Verfahren und Anordnung zur Untersuchung von Zellen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1 sowie eine Anordnung gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 12. Die Zuordnung von Zellen im Gewebsverband zu einem exakt definierten Zelltyp
(z.B. Epithelzelle, Muskelzelle, Fibroblast, Leukozyt, Karzinomzelle, Lymphomzelle) und die Erfassung von deren funktioneilen Eigenschaften erfolgt, wenn die morphologischen Charakteristika nicht ausreichen, durch immunhistologische Untersuchungen. Dabei werden hoch spezifische Antikörper die gegen charakteristische zelltypspezifische Antigene gerichtet sind eingesetzt. Aus der Färbung können entsprechende Schlüsse gezogen werden.
Bislang mangelt es an einem objektiven, automatisierten Analysesystem, welches z.B. angibt, wie viele Zellen in einem Präparat vorhanden sind, wie viele dieser Zellen mit dem(n) jeweiligen Antikörper(n) (im Falle von Mehrfachfärbungen) reagieren und wie stark diese Reaktion(en) ist (sind). Stand der Technik ist es, dass der Untersuchende entweder rein optisch eine repräsentative Anzahl von Zellen auszählt und deren Färbeintensität abschätzt oder aber er verwendet eine herkömmliche Bildverarbeitungssoftware um die Färbeintensität exakt zu messen, wobei er jedoch gezwungen ist, das zu vermessende Areal der Zelle manuell zu definieren. Will der Untersuchende eine quantitative Untersuchung bei 100 Zellen und 100 Zellkernen vornehmen, so muss er 100 Zellen und 100 Kerne einzeln umringeln und kann dann seine Messung durchführen. Diese Messungen geben jedoch in den seltensten Fällen Aufschluss über doppel-, dreifach-, usw. Reaktivitäten und sind mit einem enormen Zeitaufwand verbunden, wobei der Abgleich mit Negativ- und Positivkontrollen, die für die Vergleichbarkeit wichtig sind, den Arbeitsaufwand exponentiell ansteigen lassen. Dieser Umstand ist hauptverantwortlich dafür, dass die Resultate immunhistologischer Untersuchungen noch immer als nicht wirklich wissenschaftlich standardisierbar und vergleichbar gelten und immer mit dem Manko der Subjektivität behaftet sind, während die wesentlich jüngere Technik der Durchflusszytomethe (ein vergleichbares Analysesystem nur für Einzelzellen in Suspension) diesen Sprung schon lange geschafft hat. Kommen derzeit bei durchflusszytometrischen Untersuchungen routinemäßig 4Fachfärbungen zum Einsatz wobei genau die prozentuelle Verteilung und Färbeintensität jeder Subpopulation beliebig bestimmt werden kann, so stehen die Auswertemethoden der Immunhistologie noch immer am Stand der Technik von vor zwanzig Jahren und es werden in der überwiegenden Mehrzahl Mittel, wie ein Kreuz-, zwei Kreuz- positive Zellen, verwendet, um die visuell ermittelten Resultate auszudrücken.
Ziel der Erfindung ist es, eine automatische Erkennung von einzelnen Zellen und deren Bestandteile wie Zellkern, Zytoplasma und Zellmembran in dichten geschlossenen Zellverbänden zu erreichen und in den jeweiligen Bestandteilen exakte Messungen
durchzuführen, ohne dabei den räumlichen Bezug zu den Zellen aber auch deren Lokalisation im Gewebsverband zu verlieren. Damit soll die Immunhistologie auf die Stufe der Durchflusszytometrie gestellt werden, wobei, bezogen auf den Datenabgleich mit Positiv- und Negativkontrollen, die Aufschlüsselung der Populationen in einfach- oder mehrfach- reaktive Subpopulationen sowie die quantitative Erfassung der Färbeintensitäten, die Immunhistologie jedoch die Durchflusszytometrie in der Informationsvielfalt bei weitem übertrifft, da sie eine räumliche Zuordnung zulässt und zwar nicht nur beschränkt auf die Lokalisation der jeweiligen Zelle im Zellverband sondern auch innerhalb der Zelle (membranös, zytoplasmatisch oder nuklear). Erfindungsgemäß ist ein Verfahren der eingangs genannten Art durch die Merkmale des Kennzeichens des Anspruches 1 charakterisiert. Eine Anordnung der eingangs genannten Art ist erfindungsgemäß durch die Merkmale des Anspruches 12 charakterisiert.
