WO2002068655A1 - Method of searching for remedy for hepatitis d - Google Patents

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WO2002068655A1
WO2002068655A1 PCT/JP2002/001817 JP0201817W WO02068655A1 WO 2002068655 A1 WO2002068655 A1 WO 2002068655A1 JP 0201817 W JP0201817 W JP 0201817W WO 02068655 A1 WO02068655 A1 WO 02068655A1
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gene
amino acid
hepatitis
acid sequence
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PCT/JP2002/001817
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Hiroshi Handa
Yuki Yamaguchi
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The Circle For The Promotion Of Science And Engineering
Kyowahakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C12N2760/10011—Arenaviridae
    • C12N2760/10111—Deltavirus, e.g. hepatitis delta virus
    • C12N2760/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D. Background art
  • Hepatitis D virus is an incomplete virus that grows only in the presence of hepatitis B virus (HBV) and does not grow alone. HB V). Therefore, to treat HDV-associated hepatitis B (abbreviated as “hepatitis D”), therapies targeting HBV have been applied in the same manner as in the treatment of non-HDV-associated hepatitis B. Have been.
  • the current methods of preventing and treating hepatitis B targeting HBV include vaccines against HBV, antibodies, interferon, interferon ⁇ , ⁇ amivudine, famiciclovir, lobucavir, acyclovir, ganciclovir, vidarabine ⁇ r ivavirin DNA polymerase inhibitor, etc. (current therapeutics '99 p.85-97, p675-687).
  • vaccines against HBV antibodies, interferon, interferon ⁇ , ⁇ amivudine, famiciclovir, lobucavir, acyclovir, ganciclovir, vidarabine ⁇ r ivavirin DNA polymerase inhibitor, etc.
  • current therapeutics '99 p.85-97, p675-687 Research and development of pectin containing DNA pectin, DNA polymerase inhibitors, immune function enhancers such as IL-112 and thymosin, and therapeutic methods using genes such as antisense
  • Vaccines against HBV have shown some success in preventing hepatitis, but are not effective in patients who are already infected (2000 Pharmaceutical Drug Data Book No. 1 Fuji Keizai Co., Ltd.). Interf Peron is used for chronic hepatitis and is effective in treating 30 to 40% of patients, but is an expensive therapy. Also, side effects are strong (Today's Therapeutics' 99 p.85-97, p675-687, 2000 Prescription Drug Data Book No. 1, Fuji Keizai Co., Ltd., Rev. Med. Virol. 6, 215, 1996). Although DNA polymerase inhibitors have shown some therapeutic effect in patients who have failed interferon, they have strong side effects and are expensive treatments (Rev. Med. Virol. 6, 215, 1996).
  • HDV infection is known to be involved in HBV malignant transformation.
  • the incidence of severe severe hepatitis among acute hepatitis is about 1% in non-HDV-associated HBV hepatitis, but the incidence of severe hepatitis is increased to 2 to 20% in hepatitis D. I do.
  • the rate of progression of chronic hepatitis to cirrhosis and liver cancer is higher in hepatitis D than in non-HDV-associated hepatitis B (Polish, LB et al. Clin. Microbiol. Rev. 6, 211-229, 1993). ).
  • the HDV genome encodes only the hepatitis D virus antigen protein, the replication of the HDV genome is catalyzed by the host RNA polymerase II enzyme, and the hepatitis D virus antigen protein binds to the HDV genome. Indispensable for the proliferation of HDV (Annu. Rev. Biochem. 64, 259, 1995). To date, little has been known about how hepatitis D virus antigens support virus growth.
  • test compound that also inhibits the normal transcriptional function of uninfected cells, as in the system described above. It is an inefficient search method that may be selected, and still requires a search operation to be performed in a P2 level containment environment, and is a dangerous and inefficient search system.
  • RNA polymerase II plays a wide role in host cells and acts on RNA polymerase II. Compounds are likely to also have side effects on uninfected cells. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a safe and efficient method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D.
  • hepatitis D virus antigen which is a viral protein essential for the proliferation of HDV, binds to RNA polymerase II of the host, and that the hepatitis D virus antigen is a hepatitis D virus antigen. They found that they bind to host RNA polymerase II through the C-terminal region, and that the C-terminal region of hepatitis D virus antigen is particularly highly conserved among subspecies and isolates. Furthermore, the following findings (a) to (e) were obtained, and the present invention was completed.
  • the proliferation of HDV can be suppressed by inhibiting the binding of the hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II.
  • (d) searching for a compound that binds to hepatitis D virus antigen or Can be used to search for compounds that bind to the C-terminal region of hepatitis D virus antigen, to inhibit the binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II, or A more effective compound can be narrowed down by a method of searching for a growth inhibitor.
  • Bind a compound selected by inhibiting the binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II or by searching for an inhibitor of HDV proliferation in cells to hepatitis D virus antigen A more effective compound can be narrowed down by searching for a compound or a compound that binds to the C-terminal region of the hepatitis D virus antigen.
  • the present invention relates to the following (1) to (41).
  • HDV antigen polypeptide RNA polymerase II
  • a test compound is added to a system containing polymerase II, the amount of binding between the HD V antigen polypeptide and RNA polymerase II is measured, and the amount of binding is compared with the amount of binding without addition of the test compound.
  • a method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D which comprises selecting a compound that suppresses the binding.
  • the HDV antigen is a polypeptide consisting of one amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3.
  • HDV antigen polypeptide derivative a polypeptide containing a part of the following (hereinafter referred to as HDV antigen polypeptide derivative).
  • a polypeptide comprising a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and which binds to RNA polymerase II.
  • polypeptide consisting of an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and binding to RNA polymerase II.
  • the HDV antigen polypeptide is one or more peptides selected from tag polypeptides, marker peptides and signal peptides, in addition to the polypeptides according to any of (2) to (5).
  • the peptide selected from the marker peptide or the signal peptide is myc polypeptide, -galactosidase, protein II, the IgG binding region of protein II, chloramphenicyl acetyltransferase.
  • a method for searching a therapeutic agent for hepatitis D which comprises adding a test compound to a system containing an HDV antigen polypeptide and selecting a test compound that binds to the HDV antigen polypeptide.
  • HDV antigen polypeptide derivative a polypeptide containing a part of the amino acid sequence of the HDV antigen
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues have been deleted, substituted or added, and which binds to RNA polymerase II.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and binding to RNA polymerase II.
  • the HDV antigen polypeptide is selected from the polypeptides described in any one of (9) to (12), and further selected from a tag peptide, a marker peptide or a signal peptide.
  • the method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (8) which comprises an amino acid sequence to which at least one peptide is added, and binds to RNA polymerase II.
  • a peptide selected from a marker peptide or a signal peptide is myc polypeptide,
  • the transformant according to (18) is cultured in a medium, a polypeptide that binds to RNA polymerase II is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide is collected from the culture.
  • a method for producing a polypeptide that binds to RNA polymerase II is described in detail below.
  • a hepatitis D virus antigen C-terminal region which is a polypeptide comprising one amino acid sequence selected from the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 9 and binding to RNA polymerase II.
  • amino acid sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 9, is composed of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and Hepatitis D virus antigen C-terminal derivative, a polypeptide that binds to merase II.
  • (25) a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 60% or more homology to one amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 4 to 9, and binding to RNA polymerase II Hepatitis D virus antigen C-terminal region derivative.
  • (26) The amino acid sequence obtained by adding a peptide selected from a tag peptide, a marker peptide, or a signal peptide to the polypeptide according to any of (23) to (25). And a hepatitis D virus antigen C-terminal region derivative that is a polypeptide that binds to RNA polymerase II.
  • a peptide selected from a tag peptide, a marker peptide or a signal peptide is a myc polypeptide, ⁇ -galactidase, protein A, an IgG binding region of protein A, chloramphone.
  • Eniconore Acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose-binding polypeptide, glutathione S-transferase, polyhistidine chain, S-peptide, DNA-binding polypeptide domain , Tac antigen, thioredoxin, green'fluorescent protein, FLAG peptide, any antibody epitope and any secreted protein signal peptide (2).
  • a therapeutic agent for hepatitis D comprising the compound according to (28) as an active ingredient.
  • a gene expression promoter comprising all or a part of the amino acid sequence of hepatitis D virus antigen (HDV antigen) and comprising, as an active ingredient, a polybeptide that binds to RNA polymerase II. .
  • (31) The gene expression promoter according to (30), wherein the gene is a tissue, organ or cell-specific gene.
  • liver or hepatocytes The above tissues, organs or cells are liver or hepatocytes, nerves or nerve cells, muscle or muscle cells, fat cells, blood vessels Or a vascular endothelial cell or embryonic hepatocyte. (30) or (31).
  • the gene is a hepatocyte-specific ⁇ -fetoprotein gene, 11 ⁇ -3] 3 gene, 11-40; a gene, an insulin receptor gene or an OATP-C gene; Cell-specific nerve-specific enolase gene, NRSF gene, SCG10 gene, synapsin gene or ELA V gene; muscle cell-specific MyoD gene, myogenin gene, Myf5 gene, MRF4 gene or myosin heavy chain gene; Or the adipocyte-specific PPARv gene, UCP1 gene, PGC-1 gene, lipoprotein lipase gene or apolipoprotein gene, the gene expression promotion according to any of (30) to (32). Agent.
  • a polypeptide comprising a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and which binds to RNA polymerase II;
  • the above-mentioned tissue, organ or cell is a liver or hepatocyte, a nerve or nerve cell, a muscle or muscle cell, a fat cell, a blood vessel or a vascular endothelial cell, or an embryonic hepatocyte ( (36)
  • the gene is a hepatocyte-specific ⁇ -phytoprotein gene, HNF-3j3 gene, HNF-4 gene, insulin receptor gene or OATP-C gene; Specific nerve-specific enolase gene, NRSF gene, SCG10 gene, synapsin gene or ELAV gene; muscle cell-specific MyoD gene, myogenin gene, Myf5 gene, MRF4 gene or myosin heavy chain gene; or adipocyte-specific PPARy gene, UCP1 gene, PGC-1 gene, lipoprotein lipase gene or apolipoprotein gene.
  • the gene expression promoter according to any one of (36) to (38).
  • polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and binding to RNA polymerase II;
  • FIG. 1 shows the identification of the binding region with RNA polymerase II on the hepatitis D virus antigen protein.
  • FIG. 2 shows the inhibition of binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II by a protein.
  • FIG. 3 shows the inhibition of hepatitis D virus transcriptional activation by a protein that inhibits the binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II.
  • FIG. 4 shows the search for a binding inhibitor of hepatitis D virus antigen and RNA polymerase II.
  • FIG. 5 shows the inhibition of binding of hepatitis D virus antigen to: RNA polymerase II by the compounds sought.
  • FIG. 6 shows inhibition of transcriptional activation by hepatitis D virus antigens by the compounds sought.
  • FIG. 7 is an electrophoretogram showing the promoting effect of hepatitis D virus antigen on RNA polymerase II.
  • GST-HDAg Fusion protein of daltathione-S-transferase and hepatitis D virus antigen
  • GST-AC8 fusion protein of daltathione-S-transferase and a protein lacking the C-terminal 8 residues of hepatitis D virus antigen
  • GST-AC16 fusion protein of daltathione-S-transferase and a protein lacking the C-terminal 16 residues of the hepatitis D virus antigen
  • GST—AC24 fusion protein of daltathione-S-transferase and a protein lacking the C-terminal 24 residues of hepatitis D virus antigen
  • GST-AC31 fusion protein of daltathione-S-transferase and a protein with a deletion of the C-terminal 31 residue of hepatitis D virus antigen
  • GST- ⁇ 145 fusion protein of daltathione-S-transferase and a protein lacking the N-terminal 145 residue of hepatitis D virus antigen
  • GST- ⁇ 129 fusion protein between daltathione-S-transferase and a protein with deletion of the N-terminal 129 residue of hepatitis D virus antigen
  • GST- ⁇ 107 Glutathione-S-transferase and hepatitis D A fusion protein with a protein in which the N-terminal 107 residue of the viral antigen has been deleted
  • GST— ⁇ 88 fusion protein of glutathione-S-transferase and a protein in which the N-terminal 88 residue of the hepatitis D virus antigen has been deleted
  • ⁇ C8 Hepatitis D virus antigen with a deletion of the C-terminal 8 residues
  • ⁇ C16 Hepatitis D virus antigen-deleted 16-terminal C-terminal protein
  • ⁇ C24 Protein from which the C-terminal 24 residues of the hepatitis D virus antigen have been deleted
  • ⁇ C31 Protein from which the C-terminal 31 residue of hepatitis D virus antigen has been deleted
  • ⁇ 145 Protein from which the N-terminal 145 residues of the hepatitis D virus antigen have been deleted
  • ⁇ 129 Protein from which the N-terminal 129 residue of the hepatitis D virus antigen has been deleted
  • ⁇ 107 Protein from which the N-terminal 107 residue of hepatitis D virus antigen has been deleted
  • ⁇ 88 Protein from which the N-terminal 88 residue of the hepatitis D virus antigen has been deleted
  • HD A g AC8 Vector containing DNA encoding protein with deletion of 8 residues at C-terminal of hepatitis D virus antigen
  • HDAg AC31 Vector containing DNA encoding a protein with a deletion of the C-terminal 31 residue of hepatitis D virus antigen
  • HD A g ⁇ 88 Vector containing DNA encoding a protein with a deletion of the N-terminal 88 residue of hepatitis D virus antigen
  • Methods for searching for a therapeutic agent for hepatitis D include (1) a method for searching for a compound that inhibits the binding of HDV antigen polypeptide to RNA polymerase II, and (2) a method for searching for a compound that binds to HDV antigen polypeptide. is there.
  • the compound selected in 2 can be narrowed down by the method of 2
  • the compound selected in 1 can be narrowed down by the method 2. Further, if necessary, it can be narrowed down by a known method described in the related art.
  • the test compound is prepared in a system that prepares HDV antigen or HDV antigen polypeptide derivative and RNA polymerase II, and detects the binding between both. And selecting a compound that inhibits the binding between the HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II, using the inhibition of the binding by the test compound as an index.
  • an HDV antigen or an HDV antigen polypeptide derivative is prepared, contacted with a test compound, and bound to the HDV antigen polypeptide using the bond of the test compound as an index.
  • Test compound to be selected.
  • NA polymerase II may be prepared using any known method as long as it can be used in this method. For example, “Basic experimental method for protein 'enzyme”, Reinberg D. and Roeder RG, J. Biol. Chem.
  • RNA polymerase II can be prepared by crushing eukaryotic tissues and cells as an unpurified fraction, a partially purified fraction, and a purified fraction.
  • Eukaryotes may be any known organisms, but mammals are preferred.
  • the tissue may be any known tissue, but is preferably a tissue such as the thymus.
  • any known cells may be used, but cells such as HepG2, HeLa, and 293 cells are preferred.
  • Any known crushing method may be used for crushing the tissues and cells.
  • the tissue may be crushed by a machine using a device such as a Waring blender or a Polytron.
  • a cell nucleus extract can be prepared by a combination of the steps of disruption, solubilization using a surfactant, and centrifugation.
  • a cell nucleus extract can be prepared by a combination of mechanical crushing using a Doimce-type homogenizer or the like, solubilization using a surfactant, and centrifugation.
  • Methods for purifying RNA polymerase II from cell nucleus extracts include fractionation by ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, and the use of RNA polymerase II antibody. There is a method for purification by affinity chromatography.
  • the protein mixture is obtained by changing the salt concentration and pH using a phosphocellulose column, heparin agarose column, DEAE-5PW column, TSK-Fuel column, mono Q column, etc.
  • the amount of RNA polymerase II contained in the fractionated fraction can be measured by, for example, an immunoplot method using an anti-RNA polymerase II antibody.
  • the activity of RNA polymerase II contained in the fractionated fraction was determined by the method described in Kim, WY and Dahmus, ME, J. Biol. Chem. 263, 18880-18885 (1998). It can be used for evaluation.
  • RNA polymerase II Fractions containing a large amount of RNA polymerase II and having high RNA polymerase II activity are collectively referred to as partially purified RNA polymerase II.
  • partially purified RNA polymerase II By repeating the above procedure using about 3 to 6 different columns, highly purified RNA polymerase II can be prepared.
  • an anti-RNA polymerase II antibody such as monoclonal antibody 8WG16 (Babco) or polyclonal antibody C-21 (Santa Cruz; ⁇ ) is used in accordance with Harlow, E. and Lane, D.
  • antibodies Preparation of an affinity column by crosslinking with a chromatographic carrier using the method described in A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (1999). . Thompson NE and Burgess, RR Metnoas Enzymol. 274, 513-526 (1996), etc., and use this column to extract RNA polymerase from cell nucleus extract and partially purified RNA polymerase II fraction. II can be purified.
  • the HDV antigen is a polypeptide having one amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3.
  • the HDV antigen polypeptide derivative is a polypeptide selected from the following groups (i) to (iv).
  • amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, wherein the amino acid sequence comprises one or more amino acid residues deleted, substituted or added; and Polypeptide that binds to Merase II Do.
  • the peptide selected from the tag peptide, marker peptide, and signal peptide used in the present invention is a polypeptide that can maintain the binding activity between the HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II even when it is a fusion polypeptide. Should be fine.
  • myc polypeptide 3-galactosidase, protein A, IgG-binding domain of protein A, chloramphenicol 'acetyltransferase, poly (Arg), poly (G lu), protein G, maltose-binding polypeptide, glutathione S-transferase, polyhistidine chain (His-tag), S-peptide, DNA-binding polypeptide domain, Tac antigen, thioredoxin, green • Phenoleorescent protein (GFP), FLAG peptide, any antibody epitope and any secreted protein signal peptide [Yamakawa Akio, Experimental Medicine, 469-474 (1992) Five) ⁇ .
  • a site-specific mutation was introduced into DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 using the site-directed mutagenesis method described in peptide
  • it can be obtained by introducing a DNA encoding a sequence of an peptide selected from a signal peptide.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added to the HDV antigen polypeptide derivative is not particularly limited, but may be a number that can be deleted, substituted or added by a well-known method such as the site-directed mutagenesis described above. Yes, one to several tens, preferably one to twenty, more preferably one to ten, and even more preferably one to five.
  • HDV antigen polypeptide derivative used in the present invention in order for the HDV antigen polypeptide derivative used in the present invention to have a binding activity to RNA polymerase II, one of the amino acid sequences selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 9 is used, When calculated using [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990) 3, FAS TA [Methods in Enzymology, 183, 63-98 (1990)], etc. (to define% homology) It is preferable to have a homology of at least 60% or more, usually 80% or more, especially 95% or more.
  • the HDV antigen polypeptide used in the present invention is produced by expressing a DNA encoding the HDV antigen polypeptide of the present invention using an in vitro transcription-translation system or in a host cell.
  • an in vitro transcription and translation system known methods [Kigawa T. et al., J. Biomol. Awake, 6, 129 (1998), Spirin AS et al., Science, 242, 1162 (1988), Kigawa T. & Yokoyama S., J. Biochem., 110, 166 (1991)], and an in vitro transcription / translation system can be used.
  • DNA encoding the HDV antigen polypeptide is connected downstream of promoters such as SP6, T7, and T3, and a large amount of the HDV antigen polypeptide RNA is converted in vitro by reacting each promoter-specific RNA polymerase. Then, a cell-free translation system was used, e.g., a heron reticulocyte lysate, a wheat germ extract. An HDV antigen polypeptide can be produced using a translation system.
  • the DNA encoding the peptide can be produced by expressing it in a host cell.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the polypeptide is prepared.
  • a DNA is prepared by substituting the nucleotide sequence of the portion encoding the polypeptide of the present invention so that the nucleotide sequence becomes an optimal codon for expression in a host cell.
  • the DNA is useful for efficient production of the polypeptide of the present invention.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or full-length cDNA downstream of a promoter of an appropriate expression vector.
  • the recombinant vector is transferred to a host cell suitable for the expression vector. Introduce.
  • any cells that can express the target gene such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, can be used.
  • An expression vector that is capable of autonomous replication in the above-mentioned host cell or capable of integration into a chromosome and contains a promoter at a position capable of transcribing the DNA encoding the polypeptide of the present invention. Is used.
  • the recombinant vector containing DNA encoding the polypeptide of the present invention is a prokaryote. It is preferably a vector that is capable of autonomous replication in an organism and is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. A gene that controls a promoter may be included.
  • Is an expression vector for example, pBTrp2, pBTacl, P BTac2 (commercially available from nor any Beri down Gar Mannheim), pKK233- 2 (Pharmacia Inc.), (manufactured by Invitrogen Corp.) pSE280, pGEMEX - 1 (Promega Corporation PQE-8 (manufactured by QIAGEN), pKYPIO (Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem.,
  • Any promoter can be used as long as it functions in the host cell.
  • motors include trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, and T7 promoter, which are derived from E. coli phage.
  • Terp trp promoter
  • lac promoter lac promoter
  • PL promoter PL promoter
  • PR promoter PR promoter
  • T7 promoter which are derived from E. coli phage.
  • artificially designed and modified promoters such as a promoter in which two Ptrps are connected in series (PtrpX 2), a tac promoter, a lacT7 promoter, and a let I promoter can also be used.
  • the liposome binding sequence Shine-Dalgarno It is preferable to use a plasmid in which the distance between the sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange a transcription termination sequence immediately below a structural gene.
  • Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynepacterium, Micropacterium, Pseudomonas, etc., such as Escherichia coli XL1-Blue, Escner ichia col 1 XL2-Blue, Escherichia col 1 D Hl, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escher ichia co ⁇ , Escherichia coli GI698, Escherichia coli TB1, Serrat ia f icaris, Ser ratia font icola, Ser rat ia liquefacie ns, Serrat ia marcescens
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cells.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 , 2110 (1972)], the protoplast method (JP-A-63-248394), or Gene, 17 , 107 (1982) and Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • examples of expression vectors include YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains.
  • Examples include promoters for glycolytic genes such as hexose kinase, PHO5 promoter, PGK promoter, and GA.
  • P promoter ADH promoter, gal promoter, gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MFal promoter, CUP 1 promoter and the like.
  • any method for introducing DNA into yeast can be used.
  • the electroporation method [Methods Enzymol., 194, 182 (1990)] USA, 75, 1929 (1978) 3, lithium acetate method (J. Bacteriology, 153, 163 (1983)), Pro Natl. Acad. Sci. USA, 75 , 1929 (1978).
  • examples of the expression vector include pcDNAI, pcDM8 (manufactured by Funakoshi), pAGE107 [Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-22979. Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAS3-3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), P AGE103 [J. Biochem., 101 , 13 07 (1987) ], can be mentioned pAGE210 like.
  • any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • the promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV) the early promoter of SV40, and the retrovirus Promoters, metabolic thione promoters, heat shock promoters, SRa promoters and the like.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Examples of the host cell include Namalwa cells, which are human cells, COS cells, which are monkey cells, CH0 cells, which are Chinese hamster cells, and HBT5637 (JP-A-63-299).
  • any method can be used as long as DNA can be introduced into animal cells. For example, an electoral poration method [Cytotechnology, 3, 133 (1990) )], The calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], and Virology, 52, 456 (1973). be able to.
  • polypeptide When an insect cell is used as a host, for example, current, proto-conorez, in, molecular 'norosea, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman ana ompany, New York (1992),
  • the polypeptide can be expressed by the method described in Bio / Technology, 6, 47 (1988) and the like.
  • the recombinant gene transfer vector and PacuMouth virus were co-transfected into insect cells to obtain recombinant virus in the insect cell culture supernatant. Later, insect cells can be further infected with the recombinant virus to express the polypeptide.
  • paculovirus examples include viruses that infect night insects, such as Atographa, Californi, Nuclea, Politotro, Winnores, and Autographa calif ornica nuclear polyhedrosis virus). Can be used.
  • Insect cells include Sf9 and Sf ⁇ , ovary cells of Spodoptera frugiperda (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)), and High ovary cells of Trichoplus ia Si. 5 (manufactured by Invitrogen) can be used.
  • examples of the expression vector include Ti plasmid, tobacco mosaic virus vector, and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include the 35S motor of flower mosaic virus (CaMV) and the geneactin 1 promoter. Can be.
  • Host cells include tobacco, potato, tomato, carrot, And plant cells of rice, wheat, wheat, oats, and the like.
  • any method for introducing DNA into plant cells can be used.
  • Agrobacterium JP-A-59-140885, JP-A-59-140885, 60-70080, W094 / 00977
  • the electoral-portion method JP-A-60-251887
  • a method using a particle gun Gene gun
  • Patent No. 2606856, Patent No. 2517813 Patent No. 2606856, Patent No. 2517813
  • a method for expressing a gene in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, and the like can be performed according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition.
  • a sugar or a sugar chain-added polypeptide When expressed by yeast, animal cells, insect cells or plant cells, a sugar or a sugar chain-added polypeptide can be obtained.
  • the transformant of the present invention obtained as described above is cultured in a medium, the polypeptide of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide of the present invention is collected from the culture.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the transformant of the present invention is a transformant obtained using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host
  • the transformant is used as a medium for culturing the transformant.
  • Any of a natural medium and a synthetic medium may be used as long as the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated and can efficiently culture the transformant.
  • Any carbon source may be used as long as the transformant can be assimilated, and glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, Carbohydrates such as starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, etc., or ammonium salts of organic acids, other nitrogen-containing compounds, as well as leptone, meat extract, Yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • Inorganic salts include potassium potassium phosphate, potassium potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. Can be used.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culturing temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culturing time is usually 16 hours to 7 days.
  • It is preferable that pH during culture is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urine, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • isoforms such as isopropyl_j8-D-thiogalactopyranoside and microorganisms transformed with the recombinant vector using the trp promoter are used.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM Medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)]
  • a medium or the like obtained by adding fetal bovine serum or the like to these mediums can be used.
  • Cultivation is usually performed for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and the presence of 5% CO 2.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • Examples of a medium for culturing the transformant obtained using insect cells as a host include commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900II SFM medium (Life Technologies), ExCell Yanagi , ExCell405 (both JRH Biosciences
  • Cultivation is usually performed for 1 to 5 days under conditions of pH 6 to 7 and 25 to 30 ° C.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or by differentiating into a plant cell or organ.
  • a medium for culturing the transformant commonly used Murashige and Skog (MS) medium, white (White) medium, or a plant such as auxin, cytokinin, etc.
  • MS Murashige and Skog
  • White white
  • auxin cytokinin
  • a medium to which a hormone is added can be used.
  • Culture is usually performed at pH 5 to 9, 20 to 40 ° C for 3 to 60 days. Do.
  • an antibiotic such as kanamycin or hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector into which a DNA encoding the polypeptide of the present invention has been incorporated is cultured according to a conventional culture method.
  • the polypeptide can be produced by producing and accumulating the polypeptide and collecting the polypeptide from the culture.
  • a method for expressing a gene in addition to direct expression, secretory production, fusion polypeptide expression, and the like can be performed according to the method described in Molecular 'Cloning, 2nd edition.
  • the method for producing the polypeptide of the present invention includes a method of producing the polypeptide in a host cell, a method of secreting the polypeptide out of the host cell, and a method of producing the polypeptide on the host cell outer membrane.
  • the method can be selected by changing the structure of the polypeptide to be produced.
  • the polypeptide of the present invention is expressed by adding a signal peptide in front of the polypeptide containing the active site of the polypeptide of the present invention using a gene recombination technique. Can be actively secreted out of the host cell.
  • the production can also be increased using a gene amplification system using a folate reductase gene or the like.
  • transgenic non-human animal or plant (transgenic plant) into which the gene has been introduced is created.
  • These individuals can be used to produce the polypeptide of the present invention.
  • the transformant is an animal individual or a plant individual, it is bred or cultivated according to a conventional method to produce and accumulate the polypeptide. Then, the polypeptide can be produced by collecting the polypeptide from the animal or plant individual.
  • the gene can be transformed according to a known method [American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition, 63--, 627S (1996), Bio / Technology, 9, 830 (1991)].
  • a method for producing the polypeptide of the present invention in an animal created by introduction is mentioned.
  • the polypeptide can be produced by collecting the polypeptide.
  • the place of production and accumulation in the animal include milk (JP-A-63-309192), eggs and the like of the animal.
  • Any promoter that can be used in this case can be used as long as it can be expressed in animals. Examples of such promoters include ⁇ -casein promoter, casein promoter, ⁇ -lactoglobulin promoter, Whey acidic protein promoter, etc. Is preferably used.
  • transgenic plants into which DNA encoding the polypeptide of the present invention has been introduced can be prepared by known methods [tissue culture, 20 (1994), tissue culture, 21 (1995), Trends in Biotechnolgy, 15, 45 (1997)], producing and accumulating the polypeptide in the plant, and collecting the polypeptide from the plant to produce the polypeptide. .
  • an ordinary enzyme isolation and purification method can be used.
  • the cells are collected by centrifugation after completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated with a sonicator.
  • the cells are disrupted using a wrench press, mantongaulin homogenizer, dyno mill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method is used, that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent.
  • Jethylaminoethyl (DEAE)-Sepharose anion-exchange chromatography using resins such as DIAI ON HPA-75 (Mitsubishi Kasei), resins such as S-Sepharos e FF (Pharmacia) Chromatography using cation-exchange chromatography with resin, perishable chromatography using resin such as butinoresepharose, phenylsepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatography
  • a purified sample can be obtained by using a focusing method, an electrophoresis method such as isoelectric focusing, or a combination thereof.
  • the polypeptide of the present invention can be produced as a fusion protein with protein A, and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G.
  • the polypeptide of the present invention can be produced as a fusion protein with an F1ag peptide, and purified by affinity chromatography using an anti-F1ag antibody (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes & Dev., 4, 1288 (1990)]. Further, it can be purified by affinity chromatography using an antibody against the polypeptide.
  • the cells When the polypeptide is expressed in an insoluble form in the cells, the cells are similarly recovered, crushed, and centrifuged to obtain the polypeptide as a precipitate fraction. Collect insolubles.
  • the recovered insoluble form of the polypeptide is solubilized with a protein denaturant.
  • the polypeptide is returned to a normal three-dimensional structure by diluting or dialyzing the solubilized solution and reducing the concentration of the protein denaturant in the solubilized solution. After this operation, a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the polypeptide of the present invention or a derivative such as a polypeptide having a sugar chain added to the polypeptide is extracellularly secreted
  • the polypeptide or the polypeptide is added to the culture supernatant.
  • polypeptide obtained in this way for example, Polypeptides having the amino acid sequences described in Nos. 1 to 9 and derivatives thereof can be given.
  • polypeptide of the present invention can be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethinoleoxycanoleponyl method) and the tBoc method (t-butyloxycanoleponyl method). it can.
  • chemical synthesis can be carried out using peptide synthesizers such as hemTech, Nokin Enolema, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel-Vega, PerSeptive, and Shimadzu. it can.
  • the method of reacting HD V antigen polypeptide with RNA polymerase II and the method of detecting the amount of binding may be any method as long as it is a known method that reflects the binding of the polypeptide and RNA polymerase II in cells. .
  • HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II can be converted to solid phase such as beads such as multiwell plate, chromatographic carrier, latex, chip for surface plasmon resonance measurement, and target for mass measurement.
  • an antibody that recognizes physical adsorption, HD V antigen polypeptide or NA polymerase II, or a molecule that specifically recognizes a peptide selected from a tag peptide, a marker peptide, or a signal peptide Immobilized by intermediary binding, and if necessary, a treatment to suppress non-specific adsorption, add the other molecule, wash and remove the unadsorbed other molecule, and remove the H of the other molecule.
  • the polypeptide of the present invention is produced as a fusion protein with another protein, and a substance having an affinity for the fused protein is used to produce the polypeptide from a tag peptide, a marker peptide, or a signal peptide.
  • the selected peptide can also be specifically detected.
  • j8-Galata tosidase, kuram humeniconore acetinoletransferase, glutathione S-transferase, thioredoxin, etc. use their enzyme activity as an index, and Green Fluorescent 'protein (GFP), etc.
  • Indicators include protein A, IgG binding region of protein A, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose-binding polypeptide, poly-histidine chain (His-tag), and DNA binding.
  • the polypeptide domain, etc. uses its specific binding molecule as an index, and the myc polypeptide, S peptide, Tac antigen, FLAG peptide, any antibody peptide, etc. Detection is possible using the binding to the antibody as an index.
  • ⁇ -galactosidase chloramphenicone acetyltransferase, gnoretathione S-transferase, thioredoxin, green 'IgG binding of fluorescein protein (GFP), protein ⁇ , and protein ⁇ Region, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose-binding polypeptide, polyhistidine chain (His-tag), DNA-binding polypeptide domain, etc. also bind to their specific antibodies. Can be detected as an index.
  • the binding specificity of biotin etc. can be used to bind to a solid phase, or the interaction can be detected using the binding specificity of biotin etc., fluorescence, radioactivity, etc. You can also.
  • both the HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II are labeled with an appropriate fluorescent dye, and the hepatitis D virus antigen derivative and RNA polymerase II are bound by fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the method of reacting the HDV antigen polypeptide with the test compound and the method of detecting the binding amount may be any known methods.
