contenant que 0,1% de Triton X-100). Les glycoprotéines sont retenues sur la colonne alors que les protéines cellulaires non glycosylée sont éliminées lors du lavage. Les glycoprotéines sont ensuite éluées de la colonne avec 15 ml de tampon d'élution (identique au tampon de lavage, mais contenant 0,3 M de
N-acétylglucosamine ) . L'éluat est recueilli en 15 fractions de 1 ml. La présence de récepteurs chimériques dans chacune de ces fractions est rapidement estimée par une mesure directe de BRET sur 50 μl d'éluat. Les trois fractions contenant la plus forte activité de signal BRET sont alors réunies et congelées à —80°C sous forme d'aliquots de 50μl pour utilisation ultérieure. La concentration protéique dans les préparations de récepteurs partiellement purifiés est mesurée par un test de Bradford.
1.3 - Essai BRET
La mesure du signal BRET est effectuée en utilisant 4,5 μl d'éluat issu de la chromatographie sur lectine de Germe de Blé couplée à de la Sepharose (Sépharose-LGB ) (contenant environ 2 μg de protéine) preincubés dans des microplaques de 96 puits durant 45 minutes à 20°C dans un volume total de 60 μl contenant 30 mM MOPS, 1 mM de tétravanadate de sodium et des concentrations différentes de ligands. Sept μl de coelenterazine (concentration finale 2,6 μM) ont été ajoutés à la préparation et l'acquisition de l'émission de la lumière à 485 nm (fenêtre de filtre : 20 nm) et à 530 nm (fenêtre de filtre : 25 nm) est commencée immédiatement en utilisant l'appareil d'analyse des micloplaques Fusion® (Hewlett Packard). Le rapport BRET (Angers, S. et al. Détection of beta-2-adrenergic receptor dimerization in living cells using bioluminiscence résonance energy transfer (BRET). Proc. atl.Acad. Sci.U. SA. 96, 151-156 (1999), a été défini préalablement comme : [(émission à 530 nm) — (émission à 485 nm) x
Cf] / (émission à 485 nm) , où Cf correspond au quotient (émission à 530 nm/émission à 485 nm) pour la protéine de fusion Rluc seule dans les mêmes conditions expérimentales. Par exemple dans l'étude réalisée dans le cadre de la présente invention, ceci correspond à l'émission obtenue avec le récepteur chimère partiellement purifié à partir de cellules HEK-293 transfectés avec l' IR-Rluc seul. Afin de faciliter la lisibilité, les résultats sont exprimés en Unités milliBRET (mBU), une unité mBRET correspondant au rapport BRET multiplié par 1000. 1.4 - Auto-phosphorylation des récepteurs de l'insuline chimères partiellement purifiés.
Les récepteurs chimères de l'insuline partiellement purifiés (4,5 μl) ont été pre-incubés durant 45 minutes à 20°C dans un volume total de 60 μl contenant 30 mM MOPS, 12 mM MgC12, 2 mM MnC12, 1 mM Na3V04 et des différentes concentrations de ligands. La réaction d' auto-phosphorylation est déclenchée par addition de 5 μl d'ATP (concentration finale 100 μM) durant 2 minutes et arrêtée par addition du tampon d'échantillon Laëmmli- SDS-PAGE (Tavaré,J.M. et Denton,R.M. Studies on the autophosphotylation of the insulin receptor from human placenta. Analysis of the sites phosphorylated by two dimensional peptide mapping. Biochem.J. 252, 607-615 (1988)). L' autophosphorylation des récepteurs chimères est vérifiée par Western Blot (Issad T., Combettes, M et Ferré, P. Isoproterenol inhibits insulin-stimulated tyrosine phosphorylation of the insulin receptor without increasing its serine/threonine phosphorylation. Eur . J.Biochem. 234, 108-115 (1995)), en utilisant l'anticorps anti-phosphotyrosine 4 G10 (UBI).
1.5 - Auto-phosphorylation des récepteurs de l'insuline dans les cellules intactes. Quarante-huit heures après la transfection, des cellules HEK-293 ont été incubées durant 5 minutes en absence ou en présence d'insuline et extraites, comme décrit précédemment (Tavaré, J.M. , O'Brien, R.M. Siddle, K. et Denton,R.M. Analysis of insulin receptor phosphorylation sites in intact cells by two dimensional phosphopeptide mapping. Biochem.J. 253, 783-788 (1988)). II - RESULTATS
11.1 - Expression du récepteur de l'insuline fusionné avec Rluc et EYFP dans des cellules HEK-293.