Es werden zumindest eine nukleare Färbung, wobei jede gebräuchliche Zellkernfärbung angewendet werden kann, und zumindest eine Färbung einer Zielstruktur vorgenommen, vorzugsweise mit einem Antikörper oder Antiserum. Es ist dabei nicht wichtig, an welcher zellulären Struktur dieser Antikörper oder eine Gensonde od.dgl. bindet, solange, wie es in der Regel auch der Fall ist, sich das Reaktionsprodukt farblich von der nuklearen Färbung unterscheiden lässt. Nach oben hin sind der Anzahl der Färbungen von Zellkernen und von Zellobjekten keine Grenzen gesetzt, solange bis physikalisch eine klare Trennung der unterschiedlichen Färbungen nicht mehr möglich ist.
Prinzipiell ist es auch möglich, Zellkerne als Zielstruktur zu färben. In diesem Fall liegen somit Zellkerne vor, die zumindest einmal identifikationsgefärbt und zumindest einmal zielstrukturgefärbt sind. Da die aufgenommenen Bilder getrennt nach den Färbungen ausgewertet werden, können auch aus den beiden für die Zellkerne vorgenommenen Färbungen entsprechende Schlüsse gezogen werden.
Die SU 652 580 A betrifft die Erkennung von Strukturen in Mikroschnitten. Diese Druckschrift hat nichts mit der automatisierten Erkennung von Einzelzellen im Gewebsverband, der Analyse von Koreaktivitäten, deren statistischer Auswertung und der interaktiven graphischen Auswahl und Verknüpfung von Parametern zu tun. Insbesondere gab es im Jahr 1979 noch keine graphischen Benutzeroberflächen bei Computern.
In der JP 6138119 A wird eine Anordnung zum automatischen Zählen und zur Analyse von Zellen beschrieben. Es handelt sich dabei um ein Verfahren zur Erkennung und Vermessung von isolierten Zellen. Derartige Systeme betreffen die Analysen an Einzelzellen auf Objektträgern. Dabei muss man den Begriff "Einzelzelle" wörtlich nehmen: Die Zellen liegen einzeln (isoliert) auf Objektträgern und sind im Gegensatz zur Erfindung (räumlich) deutlich voneinander abgegrenzt (getrennt). Darüber hinaus handelt es sich bei den zu analysierenden Zellen üblicherweise um Zellen gleichen Typs (bei JP 6138119 A um
Myelozyten und (peripheral blood cells) Blutzellen, Zellen mit jeweils einheitlicher Morphologie).
Erfindungsgemäß werden verbundene Zellen in Geweben analysiert, Zellen von beliebigem Typ und von beliebiger - auch innerhalb eines Zelltyps VARIABLER - Morphologie werden erkannt und vermessen. Systeme die isolierte Einzelzellen analysieren können, scheitern am Gewebsverband. Algorithmen die isolierte Einzelzellen erkennen können, versagen, wenn diese Einzelzellen eng aneinander gepresst liegen (wie nun einmal in einem Gewebe üblich).
WO 99/04244 A1 betrifft einen Prozess zur Untersuchung von zytologischen Proben, wobei atypische Zellen aufgrund verschiedener Parameter, die innerhalb od. außerhalb von festgelegten Wertebereichen liegen, erkannt werden. Bei diesem Verfahren werden zelluläre Objekte, vor allem aber Zellkerne dargestellt, verschiedene Parameter vermessen und hinsichtlich ihrer Zugehörigkeit zu bestimmten Wertebereichen analysiert.
