WO2001092876A2 - Verfahren zur identifizierung von verbindungen zur modulierung der aktivität eines tumorsuppressorproteins - Google Patents

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Definitions

  • the N-terminal half of Merlin shows great homology with the ezrin-radixin-moesin (ERM) family of the proteins related to band 4.1 that are not tumor suppressors (review article by Gusella et al., 1999).
  • the ERM proteins combine the actin cytoskeleton with transmembrane proteins.
  • the N-terminal domains of the ERM proteins bind in vitro to a sequence motif of charged amino acids of the cytoplasmic region of the transmembrane proteins CD44, CD43 and ICAM-2, while the C-termini of the ERM proteins are associated with actin (Yonemura et al. , 1998, J. Cell. Biol. 140, 885-895).
  • Both the ERM proteins and Merlin are modified by phosphorylation and therefore presumably have two functions different states (Matsui et al., 1998; Shaw et al., 1998b; see also review article by Hall, 1998).
  • the N- and C-terminal domains of the ERM proteins can associate intramolecularly.
  • the phosphorylation of these proteins is believed to have an effect on the association of the NC termini and an effect on how the ERM proteins interact with certain binding partners in the cell. It is not yet known what factors regulate phosphorylation or what role Merlin modifications play in growth regulation.
  • the conformation of the contact inhibition complex during logarithmic growth is shown schematically in FIG.
  • the cytoplasmic complex may contain several other proteins, the identity of which has not yet been established. Different ligands can bind to the extracellular side.
  • At least two different specific ligands can bind to the extracellular side of CD44, namely a ligand which is suitable for logarithmic growth is characteristic, and a second, which occurs in confluent cells and mediates contact inhibition.
  • Another variant describes a process characterized in that a gene construct containing a promoterless thymine kinase gene (Hilhie, 1979, Nucl. Acid Res. 7, 859) is used in step b) under the control of a Ras-dependent promoter. Besides, this is Variant characterized in that Gancyclovir is used in step d).
  • the Schwannoma cell line RT4-D6-P2T and the mouse fibroblasts NIH3T3 were purchased from the European Collection of Animal Cell Cultures (Salisbury) and in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM; Gibco-BRL, Düsseldorf) with the addition of 10% fetal bovine serum ( Gibco-BRL). All cells were kept in a humidified atmosphere with 5% CO 2 at 37 ° C.
  • FIG. 6A An equal number of cells that either grew exponentially or were confluent were lysed and the lysate was subjected to 8% SDS polyacrylamide gel and immunoblotted with a Merlin specific antibody (C18).
  • the upper part of Figure 6A shows clone 5 4 without doxycycline (to detect endogenous merlin).
  • the lower part shows the cells of the same clone 8 hours after the addition of doxycycline (development time of the film approximately 30 times shorter).
  • CD44 is both a tumor suppressor and an oncogene.
  • the function of CD44 depends on ligands and presumably on tumor-specific regulation and tumor-specific mutations.
  • CD44 activates Merlin in its suppressor function.
  • the smallest isoform, namely CD44s, is shown in the diagram.
  • Larger splice variants can probably also activate Merlin.
  • a signal transmission interference by Merlin blocks the activation by growth factors and by the Ras-Raf pathway of promoters such as the CD44 promoter. The Ras-dependent exon installation is also disturbed, which reduces the production of larger CD44 variants.
  • both CD44s and the CD44 splice variants act as a platform for the presentation of growth factors and other growth-related molecules.
  • the hyaluronidase destroys the ligand responsible for the activation of merlin in confluent cells, while sequestering a ligand from exponentially growing cells removes the blocking of the merlin activation.
  • Cells from clone 5 4 were plated at low or high cell density, grown for 24 hours under serum deprivation and treated with doxycycline (+) or not (-) during the last 8 hours. Where indicated, the cells were treated with hyaluronidase (HAase, 5 U / ⁇ l) for 2 hours, with soiCD44wt for 10 minutes and / or with PDGF (5 ng / ml) for 5 minutes.
  • the proteins of the Lysates were separated by SDS-PAGE and immunoblots were carried out with antibodies specific for phospho-Erk and Erk. With clone 6 3 , the same results were obtained as in all experiments in FIG. 6.
  • the CD44 ligand hyaluronate mimics high cell density and leads to

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität des intrazellulären Tumorsuppressorgens nf2 verändern, wobei durch eine extrazelluläre Wechselwirkung der Verbindungen mit dem Zelloberflächenprotein CD44 das durch das Gen nf2 kodierte Protein NF2 in seiner Aktivität verändert wird.

Description

Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Modulierung der Aktivität eines Tumorsuppressorproteins
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen im Bereich von Tumorsuppressoren.
Eine wichtige Eigenschaft von Zellen des mehrzelligen Organismus ist ihre Fähigkeit, mit der Proliferation aufzuhören, wenn der ihnen zugeordnete Raum ausgefüllt ist. Dieser Vorgang, der als Kontaktinhibierung bezeichnet wird, ist bereits seit langem bekannt. Das Zeichen, auf das die Zellen während des Vorgangs der Kontaktinhibierung ansprechen, könnte der Kontakt der Zellen untereinander bzw. der Kontakt zwischen den Zellen und der extrazellulären Matrix sein. Der Vorgang der Kontaktinhibierung erfordert, daß ein oder mehrere Oberflächensensoren vorhanden sind, die mit dem Zellkern kommunizieren, den Zellzyklus zum Stillstand in der G1 -Phase bringen und auf diese Weise eine Hemmung des Wachstums bewirken. In vitro, in der Zellkultur, vermehren sich normale Zellen so lange, bis sie die Oberfläche des Kulturgefäßes aus, bleiben dann in der G1/G0-Phase stehen, wenn sich eine dichte Einzelzellschicht gebildet hat (Kontakt-Inhibition). Ein weiteres Erscheinungsbild des Wachstumsstopps besteht in ihrer Unfähigkeit zur Kolonienbildung, wenn sie in einer Matrix ausreichender Dichte (Weichagar) eingebettet sind. Die vollständigen Mechanismen, aufgrund derer die Zelle das Wachstum einstellt, sind noch weitgehend unbekannt. Der Verlust der Kontaktinhibierung und Kolonienbildung in Weichagar sind Eigenschaften, die für Krebszellen charakteristisch sind.
Typ-Il-Neurofibromatose (NF2) ist eine erbliche Multitumor-Erkrankung. An dieser Krankheit leidet weltweit jede 40 000. Personen. Das betroffene Gen wurde als nf2 identifiziert, welches das sonst unter der Bezeichnung Merlin bekannte NF2-Genprodukt kodiert (Merlin d.h. moesin-ezrin-radixin- artiges Protein, auch Schwannomin genannt). Typisch für NF2 ist das Auftreten bilateraler Tumoren des achten Kranialnervs, die als Schwannome bezeichnet werden. Außerdem weisen NF2-Patienten Ependymome, Meningiome, Spinalschwannome sowie
Linsenkapseltrübungen auf. Mäuse, bei denen beide Merlinallele gestört sind, sind nicht lebensfähig. Bei heterozygoten Mäusen, denen nur ein Allel fehlt, entstehen aggressive Tumore, deren Zellen das gesunde Allel verloren haben. Der Verlust der Heterozygotie am π 2-Lokus findet sich auch bei Tumoren der spontan auftretenden Schwannomen, Meningiomen und Ependymomen (Evans D. G. et al., 1992; J. Med. Genet. 29, 841-846; Jacoby L. B. et al., 1996; Genes Chromosomes Cancer 17, 45-55; Twist E. C. et al., 1994, Hum. Mol. Genet. 3, 147-151). Biachi und Cheng berichten, daß nf2-Mutationen auch bei Tumoren vorkommen, die mit der NF2-Krankheit nicht in Verbindung stehen, darunter Mesotheliomen und Mammakarzinomen (Bianchi A. B. et al., 1994; Nat. Genet. 6, 185-192; Cheng et al., 1999, Genes Chromosomes Cancer 24, 238-242).
McCIatchey et al. haben an Mäusen, mit gezielt eingeführten nf2- Mutationen, gezeigt, daß Merlin an mehreren Zelltypen, auch außerhalb des Nervensystems, als Tumorsuppressor agiert (McCIatchey et al., 1998, Genes Dev. 12, 1121-1133). Fehlen des NF-2 Proteins Merlin führt zu metastasierenden Tumoren. Aus diesen und anderen Daten ergibt sich für Merlin eine allgemeine Funktion als Tumorsuppressor (Rouleau et al., 1987, Nature 329, 246-248; Reviewartikel von Gusella et al., 1999, Biochim. Biophys. Acta 1423-M29-36).
Die N-terminale Hälfte von Merlin weist große Homologie mit der Ezrin- Radixin-Moesin-(ERM)-FamiIie der mit Bande 4.1 verwandten Proteine auf, bei denen es sich nicht um Tumorsuppressoren handelt (Reviewartikel von Gusella et al., 1999). Nach Tsukita und Yonemura (1997, Trends Biochem. Sei. 22, 53-58) verbinden die ERM-Proteine das Actin-Zytoskelett mit Transmembranproteinen. Die N-terminalen Domänen der ERM-Proteine binden in vitro an ein Sequenz-Motiv geladener Aminosäuren des zytoplasmatischen Bereichs der Transmembranproteine CD44, CD43 und ICAM-2, während die C-Termini der ERM-Proteine mit Actin assoziiert sind (Yonemura et al., 1998, J. Cell. Biol. 140, 885-895).