5 On considère que le changement conformationnel induit par l'insuline sur son récepteur entraîne un rapprochement des deux sous-unités béta et permet alors la phosphorylation sur tyrosines d'une sous-unité par l'autre sous-unité.
10 De manière à détecter ce changement conformationnel en utilisant la méthodologie BRET, la séquence codante du récepteur de l'insuline (SEQ ID N° 1) a été fusionnée avec soit celle de Renilla Luciférase (SEQ ID N° 2), soit celle de EYFP (SEQ ID N° 3). La
-15 microscopie de fluorescence montre que les cellules HEK- 293 transfectées avec l'ADNc codant pour IR-EYFP ou co- transfectées avec l'ADNc codant pour IR-Rluc et IR-EYPF expriment la protéine fluorescente chimère sur la membrane plasmatique (Figure lb).
20 Dans des cellules HEK-293 transfectées soit avec l'ADNc codant pour IR-Rluc soit avec l'ADNc codant pour IR-EYFP ou les deux, l'insuline stimule clairement la phosphorylation sur tyrosines d'une protéine ayant un poids moléculaire apparent d'environ 125-130 Kd en accord
25 avec la taille attendue de la sous-unité béta fusionnée avec Rluc ou EYFP. Ces résultats indiquent que ces récepteurs d'insuline chimères sont correctement exprimés sur la membrane plasmatique et ont conservé leur activité d' auto-phosphorylation induite par l'insuline.
30
11.2 - L'insuline stimule le transfert résonant d'énergie de bioluminescence entre béta-IR-Rluc et béta-IR-EYFP in vitro.
Les mesures par BRET effectuées sur des
35 cellules HEK-293 intactes co-transfectées avec IR-Rluc et
IR-EYFP montrent que l'insuline a peu d'effet sur le signal BRET , qui est à peine plus élevé que le niveau basai (Figure 2a). Le signal BRET basai mesuré sur des récepteurs chimères partiellement purifiés est de deux à trois fois inférieur à celui des cellules intactes. Un effet important de l'insuline sur le signal BRET est observé sur les récepteurs chimères partiellement purifiés. Bien que les raisons pour expliquer les différences dans les signaux BRET émis par les cellules intactes, et par les récepteurs partiellement purifiés soient inconnues à ce jour, ces résultats indiquent que l'approche BRET peut-être utilisée pour le suivi in vitro des changements conformationnels du récepteur de l'insuline, induits par l'insuline. (Figure 2a).
La co-transfection avec IR-Rluc et IR-EYFP peut théoriquement conduire à l'expression de trois populations de récepteurs chimères : [αβRluc]2, [αβEYFP]2 et des molécules hybrides [αβRluc]-[αβEYFP ] . Par conséquent, un signal BRET peut en théorie, provenir d'un transfert d'énergie intramoléculaire à l'intérieur de la même molécule [αβRluc]-[αβEYFP ] ou d'un mécanisme intermoléculaire entre deux récepteurs chimères, par exemple, entre [αβRluc]2 et [αβEYFP]2.
L'augmentation du volume de l'éluat issu de la chromatographie sur Sepharose-LGB, dans le mélange de réaction, de 2 μl à 10 μl, correspondant à des concentrations du récepteur partiellement purifié allant de 15 ng/ml jusqu'à 75 ng/ml, n'altère pas le signal
BRET.(Fig. 2b). Ceci indique que le signal BRET mesuré sur les récepteurs chimères partiellement purifiés est indépendant de la concentration protéique et reflète un transfert d'énergie intramoléculaire entre αβRluc et αβEYFP dans la même molécule du récepteur chimère.