  • physical adsorption or HDV antigen polypeptide is applied to solid phase such as beads such as multi-well plate, chromatographic carrier, latex, chip for surface plasmon resonance measurement, target for mass measurement, etc. Immobilized by binding through an antibody that recognizes the antigen polypeptide, or a molecule that specifically recognizes a peptide selected from a tag peptide, a marker peptide, or a signal peptide, and if necessary, nonspecific adsorption
  • the test compound is contacted with the test compound, and the unadsorbed test compound is removed by washing.
  • the test compound can be detected by generation of surface plasmon resonance, signal intensity of mass spectrometry, etc. .
  • test compound bound to the HDV antigen polypeptide can be eluted and detected using a technique such as spectroscopy, fluorescence, or mass spectrometry.
  • a technique such as spectroscopy, fluorescence, or mass spectrometry.
  • the binding of biotin or the like can be made with specificity.
  • Examples of a method for searching for a compound that suppresses the binding between the HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II include the following specific methods.
  • 1) GST fusion Hepatitis D virus antigen recombinant protein is expressed in E. coli or the like. The Escherichia coli was collected and crushed, and the supernatant of the lysate of Escherichia coli containing the obtained GST-fused hepatitis D virus antigen-recombinant protein ⁇ ⁇ 500 g, preferably 1 ⁇ 500 g, was subjected to a daltathione-immobilized carrier 0.1. 10001000 and preferably 1 / zL ⁇ : Affinity beads are formed by binding to LOOwL.
  • the affinity beads are used in the presence or absence of 1 ⁇ to 500 ⁇ , preferably 11 (1 to 100 ⁇ ) of the test compound, RNA polymerase II In ⁇ to 500 ⁇ g, preferably 1 ⁇ g to 500 / g. preferably the solution 5 z L ⁇ 5mL comprising a cell extract or R NA poly main hydrolase II lng ⁇ 500 / ig preferably 1 ⁇ g ⁇ 500 xg of purified preparation containing mixes with 10 Shikakara 1 mL After washing, the bound beads are eluted from the affinity beads by, for example, boiling with an SDS-PAGE sample buffer, and subjected to SDS-PAGE. After electrotransfer onto the PVDF membrane, the amount of bound RNA polymerase II can be detected by a method such as western blotting using an anti-RNA polymerase II antibody.
  • RNA polymerase II For example, add lng-500izg, preferably 1 ⁇ 8-50 ⁇ g of purified preparation of RNA polymerase II to one well of a 96-well microtiter plate and immobilize directly or use anti-RNA polymerase.
  • II antibody lng to 500 ⁇ g, preferably 1 ⁇ g to 50 ⁇ g is added to one well of a 96-well microtiter plate and immobilized, and then: NA polymerase II can be indirectly immobilized. it can.
  • test compound 1 ⁇ to 500 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to l ⁇ , for example, three-fused hepatitis 0 virus Recombinant antigen recombinant protein lng-500 / ⁇ g, preferably 1 ⁇ g-50 ⁇ g is added and allowed to react.After washing, bound hepatitis D virus antigen is easily measured using GST enzyme activity as an index. be able to. For example, when glutathione and CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzene) are added as GST substrates, a reaction product with the maximum absorption at 340 nanometers is synthesized, and this is measured using a plate reader. can do.
  • a method for searching for a compound that binds to the HDV antigen polypeptide includes, for example, lng / mL to 50 mg / mL, preferably 1 / g / mL to 500 ⁇ g / mL of the His-tag sequence fusion hepatitis D virus antigen.
  • the C-terminal region-containing protein is flown over a sensor chip NTA for a BIAC ORE device (manufactured by BI0C0RE), immobilized, and then a solution containing the test compound at 1 ⁇ to 500 ⁇ , preferably 1 ⁇ to 100 ⁇ is flowed, and the sensor is run.
  • a solution containing the test compound at 1 ⁇ to 500 ⁇ preferably 1 ⁇ to 100 ⁇ is flowed, and the sensor is run.
  • the antibody recognizing the polypeptide used in the present invention can be obtained by using a purified preparation of the HDV antigen polypeptide of the present invention or a purified fragment of the partial fragment polypeptide of the polypeptide to obtain a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. And so on.
  • a polyclonal antibody can be prepared by administering the purified sample of the HDV antigen polypeptide of the present invention or a partially fragmented polypeptide of the polypeptide to an animal using the purified sample as an antigen.
  • Animals such as egrets, goats, rats, mice and hamsters can be used as the animals to be administered.
  • the dose of the antigen is preferably 50 to 100 ⁇ g per animal.
  • a low molecular weight peptide it is desirable to use, as an antigen, a peptide obtained by covalently binding a peptide to a carrier protein such as keyhole limpet haemocyanin or bovine thyroglobulin.
  • a peptide serving as an antigen can be synthesized by a peptide synthesizer.
  • the administration of the antigen is performed 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the serum reacts with the antigen used for immunization by enzyme immunoassay [enzyme immunoassay (ELISA): published by Medical Shoin (1) 977), Antibodies-A Laboratory Manual, and old 5pring Harbor Laboratory (1988)].
  • enzyme immunoassay enzyme immunoassay
  • a polyclonal antibody can be obtained by obtaining serum from a non-human mammal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and separating and purifying the serum. .
  • Methods for separation and purification include centrifugation, salting out with 40 to 50% saturated ammonium sulfate, and prillic acid precipitation [Antibodies, A Labora tory manual, old Spring Harbor Laboratory, (1988)], or DEAE-Sepharose column, anion exchange column, Protein A or G-column or chromatographic column using gel filtration column can be used alone or in combination.
  • Antibodies A Labora tory manual, old Spring Harbor Laboratory, (1988)
  • DEAE-Sepharose column anion exchange column
  • Protein A or G-column or chromatographic column using gel filtration column can be used alone or in combination.
  • a rat whose serum shows a sufficient antibody titer against the polypeptide fragment of the polypeptide of the present invention used for immunization is used as a source of antibody-producing cells.
  • the spleen is removed 3 to 7 days after the last administration of the antigenic substance to the rat showing the antibody titer.
  • the spleen is shredded in MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), loosened with forceps, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded. Is treated with Tris-ammonium buffer (pH 7.65) for 1 to 2 minutes to remove red blood cells, washed three times with MEM medium, and the obtained splenocytes are used as antibody-producing cells. .
  • myeloma cells use cell lines obtained from mice or rats.
  • 8-azaguanine-resistant mouse derived from BALB / c
  • myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (hereinafter abbreviated as P3-U1) [(: urr. Topics. Microbiol. Immunol., 8 ⁇ , 1 (1978), Europ.J.
  • These cell lines are 8-azaguanine medium [R Glutamin (1.5 mmol / 1), 2-mercaptoethanol (5 ⁇ 10 " 5 mol / l), gentamicin (10 g / m 1) and fetal calf serum in PM I-164 medium (FCS) (CSL, 10%)-supplemented medium (hereinafter referred to as a normal medium) and further supplemented with 8-azaguanine (15 ⁇ g Zm 1). 3-4 days before normal medium In cultured using the cell 2 X 1 0 7 or more in the fusion.
  • MEM medium or PBS 1.83 g of sodium sodium phosphate, 0.21 g of potassium phosphate, Wash well with 7.65 g of saline, 1 liter of distilled water, pH 7.2
  • the cells in the precipitate fraction thus obtained were thoroughly disintegrated, and the cells were stirred at 37 ° C at 37 ° C per polyethylene antibody-producing cell (polyethylene glycol 100 (PEG-100) at 37 ° C. 0) 2 g, 2 ml of MEM and 0.7 ml of dimethylsulfoxide (DMSO) were added in an amount of 0.2 to 1 ml, and then 1 to 2 ml of MEM medium every 1 to 2 minutes. Add 1 several times.
  • polyethylene antibody-producing cell polyethylene glycol 100 (PEG-100) at 37 ° C. 0
  • PEG-100 polyethylene glycol 100
  • MEM dimethylsulfoxide
  • HAT medium Hypoxanthin (1 CT 4 mol / l), thymidine (1.5 X 1 0- 5 mol / l) and amine Noputeri emissions (4 X 1 0- 7 mol / l) was added medium] is suspended in 1 0 0 ml.
  • the suspension is dispensed into a 96-well culture plate at a rate of 100 ⁇ l / well and cultured at 37 ° C. for 7 to 14 days in a 5% CO 2 incubator. After culturing, a part of the culture supernatant is taken and used for the enzyme immunoassay described in Antibodies, A Laboratory manual, Old spring Harbor Laboratory, Shinapter 14 (1988), etc.
  • a hybrid which specifically reacts with the polypeptide fragment polypeptide of the present invention Select a dormer.
  • the partial fragment polypeptide of the polypeptide of the present invention used as the antigen is coated on an appropriate plate, and the hybridoma culture supernatant or the purified antibody obtained in (d) described below is used as the primary antibody. And then react with an anti-rat or anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, or a radioactive compound as a second antibody, and then react with the labeled substance. Then, those which specifically react with the polypeptide of the present invention are selected as hybridomas producing the monoclonal antibody of the present invention.
  • hybridoma Using the hybridoma, cloning was repeated twice by the limiting dilution method (the first time using HT medium (medium obtained by removing aminopterin from the HAT medium), and the second time using normal medium). Those with a strong antibody titer are selected as the hybridoma strain producing the monoclonal antibody of the present invention.
  • mice 8- to 10-week-old mice or nudes treated with pristane (0.5 ml of 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (Pristane) administered intraperitoneally and bred for 2 weeks)
  • pristane 0.5 ml of 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (Pristane) administered intraperitoneally and bred for 2 weeks
  • the mouse is intraperitoneally injected with 5 to 20 ⁇ 10 6 cells / animal producing the hybridoma cells producing the polypeptide monoclonal antibody of the present invention obtained in (c). In 10 to 21 days, the hybridoma becomes ascites tumor.
  • Ascites is collected from the ascites-tumor-carcinated mouse, and the solid content is removed by centrifugation at 3, OOOrpm for 5 minutes.
  • a monoclonal antibody can be purified and obtained in the same manner as in the polyclonal method.
  • the subclass of the antibody is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or rat monoclonal antibody typing kit.
  • the polypeptide amount is calculated by the Lowry method or from the absorbance at 28 O nm.
  • the pharmaceutical preparation containing the compound obtained in the present invention can contain the compound alone as the active ingredient, or as a mixture with any other active ingredient for treatment.
  • such pharmaceutical preparations are prepared by mixing the active ingredient with one or more pharmacologically acceptable carriers, and by any method well known in the technical field of pharmaceuticals. You.
  • Dosage forms include tablets, powders, granules, and syrups. -up agents, injections soil force s Mel.
  • Liquid preparations suitable for oral administration include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, dalicols such as polyethylene glycol, propylene glycol, sesame oil, It can be manufactured using oils such as olive oil and soybean oil, preservatives such as p-hydroxybenzoic acid esters, and flappers such as strawberry flapper and peppermint.
  • Tablets, powders, granules, and the like include lactose, glucose, sucrose, mannite, and other excipients; starch, sodium alginate and other disintegrants; magnesium stearate, talc, and other lubricants; It can be produced using a binder such as vinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, or gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin.
  • a binder such as vinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, or gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin.
  • Formulations suitable for parenteral administration are preferably isotonic with the blood of the recipient.
  • a sterile aqueous preparation containing the active compound For example, in the case of an injection, a solution for injection is prepared using a carrier composed of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of saline and a glucose solution.
  • parenteral preparations are also selected from the diluents, preservatives, flappers, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers and the like exemplified for the oral preparation.
  • scavenging components may be added.
  • the dose and frequency of administration of the compound obtained according to the present invention vary depending on the mode of administration, the age and weight of the patient, and the nature or severity of the condition to be treated. 0.1 mg to lg, preferably 0.05 to 50 mg, administered once or several times daily. In the case of parenteral administration such as intravenous administration, 0.001 to 100 mg, preferably 0.01 to: LOmg per adult is administered once to several times a day. However, the dose and the number of administrations vary depending on the various conditions described above.
  • Polypeptides containing all or part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the present invention and binding to RNA polymerase II can be various organs, tissues or cells, for example, animal cells, for example, liver or liver Various proteins by promoting the transcription of genes present in cells, nerve or nerve cells, muscle or muscle cells, adipocytes, blood vessels or vascular endothelial cells or embryonic hepatocytes, etc. Production can be promoted.
  • a gene whose transcription is promoted is particularly, but not limited to, a gene that is specifically expressed in the tissue or organ to which the cell belongs.
  • Genes expressed in a tissue, organ or cell-specific manner include, for example, hepatocyte-specific ⁇ -protein protein gene, 11-3] 3 gene, ⁇ NF-4 gene, and insulin receptor gene. Or 0 ⁇ -C gene Nerve cell-specific nerve-specific enolase gene, NRSF gene, SCG10 gene, synapsin gene or ELAV gene; muscle cell-specific MyoD gene, myogenin gene, Myf5 gene, MRF4 gene or myosin heavy chain gene Or an adipocyte-specific PPARv gene, UCP1 gene, PGC-1 gene, lipoprotein lipase gene or apolipoprotein gene.
  • genes that are not necessarily organ- or tissue-specific include, for example, histone HI gene, histone H3 gene, RPB1 gene, RPB2 gene, 3 actin gene, GAPDH gene, DS IFpl60 gene, DSIFpl4 gene, NELF -A gene or NELF-E gene.
  • a polypeptide that contains all or a part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the present invention and binds to RNA polymerase II can be used in a specific tissue or organ in a specific or various When gene expression is desired, it is particularly useful in, for example, regenerative medicine for liver, nerve, muscle, blood vessel, and the like.
  • the polypeptide itself containing all or a part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the present invention and binding to RNA polymerase II may be administered.
  • a gene typically, DNA
  • encoding the above-described polypeptide may be introduced into cells of a target tissue or organ and used for gene therapy. Insertion of the target gene into the cell can be performed using a conventional technique.
  • the present invention provides, as an active ingredient, a polypeptide that contains all or a part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the present invention and that binds to RNA polymerase II. And a gene expression promoter.
  • Said proteins are in particular tissue, organ or cell specific proteins.
  • the above organization The organ or cell is, for example, liver or hepatocyte, nerve or neuron cell, muscle or muscle cell, fat cell, vascular or vascular endothelial cell or embryonic hepatocyte.
  • the composition of the present invention is particularly useful in regenerative medicine of the above-mentioned organ or tissue.
  • the invention also provides, in another embodiment, a polypeptide which comprises all or part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the invention and which binds to RNA polymerase II.
  • Said proteins are in particular tissue, organ or cell specific proteins. Said tissue, organ or cell is, for example, a liver or hepatocyte, a neural or neuronal cell, a muscle or muscle cell, a fat cell, a blood vessel or vascular endothelial cell or an embryonic hepatocyte.
  • the composition of the present invention is particularly useful in the regenerative medicine of the above-mentioned organ or tissue.
  • polypeptide that contains all or a part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the present invention and binds to RNA polymerase II include:
  • a polypeptide comprising a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and which binds to RNA polymerase II;
  • GST-fused hepatitis D virus antigen-recombinant protein was prepared using plasmid PX9 (Makino, S. et al., Nature 329, 343-346 (1987)) into which an HDV genomic fragment was inserted.
  • PCR using the type I oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 as a primer was performed to amplify the gene fragment of the hepatitis D virus antigen.
  • This PCR fragment was cloned into pGEX-6P1 (Amersham Pharmacia Biotech), an expression vector for Escherichia coli, and the recombinant DNA was transformed into Escherichia coli BL-21-CodonPlus-RP (Stratagene).
  • This Escherichia coli was grown in a culture solution containing ampicillin, and the expression of the recombinant protein was induced by adding isopropylthio- ⁇ -D-galactoside to the culture solution.
  • the Escherichia coli was recovered and sonicated to prepare an Escherichia coli lysate containing the recombinant protein.
  • RNA polymerase II bound to the affinity column on which the full-length GST-fused hepatitis D virus antigen was immobilized (lanes 2 and 14 in Fig. 1), but almost completely different from the affinity ram on which only the GST portion was immobilized. No binding (lanes 7, 9 in Figure 1). Therefore, it was suggested that hepatitis D virus antigen and RNA polymerase II specifically bind.
  • the deletion of only 8 amino acids in the carboxy-terminal region impaired the binding to RNA polymerase II ( In FIG.
  • Example 1 Search for a protein that inhibits the binding between hepatitis D virus antigen and RNA polymerase II
  • the proteins shown in Fig. 2 were added to the reaction system for the interaction between hepatitis D virus antigen and RNA polymerase II, and proteins that inhibit the binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II were searched for.
  • the wild-type or various mutants of hepatitis D virus antigen or a gene encoding a protein other than hepatitis D virus antigen were cloned into plasmid pcDNA3 (Invitrogen).
  • TNT T7 Quick Coupled Transcription / Translation Systems Promega Using these recombinant DNAs as type I, transcription and translation reactions were carried out to prepare single proteins or mixtures of [35S] -labeled proteins.
  • mutant hepatitis D virus antigens AC8 and AC31 have a function of inhibiting the binding of wild-type hepatitis D virus antigen to: NA polymerase II.
  • Hepatitis D virus antigen has been reported to adopt a multimeric structure (Xia, YP and Lai, MM, J. Virol. 66, 6631-6648 (1992)).
  • AC8 and AC31 which do not have RNA polymerase II binding activity, inhibit the binding of wild-type hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II by forming a heteromultimer with wild-type hepatitis D virus antigen. It is estimated that
  • Test Example 1 Inhibition of HDV replication by the protein selected in Example 1 The protein selected in Example 1 was expressed in cells, and the inhibition of HDV replication was detected.
  • Plasmid pSVL (D3) (Kuo, MYP. Et al. J. Virol. 63, 1945-1950 (1989)) expressing the wild-type HDV genome was inserted into pcDNA3 with genes encoding various proteins. And transfected into HeLa cells by the calcium phosphate method. Three days after transfection, all RNAs of HeLa cells were extracted using Sepasol reagent (Nacalai Tesque), and 10 micrograms thereof were separated by formamide denaturing agarose gel electrophoresis. The separated RNA was transferred onto a nylon membrane, and the amount of HDV-RNA present on the nylon membrane was quantified by Northern blotting. For detection of HDV-RNA, an oligonucleotide probe having the sequence of SEQ ID NO: 12 specific to HDV-RNA was used. The results are shown in Figure 3.
  • Example 2 Search for low molecular weight compounds that inhibit the interaction between hepatitis D virus antigen and RNA polymerase II
  • the protein of the HeLa cell nuclear fraction rich in RNA polymerase II was immobilized on a 96-well microtiter plate.
  • E. coli lysate containing the GST-fused hepatitis D virus antigen and the compounds contained in the low molecular weight compound library LOPAC (Sigma-RBI) were added to each well and reacted. After washing each well with a buffer to remove unbound proteins and low molecular weight compounds, the remaining amount of GST-fused hepatitis D virus antigen was measured using the GST enzyme activity as an index.
  • the enzyme activity of GST is determined by adding a GST substrate, CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzene), to each well, and using a plate reader device to generate a reaction product that has a maximum absorption at 340 nm. It was determined by measurement.
  • Test Example 2 Inhibition of transcriptional activation by hepatitis D virus antigen by the compound selected in Example 2
  • the protein factor DSIF DRB sensitivity-inducing factor
  • NELF nonegati ve elongation factor
  • P-TEFb positive transcription elongation factor b
  • the transcription reaction in the test tube was performed by mixing 20 micrograms of HeLa cell nuclear extract and 0.125 micrograms of plasmid pTF3-6C2AT (Wada, T. et al. Genes Dev. 12, 343-356) as ⁇ -type DNA. ATP, CTP, U'TP and [a-32P] UTP were added. If necessary, hepatitis D virus antigen and low molecular weight compounds were added to the reaction. The synthesized transcripts were separated by urea-denatured polyacrylamide gel electrophoresis, and the synthesized amount was quantified using an image analyzer STORM (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). Fig. 6 shows the results.
  • STORM image analyzer
  • each compound was added in the presence or absence of DRB without adding hepatitis D virus antigen
  • compounds a, f, and h almost completely suppressed transcription and directly suppressed RNA polymerase II activity.
  • compounds e and g inhibit the binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II, thereby enhancing the transcription promoting effect of hepatitis D virus antigen. was found to inhibit.
  • RNA polymerase II can perform a transcription elongation reaction by skipping the transcription initiation reaction in a transcription reaction using deoxycytidine-tilted DNA as type III.
  • RNA polymerase II and deoxycytidine-tilted DNA were mixed, and ATP, GTP, CTP, UTP and [ ⁇ -32 ⁇ ] UTP were added thereto, and the mixture was reacted for 8 minutes or 16 minutes.
  • Hepatitis D virus antigen and ⁇ -amanitin were added as needed.
  • the synthesized transcripts were separated by urea-denatured polyacrylamide gel electrophoresis, and the amount of synthesis was quantified using an image analyzer STORM (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). Fig. 7 shows the results.
  • RNA polymerase II synthesized RNA at a low rate When no hepatitis D virus antigen was added, RNA polymerase II synthesized RNA at a low rate (lanes 1 and 2). When wild-type hepatitis D virus antigen was added, RNA polymerase II synthesized RNA at a high rate (lanes 5, 6). On the other hand, when a mutant hepatitis D virus antigen that does not bind to RNA polymerase II was added, RNA polymerase II synthesized RNA at a low rate (lanes 9, 10). The addition of ⁇ -amanitin, an inhibitor of RNA polymerase II, completely inhibited RN ⁇ synthesis in all cases.
  • RNA polymerase II RNA polymerase II-linked hepatitis D virus
  • Hepatitis D virus antigen was introduced into human hepatoma-derived Huh7 cells using a viral vector to prepare cells that constantly express hepatitis D virus antigen. RNA was prepared from these cells and the original Huh7 cells, respectively, and gene expression analysis was performed using Gene Chip (manufactured by Affymetrix). Some of the results are shown in the table below.
  • RNA polymerase II The transcription reaction by RNA polymerase II is composed of a series of elementary processes, namely, initiation, elongation, and termination. Transcription of this The extension reaction takes several minutes to one day. The time required depends on the length of each gene. The transcription elongation reaction is an important rate-limiting step for long genes and genes that require rapid expression control.
  • Hepatitis D virus antigen binds to RNA polymerase II and significantly activates the transcription elongation reaction. Its activation affects a relatively wide range of genes. Therefore, by expressing the hepatitis D virus antigen in cells using an appropriate expression system, expression of various genes can be promoted in the transcription elongation stage. In addition, if a protein obtained by fusing a hepatitis D virus antigen with a base sequence-specific DNA-binding domain or RNA-binding domain is used, the hepatitis D virus antigen can be bound to a specific gene and a specific gene can be bound. It can be used to control the expression of E. coli. Industrial applicability
  • a safe and efficient search method for a therapeutic agent for hepatitis D can be provided.

Abstract

A test compound is added to a system containing the full amino acid sequence of hepatitis D virus antigen (hereinafter referred to as HDV antigen) or a part of the same, a polypeptide binding to RNA polymerase II (hereinafter referred to as HDV antigen polypeptide) and RNA polymerase II. Then the binding level of the HDV antigen polypeptide to RNA polymerase II is measured and compared with the corresponding binding level in the absence of the test compound. Thus, a compound inhibiting the binding is screened. Also, a test compound is added to a system containing the HDV antigen polypeptide and thus a compound capable of binding to the HDV antigen polypeptide is screened.

Description

明 細 書  Specification
D型肝炎治療剤の探索方法 発明の分野 FIELD OF THE INVENTION Field of the Invention
本発明は D型肝炎治療剤の探索方法に関する。 背景技術  The present invention relates to a method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D. Background art
D型肝炎ウィルス （以下 HDVという） は、 B型肝炎ウィルス （ H B V) 存在下でのみ増殖し単独で増殖することはない不完全なゥ ィルスであり、 HD Vの増殖は B型肝炎ウィルス （以下 HB Vとい う） に依存している。 そこで、 これまで、 HDV伴性 B型肝炎 （ 「 D型肝炎」 と略す） の治療には、 HDV非伴性 B型肝炎の治療と同 様に、 HB Vを標的とした治療法が応用されてきた。  Hepatitis D virus (HDV) is an incomplete virus that grows only in the presence of hepatitis B virus (HBV) and does not grow alone. HB V). Therefore, to treat HDV-associated hepatitis B (abbreviated as “hepatitis D”), therapies targeting HBV have been applied in the same manner as in the treatment of non-HDV-associated hepatitis B. Have been.
現在行われている H B Vを標的とした B型肝炎の予防、 治療法と しては、 HB Vに対するワクチン、 抗体、イ ンターフェロ ン 、 イ ン ターフェ口ン β、 丄 amivudine、 famiciclovir、 lobucavir、 acyclovir 、 ganciclovir、 vidarabine^ r ivavirin の DNAポリ メラーセ阻 害剤等の投与によるものが挙げられる （今日の治療薬' 99 p.85-9 7、 p675-687) 。 D N Aヮクチンを含むヮクチン、 DNAポリ メ ラ ーゼ阻害剤や、 I L一 1 2や thymosin等の免疫機能亢進剤、 アンチ センスゃリ ボザィム等の遺伝子を用いた治療法等の開発研究が現在 進行中である （明日の新薬 2 0 0 1年 2月株式会社テクノ ミ ック  The current methods of preventing and treating hepatitis B targeting HBV include vaccines against HBV, antibodies, interferon, interferon β, 丄 amivudine, famiciclovir, lobucavir, acyclovir, ganciclovir, vidarabine ^ r ivavirin DNA polymerase inhibitor, etc. (current therapeutics '99 p.85-97, p675-687). Research and development of pectin containing DNA pectin, DNA polymerase inhibitors, immune function enhancers such as IL-112 and thymosin, and therapeutic methods using genes such as antisense ribozyme are ongoing. (Tomorrow's New Drugs February 2001 Techno Mic Co., Ltd.
HB Vに対するワクチンは、 肝炎の予防には一定の成果を挙げて いるが、 すでに感染している患者に対しては有効ではない （2000医 療用医薬品データーブック No.1 株式会社富士経済） 。 イ ンターフ ヱロ ンは、 慢性肝炎に対して用いられ、 3 0〜 4 0 %の患者に治療 効果を挙げているが、 高価な療法である。 また、 副作用も強い （今 日の治療薬' 99 p.85-97、 p675-687、 2000医療用医薬品データー ブック No, 1 株式会社富士経済、 Rev. Med. Virol. 6, 215， 1996 ) 。 DN Aポリ メ ラーゼ阻害剤は、 イ ンターフェロ ンが無効な患者 に対して一定の治療効果を挙げているが、 副作用も強く、 高価な療 法である （Rev. Med. Virol. 6, 215, 1996) 。 B型肝炎の治療に 主に用いられている既存薬である DN Aポリ メラーゼ阻害剤ゃィン ターフェ ロ ンは、 D型肝炎の治療に有効ではないことが最近報告さ れている ( Hepatology 30,546, 1999、 J. Viral Hepat. 7, 428、 2 000) 。 Vaccines against HBV have shown some success in preventing hepatitis, but are not effective in patients who are already infected (2000 Pharmaceutical Drug Data Book No. 1 Fuji Keizai Co., Ltd.). Interf Peron is used for chronic hepatitis and is effective in treating 30 to 40% of patients, but is an expensive therapy. Also, side effects are strong (Today's Therapeutics' 99 p.85-97, p675-687, 2000 Prescription Drug Data Book No. 1, Fuji Keizai Co., Ltd., Rev. Med. Virol. 6, 215, 1996). Although DNA polymerase inhibitors have shown some therapeutic effect in patients who have failed interferon, they have strong side effects and are expensive treatments (Rev. Med. Virol. 6, 215, 1996). It has recently been reported that the DNA polymerase inhibitor zinc interferon, an existing drug mainly used for the treatment of hepatitis B, is not effective in the treatment of hepatitis D (Hepatology 30,546 , 1999, J. Viral Hepat. 7, 428, 20000).
H D Vの感染は、 H B Vの悪性化に関与していることが知られて いる。 即ち、 H D V非伴性 H B V肝炎では、 急性肝炎の中でも特に 重篤な激症肝炎の発症率は 1パーセン ト程度だが、 D型肝炎では、 激症肝炎の発症率は 2〜 2 0パーセントに上昇する。 また、 慢性肝 炎が肝硬変や肝癌に進行する割合は、 HDV非伴性 B型肝炎よ り も D型肝炎の方が高い （Polish, L.B. et al. Clin. Microbiol. Rev . 6,211-229, 1993)。  HDV infection is known to be involved in HBV malignant transformation. In other words, the incidence of severe severe hepatitis among acute hepatitis is about 1% in non-HDV-associated HBV hepatitis, but the incidence of severe hepatitis is increased to 2 to 20% in hepatitis D. I do. In addition, the rate of progression of chronic hepatitis to cirrhosis and liver cancer is higher in hepatitis D than in non-HDV-associated hepatitis B (Polish, LB et al. Clin. Microbiol. Rev. 6, 211-229, 1993). ).
上述のごとく、 HDVの感染は、 H B Vの悪性化に関与してい るが、 有効な治療法は知られていない。 HD Vを標的とした開発研 究も、 唯一 C h i r o n社が、 H D Vワクチンの利用に関する研究 を報告していたが、 1 9 9 3年以降、 報告が無い （明日の新薬 2 0 0 1年 2月株式会社テクノ ミ ック） 。  As mentioned above, infection with HDV is involved in HBV malignancy, but no effective treatment is known. In the case of development research targeting HDV, only Chiron reported a study on the use of the HDV vaccine, but no report has been reported since 1993. Tsuki Corporation Techno Mic).
HD Vのゲノムは D型肝炎ウィルス抗原タンパク質のみをコー ド すること、 HDVゲノムの複製は、 宿主の R N Aポリ メラーゼ I I 酵素によって触媒されること、 D型肝炎ウィルス抗原タンパク質は H D Vゲノムと結合し、 HDVの増殖に不可欠であることなどが報 告されている （Annu. Rev. Biochem. 64, 259, 1995) 。 し力、し、 D型肝炎ウィルス抗原がどのよ うな働きによってウィルス増殖を支 持しているかについては、 現在までほとんど解明されていない。 The HDV genome encodes only the hepatitis D virus antigen protein, the replication of the HDV genome is catalyzed by the host RNA polymerase II enzyme, and the hepatitis D virus antigen protein binds to the HDV genome. Indispensable for the proliferation of HDV (Annu. Rev. Biochem. 64, 259, 1995). To date, little has been known about how hepatitis D virus antigens support virus growth.
これらの既存の知識を基に D型肝炎治療剤を探索するとすれば、 HB V， HDVの両方が感染した細胞を用いる探索系が考えられる が、 作業者への感染した場合には、 重篤な肝疾患を引き起こす確立 が高く、 大変危険な作業となるとともに、 非感染細胞が有する正常 な転写機能をも阻害する被験化合物を選択してしまう可能性のある 効率の悪い探索方法である。 また、 HD Vの RNAゲノムを発現す るプラスミ ドを導入した哺乳動物細胞を被験薬剤で処理し、 被験薬 剤による HDVの RNAの転写の抑制や HDV抗原タンパク質の発 現の抑制を検出する系も考えられる [Kuo， M. Y. et al. , J. Virol . 63, 1945-1950 (1989)]が、 上記の系と同様に、 非感染細胞が有 する正常な転写機能をも阻害する被験化合物を選択してしまう可能 性のある効率の悪い探索方法であるとともに、 依然として、 P2レべ ルの封じ込め環境下で探索作業を行わねばならず、 危険で、 作業性 の悪い探索系である。  To search for a therapeutic agent for hepatitis D based on these existing knowledge, a search system that uses cells infected with both HBV and HDV is conceivable. This is an inefficient search method that is highly likely to cause severe liver disease, is a very dangerous task, and may select test compounds that also inhibit the normal transcription function of uninfected cells. In addition, a mammalian cell transfected with a plasmid that expresses the HDV RNA genome is treated with a test agent to detect the suppression of HDV RNA transcription and HDV antigen protein expression by the test agent. [Kuo, MY et al., J. Virol. 63, 1945-1950 (1989)] found that a test compound that also inhibits the normal transcriptional function of uninfected cells, as in the system described above. It is an inefficient search method that may be selected, and still requires a search operation to be performed in a P2 level containment environment, and is a dangerous and inefficient search system.
HD Vには 3種類の亜種が知られており、 その塩基配列は亜種に よって著しく異なる [Casey, J. L. et al. , Proc. Natl. Acad. Sc i. USA, 90, 9016-9020 (1993), Casey J. L. and Gerin J. し， J. Virology 72, 2806-2814 (1998)]。 また増殖の過程で様々な 変異を起こすため、 単離株によってもその塩基配列は大きく異なる 。 そこで、 安全を確保しつつ、 上記の HB V， HDVの両方が感染 した細胞を用いる採索系を用いても、 該探索系に用いた亜種にしか 作用しない化合物を選択してしまう可能性が高い。  Three subspecies of HDV are known, and their nucleotide sequences differ significantly depending on the subspecies [Casey, JL et al., Proc. Natl. Acad. ScI. USA, 90, 9016-9020 ( 1993), Casey JL and Gerin J. J. Virology 72, 2806-2814 (1998)]. In addition, since various mutations occur during the growth process, the nucleotide sequences of the isolates vary greatly. Therefore, while securing safety, even if a mining system using cells infected with both HBV and HDV is used, there is a possibility that a compound that acts only on the subspecies used in the search system may be selected. Is high.