Durch die Ähnlichkeit zwischen den ERM-Proteinen und Merlin in Bezug auf die N-terminale Sequenz kann Merlin entweder die funktionellen Eigenschaften der ERM-Proteine teilen und/oder mit den ERM-Proteinen um eine gemeinsame Interaktionsstelle konkurrieren. Sainio et al. (1997, J. Cell. Sei. 110, 2249-2260) fand eine Colokalisierung mikroskopisch eines der Transmembranproteine, nämlich CD44, mit Ezrin und Merlin. Des weiteren wurde auch gefunden, daß abhängig von bis jetzt unbekannten Bedingungen Merlin auch im Zytoplasma lokalisiert ist (LaJeunesse et al., 1998, J. Cell. Biol. 141 , 1589-1599). Die Transmembranproteine CD44, CD43 und ICAM-2, an die Proteine der ERM-Familie binden, können auf der anderen Seite der Plasmamembran, dem extrazellulären Bereich unterschiedliche Liganden haben. In DE 40 14 510 werden Antikörper beschrieben, die an Variante CD44- Oberflächenproteine binden. Sleeman et al. (1997, J. Biol., Chem. 272, 31837-31844) beschreibt CD44 als einen Rezeptor für Glycosaminoglycane, wie z.B. Hyaluronat. Nach Sherman et al. (1995, J. Neuro-Oncology 26, 171-184) ist CD44 in einigen Zellinien der wichtigste Hyaluronatrezeptor.
Sowohl die ERM-Proteine als auch Merlin werden durch Phosphorylierung modifiziert und liegen daher vermutlich in zwei funktioneil unterschiedlichen Zuständen vor ( Matsui et al., 1998; Shaw et al., 1998b; siehe auch Reviewartikel von Hall, 1998). Die N- und C-terminalen Domänen der ERM-Proteine können intramolekular assozieren. Es wird angenommen, daß die Phosphorylierung dieser Proteine einen Einfluß auf die Assoziation der N-C-Termini ausübt und eine Wirkung darauf hat, wie die ERM-Proteine mit bestimmten Bindungspartnern in der Zelle interagieren. Es ist bisher weder bekannt, durch welche Faktoren die Phosphorylierung reguliert wird, noch welche Rolle Merlin-Modifikationen bei der Wachstumsregulation spielen.
Merlin scheint jedoch in mehreren Zelltypen als antiproliferatives Protein zu wirken. Transfektionexperimente von Merlin in Ratten-Schwannome (Sherman et al., 1997, Oncogene 15, 2505-2509) oder NIH3T3-Ze!len (Lutchman et al., 1995, Cancer Res. 55, 2270-2274; Tikoo et al., 1994, J. Biol. Che. 269, 23387-23390) haben bewiesen, daß Merlin die Zeilproliferation hemmt und der Ras-Transformation entgegen wirkt. Da ein Großteil der NF2-Patienten Merlinmutationen in der N-terminalen Hälfte trägt (Koga et al., 1998, Oncogene 17, 801-810), scheint der N- Terminus für die Proliferationskontrolle besonders wichtig zu sein. Sherman et al. zeigten, daß eine Überexpression von Merlin in der experimentellen Ratten-Schwannomzellinie RT4-D6P2T sowohl in vitro als auch in vivo das Zellwachstum hemmt. Diese stark wachstumshemmende Wirkung führte jedoch nach mehreren Zellteilungen zu einem Verlust der Merlinexpression. Deshalb war bisher eine mechanistische biochemische Analyse der Funktion von Merlin noch nicht möglich.
Somit ist offensichtlich, daß Merlin (NF2) als Tumorsuppressor eine entscheidende Rolle bei der Zeilproliferation und bei der
Wachstumskontrolle einnimmt. Da Merlin die Proliferation von verschiedenen Zelltypen hemmt, kann es als Breitband-Tumorsuppressor angewandt werden. Deshalb ist es insbesondere für die Krebsforschung von höchster medizinischer Relevanz, Verbindungen zu identifizieren, die einen positiven Einfluß auf die Aktivität von Merlin als Tumorsuppressor ausüben. Durch die in der vorliegenden Erfindung beschriebene Assoziation der Tumorsuppressorfunktion mit dem Transmembranprotein CD44 kommen, neben intrazellulär wirkenden Drogen, insbesondere extrazellulär angreifende Moleküle in Frage. Um diese extrazellulären Verbindungen zu identifizieren, muß ein System mit einem genau definierten Signalweg bereitgestellt werden. Dies ist ebenfalls Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Aktivität des intrazellulären Tumorsuppressorgens nf2 verändern, wobei durch eine extrazelluläre Wechselwirkung der Verbindungen mit dem Zelloberflächenprotein CD44 das durch das Gen nf2 kodierte Protein NF2 in seiner Aktivität verändert wird.
Das Verfahren ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Gens nf2 oder die Aktivität des Proteins NF2 gesteigert wird.
Um eine induzierte, kontinuierliche Merlinexpression zu ermöglichen, wurde ein erfindungsgemäßes System mit einem genau definierten Signalweg entwickelt. Dieses System ist dadurch gekennzeichnet, daß Klone der Rattenschwannomzellinie RT4-D6P2T verwendet werden, die sowohl einen Expressionsvektor, kodierend für einen reverse-tet- Repressor, als auch ein Merlin-cDNA-Plasmid unter der Kontrolle einer tet- Repressor-Erkennungssequenz enthalten. Der reverse-tet-Repressor dient als Transkriptionsaktivator (Gossen et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 5547-51). Die Klone besitzen eine niedrige Basalexpression von Merlin, die durch Zugabe von Doxycyclin stark induziert wird. Die Induktion von Merlin hemmt nachweislich das Tumorwachstum in vivo und in vitro. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist in Fig. 1A, B, C, E und Fig. 2A dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Induktion der Merlin-Expression im Ratten-Schwannomsystem das Tumorwachstum in vivo und in vitro supprimiert und daß sich deshalb dieses System zur Untersuchung der Merlinfunktion und der Identifizierung von regulatorisch wirkenden Verbindungen eignet.
Ferner kann mit dem erfindungsgemäßen Ratten-Schwan nomsystem kann eine exakte mechanistische Analyse der biochemischen Funktion von Merlin durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft auch die Schritte im Wirkungsmechanismus von Merlin als Tumorsuppressor. Der Verlust der Kontaktinhibierung bei Tumorzellen wird häufig beobachtet und hängt mit der Aktivierung bestimmter onkogengetriebener Signalübertragungskaskaden zusammen. Mit Hilfe des Ratten-Schwannomsystems kann gezeigt werden, daß Merlin zur Wiederherstellung der Kontaktinhibierung die Ras-MAP-Kinase- Signalübertragungskaskade beeinflußt. Dazu wird der Einfluß von Merlin auf die direkte Aktivierung der Komponenten dieses Signalübertragungsweges als Reaktion auf die Stimulation durch einen Wachstumsfaktor untersucht, bevorzugt die PDGF-abhängige Aktivierung von Erk (Serin-Threonin-Kinase) (Fig. 3 A). Bei einer durch Doxycyclin induzierten Merlinexpression wird eine verringerte Aktivierung von Erk nach PDGF-Behandlung festgestellt, jedoch nur bei konfluenten Zellkulturen. In Zellklonen mit induzierbarer Merlinexpression kann die konstitutiv aktive Ras, Raf oder MEK auf Koloniebildung in Weichagar und auf Erk-Aktivierung in Gegenwart bzw. Abwesenheit von Doxycyclin getestet werden. Mit dieser Methode kann der genaue Angriffsort von Merlin in der Signalübertragungskaskade bestimmt . werden. Die Ergebnisse aus Fig. 3 zeigen, daß Merlin die Signalübertragung dem Niveau von oder stromabwärts von Raf jedoch noch vor der Aktivierung von MEK (Tyrosin-Threonin-Kinase) stört. Dies wird von den Ergebnissen in Fig. 4 bestätigt. Ein MEK-Aktivierungshemmstoff hat die gleiche Wirkung wie Merlin hat, nämlich die Hemmung des Ras-MEK-Wegs, die Induktion von p27 sowie des Zellzyklus-Stillstands.
Die Erfindung umfaßt auch die Anwendung des erfindungsgemäßen , Ratten-Schwannomsystem bei der Aufklärung der Rolle der N- und C- terminalen Domänen von Merlin, da bei NF2-Patienten Mutationen im N-
Terminus am häufigsten sind. Werden die Molekülhälften in vitro vermischt, so sind sie zur Reassoziation fähig. Untersuchungen mit stabil in das Schwannomzellsystem eingeführten tet-induzierbaren Konstrukten, die entweder für die N-terminale Hälfte oder die C-terminale Hälfte von
Merlin kodieren, haben gezeigt, daß die Reassoziation auch in vivo stattfindet. Eine Coexpression der beiden Konstrukte in derselben Zelle führt wieder zur vollen Merlin-Aktivität, obwohl sie als zwei getrennte
Peptide exprimiert werden. Das heißt, die beiden Domänen, hier Molekülhälften, können innerhalb der Zellen assoziiert werden (Fig. 1C, D und Fig. 2B).
