WO2002059295A1 - Novel serine protease mp493 - Google Patents

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WO2002059295A1
WO2002059295A1 PCT/JP2002/000465 JP0200465W WO02059295A1 WO 2002059295 A1 WO2002059295 A1 WO 2002059295A1 JP 0200465 W JP0200465 W JP 0200465W WO 02059295 A1 WO02059295 A1 WO 02059295A1
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WO
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protein
dna
activity
amino acid
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Application number
PCT/JP2002/000465
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Yusuke Nakamura
Sumio Sugano
Tomokazu Matsusue
Atsushi Okamoto
Kazufumi Okawa
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention relates to a novel transmembrane type relating to diseases such as various cancers, tumors, various lung diseases, asthma, allergy, bronchitis, emphysema, viral diseases, shock, multiple organ failure, Tengitis, various nephritis, etc.
  • An antisense nucleic acid that suppresses the expression of the serine protease; and screening of a diagnostic agent, an inhibitor, a pharmaceutical, etc., using the serine protease or a DNA encoding the same.
  • the method relates to the spatial coordinates of the serine protease domain of MP493 and its use.
  • Prior Art 'Serine proteases are a group of proteases with Ser residues essential for activity at the catalytic site.
  • the Ser residue in this active site is highly nucleophilic and activated. This nucleophilicity is Asp- It is maintained by three kinds of catalytic groups consisting of His-Ser.
  • Serine proteases are broadly classified into four types. That is, they are chymoto's ribosin type, spurtlysin type, serine carboxypeptidase type and site megalovirus protease type. Chymotrypsin, trypsin, and elastase have high homology in the amino acid sequence. However, their functions are different due to differences in the structure of substrate-binding pockets such as specificity pockets (S1 pockets). Although the primary and tertiary structures of the sptylysine form and the serine carboxy form are different, the arrangement of the active three residues is the same. On the other hand, the cytomegalovirus protease type has a similar arrangement of three active residues, but the Asp residue is replaced by the His residue.
  • Serine proteases are involved in a variety of cellular processes, from proprotein processing to intracellular degradation. In higher animals, it is involved in a large number of biological reactions such as food digestion, blood coagulation and fibrinolysis, complement activation, hormone production, ovulation and fertilization, phagocytosis, cell proliferation, development, differentiation, aging, and cancer metastasis. (Neurath, H. Science., Vol. 224, pp. 350-357, (1984)). Therefore, many researchers have been paying attention to this, but this is This is because the theatase is deeply involved in the pathogenesis and progression of various malignant diseases, including cancer and allergies.
  • proteases which are expressed in cancer cells and play important physiological functions, exist mainly in the group of proteases.
  • plasmin thrombin is a matrix phenomenon. It activates the oral protease group and promotes the secretion of murine macrophage elastase, and the PAR-I activation peptide activates murine macrophage elastase. It is known to induce the release of zeolites.
  • MMP 9 is activated by trypsin (Duncan ME et al. 'Eur J Biochem Vol. 258, pp. 37-43, (1998)).
  • TMPRS S2 serine protease that is specifically expressed in the prostate has been selected and cloned using the cDNA microarray technology in prostate cancer cells.
  • This serine protease named TMPRS S2
  • TMPRS S2 has been implicated in cancer invasion through the degradation of extracellular matrix ⁇ basement membrane components and activation of type IV collagenase.
  • serine proteases which have been May be involved in canceration by a mechanism that can be controlled
  • hepsin a protein discovered in 1998, has been used in liver and hepatocellular carcinoma. High expression has been reported. Knockout mice lacking this hepsin-encoding gene have also been produced, and are noted in blood coagulation due to the presence of factor VIII upregulation. Due to the rise of the medium repel, it has been suggested that hepsin may be one of the most effective tumors.
  • a ligand for protease-activated receptor-2 which enhances fibroblast proliferation and collagen production in vitro, and thus is a new source of asthma and pulmonary fibrosis. It is attracting attention as a therapeutic drug.
  • trypsin-zeclara expressed in the lung H. Kido et al., J. Biol. Chem., Vol. 267, p. 13573-13579 (1992); M. Tashiro et al., J. Virol., Vol. 66, pp. 7211-7216 (1992)
  • Serine proteases expressed in the viscera include the digestive enzyme trypsin. Trypsin is known to be derived from the gut of various animals, such as porcupine, pusin, human, and egret, and is used as the name of an enzyme that has a proteolytic activity contained in Teng's solution. It is known to be an enzyme of the endopeptidase group that is produced as inactive trypsinogen in acinous cells of the kidney. Tribosine is autocatalytically activated from trypsinogen by enterokinase, mold kinase, and cathepsin B to form tribosine.
  • the purified enzyme has been used in clinical practice because of its blood coagulation, lowering blood pressure, and anti-inflammatory effects. On the other hand, it is also known as a target for diseases such as inflammation. Development of enzymes with trypsin-like substrate specificity, development of trypsin-like proteases, and serine proteases that have trypsin-like activity and are targets for diseases such as inflammation There is an eager need for isolation.
  • Nephritis is a glomerular inflammatory disease of the kidney (spleen), and is minimally altered. Intraproliferative nephritis, crescentic nephritis, glomerulosclerosis, mesangial proliferative nephritis, membranous nephropathy, Membranous proliferative nephritis, end-stage sclerosing nephritis,
  • nephritis A nephritis is known. For treatment of nephritis, adrenal cortical hormone (steroids), immunosuppressants, anticoagulants, antiplatelets, diuretics, etc. are used. In recent years, cases where glomerulonephritis patients lack Factor I, a membrane-bound serine protease, have been reported. Factor I is an enzyme that inactivates C4b / C3b in the complement system, and its association has been noted (Sadallah S et al. 'Am J Kidney Dis., Vol. 33, pp. 1153.7, (1999)).
  • trombin a type of trypsin-type serine protease, regulates hexokinase activity and is associated with mesangial cells. It has also been reported to be involved in renal impairment (Robey RB et al. Kidney Int., Vol. 57, pp. 2308-18 (2000)).
  • endogenous inhibitor Megsin an inhibitor of serine protease, is expressed in a wide variety of nephritis, including IgA nephritis. It has been speculated that certain types of serine protease may also contribute to senility disorders.
  • the present invention relates to a novel gene isolated from a human gastric signet-ring cell carcinoma cell line.
  • the present invention provides a host cell transformed with the gene, and a method for producing recombinant MP493 using the transformed cell.
  • the present invention provides a method for evaluating a protease activity regulator for MP493, using a spatially coordinated partial structure model of MP493.
  • the present invention provides a gene, mp493, which encodes MP493 (described in detail below).
  • the gene can be isolated and identified from gastric signet ring carcinoma cells, but based on the sequence disclosed herein, a general engineering technique such as hybridization was used. It may be DNA prepared by a chemical synthesis method such as the cloning-phosphoramidite method. Examples of the form include cDNA, genomic DNA, and chemically synthesized DNA, but are not particularly limited. Further, the DNA of the present invention may be single-stranded or may form a double-stranded or triple-stranded chain by binding to DNA or RNA having a sequence complementary thereto. In addition, the DNA is used for enzymes such as horseradish peroxidase (HRPO), radioisotopes, fluorescent substances, and chemical sources. It may be labeled with a light substance or the like.
  • HRPO horseradish peroxidase
  • radioisotopes radioisotopes
  • fluorescent substances and chemical sources. It
  • the base sequence of mp493 is provided, the sequence of the RNA derived therefrom and the sequence of the complementary DNA and RNA are uniquely determined, so that the present invention corresponds to the DNA of the present invention. It should be understood that DNA or RNA having a sequence complementary to the RNA or DNA of the present invention is also provided.
  • the DNA of the present invention also includes a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 4 under stringent conditions.
  • the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 4 hybridizes with the DNA under stringent conditions, and the protein encoded by the DNA is a serine protein. Variation of the nucleotide sequence is allowed as long as the enzyme activity is maintained. For example, the presence of multiple codons that code for the same amino acid residue due to so-called codon degeneracy, or the use of various artificial treatments, such as site-directed mutagenesis or treatment with a mutagen Mutation of DNA fragments due to mutation or restriction enzyme cleavage Even if the DNA sequence is partially changed due to ligation, etc., these DNA mutants may be replaced with the DNA described in SEQ ID NO: 1 or 4. High under stringent conditions As long as the DNA is a pre-sidized DNA encoding serine protease, it is within the scope of the present invention, regardless of the difference from the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4.
  • the extent of the above DNA mutation is acceptable as long as it has 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more homology with the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4.
  • the degree of high pre-hybridization can be measured under normal conditions, for example, when the probe is lapel with the DIG DNA Labeling kit (Chain No. 1175033 manufactured by Lininger, Mannheim). 3 Neutralize in DIG Easy Hy solution (Behringer's Mannheim Cat No. 1603558) at 22 ° C, and then add 0.5 XSSC solution at 50 ° C.
  • the recombinant vector having the DNA of the present invention may be in any form, such as circular or linear. Such a recombinant vector may have another nucleotide sequence, if necessary, in addition to the DNA of the present invention. Good.
  • Other nucleotide sequences include the sequences of geno, nucleotide sequence, promoter sequence, ribosome binding sequence, nucleotide sequence used for amplification of copy number, and signal peptide. This refers to the nucleotide sequence to be transcribed, the nucleotide sequence encoding other polypeptides, the polyA-added sequence, the splicing sequence, the replication origin, the nucleotide sequence of the gene that plays a key role in selection, and the like.
  • a translation initiation codon and a translation termination codon are added to the DNA of the present invention using an appropriate synthetic DNA adapter, or an appropriate restriction enzyme cleavage sequence is added to the nucleotide sequence. It can be newly generated or eliminated. These are within the range of the work normally performed by those skilled in the art, and can be arbitrarily and easily processed based on the DNA of the present invention.
  • the vector carrying the DNA of the present invention may be used by selecting an appropriate vector according to the host to be used.
  • a vector such as a nacteriophage, a baculovirus, or a baculovirus.
  • viruses such as Troilei les and Vaccinia viruses, and there is no particular limitation.
  • the protein encoded by mp493 is the amino acid shown in SEQ ID NO: 2.
  • MP493 consisting of an array.
  • MP493 has catalytic residues, Asp304, Ser400, and His257, which are conserved in serine protease.
  • a serine protein that preferentially cleaves a substrate having a basic residue (L-Asp, L-Lys) at the P1 site of the substrate was analyzed. It turned out to be one. It also demonstrated that MP493, expressed and purified in recombinant cells, hydrolyzes the expected synthetic substrate and has the validity of the model structure and serine protease activity.
  • MP493 was found to have approximately 60% homology with TMPRSS2, Factor I, trypsin, hepsin, and ⁇ -trib-unicase in the primary structure. From the results of the motif analysis, ⁇ 493 showed an LDL receptor domain, a scavenger receptor domain and a transmembrane domain. Based on the above facts, it is determined that # 493 is a serine protease having a transmembrane structure.
  • MP 493 is thought to be involved in various lung diseases such as emphysema and pulmonary fibrosis./5 Tribuse, or a transmembrane cell that is thought to be involved in the development of glomerulonephritis. It has a structure similar to that of protein protease.
  • the gene mp493 in the living body was confirmed using cDNA libraries derived from various organs, the gene was expressed in the lung, lentil, kidney, and placenta. This was confirmed.
  • MP493 is closely involved in the development of these various diseases.
  • hydrolysis of the target protein by serine protease activity is considered to be significant in the development of these diseases, compounds that can specifically inhibit MP493 are useful as pharmaceuticals. Is expected to have.
  • the search for inhibitors of the protease activity using MP493 is expected to have important significance in drug development.
  • the protein has serine protease activity, one or more amino acids are substituted in the amino acid sequence of the protein shown in SEQ ID NO: 2; Polypeptides or proteins consisting of amino acid sequences that have been deleted and / or added are also within the scope of the present invention.
  • the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is the serine protease domain of MP493, and has serine protease activity.
  • the protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 can be easily produced by genetic engineering as compared with MP493, and is suitable for use in screening for an activity regulating substance of the protein. .
  • Amino acid residue side chains which are constituents of proteins, differ in hydrophobicity, charge, size, etc., but do not substantially affect the three-dimensional structure (also called three-dimensional structure) of the entire protein
  • several highly conservative partners are known. For example, for substitution of aminoic acid residues, glycine (Gly) and proline (Pro), Gly and alanine (Al a) or norin (Val), leucine (Le u) And isoleucine (lie), glutamic acid (Glu) and glutamine (Gin), ascraginate (Asp) and asparagine (Asn), cystine (Cys) and threonine (Thr), Thr and serine (Ser) or Ala; lysine (Lys) and arginine (Arg);
  • A1a Val, Leu, Ile, Pro, methionine (Met), phenylalanine (Phe), tripfan (Trp), Gly, C Since both ys are classified
  • Examples of uncharged electrode-type amino acids include Ser, Thr, tyrosine (Tyr), Asn, and Gin.
  • Examples of acidic amino acids include Asp and G1u.
  • Examples of the basic amino acid include Lys, Arg, and histidine (His).
  • substitutions on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 5 Even if the protein is a mutant protein due to insertion, deletion, or the like, if the mutation is a protein having serine protease activity, which is an essential function of the present invention, these are within the scope of the present invention.
  • the protein specified by the spatial coordinates in FIG. 9 also has serine protease activity as MP493, and is therefore within the scope of the present invention. .
  • the substitution, deletion, and / or addition of amino acids is allowed for the protein specified by the spatial coordinates in Fig. 9 as long as it retains serine protease activity. It is.
  • Such modification of amino acid is found in nature, such as a mutation caused by a genetic polymorphism, etc., as well as by methods known to those skilled in the art, for example, mutagenesis using a mutagenic agent such as NTG. It can be performed artificially by using an induction method or a site-specific mutagenesis method using various recombinant gene techniques.
  • the amino acid mutation site and number are not particularly limited as long as the mutant protein retains serine protease activity, but the number of mutations is usually within several tens of amino acids, and preferably 10 amino acids. Within the amino acid, more preferably within one or several.
  • the present invention further provides an antibody that binds to MP493 or a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the antibody of the present invention An antibody that specifically recognizes the whole protein or its partial peptide as an antigen, and includes a monoclonal antibody and / or a polyclonal antibody.
  • there are five classes (IgG IgA, IgM, IgD, IgE) classified as immunoglobulin structure, physicochemical properties and immunological properties, or subclasses depending on the type of H chain. It may belong to it.
  • fragments such as F (ab,) 2 when immunoglobulin is decomposed with pepsin, Fab when decomposed with pappine, and chimeric antibodies are also used. You may. These antibodies are useful for research or clinical detection of MP493, clinical treatment of diseases that can be caused by MP493, and the like.
  • the present invention provides a so-called antisense nucleic acid capable of suppressing MP493 biosynthesis at the nucleic acid level in a living body.
  • the antisense nucleic acid is a transcription step from the genomic region necessary for producing MP493-encoding mRNA to pre-mRNA, a processing step from pre_mRNA to mature mRNA, and a passage through the nuclear membrane.
  • Step-At one of the translation steps into protein, it binds to DNA or RNA, which carries the genetic information, and affects the normal flow of genetic information. It means a substance that regulates the expression of a protein, and may consist of a sequence complementary to the whole or any part of the nucleic acid sequence of gene mp493.
  • nucleic acid including DNA and RNA
  • it is a nucleic acid (including DNA and RNA) consisting of a sequence corresponding to or complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the mRNA transcribed from the genomic region has an intron structure or a form containing a translated region at the 5'-end, 3'-end or 3'-end, the mRNA is equivalent to or complementary to the sequence of the untranslated portion.
  • the antisense nucleic acid used will also have a function equivalent to that of the antisense nucleic acid of the present invention.
  • the antisense nucleic acid of the present invention includes, in addition to DNA and RNA, all derivatives of three-dimensional structure and function similar to DNA and RNA. For example, substitution or modification of at least one of the nucleic acid, oligonucleotide base, sugar, and phosphoric acid with another substance bound to the 3'-end or 5'-end And nucleic acids having a skeleton (backbone) other than the sugar-monophosphate skeleton, such as a nucleic acid having a non-naturally occurring base, a sugar or phosphoric acid, and the like. These nucleic acids are suitable as inducers with at least one increase in nuclease resistance, tissue selectivity, cell permeability, and avidity. That is, it is possible to suppress the expression of MP493 activity. There is no limitation on the form of the nucleic acid as long as it has the function of
  • a base sequence that hybridizes to a loop portion of an inRNA forming a stem-loop that is, a base complementary to a base sequence of a region forming a stem-loop.
  • Antisense nucleic acids having a sequence are preferred.
  • an antisense nucleic acid that binds to the vicinity of the translation initiation codon, ribosome binding site, cabling site, or splice site that is, an antisense nucleic acid having a sequence complementary to the sequence of these sites is also generally used. It is preferable because a high expression suppression effect can be expected.
  • the antisense nucleic acid of the present invention has a chain length of 15 bases or more and 30 bases or less, preferably 15 bases or more. Those comprising a base sequence having a base number of 25 bases or less, more preferably 18 bases or more and 22 bases or less are preferred.
  • the effect of suppressing the expression of the antisense nucleic acid of the present invention can be determined by a known method, such as anti-in vitro transcription, promeca Chito: Ribo max system, etc., and in vitro translation reaction (promega, Rabbit Reticulocyte Lysate System, etc.). 5 'untranslated region, region near translation initiation site, 5' translation It can be evaluated by measuring the expression level of a reporter gene using an expression plasmid in which a DNA containing the region and a reporter gene such as luciferase are linked.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can suppress the expression of MP493 in a living body, it is useful as an agent for preventing and treating MP493-related diseases.
  • the present invention also provides a method for screening a compound having an activity of regulating the activity of MP493, using all or a part of the spatial coordinates of the serine protease domain of MP493.
  • MP493 has a characteristic domain of serine protease at a portion corresponding to amino acid residues 217 to 453 shown in SEQ ID NO: 2.
  • the spatial coordinates of the MP493 serine proteinase domain in the present invention are derived from the serine proteinase domain that is three-dimensionally structured based on this partial sequence using an appropriate protein modeling program. It is a thing that can be done.
  • the term “spatial coordinates” means a spatial arrangement substantially determined by each distance between molecules (atoms) constituting a chemical structure. This spatial arrangement is —In the case of processing as information above, the relative arrangement is converted into numerical information as specific coordinates in a certain coordinate system (referred to as coordinate conversion).
  • the essence of spatial coordinates is the arrangement determined by the mutual distance between each molecule (atom) as described above, and it is a temporary process at the time of computer processing. It should be understood that the coordinate values are not specified coordinate values.c Also, in the present specification, the atomic coordinates are the spatial coordinates of individual atoms constituting a substance (protein, amino acid, etc.). Means
  • a C-terminal amino acid residue newly generated by cleavage is called P1, and extends from that residue to the N-terminal side.
  • S 1 The site on the protease side to which P 1 binds is called S 1, and the sites to which P 2, P 3, P 4,... Bind are called S 2, S 3, S 4,.
  • chymotoribsin-type serine protease is given a sequence number corresponding to the three-dimensional structure of chymotoribosine. This number is generally called the chymotrypsin number.
  • the chymotrypsin number By using the chymotrypsin number, it is possible to associate the sequence with the three-dimensional structure.
  • Sl, S2, and S4 also referred to as SI pocket, S2 pocket, and S4 pocket
  • Sl formed from residues 394 to 400, 418 to 425, 429 to 433 (Kimotoribsin numbers 189 to 195, 213 to 221, 224 to 228).
  • S4 It is composed of residues 299 to 301, 378 and 420 (chymotrypsin numbers 97 to 99, 175 and 215).
  • the 300th, 378th, and 420th amino acid residues (98, 175, and 215 residues of chymotrypsin number) that form the S4 bottle have Thr and Leu in TMPRSS2.
  • MP493 is Arg, Ile, and Phe. Therefore, MP493 cleaves a trypsin-type substrate having Lys and Arg at the P1 site (S1 pocket binding site), as in TMPRSS2 and trypsin, but cleaves TMPRSS2 at other S2 and S4 subsites.
  • the S4 subsite has a different substrate specificity from that of trypsin and TMPRSS2. This means that targeting the S2 and S4 subsites enables the molecular design of compounds that selectively inhibit MP493.
  • the method for screening a compound using the spatial coordinates of the MP493 serine protein domain is a method for screening all the spatial coordinates of the above-mentioned MP493 serine protein domain and any compound.
  • the spatial coordinates representing the body structure are fitted on a computer, and the binding state is quantified using, for example, an empirical scoring function as an index to evaluate the binding ability of the compound to MP493. It is a way to do it.
  • residues that can come into contact with small molecule inhibitors of serine protease that are not the original substrates, that is, target binding sites It is advantageous to identify the site and pay attention to the state of connection with this site.
  • the screening method of the present invention uses the whole or a part of the space coordinates of the MP493 Serine Protease Domain and Converter ⁇ Accelrys Inc., San Francisco. Diego Co., CA), Concord (Tripos, Inc. St. Louis, MO), etc., and the spatial coordinates representing the three-dimensional structure of the desired compound obtained by molecular docking. (University of California, San Francisco, CA), etc., superimposed on a computer using a suitable program, and quantified the conformity using the scoring function etc. included in the program as an index. This is performed by evaluating the binding ability of the compound.
  • the above-mentioned method allows the search for an inhibitor to be started without waiting for the expression and purification of the protein MP493, thereby promoting the efficiency of drug discovery development.
  • the MP493 can be obtained from a large number of compounds. This makes it possible to efficiently select an activity-controlling substance that is specific to the enzyme.
  • the number of candidate substances selected by screening at all times in the combi depends on the time and cost required for experimental candidate substance evaluation. For example, it is preferable to determine the number in consideration of the number of substances obtained as a result of the experimental evaluation.
  • the present invention is not limited to the present invention, and a program for performing screening on a computer includes an evaluation system.
  • an evaluation system uses a unique method tailored to each algorithm of a corresponding program. And many. If the activity value of a candidate substance can be obtained as an evaluation system, it is possible to select a compound to be subjected to experimental evaluation based on that value, but it is not an activity value but an empirical value. There are many evaluation systems for which only numerical values can be obtained.
  • computer screening has the main advantage of narrowing down the selection of compounds to be subjected to experimental evaluation, as already mentioned, that is, the so-called narrowing down, the evaluation system ranks It is also meaningful to select as many assigned compounds as possible, which can be used for experiments from the top.
  • the top ranked compounds were evaluated for similarity in structure, physical properties, etc. It is also meaningful to select the number of compounds to be subjected to the experimental evaluation from each class evening after the class evening.
  • a candidate substance selected by screening on a computer has the expected activity is 5% to 30%, it is necessary to obtain 10 activity control substances. Approximately 30 to 200 candidate substances may be selected, and about 160 to 100 000 candidate substances may be selected to obtain 50 activity control substances.
  • the present invention further provides a compound based on the above-described screening method using a computer or a compound exhibiting an MP493 activity regulating effect obtained by an experimental screening method.
  • a pharmacophore is a physicochemical feature on a compound that is required to bind to a target protein.
  • the pharmacological agent expresses the structural features common to compounds exhibiting the activity of modulating MP493 activity as characteristic spheres, and can be defined by determining the relative distance between the characteristic spheres. It can be defined by determining the relative distance between the functional groups.
  • the pharmacophore can be defined by any method commonly used by those skilled in the art, and is not limited to the above method.
  • the pharmacological agent is defined as a set of characteristic spheres based on the properties of the characteristic sphere and the relative distance or coordinates. If so, it should be understood that it is included in the present invention. Substantially the same pharmacophore is considered to be the same compound obtained as a hit when searching for a compound that fits the pharmacophore against the same compound database. Can be done.
  • the characteristic sphere means a spatial region that retains various physicochemical properties such as hydrophobicity, chargeability, ability to form hydrogen bonds, and the like.
  • a pharmacophore-building program Catalyst (Accelrys Inc., San Diego, Calif.)
  • Hydrogen-bond Acceptor lipids can be classified.
  • Hy-arogen-bond Donorj ⁇ Hydrophobic
  • Hydrophobic Aromatic and Hydrophobic aliphatic aliphatic 'Negative Charge', 'Negative Ionizable'
  • the hydrophobic region, the hydrogen bond acceptor region, the cation region, the cyclic aromatic region, and the like are defined as physicochemical properties, and the radius of the unit A having these physicochemical properties is defined as The characteristic sphere is represented as a spherical area.
  • Examples of atoms and functional groups that are suitable for each characteristic sphere are defined in the manual attached to the program such as, for example, “Cat alyst” (Accelrys Inc., Catalyst D oc ume ntation Release 4.5). , 1999).
  • the MP493 activity modulator of the present invention is represented by a chemical structure that satisfies the spatial coordinates of characteristic spheres having certain physicochemical properties that are selectively adaptable to the substrate binding site specific to MP493. It is defined as a compound to be used.
  • the spatial arrangement between characteristic spheres means the relative spatial arrangement (relative distance) between characteristic spheres.
  • the arrangement of characteristic spheres is represented by using specific XYZ coordinate values.
  • the relative distance between each characteristic sphere can be compared. Since it is unambiguously determined by simple geometric calculation, only specific coordinates are used for convenience of description. Therefore, such coordinate values are limited except for the basis for calculating the relative distance between the characteristic spheres. It has no definite significance.
  • the spatial arrangement of the specific sphere is specified by the relative distance between the respective spheres, and in the claims, one coordinate for using this relative distance as a basis for deriving the calculation. It shows the value.
  • this spatial arrangement is processed as information on a computer, the relative arrangement is converted into numerical information as specific coordinates in a certain coordinate system (called coordinate conversion).
  • coordinate conversion is a process that is necessary for convenience in performing the integration process, and the essence of the spatial coordinates is the relative position determined by the distance between the characteristic spheres.
  • the coordinate values are not temporarily specified during the process of viewing the contents.
  • the MP493 activity modulator of the present invention has at least three arbitrary characteristic points among characteristic spheres when arranged at one coordinate on the XYZ coordinate system shown in each of Tables 1 to 3. It is a compound having a pharmacological agent that satisfies the relative configuration between spheres. table 1
  • Characteristic sphere X coordinate Y coordinate 2 Coordinate radius (A) Hydrophobic region 1 13.25 16.82 11.48 1.7 Hydrophobic region 2 7.00 7.07 7.66 1.7 Hydrogen bond acceptor region R 5.26 17.19 9.46 1.7 Hydrogen bond acceptor region T 3.93 16.71 6.80 2.3 Ring Aroma attribute region R 5.15 9.53 8.55 1.7 Cyclic aroma attribute region T 2.80 7.69 8.80 1.7
  • Characteristic sphere X coordinate Y coordinate Z coordinate Radius (A) Hydrophobic area 1 12.02 16.58 13.31 1.7 Hydrophobic area 2 7.34 14.92 16.73 1.7 Hydrophobic area 3 3.90 11.23 10.89 1.7 Cation area 3.96 10.44 7.46 1.7
  • R is defined as the starting point of the vector
  • T is defined as the ending point of the vector.
  • the hydrogen bond acceptor region is defined as the position and direction from the hydrogen bond acceptor atom to the non-covalent electron pair (present on the hydrogen bond acceptor atom) as a vector from R to T. It is a thing.
  • the plane of the ring in the cyclic aromatic attribute region is defined as a plane having a vector from R to T as a perpendicular. Also, graphs of the arrangement of characteristic spheres shown in each table are shown in Figs. 5, 6, and 7, respectively.
  • the spatial arrangement of the characteristic spheres derived from the coordinates in each table is divided into three classes according to the structural similarities of the compounds that actually exhibited the activity of MP493, and each class was classified into Structural features common to the steric structures of the compounds to which they belong are derived using appropriate programs, such as the aforementioned Catalys t. Therefore, by changing the selection and specific number of compounds used to derive the pharmacophore and the criteria for determining their binding ability, etc. Although changes can occur, it should be understood that the present invention substantially includes these changes.
  • the coordinate values of the characteristic spheres shown in Tables 1 to 3 represent the complex model of the compound used to determine each pharmacological group and the MP493 structure. Are based on the same coordinate system.
  • these characteristic spheres are considered to indicate a suitable site when the compound binds to MP493, all the characteristic spheres shown in Tables 1 to 3 are put together to obtain MP493. It can be considered as a pharmacological agent for an activity-modulating compound.
  • Fig. 8 shows a graphical representation of the arrangement of all the characteristic spheres shown in Tables 1 to 3.
  • a compound that satisfies the relative configuration of at least any three or more characteristic spheres is also expected to exert the activity of regulating the activity of MP493. Is done.
  • characteristic spheres specified in Tables 1 to 3 are superimposed on the same coordinate system based on the composite model with the MP493 structure, characteristic spheres with similar properties exist in the vicinity. In such a case, the compounds are classified as the same group, and by not using two or more characteristic spheres belonging to the same group at the same time, an efficient search for compounds becomes possible.
  • the present invention relates to a pharmacological agent consisting of the four types shown above (the pharmacological agent of Table 1, the pharmacological agent of Table 2, the pharmacological agent of Table 3 and all characteristic spheres of Tables 1 to 3
  • the present invention also provides a computerized numerical data for using the pharmacological groups of the group on a computer, and a recording medium for recording the data. (Method of searching for compounds that have MP493 activity regulating activity using pharmacological agents)
  • the search method using the pharmacological agent of the present invention means the four types shown above (the pharmacological agent in Table 1, the pharmacological agent in Table 2, the pharmacological agent in Table 3 and all of the pharmacological agents in Tables 1 to 3). Comparing the information of the pharmacological group of the pharmacological group consisting of characteristic spheres with the spatial arrangement of the steric structure of a compound, and calculating whether or not the compound satisfies the properties of the pharmacological group It is a method determined by For this calculation, a program that can be used by those skilled in the art, such as Catalyst and Unity (Tripos, Inc. St. Louis, MO), may be used as appropriate. This method allows for more efficient computer screening.
  • Catalyst and Unity Tripos, Inc. St. Louis, MO
  • the pharmacophore model obtained by the present invention can screen a large-scale compound database using only the pharmacophore model.
  • the pharmacophore model determined by superimposing the coordinated MP493 on the substrate binding site indicates that the compound that binds to the target binding site of MP493 is converted using DOCK or the like. It can be used as an effective filter for evening screening, or after each fragment is set to fit each pharmacophore, Binding with an appropriate functional group De Novo design use to build the compound is also possible.
  • a compound exhibiting an activity-regulating action on the protein of the present invention or an activity-regulating agent for the protein of the present invention refers to an action that enhances (agonist) or inhibits (agonist) the serine proteinase activity of protein MP493. Any of the compounds having It is preferably a compound having an inhibitory action.
  • the modulator of the activity of MP493, in particular, the inhibitor can be efficiently screened on a computer, so that the inhibitor of MP493 can be used without actually expressing MP493. Can be sorted out. Further, the compound screened and selected on the whole of the comb is further subjected to a biochemical assay using the protein of the present invention or a transformed cell that expresses the protein. This makes it possible to screen for inhibitors of MP493 more effectively.
  • a biochemical assay is used, whether or not a candidate compound exhibits the activity of regulating the activity of the protein of the present invention depends on the activity of the protein when the compound is added to a system in which the activity of the protein can be confirmed and when the compound is not added.
  • Having an activity regulating action means that the measured value of the protein activity is different between the group with the candidate compound added and the group without the candidate compound added.
  • Calculated inhibition (or suppression) or enhancement (or promotion) rate of 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 50% or more, and even more preferably 70% As mentioned above, it is particularly preferably 90% or more.
  • Inhibition (suppression) rate or enhancement (acceleration) rate (%) (absolute value of (measured value of group without addition-measurement value of group with addition of candidate compound)) / measured value of group without addition * 100
  • the measured value is appropriately determined depending on the type of the system in which the activity of the protein can be confirmed.
  • the absorbance can be used, and if the measured value of the candidate substance-added group ⁇ the measured value of the candidate substance-free group, In this case, it can be said that the candidate substance has MP 493 protein activity inhibitory activity.
  • the measurement system includes background and noise values, the value obtained by subtracting such values can be used as the measured value.
  • the method for searching for a compound exhibiting the activity-regulating activity of the protein of the present invention is a technique that enables a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with MP493 to be provided to a medical site in a remarkably short period of time.
  • the present invention relates to a method for storing spatial coordinates of the serine proteinase domain of MP 493.
  • the spatial coordinates of a protein having a square root of the mean square deviation of the main chain atom of 2.0 A or less with respect to the main chain atom of the protein to be prepared are also within the scope of the present invention.
  • the "backbone atoms" of the protein are N, C, and covalently bonded to C and Ca of the amino acid constituting the protein and which form the peptide bond. Means 0.
  • the present invention provides (d) at least 257 (His), 30l (Leu), 304 (Asp), 378 (378) of the amino acid numbers in SEQ ID NO: 2 among the spatial coordinates shown in FIG.
  • a spatial coordinate comprising the atomic coordinates of amino acid residues corresponding to at least 257s 299-301, 378, 394-right, 418-425 and 429-433 in amino acid number;
  • Spatial coordinates of the target binding site where the square root of the mean square deviation of the main chain atom is less than or equal to 1.OA with respect to the main chain atom of the amino acid constituting the target binding site;
  • the substrate binding site It provides the space coordinates of the substrate binding site where the square root of the mean square deviation of the main chain atoms is 1.0 A or less for the main chain atoms of the constituent amino acids.
  • At least 'contains' means, in addition to the atomic coordinates of the amino acid residue specified by the amino acid number, one or more arbitrary amino acids in Figure 9. It means that the atomic coordinates of the residue may be included.
  • the amino acid residue which may be contained is not particularly limited, but, for example, an amino acid residue in the vicinity of an amino acid residue constituting a target binding site or a substrate binding site is preferable. No. “Nearby” means within 5A, preferably within 3A. The three-dimensional structure of the protein is tightly fixed Instead, it has some fluctuations.
  • the protein has a functionally equivalent structure. However, it is preferably 1.5 A or less, and more preferably 1.5 OA or less.
  • the functionally equivalent structure is provided in the case of the structure of the target binding site or substrate binding site. However, if the square root of the mean square deviation of the main chain atoms is 1.0 OA or less, it is considered that the functionally equivalent structure is provided. However, it is preferably 0.7 A or less, and more preferably 0.5 A or less.
  • the spatial coordinates including at least the target binding site or the substrate binding site As long as it includes the spatial coordinates of the target binding site or substrate binding site, it may also include the atomic coordinates of any one or more amino acid residues in FIG. 9 in addition to them.
  • all the spatial coordinates shown in FIG. 9 are given to the computer, and then a specific part is designated to specify the screen. It is also possible to perform the screening, or to perform the screening by giving only a part of the structure.
  • the minimum structure required for screening is specified. If so, adding the atomic coordinates of any one or more amino acid residues to them would improve the accuracy of the results without any decrease. Therefore, by focusing on the spatial coordinates of the target binding site or substrate binding site, the atomic coordinates of one or more amino acid residues in FIG. "Parts" are also within the scope of the present invention.
  • the three-dimensional structure of a protein is defined by the relative spatial arrangement of the atoms constituting the structure, and spatial coordinate conversion is necessary for treating the three-dimensional structure on a computer-by-computer basis. This is a convenient process. Therefore, the spatial coordinates obtained by rotating and / or translating the spatial coordinates (h), (a) to ( g ) also represent the same three-dimensional structure as the spatial coordinates before the operation. Things.
  • the present invention provides a computer-readable storage medium storing any of the above spatial coordinates (a) to (h).
  • a computer-readable storage medium> Is not particularly limited as long as the stored space coordinates can be led to various programs (for example, a program using space coordinates) on a computer.
  • an electric temporary storage medium called a memory may be a floppy disk, a hard disk,
  • a semi-permanent storage medium such as an optical disk, a magneto-optical disk, or a magnetic tape may be used.
  • the spatial coordinates and the storage medium storing the spatial coordinates of the present invention can be used for searching or designing a compound having an activity of regulating the activity of MP493, and are useful.
  • the gene mp493 can be isolated and identified from gastric signet carcinoma cells.
  • Examples of obtaining the DNA of the present invention from a DNA library include a screening method using a suitable genomic DNA library and a cDNA library by a hybridization method, and the like. There is a method of screening by an immunoscreening method or the like using an antibody, growing a clone having the target DNA, and cutting out the clone using a restriction enzyme or the like. Screening by the no-dip-digestion method involves labeling a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof with 32 P or the like to obtain a probe.
  • the cDNA library can be prepared by a known method (for example, Maniatis T.
  • the novel DNA of the present invention can also be obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) using a genomic DNA library or a cDNA library as a type II.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • a sense primer and an antisense primer are prepared based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and any DNA library is prepared by a known method (for example, Michael AI, etc.).
  • PCR Protocols a Guide to Methods and Applications, Academic JPress, 1990) can be performed to obtain the DNA of the present invention.
  • a DNA library having the DNA of the present invention is selected and used.
  • any library having the DNA of the present invention can be used.
  • a commercially available DNA library can be used, or the DNA of the present invention can be used.
  • a cell suitable for preparing a cDNA library is selected from the cells having the DNA and a known method (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY) According to 1989), a cDNA library can be prepared and used.
  • a phosphoamidite method It can also be prepared by a chemical synthesis method such as
  • the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 has been confirmed to have an altered expression in gastric seal ring cancer cells, lung, kidney, kidney, etc.
  • a partial fragment thereof is considered to be useful as a specific probe for cancer, lung, kidney, and disease.
  • the DNA of the present invention can be used to produce MP493 in large quantities.
  • the DNA can also be labeled with an enzyme or the like and used for examining the expression status of the protein of the present invention in a tissue. That is, by using the DNA as a probe and confirming the expression level of the protein of the present invention in cells using the mRNA expression level as an index, it is suitable for the production of the protein of the present invention. In addition to being able to determine the cells and their culture conditions, it is also possible to diagnose diseases associated with the protein of the present invention.
  • a method such as PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism; method, PCR-SSCP (Single strand conformation polymorphism) method, sequencing, etc.) using a part of the DNA of the present invention as a primer, It can test and diagnose abnormalities or polymorphisms in nucleic acid sequences. Further, the DNA of the present invention can be introduced into cells in a living body, and used for gene therapy for diseases caused by impaired expression or activity of the protein of the present invention.
  • PCR-RFLP Restoral fragment length polymorphism
  • PCR-SSCP Single strand conformation polymorphism
  • the DNA of the present invention is extremely useful for the preparation of transformed cells, a method for producing the recombinant protein MP493 using the transformed cells, or the search for a compound that specifically suppresses the expression of mp493. is there.
  • the transformed cells of the present invention can be prepared by applying techniques known to those skilled in the art.For example, using various vectors that are commercially available or generally available to those skilled in the art, The DNA of the present invention can be incorporated into an appropriate host cell. At this time, the expression of the gene mp493 in the host cell was arbitrarily controlled by placing the gene mp493 under the influence of an expression control gene represented by the promoter. Is possible. This technique is suitable for use in the production of protein MP493 using transformed host cells, as well as for studying the mechanism of controlling the expression of gene mp493 or searching for a substance that can regulate the expression of the gene. It can be applied.
  • test substance is brought into contact with a cell transformed with a vector containing the gene mp493 under an appropriate condition, thereby obtaining a test substance. It is possible to search for or evaluate a substance having an action of promoting or suppressing the expression of the gene mp493 of the substance.
  • a transgenic animal can be prepared based on a mouse or other suitable animal by combining the DNA of the present invention with a known method. Even using such a transgenic animal, the same search or evaluation as in the above-described transformed cells can be performed.
  • the gene mp 493 or protein MP 493 of the present invention is associated with the onset of cancer, lung disease, renal disease and ⁇ disease, it was investigated through the above-mentioned search using the transformed cells or transgenic animals. It is expected that the compounds and the like obtained as described above will be effective therapeutic or prophylactic agents against cancer, lung, kidney or Teng disease.
  • the gene of the present invention can be expressed under the control of a promoter sequence unique to the gene.
  • a search for a substance that promotes or suppresses transcription of the gene of the present invention can be more advantageously performed.
  • another suitable expression promoter upstream of the gene of the present invention can be used by connecting or replacing it with a promoter sequence specific to the gene.
  • the promoter used in this case can be appropriately selected depending on the host and the purpose of expression.
  • the host is Escherichia coli, T7 promoter overnight, lac promoter overnight, trp promoter overnight, etc .: PL promoter overnight, etc., but if the host is yeast, If the host is an animal cell, PHO 5 Promote overnight, GAP Promote overnight, ADH Promote overnight, etc.
  • the first class can be exemplified, but of course the invention is not limited to these.
  • DNA and vector may be digested with appropriate restriction enzymes, and the obtained fragments may be ligated using DNA ligase.
  • the protein of the present invention can be prepared from various naturally expressed organs, and is a peptide synthesizer (for example, Peptide Synthesizer-1430A, manufactured by PerkinElmer Japan KK). Prepared by a chemical synthesis method using E. coli or by a recombinant method using an appropriate host cell selected from prokaryotes or eukaryotes. be able to. However, in terms of purity, production by genetic engineering techniques and recombinant proteins are preferred.