また、 一般にウィルスは増殖の過程で、 様々な変異を起こし、 薬 剤に対する耐性株が出現することが知られている。 そこで、 安全を 確保しつつ、 上記の HB V， HDVの両方が感染した細胞を用いる 探索系を用いても、 耐性株が容易に出現する可能性が高い。 In addition, it is generally known that a virus causes various mutations in the course of propagation, and a resistant strain to a drug emerges. So, safety Even if a search system using cells infected with both HBV and HDV is used, it is highly likely that resistant strains will easily appear.
安全な探索方法として、 RNAポリ メラーゼ I Iの阻害剤を探索 する方法も考えられるが、 RN Aポリ メラーゼ I I は宿生細胞内に おいて幅広い役割を担っており、 RNAポリ メラーゼ I Iに作用す る化合物は、 非感染細胞にも副作用を及ぼす可能性が高い。 発明の開示  As a safe search method, a method of searching for an inhibitor of RNA polymerase II can be considered, but RNA polymerase II plays a wide role in host cells and acts on RNA polymerase II. Compounds are likely to also have side effects on uninfected cells. Disclosure of the invention
本発明の目的は、 D型肝炎治療剤の安全で効率的な探索方法を提 供することにある。  An object of the present invention is to provide a safe and efficient method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D.
発明者らは、 鋭意検討の結果、 HDVの増殖に必須なウィルスタ ンパク質である D型肝炎ウィルス抗原が宿主の RNAポリメラーゼ I I と結合すること、 D型肝炎ウィルス抗原は D型肝炎ウィルス抗 原の C末端領域を介して、 宿主 RNAポリ メラーゼ I I と結合する こと、 D型肝炎ウィルス抗原の C末端領域は、 亜種間および単離株 間での保存性が特に高いことを見出した。 さらに、 以下 （a) 〜（e) の知見を得、 本発明を完成した。  The present inventors have conducted intensive studies and found that hepatitis D virus antigen, which is a viral protein essential for the proliferation of HDV, binds to RNA polymerase II of the host, and that the hepatitis D virus antigen is a hepatitis D virus antigen. They found that they bind to host RNA polymerase II through the C-terminal region, and that the C-terminal region of hepatitis D virus antigen is particularly highly conserved among subspecies and isolates. Furthermore, the following findings (a) to (e) were obtained, and the present invention was completed.
(a) D型肝炎ウィルス抗原と RNAポリ メラーゼ I I との結合を阻 害することによつて HDVの増殖を抑制できる。  (a) The proliferation of HDV can be suppressed by inhibiting the binding of the hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II.
(b) D型肝炎ウィルス抗原に結合する化合物を探索するこ と、 或い は、 D型肝炎ウィルス抗原 C末端領域に結合する化合物を採索する ことによって、 H D V感染細胞においてのみ作用を発揮し、 非感染 細胞に副作用を及ぼさない化合物を選択できる。  (b) By searching for a compound that binds to the hepatitis D virus antigen, or by searching for a compound that binds to the C-terminal region of the hepatitis D virus antigen, it exerts its effect only on HDV-infected cells. A compound that does not have a side effect on uninfected cells can be selected.
(c) D型肝炎ウィルス抗原 C末端領域に結合する化合物を探索する ことによって、 HDVの亜種に広く作用する可能性、 および、 耐性 株の出現を抑制できる可能性が高い化合物が選択できる。  (c) By searching for a compound that binds to the C-terminal region of the hepatitis D virus antigen, it is possible to select a compound that has a high possibility of acting broadly on HDV subspecies and a high possibility of suppressing the emergence of resistant strains.
(d) D型肝炎ウィルス抗原に結合する化合物を探索すること、 或い は、 D型肝炎ウィルス抗原 C末端領域に結合する化合物を探索する ことによって選択された化合物を、 D型肝炎ウィルス抗原と R N A ポリ メラーゼ I I の結合を阻害すること、 あるいは、 細胞内におけ る HDVの増殖抑制剤を採索する方法によって更に有効な化合物を 絞り込むことができる。 (d) searching for a compound that binds to hepatitis D virus antigen, or Can be used to search for compounds that bind to the C-terminal region of hepatitis D virus antigen, to inhibit the binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II, or A more effective compound can be narrowed down by a method of searching for a growth inhibitor.
(e)D型肝炎ウィルス抗原と RNAポリ メラーゼ I I の結合を阻害 すること、 あるいは、 細胞内における HDVの増殖抑制剤を探索す る方法によって選択された化合物を、 D型肝炎ウィルス抗原に結合 する化合物を探索すること、 あるいは、 D型肝炎ウィルス抗原 C末 端領域に結合する化合物を探索することによって更に有効な化合物 を絞り込むことができる。  (e) Bind a compound selected by inhibiting the binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II or by searching for an inhibitor of HDV proliferation in cells to hepatitis D virus antigen A more effective compound can be narrowed down by searching for a compound or a compound that binds to the C-terminal region of the hepatitis D virus antigen.
従って、 本発明は以下 （ 1 ) 〜 （ 4 1 ) の発明に関する。  Accordingly, the present invention relates to the following (1) to (41).
( 1 ) D型肝炎ウィルス抗原 （以下 HD V抗原という） のアミ ノ酸配列の全部または一部を含み、 かつ RNAポリ メラーゼ I I と 結合するポリペプチド （以下 HD V抗原ポリペプチドという） と R NAポリ メラーゼ I I とを含む系中に被験化合物を添加し、 該 HD V抗原ポリペプチドと RNAポリ メラーゼ I I との結合量を測定し 、 該結合量と被験化合物無添加の結合量とを比較して、 該結合を抑 制している化合物を選択することを特徴とする D型肝炎治療剤の探 索方法。  (1) A polypeptide that contains all or part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (hereinafter referred to as HDV antigen) and binds to RNA polymerase II (hereinafter referred to as HDV antigen polypeptide) and RNA A test compound is added to a system containing polymerase II, the amount of binding between the HD V antigen polypeptide and RNA polymerase II is measured, and the amount of binding is compared with the amount of binding without addition of the test compound. A method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D, which comprises selecting a compound that suppresses the binding.
( 2 ) H D V抗原ポリペプチドが、 HD V抗原のアミノ酸配列 の全部を含むポリペプチドである （ 1 ) .記載の D型肝炎治療剤の探 索方法。  (2) The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (1), wherein the HDV antigen polypeptide is a polypeptide containing the entire amino acid sequence of the HDV antigen.
( 3 ) HDV抗原が、 配列番号 1、 2および 3記載のアミ ノ酸 配列から選ばれる一つのァミノ酸配列からなるポリペプチドである (3) The HDV antigen is a polypeptide consisting of one amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3.
( 2 ) 記載の D型肝炎治療剤の探索方法。 (2) The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (2).
( 4) HDV抗原ポリペプチドが、 HDV抗原のアミノ酸配列 の一部を含むポリペプチ ド （以下 HD V抗原ポリぺプチド誘導体と いう） である （ 1 ) 記載の D型肝炎治療剤の探索方法。 (4) the amino acid sequence of the HDV antigen (1) The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (1), which is a polypeptide containing a part of the following (hereinafter referred to as HDV antigen polypeptide derivative).
( 5 ) HDV抗原ポリペプチ ド誘導体が、 下記 （i) 〜（： iv)の 群から選ばれるものである （ 4 ) 記載の D型肝炎治療剤の探索方法  (5) The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (4), wherein the HDV antigen polypeptide derivative is selected from the following groups (i) to (: iv):
(i) HDV抗原の C末端から N末端に向かって 1 0 0残基以内の C末端ァミ ノ酸配列からなり、 かつ RNAポリ メ ラーゼ I I と結合 するポリペプチ ド。 (i) A polypeptide comprising a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and which binds to RNA polymerase II.
(ii) 配列番号 4〜 9のいずれかに記载のァミ ノ酸配列で示される ポリペプチ ド。  (ii) a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 9;
(iii) 配列番号 1〜 9のいずれかに記载のァミ ノ酸配列において 、 1以上のアミ ノ酸残基が欠失、 置換もしく は付加されたアミ ノ酸 配列からなり、 かつ RNAポリ メ ラーゼ I I と結合するポリべプチ ド、。  (iii) an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, wherein one or more amino acid residues are deleted, substituted or added, and A polypeptide, which binds to polymerase II.
(iv) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のァミ ノ酸配列と 60%以上 の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メ ラーゼ I I と結合するポリべプチ ド。  (iv) A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and binding to RNA polymerase II.
( 6 ) HD V抗原ポリペプチ ドが、 （ 2 ) 〜 （ 5 ) のいずれか に記載のポリペプチ ドに、 さ らにタグペプチ ド、 マーカーペプチド またはシグナルぺプチ ドよ り選ばれる一つ以上のぺプチ ドが付加さ れたアミ ノ酸配列からなり、 かつ RNAポリ メ ラーゼ I I と結合す るものである （ 1 ) 記載の D型肝炎治療剤の探索方法。  (6) The HDV antigen polypeptide is one or more peptides selected from tag polypeptides, marker peptides and signal peptides, in addition to the polypeptides according to any of (2) to (5). (1) The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (1), which comprises an amino acid sequence to which an amino acid sequence is added and binds to RNA polymerase II.
( 7 ) マーカーペプチ ドまたはシグナルペプチ ドよ り選ばれる ペプチ ドが、 m y cポリペプチ ド、 -ガラク トシダーゼ、 プロテ イ ン Α、 プロテイ ン Αの I g G結合領域、 ク ロ ラムフヱニコ一ル . ァセチルトランスフェラーゼ、 ポリ （A r g ) 、 ポリ （G l u) 、 プロテイ ン G、 マルトース結合ポリぺプチ ド、 ダルタチオン S-ト ランスフェラーゼ、 ポリ ヒスチジン鎖、 Sペプチ ド、 DNA結合ポ リペプチ ド ドメイ ン、 T a c抗原、 チォレ ドキシン、 グリーン - フ ルォレツセン ト . プロテイ ン、 F L AGペプチド、 任意の抗体のェ ピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルべプチドからなる群よ り選ばれるペプチドである （ 6 ) 記載の D型肝炎治療剤の探索方法 (7) The peptide selected from the marker peptide or the signal peptide is myc polypeptide, -galactosidase, protein II, the IgG binding region of protein II, chloramphenicyl acetyltransferase. , Poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose-binding polypeptide, daltathione S- Transferase, polyhistidine chain, S-peptide, DNA-binding polypeptide domain, Tac antigen, thioredoxin, green-fluorescein.Protein, FLAG peptide, any antibody epitope and any secreted protein The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (6), which is a peptide selected from the group consisting of the following signal peptides:
( 8 ) HD V抗原ポリペプチドを含む系中に被験化合物を添加 し、 該 HDV抗原ポリべプチ ドと結合する被験化合物を選択するこ とを特徴とする D型肝炎治療剤の探索方法。 (8) A method for searching a therapeutic agent for hepatitis D, which comprises adding a test compound to a system containing an HDV antigen polypeptide and selecting a test compound that binds to the HDV antigen polypeptide.
( 9 ) HDV抗原ポリペプチドが、 HDV抗原のアミノ酸配列 の全部を含むポリペプチドである （ 8 ) 記載の D型肝炎治療剤の探 索方法。  (9) The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (8), wherein the HDV antigen polypeptide is a polypeptide containing the entire amino acid sequence of the HDV antigen.
( 1 0 ) H D V抗原が、 配列番号 1、 2および 3記载のァミ ノ 酸配列から選ばれる一つのアミ ノ酸配列からなるポリペプチドであ る （ 9 ) 記載の D型肝炎治療剤の探索方法。  (10) The therapeutic agent for hepatitis D according to (9), wherein the HDV antigen is a polypeptide comprising one amino acid sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, and 3. Search method.
( 1 1 ) HDV抗原ポリペプチドが、 HDV抗原のアミノ酸配 列の一部を含むポリペプチド （以下 HDV抗原ポリペプチド誘導体 という） である （ 8 ) 記載の D型肝炎治療剤の採索方法。  (11) The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (8), wherein the HDV antigen polypeptide is a polypeptide containing a part of the amino acid sequence of the HDV antigen (hereinafter referred to as HDV antigen polypeptide derivative).
( 1 2 ) H D V抗原ポリぺプチド誘導体が、 下記 （i) 〜（iv) の群から選ばれるものである （ 1 1 ) 記載の D型肝炎治療剤の探索 方法。  (12) The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (11), wherein the HDV antigen polypeptide derivative is selected from the following groups (i) to (iv).
(i) HDV抗原の C末端から N末端に向かって 1 0 0残基以内の C末端ァミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メラーゼ I I と結合 するポリペプチド。  (i) A polypeptide consisting of a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and which binds to RNA polymerase II.
(ϋ) 配列番号 4〜 9のいずれかに記載のアミ ノ酸配列で示される ポリペプチ ド。  (ii) a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 9;
(iii) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のアミ ノ酸配列において 、 1以上のアミ ノ酸残基が欠失、 置換もしく は付加されたアミ ノ酸 配列からなり、 かつ RNAポリ メラーゼ I I と結合するポリぺプチ ド'。 (iii) In the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues have been deleted, substituted or added, and which binds to RNA polymerase II.
(iv) 配列番号 1〜 9のいずれかに記载のァミ ノ酸配列と 60%以上 の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり 、 かつ R N Aポリ メ ラーゼ I I と結合するポリぺプチ ド。  (iv) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and binding to RNA polymerase II.
( 1 3 ) H D V抗原ポリペプチ ドが、 （ 9 ) 〜 （ 1 2) のいず れかに記載のポリペプチ ドに、 さ らにタグペプチ ド、 マーカーぺプ チ ドまたはシグナルペプチ ドよ り選ばれる一つ以上のペプチ ドが付 加されたァミ ノ酸配列からなり、 かつ R NAポリ メ ラーゼ I I と結 合するものである （ 8 ) 記載の D型肝炎治療剤の操索方法。  (13) The HDV antigen polypeptide is selected from the polypeptides described in any one of (9) to (12), and further selected from a tag peptide, a marker peptide or a signal peptide. (8) The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (8), which comprises an amino acid sequence to which at least one peptide is added, and binds to RNA polymerase II.
( 1 4 ) マーカーぺプチ ドまたはシグナルぺプチ ドよ り選ばれ るペプチ ドが、 m y cポリペプチ ド、 |8 -ガラク トシダーゼ、 プロ ティ ン A、 プロテイ ン Aの I g G結合領域、 ク ロ ラムフエ二コール ' ァセチルトランスフェラーゼ、 ポリ （A r g ) 、 ポリ （G l u) (14) A peptide selected from a marker peptide or a signal peptide is myc polypeptide, | 8-galactosidase, protein A, the IgG binding region of protein A, chloramphene. Nicole's acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu)
、 プロテイ ン G、 マルトース結合ポリペプチ ド、 グルタチオン S- トランスフェラーゼ、 ポリ ヒ スチジン鎖、 Sペプチ ド、 DNA結合 ポリペプチ ド ドメイ ン、 T a c抗原、 チォレ ドキシン、 グリ ーン ' フルォレツセン ト · プロテイ ン、 F L AGペプチ ド、 任意の抗体の ェピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルぺプチ ドからなる群 よ り選ばれるペプチ ドである （13) 記載の D型肝炎治療剤の探索方 法。 , Protein G, maltose-binding polypeptide, glutathione S-transferase, polyhistidine chain, S-peptide, DNA-binding polypeptide domain, Tac antigen, thioredoxin, green 'fluorescent protein, FL AG (13) The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to (13), which is a peptide selected from the group consisting of a peptide, a peptide of any antibody, and a signal peptide of any secreted protein.
( 1 5 ) ( 2 ) 〜 （ 7 ) 、 （ 9 ) 〜 （ 1 4 ) のいずれかに記载 のポリペプチ ドをコー ドする DNA。  (15) A DNA encoding the polypeptide described in any one of (2) to (7) and (9) to (14).
( 1 6 ) ( 1 5 ) 記載の DNAとス ト リ ンジェントな条件下で ハイプリ ダイズする DN Aであり、 かつ該 DN Aがコー ドするポリ ペプチ ドが RNAポリ メ ラーゼ I I と結合するポリペプチ ドをコー ドする D N A。 (16) A DNA that hybridizes with the DNA of (15) under stringent conditions, and wherein the polypeptide encoded by the DNA binds to RNA polymerase II. The DNA to be loaded.
( 1 7 ) ( 1 5 ) または （ 1 6 ) 記載の DNAをベクターに組 み込んで得られる耝換え体 DNA。  (17) A recombinant DNA obtained by incorporating the DNA according to (15) or (16) into a vector.
( 1 8 ) ( 1 7 ) 記載の組換え体 DNAを保有する形質転換体  (18) A transformant having the recombinant DNA according to (17).
( 1 9 ) ( 1 8 ) 記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中 に RNAポリ メラーゼ I I と結合するポリぺプチドを生成蓄積させ 、 該培養物から該ポリぺプチ ドを採取することを特徴とする R N A ポリ メラーゼ I I と結合するポリべプチ ドの製造方法。 (19) The transformant according to (18) is cultured in a medium, a polypeptide that binds to RNA polymerase II is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide is collected from the culture. A method for producing a polypeptide that binds to RNA polymerase II.
( 2 0 ) ( 2 ) 〜 （ 7 ) 、 （ 9 ) 〜 （ 1 4) のいずれかに記载 のポリべプチドを認識する抗体。  (20) An antibody that recognizes the polypeptide described in any one of (2) to (7) and (9) to (14).
( 2 1 ) ( 1 5 ) または （ 1 6 ) に記載の DN Aの塩基配列を 記録した電子媒体。  (21) An electronic medium on which the DNA sequence of DNA described in (15) or (16) is recorded.
( 2 2) ( 2) 〜 （ 7 ) 、 ( 9 ) 〜 （ 1 4) のいずれかに記載 のポリぺプチド配列を記録した電子媒体。  (22) An electronic medium on which the polypeptide sequence according to any one of (2) to (7) and (9) to (14) is recorded.
( 2 3 ) 配列番号 4〜 9に記载のァミノ酸配列から選ばれる一 つのアミノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メラーゼ I I と結合す るポリペプチドである D型肝炎ウイルス抗原 C末端領域。  (23) A hepatitis D virus antigen C-terminal region which is a polypeptide comprising one amino acid sequence selected from the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4 to 9 and binding to RNA polymerase II.
( 2 4) 配列番号 4〜 9記载のァミ ノ酸配列から選ばれる一つ のアミ ノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換もしくは 付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メ ラーゼ I I と 結合するポリぺプチドである D型肝炎ウィルス抗原 C末端領域誘導 体。  (24) In one amino acid sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 9, the amino acid sequence is composed of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and Hepatitis D virus antigen C-terminal derivative, a polypeptide that binds to merase II.
( 2 5 ) 配列番号 4 ~ 9記載のァミノ酸配列から選ばれる一つ のァミ ノ酸配列と 60%以上の相同性を有するァミノ酸配列からなり 、 かつ RNAポリ メラーゼ I I と結合するポリペプチドである D型 肝炎ウィルス抗原 C末端領域誘導体。 ( 2 6 ) ( 2 3 ) 〜 （ 2 5 ) のいずれかに記載のポリペプチド に、 タグペプチド、 マーカーペプチド、 またはシグナルペプチ ドよ り選ばれるぺプチ ドが付加されたァミ ノ酸配列からなり、 かつ RN Aポリ メラーゼ I I と結合するポリペプチドである D型肝炎ウィル ス抗原 C末端領域誘導体。 (25) a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 60% or more homology to one amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 4 to 9, and binding to RNA polymerase II Hepatitis D virus antigen C-terminal region derivative. (26) The amino acid sequence obtained by adding a peptide selected from a tag peptide, a marker peptide, or a signal peptide to the polypeptide according to any of (23) to (25). And a hepatitis D virus antigen C-terminal region derivative that is a polypeptide that binds to RNA polymerase II.
( 2 7 ) タグペプチド、 マーカ一ペプチドまたはシグナルぺプ チドよ り選ばれるペプチドが、 m y cポリペプチド、 β -ガラ ク シダーゼ、 プロテイ ン A、 プロテイ ン Aの I g G結合領域、 ク ロ ラ ムフ エニコーノレ . ァセチルトランスフェラーゼ、 ポリ （A r g ) 、 ポリ （G l u) 、 プロテイ ン G、 マルトース結合ポリペプチド、 グ ルタチオン S -トランスフェラーゼ、 ポリ ヒ スチジン鎖、 Sぺプチ ド、 DN A結合ポリぺプチドドメイ ン、 T a c抗原、 チォレ ドキシ ン、 グリーン ' フルォレツセン ト · プロテイ ン、 F L AGペプチ ド 、 任意の抗体のェピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルぺプ チドからなる群よ り選ばれるペプチ ドである （ 2 6 ) 記載の D型肝 炎ウィルス抗原 C末端領域誘導体。  (27) A peptide selected from a tag peptide, a marker peptide or a signal peptide is a myc polypeptide, β-galactidase, protein A, an IgG binding region of protein A, chloramphone. Eniconore. Acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose-binding polypeptide, glutathione S-transferase, polyhistidine chain, S-peptide, DNA-binding polypeptide domain , Tac antigen, thioredoxin, green'fluorescent protein, FLAG peptide, any antibody epitope and any secreted protein signal peptide (2). 6) The derivative of hepatitis D virus antigen C-terminal region described in the above.
( 2 8 ) ( 1 ) 〜 （ 1 4) のいずれかに記載の探索方法により 得られる化合物。  (28) A compound obtained by the search method according to any one of (1) to (14).
( 2 9 ) ( 2 8 ) 記載の化合物を有効成分として含有する D型 肝炎の治療剤。  (29) A therapeutic agent for hepatitis D, comprising the compound according to (28) as an active ingredient.
( 3 0 ) D型肝炎ウィルス抗原 （HDV抗原） のアミ ノ酸配列の 全部または一部分を含み、 かつ RNAポリ メラーゼ IIと結合するポ リベプチドを有効成分と して含んでなる、 遺伝子の発現促進剤。  (30) A gene expression promoter comprising all or a part of the amino acid sequence of hepatitis D virus antigen (HDV antigen) and comprising, as an active ingredient, a polybeptide that binds to RNA polymerase II. .
( 3 1 ) 上記遺伝子が、 組織、 器官または細胞特異的遺伝子であ る （ 3 0 ) に記載の遺伝子発現促進剤。  (31) The gene expression promoter according to (30), wherein the gene is a tissue, organ or cell-specific gene.
( 3 2 ) 上記の組織、 器官または細胞が、 肝臓もしくは肝細胞、 神経もしく は神経細胞、 筋肉もしくは筋肉細胞、 脂肪細胞、 血管も しく は血管内皮細胞または胚性肝細胞である （ 3 0 ) または （ 3 1 ) に記載に遺伝子発現促進剤。 (32) The above tissues, organs or cells are liver or hepatocytes, nerves or nerve cells, muscle or muscle cells, fat cells, blood vessels Or a vascular endothelial cell or embryonic hepatocyte. (30) or (31).
( 3 3 ) 前記遺伝子が、 肝細胞特異的な α —フエ トプロティン遺 伝子、 11^-3]3遺伝子、 11 -40；遺伝子、 イ ンス リ ンレセプター遺伝 子もしくは OATP- C遺伝子 ； 神経細胞特異的な神経特異的エノラーゼ 遺伝子、 NRSF遺伝子、 SCG10遺伝子、 シナプシン遺伝子もしく は ELA V遺伝子 ； 筋肉細胞特異的な MyoD遺伝子、 マイオジェニン遺伝子、 M yf5遺伝子、 MRF4遺伝子もしく はミオシン重鎖遺伝子 ； または脂肪 細胞特異的な PPARv遺伝子、 UCP1遺伝子、 PGC- 1遺伝子、 リポプロ ティンリパーゼ遺伝子もしく はァポリポプロティン遺伝子である、 ( 3 0 ) 〜 （ 3 2 ) のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤。  (33) The gene is a hepatocyte-specific α-fetoprotein gene, 11 ^ -3] 3 gene, 11-40; a gene, an insulin receptor gene or an OATP-C gene; Cell-specific nerve-specific enolase gene, NRSF gene, SCG10 gene, synapsin gene or ELA V gene; muscle cell-specific MyoD gene, myogenin gene, Myf5 gene, MRF4 gene or myosin heavy chain gene; Or the adipocyte-specific PPARv gene, UCP1 gene, PGC-1 gene, lipoprotein lipase gene or apolipoprotein gene, the gene expression promotion according to any of (30) to (32). Agent.
( 3 4) 器官または組織の再生医療用である （ 3 0 ) 〜 （ 3 3 ) のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤。  (34) The gene expression promoter according to any of (30) to (33), which is used for regenerative medicine of an organ or a tissue.
( 3 5 ) 前記の D型肝炎ウィルス抗原 （HDV抗原） のアミ ノ酸 配列の全部または一部分を含み、 かつ RNAポリ メラーゼ IIと結合 するポリペプチドが、  (35) A polypeptide that contains all or a part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) and binds to RNA polymerase II,
(i) HD V抗原の C末端から N末端に向かって 1 0 0残基以内 の C末端ァミノ酸配列からなり、 かつ RNAポリ メラーゼ I I と結 合するポリぺプチド ；  (i) a polypeptide comprising a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and which binds to RNA polymerase II;
(ii) 配列番号 4〜 9のいずれかに記载のァミノ酸配列で示され るポリペプチド ；  (ii) a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 9;
(iii) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のアミノ酸配列におい て、 1以上のアミノ酸残基が欠失、 置換もしく は付加されたァミ ノ 酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メラーゼ I I と結合するポリぺプ チド ； または  (iii) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9 comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues have been deleted, substituted or added; and A binding polypeptide; or
(iv) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のァミ ノ酸配列と 60%以 上の相同性を有するアミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メ ラー ゼ I I と結合するポリペプチド ； (iv) an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and an RNA polymerase A polypeptide that binds to Ze II;
である、 （ 3 0 ) 〜 （ 3 4 ) のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤 The gene expression promoter according to any one of (30) to (34),
( 3 6 ) D型肝炎ウィルス抗原 （HDV抗原） のアミ ノ酸配列の 全部または一部分を含み、 かつ RNAポリ メラーゼ IIと結合するポ リペプチ ドをコードする DN Aを有効成分と して含んでなる、 遺伝 子の発現促進剤。 (36) Contains, as an active ingredient, DNA that contains all or part of the amino acid sequence of hepatitis D virus antigen (HDV antigen) and encodes a polypeptide that binds to RNA polymerase II , Gene expression promoter.
( 3 7 ) 上記遺伝子が、 組織または器官特異的タンパク質である ( 3 6 ) に記載の遺伝子発現促進剤。  (37) The gene expression promoter according to (36), wherein the gene is a tissue or organ-specific protein.
( 3 8 ) 上記の組織、 器官または細胞が、 肝臓もしく は肝細胞、 神経もしく は神経細胞、 筋肉もしくは筋肉細胞、 脂肪細胞、 血管も しくは血管内皮細胞または胚性肝細胞である （ 3 6 ) または （ 3 7 ) に記載に遺伝子発現促進剤。  (38) The above-mentioned tissue, organ or cell is a liver or hepatocyte, a nerve or nerve cell, a muscle or muscle cell, a fat cell, a blood vessel or a vascular endothelial cell, or an embryonic hepatocyte ( (36) The gene expression promoter according to (37).
( 3 9 ) 前記遺伝子が、 肝細胞特異的な α—フエ トプロテイ ン遺 伝子、 HNF- 3j3遺伝子、 HNF- 4ひ遺伝子、 イ ンス リ ンレセプター遺伝 子もしく は OATP- C遺伝子 ； 神経細胞特異的な神経特異的エノラーゼ 遺伝子、 NRSF遺伝子、 SCG10遺伝子、 シナプシン遺伝子もしくは ELA V遺伝子 ； 筋肉細胞特異的な MyoD遺伝子、 マイオジェニン遺伝子、 M yf5遺伝子、 MRF4遺伝子もしくはミオシン重鎖遺伝子 ； または脂肪 細胞特異的な PPARy遺伝子、 UCP1遺伝子、 PGC- 1遺伝子、 リポプロ ティンリパーゼ遺伝子もしく はァポリポプロティン遺伝子である、 (39) the gene is a hepatocyte-specific α-phytoprotein gene, HNF-3j3 gene, HNF-4 gene, insulin receptor gene or OATP-C gene; Specific nerve-specific enolase gene, NRSF gene, SCG10 gene, synapsin gene or ELAV gene; muscle cell-specific MyoD gene, myogenin gene, Myf5 gene, MRF4 gene or myosin heavy chain gene; or adipocyte-specific PPARy gene, UCP1 gene, PGC-1 gene, lipoprotein lipase gene or apolipoprotein gene.
( 3 6 ) 〜 （ 3 8 ) のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤。 The gene expression promoter according to any one of (36) to (38).
( 4 0 ) 器官または組織の再生医療用である （ 3 6 ) 〜 （ 3 9 ) のいずれか記載の遺伝子発現促進剤。  (40) The gene expression promoter according to any one of (36) to (39), which is for regenerative medicine of an organ or tissue.
( 4 1 ) 前記の D型肝炎ウィルス抗原 （HDV抗原） のアミノ酸 配列の全部または一部分を含み、 かつ RN Aポリ メラーゼ IIと結合 するポリペプチドが、 (i) HDV抗原の C末端から N末端に向かって 1 0 0残基以内 の C末端アミ ノ酸配列からなり、 かつ RNAポリ メラーゼ I I と結 合するポリぺプチド ； (41) a polypeptide which comprises all or part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) and binds to RNA polymerase II, (i) a polypeptide comprising a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen and binding to RNA polymerase II;
(ii) 配列番号 4〜 9のいずれかに記載のァミ ノ酸配列で示され るポリペプチド ；  (ii) a polypeptide represented by the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 4 to 9;
(iii) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のアミ ノ酸配列におい て、 1以上のアミ ノ酸残基が欠失、 置換もしくは付加されたァミ ノ 酸配列からなり、 かつ RN Aポリ メラーゼ I I と結合するポリぺプ チド ； または  (iii) an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 9, and A polypeptide that binds to Merase II; or
(iv) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のアミ ノ酸配列と 60%以 上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メラー ゼ I I と結合するポリペプチド ；  (iv) a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and binding to RNA polymerase II;
である、 （ 3 6 ) 〜 （ 4 0 ) のいずれかに記載の遺伝子発現促進剤 The gene expression promoter according to any one of (36) to (40),
図面の簡単な説明 BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 D型肝炎ウィルス抗原タンパク質上の RN Aポリ メラー ゼ I I との結合領域の同定を示す。  FIG. 1 shows the identification of the binding region with RNA polymerase II on the hepatitis D virus antigen protein.
図 2は、 タンパク質による D型肝炎ウィルス抗原と R N Aポリ メ ラーゼ I I の結合阻害を示す。  FIG. 2 shows the inhibition of binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II by a protein.
図 3は、 D型肝炎ウィルス抗原と RNAポリ メ ラーゼ I I の結合 を阻害するタンパク質による、 D型肝炎ウィルスによる転写活性化 の阻害を示す。  FIG. 3 shows the inhibition of hepatitis D virus transcriptional activation by a protein that inhibits the binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II.
図 4は、 D型肝炎ウィルス抗原と RNAポリ メラーゼ I Iの結合 阻害剤の探索を示す。  FIG. 4 shows the search for a binding inhibitor of hepatitis D virus antigen and RNA polymerase II.
図 5は、 探索された化合物による D型肝炎ウィルス抗原と： RN A ポリ メラ一ゼ I I の結合阻害を示す。 図 6は、 探索された化合物による、 D型肝炎ウィルス抗原による 転写活性化の阻害を示す。 FIG. 5 shows the inhibition of binding of hepatitis D virus antigen to: RNA polymerase II by the compounds sought. FIG. 6 shows inhibition of transcriptional activation by hepatitis D virus antigens by the compounds sought.
図 7は、 D型肝炎ウィルス抗原の、 RN Aポリ メ ラ-ゼ IIに対す る促進効果を示す電気泳動図である。  FIG. 7 is an electrophoretogram showing the promoting effect of hepatitis D virus antigen on RNA polymerase II.