Mit dem erfindungsgemäßen Ratten-Schwannomsystem, bei dem die Merlinexpression kontrolliert induziert werden kann, ist es möglich, einen weiteren Schritt im Mechanismus der .Merlinwirkung auf die Proliferation von Zellen zu untersuchen. Hält man Schwannomzellen in Kultur, so proliferieren nichtinduzierte Zellen bei Erreichen der Konfluenz in der für Tumorzellen typischen Form weiter. Sie gehorchrn Kontaktinhibitionssignalen nicht oder unzureichend. Bei induzierten Zellen, d.h. bei Zellen mit einem hohen Expressionsniveaus von Merlin, induziert durch Doxycyclin, tritt ein Wachstumsstopp sowie eine Erhöhung des Anteils von Zellen in der G1 -Phase bei Konfluenz auf. Diese Zellen ähneln folglich transformierten Zellen, die Kontaktinhibierungssignalen gehorchen (Fig. 2B). Merlin liegt daher in zwei unterschiedlichen Formen vor, nämlich wachstumssupprimierend bei hoher Zelldichte und inaktiv bei niederer Zelldichte. Die Induktion der aktiven Form führt daher zu den Folgen, die üblicherweise bei nicht transformierten Zellen zu beobachten sind. Diese sind nämlich die Anhäufung von hypophosphoryliertem Retinoblastomprotein Rb sowie ein Anstieg der Zelizyklusinhibitoren p21 und p27 im Zellkern, wodurch der Einbau von Thymidin reduziert wird (Fig. 5A) (St. Croix et al., J. Cell Biol. 142, 557-71 , 1998). D. h., daß Merlin den Schritt in der Signalkaskade „stört", welcher die Progression des Zellzyklus beeinflußt.
Merlin weist ferner strukturelle Unterschiede auf, welche mit der Funktion korrelieren und von der Zelldichte abhängig sind, d. h. Merlin wird durch posttranslationale Modifizierungen aktiviert. Elektrophoretische Auftrennung und Westem-Blots von RT4-D6P2T-Zell-Lysaten lösen Merlin in zwei Banden auf (Fig. 6A). Bei den nicht-konfluenten Kulturen überwiegt eine langsamer wandernde Bande, während eine zweite, rascher wandernde Bande nur bei Konfluenz zu beobachten ist. Da die langsamer wandernde Bande bei Verdau der Lysate mit Kälberdarm-Phosphatase verschwindet, handelt es sich bei der rascher wandernden Bande um eine hypophosphorylierte Merlinform (Fig. 6B). Das hypophosphorylierte Molekül ist jedoch nur in Lysaten von konfluenten Kulturen oder von in Weichagar gezüchteten Zellen zu beobachten, auch dann, wenn die Expression von Merlin stark induziert ist. Diese Ergebnisse bedeuten, daß die hypophosphorylierte Merlinform als Wachstumssuppressor wirkt und daß Bedingungen, welche die Kontaktinhibierung fördern, die Merlinphosphorylierung und -funktion hemmen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität des intrazellulären NF2 Proteins verändern, indem die Aktivierung von NF2 erfindungsgemäß durch Dephosphorylierung des Proteins erfolgt.
Weitere Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben ergeben, daß Merlin als inaktives Molekül synthetisiert wird. Die Aktivierung erfordert die Bedingungen einer konfluenten Zellkultur. Da die Wirkung von Merlin als Wachstumssuppressor und sein Phosphorylierungsstatus von der Zelldichte abhängig sind, kann die Merlinfunktion als Reaktion auf Interaktionen zwischen den Zellen und/oder zwischen Zelle und Matrix geändert werden. Eine Aktivierung durch einen extrazellulären Reiz erfordert eine Signalübertragung durch die Plasmamembran hindurch, z.B. über ein Transmembranprotein.
Wie Sainio et al. zeigten, geht Merlin in vitro mit dem zytoplasmatischen Bereich von CD44 eine Wechselwirkung ein.
Coimmunpräzipitationsexperimente im Rahmen dieser Erfindung haben gezeigt, daß Merlin unter Verwendung des für CD44 spezifischen Antikörpers 5G8 mit CD44 (Sleeman et al., 1996, Cancer Res. 56, 3134- 3141) nur dann in einer Coimmunpräzipitation gefällt wird, wenn die Zellen Konfluenz erreichen (Fig. 7A; für die Zellen in der log-Phase nicht gezeigt, siehe jedoch Fig. 7D). Das bedeutet, daß nur die hypophosphorylierte Form von Merlin mit CD44 assoziiert.
Die o. g. Wechselwirkungen zwischen CD44 und Merlin an der
Zellmembran ist erforderlich, damit Merlin die Zeilproliferation inhibieren kann. Dies beweisen Experimente mit stabilen, aus den erfindungsgemäßen induzierbaren Schwannomzellen hergestellten Klonen, die den zytoplasmatischen Bereich von CD44 in Fusion mit GST (Smith and Johnson, 1988, Gene 67, 31) als lösliches Zytoplasmapeptid überexprimieren. Das Zytoplasma-Fusionsprotein wird in diesen Klonen 20-mal stärker exprimiert als das endogene CD44 (Fig. 7B). Das CD44- zytoplasmatischer-Bereich/GST-Fusionsprotein sequestriert- Merlin von seiner Aktivierungsstelle am Transmembran protein CD44 und blockiert so die durch Merlin verursachte Wachstumshemmung in Weichagar. Im Gegensatz dazu hat die Expression von GST alleine keine Auswirkung auf die Merlinfunktion (Fig. 7B).
Bei einem ähnlichen Klon, der das CD44- zytoplasmatischer Bereich/GST- Fusionsprotein mit einer Mutation in der ERM-proteinbindenden Domäne exprimiert, wird die durch Merlin hervorgerufene Wachstumshemmung nicht aufgehoben (Fig. 7B). Dies zeigt, daß Merlin von den zytoplasmatischen Bereichen des Wildtyp-CD44, jedoch nicht von den zytoplasmatischen Bereichen der Mutante in einer lmmunpräzipitation gefällt wird (Fig. 7C).
Obwohl, wie das oben beschrieben Ergebnis zeigt, Merlin in Wechselwirkung mit der ERM-proteinbindenden Domäne von CD44 tritt, steht es nicht in direkter Konkurrenz mit Ezrin um diese Domäne. Ezrin kann nicht mit CD44 aus Lysaten konfluenter Kulturen coimmunpräzipitiert werden (Fig. 7A). Unter konfluenten Bedingungen bindet nur Merlin an den zytoplasmatischen Bereich von CD44 (Fig. 7C). Dies zeigt eine Untersuchung der Assoziation von Ezrin mit CD44, bei der Zellen verwendet werden, die das CD44-zytoplasmatischer Bereich/GST-
Fusionsprotein stabil exprimieren und dieses Protein mit
Glutathionagarose (Fig. 7C) oder durch lmmunpräzipitation mit einem
GST-Antikörper (Fig. 7D) isoliert wird. Im Gegensatz dazu assoziiert während der exponentiellen Wachstumsphase Ezrin mit CD44, und Merlin nicht (Fig. 7D). Das heißt, daß die Bindung von Merlin an CD44 die Bindung von Ezrin ausschließt und umgekehrt. Außerdem hängt die Funktion beider Proteine von ihrer Wechselwirkung mit CD44 ab (Fig. 1D). Unter den gleichen Wachstumsbedingungen sind Merlin und Ezrin jedoch nicht gleichzeitig aktiv.
In Fig. 8 ist die Konformation des Kontaktinhibierungskomplexes während des logarithmischen Wachstums schematisch dargestellt. Auf der Zytoplasmaseite der Zellen befindet sich ein Komplex entweder mit Merlin und einer Phosphatase oder mit Ezrin und einer Proteinkinase. In beiden Fällen bleiben die beiden Komponenten dicht beieinander. Der Zytoplasmakomplex kann noch mehrere andere Proteine enthalten, deren Identität noch nicht geklärt ist. An der extrazellulären Seite können unterschiedliche Liganden binden.
Innerhalb der Zelle kann Merlin in zwei Konformationen vorliegen, so daß es für den Zellzyklus bei Konfluenz hemmend wirkt, während der log- Phase jedoch das Voranschreiten des Zellzyklus gestattet oder sogar fördert. Das bedeutet, einerseits unterliegt der Merlinkomplex an der Zellinnenseite zwischen Konfluenz und logarithmischem Wachstum einer Veränderung von hypo- nach hyperphosphoryliert, andererseits bestimmen erfindungsgemäß Liganden an CD44 im extrazellulären Bereich die Bestandteile und Eigenschaften des Komplexes wie in Fig. 8 und 9 dargestellt.
Eine Ausführung der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität des - intrazellulären Tumorsuppressors NF2 verändern dadurch gekennzeichnet, daß a) eine Zellkultur mit einem dominanten Onkogen ausgestattet wird, b) diese „onkogene" Zellkultur zusätzlich mit einem Genkonstrukt ausgestattet wird, welches ein promotorloses Reportergen unter der Kontrolle eines Ras-abhängigen Promotors (Hofmann, 1993, Cancer Res. 53, 1516) enthält, c) diese so erhaltene Zellkultur mit einer Verbindung versehen wird, die durch Wechselwirkung mit einem Zeiloberflächenprotein potentiell die intrazelluläre Aktivität von NF2 steigern kann, d) der so behandelten Zellkultur zusätzlich eine Substanz zugesetzt wird, die durch das Expressionsprodukt des
Reportergens umgesetzt werden kann, e) ggf. die in d) zugesetzte Substanz wieder entfernt wird, f) die so behandelte Zellkultur zur Vermehrung der Zellen mit einem entsprechenden Kulturmedium versehen wird und g) eine Verbindung aus c) tatsächlich als eine solche identifiziert wird, welche die intrazelluläre Aktivität von NF2 steigert, was sich in Reduktion der Zellvermehrung und/oder der Expression des Reportergens äußert.