[αβRluc] - [αβEYFP]. De plus, aucun signal BRET n'a pu être détecté lorsque des éluats issus de la chromatographie sur lectine de germe de blé (éluats LGB) des cellules transfectées avec IR-Rluc seul sont mélangés avec des extraits LGB de cellules transfectées avec IR- EYFP seul (résultats non-montrés) . Ceci indique qu'aucun transfert d'énergie ne se produit entre [αβRluc ]2 et [αβEYFP] 2 et appuie la notion que le transfert d'énergie observé est un processus intramoléculaire qui reflète un changement conformationnel entre les sous-unités [αβRluc]
- [αβEYFP] d'un même récepteur chimère. La figure 3a montre que l'insuline stimule
1'auto-phosphorylation in vitro des récepteurs de fusion partiellement purifiés. L'effet de l'insuline sur l' autophosphorylation (Figure 3b) est du même ordre de magnitude (2,5 fois à 3 fois) que l'effet de l'insuline sur le signal BRET (Figure 3c). Ce résultat indique que le signal BRET peut être considéré comme une mesure représentative de l'état d'activation du récepteur de l'insuline. L'effet in vitro de l'insuline sur le signal BRET est indépendant de la réaction d'auto- phosphorylation. En effet, un signal BRET équivalent est obtenu, que la réaction d' auto-phosphorylation soit effectuée ou non avant les tests BRET (Figure 3c).
II.3 - Effets dose-réponse de l'insuline, IGF1, et EGF sur le signal BRET.
L'effet de concentrations croissantes d'insuline sur le signal BRET est montré figure 4A. l'effet maximal est observé à une dose de 15 nM d'insuline. L'effet demi-maximal (EC50) est observé à une dose de 15 nM d'insuline. L'IGFl montre également un signal BRET dose—dépendant avec un EC50 d'environ 200 nM. L'EGF n'a aucun effet sur le signal BRET. Ces résultats sont en accord avec les propriétés pharmacologiques connues de ces ligands envers le récepteur de l'insuline. L ' auto-phosphorylation des récepteurs chimères en réponse à ces ligands présente des profils dose-réponse similaires, indiquant que le signal BRET reflète en effet l'état d'activation du récepteur de l'insuline. (Figure 4B).
II.4 - Effet d'anticorps anti-récepteur sur le signal BRET. L'anticorps monoclonal 83-14 dirigé contre la sous-unité alpha du récepteur de l'insuline (Soos MA, Siddle K, Baron MD, et al. (1986) Monoclonal antibodies reacting with multiple epitopes on the human insulin receptor. Biochem J 235: 199-208) a une activité similaire à celle de l'insuline ( insulin-like) sur le métabolisme des adipocytes humains (Taylor, R., Soos, M. A., Wells, A;, Argyari,M and Siddle, K. "Insulin- like and insulin-inhibitory effects of monoclonal antibodies for différent epitopes on the human insulin receptor. Biochem.J. vol 242, page 123-129, (1987)) et sur 1 ' auto-phosphorylation du récepteur de l'insuline (O'Brien RM, Soos MA, Siddle K (1987) Monoclonal antibodies to the insulin receptor stimulate the intrinsic tyrosine kinase activity by cross-linking receptor molécules. Embo J 6: 4003-4010)
De manière intéressante, cet anticorps active aussi complètement les récepteurs de l'insuline d'un patient insulino-résistant qui ne peuvent pas être activés par l'insuline comme conséquence d'une mutation qui empêche la liaison de l'insuline. (Krook A, Soos MA, Kumar S, Siddle K, O'Rahilly S (1996) Functional activation of mutant human insulin receptor by monoclonal antibody. Lancet 347: 1586-1590).
Il a été suggéré que cette approche pouvait être une solution aux défaillances dans 1 ' autophosphorylation du récepteur induite par l'insuline chez un patient insulino résistant. (Krook A, Soos MA, Kumar S, Siddle K, O'Rahilly S (1996) Functional activation of mutant human insulin receptor by monoclonal antibody. Lancet 347: 1586-1590).
Il apparaît que l'anticorps 83-14 stimule fortement le signal BRET (Figure 5a).
Des travaux préalables montraient que de façon inattendue, l'effet maximal de l'insuline sur 1 ' auto-phosphorylation pouvaient être augmenté par l'anticorps 83-14, conduisant à une activation supramaximale de l' auto-phosphorylation du récepteur de l'insuline lorsque les deux ligands sont présents ensemble. (O'Brien RM, Soos MA, Siddle K (1987) Monoclonal antibodies to the insulin receptor stimulate the intrinsic tyrosine kinase activity by cross-linking receptor molécules. Embo J 6: 4003-4010).
De manière similaire, l'incubation combinée du récepteur chimère selon l'invention avec l'insuline et avec l'anticorps 83-14 conduit également à un signal BRET qui est plus élevé que l'effet maximal obtenu avec l'insuline seule. Ces résultats indiquent que la méthode de l'invention détecte des changements conformationnels induits par un anticorps avec une activité qui mime celle de l'insuline.