Das Verfahren nach WO 99/04244 A1 sieht vor, dass unter Einbeziehung einer Fülle von Daten (Patientengeschichte, Anamnese, Voruntersuchungen und - nur ein Faktor - bildanalytische Bearbeitung aktueller Proben) eine Wahrscheinlichkeitsberechnung durchgeführt wird, die dem Pathologen darüber Auskunft gibt, ob ein vaginaler Abstrich „wahrscheinlich entartete Zellen enthält,,, „verdächtig,, oder wahrscheinlich „innerhalb normaler Grenzwerte,, ist. Das erfindungsgemäße Analyseverfahren trifft keine derartigen Aussagen, sondern stellt zusammenfassend gesehen ein Messinstrument dar, mit dem Grundlagenforscher wie Pathologen detaillierte Aussagen über die Zustände einzelner Zellen im Gewebsverband treffen können. Insbesondere durch Vergleich von normalen und entarteten Geweben sowie in Bezug setzten der Messwerte mit Positiv- und Negativkontrollen können sehr genaue Zustandsbestimmungen vorgenommen werden. Mit dem in der WO 99/04244 A1 beschriebenen Verfahren werden vor allem vaginale
Abstriche (s.g. PAP-smears) untersucht, eine Probenform also, bei der die zu vermessenden Zellen wiederum nicht in Gewebeform sondern mehr oder weniger isoliert vorliegen (vergleiche Ausführung bezüglich JP 6138119). Zwar wird in der WO 99/04244 A1 eingangs angeführt, dass jenes Verfahren auch für die Untersuchung von Gewebeproben geeignet sei, im weiteren Verlauf der Patentbeschreibung wird darauf jedoch kein Bezug mehr genommen. Dies ist nur insoweit plausibel, als von einer zellunabhängigen bzw. statistischen Erfassung von zellulären Parametern im Gewebsverband die Rede ist. Sehr wohl Bezug genommen wird aber auf die insbesondere bei einer Einfarbentechnik nicht nur in Geweben sondern selbst bei Abstrichen auftretende Problematik der optischen Trennung von Einzelzellen. Wenn also mit jenem Verfahren überhaupt etwas im Gewebe vermessen wird, dann bestenfalls isolierte (statistisch oder spezifisch verteilte) Strukturen, aber es werden keine individuellen Zellen in ihrer Ganzheit identifiziert. Es wird des Weiteren zwar ausgeführt, dass irgendwelche Strukturen in irgendwelchen Bildern analysiert werden; die
Identifikation von Einzelzellen im Gewebsverband ist davon elementar verschieden, sowohl was die praktische Bedeutung als auch - und insbesondere - die erforderliche Methodik und die Verfahrensschritte betrifft. Es werden lediglich Einfachfärbungen analysiert, jedoch keine Mehrfarbenkombinationen. Das bedeutet, es kann nur eine zelluläre Struktur untersucht werden, wobei diese Struktur zwar die Zelle repräsentiert, aber eben nicht die Zelle ist. Wird ein Zellkern identifiziert, so ist damit die einzelne Zelle zu der dieser Zellkern gehört nur in erster Näherung identifiziert. Die genaue Lage des Zellleibes, der für zytologische Vermessungen und Erfassung diagnostisch relevanter Parameter unerlässlich ist, bleibt bei jener Betrachtung/bei jenem Analyseverfahren völlig unberücksichtigt. Eine adäquate zytopathologische Analyse setzt eine Differenzierung in Zellmembran, Zytoplasma und Zellkern voraus. Eine derartige Differenzierung in einzelne Zellkompartimente auf der Basis von identifizierten einzelnen Zellen erfordert zwingend den Einsatz einer Mehrfarbentechnik zur Darstellung der einzeln zu analysierenden Komponenten. Dieser Grundanforderung moderner Einzelzelldiagnostik - geforderte Differenzierung in Zellmembran, Zytoplasma und Zellkern - kann die auf einer Einfarbentechnik basierende WO 99/04244 A1 also gar nicht gerecht werden. Diese Grundeigenschaft des erfindungsgemäßen Analyseverfahrens - Differenzierung in Zellmembran, Zytoplasma und Zellkern - unterscheidet die vorliegende Patentanmeldung sehr wesentlich von der WO 99/04244 A1. Es wird in dieser Schrift ausdrücklich darauf hingewiesen, dass jenes Verfahren nicht auf die Analyse von Zellkernen beschränkt ist, sondern auf beliebige zelluläre Parameter angewendet werden kann. Dies wird zwar nirgends in der besagten Patentschrift dargestellt, ändert jedoch auch nichts daran, dass mit einer Einfarbentechnik die zytopathologisch essentielle Differenzierung in Zellmembran, Zytoplasma und Zellkern nicht realisierbar ist.
WO 99/08091 A1 zeigt ein automatisiertes Analysesystem zur Identifizierung von malignen Zellen. Um Daten über die Bösartigkeit von Zellen zu erlangen, werden insbesondere Informationen aus dem Zellkern verarbeitet. Weiters können mit geeigneten Algorithmen die Zellränder und die Flächen der Zellen berechnet werden. Ähnlich wie bei der WO 99/04244 A1 handelt es sich bei der WO 99/08091 A1 um ein Verfahren zur zytometrischen Analyse von Zellkernen (nicht Zellen im morphologischen Sinne) von nicht im Gewebsverband befindlichen Zellen. Zwar ist es ein gutes Verfahren zur Vermessung von Zellkernen, aber nicht mehr. Hingegen ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf eine Färbemethode (Zellkernfärbung) beschränkt, sondern auf beliebige fluoreszenztechnische Methoden und Farbstoffkombinationen anwendbar. Es werden allerdings nur die Ränder und Flächen der Zellkerne erkannt bzw. berechnet und eben gerade nicht jene der ganzen Zellen. Dies ist aber genau die Schwierigkeit, die erfindungsgemäß gelöst wird, nämlich, dass die Erkennung von ganzen Zellen (Zellkern, Membran, Zellplasma), noch dazu von Zellen im geschlossenen Gewebsverband, ermöglicht wird. Genau diese Funktionalität aber, ist in der WO 99/08091 A1 nicht einmal ansatzweise erkennbar.
Als Färbungen bzw. färbbare Zellobjekte kommen insbesondere Färbungen bzw. Zellobjekte in Frage, wie sie im Anspruch 4 angeführt sind.
Erfindungsgemäß wird für eine erste Identifikation der zu untersuchenden Zellen zumindest ein Parameter der kenntlich gemachten Zellkerne auf einen bestimmten Wertebereich eingeschränkt. Dieser Wertebereich soll mit größtmöglicher Wahrscheinlichkeit einen Wertebereich darstellen, mit dem die gefärbten Zellkerne tatsächlich erfasst werden können. Objekte, die z.B. kleiner sind und in den für den Parameter "Größe" vorgegebenen Wertebereich nicht hineinpassen, sollen ausgeschieden werden, da es sich bei derartigen Objekten nicht um Zellkerne handelt. Auch zu große Objekte werden ausgeschieden. Die Anzahl der Parameter, die zur Aussiebung von als Zellkerne zu betrachtenden Objekten angewendet werden, ist nicht beschränkt. Zur Aussiebung der Zellkerne bzw. Bestimmung der Parameterbereiche können auch die Abhängigkeiten einzelner Parameter voneinander bzw. Gegenüberstellungen von Parametern in Form von Scatterg rammen oder Histogrammen verwendet werden. Die Beschränkung der Werte der einzelnen Parameter kann auch in Abhängigkeit von den Parametern der rekonstruierten Einzelzellen erfolgen; insbesondere können dadurch die Parameterbereiche in Abhängigkeit von den erzielten Untersuchungsresultaten festgelegt und verfeinert werden. Vorteilhafterweise wird dabei vorgegangen, wie in den Ansprüchen 3, 5 und/oder 7 angegeben wird. Die Auswirkungen der einschränkenden Maßnahmen, die vorzugsweise mittels
Eingrenzungen der gewünschten Populationen in Scattergrammen vorgenommen werden, führen in Form eines Rückkopplungsprozesses zu einer verbesserten, den Zellkerneigenschaften angepassten Objektidentifikationstrategie und können mit einer farblichen Veränderung der eingegrenzten Population im Originalbild verbunden werden, um die Konsequenzen dieser Operationen kontrollieren zu können.
Ist der Identifikationsprozess des untersuchten Teilbereiches des Gewebepräparates abgeschlossen, so werden mit den ermittelten Parametern alle weiteren Bilder des Gewebepräparates oder weiterer Gewebepräparate desselben oder eines gleichen Organes automatisch ausgewertet. Für die Auswertung ist eine Identifikation des Zellleibes (Zytoplasma) und des
Zellrandes (Zellmembran) erforderlich. Dazu ist zumindest eine Zielstrukturfarbung erforderlich, die das Zytoplasma und/oder die Zellmembran färbt. Die für diese Färbung charakteristischen Eigenschaften können mittels eines softwaremäßig zur Verfügung gestellten Messwerkzeugs automatisch ermittelt werden, wobei der Anwender durch Markierung einer gefärbten Zelle, die er aus der repräsentativen Szene aus dem dargestellten Bild auswählt, das Areal vorgibt, in dem die Messung dieses Parameters erfolgen soll. Das Messwerkzeug kann automatisch z.B. die Färbeintensität, den Farbton, die Größe und/oder Form dieser Zelle ermitteln. Die Grenze bzw. der Unterschied zu
ungefärbten Zellen kann ermittelt werden, indem eine ungefärbte Zelle mit dem Messwerkzeug markiert und vermessen wird. Diese Operation kann für jeden zur Verfügung stehenden Farbkanal durchgeführt werden. Damit kann die Flächenerstreckung einer Zelle in einfacher Weise festgelegt werden. Im Zuge einer Korrelierung des(r) identifikationsgefärbten Bildes(r) und des(r) zielstrukturgefärbten Bildes(r) werden alle Objekte mit vergleichbaren Eigenschaften betrachtet.
Vorteilhafterweise wird gemäß den Merkmalen des Anspruches 8 vorgegangen, wobei bei einer zytoplasmatischen Zielstruktur-Färbung, ausgehend von den bereits identifizierten Zellkernen ein Wachstumsprozess eingeleitet und solange fortgesetzt wird, bis entweder ein Bildpunkt erreicht wird, der nicht dem ausgewählten Farbton entspricht, oder die Toleranzgrenze für die Größe und Form (Durchmesser) überschritten wird bzw. ein dem benachbarten Zellkern zugehöriges Objekt erreicht wird. Der Wachstumsprozess wird vorteilhafterweise bei Erreichen eines ungültigen Bildpunktes nicht abgebrochen, sondern nur der ungültige Bildpunkt nicht in das wachsende Binärobjekt einbezogen. Im Falle einer Membranfärbung wird das Größenwachstum ausgehend von den Zellkernen solange fortgesetzt bis ein dem Farbton entsprechendes Areal erreicht wird, wobei dieser Prozess solange innerhalb des gefärbten Areals fortgesetzt wird, bis das Intensitätsmaximum oder ein benachbartes Objekt bzw. die Toleranzgrenze für die Größe erreicht wird.
Im Falle von Mehrfachfärbungen, die membranöse und/oder zytoplasmatische Anteile der Zellen umfassen, können beide Wachstumsprozesse gleichzeitig durchgeführt werden; auch mehrere Farbtöne können nebeneinander zur Zellrekonstruktion herangezogen werden.
Die mit dieser Methode im dargestellten bzw. aufgenommenen Bild identifizierten Zellen werden bezüglich ihrer Parameter, vorzugsweise Färbeintensität, Größe, Form analysiert und die Resultate, bezogen auf alle Zellkerne dieses Bildes, in Form von Scattergrammen dargestellt bzw. ausgegeben. Vorteilhafterweise wird die Größe gegen die Färbeintensität aufgetragen bzw. dargestellt, und zwar für jeden Farbkanal separat. Bei Mehrfachfärbungen werden zweckmäßigerweise die Objekte nach den unterschiedlichen Farbkanälen geordnet nach der jeweiligen Färbeintensität, gegenübergestellt. Zusätzlich können die identifizierten Objekte bzw. Zellen im Originalbild farblich hervorgehoben werden. Die durch die Scattergramme dargestellten Verhältnisse und Abhängigkeiten verändern sich, wenn die Paramterbereiche verändert bzw. neu definiert werden.
Die Bilder aller Teilbereiche des Gewebepräparates werden in der obigen Weise analysiert und die Resultate bzw. ermittelten Parameter der Einzelzellen in Form von Scattergrammen ausgegeben, die vorzugsweise Färbeintensitäten einander gegenüberstellen. Die Auswertung für die Zellobjekte Zellkern, Zytoplasma und Zellmembran kann einzeln, aber auch beliebig kombiniert, durchgeführt werden. Die abschließende Auswertung erfolgt vorteilhafterweise mit Hilfe von Intensitätsscattergrammen, wobei
graphisch einzelne Populationen unterschieden und separat ausgewertet werden können. Die Auswertung erfolgt vor allem hinsichtlich der Anzahl der analysierten Objekte, der prozentuellen Verteilung der jeweiligen Objekte in den unterschiedlichen Farbkanälen, der Färbeintensität, der Größe und der Form, wobei Populationseinschränkungen am Scattergramm vorgenommen werden können.
Mit der Erfindung wird es möglich, individuelle Zellen, selbst in geschlossenen Zellverbänden, automatisiert mit hoher Genauigkeit zu erkennen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnungen beispielsweise näher erläutert. Fig. 1 zeigt die Vorgabe von Parametern von Zellen bzw. die Festlegung der zulässigen Parameterbereiche mittels intuitiver softwaremäßiger Markierungswerkzeuge. Fig. 2 zeigt Beispiele für Scattergramme und Histogramme. Fig. 3 zeigt ein Beispiel für die Datenauswertung und Fig. 4 zeigt ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Anordnung.
In Fig. 1 ist als Beispiel ein Gewebeschnitt einer Niere dargestellt. Gefärbt wurden die Zellkerne (Identifikationsfärbung), z.B. blau und das Zytoplasma (Zielstrukturfarbung). Nach der Färbung von Gewebepräparaten werden Teilbereiche definiert und z.B. mit Hilfe eines Eppendorf-Mikromanipulators abgefahren. Mit einem Laserscanning-Mikroskop werden, z.B. zwei Scans in der Z-Ebene, ein grober und ein feiner, entlang einer horizontalen Linie in der Mitte des Bildes, durchgeführt, wobei der Fokus auf den Bereich größter Helligkeit eingestellt werden kann. Die Scanzeit beträgt z.B. vier Sekunden pro Gesichtsfeld, wobei jeder Teilbereich nur einmal mit einem 488 nm Argon-Laser eingescannt wird. Es ist möglich, mehrere, aufeinanderfolgende Scans vorzunehmen. Zur Erzielung unterschiedlicher Färbungen könnte z.B. ein erster Scan mit 543 nm He/Ne-Laser, um die Fluorochrome Cyanin 5 (Cy5) oder Cy3 messen zu können, gefolgt von einem Scan mit einem 488 nm Argon-Laser, um die Fluorochrome Cy2, Fluoreszin-Isothiozyanat (FITC) oder Peridinin- Chlorophyllprotein (PerCP) erfassen zu können, vorgenommen werden. Die Einstellung der Sensitivität der Detektoren muss einmal in Abstimmung mit den Negativ- und Positivkontrollen bzw. Einstellung der Parameterbereiche erfolgen. Das systematische Speichern der Bilddaten jedes einzelnen Scans, bestehend aus bis zu acht Farbkanälen, wird automatisch ausgeführt.
Zum Einstellen des Messsystems stehen Softwarewerkzeuge zur intuitiven Markierung der Gültigkeitsbereiche der einzelnen Messparameter und allenfalls auch auf bestimmte Bildbereiche zur Verfügung (Fig. 1). Diese Messparameter umfassen z.B. Größe, Umfang, Form, Färbeintensität und Färbemuster der dargestellten Objekte. Dabei können diese Grenzwerte numerisch oder graphisch definiert werden; vorzuziehen ist eine intuitive Definition, d.h. der Benutzer gibt dem System nach Betrachtung des dargestellten Bildes ein oder mehrere repräsentative Messobjekte vor, also einzelne Zellen oder zelluläre Kompartimente, die im dargestellten Bild erkennbar sind und das System extrahiert daraus
selbständig die numerischen Daten für die Gültigkeitsintervalle jedes gewünschten Parameters. Damit ist das System in der Lage all jene Strukturen in den Bildern selbständig zu erkennen, die innerhalb vorgegebener Toleranzgrenzen den als repräsentativ definierten Objekten entsprechen. Durch Kennzeichnung von zwei Zellkernen wird, wie in Fig. 1 oben dargestellt, der
Parameter Färbeintensität bezüglich seines Minimalwertes und seines Maximalwertes vorgegeben. Diese beiden Werte stellen die Bereichsgrenzen für diesen Parameter dar und im weiteren Auswertevorgang werden nur Objekte als Zellkern erkannt bzw. zugelassen, deren Färbeintensität innerhalb dieses Bereiches liegen. Für die Definition des Parameterbereiches der Zellgröße wird eine Färbung herangezogen, die charakteristisch für die gesamte Zelle ist, also vorteilhafterweise eine Membranfärbung oder Zytoplasmafärbung. Die dabei ermittelten Parameter geben den Parameterbereich für die Zellgröße vor (Fig. 1 rechts unten).
Die Bilder, in denen die Zellkerne bezüglich ihrer Färbeintensität mit entsprechenden Parameterbereichen definiert wurden, und die Bilder, in denen die Zellgröße mit entsprechenden Parameterbereichen, definiert wurde, werden korreliert, wobei die Zellkerne und die durch die Größe definierten Zellen, insbesondere lagemäßig, einander zugeordnet werden. Eine derartige Zuordnung kann auch derart erfolgen, dass einer Mehrzahl von unterschiedlichen Zellkernfärbungen jeweils einer aus einer Mehrzahl von unterschiedlichen Zellfärbungen zugeordnet wird und umgekehrt, da durch Korrelation einer Mehrzahl von unterschiedlichen Färbungen und entsprechenden Auswertevorgängen die Definition von Zellkernen und Zellgröße bzw. Zellen exakter vorgenommen werden kann, wodurch die Auswertegenauigkeit erhöht wird.
Es ist möglich, in dem dargestellten Bild eines Teilbereiches eines Gewebepräparates die Zellkerne und/oder die Zellobjekte zu kennzeichnen, die den gewählten oder vorgegebenen Parameterbereichen entsprechen. Für diese gekennzeichneten Objekte können auch weitere Parameter bestimmt werden, indem diese Objekte vermessen werden. Die Gegenüberstellung von ermittelten Parametern in Scattergrammen oder Histogrammen (Fig. 2) bringt bereits erste Aussagen über die vorhandene Zellpopulation bzw. kann dazu herangezogen werden, die zuvor verwendeten Parameterbereiche zur Erhöhung der Auswertegenauigkeit neu bzw. exakter festzulegen.
Zur Zellrekonstruktion bzw. zur Ermittlung der Einzelzellen wird, ausgehend von den identifizierten Zellkernen, mit einem vorgegebenen oder an das jeweilige zu untersuchende Gewebepräparat angepassten bzw. wählbaren Rechenalgorithmus ein Zellwachstum eingeleitet. Dabei wird, vorzugsweise unter Berücksichtigung von Maximal- und Minimalwerten von Zellparametern, insbesondere für Zellgröße bzw. Zelldurchmesser, um die Zellkerne herum jeweils eine Zellfläche aufgebaut, und zwar unter Beachtung des Kriteriums, dass benachbarte, ebenfalls wachsende Zellflächen miteinander nicht
verschmelzen und eine Berührung der Zellflächen bzw. Zellwände bzw. Zellmembran ausgeschlossen wird. Die erhaltene Begrenzung der ermittelten bzw. gewachsenen Objekte wird als Begrenzung der dadurch rekonstruierten Einzelzellen angesehen.
Die Anzahl, die Fläche und/oder Färbeintensität bezüglich zumindest einer der vorgenommenen Färbungen und/oder andere Parameter der rekonstruierten Einzelzellen können festgestellt werden und/oder die Einzelzellen gegebenenfalls in Abhängigkeit von ihrer Färbeintensität und/oder anderer ausgewählter Parameter in Populationen eingeteilt und allenfalls dargestellt und weiter untersucht bzw. analysiert werden. Die aus dem jeweiligen Bildmaterial extrahierten Merkmale, verfügbar in Form von numerischen Daten, können in Form von Histogrammen und Scattergrammen aufbereitet und dargestellt werden (Fig. 2).
In Fig. 2 sind Histogramme (Häufigkeit von Färbeintensitäten in einzelnen Farbkanälen) und Scattergramme (für einfach, doppelt und dreifach reaktive Zellen) für die Färbeintensitäten in unterschiedlichen Farbkanälen dargestellt. Man erkennt die Lokalisierung bzw. Gruppierung von einzelnen Zellen zugeordneten Messwerten, die Aussagen über die Zellen zulassen. Dabei eignen sich Scattergramme besonders zur weiteren Bearbeitung der Messwerte und einer vertiefenden Evaluation der numerischen Daten. In solchen Scattergrammen können verschiedene Objekteigenschaften (Objektform, Oberflächenbeschaffenheit, mittlere densitometrische Intensität, Intensitätsschwankungen, etc) gegeneinander aufgetragen und ihr Verhältnis zueinander dargestellt werden. Anhand solcher Scattergramme können Gates (Gültigkeitsintervalle für je zwei Messparameter) gesetzt werden, und diese miteinander verknüpft werden (Fig. 3).
Fig. 3 zeigt das Resultat der Indentifikation des in Fig. 1 dargestellten Gewebepräparates und eine vorteilhafte Vorgangsweise bei der Verwertung der erhaltenen Parameter bzw. Bildinhalte. Aus einer repräsentativen korrespondierenden Szene von kenntlich gemachten Zellobjekten wird ein Scattergramm abgeleitet, bei dem die Größe der Objekte der Färbeintensität gegenübergestellt wird (erste Reihe von Fig. 3). Durch Definition von Gates, entweder interaktiv oder automatisch durch Schwerpunktbestimmung von Messpunktgruppen können spezifische Populationen innerhalb der gesamten Messwerte identifiziert werden, wie beispielsweise in der zweiten Reihe dargestellt ist, wenn entsprechende Parameter von unterschiedlichen Farbkanälen einander gegenübergestellt werden.
Gates, die in einer Parameterkombination definiert wurden, können auch in anderen Parameterkombinationen visualisiert werden, wodurch immer genauer definierte Subpopulationen identifiziert werden können, wie dies beispielsweise aus der dritten Reihe hervorgeht.
Gemäß der untersten Darstellung in Fig. 3 können die auf dem Bildschirm 14 (Fig. 4) dargestellten Zellobjekte in unterschiedlicher Kenntlichmachung dargestellt werden, d.h.
nach ungegateten Messwerten, nach Messwerten im Gate 1 bzw. nach Messwerten in Gate 1 und Gate 2 bzw. nach Messwerten in Gate 1 aber nicht in Gate 2 kenntlich gemacht. Diese Kennzeichnung, insbesondere durch Färbung, kann automatisch vom Rechner vorgenommen werden; Voraussetzung dafür ist die Darstellung der im Zuge des Korrelierungsvorganges erhaltenen Parameter in Form von Histogrammen und Scattergrammen und eine überlegte Auswahl der gewählten Parameter.
Mit dieser Auswertemöglichkeit können sehr genaue Identifikationen von Einzelzellen eines bestimmten Zelltyps erreicht werden. Die in einem Gate beinhalteten Zellen können in anderen Scattergrammen, wo andere Messparameter gegeneinander aufgetragen sind, farblich hervorgehoben und analytisch separat behandelt werden, so dass man die Eigenschaften von Zellen, die einmal in einem Gate (also durch zwei Messparameter) zu einer Population zusammengefasst wurden, spezifisch in Hinblick auf andere Objekteigenschaften untersuchen kann, ohne wiederum die Gesamtheit der vermessenen Zellen für die Auswertung heranziehen zu müssen. Die eigentliche Evaluation der Messwerte findet also nicht durch Einschränkungen bei der Bildanalyse, sondern an Hand bestimmter Objekteigenschaften innerhalb der Gesamtheit der vermessenen Objekte statt. Die bei dieser Auswertung ermittelten Parameter können verwendet werden, um die Festlegung der Wertebereiche der Parameter zu verbessern.
In Fig. 4 ist ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Anordnung schematisch dargestellt. Die Anordnung umfasst einen Träger 1 für Gewebepräparate 2. Die entsprechend gefärbten Gewebepräparate 2 werden mit einer elektronischen Bildaufnahmeeinrichtung 3 durch eine Anzahl von Farbkanälen 4 aufgenommen. Die Bilder in der entsprechenden Färbung werden dem Rechner 5 in digitaler Form zugeführt und unter Verwendung eines Prozessors 6 ausgewertet. Der Rechner umfasst eine Parametereingrenzungseinheit 7, die vorteilhafterweise als Softwaretool ausgeführt ist und mit der Wertebereiche für die Zellparameter vorgegeben werden können. Es kann dabei vorgegangen werden, wie in Fig. 1 dargestellt ist, dass eine bestimmte Kerngröße und Färbung als Parameterwert für Zellkerne 11 und 11' vorgegeben wird und z.B. ein stark 11 und ein schwach 11' gefärbter Zellkern markiert werden. Damit erfolgt eine Eingrenzung des Parameters Färbeintensität der Zellkerne in dem dargestellten Bild auf einen minimalen und auf einen maximalen Wert. Auch andere Parameter können eingegrenzt werden.
In derselben Weise kann z.B. auch die Zellgröße auf einen Parameterbereich eingegrenzt werden. In Fig. 1 rechts unten sind eine stärker gefärbte große Zelle 12 und eine geringer gefärbte kleinere Zelle 12' markiert und diese bilden somit die Bereichsgrenzen für die Parameter Zellgröße und Färbeintensität gemäß der gesamten Zellerstreckung bzw. Zellfläche. Prinzipiell ist es auch möglich, derartige Parameterwerte bzw. Bereich händisch bzw. nach Erfahrungswerten oder aufgrund von vorangehenden Auswertungen erhaltener
Ergebnisse einzugeben und festzulegen. Diese Parameter werden sodann der Korrelation der identifikationsgefärbten und der strukturgefärbten Bilder zugrunde gelegt.
Der Rechner 5 umfasst des weiteren einen Speicher 8 für die gewählten Parameter bzw. für ermittelte Parameter und des weiteren einen Bildspeicher 9 für die verschieden gefärbten, aufgenommenen digitalen Bilder.
Eine Korrelierung der für die Zellkerne ermittelten Bildinhalte mit den für die zielstrukturgefärbten Zellobjekte ermittelten Bildinhalte erfolgt in einer Korrelierungseinheit 10. In der Korrelierungseinheit 10 erfolgt rechnerisch das Zellwachstum, insbesondere unter Beachtung der lagemäßigen Zuordnung von den ermittelten Zellkernen und den, ausgehend von diesen Zellkernen, wachsenden Zellflächen. Die Darstellung der Bilder der gefärbten Gewebepräparate und/oder rekonstruierten Zellen und/oder der Histogramme und Scattergramme erfolgt auf einem Monitor 14.
Die erfindungsgemäßen Verfahrensschritte werden mittels entsprechenden Recheneinheiten bzw. Hardware-Bauteilen und -Programmen der erfindungsgemäßen Anordnung vorgenommen.