Erfindungsgemäß erfolgt die Änderung in der Aktivität von Merlin durch die Wechselwirkung von CD44 mit Merlin auf der intrazellulären Seite der Plasmamembran und durch Wechselwirkung von CD44 mit Liganden auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran. Mögliche Liganden können vor der Bindung an die Zellmembran durch Zugabe Proteinen die nur dem extrazellulären Teil von CD44 zur Zellkultur wegefangen und an der Bindung zum Transmembranprotein gehindert werden. Sie können dadurch auch isoliert und identifiziert werden. Solche Proteine sind z. B. Splicevarianten und Mutanten von CD44 (CD44s). Die Ergebnisse der Versuche mit der kleinsten Splicevariante CD44s zeigen, daß bei konfluenten Zelikulturen, bei denen die Expression von Merlin durch Doxycyclin induziert wird, die Wachstumshemmung aufgehoben wird (Fig. 10). Im Gegensatz dazu bleibt die Wachstumshemmung bei der Verwendung einer CD44s-Mutante, der die Glycosaminoglycanbindung fehlt, bestehen. Das bedeutet, die Aktivierung von Merlin erfolgt durch ein Glycosaminoglycan das an CD44 an der extrazellulären Membranseite bindet.
Dementsprechend ist eine Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens dadurch gekennzeichnet, daß ein Ratten-Schwannomsystem, enthaltend Klone von RT4-D6P2T-Zellen, verwendet wird, wobei diese Klone sowohl einen Expressionsvektor, kodierend für einen reverse-tet-Repressor, als auch ein Merlin-cDNA-Plasmid unter der Kontrolle einer tet-Repressor- Erkennungssequenz enthalten. Die Klone weisen eine niedrige Basalexpression von Merlin auf, die durch Zugabe von Doxycyclin stark induziert wird.
Die bisher beschriebenen Experimente haben gezeigt, daß über die
Wechselwirkung mit CD44 Merlin von extrazellulären Stoffen aktiviert wird.
Ein von Schwannomzellen synthetisiertes Glycosaminoglycan ist Hyaluronat. Eine Spaltung von Hyaluronat durch Hyaluronidase in einer konfluenten Kultur verhindert eine Wachstumshemmung (Fig. 10).
Andererseits zeigen die Ergebnisse aus Fig. 11 , wie Hyaluronat die
Wirkungen der Kontaktinhibierung in Kulturen logarithmisch wachsender
Zellen imitieren kann. Fig. 12 zeigt, daß eine durch Hyaluronat induzierte Aktivierung von Merlin auch bei NIH3T3-Zellen beobachtet wird, was folglich zur Induktion von p21 und p27 sowie zur Wachstumsverzögerung führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß vor der Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität des intrazellulären Tumorsuppressorgens nf2 verändern, eine beliebige Zellkultur auf ihre Eignung getestet wird, indem durch Zugabe von Hyaluronat und/oder anderer spezifischer Antikörper gegen die Hyaluronatbindungsstelle auf CD44 das Zellwachstum gehemmt wird.
Die Aktivierung von Merlin, induziert durch Hyaluronat, führt zu Wachstumsstillstand, wenn die Kulturen eine hohe Zelldichte erreichen. In exponentiell wachsenden Kulturen können jedoch andere Liganden an CD44 gebunden vorliegen. Die Ergebnisse aus Fig. 10 zeigen, daß bei Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase die mit löslichem Wildtyp- sowie Mutanten-CD44s versetzt werden, eine Wachstumshemmung auftritt. Das bedeutet, daß Zellen in der log-Phase einen CD44-Liganden tragen, der auf Merlin hemmend wirkt, bei dem es sich jedoch nicht um Hyaluronat handelt. Durch Entfernung dieses hemmenden Liganden durch die lösliche extrazelluläre CD44~Domäne kommt es sofort zur Dephosphorylierung, d. h. Aktivierung von Merlin (Fig. 10B).
Eine weitere Variante der Erfindung betrifft ein Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität des intrazellulären Tumorsuppressorgens nf2 verändern, eine beliebige Zellkultur auf ihre Eignung getestet wurde, indem durch Zugabe von löslichen CD44-Proteinen, enthaltend extrazelluläre Domänen, und/oder Mutanten davon, die Wachstumshemmung in konfluenten Kulturen aufgehoben wird und/oder die Wachstumshemmung bei Kulturen in der log-Phase induziert wird.
An der extrazellulären Seite von CD44 können mindestens zwei unterschiedliche, spezifische Liganden binden, nämlich ein Ligand, der für logarithmisches Wachstum charakteristisch ist, sowie ein zweiter, der in konfluenten Zellen vorkommt und die Kontaktinhibierung vermittelt.
Bisher sind jedoch nur sehr wenige physiologisch wirksame Verbindungen bekannt, die als extrazelluläre Liganden die Aktivierung von Merlin regulieren. Die Kenntnis solcher Liganden könnte jedoch bei der Tumortherapie nützlich sein. Diejenigen Verbindungen, die Merlin aktivieren, müßten das Tumorwachstum verringern. Ein Screening auf solche CD44-Liganden zur Identifikation von tumorsupprimierenden Verbindungen ist daher von hoher medizinischer Relevanz.
Dies kann mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren und Systemen durchgeführt werden oder mit anderen Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung betrifft einen Negativ- Test, dadurch gekennzeichnet, daß als dominantes Onkogen das Gen RasV12 (Lowy 1993, Ann. Rev. Biochem., 62, 851) eingesetzt wird. Als Ras-abhängiger Promotor wird der Promotor des c-fos-Gens (Verma, 1987, Adv. Cancer Res. 49, 29) oder des Gens der menschlichen Collagenase (Angel et al. Cell, 1987) eingesetzt. Das dominante Onkogen treibt die Expression des Reportergens. Unter diesen Bedingungen exprimieren die Zellen so lange das Genprodukt des Reportergens bis die Aktivierung von Merlin zum Abschalten der Expression führt.
Eine andere Variante beschreibt ein Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) ein Genkonstrukt enthaltend ein promotorloses Thyminkinasegen (Hilhie, 1979, Nucl. Acid Res. 7, 859) unter der Kontrolle eines Ras-abhängigen Promotors eingesetzt wird. Außerdem ist diese Variante dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt d) Gancyclovir eingesetzt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Variante zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität des intrazellulären Tumorsuppressorgens nf2 verändern, das auf einem Positiv-Test beruht. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) des Verfahrens ein Genkonstrukt enthaltend ein promotorloses Reportergen eingesetzt wird, wobei in den Kodierbereich des Reportergens ein CD44- Exon (König, 1998, EMBO 17, 2904), bevorzugt das CD44-Exon v5, integriert ist. Des weiteren ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß bedingt durch eine gesteigerte Aktivität von NF2 durch die in Schritt c) zugesetzte Verbindung der durch Ras verursachte Einbau des CD44- Exons in reife mRNA des Reportergens verhindert wird und das Expressionsprodukt des Reportergens spezifisch nachgewiesen wird. Das Reportergen ist so eingesetzt hinter das Exon v5, daß es entweder nur abgelesen werden kann, nach Verlust der Sequenz des Exons v5, oder alternativ, nur in Gegenwart von v5 in der reifen RNA. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß als Reportergen ein promotorloses Luciferase-Gen (De Wet, 1987, Cell Biol. 7, 725) oder ein promotorloses Green Fluorescent Protein eingesetzt wird. Außerdem als Reportergene geeignet sind das lacZ-Gen kodierend für eine ß-Galaktosidase, Gene kodierend für fluoreszierende Proteine, z.B. GFP („green fluorescence protein,,) (Genbank accession nr. GFP U 47997) oder die entsprechenden rot bzw. blau fluoreszierenden Proteine, Gene kodierend für spezifische Oberflächenantigene die von Antikörpern identifiziert werden oder Gene die für eine Wirkstoff-Resistenz kodieren, wie z. B. Neomycin, Gentamycin, Hygromycin. Erfindungsgemäß werden Gene kodierend für fluoreszierende Proteine bevorzugt. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch alle nicht explizit aufgeführten und im Sinne der Erfindung geeigneten Selektionsmarker, die aus der Literatur bekannt sind.
Ferner ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Vektor zum Einsatz in ein Verfahren wie oben beschrieben, dadurch gekennzeichnet, daß er ein promotorloses Reportergen unter der Kontrolle eines Ras-abhängigen Promotors enthält sowie zusätzliche Strukturen, die für ein NF2- abhängiges, gezieltes Spleißen von Exons aus der abgeleiteten Prä- mRNA des Reportergens verantwortlich ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Verbindungen die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurden. In einer Variante der vorliegenden Erfindung sind diese Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie die CD44-spezifιschen Antikörper IM7 oder KM81 sind. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner die Verbindungen die niedermolekulare chemische Verbindungen, bevorzugt von Hyaluronsäure verschiedene Verbindungen, sind. Außerdem betrifft die vorliegenden Erfindung Verbindungen, die spezifisch an eine Sequenz eines Zelioberflächenproteins (hier CD44) binden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Krebserkrankungen.
Beispiele
1. Wachstumsfaktoren und Reagenzien
Diese wurden von den folgenden Firmen bezogen: rekombinanter menschlicher "platelet-derived growth factor" BB (Biomol, Hamburg); Doxycyclin (Sigma, Deisenhofen); Hyaluronat (Healon; hochmolekular; Pharmacia & Upjohn, Erlangen); Hyaluronidase Typ Vl-S aus Rinderhoden (Sigma); Glutathionagarose (Santa Cruz, CA); Nonidet P-40 (NP40; Boehringer Mannheim).