Il est également observé qu'un anticorps dirigé contre la portion intracellulaire complète du récepteur de l'insuline humain, l'anticorps anti-kinase AK766, qui inhibe 1 ' auto-phosphorylation induite par l'insuline (Figure 5D), réduit clairement l'effet de l'insuline sur le signal BRET (Figure 5C) lorsqu'il est utilisé dans la méthode selon l'invention. Ceci est une preuve que les inhibiteurs de l'activité du récepteur de l'insuline peuvent également être détectés par cette méthodologie.
Ainsi, ces deux anticorps, interagissent avec la sous-unité alpha (83-14) ou la sous-unité béta (AK766) du récepteur de l'insuline et sont également capables d'induire un changement d'activité du récepteur que l'on peut mettre en évidence avec la méthode de l'invention.
II.5 Essais de liaison des récepteurs chimériques.
Les propriétés de liaison des récepteurs chimériques ont été comparées par déplacement de la liaison de l'insuline radioactive mono-iodée ( [ 125 I] iodotyrosyl A14) par de l'insuline non-radioactive.
Les résultats obtenus sont illustrés figure 7 en annexe. Les cellules HEK-293 ont été transfectées avec l'ADNc codant pour le récepteur de l'insuline humain normal [IR] (#), l'ADNc codant pour le récepteur de l'insuline fusionné à la luciférase [IR-Rluc] (#), l'ADNc codant pour le récepteur de l'insuline fusionné à la protéine fluorescente jaune [IR-EYFP] (Θ), ou co- transfectées avec à la fois l'ADNc codant pour le récepteur de l'insuline fusionné à la luciférase et l'ADNc codant pour le récepteur de l'insuline fusionné à la protéine fluorescente jaune [IR-Rluc] -[ IR-EYFP] (O). Quarante-huit heures après la transfection, les récepteurs ont été partiellement purifiés par chromatographie d'affinité sur LGB comme décrit précédemment, puis incubés pendant une nuit à 4°C en présence d'insuline radioactive marquée à l'iode 125 et de quantités croissantes d'insuline non-radioactive. Le complexe récepteur-insuline [ 125 I] est précipité au Polyethylene Glycol, et la radioctivité associée au récepteur est mesurée dans un compteur gamma. ( (Maury J, Burnol AF, Loizeau M, Issad T, Girard J, Ferre P. Insulin receptor function is preserved in a physiological state of hypoinsulinemia and insulin résistance. Am J Physiol 262,E818-E825 (1992)).
Les courbes de déplacement de la liaison de l'insuline radioactive par l'insuline froide indiquent que les propriétés de liaison de l'insuline sont très similaires pour les différent types de récepteurs. La fusion de la sous-unité béta du récepteur humain de l'insuline avec la Rluc ou la EYFP ne modifie pas les propriétés de liaison de l'insuline par la sous-unité alpha de ce récepteur.
III - Conclusion L'ensemble de ces résultats confirme que la méthode mise au point dans le cadre de l'invention permet de mesurer des changements de conformation induits soit par des activateurs soit par des inhibiteurs d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline.
Cette méthode, basée sur le transfert résonant d'énergie de bioluminescence permet le suivi des changements conformationnels dudit récepteur.
Le signal BRET détecté dans ce test reflète fidèlement le stade d'activation du récepteur, et par conséquent il peut être utilisé pour étudier les effets stimulateurs ou inhibiteurs de molécules sur l'activité dudit récepteur.
Cette méthode constitue un outil adéquat pour la recherche de molécules ayant des propriétés thérapeutiques vis-à-vis de pathologies liées à une diminution de l'action de ligands du récepteur sur ses tissus cibles. Par exemple, dans le cas du récepteur de l'insuline, il peut s'agir de pathologies liées à la résistance à l'insuline ou à une diminution, voire l'absence de la sécrétion pancréatique d'insuline.

Claims

REVENDICATIONS
1) Méthode de détection de molécules susceptibles de modifier l'activité tyrosine kinase d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur isolé comprenant un premier hétérodimère αβassocié à un premier élément de réponse et un second hétérodimère αβassocié à un second élément de réponse différent du premier, ledit premier élément de réponse étant capable d'agir sur le second élément de réponse lorsque ceux-ci sont rapprochés, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères αβ résultant de l'interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la réponse du second élément de réponse à un signal émis par le premier élément de réponse lorsqu'il est activé.