  • a peptide synthesizer for example, Peptide Synthesizer-1430A, manufactured by PerkinElmer Japan KK.
  • Methods for introducing a recombinant vector into a host cell include an electroporation method, a protoplast method, an alkali metal method, a calcium phosphate precipitation method, and a DEAE text.
  • Well-known methods such as the Run method, the Mycroinjection method, and the method using viral particles (see Extraordinary Special Issue on Experimental Medicine, Handbook of Genetic Engineering, published on March 20, 2001, Yodosha, etc.) Yes, any method may be used o
  • Transformants In order to produce the protein by genetic engineering, the above transformant is cultured to recover a culture mixture, and the protein is purified. Transformants can be cultured by a general method. Regarding the culture of transformants, various books (Taehae, “Microbial Experiment Method”, edited by The Japanese Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, Ltd., 1992 ), So that they can be performed with reference to them.
  • an appropriate method can be appropriately selected from methods generally used for protein purification. That is, salting out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, antibody chromatography, etc.
  • affinity chromatography such as chromatography, chromatofocusing, adsorption chromatography, and reversed-phase chromatography
  • An appropriate method can be appropriately selected from methods that can be generally used, such as filtration, and purification can be performed in an appropriate order using an HPLC system or the like as necessary.
  • the protein of the present invention can be combined with other proteins (eg, glutathione S-transferase, protein A, oxahistidine, FLAG tag, etc.). It can also be expressed as a fusion protein.
  • the expressed fusion form can be excised using an appropriate protease (eg, thrombin or the like), and in some cases, protein preparation can be performed more advantageously. It becomes possible.
  • Purification of the protein of the present invention may be carried out by appropriately combining general methods known to those skilled in the art, and particularly when expressed in the form of a fusion protein, It is preferable to use a purification method that is characteristic for the morphology.
  • the protein of the present invention can be prepared in its own form or in the form of a fusion protein with another kind of protein, but is not limited thereto. It is also possible to convert to various forms. For example, processing by various methods known to those skilled in the art, such as various chemical modifications to a protein, binding to a polymer such as polyethylene glycol, binding to an insoluble carrier, and the like can be considered. In addition, depending on the host used, the presence or absence of sugar chains and the degree of addition are also different. Even in such a case, as long as it functions as a serine protease, it should be considered as being under the concept of the present invention.
  • the protein of the present invention can be used as an antigen for producing an antibody, or can be used for screening a substance that binds to the protein or a substance that regulates the activity of the protein. It is.
  • the antibodies of the present invention include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. All of them can be obtained by referring to known methods (for example, immunization experiment procedures, edited by the Japanese Society of Immunology, published by the Japan Society of Immunology). This will be briefly described below.
  • an animal is first treated with the protein of the present invention as an immunizing antigen and, if necessary, a complete Freund's antigen.
  • the protein of the present invention used as an antigen may be obtained by any method as long as it has a degree of purification that can be used for producing an antibody.
  • the partial polypeptide of the protein of the present invention is also suitably used as an immunizing antigen. If the polypeptide used as the immunizing antigen is a low-molecular-weight polypeptide, that is, a polypeptide composed of about 10 to 20 amino acids, it is converted to a keyhole polypeptide. ⁇ To Hemochanin
  • the animal to be immunized can be any animal, but is preferably used in rats, mice, rabbits, sheep, sheep, dogs, and horses usually used in immunological experiments by those skilled in the art. ⁇ It is preferable to select and use an animal species that can produce the desired antibody from birds, goats, bushes, and sea bream.
  • the polyclonal antibody can be obtained by purifying the obtained antiserum. Purification may be carried out by appropriately combining known methods such as salting out, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the procedure for obtaining a monoclonal antibody is as follows. That is, antibody-producing cells such as spleen cells or lymphocytes are collected from the immunized animal, and the cells are collected by a known method using polyethylene glycol, Sendai virus, electric pulse, or the like. And hybridis with myeloma cell lines to produce hybridomas. Thereafter, a clone producing an antibody that binds to the protein of the present invention is selected and cultured, and the culture supernatant of the selected clone is purified to obtain good results. For purification, a known method such as salting out, ion exchange chromatography, affinity chromatography, or the like may be appropriately used in combination.
  • the novel antibody can also be obtained by using a genetic engineering method.
  • a hybrid cell producing a monoclonal cell against a tile cell, a lymphocyte, or a protein of the present invention or a partial polypeptide thereof immunized with the protein of the present invention or a partial polypeptide thereof.
  • MRNA is collected from one mouse, and cDNA live Create a library.
  • a clone producing an antibody that reacts with an antigen is screened, the resulting clone is cultured, and the desired antibody can be purified from the culture mixture by a combination of known methods.
  • Antisense nucleic acids can be produced by known methods (eg, Stanley T. Crooke and BeRNAld Lebleu, eds. In Antisense Research and Applications, published by CRC, Florida, 1993). Natural DNA or RNA can be synthesized using a chemical synthesizer, or the antisense nucleic acid of the present invention can be obtained by a PCR method using mp493 as type III. Some derivatives, such as methyl phosphate type and phosphor type, use chemical synthesizers (for example, Model 394, manufactured by PerkinElmer Japan KK). Some can be synthesized. In this case, the operation is performed according to the manual attached to the chemical synthesizer, and the obtained synthetic product is purified by an HPLC method using a reversed-phase chromatography, for example. In addition, an antisense nucleic acid can be obtained.
  • the DNA or antisense nucleic acid of the present invention may be used as a radioprobe according to a known method. Label with sotopes, enzymes, fluorescent substances, or luminescent substances. Next, DNA or mRNA is prepared from the sample by a known method, and this is used as a test substance.Then, the labeled probe is added and reacted. Remove the probe. If the test substance contains the gene mp493 or RNA, the antisense nucleic acid binds to them. The presence or absence of bond formation can be determined by using, as an index, light emission, fluorescence, radioactivity, or the like caused by a labeled enzyme, fluorescent substance, luminescent substance, or radioisotope.
  • nucleic acid of the present invention in particular, an antisense nucleic acid is used for a pharmaceutical purpose
  • a nucleic acid having a purity suitable for use as a pharmaceutical should be used in a pharmacologically acceptable use method. Is preferred.
  • the nucleic acid or antisense nucleic acid of the present invention may be used by directly dissolving or suspending it in an appropriate solvent, or may be encapsulated in a liposome or incorporated into an appropriate vector. It may be used in the form of an ellipse.
  • pharmacologically acceptable auxiliary ingredients may be added, and injections, tablets, capsules, eye drops, creams, suppositories, suppositories, sprays and patches It may be used in an appropriate dosage form.
  • Pharmaceutically acceptable auxiliary ingredients include solvents, bases, stabilizers, preservatives, solubilizers, excipients, buffers and the like.
  • nucleic acid or antisense nucleic acid of the present invention When the nucleic acid or antisense nucleic acid of the present invention is in the above-mentioned dosage form, its administration method and dosage are set according to the patient's age, sex, disease type and degree. Can be used. That is, oral, or inhalation, transdermal, ophthalmic, intravaginal, intraarticular, rectal, intravenous, topical, intramuscular administration in an amount appropriate to improve the condition An appropriate method may be selected from subcutaneous administration, intraperitoneal administration and the like.
  • the present invention relates to a protein of the present invention, a transformed cell expressing the protein, a DNA of the present invention, a recombinant vector containing the DNA, or the recombinant vector.
  • the present invention relates to a method for screening a substance that regulates the function of the protein of the present invention, which comprises using the transformed cell transformed in (1). More specifically, (1) a method for evaluating the serine protease activity of MP493 in the presence / absence of a candidate substance; (2) a protein of the present invention in the presence / absence of a candidate substance; Examples include a method of comparing the expression levels of genes and screening a substance that regulates the expression of the protein of the present invention.
  • Example 5 in the system shown in Example 5, the substrate cleavage activity of MP493 in the absence of a test substance and in the absence of Z was measured. What is necessary is just to measure.
  • Examples of (2) include known methods, for example, in vitro transcription anti-d, (Prome-Riksha Co., Ltd .: Ribo max system) and in vitro translation anti-disease, and (from cane soil: RaDbit Reticulocyte Lysate System, etc.).
  • the DNA containing the 5 'untranslated region, the region near the translation initiation site, and the 5' translated region of the mp493 gene, and a repo overnight gene such as luciferase were ligated.
  • the expression level of the repo overnight gene using the expression plasmid can be measured and evaluated in the presence or absence of the candidate substance.
  • Candidate substances include proteins, peptides, oligonucleotides, synthetic compounds, naturally occurring compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. The substance is not limited to this, and may be a new substance or a known substance.
  • BLAST Altschul SF.'J Mol Evol., Vol. 36, pp. 290-300 (l993); Altschul SF et al., J. Mol. Biol., Vol. 215 , pp.40310 (1990)
  • ClustalW Thompson JD, Higgins DG, Gibson T J., Nucleic Acids Res., Vol.22, pp.4673-4680) 1994
  • PROSITE database http: www.expasy.ch/prosite/
  • Pfam http://www.Sanger.ac.uk
  • Pf am http://www.Sanger.ac.uk
  • E .LL Sonnhammer SR Eddy
  • R. Durbin Proteins., 28, pp. 405-420 (1997)
  • HMMER R. Durbin, S. Eddy
  • FAMS Ferta, K. et.al., J. Mol. Graph.Model., Vol. 18, pp. 258-272 (2000)
  • Modeler Accelelrys Inc., S andie o, CA
  • Homology Accelelrys Inc., S andie go, CA
  • protein structure evaluation programs include Profiles-3D (Accelrys Inc., Sandiego, CA) and Graphite. It is possible to use Insightll (Accelrys Inc., Sandiego, CA), Sybyl (ripos, Inc. St. Louis, MO), etc. as a box display program.
  • the compound for which the presence or absence of an activity regulating activity on MP493 is to be confirmed may be any of known and novel compounds, and there is no particular limitation on the structure, origin, physical properties, etc., but drug development in the future It is preferable that the compound is a low-molecular compound in performing the method.
  • compound information registered in the Available Chemicals Directory ⁇ ACD is useful.
  • Concord, Converter, etc. can be used as a program for converting the three-dimensional structure of such a low-molecular compound into a coordinate.
  • the binding between the coordinated MP493 and the low molecular weight compound can be automatically performed using the molecular docking package DOCK, etc., or molecular display software such as Insightll For It can also be done interactively.
  • the index for evaluating the conformity using these programs the free energy calculation value of the whole coupling body, the empirical scoring function, etc. are arbitrarily selected and used. can do. With this index, it is possible to objectively evaluate the quality of the connection.
  • a program such as Catalysts Unity (Tripos, Inc. St. Louis, MO) was used to determine the pharmacological agent from the compound exhibiting MP493 activity-modulating activity and to compare the determined pharmacological agent with the three-dimensional structure of the compound. It can be used. At this time, if a class ring of the compound is required, it is possible to use a program such as Daylight (Daylight Chemical Iniormation Systems, Inc., Mission "Vlejo, CA").
  • FIG. 1 shows the results of an alignment between MP493 and another protein having high homology on the amino acid sequence.
  • the left end shows the proteins by PDB accession numbers except for MP493.
  • Penetration type serine protection NP056590 indicates mouse transmembrane serine proteinase 2, respectively.
  • FIG. 2 shows the results of the alignment with a known serine protease.
  • TMS2 is transmembrane serine protease 2
  • HEPS is hepsin
  • TRP 1 is trypsin 1
  • TRP2 is trypsin 2
  • TRYB is /? Indicates Factor I, respectively.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of a domain structure with a known serine protease.
  • FIG. 4 shows the model structure of the MP493 serine protease domain.
  • FIG. 5 shows a pharmacological agent having the configuration of the characteristic spheres shown in Table 1.
  • H p 1 is the hydrophobic region 1
  • H p 2 is the hydrophobic region 2
  • HBA 1.R is the hydrogen bond receptor region R
  • HBA 1.T is the hydrogen bond receptor region ⁇
  • ⁇ I 1 is the hydrogen bond receptor region Represents the positive ion region.
  • FIG. 6 shows a pharmacological agent having the configuration of the characteristic spheres shown in Table 2.
  • ⁇ 3 is the hydrophobic region 1
  • ⁇ 4 is the hydrophobic region 2
  • R is the hydrogen bond acceptor region R
  • HBA 2.T is the hydrogen bond acceptor region T
  • RA 1 R is a cyclic aromatic region R
  • RA 1 T represents a cyclic aromatic region T.
  • FIG. 7 shows a pharmacological agent having the configuration of the characteristic spheres shown in Table 3.
  • ⁇ 5 represents the hydrophobic region 1
  • ⁇ 6 represents the hydrophobic region 2
  • ⁇ 7 represents the hydrophobic region 3
  • ⁇ I2 represents the cationic region.
  • FIG. 8 shows a pharmacological agent having all the characteristic sphere configurations shown in Tables 1 to 3.
  • Figure 9 shows the spatial coordinates of the ⁇ 493 serine protease domain.
  • the table is composed of eight columns. ATOM in the first column indicates that this row is a row of atomic coordinates, and the second column name indicates the order of the atoms (1 to 1728).
  • the third column shows the atom distinction in amino acid residues, etc., the fourth column shows the amino acid residues in three letters, and the fifth column shows the amino acid number corresponding to SEQ ID NO: 5.
  • Columns 6, 7, and 8 show the coordinates of the atom (X units on the X, Y, and ⁇ axes, respectively).
  • the last row indicates that this is the last row in the table.
  • the table is described in accordance with the format of Protein Data Bank, a method commonly used by those skilled in the art.
  • BAP Bacterial Alkaline Phosphatase
  • TiKaRa Bacterial Alkaline Phosphatase
  • the recovered poly (A) + RNA was used in a buffer containing 50 mM sodium acetate (pH 5.5), ImM EDTA, 5 mM 2-mercaptoethanol and 100 U RNasin in 20 U Tobacco.
  • oligopapori (A) + RNA was transferred to lOpmol dT adapter one primer (5, -GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT GGC CTT TTT TTT TTT TTT-3 ') And Superscript II I RNAse H "Reverse Transcriptase
  • the PCR was performed 5 to 10 times at 94 ° C for 1 minute, at 58 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 10 minutes.
  • a plasmid was prepared from the cDNA library prepared by the method (1) using a PI-100 port bottle (KURABO), the nucleotide sequence of each clone was confirmed, and a database was prepared.
  • Nucleotide sequencing Carry out the sequencing reaction according to the attached protocol using AutoCycle sequencing kit (Amersham Pharmacia) and ROB DNA processor (Amersham Pharmacia), and carry out using ALF DNA sequencer ⁇ Amersham Pharmacia).
  • the plasmid C-KAT00786 obtained by the method described in (1) encodes a novel protein consisting of 453 amino acids represented by SEQ ID NO: 2 and is represented by SEQ ID NO: 1. It contained a cDNA consisting of a 2418 base pair base sequence represented by SEQ ID NO: 3 including an open reading frame consisting of a base sequence of 1359 bases.
  • BLAST Altschul SF., J Mol Evol., Vol. 36, pp. 290-300 (1993); Altschul SF et al., J. Mol. Biol., Vol. 215, pp. 403) ⁇ 10 (1990)
  • BLAST Altschul SF., J Mol Evol., Vol. 36, pp. 290-300 (1993); Altschul SF et al., J. Mol. Biol., Vol. 215, pp. 403
  • search for local sequence matches For homology search, BLAST (Altschul SF., J Mol Evol., Vol. 36, pp. 290-300 (1993); Altschul SF et al., J. Mol. Biol., Vol. 215, pp. 403) ⁇ 10 (1990)
  • a BLAST homology search was performed on the Genbank protein database using the deduced protein sequence as a query sequence. Taking the methionine of the initiation codon as No. 1, it extends over 409 residues at the 448th position from 52 amino acids and has a transmembrane human serine protease 2 (GenBank Accession: NP— 005647) with 58% homology to the mouse serine protease TMPRSS2 (GenBank Accession: AAF97867) spanning 383 residues from the 72nd to the 447th.
  • FIG. 1 shows the results of multiple alignment using the reference program ClustalW (Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ., Nucleic Acids Res., Vol. 22, pp. 4673-4680 (1994)).
  • Human sequences with significant homology in the serine protein domain TMPRSS2; GenBank Accession 0015393; Factor I GenBank Accession P05156; Trypsin GenBank Accession P07477, P07478 Hepsin GenBank Accession Fig. 2 shows the results of multiple alignment using ClustalW in P05981; Tripichi GenBank Accession P20231).
  • the PR0SITE database http://www.expasy.ch/prosite/), which is a motivation database, is used to estimate the protein distribution.
  • a motif was found in which the 221st asparagine was a sugar chain binding site.
  • LDL-receptor class A (LDLRA) domain signature [PROSITE Accession: PS01209] (85-107) was observed. Furthermore, the motif [PROSITE Accession: PS00134] found in the histidine residue in the active center of the serine protease trypsin has amino acid residues 253 to 258. In the same manner, the motif [PROSITE Accession: PS 00135] found in the serine residue at the center of the activity of trypsin has amino acids 394 to 405. Residues were found.
  • a plasmid for expressing MP493 in mammalian cells was prepared by the following method.
  • Sense Primer 3 (5 '— ACA GAG GAT GGA GGT GAC GCC-3') and Antisense Primer 3 (5, -CCC A AG CTT GGT TTT TAG GTC TCT CTC CAT -3 ')
  • the C-KAT00786 plasmid designed and produced by the oligocap method was used as a type, and Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa) was used for 10 seconds at 98 ° C, 30 seconds at 55 ° C, 72 ° C. C was repeated 30 times for 1 minute cycle to perform PCR reaction.
  • the obtained DNA fragment of about 0.3 kb was digested with Bglll and Hindlll, and recovered by agarose gel electrophoresis.
  • mp493 plasmid prepared by the oligocap method was digested with XhoI and Bglll, A DNA fragment of about 1.3 kb was recovered.
  • pcDNA3.1 / Myc-His (-) A (Invitrogen) was digested with XhoI and Hindlll, and a DNA fragment of about 5.5 kb was recovered as a vector by agarose gel electrophoresis.
  • the two types of DNA fragments previously collected in the vector fragment were ligated by a standard method, and the JM109 competent cells (TaKaRA) were transformed to obtain the desired plasmid (pM5001). .
  • the expression plasmid pM5001 was introduced into COS-1 cells by the following method to express the protein. That is, COS-1 cells were inoculated at a concentration of 3.0 ⁇ 10 5 cells / well in 6 ⁇ l plates and cultured for 1 day and night under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. The next day, FuGENEG (Roche's Diagnostics) per 1 ⁇ l and 1 g of pM5001 were mixed according to the attached protocol and supplemented to COS-1 cells.
  • Penta'His Antibody QIAGEN
  • HRP-labeled Egret anti-mouse immunoglobulin DAKO
  • Chemilmi was detected using an ECL detection reagent (Amersham-pharmacia). As a result, the expression of a protein of about 55 kDa was confirmed.
  • enterokinase recognition site In order to obtain the serine protease domain of MP493 as a protein, enterokinase recognition site (enterokinase recognition site) is located at the C-terminal side of the mouse Ig kappa chain signal peptide at the C-terminal side. Immediately after that, a plasmid for expressing chimera protein followed by MP493 serine protease domain, myc epitope and histidine tag was constructed by the following method.
  • Sense primer 4 (5'-CCA GAT ATA CGC GTT GAC ATT-3 ') and antisense primer 4 (5, -CTT ATC GTC ATC GTC GTC ACC AGT GGA ACC TGG AAC-3')
  • pSecTag2A (Invitrogen)
  • TaKaRa Pyrobest DNA Polymerase
  • Sense primer 5 (5'-ATC GTG GGT GGA AAC ATG Tecs ') and antisense primer 5 (5, -CCG CTC GAG TTT TTA GGT CTC TCT-3') were designed and PCR was performed in the same manner using the C-KAT00786 plasmid prepared by the step method as the type III.
  • the resulting PCR product is ligated with MEGALABEL kit (TaKaRa) at the 5 'end, the former PCR product is digested with SpeI and the latter PCR product is digested with XhoI and subjected to agarose gel electrophoresis. In both cases, a DNA fragment of about 0.7 kb was recovered.
  • pSecTag2 A 5'-ATC GTG GGT GGA AAC ATG Tecs '
  • antisense primer 5 5'-CCG CTC GAG TTT TTA GGT CTC TCT-3'
  • the expression plasmid pM5002 was introduced into COS-1 cells by the following method to express the protein.
  • the plasmid DNA was mixed with 12.5 g of the above plasmid DNA according to the attached protocol, and added to COS-1 cells grown on a semiconfluent in a 150 cm 2 flask. After culturing for 72 hours under the conditions of 5% C0 2, 37 ° C , the culture supernatant was recovered. The collected culture supernatant was dialyzed all day and night against PBS-to which 10 ⁇ M of pepsin-tin, oral dibutin, and EDTA were added, respectively. This was subjected to histidine column chromatography on a commercially available nickel column ProBond.
  • Activated MP493 serine proteinase domain lOmM CaCl 2, 130mM NaCl, 0.1 % final preparation of 0 to 1 g / ml concentration of 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 was prepared containing BSA, B in earthenware pots by a final group protein concentration 4 mM z -L -Arg-pNA ⁇ HCl (3057, Protein Research Council) was added. After performing the reaction at 37 ° C for 30-60 minutes, the reaction was stopped with 50% acetic acid, and the substrate specificity was examined and analyzed by the absorbance at OD405nm. As a result, the serine protease domain of the present invention efficiently cleaved the trypsin-type substrate.
  • An expression plasmid for serine protease domain secretion of MP493 using E. coli as a host was constructed by the following method.
  • Sense primer 6 (5'-ACA GCT TAT CAT TGG GAG CTG-3 ') and antisense primer 6 (5, -TTT CCA CCC ACG ATC TTA TCA TCA TCA TCA CCC GAG CCT T-3') PM781 (Japanese Patent Laid-Open No. 6-315386) using Pyrobest DNA Polymerase (aKaRa) for 30 seconds at 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The PCR reaction was repeated several times.
  • the collected culture supernatant was dialyzed for 48 hours against PBS containing 10 ⁇ M of pepsin, leuptin, and EDTA, respectively. The exchange was performed three times a day. Next, histidine gel column chromatography was performed on a commercial nickel-produced ProBond. Equilibration was carried out sufficiently with 20 mM phosphate buffer + 500 mM NaCl pH 7.8, and then the dialyzed culture supernatant was applied to a nickel column. Many of the proteins in the culture supernatant were passed through, washed thoroughly, and then eluted with 20 mM phosphate buffer + 500 mM NaCl pH 4.0.
  • an expression plasmid for expressing the cell domain of MP493 in the cell was prepared by the following method.
  • Sense primer 6 and anti-sense primer 9 (5, -ACG Pyrobest DNA Polymerase using ATC TTA TCG TCA TCG TCC ATT TTA TTT TAT ACC CTT T-3 ')
  • the collected Escherichia coli was suspended in PBS supplemented with 10 ⁇ M of peptide, leptin, and EDTA, and then disrupted by ultrasonication to dissolve the soluble fraction. And the insoluble fraction were separated by centrifugation. After that, the solubilization of the inclusion bodies was performed using 20 mM phosphoric acid phosphate + 500 mM NaCl + 8 M urea pH 7.8. Next, histidine tag chromatography was performed on a commercially available nickel column ProBond. The equilibrium was sufficiently performed with 20 mM phosphoric acid phosphate + 500 mM NaCl + 8 M urine, pH 7.8, and then the sample in which the aggregate was solubilized was applied to a nickel column.
  • This sample is reacted overnight at 20 ° C with a commercially available enterokinase cleavage capture kit (Novagen) to obtain MP493 serine proteinase domain, which is considered to be the active form.
  • Novagen enterokinase cleavage capture kit
  • the sample was applied to the above affinity column under the buffer conditions except for 8 M urea, and the permeated fraction was dialyzed against PBS-, concentrated, and activated MP493 serine protease domain. It was a purified sample. This sample showed a silver stain at a position with a molecular weight of about 30K. This purification system was suitable for preparing large quantities of MP493.
  • Bz-L-Arg-pNA'HCl (3057, the Society for the Promotion of White Matter Research) was prepared so that the final substrate concentration was 4 mM, and the reaction was carried out at 37 ° C for 30-60 minutes. After stopping the reaction with 50% acetic acid, the substrate specificity was examined and analyzed by OD405nm absorption.
  • the recombinant MP493 serine protein-zedomin which was produced and purified as a recombinant, was mixed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 10 mM CaCl 2 , 130 mM NaCl, and 0.1% BSA at 0 to 1 ⁇ l. It was prepared to a concentration of g / ml.
  • MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-Pna.0.7H2O (EOS) was used as a substrate to be cleaved by human sputum-derived elasase (SE563, Elastin Products) so that the final substrate concentration was 4 mM.
  • Arg- ⁇ ⁇ HC1 (3057, Protein Research Initiative) is used as a base for Sue-Ala-Ala'Ala 'pNA (3071) as a substrate to be cut off by Buera Erasase (E-1250SIGUMA).
  • Figure 9 shows the obtained spatial coordinates.
  • amino acid residues at positions 300, 378, and 420 (residues at positions 98, 175, and 215 in chymotrypsin) forming the S4 pocket, and Thr, Leu, Trp (Thrips for trypsin, Lys ⁇ Trp)
  • Thr, Leu, Trp Thrips for trypsin, Lys ⁇ Trp
  • Agr, Ile, and Pe for MP493.
  • the target binding site of the MP 493 inhibitor was determined by referring to the crystal structure of the complex with the serine protease inhibitor (PDB code: 1EKB, 1A0L, IGCT, IBRU, 1A0J, 2TBS, IFXY, 1DAN).
  • PDB code 1EKB, 1A0L, IGCT, IBRU, 1A0J, 2TBS, IFXY, 1DAN.
  • the amino acid residue that constructs was estimated.
  • the representative compound uses the binding conformation of the complex model structure obtained above, and the compounds other than the representative are Catalyst Release 4.5 (Accelrys Inc., After generating up to 255 conformations using the Best method using CatConf from San Diego, CA), all compounds in the cluster were routinely generated using HipHop from Catalyst. Common pharmacophores were extracted.
  • the pharmacological agent of each class is superimposed on the model structure of the MP493 complex with the representative compound of that class, and the pharmacological action surface of all the classes is mapped to the MP493 structure. I pinged.
  • Catalyst's CatSearch ACD compounds were searched for compounds that simultaneously satisfied three or more points from all the characteristic spheres shown in Tables 1 to 3.
  • the obtained compounds were subjected to class ring according to the method described in (1), and the MP493 inhibitory activity of the 20 compounds was measured using the method described in Example 5. Showed more than 50% inhibition at a concentration of 10 g / mL.
  • a compound having a good docking state in the partial screening using DOCK in Example 6 three or more points of all the characteristic spheres shown in Tables 1 to 3 were simultaneously measured. Satisfactory compounds were extracted.
  • the compound obtained was obtained from the Hierachical Aggiomerrative Custering Package No.
  • the drug efficacy measurement for cancer cell invasion was performed according to the method of Isoai and Kumagaya using Boyden's chamber (Cancer Invasion and Metastasis Research Manual, Isoai, Kumagaya, pp. 125-131, Kinhodo, 1995). This can be done by examining the inhibitory effect of the test drug on the invasive potential of tumor-derived B16F10 cells. Coat a filter with a pore size of 8 M in the void chamber with matrigel, and add 2 ⁇ 10 5 B16F10 cells and the test drug to the upper chamber of the chamber.
  • BSA-DMEM 0.1% fetal serum albumin-Dalbeco modified Eagle's medium
  • the method is based on the method of Fuji Ino and Saiki (Cancer Invasion and Metastasis Research Manual, Fuji Ino and Saiki, pp. 7-11, Kinhodo, 1995).
  • Six-week-old male BDF1 mice are transplanted by injecting 1 ⁇ 10 5 mouse melanoma-derived B16F10 cells into the tail vein.
  • the appropriate dose of MP493 control substance, with a dose is injected into the tail vein together with B16F10 cells.
  • the samples were administered for the next two days, the mice were sacrificed 15 days after cell transplantation, and the number of cancer colonies in the lungs (ie, the number of metastatic nodules) was counted and compared with the control phosphate-buffered saline group.
  • MP493 inhibition The effect of the substance on suppressing lung metastasis of cancer cells can be evaluated.
  • An ARDS model is created by intraperitoneally or intravenously administering endotoxin to mice or rats.
  • the MP 493 activity modulator is administered intravenously, intraperitoneally, or orally immediately before or several hours after the endotoxin administration. Eighteen hours after administration of endotoxin, the lungs were removed, and the MP 493 activity modulator was determined by measuring the wet-dry weight ratio and the amount of pigment leaked into the lung tissue or the number of lymphocytes infiltrated into the lung 'tissue. Can be evaluated for its effect on lung injury.
  • glomerular basement membrane anti-sag antiserum was intravenously administered to SD rats weighing 180 g to 220 g (7 to 8 weeks), and the following day, Sagiria-guma Prince was treated with Freund's complete adjuvant. It is emulsified with knot and injected into both hind footprints intradermally.
  • the effect of MP493 activity modulator on renal impairment can be determined by collecting urine on the 19th day after administration and measuring urinary protein concentration and urine urea concentration or observing glomerular lesions by pathological observation. Can be evaluated.
  • Serine protease-related diseases in tissues where MP493 is predominantly expressed especially various cancers, various lung diseases, asthma, allergy, bronchitis, emphysema, viral diseases, shock, multiple organ failure, inflammatory disease It can be used for diagnosis, research, prevention and treatment of diseases related to various nephritis.

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Abstract

A gene and a protein widely relating to cancer infiltration, kidney diseases, lung diseases, etc. and a method of efficiently evaluating a substance controlling the activity of this protein. DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO:1 or 2; a serine protease encoded by the DNA; a method of evaluating a compound controlling the activity of the above protein by using an antisense nucleic acid against the DNA sequence as described above, the above protein or a partial model structure thereof; an antisense nucleic acid against the DNA; and an antibody specific to the above protein.

Description

明 細 書 新規なセ リ ンプロテア一ゼ M P 4 9 3 発明の詳細な説明  Description New Serine Proteinase MP493 Detailed Description of the Invention
発明の属する技術分野  Technical field to which the invention belongs
本発明は、 各種癌 ， 腫瘍、 各種肺疾患、 喘息、 ア レルギー、 気管支炎、 肺気腫、 ウィ ルス性疾患、 ショ ッ ク、 多臓器不全、 滕炎、 各種腎炎などの疾患に関わる膜貫通型新規セ リ ンプロテ ァーゼ MP493、 該セ リ ンプロテア一ゼをコ一 ドする D NA な ら びに組換えぺク夕一、 該ベク タ一を用いた形質転換体、 該セ リ ン プロテア一ゼに対する特異抗体、 該セ リ ンプロテア一ゼの発 現を抑制するアンチセンス核酸、 及び該セ リ ンプロテア一ゼま たはそれをコー ドする D NAを用いた診断薬、 阻害剤、 医薬品な どのスク リ 一ニング方法、 M P493 のセ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンの空間座標及びその使用方法に関する。  The present invention relates to a novel transmembrane type relating to diseases such as various cancers, tumors, various lung diseases, asthma, allergy, bronchitis, emphysema, viral diseases, shock, multiple organ failure, Tengitis, various nephritis, etc. Serine proteinase MP493, DNA encoding the serine proteinase and a recombinant vector, a transformant using the vector, a specific antibody against the serine proteinase An antisense nucleic acid that suppresses the expression of the serine protease; and screening of a diagnostic agent, an inhibitor, a pharmaceutical, etc., using the serine protease or a DNA encoding the same. The method relates to the spatial coordinates of the serine protease domain of MP493 and its use.
従来の技術 ' セ リ ンプロテア一ゼは、 触媒部位に活性に必須な S er 残基を もつ一群のプロテア一ゼである。 こ の活性部位にある S e r 残基 は、 求核性が大き く 活性化されてい る。 こ の求核性は、 Asp - His-Serからなる 3種類の触媒基によって維持されている。 Prior Art 'Serine proteases are a group of proteases with Ser residues essential for activity at the catalytic site. The Ser residue in this active site is highly nucleophilic and activated. This nucleophilicity is Asp- It is maintained by three kinds of catalytic groups consisting of His-Ser.
セ リ ンプロテアーゼは、 4 つのタイ プに大き く 分類される。 すなわち、 キモ ト 'リ ブシン型、 スプチ リ シン型、 セ リ ンカルボ キシぺプチダ一ゼ型、 サイ ト メ ガロ ウィルスプロテア一ゼ型で ある。 キモ ト リ ブシン、 ト リ プシン、 エラスターゼはア ミ ノ酸 配列上の相同性が高い。 ただ し、 特異性ポケ ヅ ト （ S 1ポケ ヅ ト） などの基質結合ポケ ッ ト の構造に差異がみられるため、 その機 能は異なる。 スプチ リ シン型とセ リ ンカルボキシ型は、 一次配 列、 三次構造共に異なるが、 活性 3 残基の配置が同 じである。 一方、 サイ ト メ ガロ ウィ ルス プロテア一ゼ型のものも同様の活 性 3 残基の配置を有するが、 Asp残基が His残基に置換 してい る。  Serine proteases are broadly classified into four types. That is, they are chymoto's ribosin type, spurtlysin type, serine carboxypeptidase type and site megalovirus protease type. Chymotrypsin, trypsin, and elastase have high homology in the amino acid sequence. However, their functions are different due to differences in the structure of substrate-binding pockets such as specificity pockets (S1 pockets). Although the primary and tertiary structures of the sptylysine form and the serine carboxy form are different, the arrangement of the active three residues is the same. On the other hand, the cytomegalovirus protease type has a similar arrangement of three active residues, but the Asp residue is replaced by the His residue.
セ リ ンプロテアーゼは、 前駆夕 ンパク質の処理か ら細胞内分 解までの多様な細胞プロセスに関わる。 高等動物では、 食物の 消化、 血液凝固 · 線溶、 補体活性化、 ホルモン産生、 排卵と受 精、 食作用、 細胞増殖、 発生 ' 分化、 老化、 癌転移など極めて 多 く の生体反応に関与 して い る こ とがわかってい る（Neurath, H. Science., Vol.224, pp.350-357, (1984)) 。 そのため、 これま で多 く の研究者から注目されてきてい るが、 これはセ リ ンプロ テア一ゼが癌、 アレルギーをは じめ、 各種悪性疾患の病因 · 病 態進行に深 く 関わっているためである。 Serine proteases are involved in a variety of cellular processes, from proprotein processing to intracellular degradation. In higher animals, it is involved in a large number of biological reactions such as food digestion, blood coagulation and fibrinolysis, complement activation, hormone production, ovulation and fertilization, phagocytosis, cell proliferation, development, differentiation, aging, and cancer metastasis. (Neurath, H. Science., Vol. 224, pp. 350-357, (1984)). Therefore, many researchers have been paying attention to this, but this is This is because the theatase is deeply involved in the pathogenesis and progression of various malignant diseases, including cancer and allergies.
癌細胞に発現し重要な生理機能を担う プロテア一ゼがメ 夕 口 プロテア一ゼ群を中心に多数存在する こ とは、 よ く 知られてい る。 一方、 セ リ ンプロテア一ゼに関 しては、 その機構や関わ り がはっ き り とは特定されていないのが現状であるが、 プラス ミ ンゃ ト ロ ン ビンがマ ト リ クスメ 夕 口 プロテア一ゼ群を活性化し た り 、 ム リ ンマク ロ ファージエラス夕一ゼの分泌を促進した り する こ と、 また、 PAR - I 活性化べプチ ドがム リ ンマクロ フ ァー ジエラス夕一ゼの遊離を誘導する こ とが知られてい る。 更にメ 夕 口 プロテア一ゼ 9 ( MMP 9 ) は、 ト リ プシンによ って活性化 され（Duncan ME et al.' Eur J Biochem Vol.258, pp.37-43 , (1998)) , 癌浸潤などに関与する。 その他、 近年、 前立腺に特異的に発現 する膜結合型のセ リ ンプロテア一ゼが、 前立腺癌細胞における cD NA マイ ク ロアレイ技術によ って選抜されてクロ一ニングさ れた。 TMPRS S 2 と命名されたこのセ リ ンプロテア一ゼは、 こ れまで、細胞外マ ト リ クスゃ基底膜構成成分の分解や IV型コラ ゲナーゼの活性化な どを介して癌浸潤などに関わる とされてき たセ リ ンプロテアーゼ群とは異な り 、 アン ド ロゲンなどによつ て制御されう る機構で癌化に閼与する可能性が示されてい るIt is well known that a large number of proteases, which are expressed in cancer cells and play important physiological functions, exist mainly in the group of proteases. On the other hand, the mechanism and relationship of serine protease has not been clearly identified at present, but plasmin thrombin is a matrix phenomenon. It activates the oral protease group and promotes the secretion of murine macrophage elastase, and the PAR-I activation peptide activates murine macrophage elastase. It is known to induce the release of zeolites. In addition, MMP 9 is activated by trypsin (Duncan ME et al. 'Eur J Biochem Vol. 258, pp. 37-43, (1998)). Involved in infiltration and the like. In recent years, a membrane-bound serine protease that is specifically expressed in the prostate has been selected and cloned using the cDNA microarray technology in prostate cancer cells. This serine protease, named TMPRS S2, has been implicated in cancer invasion through the degradation of extracellular matrix ゃ basement membrane components and activation of type IV collagenase. Unlike the serine proteases which have been May be involved in canceration by a mechanism that can be controlled
(Cancer Res. Vol.59，PP.4180-4184, (1999))。 しか しながら、 ま だ確かな知見は得られていないのが現状である。 (Cancer Res. Vol. 59, PP. 4180-4184, (1999)). However, at this time, no solid knowledge has been obtained.
この種の膜結合型のセ リ ンプロテアーゼ 自体、 その機能の詳 細があま り知 られていないが、 1998年に見出された蛋白質であ るヘプシンは、 肝臓な らびに肝細胞ガンでの発現が高い こ とが 報告されている。 このヘプシンをコ一 ドする遺伝子を欠いたノ ッ クァゥ トマウスも作成されてお り、 第 8 因子のア ップレギュ レーシヨ ンが認められるために血液凝固の面で注目 されている こ と、 hepatomaで血中 レペルが上昇する こ となどから、 ヘプシ ンの腫瘍マ一力一と しての示唆がされている。  Although the details of the function of this type of membrane-bound serine protease itself are not well known, hepsin, a protein discovered in 1998, has been used in liver and hepatocellular carcinoma. High expression has been reported. Knockout mice lacking this hepsin-encoding gene have also been produced, and are noted in blood coagulation due to the presence of factor VIII upregulation. Due to the rise of the medium repel, it has been suggested that hepsin may be one of the most effective tumors.
従来、 肺の各種疾患、 例えば肺気腫、 肺繊維症、 喘息、 ァレ ルギ一、 外来性微生物、 カ ビ、 及びウィルス等に よる疾患は、 好中球エラス夕一ゼ、 キマ一ゼ、 5 ト リ プ夕一ゼ といったセ リ ンプロテア一ゼとの闋係が示唆されて きている。 β ト リ プ夕ー ゼは、 喘息患者、 鼻炎患者のアレルギー性炎症部位で産生され、 キニノ一ゲンからのキニン生成や補体 C3 から C3a 生成を触媒 する基質特異性を有する。 そのため、 抗原に暴露された喘息患 者の咳の発生や、 気道収縮への閧与が指摘されている。 また、 プロ テア一ゼ活性化受容体 -2(PAR-2)の リ ガン ド で あ り 、 in vitro で繊維芽細胞の増殖やコ ラーゲン産生を増強する こ とか ら、 喘息や肺繊維症の新たな治療薬と して注目されている。 そ の他、 肺に発現している ト リ プ夕ーゼクララ（H. Kido et al.， J. Biol. Chem., Vol.267, p .13573■ 13579 (1992)； M. Tashiro et al.， J. Virol., Vol.66, pp .7211 - 7216 (1992))は、 ィ ンフルェンザ ウィ ルスの外膜蛋白質を限定分解するために、 結果と して細胞 膜の融合活性を発揮させ、 感染を引き起こ し得る こ とが示唆さ れている。 Conventionally, various diseases of the lung, such as emphysema, pulmonary fibrosis, asthma, allergies, exogenous microorganisms, molds, and viruses, are caused by neutrophil elastase, chimase, It has been suggested that there is a relationship with serine proteases such as the Lipase. β-tripse is produced in allergic inflammatory sites in asthmatics and rhinitis patients and has substrate specificity that catalyzes the production of kinin from kininogen and C3a from complement C3. For this reason, it has been pointed out that asthma patients exposed to the antigen may develop cough and have an effect on airway constriction. Also, A ligand for protease-activated receptor-2 (PAR-2), which enhances fibroblast proliferation and collagen production in vitro, and thus is a new source of asthma and pulmonary fibrosis. It is attracting attention as a therapeutic drug. In addition, trypsin-zeclara expressed in the lung (H. Kido et al., J. Biol. Chem., Vol. 267, p. 13573-13579 (1992); M. Tashiro et al., J. Virol., Vol. 66, pp. 7211-7216 (1992)) limitedly degrades the outer membrane protein of influenza virus, resulting in its cell membrane fusion activity, It is suggested that it can cause this.