符号の説明 Explanation of reference numerals
G S T -HDA g ： ダルタチオン- S-トランスフェラーゼと D型肝 炎ウィルス抗原の融合タンパク質  GST-HDAg: Fusion protein of daltathione-S-transferase and hepatitis D virus antigen
G S T - AC8： ダルタチオン - S-ト ラ ンスフェラーゼと D型肝炎ゥ ィルス抗原の C末端 8残基が欠失したタンパク質との融合タンパク 質  GST-AC8: fusion protein of daltathione-S-transferase and a protein lacking the C-terminal 8 residues of hepatitis D virus antigen
G S T - AC16： ダルタチオン- S-ト ラ ンスフェラーゼと D型肝炎ゥ ィルス抗原の C末端 16残基が欠失したタンパク質との融合タンパク 質  GST-AC16: fusion protein of daltathione-S-transferase and a protein lacking the C-terminal 16 residues of the hepatitis D virus antigen
G S T— AC24 : ダルタチオン- S-トランスフェラーゼと D型肝炎ゥ ィルス抗原の C末端 24残基が欠失したタンパク質との融合タ ンパク 質  GST—AC24: fusion protein of daltathione-S-transferase and a protein lacking the C-terminal 24 residues of hepatitis D virus antigen
G S T - AC31： ダルタチオン- S-トランスフェラーゼと D型肝炎ゥ ィルス抗原の C末端 31残基が欠失したタンパク質との融合タンパク 質  GST-AC31: fusion protein of daltathione-S-transferase and a protein with a deletion of the C-terminal 31 residue of hepatitis D virus antigen
G S T ： ダルタチオン- S-ト ラ ンスフェラーゼ  GST: daltathione-S-transferase
G S T - ΔΝ145： ダルタチオン- S-トランスフェラーゼと D型肝炎 ウィルス抗原の N末端 145残基が欠失したタンパク質との融合タン パク質  GST-ΔΝ145: fusion protein of daltathione-S-transferase and a protein lacking the N-terminal 145 residue of hepatitis D virus antigen
G S T - ΔΝ129： ダルタチオン- S-トランスフェラーゼと D型肝炎 ウィルス抗原の N末端 129残基が欠失したタンパク質との融合タン パク質  GST-ΔΝ129: fusion protein between daltathione-S-transferase and a protein with deletion of the N-terminal 129 residue of hepatitis D virus antigen
G S T - ΔΝ107： グルタチオン- S-トランスフェラーゼと D型肝炎 ウィルス抗原の N末端 107残基が欠失したタンパク質との融合タ ン パク質 GST-ΔΝ107: Glutathione-S-transferase and hepatitis D A fusion protein with a protein in which the N-terminal 107 residue of the viral antigen has been deleted
G S T— ΔΝ88： グルタチオン- S-トランスフェラーゼと D型肝炎ゥ ィルス抗原の N末端 88残基が欠失したタンパク質との融合タンパク 質  GST—ΔΝ88: fusion protein of glutathione-S-transferase and a protein in which the N-terminal 88 residue of the hepatitis D virus antigen has been deleted
△ C8： D型肝炎ウィルス抗原の C末端 8残基が欠失したタンパク質 ΔC8: Hepatitis D virus antigen with a deletion of the C-terminal 8 residues
△ C16： D型肝炎ウィルス抗原の C末端 16残基が欠失したタンパク 質 △ C16: Hepatitis D virus antigen-deleted 16-terminal C-terminal protein
△ C24： D型肝炎ウィルス抗原の C末端 24残基が欠失したタンパク 質  ΔC24: Protein from which the C-terminal 24 residues of the hepatitis D virus antigen have been deleted
△ C31： D型肝炎ウィルス抗原の C末端 31残基が欠失したタンパク 質  ΔC31: Protein from which the C-terminal 31 residue of hepatitis D virus antigen has been deleted
ΔΝ145： D型肝炎ウィルス抗原の N末端 145残基が欠失したタンパ ク質  ΔΝ145: Protein from which the N-terminal 145 residues of the hepatitis D virus antigen have been deleted
ΔΝ129： D型肝炎ウィルス抗原の N末端 129残基が欠失したタンパ ク質  ΔΝ129: Protein from which the N-terminal 129 residue of the hepatitis D virus antigen has been deleted
ΔΝ107： D型肝炎ウィルス抗原の N末端 107残基が欠失したタンパ ク質  ΔΝ107: Protein from which the N-terminal 107 residue of hepatitis D virus antigen has been deleted
ΔΝ88： D型肝炎ウイルス抗原の N末端 88残基が欠失したタンパク 質  ΔΝ88: Protein from which the N-terminal 88 residue of the hepatitis D virus antigen has been deleted
HD A g AC8： D型肝炎ウィルス抗原の C末端 8残基が欠失したタ ンパク質をコー ドする DNAを含むベクター  HD A g AC8: Vector containing DNA encoding protein with deletion of 8 residues at C-terminal of hepatitis D virus antigen
H D A g AC31 ： D型肝炎ウィルス抗原の C末端 31残基が欠失した タンパク質をコー ドする DNAを含むベクター  HDAg AC31: Vector containing DNA encoding a protein with a deletion of the C-terminal 31 residue of hepatitis D virus antigen
HD A g ΔΝ88： D型肝炎ウィルス抗原の N末端 88残基が欠失した タンパク質をコー ドする DNAを含むベクター  HD A g ΔΝ88: Vector containing DNA encoding a protein with a deletion of the N-terminal 88 residue of hepatitis D virus antigen
D R B ： 5， 6- dichloro_l - ]3 -D - r ibofuranosylbenzimidazole 5， 6 -ジク口 口- 1_ j3 - D-リボフラノシルベンジミダゾーノレ 発明の実施の形態 DRB: 5, 6-dichloro_l-] 3 -D-r ibofuranosylbenzimidazole 5, 6-Dig mouth Mouth-1_ j3-D-ribofuranosylbenzimidazonole Embodiment of the invention
以下、 本発明について、 詳細に説明する。  Hereinafter, the present invention will be described in detail.
D型肝炎治療剤の探索方法には、 ① HD V抗原ポリペプチドと R NAポリ メラーゼ I I の結合を抑制する化合物を探索する方法、 ② HD V抗原ポリぺプチドに結合する化合物を探索する方法がある。 ②で選択された化合物を①の方法で絞り込むこと、 ①で選択された 化合物を②で絞り込むこともできる。 更に、 必要に応じて、 従来の 技術に記載した公知の方法で、 絞り込むことができる。  Methods for searching for a therapeutic agent for hepatitis D include (1) a method for searching for a compound that inhibits the binding of HDV antigen polypeptide to RNA polymerase II, and (2) a method for searching for a compound that binds to HDV antigen polypeptide. is there. The compound selected in ② can be narrowed down by the method of ②, and the compound selected in ① can be narrowed down by the method ②. Further, if necessary, it can be narrowed down by a known method described in the related art.
以下に、 ①、 ②の方法を詳述する。  The methods of ① and ② are described below in detail.
① H D V抗原ポリペプチ ドと RNAポリメラーゼ I Iの結合を抑制 する化合物を探索する方法では、 H D V抗原或いは H D V抗原ポリ ぺプチド誘導体と RNAポリ メラーゼ I I を調製し、 両者の結合を 検出する系に、 被験化合物を加え、 被験化合物による該結合の抑制 を指標に、 HDV抗原ポリペプチドと RNAポリ メ ラーゼ I I の結 合を抑制する化合物を選択する。  (1) In the method of searching for a compound that inhibits the binding between HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II, the test compound is prepared in a system that prepares HDV antigen or HDV antigen polypeptide derivative and RNA polymerase II, and detects the binding between both. And selecting a compound that inhibits the binding between the HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II, using the inhibition of the binding by the test compound as an index.
② HD V抗原ポリペプチドに結合する化合物を探索する方法では、 H D V抗原あるいは HDV抗原ポリべプチド誘導体を調製し、 被験 化合物と接触させ、 被験化合物の結合を指標に、 HDV抗原ポリべ プチドと結合する被験化合物を選択する。  (2) In the method of searching for a compound that binds to the HDV antigen polypeptide, an HDV antigen or an HDV antigen polypeptide derivative is prepared, contacted with a test compound, and bound to the HDV antigen polypeptide using the bond of the test compound as an index. Test compound to be selected.
こ こで用いる： NAポリ メ ラーゼ I I は、 本法に使える限り、 公 知のいかなる方法を用いて調製しても良く、 例えば 「蛋白質'酵素 の基礎実験法」 、 Reinberg D. and Roeder R. G. , J. Biol. Chem. As used herein: NA polymerase II may be prepared using any known method as long as it can be used in this method. For example, "Basic experimental method for protein 'enzyme", Reinberg D. and Roeder RG, J. Biol. Chem.
262, 3310-3321 (1987) .Thompson N. E. and Burgess, R. R. , Met hods Enzymol. 274, 513 - 526 (1996), Lu H et al.， Proc. Natl. A cad. Sci. USA 88, 10004-10008 (1991)などに記載の方法を用いて 、 調製することができる。 262, 3310-3321 (1987) Thompson NE and Burgess, RR, Met hods Enzymol. 274, 513-526 (1996), Lu H et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA 88, 10004-10008 (1991) Can be prepared.
R N Aポリ メラーゼ I I は、 真核生物の組織、 細胞を破砕し、 未 精製画分、 部分精製画分、 精製画分と して調製することができる。 真核生物と しては、 公知のいかなる生物でも良いが、 哺乳類が好ま しい。 組織と しては、 公知のいかなる組織でも良いが、 胸腺等の組 織が好ましい。 細胞と しては、 公知のいかなる細胞でも良いが、 H e p G 2、 H e L a、 2 9 3細胞等の細胞が好ましい。 組織、 細胞 の破碎方法と しては、 公知のいかなる破砕方法でも良いが、 組織か らは、 ワーリ ング ブレンダー （War ing bl ender) やポリ ト ロ ン （ Polyt ron) 等の装置を用いた機械的破砕、 界面活性剤を用いた可溶 化、 遠心分離等の操作を組み合わせることによって、 細胞核抽出液 を調製することができる。 培養細胞からは、 Doimce型ホモジナイザ 一等を用いた機械的破砕や界面活性剤を用いた可溶化、 遠心分離等 の操作を組み合わせることによって、 細胞核抽出液を調製すること ができる。 細胞核抽出液から R N Aポリ メラーゼ I I を精製する方 法と しては、 ィオン交換ク口マ トグラフィ一や疎水性ク ロマ トグラ フィ一等によつて分画する方法や、 R N Aポリ メラーゼ I I抗体を 用いたァフィ二ティクロマ トグラフィーによつて精製する方法があ る。  RNA polymerase II can be prepared by crushing eukaryotic tissues and cells as an unpurified fraction, a partially purified fraction, and a purified fraction. Eukaryotes may be any known organisms, but mammals are preferred. The tissue may be any known tissue, but is preferably a tissue such as the thymus. As the cells, any known cells may be used, but cells such as HepG2, HeLa, and 293 cells are preferred. Any known crushing method may be used for crushing the tissues and cells. The tissue may be crushed by a machine using a device such as a Waring blender or a Polytron. A cell nucleus extract can be prepared by a combination of the steps of disruption, solubilization using a surfactant, and centrifugation. From cultured cells, a cell nucleus extract can be prepared by a combination of mechanical crushing using a Doimce-type homogenizer or the like, solubilization using a surfactant, and centrifugation. Methods for purifying RNA polymerase II from cell nucleus extracts include fractionation by ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, and the use of RNA polymerase II antibody. There is a method for purification by affinity chromatography.
前者の方法の場合、 ホスホセルロースカラム、 へパリ ンァガロー スカラム、 DEAE- 5PWカラム、 TSK-フエ二ルカラム、 mono Qカラムな どを用い、 塩濃度や pHを変化させることによって、 タンパク質の混 合物を分画することができる。 分画した画分に含まれる R N Aポリ メラーゼ I I の量は、 抗 R N Aポリ メラーゼ I I抗体を用いた免疫 プロ ッ ト法等によつて測定することができる。 分画した画分に含ま れる R N Aポリ メラーゼ I I の活性は、 Kim， W. Y. and Dahmus , M . E.， J. Bi o l. Chem. 263 , 18880-18885 ( 1998 ) 記載の方法等を 用いて評価するこ とができる。 RNAポリ メ ラーゼ I Iが多く含ま れ、 RNAポリ メ ラーゼ I I の活性が高い画分をまとめて、 部分精 製された RNAポリ メ ラーゼ I I とする。 3ないし 6種類程度の異な るカラムを用いて以上の操作を繰り返すこ とによって、 高度に精製 された RN Aポリ メ ラーゼ I I を調製するこ とができる。 In the case of the former method, the protein mixture is obtained by changing the salt concentration and pH using a phosphocellulose column, heparin agarose column, DEAE-5PW column, TSK-Fuel column, mono Q column, etc. Can be fractionated. The amount of RNA polymerase II contained in the fractionated fraction can be measured by, for example, an immunoplot method using an anti-RNA polymerase II antibody. The activity of RNA polymerase II contained in the fractionated fraction was determined by the method described in Kim, WY and Dahmus, ME, J. Biol. Chem. 263, 18880-18885 (1998). It can be used for evaluation. Fractions containing a large amount of RNA polymerase II and having high RNA polymerase II activity are collectively referred to as partially purified RNA polymerase II. By repeating the above procedure using about 3 to 6 different columns, highly purified RNA polymerase II can be prepared.
後者の方法の場合、 抗 RN Aポリ メ ラーゼ I I抗体、 例えばモノ ク ローナル抗体 8WG16 (Babco社製） やポリ ク ローナル抗体 C- 21 (Sa nta Cruz社;^) 等を、 Harlow, E. and Lane , D. Using antibodies ： A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, New York, USA (1999) 記載の方法等を用い てク ロマ トグラフィー担体と架橋し、 ァフィ二ティーカラムを調製 。 Thompson N. E. and Burgess , R. R. Metnoas Enzymol. 274 , 513-526 (1996) 記載の方法等によ り、 このカラムを用いて、 細胞 核抽出液や RN Aポリ メ ラーゼ I I部分精製画分から RNAポリ メ ラーゼ I I を精製するこ とができる。  In the latter method, an anti-RNA polymerase II antibody, such as monoclonal antibody 8WG16 (Babco) or polyclonal antibody C-21 (Santa Cruz; ^), is used in accordance with Harlow, E. and Lane, D. Using antibodies: Preparation of an affinity column by crosslinking with a chromatographic carrier using the method described in A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (1999). . Thompson NE and Burgess, RR Metnoas Enzymol. 274, 513-526 (1996), etc., and use this column to extract RNA polymerase from cell nucleus extract and partially purified RNA polymerase II fraction. II can be purified.
HDV抗原とは、 配列番号 1、 2、 及び 3記載のアミ ノ酸配列か ら選択される一つのァミ ノ酸配列を有するポリぺプチ ドである。 H DV抗原ポリペプチド誘導体とは、 下記 （i) 〜 （iv) の群から選 ばれるポリべプチ ドである。  The HDV antigen is a polypeptide having one amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3. The HDV antigen polypeptide derivative is a polypeptide selected from the following groups (i) to (iv).
(i) HDV抗原の C末端から N末端に向かって 1 0 0残基以内の C末端アミ ノ酸配列からなり、 かつ： N Aポリ メ ラーゼ I I と結合 するポリペプチ ド。  (i) A polypeptide comprising a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and: a polypeptide that binds to NA polymerase II.
(ii) 配列番号 4〜 9のいずれかに記载のァミ ノ酸配列で示される ポリペプチ ド。  (ii) a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 9;
(iii) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のアミ ノ酸配列において 、 1以上のアミ ノ酸残基が欠失、 置換もしく は付加されたアミ ノ酸 配列からなり、 かつ; N Aポリ メ ラーゼ I I と結合するポリぺプチ ド、。 (iii) the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, wherein the amino acid sequence comprises one or more amino acid residues deleted, substituted or added; and Polypeptide that binds to Merase II Do.
本発明に用いられるタグペプチド、 マーカーペプチ ド、 またはシ グナルペプチドより選ばれるペプチドは、 融合ポリペプチドとなつ た場合にも H D V抗原ポリペプチドと R NAポリ メラーゼ I I との 結合活性を維持できるポリペプチドであればよい。 具体的には、 m y cポリペプチド、 ]3 -ガラク トシダーゼ、 プロテイン A、 プロテ イ ン Aの I g G結合領域、 ク ロラムフエ二コール ' ァセチル トラン ス フエラ一ゼ、 ポリ （A r g ) 、 ポリ （G l u) 、 プロテイ ン G、 マル トース結合ポリべプチ ド、 グルタチオン S -トランスフェラー ゼ、 ポリ ヒ スチジン鎖 （H i s — t a g ) 、 Sペプチ ド、 DNA結 合ポリペプチド ドメイン、 T a c抗原、 チォレドキシン、 グリーン • フノレオレツセント · プロテイ ン（G F P )、 F L A Gペプチ ド、 任 意の抗体のェピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルぺプチド 等を挙げることができる 〔山川彰夫， 実験医学， ， 469-474 (199 5)〕 。  The peptide selected from the tag peptide, marker peptide, and signal peptide used in the present invention is a polypeptide that can maintain the binding activity between the HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II even when it is a fusion polypeptide. Should be fine. Specifically, myc polypeptide,] 3-galactosidase, protein A, IgG-binding domain of protein A, chloramphenicol 'acetyltransferase, poly (Arg), poly (G lu), protein G, maltose-binding polypeptide, glutathione S-transferase, polyhistidine chain (His-tag), S-peptide, DNA-binding polypeptide domain, Tac antigen, thioredoxin, green • Phenoleorescent protein (GFP), FLAG peptide, any antibody epitope and any secreted protein signal peptide [Yamakawa Akio, Experimental Medicine, 469-474 (1992) Five)〕 .
D型肝炎ウィルス抗原誘導体をコードする DNAは、 Molecular し loning， A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Ha rbor Laboratory Press (1989) (以下、 モレキュラー - クローニン グ第 2版と略す） 、 Current Protocols in Molecular Biology, Jo hn Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カ レント · プロ トコールズ ' イ ン . モレキュラー ' バイオロジーと略す） 、 Nucleic Acids Re search, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 640 9(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4 431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記 載の部位特異的変異導入法を用いて、 例えば配列番号 1で示される アミノ酸配列を有するポリペプチドをコー ドする DNAに部位特異 的変異を導入し、 必要に応じて、 タグペプチド、 マーカーペプチド 、 またはシグナルぺプチ ドより選ばれるぺプチドの配列をコー ドす る D N Aを揷入することにより、 取得することができる。 The DNA encoding the hepatitis D virus antigen derivative is described in Molecular loning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (hereinafter abbreviated as Molecular-Cloning 2nd edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter abbreviated as Current Protocols 'in. Molecular' biology), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985), etc. For example, a site-specific mutation was introduced into DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 using the site-directed mutagenesis method described in peptide Alternatively, it can be obtained by introducing a DNA encoding a sequence of an peptide selected from a signal peptide.
HD V抗原ポリペプチド誘導体の欠失、 置換もしくは付加される アミノ酸の数は特に限定されないが、 上記の部位特異的変異法等の 周知の方法によ り欠失、 置換もしくは付加できる程度の数であり、 1個から数十個、 好ましくは 1〜2 0個、 よ り好ましくは 1〜 1 0 個、 さ らに好ましくは 1〜5個である。  The number of amino acids to be deleted, substituted or added to the HDV antigen polypeptide derivative is not particularly limited, but may be a number that can be deleted, substituted or added by a well-known method such as the site-directed mutagenesis described above. Yes, one to several tens, preferably one to twenty, more preferably one to ten, and even more preferably one to five.
また、 本発明に用いられる HDV抗原ポリべプチド誘導体が RN Aポリメラーゼ I I との結合活性を有するためには、 配列番号 1〜 9記載のアミ ノ酸配列から選択される一つのアミノ酸配列と、 B L A S T [J. Mol. Biol. , 215, 403 (1990)3 や F A S TA [Method s in Enzymology, 183, 63-98 (1990)〕 等を用いて計算したときに (相同性の％を定義するための計算手段 · 方法等を記載する） 、 少 なく とも 6 0 %以上、 通常は 8 0 %以上、 特に 9 5 %以上の相同性 を有していることが好ましい。  In addition, in order for the HDV antigen polypeptide derivative used in the present invention to have a binding activity to RNA polymerase II, one of the amino acid sequences selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 9 is used, When calculated using [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990) 3, FAS TA [Methods in Enzymology, 183, 63-98 (1990)], etc. (to define% homology) It is preferable to have a homology of at least 60% or more, usually 80% or more, especially 95% or more.
本発明に用いられる HDV抗原ポリペプチ ドは、 本発明の HDV 抗原ポリぺプチ ドをコ一ドする DN Aを in vitro転写 '翻訳系を用 いて、 或いは宿主細胞中で発現させて、 製造することができる。 in vitro転写 · 翻訳系としては、 公知の方法 [Kigawa T.ら， J. Biomol. 醒， 6, 129 (1998)、 Spirin A. S. ら， Science, 242, 1 162 (1988)、 Kigawa T. & Yokoyama S.， J. Biochem. , 110, 166 ( 1991)] に準じて、 in vitro転写 . 翻訳系を用いることができる。 すなわち、 H D V抗原ポリペプチドをコー ドする D N Aを SP6、 T7 、 T3等のプロモーターの下流につなげ、 それぞれのプロモーター特 異的な RNAポリ メラーゼを反応させることにより大量の HDV抗 原ポリペプチド RNAをインビトロで合成した後、 無細胞系の翻訳 系例えばゥサギ網状赤血球ライセー トゃコムギ胚芽抽出液を用いた 翻訳系を利用して、 HDV抗原ポリペプチドを生産することができ る。 The HDV antigen polypeptide used in the present invention is produced by expressing a DNA encoding the HDV antigen polypeptide of the present invention using an in vitro transcription-translation system or in a host cell. Can be. As an in vitro transcription and translation system, known methods [Kigawa T. et al., J. Biomol. Awake, 6, 129 (1998), Spirin AS et al., Science, 242, 1162 (1988), Kigawa T. & Yokoyama S., J. Biochem., 110, 166 (1991)], and an in vitro transcription / translation system can be used. That is, DNA encoding the HDV antigen polypeptide is connected downstream of promoters such as SP6, T7, and T3, and a large amount of the HDV antigen polypeptide RNA is converted in vitro by reacting each promoter-specific RNA polymerase. Then, a cell-free translation system was used, e.g., a heron reticulocyte lysate, a wheat germ extract. An HDV antigen polypeptide can be produced using a translation system.
また、 モレキュラー ' ク ローニング第 2版や力レン ト ' プロ トコ ールズ ' イン ' モレキュラー ' バイオ口ジ一等に記载された方法等 を用い、 例えば以下の方法により、 本発明の H D V抗原ポリべプチ ドをコー ドする D N Aを宿主細胞中で発現させて、 製造することが できる。  Also, using the method described in Molecular 'Cloning 2nd edition or Rikilent' Protocols' in 'Molecular' bio mouth, etc. The DNA encoding the peptide can be produced by expressing it in a host cell.
全長 c DN Aをもとにして、 必要に応じて、 該ポリペプチ ドをコ 一ドする部分を含む適当な長さの DN A断片を調製する。  Based on the full-length cDNA, if necessary, a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the polypeptide is prepared.
また、 必要に応じて、 本発明のポリペプチドをコー ドする部分の 塩基配列を、 宿主細胞の発現に最適なコ ドンとなるよ うに塩基を置 換した DNAを調製する。 該 DN Aは本発明のポリペプチドの効率 的製造に有用である。  Further, if necessary, a DNA is prepared by substituting the nucleotide sequence of the portion encoding the polypeptide of the present invention so that the nucleotide sequence becomes an optimal codon for expression in a host cell. The DNA is useful for efficient production of the polypeptide of the present invention.
該 DNA断片、 または全長 c DNAを適当な発現ベクターのプロ モーターの下流に挿入することによ り、 組換えべクターを作製する 該組換えべクターを、 該発現べクターに適合した宿主細胞に導入 する。  A recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or full-length cDNA downstream of a promoter of an appropriate expression vector. The recombinant vector is transferred to a host cell suitable for the expression vector. Introduce.
宿主細胞としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞 等、 目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いるこ とができる。  As the host cell, any cells that can express the target gene, such as bacteria, yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, can be used.
発現ベクターと しては、 上記宿主細胞において自立複製可能ない しは染色体中への組込が可能で、 本発明のポリペプチ ドをコー ドす る DNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用 いられる。  An expression vector that is capable of autonomous replication in the above-mentioned host cell or capable of integration into a chromosome and contains a promoter at a position capable of transcribing the DNA encoding the polypeptide of the present invention. Is used.
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、 本発明のポリ ペプチドをコードする DNAを含有してなる組換えベクターは原核 生物中で自立複製可能であると同時に、 プロモーター、 リボソーム 結合配列、 本発明の DNA、 転写終結配列、 より構成されたべクタ 一であることが好ましい。 プロモーターを制御する遺伝子が含まれ ていてもよい。 When a prokaryote such as a bacterium is used as a host cell, the recombinant vector containing DNA encoding the polypeptide of the present invention is a prokaryote. It is preferably a vector that is capable of autonomous replication in an organism and is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. A gene that controls a promoter may be included.
発現ベクターと しては、 例えば、 pBTrp2、 pBTacl、 PBTac2 (いず れもベーリ ンガーマンハイム社より市販） 、 pKK233- 2 (Pharmacia 社製） 、 pSE280 (Invitrogen社製） 、 pGEMEX - 1 (Promega社製） 、 p QE-8 (QIAGEN社製） 、 pKYPIO (特開昭 58-110600) 、 pKYP200 [Agri c. Biol. Chem.， 48, 669 (1984)〕 、 pLSAl [Agric. Biol. Chem.，Is an expression vector, for example, pBTrp2, pBTacl, P BTac2 (commercially available from nor any Beri down Gar Mannheim), pKK233- 2 (Pharmacia Inc.), (manufactured by Invitrogen Corp.) pSE280, pGEMEX - 1 (Promega Corporation PQE-8 (manufactured by QIAGEN), pKYPIO (Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem.,
53, 277 (1989)〕 、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 43 06 (1985)〕 、 pBluescript II SK (-) ( Stratagene社製） 、 pTrs3053, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK (-) (Stratagene), pTrs30
[Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP - 5407) より調製〕 、 PTrs32 [Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP - 5權） よ り調 製〕 、 pGHA2 [Escherichia coli IGHA2 (FERM BP- 400) より調製、 特開昭 60- 221091〕 、 GKA2 [Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-67 98) よ り調製、 特開昭 60 - 221091〕 、 PTerm2 (US4686191、 US493909 4、 US5160735) 、 pSupex、 pUBHO, pTP5、 pC194、 pEG400 [J. Bact eriol.， 172, 2392 (1990)] 、 pGEX ( Pharmac ia社製） 、 pETシステ ム （Novagen社製） 等をあげることができる。 [Prepared from Escherichia coli JM109 / pTrS30 (FERM BP-5407)], P Trs32 [prepared from Escherichia coli JM109 / pTrS32 (FERM BP-5 rights)], pGHA2 [prepared from Escherichia coli IGHA2 (FERM BP-400)] Prepared from Escherichia coli IGKA2 (FERM BP-6798), JP-A-60-221091), P Term2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUBHO, pTP5, pC194, pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX (Pharmacia), pET system (Novagen) and the like.
プロモーターと しては、 宿主細胞中で機能するものであればいか なるものでもよい。 例えば、 trpプロモーター （Ptrp) 、 lacプロモ 一ター、 PLプロモーター、 PRプロモーター、 T7プロモーター等の、 大腸菌ゃファ一ジ等に由来するプ口モーターをあげることができる 。 また Ptrpを 2つ直列させたプロモーター （PtrpX 2 ) 、 tacプロ モーター、 lacT7プロモーター、 let Iプロモーターのよ うに人為的 に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。  Any promoter can be used as long as it functions in the host cell. Examples of such motors include trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, and T7 promoter, which are derived from E. coli phage. Further, artificially designed and modified promoters such as a promoter in which two Ptrps are connected in series (PtrpX 2), a tac promoter, a lacT7 promoter, and a let I promoter can also be used.
リポソーム結合配列であるシャイ ン—ダルガノ （Shine- Dalgarno ) 配列と開始コ ドンとの間を適当な距離 （例えば 6〜18塩基） に調 節したプラスミ ドを用いることが好ましい。 The liposome binding sequence Shine-Dalgarno ) It is preferable to use a plasmid in which the distance between the sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases).
本発明の組換えベクターにおいては、 本発明の DN Aの発現には 転写終結配列は必ずしも必要ではないが、 構造遺伝子の直下に転写 終結配列を配置することが好ましい。  In the recombinant vector of the present invention, a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange a transcription termination sequence immediately below a structural gene.
宿主細胞と しては、 ェシエリ ヒア属、 セラチア属、 バチルス属、 ブレビバクテリ ウム属、 コ リネパクテリ ゥム属、 ミクロパクテリ ゥ ム属、 シユードモナス属等に属する微生物、 例えば、 Escherichia coli XL1- Blue、 Escner ichia col 1 XL2 - Blue、 Escherichia col 1 D Hl、 Escherichia coli MC1000、 Escherichia coli KY3276、 Escher ichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escher ichia coli H B101、 Escherichia coli No.49、 Escherichia coli W3110、 Escher ichia co丄 i NY49、 Escherichia coli GI698、 Escherichia coli TB 1、 Serrat ia f icaris、 Ser rat ia font icola、 Ser rat ia liquefacie ns、 Serrat ia marcescens^ Bacillus subtil is、 Bacillus amylol i quefaciens^ Brevibact er ium ammoniagenes Br evibacter ium imma r iophi lum ATCし 14068、 Brevibacter ium saccharo lyt icum ATCC140り 6、 Brevibacter ium f lavum ATCC14067、 Brevibacter ium lacto_f erm entum ATCし 13869、 Corynebacter ium glutami cum ATCC13032、 Coryn ebacter ium glutamicum ATCし 13869、 Corynebacter ium acetoac idop hilum ΑΓし C13870、 Microbacter ium ammo niaphi lum ATCC15354、 Pse udomonas put ida 、 Pseudomonas sp. D—0丄 10等をあげること力 sでき る。 Host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynepacterium, Micropacterium, Pseudomonas, etc., such as Escherichia coli XL1-Blue, Escner ichia col 1 XL2-Blue, Escherichia col 1 D Hl, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escher ichia co 丄, Escherichia coli GI698, Escherichia coli TB1, Serrat ia f icaris, Ser ratia font icola, Ser rat ia liquefacie ns, Serrat ia marcescens ^ Bacillus subtil is, Bacillus amylol i quefaciens ^ Brevibact er r ium genium biorium bacterium erium ammoniagenes Brevi lum ATC 14068, Brevibacterium saccharo lyt icum ATCC140, 6, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lacto_ferm entum ATC 13869, Corynebacter ium glutami cum ATCC13032, and Coryn ebacter ium glutamicum ATC 13869, Ru can Corynebacter ium acetoac idop hilum ΑΓ and C13870, Microbacter ium ammo niaphi lum ATCC15354 , Pse udomonas put ida, Pseudomonas sp. that the force s raise the D-0丄10, etc. .
組換えべクターの導入方法としては、 上記宿主細胞へ DNAを導 入する方法であればいずれも用いるこ とができ、 例えば、 カルシゥ ムイオンを用いる方法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 ( 1972)〕 、 プロ トプラス ト法 （特開昭 63- 248394) 、 または Gene, 17 ， 107 (1982)や Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) に記載の方法等をあげることができる。 Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cells. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 , 2110 (1972)], the protoplast method (JP-A-63-248394), or Gene, 17 , 107 (1982) and Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
酵母を宿主細胞と して用いる場合には、 発現ベクターとして、 例 えば、 YEP13 (ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC374 19) 、 pHS19、 pHS15等をあげることができる。  When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
プロモーターとしては、 酵母菌株中で発現できるものであればい ずれのものを用いてもよく、 例えば、 へキソー スキナーゼ等の解糖 系の遺伝子のプロモーター、 P HO 5 プロモーター、 P GKプロモ 一ター、 GA Pプロモーター、 ADHプロモーター、 gal lプロモ 一ター、 gal 10プロモーター、 ヒ ー トショ ックポリペプチドプロモ 一ター、 MFa l プロモーター、 CUP 1プロモーター等をあげること ができる。  Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains.Examples include promoters for glycolytic genes such as hexose kinase, PHO5 promoter, PGK promoter, and GA. P promoter, ADH promoter, gal promoter, gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MFal promoter, CUP 1 promoter and the like.
宿主細胞と しては、 Saccharomv. ces鳥、
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As host cells, Saccharomv. Ces birds,
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Kluyveromycesfe、 Tricnosporonu禹、 Schwann iomyces属、 Pichia属 、 Candida属等に属する微生物、 例えば、 Saccharomyces cerevisia _、 Scnizosaccnaromyces pombe、 Kluvveromyces 丄 actis、 Tr ichosp oron pullulans^ Schwanniomyces a丄丄 uvius、 Candida utilis^ ¾r あげることができる。 Microorganisms belonging to the genus Kluyveromycesfe, Tricnosporonu U, Schwann iomyces, Pichia, Candida, such as Saccharomyces cerevisia _, Scnizosaccnaromyces pombe, Kluvveromyces 丄 actis, Trichosporon pullulans ^ Schwanniomys, and that of Trichosporon pullulans ^ Schwanniomyces it can.