2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère αβassocié à un premier élément bioluminescent ou fluorescent et un second hétérodimère αβassocié à un second élément fluorescent différent du premier, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimère αβ résultant de l'interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par le second élément fluorescent en réponse à un signal émis par le premier élément de réponse lorsqu'il est activé. 3) Méthode de détection de molécules susceptibles de modifier l'activité tyrosine kinase d'un récepteur selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes
a) la mise en contact d'une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère αβassocié à un élément bioluminescent et un second hétérodimère αβ associé à un élément fluorescent, b) la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères αβ résultant de l'interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par l'élément fluorescent en réponse à un signal émis par l'élément bioluminescent lorsqu'il est activé .
4) Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères αβ est mesurée en mettant en contact à l'étape (b) le récepteur avec un substrat de l'élément bioluminescent.
5 ) Méthode de détection de molécules susceptibles de modifier l ' activité tyrosine kinase d ' un récepteur selon l ' une des revendications 1 ou 2 , caractérisée en ce qu ' e lle comprend les étape s suivantes : a ) la mise en contact d ' une molécule à analyser avec un récepteur ou partie de récepteur comprenant un premier hétérodimère αβ associé à un premier élément f luorescent et un second hétérodimère αβ associé à un second élément f luorescent différent du premier , b ) la détection du rapprochement ou d ' un changement de conformation des deux hétérodimères αβ résultant de l ' interaction éventuelle de ladite molécule avec le récepteur ou partie de récepteur par mesure de la fluorescence émise par le second élément fluorescent en réponse à un signal émis par le premier élément fluorescent lorsqu' il est activé .
6) Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que la détection du rapprochement ou d'un changement de conformation des deux hétérodimères αβ est mesurée en exposant à l'étape (b) le récepteur ou partie de récepteur isolé à une source lumineuse spécifique du premier élément fluorescent.
7) Méthode selon l'une quelconque revendication 1 à 6, caractérisé en ce que le premier et/ou le second hétérodimère αβ est/ (sont) délétée(s) du domaine tyrosine kinase ou d'une partie ou de la totalité du domaine intracellulaire et/ou transmembranaire du récepteur.
8) Méthode selon l'une quelconque revendication 1 à 6, caractérisé en ce que le premier et/ou le second hétérodimère αβ comprennent un domaine tyrosine kinase.
9) Méthode selon l'une quelconque revendication 1 à 8, caractérisée en ce que l'on compare la mesure obtenue à l'étape (b) avec celle obtenue en réalisant ladite méthode dans l'une au moins des conditions suivantes : - en l'absence de la molécule à tester,
- avec une molécule témoin, en présence ou en absence de la molécule à tester, avec un excipient, en présence ou en absence de la molécule à tester, - avec un récepteur témoin à la place du récepteur ou partie de récepteur isolé. 10 ) Méthode se lon l ' une que lconque revendication 1 à 9 , caractérisée en ce que l ' élément bioluminescent est la luciférase ou un fragment bioluminescent de celle-ci .
11) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'au moins un élément fluorescent est choisi parmi une protéine fluorescente ou un composé chimique fluorescent.
12) Méthode selon la revendication 11, caractérisée en ce que la protéine fluorescente est choisie parmi dans le groupe comprenant la Protéine verte fluorescente (GFP) et ses variantes comme la Protéine jaune fluorescente (EYFP), la Protéine Bleue fluorescente (EBFP), la Protéine cyano fluorescente (ECFP) ou d'autres protéines fluorescentes telle la Ds Red ou des fragments de celles-ci.
13) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'au moins un élément fluorescent est choisi parmi 1 'Europium ou 1 ' allophycocyanine .
14) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que la molécule susceptible de modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline est un activateur dudit récepteur.
15) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la molécule susceptible de modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur est un inhibiteur dudit récepteur.
16) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que la molécule susceptible de modifier l'activité tyrosine kinase du récepteur est choisie parmi, un ligand, un agoniste ou un antagoniste dudit récepteur.
17) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les molécules à analyser sont présentes dans un milieu biologique naturel et sont mises en contact avec le récepteur chimérique isolé dans ledit milieu naturel.
18) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les molécules à analyser sont issues de l'expression d'une banque d'ADNc.
19) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la détection de la fluorescence émise lors de l'étape (c) est effectuée au moyen d'un luminomètre/fluorimètre.
20) Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline est choisi parmi le récepteur de l'insuline, le récepteur IGF-1, le récepteur IRR ou des variantes de ceux-ci.