勝臓に発現するセ リ ンプロテアーゼと して、 消化酵素の ト リ プシ ンがあげられる。 ト リ プシンはゥシ、 プ夕、 ヒ ト、 ゥサギ など各種動物の脬臓に由来する こ とが知られ、 滕液中に含まれ る蛋白質分解作用を有する酵素の名称と して使用され、 脬臓の acinous cell で不活性型の ト リ プシノ一ゲン と して作られるェ ン ドぺプチダ一ゼ群の酵素である こ とがわかってい る。 ト リ ブ シンは、 ト リ プシノ ーゲンから 自己触媒的にェンテロキナーゼ、 モル ドキナーゼ、 カテブシン B によって活性化を う けて ト リ ブ シン となる。 その性質や構造については研究され、 ペプチ ド、 ア ミ ド、 エステルの類を L- Arg または L-Lysの力ルポキシル基 側のぺプチ ド結合を優先的に加水分解する作用を有 している。 純化された酵素は血液凝固、 血圧低下、 抗炎症作用などが認め られて臨床に利用されている。 また、 その一方で脬炎などの疾 患標的と して知られてい る。 ト リ プシン様の基質特異性を有す る酵素の開発及び ト リ プシン様プロテアーゼの開発および、 ト リ プシン様の活性を有 して脬炎な どの疾患の標的となるセ リ ン プロテア一ゼの単離が切望されている。 Serine proteases expressed in the viscera include the digestive enzyme trypsin. Trypsin is known to be derived from the gut of various animals, such as porcupine, pusin, human, and egret, and is used as the name of an enzyme that has a proteolytic activity contained in Teng's solution. It is known to be an enzyme of the endopeptidase group that is produced as inactive trypsinogen in acinous cells of the kidney. Tribosine is autocatalytically activated from trypsinogen by enterokinase, mold kinase, and cathepsin B to form tribosine. Its properties and structures have been studied and peptides, amides and esters have been converted to L-Arg or L-Lys lipoxyl groups. It has the action of preferentially hydrolyzing the peptide bond on the side. The purified enzyme has been used in clinical practice because of its blood coagulation, lowering blood pressure, and anti-inflammatory effects. On the other hand, it is also known as a target for diseases such as inflammation. Development of enzymes with trypsin-like substrate specificity, development of trypsin-like proteases, and serine proteases that have trypsin-like activity and are targets for diseases such as inflammation There is an eager need for isolation.
腎 （臓） の糸球体の炎症性疾患と して腎炎があ り 、 微小変化 群管内増殖性腎炎、 半月体形性腎炎、 糸球体硬化症、 メ サンギ ゥム増殖性腎炎、 膜性腎症、 膜性増殖性腎炎、 末期硬化性腎炎、 Nephritis is a glomerular inflammatory disease of the kidney (spleen), and is minimally altered. Intraproliferative nephritis, crescentic nephritis, glomerulosclerosis, mesangial proliferative nephritis, membranous nephropathy, Membranous proliferative nephritis, end-stage sclerosing nephritis,
I g A腎炎な どが知られている。 腎炎の治療には、 副腎皮質ホ ルモ ン （ステ ロイ ド剤） 、 免疫抑制剤、 抗凝固剤、 抗血小板剤、 利尿剤などが用い られている。 近年、 糸球体腎炎患者において、 膜結合型セ リ ンプロテアーゼであ る フ ァク タ一 I が欠損 してい るケ一スが報告されている。フ ァク タ一 I は、補体系の C 4b /C 3b を不活性化 さ せ る酵素で あ り 、 その 関連が注 目 さ れて い る (S adallah S et al. 'Am J Ki dney Dis . , Vol.33, pp . 1153. 7 , ( 1999) )。 また、 ト リ プシン型セ リ ンプロテア一ゼの一種であ る ト ロ ン ビ ンは、 へキソキナーゼ活性を制御 しメ サンギゥム細胞における 腎障害 に 関与 す る こ と も 報告さ れて い る （Robey RB et al. Kidney Int., Vol.57, pp .2308- 18(2000))。 更に、 セ リ ンプロテア —ゼの阻害剤で あ る 内在性のィ ン ヒ ビ夕 一で あ る メ グシ ン ( Megsin) は、 IgA腎炎を始め多種多様の腎炎において発現し てお り 、 これか ら も賢障害にある種のセ リ ンプロテア一ゼが闋 与する こ とが推測されている。 Ig A nephritis is known. For treatment of nephritis, adrenal cortical hormone (steroids), immunosuppressants, anticoagulants, antiplatelets, diuretics, etc. are used. In recent years, cases where glomerulonephritis patients lack Factor I, a membrane-bound serine protease, have been reported. Factor I is an enzyme that inactivates C4b / C3b in the complement system, and its association has been noted (Sadallah S et al. 'Am J Kidney Dis., Vol. 33, pp. 1153.7, (1999)). In addition, trombin, a type of trypsin-type serine protease, regulates hexokinase activity and is associated with mesangial cells. It has also been reported to be involved in renal impairment (Robey RB et al. Kidney Int., Vol. 57, pp. 2308-18 (2000)). In addition, endogenous inhibitor Megsin, an inhibitor of serine protease, is expressed in a wide variety of nephritis, including IgA nephritis. It has been speculated that certain types of serine protease may also contribute to senility disorders.
発明が解決 しょ う とする課題  Problems to be solved by the invention
このよう な背景か ら、 上記疾患に関与する ヒ ト 由来新規セ リ ンプロテアーゼ及びこれをコ一 ドする遺伝子を見出すこ と、 そ して該蛋白質を生産 し、 該蛋白質の活性を調節する物質を効率 的にス ク リ ーニングする方法、 活性調節剤、 特異的抗体、 ある いはアンチセンス核酸の開発が切望されている。  Against such a background, a novel human-derived serine protease involved in the above-mentioned diseases and a gene encoding the same have been found, and a substance that produces the protein and regulates the activity of the protein There is a strong need for the development of efficient screening methods, activity modulators, specific antibodies, or antisense nucleic acids.
本発明は、 癌 ， 腫瘍細胞や、 肺、 脾臓、 腎臓、 胎盤組織にお ける各種疾患に関与する新規なセ リ ン プロテア一ゼ、 及びそれ をコー ドする DNAを提供する こ とにある。 さ ら に、 本発明は当 該 DNAを用いた当該プロテアーゼの生産方法、当該セ リ ンプロ テア一ゼの活性を調節する化合物およびそのスク リ 一ニング方 法を提供する こ と を目的とする ものである。  It is an object of the present invention to provide a novel serine protease involved in various diseases in cancer, tumor cells, lung, spleen, kidney, and placental tissues, and a DNA encoding the same. Furthermore, the present invention has an object to provide a method for producing the protease using the DNA, a compound for regulating the activity of the serine protease, and a method for screening the same. It is.
課題を解決するための手段 本発明は、 ヒ ト 胃印環細胞癌株か ら単離された新規な遺伝子Means for solving the problem The present invention relates to a novel gene isolated from a human gastric signet-ring cell carcinoma cell line.
(mp493 とする） 、 当該遺伝子にコー ドされる膜結合型の新規 セ リ ンプロテア一ゼ蛋白質 （ MP493 とする） に関する。 また、 当該遺伝子を用いて形質転換 した宿主細胞、 該形質転換細胞を 用いた組換 MP493の生産方法を提供する。 さ ら に、 空間座標化 した MP493 の部分構造モデルを利用 した、 MP493 に対するプ 口テアーゼ活性調節剤の評価方法を提供する。 (referred to as mp493) and a novel membrane-bound serine protease protein (referred to as MP493) encoded by the gene. Further, the present invention provides a host cell transformed with the gene, and a method for producing recombinant MP493 using the transformed cell. In addition, the present invention provides a method for evaluating a protease activity regulator for MP493, using a spatially coordinated partial structure model of MP493.
(核酸）  (Nucleic acid)
本発明は、 MP493 (後に詳 し く 述べる） をコー ドする遺伝子 mp493 を提供する。 該遺伝子は胃印環癌細胞から単離同定する こ とができるが、 本明細書に開示された配列を基に、 一般的な ハイ ブリ ダィゼ一シ ヨ ン等の遺伝子工学的手法を用いたク ロー ニングゃホスホアミ ダイ ト法などの化学合成的手法によ り 調製 される DNAであっても よい。 その形態と しては cDNA、 ゲノ ム DNAの他、 化学合成 DNAなどが含まれるが、 特に制限はない。 また、 本発明の DNAは 1本鎖であっても、 それに相補的な配列 を有する DNAや RNA と結合して 2 重鎖、 3 重鎖を形成してい ても良い。 また、 当該 DNAは、 ホースラディ ヅシュペルォキシ ダ一ゼ （HRPO) 等の酵素や放射性同位体、 蛍光物質、 化学発 光物質等で標識されていてもよい。 The present invention provides a gene, mp493, which encodes MP493 (described in detail below). The gene can be isolated and identified from gastric signet ring carcinoma cells, but based on the sequence disclosed herein, a general engineering technique such as hybridization was used. It may be DNA prepared by a chemical synthesis method such as the cloning-phosphoramidite method. Examples of the form include cDNA, genomic DNA, and chemically synthesized DNA, but are not particularly limited. Further, the DNA of the present invention may be single-stranded or may form a double-stranded or triple-stranded chain by binding to DNA or RNA having a sequence complementary thereto. In addition, the DNA is used for enzymes such as horseradish peroxidase (HRPO), radioisotopes, fluorescent substances, and chemical sources. It may be labeled with a light substance or the like.
mp493 の塩基配列が提供されれば、 これよ り 導かれる RNA の配列や、 相補的な DNAおよび RNAの配列などは一義的に決 定されるので、 本発明は、 本発明の DNAに対応する RNAある いは本発明の DNA と相補的な配列を有する DNA および RNA も また提供するものと理解すべきである。  If the base sequence of mp493 is provided, the sequence of the RNA derived therefrom and the sequence of the complementary DNA and RNA are uniquely determined, so that the present invention corresponds to the DNA of the present invention. It should be understood that DNA or RNA having a sequence complementary to the RNA or DNA of the present invention is also provided.
さ ら に、 本発明の DNAには、 配列番号 1 または 4 に記載の塩 基配列からなる DNA とス ト リ ンジヱン ト な条件でハイ ブリ ダ ィ ズする DNAをも含むものである。  Furthermore, the DNA of the present invention also includes a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 4 under stringent conditions.
配列番号 1 または 4 に記載の塩基配列からなる DNA に対し ては、これとス ト リ ンジ ェ ン トな条件でハイ ブリ ダィ ズし、 かつ 該 DNA にコー ド される蛋白質がセ リ ンプロテア一ゼ活性を保 持する範囲内において、 塩基配列のバ リ エーショ ンが許容され る。 例えば、 いわゆるコ ド ン縮重によ る同一ア ミ ノ 酸残基をコ — ドする複数のコ ド ンの存在や、 種々の人為的処理例えば部位 特異的変異導入、 変異剤処理によるラ ンダム変異、 制限酵素切 断による DNA断片の変異 '欠失 '連結等によ り 、 部分的に DNA 配列が変化 したものであっても、 これら DNA変異体が配列番号 1 または 4 に記載の DNA とス ト リ ンジヱ ン トな条件下でハイ プリ ダイズし、かつセ リ ンプロテア一ゼをコー ドする DNAであ れば、配列番号 1 または 4 に示した DNA配列との相違に関わら ず、 本発明の範囲内のものである。 The DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 4 hybridizes with the DNA under stringent conditions, and the protein encoded by the DNA is a serine protein. Variation of the nucleotide sequence is allowed as long as the enzyme activity is maintained. For example, the presence of multiple codons that code for the same amino acid residue due to so-called codon degeneracy, or the use of various artificial treatments, such as site-directed mutagenesis or treatment with a mutagen Mutation of DNA fragments due to mutation or restriction enzyme cleavage Even if the DNA sequence is partially changed due to ligation, etc., these DNA mutants may be replaced with the DNA described in SEQ ID NO: 1 or 4. High under stringent conditions As long as the DNA is a pre-sidized DNA encoding serine protease, it is within the scope of the present invention, regardless of the difference from the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4.
上記の DNA変異の程度は、配列番号 1 または 4 に記載の DNA 配列と 70%以上、 好ま し く は 80%以上、 更に好ま し く は 90% 以上の相同性を有する も のであれば許容範囲内であ る。 また、 ハイ プリ ダイ ズする程度と しては、 通常の条件下、 例えば DIG DNA Labeling kit ( ぺ 一 リ ン ガー . マ ン ハ イ ム 社製 Cat No.1175033) でプローブをラペル した場合に、 3 2 °Cの DIG Easy Hy 溶 液 （ ベ ー リ ン ガ ー ' マ ン ハ イ ム 社製 Cat No.1603558) 中でノヽイ ブリ ダィ ズさせ、 5 0 °Cの 0 . 5 X S S C溶液 （ 0 . 1 % [ w/ ] S D S を含む） 中でメ ンブレ ンを 洗浄する条件 （ 1 X S S Cは 0 . 1 5 M N a C l、 0 . 0 1 5 M クェン酸ナ ト リ ゥムである）でのサザンノヽイ ブリ ダィ ゼ一シ ヨ ンで、 配列番号 1 または 4 に記載の核酸にハイ ブ リ ダィ ズす る程度であればよい。  The extent of the above DNA mutation is acceptable as long as it has 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more homology with the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4. Within. In addition, the degree of high pre-hybridization can be measured under normal conditions, for example, when the probe is lapel with the DIG DNA Labeling kit (Chain No. 1175033 manufactured by Lininger, Mannheim). 3 Neutralize in DIG Easy Hy solution (Behringer's Mannheim Cat No. 1603558) at 22 ° C, and then add 0.5 XSSC solution at 50 ° C. Conditions for washing the membrane in 0.1% [w /] SDS (1 XSSC is 0.15 MNaCl, 0.015 M sodium citrate) In the Southern noise hybridization described in (1), it is only necessary to hybridize to the nucleic acid of SEQ ID NO: 1 or 4.
本発明の DNA を有する組換えべクタ一は、 環状、 直鎖状等い かなる形態のものであっても よい。 かかる組換えべク夕一は、 本発明の DNAに加え、必要な らば他の塩基配列を有 していても よい。 他の塩基配列とは、 ェ ン ノ、ンサ一の配列、 プロモー夕一 の配列、 リ ボゾーム結合配列、 コ ピー数の増幅を目的と して使 用される塩基配列、 シグナルぺプチ ド をコ一 ドする塩基配列、 他のポ リペプチ ドをコー ドする塩基配列、 ポ リ A付加配列、 ス プライ シング配列、 複製開始点、 選択マ一力一となる遺伝子の 塩基配列等のことである。 The recombinant vector having the DNA of the present invention may be in any form, such as circular or linear. Such a recombinant vector may have another nucleotide sequence, if necessary, in addition to the DNA of the present invention. Good. Other nucleotide sequences include the sequences of geno, nucleotide sequence, promoter sequence, ribosome binding sequence, nucleotide sequence used for amplification of copy number, and signal peptide. This refers to the nucleotide sequence to be transcribed, the nucleotide sequence encoding other polypeptides, the polyA-added sequence, the splicing sequence, the replication origin, the nucleotide sequence of the gene that plays a key role in selection, and the like.
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成 DNAアダプタ一を用 いて翻訳開始コ ド ンや翻訳終止コ ド ンを本発明の D NA に付加 した り 、 あ るいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新た に発生させあるいは消失させる こ と も可能である。 これらは当 業者が通常行う作業の範囲内であ り、本発明の D NA を基に任意 かつ容易に加工する こ とができ る。  In gene recombination, a translation initiation codon and a translation termination codon are added to the DNA of the present invention using an appropriate synthetic DNA adapter, or an appropriate restriction enzyme cleavage sequence is added to the nucleotide sequence. It can be newly generated or eliminated. These are within the range of the work normally performed by those skilled in the art, and can be arbitrarily and easily processed based on the DNA of the present invention.
また本発明の DNAを保持するぺク夕一は、使用する宿主に応 じた適当なベクタ一を選択して使用すればよ く 、 プラス ミ ドの 他にノ クテ リ オファージ、 バキュロ ウィルス、 レ ト ロ ゥイ リレス、 ワク シニアウィ ルス等の種々のウィルスを用いる こ とも可能で あ り 、 特に制限はない。  The vector carrying the DNA of the present invention may be used by selecting an appropriate vector according to the host to be used. In addition to plasmid, it is also possible to use a vector such as a nacteriophage, a baculovirus, or a baculovirus. It is also possible to use various viruses such as Troilei les and Vaccinia viruses, and there is no particular limitation.
(蛋白質 MP 493 )  (Protein MP 493)
mp 493 にコー ドされる蛋白質は、 配列番号 2 に示すア ミ ノ酸 配列からなる MP493 である。 MP493 はセ リ ンプロテア一ゼに おいて保存される触媒残基、 Asp304、 Ser400、 His257 を有す る。 また後述する よう に、 その 3 次元構造をモデリ ングし解析 したと こ ろ、 基質の P1部位に塩基性の残基 （ L-Asp, L-Lys) を 有する基質を好んで切断するセ リ ンプロテア一ゼである こ とが 判明 した。 また、組み換え細胞において発現し、精製した MP493 は、 確かに予想された合成基質を水解 し、 モデル構造の妥当性 とセ リ ンプロテア一ゼ活性を有する こ とがこれによ り実証され た。 相同性解析の結果、 MP493は TMPRSS2、 Factor I 、 ト リ プシン、 ヘプシン、 β ト リ ブ夕一ゼと一次構造上約 6 0 %の相 同性が認められた。 またモチーフ解析の結果からは、 ΜΡ493 に は LDL レセプ夕一 ドメイ ン、 スカベンジャーレセプ夕一システ イ ン リ ッチ ドメ イ ン、 膜貫通領域が認められた。 以上の事実よ り、 ΜΡ493は膜貫通型構造を有するセ リ ンプロテア一ゼである と判断される。 The protein encoded by mp493 is the amino acid shown in SEQ ID NO: 2. MP493 consisting of an array. MP493 has catalytic residues, Asp304, Ser400, and His257, which are conserved in serine protease. Also, as described later, when the three-dimensional structure was modeled and analyzed, a serine protein that preferentially cleaves a substrate having a basic residue (L-Asp, L-Lys) at the P1 site of the substrate was analyzed. It turned out to be one. It also demonstrated that MP493, expressed and purified in recombinant cells, hydrolyzes the expected synthetic substrate and has the validity of the model structure and serine protease activity. As a result of homology analysis, MP493 was found to have approximately 60% homology with TMPRSS2, Factor I, trypsin, hepsin, and β-trib-unicase in the primary structure. From the results of the motif analysis, ΜΡ493 showed an LDL receptor domain, a scavenger receptor domain and a transmembrane domain. Based on the above facts, it is determined that # 493 is a serine protease having a transmembrane structure.
ΜΡ493 が胃印環癌細胞で発現している こ と、 セ リ ンプロテア —ゼ ドメ イ ンゃ膜貫通 ド メ ィ ンな ど種々のモチーフが存在する こ と、 ア ミ ノ酸配列および核酸配列上の相同性、 特に前立腺癌 細胞で特異的に発現さ れる 膜貫通型セ リ ン プロ テ ア一ゼの TMPRS S 2と 6 1 %の相同性を有 している こ となどから、 MP 493 は TMPRS S 2 と同様、 アン ド ロゲンなどによって制御される癌 化に関与する蛋白質である と判断された。 The presence of various motifs such as 癌 493 in gastric signet ring carcinoma cells and the presence of various motifs, such as serine protein-zedomin and transmembrane domains, indicates that amino acids and nucleic acid sequences Of transmembrane serine proteinase that is specifically expressed in prostate cancer cells Based on the fact that it has 61% homology with TMPRS S2, it was concluded that MP493, like TMPRS S2, is a protein involved in oncogenesis controlled by androgens.
また、 MP 493 は、 肺気腫や肺繊維症などの肺の各種疾患に関 与する とされる /5 ト リ ブ夕ーゼ、 あるいは糸球体腎炎の発症に 関与する とされる膜貫通型セ リ ンプロテア一ゼ factorl などと も近い構造を有 している。 加えて、 遺伝子 mp 493 の生体におけ る発現分布を各種臓器由来の c DNA ライ ブラ リ 一を用いて確 認した と こ ろ、 該遺伝子は肺、 滕臓、 腎臓、 胎盤で発現 してい る こ とが確認された。  In addition, MP 493 is thought to be involved in various lung diseases such as emphysema and pulmonary fibrosis./5 Tribuse, or a transmembrane cell that is thought to be involved in the development of glomerulonephritis. It has a structure similar to that of protein protease. In addition, when the expression distribution of the gene mp493 in the living body was confirmed using cDNA libraries derived from various organs, the gene was expressed in the lung, lentil, kidney, and placenta. This was confirmed.
従って、 MP493はこれら各種疾患の発症とも密接に関与 して いる ものと推察される。 特にセ リ ンプロテア一ゼ活性に よる標 的蛋白質の加水分解がこれらの疾患の発症において意義をもつ と想定される こ とから、 MP493 を特異的に阻害 し得る化合物は 医薬と しての有用性を持つと期待される。 また、 MP493 を用い た同プロテアーゼ活性の阻害剤の探索は、 医薬開発において重 要な意義を有する と期待される。  Therefore, it is presumed that MP493 is closely involved in the development of these various diseases. In particular, since hydrolysis of the target protein by serine protease activity is considered to be significant in the development of these diseases, compounds that can specifically inhibit MP493 are useful as pharmaceuticals. Is expected to have. In addition, the search for inhibitors of the protease activity using MP493 is expected to have important significance in drug development.
なお、 セ リ ンプロテア一ゼ活性を有する限 り、 配列番号 2 に 示す蛋白質のアミ ノ酸配列において、 1 以上のアミ ノ酸が置換、 欠失、 および/若 し く は付加 したアミ ノ酸配列か ら なるポ リべ プチ ドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。 また、 配列番 号 5 に示すアミ ノ 酸配列か らなる蛋白質は、 MP493 のセ リ ンブ 口テア一ゼ ドメ イ ンであ り 、セ リ ンプロテア一ゼ活性を有する。 配列番号 5 に示すアミ ノ酸配列からなる蛋白質は、 MP493 に比 して遺伝子工学的に生産が容易であ り 、該蛋白質の活性調節物 質のス ク リ ーニング等に供するのに好適である。 ま た、 配列番 号 5 に示すアミ ノ酸配列の情報から、 実施例 6 に示すよ う にコ ン ピュー夕一上での活性阻害化合物のスク リ ーニングを行う こ とが可能であ る。 こ のセ リ ンプロテア一ゼ活性を有する限 り 、 配列番号 5 に示す蛋白質のアミ ノ酸配列において 1 以上のアミ ノ酸が置換、欠失、 及び も し く は付加したア ミ ノ酸配列からな るポ リペプチ ドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。 As long as the protein has serine protease activity, one or more amino acids are substituted in the amino acid sequence of the protein shown in SEQ ID NO: 2; Polypeptides or proteins consisting of amino acid sequences that have been deleted and / or added are also within the scope of the present invention. In addition, the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is the serine protease domain of MP493, and has serine protease activity. The protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 can be easily produced by genetic engineering as compared with MP493, and is suitable for use in screening for an activity regulating substance of the protein. . In addition, based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 5, it is possible to screen the activity-inhibiting compound on a computer as shown in Example 6. As long as this protein has the serine protease activity, one or more amino acids in the amino acid sequence of the protein shown in SEQ ID NO: 5 are substituted, deleted, or added to the amino acid sequence. Other polypeptides or proteins are also within the scope of the present invention.
蛋白質の構成要素となるアミ ノ酸残基側鎖は、 疎水性、 電荷、 大きさなどにおいてそれそれ異なるが、 実質的に蛋白質全体の 3次元構造 （立体構造と も言う ） に影響を与えない い う意味 で保存性の高い幾つかの閧係が知られている。 例えば、 ァ ミ ノ 酸残基の置換については、 グリ シン （ Gly ) と プロ リ ン （ Pro ) 、 Gly とァラニン （Al a ) またはノ リ ン （Val ) 、 ロイ シン （Le u ) とイ ソ ロイ シ ン （lie)、 グルタ ミ ン酸（ Glu) とグルタ ミ ン（ Gin) アスク ラ ギン酸（Asp)とァスパラ ギン（ Asn)、 システィ ン（ Cys) とス レオニン （Thr) 、 Thr とセ リ ン （Ser) または Ala、 リ ジ ン （ Lys) とアルギニン （ Arg) 、 等が挙げられる。 また、 A 1 a、 V a l、 L e u、 I l e、 P r o、 メ チォニン （ M e t ) 、 フ ヱ二ルァラニン （ P h e ) 、 ト リ プ ト フ ァン （ T r p ) 、 G l y、 C y s は、 共に非極性ア ミ ノ酸に分類されるため、 互いに似た 性質を有する と考え ら れる 。 非荷電極性ア ミ ノ 酸と しては、 S e r、 T h r、 チロ シ ン （ T y r ) 、 A s n、 G i nが挙げ られる。 酸性アミ ノ酸と しては、 A s pおよび G 1 uが挙げら れる。 塩基性アミ ノ酸と しては L y s、 A r g、 ヒスチジ ン （ H i s ) が挙げられる。 また、 上述の意味の保存性を損なう場合 でも、 なおその蛋白質の本質的な機能、 本発明においてはセ リ ンプロテア一ゼ活性、 を失わない変異も当業者に多 く 知られて いる。 さ ら に、 異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、 幾つかのァ ミ ノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入さ れていてもなお本質的な機能を保持している例も多 く 認め られ ている。 Amino acid residue side chains, which are constituents of proteins, differ in hydrophobicity, charge, size, etc., but do not substantially affect the three-dimensional structure (also called three-dimensional structure) of the entire protein In this sense, several highly conservative partners are known. For example, for substitution of aminoic acid residues, glycine (Gly) and proline (Pro), Gly and alanine (Al a) or norin (Val), leucine (Le u) And isoleucine (lie), glutamic acid (Glu) and glutamine (Gin), ascraginate (Asp) and asparagine (Asn), cystine (Cys) and threonine (Thr), Thr and serine (Ser) or Ala; lysine (Lys) and arginine (Arg); In addition, A1a, Val, Leu, Ile, Pro, methionine (Met), phenylalanine (Phe), tripfan (Trp), Gly, C Since both ys are classified as non-polar amino acids, they are considered to have similar properties. Examples of uncharged electrode-type amino acids include Ser, Thr, tyrosine (Tyr), Asn, and Gin. Examples of acidic amino acids include Asp and G1u. Examples of the basic amino acid include Lys, Arg, and histidine (His). Further, even if the above-mentioned conservative property is impaired, many mutations that do not lose the essential function of the protein, serine protease activity in the present invention, are well known to those skilled in the art. In addition, the same type of protein conserved between different species retains essential functions even when several amino acids are deleted or inserted in a concentrated or dispersed manner. Are also recognized.
従って、 配列番号 2 または 5 に示 したアミ ノ酸配列上の置換、 揷入、 欠失等による変異蛋白質であっても、 その変異が本発明 の本質的機能であるセ リ ンプロテアーゼ活性を有する蛋白質で あれば、 これらは本発明の範囲内にあるものと言う こ とができる さ らに、 第 9 図の空間座標によ り特定される蛋白質も MP493 と してのセ リ ンプロテア一ゼ活性を有する ものであ るので、 本発 明の範囲内のものである。 第 9 図の空間座標によ り 特定される 蛋白質に対 しても、 セ リ ンプロテア一ゼ活性を保持する限り に おいてアミ ノ 酸の置換、欠失、 及び/も し く は付加が許される。 Therefore, substitutions on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 5, Even if the protein is a mutant protein due to insertion, deletion, or the like, if the mutation is a protein having serine protease activity, which is an essential function of the present invention, these are within the scope of the present invention. In addition, the protein specified by the spatial coordinates in FIG. 9 also has serine protease activity as MP493, and is therefore within the scope of the present invention. . The substitution, deletion, and / or addition of amino acids is allowed for the protein specified by the spatial coordinates in Fig. 9 as long as it retains serine protease activity. It is.
このよう なア ミ ノ 酸の改変は、 遺伝子多形等によ って生ずる 変異の様に自然界において認められる他、 当業者に公知の方法、 例えば NT G な どの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々 の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用 して、 人為 的に行う こ とができ る。 アミ ノ酸の変異部位および個数は、 変 異蛋白質がセ リ ンプロテア一ゼ活性を保持する限 り 特に制限は ないが、 変異個数は通常数十ア ミ ノ酸以内、 好ま し く は 1 0 ァ ミ ノ酸以内、 よ り好ま し く は 1 も し く は数個以内である。  Such modification of amino acid is found in nature, such as a mutation caused by a genetic polymorphism, etc., as well as by methods known to those skilled in the art, for example, mutagenesis using a mutagenic agent such as NTG. It can be performed artificially by using an induction method or a site-specific mutagenesis method using various recombinant gene techniques. The amino acid mutation site and number are not particularly limited as long as the mutant protein retains serine protease activity, but the number of mutations is usually within several tens of amino acids, and preferably 10 amino acids. Within the amino acid, more preferably within one or several.
(抗体）  (Antibody)
本発明はさ ら に MP 493 または配列番号 5 に記載のアミ ノ 酸配 列か らなる蛋白質に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、 上記蛋白質全体あるいはその部分べプチ ド を抗原と して特異的 に認識する抗体であ り、 モ ノ ク 口一ナル抗体及び/またはポ リ ク 口一ナル抗体が含まれる。 また、 免疫グロ ブリ ンの構造、 物理 化学的性質や免疫学的性質と して分類される 5 つのクラス（ IgG IgA, IgM, IgD, IgE) 、 あるいは H鎖のタイ プによるサブクラ スのいずれに属する ものであって も よい。 さ らに、 免疫グロ ブ リ ンを例えばペプシンで分解したと きの F(ab， ）2、 パパイ ンで 分解したと きの Fab などのフラグメ ン トであっても、 またキメ ラ抗体であっても よい。 これらの抗体は、 MP493 の研究的ある いは臨床的な検出、 MP493 によってもた ら され得る疾患の臨床 治療等に有用である。 The present invention further provides an antibody that binds to MP493 or a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5. The antibody of the present invention An antibody that specifically recognizes the whole protein or its partial peptide as an antigen, and includes a monoclonal antibody and / or a polyclonal antibody. In addition, there are five classes (IgG IgA, IgM, IgD, IgE) classified as immunoglobulin structure, physicochemical properties and immunological properties, or subclasses depending on the type of H chain. It may belong to it. Furthermore, fragments such as F (ab,) 2 when immunoglobulin is decomposed with pepsin, Fab when decomposed with pappine, and chimeric antibodies are also used. You may. These antibodies are useful for research or clinical detection of MP493, clinical treatment of diseases that can be caused by MP493, and the like.
(アンチセンス核酸）  (Antisense nucleic acid)
本発明は、生体内において核酸レベルでの MP493生合成を抑制 する こ とので きる、 いわゆるアンチセ ンス核酸を提供する。 か かるアンチセンス核酸は、 MP493 をコー ドする mRNAを作 り 出 すのに必要なゲノ ム領域か ら pre-mRNA への転写段階、 pre_ mRNAから成熟 mRNAへのプロセ ッ シング段階、 核膜通過段階- 蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担う DNAも し く は RNAに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて 蛋白質の発現を調節する ものを意味し、 遺伝子 mp 493の核酸配 列の全体あ る いはいずれかの部分に相補する配列か らなる もの であっても よい。 好ま し く は、 配列番号 1 または 3 に記載の核 酸配列に相当あるいは相補する配列から成る核酸 （ DNA、 RNA を含む） であ る。 また、 ゲノ ム領域から転写される m RNAがィ ン ト ロ ン構造あるいは 5 ' 末端や 3 ， 末端に被翻訳領域を含む 形であ る と きは、 かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補 するアンチセ ンス核酸も本発明のアンチセ ンス核酸と同等の機 能を有するものとなろう。 The present invention provides a so-called antisense nucleic acid capable of suppressing MP493 biosynthesis at the nucleic acid level in a living body. The antisense nucleic acid is a transcription step from the genomic region necessary for producing MP493-encoding mRNA to pre-mRNA, a processing step from pre_mRNA to mature mRNA, and a passage through the nuclear membrane. Step-At one of the translation steps into protein, it binds to DNA or RNA, which carries the genetic information, and affects the normal flow of genetic information. It means a substance that regulates the expression of a protein, and may consist of a sequence complementary to the whole or any part of the nucleic acid sequence of gene mp493. Preferably, it is a nucleic acid (including DNA and RNA) consisting of a sequence corresponding to or complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3. When the mRNA transcribed from the genomic region has an intron structure or a form containing a translated region at the 5'-end, 3'-end or 3'-end, the mRNA is equivalent to or complementary to the sequence of the untranslated portion. The antisense nucleic acid used will also have a function equivalent to that of the antisense nucleic acid of the present invention.
本発明のアンチセ ンス核酸は、 DNA や RNA の他、 その立体 構造や機能が D NAあるいは RNA と類似する各種誘導体のすべ てを含むものである。 例えば、 3 ' 末端も し く は 5 ' 末端に他 の物質が結合した核酸、 オ リ ゴヌ ク レ オチ ド の塩基、 糖、 リ ン 酸の少な く と もいずれか 1 つにおいて置換や修飾が生じた核酸、 天然には存在 しないような塩基、 糖あるいはリ ン酸を有する核 酸、 糖一リ ン酸骨格以外の骨格 （バ ッ クボーン） を有する核酸 等が挙げられる。 これらの核酸は、 ヌ ク レ ア一ゼ耐性、 組織選 択性、 細胞透過性、 結合力の少な く と も 1 つが高め られた誘導 体と して好適である。 すなわち、 MP 49 3 の活性発現を抑制し得 る機能を有する限 り 、 核酸の形態に制限はない。 The antisense nucleic acid of the present invention includes, in addition to DNA and RNA, all derivatives of three-dimensional structure and function similar to DNA and RNA. For example, substitution or modification of at least one of the nucleic acid, oligonucleotide base, sugar, and phosphoric acid with another substance bound to the 3'-end or 5'-end And nucleic acids having a skeleton (backbone) other than the sugar-monophosphate skeleton, such as a nucleic acid having a non-naturally occurring base, a sugar or phosphoric acid, and the like. These nucleic acids are suitable as inducers with at least one increase in nuclease resistance, tissue selectivity, cell permeability, and avidity. That is, it is possible to suppress the expression of MP493 activity. There is no limitation on the form of the nucleic acid as long as it has the function of
また本発明では、 一般的には、 ステム · ループを形成 してい る inRNAのループ部分にハイ プリ ダイズする よう な塩基配列、 すなわちステム · ループを形成している領域の塩基配列に相補 的な塩基配列をもつアンチセ ンス核酸が好適である。 あるいは、 翻訳開始コ ド ン付近、 リ ボソーム結合部位、 キヤ ッ ビング部位、 スプライ ス部位に結合する よ うなアンチセンス核酸、 すなわち これらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸 も、 一般に高い発現抑制効果が期待で きる点で好ま しい。  In addition, in the present invention, in general, a base sequence that hybridizes to a loop portion of an inRNA forming a stem-loop, that is, a base complementary to a base sequence of a region forming a stem-loop. Antisense nucleic acids having a sequence are preferred. Alternatively, an antisense nucleic acid that binds to the vicinity of the translation initiation codon, ribosome binding site, cabling site, or splice site, that is, an antisense nucleic acid having a sequence complementary to the sequence of these sites is also generally used. It is preferable because a high expression suppression effect can be expected.
こ の様なアンチセ ンス核酸を細胞内に取 り 込ませ、 効率的に 作用させるためには、本発明のアンチセンス核酸の鎖長は 15塩 基以上 30塩基以下、 好ま し く は 15 塩基以上 25 塩基以下、 よ り好ま し く は 18塩基以上 22塩基以下の塩基数からなる塩基配 列からなる ものが好適である。  In order for such an antisense nucleic acid to be taken up into a cell and to act efficiently, the antisense nucleic acid of the present invention has a chain length of 15 bases or more and 30 bases or less, preferably 15 bases or more. Those comprising a base sequence having a base number of 25 bases or less, more preferably 18 bases or more and 22 bases or less are preferred.
本発明のアンチセ ンス核酸の発現抑制効果は、 公知の手法、 えは in vitro transcription 反 、プロ メ カ千土 ： Ribo max system等) と in vitro translation反応 (プロメ ガ社 ： Rabbit Reticulocyte Lysate System等） を併用 した翻訳段階の阻害活 性、 あるいは 5' 非翻訳領域、 翻訳開始部位近傍領域、 5' 翻訳 領域を含む D NA とルシフ ェラ 一ゼ等の レポ一ター遺伝子を連 結した発現プラス ミ ドを用いた レポーター遺伝子の発現量など を測定して、 評価するこ とができる。 The effect of suppressing the expression of the antisense nucleic acid of the present invention can be determined by a known method, such as anti-in vitro transcription, promeca Chito: Ribo max system, etc., and in vitro translation reaction (promega, Rabbit Reticulocyte Lysate System, etc.). 5 'untranslated region, region near translation initiation site, 5' translation It can be evaluated by measuring the expression level of a reporter gene using an expression plasmid in which a DNA containing the region and a reporter gene such as luciferase are linked.
本発明のアンチセンス核酸は、生体内における MP 493 の発現 を抑制する こ とがで きるので、 MP493 が関連する疾患の予防 · 治療剤と して有用である。  Since the antisense nucleic acid of the present invention can suppress the expression of MP493 in a living body, it is useful as an agent for preventing and treating MP493-related diseases.
( MP493セ リ ンプロテアーゼ ドメ イ ンの空間座標を利用 した 化合物のスク リーニング方法）  (Compound screening method using spatial coordinates of MP493 serine protease domain)
本発明は、 MP493のセ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンの空間座標 の全部またはその一部を利用 した、 MP493 の活性調節作用を有 する化合物のスク リ ーニング方法も提供する。  The present invention also provides a method for screening a compound having an activity of regulating the activity of MP493, using all or a part of the spatial coordinates of the serine protease domain of MP493.
MP 493 は、 配列番号 2 に示した 2 17番目〜 453番目のァミ ノ 酸残基に相当する部分に、 セ リ ンプロテア一ゼの特徴的 ドメ イ ンを有 している。本発明における MP493セ リ ンプロテア一ゼ ド メイ ンの空間座標は、 こ の部分配列を基に適当な蛋白質モデ リ ングプログラムを用いて立体構造化されるセ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンか ら導かれるものである。 本発明において空間座標と は、 実質的には化学構造を構成する分子（原子）間の各距離によ つて定まる空間配置を意味する。 この空間配置をコ ンピュータ —上で情報と して処理する場合には、 相対的な配置をあ る座標 系における特定座標と して数値情報化する （座標化 という ） が、 これはコ ン ビュ一夕一処理を行う にあた り便宜上必要な処理で あ って、 空間座標の本質は、 先に示 した通 り 各分子（原子）間相 互の距離によって定まる配置であって、 コ ン ピュータ一処理時 に一時的に特定される座標値ではないと理解されるべきである c また、 本明細書中において原子座標とは、 物質 （蛋白質、 ア ミ ノ 酸な ど） を構成する個々の原子についての空間座標を意味す る。 MP493 has a characteristic domain of serine protease at a portion corresponding to amino acid residues 217 to 453 shown in SEQ ID NO: 2. The spatial coordinates of the MP493 serine proteinase domain in the present invention are derived from the serine proteinase domain that is three-dimensionally structured based on this partial sequence using an appropriate protein modeling program. It is a thing that can be done. In the present invention, the term “spatial coordinates” means a spatial arrangement substantially determined by each distance between molecules (atoms) constituting a chemical structure. This spatial arrangement is —In the case of processing as information above, the relative arrangement is converted into numerical information as specific coordinates in a certain coordinate system (referred to as coordinate conversion). This is a process that is necessary for convenience, and the essence of spatial coordinates is the arrangement determined by the mutual distance between each molecule (atom) as described above, and it is a temporary process at the time of computer processing. It should be understood that the coordinate values are not specified coordinate values.c Also, in the present specification, the atomic coordinates are the spatial coordinates of individual atoms constituting a substance (protein, amino acid, etc.). Means
一般的に、プロテアーゼによ り 切断を受ける基質ア ミ ノ 酸配 列において、 切断によ り新たに生じる C末端のアミ ノ酸残基を P 1 と呼び、 その残基から N末端側に伸張する残基を P2、 P 3 S P 4、 · · · と呼ぶ。 また、 P 1 の結合するプロテア一ゼ側の部位 を S 1 と、 P2、 P 3、 P4、 · · · の結合する部位をそれそれ S 2、 S 3、 S 4、 · ' · と呼ぶ。 Generally, in a substrate amino acid sequence that is cleaved by a protease, a C-terminal amino acid residue newly generated by cleavage is called P1, and extends from that residue to the N-terminal side. the residue P2, P 3 S P 4, referred to as · · ·. The site on the protease side to which P 1 binds is called S 1, and the sites to which P 2, P 3, P 4,... Bind are called S 2, S 3, S 4,.