2. Antikörper
Zum Nachweisen von Merlin wurden polyklonale Kaninchenantikörper verwendet: A-19, N-terminaler Epitop; C-18, C-terminaler Epitop (Santa Cruz). Die Antikörper, die das Retinoblastomprotein (Rb) erkannten, stammten von Santa Cruz (C-15). Die Antikörper gegen den CD44- zytoplasmatischen Bereich wurden gemäß Standardmethoden hergestellt und sind anderswo beschrieben. Andere Antikörper: der für phosphoryliertes Erk spezifische Antikörper stammte von New England Biolabs (Schwalbach), die gegen Erk (K23), p27 (C-19), GST (Z-5) und Actin (1-19) stammten von Santa Cruz. Die für Ezrin spezifischen Antikörper (E13420) stammten von Transduction Labs (Dianova, Hamburg) und diejenigen für die Hämagglutinin-Marker (12CA5) von Boehringer Mannheim. Der für CD44 spezifische Antikörper 5G8 ist bereits beschrieben (Sleeman et al., 1996).
3. Plasmidkonstrukte pUHD17-1, das für den "revers tetracycline-dependent transactivator" (rtTA) kodiert, pUHC13-3, der "rtTA-responsive luciferase reporter" sowie pUHD10-3, der "rtTA-responsive cloning vector" (Gossen und Bujard, 1992; Gossen et al., 1995) wurden freundlicherweise von Hermann Bujard (Heidelberg) zur Verfügung gestellt. Die EcoR1 -Fragmente, die entweder für die vollständige Merlin-cDNA (NF2.17) oder die N-terminale Hälfte (NF2.17-N-term) bzw. die C-terminale Hälfte (NF2.17-C-term) kodieren (Sherman et al., 1997), wurden in pUHD10-3 subkloniert. Die pcDNA3- NF2-Mutanten 64, 413 sowie 535 sind wie bei Gutmann et al. (1999, Hum. Mol. Gen. 8, 267-285), beschrieben. Ratten-Ezrin-cDNA wurde aus einer aus der Ratten-Pankreastumorzellinie BSp73-AS hergestellten cDNA- Bibliothek unter Verwendung der folgenden Primer isoliert: 5'CTCGGAAGCTTAGCCACCAACCAGCCAAGATGCC3' und
5'GCCATGAATTCCTAGCCCGCATAGTCAGGAACATCGTATG GGTACATGGCCTCAAACTCGTCGATGCG3' für Vollängen-Ezrin; für das N-terminale Ezrin lautete der 3'-Primer
5"GCCATGAATTCCTAGCCCGCATAGTCAGGAATATCGTATGGGTACT GGGCCTTCATCTGCTGCACCTC3'. Der 3'-Primer kodierte außerdem einen Hämagglutinin-Marker. Die cDNAs wurden in pcDNA3.1 Moniert (Invitrogen, DeShelp). Vom CMV-Promoter regulierte
Expressionskonstrukte, die die verkürzte extrazelluläre CD44-Domäne kodierten, wurden wie beschrieben hergestellt (Aruffo et al., 1990, Cell 61 , 1303-1313). Eine Mutante des hyaluronatbindenden Motivs wurde wie von Bartolazzi et al. (1994, J. Exp. Med. 180. 53-66) beschrieben hergestellt. Das für den CD44-zytoplasmatischen Bereich kodierende Plasmid war wie bei Legg und isacke (1998, Curr. Biol. 8, 705-708), beschrieben, wurde mittels PCR aus dem Bakterien-Expressionsklon amplifiziert und in pEBG- 3x insertiert. Bei der für Ezrinbindung defizienten Konstruktmutante war Arginin in den Positionen 293 und 294 sowie Lysin in den Positionen 298, 299 und 300 durch Alanin substituiert (Legg und Isacke, 1998). Die Expressionskonstrukte, die die aktivierten Onkogene kodierten, lauteten folgendermaßen: Ras (Ieu61) (Medema et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11 , 5963-5967), Raf BXB (Bruder et al., 1992, Genes Dev. 6, 645-556), bezogen von Martin Schwarte, Scripps, MEK-1 DD, von Axel Knebel in pcDNA3.1 subkloniert (Mansour et al., 1994, Science 265, 996-997), bezogen von Acel Kebel, Dundee). Das mit Hämagglutinin-Marker versehene Plasmid Erk-2 wurde von Axel Ullrich (Martinsried) zur Verfügung gestellt).
4. Zellkulturen
Die Schwannomzellinie RT4-D6-P2T und die Mausfibroblasten NIH3T3 wurden von der European Collection of Animal Cell Cultures (Salisbury) käuflich erworben und in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; Gibco-BRL, Karlsruhe) mit einem Zusatz von 10% fötalem Rinderserum (Gibco-BRL) gezüchtet. Alle Zellen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% C02 bei 37°C gehalten.
5. Stabile sowie transiente Transfektion der Zellen
Alle Transfektionen wurden in Platten mit 6 Wells unter Verwendung des liposomalen Transfektionsreagenz DOTAP (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Zum Erhalt stabiler Klone wurden die Zellen unter Selektion mit dem geeigneten Antibiotikum gezüchtet. Zum Nachweis von Antibiotikaresistenz wurden die folgenden Plasmide cotransfiziert: pCEP4 (Invitrogen) für Hygromycin, pBabe (Invitrogen) für Puromycin sowie pcDNA3.1 (Invitrogen) für Neomycin (G418).
6. Herstellung von doxycyclininduzierbaren Merlinzellinien Das rtTA-Expressionskonstrukt pUHD17-1 wurde gemeinsam mit dem Puromycin-Marker in die Ratten-Schwannomzellinie RT4-D6-P2T cotransfiziert. Dreißig unabhängige puromycinresistente Klone (bei 1 μg/ml) wurden auf ihre Fähigkeit, die Expression des "tet-responsive" Luciferasereporterkonstrukts pUHC13-3 in einem Assay auf transiente Transfektion zu induzieren, untersucht (Gossen et al., 1995). Es wurden drei Stammklone erhalten, bei denen die spontane Expression niedrig war, die Luciferase-Expression jedoch bei Behandlung mit Doxycyclin stark induzierbar war. In diese Stammzellinien wurden entsprechende Plasmide kodierend für Merlin bzw. der Merlinmolekülhälften mit einem Neomycin- Marker stabil transfiziert. Unabhängige G418-resistente Klone (bei 500 μg/ml) wurden selektiert und die Induzierbarkeit nach Zugabe von Doxycyclin überprüft.. Bei allen in-vitro-Versuchen betrug die Doxycyclindosis 1 μg/ml.
7. Herstellung von löslichem CD44
Bei den Expressionskonstrukten handelte es sich um transfizierte COS-1- Zellen, und lösliches Protein wurde wie von Bartolazzi et al., (1994, J. Exp. Med. 180, 53-60) beschrieben aufgereinigt und quantifiziert.
8. Tumorwachstum in vivo
5x105 RT4-D6-P2T-Schwannomzellen, die über das doxycyclininduzierbare Merlinkonstrukt verfügten und in Calcium- und Magnesium-freiem PBS -resuspendiert waren, wurden Nacktmäusen subkutan in die rechte Flanke injiziert. Die Tumorvolumina wurden mit einem Tastzirkel bestimmt. Jeder Datenpunkt stellt das mittlere Tumorvolumen von vier Tieren +/- Standardfehler dar. Eine Woche vor der Tumorimplantation und dann während des ganzen Versuchs wurde in der entsprechenden Versuchsgruppe das Trinkwasser mit Doxycyclin (100 μg/ml) versetzt.
9. Zellwachstum in vitro
Weichagar-Kolonietest: die Zellen wurden mit Trypsin behandelt und in
Komplettmedium resuspendiert. Man versetzte mit 1/10 Volumen erwärmtem 3,3%igem Weichagar und beimpfte jedes Näpfchen einer 24- Well-Platte mit 1,25x103 Zellen. Nachdem die Platten zwei Minuten bei 4°C abgekühlt wurden, wurden sie inkubiert und die Kolonien nach 7 Tagen gezählt.
Wachstum in Kuturgefäßen: Zur Bestimmung der Wachstumskurven wurde jedes Näpfchen einer 24-Well-Platte mit 5x103 Zellen (bei Fig. 7 2,5x103) beimpft, und alle 24 Stunden (Tage) wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt. Definition der Wachstumsbedingungen:
1. Niedrige Zelldichte (= logarithmisches oder exponentielles Wachstum) bedeutet Zelldichte von 500 Zellen pro cm224 Stunden nach dem Überimpfen.
2. Hohe Zelldichte (= konfluente Wachstumsbedingung) ist definiert als Zelldichte von 5x103 Zellen pro cm224 Stunden nach dem Überimpfen.
10. Phosphorylierung von Erk Die Zellen wurden ohne bzw. mit 0,8% Methylcellulose bei niedriger Dichte in 6-Well-Platten und bei hoher Zelldichte in 24-Well-Platten überimpft. Die Zellen blieben 24 Stunden serumfrei und wurden die letzten 8 Stunden mit Doxycyclin behandelt bzw. blieben unbehandelt. Dann wurden die Zellen 5 Minuten mit 5 ng/ml PDGF stimuliert und anschließend in 2x Laemmli- Probenpuffer geerntet, und die Zellextrakte wurden auf einem 10%igem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nach dem Übertragen der Proteine auf Membran wurde mit einem für Phospho-Erkspezifischen Antikörper Immunblots hergestellt und der gebundene Antikörper nachgewiesen. Zur Kontrolle gleichmäßiger Beladung des Trenngels mit Erk wurde die Membran gestrippt (von Antikörper befreit) und Anti-Erk geblottet.