21) Un récepteur chimère comportant deux hétérodimères αβ,susceptible d'être mis en œuvre dans une méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, caractérisé en ce que l'un des deux hétérodimères αβest associé à un élément bioluminescent ou un premier élément fluorescent et l'autre hétérodimère αβest associé à un second élément fluorescent différent du premier.
22) Un récepteur chimère selon la revendication 21, caractérisé en ce que ledit hétérodimère αβ est choisi parmi un hétérodimère αβ du récepteur de l'insuline, du récepteur IGF-1 ou du récepteur IRR. 23) Un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendications 21 ou 22, caractérisé en ce que l'élément bioluminescent et/ou l'élément fluorescent sont des protéines ou des fragments de celles-ci.
24) Un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que l'association entre 1 ' hétérodimère αβ et l'élément bioluminescent est obtenue par la fusion de l'ADNc codant pour ledit hétérodimère αβ et l'ADNc codant pour la protéine bioluminescente ou un fragment bioluminescent de celle-ci.
25) Un récepteur chimère selon la revendication 24, caractérisé en ce que l'ADNc codant pour ledit hétérodimère αβ est choisi parmi l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ du récepteur de l'insuline, du récepteur IGF-1 ou du récepteur IRR.
26) Un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendications 24 ou 25, caractérisé en ce que l'association entre l' hétérodimère αβ et l'élément fluorescent est obtenue par la fusion de l'ADNc codant pour ledit hétérodimère αβ et l'ADNc codant pour une protéine fluorescente ou un fragment fluorescent de celle-ci.
27) Un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendications 21 à 26, caractérisé en ce que l'élément bioluminescent est la luciférase de Renilla et en ce que l'élément fluorescent est la Protéine Fluorescente Jaune.
28) Un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendications 21 ou 22, caractérisé en ce que l'élément fluorescent est associé à l'un ou l'autre ou les deux hétérodimères αβ par des liaisons covalentes ou non covalentes .
29) Un ADNc comprenant l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour un élément bioluminescent.
30) Un ADNc selon la revendication 29, caractérisé en ce que l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline est choisi parmi l'ADNc codant pour l' hétérodimère αβ du récepteur de l'insuline, l'ADNc codant pour 1 'hétérodimère αβ du récepteur IFG-1 ou l'ADNc codant pour l' hétérodimère αβ du récepteur IRR.
31) Un ADNc selon les revendications 29 ou 30, comprenant l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour la Luciférase de Renilla identifié par la SEQ ID N° 1 dans la liste de séquences en annexe.
32) Un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comporte un ADNc défini aux revendications 29 à 31.
33) Un vecteur d'expression selon la revendication 32, identifié par la SEQ ID N° 2 dans la liste de séquences en annexe.
34) Une protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc défini à l'une des revendications 29 à 31.
35 ) Une protéine de fusion selon la revendication 34 , obtenue par expression dans une cellule d ' un ADNc comprenant l 'ADNc codant pour le récepteur de l'insuline et l'ADNc codant pour la Luciférase de Renilla identifiée par la séquence SEQ ID N° 3 dans la liste de séquences en annexe.
36) Un ADNc comprenant l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour un élément fluorescent.
37) Un ADNc selon la revendication 36 caractérisé en ce que l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline est choisi parmi l'ADNc codant pour 1 'hétérodimère αβ du récepteur de l'insuline, l'ADNc codant pour 1 'hétérodimère αβ du récepteur IFG-1 ou l'ADNc codant pour l' hétérodimère αβ du récepteur IRR.
38) Un ADNc selon les revendications 36 ou 37, comprenant l'ADNc codant pour un hétérodimère αβ ou un fragment de celui-ci d'un récepteur de la famille des récepteurs de l'insuline et un ADNc codant pour la protéine fluorescente jaune (EYFP) identifié par la SEQ ID N° 4 dans la liste de séquences en annexe.
39) Un vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comporte un ADNc défini à l'une quelconque des revendications 36 à 38.
40) Un vecteur d'expression selon la revendication 39, identifié par la SEQ ID N° 5 dans la liste de séquences en annexe.
41) Une protéine de fusion obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc défini à l'une des revendications 36 à 38. 42) Une protéine de fusion selon la revendication 41, obtenue par expression dans une cellule d'un ADNc comprenant l'ADNc codant pour le récepteur de l'insuline et l'ADNc codant pour protéine fluorescente jaune (EYFP) identifiée par la séquence SEQ ID N° 6 dans la liste de séquences en annexe.