通常、 キモ ト リ ブシン型セ リ ンプロテアーゼは、 キモ ト リ ブ シンの立体構造と対応させた配列番号が付与される。 こ の番号 を一般にキモ ト リ プシン番号と呼ぶ。 キモ ト リ ブシン番号を使 用する こ とで、 配列と立体構造の対応が可能となる。 本明細書内に記載される Sl、 S2、 S4 ( SI ポケ ッ ト、 S2 ボケ ヅ ト、 S4ポケ ッ ト と呼ぶ場合もある） を、 以下に定義する。 Normally, chymotoribsin-type serine protease is given a sequence number corresponding to the three-dimensional structure of chymotoribosine. This number is generally called the chymotrypsin number. By using the chymotrypsin number, it is possible to associate the sequence with the three-dimensional structure. Sl, S2, and S4 (also referred to as SI pocket, S2 pocket, and S4 pocket) described in this specification are defined below.
Sl : 394〜 400、 418〜 425、 429〜 433 番 （キモ 卜 リ ブシン番 号 189〜 195、 213〜221、 224〜228番） の残基で形成される。  Sl: formed from residues 394 to 400, 418 to 425, 429 to 433 (Kimotoribsin numbers 189 to 195, 213 to 221, 224 to 228).
S2： 257s 301、 419、 420番 （キモ 卜 U プシン番号 57、 99、 214、 215番） の残基で形成される。  S2: 257s formed from residues 301, 419 and 420 (Kimoto U psin numbers 57, 99, 214 and 215).
S4： 299~ 301, 378、 420番 （キモ ト リ プシン番号 97~99、 175、 215番） の残基で形成される。  S4: It is composed of residues 299 to 301, 378 and 420 (chymotrypsin numbers 97 to 99, 175 and 215).
MP493 の基質結合部位、 すなわち S1 ポケヅ ト、 S2ポケヅ ト お よ び S4 ポ ケ ッ ト の 立体構造 を ヒ ト ト リ プ シ ン並び に TMPRSS2 の基質結合部位の立体構造と比較した結果、 以下の こ とが判明 した。 MP493は、 S 1ポケ ヅ ト の構造が ト リ ブシン及 び TMPRSS2 と一致しているが、 S2 ポケ ヅ ト と S4 ポケヅ ト を 形成している 301 番目のアミ ノ酸残基 （キモ ト リ ブシン番号で 99番残基） は、 TMPRSS2 では Lys になっている （ ト リ プシン では Leu) のに対し、 MP493 では Leu である。 また、 S4 ボケ ヅ ト を形成している 300 番目、 378 番目、 420 番目のアミ ノ酸 残基 （キモ ト リ ブシン番号で 98番、 175番、 215番残基） が、 TMPRSS2では Thr、 Leu、 Trp、 ト リ プシンでは Thr、 Lys、 Trp になっているのに対し、 MP493では Arg、 Ile、 Phe である。 従 つて、 MP493は、 TMPRSS2や ト リ プシンと同じ く P1部位 （ S1 ポケ ヅ ト結合部位） に Lys、 Arg を持つ ト リ ブシン型基質を切 断するが、 その他の S2、 S4サブサイ ト において TMPRSS2 と、 また S4サブサイ トにおいて ト リ ブシン、 TMPRSS2 と異なる基 質特異性を示すと考えられる。 こ の事は、 S2、 S4のサブサイ ト を標的とする こ とで、 MP493 を選択的に阻害する化合物を分子 設計するこ とが可能となる こ とを意味する。 As a result of comparing the three-dimensional structure of the substrate binding site of MP493, that is, the S1, S2, and S4 pockets with the three-dimensional structure of the substrate binding site of human trypsin and TMPRSS2, the following results were obtained. It has been found. MP493 shows that the structure of the S1 pocket is identical to that of trypsin and TMPRSS2, but that the amino acid residue at position 301 (chymotrypsin) forms the S2 and S4 pockets. Residue number 99 is Lys in TMPRSS2 (Leu in trypsin), whereas it is Leu in MP493. In addition, the 300th, 378th, and 420th amino acid residues (98, 175, and 215 residues of chymotrypsin number) that form the S4 bottle have Thr and Leu in TMPRSS2. , Trp, and trypsin, Thr, Lys, Trp Whereas MP493 is Arg, Ile, and Phe. Therefore, MP493 cleaves a trypsin-type substrate having Lys and Arg at the P1 site (S1 pocket binding site), as in TMPRSS2 and trypsin, but cleaves TMPRSS2 at other S2 and S4 subsites. In addition, it is considered that the S4 subsite has a different substrate specificity from that of trypsin and TMPRSS2. This means that targeting the S2 and S4 subsites enables the molecular design of compounds that selectively inhibit MP493.
本発明である MP493 セ リ ンプロテア一ゼ ドメイ ンの空間座 標を用いた化合物のスク リ ーニング方法は、上記の MP493 セ リ ン プロテア一ゼ ドメ イ ンの空間座標の全部と任意の化合物の立 体構造を表す空間座標と を コ ン ピュータ一上で適合させ、その 結合状態を、 例えば経験的スコ ア リ ング関数を指標とする こ と で数値化して、該化合物の MP493 に対する結合能を評価する方 法であ る。 その際、 MP493 の基質結合部位を構成するア ミ ノ 酸 残基の中か ら、 本来の基質ではないセ リ ンプロテアーゼに対す る低分子阻害剤と接触し得る残基、 すなわち標的結合サイ ト を 特定し、このサイ ト との結合状態に着目する こ とが有利であ る。  The method for screening a compound using the spatial coordinates of the MP493 serine protein domain according to the present invention is a method for screening all the spatial coordinates of the above-mentioned MP493 serine protein domain and any compound. The spatial coordinates representing the body structure are fitted on a computer, and the binding state is quantified using, for example, an empirical scoring function as an index to evaluate the binding ability of the compound to MP493. It is a way to do it. At this time, of the amino acid residues that constitute the substrate binding site of MP493, residues that can come into contact with small molecule inhibitors of serine protease that are not the original substrates, that is, target binding sites It is advantageous to identify the site and pay attention to the state of connection with this site.
MP493に結合するであろ う阻害剤の標的結合サイ ト を構築す
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Build target binding sites for inhibitors that will bind to MP493
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以上のよ う に、本発明のスク リ一ニング方法は、 MP493セ リ ン プ ロ テ ア 一ゼ ド メ ィ ン の 空 間座標の 全部 ま た は一部 と 、 Converter ^ Accelrys Inc., San Diego, CA)、 Concord ( Tripos, Inc. St. Louis, MO) などの適当なプログラムを用いて得られる 所望の化合物の立体構造を表す空間座標とを、 分子 ド ッ キング ノ ヅ ケ一ジ DOCK ( University of California, San Francisco, CA) 等の適当なプログラムを利用 してコ ンピュータ一上で重ね あわせ、その適合状態を該プロ グラムに含まれるスコ ア リ ング 関数等を指標と して数値化する こ とで、 該化合物の結合能を評 価する こ とで行われる。 As described above, the screening method of the present invention uses the whole or a part of the space coordinates of the MP493 Serine Protease Domain and Converter ^ Accelrys Inc., San Francisco. Diego Co., CA), Concord (Tripos, Inc. St. Louis, MO), etc., and the spatial coordinates representing the three-dimensional structure of the desired compound obtained by molecular docking. (University of California, San Francisco, CA), etc., superimposed on a computer using a suitable program, and quantified the conformity using the scoring function etc. included in the program as an index. This is performed by evaluating the binding ability of the compound.
以上の方法は、 蛋白質 MP493 の発現 ·精製を待たずして阻害 剤の探索を開始でき るため、 創薬開発の効率化を推進する こ と が可能となる。 すなわち、 MP493の標的結合領域の性質、 形状 に適合する空間座標配置を予測 し、 これを埋める こ との可能な 構造を有する化合物を計算に よ り選択する こ とで、 多数の化合 物から MP493 に特異的な活性制御物質を効率的に選択する こ とが可能となる。  The above-mentioned method allows the search for an inhibitor to be started without waiting for the expression and purification of the protein MP493, thereby promoting the efficiency of drug discovery development. In other words, by predicting the spatial coordinate arrangement that conforms to the properties and shape of the target binding region of MP493 and selecting by calculation a compound having a structure that can fill this, the MP493 can be obtained from a large number of compounds. This makes it possible to efficiently select an activity-controlling substance that is specific to the enzyme.
その際、 コ ンピューター上のスク リ ーニングによ り選択され た候補物質を、 実験的に当該物質の特性を評価する こ とが望ま しい。 そのため、 コ ン ビュ一夕一上のスク リ ーニングによ り選 択される候補物質の数、 すなわち実験的評価に供される物質の 数は、 実験的な候補物質の評価に要する時間 · 費用等、 さ らに 当該実験的評価の結果と して得られる物質の数を考慮の上で定 めるこ とが好ま しい。 At that time, it is desirable to experimentally evaluate the characteristics of the candidate substance selected by screening on a computer. New For this reason, the number of candidate substances selected by screening at all times in the combi, that is, the number of substances to be subjected to experimental evaluation, depends on the time and cost required for experimental candidate substance evaluation. For example, it is preferable to determine the number in consideration of the number of substances obtained as a result of the experimental evaluation.
本発明に限らず、 コ ン ピューター上のス ク リーニングを行う プログラムには評価システムが含まれるが、 かかる評価システ ムは、 対応するプログラムのアルゴ リ ズム毎に合わせた独自の 手法が用い られる こ とが多い。 評価システム と して候補物質の 活性値が得られる場合は、 その値を基準と して実験的評価に供 する化合物を選択する こ とが可能であるが、 活性値ではな く経 験的な数値 しか得られない評価シス テムも数多 く 存在する。 ， 一方で、 コ ン ピュータ一スク リーニングが、 既に述べたよ う に実験的評価に供する化合物を効率的に選択する、 いわゆる絞 り込みに主たる利点を有する と考える と、 評価シス テムによ り 順位付けられた化合物を、 上位から実験に供する こ とが可能な 数だけ選択する こ とも有意義である。  The present invention is not limited to the present invention, and a program for performing screening on a computer includes an evaluation system. However, such an evaluation system uses a unique method tailored to each algorithm of a corresponding program. And many. If the activity value of a candidate substance can be obtained as an evaluation system, it is possible to select a compound to be subjected to experimental evaluation based on that value, but it is not an activity value but an empirical value. There are many evaluation systems for which only numerical values can be obtained. On the other hand, considering that computer screening has the main advantage of narrowing down the selection of compounds to be subjected to experimental evaluation, as already mentioned, that is, the so-called narrowing down, the evaluation system ranks It is also meaningful to select as many assigned compounds as possible, which can be used for experiments from the top.
この際、 最終的に得られる活性制御物質の多様性を持たせる こ とを 目的と して、 評価の上位化合物を構造 · 物性等の類似度 によ り クラス夕 リ ングした後、 各ク ラス夕一から実験的評価に 供する化合物数を選択する こ と も有意義である。 At this time, in order to give diversity to the finally obtained activity control substance, the top ranked compounds were evaluated for similarity in structure, physical properties, etc. It is also meaningful to select the number of compounds to be subjected to the experimental evaluation from each class evening after the class evening.
例えば、 コ ンピュータ一上のスク リ 一ニングによ り選択され た候補物質が、 期待される活性を有する確率を 5 %〜 3 0 %と 考えた場合、 1 0 の活性制御物質を得るためには約 3 0〜 2 0 0 の候補物質を選択すれば良く 、 5 0 の活性制御物質を得るた めには約 1 6 0〜 1 0 0 0 の候補物質を選択すれば良い。  For example, if the probability that a candidate substance selected by screening on a computer has the expected activity is 5% to 30%, it is necessary to obtain 10 activity control substances. Approximately 30 to 200 candidate substances may be selected, and about 160 to 100 000 candidate substances may be selected to obtain 50 activity control substances.
(薬理作用団モデル）  (Pharmacological activator model)
本発明は更に、前述のコ ン ピ ュ一夕一を用いたス ク リーニ ン グ方法や実験的スク リ一ニ ング方法で得られた MP493 活性調 節作用を示す化合物を基に、 これら化合物に共通して存在する 薬理作用団を有する、 MP 493活性調節剤を提供する。  The present invention further provides a compound based on the above-described screening method using a computer or a compound exhibiting an MP493 activity regulating effect obtained by an experimental screening method. An MP 493 activity modulator having a pharmacological agent commonly present in the present invention.
薬理作用団とは、標的蛋白質に結合するために必要とされる、 化合物上の物理化学的特徴である。 薬理作用団は、 MP493活性 調節作用を示す化合物に共通する構造上の特徴を特性球と して 表し、 特性球間の相対距離を決定する こ とで定義する こ とがで き る し、 特定の官能基間の相対距離を決定する こ とで定義する こ とも可能である。 その他、 当業者が通常用い得る手法を任意 に使用 して薬理作用団を定義可能であ り、 前述の方法に限定さ れる ものではない。 また、 化合物によ り蛋白質に結合する部位が異なる と、 全て の化合物に共通する物理化学的性質が存在 しない場合がある。 この場合は、 ィ匕合物を適切にクラス夕 リ ングした後、 各クラス 夕一内で共通する物理化学的性質を決定する必要がある。 A pharmacophore is a physicochemical feature on a compound that is required to bind to a target protein. The pharmacological agent expresses the structural features common to compounds exhibiting the activity of modulating MP493 activity as characteristic spheres, and can be defined by determining the relative distance between the characteristic spheres. It can be defined by determining the relative distance between the functional groups. In addition, the pharmacophore can be defined by any method commonly used by those skilled in the art, and is not limited to the above method. In addition, if the site of protein binding differs depending on the compound, there may be no physicochemical property common to all compounds. In this case, it is necessary to determine the common physicochemical properties within each class after properly classifying the compound.
本明細書中では、 便宜的に薬理作用団を特性球の集合と して 特性球の性質と相対距離または座標で定義するが、 異なる定義 方法であっても実質的に同一の薬理作用団を表すものであれば. 本発明に含まれる も のと解されるべきであ る。 実質的に同一の 薬理作用団 とは、 同一の化合物デ一夕ベースに対して薬理作用 団に当てはまる化合物を検索 したと き、 同一の化合物がヒ ッ ト と して得られる ものと考えるこ とが出来る。  In the present specification, for convenience, the pharmacological agent is defined as a set of characteristic spheres based on the properties of the characteristic sphere and the relative distance or coordinates. If so, it should be understood that it is included in the present invention. Substantially the same pharmacophore is considered to be the same compound obtained as a hit when searching for a compound that fits the pharmacophore against the same compound database. Can be done.
特性球は、 疎水性、 帯電性、 水素結合を形成し得る能力、 な どの種々の物理化学的性質を保持した空間的領域を意味する。 例えば、 薬理作用団構築プログラムである Catalyst (Accelrys Inc., San Diego, CA) においては、 「 Hydrogen-bond Acceptor The characteristic sphere means a spatial region that retains various physicochemical properties such as hydrophobicity, chargeability, ability to form hydrogen bonds, and the like. For example, a pharmacophore-building program, Catalyst (Accelrys Inc., San Diego, Calif.)
(さ らに、 Hydrogen-bond Acceptor lipid を分類する こともで きる ) 」 、 「 Hy arogen-bond Donorj ヽ 「 Hydrophobic 、さ ら に、 Hydrophobic Aromatic と Hydrophobic aliphatic ¾分類す る こ ともで きる )」、「 Negative Charge」、 ' Negative Ionizable」(In addition, Hydrogen-bond Acceptor lipids can be classified.), Hy-arogen-bond Donorj ヽ Hydrophobic, and also Hydrophobic Aromatic and Hydrophobic aliphatic aliphatic. 'Negative Charge', 'Negative Ionizable'
「 Positive Char ge」、 「 Positive Ionizable」、 「 Ring Aromaticj の 8 種類の特性球が示されているが、 該プロ グラムのユーザー が新たな定義を加える こ と も可能であ り、 上記の構成要素以外 を利用する こ と も可能である。 本発明では、 疎水性領域、 水素 結合受容体領域、 陽イ オン領域、 環状芳香族性領域、 等を物理 化学的性質と して規定し、 これら該物理化学的性質を有する A 単位の半径の球状の領域と して、 特性球を表してい る。 各特性 球に適合する原子や官能基の例は、 例えば C at alystなどのプロ グラ ムに付属のマニュアルに定義されてい る （ Acce lrys I nc . , C at alyst D ocume ntation Rele ase 4. 5 , 1999 ) 。 Positive Charge, Positive Ionizable, Ring Aromaticj Although the eight types of characteristic spheres are shown, the user of the program can add a new definition, and it is also possible to use components other than the above components. In the present invention, the hydrophobic region, the hydrogen bond acceptor region, the cation region, the cyclic aromatic region, and the like are defined as physicochemical properties, and the radius of the unit A having these physicochemical properties is defined as The characteristic sphere is represented as a spherical area. Examples of atoms and functional groups that are suitable for each characteristic sphere are defined in the manual attached to the program such as, for example, “Cat alyst” (Accelrys Inc., Catalyst D oc ume ntation Release 4.5). , 1999).
換言すれば、本発明の MP493活性調節剤は、 MP49 3 に特有の 基質結合部位に選択的に適合可能な、 一定の物理化学的性質を 有する特性球相互の空間座標を満足させる化学構造で表される 化合物と して規定される。  In other words, the MP493 activity modulator of the present invention is represented by a chemical structure that satisfies the spatial coordinates of characteristic spheres having certain physicochemical properties that are selectively adaptable to the substrate binding site specific to MP493. It is defined as a compound to be used.
この特性球相互の空間配置とは、 特性球相互の相対的な空間 配置 （相対距離） を意味する ものである。 請求の範囲では、 特 性球の配置を特定の XYZ座標値を利用 して表 しているが、 これ は、 一の座標値を与える こ とによ り 各特性球間の相対距離が比 較的単純な幾何学的計算によって一義的に定ま る こ とか ら、 記 載の便宜上特定の座標を利用 しているに過ぎない。 従ってかか る座標値は、 各特性球間の相対距離を算出する根拠以外には限 定的な意義は有しない。換言すれば、特定球の空間配置は各球相 互の相対距離で特定される ものであ り 、請求の範囲ではこの相 対距離を計算で導く に足る根拠と して用いるための一の座標値 を示 しているのである。 The spatial arrangement between characteristic spheres means the relative spatial arrangement (relative distance) between characteristic spheres. In the claims, the arrangement of characteristic spheres is represented by using specific XYZ coordinate values. However, by giving a single coordinate value, the relative distance between each characteristic sphere can be compared. Since it is unambiguously determined by simple geometric calculation, only specific coordinates are used for convenience of description. Therefore, such coordinate values are limited except for the basis for calculating the relative distance between the characteristic spheres. It has no definite significance. In other words, the spatial arrangement of the specific sphere is specified by the relative distance between the respective spheres, and in the claims, one coordinate for using this relative distance as a basis for deriving the calculation. It shows the value.
従って、特性球間の相対距離が変化 しない限 り 、 請求の範囲に 記載される座標値とは異なる任意の XYZ座標、 すなわち回転 · 並進が施された座標系での座標値を基にその相対距離が算出さ れる場合でも、 その相対距離を満足させる薬理作用面を有する 化合物は、 依然と して本発明そのものに他ならないのである。  Therefore, as long as the relative distance between the characteristic spheres does not change, the relative values based on arbitrary XYZ coordinates different from the coordinate values described in the claims, that is, the coordinate values in the rotated / translated coordinate system are used. Even if the distance is calculated, a compound having a pharmacologically active surface that satisfies the relative distance is still the present invention itself.
なお、 この空間配置をコ ン ピュ一夕一上で情報と して処理す る場合には、 相対的な配置をある座標系における特定座標と し て数値情報化する （座標化 とい う） 場合もあるが、これはコ ン ビ ユ ー夕一処理を行う にあた り便宜上必要な処理であ って、 空間 座標の本質は各特性球間相互の距離をも って定められる相対位 置であ って、 コ ン ビユー夕一処理時に一時的に特定される座標 値ではないのは、 先に述べた通 り である。  When this spatial arrangement is processed as information on a computer, the relative arrangement is converted into numerical information as specific coordinates in a certain coordinate system (called coordinate conversion). However, this is a process that is necessary for convenience in performing the integration process, and the essence of the spatial coordinates is the relative position determined by the distance between the characteristic spheres. However, it is as described above that the coordinate values are not temporarily specified during the process of viewing the contents.
本発明である MP493活性調節剤は、表 1 乃至表 3 のそれぞれ で示される XYZ座標系上の一の座標に配置された場合の特性球 のう ち、 少な く と も任意の 3 点の特性球間の相対配置を満足さ せる薬理作用団を有する化合物である。 表 1 The MP493 activity modulator of the present invention has at least three arbitrary characteristic points among characteristic spheres when arranged at one coordinate on the XYZ coordinate system shown in each of Tables 1 to 3. It is a compound having a pharmacological agent that satisfies the relative configuration between spheres. table 1
特性球 X座標 Y座標 z m 半怪 (A) 疎水性領域 1 7.79 13.55 15.25 1.7 疎水性領域 2 3.92 11.42 11.58 1.7 水素結合受容体領域 R 3.68 10.63 15.36 1.7 水素結合受容体領域 T 2.74 8.15 16.82 2.3 陽イオン領域 4.36 10.26 8.47 1.7  Characteristic sphere X coordinate Y coordinate zm Semi-monster (A) Hydrophobic region 1 7.79 13.55 15.25 1.7 Hydrophobic region 2 3.92 11.42 11.58 1.7 Hydrogen bond receptor region R 3.68 10.63 15.36 1.7 Hydrogen bond receptor region T 2.74 8.15 16.82 2.3 Cation Area 4.36 10.26 8.47 1.7
表 2 Table 2
特性球 X座標 Y座標 2：座標 半径 (A) 疎水性領域 1 13.25 16.82 11.48 1.7 疎水性領域 2 7.00 7.07 7.66 1.7 水素結合受容体領域 R 5.26 17.19 9.46 1.7 水素結合受容体領域 T 3.93 16.71 6.80 2.3 環状芳香属性領域 R 5.15 9.53 8.55 1.7 環状芳香属性領域 T 2.80 7.69 8.80 1.7  Characteristic sphere X coordinate Y coordinate 2: Coordinate radius (A) Hydrophobic region 1 13.25 16.82 11.48 1.7 Hydrophobic region 2 7.00 7.07 7.66 1.7 Hydrogen bond acceptor region R 5.26 17.19 9.46 1.7 Hydrogen bond acceptor region T 3.93 16.71 6.80 2.3 Ring Aroma attribute region R 5.15 9.53 8.55 1.7 Cyclic aroma attribute region T 2.80 7.69 8.80 1.7
表 3 Table 3
特性球 X座標 Y座標 Z座標 半径 (A) 疎水性領域 1 12.02 16.58 13.31 1.7 疎水性領域 2 7.34 14.92 16.73 1.7 疎水性領域 3 3.90 11.23 10.89 1.7 陽イオン領域 3.96 10.44 7.46 1.7 上記各表において、 Rはベク トルの開始点と、 T はベク トル の終点とそれそれ定義される。 水素結合受容体領域は、 水素結 合受容体原子か ら （水素結合受容体原子に存在する） 非共有電 子対への位置 · 方向を Rから Tへのべク ト ルと して定義 したも のである。 また、 環状芳香属性領域における環の平面は、 Rから Tへのべク トルを垂線と してもつ平面と して定義される。 また、 各表に示される特性球の配置をグラ フ ィ クス化 したものを、 そ れぞれ第 5 図、 第 6 図、 第 7 図に示す。 Characteristic sphere X coordinate Y coordinate Z coordinate Radius (A) Hydrophobic area 1 12.02 16.58 13.31 1.7 Hydrophobic area 2 7.34 14.92 16.73 1.7 Hydrophobic area 3 3.90 11.23 10.89 1.7 Cation area 3.96 10.44 7.46 1.7 In each of the above tables, R is defined as the starting point of the vector, and T is defined as the ending point of the vector. The hydrogen bond acceptor region is defined as the position and direction from the hydrogen bond acceptor atom to the non-covalent electron pair (present on the hydrogen bond acceptor atom) as a vector from R to T. It is a thing. The plane of the ring in the cyclic aromatic attribute region is defined as a plane having a vector from R to T as a perpendicular. Also, graphs of the arrangement of characteristic spheres shown in each table are shown in Figs. 5, 6, and 7, respectively.
各表の座標から導かれる特性球の空間配置は、 実際に MP 493 の活性調節作用を示 した化合物の構造の類似性によ って 3 つに クラス夕一分け し、各ク ラス夕一に属する化合物の立体構造に 共通の構造的特徴を、適当なプログラ ム、例えば前述の C atalys t を用いて導いたものである。従って、薬理作用団を導 く ために使 用する具体的な化合物の選択とデ一夕数、 これらの結合能の判 定基準などを変化させる こ とによって、 導かれる薬理作用団に も多少の変化は生 じ得るのであるが、 本願発明はこれらの変化 も実質的に含んでいる と解されるべきである。  The spatial arrangement of the characteristic spheres derived from the coordinates in each table is divided into three classes according to the structural similarities of the compounds that actually exhibited the activity of MP493, and each class was classified into Structural features common to the steric structures of the compounds to which they belong are derived using appropriate programs, such as the aforementioned Catalys t. Therefore, by changing the selection and specific number of compounds used to derive the pharmacophore and the criteria for determining their binding ability, etc. Although changes can occur, it should be understood that the present invention substantially includes these changes.
さ ら に、 表 1 乃至表 3 に示す特性球の座標値は、 各薬理作用 団を決定した際に用いた化合物と MP493 構造との複合体モデ ルに基づき同一の座標系に重ねあわせを したものである。 また、 これらの特性球は、化合物が MP493 に対して結合する際に好適 な部位を示 している と考え られるため、 表 1 乃至表 3 に示す全 ての特性球をま とめて、 MP 493活性調節化合物の薬理作用団と 考える こ とが可能である。 この表 1 から 3 に示される全ての特 性球の配置をグラフ イ クス化 したものを、 第 8 図に示す。 In addition, the coordinate values of the characteristic spheres shown in Tables 1 to 3 represent the complex model of the compound used to determine each pharmacological group and the MP493 structure. Are based on the same coordinate system. In addition, since these characteristic spheres are considered to indicate a suitable site when the compound binds to MP493, all the characteristic spheres shown in Tables 1 to 3 are put together to obtain MP493. It can be considered as a pharmacological agent for an activity-modulating compound. Fig. 8 shows a graphical representation of the arrangement of all the characteristic spheres shown in Tables 1 to 3.
表 1 から表 3 に規定される全ての特性球のう ち、 少な く とも 任意の 3点以上の特性球の相対配置を満足させる化合物も また MP 49 3の活性調節作用を発揮する ものと期待される。 また、 表 1 か ら表 3 に規定される全ての特性球を MP493 構造との複合 体モデルに基づき同一の座標系に重ねあわせた際に、 相似する 性質を持つ特性球同士が近傍に存在する場合は同一の群と して 分類 し、 同 じ群に属する特性球を同時に 2 個以上使わない こ と によ り 、 化合物の効率的な検索が可能となる。 なお、 本発明は、 先に示 した 4種 （表 1 の薬理作用団、 表 2 の薬理作用団、 表 3 の薬理作用団および表 1 〜表 3 の全ての特性球か ら なる薬理作 用団） の薬理作用団をコ ン ピュー夕一上で使用するために数値 情報化 したデ一夕、 及び該デ一夕 を記録した記録媒体をも提供 する ものである。 (薬理作用団を用いた MP493 活性調節作用を有する化合物 の検索方法） Of all the characteristic spheres specified in Tables 1 to 3, a compound that satisfies the relative configuration of at least any three or more characteristic spheres is also expected to exert the activity of regulating the activity of MP493. Is done. When all characteristic spheres specified in Tables 1 to 3 are superimposed on the same coordinate system based on the composite model with the MP493 structure, characteristic spheres with similar properties exist in the vicinity. In such a case, the compounds are classified as the same group, and by not using two or more characteristic spheres belonging to the same group at the same time, an efficient search for compounds becomes possible. The present invention relates to a pharmacological agent consisting of the four types shown above (the pharmacological agent of Table 1, the pharmacological agent of Table 2, the pharmacological agent of Table 3 and all characteristic spheres of Tables 1 to 3 The present invention also provides a computerized numerical data for using the pharmacological groups of the group on a computer, and a recording medium for recording the data. (Method of searching for compounds that have MP493 activity regulating activity using pharmacological agents)
本発明である薬理作用団を用いた検索方法とは、先に示 した 4 種 （表 1 の薬理作用団、 表 2 の薬理作用団、 表 3 の薬理作用団 および表 1 〜 3 の全ての特性球か らなる薬理作用団） の薬理作 用団の情報と あ る化合物の立体構造の空間配置と を比較 し、該 化合物が薬理作用団の性質を満足させる も のであるかどう かを 計算によ り決定する方法である。この計算には、 C atalyst、 Unity ( Trip o s , Inc . S t. Lo uis, MO ) 等の当業者が通常使用可能なプ ログラムを適宜用いればよい。 この方法は、コ ン ピュー夕一スク リ一ニングをさ ら に効率的に実行する こ とができる。すなわち、 本発明によ り 得られる薬理作用団モデルは、 それのみを利用 し て大規模な化合物デ一夕べ一スをス ク リ ーニングするこ とがで きる。 また、 座標化された MP493 の基質結合部位上での重ね合 わせによ り決定される薬理作用団モデルは、 MP493 の標的結合 サイ ト に対して結合する化合物を D O C K等を用いてコ ンビユ ー 夕一ス ク リ 一ニングする際に有効なフ ィ ル夕一と して使用する こ とがで きる し、 各薬理作用団に対 して適合する フ ラグメ ン ト を配置 した後に各フ ラグメ ン ト を適当な官能基で結合させて化 合物を構築する De Novo設計的使用も可能である。 The search method using the pharmacological agent of the present invention means the four types shown above (the pharmacological agent in Table 1, the pharmacological agent in Table 2, the pharmacological agent in Table 3 and all of the pharmacological agents in Tables 1 to 3). Comparing the information of the pharmacological group of the pharmacological group consisting of characteristic spheres with the spatial arrangement of the steric structure of a compound, and calculating whether or not the compound satisfies the properties of the pharmacological group It is a method determined by For this calculation, a program that can be used by those skilled in the art, such as Catalyst and Unity (Tripos, Inc. St. Louis, MO), may be used as appropriate. This method allows for more efficient computer screening. That is, the pharmacophore model obtained by the present invention can screen a large-scale compound database using only the pharmacophore model. In addition, the pharmacophore model determined by superimposing the coordinated MP493 on the substrate binding site indicates that the compound that binds to the target binding site of MP493 is converted using DOCK or the like. It can be used as an effective filter for evening screening, or after each fragment is set to fit each pharmacophore, Binding with an appropriate functional group De Novo design use to build the compound is also possible.
本発明の蛋白質に対する活性調節作用を示す化合物または本 発明の蛋白質の活性調節剤とは、蛋白質 MP493 のセ リ ンプロテ ァ一ゼ活性を増強（ァゴニス ト）あるいは阻害する （アン夕 ゴニ ス ト） 作用を有する化合物のいずれで も良い。 好ま し く （ま阻害 作用を有する化合物である。  A compound exhibiting an activity-regulating action on the protein of the present invention or an activity-regulating agent for the protein of the present invention refers to an action that enhances (agonist) or inhibits (agonist) the serine proteinase activity of protein MP493. Any of the compounds having It is preferably a compound having an inhibitory action.
以上の方法によれば、 MP493 の活性調節物質、 特に阻害剤を コ ン ピュータ一上で効率的にスク リ 一ニングでき るので、 実際 に MP 493 を発現する こ とな く MP 493 の阻害剤を選別する こ と が可能になる。 また、 コ ン ビュ一夕一上でスク リ ーニングし選 別 した化合物を、 更に本発明の蛋白質又は該蛋白質を発現する 形質転換細胞を用いた生化学的アツセィ に供する こ とに よ り 、 よ り 効果的に MP493の阻害剤を選別する こ とが可能になる。生 化学ア ツセィ を用いるに際して、 候補化合物が本発明の蛋白質 の活性調節作用を示すかどう かは、 蛋白質の活性を確認できる 系に該化合物を添加 した場合と無添加の場合の蛋白質の活性に 差があるかどうかを調べればよい。活性調節作用を有する とは、 蛋白質の活性の測定値が、 候補化合物添加群と、 候補化合物無 添加群との間で差がある こ とをいう 。 たとえば、 下記の式で計 算される阻害 （または抑制） 率あるいは増強 （または促進） 率 が 1 0 %以上、 好ま し く は 3 0 %以上、 よ り好ま し く は 5 0 % 以上、 更に好ま し く は 7 0 %以上、 特に好ま し く は 9 0 %以上 である こ とをいう 。 According to the above-mentioned method, the modulator of the activity of MP493, in particular, the inhibitor can be efficiently screened on a computer, so that the inhibitor of MP493 can be used without actually expressing MP493. Can be sorted out. Further, the compound screened and selected on the whole of the comb is further subjected to a biochemical assay using the protein of the present invention or a transformed cell that expresses the protein. This makes it possible to screen for inhibitors of MP493 more effectively. When a biochemical assay is used, whether or not a candidate compound exhibits the activity of regulating the activity of the protein of the present invention depends on the activity of the protein when the compound is added to a system in which the activity of the protein can be confirmed and when the compound is not added. You just have to check if there is a difference. Having an activity regulating action means that the measured value of the protein activity is different between the group with the candidate compound added and the group without the candidate compound added. For example, Calculated inhibition (or suppression) or enhancement (or promotion) rate of 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 50% or more, and even more preferably 70% As mentioned above, it is particularly preferably 90% or more.
阻害（抑制）率あ るいは増強 （促進） 率 （％ ) = (無添加群の測 定値ー候補化合物添加群の測定値） の絶対値/無添加群の測定 値 * 1 0 0 Inhibition (suppression) rate or enhancement (acceleration) rate (%) = (absolute value of (measured value of group without addition-measurement value of group with addition of candidate compound)) / measured value of group without addition * 100
こ こで、 測定値は蛋白質の活性を確認できる系の種類によつ て適宜定められる。 たとえば、 蛋白質の活性を確認でき る系が 実施例 5 に示す方法の場合には、 吸光度を用いる こ とがで き、 候補物質添加群の測定値 <候補物質無添加群の測定値となる場 合、候補物質には MP 493蛋白質活性阻害作用がある といえる。 測定系にバッ クグラ ウン ドやノ イズの値が含まれる場合には、 そのよ うなものを差 し引いた値を測定値とする こ とがで きる。 本発明の蛋白質の活性調節作用を示す化合物の検索方法は、 MP 493 が関わる疾患の予防薬 · 治療薬を著 し く 短い期間で医療 現場に提供する こ と を可能とする手法である。  Here, the measured value is appropriately determined depending on the type of the system in which the activity of the protein can be confirmed. For example, when the system capable of confirming the activity of the protein is the method described in Example 5, the absorbance can be used, and if the measured value of the candidate substance-added group <the measured value of the candidate substance-free group, In this case, it can be said that the candidate substance has MP 493 protein activity inhibitory activity. If the measurement system includes background and noise values, the value obtained by subtracting such values can be used as the measured value. The method for searching for a compound exhibiting the activity-regulating activity of the protein of the present invention is a technique that enables a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with MP493 to be provided to a medical site in a remarkably short period of time.
(空間座標および空間座標を格納した記憶媒体とその使用） 本発明は、 MP 493のセ リ ンプロテア一ゼ ド メイ ンの空間座標を 提供する。 （ a ) 第 9 図に示される空間座標の全部または一部 のほか、 （ b ) 第 9 図に示される空間座標によ り 特定される蛋 白質において、 1 も し く は数個のア ミ ノ酸が欠失、 置換も し く は付加されたアミ ノ 酸配列からな り 、 かつセ リ ンプロテアーゼ 活性を有する蛋白質の空間座標 ； （ c ) 第 9 図に示される空間 座標によ り 特定される蛋白質の主鎖原子に対して、 主鎖原子の 平均二乗偏差の平方根が 2 . 0 A以下であ る蛋白質の空間座 標 ； も また本発明の範囲内のものである。 こ こで「蛋白質の主鎖 原子 （backbone atoms) 」とは、 蛋白質を構成 しているア ミ ノ 酸の C 、 および C a と共有結合しかつべプチ ド結合を構成し ている N、 C、 0を意味する。 (Spatial coordinates and storage medium storing the spatial coordinates and use thereof) The present invention relates to a method for storing spatial coordinates of the serine proteinase domain of MP 493. provide. (A) all or part of the other spatial coordinates shown in FIG. 9, (b) the ninth蛋white matter specified Ri by the spatial coordinates shown in the figures, also rather it is several A Mi 1 Spatial coordinates of a protein consisting of an amino acid sequence in which amino acids have been deleted, substituted or added, and having serine protease activity; (c) specified by the spatial coordinates shown in FIG. The spatial coordinates of a protein having a square root of the mean square deviation of the main chain atom of 2.0 A or less with respect to the main chain atom of the protein to be prepared are also within the scope of the present invention. Here, the "backbone atoms" of the protein are N, C, and covalently bonded to C and Ca of the amino acid constituting the protein and which form the peptide bond. Means 0.
化合物のスク リ ーニングに際しては MP493 のセ リ ンプロテ ァーゼ ドメ ィ ンの中でも標的結合サイ ト を構成しているア ミ ノ 酸残基から構成される構造または基質結合部位を構成している ア ミ ノ酸残基から構成される構造を抜き出 して使用する こ とが 有益である 。 よって、 本発明は、 （ d ) 第 9 図に示される空間 座標のう ち、配列番号 2 のアミ ノ酸番号で少な く とも 257(His)， 30l(Leu), 304(Asp), 378(Ile), 386(Ala), 387(Gly), 394(Asp), 395(Ser), 396(Cys), 397(Gln), 398(Gly), 399(Asp), 400(Ser), 418(Thr), 4l9(Ser), 420(Phe), 42l(Gly), 422(Ile), 423(Gly), 424(Cys), 429(Lys), 430(Pro), 43l(Gly), 432(Val),お よ ぴ 433(Tyr)に相当するア ミ ノ酸残基の原子座標を含んでなる空間 座標 ； （ e ) 第 9 図に示される空間座標の う ち、 配列番号 2 の アミ ノ酸番号で少な く とも 257s 299〜301、 378、 394〜權、 418〜425および 429〜 433番に相当するァ ミ ノ酸残基の原子座 標を含んでなる空間座標 ； （ f ) 標的結合サイ ト を構成するァ ミ ノ酸の主鎖原子に対して、 主鎖原子の平均二乗偏差の平方根 が 1 . O A以下である標的結合サイ トの空間座標 ； （ g ) 基質 結合部位を構成するアミ ノ酸の主鎖原子に対して、 主鎖原子の 平均二乗偏差の平方根が 1 . 0 A以下であ る基質結合部位の空 間座標を提供する。 「少な く と も ' · · 含んでなる」 とは、 ァ ミ ノ酸番号で特定されたアミ ノ酸残基の原子座標以外に、 第 9 図中の任意の 1 以上の.ア ミ ノ酸残基の原子座標を含んでよい こ とを意味する。 含んでも よいア ミ ノ酸残基は特に限定されない が、 例えば標的結合サイ ト または基質結合部位を構成するア ミ ノ酸残基の近傍にあるア ミ ノ酸残基が好ま しい例と して挙げら れる。 「近傍にある」 とは 5 A以内、 好ま し く は 3 A以内にあ る こ とを言う。 蛋白質の立体構造はかつち り と固定されたもの でな く 、 ある程度の揺ら ぎを持っている。 蛋白質全体の構造と して主鎖原子の位置のずれ、 すなわち主鎖原子の平均二乗偏差 の平方根が 2 . 0 A以下であれば、 機能的に同等の構造を有す る もの と考える こ とができるが、 好ま し く は 1 . 5 A以下、 よ り好ま し く は 1 . O A以下である。 また、 標的結合サイ トや基 質結合部位の構造の場合には、 主鎖原子の平均二乗偏差の平方 根が 1 . O A以下であれば、 機能的に同等の構造を有する もの と考える こ とができるが、 好ま し く は 0 . 7 A以下、 よ り好ま し く は 0 . 5 A以下である。 「第 9 図に示される空間座標の全部ま たは一部」 の 「一部」 とは、 最小限と して標的結合サイ ト また は基質結合部位を含む空間座標の こ とであ る。 標的結合サイ ト または基質結合部位の空間座標を含む限 り 、 それら に加えて第 9 図中の任意の 1 以上のアミ ノ酸残基の原子座標を含んでも よ い。 本発明の空間座標を用いたス ク リ ーニングを行う際には、 コ ン ピュー夕一に第 9 図に示される空間座標の全部を与えた上 で特定の一部を指定してスク リ 一ニングを実行する こと も可能 である し、 一部の構造のみを与えてスク リ ーニングを実行する こ と も可能である。 コ ン ピュータ一上でス ク リ ーニングを実行 するにあたってはスク リ ーニングに必要な最小限の構造が特定 されれば、 それらに任意の 1 以上のア ミ ノ酸残基の原子座標を 加えても結果の精度は向上こそすれ低下する こ とはない と考え られる。 よ って標的結合サイ ト または基質結合部位の空間座標 に力 Πえて第 9 図中の任意の 1 以上のァ ミ ノ酸残基の原子座標か らなる 「第 9 図に示される空間座標の一部」 も また本発明の範 囲内のものである。 When screening compounds, the structure consisting of amino acid residues that make up the target binding site or the amino acid that makes up the substrate binding site in the serine proteinase domain of MP493 It is useful to extract and use the structure composed of acid residues. Therefore, the present invention provides (d) at least 257 (His), 30l (Leu), 304 (Asp), 378 (378) of the amino acid numbers in SEQ ID NO: 2 among the spatial coordinates shown in FIG. Ile), 386 (Ala), 387 (Gly), 394 (Asp), 395 (Ser), 396 (Cys), 397 (Gln), 398 (Gly), 399 (Asp), 400 (Ser), 418 (Thr), 4l9 (Ser), 420 (Phe), 42l (Gly), 422 (Ile), 423 (Gly), 424 (Cys), 429 (Lys), 430 (Pro), 43l (Gly), 432 (Val), 空間 433 (Tyr), the spatial coordinates including the atomic coordinates of the amino acid residue; (e) Of the spatial coordinates shown in FIG. A spatial coordinate comprising the atomic coordinates of amino acid residues corresponding to at least 257s 299-301, 378, 394-right, 418-425 and 429-433 in amino acid number; (f) Spatial coordinates of the target binding site where the square root of the mean square deviation of the main chain atom is less than or equal to 1.OA with respect to the main chain atom of the amino acid constituting the target binding site; (g) the substrate binding site It provides the space coordinates of the substrate binding site where the square root of the mean square deviation of the main chain atoms is 1.0 A or less for the main chain atoms of the constituent amino acids. `` At least 'contains' means, in addition to the atomic coordinates of the amino acid residue specified by the amino acid number, one or more arbitrary amino acids in Figure 9. It means that the atomic coordinates of the residue may be included. The amino acid residue which may be contained is not particularly limited, but, for example, an amino acid residue in the vicinity of an amino acid residue constituting a target binding site or a substrate binding site is preferable. No. “Nearby” means within 5A, preferably within 3A. The three-dimensional structure of the protein is tightly fixed Instead, it has some fluctuations. If the position of the main chain atoms is displaced as the structure of the entire protein, that is, if the square root of the mean square deviation of the main chain atoms is 2.0 A or less, it is considered that the protein has a functionally equivalent structure. However, it is preferably 1.5 A or less, and more preferably 1.5 OA or less. In addition, in the case of the structure of the target binding site or substrate binding site, if the square root of the mean square deviation of the main chain atoms is 1.0 OA or less, it is considered that the functionally equivalent structure is provided. However, it is preferably 0.7 A or less, and more preferably 0.5 A or less. The “part” of “all or part of the spatial coordinates shown in FIG. 9” is the spatial coordinates including at least the target binding site or the substrate binding site. As long as it includes the spatial coordinates of the target binding site or substrate binding site, it may also include the atomic coordinates of any one or more amino acid residues in FIG. 9 in addition to them. When performing the screening using the spatial coordinates of the present invention, all the spatial coordinates shown in FIG. 9 are given to the computer, and then a specific part is designated to specify the screen. It is also possible to perform the screening, or to perform the screening by giving only a part of the structure. When performing screening on a computer, the minimum structure required for screening is specified. If so, adding the atomic coordinates of any one or more amino acid residues to them would improve the accuracy of the results without any decrease. Therefore, by focusing on the spatial coordinates of the target binding site or substrate binding site, the atomic coordinates of one or more amino acid residues in FIG. "Parts" are also within the scope of the present invention.
また、 蛋白質の立体構造はその構造を構成する原子の相対的 な空間配置によ り定義される も のであ り、 空間座標化は立体構 造をコ ン ピュ一夕一等で扱う上で必要な便宜的処理である。 し たがって、 （ h ) ( a)〜（g)の空間座標を回転および/も し く は並 進操作 して得られる空間座標も、 操作前の空間座標と全 く 同一 の立体構造を表すものである。 In addition, the three-dimensional structure of a protein is defined by the relative spatial arrangement of the atoms constituting the structure, and spatial coordinate conversion is necessary for treating the three-dimensional structure on a computer-by-computer basis. This is a convenient process. Therefore, the spatial coordinates obtained by rotating and / or translating the spatial coordinates (h), (a) to ( g ) also represent the same three-dimensional structure as the spatial coordinates before the operation. Things.
さ ら に、 本発明は上述の空間座標 （ a ) 〜 （ h ) のいづれか を格納 したコ ン ピュ一夕一読み取り 可能な記憶媒体を提供する < コ ン ピュータ一読み取り 可能な記憶媒体と しては、 格納 した空 間座標をコ ン ピュ一夕一上の各種プロ グラム （例えば空間座標 を利用する プログラム） 上に導く こ とがで きるものであれば特 に限定される も のではない。 例えば、 メモ リ と呼ばれる電気的 な一時記憶媒体でも、 フ ロ ッ ピ一ディ スク、 ハー ドディ ス ク、 光ディ スク、 光磁気ディ ス ク、 磁気テープなどの半永久的な記 憶媒体でも良い。 Further, the present invention provides a computer-readable storage medium storing any of the above spatial coordinates (a) to (h). <As a computer-readable storage medium> Is not particularly limited as long as the stored space coordinates can be led to various programs (for example, a program using space coordinates) on a computer. For example, an electric temporary storage medium called a memory may be a floppy disk, a hard disk, A semi-permanent storage medium such as an optical disk, a magneto-optical disk, or a magnetic tape may be used.
本発明の空間座標お よび空間座標を格納 した記憶媒体は、 MP493の活性調節作用を有する化合物の検索または設計に使用 する こ とができ、 有用である。  The spatial coordinates and the storage medium storing the spatial coordinates of the present invention can be used for searching or designing a compound having an activity of regulating the activity of MP493, and are useful.
発明の実施の最良の形態  BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
(核酸）  (Nucleic acid)
遺伝子 mp493は、 胃印環癌細胞から単離同定する こ とができ る。 本発明の DNAを DNA ライ ブラ リ一から得る例と しては、 適当なゲノ ム DNAライ ブラ リ 一や cDNAライ ブラ リ 一を、ハイ ブリ ダィゼ一シヨ ンによ るスク リ ーニング法や、 抗体を用いた ィ ムノ スク リーニング法等でスク リ ーニング し、 目的の DNAを 有する クローンを増殖させ、 そこから制限酵素等を用いて切 り 出す方法がある。 ノヽィ プリ ダイ ゼ一シヨ ン法によるスク リー二 ングは、 配列番号 1 に記載の塩基配列も し く はその一部を有す る DNAを 32 P等でラベル してプローブと し、任意の cDNAラィ プラ リ 一に対 して、 公知の方法で （例えば、 Maniatis T.等， olecuiarCloning, a Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, New York, 1982 年） 行う こ とができ る。 ィ ムノ スク リ ーニング法で用いる抗体は、 後述する本発明の抗体を使 用する こ とができる。 本発明の新規 DNA はまた、 ゲノ ム DNA ラ イ ブラ リ ー も し く は cDNA ラ イ ブ ラ リ 一 を 錶型 と す る PCR(Polymerase Chain Reaction)によっても得る事がで きる。 PCRは、 配列番号 1 に記載の塩基配列をも とに、 セ ンス プライ マ一、 アンチセンスプライ マ一を作成し、 任意の DNAライ ブラ リ 一に対し、公知の方法（例えば Michael A. I.等，PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications, Academic JPress、 1990 年参照） 等を行って、 本発明の DNA を得る事もできる。 上記各 種方法で使用する DNAライ プラ リ ーは、 本発明の DNAを有す る DNAライ ブラ リ一を選択 して使用する。 当該 DNAライ ブラ リ ーは、 本発明の DNAを有するライ ブラ リ ーであれば、 いかな る ものも使用可能であ り、市販の DNAライ ブラ リ一を使用 した り 、本発明の DNAを有する細胞か ら cDNAライ ブラ リ 一を作成 す る の に適 し た細胞 を選び公知の方法 （ J.Sambrook 等、 Molecular Cloning , a Lab oratory Manual 2nd e d. , Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989年参照） に従って、 cDNA ライ ブラ リ 一を作製し、 利用する こ とがで きる。 The gene mp493 can be isolated and identified from gastric signet carcinoma cells. Examples of obtaining the DNA of the present invention from a DNA library include a screening method using a suitable genomic DNA library and a cDNA library by a hybridization method, and the like. There is a method of screening by an immunoscreening method or the like using an antibody, growing a clone having the target DNA, and cutting out the clone using a restriction enzyme or the like. Screening by the no-dip-digestion method involves labeling a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof with 32 P or the like to obtain a probe. The cDNA library can be prepared by a known method (for example, Maniatis T. et al., olecuiar Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). I Muno As the antibody used in the screening method, the antibody of the present invention described later can be used. The novel DNA of the present invention can also be obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) using a genomic DNA library or a cDNA library as a type II. In PCR, a sense primer and an antisense primer are prepared based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and any DNA library is prepared by a known method (for example, Michael AI, etc.). PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications, Academic JPress, 1990) can be performed to obtain the DNA of the present invention. As the DNA library used in each of the above methods, a DNA library having the DNA of the present invention is selected and used. As the DNA library, any library having the DNA of the present invention can be used.A commercially available DNA library can be used, or the DNA of the present invention can be used. A cell suitable for preparing a cDNA library is selected from the cells having the DNA and a known method (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY) According to 1989), a cDNA library can be prepared and used.
また、 本明細書に開示された配列を基にホスホア ミ ダイ ト法 などの化学合成的手法によ り調製する こ とも可能である。 Also, based on the sequences disclosed herein, a phosphoamidite method It can also be prepared by a chemical synthesis method such as
配列番号 1 に記載の塩基配列からなる DNAは、 胃印環癌細胞、 肺、 腎臓、 脬臓等においてその発現変化が確認されている こ と から、配列番号 1 に記載の塩基配列からなる DNAあるいはその 部分断片は、 癌、 肺、 腎、 脬疾患の特異的プローブと して有用 である と考え られる。  The DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 has been confirmed to have an altered expression in gastric seal ring cancer cells, lung, kidney, kidney, etc. Alternatively, a partial fragment thereof is considered to be useful as a specific probe for cancer, lung, kidney, and disease.
本発明の DNA は、 MP493 を大量に生産するために使用する こ とができる。 該 DNAはまた、 酵素等で標識して、 組織におけ る本発明の蛋白質の発現状況を検査するために使用する こ とが できる。 すなわち、 該 DNAをプロ一ブと して使用 し、 細胞にお ける本発明の蛋白質の発現量を mRNA発現量を指標と して確認 する こ とによ り、 本発明の蛋白質の製造に適した細胞やその培 養条件を決定する こ とがで きるほか、 本発明の蛋白質が関連す る疾患の診断を行う こ とも可能である。  The DNA of the present invention can be used to produce MP493 in large quantities. The DNA can also be labeled with an enzyme or the like and used for examining the expression status of the protein of the present invention in a tissue. That is, by using the DNA as a probe and confirming the expression level of the protein of the present invention in cells using the mRNA expression level as an index, it is suitable for the production of the protein of the present invention. In addition to being able to determine the cells and their culture conditions, it is also possible to diagnose diseases associated with the protein of the present invention.
また、 本発明の DNA の一部を プラ イ マー と して使用 した PCR-RFLP ( Restriction fragment length polymorphism; 法、 PCR-SSCP (Single strand conformation polymorphism) 法、 シークェンシング等の方法によ り、 核酸配列上の異常あるいは 多形を検査 · 診断する こ とができる。 また、 本発明の D NAを生体内の細胞に導入し、 本発明の蛋白 質の発現または活性が損なわれている こ とによる疾患の遺伝子 治療にも使用する事ができる。 Further, a method such as PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism; method, PCR-SSCP (Single strand conformation polymorphism) method, sequencing, etc.) using a part of the DNA of the present invention as a primer, It can test and diagnose abnormalities or polymorphisms in nucleic acid sequences. Further, the DNA of the present invention can be introduced into cells in a living body, and used for gene therapy for diseases caused by impaired expression or activity of the protein of the present invention.
本発明の D NAは、 形質転換細胞の調製、 さ ら には該形質転換 細胞を用いた組換蛋白質 MP 493 の生産方法、 あるいは mp493 の発現を特異的に抑制する化合物の探索に大いに有用である。 本発明における形質転換細胞は当業者に公知の技術を適用 し て調製する こ とが可能であ り、 例えば、 市販されあ るいは当業 者が一般に入手容易な様々なベクターを利用 して、 適当な宿主 細胞へ本発明の D NAを組み入れる こ とが可能である。その際、 遺伝子 mp 493 をプロモ一夕一ゃェンハンサ一に代表される発 現制御遺伝子の影響下にお く こ とで、 遺伝子 mp 493 の宿主細胞 内での発現を任意にコ ン ト ロ一ルする こ とが可能である。 この 手法は、形質転換された宿主細胞を用いた蛋白質 MP 493の生産 において好適に用い られる他、 遺伝子 mp 49 3 の発現制御機構の 研究あるいは該遺伝子の発現を調節 し得る物質の探索などにも 応用する こ とが可能となる。  The DNA of the present invention is extremely useful for the preparation of transformed cells, a method for producing the recombinant protein MP493 using the transformed cells, or the search for a compound that specifically suppresses the expression of mp493. is there. The transformed cells of the present invention can be prepared by applying techniques known to those skilled in the art.For example, using various vectors that are commercially available or generally available to those skilled in the art, The DNA of the present invention can be incorporated into an appropriate host cell. At this time, the expression of the gene mp493 in the host cell was arbitrarily controlled by placing the gene mp493 under the influence of an expression control gene represented by the promoter. Is possible. This technique is suitable for use in the production of protein MP493 using transformed host cells, as well as for studying the mechanism of controlling the expression of gene mp493 or searching for a substance that can regulate the expression of the gene. It can be applied.
例えば、 任意の被験物質と遺伝子 mp 493 を含むベクタ一で形 質転換された細胞と を適当な条件下で接触させる こ とで、 被験 物質の遺伝子 mp 493 の発現を促進あ るいは抑制する作用を有 する物質を探索し、 あるいは評価を行う こ とができる。 For example, a test substance is brought into contact with a cell transformed with a vector containing the gene mp493 under an appropriate condition, thereby obtaining a test substance. It is possible to search for or evaluate a substance having an action of promoting or suppressing the expression of the gene mp493 of the substance.
また、本発明である D NAと公知の方法とを組み合わせてマウ スまたはその他の適当な動物を基に ト ランスジエニ ック動物を 調製する こ とが出来る。 かかる ト ラ ンスジエニ ッ ク動物を用い ても、 上記の形質転換細胞と同様の探索あるいは評価を行う こ とがで きる 。 特に本発明である遺伝子 mp 493 あるいは蛋白質 MP 493は癌発症あるいは肺疾患、 腎疾患や脬疾患に関連する こ とか ら、 上述の形質転換細胞あるいは ト ラ ンスジヱニ ッ ク動物 を用いた探索を通 じて得られる化合物等は、 癌、 肺、 腎あるい は'滕疾患に対する有効な治療薬または予防薬となる ことが期待 される。  In addition, a transgenic animal can be prepared based on a mouse or other suitable animal by combining the DNA of the present invention with a known method. Even using such a transgenic animal, the same search or evaluation as in the above-described transformed cells can be performed. In particular, since the gene mp 493 or protein MP 493 of the present invention is associated with the onset of cancer, lung disease, renal disease and 脬 disease, it was investigated through the above-mentioned search using the transformed cells or transgenic animals. It is expected that the compounds and the like obtained as described above will be effective therapeutic or prophylactic agents against cancer, lung, kidney or Teng disease.
本発明の遺伝子の発現は、 該遺伝子固有のプロモーター配列 の制御下に発現させる こ とがで きる。 かかる発現系を用いれば、 本発明の遺伝子の転写を促進あるいは抑制する物質の探索がよ り有利に行える。 あるいは、 本発明の遺伝子の上流に別の適当 な発現プロモ一夕一を該遺伝子固有のプロモー夕一配列に接続 あるいは置き換えて使用する こ と もで きる。 この場合に使用す る プロモー夕一は、 宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すれ ばよ く 、 例えば宿主が大腸菌である場合には T 7 プロモー夕一、 l a c プロモ一夕一、 t r p プロモ一夕一、 え： P L プロモ一夕 —な どが、 宿主が酵母である場合には P H O 5 プロ モ一夕一、 G A P プロモ一夕一、 A D Hプロモ一夕一等が、 宿主が動物細 胞である場合には S V 4 0 由来プロモ一夕一、 レ ト ロ ウ ィ ルス プロモ一夕一等を例示で きるが、 当然ながら これら には限定さ れない。 The gene of the present invention can be expressed under the control of a promoter sequence unique to the gene. By using such an expression system, a search for a substance that promotes or suppresses transcription of the gene of the present invention can be more advantageously performed. Alternatively, another suitable expression promoter upstream of the gene of the present invention can be used by connecting or replacing it with a promoter sequence specific to the gene. The promoter used in this case can be appropriately selected depending on the host and the purpose of expression. For example, if the host is Escherichia coli, T7 promoter overnight, lac promoter overnight, trp promoter overnight, etc .: PL promoter overnight, etc., but if the host is yeast, If the host is an animal cell, PHO 5 Promote overnight, GAP Promote overnight, ADH Promote overnight, etc. The first class can be exemplified, but of course the invention is not limited to these.
DNA をぺク 夕一に導入する方法は公知である （ J.Sambrook 等、 Molecular Cloning , a Laboratory Manual 2nd e d. , し old Spring Harbor Laborator , ニュ一ョ一ク (New York) , 1989 年、 参照） 。 すなわち、 DNA とべクタ一をそれぞれ適当な制限 酵素で消化 し、得られたそれぞれの断片を DNA リ ガーゼを用い てライ ゲ一シヨ ンさせればよい。  A method for introducing DNA at a constant rate is known (J. Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., New Spring Harbor Laborator, New York, 1989, See). That is, DNA and vector may be digested with appropriate restriction enzymes, and the obtained fragments may be ligated using DNA ligase.
(蛋白質）  (protein)
本発明の蛋白質は、 天然に発現している各種臓器から調製す る こ とがで きるが、 ペプチ ド合成機 （例えば、 ペプチ ド シンセ サイ ザ一 430A型、 パーキンエルマ一ジャパン （株） 製） を使用 した化学合成法でも、 また原核生物あるいは真核生物か ら選択 される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によって も調製する こ とができ る。 しか しながら、 その純度の面から遺伝子工学的 な手法による生産な らびに組換え型蛋白質が好ま しい。 The protein of the present invention can be prepared from various naturally expressed organs, and is a peptide synthesizer (for example, Peptide Synthesizer-1430A, manufactured by PerkinElmer Japan KK). Prepared by a chemical synthesis method using E. coli or by a recombinant method using an appropriate host cell selected from prokaryotes or eukaryotes. be able to. However, in terms of purity, production by genetic engineering techniques and recombinant proteins are preferred.
前項の組換えベク ターを用いて形質転換させる宿主細胞には 特に制限はな く 、 E . coli、 B . sub tilis あるいは S . cere visiae に代 表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、 昆虫細 胞、 C O S 7細胞、 CH O 細胞、 Hel a 細胞に代表される動物細胞 など多 く の細胞が、 本発明に対しても利用可能である。  There are no particular restrictions on the host cells transformed using the recombinant vector described in the preceding paragraph, and lower cells that can be used in genetic engineering techniques represented by E. coli, B. subtilis or S. cerevisiae. Many cells such as insect cells, COS7 cells, CHO cells, and animal cells represented by Hela cells can also be used in the present invention.
組換えべク夕ーを宿主細胞に導入する方法と しては、 エレク ト ロ ポ レーシ ヨ ン法、 プロ ト プラ ス ト法、 アルカ リ 金属法、 リ ン酸カルシウム沈澱法、 D EAE デキス ト ラ ン法、 マイ クロイ ン ジェクシヨ ン法、 ウィルス粒子を用い る方法等の公知方法 (実 験医学臨時増刊、 遺伝子工学ハン ド ブック 199 1年 3月 20 日発 行、 羊土社、 参照） があ るが、 いずれの方法を用いても構わな い o  Methods for introducing a recombinant vector into a host cell include an electroporation method, a protoplast method, an alkali metal method, a calcium phosphate precipitation method, and a DEAE text. Well-known methods such as the Run method, the Mycroinjection method, and the method using viral particles (see Extraordinary Special Issue on Experimental Medicine, Handbook of Genetic Engineering, published on March 20, 2001, Yodosha, etc.) Yes, any method may be used o
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、 上述の形質転換 体を培養して培養混合物を回収し、 当該蛋白質を精製する。 形 質転換体の培養は、 一般的な方法で行う こ とがで き る。 形質転 換体の培養については各種の成書 （た とえは、 「微生物実験法」 社団法人日本生化学会編、 株式会社東京化学同人、 1992年、 参 照） があるので、 それら を参考に して行う こ とがで きる。 In order to produce the protein by genetic engineering, the above transformant is cultured to recover a culture mixture, and the protein is purified. Transformants can be cultured by a general method. Regarding the culture of transformants, various books (Taehae, “Microbial Experiment Method”, edited by The Japanese Biochemical Society, Tokyo Chemical Dojin, Ltd., 1992 ), So that they can be performed with reference to them.
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法と しては、 蛋 白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適 宜選択して行う こ とができる。 すなわち、 塩析法、 限外濾過法、 等電点沈澱法、 ゲル濾過法、 電気泳動法、 イ オン交換ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 疎水性ク ロ マ ト グラ フ ィ 一や抗体ク ロ マ ト グラ フ ィ 一等の各種ァフ ィ 二テ ィ ーク ロマ ト グラ フ ィ ー、 クロマ ト フ ォ一カ シング法、 吸着ク ロマ ト グラ フ ィ 一およぴ逆相ク ロマ ト グラ フ ィ 一等、 通常使用され得る方法の中から適切な方法を適 宜選択 し、 必要によ り HPL C システム等を使用 して適当な順序 で精製を行えば良い。  As a method for purifying the protein of the present invention from the culture mixture, an appropriate method can be appropriately selected from methods generally used for protein purification. That is, salting out method, ultrafiltration method, isoelectric point precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, antibody chromatography, etc. Various types of affinity chromatography such as chromatography, chromatofocusing, adsorption chromatography, and reversed-phase chromatography An appropriate method can be appropriately selected from methods that can be generally used, such as filtration, and purification can be performed in an appropriate order using an HPLC system or the like as necessary.
また、 本発明の蛋白質を他の蛋白質ゃ夕 グ （例、 グル夕チォ ン S ト ラ ンス フ ェ ラ ーゼ、 プロ テイ ン A、 ヒ キサ ヒ スチ ジ ン 夕 グ、 F L A Gタグその他） との融合蛋白質と して発現させる こ と も可能である。 発現させた融合型は、 適当なプロテアーゼ （例、 ト ロ ン ビンその他） を用いて切 り 出すこ とが可能であ り 、 と き と して蛋白質の調製をよ り有利に行う こ とが可能となる。 本発 明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて 行えばよ く 、 特に融合蛋白質の形態で発現させた と きは、 その 形態に特徴的な精製法を採用する こ とが好ま しい。 In addition, the protein of the present invention can be combined with other proteins (eg, glutathione S-transferase, protein A, oxahistidine, FLAG tag, etc.). It can also be expressed as a fusion protein. The expressed fusion form can be excised using an appropriate protease (eg, thrombin or the like), and in some cases, protein preparation can be performed more advantageously. It becomes possible. Purification of the protein of the present invention may be carried out by appropriately combining general methods known to those skilled in the art, and particularly when expressed in the form of a fusion protein, It is preferable to use a purification method that is characteristic for the morphology.
ま た、 組換え DNA 分子を利用 して無細胞系 の合成方法 ( J . S amb rook, e t al . ： Mole cular Cloning 2n d e d . ( 1989年) ) で得る方法も、 遺伝子工学的に生産する方法の 1 つである。  In addition, a method of obtaining a cell-free system using recombinant DNA molecules (J. Sambrook, et al .: Molecular Cloning 2nd ded. (1989)) is also produced by genetic engineering. One of the ways.
この様に本発明の蛋白質は、 それ単独の形態でも別種の蛋白 質との融合蛋白質の形態でも調製する こ とができる が、 これら のみに制限される ものではな く 、 本願発明の蛋白質を更に種々 の形態へと変換させる こ とも可能である。 例えば、 蛋白質に対 する種々の化学修飾、 ポ リ エチレ ングリ コール等の高分子との 結合、 不溶性担体への結合など、 当業者に知られている多種の 手法による加工が考え られる。 また、 用いる宿主に よっては糖 鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認めら れる。 かか る場合にあっても、 セ リ ンプロテア一ゼと して機能する限 り に おいて、 なお、 本発明の思想下にある とい うべきである。  As described above, the protein of the present invention can be prepared in its own form or in the form of a fusion protein with another kind of protein, but is not limited thereto. It is also possible to convert to various forms. For example, processing by various methods known to those skilled in the art, such as various chemical modifications to a protein, binding to a polymer such as polyethylene glycol, binding to an insoluble carrier, and the like can be considered. In addition, depending on the host used, the presence or absence of sugar chains and the degree of addition are also different. Even in such a case, as long as it functions as a serine protease, it should be considered as being under the concept of the present invention.
本発明の蛋白質は、 抗体を作製するための抗原と して使用 し た り 、 該蛋白質に結合する物質ゃ該蛋白の活性を調節する物質 のスク リ一ニングに使用する こ とができ、 有用である。  The protein of the present invention can be used as an antigen for producing an antibody, or can be used for screening a substance that binds to the protein or a substance that regulates the activity of the protein. It is.
(抗体）  (Antibody)
本発明の抗体は、 ポ リ ク ローナル抗体、 モノ ク ローナル抗体 いずれも公知方法を参考に して得る こ とができる （例えば、 免 疫実験操作法、 日本免疫学会編、 日本免疫学会発行、 参照） 。 以下に簡単に説明する。 The antibodies of the present invention include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. All of them can be obtained by referring to known methods (for example, immunization experiment procedures, edited by the Japanese Society of Immunology, published by the Japan Society of Immunology). This will be briefly described below.
当該新規抗体を得るには、 まず動物に、 免疫抗原と して本発 明の蛋 白 質 を必要に応 じて フ ロ イ ン ト の完全ア ジ ュ ノ ン ト In order to obtain the novel antibody, an animal is first treated with the protein of the present invention as an immunizing antigen and, if necessary, a complete Freund's antigen.
( F CA) や不完全アジュバン ト （FIA) 等の適切なアジュ ノ ン ト と とも に接種し、 必要があれば 2 〜 4週間の間隔で追加免疫す る。 追加免疫後、 採血を行い抗血清を得る。 抗原と して用いる 本発明の蛋白質は、 それか抗体の作製に使用 しう る精製度のも のであれはいかなる方法で得られたも のであっても よい。 本発 明の蛋白質の部分ポ リべプチ ドも免疫抗原と して好適に使用 し う る。 免疫抗原と して使用するポ リ ペプチ ドが、 低分子のポ リ ぺプチ ド、すなわち約 10〜 20アミ ノ酸からなるポリべプチ ドで あ る 場合に は、 それをキー ホール リ ンぺ ヅ ト へモ シ ァニ ンInoculate with an appropriate adjuvant, such as (FCA) or incomplete adjuvant (FIA), and boost if necessary at 2 to 4 week intervals. After the booster, blood is collected to obtain antiserum. The protein of the present invention used as an antigen may be obtained by any method as long as it has a degree of purification that can be used for producing an antibody. The partial polypeptide of the protein of the present invention is also suitably used as an immunizing antigen. If the polypeptide used as the immunizing antigen is a low-molecular-weight polypeptide, that is, a polypeptide composed of about 10 to 20 amino acids, it is converted to a keyhole polypeptide.へ To Hemochanin
( KLH )等のキヤ リ アと結合させて抗原と して使用すればよい。 免疫する動物はいかなる ものであ っても良いが、 好ま し く は通 常当業者で免疫学的な実験に使用されるラ ッ ト、 マウス、 ゥサ ギ、 ヒ ッジ、 ゥマ、 ニヮ ト リ、 ャギ、 ブ夕、 ゥシ等から、 目的 の抗体を産生 しう る動物種を選択して使用する こ とが好ま しい。 ボ リ クローナル抗体は、 得られた抗血清を精製する こ とによ つて得る事が出来る。 精製は、 塩析、 イオン交換ク ロマ ト グラ フ ィ一、 ァフ ィ 二テ ィ ーク ロマ ト グラ フ ィ ー等の公知方法を適 宜組み合わせて行えば良い。 It may be used as an antigen by binding to a carrier such as (KLH). The animal to be immunized can be any animal, but is preferably used in rats, mice, rabbits, sheep, sheep, dogs, and horses usually used in immunological experiments by those skilled in the art.ヮ It is preferable to select and use an animal species that can produce the desired antibody from birds, goats, bushes, and sea bream. The polyclonal antibody can be obtained by purifying the obtained antiserum. Purification may be carried out by appropriately combining known methods such as salting out, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
モノ クローナル抗体.を得るには以下のよう に行う 。 すなわち、 免疫 した動物から脾細胞も し く は リ ンパ球等の抗体産生細胞を 採取し、 ポ リ エチレ ング リ コ一ル、 セ ンダイ ウィ ルス、 電気パ ルス等を用いる公知方法に よ って、 ミ エロ一マ細胞株等と融合 し、 ハイ プリ ドーマを作製する。 その後、 本発明の蛋白質に結 合する抗体を産生 している ク ローンを選択 して培養 し、 その選 択されたク ローンの培養上清を精製するこ とによって得れは良 い。 精製は、 塩析、 イ オン交換ク ロ マ ト グラ フ ィ ー、 ァフ ィ 二 ティ一クロマ トグラ フ ィ 一等の公知方法を適宜組み合わせて用 いれば良い。  The procedure for obtaining a monoclonal antibody is as follows. That is, antibody-producing cells such as spleen cells or lymphocytes are collected from the immunized animal, and the cells are collected by a known method using polyethylene glycol, Sendai virus, electric pulse, or the like. And hybridis with myeloma cell lines to produce hybridomas. Thereafter, a clone producing an antibody that binds to the protein of the present invention is selected and cultured, and the culture supernatant of the selected clone is purified to obtain good results. For purification, a known method such as salting out, ion exchange chromatography, affinity chromatography, or the like may be appropriately used in combination.
また、 遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られ る。 例えば、 本発明蛋白質またはその部分ポ リ ペプチ ドで免疫 した動物の牌細胞、 リ ンパ球あるいは、 本発明蛋白質またはそ の部分ポリべプチ ド に対するモノ ク ロ一ナル抗体を産生するハ イ ブリ ド一マから mRNAを採取し、 これをも とに cDNAラィ ブ ラ リーを作成する。 抗原と反応する抗体を産生 している ク ロー ンをス ク リ ーニング し、 得られたク ローンを培養し、 培養混合 物から 目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製する こ と ができる。 The novel antibody can also be obtained by using a genetic engineering method. For example, a hybrid cell producing a monoclonal cell against a tile cell, a lymphocyte, or a protein of the present invention or a partial polypeptide thereof immunized with the protein of the present invention or a partial polypeptide thereof. MRNA is collected from one mouse, and cDNA live Create a library. A clone producing an antibody that reacts with an antigen is screened, the resulting clone is cultured, and the desired antibody can be purified from the culture mixture by a combination of known methods.
(アンチセ ンス核酸）  (Antisense nucleic acid)
アンチセ ンス核酸は、 公知方法で製造する こ とがで きる （例え ば、 Stanley T.CrooKeおよび BeRNAld Lebleu編、 in Antisense Research and Applications, CRC 出版、 フ ロ リ ダ、 1993年） 。 天然の DNAや RNAであれば、 化学合成機を使用 して合成した り、 mp493 を鐯型と して PCR法によ り 本発明のアンチセンス核 酸を得る こ とができ る。 また、 メ チルフ ォ ス フ ォ ネ一 ト型ゃフ ォス フ ォロチォエ ー ト型等、 誘導体の中には化学合成機 （たと えばパーキンエルマ一ジャパン （株） 製、 394 型） を使用 して 合成で きる ものもあ る。 この場合には、 化学合成機に添付され たマニュアルに従って操作を行い、 得られた合成産物を逆相ク 口マ ト グラ フ ィ 一等を用いた HPLC法によ り 精製するこ とによ つても、 アンチセンス核酸を得る こ とができる。 Antisense nucleic acids can be produced by known methods (eg, Stanley T. Crooke and BeRNAld Lebleu, eds. In Antisense Research and Applications, published by CRC, Florida, 1993). Natural DNA or RNA can be synthesized using a chemical synthesizer, or the antisense nucleic acid of the present invention can be obtained by a PCR method using mp493 as type III. Some derivatives, such as methyl phosphate type and phosphor type, use chemical synthesizers (for example, Model 394, manufactured by PerkinElmer Japan KK). Some can be synthesized. In this case, the operation is performed according to the manual attached to the chemical synthesizer, and the obtained synthetic product is purified by an HPLC method using a reversed-phase chromatography, for example. In addition, an antisense nucleic acid can be obtained.
本発明の DNA やアンチセンス核酸を診断用のプロ一ブと し て使用する場合には、 それら を公知の方法に従い、 ラジオアイ ソ トープ、 酵素、 蛍光物質、 あるいは発光物質等で標識する。 次に、 検体から D NA も し く は mRNA を公知方法で調製し、 こ れを被検物質と して、 前記標識プロ一ブを加えて反応させた後、 洗浄して未反応の前記標識プローブを除去する。被検物質中に、 遺伝子 mp 493 も し く は RNA が含まれていれば、 当該アンチセ ンス核酸はそれら と結合する。 結合形成の有無は、 標識 した酵 素、 蛍光物質、 発光物質、 あるいは放射性同位元素等による発 光、 蛍光、 放射能等を指標と して知る こ とができる。 When the DNA or antisense nucleic acid of the present invention is used as a probe for diagnosis, the DNA or antisense nucleic acid may be used as a radioprobe according to a known method. Label with sotopes, enzymes, fluorescent substances, or luminescent substances. Next, DNA or mRNA is prepared from the sample by a known method, and this is used as a test substance.Then, the labeled probe is added and reacted. Remove the probe. If the test substance contains the gene mp493 or RNA, the antisense nucleic acid binds to them. The presence or absence of bond formation can be determined by using, as an index, light emission, fluorescence, radioactivity, or the like caused by a labeled enzyme, fluorescent substance, luminescent substance, or radioisotope.
本発明の核酸、 特にアンチセ ンス核酸を医薬用途に使用する場 合には、 医薬品と して使用するのに適 した純度のものを、 薬理 学的に許容されう る使用方法で使用するこ とが好ま しい。 When the nucleic acid of the present invention, in particular, an antisense nucleic acid is used for a pharmaceutical purpose, a nucleic acid having a purity suitable for use as a pharmaceutical should be used in a pharmacologically acceptable use method. Is preferred.
本発明の核酸あるいはアンチセ ンス核酸は、 それら を直接適 当な溶媒に溶解も し く は懸濁 して使用 しても よい し、 リ ポソ一 ム中に封入 した り、 適当なベクターに組み込んだ形に して使用 しても よい。 また、 必要に応 じて、 薬理学的に許容され得る補 助成分を添加 し、 注射剤、 錠剤、 カ プセル剤、 点眼剤、 ク リ ー ム剤、 座剤、 噴霧剤、 パ ッ プ剤等適当な剤型に して使用 しても よい。 薬理学的に許容され得る補助成分とは、 溶媒、 基剤、 安 定化剤、 防腐剤、 溶解剤、 賦形剤、 緩衝剤等のこ とである。 本発明の核酸ある いはアンチセンス核酸は、 上述のよ う な剤 型と した場合、 患者の年齢や、 性別、 疾患の種類、 程度に応 じ て、 その投与方法、 その投与量を設定 して使用する こ とができ る。 すなわち、 病態を改善するのに適した量を、 経口投与、 あ る いは、 吸入、 経皮投与、 点眼、 膣内投与、 関節内投与、 直腸 投与、 静脈内投与、 局所投与、 筋肉内投与、 皮下投与、 腹腔内 投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。 The nucleic acid or antisense nucleic acid of the present invention may be used by directly dissolving or suspending it in an appropriate solvent, or may be encapsulated in a liposome or incorporated into an appropriate vector. It may be used in the form of an ellipse. Also, if necessary, pharmacologically acceptable auxiliary ingredients may be added, and injections, tablets, capsules, eye drops, creams, suppositories, suppositories, sprays and patches It may be used in an appropriate dosage form. Pharmaceutically acceptable auxiliary ingredients include solvents, bases, stabilizers, preservatives, solubilizers, excipients, buffers and the like. When the nucleic acid or antisense nucleic acid of the present invention is in the above-mentioned dosage form, its administration method and dosage are set according to the patient's age, sex, disease type and degree. Can be used. That is, oral, or inhalation, transdermal, ophthalmic, intravaginal, intraarticular, rectal, intravenous, topical, intramuscular administration in an amount appropriate to improve the condition An appropriate method may be selected from subcutaneous administration, intraperitoneal administration and the like.
(スク リ一ニング方法） 本発明は、 本発明の蛋白質、 該蛋白質を発現 している形質転 換細胞、 本発明の D NA、 該 D NA を含む組換えベクター、 また は該組換えべクタ一で形質転換された形質転換細胞を用いる こ とを特徴とする、 本発明の蛋白質の機能を調節する物質をスク リ 一ニング方法に関する。 よ り具体的には、 （ 1 ) 候補物質の 存在下/非存在下における MP493 のセ リ ンプロテアーゼ活性 を評価する方法、 （ 2 ) 候補物質の存在下ノ非存在下における 本発明の蛋白質または遺伝子の発現レベルを比較 し、 本発明の 蛋白質の発現を調節する物質をスク リ ーニングする方法などが 挙げられる。 （ 1 ) の例と しては、 実施例 5 に示す系において、 被験物質存在下 Z非存在下における MP 49 3 の基質切断活性を 測定すればよい。（ 2 )の例と しては、公知の手法、例えば in vitro transcription反 d、(プロメ 力社： Rib o max system等)と in vitro translation 反 、 (フ ロ メ カネ土 ： RaDbit Reticulocyte Lysate System 等） を併用 した翻訳段階の阻害活性、 あるいは mp493 遺伝子の 5' 非翻訳領域、 翻訳開始部位近傍領域、 5' 翻訳領域 を含む DNA とルシフ ヱラ一ゼ等の レポ一夕一遺伝子を連結 し た発現プラス ミ ド を用いた レポ一夕一遺伝子の発現量などを、 候補物質の存在下ノ非存在下で測定 して評価する こ とができる。 候補物質と しては蛋白質、 ペプ^ ド、 オ リ ゴヌ ク レオチ ド、 合成化合物、 天然由来化合物、 醃酵生成物、 細胞抽出液、 植物 抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられる がこれに限定されず、 新規物質でも公知物質でも よい。 (Screening Method) The present invention relates to a protein of the present invention, a transformed cell expressing the protein, a DNA of the present invention, a recombinant vector containing the DNA, or the recombinant vector. The present invention relates to a method for screening a substance that regulates the function of the protein of the present invention, which comprises using the transformed cell transformed in (1). More specifically, (1) a method for evaluating the serine protease activity of MP493 in the presence / absence of a candidate substance; (2) a protein of the present invention in the presence / absence of a candidate substance; Examples include a method of comparing the expression levels of genes and screening a substance that regulates the expression of the protein of the present invention. As an example of (1), in the system shown in Example 5, the substrate cleavage activity of MP493 in the absence of a test substance and in the absence of Z was measured. What is necessary is just to measure. Examples of (2) include known methods, for example, in vitro transcription anti-d, (Prome-Riksha Co., Ltd .: Ribo max system) and in vitro translation anti-disease, and (from cane soil: RaDbit Reticulocyte Lysate System, etc.). ) Or the DNA containing the 5 'untranslated region, the region near the translation initiation site, and the 5' translated region of the mp493 gene, and a repo overnight gene such as luciferase were ligated. The expression level of the repo overnight gene using the expression plasmid can be measured and evaluated in the presence or absence of the candidate substance. Candidate substances include proteins, peptides, oligonucleotides, synthetic compounds, naturally occurring compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc. The substance is not limited to this, and may be a new substance or a known substance.
(座標化された MP493 の基質結合部位を利用するスク リ ー ニング法）  (Screening method using coordinated substrate binding site of MP493)
以下には複数のプログラムが記載されているが、 これらは実 施方法を明確にするための一例であ り 、 同等の機能を持つプロ グラムを代替と して使用するこ と も可能である。  A plurality of programs are described below, but these are examples for clarifying the implementation method, and a program having an equivalent function can be used as an alternative.
MP493のア ミ ノ酸配列と公知のセ リ ンプロテアーゼのアミ ノ 酸配列情報とを比較する段階、 MP493 のセ リ ンプロテア一ゼ ド メ イ ンを構成する部分配列を特定する段階、既に立体構造が決 定されてい る公知のセ リ ンプロテア一ゼの構造情報を錶型と し て該 ド メイ ンを座標化する段階、 基質結合部位を構成している アミ ノ 酸残基または標的結合サイ ト を構成 している アミ ノ 酸残 基を特定する段階、それぞれに必要と される情報やプログラ ム は、 一般に開放されてい るデ一夕べ一スあるいは巿販化されて いる各種プログラムを用いて行う こ とがで きる。 ド メ イ ンの特 定に必要な公知の蛋白質情報は、 Genbank蛋白質データベース (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), PDBデータべ一スなど、 公開 デ—夕ベースから入手可能である。 また、 アミ ノ酸配列比較に は、 BLAST (Altschul SF.'J Mol Evol., Vol.36, pp.290-300 (l993);Altschul SF et al., J. Mol. Biol., Vol.215, pp.403· 10(1990))、 マルチ プルァ ラ イ メ ン ト プロ グラ ム ClustalW (Thompson JD， Higgins DG， Gib son T J. , Nucleic Acids Res ., Vol.22, pp.4673-4680(1994))、 その他入手可能ないずれのプログラ ムを用いてもよい。 ドメイ ン検索には、モチーフデ一夕ベースであ る PROSITEデ一夕べ一ス （http:〃www.expasy.ch/prosite/)、 ま 7こ は Pfam (http：// www. Sanger .ac.uk/Pf am/; E .L.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, and R. Durbin., Proteins .,28, pp.405-420(1997))な どが利用可能であ り 、検索プログラ ム と し ては、 隠れマルコ フモデルを用いた相同性検索プロ グラ ムであ る HMMER (R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh, G. Mitchison., Cambridge University Press., 重み行列を用いた膜貫通予測プ ロ グラ ム tmap (Persson B, Argos P., J Mol Biol., Vol.237, pp.182-92 (1994))等が挙げられる。 これらのデ一夕べ一スある いはプロ グラ ムはその性質上内容が改良され、 ある いは将来的 に新たなプログラム等が開発される こ とも あ り得るが、 本発明 の実施に必要な機能を有 してい る限 り 利用可能であ り 、上記の 例に限定されるも のではない。 Comparing the amino acid sequence of MP493 with the amino acid sequence information of a known serine protease; serine protease of MP493; A step of specifying a partial sequence constituting the main, a step of converting the domain of the known serine proteinase, whose tertiary structure has already been determined, into a type 錶, and a step of substrate binding The step of identifying the amino acid residues that make up the site or the amino acid residues that make up the target binding site, and the information and programs required for each, are open to the public. This can be done in the evening or using various commercial programs. Known protein information required for domain identification is available from public databases such as the Genbank protein database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) and the PDB database. It is possible. For amino acid sequence comparison, BLAST (Altschul SF.'J Mol Evol., Vol. 36, pp. 290-300 (l993); Altschul SF et al., J. Mol. Biol., Vol. 215 , pp.40310 (1990)), ClustalW (Thompson JD, Higgins DG, Gibson T J., Nucleic Acids Res., Vol.22, pp.4673-4680) 1994)), and any other available programs. For domain search, PROSITE database (http: www.expasy.ch/prosite/), which is based on motifs, and Pfam (http://www.Sanger.ac.uk) / Pf am /; E .LL Sonnhammer, SR Eddy, and R. Durbin., Proteins., 28, pp. 405-420 (1997)), and HMMER (R. Durbin, S. Eddy), a homology search program using a hidden Markov model, is used as a search program. , A. Krogh, G. Mitchison., Cambridge University Press., Transmembrane prediction program using weight matrix tmap (Persson B, Argos P., J Mol Biol., Vol.237, pp.182-92 (1994)), etc. These programs or programs may be improved in nature due to their nature, or new programs may be developed in the future. However, it can be used as long as it has a function necessary for carrying out the present invention, and is not limited to the above example.
セ リ ンプロテアーゼ ドメ イ ン情報か ら、 基質結合部位を構成 するア ミ ノ 酸残基または標的結合サイ ト を構成しているア ミ ノ 酸残基を特定 し空間配置を特定する には、公知のセ リ ンプロテ ァーゼの立体構造情報、 な らびに該公知のプロテアーゼと特異 的セ リ ンプロテアーゼ阻害剤との複合体の立体構造情報、 な ら びにこれら をコ ンピューター上で比較処理する プロ グラ ムなど が必要となる。 実験的に決定された立体構造情報は、 PDBデ一 夕 べ一ス H. M. Berman, et. al.， Nucleic Acids Jtiesearch, Vol.28, pp.235-242 (2000), http://www.rcsb.org/pdb/) などの 公開デ一夕ペースか ら入手可能である。 また、 蛋白質モデ リ ン グプログラムと しては、 FAMS( Ogata, K. et. al., J. Mol. Graph. Model., Vol.18, pp.258-272 (2000)) 、 Modeler ( Accelrys Inc., S andie o, CA) 、 Homology ( Accelrys Inc., S andie go, C A) 、 蛋白質構造評価プロ グラ ム と しては、 Profiles-3D ( Accelrys Inc., Sandiego, CA) 、 グラ フ ィ ッ クス表示プログラムと しては. Insightll ( Accelrys Inc., Sandiego, CA) 、 Sybyl ( ripos, Inc. St. Louis, MO) 等を使用する こ とが可能である。 In order to identify amino acid residues constituting the substrate binding site or amino acid residues constituting the target binding site from the serine protease domain information, and to specify the spatial arrangement, Three-dimensional structure information of a known serine protease, and three-dimensional structure information of a complex of the known protease and a specific serine protease inhibitor, and a process for comparing these on a computer Gram etc. are required. The tertiary structure information determined experimentally is described in PDB Data, HM Berman, et. Al., Nucleic Acids Jtiesearch, Vol.28, pp.235-242 (2000), http: //www.rcsb. .org / pdb /) It is available from the public data overnight. In addition, FAMS (Ogata, K. et.al., J. Mol. Graph.Model., Vol. 18, pp. 258-272 (2000)), Modeler (Accelrys Inc., S andie o, CA), Homology (Accelrys Inc., S andie go, CA), and protein structure evaluation programs include Profiles-3D (Accelrys Inc., Sandiego, CA) and Graphite. It is possible to use Insightll (Accelrys Inc., Sandiego, CA), Sybyl (ripos, Inc. St. Louis, MO), etc. as a box display program.
MP493に対する活性調節作用の有無を確認しょ う とする化合 物は、 公知、新規いずれであっても差し支えな く 、 その構造、由 来、 物性等にも特に制限はないが、 将来的に医薬開発を行う上 では低分子化合物であ る こ と が好ま し く 、 例えば Available Chemicals Directory ^ACD (MDL information s stems, Inc., San Leandro, CA)に登録されている化合物情報は有益である。  The compound for which the presence or absence of an activity regulating activity on MP493 is to be confirmed may be any of known and novel compounds, and there is no particular limitation on the structure, origin, physical properties, etc., but drug development in the future It is preferable that the compound is a low-molecular compound in performing the method. For example, compound information registered in the Available Chemicals Directory ^ ACD (MDL information systems, Inc., San Leandro, CA) is useful.
この様な低分子化合物の立体構造を座標化する プログラム と しては Concord, あるいは Converter等が利用可能である。 こ の様に して座標化 した MP493 と低分子化合物との結合は、分子 ド ヅ キングパ ヅケージ DOCK 等を使用 して自動的に行わせる こ とも可能である し、 Insightll等の分子表示ソフ ト ウエアを用 いて対話的に行う こ とも可能である。 その際、 これらのプログ ラムを用いて適合状態を評価する際の指標と しては、 結合体全 体の自 由エネルギー計算値、 経験的ス コア リ ング関数な どを任 意に選んで使用する こ とができる。 この指標によ り 、結合の良否 を客観的に評価する こ とが可能となる。 Concord, Converter, etc. can be used as a program for converting the three-dimensional structure of such a low-molecular compound into a coordinate. In this way, the binding between the coordinated MP493 and the low molecular weight compound can be automatically performed using the molecular docking package DOCK, etc., or molecular display software such as Insightll For It can also be done interactively. At that time, as the index for evaluating the conformity using these programs, the free energy calculation value of the whole coupling body, the empirical scoring function, etc. are arbitrarily selected and used. can do. With this index, it is possible to objectively evaluate the quality of the connection.
(薬理作用団の抽出と これを用いたスク リ 一ニング）  (Pharmacophore extraction and screening using this)
MP493活性調節作用を示す化合物からの薬理作用団の決定、 及び、 決定 した薬理作用団 と化合物の立体構造との比較には Catalysts Unity ( Tripos, Inc. St. Louis, MO) 等のプログラ ムを使用する こ とが可能である。 この際、 化合物のクラス夕 リ ン グ が 必 要 で あ れ ば 、 Daylight ( Daylight Chemical Iniormation Systems, Inc., Mission "V le j o, C A) 等のプロクフ ムを使用する こ とが可能である。  A program such as Catalysts Unity (Tripos, Inc. St. Louis, MO) was used to determine the pharmacological agent from the compound exhibiting MP493 activity-modulating activity and to compare the determined pharmacological agent with the three-dimensional structure of the compound. It can be used. At this time, if a class ring of the compound is required, it is possible to use a program such as Daylight (Daylight Chemical Iniormation Systems, Inc., Mission "Vlejo, CA").
図面の簡単な説明 BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
第 1 図は、 MP493 とアミ ノ酸配列上の相同性の高い他の蛋白 質とのァライ メ ン ト結果を示す。 図中、 左端の表示は MP493 を 除き、 蛋白質を PDBァクセ ッ ショ ン番号で示 したものであ り、 AAF97867 は TMPRSS2 を、 AAF64186 は、 マウスのプラズマ 膜貫通型蛋白質 Xを、 NP005647 はヒ ト膜貫通型セ リ ンプロテ ァ一ゼ 2 を、 NP056590 はマウス膜貫通型セ リ ンプロテア一ゼ 2 を、 それぞれ示す。 FIG. 1 shows the results of an alignment between MP493 and another protein having high homology on the amino acid sequence. In the figure, the left end shows the proteins by PDB accession numbers except for MP493. Penetration type serine protection NP056590 indicates mouse transmembrane serine proteinase 2, respectively.
第 2 図は、 公知のセ リ ンプロテアーゼとのァライ メ ン ト結果 を示す。図中、 TMS2 は膜貫通型セ リ ンプロテア一ゼ 2 を、 HEPS はヘプシンを、 TRP 1 は ト リ プシン 1 を、 TRP2 は ト リ プシン 2 を TRYBは /? ト リ プ夕一ゼを、 CFAIはファクター I を、 それそ れ示す。  FIG. 2 shows the results of the alignment with a known serine protease. In the figure, TMS2 is transmembrane serine protease 2, HEPS is hepsin, TRP 1 is trypsin 1, TRP2 is trypsin 2, TRYB is /? Indicates Factor I, respectively.
第 3 図は、 公知のセ リ ンプロテアーゼとの ド メ イ ン構造の相 閧図を示す。  FIG. 3 shows a schematic diagram of a domain structure with a known serine protease.
第 4 図は、 MP493セ リ ンプロテアーゼ ドメ イ ンのモデル構造 を示す。  FIG. 4 shows the model structure of the MP493 serine protease domain.
第 5 図は、 表 1 に示される特性球の配置を有する薬理作用団 を示す。 図中、 H p 1 は疎水性領域 1、 H p 2 は疎水性領域 2、 H B A 1 . Rは水素結合受容体領域 R、 H B A 1 . Tは水素結 合受容体領域 Τ、 Ρ I 1 は陽イ オン性領域を表す。  FIG. 5 shows a pharmacological agent having the configuration of the characteristic spheres shown in Table 1. In the figure, H p 1 is the hydrophobic region 1, H p 2 is the hydrophobic region 2, HBA 1.R is the hydrogen bond receptor region R, HBA 1.T is the hydrogen bond receptor region Τ, ΡI 1 is the hydrogen bond receptor region Represents the positive ion region.
第 6 図は、 表 2 に示される特性球の配置を有する薬理作用団 を示す。 図中、 Η ρ 3 は疎水性領域 1、 Η ρ 4は疎水性領域 2、 Η Β Α 2 . Rは水素結合受容体領域 R、 H B A 2 . Tは水素結 合受容体領域 T、 R A 1 . ： Rは環状芳香族性領域 R、 R A 1 , Tは環状芳香族性領域 T を表す。 FIG. 6 shows a pharmacological agent having the configuration of the characteristic spheres shown in Table 2. In the figure, ρρ 3 is the hydrophobic region 1, Ηρ 4 is the hydrophobic region 2, Η Α2 .R is the hydrogen bond acceptor region R, HBA 2.T is the hydrogen bond acceptor region T, RA 1 : R is a cyclic aromatic region R, RA 1, T represents a cyclic aromatic region T.
第 7 図は、 表 3 に示される特性球の配置を有する薬理作用団 を示す。 図中、 Η ρ 5 は疎水性領域 1、 Η ρ 6 は疎水性領域 2、 Η ρ 7 は疎水性領域 3、 Ρ I 2 は陽イ オン性領域を表す。  FIG. 7 shows a pharmacological agent having the configuration of the characteristic spheres shown in Table 3. In the figure, ρρ5 represents the hydrophobic region 1, Ηρ6 represents the hydrophobic region 2, Ηρ7 represents the hydrophobic region 3, and ΡI2 represents the cationic region.
第 8 図は、 表 1 〜表 3 に示される全ての特性球の配置を有す る薬理作用団を示す。  FIG. 8 shows a pharmacological agent having all the characteristic sphere configurations shown in Tables 1 to 3.
第 9 図は ΜΡ493 セ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンの空間座標を 表す。 表は 8 列から構成されてお り、 1 列目の A T O Mはこの 行が原子座標の行である こ とを示 し、 2列名はその原子の順番 を示し （ 1 〜 1 7 2 8 ) 、 3 列目はア ミ ノ 酸残基等における原 子の区別を、 4列目はア ミ ノ酸残基を 3 文字表記で、 5 列目は 配列番号 5 に対応 したア ミ ノ酸番号を、 6、 7、 8 列目はその 原子の座標 （それぞれ X、 Y、 Ζ軸で Α単位） を示 している。 最終行は、 この表の終わ り の行である こ と を示 している。 表は 当業者に と っ て一般的に用い られてい る方法であ る プロ ティ ン . デ一夕 · バンクの形式に従って記述している。  Figure 9 shows the spatial coordinates of the ΜΡ493 serine protease domain. The table is composed of eight columns. ATOM in the first column indicates that this row is a row of atomic coordinates, and the second column name indicates the order of the atoms (1 to 1728). The third column shows the atom distinction in amino acid residues, etc., the fourth column shows the amino acid residues in three letters, and the fifth column shows the amino acid number corresponding to SEQ ID NO: 5. Columns 6, 7, and 8 show the coordinates of the atom (X units on the X, Y, and Ζ axes, respectively). The last row indicates that this is the last row in the table. The table is described in accordance with the format of Protein Data Bank, a method commonly used by those skilled in the art.
実施例  Example
以下の実施例によ り本発明を更に詳述するが、 本発明はこれ ら実施例に限定して理解されるべきものではない。 実施例 1 遺伝子 mp493のク ローニング The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, but it should not be understood that the present invention is limited to these Examples. Example 1 Cloning of gene mp493
( 1 ) オ リ ゴキヤ ヅ プ法による完全長 cDNA ライ ブラ リーの作 ヒ ト 胃印環細胞癌株であ る ΚΑΤΟ-ΠΙ 細胞（ATCC No.HTB- 103) よ り Sambrook ら の 方 法 ( Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd e a. Cold Spring harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.) に従い、 オ リ ゴ dTセルロースを用 いてポ リ （A) + RNAを調製した。 次に 5-10〃 gのポリ（A)+RNAを、 lOOmMの Tris - HCl(pH8.0)、 5mMの 2-メリレカプ トエタノ ール 及び 100U の RNasin ( Promega) を含む緩衝液中で、 1.2U の Bacterial Alkaline Phosphatase ( 以 下 BAP と 略 す る ） ( TaKaRa) と 37°Cで 40分間反応させ、 キヤ ッ プ構造を持たな いポ リ （A) + RNA の脱リ ン酸化を行った。 その後、 フ エノ ール ： ク ロ 口ホルム = 1 ： 1 の混合液にて反応液を 2 回抽出し、 ポ リ (A) + RNA を エ タ ノ ール沈殿 と して 回収 した。 回収 したポ リ (A) + RNAは、 50mMの酢酸ナ ト リ ゥム （pH5.5) 、 ImMの EDTA、 5mMの 2-メ ルカプ トエタ ノール及び 100Uの RNasinを含む緩 衝液中で 20U の Tobacco acid pyrophosphatase (以下 AP と略する） （Maruyama and Sugano, Gene vol.138, 171-174) にて 37°Cで 45 分間処理し、 キャ ッ プ構造の除去を行った。 そ の後、 フヱ ノ ール ： ク ロ 口ホルム = 1 : 1 の混合液にて反応液を 2 回抽出 して、 エタ ノ ール沈殿を行い、 BAP_TAP 処理済ポ リ (A)+RNAを回収した。 (1) Construction of a full-length cDNA library by the Oligocap method The method of Sambrook et al. (ATCC No.HTB-103), a human gastric signet-ring cell carcinoma cell line, was used. Cloning. a Laboratory Manual, 2 nd e a. Cold Spring harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, according NY.), was prepared Itepo Li (a) + RNA use the O Li rubber dT cellulose. Next, 5-10 μg of poly (A) + RNA was added to a buffer containing 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM 2-merilecaptoethanol and 100 U RNasin (Promega) in a buffer containing 1.2 mM. U was reacted with Bacterial Alkaline Phosphatase (hereinafter abbreviated as BAP) (TaKaRa) at 37 ° C for 40 minutes to perform dephosphorylation of poly (A) + RNA without a cap structure. . Thereafter, the reaction solution was extracted twice with a mixture of phenol: close-up form = 1: 1, and the poly (A) + RNA was recovered as ethanol precipitate. The recovered poly (A) + RNA was used in a buffer containing 50 mM sodium acetate (pH 5.5), ImM EDTA, 5 mM 2-mercaptoethanol and 100 U RNasin in 20 U Tobacco. acid pyrophosphatase (AP) (Maruyama and Sugano, Gene vol.138, 171-174) At 37 ° C for 45 minutes to remove the cap structure. Then, the reaction mixture was extracted twice with a mixture of phenol: cloth form = 1: 1, ethanol precipitated, and BAP_TAP-treated poly (A) + RNA Was recovered.
こ の回収 したポ リ （A)+RNA2-4〃 g を 0.4〃 g の 5，オリ ゴマー 2-4 〃 g of the recovered poly (A) + RNA was added to 0.4 〃 g of 5, oligomer.
( 5' -AGC AUG GAG UCG GCC UUG UUG GCC UAC UGG-3' ) とラ イ ゲー シ ヨ ン反応を行った。 こ の反応は 50mM の Tris- HCl(pH7.5)、 5mMの MgCl2、 5mMの 2 -メルカ プ トェ夕ノ ール、 0.5mMの ATP、 25%の PEG8000及び 100Uの RNasin を含む緩 衝液中で、 250Uの RNA リ ガーゼ （TaKaRa) を用いて 20°Cで 3 - 16時間行った。その後、未反応のオ リ ゴマ一を除去 して cDNA 合成を行った。すなわち、 2-4 gのォ リ ゴキヤ ヅ プポ リ （A)+RNA を lOpmolの dTアダプタ一プライ マ一（ 5， -GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT GGC CTT TTT TTT TTT TTT TTT-3' ) と混合 し 、 Superscript 丄 I RNAse H" Reverse Transcriptase(5'-AGC AUG GAG UCG GCC UUG UUG GCC UAC UGG-3 ') and a ligation reaction was performed. This reaction was performed in a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl 2 , 5 mM 2-mercaptophenol, 0.5 mM ATP, 25% PEG8000 and 100 U RNasin. The reaction was performed at 250C for 3-16 hours using 250 U of RNA ligase (TaKaRa). After that, unreacted oligosaccharides were removed and cDNA synthesis was performed. That is, 2-4 g of oligopapori (A) + RNA was transferred to lOpmol dT adapter one primer (5, -GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT GGC CTT TTT TTT TTT TTT TTT-3 ') And Superscript II I RNAse H "Reverse Transcriptase
( GibcoBRL) を用い、 添付の緩衝液中で 42°C、 1時間反応させ た。 (GibcoBRL) and reacted at 42 ° C for 1 hour in the attached buffer.
錶型の RNAを除去するために 15mMの NaOH を用いて 65°C で 1時間反応させた後に、 cDNAの増幅操作を行った。 の オ リ ゴキヤ ヅ プポ リ （A) + RNA よ り合成された cDNA を 16pmol のセ ン ス プラ イ マ ー 1 ( 5' -AGC ATC GAG TCG GCC TTG TTG-3，）及びア ンチセ ンス プラ イ マ一 1( 5， -GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT-3' ) と混合し、 XL PGR kit ( Perkin-Elmer ) を用いて増幅 した。 この際の PCR反応の条件は、 94°Cで 1 分間、 58°Cで 1分間、 72°Cで 10分間のサイ クルを 5-10回行った。PCR 産物をフ エノ ール ： クロ口ホルム = 1 : 1 の混合液にて抽出 し、 エタ ノ ール沈殿と して回収した。 その後、 回収物を Sfi I で消化 し、 ァガロースゲル電気泳動にて lOOObp 以上の cDNA を分離 し、 哺乳動物細胞発現ベクターである pMEl8S-FL3 ( GenBank accession No.AB009864) の Dralll サイ ト に揷入 した。 尚、 PME18S-FL3 の Dralllサイ トは非対称性となってお り、 cDNA 断片の末端にはこれと相補的な Sfi I サイ ト となっているため、 挿入した cDNA断片は一方向性に揷入されている。 After removing the type I RNA, the reaction was carried out at 65 ° C for 1 hour using 15 mM NaOH, and then the cDNA was amplified. of Oh Li Gokiya Uz Pupo Li (A) + RNA by Ri synthesized cDNA of 16pmol cell down the scan plastic Yi Ma over 1 (5 '-AGC ATC GAG TCG GCC TTG TTG-3,) and A Nchise Nsu Pula Lee It was mixed with MA-1 (5, -GCG GCT GAA GAC GGC CTA TGT-3 ') and amplified using XL PGR kit (Perkin-Elmer). The PCR was performed 5 to 10 times at 94 ° C for 1 minute, at 58 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 10 minutes. The PCR product was extracted with a mixture of phenol: cloth form = 1: 1, and collected as ethanol precipitate. Thereafter, the recovered product was digested with SfiI, and cDNAs of lOOOObp or more were separated by agarose gel electrophoresis, and introduced into a Dralll site of a mammalian cell expression vector pMEl8S-FL3 (GenBank accession No. AB009864). Since the Dralll site of PME18S-FL3 is asymmetric and the SfiI site complementary to the end of the cDNA fragment is inserted, the inserted cDNA fragment is inserted unidirectionally. Have been.
( 2 ) cDNA ク ローン塩基配列及びその推定蛋白質情報の解 析  (2) Analysis of cDNA clone base sequence and its estimated protein information
( 1 ) の方法で作製した cDNAライ ブラ リ 一よ り 、 PI-100 口 ボヅ ト （ KURABO) を用いてプラス ミ ドを調製し、 各ク ローン の塩基配列を確認し、 データベース化 した。 塩基配列決定は、 AutoCycle sequencing kit ( Amersham Pharmacia ) と R.O.B. DNA processor ( Amersham Pharmacia) を用い添付のプロ ト コ 一 ル に 従 っ て シ ー ク ェ ン ス 反応 を 行 い 、 ALF DNA sequencer ^ Amersham Pharmacia) によ り 行った。 A plasmid was prepared from the cDNA library prepared by the method (1) using a PI-100 port bottle (KURABO), the nucleotide sequence of each clone was confirmed, and a database was prepared. Nucleotide sequencing Carry out the sequencing reaction according to the attached protocol using AutoCycle sequencing kit (Amersham Pharmacia) and ROB DNA processor (Amersham Pharmacia), and carry out using ALF DNA sequencer ^ Amersham Pharmacia). Was.
( 1 ) に記載の方法で取得したプラス ミ ド C-KAT00786 には、 配列番号 2 で表される 453 個のアミ ノ酸からなる新規な蛋白質 をコ一 ドする、配列番号 1 で表される 1359塩基の塩基配列から なるオープン リ一ディ ングフ レームを含む配列番号 3 で表わさ れる 2418塩基対の塩基配列からなる c DNAが含まれていた。  The plasmid C-KAT00786 obtained by the method described in (1) encodes a novel protein consisting of 453 amino acids represented by SEQ ID NO: 2 and is represented by SEQ ID NO: 1. It contained a cDNA consisting of a 2418 base pair base sequence represented by SEQ ID NO: 3 including an open reading frame consisting of a base sequence of 1359 bases.
相同性の検索には BLAST (Altschul SF.,J Mol Evol., Vol.36, pp.290-300 (1993)； Altschul SF et al., J. Mol. Biol., Vol.215, pp.403 ·10(1990))を用いて、 局部的な配列の一致を検索した。  For homology search, BLAST (Altschul SF., J Mol Evol., Vol. 36, pp. 290-300 (1993); Altschul SF et al., J. Mol. Biol., Vol. 215, pp. 403) · 10 (1990)) to search for local sequence matches.
MP493完全長 cDNA配列は問い合わせとする配列の順方向、 逆方向すベての読み枠を翻訳して相同性検索をおこなう blastx プ ロ グ ラ ム を 用 い て Genbank 蛋 白 質 デ ー タ ベ ー ス (http：〃 www. ncbi.nlm.nih.gov/)に対し相同性検索を実施した。 こ の 方 法 に よ り 有 為 な 相 同 性 の み ら れ た ア ミ ノ 酸 配 列 (GenBank Accession: AAF97867, AAF64186, NP_005647, NP— 056590)と、 対応する MP493完全長 cDNA配列のコ ド ンの 読み枠から翻訳される蛋白質配列の推定をおこなった。 For the MP493 full-length cDNA sequence, use the blastx program to perform homology searches by translating all open and reverse reading frames of the sequence to be queried. (Http: 検 索 www.ncbi.nlm.nih.gov/). The amino acid sequence (GenBank Accession: AAF97867, AAF64186, NP_005647, NP-056590) that has significant homology with this method and the corresponding MP493 full-length cDNA sequence code Of The protein sequence translated from the reading frame was estimated.
続いて こ の推定された蛋白質配列を問い合わせ配列 と して Genbank 蛋白質デ一夕ベースに対し BLAST 相同性検索を行つ た。 開始コ ド ンのメ チォニンを 1番と して、 52 カゝら 448番目の 409 残基 に わ た り ヒ ト 膜貫 通型 セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ 2 ( GenBank Accession: NP— 005647) との相同性が 58%、 72か ら 447 番 目 の 383 残基にわた り マ ウスセ リ ン プロテア一ゼ TMPRSS2 ( GenBank Accession: AAF97867) との相同性が 61%. 72から 447番目の 383残基にわた り マウスのプラズマ膜貫通型 蛋白質 X ( GenBank Accession: AAF64186 ) との相同性が 60%、 72から 447番目の 383残基にわた り マウス膜貫通型セ リ ンプロ テア一ゼ 2 ( GenBank Accession: NP„056590) との相同性が 59 %みられた。  Subsequently, a BLAST homology search was performed on the Genbank protein database using the deduced protein sequence as a query sequence. Taking the methionine of the initiation codon as No. 1, it extends over 409 residues at the 448th position from 52 amino acids and has a transmembrane human serine protease 2 (GenBank Accession: NP— 005647) with 58% homology to the mouse serine protease TMPRSS2 (GenBank Accession: AAF97867) spanning 383 residues from the 72nd to the 447th. 60% homology with mouse plasma transmembrane protein X (GenBank Accession: AAF64186) over 383 residues, mouse transmembrane serine protease over 383 residues from residues 72 to 447 2 (GenBank Accession: NP „056590).
MP493 塩基配列と上記 4塩基配列を Fasta(W.R. Pearson & D.J. Lipman., PNAS., Vol.85, pp.2444-2448 (1988))プログラ ムを用いて相同性検索を実施した結果、 ヒ ト膜貫通型セ リ ンブ 口テア一ゼ 2 ( GenBank Accession: NP_005647) と 1 1 7 0 塩基に お い て 56%の 同一性、 マ ウ ス セ リ ン プ ロ テ ア一ゼ TMPRSS2 ( GenBank Accession: AAF97867) と 791 塩基にお い て 57%の 同 一性、 マ ウ ス の プ ラ ズ マ膜貫通型蛋 白 質 X ( GenBank Accession:AAF64186) と 791塩基において 57%の 同一性、 マ ウ ス膜貫通型セ リ ン プロ テ アーゼ 2 ( GenBank Accession: NP— 056590) と 791塩基において 57%の同一性がみ られた。 A homology search was performed on the MP493 base sequence and the above four base sequences using the Fasta (WR Pearson & DJ Lipman., PNAS., Vol. 85, pp. 2444-2448 (1988)) program. 56% identity at 117 bases with penetrating cell mouth protease 2 (GenBank Accession: NP_005647), mouse serine protease TMPRSS2 (GenBank Accession: AAF97867 ) And 791 bases 57% homology, 57% identity at 791 bases with mouse plasma transmembrane protein X (GenBank Accession: AAF64186), mouse transmembrane serine protein 57% identity was found at 791 bases with thease 2 (GenBank Accession: NP-056590).
さ ら に推定された蛋白質配列と相同性検索から得られた近縁 関 係 に あ る セ リ ン プ ロ テ ア 一 ゼ （GenBank Accession: AAF97867, AAF64186, NP— 005647, NP— 056590)をマ レ チ フ。ノレ ァライ メ ン ト プログラム ClustalW (Thompson JD, Higgins DG， Gibson TJ., Nucleic Acids Res., Vol.22, pp.4673-4680(1994)) を用いて多重整列 した結果を第 1 図に示す。 またセ リ ンプロテ ァ一ゼ ド メ イ ン において有為な相 同性のみ ら れた ヒ ト 配列 ( TMPRSS2;GenBank Accession 0015393;Factor I GenBank Accession P05156； ト リ プ シ ン GenBank Accession P07477,P07478 ヘプシン GenBank Accession P05981; ト リ プ夕一ゼ GenBank Accession P20231 ) において ClustalW を 用い、 多重整列を行った結果を第 2 図に示す。  Furthermore, a closely related serine protease (GenBank Accession: AAF97867, AAF64186, NP-005647, NP-056590) obtained from the homology search with the deduced protein sequence was used. Retif. Figure 1 shows the results of multiple alignment using the reference program ClustalW (Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ., Nucleic Acids Res., Vol. 22, pp. 4673-4680 (1994)). Human sequences with significant homology in the serine protein domain (TMPRSS2; GenBank Accession 0015393; Factor I GenBank Accession P05156; Trypsin GenBank Accession P07477, P07478 Hepsin GenBank Accession Fig. 2 shows the results of multiple alignment using ClustalW in P05981; Tripichi GenBank Accession P20231).
モ チ 一 フ デ 一 夕 べ一 ス で あ る PR0SITE デ一 夕 べ一 ス (http://www.expasy.ch/prosite/) ¾用いて、推定される蛋白質配 列の機能について、 PROSITEデ一夕 ベース に対 しパ 夕一ン検索 した結果、 221 番目 のァスパ ラギ ン が糖鎖結合部位であ るモチ —フ がみ ら れた。 The PR0SITE database (http://www.expasy.ch/prosite/), which is a motivation database, is used to estimate the protein distribution. As a result of a search of the column function against the PROSITE database, a motif was found in which the 221st asparagine was a sugar chain binding site.
更に LDL-受容体ク ラ ス A (LDLRA)ド メ イ ン シ グニチ ヤ一 [PROSITE Accession:PS01209] (85 - 107)がみ られた。 さ ら に、 セ リ ン プロ テア一ゼであ る ト リ プシ ンの活性中心の ヒスチジン 残基に見ら れるモチーフ [PROSITE Accession:PS00134]が 253 か ら 258番 目のア ミ ノ 酸残基に見ら れ、 同 じ く ト リ プシ ンの活 性 中 心 の セ リ ン 残 基 に 見 ら れ る モ チ ー フ [PROSITE Accession: PS 00135]が 394か ら 405番目のア ミ ノ 酸残基にみ ら れた。  In addition, the LDL-receptor class A (LDLRA) domain signature [PROSITE Accession: PS01209] (85-107) was observed. Furthermore, the motif [PROSITE Accession: PS00134] found in the histidine residue in the active center of the serine protease trypsin has amino acid residues 253 to 258. In the same manner, the motif [PROSITE Accession: PS 00135] found in the serine residue at the center of the activity of trypsin has amino acids 394 to 405. Residues were found.
PROSITE プロ フ ァイ ル検索か ら は、 72 か ら 108 番目のア ミ ノ 酸残基に LDLレ セ プ夕 一ク ラス Aの ド メ イ ンの プロ フ ァイ ル [PROSITE Accession: PS 50068]が見 られた。  From the PROSITE profile search, it was found that the amino acid residue at the 72nd to 108th amino acid residues had the profile of the domain of the LDL receptor class A [PROSITE Accession: PS 50068]. ]has seen.
隠れマル コ フ モ デル を用 い た相 同性検索 プロ グ ラ ムで あ る HMMER (R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh, G. Mitchison., Cambridge University Press., (1998))を用いて夕 ンノ ク質 ドメ イ ンデ一夕ペースで あ る Pfam (http：// www. San er . ac.uk/Pfam/； E.L.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, and R. Durbin., Proteins ., Vol.28, pp.405·420(1997))に検索を実施した結果、 有為な相同 性のある ド メ イ ン と してア ミ ノ酸番号 71 から 109番目に LDL- 受容体 ドメ イ ンク ラス A [Pfam Accession:PF00057]、 ァミ ノ 酸番号 110から 205番'目にスカベンジャ一受容体 Cys リ ヅチ ド メ イ ン [Pfam Accession: PF00530], ァミ ノ酸番号 217から 443 番目 にセ リ ン ブ口 テア一ゼであ る ト リ プシ ン ド メ イ ン [Pfam Accession: PF00089]が見出された。 Using HMMER (R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh, G. Mitchison., Cambridge University Press., (1998)), a homology search program using a hidden Markov model Pfam (http: // www. Saner. Ac.uk/Pfam/; ELL Sonnhammer, SR Eddy, and R. Durbin., Proteins., Vol. 28, pp. 405, 420 (1997)), we found that the domain with significant homology is the LDL-receptor domain from amino acid number 71 to position 109. Class A [Pfam Accession: PF00057], amino acid number 110 to 205 'scavenger receptor Cys peptide domain [Pfam Accession: PF00530], amino acid number 217 to 443 The trypsin main [Pfam Accession: PF00089], which is a cell mouth tear, was found.
重み行列を用いた膜貫通予測プロ グラム tmap (Persson B, Argos P ., J Mol Biol., Vol.237, pp.182-92 (1994))によ り膜貫 通へ リ ッ クスの予測をおこなったと こ ろ、 41 番目から 69 番目 のア ミ ノ酸残基の 2 9残基において膜貫通領域が予測された。 MP493と他のセ リ ンプロテア一ゼの ドメ イ ン構造概念図を第 3 図に示す。  A transmembrane prediction program tmap (Persson B, Argos P., J Mol Biol., Vol.237, pp.182-92 (1994)) using a weight matrix predicts the transmembrane risk. As a result, a transmembrane region was predicted at 29 residues of the 41st to 69th amino acid residues. Figure 3 shows a conceptual diagram of the domain structure of MP493 and other serine proteases.
実施例 2 PCR法による各種臓器における発現解析  Example 2 Expression analysis in various organs by PCR
遺伝子 mp493の各種臓器における発現を調べるために、 市販 の cDNA ( Human MTC Panel I 及び II) ( CLONTECH) を錶 型に PCR を行った。 すなわち、 MP493 の 3' 非翻訳領域に特異 的なセ ンス プライ マ一 2 ( 55 -GAT TCC AGCACA ACC TTC AA-3'：)及びアンチセンスプライ マ一 2( 5， -GGC CTT AAA CGA GTC ATT CC-3' ) を用い、 PLATINUM Taq DNA Polymerase ( GibcoBRL) によ り 94°Cで 2分間反応した後に、 94°Cで 30秒. 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分のサイ クルを 30 回繰り 返し、 PCR反 応を行った。 得られたサンプルについてァガロースゲル電気泳 動を行い、 DNA断片の増幅の有無を調べた。 その結果、 肺、 脬 臓、 腎臓、 胎盤で遺伝子 mp493の発現が確認された。 In order to examine the expression of the gene mp493 in various organs, a commercially available cDNA (Human MTC Panels I and II) (CLONTECH) was subjected to PCR using the 錶 type. That is, 'single specific cell Nsu ply Ma untranslated region 2 (5 5 -GAT TCC AGCACA ACC TTC AA-3' 3 of MP493 :) and antisense ply Ma one 2 (5, -GGC CTT AAA CGA GTC ATT CC-3 '), react with PLATINUM Taq DNA Polymerase (GibcoBRL) at 94 ° C for 2 minutes, then at 94 ° C for 30 seconds.55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute This cycle was repeated 30 times, and a PCR reaction was performed. The obtained sample was subjected to agarose gel electrophoresis, and the presence or absence of amplification of the DNA fragment was examined. As a result, expression of the gene mp493 was confirmed in the lung, kidney, kidney, and placenta.
実施例 3 哺乳動物細胞での発現  Example 3 Expression in mammalian cells
( 1 ) 発現プラ ス ミ ド p M5001 の構築  (1) Construction of expression plasmid pM5001
MP493を哺乳動物細胞で発現させるためのプラス ミ ド を以下 の方法で作製した。  A plasmid for expressing MP493 in mammalian cells was prepared by the following method.
セ ンス プラ イ マ一 3 ( 5' — ACA GAG GAT GGA GGT GAC GCC-3')及びア ンチセ ンス ブラ イ マー 3( 5, -CCC A AG CTT GGT TTT TAG GTC TCT CTC CAT -3' ) を設計し、 オ リ ゴキャ ッ プ 法で作製した C-KAT00786 プラス ミ ドを鍩型と して、 Pyrobest DNA Polymerase ( TaKaRa) によ り 98°Cで 10 秒、 55°Cで 30 秒、 72°Cで 1 分のサイ クルを 30 回繰り返し、 PCR 反応を行つ た。得られた約 0.3kb の DNA断片を Bglll及ぴ Hindlllで消化 し、 ァガロースゲル電気泳動にて回収した。 また、 オ リ ゴキヤ ヅ プ法で作製した mp493 プラス ミ ド を Xho I と Bglllで消化 し、 約 1.3kbの DNA断片を回収した。次に pcDNA3.1/Myc-His (-) A ( Invitrogen) を Xho I と Hindlll にて消ィ匕 し、 ァガロースゲ ル電気泳動にて約 5.5kbの DNA断片をベク ターと して回収した < このベクター断片に先に回収した 2種の DNA断片を定法によ り ライ ゲ一シヨ ン し、 JM109 コ ン ビテン ト細胞 （TaKaRA) を形 質転換 し、 目的のプラス ミ ド （pM5001) を得た。 Sense Primer 3 (5 '— ACA GAG GAT GGA GGT GAC GCC-3') and Antisense Primer 3 (5, -CCC A AG CTT GGT TTT TAG GTC TCT CTC CAT -3 ') The C-KAT00786 plasmid designed and produced by the oligocap method was used as a type, and Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa) was used for 10 seconds at 98 ° C, 30 seconds at 55 ° C, 72 ° C. C was repeated 30 times for 1 minute cycle to perform PCR reaction. The obtained DNA fragment of about 0.3 kb was digested with Bglll and Hindlll, and recovered by agarose gel electrophoresis. Also, mp493 plasmid prepared by the oligocap method was digested with XhoI and Bglll, A DNA fragment of about 1.3 kb was recovered. Next, pcDNA3.1 / Myc-His (-) A (Invitrogen) was digested with XhoI and Hindlll, and a DNA fragment of about 5.5 kb was recovered as a vector by agarose gel electrophoresis. The two types of DNA fragments previously collected in the vector fragment were ligated by a standard method, and the JM109 competent cells (TaKaRA) were transformed to obtain the desired plasmid (pM5001). .
( 2 ) COS-1細胞を用いた MP493の発現確認  (2) Confirmation of MP493 expression using COS-1 cells
発現プラス ミ ド pM5001を下記の方法で COS-1細胞に導入し、 蛋白質の発現を行った。 すなわち 3.0 X 105cells/well の濃度で COS-1細胞を 6 ゥヱルプレー ト に植え込み、 5% C02、 37°Cの条 件下で 1 昼夜培養 した。 翌 日 、 1 ゥ エルあ た り の FuGENEG (ロ シュ ' ダイ ァグノ ステ ィ ヅ クス社） と 1 gの pM5001 とを添付プロ ト コ一ルに従い混合 し、 COS-1 細胞に添 力 Πした。 5%C02、 37°Cの条件下でさ らに 72時間培養した後に、 上清 を 除去 し 、 PBS—で 細胞 を 洗 浄 し 、 100 1 /well の ElectroPure Reagents Tris-SDS Sample Buffer(2倍濃度） （第 一化学薬品） で細胞を溶解させた。 次にその溶解液 10 1 を 5-20%グラジェン ト SDSポリ アク リ リレア ミ ドゲルにて電気泳動 を行い、 Pall FluoroTrans W Membrane 、 Pall CorOoration) に蛋白 を転写し、 ウエスタ ンプロ ヅティ ングを行っ た。 尚、 一 次抗体には Penta'His Antibody ( QIAGEN) を、 二次抗体には HRP標識ゥサギ抗マウスィ ムノ グロ プリ ン （DAKO) を用いた。 また ECL検出試薬 （ Amer sham -pharmacia) によ り ケミルミ検 出を行った。 その結果、 約 55kDaの蛋白質の発現が確認で きた ,The expression plasmid pM5001 was introduced into COS-1 cells by the following method to express the protein. That is, COS-1 cells were inoculated at a concentration of 3.0 × 10 5 cells / well in 6 μl plates and cultured for 1 day and night under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. The next day, FuGENEG (Roche's Diagnostics) per 1 μl and 1 g of pM5001 were mixed according to the attached protocol and supplemented to COS-1 cells. After culturing for 72 hours in the al under the conditions of 5% C0 2, 37 ° C , the supernatant was removed, the cells were washing with PBS-, of 100 1 / well ElectroPure Reagents Tris- SDS Sample Buffer (2 The cells were lysed with (double concentration) (first chemical). Next, the lysate 101 was electrophoresed on a 5-20% gradient SDS polyacrylamide gel, and Pall FluoroTrans W Membrane, Pall CorOoration) The protein was transcribed and subjected to Western blotting. In addition, Penta'His Antibody (QIAGEN) was used as the primary antibody, and HRP-labeled Egret anti-mouse immunoglobulin (DAKO) was used as the secondary antibody. Chemilmi was detected using an ECL detection reagent (Amersham-pharmacia). As a result, the expression of a protein of about 55 kDa was confirmed.
( 3 ) 発現ブラス ミ ド pM5002 の構築 (3) Construction of expression plasmid pM5002
MP493のセ リ ンプロテア一ゼ ドメ ィ ンを蛋白質と して得るため に、マウス I g kapp a鎖シグナルペプチ ドの C端側にェンテロキ ナ一セ S§識咅 |3位 ( enterokinase recognition site) が続き、 その 直後に MP493のセ リ ンプロテアーゼ ドメイ ン、 ミ ヅ クェピ ト一 プ （ myc epitope) 、 ヒスチジンタ グが続く キメ ラ蛋白質を発現 させるためのプラス ミ ド を以下の方法で構築した。 In order to obtain the serine protease domain of MP493 as a protein, enterokinase recognition site (enterokinase recognition site) is located at the C-terminal side of the mouse Ig kappa chain signal peptide at the C-terminal side. Immediately after that, a plasmid for expressing chimera protein followed by MP493 serine protease domain, myc epitope and histidine tag was constructed by the following method.
セ ン ス プラ イ マ一 4 ( 5 ' -CCA GAT ATA CGC GTT GAC ATT-3' )及びアンチセンス プライ マ一 4( 5， -CTT ATC GTC ATC GTC GTC ACC AGT GGA ACC TGG AAC-3' ) を設計し、 マウ ス Ig kappa鎖 V-J2-Cのシグナルぺプチ ドを持つ発現プラス ミ ド pSecTag2 A ( Invitrogen ) を 錶 型 に Pyrobest DNA Polymerase ( TaKaRa)によ り 98°Cで 10秒、 55°Cで 30秒、 72°C で 1 分のサイ クルを 30 回繰り返 し、 PCR 反応を行った。 また センスプライ マ一 5 ( 5' -ATC GTG GGT GGA AAC ATG Tecs' ) とアンチセ ンス ブラ イ マ一 5 ( 5， -CCG CTC GAG TTT TTA GGT CTC TCT-3' ) を設計 し、 オ リ ゴキヤ ッ プ法で作製した C-KAT00786 プラス ミ ド を錶型と して同様に PCR を行った。 得 られた PCR産物を MEGALABELキ ヅ ト （TaKaRa)を用いて 5， 末端を リ ン酸化した後に、 前者の PCR産物は Spe I で、 後者の PCR産物は Xho I で消化 し、 ァガロースゲル電気泳動にて共に 約 0.7kb の DNA 断片を回収した。 また、 pSecTag2 A を SpeSense primer 4 (5'-CCA GAT ATA CGC GTT GAC ATT-3 ') and antisense primer 4 (5, -CTT ATC GTC ATC GTC GTC ACC AGT GGA ACC TGG AAC-3') Using the expression plasmid pSecTag2A (Invitrogen), which has the mouse Ig kappa chain V-J2-C signal peptide, as a 錶 type with Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa) for 10 seconds at 98 ° C. The PCR reaction was repeated 30 times at 55 ° C for 30 seconds and at 1 minute at 72 ° C for 30 times. Also Sense primer 5 (5'-ATC GTG GGT GGA AAC ATG Tecs ') and antisense primer 5 (5, -CCG CTC GAG TTT TTA GGT CTC TCT-3') were designed and PCR was performed in the same manner using the C-KAT00786 plasmid prepared by the step method as the type III. After the resulting PCR product is ligated with MEGALABEL kit (TaKaRa) at the 5 'end, the former PCR product is digested with SpeI and the latter PCR product is digested with XhoI and subjected to agarose gel electrophoresis. In both cases, a DNA fragment of about 0.7 kb was recovered. In addition, pSecTag2 A
I 及び Xho I で消化 し、 ァガロースゲル電気泳動にて約 4.3kb の DNA断片をべクタ一と して回収した。このべクタ一断片と先 の 2 種の DNA 断片 と を定法 に従 っ て ラ イ ゲ一 シ ヨ ン しAfter digestion with I and XhoI, a DNA fragment of about 4.3 kb was recovered as a vector by agarose gel electrophoresis. This vector fragment and the two types of DNA fragments are subjected to a Lige-Section according to a standard method.
( three-way ligation) 、 JM109 コ ン ビテ ン ト細胞へ形質転換 した。 得られたコ ロニ一を PCRで解析を行い、 目的のプラス ミ ド pM5002 を得た。 (Three-way ligation), and transformed into JM109 combinant cells. The obtained colony was analyzed by PCR to obtain the desired plasmid pM5002.
( 4 ) COS-1 細胞を用いたセ リ ンプロテアーゼ ドメ イ ンの発 現および精製  (4) Expression and purification of serine protease domain using COS-1 cells
発現プラス ミ ド pM5002 を下記の方法で COS-1細胞に導入し、 蛋白質の発現を行った。  The expression plasmid pM5002 was introduced into COS-1 cells by the following method to express the protein.
FuGENE6 (ロシュ ' ダイ ァグノ スティ ヅ ク ス社） 50〃 1 を上 記プラス ミ ド DNA12.5 g と添付プロ ト コールに従い混合し、 150cm2 フ ラス コ にセ ミ コ ン フルェン ト に増殖した COS-1 細胞 に添加 した。 5% C02、 37°Cの条件下で 72 時間培養した後に、 培養上清を回収した。 回収 した培養上清は、 ぺプス夕チン、 口 ィ ぺブチン、 EDTA を 10 M となる よ う にそれぞれ添加 した PBS -に対して、 一昼夜透析を行った。 これを、 市販のニッケル カラム ProBondにて ヒスチジン夕グァフ ィ ニティ カラムクロマ ト グラ フ ィ 一を行っ た。 平衡化は、 20mM リ ン酸ノ ヅ フ ァー + 500mMNaCl pH7.8で十分に行い、 その後、 透析後の培養上清 をニッケルカラ ムにアプライ した。 多 く の培養上清中の蛋白質 は 素通 り し 、 十 分 に 洗 浄後 、 20mM リ ン 酸 バ ッ フ ァ ー + 500mMNaCl pH4.0 でグラ一ジェ ン ト溶出 した。 続いて溶出 画分 を 市販 の ェ ン テ ロ キ ナ ー ゼ ( Enterokinase Cleavage Caputure kit； Novagen社製） と 2 0 °Cで終夜反応させ、 活性 型と考え られる MP493セ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンを得た。同 サンプルは、 上記ァフ ィ 二ティ カラムに供 し、 素通 り した画分 を PBS ·に透析後、 濃縮し活性型 MP493 精製標品と した。 本標 品は銀染色にて、 分子量約 30Kの位置にバン ドを示 した。 FuGENE6 (Roche's Diagnostics) 50〃 1 up The plasmid DNA was mixed with 12.5 g of the above plasmid DNA according to the attached protocol, and added to COS-1 cells grown on a semiconfluent in a 150 cm 2 flask. After culturing for 72 hours under the conditions of 5% C0 2, 37 ° C , the culture supernatant was recovered. The collected culture supernatant was dialyzed all day and night against PBS-to which 10 μM of pepsin-tin, oral dibutin, and EDTA were added, respectively. This was subjected to histidine column chromatography on a commercially available nickel column ProBond. Equilibration was carried out sufficiently with 20 mM phosphate buffer + 500 mM NaCl pH 7.8, and the dialyzed culture supernatant was applied to a nickel column. Many of the proteins in the culture supernatant passed, and after thorough washing, they were eluted with 20 mM phosphoric acid buffer + 500 mM NaCl pH 4.0. Subsequently, the eluted fraction was reacted overnight with a commercially available enterokinase (Enterokinase Cleavage Capture kit; Novagen) at 20 ° C, and MP493 serine protease domain, which is considered to be an active form, was obtained. I got The same sample was applied to the above-mentioned affinity column, and the permeated fraction was dialyzed against PBS and concentrated to obtain a purified active MP493 sample. This sample showed a band at a molecular weight of about 30K by silver staining.
活性型 MP493 セ リ ンプロテア一ゼ ド メ イ ン精製標品から、 lOmM CaCl2， 130mM NaCl, 0.1% BSAを含む 20mM Tris-HCl 緩衝液 pH 7.5 に 0〜 1 g/ml濃度の最終標品を調製 し、 最終基 質濃度 4mM となる よ う に Bz-L-Arg-pNA·HCl( 3057，蛋白質研 究奨励会） を添加 した。 37°Cで 30-60 分、 反応を実施した後、 50% 酢酸で反応を停止後、 その基質特異性を OD405nmの吸収 で検討、 解析 した。 その結果、 本発明のセ リ ンプロテアーゼ ド メイ ンは ト リ プシン型の基質を効率よ く切断 した。 Activated MP493 serine proteinase domain lOmM CaCl 2, 130mM NaCl, 0.1 % final preparation of 0 to 1 g / ml concentration of 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 was prepared containing BSA, B in earthenware pots by a final group protein concentration 4 mM z -L -Arg-pNA · HCl (3057, Protein Research Council) was added. After performing the reaction at 37 ° C for 30-60 minutes, the reaction was stopped with 50% acetic acid, and the substrate specificity was examined and analyzed by the absorbance at OD405nm. As a result, the serine protease domain of the present invention efficiently cleaved the trypsin-type substrate.
実施例 4 大腸菌における MP493の発現  Example 4 Expression of MP493 in E. coli
( 1 ) 発現プラス ミ ド pM5003 の構築  (1) Construction of expression plasmid pM5003
大腸菌を宿主と した MP493 のセ リ ンプロテアーゼ ド メ イ ン分 泌発現プラス ミ ドを以下の方法で構築した。 An expression plasmid for serine protease domain secretion of MP493 using E. coli as a host was constructed by the following method.
センス プラ イ マ一 6 ( 5' -ACA GCT TAT CAT TGG GAG CTG- 3' ) とアンチセ ンス プライ マ一 6 ( 5， -TTT CCA CCC ACG ATC TTA TCA TCA TCA TCA CCC GAG CCT T-3' ) を用い、 pM781 (特 開 平 6-315386 ) を錶型 に Pyrobest DNA Polymerase ( aKaRa) によ り 98°Cで 10秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分の サイ クルを 30 回繰り 返し、 PCR 反応を行った。 また、 センス プラ イ マ一 7 ( 5， -AAG GCT CGG GTG ATG ATG ATG ATA AGA TCG TGG GTG GAA Α·3' ) とアンチセンスプライ マ一 7 (5' ■ATT TTA TTA GGA AAG GAC AGT GG-3' ) を用い、 pM5002 を銪型に同様に PCR反応を行った。 Sense primer 6 (5'-ACA GCT TAT CAT TGG GAG CTG-3 ') and antisense primer 6 (5, -TTT CCA CCC ACG ATC TTA TCA TCA TCA TCA CCC GAG CCT T-3') PM781 (Japanese Patent Laid-Open No. 6-315386) using Pyrobest DNA Polymerase (aKaRa) for 30 seconds at 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute. The PCR reaction was repeated several times. In addition, the sense primer 7 (5, -AAG GCT CGG GTG ATG ATG ATG ATA AGA TCG TGG GTG GAA Α · 3 ') and the antisense primer 7 (5' ■ Using ATT TTA TTA GGA AAG GAC AGT GG-3 '), PCR was carried out in the same manner as in pM5002 with type I.
得られた PCR産物をそれそれァガロースゲル電気泳動によ り 回収した後に、 これら断片の混合物を銪型と して、 センスブラ イ マ一 6 とアンチセンスプライ マー 8 (5' -CTA GAA GGC ACA GTC GAG GC-3' ) を用いてさ らに PCR反応を行った。 その後、 PCR産物をフエノール ： 、 ク ロ 口ホルム = 1 : 1 の混合液にて抽 出 し、 エタ ノ ール沈殿で DNA 断片を回収した。 MEGALABEL キ ッ ト （ TaKaRa) を用いて 5 ' 末端を リ ン酸化 した後に、 次に Hindlll にてこの DNA断片を消化 し、 ァガロースゲル電気泳動 にて約 l.Okb の DNA断片を回収した。 また、 pM781 を BamH I で消化後、 T4 DNA Polymerase ( TaKaRa) で末端を平滑化 した。 その後、 さ らに Hindlllで消化 し約 3.3kb の DNA断片を ァガロ ースゲル電気泳動にて回収し、 ベク タ一と した。 このべ ク タ一断片と先の DNA 断片を定法に従いライゲ一ショ ン し、 JM109 コ ン ビテン ト細胞を形質転換 した。 得られたコ ロ ニーを PCRで解析を行い、 目的のプラス ミ ド （pM5003) を得た。  After the obtained PCR products were collected by agarose gel electrophoresis, the mixture of these fragments was converted into type III, and the sense primer 16 and the antisense primer 8 (5'-CTA GAA GGC ACA GTC GAG Further PCR reaction was carried out using GC-3 '). Thereafter, the PCR product was extracted with a mixture of phenol: and black form = 1: 1, and the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation. After the 5 'end was phosphorylated using a MEGALABEL kit (TaKaRa), the DNA fragment was then digested with Hindlll, and a DNA fragment of about l.Okb was recovered by agarose gel electrophoresis. After digestion of pM781 with BamHI, the ends were blunt-ended with T4 DNA Polymerase (TaKaRa). Thereafter, the DNA fragment was further digested with Hindlll, and a DNA fragment of about 3.3 kb was recovered by agarose gel electrophoresis to obtain a vector. This vector fragment and the above DNA fragment were ligated according to a standard method, and JM109 competent cells were transformed. The obtained colony was analyzed by PCR to obtain the desired plasmid (pM5003).
( 2 )大腸菌での MP493セ リ ンプロテアーゼ ドメ イ ンの分泌、 発現 Hanaha の方法に従い ( Hanahan, D.著、 Techniques for Transformation of E. Coli、 In: DNA cloning, vol. 1, Glover, D. M. (ed.)， 109-136頁、 IRLPress、 1985年） 、 大腸菌 JE5505 を形質転換し、 JE5505(pM5003) を作製した。 この組換え株を 50〃 g/mlアンピシ リ ン含有 L-ブロース 5ml にて 37°Cで終夜培 養後、 アンピシ リ ン 50〃 g/ml及びカザミ ノ 酸 2 %を含む M9 C A 培地 50倍量に、 この培養液を植菌 し、 37°Cにて約 1 時間培養し た。 培地に終濃度 10 g/ml の 3 /5 ·イ ン ドールアク リル酸 （和 光純薬工業） を添加 し、 30°Cでさ ら に 18時間培養した。 得られ た培養混合物を遠心分離 し、 上清を回収した。 回収 した培養上 清は、 ぺプス夕チン、 ロイ ぺブチン、 EDTAを 10〃 M となる よ う にそれぞれ添加 した PBS ·に対して、 48hr 透析を行った。 透 析交換は、 1 日あた り 3 回実施した。 次に、 市販のニッケル力 ラム ProBondにて ヒスチジンタ グァフ ィ 二テ ィ カラ ムク ロマ ト グラ フ ィ ーを行っ た。 平衡化は、 20mM リ ン酸ノ ヅ フ ァ ー + 500mMNaCl pH7.8で十分に行い、 その後、 透析後の培養上清 をニヅケルカラムにアプライ した。 多 く の培養上清中の蛋白質 は、 素通 り し、 十分に 洗浄後、 20mM リ ン 酸バ ッ フ ァ 一 + 500mMNaCl pH4.0 でグラージェ ン ト溶出 した。 次に、 平衡 化バッ フ ァ一にて、 透析を一昼夜行い、 平衡化 したカラムに対 して、 リ ク 口 マ ト した。 溶出画分を市販のェンテ ロ キナーゼ ( Enterokinase Cleavage Caputure kit;Novagen社製)と 20 °C で終夜反応させ、活性型と考え られる MP493セ リ ンプロテア一 ゼ ドメ イ ンを得た。 同サンプルは、 上記ァフ ィ 二テ ィ カラムに 供し、 素通り した画分を PBS-に透析後、 濃縮し活性型 MP493 セ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ン精製標品と した。 本標品は銀染色 にて、分子量約 30Kの位置にノ ン ド を示 した。次に、 10mM CaCl2, 130mM NaCl, 0.1% BSAを含む 20mM Tris-HCl緩衝液 pH 7.5 に、 0〜 1 g/mlの濃度に最終標品を調製 し、 最終基質濃度 4mM となる よ う に Bz-L-Arg-pNA'HCl ( 3057，蛋白質研究奨励会） を 添加した。 37°Cで 30-60分反応を実施した後、 50% 酢酸で反応 を停止後、 その基質特異性を OD405nmの吸収で検討解析した。 その結果、 大腸菌内で発現されるセ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ン は、 ト リ プシン型の基質を効率よ く 切断 した。 (2) Secretion and expression of MP493 serine protease domain in E. coli Following the method of Hanaha (Hanahan, D., Techniques for Transformation of E. Coli, In: DNA cloning, vol. 1, Glover, DM (ed.), Pp. 109-136, IRLPress, 1985), E. coli JE5505 was After transformation, JE5505 (pM5003) was prepared. After culturing this recombinant strain at 37 ° C overnight in 5 ml of L-broth containing 50 μg / ml ampicillin, the M9 CA medium containing 50 μg / ml ampicillin and 2% casamino acid 50 times This culture solution was inoculated to the amount and cultured at 37 ° C for about 1 hour. The culture medium was supplemented with 3/5 · indoleacrylic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a final concentration of 10 g / ml, and cultured at 30 ° C for an additional 18 hours. The obtained culture mixture was centrifuged, and the supernatant was recovered. The collected culture supernatant was dialyzed for 48 hours against PBS containing 10 μM of pepsin, leuptin, and EDTA, respectively. The exchange was performed three times a day. Next, histidine gel column chromatography was performed on a commercial nickel-produced ProBond. Equilibration was carried out sufficiently with 20 mM phosphate buffer + 500 mM NaCl pH 7.8, and then the dialyzed culture supernatant was applied to a nickel column. Many of the proteins in the culture supernatant were passed through, washed thoroughly, and then eluted with 20 mM phosphate buffer + 500 mM NaCl pH 4.0. Next, balance The dialysis was performed overnight in a chemical buffer, and the liquid was added to the equilibrated column. The eluted fraction was reacted overnight with a commercially available enterokinase (Enterokinase Cleavage Capture kit; manufactured by Novagen) at 20 ° C to obtain MP493 serine protease domain considered to be an active form. The same sample was applied to the above-mentioned affinity column, and the passed fraction was dialyzed into PBS-, concentrated and concentrated to obtain a purified active MP493 serine proteinase domain. This sample showed a silver stain at a position with a molecular weight of about 30K. Next, prepare a final sample in 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 containing 10 mM CaCl 2 , 130 mM NaCl, and 0.1% BSA to a concentration of 0 to 1 g / ml so that the final substrate concentration is 4 mM. Bz-L-Arg-pNA'HCl (3057, Protein Research Council) was added. After performing the reaction at 37 ° C for 30-60 minutes, the reaction was stopped with 50% acetic acid, and the substrate specificity was analyzed by OD405nm absorption analysis. As a result, the serine protease domain expressed in Escherichia coli efficiently cleaved the trypsin-type substrate.
( 3 ) 大腸菌発現プラ ス ミ ド pM5004の構築  (3) Construction of E. coli expression plasmid pM5004
大腸菌を宿主と して、 MP493のセ リ ンブ口テア一ゼ ドメ イ ンを 細胞内で発現させる発現プラス ミ ド を以下の方法で構築した。 Using Escherichia coli as a host, an expression plasmid for expressing the cell domain of MP493 in the cell was prepared by the following method.
センス プラ イ マ一 6 とアンチセ ンスプライ マ一 9 ( 5， -ACG ATC TTA TCG TCA TCG TCC ATT TTA TTT TAT ACC CTT T-3 ' ) を用い、 pM781 を铸型に Pyrobest DNA PolymeraseSense primer 6 and anti-sense primer 9 (5, -ACG Pyrobest DNA Polymerase using ATC TTA TCG TCA TCG TCC ATT TTA TTT TAT ACC CTT T-3 ')
( TaKaRa) によ り 98°Cで 10秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1 分の サイ クルを 30 回繰り返し、 PCR 反応を行った。 また、 セ ンス プライ マ一 8 ( 5' -AAA GGG TAT AAA ATA AAA TGG ACG ATG ACG ATA AGA TCG T-3' ) とアンチセンスプライ マ一 7 を用い- PM5002 を錄型に同様に PCR反応を行つた。得られた PCR産物 をァガロースゲル電気泳動によ り 回収した後に、 これら断片の 混合物を铸型と して、 センスブライ マー 6 とアンチセンスブラ イ マ一 8 を用いてさ らに PCR反応を行った。その後 PCR産物を フ エノ ール ： クロ 口ホルム = 1 : 1 の混合液にて抽出 し、 ェ夕 ノ —ル 沈殿で DNA 断片 を 回収 し た 。 MEGALABEL キ ヅ ト(TaKaRa) was repeated 30 times at 98 ° C for 10 seconds, at 55 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 1 minute, and the PCR reaction was performed 30 times. In addition, PCR was performed using sense primer 8 (5'-AAA GGG TAT AAA ATA AAA TGG ACG ATG ACG ATA AGA TCG T-3 ') and antisense primer 7 with- I went. After the obtained PCR product was recovered by agarose gel electrophoresis, a mixture of these fragments was used as type I, and a PCR reaction was further performed using sense primer 6 and antisense primer 18. . Thereafter, the PCR product was extracted with a mixture of phenol: cloth form = 1: 1, and the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation. MEGALABEL kit
(TaKaRa)を用いて 5，末端を リ ン酸化した後に、次に Hindlll にてこの DNA断片を消化 し、約 0.9kb の DNA断片を回収 した。 ま た ヽ pM781 を BamH I で 消ィ匕後、 T4 DNA PolymeraseAfter phosphorylation of the 5 'end with (TaKaRa), this DNA fragment was digested with Hindlll, and a DNA fragment of about 0.9 kb was recovered.消 After erasing pM781 with BamHI, T4 DNA Polymerase
( TaKaRa) で末端を平滑化 した。 その後、 さ ら に Hindlll で消 ィ匕 し約 3.3kbの DNA断片をァガロースゲル電気泳動にて回収し- ベク タ一と した。このべク タ一断片と先の DNA断片を定法に従 いライ ゲ一シヨ ン し、 JM109 コ ン ビテン ト細胞を形質転換した , 得 ら れ た コ ロ ニ 一 を PCR で 解析 し 、 目 的 の プ ラ ス ミ ド (PM5004) を持つ形質転換株 （ JM109(pM5004)) を得た。 The ends were blunted with (TaKaRa). Thereafter, the DNA fragment was further digested with Hindlll, and a DNA fragment of about 3.3 kb was recovered by agarose gel electrophoresis to obtain a vector. This vector fragment and the preceding DNA fragment were ligated according to a standard method to transform JM109 competent cells. The resulting et child B two one analyzed by PCR, to obtain a transformant strain having the purpose of flops la scan mi de (P M5004) (JM109 (pM5004 )).
( 4 ) 大腸菌（細胞内）での発現  (4) Expression in E. coli (intracellular)
組換え株 JM109(p M5004)を 50 i g/ml アンピシ リ ン含有 L- ブロース 5ml にて 37°Cで終夜培養後、 ア ン ピシ リ ン 50〃 g/ml 含有 L-ブロース 50倍量に、 この培養液を植菌し、 37°Cにて約 1 時間培養した。 培地に終濃度 10 /ml の 3 ? -イ ン ド一ルァク リル酸 （和光純薬工業） を添加 し、 30°Cでさ らに 18時間培養 し た。 得 られた培養混合物を遠心分離し、 大腸菌を集菌した。 集 菌した大腸菌は、 ぺプス夕チン、 ロイぺプチン、 EDTAを 10〃 M となる よ う にそれぞれ添加した PBS ·に対して懸濁後、超音波 処理による菌体破碎を実施し、 可溶性画分、 不溶性画分に遠心 分離に よって分けた。 その後、 凝集体 （ inclusion body) の可 溶化を 20mM リ ン酸ノ ヅ フ ァ一 +500mMNaCl+8M 尿素 pH7.8 を用いて実施した。 次に、 市販のニ ヅケルカラム ProBondにて ヒスチジンタ グァフ ィ 二ティ カラ ムク ロマ ト グラ フ ィ ーを行つ た。 平衡ィ匕は、 20mM リ ン酸ノ ヅ フ ァー +500mM NaCl + 8M 尿 素、 pH7.8 で十分に行い、 その後、 凝集体を可溶化 した上記サ ンプルをニ ッ ケルカラムにアプライ した。 多 く の培養上 ¾中の 蛋白質は素通 り し、 十分に洗浄後、 20mM リ ン酸バ ッ フ ァ一 + 500mMNaCl +8M 尿素 pH4.0 でグラージェ ン ト 溶出 した。 SDS-PAGE にて、 混入蛋白質のない画分を選別 し、 20mM リ ン 酸ノ ヅ フ ァ ー +500mMNaCl +8M 尿素 pH7.8 で 0.2mg/mlAfter culturing the recombinant strain JM109 (pM5004) in 5 ml of L-broth containing 50 ig / ml ampicillin at 37 ° C overnight, to 50 times the volume of L-broth containing 50 μg / ml ampicillin, This culture was inoculated and cultured at 37 ° C for about 1 hour. The medium was supplemented with 10-ml final concentration of 3 -indoleacrylic acid (Wako Pure Chemical Industries) and incubated at 30 ° C for an additional 18 hours. The resulting culture mixture was centrifuged to collect E. coli. The collected Escherichia coli was suspended in PBS supplemented with 10 μM of peptide, leptin, and EDTA, and then disrupted by ultrasonication to dissolve the soluble fraction. And the insoluble fraction were separated by centrifugation. After that, the solubilization of the inclusion bodies was performed using 20 mM phosphoric acid phosphate + 500 mM NaCl + 8 M urea pH 7.8. Next, histidine tag chromatography was performed on a commercially available nickel column ProBond. The equilibrium was sufficiently performed with 20 mM phosphoric acid phosphate + 500 mM NaCl + 8 M urine, pH 7.8, and then the sample in which the aggregate was solubilized was applied to a nickel column. Many cultures The protein passed through, and after thorough washing, gradient eluted with 20 mM phosphate buffer + 500 mM NaCl + 8 M urea pH 4.0. Fractions free from contaminating proteins were selected by SDS-PAGE, and 0.2 mg / ml with 20 mM phosphoric acid buffer + 500 mM NaCl + 8 M urea pH 7.8
(OD280 換算 ODl = lmg/ml) となる よう に調製 した。 次に、 10倍量の外液バ ッ フ ァ一 （ 50mM Tris-HCL、 0.5M NaClヽ 0.5M LiCl、 5mM EDTA、 O.lmM GSSG, ImMGSSH, pH8.0) に対し て終夜透析を行い、 ついで半量づっ 1 日 3 回交換する という作 業を 2 日間実施した。 最終透析倍率 640倍 PBS- 100倍量に対 して透析、 遠心後、 フ ィ ル ト レ一シ ヨ ンを実施した。 こ の標品 を、巿販のェ ンテ口 キナ fe ( Enterokinase Cleavage Caputure kit ; Novagen 社製） と 20°Cで終夜反応させ、 活性型と考え ら れる MP493セ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンを得た。同サンプルを 上記ァフ ィ 二ティ カラムに 8 M 尿素を除いた buffer 条件下で 供 し、 素通 り した画分を PBS-に透析後、 濃縮し、 活性型 MP493 セ リ ン プロテアーゼ ドメ ィ ン精製標品と した。 本標品は銀染色 にて、 分子量約 30K の位置にノ ン ド を示 した。 大量の MP493 調製に適した精製系であつた。次に、 lOmM CaCl2) 130mM NaCl, 0.1% BSA を含む 20mM Tris-HCl 緩衝液 DH 7.5 に、 0〜： 1〃 g/ml の濃度に最終標品を調製し、 最終基質濃度 4mM となるよ う に Bz-L-Arg-pNA'HCl ( 3057，蛋白質研究奨励会） を添加した c 37°Cで 30-60分反応を実施した後、 50% 酢酸で反応を停止後、 その基質特異性を OD405nmの吸収で検討解析 した。 その結果、 リ フ ォルディ ングさせた MP493 は ト リ プシ ン型の基質を効率 よ く切断した。 (ODl in terms of OD280 = lmg / ml). Next, dialysis was performed overnight against a 10-fold amount of an external buffer (50 mM Tris-HCL, 0.5 M NaClM0.5 M LiCl, 5 mM EDTA, O.lmM GSSG, ImMGSSH, pH 8.0). Then, the work of replacing half the amount three times a day was carried out for two days. The final dialysis ratio was dialyzed against 640-fold PBS-100 volume, centrifuged, and then filtration was performed. This sample is reacted overnight at 20 ° C with a commercially available enterokinase cleavage capture kit (Novagen) to obtain MP493 serine proteinase domain, which is considered to be the active form. Was. The sample was applied to the above affinity column under the buffer conditions except for 8 M urea, and the permeated fraction was dialyzed against PBS-, concentrated, and activated MP493 serine protease domain. It was a purified sample. This sample showed a silver stain at a position with a molecular weight of about 30K. This purification system was suitable for preparing large quantities of MP493. Next, lOmM CaCl 2) In 20 mM Tris-HCl buffer DH7.5 containing 130 mM NaCl, 0.1% BSA, 0 ~: 1〃 The final preparation adjusted to a concentration of g / ml, final substrate concentration 4mM become by power sale to Bz-L-Arg-pNA'HCl ( 3057, Protein Research Foundation) in c 37 ° C with the addition of 30-60 After performing the reaction, the reaction was stopped with 50% acetic acid, and the substrate specificity was analyzed by OD405nm absorption analysis. As a result, the reshaped MP493 efficiently cleaved the trypsin-type substrate.
実施例 5 実験に よ る ス ク リ ーニ ング系の確立 と基質特異 性 · 阻害スぺク ト ラム測定  Example 5 Establishment of screening system by experiment and measurement of substrate specificity and inhibition spectrum
組換え体と して調製した MP493 セ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンの阻害剤スぺク ト ラ ム を検討 した。 10mM CaCl2， 130mM NaCl, 0.1% BSA を含む 20mM Tris-HCl 緩衝液 pH 7.5 にて、 0〜 1〃 g/ ml の濃度に調製した。 この際、 プロテア一ゼ阻害剤 と して知られる E-64、 ロイぺプチン、 EDTA、 ぺブス夕チン、 PMSF を 1 M となる よう にノ ' ヅ フ ァ一中に溶解した。 次に最 終基質濃度 4mM となる よう に Bz-L-Arg-pNA'HCl( 3057， 白 質研究奨励会） を調製し、 37°Cで 30-60分反応を実施した。 50% 酢酸で反応を停止後、 その基質特異性を OD405nm の吸収で検 討、 解析した。 We investigated the spectrum of the recombinant MP493 serine proteinase domain inhibitor. A 20 mM Tris-HCl buffer solution containing 10 mM CaCl 2 , 130 mM NaCl, and 0.1% BSA was adjusted to pH 7.5 to a concentration of 0 to 1 μg / ml. At this time, E-64, leptin, EDTA, ubusutin, and PMSF, which are known as protease inhibitors, were dissolved in methanol so as to be 1M. Next, Bz-L-Arg-pNA'HCl (3057, the Society for the Promotion of White Matter Research) was prepared so that the final substrate concentration was 4 mM, and the reaction was carried out at 37 ° C for 30-60 minutes. After stopping the reaction with 50% acetic acid, the substrate specificity was examined and analyzed by OD405nm absorption.
その結果、 阻害剤を含まない試料の OD405nm 吸収に比較し て、 MP493セ リ ンプロテアーゼ ドメ イ ンは明らかにセ リ ンプロ テアーゼの阻害剤である PMSF によ ってその水解活性が強 く 阻 害された。 これによ り、 MP493 は、 その一次配列および立体構 造か ら予測された結果どお り にセ リ ンプロテアーゼの機能を有 する こ とが確認された。 As a result, compared to the OD405nm absorbance of the sample without inhibitor Thus, the hydrolytic activity of MP493 serine protease domain was clearly inhibited by PMSF, a serine proteinase inhibitor. This confirmed that MP493 has a serine protease function as predicted from its primary sequence and tertiary structure.
次に、 組換え体と して製造、 精製した MP493セ リ ンプロテア —ゼ ド メイ ンを 10mM CaCl2, 130mM NaCl, 0.1% BSAを含む 20mM Tris-HCl 緩衝液 pH 7.5 にて、 0〜 1〃 g/ mlの濃度に調 製した。 次に最終基質濃度 4mM となるよ う に、 ヒ ト喀痰由来 エ ラ ス夕一ゼ （SE563,Elastin Products) が切断する基質と し て MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-Pna.0.7H2O ( SP-04- 14101 A,コスモ ハ、、ィォ） を、 またヒ ト ' フ ァ クター X a ( Iンサ、 ム · リサ—チ） が切 断する基質と して S-2222 (第一化学薬品） を、 ヒ ト ' ト ロ ン ビン （ T-6759，SIGUMA) が切断する基質と しては S'2238 (第 一化学薬品） を、 更に ト リ プシンの基質と して Bz-L-Arg-ρΝΑ· HC1 ( 3057,蛋白質研究奨励会） を、 ブ夕脬エ ラ ス 夕 ーゼ （ E- 1250SIGUMA ) が 切 断 す る 基 質 と し て Sue- Ala-Ala'Ala' pNA(3071,ぺプチ ド研）を、 キモ ト リ ブシンが切断する基質と し て Bz-TyrpNA (ペプチ ド研） を、 カ リ ク レイ ンが切断する基 質と して S-2302 (第一化学薬品） を、 プラス ミ ンが切断する基 質と して S-2251 (第一化学薬品） をそれそれ調製 し、 MP493 セ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンを添加後 37°Cで 30-60分反応を実 施した。 50% 酢酸で反応を停止後、その基質特異性を OD405nm の吸収で検討解析 したと こ ろ、 ト リ ブシンの基質を も っ とも迅 速確実に切断する こ とが判明した。 一方で、 ブ夕脬エラ ス夕一 ゼ （ E-1250SIGUMA) が切断する基質 Suc-Ala-Ala'Ala-pNAに 対しては切断活性が弱かった。この結果は MP493 の予測立体構 造から推測される基質特異性と全く 同 じであ り 、 合成基質に関 しては ト リ プシンが好んで切断する P 1 部位に塩基性のアミ ノ 酸残基を特に有する基質を好んで切断する傾向がある こ とを示 している。 すなわち、 MP493 は、 膜結合型の新規の ト リ プシン 型セ リ ンプロテア一ゼである こ とが、 実験的に証明された。 Next, the recombinant MP493 serine protein-zedomin, which was produced and purified as a recombinant, was mixed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 10 mM CaCl 2 , 130 mM NaCl, and 0.1% BSA at 0 to 1 μl. It was prepared to a concentration of g / ml. Next, MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-Pna.0.7H2O (EOS) was used as a substrate to be cleaved by human sputum-derived elasase (SE563, Elastin Products) so that the final substrate concentration was 4 mM. SP-04-14101 A, Cosmoha, Io) and S-2222 (Daiichi Kagaku) as substrates for cleavage by human factor Xa (Insa, Mu-Resarch) Drug), S'2238 (first chemical) as a substrate cleaved by human thrombin (T-6759, SIGUMA), and Bz-L- as a substrate for trypsin. Arg-ρΝΑ · HC1 (3057, Protein Research Initiative) is used as a base for Sue-Ala-Ala'Ala 'pNA (3071) as a substrate to be cut off by Buera Erasase (E-1250SIGUMA). , Peptide labs) as a substrate for cleavage by chymotrypsin, and a group that cleaves Bz-TyrpNA (peptide labs) S-2302 (Daiichi Kagaku) as a substrate and S-2251 (Daiichi Kagaku) as a substrate to be cleaved by plasmin. After the addition of, the reaction was carried out at 37 ° C for 30-60 minutes. After terminating the reaction with 50% acetic acid, the substrate specificity was examined and analyzed by absorption at OD 405 nm. As a result, it was found that the substrate of tribsine was cleaved at the earliest time. On the other hand, the cleavage activity was weak for the substrate Suc-Ala-Ala'Ala-pNA, which is cleaved by Escherichia coli (E-1250SIGUMA). This result is exactly the same as the substrate specificity deduced from the predicted three-dimensional structure of MP493, and the basic amino acid residue at the P1 site, which is preferentially cleaved by trypsin, for synthetic substrates. This indicates that it has a tendency to cleave in favor of substrates having particular groups. That is, MP493 was experimentally proved to be a novel membrane-bound trypsin-type serine protease.
実施例 6 化合物の MP493 に対する活性調節作用の評価方 法  Example 6 Method for evaluating the activity of compound to modulate activity on MP493
( 1 ) MP493 のセ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンの空間座標化 MP493の 217番〜 453番のアミ ノ酸残基に相当する配列情報 を下に、全自動モデ リ ングシステム FAMS ( Ogata, K. et. al., J. Mol. Graph. Model., Vol.18, pp.258-272 (2000)) を用いて、 MP493セ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ン のモデル構造を空間座標と して構築した。 このとき、 FAMS が主鎖構造の構築に用いる立 体構造デ一夕 べ一ス と して、 Brookhaven Protein Database (PDB) ( H. M. Berman, et. al., Nucleic Acids Research, Vol.28, pp.235-242 (2000), http://www.rcsb.or /pdb/) の 2000年 8月 31日 リ リ ースから Webでの Culled PDB Listsサ一ビス（Roland L. Dunbrack, dr. et. al. , http：〃 www. iccc.edu/Research/labs/ dunbrack/culle dpdb.html) を利用 して、 1)50 アミ ノ酸残基以 上、 2)解像度 8A以下、 3)NMR構造を含む、 4)Cひのみの構造を 含まない、 の条件で 90%以上の相同配列をクラス夕 リ ング し、 配列冗長性を除いたデ一夕セ ッ ト （ 3703構造） を作成して使用 した。 また、 側鎖構造の構築に用い るデ一夕べ一スは、 FAMS オ リ ジナルのものを使用 した。 この結果、 配列番号 2 に示すァ ミ ノ酸配列の 217〜443 番目のアミ ノ酸残基部分の空間座標を 得た。 (1) Spatial coordination of serine protease domain of MP493 The sequence information corresponding to amino acid residues 217 to 453 of MP493 is shown below, and the fully automatic modeling system FAMS (Ogata, K et.al., J. Mol. Graph.Model., Vol. 18, pp. 258-272 (2000)) A model structure of the MP493 serine protease domain was constructed as spatial coordinates. At this time, the FAMS used the Brookhaven Protein Database (PDB) (HM Berman, et.al., Nucleic Acids Research, Vol. 28, pp. 235-242 (2000), http: //www.rcsb.or/pdb/), released from the August 31, 2000 release of the Culled PDB Lists service on the Web (Roland L. Dunbrack, dr. Et. al., http: 〃www.iccc.edu / Research / labs / dunbrack / culle dpdb.html), 1) 50 amino acid residues or more, 2) Resolution 8A or less, 3) NMR structure Under the conditions of (4) not containing the structure of C-only, a homozygous sequence of 90% or more is class-ligated, and a data set (3703 structure) is created without sequence redundancy. used. The FAMS original was used for the construction of the side chain structure overnight. As a result, the spatial coordinates of the amino acid residues at positions 217 to 443 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 were obtained.
得られた空間座標を第 9 図に示す。  Figure 9 shows the obtained spatial coordinates.
モデル構造の空間座標を決定した後、 さ らに分子設計支援ソ フ ト ウ ェアノ S ヅ ケ一ジ Insightll ( Accelrys Inc., Sandiego, CA) のモジュールである Profiles -3D 等の蛋白質立体構造評価 プログラムを用いて、 構築された座標に理論上の問題がないこ とを検証した。 このモデル構造を第 4 図に示す。 After determining the spatial coordinates of the model structure, further evaluate the protein three-dimensional structure such as Profiles-3D, which is a module of Insightll (Accelrys Inc., Sandiego, CA), a molecular design support software. The program was used to verify that the constructed coordinates had no theoretical problems. Figure 4 shows the model structure.
( 2 ) MP493セ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンモデル構造の解析 TMPRSS2 のセ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンのモデル構造を（1) の方法に則 り構築した後、 MP493 のセ リ ンプロテア一ゼ ドメ イ ンの構造と比較した。 また、 MP493 の活性中心近傍の残基は ト リ ブシンと相同性が高いため、 PDB に登録されている ヒ ト ト リ プシン （ PDB コ 一 ド ： 1TRN) と MP493 モデル構造との比較を 行った。  (2) Analysis of the MP493 serine protein domain model structure After constructing the model structure of the TMPRSS2 serine protein domain according to the method (1), the MP493 serine protein domain model was constructed. Compared with the structure of the Since the residues near the active center of MP493 are highly homologous to trypsin, we compared human trypsin (PDB code: 1TRN) registered in the PDB with the MP493 model structure. .
MP493 と、 TMPRSS2 及び ト リ プシン構造との重ね合わせを Insightll の Homology モ ジ ュ ール を 使用 し て行 っ た後 、 Insightll を使用 してその構造を観察した。 その結果、 S1 ポケ ヅ ト構造は全ての構造で良 く 一致していたが、 S2ポケ ヅ ト と S4 ポケ ヅ ト を形成している 301 番目のアミ ノ酸残基 （キモ ト リ ブ シン番号で 99番残基） が、 TMPRSS2 では Lys ( ト リ プシンで は Leu) であるのに対して MP493 では Leuであった。 また S4 ポケ ヅ ト を形成している 300番、 378番、 420番目のアミ ノ酸残 基 （キモ ト リ ブシン番号で 98 番、 175 番、 215 番残基） が、 TMPRSS2では Thr、 Leu, Trp ( ト リ プシンでは Thr、 Lysヽ Trp) であるのに対して MP493では Agr、 Ile、 P e であった。 After superimposing MP493 with TMPRSS2 and trypsin structure using Insight's Homology module, the structure was observed using Insightll. As a result, the S1 pocket structure was in good agreement with all structures, but the amino acid residue at position 301 (the chymotrypsin number) forming the S2 and S4 pockets. The residue at position 99) was Lys in TMPRSS2 (Leu for trypsin), whereas it was Leu in MP493. The amino acid residues at positions 300, 378, and 420 (residues at positions 98, 175, and 215 in chymotrypsin) forming the S4 pocket, and Thr, Leu, Trp (Thrips for trypsin, Lys ヽ Trp) On the other hand, Agr, Ile, and Pe for MP493.
( 3 ) 化合物の評価  (3) Evaluation of compounds
化合物デ一夕は、 Available Chemicals Directory (ACD) ノ 一 ジ ョ ン 1999.2 (MDL information systems, Inc., San Leandro, CA)に登録されている化合物を使用 した。  For the compound data, compounds registered in Available Chemicals Directory (ACD) No. 1999.2 (MDL information systems, Inc., San Leandro, CA) were used.
セ リ ンプロテア一ゼ阻害剤 との複合体結晶構造 （ PDB コ一 ド ： 1EKB, 1A0L, IGCT, IBRU, 1A0J, 2TBS, IFXY, 1DAN) を 参考に し、 M P 493 の阻害剤の標的結合サイ ト を構築するア ミ ノ 酸残基を推定 した。 該当する残基は、 257(His), 30l(Leu), 304(Asp), 378(Ile), 386(Ala), 387(Gly), 394(Asp), 395(Ser), 396(Cys), 397(Gln), 398(Gly), 399(Asp), 400(Ser), 418(Thr), 419(Ser)， 420(Phe), 42l(Gly), 422(Ile), 423(Gly), 424(Cys), 429(Lys), 430(Pro), 43l(Gly), 432(Val), 433(Tyr)番であ った。 分子 ド ヅキングパ ッケージ DOCKバ一ジョ ン 4.0.1 を用いてマ ニュアルに従い、 パ一チャルスク リ ーニングを実施した。 この と き、 DOCK の flexible search 機能を使用 し、 energy grid を使用 して、 最もスコアの高いコ ンホメ一シヨ ン と結合様式の 組み合わせをその化合物の結合様式と した。  The target binding site of the MP 493 inhibitor was determined by referring to the crystal structure of the complex with the serine protease inhibitor (PDB code: 1EKB, 1A0L, IGCT, IBRU, 1A0J, 2TBS, IFXY, 1DAN). The amino acid residue that constructs was estimated. The corresponding residues are 257 (His), 30l (Leu), 304 (Asp), 378 (Ile), 386 (Ala), 387 (Gly), 394 (Asp), 395 (Ser), 396 (Cys) , 397 (Gln), 398 (Gly), 399 (Asp), 400 (Ser), 418 (Thr), 419 (Ser), 420 (Phe), 42l (Gly), 422 (Ile), 423 (Gly) , 424 (Cys), 429 (Lys), 430 (Pro), 43l (Gly), 432 (Val) and 433 (Tyr). Using the molecular docking package DOCK version 4.0.1, partial screening was performed according to the manual. At this time, using the flexible search function of DOCK and the energy grid, the combination of the conformation and the binding mode with the highest score was determined as the binding mode of the compound.
ド ッキング終了後、 Insightll を用いて、 スコ ア上位 2000化 合物の中か ら、 我々が予め標的結合サイ ト と推測 した部位に形 状相補性が良好な状態で結合している 237化合物を抽出 した後. 適当と考え られた 30化合物の MP493酵素阻害活性を実施例 5 に示した手法を用いて測定 した。 この結果、 4化合物に MP493 酵素阻害活性が認め られた。 同様の手法によ り 、 他の化合物デ —夕べ一ス か ら も MP493阻害活性を示す 26化合物を得た。 After docking, use Insightll to make the top 2000 score After extracting 237 compounds from the compounds that had good shape complementarity at the site that we presumed to be the target binding site in advance. MP493 enzyme inhibition of 30 compounds considered appropriate The activity was measured using the method described in Example 5. As a result, four compounds showed MP493 enzyme inhibitory activity. In a similar manner, 26 compounds having MP493 inhibitory activity were obtained from other compounds.
実施例 7 MP493阻害物質の 3次元薬理作用団の特定と これ を用いたス ク リ一ニング  Example 7 Identification of 3D pharmacophore of MP493 inhibitor and screening using this
( 1 ) 3次元薬理作用団の特定  (1) Identification of 3D pharmacological agents
Daylight ク ラ ス 夕 リ ン グパ ッ ケ ー ジ Λ — ジ ョ ン 4.51 の Jarvis-Patrick Clustering 法を使用 し、 実施例 6 で MP493 阻 害活性を示 した化合物を用いて非階層型クラス夕 リ ングを行い、 3 つのクラス夕一と 7 つのシ ングル ト ンに分類 した。 得られた 3 クラス夕一において最も MP493 阻害活性が強い化合物をク ラ ス 夕 一の代表化合物 と し 、 各 ク ラ ス 夕 一 の代表化合物 と MP493の結合様式を、 DOCKを用いたフ レ キシ ブル ド ヅキング によ り探索 した。 評価グリ ッ ドは energy grid を使用 した。 そ の後、 各化合物の最もスコアの高い結合様式を初期構造と して、 Discover ( Accelrys Inc., San Diego, CA) を用いた分子力学計 算による構造最適化を MP493構造をフ ィ ク ス （ Fix) して行い、 MP493 と代表化合物の複合体モデル構造を得た。 Daylight class evening ring package Λ Using the Jarvis-Patrick Clustering method described in Section 4.51, using the compound that showed MP493 inhibitory activity in Example 6, the non-hierarchical class evening package was used. The class was divided into three classes, one evening and seven singletons. The compound with the strongest MP493 inhibitory activity in the three classes was determined as the representative compound of class 1, and the binding mode of the representative compound of class 1 and MP493 was determined using a flexible method using DOCK. Searched by birding. The evaluation grid used was an energy grid. Then, the binding mode with the highest score for each compound was used as the initial structure, and a molecular mechanics instrument using Discover (Accelrys Inc., San Diego, CA) was used. The structure was optimized by calculation and the MP493 structure was fixed, and a complex model structure of MP493 and a representative compound was obtained.
次に、 ク ラス夕一ごとに、 代表化合物は上記で得 られた複合 体モデル構造の結合コ ンホメ一シ ョ ンを用い、 代表以外の化合 物は Catalyst リ リ ース 4.5 ( Accelrys Inc., San Diego, CA) の CatConf を使用 して Best法によ り 最大 255コ ンホメ 一シヨ ンを 発生させた後、 Catalystの HipHop を使用 し、 常法によ り ク ラ スター内の全ての化合物に共通して存在する薬理作用団を抽出 した。  Next, every class, the representative compound uses the binding conformation of the complex model structure obtained above, and the compounds other than the representative are Catalyst Release 4.5 (Accelrys Inc., After generating up to 255 conformations using the Best method using CatConf from San Diego, CA), all compounds in the cluster were routinely generated using HipHop from Catalyst. Common pharmacophores were extracted.
さ ら に、 各クラス夕一の薬理作用団を、 そのクラス夕一の代 表化合物と MP493複合体モデル構造に重ね合わせて、全てのク ラ ス夕一の薬理作用面を MP493構造にマ ヅ ピングした。  In addition, the pharmacological agent of each class is superimposed on the model structure of the MP493 complex with the representative compound of that class, and the pharmacological action surface of all the classes is mapped to the MP493 structure. I pinged.
( 2 ) 薬理作用団を使用 したス ク リ ーニング  (2) Screening using pharmacological agents
Catalystの CatSearchを使用 し、 表 1 か ら表 3 に示 した全ての 特性球の内、 3 つ以上の点を同時に満たす化合物を ACD化合物 から検索した。 得られた化合物は、 （ 1 ) に示した方法に則つ てクラス夕 リ ングを行い、 2 0化合物の MP493阻害活性を実施 例 5 に示した手法を用いて測定 した と こ ろ、 8化合物が 10 g/mLの濃度で 50%以上の阻害を示 した。 また、 実施例 6 における DOCKを用いたパーチヤルスク リ 一 ニングで ド ッキング状態が良好だった化合物を対象に、 表 1 か ら表 3 に示 した全ての特性球の内、 3 つ以上の点を同時に満た す化合物を抽出 した。 得られた化合物は、 Daylight クラス夕 リ ン グ パ ヅ ケ 一 ジ ノ 一 ジ ョ ン 4.51 ( Daylight Chemical Information Systems, Inc., Mission Viejo, C A) の Hierachical Aggiomerr ative Custering Package ノ 一 ジ ョ ン 5.0 (Barnard Chemical Information Ltd., Sheffield, UK) を使用 して階層型 クラス夕 リ ン グに よ り 20 クラス夕一に分類 した後、各クラス夕 —のセン ト ロイ ド に対応する 20化合物の MP493 阻害活性を測 定したとこ ろ、 1 3化合物が 10^ /mLの濃度で 50%以上の阻害 を示 した。 Using Catalyst's CatSearch, ACD compounds were searched for compounds that simultaneously satisfied three or more points from all the characteristic spheres shown in Tables 1 to 3. The obtained compounds were subjected to class ring according to the method described in (1), and the MP493 inhibitory activity of the 20 compounds was measured using the method described in Example 5. Showed more than 50% inhibition at a concentration of 10 g / mL. In addition, for a compound having a good docking state in the partial screening using DOCK in Example 6, three or more points of all the characteristic spheres shown in Tables 1 to 3 were simultaneously measured. Satisfactory compounds were extracted. The compound obtained was obtained from the Hierachical Aggiomerrative Custering Package No. 5.0 (Daylight Chemical Information Systems, Inc., Mission Viejo, Calif.) In the Daylight Class Night Ring Package No. 4.51 (Daylight Chemical Information Systems, Inc., Mission Viejo, CA). Using Barnard Chemical Information Ltd., Sheffield, UK), the MP493 inhibition of 20 compounds corresponding to the centroid of each class after classifying into 20 classes by the hierarchical class setting When the activity was measured, 13 compounds showed more than 50% inhibition at a concentration of 10 ^ / mL.
試験例 MP493活性調節剤の薬学的効果の評価方法  Test example Evaluation method of pharmacological effect of MP493 activity modulator
癌細胞浸潤に対する薬効評価 Evaluation of efficacy for cancer cell invasion
癌細胞浸潤に対する薬効測定は、 ボイデンチヤ ンバーを用い た磯合、 熊谷の方法 （がんの浸潤 · 転移研究マニュアル、 磯合、 熊谷、 125頁— 131 頁、 金芳堂、 1995年） に準じ、 マウス黒色 腫由来 B16F10 細胞の浸潤能に対する被検薬の阻害効果を調べ る こ とによって実施でき る。 ボイ デンチャ ンバ一内の直径 8 M の細孔を有するフ ィ ル夕 —をマ ト リ ゲルでコー ト し、 チャ ンバ一上室に B16F10 細胞 2 X 105 個および被検薬を添加する。 対照には、 被検薬の代わ り に 0.1 %ゥシ胎児血清アルブミ ン一ダルべヅ コ変法イーグル培 養液 （以下、 BSA— DMEM と略す） を添加する。 チャンバ一下 室にはケモア ト ラク タ ン ト と してフ ィ ブロネクチンを含む培養 液をいれる。 ー晚培養し、 マ ト リ ゲルを浸潤 しフ ィ ル夕一下面 に移動 した B 16F10細胞の数を MTT比色定量法にて測定し、 対 照の 0.1% BSA— DMEM添加と比較する こ とで、 MP493制御物 質の癌浸潤抑制効果を測定でき る。 The drug efficacy measurement for cancer cell invasion was performed according to the method of Isoai and Kumagaya using Boyden's chamber (Cancer Invasion and Metastasis Research Manual, Isoai, Kumagaya, pp. 125-131, Kinhodo, 1995). This can be done by examining the inhibitory effect of the test drug on the invasive potential of tumor-derived B16F10 cells. Coat a filter with a pore size of 8 M in the void chamber with matrigel, and add 2 × 10 5 B16F10 cells and the test drug to the upper chamber of the chamber. For the control, add a 0.1% fetal serum albumin-Dalbeco modified Eagle's medium (hereinafter abbreviated as BSA-DMEM) instead of the test drug. In the lower chamber of the first chamber, a culture solution containing fibronectin is added as a chemoretractant. -The number of B16F10 cells that have been cultured and infiltrated with the matrigel and migrated to the bottom of the filter are measured by MTT colorimetry, and compared with the control with the addition of 0.1% BSA-DMEM. Thus, the effect of the MP493 control substance on suppressing cancer invasion can be measured.
癌の肺転移抑制に対する薬効評価  Evaluation of drug efficacy for suppressing lung metastasis of cancer
藤猪、 済木の方法 （がんの浸潤 · 転移研究マニュアル、 藤猪、 済木、 7頁— 11頁、 金芳堂、 1995年） に準 じ実施する。 6週令 の雄性 BDF1 マウスに、 マウス黒色腫由来 B16F10細胞 1 X 105 個を尾静脈内注射する こ とによ り移植する。 ドーズを振った適 当量の MP493制御物質、 は B16F10細胞と共に尾静脈内注射す る。 検体をその後 2 日間投与 し、 細胞移植よ り 15 日後にマウス を屠殺 し、 肺の癌コ ロニー数 （即ち、 転移結節数） を数え対照 の リ ン酸緩衝生理食塩水投与群と比較する こ とで、 MP493 阻害 物質の癌細胞の肺転移抑制作用を評価できる。 The method is based on the method of Fuji Ino and Saiki (Cancer Invasion and Metastasis Research Manual, Fuji Ino and Saiki, pp. 7-11, Kinhodo, 1995). Six-week-old male BDF1 mice are transplanted by injecting 1 × 10 5 mouse melanoma-derived B16F10 cells into the tail vein. The appropriate dose of MP493 control substance, with a dose, is injected into the tail vein together with B16F10 cells. The samples were administered for the next two days, the mice were sacrificed 15 days after cell transplantation, and the number of cancer colonies in the lungs (ie, the number of metastatic nodules) was counted and compared with the control phosphate-buffered saline group. And MP493 inhibition The effect of the substance on suppressing lung metastasis of cancer cells can be evaluated.
肺障害に対する薬効評価  Evaluation of efficacy for pulmonary disorders
マウスあるいはラ ッ ト にエン ド ト キシンを腹腔内投与あるい は静脈内投与するこ とによ り ARDS モデルを作成する。 MP 493 活性制御物質は、 ェン ド ト キシン投与直前あるいは数時間後に 静脈内投与、 腹腔内投与、 あ るいは経口投与する。 エン ド トキ シン投与 1 8時間後に肺を摘出 し、 その湿乾重量比および肺組 織中漏出色素量または肺'組織に浸潤 した リ ンパ球数を測定する こ とで、 MP 493活性調節剤の肺障害に対する効果を評価する こ とができる。  An ARDS model is created by intraperitoneally or intravenously administering endotoxin to mice or rats. The MP 493 activity modulator is administered intravenously, intraperitoneally, or orally immediately before or several hours after the endotoxin administration. Eighteen hours after administration of endotoxin, the lungs were removed, and the MP 493 activity modulator was determined by measuring the wet-dry weight ratio and the amount of pigment leaked into the lung tissue or the number of lymphocytes infiltrated into the lung 'tissue. Can be evaluated for its effect on lung injury.
腎障害に対する薬効評価  Evaluation of efficacy for renal disorders
体重 180 g ~ 220 g の S D ラ ヅ ト （ 7 〜 8 週例） をペン トノ ル ビ夕一ルを腹腔内投与する こ とによ り麻酔し、 背位固定 した後 開腹する。 左腎動脈上、 中、 下枝 3 本のう ち上下枝 2 本を結紮 する。 さ ら に 1週間後に右腎を摘出 し、 5/6腎摘ラ ッ ト を作成す る。 MP493活性調節物質は、 術後よ り 0.0 1〜 ； L 000m g/k g/日 の 用量で投与する。 該物質は飼料に混ぜて投与して も よい。 賢摘 よ り 2 週間毎に採尿 し、 尿中蛋白質濃度および尿中尿素濃度を 測定する、 または病理学的観察を行って糸球体硬化指数および 間質繊維化比率を測定する こ とで、 MP 493活性調節剤の腎障害 に対する効果を評価する こ とがで きる。 Anesthetize an SD rat weighing 180 g to 220 g (7 to 8 weeks) by intraperitoneal administration of pentorubil, fix the dorsal position, and perform laparotomy. Ligate the upper and lower branches out of the three upper, middle and lower branches of the left renal artery. One week later, the right kidney is removed and a 5/6 nephrectomy rat is prepared. MP493 activity modulator is administered at a dose of 0.01 to post-operatively; L 000 mg / kg / day. The substance may be mixed with the feed and administered. Collect urine every two weeks from sectectomy, measure urinary protein and urine levels, or perform pathological observations to determine glomerulosclerosis index and By measuring the ratio of interstitial fibrosis, the effect of the MP 493 activity modulator on renal impairment can be evaluated.
また、 体重 180 g〜 220 g の S D ラ ヅ ト （ 7〜 8 週例） に糸球体 基底膜ゥサギ抗血清を静脈内投与 し、 その翌日にゥサギア —グ 口 プリ ンをフ ロイ ン ト完全アジュ ノ ン ト と乳化 し、 両後肢足跡 皮内に注射する。 投与後 19 日 目に採尿し、 尿蛋白質濃度および 尿中尿素濃度を測定する、 または病理学的観察を行って糸球体 病変を観察するこ とで、 MP493活性調節剤の腎障害に対する効 果を評価する こ とができる。  In addition, glomerular basement membrane anti-sag antiserum was intravenously administered to SD rats weighing 180 g to 220 g (7 to 8 weeks), and the following day, Sagiria-guma Prince was treated with Freund's complete adjuvant. It is emulsified with knot and injected into both hind footprints intradermally. The effect of MP493 activity modulator on renal impairment can be determined by collecting urine on the 19th day after administration and measuring urinary protein concentration and urine urea concentration or observing glomerular lesions by pathological observation. Can be evaluated.
発明の効果  The invention's effect
MP 493が優位に発現する組織におけるセ リ ンプロテアーゼ関連 疾患、 特に各種癌、 各種肺疾患、 喘息、 ア レルギー、 気管支炎、 肺気腫、 ウィ ルス性疾患、 シ ョ ッ ク、 多臓器不全、 脬炎、 各種 腎炎な どに関する疾患の診断 · 研究 · 予防及び治療において利 用できる。  Serine protease-related diseases in tissues where MP493 is predominantly expressed, especially various cancers, various lung diseases, asthma, allergy, bronchitis, emphysema, viral diseases, shock, multiple organ failure, inflammatory disease It can be used for diagnosis, research, prevention and treatment of diseases related to various nephritis.

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims
1 . 以下の （ a ) または （ b ) の DNA；  1. DNA of the following (a) or (b):
( a ) 配列番号 ： 1 に記載の塩基配列からなる DNA；  (a) SEQ ID NO: DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in 1;
( b ) 配列番号 ： 1 の DNA とス ト リ ンジヱ ン 卜な条件でハイ ブ リ ダィ ズし、 かつセ リ ン プロテア一ゼ活性を有する蛋白質をコ ー ドする DNA。  (b) a DNA that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and encodes a protein having serine protease activity.
2 . 以下の （ a ) または （ b ) の DNA；  2. DNA of the following (a) or (b):
( a ) 配列番号 ： 4 に記載の塩基配列からなる DNA；  (a) SEQ ID NO: DNA consisting of the nucleotide sequence set forth in 4;
( b ) 配列番号 ： 4 の DNA とス ト リ ンジェ ン トな条件でハイ ブ リ ダィ ズし、 かつセ リ ン プロテア一ゼ活性を有する蛋白質をコ ー ドする DNA。  (b) DNA that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 4 under stringent conditions and encodes a protein having serine protease activity.
3 . 請求項 1 または請求項 2 に記載の DNAにコ一 ドされる蛋 白質。  3. A protein encoded by the DNA according to claim 1 or 2.
4 . 以下の （ a ) または （ b ) の蛋白質 ；  4. The following (a) or (b) protein;
( a ) 配列番号 ： 2 に記載のア ミ ノ酸配列か らなる蛋白質 ； ( b ) 配列番号 ： 2 のア ミ ノ酸配列においてアミ ノ 酸が欠失、 置換も し く は付加されたア ミ ノ酸配列から な り、 かつセ リ ンブ 口テア一ゼ活性を有する蛋白質。  (a) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b) an amino acid having a deletion, substitution or addition of amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 A protein consisting of a amino acid sequence and having a serine oral protease activity.
5 . 以下の （ a ) または （ b ) の蛋白質 ； ( a ) 配列番号 ： 5 に記載のア ミ ノ酸配列か らなる蛋白質 ； ( b ) 配列番号 ： 5 のア ミ ノ酸配列においてアミ ノ 酸が欠失、 置換も し く は付加されたア ミ ノ酸配列からな り、 かつセ リ ンブ 口テア一ゼ活性を有する蛋白質。 5. The following (a) or (b) protein; (a) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; (b) an amino acid in which amino acid is deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 A protein consisting of a amino acid sequence and having a serine oral protease activity.
6 . 請求項 1 または請求項 2 に記載の D NAを含む組換えべク 夕一。  6. A recombinant vector containing the DNA of claim 1 or claim 2.
7 . 請求項 6 に記載の組換えべク夕一に よ り形質転換された 形質転換細胞。  7. A transformed cell transformed by the recombinant vector according to claim 6.
8 . 請求項 3乃至請求項 5 のいずれかに記載の蛋白質の発現 を抑制するアンチセ ンス核酸。  8. An antisense nucleic acid that suppresses the expression of the protein according to any one of claims 3 to 5.
9 . 塩基配列が、 請求項 1 または請求項 2 に記載の DNAの全 部または一部に相補する配列である、 請求項 8 に記載のアンチ セ ンス核酸。  9. The antisense nucleic acid according to claim 8, wherein the base sequence is a sequence complementary to all or a part of the DNA according to claim 1 or 2.
1 0 . 請求項 3乃至請求項 5 のいずれかに記載の蛋白質も し く はその部分べプチ ドに対する抗体。  10. An antibody against the protein according to any one of claims 3 to 5 or a partial peptide thereof.
1 1 . 請求項 3乃至請求項 5 のいずれかに記載の蛋白質ある いは該蛋白質を発現している形質転換細胞と候補物質とを接触 させ、 該蛋白質のセ リ ンプロテア一ゼ活性の変化を検出する こ とを特徴とする、 該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方 法。 11. The protein according to any one of claims 3 to 5 or a transformed cell expressing the protein is brought into contact with a candidate substance, and the change in serine protease activity of the protein is determined. Searching for a substance exhibiting an activity regulating activity of the protein, characterized by detecting Law.
1 2 . 請求項 6 に記載の組換えべク タ一または請求項 7 に記 載の形質転換細胞と候補物質とを接触させ、 請求項 1 又は請求 項 2 に記載の DNA の発現レベルの変化を検出する こ とを特徴 とする、請求項 1 又は請求項 2 に記載の DNAの発現調節作用を 示す物質の検索方法。  1 2. Contacting the recombinant vector according to claim 6 or the transformed cell according to claim 7 with a candidate substance, and changing the expression level of the DNA according to claim 1 or 2. 3. The method for searching for a substance exhibiting a DNA expression regulating action according to claim 1 or 2, wherein the substance is detected.
1 3 . XYZ 座標系上の下記座標に配置された特性球のう ち少 な く と も任意の 3点の特性球間の相対配置を満足させる薬理作 用団を有する、 請求項 3 乃至請求項 5 のいずれかに記載の蛋白 質の活性調節剤 ；  13. A pharmacological operative group that satisfies the relative arrangement between at least three characteristic spheres of at least three characteristic spheres arranged at the following coordinates on the XYZ coordinate system. Item 6. A protein activity regulator according to any one of Items 5;
特性球 1 ； X座標 7.79、 Y座標 13.55、 Z座標 15.25 に中心 を有する半径 1.7Aの第 1 の疎水性領域、  Characteristic sphere 1; first hydrophobic region of radius 1.7A centered at X coordinate 7.79, Y coordinate 13.55, Z coordinate 15.25,
特性球 2 ； X座標 3.92、 Y座標 11.42、 Z座標 11.58 に中心 を有する半径 1.7Aの第 2 の疎水性領域、  Characteristic sphere 2; second hydrophobic region of radius 1.7A centered at X coordinate 3.92, Y coordinate 11.42, Z coordinate 11.58;
特性球 3 ； X座標 3.68、 Y座標 10.63、 Z座標 15.36 に中心 を有する半径 1.7Aの水素結合受容体領域 Rを開始点と し、 X座 標 2.74、 Y座標 8.15、 Z 座標 16.82 に中心を有する半径 2.3 A の水素結合受容体領域 T を終点とするべク ト ルで、 水素結合受 容体原子か ら （水素結合受容体原子に存在する） 非共有電子対 への位置 · 方向が定義される水素結合受容体領域、 Characteristic sphere 3; hydrogen bond acceptor region R with radius 1.7A centered at X coordinate 3.68, Y coordinate 10.63, Z coordinate 15.36, starting point, centered at X coordinate 2.74, Y coordinate 8.15, Z coordinate 16.82 A vector ending in a hydrogen-bond acceptor region T with a radius of 2.3 A that has a lone pair from a hydrogen-bond acceptor atom (present in the hydrogen-bond acceptor atom) Hydrogen bond receptor region, whose direction is defined
特性球 4 ; X座標 4.36、 Y座標 10.26、 Z座標 8.47 に中心 を有する半径 1.7Aの陽イ オン性領域。  Characteristic sphere 4; Positive ionic region with radius 1.7A centered at X coordinate 4.36, Y coordinate 10.26, Z coordinate 8.47.
1 4 . XYZ座標系上の下記座標に配置された特性球のう ち少 な く と も任意の 3点の特性球間の相対配置を満足させる薬理作 用団を有する、 請求項 3 乃至請求項 5 のいずれかに記載の蛋白 質の活性調節剤 ；  14. A pharmacological group that satisfies the relative arrangement of at least three characteristic spheres arranged at the following coordinates on the XYZ coordinate system at least at any three points. Item 6. A protein activity regulator according to any one of Items 5;
特性球 1 ; X座標 13.25、 Y座標 16.82、 Z座標 11.48 に中 心を有する半径 1.7 Aの第 1 の疎水性領域、  Characteristic sphere 1; first hydrophobic region of radius 1.7 A, centered at X coordinate 13.25, Y coordinate 16.82, Z coordinate 11.48,
特性球 2 ； X座標 7.00、 Y座標 7.07、 Z座標 7.66 に中心を 有する半径 1.7Aの第 2 の疎水性領域、  Characteristic sphere 2; second hydrophobic region of radius 1.7A centered at X coordinate 7.00, Y coordinate 7.07, Z coordinate 7.66;
特性球 3 ; X座標 5.26、 Y座標 17.19、 Z座標 9.46 に中心 を有する半径 1.7Aの水素結合受容体領域 Rを開始点と し、 X座 標 3.93、 Y座標 16.71、 Z座標 6.80 に中心を有する半径 2.3A の水素結合受容体領域 T を終点とするべク トルで、 水素結合受 容体原子か ら （水素結合受容体原子に存在する） 非共有電子対 への位置 · 方向が定義される水素結合受容体領域、  Characteristic sphere 3; hydrogen bond acceptor region R with a radius of 1.7A centered at X coordinate 5.26, Y coordinate 17.19, Z coordinate 9.46 as starting point, centered at X coordinate 3.93, Y coordinate 16.71, Z coordinate 6.80 A vector ending in a hydrogen-bond acceptor region T with a radius of 2.3A that defines the position and direction from the hydrogen-bond acceptor atom to the lone pair (present in the hydrogen-bond acceptor atom) Hydrogen bond acceptor region,
特性球 4 ； X座標 5.15、 Y座標 9.53、 Z座標 8.55 に中心を 有する半径 1.7Aの第 1 の環状芳香族性領域 Rを開始点と し、 X 座標 2.80、 Y座標 7.69、 Ζ座標 8.80 に中心を有する半径 1.7 A の第 2 の環状芳香族性領域 T を終点とするべク トルを垂線と し て環平面が定義される環状芳香族性領域。 Characteristic sphere 4; first cyclic aromatic region R having a radius of 1.7A and centered at X coordinate 5.15, Y coordinate 9.53, Z coordinate 8.55 as a starting point; A cyclic aromatic region whose center is at coordinate 2.80, Y coordinate 7.69, and Ζ coordinate 8.80 and has a radius of 1.7 A and a ring plane defined by a vector perpendicular to the end point of the second aromatic aromatic region T with a radius of 1.7 A .
1 5 . XYZ座標系上の下記座標に配置された特性球のう ち少 な く と も任意の 3 点の特性球間の相対配置を満足させる薬理作 用団を有する、 請求項 3 乃至請求項 5 のいずれかに記載の蛋白 質の活性調節剤 ；  15. A pharmacological operative group that satisfies the relative arrangement between at least three characteristic spheres at least at any of the characteristic spheres arranged at the following coordinates on the XYZ coordinate system. Item 6. A protein activity regulator according to any one of Items 5;
特性球 1 ； X座標 12.02、 Y座標 16.56、 Z座標 13.31 に中 心を有する半径 1.7Aの第 1 の疎水性領域、  Characteristic sphere 1; first hydrophobic region of radius 1.7A centered at X coordinate 12.02, Y coordinate 16.56, Z coordinate 13.31,
特性球 2 ； X座標 7.34、 Y座標 14.92、 Z座標 16.73 に中心 を有する半径 1.7Aの第 2 の疎水性領域、  Characteristic sphere 2; second hydrophobic region of radius 1.7A centered at X coordinate 7.34, Y coordinate 14.92, Z coordinate 16.73,
特性球 3 ； X座標 3.90、 Y座標 11.23、 Z座標 10.89 に中心 を有する半径 1.7Aの第 3 の疎水性領域、  Characteristic sphere 3; third hydrophobic region of radius 1.7A centered at X coordinate 3.90, Y coordinate 11.23, Z coordinate 10.89,
特性球 4 ; X座標 3.96、 Y座標 10.44、 Z座標 7.46 に中心 を有する半径 1.7 Aの陽ィ オン性領域。  Characteristic sphere 4; Anionic region with radius 1.7A centered at X coordinate 3.96, Y coordinate 10.44, Z coordinate 7.46.
1 6 . 請求項 1 3 乃至請求項 1 5 に記載の全ての特性球の う ち、 少な く とも任意の 3 点の特性球の相対配置を満足させる薬 理作用団を有する請求項 3 乃至請求項 5 のいずれかに記載の蛋 白質の活性調節剤。 16. A claim 3 to claim having a pharmacological agent that satisfies the relative arrangement of at least three characteristic spheres among all the property spheres described in claims 13 to 15. Item 6. The protein activity regulator according to any one of Items 5 to 7.
1 7 . 下記段階 ； 1 7. The following steps;
( 1 ) 化合物の立体構造を空間座標化する段階、  (1) converting the three-dimensional structure of the compound into spatial coordinates,
( 2 ) ( 1 ) の空間座標と請求項 1 3 乃至請求項 1 6 のい ずれかに記載された薬理作用団を規定する特性球の空間座標と を対比させる段階、  (2) comparing the spatial coordinates of (1) with the spatial coordinates of the characteristic sphere defining the pharmacological agent as set forth in any one of claims 13 to 16;
( 3 ) ( 1 ) の空間座標が請求項 1 3 乃至請求項 1 6 のい ずれかに記載された薬理作用団における少な く とも 3点以上の 特性球の相対配置を満足させる こ と を確認する段階、  (3) Confirm that the spatial coordinates of (1) satisfy the relative arrangement of at least three or more characteristic spheres in the pharmacological group described in any one of claims 13 to 16 Stage to do
を含む、 請求項 3 乃至請求項 5 のいずれかに記載の蛋白質に対 する活性調節作用を示す化合物を検索も し く は設計する方法。 A method for retrieving or designing a compound exhibiting an activity regulating activity on the protein according to any one of claims 3 to 5, comprising:
1 8 . 以下の （ a ) から （ h ) のいずれかの空間座標 ； ( a ) 第 9 図に示される空間座標の全部または一部 ； 18. Any of the following spatial coordinates (a) to (h); (a) all or part of the spatial coordinates shown in FIG. 9;
( b ) 第 9 図に示される空間座標に よ り特定される蛋白質にお いて、 1 も し く は数個のア ミ ノ酸が欠失、 置換も し く は付加さ れたア ミ ノ 酸配列か らな り、 かつセ リ ンプロテア一ゼ活性を有 する蛋白質の空間 ¾標 ；  (b) In the protein identified by the spatial coordinates shown in Fig. 9, one or several amino acids are deleted, substituted or added. A spatial marker for a protein consisting of an acid sequence and having serine protease activity;
( c ) 第 9 図に示される空間座標によ り特定される蛋白質の主 鎖原子に対 して、 主鎖原子の平均二乗偏差の平方根が 2 . 0 A 以下である蛋白質の空間座標 ； ( d ) 第 9 図に示される空間座標のう ち、 配列番号 2 のァ ミ ノ 酸番号で少な く と も 257(His)， 301(Leu), 304(Asp), 378(lle), 386(Ala), 387(Gly), 394(Asp), 395(Ser), 396(Cys), 397(Gln), 398(Gly), 399(Asp), 400(Ser), 418(Thr), 419(Ser), 420(Phe), 42l(Gly), 422(Ile), 423(Gly), 424(Cys), 429(Lys), 430(Pro), 43l(Gly), 432(Val),および 433(Tyr)に相当するア ミ ノ 酸残基 の原子座標を含んでなる空間座標 ； (c) With respect to the main chain atoms of the protein specified by the spatial coordinates shown in Fig. 9, the spatial coordinates of the protein whose mean square deviation of the main chain atoms is less than 2.0 A; (d) Of the spatial coordinates shown in Fig. 9, at least 257 (His), 301 (Leu), 304 (Asp), 378 (lle), and 386 amino acid numbers of SEQ ID NO: 2 (Ala), 387 (Gly), 394 (Asp), 395 (Ser), 396 (Cys), 397 (Gln), 398 (Gly), 399 (Asp), 400 (Ser), 418 (Thr), 419 (Ser), 420 (Phe), 42l (Gly), 422 (Ile), 423 (Gly), 424 (Cys), 429 (Lys), 430 (Pro), 43l (Gly), 432 (Val), and Spatial coordinates comprising the atomic coordinates of the amino acid residue corresponding to 433 (Tyr);
( e ) 第 9 図に示される空間座標の う ち、 配列番号 2 のァ ミ ノ 酸番号で少な く とも 257、 299〜 301、 378、 394〜 400、 418~ 425 および 429〜433 番に相当するアミ ノ酸残基の原子座標を含ん でなる空間座標 ；  (e) Among the spatial coordinates shown in Fig. 9, the amino acid number of SEQ ID NO: 2 corresponds to at least 257, 299 to 301, 378, 394 to 400, 418 to 425, and 429 to 433 Spatial coordinates comprising the atomic coordinates of the amino acid residue;
(： f )標的結合サイ ト を構成するア ミ ノ酸の主鎖原子に対 して、 主鎖原子の平均二乗偏差の平方根が 1 . 0 A以下である標的結 合サイ トの空間座標 ；  (: F) spatial coordinates of the target binding site where the square root of the mean square deviation of the main chain atom is 1.0 A or less with respect to the main chain atom of the amino acid constituting the target binding site;
( g ) 基質結合部位を構成するア ミ ノ 酸の主鎖原子に対 して、 主鎖原子の平均二乗偏差の平方根が 1 . 0 A以下である基質結 合部位の空間座標 ；  (g) relative to the main chain atom of the amino acid constituting the substrate binding site, the spatial coordinates of the substrate binding site having a square root of the mean square deviation of the main chain atom of 1.0 A or less;
( h ) (a) 〜（ g )のいずれかの空間座標に対して、 回転および /も し く は並進の操作を加えた結果得る こ とが可能な空間座標。 (h) Spatial coordinates that can be obtained as a result of applying rotation and / or translation operations to any of the spatial coordinates (a) to (g).
1 9 . 請求項 1 8 に記載の空間座標を格納 したコ ン ビュ一夕 —読み取 り 可能な記憶媒体。 19. A combi-hologram storing the spatial coordinates according to claim 18. A readable storage medium.
2 0 . 請求項 3 乃至請求項 5 のいずれかに記載の蛋白質に対 する活性調節作用を示す化合物を検索または設計するための、 請求項 1 8 に記載の空間座標または請求項 1 9 に記載の記憶媒 体の使用。  20. The spatial coordinate system according to claim 18 or the spatial coordinate system according to claim 19, for searching or designing a compound exhibiting an activity regulating activity on the protein according to any one of claims 3 to 5. Use of storage media.
2 1 . 請求項 3 乃至請求項 5 のいずれかに記載の蛋白質に対 する活性調節作用を示す化合物の検索方法であって、  21. A method for searching for a compound exhibiting an activity regulating activity on the protein according to any one of claims 3 to 5,
( 1 ) 化合物の立体構造を空間座標化する段階、  (1) converting the three-dimensional structure of the compound into spatial coordinates,
( 2 ) ( 1 ) 及び請求項 1 8 に記載の空間座標を同一座標系上 で重ね合わせて、 両者の適合状態を評価する段階  (2) A step of superimposing the spatial coordinates described in (1) and claim 18 on the same coordinate system and evaluating the conformity of the two.
を含むこ と を特徴とする、 該蛋白質に対する活性調節作用を示 す化合物の検索方法。 A method for searching for a compound exhibiting an activity regulating activity on said protein, characterized by comprising:
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