11. lmmunpräzipitation
Für die lmmunpräzipitation von Merlin wurden die Zellen in 10-cm-Schalen bis zur Konfluenz gezüchtet, einmal in eiskaltem PBS gewaschen und dann auf Eis mit 1 ml Lysepuffer pro Platte (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5% NP-40, 1 mM PMSF, 10 μg/Aprotinin ml, 10 μg/ml Leupeptin) lysiert. Die DNA wurde mittels einer Nadel der Stärke 26 geschert. Das Lysat wurde durch Zentrifugation geklärt und der Überstand mit 5 μg/ml Merlin-Antikörper bei 4°C über Nacht unter langsamem Rotieren inkubiert. Anschließend wurde mit 30 μl Protein-A-Agarose (Dianova) versetzt und noch weitere 3 Stunden bei 4°C rotieren gelassen. Die Immunkomplexe wurden 4mal mit kaltem Lysepuffer gewaschen und in 50 μl 2x Laemmli-Probenpuffer getrennt. Das Protein wurde in einer 10%igen SDS-PAGE aufgelöst und es wurden lmmunblotts mit einem für Merlin spezifischen Antikörper erzeugt. Zur Behandlung mit Kälberdarmphosphatase (CIP) wurde das Lysat vor der lmmunpräzipitation 1 Stunde bei 30°C mit 1 Einheit CIP inkubiert. Die Coimmunpräzipitation von Merlin und CD44 wurde entsprechend durchgeführt, nur daß ein unterschiedlicher Lysepuffer verwendet wurde (20 mM Tris pH7,4, 50 mM NaCl, 3 mM MgCI2, 0,5% NP40). Die Lysate wurden mit Protein-A/G-Agarose (Dianova) 2 Stunden zur Entfernung unspezifisch bindender Komponenten vorinkubiert, wonach man mit 5 μg/ml CD44-Antikörper 5G8 versetzte und über Nacht rotieren ließ. Die
Immunkomplexe wurden mit Protein-A/G-Agarose gefällt. Zur Copräzipitation mit den überexprimierten Peptiden der zytoplasmatischen
Bereichs von CD44 wurden die Lysate mit Glutathionagarose (Santa Cruz) oder mit 5 μg/ml GST-spezifischem Antikörper und anschließend mit
Protein-A/G-Agarose behandelt. Die lmmunpräzipitation von mit HA markiertem Erk wurde wie oben beschrieben durchgeführt, nur daß die Zellen in RIPA-Puffer (10 nM Tris pH7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% TritonX100, 0,1% SDS, 0,5% Desoxycholat, 10 mM NaF, 1 mM Vanadat) lysiert wurden. 12. lmmunblotting
Nach der Gelelektrophorese wurden die Proteine auf Immobilon- Membranen (Millipore, Eschborn) übertragen. Die Membranen wurden eine Stunde bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer (10% Magermilch, 0,1% Tween, 10 mM Tris pH 7,6, 100 mM NaCl) und anschließend noch eine Stunde oder über Nacht bei 4°C mit den Primärantikörpern in Blockierungspuffer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden die Membranen eine " Stunde bei Raumtemperatur mit dem Sekundärantikörper inkubiert, mittels Chemilumineszenzverstärkung (Amersham, Braunschweig) entwickelt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Figur 1.
Tumorsuppressorfunktion von reguliert exprimiertem Merlin in der Schwannomzellinie RT4-D6P2T exprimiertem Merlin.
A. Doxycyclininduzierbare Merlin-Expressionsklone. RT4-D6P2T-Zellen wurden mit einem doxycyclininduzierbaren Merlin-Vektor und dem r-tet- Regulator stabil cotransfiziert. Drei unterschiedliche Klone wurden auf Merlin-Expression untersucht. Die Zellen wurden 8 Stunden nach der Doxycyclinzugabe geerntet, lysiert und einer SDS-PAGE sowie einem Westem-Blotting mit Antikörpern, die gegen den C-Terminus (C18) von Meriin gerichtet waren, unterzogen. Der Blot, der endogenes Merlin in einem Vektorkontrollklon zeigt, wurde ungefähr 20mal länger exponiert.
B. Merlin hemmt das Tumorwachstum in vivo. Wachstum eines subkutanen Tumors nach Injektion von Klon-54-Zellen in Nacktmäuse. Wo angegeben wurde das Trinkwasser mit Doxycyclin versetzt. Die Versuche wurden auch mit den anderen Merlin exprimierenden Klonen 23, 63 und 6 durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erzielt wurden.
C. Meriin reduziert die Agarkoloniebildung. Doxycyclininduzierbare Klone, die entweder Wildtyp-Merlin oder Merlin-Molekülhälften exprimierten, oder
Klone, die sowohl die N- als auch die C-terminale Hälfte von Merlin exprimierten, wurden in Weichagar gegeben. Die Klone wurden aufgrund ihrer ungefähr gleich starker Expression ausgewählt. Ihre Expression 8 Stunden nach Zugabe von Doxycyclin wurde mittels Westem-Blotting unter Verwendung von Antikörpern nachgewiesen, die entweder gegen den C-Terminus (C18; Tafel 1 , 2 und 4) oder den N-Terminus (A19; Tafel 2 und 4) von Merlin gerichtet waren. In Tafel 4 stellen die beiden Bahnen links den Westem-Blot mit A19, die beiden Bahnen rechts denjenigen von C18 dar. Die Koloniezahlen pro Näpfchen sind aufgetragen. Die Ergebnisse wurden auch mit den Klonen 23, 63 und 6 durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erzielt wurden.
D. N-Terminales Ezrin-Peptid stört die Merlinfunktion. Der Klon 54 wurde wie angegeben mit den Merlin- und Ezrin-Expresssionsvektoren gemeinsam mit einem Expressionsvektor für Hygromycinresistenz stabil supertransfiziert. Hygromycinresistente Klone wurden in Weichagar gegeben. Die Expressionniveaus waren ähnlich wie bei C.
E. Den Klonen mit mutiertem Merlin fehlt gemäß Agarkoloniebildungsassay die Tumorsuppressorfunktion. Die bezeichneten stabilen Transfektanten (siehe auch Methoden) wurden aif ihre Fähigkeit in Weichagar Kolonien bilden zu können, untersucht.
Figur 2.
Merlin reduziert die Zeilproliferation bei hoher Zelldichte in vitro. Die getrennt exprimierten N- und C-terminalen Peptidhälften von Merlin reassoziieren in vivo.
A. Einbau von 3H-Thymidin in Schwannomzellen mit oder ohne exogene(r) Merlin-Expression. Jeweils 3 Wells einer 24-Well-Platte wurden mit 2,5x104 Schwannomzellen, die vorher mit einem Kontrollvektor oder einem doxycyclinabhängigen Merlinvektor transfiziert wurden, beimpft. Wo angegeben, wurden die Zellen über Nacht mit Doxycyclin behandelt. Die Zellen wurden anschließend 3 Stunden mit 2 μCi/ml 3H-Thymidin (Amersham) markiert, zweimal mit PBS gewaschen und in 200 μl 0,2 M NaOH solubilisiert. Die in den Zellen eingebaute Radioaktivität wurde in einem Flüssigkeitsszintillationszähler bestimmt und als mittlere CPM aufgetragen, und die Standardfehler wurden berechnet.
B. Die N-terminale Hälfte von Meriin wird mit dem C-Terminus copräzipitiert. Cos-1 -Zellen wurden mit den Merlin-Konstrukten pcDNA3- N-terminal und pcDNA3-C17-terminal transient transfiziert. Nach 36 Stunden wurden die Zellen mit Nonident P-40 Puffer (50 mM Tris-HCI ph 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% Nonident P-40, 10 μg/ml Aprotinin, 1 mM PMSF, 10 μg/ml Leupeptin) lysiert. Die Proteine wurden aus den Lysaten mit einem für den C-Terminus von Merlin spezifischen Antikörper (C-18, Santa Cruz) bei 4°C über Nacht durch lmmunpräzipitation gefällt und anschließend 3 Stunden mit Protein-A-Agarose (Oncogene Science) inkubiert. Die Immunkomplexe wurden durch Zentrifugation gewonnen und 4mal mit Lysepuffer gewaschen. Die Proteine wurden mit 2x Laemmli- Puffer eluiert und in einem Westem-Blot mit einem für den N-Terminus von Meriin spezifischen Antikörper (A-19, Santa Cruz) untersucht (2B links). Zum Nachweis der lmmunpräzipitation der C-terminalen Merlinfragmente wurde der Blot nochmals mit dem für den C-Terminus von Merlin spezifischen Antikörper C-18 als Sonde behandelt (Tafel rechts).
Figur 3.
Merlin interferiert die Signalübertragung.
A. PDGF-abhängige Phosphorylierung von Erk. Zellen des Merlin exprimierenden Klons 54 wurden bei niedriger oder hoher Dichte bzw. in Methylcellulose (Methocel) in Kulturschalen gegeben und 24 Stunden unter Serumentzug wachsen gelassen. Wo angegeben, war vor der PDGF-Behandlung (5 ng/ml) Doxycyclin 8 Stunden lang anwesend. Die Zellen wurden 5 Minuten später geerntet, und mit den Lysaten wurde eine SDS-PAGE sowie ein Westem-Blotting auf phosphoryliertes Erk sowie Gesamt-Erk durchgeführt. B. Hemmbarkeit der Ras, Raf und MEK abhängigen Agarkoloniebildung durch Merlin. Der induzierbare Klon 5 wurde mit Expressionskonstrukten, die für konstitutiv aktive Mutanten von Ras, Raf oder MEK kodieren, stabil supertransfiziert und in Weichagar gezüchtet. C. Einfluß von Ras, Raf und MEK abhängige Phosphorylierung von Erk. Der doxycyclininduzierbare Klon 54 wurde im Verhältnis 5:1 mit Konstrukten, die für die konstitutiv aktiven Mutanten von Ras, Raf oder MEK kodierten, sowie mit einer mit Hämagglutinin-Marker versehenen Erk-Version cotransfiziert. Die Zellen wurden dicht ausplattiert, 24 Stunden unter Serumentzug kultiviert und bei den angegebenen Experimenten 8 Stunden mit Doxycyclin behandelt, gefolgt von Lyse und Westem-Blotting wie unter A beschrieben. Die Versuche von A bis C wurden mit den Klonen 23, 63 und 67 wiederholt, wobei ähnliche Ergebnisse erzielt wurden.
Figur 4. Die Hemmung von MEK führt zur Erhöhung von p27Kιp1 und zu einem Anstieg an hypophosphoryliertem Rb.
Merlininduzierbare Schwannomzellen wurden in einer Dichte von 1,5x104 Zellen pro Well auf 6-Well-Platten ausplattiert. Wo angegeben, wurde mit 1 μg/ml Doxycyclin zugesetzt. Nach 16 Stunden wurde 2 bzw. 12 Stunden lang ein MEK-Aktivierungshemmstoff (UO126; Promega) zugegeben. 0 bedeutet keine Hemmstoffzugabe. Die Zellen wurden geerntet und in 2x Laemmli-Puffer solubiiisiert, und die Proteine wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Proteine wurden auf eine Membran übertragen, und es wurde entweder mit dem polyklonalen p27Kip1 -Antikörper C-19 aus dem Kaninchen oder mit dem für Rb spezifischen Antikörper C-15 ein Immun-Blot durchgeführt (Santa Cruz). Als Ladekontrolle wurde der für Actin spezifische Antikörper 1-19 verwendet.
Figur 5.
Aktivierung von Merlin bei hoher Zelldichte.
A. Wachstum der parentalen RT4-D6P2T-Zellen des Klons 54 (induzierbar) für Merlin-Expression) sowie Vektorkontrollzellen in Kulturschalen (dreifache Wiederholung in 24-Well-Schalen). Die Zellen wurden in niedriger Zelldichte ausgesät und die Zunahme der Zellzahl nach 1 bis 5 Tagen in An- oder Abwesenheit von Doxycyclin gezählt. Kurven wurden durch Auftragen der Zellzahl gegen die Zeit erstellt. Die Standardfehler sind angegeben. Die Versuche wurden auch mit den Klonen 23, 63 und 67 durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erzielt wurden.
B. Immunologischer Nachweis des Rb-Proteins von Zellen des Klons 54 am 3. Kulturtag in An- oder Abwesenheit von Doxycyclin.
Figur 6. Hohe Zelldichte führt zur Dephosphorylierung von Merlin.
A. Eine gleiche Anzahl von Zellen, die entweder exponentiell wuchsen oder konfluent waren, wurde lysiert, und das Lysat wurde einem 8%igen SDS-Polyacrylamidgel sowie einem Immunblotting mit einem für Merlin spezifischen Antikörper unterzogen (C18). Der obere Teil von Figur 6A zeigt den Klon 54 ohne Doxycyclin (um endogenes Merlin nachzuweisen). Der untere Teil zeigt die Zellen des gleichen Klons 8 Stunden nach der Zugabe von Doxycyclin (Entwicklungszeit des Films ungefähr 30mal kürzer).
B. Immun-Blots von Immunpräzipitaten. Die langsamer wandernde Bande verschwindet, wenn vor- dem Auftragen auf das Gel mit
Kälberdarmphosphatase (CIP) verdaut wird.
Figur 7.
Die Funktion von Merlin hängt von einer Interaktion mit dem Transmembranprotein CD44 ab.
A. Durch Doxycyclin induziertes Merlin wird mit dem für CD44 spezifischen Antikörper (5G8) kopräzipitiert. Konfluente Zellen des Klons 54 wurden 8 Stunden mit Doxycyclin behandelt und lysiert. Mit den Lysaten wurde entweder direkt oder nach der Behandlung und de Isolierung der Proteine mit Protein-A/G-sepharoseperlen mit oder ohne vorherige Zugabe eines Antikörpers (CD44, 5G8) eine SDS-PAGE durchgeführt. Immunblots wurden der Reihe nach mit für Merlin und für Ezrin spezifischen Antikörpern erstellt. Die Ezrin-Antikörper kreuzreagieren mit Moesin. B. Die Sequestrierung von Merlin durch eine Bindung an überexprimierte lösliche CD44-zytoplasmatischen Bereich homologe Peptide hebt die Funktion von Meriin auf. Der doxycyclininduzierbares Merlin exprimierende Klon von 54 wurde mit Expressionskonstrukten, die entweder für den CD44-zytoplasmatischen Bereich in Wildtypform oder in Form einer Mutante, beide in Fusion mit GST kodieren, stabil transfiziert. Die mutierte Form wurde aufgrund ihrer Unfähigkeit, Ezrin zu binden, gewählt (siehe Text sowie Methoden). Subklone mit hohen Expressionsniveaus (siehe Westem-Blot mit für CD44-zytoplasmatischen Bereich spezifischen Antikörpern) wurden selektiert. In Weichagar wurde ihre Koloniebildungsfähigkeit in An- oder Abwesenheit von Doxycyclin bestimmt.
C. und D. Copräzipitation von Merlin und Ezrin mit dem überexprimierten zytoplasmatischen Bereich von CD44. C. Die Zellen von B wurden in hoher Dichte ausplattiert. 8 Stunden nach Zugabe von Doxycyclin wurden die Zellen lysiert und die GST-Fusionspeptide mittels GSH-Agarose angereichert. D. Mit Doxycyclin behandelte Kulturen bei niedriger Zelldichte wurden lysiert, und die GST-Fusionspeptide wurden mit für GST spezifischen Antikörpern gefällt. Es sind die Immunblots mit für Merlin, Ezrin und CD44- zytoplasmatischen Bereich spezifischen Antikörpern dargestellt. Zu bemerken ist, daß aus technischen Gründen von Zellen in der log-Phase weniger Protein geerntet wurde.
Figur 8.
CD44 ist sowohl ein Tumorsuppressor als auch ein Onkogen. Die Funktion von CD44 hängt von Liganden und vermutlich von der tumorspezifischen Regulation und tumorspezifischen Mutationen ab. In seiner Suppressorfunktion aktiviert CD44 Merlin. Im Schema ist die kleinste Isoform, nämlich CD44s, gezeigt. Vermutlich können größere Spleißvarianten Merlin ebenfalls aktivieren. Eine Störung der Signalübertragung durch Merlin blockiert die Aktivierung durch Wachstumsfaktoren und durch den Ras-Raf-Weg von Promotern wie u. a. dem CD44-Promoter. Außerdem wird der Ras-abhängige Exoneinbau gestört, wodurch die Produktion größerer CD44-Varianten verringert wird. Im Wachstumsmodus agieren sowohl CD44s als auch die CD44- Spleißvarianten als Plattform für die Präsentation von Wachstumsfaktoren und anderen mit dem Wachstum in Zusammenhang stehenden Molekülen. Im Schema ist nur eine große CD44-Variante gezeigt (das in Vierecke geteilte Feld stellt variable Exonsequenzen dar). Anzeigt ist auch die Oligomerisierung der Varianten Spleißform. Alle CD44-Varianten, die an den Exons v6 und v7 kodierte Sequenzen tragen, neigen zur Cluster- Bildung (durch Pfeile symbolisiert), die vermutlich die Plattformfunktion fördern.
Figur 9.
Modell der Wirkung von CD44 unter Bedingungen des exponentiellen und konfluenten Wachstums.
Spezifische Liganden bestimmen zwei Funktionszustände von CD44, die die Zytoplasmakomplexe beeinflussen. GF = Wachstumsfaktor, MMP = Metalloprotease, PP = Proteinphosphatase. Das graue Feld bedeutet, daß wahrscheinlich noch zusätzliche Komponenten mit den an CD44 gebundenen Komplexen assoziiert sind. Figur 10.
Ligandenabhängige Aktivierung von Merlin bzw. Blockierung der Aktivierung.
A. Die lösliche extrazelluläre Domäne von CD44 sequestriert unterschiedliche Liganden von exponentiell wachsenden und konfluenten
Zellen. Je 3 Wells einer 24-Well-Platten wurden in dreifacher Wiederholung mit Zellen des Klons 54 beimpft, und die Zellen wurden mit Doxycyclin behandelt, um die Expression von Merlin zu induzieren. Am 1. Tag (logarithmisch wachsende Zellen) bzw. am 3. Tag (konfluente Zellen) wurde mit 10 ng/ml löslicher extrazellulärer Domäne von CD44, und zwar entweder des Wildtyps (solCD44 oder solCD44wt) oder der Glycosaminoglycan-Bindungsmutante (solCD44mut) versetzt. Als Kontrolle wurden Zellen ohne Doxycyclin auf gleiche Weise behandelt (da die Zugabe von solCD44 wirkungslos blieb, ist nur eine Datengruppe gezeigt).
B. Induzierte Dephosphorylierung von Merlin in exponentiell wachsenden Zellen als Reaktion auf solCD44wt. Nachweis von Merlin in Lysaten exponentiell wachsender Zellen des Klons 54, die 8 Stunden mit Doxycyclin behandelt wurden, mittels Immun-Blot. Vergleich der Zellen in Abwesenheit von solCD44wt oder 5 Minuten nach Zugabe von 10 ng/ml soICD44wt. Gelauflösung wie in Figur 4.
C. Die Hyaluronidase zerstört den für die Aktivierung von Merlin in konfluenten Zellen verantwortlichen Liganden, während durch Sequestrieren eines Liganden von exponentiell wachsenden Zellen eine Blockierung der Merlin-Aktivierung aufgehoben wird. Zellen des Klons 54 wurden bei niedriger bzw. hoher Zelldichte ausplattiert, 24 Stunden unter Serumentzug wachsen gelassen und während der letzten 8 Stunden mit Doxycyclin behandelt (+) oder nicht (-). Wo angegeben, wurden die Zellen 2 Stunden mit Hyaluronidase (HAase, 5 U/μl), 10 Minuten mit soiCD44wt und/oder 5 Minuten mit PDGF (5 ng/ml) behandelt. Die Proteine der Lysate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, und es wurden mit für Phospho-Erk und Erk spezifischen Antikörpern Immunblots durchgeführt. Mit Klon 63 gelangte man zu den gleichen Ergebnissen wie bei allen Versuchen in Figur 6.
Figur 11.
Der CD44-Ligand Hyaluronat imitiert hohe Zelldichte und führt zur
Aktivierung von Merlin.
A. Induzierte Dephosphorylierung von Merlin in exponentiell wachsenden Zellen als Reaktion auf Hyaluronat-Zugabe. Der Versuch wurde wie in
Figur 6A beschrieben durchgeführt, nur daß statt solCD44wt Hyaluronat (HA) zugegeben wurde.
B. Wachstumsverzögerung durch Hyaluronat. Je 3 Wells einer 24-Well- Platten wurden in dreifacher Wiederholung mit Zellen des Klons 54 beimpft. Doxycyclin und Hyaluronat (100 μg/ml) wurden wie angegeben zugesetzt.
C. Durch Hyaluronat aktiviertes Merlin blockiert die PDGF-abhängige Phosphorylierung von Erk. Zellen werden bei niedriger Zelldichte kultiviert, anschließend unter Serumentzug und mit Doxycyclin behandelt Zellen wie in Figur 6C dargestellt und auf PDGF-abhängige Erk-Phosphorylierung geprüft. Wo angegeben, war 10 Minuten lang HA (100 μg/ml) und 5 Minuten lang PDGF (5 ng/ml) vorhanden. Die Versuche von A bis C wurden auch mit dem Klon 63 durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erzielt wurden.
Figur 12
Die hyaluronanabhängige Aktivierung von Merlin in NIH3T3-Zellen verringerte ihre Wachstumsrate. Der Zellzyklusinhibitor p27Kιp1 wurde sowohl durch Zugabe von Hyaluronat als auch durch Zugabe von solCD44s erhöht. A. Wachstumsrate von NIH3T3-Zellen nach Zugabe von Hyaluronan. 24- Well-Platten wurden in dreifacher Wiederholung in einer Dichte von 0,5x104 Zellen mit NIH3T3-Zellen beimpft. Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium wo angegeben mit 100 μg/ml Hyaluronan (Healon) versetzt. Die Zellzahlen wurden dann an jedem der folgenden 3 Tage bestimmt.
B. Induktion von p27Kip1 durch Behandlung mit Hyaluronan. NlH3T3-Zellen wurden in 6-Well-Platten in einer Dichte von 1 ,5x104 Zellen ausplattiert. Am folgenden Tag wurde entweder mit 100 μg/ml Hyaluronan oder mit 10 ng/ml solCD44s versetzt und die Platten wurden 30 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden in 2x Laemmli-Probenpuffer geerntet und es wurde ein Immunblot mit einem polyklonalen für p27Kιp1 spezifischen Antikörper aus dem Kaninchen durchgeführt (C-19, Santa Cruz). Zur Ladekontrolle wurde ein polyklonaler Actin-Antikörper aus der Ziege (1-19, Santa Cruz) verwendet.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität des intrazellulären Tumorsuppressorgens nf2 verändern, wobei durch eine extrazelluläre Wechselwirkung der Verbindungen mit dem
Zeiloberflächenprotein CD44 das durch das Gen nf2 kodierte Protein NF2 in seiner Aktivität verändert wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Gens nf2 oder die Aktivität des Proteins NF2 gesteigert wird.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung von NF2 durch Dephosphorylierung des Proteins erfolgt.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß a) eine Zellkultur mit einem dominanten Onkogen ausgestattet wird, b) diese „onkogene" Zellkultur zusätzlich mit einem Genkonstrukt ausgestattet wird, welches ein promotorloses Reportergen unter der Kontrolle eines Ras-abhängigen Promotors enthält, c) diese so erhaltene Zellkultur mit einer Verbindung versehen wird, die durch Wechselwirkung mit einem Zeiloberflächenprotein potentiell die intrazelluläre Aktivität von NF2 steigern kann, d) der so behandelten Zellkultur zusätzlich eine Substanz zugesetzt wird, die durch das Expressionsprodukt des Reportergens umgesetzt werden kann, e) ggf. die in d) zugesetzte Substanz wieder entfernt wird, f) die so behandelte Zellkultur zur Vermehrung der Zellen mit einem entsprechenden Kulturmedium versehen wird und g) eine Verbindung aus c) tatsächlich als eine solche identifiziert wird, welche die intrazelluläre Aktivität von NF2 steigert, dadurch daß sich die Zellen vermehren und/oder das Expressionsprodukt des Reportergens spezifisch nachgewiesen wird.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt a) als dominantes Onkogen das Gen RasV12 eingesetzt wird.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Ras-abhängiger Promotor der Promotor des c-fos-Gens oder eines Collagenasegens eingesetzt wird.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) ein Genkonstrukt enthaltend ein promotorloses Thyminkinasegen unter der Kontrolle eines Rasabhängigen Promotors eingesetzt wird.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt d) Gancyclovir eingesetzt wird.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) ein Genkonstrukt enthaltend ein promotorloses Reportergen eingesetzt wird, wobei in den
Kodierbereich des Reportergens ein CD44-Exon, bevorzugt das
CD44-Exon v5, integriert ist.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Reportergen ein promotorloses Luciferase-Gen oder ein promotorloses Green Fluorescent Protein eingesetzt wird.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß bedingt durch eine gesteigerte Aktivität von NF2 durch die in Schritt c) zugesetzte Verbindung das CD44-Exon spezifisch aus der reifen mRNA des Reportergens herausgeschnitten und das Expressionsprodukt des Reportergens spezifisch nachgewiesen wird.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß bevorzugt ein Ratten-Schwan nomsystem, enthaltend Klone von RT4-D6P2T-Zellen verwendet wird, wobei diese
Klone einen Expressionsvektor, kodierend für einen reverse-tet- Repressor, als auch ein Merlin-cDNA-Plasmid unter der Kontrolle einer tet-Repressor-Erkennungssequenz enthalten.
13. Vektor zum Einsatz in ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß er ein promotorloses Reportergen unter der Kontrolle eins Ras-abhängigen Promotors enthält sowie zusätzliche Strukturen, die für ein NF2-abhängiges, gezieltes Splicing von Exons aus der abgeleiteten reifen mRNA des Reportergens verantwortlich ist.
14. Verbindungen identifiziert gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
15. Verbindungen gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie die CD44-spezifιschen Antikörper IM7 oder KM81 sind.
16. Verbindungen gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie niedermolekulare chemische Verbindungen, bevorzugt von
Hyaluronsäure verschiedene Verbindungen, sind.
17. Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch an eine Sequenz eines Zeiloberflächenproteins binden.
18. Verwendung der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Krebserkrankungen.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110904051B (zh) * 2019-12-26 2021-08-06 上海交通大学医学院附属第九人民医院 人源听神经瘤永生化细胞系、制备方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506119A (en) * 1990-05-07 1996-04-09 Kernforschungszentrum Karlsruhe Gmbh DNA encoding variant CD44 surface proteins associated with metastatic tumors
US6001356A (en) * 1995-09-29 1999-12-14 Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center Method of inhibiting tissue destruction in autoimmune disease using anti-CD44 antibodies

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1931895A (en) * 1994-03-14 1995-10-03 General Hospital Corporation, The Treatment of graft-versus-host disease

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506119A (en) * 1990-05-07 1996-04-09 Kernforschungszentrum Karlsruhe Gmbh DNA encoding variant CD44 surface proteins associated with metastatic tumors
US6001356A (en) * 1995-09-29 1999-12-14 Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center Method of inhibiting tissue destruction in autoimmune disease using anti-CD44 antibodies

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAJORATH JURGEN: "Molecular organization, structural features, and ligand binding characteristics of CD44, a highly variable cell surface glycoprotein with multiple functions." PROTEINS, Bd. 39, Nr. 2, 1. Mai 2000 (2000-05-01), Seiten 103-111, XP001053566 ISSN: 0887-3585 *
GUSELLA JAMES F ET AL: "Merlin: The neurofibromatosis 2 tumor suppressor." BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, Bd. 1423, Nr. 2, 25. M{rz 1999 (1999-03-25), Seiten M29-M36, XP001053528 ISSN: 0006-3002 in der Anmeldung erw{hnt *
HERRLICH PETER ET AL: "CD44 acts both as a growth- and invasiveness-promoting molecule and as a tumor-suppressing cofactor." ANNALS OF THE NEW YORK ACADEMY OF SCIENCES, Bd. 910, 2000, Seiten 106-120, XP001053547 Conference on Colorectal Cancer New Aspects of Molecular Bioloogy, Immunology and Clinical Applications;Berlin, Germany; October 08-09, 1999, aspects of molecular biology and immunology and their clinical applications. 2000 New York Academy of Sciences 2 East 63rd Street, New York, NY, 10021, USA ISBN: 1-57331-277-0 *
MORRISON HELEN ET AL: "The NF2 tumor suppressor gene product, merlin, mediates contact inhibition of growth through interactions with CD44." GENES & DEVELOPMENT, Bd. 15, Nr. 8, 15. April 2001 (2001-04-15), Seiten 968-980, XP002190162 ISSN: 0890-9369 *
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