43) Une cellule génétiquement modifiée par transfection avec soit un vecteur d'expression comportant la séquence d'un ADNc défini à l'une revendications 29 à 31 soit avec un vecteur d'expression comportant un ADNc défini à l'une quelconque des revendications 37 à 38 pour exprimer un récepteur chimère soit avec ces deux vecteurs.
44) Une cellule selon la revendication 43, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi des cellules ovariennes de Hamster Chinois (CHO : Chinese Hamster Ovary cells), des cellules HEK 293 (Human Embryonic Kidney Cells — Cellules embryonnaires Humaines de Rein) ou des Cellules humaines HeLa.
45) Utilisation de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 20 pour le criblage à haut débit des molécules utiles pour la prévention et/ou le traitement de pathologies liées aux défaillances de l'action de l'insuline sur ses tissus cibles ou aux défaillances partielles ou totales de sécrétion d'insuline.
46) Utilisation selon la revendication 45 pour la détection de molécules utiles pour la prévention et/ou le traitement d'une pathologie choisie parmi le diabète, l'obésité, les pathologies liées à la résistance à l'insuline. 47) Un support solide caractérisé en ce qu'il comporte un récepteur chimère selon l'une quelconque des revendications 21 à 28.
48) Un support solide selon la revendication
47, caractérisé en ce que le récepteur chimère est fixé sur ledit support par des liaisons covalentes ou non covalentes.
49) Un support solide selon les revendications 47 ou 48, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe de supports comprenant les supports inorganiques tels que le métal, le verre, le silicium et les supports organiques à base de polymères ou de co-polymères tels que le polystyrène, le polyethylene, le polycarbonate, la polyacrylamide, le nylon ou le latex.
50) Un support solide selon l'une quelconque des revendications 47 à 49, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi le groupe des supports sous forme de particules y compris des particules colloïdales, des bandelettes, des microplaques, des tubes.
51) Un support solide selon l'une quelconque des revendications 47 à 50, caractérisé en ce qu'il est sous une forme lyophilisée.
52) Un support solide selon l'une quelconque des revendications 47 à 50, caractérisé en ce qu'il est sous une forme congelée.
53) Un kit pour la détection d' activateurs ou d'inhibiteurs des récepteurs de la famille du récepteur de l'insuline comprenant au moins un support solide selon l'une quelconque des revendications 47 à 52, éventuellement le substrat d'un élément bioluminescent, et une notice d'utilisation.
PCT/FR2002/001471 2001-04-27 2002-04-26 Methode de detection de composes activateurs ou inhibiteurs des recepteurs de la famille du recepteur de l'insuline WO2002088752A2 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002302699A AU2002302699A1 (en) 2001-04-27 2002-04-26 Method for detecting activator or inhibitor compounds of receptors of the family of the insulin receptor using an isolated chimeric receptor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0105737A FR2824076B1 (fr) 2001-04-27 2001-04-27 Methode de detection de composes activateurs ou inhibiteurs des recepteurs de la famille du recepteur de l'insuline au moyen d'un recepteur chimere isole
FR01/05737 2001-04-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2002088752A2 true WO2002088752A2 (fr) 2002-11-07
WO2002088752A3 WO2002088752A3 (fr) 2003-04-10

Family

ID=8862802

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2002/001471 WO2002088752A2 (fr) 2001-04-27 2002-04-26 Methode de detection de composes activateurs ou inhibiteurs des recepteurs de la famille du recepteur de l'insuline

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU2002302699A1 (fr)
FR (1) FR2824076B1 (fr)
WO (1) WO2002088752A2 (fr)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7217796B2 (en) 2002-05-24 2007-05-15 Schering Corporation Neutralizing human anti-IGFR antibody
US7326567B2 (en) 2003-11-12 2008-02-05 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
US7811562B2 (en) 2004-12-03 2010-10-12 Schering Corporation Biomarkers for pre-selection of patients for anti-IGF1R therapy