組換えべクターの導入方法としては、 酵母に DN Aを導入する方 法であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレク トロポレー シヨ ン法 [Methods Enzymol. , 194, 182 (1990)〕 、 スフエ πプラ ス ト法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)3 、 酢酸 リチウム法 〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983)〕 、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることがで さる。  As a method for introducing a recombinant vector, any method for introducing DNA into yeast can be used. For example, the electroporation method [Methods Enzymol., 194, 182 (1990)] USA, 75, 1929 (1978) 3, lithium acetate method (J. Bacteriology, 153, 163 (1983)), Pro Natl. Acad. Sci. USA, 75 , 1929 (1978).
動物細胞を宿主と して用いる場合には、 発現ベクターとして、 例 えば、 pcDNAI、 pcDM8 (フナコシ社製） 、 pAGE107 〔特開平 3-22979 、 Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕 、 pAS3-3 (特開平 2-227075) 、 pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)〕 、 pcDNAI/Amp (Invitrogen社 製） 、 pREP4 (Invitrogen社製） 、 PAGE103 [J. Biochem.， 101, 13 07 (1987)〕 、 pAGE210等をあげることができる。 When an animal cell is used as a host, examples of the expression vector include pcDNAI, pcDM8 (manufactured by Funakoshi), pAGE107 [Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-22979. Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAS3-3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), P AGE103 [J. Biochem., 101 , 13 07 (1987) ], can be mentioned pAGE210 like.
プロモーターとしては、 動物細胞中で機能するものであればいず れも用いることができ、 例えば、 サイ トメガロウィルス （CMV) の I E (immediate early) 遺伝子のプロモーター、 SV40の初期プロモー ター、 レ ト ロゥイノレスのプロモーター、 メ タ 口チォネイ ンプロモー ター、 ヒー トショ ックプロモーター、 S R aプロモーター等をあげ ることができる。 また、 ヒ ト CMVの I E遺伝子のェンハンサーを プロモーターと共に用いてもよレヽ。  Any promoter can be used as long as it functions in animal cells. For example, the promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV), the early promoter of SV40, and the retrovirus Promoters, metabolic thione promoters, heat shock promoters, SRa promoters and the like. Alternatively, the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
宿主細胞としては、 ヒ トの細胞であるナマルパ （Namalwa) 細胞 、 サルの細胞である COS細胞、 チャイニーズ · ハムスターの細胞で ある CH0細胞、 HBT5637 (特開昭 63-299) 等をあげることができる。 動物細胞への組換えべクターの導入方法と しては、 動物細胞に D N Aを導入する方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレク ト口ポレーシヨ ン法 〔Cytotechnology， 3， 133 (1990)] 、 リ ン酸カルシウム法 （特開平 2-227075) 、 リポフエクシヨン法 〔Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] 、 Virology, 52, 4 56 (1973)等をあげることができる。  Examples of the host cell include Namalwa cells, which are human cells, COS cells, which are monkey cells, CH0 cells, which are Chinese hamster cells, and HBT5637 (JP-A-63-299). . As a method for introducing a recombinant vector into animal cells, any method can be used as long as DNA can be introduced into animal cells. For example, an electoral poration method [Cytotechnology, 3, 133 (1990) )], The calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], and Virology, 52, 456 (1973). be able to.
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばカ レン ト · プロ ト コーノレズ · イ ン . モレキュラー ' ノ ィォロ シー、 Baculovirus Expr ession Vectors , A Laboratory Manual, W. H. Freeman ana し ompa ny， New York (1992)、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記载さ れた方法によって、 ポリペプチドを発現することができる。  When an insect cell is used as a host, for example, current, proto-conorez, in, molecular 'norosea, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman ana ompany, New York (1992), The polypeptide can be expressed by the method described in Bio / Technology, 6, 47 (1988) and the like.
すなわち、 組換え遺伝子導入べクタ一およびパキュ口ウィルスを 昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えゥィルスを得た 後、 さ らに組換えウィルスを昆虫細胞に感染させ、 ポリペプチ ドを 発現させるこ とができる。 That is, the recombinant gene transfer vector and PacuMouth virus were co-transfected into insect cells to obtain recombinant virus in the insect cell culture supernatant. Later, insect cells can be further infected with the recombinant virus to express the polypeptide.
該方法において用いられる遺伝子導入べクターと しては、 例えば As the gene transfer vector used in the method, for example,
、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともに Invitorogen社製） 等を あげるこ とができる。 And pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (both manufactured by Invitorogen) and the like.
パキュロ ウィルス と しては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するゥ ィルスであるァゥ トグラファ · カ リ フォルニ力 · ヌク レア一 · ポリ へ 卜 ロンス · ウイノレス、 Autographa calif ornica nuclear polyhedr osis virus)等を用いるこ とができる。  Examples of the paculovirus include viruses that infect night insects, such as Atographa, Californi, Nuclea, Politotro, Winnores, and Autographa calif ornica nuclear polyhedrosis virus). Can be used.
昆虫細胞と しては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞である Sf 9 、 Sf 丄 〔Baculovirus Expression Vectors , A Laboratory Manual , W. H. Freeman and Company, New York (1992) ] 、 Tr ichoplus ia Siの卵巣細胞である High 5 (Invitrogen社製） 等を用いるこ とがで きる。  Insect cells include Sf9 and Sf 丄, ovary cells of Spodoptera frugiperda (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)), and High ovary cells of Trichoplus ia Si. 5 (manufactured by Invitrogen) can be used.
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝 子導入べクターと上記パキュ口 ウィルスの共導入方法と しては、 例 えば、 リ ン酸カルシウム法 （特開平 2- 227075) 、 リ ボフヱクシヨ ン 法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕 等をあげる ことができる。  As a method of co-introducing the above-mentioned recombinant gene introduction vector and the above-mentioned PacuMouth virus into insect cells for preparing a recombinant virus, for example, the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075) Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] and the like.
植物細胞を宿主細胞と して用いる場合には、 発現べクターと して 、 例えば、 T i プラス ミ ド、 タバコモザィ ク ウィルスベクター等を あげるこ とができる。  When a plant cell is used as a host cell, examples of the expression vector include Ti plasmid, tobacco mosaic virus vector, and the like.
プロモーターと しては、 植物細胞中で発現できるものであればい ずれのものを用いてもよく、 例えば、 カ リ フラワーモザイク ウィル ス (CaMV) の 35Sプ口モーター、 ィネアクチン 1 プロモーター等を あげるこ とができる。  Any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include the 35S motor of flower mosaic virus (CaMV) and the geneactin 1 promoter. Can be.
宿主細胞と しては、 タバコ、 ジャガイモ、 . トマ ト、 ニンジン、 ダ ィズ、 アブラナ、 アルフアルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植 物細胞等をあげることができる。 Host cells include tobacco, potato, tomato, carrot, And plant cells of rice, wheat, wheat, oats, and the like.
組換えべクターの導入方法としては、 植物細胞に D N Aを導入す る方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 ァグロパクテ リ ウム （Agrobac t e r ium) (特開昭 59-140885、 特開昭 60- 70080、 W0 94/00977) 、 エレク ト 口ポレーシヨ ン法 （特開昭 60- 251887) 、 パ 一ティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （特許第 2606856、 特許 第 2517813) 等をあげることができる。  As a method for introducing a recombinant vector, any method for introducing DNA into plant cells can be used. For example, Agrobacterium (JP-A-59-140885, JP-A-59-140885, 60-70080, W094 / 00977), the electoral-portion method (JP-A-60-251887), a method using a particle gun (gene gun) (Patent No. 2606856, Patent No. 2517813), and the like. .
遺伝子の発現方法と しては、 直接発現以外に、 モレキュラー · ク ローニング第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融 合タンパク質発現等を行う ことができる。  As a method for expressing a gene, in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, and the like can be performed according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition.
酵母、 動物細胞、 昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合 には、 糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができ る。  When expressed by yeast, animal cells, insect cells or plant cells, a sugar or a sugar chain-added polypeptide can be obtained.
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に本発明のポリべプチドを生成蓄積させ、 該培養物から採 取することにより、 本発明のポリぺプチドを製造することができる  The transformant of the present invention obtained as described above is cultured in a medium, the polypeptide of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide of the present invention is collected from the culture. Can be manufactured
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用い られる通常の方法に従って行う ことができる。 The method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核 生物を宿主と して得られた形質転換体である場合、 該形質転換体を 培養する培地と して、 該形質転換体が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 該形質転換体の培養を効率的に行える培地で あれば天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。  When the transformant of the present invention is a transformant obtained using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host, the transformant is used as a medium for culturing the transformant. Any of a natural medium and a synthetic medium may be used as long as the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated and can efficiently culture the transformant.
炭素源としては、 該形質転換体が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラク トース、 スク ロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロ ピ オン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノールなどのアルコール類 等を用いることができる。 Any carbon source may be used as long as the transformant can be assimilated, and glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, Carbohydrates such as starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニ ゥム、 酢酸アンモニゥム、 リ ン酸アンモニゥム等の無機酸もしく は 有機酸のアンモニゥム塩、 その他の含窒素化合物、 ならびに、 ぺプ トン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチープリカー、 カゼイン加 水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体およびそ の消化物等を用いることができる。  Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, etc., or ammonium salts of organic acids, other nitrogen-containing compounds, as well as leptone, meat extract, Yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
無機塩と しては、 リ ン酸第一カリ ウム、 リ ン酸第二カリ ウム、 リ ン酸マグネシウム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナト リ ウム、 硫酸第一 鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができ る。  Inorganic salts include potassium potassium phosphate, potassium potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. Can be used.
培養は、 振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で 行う。 培養温度は 1 5〜 4 0 °Cがよく、 培養時間は、 通常 1 6時間 〜7 日間である。 培養中の p Hは 3 . 0〜9 . 0に保持することが 好ましい。 p Hの調整は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿 素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。  The culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture. The culturing temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culturing time is usually 16 hours to 7 days. It is preferable that pH during culture is maintained at 3.0 to 9.0. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urine, calcium carbonate, ammonia, or the like.
また、 培養中必要に応じて、 アンピシリ ンやテ トラサイク リ ン等 の抗生物質を培地に添加してもよい。  If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
プロモーターと して誘導性のプロモーターを用いた組換えべクタ 一で形質転換した微生物を培養するときには、 必要に応じてイ ンデ ュ一サーを培地に添加してもよい。 例えば、 lacプロモーターを用 いた組換えべクターで形質転換した微生物を培養するときにはィ ソ プロピル _ j8 — D—チォガラク トピラノシド等を、 t rpプロモータ 一を用いた組換えべクターで形質転換した微生物を培養するときに はィンドールァク リル酸等を培地に添加してもよい。 動物細胞を宿主と して得られた形質転換体を培養する培地と して は、 一般に使用されている RPMI1640培地 〔The Journal of the Ame rican Medical Association, 199, 519 (1967)〕 、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)] 、 ダルベッコ改変 MEM培地 〔Virolog y, 8, 396 (1959)〕 、 1 9 9培地 [Proceeding of the Society fo r the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕 またはこれら培地に 牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。 When culturing a microorganism transformed with a recombinant vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium, if necessary. For example, when culturing a microorganism transformed with a recombinant vector using the lac promoter, isoforms such as isopropyl_j8-D-thiogalactopyranoside and microorganisms transformed with the recombinant vector using the trp promoter are used. When culturing, indoleacrylic acid or the like may be added to the medium. As a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host, commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM Medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] Alternatively, a medium or the like obtained by adding fetal bovine serum or the like to these mediums can be used.
培養は、 通常 p H 6〜 8、 3 0〜 4 0 °C、 5 % C O2存在下等の 条件下で 1〜 7 日間行う。  Cultivation is usually performed for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and the presence of 5% CO 2.
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリ ン等の抗生 物質を培地に添加してもよい。  If necessary, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
昆虫細胞を宿主と して得られた形質転換体を培養する培地として は、 一般に使用されている TNM- FH培地 （Pharmingen社製） 、 Sf - 900 II SFM培地 (Life Technologies社製） 、 ExCell柳、 ExCell405 ( いずれも JRH Biosciences |±®) 、 brace s Insect Medium [Nature ， 195, 788 (1962)〕 等を用いることができる。  Examples of a medium for culturing the transformant obtained using insect cells as a host include commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900II SFM medium (Life Technologies), ExCell Yanagi , ExCell405 (both JRH Biosciences | ± ®), brace s Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] and the like can be used.
培養は、 通常 P H 6〜 7、 2 5〜 3 0 °C等の条件下で、 1〜 5 日 間行う。  Cultivation is usually performed for 1 to 5 days under conditions of pH 6 to 7 and 25 to 30 ° C.
また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地 に添加してもよい。  If necessary, an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
植物細胞を宿主と して得られた形質転換体は、 細胞として、 また は植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。 該形質転 換体を培養する培地と しては、 一般に使用されているムラシゲ · ァ ンド · スク一グ（MS)培地、 ホワイ ト（White)培地、 またはこれら培 地にオーキシン、 サイ トカイニン等、 植物ホルモンを添加した培地 等を用いることができる。  A transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or by differentiating into a plant cell or organ. As a medium for culturing the transformant, commonly used Murashige and Skog (MS) medium, white (White) medium, or a plant such as auxin, cytokinin, etc. A medium to which a hormone is added can be used.
培養は、 通常 p H 5〜 9、 2 0〜 4 0 °Cの条件下で 3〜 6 0 日間 行う。 Culture is usually performed at pH 5 to 9, 20 to 40 ° C for 3 to 60 days. Do.
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等 の抗生物質を培地に添加してもよい。  If necessary, an antibiotic such as kanamycin or hygromycin may be added to the medium during the culture.
上記のとおり、 本発明のポリペプチドをコードする DNAを組み 込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、 動物細胞、 あるいは植 物細胞由来の形質転換体を、 通常の培養方法に従って培養し、 該ポ リぺプチドを生成蓄積させ、 該培養物より該ポリペプチ ドを採取す ることによ り、 該ポリペプチドを製造することができる。  As described above, a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector into which a DNA encoding the polypeptide of the present invention has been incorporated is cultured according to a conventional culture method. The polypeptide can be produced by producing and accumulating the polypeptide and collecting the polypeptide from the culture.
遺伝子の発現方法と しては、 直接発現以外に、 モレキュラー ' ク ローニング第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融 合ポリペプチド発現等を行う ことができる。  As a method for expressing a gene, in addition to direct expression, secretory production, fusion polypeptide expression, and the like can be performed according to the method described in Molecular 'Cloning, 2nd edition.
本発明のポリペプチ ドの生産方法と しては、 宿主細胞内に生産さ せる方法、 宿主細胞外に分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上 に生産させる方法があり、 使用する宿主細胞や、 生産させるポリべ プチドの構造を変えることにより、 該方法を選択することができる 本発明のポリぺプチ ドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生 産される場合、 ポールソンらの方法 〔J. Biol. Chem. , 264, 17619 (1989)〕 、 ロウらの方法 CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 822 7 (1989)、 Genes Develop. , 4, 1288 (1990)〕 、 または特開平 5- 33 6963、 W094/23021等に記載の方法を準用することにより、 該ポリべ プチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。  The method for producing the polypeptide of the present invention includes a method of producing the polypeptide in a host cell, a method of secreting the polypeptide out of the host cell, and a method of producing the polypeptide on the host cell outer membrane. The method can be selected by changing the structure of the polypeptide to be produced.When the polypeptide of the present invention is produced in the host cell or on the host cell outer membrane, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], the method of Lowe et al., CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], or By applying the method described in 5-336963, W094 / 23021, etc., the polypeptide can be positively secreted out of host cells.
すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 本発明のポリペプチド の活性部位を含むポリぺプチ ドの手前にシグナルぺプチドを付加し た形で発現させることによ り、 本発明のポリぺプチドを宿主細胞外 に積極的に分泌させることができる。  That is, the polypeptide of the present invention is expressed by adding a signal peptide in front of the polypeptide containing the active site of the polypeptide of the present invention using a gene recombination technique. Can be actively secreted out of the host cell.
また、 特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、 ジヒ ドロ 葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上 昇させることもできる。 Also, according to the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075, The production can also be increased using a gene amplification system using a folate reductase gene or the like.
さらに、 遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させるこ とによ り、 遺伝子が導入された動物個体 （ トランスジエニック非ヒ ト動物） または植物個体 （トランスジエニック植物） を造成し、 こ れらの個体を用いて本発明のポリぺプチドを製造することもできる 形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従 つて、 飼育または栽培し、 該ポリペプチドを生成蓄積させ、 該動物 個体または植物個体より該ポリぺプチドを採取するこ とによ り、 該 ポリぺプチ ドを製造することができる。  Further, by regenerating the cells of the transgenic animal or plant, an individual animal (transgenic non-human animal) or plant (transgenic plant) into which the gene has been introduced is created. These individuals can be used to produce the polypeptide of the present invention. When the transformant is an animal individual or a plant individual, it is bred or cultivated according to a conventional method to produce and accumulate the polypeptide. Then, the polypeptide can be produced by collecting the polypeptide from the animal or plant individual.
動物個体を用いて本発明のポリべプチドを製造する方法と しては As a method for producing the polypeptide of the present invention using an animal individual,
、 例えは公知の方法 [American Journal of Clinical Nutrition, 63 , 639S (1996)、 American Journal of Clinical Nutrition, 63—, 627S (1996)、 Bio/Technology, 9, 830 (1991)〕 に準じて遺伝子 を導入して造成した動物中に本発明のポリペプチドを生産する方法 があげられる。 For example, the gene can be transformed according to a known method [American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition, 63--, 627S (1996), Bio / Technology, 9, 830 (1991)]. A method for producing the polypeptide of the present invention in an animal created by introduction is mentioned.
動物個体の場合は、 例えば、 本発明のポリペプチドをコー ドする DN Aを導入したトランスジエニック非ヒ ト動物を飼育し、 該ポリ ぺプチドを該動物中に生成 · 蓄積させ、 該動物中よ り該ポリぺプチ ドを採取することにより、 該ポリぺプチドを製造することができる 。 該動物中の生成 · 蓄積場所と しては、 例えば、 該動物のミルク （ 特開昭 63-309192) 、 卵等をあげることができる。 この際に用いら れるプロモーターとしては、 動物で発現できるものであればいずれ も用いることができるが、 例えば、 乳腺細胞特異的なプロモーター である αカゼインプロモーター、 カゼインプロモーター、 β ラ ク トグロプリ ンプロモーター、 ホエー酸性プロテインプロモ ター等 が好適に用いられる。 In the case of an animal individual, for example, a transgenic non-human animal into which DNA encoding the polypeptide of the present invention has been introduced is bred, and the polypeptide is produced and accumulated in the animal. Thus, the polypeptide can be produced by collecting the polypeptide. Examples of the place of production and accumulation in the animal include milk (JP-A-63-309192), eggs and the like of the animal. Any promoter that can be used in this case can be used as long as it can be expressed in animals. Examples of such promoters include α-casein promoter, casein promoter, β-lactoglobulin promoter, Whey acidic protein promoter, etc. Is preferably used.
植物個体を用いて本発明のポリベプチドを製造する方法と しては As a method for producing the polypeptide of the present invention using a plant individual,
、 例えば本発明のポリペプチドをコー ドする D N Aを導入したトラ ンスジエニック植物を公知の方法 〔組織培養， 20 ( 1994)、 組織培 養， 21 ( 1995 )、 Trends in Bi ot echno l ogy , 15 , 45 ( 1997)〕 に準 じて栽培し、 該ポリペプチドを該植物中に生成 ·蓄積させ、 該植物 中より該ポリべプチドを採取することにより、 該ポリペプチドを生 産する方法があげられる。 For example, transgenic plants into which DNA encoding the polypeptide of the present invention has been introduced can be prepared by known methods [tissue culture, 20 (1994), tissue culture, 21 (1995), Trends in Biotechnolgy, 15, 45 (1997)], producing and accumulating the polypeptide in the plant, and collecting the polypeptide from the plant to produce the polypeptide. .
本発明の形質転換体により製造されたポリベプチドを単離精製す るためには、 通常の酵素の単離精製法を用いることができる。 例 えば本発明のポリぺプチドが、 細胞内に溶解状態で発現した場合に は、 培養終了後、 細胞を遠心分離によ り回収し、 水系緩衝液にけん 濁後、 超音波破砕機、 フ レンチプレス、 マン ト ンガウリ ンホモゲナ ィザ一、 ダイノ ミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することによ り得られる上清から、 通常 の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱 塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミ ノエチル （DEAE) —セ ファロース、 D IAI ON HPA-75 (三菱化成社製） 等のレジンを用いた 陰ィオン交換クロマ トグラフィ一法、 S- Sepharos e FF (Pharmac ia 社製） 等のレジンを用いた陽イオン交換クロマ トグラフィー法、 ブ チノレセファ ロース、 フエ二ルセファ ロース等のレジンを用いた珠水 性クロマ トグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィニテ ィーク ロマ トグラフィー法、 クロマ トフォーカシング法、 等電点電 気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることができる。 タグペプチド、 マーカーペプチド、 またはシグナルペプチドより選ばれるペプチ ドを用いたァフィニテ ィーク ロマ トグラフィーを利用して精製することもできる。 例えば 、 ロウらの方法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989) 、 Genes & Dev. , 4, 1288 (1990) 〕 、 特開平 05 - 336963、 應 4/23 021に記載の方法に準じて、 本発明のポリペプチドをプロテイン A との融合タンパク質と して生産し、 ィムノグロブリ ン Gを用いるァ フイエティークロマ トグラフィーにより精製することができる。 ま た、 本発明のポリペプチドを F 1 a gペプチドとの融合タンパク質 と して生産し、 抗 F 1 a g抗体を用いるァフィ二ティークロマ トグ ラフィ一により精製することができる 〔Proc. Natl. Acad. Sci. U SA， 86, 8227 (1989)、 Genes & Dev. , 4, 1288 (1990)〕 。 更に、 該ポリペプチドに対する抗体を用いたァフィ二ティ一クロマ トグラ フィ一で精製するこ ともできる。 In order to isolate and purify the polypeptide produced by the transformant of the present invention, an ordinary enzyme isolation and purification method can be used. For example, when the polypeptide of the present invention is expressed in a lysed state in the cells, the cells are collected by centrifugation after completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated with a sonicator. The cells are disrupted using a wrench press, mantongaulin homogenizer, dyno mill, etc. to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a normal enzyme isolation and purification method is used, that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent. , Jethylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, anion-exchange chromatography using resins such as DIAI ON HPA-75 (Mitsubishi Kasei), resins such as S-Sepharos e FF (Pharmacia) Chromatography using cation-exchange chromatography with resin, perishable chromatography using resin such as butinoresepharose, phenylsepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatography A purified sample can be obtained by using a focusing method, an electrophoresis method such as isoelectric focusing, or a combination thereof. Purification can also be carried out by affinity chromatography using a peptide selected from a tag peptide, a marker peptide, or a signal peptide. For example Natl.Acad.Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes & Dev., 4, 1288 (1990)], JP-A 05-336963, 4/23 021. According to the method, the polypeptide of the present invention can be produced as a fusion protein with protein A, and purified by affinity chromatography using immunoglobulin G. In addition, the polypeptide of the present invention can be produced as a fusion protein with an F1ag peptide, and purified by affinity chromatography using an anti-F1ag antibody (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes & Dev., 4, 1288 (1990)]. Further, it can be purified by affinity chromatography using an antibody against the polypeptide.
また、 該ポリべプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合 は、 同様に細胞を回収後、 破砕し、 遠心分離を行う ことによ り、 沈 殿画分としてポリべプチ ドの不溶体を回収する。 回収したポリぺプ チ ドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。 該可溶化液を希釈また は透析し、 該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより 、 該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。 該操作の後、 上記と同 様の単離精製法により該ポリべプチドの精製標品を得ることができ る。  When the polypeptide is expressed in an insoluble form in the cells, the cells are similarly recovered, crushed, and centrifuged to obtain the polypeptide as a precipitate fraction. Collect insolubles. The recovered insoluble form of the polypeptide is solubilized with a protein denaturant. The polypeptide is returned to a normal three-dimensional structure by diluting or dialyzing the solubilized solution and reducing the concentration of the protein denaturant in the solubilized solution. After this operation, a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
本発明のポリペプチ ド、 あるいは該ポリべプチドに糖鎖の付加さ れたポリぺプチド等の誘導体が細胞外に分泌された'場合には、 培養 上清に該ポリペプチドあるいは該ポリべプチ ドの誘導体を回収する ことができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法に よ り処理することによ り培養上清を取得し、 該培養上清から、 上記 と同様の単離精製法を用いることにより、 精製標品を得ることがで きる。  When the polypeptide of the present invention or a derivative such as a polypeptide having a sugar chain added to the polypeptide is extracellularly secreted, the polypeptide or the polypeptide is added to the culture supernatant. Can be recovered. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and from the culture supernatant, an isolation and purification method as described above is used. A refined sample can be obtained.
このようにして取得されるポリペプチドと して、 例えば、 配列番 号 1〜 9記載のアミノ酸配列を有するポリぺプチドぉよびそれらの 誘導体をあげることができる。 As the polypeptide obtained in this way, for example, Polypeptides having the amino acid sequences described in Nos. 1 to 9 and derivatives thereof can be given.
また、 本発明のポリペプチ ドは、 F m o c法 （フルォレニルメチ ノレォキシカノレポニル法） 、 t B o c法 （ t —ブチルォキシカノレポ二 ル法） 等の化学合成法によっても製造することができる。 また、 Ad vanced し hemTech社、 ノヽーキン · エノレマ一社、 Pharmacia社、 Protei n Technology Instrument社、 Synthecel丄 -Vega社、 PerSeptive社、 島津製作所等のぺプチド合成機を利用して化学合成することもでき る。  Further, the polypeptide of the present invention can be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethinoleoxycanoleponyl method) and the tBoc method (t-butyloxycanoleponyl method). it can. In addition, chemical synthesis can be carried out using peptide synthesizers such as hemTech, Nokin Enolema, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel-Vega, PerSeptive, and Shimadzu. it can.
HD V抗原ポリべプチドと RNAポリ メラーゼ I I の反応方法、 結合量の検出方法は、 該ポリペプチ ドと RNAポリ メラーゼ I I の 細胞內での結合を反映する既知の方法であれば、 いかなる方法でも 良い。  The method of reacting HD V antigen polypeptide with RNA polymerase II and the method of detecting the amount of binding may be any method as long as it is a known method that reflects the binding of the polypeptide and RNA polymerase II in cells. .
例えば、 HDV抗原ポリペプチドと RNAポリメラーゼ I Iいず れか一方の分子をマルチウエルプレートゃクロマ ト担体ゃラテック ス等のビーズ、 表面プラズモン共鳴測定用のチップ、 質量測定用の ターゲッ ト等の固相に、 物理的吸着や、 HD V抗原ポリペプチ ドあ るいは; NAポリ メラーゼ I I を認識する抗体等や、 タグペプチド 、 マーカーペプチド、 またはシグナルペプチドより選ばれるぺプチ ドを特異的に認識する分子を介した結合によ り固定化し、 必要に応 じて非特異吸着を抑制する処理を施した後、 他方の分子を添加し、 更に未吸着な他方の分子を洗浄除去後、 他方の分子の H DV抗原ポ リペプチドあるいは RNAポリメラーゼ I I部分やタグペプチド、 マーカーペプチド、 またはシグナルペプチドより選ばれるペプチド の酵素活性、 結合特性、 表面プラズモン共鳴の発生、 質量分析の信 号強度等、 を生かして、 結合した他方の分子を検出することにより 、 H D V抗原ポリペプチドと RNAポリ メラーゼ I I の結合量を検 出するこ とができる。 For example, HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II can be converted to solid phase such as beads such as multiwell plate, chromatographic carrier, latex, chip for surface plasmon resonance measurement, and target for mass measurement. In addition, an antibody that recognizes physical adsorption, HD V antigen polypeptide or NA polymerase II, or a molecule that specifically recognizes a peptide selected from a tag peptide, a marker peptide, or a signal peptide. Immobilized by intermediary binding, and if necessary, a treatment to suppress non-specific adsorption, add the other molecule, wash and remove the unadsorbed other molecule, and remove the H of the other molecule. Enzyme activity of DV antigen polypeptide or peptide selected from RNA polymerase II part, tag peptide, marker peptide, or signal peptide Properties, occurrence of surface plasmon resonance, such as signal strength of a mass spectrometer, taking advantage of, by detecting the other molecule bound, detected a binding amount of HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II Can be issued.
例えば、 本発明のポリぺプチ ドを他のタンパク質との融合タンパ ク質と して生産し、 融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用い てタグペプチ ド、 マーカーペプチ ド、 またはシグナルペプチ ドよ り 選ばれるぺプチ ドを特異的に検出するこ ともできる。 j8 -ガラタ ト シダーゼ、 ク 口ラムフエニコーノレ · ァセチノレトランスフェラーゼ、 グルタチオン S -トランスフェラーゼ、 チォレ ドキシン等は、 その 酵素活性を指標に、 グリーン · フルォレツセント ' プロテイ ン （G F P) 等は、 その蛍光を指標に、 プロテイ ン A、 プロテイン Aの I g G結合領域、 ポリ （A r g ) 、 ポリ （G l u) 、 プロテイ ン G、 マルトース結合ポリペプチ ド、 ポリ ヒ スチジン鎖 （His-tag) 、 D NA結合ポリペプチ ド ドメイ ン等は、 その特異的結合分子との結合 を指標に、 m y cポリペプチ ド、 Sペプチ ド、 T a c抗原、 F L A Gペプチ ド、 任意の抗体のェピ ト一プ等は、 その特異的抗体との結 合を指標に、 検出できる。  For example, the polypeptide of the present invention is produced as a fusion protein with another protein, and a substance having an affinity for the fused protein is used to produce the polypeptide from a tag peptide, a marker peptide, or a signal peptide. The selected peptide can also be specifically detected. j8-Galata tosidase, kuram humeniconore acetinoletransferase, glutathione S-transferase, thioredoxin, etc., use their enzyme activity as an index, and Green Fluorescent 'protein (GFP), etc. Indicators include protein A, IgG binding region of protein A, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose-binding polypeptide, poly-histidine chain (His-tag), and DNA binding. The polypeptide domain, etc., uses its specific binding molecule as an index, and the myc polypeptide, S peptide, Tac antigen, FLAG peptide, any antibody peptide, etc. Detection is possible using the binding to the antibody as an index.
β -ガラク トシダーゼ、 ク ロラムフエニコーノレ · ァセチルトラン スフエラーゼ、 グノレタチオン S -トランスフェラーゼ、 チォレ ドキ シン、 グリ ーン ' フルォレツセン ト · プロテイ ン (G F P) 、 プロ ティ ン Α、 プロテイ ン Αの I g G結合領域、 ポリ （A r g) 、 ポリ (G l u) 、 プロテイ ン G、 マルトース結合ポリペプチ ド、 ポリ ヒ スチジン鎖 （His-tag) 、 D N A結合ポリペプチ ド ドメイ ン等もそ れらの特異的抗体との結合を指標に検出するこ ともできる。  β-galactosidase, chloramphenicone acetyltransferase, gnoretathione S-transferase, thioredoxin, green 'IgG binding of fluorescein protein (GFP), protein Α, and protein Α Region, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose-binding polypeptide, polyhistidine chain (His-tag), DNA-binding polypeptide domain, etc. also bind to their specific antibodies. Can be detected as an index.
また、 HDV抗原ポリペプチ ドと RNAポリ メ ラーゼ I I のいず れか或いは双方をピオチン等の結合に特異性を有する分子や蛍光試 薬、 R I標識試薬等によ り修飾後、 上記の反応系に用いるこ とによ つて、 ピオチン等の結合特異性を生かして固相に結合させたり、 ビ ォチン等の結合特異性や蛍光、 放射性等を指標に相互作用を検出す ることもできる。 In addition, after modifying either or both of the HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II with a molecule having specificity for binding such as biotin, a fluorescent reagent, an RI labeling reagent, etc., Depending on the use, the binding specificity of biotin etc. can be used to bind to a solid phase, or the interaction can be detected using the binding specificity of biotin etc., fluorescence, radioactivity, etc. You can also.
さ らに、 HDV抗原ポリペプチドと RNAポリ メラ ゼ I I の双 方を適切な蛍光色素でラベル化し、 蛍光共鳴エネルギー移動 （F R E T) により、 D型肝炎ウィルス抗原誘導体と RNAポリメラーゼ I I が結合しているときのみ発する蛍光を利用して、 溶液系で HD V抗原ポリペプチドと； NAポリ メラーゼ I I の相互作用を検出す ることができる。  Furthermore, both the HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II are labeled with an appropriate fluorescent dye, and the hepatitis D virus antigen derivative and RNA polymerase II are bound by fluorescence resonance energy transfer (FRET). The fluorescence emitted only occasionally can be used to detect the interaction between the HD V antigen polypeptide and the NA polymerase II in a solution system.
HDV抗原ポリべプチドと被験化合物の反応方法、 結合量の検出 方法は、 既知の方法であれば、 いかなる方法でもよい。  The method of reacting the HDV antigen polypeptide with the test compound and the method of detecting the binding amount may be any known methods.
例えば、 HDV抗原ポリペプチドをマルチウエルプレートやク ロ マ ト担体やラテツクス等のビーズ、 表面プラズモン共鳴測定用のチ ップ、 質量測定用のターゲッ ト等の固相に、 物理的吸着や、 HDV 抗原ポリペプチドを認識する抗体等や、 タグペプチド、 マーカーぺ プチド、 またはシグナルペプチドより選ばれるペプチ ドを特異的に 認識する分子を介した結合によ り固定化し、 必要に応じて非特異吸 着を抑制する処理を施した後、 被験化合物と接触させ、 更に未吸着 な被験化合物を洗浄除去後、 被験化合物を表面プラズモン共鳴の発 生、 質量分析の信号強度等により、 検出するこ とができる。 或いは 、 HDV抗原ポリペプチドに結合した被験化合物を溶出し、 分光ス ぺク トル、 蛍光スぺク トル、 質量分析等の手法を用いて検出するこ とができる。 また、 HDV抗原ポリペプチドをピオチン等の結合に 特異性を有する分子等によ り修飾後、 上記の反応系に用いることに よって、 ピオチン等の結合に特異性を生かして結合させることもで きる。  For example, physical adsorption or HDV antigen polypeptide is applied to solid phase such as beads such as multi-well plate, chromatographic carrier, latex, chip for surface plasmon resonance measurement, target for mass measurement, etc. Immobilized by binding through an antibody that recognizes the antigen polypeptide, or a molecule that specifically recognizes a peptide selected from a tag peptide, a marker peptide, or a signal peptide, and if necessary, nonspecific adsorption After the treatment to suppress the concentration of the test compound, the test compound is contacted with the test compound, and the unadsorbed test compound is removed by washing.The test compound can be detected by generation of surface plasmon resonance, signal intensity of mass spectrometry, etc. . Alternatively, the test compound bound to the HDV antigen polypeptide can be eluted and detected using a technique such as spectroscopy, fluorescence, or mass spectrometry. In addition, by modifying the HDV antigen polypeptide with a molecule having specificity for binding of biotin or the like and then using the above reaction system, the binding of biotin or the like can be made with specificity. .
HDV抗原ポリペプチドと RNAポリ メラ一ゼ I I の結合を抑制 する化合物を探索する方法と しては、 例えば、 下記の具体的方法が あげられる。 1 ) G S T融合 D型肝炎ウィルス抗原組換えタンパク質を大腸菌な どにて発現させる。 該大腸菌を集め、 破碎し、 得られた G S T融合 D型肝炎ウィルス抗原組換えタンパク質 ^〜500 g好ましく は 1 μ g 〜500 μ gを含む大腸菌破砕液の上清を、 ダルタチオン固定化 担体0.1 し〜1000 し好ましく は 1 /z L〜： LOOw Lに結合させ、 親和性 ビ一ズとする。 該親和性ビーズを 1ηΜ〜500 μ Μ好ましくは 1 1(1〜100 μ Μの被験化合物の存在下、 非存在下、 RNAポリ メラーゼ I I In §〜500 μ g好ましくは 1 μ g〜500 / gを含む細胞抽出液または R NAポリ メ ラーゼ I I lng〜500 /i g好ましく は 1 β g〜500 x gの 精製標品を含む溶液 5 z L〜5mL好ましく は、 10 しカゝら 1 mLと混合 し、 上清を除く。 洗浄後、 該親和性ビーズから、 例えば、 SDS- PAGE のサンプルバッファーと ともに煮沸して、 結合した RNAポリ メ ラ ーゼ I I を溶出し、 SDS- PAGEに供し、 例えば、 PVDF膜に電気的に転 写後、 結合した RN Aポリ メラーゼ I I の量を、 抗 RNAポリ メ ラ —ゼ I I抗体を用いたウェスタンプロ ッティ ングなどの方法によつ て検出できる。 Examples of a method for searching for a compound that suppresses the binding between the HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II include the following specific methods. 1) GST fusion Hepatitis D virus antigen recombinant protein is expressed in E. coli or the like. The Escherichia coli was collected and crushed, and the supernatant of the lysate of Escherichia coli containing the obtained GST-fused hepatitis D virus antigen-recombinant protein ^ ~ 500 g, preferably 1 ~ 500 g, was subjected to a daltathione-immobilized carrier 0.1. 10001000 and preferably 1 / zL〜: Affinity beads are formed by binding to LOOwL. The affinity beads are used in the presence or absence of 1ηΜ to 500 μΜ, preferably 11 (1 to 100 μΜ) of the test compound, RNA polymerase II In § to 500 μg, preferably 1 μg to 500 / g. preferably the solution 5 z L~5mL comprising a cell extract or R NA poly main hydrolase II lng~500 / ig preferably 1 β g~500 xg of purified preparation containing mixes with 10 Shikakara 1 mL After washing, the bound beads are eluted from the affinity beads by, for example, boiling with an SDS-PAGE sample buffer, and subjected to SDS-PAGE. After electrotransfer onto the PVDF membrane, the amount of bound RNA polymerase II can be detected by a method such as western blotting using an anti-RNA polymerase II antibody.
2 ) 大腸菌発現系や試験管内翻訳系を用いて、 [35 S] で標識した D型肝炎ウィルス抗原組換えタンパク質を調製できる。 該 D型肝炎 ゥィルス抗原組換えタンパク質 lng〜500 /z g好ましくは 1 μ g 〜50 μ gを含む溶液を 1ηΜ〜500 μ M好ましく は 1 μ M〜： LOO M被験化合物 存在下、 非存在下、 RNAポリ メラーゼ I I lng〜500 / g好まし く は 1 g〜50μ gを含む細胞抽出液または RNAポリ メラーゼ I I 1η 〜500 g好ましくは 1 μ g〜50μ gの精製標品と混合し、 抗 RNAポリ メラーゼ I I抗体およびプロティン G固定化担体など を用いて免疫沈降させ、 沈降物中の D型肝炎ウィルス抗原タンパク 質量を、 オー トラジオグラフィーなどの方法によって検出すること によって、 HDV抗原ポリペプチドと； RNAポリ メラーゼ I Iの結 合を抑制する化合物を探索することができる。 2) using an E. coli expression system and in vitro translation systems can prepare hepatitis D virus antigen recombinant proteins labeled with [35 S]. The hepatitis D Wirusu antigenic recombinant proteins ln g to 500 / zg preferably 1 μ g ~50 1ηΜ~500 a solution containing mu g mu M preferably 1 μ M~: LOO M test compound the presence, absence , preferably RNA polymerase II ln g ~500 / g Ku is mixed with a cell extract or RNA polymerase II 1 [Eta] to 500 g purified sample preferably 1 μ g~50μ g containing 1 g~50μ g, Immunoprecipitation using anti-RNA polymerase II antibody and Protein G-immobilized carrier, etc., and detection of the mass of hepatitis D virus antigen protein in the sediment by a method such as autoradiography enables HDV antigen polypeptide And the conclusion of RNA polymerase II Compounds that inhibit the binding can be searched for.
3 ) 例えば、 RN Aポリ メラーゼ I I の精製標品 lng〜500izg好ま しくは 1 μ 8〜50μ を 96穴マイクロタイタ一プレー トの 1穴に添 加し、 直接固定化するか、 抗 RNAポリ メラーゼ I I抗体 lng〜500 μ g好ましくは 1 μ g〜50 μ gを 96穴マイクロタイタープレートの 1穴に添加し、 固定化した上で、 ： N Aポリ メ ラーゼ I I を間接的 に固定化することができる。 そこに 1ηΜ〜500 μ M好ましくは 1 μ M〜l ΟΟμΜの被験化合物存在下、 非存在下、 大腸菌などにて発現させた D型肝炎ウィルス抗原組換えタンパク質、 例えば、 3丁融合0型 肝炎ウィルス抗原組換えタンパク質 lng〜500 /Ζ g好ましくは 1 μ g 〜50μ gを添加し反応させ、 洗浄後、 結合した D型肝炎ウィルス抗 原を、 G S Tの酵素活性を指標にして、 簡便に測定することができ る。 例えば、 G S Tの基質としてグルタチオンと C D N B (1-chlo ro-2,4-dinitrobenzene) を添カロすると、 3 4 0ナノメートノレに最 大吸収を持つ反応産物が合成され、 これをプレート リーダー装置に て測定するこ とができる。 また、 H D V抗原ポリペプチドに結合す る化合物を探索する方法では、 例えば、 lng/mL〜50mg/mL好ましく は 1 / g /mL~500 μ g /mLの His- tag配列融合 D型肝炎ウィルス抗原 C末端領含有タンパク質を、 B I A C OR E装置 （BI0C0RE社製） 用のセンサーチップ NTA上に流して固定化後、 1ηΜ〜500 μΜ好ましく は 1μΜ〜 100 μΜの被験化合物を含有する溶液を流し、 センサーダラ ムを観察することによって、 D型肝炎ウィルス抗原の C末端領域に 結合する化合物を探索することができる。  3) For example, add lng-500izg, preferably 1μ8-50μg of purified preparation of RNA polymerase II to one well of a 96-well microtiter plate and immobilize directly or use anti-RNA polymerase. II antibody lng to 500 μg, preferably 1 μg to 50 μg is added to one well of a 96-well microtiter plate and immobilized, and then: NA polymerase II can be indirectly immobilized. it can. A recombinant protein of hepatitis D virus antigen expressed in E. coli or the like in the presence or absence of a test compound of 1ηΜ to 500 μM, preferably 1 μM to lΟΟμΜ, for example, three-fused hepatitis 0 virus Recombinant antigen recombinant protein lng-500 / Ζg, preferably 1 μg-50 μg is added and allowed to react.After washing, bound hepatitis D virus antigen is easily measured using GST enzyme activity as an index. be able to. For example, when glutathione and CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzene) are added as GST substrates, a reaction product with the maximum absorption at 340 nanometers is synthesized, and this is measured using a plate reader. can do. In addition, a method for searching for a compound that binds to the HDV antigen polypeptide includes, for example, lng / mL to 50 mg / mL, preferably 1 / g / mL to 500 μg / mL of the His-tag sequence fusion hepatitis D virus antigen. The C-terminal region-containing protein is flown over a sensor chip NTA for a BIAC ORE device (manufactured by BI0C0RE), immobilized, and then a solution containing the test compound at 1ηΜ to 500 μΜ, preferably 1 μΜ to 100 μΜ is flowed, and the sensor is run. By observing the dram, it is possible to search for a compound that binds to the C-terminal region of the hepatitis D virus antigen.
本発明に用いられるポリべプチドを認識する抗体は、 本発明の HD V抗原ポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分断片ポリぺプ チ ドの精製標品を用いて、 ポリ クローナル抗体、 モノク ローナル抗 体等として作製することができる。 ( 1 ) ポリ クローナル抗体の作製 The antibody recognizing the polypeptide used in the present invention can be obtained by using a purified preparation of the HDV antigen polypeptide of the present invention or a purified fragment of the partial fragment polypeptide of the polypeptide to obtain a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. And so on. (1) Preparation of polyclonal antibody
本発明の HD V抗原ポリペプチドまたは該ポリペプチ ドの部分断 片ポリべプチドの精製標品を抗原と して用い、 動物に投与すること によ りポリ クロ ーナル抗体を作製することができる。  A polyclonal antibody can be prepared by administering the purified sample of the HDV antigen polypeptide of the present invention or a partially fragmented polypeptide of the polypeptide to an animal using the purified sample as an antigen.
投与する動物として、 ゥサギ、 ャギ、 ラッ ト、 マウス、 ハムスタ 一等を用いることができる。  Animals such as egrets, goats, rats, mice and hamsters can be used as the animals to be administered.
該抗原の投与量は動物 1匹当たり 5 0 ~ 1 0 0 β gが好ましい。 低分子べプチドを用いる場合は、 ペプチドをスカシガイへモシァ ニン (keyhole limpet haemocyanin) や牛チログロブリ ンなどのキ ャリ ァ蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。 抗原 とするペプチドは、 ぺプチド合成機で合成することができる。 The dose of the antigen is preferably 50 to 100 βg per animal. When a low molecular weight peptide is used, it is desirable to use, as an antigen, a peptide obtained by covalently binding a peptide to a carrier protein such as keyhole limpet haemocyanin or bovine thyroglobulin. A peptide serving as an antigen can be synthesized by a peptide synthesizer.
該抗原の投与は、 1 回目の投与の後 1〜 2週間おきに 3〜 1 0回 行う。 各投与後、 3〜 7 日 目に眼底静脈叢より採血し、 該血清が免 疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法 〔酵素免疫測定法 ( E L I S A法） ： 医学書院刊 （ 1 9 7 6年） 、 Antibodies- A Lab oratory Manual , し old 5pr ing Harbor Laboratory (1988)] 等で確 認する。  The administration of the antigen is performed 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the serum reacts with the antigen used for immunization by enzyme immunoassay [enzyme immunoassay (ELISA): published by Medical Shoin (1) 977), Antibodies-A Laboratory Manual, and old 5pring Harbor Laboratory (1988)].
免疫に用いた抗原に対し、 その血清が充分な抗体価を示した非ヒ ト哺乳動物より血清を取得し、 該血清を分離、 精製することによ り ポリ クロ ーナル抗体を取得することができる。  A polyclonal antibody can be obtained by obtaining serum from a non-human mammal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and separating and purifying the serum. .
分離、 精製する方法と しては、 遠心分離、 4 0〜 5 0 %飽和硫酸 アンモニゥムによる塩析、 力プリル酸沈殿 [Antibodies, A Labora tory manual , し old Spring Harbor Laboratory, (1988)〕 、 または D E A E—セファロースカラム、 陰イオン交換カラム、 プロテイン Aまたは G—力ラムあるいはゲル濾過力ラム等を用いるクロマ トグ ラフィ一等を、 単独または組み合わせて処理する方法があげられる ( 2 ) モノ ク ローナル抗体の作製 Methods for separation and purification include centrifugation, salting out with 40 to 50% saturated ammonium sulfate, and prillic acid precipitation [Antibodies, A Labora tory manual, old Spring Harbor Laboratory, (1988)], or DEAE-Sepharose column, anion exchange column, Protein A or G-column or chromatographic column using gel filtration column can be used alone or in combination. (2) Preparation of monoclonal antibody
(a)抗体産生細胞の調製  (a) Preparation of antibody-producing cells
免疫に用いた本発明のポリペプチ ドの部分断片ポリペプチドに対 し、 その血清が十分な抗体価を示したラッ トを抗体産生細胞の供給 源と して供する。  A rat whose serum shows a sufficient antibody titer against the polypeptide fragment of the polypeptide of the present invention used for immunization is used as a source of antibody-producing cells.
該抗体価を示したラッ トに抗原物質を最終投与した後 3〜 7 日 目 に、 脾臓を摘出する。  The spleen is removed 3 to 7 days after the last administration of the antigenic substance to the rat showing the antibody titer.
該脾臓を MEM培地 （日水製薬社製） 中で細断し、 ピンセッ トで ほぐし、 1， 2 0 0 r p mで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる 得られた沈殿画分の脾細胞を ト リ スー塩化アンモニゥム緩衝液 （ p H 7. 6 5 ) で 1〜 2分間処理し赤血球を除去した後、 ME M培 地で 3回洗浄し、 得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。 The spleen is shredded in MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), loosened with forceps, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded. Is treated with Tris-ammonium buffer (pH 7.65) for 1 to 2 minutes to remove red blood cells, washed three times with MEM medium, and the obtained splenocytes are used as antibody-producing cells. .
(b)骨髄腫細胞の調製 (b) Preparation of myeloma cells
骨髄腫細胞と しては、 マウスまたはラッ トから取得した株化細胞 を使用する。 例えば、 8—ァザグァニン耐性マウス （BALB/c由来） 骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8- U1 (以下、 P 3—U 1 と略す） 〔(： urr. Topi cs. Microbiol. Immunol. , 8丄， 1 (1978)、 Europ. J. Immunol. , 6 , 511 (1976)〕 、 SP2/0 - Agl4(SP- 2) [Nature, 276, 269 (1978)] 、 P3-X63-Ag8653(653) [J. Immunol.， 123, 1548 (1979)〕 、 P3-X6 3-Ag8(X63) [Nature, 256, 495 (1975)〕 等を用いることができる 。 これらの細胞株は、 8—ァザグァニン培地 〔R PM I — 1 6 4 0 培地にグルタミ ン ( 1 . 5 mmol/1) 、 2—メルカプトエタノール ( 5 X 1 0 "5mol/l) 、 ジェンタマイシン ( 1 0 g /m 1 ) および 牛胎児血清 （F C S ) (C S L社製、 1 0 %) を加えた培地 （以下 、 正常培地という） に、 さらに 8—ァザグァニン ( 1 5 μ g Zm 1 ) を加えた培地〕 で継代するが、 細胞融合の 3〜 4 日前に正常培地 で培養し、 融合には該細胞を 2 X 1 07個以上用いる。 As myeloma cells, use cell lines obtained from mice or rats. For example, 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BALB / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (hereinafter abbreviated as P3-U1) [(: urr. Topics. Microbiol. Immunol., 8 丄, 1 (1978), Europ.J. Immunol., 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) [J Immunol., 123, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)], etc. These cell lines are 8-azaguanine medium [R Glutamin (1.5 mmol / 1), 2-mercaptoethanol (5 × 10 " 5 mol / l), gentamicin (10 g / m 1) and fetal calf serum in PM I-164 medium (FCS) (CSL, 10%)-supplemented medium (hereinafter referred to as a normal medium) and further supplemented with 8-azaguanine (15 μg Zm 1). 3-4 days before normal medium In cultured using the cell 2 X 1 0 7 or more in the fusion.
( c )ハイブリ ドーマの作製 (c) Preparation of hybridoma
(a)で取得した抗体産生細胞と（b)で取得した骨髄腫細胞を MEM 培地または P B S (リ ン酸ニナト リ ウム 1 . 8 3 g、 リ ン酸一カリ ゥム 0. 2 1 g、 食塩 7. 6 5 g、 蒸留水 1 リ ッ トル、 p H 7. 2 ) でよく洗浄し、 細胞数が、 抗体産生細胞 ： 骨髄腫細胞 = 5〜 1 0 ： 1になるよう混合し、 1 , 2 0 0 r p mで 5分間遠心分離した後 、 上清を捨てる。  The antibody-producing cells obtained in (a) and the myeloma cells obtained in (b) were combined with MEM medium or PBS (1.83 g of sodium sodium phosphate, 0.21 g of potassium phosphate, Wash well with 7.65 g of saline, 1 liter of distilled water, pH 7.2), and mix the cells so that the number of antibody-producing cells: myeloma cells = 5 to 10: 1. After centrifugation at 200 rpm for 5 minutes, discard the supernatant.
得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、 該細胞群に、 攪拌しな がら、 3 7 °Cで、 1 08抗体産生細胞あたり、 ポリエチレングライ コール一 1 0 0 0 (P E G— 1 0 0 0 ) 2 g、 MEM 2 m l および ジメチルスルホキシ ド (DM S O) 0. 7 m 1 を混合した溶液を 0 . 2〜 l m l添加し、 さ らに 1〜 2分間毎に MEM培地 1〜 2 m 1 を数回添加する。  The cells in the precipitate fraction thus obtained were thoroughly disintegrated, and the cells were stirred at 37 ° C at 37 ° C per polyethylene antibody-producing cell (polyethylene glycol 100 (PEG-100) at 37 ° C. 0) 2 g, 2 ml of MEM and 0.7 ml of dimethylsulfoxide (DMSO) were added in an amount of 0.2 to 1 ml, and then 1 to 2 ml of MEM medium every 1 to 2 minutes. Add 1 several times.
添加後、 MEM培地を加えて全量が 5 0 m 1 になるように調製す る。 該調製液を 9 0 0 r p mで 5分間遠心分離後、 上清を捨てる。 得られた沈殿画分の細胞を、 ゆるやかにほぐした後、 メスピペッ ト による吸込み、 吹出しでゆるやかに HAT培地 〔正常培地にヒポキ サンチン （ 1 CT 4mol/l) 、 チミ ジン （ 1 . 5 X 1 0— 5mol/l) およ びアミ ノプテリ ン （ 4 X 1 0— 7mol/l) を加えた培地〕 1 0 0 m l 中に懸濁する。 After the addition, add MEM medium to adjust the total volume to 50 ml. After centrifuging the preparation at 900 rpm for 5 minutes, discard the supernatant. Gently loosen the cells of the obtained precipitate fraction, then slowly inhale and blow out with a mesipette. HAT medium [Hypoxanthin (1 CT 4 mol / l), thymidine (1.5 X 1 0- 5 mol / l) and amine Noputeri emissions (4 X 1 0- 7 mol / l) was added medium] is suspended in 1 0 0 ml.
該懸濁液を 9 6穴培養用プレートに 1 0 0 μ 1 /穴ずつ分注し、 5 % C O 2インキュベータ一中、 3 7 °Cで 7〜 1 4 日間培養する。 培養後、 培養上清の一部をと りアンチボディィズ [Antibodies, A Laboratory manual , し old spring Harbor Laboratory, し napter 14 (1988)〕 等に述べられている酵素免疫測定法によ り、 本発明の ポリべプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイプリ ドーマを選択する。 The suspension is dispensed into a 96-well culture plate at a rate of 100 μl / well and cultured at 37 ° C. for 7 to 14 days in a 5% CO 2 incubator. After culturing, a part of the culture supernatant is taken and used for the enzyme immunoassay described in Antibodies, A Laboratory manual, Old spring Harbor Laboratory, Shinapter 14 (1988), etc. A hybrid which specifically reacts with the polypeptide fragment polypeptide of the present invention Select a dormer.
酵素免疫測定法の具体例と して、 以下の方法をあげることができ る。  The following methods can be given as specific examples of the enzyme immunoassay.
免疫の際、 抗原に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリべ プチドを適当なプレートにコー ト し、 ハイプリ ドーマ培養上清もし く は後述の（d)で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、 さ らに第二抗体と してビォチン、 酵素、 化学発光物質あるいは放射線 化合物等で標識した抗ラッ トまたは抗マウスィムノグロプリ ン抗体 を反応させた後に標識物質に応じた反応を行い、 本発明のポリぺプ チドに特異的に反応するものを本発明のモノクローナル抗体を生産 するハイプリ ドーマとして選択する。  At the time of immunization, the partial fragment polypeptide of the polypeptide of the present invention used as the antigen is coated on an appropriate plate, and the hybridoma culture supernatant or the purified antibody obtained in (d) described below is used as the primary antibody. And then react with an anti-rat or anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, or a radioactive compound as a second antibody, and then react with the labeled substance. Then, those which specifically react with the polypeptide of the present invention are selected as hybridomas producing the monoclonal antibody of the present invention.
該ハイプリ ドーマを用いて、 限界希釈法によりクローニングを 2 回繰り返し 〔 1回目は、 HT培地 （HAT培地からアミ ノプテリ ン を除いた培地） 、 2回目は、 正常培地を使用する〕 、 安定して強い 抗体価の認められたものを本発明のモノク口ーナル抗体を産生する ハイプリ ドーマ株として選択する。  Using the hybridoma, cloning was repeated twice by the limiting dilution method (the first time using HT medium (medium obtained by removing aminopterin from the HAT medium), and the second time using normal medium). Those with a strong antibody titer are selected as the hybridoma strain producing the monoclonal antibody of the present invention.
(d)モノクローナル抗体の調製 (d) Preparation of monoclonal antibody
プリスタン処理 〔 2， 6， 1 0 , 1 4—テ トラメチルペンタデカ ン （P r i s t a n e ) 0. 5 m l を腹腔内投与し、 2週間飼育す る〕 した 8〜 1 0週令のマウスまたはヌードマウスに、 （c)で取得 した本発明のポリペプチドモノク ローナル抗体産生ハイプリ ドーマ 細胞 5〜 2 0 X 1 06細胞/匹を腹腔内に注射する。 1 0〜 2 1 日 間でハイプリ ドーマは腹水癌化する。 8- to 10-week-old mice or nudes treated with pristane (0.5 ml of 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (Pristane) administered intraperitoneally and bred for 2 weeks) The mouse is intraperitoneally injected with 5 to 20 × 10 6 cells / animal producing the hybridoma cells producing the polypeptide monoclonal antibody of the present invention obtained in (c). In 10 to 21 days, the hybridoma becomes ascites tumor.
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、 3 , O O O r p mで 5 分間遠心分離して固形分を除去する。  Ascites is collected from the ascites-tumor-carcinated mouse, and the solid content is removed by centrifugation at 3, OOOrpm for 5 minutes.
得られた上清よ り、 ポリ ク ローナルで用いた方法と同様の方法で モノ ク ローナル抗体を精製、 取得することができる。 抗体のサブクラスの決定は、 マウスモノク ローナル抗体タイ ピン グキッ トまたはラッ トモノ ク ローナル抗体タイ ピングキッ トを用い て行う。 ポリペプチド量は、 ローリー法あるいは 2 8 O n mでの吸 光度より算出する。 From the obtained supernatant, a monoclonal antibody can be purified and obtained in the same manner as in the polyclonal method. The subclass of the antibody is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or rat monoclonal antibody typing kit. The polypeptide amount is calculated by the Lowry method or from the absorbance at 28 O nm.
本発明で得られた化合物を含有する医薬製剤は、 活性成分として 化合物単独で、 あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合 物と して含有することができる。 また、 それら医薬製剤は、 活性成 分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混 合し、 製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法によ り製造される。  The pharmaceutical preparation containing the compound obtained in the present invention can contain the compound alone as the active ingredient, or as a mixture with any other active ingredient for treatment. In addition, such pharmaceutical preparations are prepared by mixing the active ingredient with one or more pharmacologically acceptable carriers, and by any method well known in the technical field of pharmaceuticals. You.
投与経路は、 治療に際し最も効果的なものを使用するのが望まし く、 経口または、 例えば静脈内などの非経口をあげることができる 投与形態と しては、 錠剤、 散剤、 顆粒剤、 シロ ップ剤、 注射剤な ど力 sめる。 It is desirable to use the most effective route for treatment, and it can be oral or parenteral such as intravenous. Dosage forms include tablets, powders, granules, and syrups. -up agents, injections soil force s Mel.
経口投与に適当な、 例えばシロ ップ剤のよ うな液体調製物は、 水 、 蔗糖、 ソルビッ ト、 果糖などの糖類、 ポ リ エチレングリ コ一ル、 プロ ピレングリ コールなどのダリ コール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油などの油類、 p —ヒ ドロキシ安息香酸エステル類などの防腐 斉 IJ、 ス トロベリーフ レーパー、 ペパーミ ントなどのフ レ一パ一類な どを使用して製造できる。 また、 錠剤、 散剤および顆粒剤などは、 乳糖、 ブドウ糖、 蔗糖、 マンニッ トなどの賦形剤、 澱粉、 アルギン 酸ソーダなどの崩壌剤、 ステアリ ン酸マグネシウム、 タルクなどの 滑沢剤、 ポ リ ビニールアルコール、 ヒ ドロ キシプロ ピルセルロース 、 ゼラチンなどの結合剤、 脂肪酸エステルなどの界面活性剤、 グリ セリ ンなどの可塑剤などを用いて製造できる。  Liquid preparations suitable for oral administration, e.g., syrups, include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, dalicols such as polyethylene glycol, propylene glycol, sesame oil, It can be manufactured using oils such as olive oil and soybean oil, preservatives such as p-hydroxybenzoic acid esters, and flappers such as strawberry flapper and peppermint. Tablets, powders, granules, and the like include lactose, glucose, sucrose, mannite, and other excipients; starch, sodium alginate and other disintegrants; magnesium stearate, talc, and other lubricants; It can be produced using a binder such as vinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, or gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin.
非経口投与に適当な製剤は、 好ましく は受容者の血液と等張であ る活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。 例えば、 注射剤の場合は 、 塩溶液、 ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からな る担体などを用いて注射用の溶液を調製する。 Formulations suitable for parenteral administration are preferably isotonic with the blood of the recipient. A sterile aqueous preparation containing the active compound. For example, in the case of an injection, a solution for injection is prepared using a carrier composed of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of saline and a glucose solution.
また、 これら非経口剤においても、 経口剤で例示した希釈剤、 防 腐剤、 フ レーパー類、 賦形剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 結合剤、 界面活性 剤、 可塑剤などから選択される 1種もしくはそれ以上の捕助成分を 添加することもできる。  In addition, these parenteral preparations are also selected from the diluents, preservatives, flappers, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers and the like exemplified for the oral preparation. One or more scavenging components may be added.
本発明で得られた化合物の投与量および投与回数は、 投与形態、 患者の年齢、 体重、 治療すべき症状の性質もしくは重篤度によ り異 なるが、 通常経口の場合、 成人一人当り 0. 0 1 m g〜 l g、 好ま しくは 0. 0 5〜 5 0 m gを一日一回ないし数回投与する。 静脈内 投与などの非経口投与の場合、 成人一人当り 0. 0 0 1 〜 1 0 0 m g、 好ましくは 0. 0 1〜 ： L O m gを一日一回ないし数回投与す る。 しかしながら、 これら投与量および投与回数に関しては、 前述 の種々の条件により変動する。  The dose and frequency of administration of the compound obtained according to the present invention vary depending on the mode of administration, the age and weight of the patient, and the nature or severity of the condition to be treated. 0.1 mg to lg, preferably 0.05 to 50 mg, administered once or several times daily. In the case of parenteral administration such as intravenous administration, 0.001 to 100 mg, preferably 0.01 to: LOmg per adult is administered once to several times a day. However, the dose and the number of administrations vary depending on the various conditions described above.
本発明の D型肝炎ウィルス抗原 （HDV抗原） のアミノ酸配列の 全部または一部分を含み、 かつ RNAポリメラーゼ IIと結合するポ リペプチドは、 各種の器官、 組織または細胞、 例えば動物細胞、 例 えば肝臓もしくは肝細胞、 神経もしくは神経細胞、 筋肉もしくは.筋 肉細胞、 脂肪細胞、 血管もしく は血管内皮細胞または胚性肝細胞、 などに存在する遺伝子の転写を促進することによ り、 各種のタンパ ク質の産生を促進するこ とが出来る。 転写が促進される遺伝子は、 特に、 その細胞が属する組織または器官で特異的に発現される遺伝 子であるが、 それに限定されない。  Polypeptides containing all or part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the present invention and binding to RNA polymerase II can be various organs, tissues or cells, for example, animal cells, for example, liver or liver Various proteins by promoting the transcription of genes present in cells, nerve or nerve cells, muscle or muscle cells, adipocytes, blood vessels or vascular endothelial cells or embryonic hepatocytes, etc. Production can be promoted. A gene whose transcription is promoted is particularly, but not limited to, a gene that is specifically expressed in the tissue or organ to which the cell belongs.
組織、 器官または細胞特異的に発現される遺伝子と しては、 例え ば肝細胞特異的な α—フエ トプロテイン遺伝子、 11 -3]3遺伝子、 Η NF - 4ひ遺伝子、 イ ンスリ ンレセプター遺伝子もしく は 0ΑΤΡ- C遺伝子 ； 神経細胞特異的な神経特異的エノラーゼ遺伝子、 NRSF遺伝子、 SC G10遺伝子、 シナプシン遺伝子もしく は ELAV遺伝子 ； 筋肉細胞特異 的な MyoD遺伝子、 マイオジェニン遺伝子、 Myf 5遺伝子、 MRF4遺伝 子もしくはミオシン重鎖遺伝子 ； または脂肪細胞特異的な PPAR v遺 伝子、 UCP1遺伝子、 PGC-1遺伝子、 リポプロテインリパーゼ遺伝子 もしく はァポリポプロティン遺伝子などが挙げられる。 Genes expressed in a tissue, organ or cell-specific manner include, for example, hepatocyte-specific α-protein protein gene, 11-3] 3 gene, ΗNF-4 gene, and insulin receptor gene. Or 0ΑΤΡ-C gene Nerve cell-specific nerve-specific enolase gene, NRSF gene, SCG10 gene, synapsin gene or ELAV gene; muscle cell-specific MyoD gene, myogenin gene, Myf5 gene, MRF4 gene or myosin heavy chain gene Or an adipocyte-specific PPARv gene, UCP1 gene, PGC-1 gene, lipoprotein lipase gene or apolipoprotein gene.
更に、 必ずしも器官または組織特異的ではない遺伝子としては、 例えばヒス ト ン HI遺伝子、 ヒス ト ン H3遺伝子、 RPB1遺伝子、 RPB2遺 伝子、 3ァクチン遺伝子、 GAPDH遺伝子、 DS IFpl60遺伝子、 DSIFpl4 遺伝子、 NELF- A遺伝子または NELF - E遺伝子などが挙げられる。  Furthermore, genes that are not necessarily organ- or tissue-specific include, for example, histone HI gene, histone H3 gene, RPB1 gene, RPB2 gene, 3 actin gene, GAPDH gene, DS IFpl60 gene, DSIFpl4 gene, NELF -A gene or NELF-E gene.
従って本発明の D型肝炎ウィルス抗原 （H D V抗原） のアミ ノ酸 配列の全部または一部分を含み、 かつ R N Aポリ メラーゼ I Iと結合 するポリペプチ ドは、 特定の組織または器官において、 特定のまた は種々の遺伝子の発現が望まれる場合、 例えば肝臓、 神経、 筋肉、 、 血管、 などの再生医療などにおいて特に有用である。  Therefore, a polypeptide that contains all or a part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the present invention and binds to RNA polymerase II can be used in a specific tissue or organ in a specific or various When gene expression is desired, it is particularly useful in, for example, regenerative medicine for liver, nerve, muscle, blood vessel, and the like.
また、 上記の用途においては、 本発明の D型肝炎ウィルス抗原 （ H D V抗原） のアミ ノ酸配列の全部または一部分を含み、 かつ R N Aポリ メラーゼ I Iと結合するポリペプチド自体を投与してもよいが 、 必ずしもその必要はなく、 上記のポリペプチドをコードする遺伝 子 （典型的には D N A ) を、 対象となる組織や器官の細胞に導入し て、 遺伝子治療として用いてもよい。 細胞への目的遺伝子の挿入は 常用の技法を用いて行う ことができる。  In the above-mentioned application, the polypeptide itself containing all or a part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the present invention and binding to RNA polymerase II may be administered. However, this is not always necessary, and a gene (typically, DNA) encoding the above-described polypeptide may be introduced into cells of a target tissue or organ and used for gene therapy. Insertion of the target gene into the cell can be performed using a conventional technique.
従って、 本発明は、 一つの態様において、 本発明の D型肝炎ウイ ルス抗原 （H D V抗原） のアミノ酸配列の全部または一部分を含み 、 かつ R N Aポリ メラーゼ I Iと結合するポリぺプチドを有効成分と して含んでなる、 遺伝子の発現促進剤を提供する。 上記タンパク質 は特に組織、 器官または細胞特異的タンパク質である。 上記の組織 、 器官または細胞は、 例えば肝臓もしくは肝細胞、 神経もしく は神 経細胞、 筋肉もしく は筋肉細胞、 脂肪細胞、 血管もしくは血管内皮 細胞または胚性肝細胞などである。 本願発明の組成物は前記の器官 または組織の再生医療において特に有用である。 Accordingly, in one embodiment, the present invention provides, as an active ingredient, a polypeptide that contains all or a part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the present invention and that binds to RNA polymerase II. And a gene expression promoter. Said proteins are in particular tissue, organ or cell specific proteins. The above organization The organ or cell is, for example, liver or hepatocyte, nerve or neuron cell, muscle or muscle cell, fat cell, vascular or vascular endothelial cell or embryonic hepatocyte. The composition of the present invention is particularly useful in regenerative medicine of the above-mentioned organ or tissue.
本発明はまた、 他の態様において、 本発明の D型肝炎ウィルス抗 原 （HDV抗原） のアミ ノ酸配列の全部または一部分を含み、 かつ RNAポリ メラーゼ IIと結合するポリべプチドをコ一ドする DAN を有効成分として含んでなる、 遺伝子の発現促進剤を提供する。 上 記タンパク質は特に組織、 器官または細胞特異的タンパク質である 。 上記の組織、 器官または細胞は、 例えば肝臓もしく は肝細胞、 神 経もしくは神経細胞、 筋肉もしく は筋肉細胞、 脂肪細胞、 血管もし くは血管内皮細胞または胚性肝細胞などである。 本願発明の組成物 は前記の器官または組織の再生医療において特に有用である。  The invention also provides, in another embodiment, a polypeptide which comprises all or part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the invention and which binds to RNA polymerase II. A gene expression promoter comprising DAN as an active ingredient. Said proteins are in particular tissue, organ or cell specific proteins. Said tissue, organ or cell is, for example, a liver or hepatocyte, a neural or neuronal cell, a muscle or muscle cell, a fat cell, a blood vessel or vascular endothelial cell or an embryonic hepatocyte. The composition of the present invention is particularly useful in the regenerative medicine of the above-mentioned organ or tissue.
本発明の D型肝炎ウィルス抗原 （HDV抗原） のアミ ノ酸配列の 全部または一部分を含み、 かつ RNAポリ メラーゼ IIと結合するポ リペプチドとしては、 例えば、  Examples of the polypeptide that contains all or a part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) of the present invention and binds to RNA polymerase II include:
(i) H D V抗原の C末端から N末端に向かって 1 0 0残基以内 の C末端ァミノ酸配列からなり、 かつ RN Aポリ メラーゼ I I と結 合するポリベプチ ド ；  (i) a polypeptide comprising a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and which binds to RNA polymerase II;
(ii) 配列番号 4〜 9のいずれかに記載のァミノ酸配列で示され るポリペプチド ；  (ii) a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 9;
(iii) 配列番号 1〜 9のいずれかに記载のァミ ノ酸配列におい て、 1以上のアミ ノ酸残基が欠失、 置換もしく は付加されたァミノ 酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メラーゼ I I と結合するポリぺプ チド ； または  (iii) an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, wherein one or more amino acid residues are deleted, substituted or added, and A polypeptide that binds to polymerase II; or
(iv) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のァミ ノ酸配列と 60%以 上の相同性を有するァミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メラー ゼ I I と結合するポリペプチド ； (iv) an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and an RNA polymerase A polypeptide that binds to Ze II;
である。 実施例 It is. Example
参考例. D型肝炎ウィルス抗原と RN Aポリ メラーゼ I Iの相互作 用の検出 Reference Example. Detection of interaction between hepatitis D virus antigen and RNA polymerase II
GST融合 D型肝炎ウィルス抗原耝換えタンパク質を作製するため 、 H D Vのゲノム断片が挿入されたプラスミ ド PX9 (Makino, S. et al.， Nature 329, 343-346 (1987))を用い、 配列番号 1 0および 配列番号 1 1 の配列を有する铸型オリ ゴヌク レオチ ドをプライマー と して用いた PCRを行ない、 D型肝炎ウィルス抗原の遺伝子断片を 増幅した。  GST-fused hepatitis D virus antigen-recombinant protein was prepared using plasmid PX9 (Makino, S. et al., Nature 329, 343-346 (1987)) into which an HDV genomic fragment was inserted. PCR using the type I oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 as a primer was performed to amplify the gene fragment of the hepatitis D virus antigen.
この PCR断片を大腸菌用発現べクタ一 pGEX- 6P1 ( AmershamPharmac ia Biotech社製） にクローニングし、 組換え DNAを大腸菌 BL- 21- Cod onPlus- RP株 （Stratagene社製） に形質転換した。 この大腸菌をァ ンピシリ ンを含む培養液で増殖させ、 培養液にィソプロ ピルチオ - β -D-ガラク トシドを添加することで組換えタンパク質の発現を誘 導した。 この大腸菌を回収し、 超音波破碎することで、 組換えタン パク質を含む大腸菌溶解液を調製した。  This PCR fragment was cloned into pGEX-6P1 (Amersham Pharmacia Biotech), an expression vector for Escherichia coli, and the recombinant DNA was transformed into Escherichia coli BL-21-CodonPlus-RP (Stratagene). This Escherichia coli was grown in a culture solution containing ampicillin, and the expression of the recombinant protein was induced by adding isopropylthio-β-D-galactoside to the culture solution. The Escherichia coli was recovered and sonicated to prepare an Escherichia coli lysate containing the recombinant protein.
D型肝炎ウィルス抗原と RN Αポリ メラーゼ I I の相互作用を検 出するため、 適当量の大腸菌溶解液と Glutathione- Sepharose (Ame rsham Pharmacia Biotech社製） を混合レ、 GST融合 D型肝炎ウイ ルス抗原、 約 1マイク ログラムを Sepharose粒子に結合させた。 そこ に、 R N Aポリ メ ラーゼ I I を含む HeLa細胞核抽出液、 約 500マイ クログラムを添加し混合した。 非結合画分を除去した後、 Sepharos e粒子にバッファーを加えて再度 BF分離した。 この操作を数回繰り 返すことによって、 特異的吸着成分を選別した。 吸着成分を SDSポ リアク リルアミ ドゲル電気泳動により分離し、 それらを PVDF膜上に 転写した。 PVDF膜上の: NAポリ メラーゼ I I を、 抗 RNAポリ メ ラーゼ I I抗体 （Babco社製）を用いた免疫ブロッテイングにより検 出した。 結果を図 1 に示す。 To detect the interaction between hepatitis D virus antigen and RNII polymerase II, mix an appropriate amount of Escherichia coli lysate with Glutathione-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech), GST fusion hepatitis D virus antigen About 1 microgram was bound to the Sepharose particles. HeLa cell nucleus extract containing RNA polymerase II and about 500 micrograms were added thereto and mixed. After removing the unbound fraction, a buffer was added to the Sepharose particles, and BF separation was performed again. By repeating this operation several times, specific adsorbed components were selected. SDS po Separation was carried out by reactive amide gel electrophoresis, and they were transferred onto a PVDF membrane. On the PVDF membrane: NA polymerase II was detected by immunoblotting using an anti-RNA polymerase II antibody (Babco). The results are shown in Figure 1.
RNAポリ メラーゼ I I は全長の GST融合 D型肝炎ゥィルス抗原 を固定化した親和性カラムとは結合した （図 1のレーン 2、 14) が 、 GST部分のみを固定化した親和性力ラムとはほとんど結合しなか つた （図 1のレーン 7、 9)。 従って、 D型肝炎ウィルス抗原と R N Aポリ メラーゼ I I は特異的に結合することが示唆された。 次に、 D型肝炎ウィルス抗原の欠損変異体を融合した GSTタンパク質を用 いたところ、 カルボキシ末端領域のわずか 8ァミノ酸の欠失が RN Aポリ メラーゼ I I との結合を損なわせたのに対し （図 1のレーン 3〜6)、 ァミ ノ末端の 1〜 129番目のアミ ノ酸の欠失は RNAポリ メ ラーゼ I I との結合にほとんど影響しなかった （図 1のレーン 10〜 13)。 従って、 この実験条件下では、 D型肝炎ウィルス抗原の 130〜 195番目のアミ ノ酸の領域が RNAポリ メ ラーゼ I I との結合に必 要であることが示された。  RNA polymerase II bound to the affinity column on which the full-length GST-fused hepatitis D virus antigen was immobilized (lanes 2 and 14 in Fig. 1), but almost completely different from the affinity ram on which only the GST portion was immobilized. No binding (lanes 7, 9 in Figure 1). Therefore, it was suggested that hepatitis D virus antigen and RNA polymerase II specifically bind. Next, using a GST protein fused to a hepatitis D virus antigen-deficient mutant, the deletion of only 8 amino acids in the carboxy-terminal region impaired the binding to RNA polymerase II ( In FIG. 1, lanes 3 to 6), deletion of amino acids 1-129 at the amino terminus had little effect on the binding to RNA polymerase II (lanes 10 to 13 in FIG. 1). Thus, under these experimental conditions, it was shown that the amino acid region at positions 130 to 195 of the hepatitis D virus antigen is required for binding to RNA polymerase II.
実施例 1. D型肝炎ウィルス抗原と RNAポリメラーゼ I I との結 合を阻害するタンパク質の探索 Example 1. Search for a protein that inhibits the binding between hepatitis D virus antigen and RNA polymerase II
D型肝炎ウィルス抗原と RN Aポリ メラーゼ I I の相互作用を調 ぺる反応系に図 2記載のタンパク質を加え、 D型肝炎ウィルス抗原 と RNAポリ メラーゼ I I の結合を阻害するタンパク質を探索した 図 2記載の D型肝炎ウィルス抗原の野生体または様々な変異体、 または D型肝炎ウィルス抗原以外のタンパク質をコー ドする遺伝子 をプラスミ ド pcDNA3 (Invitrogen社製） にク ローニングした。 TNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation Systems (Pr omega 社製） を用いて、 これらの組換え DN Aを铸型と した転写、 翻訳反 応を行ない、 [35S]で標識されたタンパク質の単品または混合物を 調製した。 The proteins shown in Fig. 2 were added to the reaction system for the interaction between hepatitis D virus antigen and RNA polymerase II, and proteins that inhibit the binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II were searched for. The wild-type or various mutants of hepatitis D virus antigen or a gene encoding a protein other than hepatitis D virus antigen were cloned into plasmid pcDNA3 (Invitrogen). TNT T7 Quick Coupled Transcription / Translation Systems (Promega Using these recombinant DNAs as type I, transcription and translation reactions were carried out to prepare single proteins or mixtures of [35S] -labeled proteins.
これらのタンパク質を、 RNAポリ メ ラーゼ I I を含む HeLa細胞 核抽出液、 約 500マイクログラムと混合し、 抗 RNAポリ メラーゼ I 丄 体と Protein G-Sepharose AmersnamPharmac ia Biotech社製 ) を用いて免疫沈降した。 沈降物を SDSポリアク リルアミ ドゲル電 気泳動により分離し、 ゲルをォートラジオグラフィーするこ とによ つて、 RNAポリ メラーゼ I I と結合したタンパク質を検出した。 結果を図 2に示す。  These proteins were mixed with about 500 micrograms of HeLa cell nuclear extract containing RNA polymerase II, and immunoprecipitated using anti-RNA polymerase I protein and Protein G-Sepharose Amersnam Pharmacia Biotech). . The precipitate was separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and proteins bound to RNA polymerase II were detected by autoradiography of the gel. The result is shown in figure 2.
1倍量の野生型 D型肝炎ウィルス抗原を単独で結合実験に用いた ， 場合、 野生型 D型肝炎ウィルス抗原と R N Aポリ メラーゼ I I の結 合が確認できた （図 2のレーン 12)。 こ こに 5倍量の野生型 D型肝 炎ウィルス抗原をさらに加えても、 野生型 D型肝炎ウィルス抗原と RNAポリ メラーゼ I I の結合は阻害されず、 むしろ総結合量は増 加した （図 2のレーン 7)。 しかし、 1倍量の野生型 D型肝炎ウィル ス抗原に 5倍量の変異型 D型肝炎ウィルス抗原 AC8または AC31を加 えると、 野生型 D型肝炎ウィルス抗原と RNAポリ メ ラーゼ IIの結 合はほとんど確認できなかった （図 2のレーン 8、 9)。 一方、 1倍量 の野生型 D型肝炎ウィルス抗原に 5倍量の変異型 D型肝炎ウィルス 抗原 ΔΝ88またはルシフェラーゼタンパク質を加えても、 野生型 D 型肝炎ウィルス抗原と RNAポリ メラーゼ I I の結合はほとんど阻 害されなかった （図 2のレーン 10、 11)。 従って、 調べたタンパク 質のうち、 変異型 D型肝炎ウィルス抗原 AC8と AC31は野生型 D型 肝炎ウィルス抗原と： NAポリ メラーゼ I Iの結合を阻害する働き を持つことが示された。  When 1-fold amount of wild-type hepatitis D virus antigen was used alone in the binding experiment, binding of wild-type hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II was confirmed (lane 12 in FIG. 2). Addition of a 5-fold amount of wild-type hepatitis D virus antigen did not inhibit the binding of wild-type hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II, but rather increased the total amount (Fig. Lane 2 of 2). However, when one-fold the amount of wild-type hepatitis D virus antigen and five-fold the amount of mutant hepatitis D virus antigen AC8 or AC31, the binding of the wild-type hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II occurs. Was almost unidentified (lanes 8, 9 in Figure 2). On the other hand, even if 1-fold amount of wild-type hepatitis D virus antigen and 5-fold amount of mutant hepatitis D virus antigen ΔΝ88 or luciferase protein were added, binding of wild-type hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II was almost complete. Not blocked (lanes 10, 11 in Figure 2). Therefore, among the proteins examined, it was shown that mutant hepatitis D virus antigens AC8 and AC31 have a function of inhibiting the binding of wild-type hepatitis D virus antigen to: NA polymerase II.
D型肝炎ウィルス抗原は多量体構造をとることが報告されている (Xia, Y.P. and Lai, M. M. , J. Virol. 66, 6631-6648 (1992))。 RNAポリ メラーゼ I I結合活性を持たない AC8と AC31は、 野生 型 D型肝炎ウィルス抗原とへテ口多量体を形成することで、 野生型 D型肝炎ウィルス抗原と RNAポリ メラーゼ I I の結合を阻害して いると推定される。 Hepatitis D virus antigen has been reported to adopt a multimeric structure (Xia, YP and Lai, MM, J. Virol. 66, 6631-6648 (1992)). AC8 and AC31, which do not have RNA polymerase II binding activity, inhibit the binding of wild-type hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II by forming a heteromultimer with wild-type hepatitis D virus antigen. It is estimated that
試験例 1. 実施例 1で選ばれたタンパク質による H D V複製の抑制 実施例 1で選ばれたタンパク質を細胞内で発現させ、 HD Vの複 製阻害を検出した。 Test Example 1. Inhibition of HDV replication by the protein selected in Example 1 The protein selected in Example 1 was expressed in cells, and the inhibition of HDV replication was detected.
野生型 HDVゲノムを発現するプラスミ ド pSVL (D3) (Kuo,M. Y.P . et al. J. Virol.63, 1945 - 1950 (1989)) を、 様々なタンパク質 をコー ドする遺伝子を pcDNA3に挿入したプラスミ ド （上述） と共に 、 リ ン酸カルシウム法によつて HeLa細胞に トランスフエクショ ンし た。 トランスフエクシヨ ンの 3日後に、 HeLa細胞の全 R N Aをセパ ゾール試薬（ナカライテスク社製） を用いて抽出し、 そのうちの 10 マイクログラムを、 ホルムアミ ド変性ァガロースゲル電気泳動によ り分離した。 分離した RNAをナイ ロン膜上に転写し、 ナイロン膜 上に存在する HDV-RNA量をノーザンブロッティングにより定量した 。 HDV- RNAの検出には、 HDV- RNA特異的な配列番号 1 2の配列を持つ オリ ゴヌクレオチドプローブを用いた。 結果を図 3に示す。  Plasmid pSVL (D3) (Kuo, MYP. Et al. J. Virol. 63, 1945-1950 (1989)) expressing the wild-type HDV genome was inserted into pcDNA3 with genes encoding various proteins. And transfected into HeLa cells by the calcium phosphate method. Three days after transfection, all RNAs of HeLa cells were extracted using Sepasol reagent (Nacalai Tesque), and 10 micrograms thereof were separated by formamide denaturing agarose gel electrophoresis. The separated RNA was transferred onto a nylon membrane, and the amount of HDV-RNA present on the nylon membrane was quantified by Northern blotting. For detection of HDV-RNA, an oligonucleotide probe having the sequence of SEQ ID NO: 12 specific to HDV-RNA was used. The results are shown in Figure 3.
野生型 HD Vゲノムを導入した細胞では、 複製した HDV- RNAが検 出できた （図 3のレーン 1)。 しかし、 野生型 H D Vゲノムと共に変 異型 D型肝炎ウィルス抗原 AC8または AC31を発現させると、 HDV-R NAの複製は著しく抑制された （図 3のレーン 3、 4)。 一方、 対象実 験と して、 野生型 HD Vゲノムと共に野生型 D型肝炎ウィルス抗原 や変異型 D型肝炎ウィルス抗原 ΔΝ88、 ルシフエラ一ゼタンパク質 を発現させても、 HDV-RNAの複製にはほとんど影響しなかった （図 3のレーン 2、 5、 6)。 従って、 厶 C8と AC31は野生型 HD Vゲノム の複製を阻害する働きを持つことが示された。 In cells transfected with the wild-type HDV genome, replicated HDV-RNA could be detected (lane 1 in Fig. 3). However, when the mutant hepatitis D virus antigen AC8 or AC31 was expressed together with the wild-type HDV genome, the replication of HDV-RNA was significantly suppressed (Fig. 3, lanes 3 and 4). On the other hand, even if the wild-type HDV genome was expressed together with the wild-type hepatitis D virus antigen, mutant hepatitis D virus antigen ΔΝ88, and luciferase protein, almost no replication of HDV-RNA was performed. No effect (lanes 2, 5, 6 in Figure 3). Thus, C8 and AC31 are the wild-type HDV genomes. It has been shown to have a function of inhibiting the replication of s.
実施例 2. D型肝炎ウィルス抗原と RNAポリ メラーゼ I I の相互 作用を阻害する低分子化合物の探索 Example 2. Search for low molecular weight compounds that inhibit the interaction between hepatitis D virus antigen and RNA polymerase II
R N Aポリ メ ラーゼ I I に富む HeLa細胞核画分のタンパク質を 96 穴マイクロタイタープレート上に固定化した。 各穴に、 GST融合 D 型肝炎ウィルス抗原を含んだ大腸菌溶解液と低分子化合物ライブラ リー LOPAC (Sigma- RBI社製） に含まれる化合物を添加し、 反応させ た。 各穴をパッファ一で洗浄して非結合タンパク質と低分子化合物 を除去した後、 GST融合 D型肝炎ウィルス抗原の残存量を、 GSTの酵 素活性を指標にして測定した。 GSTの酵素活性は、 GSTの基質である CDNB (1— chloro— 2，4一 dinitrobenzene) を各穴に添カロし、 生成され る 340 nmに最大吸収を持つ反応産物をプレー ト リーダー装置を用い て測定することによ り求めた。  The protein of the HeLa cell nuclear fraction rich in RNA polymerase II was immobilized on a 96-well microtiter plate. E. coli lysate containing the GST-fused hepatitis D virus antigen and the compounds contained in the low molecular weight compound library LOPAC (Sigma-RBI) were added to each well and reacted. After washing each well with a buffer to remove unbound proteins and low molecular weight compounds, the remaining amount of GST-fused hepatitis D virus antigen was measured using the GST enzyme activity as an index. The enzyme activity of GST is determined by adding a GST substrate, CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzene), to each well, and using a plate reader device to generate a reaction product that has a maximum absorption at 340 nm. It was determined by measurement.
約 600種類の低分子化合物ライブラリーをスク リ 一二ングした結 果、 8種類の化合物がマイクロタイタープレー ト上に残存する GST融 合 D型肝炎ウィルス抗原量を減少させた。 この結果を図 4に示す。 マイクロタイタープレート上に残存する GST融合 D型肝炎ウィルス 抗原量を減少させた化合物 a〜！！はそれぞれ、 a: benserazide hydro chloride、 b： R (-ノ- norapomorphine nydrobromide^ c： NS102、 d： (+/- ) - 5 - trif luoromethyl- 5， 6 - dihydrouracil、 e： 1- (3-chlorophe nyl )piperazine dihydrochlor ide^ f： quinacr ine dihydrochlorid e、 g： sulf aphenazole, h： sanguinar ine chlor ide7こった。 2種類 の化合物がマイクロタイタープレート上に残存する GST融合 D型肝 炎ウィルス抗原量を増加させた。 その他の約 590種類の化合物はほ とんど影響を及ぼさなかった。  As a result of screening about 600 low-molecular compound libraries, eight compounds reduced the amount of GST-fused hepatitis D virus antigen remaining on the microtiter plate. Fig. 4 shows the results. GST-fused hepatitis D virus remaining on microtiter plates Compounds with reduced antigen a-! ! Are a: benserazide hydrochloride, b: R (-no-norapomorphine nydrobromide ^ c: NS102, d: (+/-)-5-trif luoromethyl- 5, 6,-dihydrouracil, e: 1- (3-chlorophe nyl) piperazine dihydrochloride ^ f: quinacrine dihydrochloride e, g: sulfaphenazole, h: sanguinarine chlorchloride 7. Two types of compounds increase the amount of GST-fused hepatitis D virus antigen remaining on microtiter plates About 590 other compounds had little effect.
マイクロタイタープレート上に残存する GST融合 D型肝炎ウィル ス抗原量を減少させた 8種類の化合物 a〜hが D型肝炎ウィルス抗原 と R N Aポリ メラーゼ I I の相互作用に影響するこを確認するため 、 GST融合 D型肝炎ウィルス抗原を固定化した Sepharose粒子を RN Aポリ メラーゼ I I を含む HeLa細胞核抽出液およびこれらの化合物 と混合し、 GST融合 D型肝炎ウィルス抗原に結合した RN Aポリ メ ラーゼ II量を免疫ブロ ッテイ ングによ り測定した。 GST融合 D型肝 炎ウィルス抗原と結合する RNAポリ メラーゼ I I の量は、 化合物 a、 e、 f、 g、 hの添加によってそれぞれ減少した。 この結果を図 5 に示す。 Eight compounds a to h that reduced the amount of GST-fused hepatitis D virus remaining on the microtiter plate were hepatitis D virus antigens Sepharose particles immobilized with GST-fused hepatitis D virus antigen were mixed with HeLa cell nucleus extract containing RNA polymerase II and these compounds to confirm the effect of the interaction between RNA polymerase II and RNA polymerase II. The amount of RNA polymerase II bound to the GST-fused hepatitis D virus antigen was measured by immunoblotting. The amount of RNA polymerase II bound to the GST-fused hepatitis D virus antigen was reduced by the addition of compounds a, e, f, g, and h, respectively. Figure 5 shows the results.
試験例 2. 実施例 2で選ばれた化合物による D型肝炎ウィルス抗原 による転写活性化の抑制 Test Example 2. Inhibition of transcriptional activation by hepatitis D virus antigen by the compound selected in Example 2
細胞内には、 RN Aポリ メラーゼ I I による転写を抑制するタン パク質因子 DSIF(DRB sensitivity-inducing factor) h NELF(negati ve elongation factor), そしてその抑制を解除するタンパク質因 -? -P-TEFb( positive transcription elongation factor b)力 S含まれ ている。 P- TEFbは DRB感受性のタンパク質リ ン酸化酵素であり、 そ の酵素活性を通じて DSIFと NELFによる転写抑制を解除する。 D型肝 炎ウィルス抗原による転写活性化には 2つの側面がある。 第 1に、 D 型肝炎ウィルス抗原は NELFと RNAポリ メラーゼ I I との相互作用 を妨げることで DSIFと NELFによる転写抑制を解除する。 第 2に、 D 型肝炎ウィルス抗原は RN Aポリ メラーゼ I I と相互作用すること で転写を直接促進する。 つまり、 P- TEFbと D型肝炎ウィルス抗原は 異なる機構で DSIFと NELFによる転写抑制を解除している。  In the cells, the protein factor DSIF (DRB sensitivity-inducing factor) h NELF (negati ve elongation factor) that suppresses transcription by RNA polymerase II, and the protein factor that releases the repression-? -P-TEFb (positive transcription elongation factor b) force S is included. P-TEFb is a DRB-sensitive protein phosphatase that releases transcriptional repression by DSIF and NELF through its enzymatic activity. There are two aspects to transcriptional activation by hepatitis D virus antigen. First, the hepatitis D virus antigen releases transcriptional repression by DSIF and NELF by blocking the interaction of NELF with RNA polymerase II. Second, hepatitis D virus antigen directly promotes transcription by interacting with RNA polymerase II. In other words, P-TEFb and hepatitis D virus antigen release transcriptional repression by DSIF and NELF by different mechanisms.
HeLa細胞の核抽出液を用いた試験管内転写反応においては、 P-TE Fbが活性な状態にあり、 DSIFと NELFによる抑制がもともと解除され ているため、 D型肝炎ウィルス抗原による転写促進効果がわずかし か認められない。 P- TEFbが持つ酵素活性の特異的阻害剤 DRBを転写 反応に加えると、 D型肝炎ウィルス抗原による著しい転写活性化が 認められる。 In the in vitro transcription reaction using the nuclear extract of HeLa cells, P-TE Fb is in an active state and the suppression by DSIF and NELF was originally released. Only a few are recognized. When DRB, a specific inhibitor of the enzymatic activity of P-TEFb, is added to the transcription reaction, significant transcriptional activation by hepatitis D virus antigen Is recognized.
化合物 a、 e、 f、 g、 hを試験管内転写反応に加え、 D型肝炎ウイ ルス抗原による転写促進効果の阻害を検出した。  Compounds a, e, f, g, and h were added to the in vitro transcription reaction, and the inhibition of the transcription promoting effect by the hepatitis D virus antigen was detected.
試験管内の転写反応は、 HeLa細胞核抽出液 20マイクログラムと铸 型 D N Aとしてプラスミ ド pTF3 - 6C2AT (Wada , T. et al. Genes De v. 12 , 343-356 ) 0. 125マイクログラムを混合し、 ATP、 CTP、 U'TPお よび [ a -32P] UTPを添加することによって行なった。 必要に応じて 、 さらに D型肝炎ウィルス抗原と低分子化合物を反応に加えた。 合 成された転写産物は尿素変性ポリアク リルァミ ドゲル電気泳動によ り分離し、 その合成量は画像解析装置 STORM ( Amersham Pharmac ia Biotech社製） を用いて定量した。 結果を図 6に示す。  The transcription reaction in the test tube was performed by mixing 20 micrograms of HeLa cell nuclear extract and 0.125 micrograms of plasmid pTF3-6C2AT (Wada, T. et al. Genes Dev. 12, 343-356) as 铸 -type DNA. ATP, CTP, U'TP and [a-32P] UTP were added. If necessary, hepatitis D virus antigen and low molecular weight compounds were added to the reaction. The synthesized transcripts were separated by urea-denatured polyacrylamide gel electrophoresis, and the synthesized amount was quantified using an image analyzer STORM (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). Fig. 6 shows the results.
D型肝炎ウィルス抗原および実施例 2で選ばれた化合物を反応に 加えないとき、 DRBの添加によって転写は約 1/10に抑制された。 DRB 非存在下において D型肝炎ウィルス抗原を加えると、 転写は約 1. 5 倍に促進された。 ここにさらに実施例 2で選ばれた化合物を加えた ところ、 D型肝炎ウィルス抗原によって促進された転写は抑制され た。 一方、 DRB存在下において D型肝炎ウィルス抗原を加えると、 転写は約 10倍に促進された。 ここにさ らに実施例 2で選ばれた化合 物を加えたところ、 D型肝炎ウィルス抗原によつて促進された転写 は抑制された。  When the hepatitis D virus antigen and the compound selected in Example 2 were not added to the reaction, the addition of DRB suppressed transcription to about 1/10. Addition of hepatitis D virus antigen in the absence of DRB increased transcription approximately 1.5-fold. When the compound selected in Example 2 was further added thereto, transcription promoted by the hepatitis D virus antigen was suppressed. On the other hand, when hepatitis D virus antigen was added in the presence of DRB, transcription was increased about 10-fold. When the compound selected in Example 2 was further added thereto, transcription promoted by the hepatitis D virus antigen was suppressed.
別途、 これらの化合物による R N Aポリ メラーゼ I I の直接的な 活性抑制を検討するため、 上記反応系で、 D型肝炎ウィルス抗原を 添加せずに、 DRB存在下、 非存在下で、 各化合物を添加したところ 、 化合物 a、 f、 hは転写をほぼ完全に抑制し、 R N Aポリメラーゼ I I活性を直接的に抑制していることが判明した。 そこで、 化合物 e、 gが D型肝炎ウィルス抗原と R N Aポリ メラーゼ I I との結合を 阻害することによって、 D型肝炎ウィルス抗原による転写促進効果 を阻害することが判明した。 Separately, in order to investigate the direct inhibition of RNA polymerase II activity by these compounds, in the above reaction system, each compound was added in the presence or absence of DRB without adding hepatitis D virus antigen As a result, it was found that compounds a, f, and h almost completely suppressed transcription and directly suppressed RNA polymerase II activity. Thus, compounds e and g inhibit the binding of hepatitis D virus antigen to RNA polymerase II, thereby enhancing the transcription promoting effect of hepatitis D virus antigen. Was found to inhibit.
実施例 3. Example 3.
精製された RNAポリ メラーゼ I I とデォキシシチジンティル化 DNAを用いて、 D型肝炎ウィルス抗原が RN Aポリ メラーゼ I I の転写伸長反応に与える効果を試験管内で測定した。 デォキシシチ ジンティル化 D N Aは特殊な末端を持つ線状 D N Aである。 R N A ポリメラーゼ I I はデォキシシチジンティル化 DNAを铸型とした 転写反応において、 転写開始反応をスキップして、 転写伸長反応を 行なう ことができる。  Using the purified RNA polymerase II and deoxycytidine-tiled DNA, the effect of the hepatitis D virus antigen on the RNA elongation reaction of RNA polymerase II was measured in vitro. Deoxycithinated DNA is a linear DNA with special ends. RNA polymerase II can perform a transcription elongation reaction by skipping the transcription initiation reaction in a transcription reaction using deoxycytidine-tilted DNA as type III.
R N Aポリ メ ラーゼ I I とデォキシシチジンティル化 D N Aを混 合し、 AT P， G T P , C T P， UT Pおよび 〔 α—32Ρ〕 UT P を加えて、 8分または 1 6分反応させた。 必要に応じて、 さらに D 型肝炎ウィルス抗原と α—アマ二チンを加えた。 合成された転写産 物は尿素変性ポリアタ リルアミ ドゲル電気泳動により分離し、 その 合成量は画像解析装置 S T O RM (Amersham Pharmacia Biotech社 製） を用いて定量した。 結果を図 7に示す。  RNA polymerase II and deoxycytidine-tilted DNA were mixed, and ATP, GTP, CTP, UTP and [α-32Ρ] UTP were added thereto, and the mixture was reacted for 8 minutes or 16 minutes. Hepatitis D virus antigen and α-amanitin were added as needed. The synthesized transcripts were separated by urea-denatured polyacrylamide gel electrophoresis, and the amount of synthesis was quantified using an image analyzer STORM (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). Fig. 7 shows the results.
D型肝炎ウィルス抗原非添加時において、 RNAポリ メラ一ゼ I I は低い速度で RN Aを合成した （レーン 1， 2 ) 。 野生型 D型肝 炎ウィルス抗原を加えると、 RNAポリ メラ一ゼ I I は高い速度で RNAを合成した （レーン 5， 6 ) 。 一方、 RNAポリ メラーゼ I I と結合しない変異型 D型肝炎ウィルス抗原を加えると、 RNAポ リ メラーゼ I I は低い速度で RNAを合成した （レーン 9， 1 0 ) 。 RNAポリ メラーゼ I I の阻害剤である α—アマ二チンを加える と、 いずれの場合でも RN Α合成は完全に阻害された。 従って、 D 型肝炎ウィルス抗原自体に RN A合成活性があるわけではなく、 観 察された RNA合成は RNAポリ メラーゼ I I に由来することが分 かった。 そして、 RNAポリ メ ラーゼ I I結合型の D型肝炎ウィル ス抗原は RN Aポリ メ ラーゼ I I の転写伸長反応を著しく活性化す ることが分かった。 When no hepatitis D virus antigen was added, RNA polymerase II synthesized RNA at a low rate (lanes 1 and 2). When wild-type hepatitis D virus antigen was added, RNA polymerase II synthesized RNA at a high rate (lanes 5, 6). On the other hand, when a mutant hepatitis D virus antigen that does not bind to RNA polymerase II was added, RNA polymerase II synthesized RNA at a low rate (lanes 9, 10). The addition of α-amanitin, an inhibitor of RNA polymerase II, completely inhibited RNΑ synthesis in all cases. Therefore, it was found that the hepatitis D virus antigen itself did not have RNA synthesizing activity, and that the observed RNA synthesis was derived from RNA polymerase II. And RNA polymerase II-linked hepatitis D virus These antigens were found to significantly activate the RNA elongation reaction of RNA polymerase II.
D型肝炎ウィルス抗原が遺伝子発現に及ぼす効果を検討した。 D 型肝炎ウィルス抗原をウィルスベクターを用いてヒ ト肝癌由来の H u h 7細胞に導入し、 D型肝炎ウィルス抗原を恒常的に発現する細 胞を調製した。 この細胞および元の H u h 7細胞からそれぞれ R N Aを調製し、 Gene Chip ( Af fymetr ix社製） を用いて遺伝子発現解析 を行なった。 結果の一部を下記表に示す。  The effect of hepatitis D virus antigen on gene expression was examined. Hepatitis D virus antigen was introduced into human hepatoma-derived Huh7 cells using a viral vector to prepare cells that constantly express hepatitis D virus antigen. RNA was prepared from these cells and the original Huh7 cells, respectively, and gene expression analysis was performed using Gene Chip (manufactured by Affymetrix). Some of the results are shown in the table below.
Huh7 D型肝炎ウィルス 細胞細胞 抗原発現細胞 プロニユーロテンシン遺伝子 1.0 21.0Huh7 hepatitis D virus cell cell antigen-expressing cell proneurotensin gene 1.0 21.0
ΡΡΠ α遺伝子 1.0 15.5 a—フエ トプロティ ン遺伝子 1.0 13.4 ダルタチオン S トランスフェラ一ゼ遺伝子 1.0 11.9 ΡΡΠ α gene 1.0 15.5 a-Phytoprotein gene 1.0 13.4 Daltathione S transferase gene 1.0 11.9
UDPク"ノレク 口ノシノレトランスフ エラーゼ遺伝子 1.0 9.5  UDP "Norek Mouth Nosinoretransfer erase gene 1.0 9.5
TSC501遺伝子 1.0 8.0 元の H u h 7細胞細胞と比較して、 D型肝炎ウィルス抗原発現細 胞ではプロニユー ロテンシン遺伝子、 Ρ Ρ Η α遺伝子、 α—フエ ト プロティン遺伝子、 グルタチオン トランスフヱラーゼ遺伝子、 U D Ρダルク口ノシル ト ラ ンスフエラーゼ遺伝子、 T S C 5 0 1遺伝 子の発現量がそれぞれ 2 1 . 0倍、 1 5. 5倍、 1 3. 4倍、 1 1 . 9倍、 9. 5倍、 8. 0倍増加していた。 従って、 D型肝炎ウイ ルス抗原は肝臓特異的遺伝子のみならず、 様々な遺伝子の発現に対 して活性化作用を示すことが分かった。  TSC501 gene 1.0 8.0 Compared to the original Huh 7 cell, the hepatitis D virus antigen-expressing cells show proneurogensin gene, Ρ Ρ Η α gene, α-phytoprotein gene, glutathione transferase gene, UD Ρ The expression levels of the Darcian nosyltransferase gene and the TSC501 gene are 21.0, 15.5, 13.4, 11.9, 9.5, and 9.5, respectively. Had increased by a factor of 0. Therefore, it was found that hepatitis D virus antigen has an activating effect on the expression of various genes as well as liver-specific genes.
RNAポリ メラーゼ I I による転写反応は一連の素過程、 すなわ ち開始、 伸長、 そして終結、 から構成されている。 このうちの転写 伸長反応には数分から 1 日を要する。 その所要時間はそれぞれの遺 伝子の長さに依存している。 遺伝子長の長い遺伝子や迅速な発現制 御を必要とする遺伝子にとって、 転写伸長反応は重要な律速段階と なっている。 The transcription reaction by RNA polymerase II is composed of a series of elementary processes, namely, initiation, elongation, and termination. Transcription of this The extension reaction takes several minutes to one day. The time required depends on the length of each gene. The transcription elongation reaction is an important rate-limiting step for long genes and genes that require rapid expression control.
D型肝炎ウィルス抗原は R N Aポリ メラーゼ I I と結合し、 転写 伸長反応を著しく活性化する。 その活性化作用は比較的幅広い遺伝 子に及ぶ。 従って、 D型肝炎ウィルス抗原を適当な発現系を用いて 細胞内で発現させることによって、 様々な遺伝子の発現を転写伸長 段階において促進することができる。 また、 D型肝炎ウィルス抗原 を塩基配列特異的な D N A結合ドメイ ンまたは R N A結合ドメイ ン と融合させたタンパク質を利用すれば、 D型肝炎ウィルス抗原を特 定の遺伝子上に結合させ、 特定の遺伝子の発現制御に利用すること ができる。 産業上の利用可能性  Hepatitis D virus antigen binds to RNA polymerase II and significantly activates the transcription elongation reaction. Its activation affects a relatively wide range of genes. Therefore, by expressing the hepatitis D virus antigen in cells using an appropriate expression system, expression of various genes can be promoted in the transcription elongation stage. In addition, if a protein obtained by fusing a hepatitis D virus antigen with a base sequence-specific DNA-binding domain or RNA-binding domain is used, the hepatitis D virus antigen can be bound to a specific gene and a specific gene can be bound. It can be used to control the expression of E. coli. Industrial applicability
本発明により、 D型肝炎治療剤の安全かつ効率的な探索方法を提 供することができる。  According to the present invention, a safe and efficient search method for a therapeutic agent for hepatitis D can be provided.

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims
1. D型肝炎ウィルス抗原 （以下 HDV抗原という） のアミ ノ酸 配列の全部または一部を含み、 かつ RN Aポリ メラーゼ I I と結合 するポリペプチド （以下 H D V抗原ポリペプチドという） と RNA ポリ メラーゼ I I とを含む系中に被験化合物を添加し、 該 HD V抗 原ポリペプチドと RNAポリメラーゼ I I との結合量を測定し、 該 結合量と被験化合物無添加の結合量とを比較して、 該結合を抑制し ている化合物を選択することを特徴とする D型肝炎治療剤の探索方 法。 1. A polypeptide that contains all or part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (hereinafter referred to as HDV antigen) and binds to RNA polymerase II (hereinafter referred to as HDV antigen polypeptide) and RNA polymerase II A test compound is added to a system containing the following, the amount of binding between the HDV antigen polypeptide and RNA polymerase II is measured, and the amount of binding is compared with the amount of binding without addition of the test compound. A method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D, which comprises selecting a compound that suppresses hepatitis.
2. H D V抗原ポリペプチドが、 HDV抗原のアミ ノ酸配列の全 部を含むポリペプチドである請求項 1記載の D型肝炎治療剤の探索 方法。  2. The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to claim 1, wherein the HDV antigen polypeptide is a polypeptide containing the entire amino acid sequence of the HDV antigen.
3. HDV抗原が、 配列番号 1、 2および 3記載のアミノ酸配列 から選ばれる一つのアミ ノ酸配列からなるポリペプチドである請求 項 2記載の D型肝炎治療剤の探索方法。  3. The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to claim 2, wherein the HDV antigen is a polypeptide consisting of one amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1, 2 and 3.
4. H D V抗原ポリペプチドが、 H D V抗原のアミ ノ酸配列の一 部を含むポリペプチド （以下 HDV抗原ポリべプチ ド誘導体という ) である請求項 1記載の D型肝炎治療剤の探索方法。  4. The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to claim 1, wherein the HDV antigen polypeptide is a polypeptide containing a part of the amino acid sequence of the HDV antigen (hereinafter referred to as HDV antigen polypeptide derivative).
5. HD V抗原ポリペプチド誘導体が、 下記 （i) 〜（iv)の群か ら選ばれるものである請求項 4記載の D型肝炎治療剤の探索方法。 5. The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to claim 4, wherein the HDV antigen polypeptide derivative is selected from the following groups (i) to (iv).
(i) HDV抗原の C末端から N末端に向かって 1 0 0残基以内の C末端アミノ酸配列からなり、 かつ： NAポリ メラーゼ I I と結合 するポリペプチ ド。 (i) a polypeptide comprising a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and: binding to NA polymerase II;
(ii) 配列番号 4〜 9のいずれかに記载のァミノ酸配列で示される ポリペプチド。  (ii) a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 9;
(iii) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のアミ ノ酸配列において 、 1以上のアミノ酸残基が欠失、 置換もしくは付加されたアミ ノ酸 配列からなり、 かつ RNAポリ メラーゼ I I と結合するポリべプチ ド、。 (iii) In the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues have been deleted, substituted or added, and which binds to RNA polymerase II.
(iv) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のアミ ノ酸配列と 60%以上 の相同性を有するァミノ酸配列からなり、 かつ RN Aポリ メ ラーゼ I I と結合するポリぺプチド。  (iv) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and binding to RNA polymerase II;
6. HD V抗原ポリペプチドが、 請求項 2〜 5のいずれかに記载 のポリペプチドに、 さらにタグペプチド、 マーカーペプチドまたは シグナルぺプチドょ り選ばれる一つ以上のぺプチドが付加されたァ ミ ノ酸配列からなり、 かつ RN Aポリ メラーゼ I I と結合するもの である請求項 1記載の D型肝炎治療剤の探索方法。  6. An HDV antigen polypeptide, wherein the polypeptide according to any one of claims 2 to 5 is further added with one or more peptides selected from a tag peptide, a marker peptide, and a signal peptide. 2. The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to claim 1, which comprises a amino acid sequence and binds to RNA polymerase II.
7. マーカーペプチドまたはシグナルペプチドよ り選ばれるぺプ チドが、 m y cポリペプチド、 β -ガラ ク トシダーゼ、 プロテイ ン Α、 プロテイ ン Αの I g G結合領域、 クロラムフエ二コール · ァセ チルトランスフェラーゼ、 ポリ （A r g) 、 ポリ （G l u) 、 プロ ティ ン G、 マルトース結合ポリペプチ ド、 ダルタチオン S-トラン スフエラーゼ、 ポリ ヒスチジン鎖、 Sペプチド、 DN A結合ポリべ プチ ド ドメイ ン、 T a c抗原、 チォレ ドキシン、 グリ ーン ' フルォ レツセント ' プロテイン、 F L A Gペプチド、 任意の抗体のェピト ープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルぺプチ ドからなる群よ り選 ばれるペプチドである請求項 6記載の D型肝炎治療剤の探索方法。  7. The peptide selected from the marker peptide or signal peptide is myc polypeptide, β-galactosidase, protein II, the IgG-binding domain of protein II, chloramphenicol acetyltransferase, and polypeptide. (A rg), poly (G lu), protein G, maltose-binding polypeptide, daltathione S-transferase, polyhistidine chain, S-peptide, DNA binding polypeptide domain, Tac antigen, thioredoxin The therapeutic agent for hepatitis D according to claim 6, which is a peptide selected from the group consisting of green 'fluorescent' protein, FLAG peptide, any antibody epitope and any secretory protein signal peptide. Search method.
8 , HD V抗原ポリぺプチドを含む系中に被験化合物を添加し、 該 HDV抗原ポリべプチ ドと結合する被験化合物を選択することを 特徴とする D型肝炎治療剤の探索方法。  8. A method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D, which comprises adding a test compound to a system containing an HDV antigen polypeptide and selecting a test compound that binds to the HDV antigen polypeptide.
9. H D V抗原ポリペプチドが、 HDV抗原のアミ ノ酸配列の全 部を含むポリべプチ ドである請求項 8記載の D型肝炎治療剤の探索 方法。 9. The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to claim 8, wherein the HDV antigen polypeptide is a polypeptide containing the entire amino acid sequence of the HDV antigen.
1 0. HDV抗原が、 配列番号 1、 2および 3記載のァミノ酸配 列から選ばれる一つのアミ ノ酸配列からなるポリペプチドである請 求項 9記載の D型肝炎治療剤の探索方法。 10. The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to claim 9, wherein the HDV antigen is a polypeptide comprising one amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1, 2 and 3.
1 1 . HD V抗原ポリペプチドが、 HD V抗原のァミ ノ酸配列の 一部を含むポリペプチド （以下 HDV抗原ポリペプチ ド誘導体とい う） である請求項 8記載の D型肝炎治療剤の探索方法。  11. The therapeutic agent for hepatitis D according to claim 8, wherein the HDV antigen polypeptide is a polypeptide containing a part of the amino acid sequence of the HDV antigen (hereinafter referred to as HDV antigen polypeptide derivative). Method.
1 2. HDV抗原ポリべプチド誘導体が、 下記 （i) 〜（iv)の群 から選ばれるものである請求項 1 1記載の D型肝炎治療剤の探索方 法。  12. The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to claim 11, wherein the HDV antigen polypeptide derivative is selected from the following groups (i) to (iv).
(i) HDV抗原の C末端から N末端に向かって 1 0 0残基以内の C末端ァミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メラーゼ I I と結合 するポリペプチド。  (i) A polypeptide consisting of a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and which binds to RNA polymerase II.
(ii) 配列番号 4〜 9のいずれかに記载のァミ ノ酸配列で示される ポリペプチド。  (ii) a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 9;
(iii) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のアミ ノ酸配列において (iii) In the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9,
、 1以上のアミ ノ酸残基が欠失、 置換もしく は付加されたアミ ノ酸 配列からなり、 かつ R N Aポリ メラーゼ I I と結合するポリべプチ ド、。 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues have been deleted, substituted or added, and which binds to RNA polymerase II.
(iv) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のアミ ノ酸配列と 6 0 %以 上の相同性を有するァミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メ ラー ゼ I I と結合するポリペプチ ド。  (iv) A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 9, and binding to RNA polymerase II.
1 3. H D V抗原ポリぺプチドが、 請求項 9〜 1 2のいずれかに 記載のポリペプチドに、 さらにタグペプチド、 マーカーペプチドま たはシグナルべプチドょ り選ばれる一つ以上のぺプチ ドが付加され たァミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メラーゼ I I と結合する ものである請求項 8記載の D型肝炎治療剤の探索方法。  1 3. The HDV antigen polypeptide is the polypeptide according to any one of claims 9 to 12, and one or more peptides selected from a tag peptide, a marker peptide, and a signal peptide. 9. The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to claim 8, comprising an added amino acid sequence and binding to RNA polymerase II.
1 4. マーカーペプチ ドまたはシグナルペプチドよ り選ばれるぺ プチドが、 m y cポリペプチド、 β -ガラク トシダーゼ、 プロティ ン k プロテイン Aの I g G結合領域、 クロラムフエ二コール ' ァ セチルトランスフェラーゼ、 ポリ （A r g ) 、 ポリ （G l u) 、 プ ロティ ン G、 マルトース結合ポリべプチド、 ダルタチオン S -トラ ンスフヱラーゼ、 ポリ ヒスチジン鎖、 Sペプチド、 DNA結合ポリ ペプチ ド ドメイ ン、 T a c抗原、 チォレ ドキシン、 グリーン . フル ォレツセント ' プロテイン、 F L AGペプチド、 任意の抗体のェピ トープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチドからなる群より 選ばれるぺプチドである請求項 1 3記載の D型肝炎治療剤の探索方 法。 1 4. Selected from marker peptides or signal peptides. Peptide is myc polypeptide, β-galactosidase, IgG binding region of protein k protein A, chloramphenicol 'acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu), protein G, maltose Binding polypeptide, daltathione S-transferase, polyhistidine chain, S-peptide, DNA-binding polypeptide domain, Tac antigen, thioredoxin, green. Fluorescent protein, FLAG peptide, any antibody epitope 14. The method for searching for a therapeutic agent for hepatitis D according to claim 13, which is a peptide selected from the group consisting of tope and a signal peptide of an arbitrary secreted protein.
1 5. 請求項 2〜 7、 9〜 1 4のいずれかに記載のポリペプチド をコードする DNA。  1 5. A DNA encoding the polypeptide according to any one of claims 2 to 7, and 9 to 14.
1 6. 請求項 1 5記載の D NAとス ト リ ンジェン トな条件下でハ イブリ ダイズする DN Aであり、 かつ該 DN Aがコ ー ドするポリべ プチドが RNAポリ メラーゼ I I と結合するポリペプチドをコード する D N A。  1 6. A DNA that hybridizes with the DNA according to claim 15 under stringent conditions, and the polypeptide encoded by the DNA binds to RNA polymerase II. DNA encoding a polypeptide.
1 7. 請求項 1 5または 1 6記載の DN Aをべクターに組み込ん で得られる耝換え体 D N A。  1 7. A recombinant DNA obtained by incorporating the DNA according to claim 15 or 16 into a vector.
1 8. 請求項 1 7記載の組換え体 DNAを保有する形質転換体。  1 8. A transformant having the recombinant DNA according to claim 17.
1 9. 請求項 1 8記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に1 9. Culturing the transformant according to claim 18 in a medium,
RNAポリ メラーゼ I I と結合するポリべプチドを生成蓄積させ、 該培養物から該ポリペプチ ドを採取することを特徴とする RNAポ リ メラーゼ I I と結合するポリべプチドの製造方法。 A method for producing a polypeptide that binds to RNA polymerase I I, comprising producing and accumulating a polypeptide that binds to RNA polymerase I I, and collecting the polypeptide from the culture.
2 0. 請求項 2〜 7、 9〜 1 4のいずれかに記載のポリペプチド を認識する抗体。  20. An antibody that recognizes the polypeptide according to any one of claims 2 to 7 and 9 to 14.
2 1 . 請求項 1 5または 1 6に記載の DN Aの塩基配列を記録し た電子媒体。 21. An electronic medium on which the nucleotide sequence of the DNA according to claim 15 or 16 is recorded.
2 2 . 請求項 2〜 7、 9〜 1 4のいずれかに記載のポリペプチ ド 配列を記録した電子媒体。 22. An electronic medium on which the polypeptide sequence according to any one of claims 2 to 7 and 9 to 14 is recorded.
2 3 . 配列番号 4〜 9に記载のァミ ノ酸配列から選ばれる一つの ァミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メ ラーゼ I I と結合するポ リベプチ ドである D型肝炎ウィルス抗原 C末端領域。  23. Hepatitis D virus antigen C consisting of one amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 4 to 9 and binding to RNA polymerase II Terminal region.
2 4 . 配列番号 4〜 9記载のァミ ノ酸配列から選ばれる一つのァ ミ ノ酸配列において、 1以上のアミ ノ酸が欠失、 置換も しく は付加 されたアミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メ ラーゼ I I と結合 するポリべプチ ドである D型肝炎ウィルス抗原 C末端領域誘導体。  24. In one amino acid sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 9, one or more amino acid sequences are deleted, substituted or added. A hepatitis D virus antigen C-terminal region derivative that is a polypeptide that binds to RNA polymerase II.
2 5 . 配列番号 4〜 9記載のアミ ノ酸配列から選ばれる一つのァ ミ ノ酸配列と 60%以上の相同性を有するァミ ノ酸配列からなり、 か つ R N Aポリ メ ラーゼ I I と結合するポリぺプチ ドである D型肝炎 ウィルス抗原 C末端領域誘導体。  25. Consists of an amino acid sequence having 60% or more homology with one amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 4 to 9, and binds to RNA polymerase II Hepatitis D virus antigen, a C-terminal region derivative.
2 6 . 請求項 2 3〜 2 5のいずれかに記載のポリペプチ ドに、 タ グペプチ ド、 マーカーペプチ ド、 またはシグナルペプチ ドよ り選ば れるペプチ ドが付加されたアミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メ ラーゼ I I と結合するポリぺプチ ドである D型肝炎ウィルス抗原 C末端領域誘導体。  26. The polypeptide according to any one of claims 23 to 25, comprising an amino acid sequence in which a peptide selected from a tag peptide, a marker peptide, or a signal peptide is added, and Hepatitis D virus antigen C-terminal region derivative, which is a polypeptide that binds to RNA polymerase II.
2 7 . タグぺプチ ド、 マーカーぺプチ ドまたはシグナルぺプチ ド よ り選ばれるペプチ ドが、 m y c ポリペプチ ド、 β -ガラク ト シダ ーゼ、 プロテイ ン Α、 プロテイ ン Αの I g G結合領域、 ク ロラムフ ェニコール . ァセチルトランスフェラーゼ、 ポリ （A r g ) 、 ポリ 27. The peptide selected from tag peptide, marker peptide or signal peptide is the IgG binding region of myc polypeptide, β-galactosidase, protein II, and protein II. , Chloramphenicol. Acetyltransferase, poly (Arg), poly
( G 1 u ) 、 プロテイ ン G、 マルトース結合ポリペプチ ド、 グルタ チオン S -トランスフェラーゼ、 ポリ ヒスチジン鎖、 Sペプチ ド、 D N A結合ポリペプチ ド ドメイ ン、 T a c抗原、 チォレ ドキシン、 グリーン ' フルォレツセント · プロテイ ン、 F L A Gぺプチ ド、 任 意の抗体のェピトープおよび任意の分泌蛋白質のシグナルペプチ ド からなる群より選ばれるペプチ ドである請求項 2 6記載の D型肝炎 ウィルス抗原 C末端領域誘導体。 (G1u), protein G, maltose-binding polypeptide, glutathione S-transferase, polyhistidine chain, S-peptide, DNA-binding polypeptide domain, Tac antigen, thioredoxin, green'fluorescent protein, FLAG peptide, epitope of any antibody and signal peptide of any secreted protein 27. The hepatitis D virus antigen C-terminal region derivative according to claim 26, which is a peptide selected from the group consisting of:
2 8. 請求項 1〜 1 4のいずれかに記載の探索方法によ り得られ る化合物。  2 8. A compound obtained by the search method according to any one of claims 1 to 14.
2 9. 請求項 2 8記載の化合物を有効成分として含有する D型肝 炎の治療剤。  29. A therapeutic agent for hepatitis D, comprising the compound according to claim 28 as an active ingredient.
3 0. D型肝炎ウィルス抗原 （HDV抗原） のアミ ノ酸配列の全 部または一部分を含み、 かつ RNAポリ メラーゼ IIと結合するポリ ペプチドを有効成分と して含んでなる、 遺伝子の発現促進剤。  30. Gene expression promoter comprising all or part of the amino acid sequence of hepatitis D virus antigen (HDV antigen) and a polypeptide that binds to RNA polymerase II as an active ingredient .
3 1. 上記遺伝子が、 組織、 器官または細胞特異的遺伝子である 請求項 3 0に記載の遺伝子発現促進剤。  31. The gene expression promoter according to claim 30, wherein the gene is a tissue, organ or cell-specific gene.
3 2. 上記の組織、 器官または細胞が、 肝臓もしく は肝細胞、 神 経もしく は神経細胞、 筋肉もしくは筋肉細胞、 脂肪細胞、 血管もし くは血管内皮細胞または胚性肝細胞である請求項 3 0または 3 1に 記載に遺伝子発現促進剤。  3 2. The above-mentioned tissue, organ or cell is a liver or hepatocyte, a nerve or nerve cell, a muscle or muscle cell, a fat cell, a blood vessel or a vascular endothelial cell or an embryonic hepatocyte. Item 30. The gene expression promoter according to Item 30 or 31.
3 3. 前記遺伝子が、 肝細胞特異的な α—フエ トプロティン遺伝 子、 1^?-3 ]3遺伝子、 HNF-4Q；遺伝子、 イ ンスリ ンレセプター遺伝子 もしく は 0ATP-C遺伝子 ； 神経細胞特異的な神経特異的エノラーゼ遺 伝子、 NRSF遺伝子、 SCG10遺伝子、 シナプシン遺伝子も しく は ELAV 遺伝子 ； 筋肉細胞特異的な MyoD遺伝子、 マイオジェニン遺伝子、 My f 5遺伝子、 MRF4遺伝子もしく はミオシン重鎖遺伝子 ； または脂肪 細胞特異的な PPAR T/遺伝子、 UCP1遺伝子、 PGC- 1遺伝子、 リポプロ ティンリパーゼ遺伝子もしく はァポリポプロティン遺伝子である、 請求項 3 0〜 3 2のいずれか 1項に記載の遺伝子発現促進剤。  3 3. The gene is a hepatocyte-specific α-fetoprotein gene, 1 ^?-3] 3 gene, HNF-4Q; gene, insulin receptor gene or 0ATP-C gene; nerve cell Specific nerve-specific enolase gene, NRSF gene, SCG10 gene, synapsin gene or ELAV gene; muscle cell-specific MyoD gene, myogenin gene, Myf5 gene, MRF4 gene or myosin heavy chain gene Or the adipocyte-specific PPAR T / gene, UCP1 gene, PGC-1 gene, lipoprotein lipase gene or apolipoprotein gene, according to any one of claims 30 to 32. Gene expression promoter.
3 4. 器官または組織の再生医療用である請求項 3 0〜 3 3のい ずれか 1項に記載の遺伝子発現促進剤。  34. The gene expression promoter according to any one of claims 30 to 33, which is for regenerative medicine of an organ or a tissue.
3 5. 前記の D型肝炎ウィルス抗原 （HDV抗原） のアミ ノ酸配 列の全部または一部分を含み、 かつ RNAポリ メラーゼ IIと結合す るポリペプチドが、 3 5. The amino acid sequence of hepatitis D virus antigen (HDV antigen) A polypeptide that contains all or part of a sequence and that binds RNA polymerase II;
(i) HDV抗原の C末端から N末端に向かって 1 0 0残基以内 の C末端アミノ酸配列からなり、 かつ RNAポリ メラーゼ I I と結 合するポリペプチド ；  (i) a polypeptide comprising a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and which binds to RNA polymerase II;
(ii) 配列番号 4〜 9のいずれかに記載のアミノ酸配列で示され るポリペプチド ；  (ii) a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 9;
(iii) 配列番号 1〜 9のいずれかに記载のァミノ酸配列におい て、 1以上のアミノ酸残基が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ 酸配列からなり、 かつ RNAポリ メラーゼ I I と結合するポリぺプ チ ド ； または  (iii) In the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, the amino acid sequence has one or more amino acid residues deleted, substituted or added, and binds to RNA polymerase II. A polypeptide; or
(iv) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のアミノ酸配列と 60%以 上の相同性を有するァミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メラー ゼ I I と結合するポリペプチド ；  (iv) a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and binding to RNA polymerase II;
である、 請求項 3 0〜 3 4のいずれか 1項に記載の遺伝子発現促進 剤。 The gene expression promoter according to any one of claims 30 to 34, wherein
3 6. D型肝炎ウィルス抗原 （HDV抗原） のアミ ノ酸配列の全 部または一部分を含み、 かつ RNAポリ メラーゼ IIと結合するポリ ペプチドをコードする DNAを有効成分と して含んでなる、 遺伝子 の発現促進剤。  3 6. A gene that contains all or part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen) and contains, as an active ingredient, DNA encoding a polypeptide that binds to RNA polymerase II. Expression promoter.
3 7. 上記遺伝子が、 組織、 器官または細胞特異的タンパク質で ある請求項 3 6に記載の遺伝子発現促進剤。  37. The gene expression promoter according to claim 36, wherein the gene is a tissue, organ or cell-specific protein.
3 8. 上記の組織、 器官または細胞が、 肝臓もしく は肝細胞、 神 経もしくは神経細胞、 筋肉もしく は筋肉細胞、 脂肪細胞、 血管もし く は血管内皮細胞または胚性肝細胞である請求項 3 6または 3 7に 記載に遺伝子発現促進剤。  3 8. The above-mentioned tissue, organ or cell is a liver or hepatocyte, a neural or nerve cell, a muscle or muscle cell, a fat cell, a blood vessel or a vascular endothelial cell or an embryonic hepatocyte. Item 36. The gene expression promoter according to Item 36 or 37.
3 9. 前記遺伝子が、 肝細胞特異的な α —フエ トプロティン遺伝 子、 HNF_3j3遺伝子、 HNF-4Q!遺伝子、 イ ンスリ ンレセプター遺伝子 もしく は 0ATP-C遺伝子 ； 神経細胞特異的な神経特異的エノラーゼ遺 伝子、 NRSF遺伝子、 SCG10遺伝子、 シナプシン遺伝子もしく は ELAV 遺伝子 ； 筋肉細胞特異的な MyoD遺伝子、 マイオジェニン遺伝子、 My f 5遺伝子、 MRF4遺伝子もしく はミオシン重鎖遺伝子 ； または脂肪 細胞特異的な PPARy遺伝子、 UCP1遺伝子、 PGC-1遺伝子、 リ ポプロ ティンリパーゼ遺伝子もしくはァポリポプロティン遺伝子である、 請求項 3 6〜 3 8のいずれか 1項に記載の遺伝子発現促進剤。 3 9. The gene is a hepatocyte-specific α -fetoprotein gene Gene, HNF_3j3 gene, HNF-4Q! Gene, insulin receptor gene or 0ATP-C gene; nerve cell-specific nerve-specific enolase gene, NRSF gene, SCG10 gene, synapsin gene or ELAV gene Muscle cell-specific MyoD gene, myogenin gene, Myf5 gene, MRF4 gene or myosin heavy chain gene; or adipocyte-specific PPARy gene, UCP1 gene, PGC-1 gene, lipoprotein lipase gene or 39. The gene expression promoter according to any one of claims 36 to 38, which is an apolipoprotein gene.
4 0. 器官または組織の再生医療用である請求項 3 6〜 3 9のい ずれか 1項に記載の遺伝子発現促進剤。  40. The gene expression promoter according to any one of claims 36 to 39, which is for regenerative medicine of an organ or tissue.
4 1 . .前記の D型肝炎ウィルス抗原 （HDV抗原） のアミ ノ酸配 列の全部または一部分を含み、 かつ: RNAポリ メラーゼ Πと結合す るポリペプチドが、  41. The polypeptide comprising all or a part of the amino acid sequence of the hepatitis D virus antigen (HDV antigen), and which binds to RNA polymerase 、,
(i) HDV抗原の C末端から N末端に向かって 1 0 0残基以内 の C末端ァミノ酸配列からなり、 かつ RN Aポリ メラーゼ I I と結 合するポリぺプチド ；  (i) a polypeptide comprising a C-terminal amino acid sequence within 100 residues from the C-terminus to the N-terminus of the HDV antigen, and which binds to RNA polymerase II;
(ii) 配列番号 4〜 9のいずれかに記载のァミノ酸配列で示され るポリペプチド ；  (ii) a polypeptide represented by the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 9;
(iii) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のァミノ酸配列におい て、 1以上のアミ ノ酸残基が欠失、 置換もしく は付加されたァミノ 酸配列からなり、 かつ RNAポリ メラーゼ I I と結合するポリぺプ チド ； または  (iii) an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, wherein one or more amino acid residues are deleted, substituted or added, and the RNA polymerase II A polypeptide that binds to; or
(iv) 配列番号 1〜 9のいずれかに記載のァミノ酸配列と 60%以 上の相同性を有するァミ ノ酸配列からなり、 かつ R N Aポリ メラー ゼ I I と結合するポリペプチド ；  (iv) a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 9, and which binds to RNA polymerase II;
である、 請求項 3 6〜 4 0のいずれか 1項に記載の遺伝子発現促進 剤。 The gene expression promoter according to any one of claims 36 to 40, wherein the agent is:
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