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIAZZO-ASHNAULT DAWN E ET AL: "Detection of insulin receptor tyrosine kinase activity using time-resolved fluorescence energy transfer technology." ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 291, no. 1, 1 avril 2001 (2001-04-01), pages 155-158, XP002194471 ISSN: 0003-2697 *
BOUTE NICOLAS ET AL: "Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer." MOLECULAR PHARMACOLOGY, vol. 60, no. 4, octobre 2001 (2001-10), pages 640-645, XP001053695 ISSN: 0026-895X *
LI S-L ET AL: "The carboxyl-terminal domain of insulin-like growth factor-I receptor interacts with the insulin receptor and activates its protein tyrosine kinase" FEBS LETTERS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 421, no. 1, 2 janvier 1998 (1998-01-02), pages 45-49, XP004261691 ISSN: 0014-5793 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7217796B2 (en) 2002-05-24 2007-05-15 Schering Corporation Neutralizing human anti-IGFR antibody
US7326567B2 (en) 2003-11-12 2008-02-05 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
US8062886B2 (en) 2003-11-12 2011-11-22 Schering Corporation Plasmid system for multigene expression
US7811562B2 (en) 2004-12-03 2010-10-12 Schering Corporation Biomarkers for pre-selection of patients for anti-IGF1R therapy

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002088752A3 (fr) 2003-04-10
FR2824076B1 (fr) 2003-06-13
FR2824076A1 (fr) 2002-10-31
AU2002302699A1 (en) 2002-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bocquet et al. Real-time monitoring of binding events on a thermostabilized human A2A receptor embedded in a lipid bilayer by surface plasmon resonance
CN103959063B (zh) 用于对抗体的糖基化进行测定的方法
US11360096B2 (en) Complex BRET technique for measuring biological interactions
Podewin et al. Conditional and reversible activation of class A and BG protein-coupled receptors using tethered pharmacology
HUE027306T2 (en) A method for screening for a compound capable of enhancing or inhibiting OATP1B1 transport activity and determining the expression level of OATP1B1.
JP6419139B2 (ja) 膜貫通輸送を監視するための組成物および方法
EP3658913B1 (fr) Méthode pour mesurer la modulation de l&#39;activation d&#39;un récepteur couplé à une protéine g
Gehlert et al. Co-expression of neuropeptide Y Y1 and Y5 receptors results in heterodimerization and altered functional properties
US20070105160A1 (en) Detection of intracellular enzyme complex
WO2002088752A2 (fr) Methode de detection de composes activateurs ou inhibiteurs des recepteurs de la famille du recepteur de l&#39;insuline
WO2005045028A1 (fr) Procede d&#39;analyse acellulaire du clivage de notch et procede d&#39;identification de medicaments par criblage
EP2518157A1 (fr) Systèmes de test et procédés d&#39;identification d&#39;un composant altérant l&#39;activité cellulaire de DDR
KR20140094442A (ko) 생리 활성 물질을 검출하는 바이오어세이법
EP3158081B1 (fr) Biocapteurs de kinase activée par l&#39;amp fluorescente
Cevheroglu et al. Ste2p Under the Microscope: the Investigation of Oligomeric States of a Yeast G Protein-Coupled Receptor
CA2652960C (fr) Methodes de criblage de modulateurs trpm4 de la secretion d&#39;insuline
Petersen et al. Free fatty acid receptor 1 stimulates cAMP production and gut hormone secretion through Gq-mediated activation of adenylate cyclase 2
Thoduvayil et al. Rapid Quantification of First and Second Phase Insulin Secretion Dynamics using an In vitro Platform for Improving Insulin Therapy
EP1644739A2 (fr) Procede de mise en evidence d un evenement moleculaire dans une cellule grace a des proteines marqueurs fluorescentes
EP2828659B1 (fr) Procede de determination de la capacite d&#39;un anticorps a maintenir des cellules a proximite l&#39;une de l&#39;autre
Mancini et al. Exploring the Technology Landscape of 7TMR Drug Signaling Profiling
AU2003301960A1 (en) Methods of isolation of active compounds and activated targets
Hennig et al. 1Q1 Q2 Real-time monitoring of binding events on a thermostabilized human A2A 2 receptor embedded in a lipid bilayer by surface plasmon resonance
EP1493035B1 (fr) PROCEDE DE SELECTION D&#39;AGENTS BIO-ACTIFS PAR DETECTION D&#39;UNE VARIATION INDUITE DE LA CONCENTRATION INTRACELLULAIRE D&#39;AMPc D&#39;UNE CELLULE VIVANTE SENSIBLE
FR2849041A1 (fr) Proteine chimerique pour le criblage d&#39;agonistes et d&#39;antagonistes des voies de signalisation cellulaires dependantes des recepteurs couples aux proteines g

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP