WO2001079501A2 - Nucleic acid coding for at least one raf partial sequence with a mekk1 binding site - Google Patents

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WO2001079501A2
WO2001079501A2 PCT/DE2001/001518 DE0101518W WO0179501A2 WO 2001079501 A2 WO2001079501 A2 WO 2001079501A2 DE 0101518 W DE0101518 W DE 0101518W WO 0179501 A2 WO0179501 A2 WO 0179501A2
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Ulf R. Rapp
Thomas Wirth
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Rapp Ulf R
Thomas Wirth
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to nucleic acids which act on the nuclear factor KB (NFKB), substances for inhibiting this interaction, screening methods for determining such substances and pharmaceutical preparations prepared with such substances.
  • NFKB nuclear factor KB
  • raf protein in its various isoforms plays an important role in the regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis.
  • raf is an effector kinase from ras and an important link in the mitogenic cytoplasmic protein kinase (MAPK) signaling cascade (see Daum, 0., Eisenmann-Tappe, I., Fries, H.-W., Troppmair, J. & Rapp, UR (1994) Trends Biochem. Sci. 19, 474-479).
  • MAPK mitogenic cytoplasmic protein kinase
  • NF-kB / Rel transcription factors consists of 5 members in mammals (RelA, RelB, c-Rel, pl05 / NF- ⁇ Bl and pl00 / NF- ⁇ B2), which bind to DNA as homo- or heterodimeric complexes (Baldwin, AS (1996) Annu. Rev. Immunol. 14, 649-681; Schreck, R. , Kistler, B. & Wirth. (1997) in Transcripti on Factors m Eukarotes, eds. Papavassiliou, AG (RGLandes Company, Austin, Texas), pp.153-188.).
  • NF- ⁇ B family for certain cellular functions, such as proliferation, cytokine expression, differentiation or
  • the binding of one of the three inhibitor proteins I ⁇ B ⁇ , I ⁇ Bß or I ⁇ B ⁇ to this is responsible for the sequestration of the NF- ⁇ B / I ⁇ B complex in the cytoplasm (Whiteside, ST & Israel, A. (1997) Sem. Xancer Bi ol. 8, 75-82 ).
  • a large variety of substances trigger signal transduction cascades, which lead to the phosphorylation of specific serine residues in the NH 2 -terminal domains of the I ⁇ B proteins.
  • the phosphorylated I ⁇ B molecules are then poly- ubiquitinated and broken down via the Proteaso complex. This results in the release of NF- ⁇ B, which can migrate into the core.
  • Target genes regulated by NF- ⁇ B play important roles in immune, inflammatory and stress reactions, in cell adhesion and protection against apoptosis (Baeuerle, PA & Renkel, T. (1994) Annu. Rev. Immuno 1, 12, 141- 179; Siebenlist, TJ., Franzoso, G. & Brown, K. (1994) Annu. Rev. Cell. Biol. 10, 405-455).
  • the status of cell differentiation and the specific signal responsible for cell activation determine which set of target genes is transcribed by induction using NF- ⁇ B.
  • I ⁇ B degradation and consequently NF- ⁇ B activation can be induced in many cell types by multiple different stimuli. Therefore, several parallel transduction pathways must exist, all of which ultimately lead to I ⁇ B kinase activation and I ⁇ B degradation.
  • the best known signaling pathways include those for inflammatory cytokines tumor necrosis factor alpha (TNF ⁇ ) and interleukin 1 (IL1) (Malinin, NL, Boldin, MP, Kovalenko, AV & Wallach, D. (1997) Nature 385, 540-544).
  • TRAF proteins TRAF proteins
  • TRAF6 TNF-RI / TNF-RII and IL1R
  • MEKKl membrane Schüttle kinases
  • NIK NF- ⁇ B inducing kinase
  • TRAF proteins interact directly with NIK and it seems plausible that they activate NIK (Malinin, NL, Boldin, MP, Kovalenko, AV & Wallach, D. (1997) Nature 385, 540-544).
  • Other important proteins involved in these signal transduction processes are RIP and IRAK for TNF and IL1 (Lee, SY, Reichlin, A., Santana, A., Sokol, KA, Nussenzweig, MC & Choi, Y. (1997) Immuni ty 1, 703-713; Yeh, W.-C., Shahinian, A., Amsterdamr, D.,
  • IKK-1 and IKK-2 were identified independently of one another by biochemical purification of the active kinase and by a yeast two hybrid screening with NIK as bait (IKK-1). IKK-1 and IKK-2 phosphorylate I ⁇ B proteins directly and show a higher one
  • I ⁇ B-kinase complex has so far been identified: a protein called NEMO (NF- ⁇ B essential modulator) / IKK ⁇ , which appears to be important for the association or the function of the complex (Yamaoka, S., Courtois, 0., Bessia, C, Whiteside, ST, Weil, R., Agou, F., Kirk, HE, Kay, RJ & Israel, A.
  • NEMO NF- ⁇ B essential modulator
  • hbEGF heparin binding epidermal growth factor
  • the invention is based on the technical problem of finding an approach for inhibiting NF- ⁇ B activation and then subsequently finding active substances which are able to effectively suppress NF- ⁇ B activation and consequently to prevent proliferation of tumor cells.
  • NF- ⁇ B activation was examined as well as the mechanism by which PMA and raf NF- ⁇ B Induce activity. Inhibition of NF-KB activation was found to block raf transformation.
  • the NF- ⁇ B activation by raf and PMA depends critically on the I ⁇ B kinase complex, especially IKK-2. raf does not directly phosphorylate the I ⁇ B kinase proteins. Rather, this happens via the membrane kinase MEKKl. raf dependent activation is blocked by a dominant negative form of
  • MEKKl is therefore a new target for the inhibition of the raf-induced transformation, raf is a new one
  • the invention first teaches a nucleic acid coding for at least one raf partial sequence, the partial sequence containing a MEKK1 binding site, or coding for at least one binding site for raf containing partial sequence of MEKKl, or silent mutation of such a nucleic acid or nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or its silent mutation.
  • nucleic acid encompasses DNA, RNA and PNA. The one in the
  • raf part-sequence used in patent claims refers to protein or its amino acid sequence.
  • the raf partial sequence preferably contains the enzymatically active domain of raf protein.
  • Silent mutations mean variants in the sequence which do not lead to any functional difference, based on the binding site of the protein for MEKK1, of the variant compared to the natural, non-mutated sequence. Silent mutations can be alleles or artificial mutations.
  • nucleic acids hybridizing with nucleic acids according to the invention are those which hybridize under stringent conditions. Stringency typically occurs in a temperature range from 5 ° C to 25 ° C below the melting temperature during hybridization. Stringent conditions mean a hybridization with at least 95% sequence identity, preferably 98% sequence identity. With regard to the hybridization method on which these definitions are based, reference is made to the literature reference Sambrook, JM; Fritsch, EF; Manaitis, T; Molecular cloning. A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), and in addition to Southern, EM; Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis; J. Mol. Biol. 98, 503 (1975).
  • nucleic acids can be used to search for inhibitors of the signaling cascade found. In particular, it is possible to search for substances that block the MEKK1 binding site of the nucleic acid. You can also search for substances that mimic the natural nucleic acids, i.e. bind to MEKKl, but block it for its subsequent reactions. The nucleic acids can therefore be used as a screening tool and to search for suitable facial expression substances for the natural nucleic acids.
  • a nucleic acid according to the invention is preferably a cDNA.
  • the invention further teaches an isolated recombinant vector containing a nucleic acid according to the invention or an expression plasmid with this
  • Nucleic acid for stable expression, a DNA fragment coding for a suitable viral protein, for example gag, can also be used (fusion gag with, for example, raf or raf fragment).
  • a constitutively active variant can also be created by fusion with the carboxyl-terminal domain from ras to the kinase domain from raf.
  • a transformant can be generated using the expression plasmid form, which in turn can be used to produce the protein or peptide encoded by the nucleic acid. For this purpose, the transformant is cultivated in a suitable manner using customary methods.
  • the complex of the invention also includes substances for inhibiting the action of MEKKl.
  • This can be an antisense nucleic acid or a ribozyme binding to a nucleic acid according to the invention, in particular RNA.
  • This inhibits the formation of the protein encoded by the nucleic acid according to the invention.
  • this can also be a substance with a binding site for a protein or peptide encoded by a nucleic acid according to the invention selected from the group consisting of a) deactivated MEKKl (for example dominant negative), b) inactive proteins or peptides (inactive MEKKl analogs, ie proteins, which have the MEKKl binding site on raf, but are MEKKl-inactive), c) aptamers.
  • the protein itself which is encoded by the nucleic acid according to the invention, is inhibited by these substances. It is advisable to stabilize the aptamers against enzymes that cleave nucleic acids.
  • these are “tailor-made”, highly specific synthetic molecules for the MEKKl binding site of the protein encoded by the nucleic acid according to the invention.
  • the invention also includes a substance with a binding site for the binding site of MEKK1 to a protein or peptide encoded by a nucleic acid according to the invention, in particular kinase-inactive analogs / homologs from raf.
  • Analogs are proteins that have the binding site of the raf for MEKKl, but are kinase-inactive are. With such a substance, the MEKKl is blocked for binding to raf.
  • An example of this is a kinase-active variant of raf, in particular raf-BxB-CX 375W.
  • the invention further teaches the use of a substance according to the invention for blocking the binding of raf to MEKKl and its use for the production of a pharmaceutical preparation for the treatment of cancer.
  • the invention furthermore teaches the use of a nucleic acid according to the invention or a protein or peptide encoded thereby or a nucleic acid coding for at least one partial sequence of MEKKl protein containing a binding site or binding region to raf or one or more proteins or peptides encoded by such a nucleic acid a screening process to determine a substance that blocks the binding of raf to MEKKl.
  • the procedure is as follows. A protein or peptide containing or consisting of the binding region of raf or MEKKl for binding raf / MEKKl (determination see below) is produced. A prospective inhibitor is added to a solution containing this protein or peptide and the binding is examined.
  • Binding prospective inhibitors are selected, non-binding ones are discarded. It can be already drafted gear- with a mixture of prospective inhibitors, in which case a deconvolution (testing of individual inhibitors of the mixture or of sub-groups of the mixture of inhibitors) recomme ⁇ choose, when determined for a mixture bond has been. In the case of an identified inhibitor, it will be expedient to verify or to re-select the inhibitory effect by competitive binding in vitro or in vivo.
  • Competitive binding means that the prospective inhibitor reduces the number of binding events raf / MEKK1 in one experiment compared to the number of binding events without the prospective inhibitor or with a placebo substance.
  • the substances according to the invention can be used in a method for treating a human or animal body with tumor cells, in which a pharmaceutical preparation according to claim 9 is administered to the body, or wherein a substance according to one of claims 4 to 7 is used in the tumor cells by means of gene therapy methods Expression is brought.
  • the exact raf-side binding site for MEKKl can be easily determined or circled by specifically investigating the binding ability of MEKKl with different (with regard to the position and size of partial sequences) raf fragments. Fragments that show no binding do not contain the binding site; In contrast, fragments that show binding comprise the binding site.
  • the MEKKl-side binding site for raf can be determined analogously by using different partial sequences of MEKKl and binding assay compared to raf. It may be advisable to work with complete raf protein in the former case and with complete MEKKl protein in the latter case.
  • the invention also includes a method for identifying the binding regions of raf and / or MEKKl of the binding pair raf / MEKKl.
  • the invention teaches the use of a nucleic acid coding for at least a partial sequence of raf or a silent mutation of such a nucleic acid or a nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or its silent mutation in a screening method for examining the interaction of the protein or peptide encoded by the nucleic acid with the signaling cascade preceding the activation of NF- ⁇ B and the use of a nucleic acid coding for at least a partial sequence of raf or a silent mutation of such a nucleic acid or a nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or its silent mutation or proteins or peptides coded by such nucleic acids, in particular also of proteins or peptides which contain partial sequences obtained in the above-described method for identifying binding regions, preferably consisting of them, in a screening Method for determining inhibitors of the transformation of cells by raf-mediated activation of NF- ⁇ B.
  • Fig. 6 Results showing that raf and PMA induce NF- ⁇ B in HeLa cells independent of the MAPK cascade.
  • Fig. 7a-c results, which show that in vitro raf induced IKK activity, but not di rectly ⁇ IKK proteins phosphorylated
  • 8a-c results which demonstrate the interaction raf with MEKKl
  • Fig. 9 Different synergistic paths of the raf-induced cell transformation.
  • v-raf expression plasmid has been described in Troppmair, J., Potter, M., Wax, JS & Rapp, UR (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86, 9941-5.
  • the construction of hemagglutinin (HA-) tagged wild type raf BxB, BxB-CX and kinase-inactive BxB-CX, which carries a substitution of K by W in position 375, is described in the literature reference Flory, E., Weber, CK , Chen, P., Hoffmeyer, A., Jassoy, C. & Rapp, UR (1998) J. Virol.
  • raf BxB is an in-frame deletion of amino acids 22-303 from human c-raf-1
  • CX is the C-terminal targeting domain of Ki-ras.
  • VSV tagged IKK-2 and VSV tagged kinase-inactive IKK-2 have been described in the reference Yamaoka, S., Courtois, G., Bessia, C, Whiteside, ST, Weil, R., Agou, F., Kirk, HE, Kay, RJ & Israel, A. (1998) Cell 93, 1231 - 1240.
  • Dominant negative MEK-1 (MEK-S217A) was obtained from S. Cowley (Cowley, S., Paterson, H., Kemp, P.
  • the Luciferase Reporter Plasmids (3x ⁇ B.luc, 4x17. TATA,
  • HSV-tk-luc and the Gal-Elk expression vector have been described in the following references:
  • Monoclonal anti-HA antibodies (clone 12CA5) were purified using standard cell culture supernatant procedures using a HiTrap protein G sepharose column (Pharmacia).
  • Anti VSV antibodies (clone P5D4) were purchased from Sigma and antisera against IKK-1, IKK-2 and ERK-2 were obtained from Santa Cruz.
  • DMEM / Glutamax (Gibco BRL) supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 ⁇ M ß-mercaptoethanol and antibiotics. The same medium, but without ⁇ -mercaptoethanol, was used for the NIH / 3T3 cells. 3 ⁇ g of the ⁇ B-dependent luciferase reporter (3x ⁇ B.luc) or 4 ⁇ g of 4x17 were used for transient transfections. TATA Reporter used together with 1 ⁇ g RSV-Lac-Z. The total amount of DNA was 25-30 ⁇ g and was filled up with expression vectors. Typically, 10 ⁇ g of the expression vector in question and / or empty expression vector were used.
  • Jurkat T cells, S107 cells and Heia cells were washed twice in PBS, finally resuspended in 200 ⁇ l or 500 ⁇ l PBS and then transferred into cuvettes (BioRad, 4mm diameter). Then the DNA mix was added, mixed with the cell suspension and the mixture was subjected to electroporation using a BioRad gene pulser at 960 ⁇ F and 220V (Jurkat), 230V (S107) or 250V (Heia). Immediately after the electroporation, the cells were placed on ice (5 min.) And then for 5 min. Incubated at 20 ° C, followed by placing on medium (1/3 conditioned, 2/3 fresh). The samples were aliquoted and treated 16 hours after transfection as described for the figures. The cells were harvested 6 hours later. Luciferase activities were determined and ß-galactosidase levels were used to normalize for different transfection efficiencies.
  • NP-40 lysis buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM Na pyrophosphate, 25 mM Na glycerophosphate, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 1 mM NaV0 4 , 5 mM Benzamidm, 5 ⁇ g / ml aprotinin, and 5 ⁇ g / ml Leupeptm) lysed.
  • NP-40 lysis buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM Na pyrophosphate, 25 mM Na glycerophosphate, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 1 mM NaV0 4 , 5
  • Lysates were removed by centrifugation at 14,000 g for 30 min. cleared and normalized for protein content.
  • the immunoprecipitation was carried out for 2 hours at 4 ° C. on a rocking platform using either anti-VSV antibodies pre-adsorbed on protein G sepharose (for transfected cells) or on protein A beads pre-adsorbed IKK-2 antiserum (ICK-2 to prevent narrowing).
  • ERK activity assay cells were placed in RIPA buffer (25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate, 1% Nonidet P-40, 10% glycerol, 2 mM EDTA, pH 8.0, supplemented with ImM Na orthovanadate, 1 mM PMSF, 5 mM benzamidine, 5 ⁇ g / ml aprotinin, and 5 ⁇ g / ml leupeptin) lysed, followed by 5 clarification at 40,000 g for 30 min. Lysates were normalized for protein content and incubated for 2 hours at 4 ° C. with 8 ⁇ g anti-HA antibody (for transfected cells) or anti-ERK-2 antiserum (for 10 endogenous ERK2) pre-adsorbed on protein agarose (Boehringer Mannheim).
  • RIPA buffer 25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0.1% SDS
  • reaction was carried out in a total volume of 30 ⁇ l kinase buffer for 20 min. at 30 ° C and with constant stirring in the presence of 1 mM DTT, 10 ⁇ Ci [ ⁇ 32 P] ATP (specific activity: 3000Ci / mmol),
  • ERK-2 The activity of ERK-2 was determined using myelin basic protein as substrate (Gibco BRL) according to the literature Hoffmeyer, A., Avots, A., Flory, E., Weber, CK Serfling E. & Rapp, UR (1998 ) J Biol Chem273, 10112-9.
  • the pGEX-GST-IKKß kinase domain was obtained by subcloning the N-terminal fragment (amino acids 1-291) from VSV-IKKß in pGEX-2T (Pharmacia) using the endogenous BamHl sites.
  • E. coli bl21 was transformed with the plasmid and the protein expression was induced by adding isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside for 4 hours at 30 ° C.
  • the bacterial pellet was sonicated in PBS containing 1% Triton X-100.
  • GST fusion protein was precipitated using glutathione sepharose beads (Pharmacia).
  • the IKK ⁇ protein was further purified by means of chromatography through a mon Q column (Pharmacia). The purity of the eluted protein was better than 90%, as evidenced by SDS-PAGE and subsequent Coomassie staining of the gel. 1.8 Purification of active c-raf from Sf9 cells
  • Sf9 insect cells were treated with an MOI (multiplicity 5 of infection) of 5 with a GST-raf ⁇ l .
  • MOI multiplicity 5 of infection
  • 302 YY340-341DD GST-BxB-DD, provided by Dr. P. Cohen, Dundee, expressing baculovirus.
  • the cells were harvested 48 hours after infection and in RIPA buffer (25mM Tris-HCl, 137mM NaCl, 0.1% O SDS, 0.5% Deoxycholat, 1% Nonidet P-40, 10% Glycerol, 2mM EDTA, pH 8.0, supplemented with ImM Na orthovanadate, 1 mM PMSF, 5 mM benzamidine, 5 ⁇ g / ml aprotinin, and 5 ⁇ g / ml leupeptin) lysed. All subsequent steps were carried out at 4 ° C. 5 GST-BxB-DD was precipitated using glutation beads. The beads were washed twice with RIPA buffer as above and once for 5 min.
  • RIPA buffer 25mM Tris-HCl, 137mM NaCl, 0.1% O SDS, 0.5% Deoxycholat, 1% Nonidet P-40, 10% Glycerol, 2mM EDTA, pH 8.0, supplemented with ImM Na orthovanadate, 1 m
  • the fusion protein was dialyzed in 20 mM HEPES (pH 0 7.5), 150 mM NaCl, 10% glycerol and 1 mM DTT.
  • the purity of GST-BxB-YY340-341DD was approx. 70% according to SDS-PAGE and Coomassie staining.
  • the activity of the fusion protein was tested in an in vitro kinase assay using 5 recombinant kinaseinactive MEK as a substrate according to the following references: Baldwin, AS (1996) Annu. Rev. Immuno 1. 14, 649-681; Schreck, R., Kistler, B. & Wirth.
  • HA tagged raf proteins were obtained from transfected Jurkat cells according to Baldwin, AS (1996) Annu. Rev. Immunol. 14, 649-681, immune-reduced. 500 ng of purified GST-IKK ⁇ kinase domain were extracted with the specified raf proteins or purified GST-BxB-DD from Sf9 cells in kinase buffer (25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 25 mM ⁇ -glycerophosphate, 10 mg MgCl 2 , 100 ⁇ g ATP, 1 mM DTT) in the presence of 10 ⁇ Ci [ ⁇ 32 P] ATP for 20 mm. incubated at 30 ° C.
  • kinase buffer 25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 25 mM ⁇ -glycerophosphate, 10 mg MgCl 2 , 100 ⁇ g ATP, 1 mM DTT
  • Jurkat cells were incubated in hypotonic buffer (see: Digna, JD, Lebovitz, RM & Roeder, RG (1983) Nuel. Acids Res. 11, 1475-1489) and lysed by multiple passage through a 21 gauge needle. Lysates were cleared by centrifugation and normalized for protein content. For every assay 1 mg of lysate protein were incubated with 10 ⁇ g of purified GST-BxB-DD from Sf9 cells. Thermally deactivated GST-BxB-DD (90 ° C for 10 min.) was used as a control. The incubation was at 20 ° C for 5 20 min. and carried out with constant stirring in the presence of 10 ⁇ M ATP.
  • hypotonic buffer see: Digna, JD, Lebovitz, RM & Roeder, RG (1983) Nuel. Acids Res. 11, 1475-1489
  • IKK ⁇ and IKKß corresponds to IKK-1 and IKK-2).
  • Recombinant IKK ⁇ or IKKß (provided by Dr. J. Li: Li, J., Peet, GW, Pullen, SS, Schembri-King, 3., Warren, T. C, Marcu, KB, Kehry, 20 MR, Barton, R. & Jakes, S. (1998) J Bi ol Chem 273, 30736-41) was purified with purified GST-BxB-DD in kinase buffer (25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 25 mM ß- Glycerophosphate, 10 mg MgCl 2 , 100 ⁇ g ATP, 1 mM DTT) incubated.
  • kinase buffer 25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 25 mM ß- Glycerophosphate, 10 mg MgCl 2 , 100 ⁇ g ATP, 1 mM DTT
  • Coomassie coloring checked.
  • the gels were dried and phosphorylated proteins were visualized by autoradiography.
  • NIH / 3T3 fibroblasts were mixed with the v-raf expression plasmid EHneo (250 ng) together with a
  • kinase-active IKK-2 is known to function as a dominant negative regulator of the induction of NF- ⁇ B by TNF ⁇ and other stimuli. This in
  • the cells were transfected with 20 ng / ⁇ l PMA or
  • Luciferase activity for non-induced cells co-transfected with pcDNA3 was set to 1 and all other activities are normalized to this.
  • Expression vectors blocked activation not only in the case of TNF ⁇ , but also in the case of PMA.
  • Figure lc shows activities in Jurkat cells which are cotransfected with the reporter HSV-tk.luc and expression vectors for either wild type IKK-2 or dn-IKK-2.
  • the expression level upon co-transfection of the reporter (10 ⁇ g) with pcDNA3 is set to 100 reference value.
  • FIG. 1c shows that the effects of IKK-2 and dn-IKK-2 shown above
  • Cotransfections are specific for the NF-kB dependent reporter, since a constitutive promoter (herpes virus thymidine kinase promoter) was not touched.
  • FIG. 1d In the experiments on which FIG. 1d was based, Jurkat cells were transfected with the ⁇ B-dependent reporter and active raf. 16 hours after the transfection, the cells were treated with suramin (1.5 mM f.c.). An hour later, PMA or
  • TNF ⁇ added, as can be seen, and the cells were harvested an additional 6 hours after.
  • Suramin is a heterocyclic polyanionic compound, which in
  • FIG. 1d shows that TNF ⁇ -mediated NF- ⁇ B activity is reduced by treatment with suramin, as expected. In contrast, neither PMA nor raf-induced NF- ⁇ B activity was touched. This suggests that an autocrine loop is not involved.
  • FIG. 2a shows results which were obtained with Jurkat cells which were cotransfected with 3xkB.luc and active raf (raf-BxB-CX) and 7 or wild type IKK-2. Stimulation was done with PMA as indicated. The results show that overexpression of wild type IKK-2 as such significantly stimulates NF- ⁇ B dependent transcription. Cotransfection of the constitutively active raf construct with wild type
  • the top panel shows an autoradiogram of an immune
  • VSV-IKK-2 was immunoprecipitated and either wild type (wt) or mutated I ⁇ Ba (AA), with serine at the positions
  • the numbers below show the relative I ⁇ B ⁇ -specific kinase activity.
  • the background phosphorylation in pcDNA3 transfected cells was set to 1.
  • the lower panel shows Western blot analyzes of the immunoprecipitated IKK-2. The specificity of the phosphorylation found is evidenced by the absence of phosphorylation in the case of the mutant substrate.
  • FIG. 2c shows that the IKK-2 activity in extracts from cells which have an active raf
  • the upper panel shows an immune complex assay with immunoprecipitated VSV-IKK-2 and I ⁇ B ⁇ as substrate.
  • the star shows autophosphorylated IKK-2 protein.
  • the numbers below the panel indicate the relative kinase activities.
  • the lower panel shows a Western immunoblot for precipitated IKK-2 as a control. The sizes of the protein markers are shown on the side. It is not shown that mutant I ⁇ B ⁇ protein was not affected, which impairs the specificity of the
  • mutant raf construct (mutated in the region of the ATP binding site) results in a kinaseinactive protein which is I ⁇ B ⁇ -specific
  • a low molecular weight inhibitor, PD98059 is known to block MEK activation in many systems (Dudley, DT, Pang, L., Decker, S.J., Bridges, AJ & Saltiel, AR (1995) Proc Na tl Acad Sei USA 92, 7686-9).
  • 3b shows results of a transient transfection of Jurkat cells with 3x ⁇ B.luc.
  • the cells were cotransfected with the active raf expression vector BxB-CX and treated with PMA and PD98059 as indicated.
  • PD98059 was added 4 hours after transfection, PMA was added another 12 hours later for 6 hours. It can be seen that PD98059 does not reduce the PMA- or raf-stimulated ⁇ B-dependent reporter activity. A slight stimulation of the ⁇ B-dependent transcription can be seen.
  • Figure 3c shows that PMA and TNF ⁇ stimulated activity of the IKK complex is not affected by PD98059. Endogenous IKK activity was time-dependent following Jurkat's stimulation
  • the panels show autoradiograms of an immune complex assay using I ⁇ B ⁇ as a substrate after 10, 30 and 60 min. and in the
  • Fig. 4a Jurkat cells were transiently transfected with 3xkB.luc and expression vectors for raf (BxB-CX, wild type IKK-2 and two dominant negative variants of MEK (MEK-S217A and MEK-K97M, each 15 ⁇ g). Neither MEK mutants reduced the raf-induced transactivation of the NF- ⁇ B-dependent reporter.
  • Figure 4b Jurkat cells were transfected with the plasmids indicated as described in Figure 4. The upper panel shows an autoradiogram of an immune complex assay using IKK-2 activity of I ⁇ B ⁇ as substrate.
  • a slow migrating band (star) is probably autophosphorylation of immunoprecipitated IKK-2.
  • the numerical values indicate the relative IKK-2 kinase activity.
  • the lower panel shows a Western blot of the immunoprecipitated IKK-2.
  • IKK-2 expression alone results in a measurable, in vitro kinase activity specific for I ⁇ B ⁇ .
  • Cotransfection of mutant MEK does not affect this constitutive activity. This proves that MEK is not required for raf-mediated NF- ⁇ B activation.
  • Figures 4c and 4d also show that this result is not due to a lack of function of the MEK mutants as a dominant negative. For FIG.
  • a GAL4 reporter (4xl7.TATA) was co-transfected with the expression vector for the GAL-ERK fusion protein and raf BxB-CX as well as the mentioned MEK mutants (15 ⁇ g each) were included.
  • Jurkat cells were transfected with either pcDNA3 or an expression vector for HA-tagged ERK-2 together with the plasmids indicated.
  • ERK-2 was immunoprecipitated using the tag-specific antibody and the top panel shows an autoradiogram of an immune complex assay with MBP as the substrate. The numerical values indicate the relative activities.
  • the lower panel shows a Western blot of the immunoprecipitated ERK-2. It can be seen that the dn-MEK used, as expected, blocks the raf-induced GAL-ELK transcription activity and that ERK-2 activation is suppressed by raf BxB-CX.
  • FIG. 5 shows a cotransfection Experi ent with GAL-ELK and the GAL4 reporter in Jurkat cells together with expression vectors for raf BxB-CX and wild type IKK-2 and dn-IKK-2, as indicated.
  • S107 is a mutant plasmacytoma cell line which lacks the ability to activate NF- ⁇ B on different stimuli and this defect is upstream of the IKK complex.
  • FIG. 5a shows that neither PMA nor raf activate the ⁇ B-dependent reporter in these cells. In contrast, the same stimuli showed one
  • FIG. 5b ultimately proves that the raf-MEK-ERK and raf-IKK pathways are independent of one another. Neither wildly stimulates i5 type IKK-2 GAL-ELK activity, nor does dn-IKK-2 raf stimulate GAL-ELK activity upon cotransfection in Jurkat cells.
  • Figure 6 shows test results in HeLa cells. These were transiently transfected with 3xkB.luc and expression vectors for raf-BxB-CX, dn-IKK-2 and dn-MEK (S217A) as indicated. PMA induction was carried out as previously indicated. The results on the HeLa cells are in full agreement with those on Jurkat cells.
  • Fig. 7a cytosolic extracts from untreated or PMA-induced (30 min.) Jurkat cells were incubated with active (+) or heat-deactivated (-) recombinant raf-BxB-DD protein in the presence of unlabeled ATP.
  • the endogenous IKK complex was immunoprecipitated with either IKK-1 or IKK-2 recognizing antibodies and tested in an in vitro kinase assay with GST-I ⁇ B ⁇ (upper panel).
  • the lower panel shows a control immunoblot of the immunoprecipitates with a mixture of antibodies recognizing IKK-1 and IKK-2.
  • FIG. 7b shows an in vitro kinase assay with recombinant GST, GST-MEK and the activation loop containing GST-IKK-2 (1-291) as substrate.
  • Jurkat cells were transfected with HA-tagged raf-BxB-CX, an HA-tagged kinase-inactive mutant thereof, or pcDNA3. Extracts were immunoprecipitated with HA-specific antibodies and tested in an immune complex assay with the specified substrates.
  • substrate proteins were also mixed with 5 ⁇ g recombinant raf-BxB-DD, purified from baculovirus-infected Sf9 cells.
  • results are presented with the intermediates i n candidate substances MEKKl and NIK.
  • 8a shows results of a cotransfection of 3x ⁇ B.luc with either 5 ⁇ g or 2 ⁇ g MEKKl expression vector and decreasing amounts (10, 7, 5 ⁇ g) of raf-BxB-CX.
  • the activity of the reporter in co-transfection with pcDNA3 was set to 1. It can be seen that raf synergistically increases MEKK1-mediated activity at all concentrations tested.
  • FIG. 8b shows that the synergy between raf and MEKKl even in the case of raf BXB CX, raf BXB DD and, interestingly, also of raf-BxB, which as such shows no NF- ⁇ B-inducing activity in T cells (FIG. 8b: 5 ⁇ g MEKKl and / or 10 ⁇ g each of the raf variants).
  • the kinase-active mutant showed raf-BxB-CX375W no effect on MEKKl and did not interact with the MEKKl-mediated NF- ⁇ B activation, which shows that MEKKl is downstream in this pathway.
  • the effects of dominant negative variants of MEKKl and NIK (10 ⁇ g, 10 ⁇ g raf-BxB-CX, 3x ⁇ B.luc) was tested and it can be seen that dnMEKKl inhibits the raf-induced ⁇ B-dependent reporter activity.
  • FIG. 9 shows schematically that, according to the studies presented, there are two raf-induced pathways for cell transformation.

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Abstract

The invention concerns nucleic acids coding for at least one raf partial sequence, wherein said partial sequence contains a MEKK1 binding site, or a silent mutation of said nucleic acid or a nucleic acid hybridizing with said nucleic acid or the silent mutation thereof, and especially, a screening method using said nucleic acids.

Description

Nukleinsaure codierend für zumindest eine raf Teilsequenz mit einer MEKKl Bindungsstelle Nucleic acid coding for at least one raf partial sequence with a MEKK1 binding site
Gebiet der ErfindungField of the Invention
Die Erfindung betrifft raf Nukleinsäuren, welche auf den Nuclear faktor KB (NFKB) wirken, Substanzen zur Inhibierung dieser Wechselwirkung, Screening Verfahren zur Bestimmung solcher Substanzen sowie mit solchen Substanzen hergestellte pharmazeutische Präparate.The invention relates to nucleic acids which act on the nuclear factor KB (NFKB), substances for inhibiting this interaction, screening methods for determining such substances and pharmaceutical preparations prepared with such substances.
Hintergrund der ErfindungBackground of the Invention
Das raf Protein in seinen verschiedenen Isoformen spielt eine wichtige Rolle in der Regulierung der Proliferation, Differenzierung und Apoptose von Zellen. raf ist eine Effektorkinase von ras und ein wichtiges Glied in der mitogenen cytoplasmischen Protein Kinase (MAPK) Signalisierungkaskade (siehe Daum, 0., Eisenmann-Tappe, I., Fries, H.-W., Troppmair, J. & Rapp, U. R. (1994) Trends Biochem . Sei . 19, 474-479). Die meisten Effekte werden mediiert durch direkte Pho- phorylierung von MEK (mitogen activated and extracel- lular Stimuli regulated kinase kinase) , eine Kinase mit zweifacher Spezifität, welche ihrerseits die ERK Proteine (extracellular Stimuli regulated kinase) phosphoryliert und aktiviert.The raf protein in its various isoforms plays an important role in the regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. raf is an effector kinase from ras and an important link in the mitogenic cytoplasmic protein kinase (MAPK) signaling cascade (see Daum, 0., Eisenmann-Tappe, I., Fries, H.-W., Troppmair, J. & Rapp, UR (1994) Trends Biochem. Sci. 19, 474-479). Most effects are mediated by direct phosphorylation of MEK (mitogen activated and extracellular stimuli regulated kinase kinase), a kinase with double specificity, which in turn phosphorylates and activates the ERK proteins (extracellular stimuli regulated kinase).
Die Familie der NF-kB/Rel Transkriptionsfaktoren besteht bei Säugetieren aus 5 Mitgliedern (RelA, RelB, c-Rel, pl05/NF-κBl und pl00/NF-κB2) , welche an DNA als homo- oder heterodimere Komplexe binden (Baldwin, A. S. (1996) Annu . Rev. Immunol . 14, 649-681; Schreck, R., Kistler, B. & Wirth. (1997) in Transcripti on Fac- tors m Eukarotes, eds . Papavassiliou, A. G. (R.G.Landes Company, Austin, Texas), pp.153-188.) . Mittels knock out Experimenten ist die Rolle der NF-κB Familie für bestimmte zelluläre Funktionen, wie Proliferation, Zytokin Expression, Differenzierung oderThe family of NF-kB / Rel transcription factors consists of 5 members in mammals (RelA, RelB, c-Rel, pl05 / NF-κBl and pl00 / NF-κB2), which bind to DNA as homo- or heterodimeric complexes (Baldwin, AS (1996) Annu. Rev. Immunol. 14, 649-681; Schreck, R. , Kistler, B. & Wirth. (1997) in Transcripti on Factors m Eukarotes, eds. Papavassiliou, AG (RGLandes Company, Austin, Texas), pp.153-188.). Using knock-out experiments, the role of the NF-κB family for certain cellular functions, such as proliferation, cytokine expression, differentiation or
Schutz vor Apoptose, gezeigt worden (Attar, R. M.,Protection against apoptosis, has been shown (Attar, R. M.,
Caa ano, J., Carrasco, D., Iotsova, V., Ishikawa, H.,Caa ano, J., Carrasco, D., Iotsova, V., Ishikawa, H.,
Ryseck, R.-P., Weih, F. & Bravo, R. (1997) Sem . CancerRyseck, R.-P., Weih, F. & Bravo, R. (1997) Sem. Cancer
Bi ol . 8, 93-101; Guttridge, D.C., Albanese, C,Bi ol. 8, 93-101; Guttridge, D.C., Albanese, C,
Reuther, J. Y., Pesteil, R. G. & Baldwin, A. S., Jr .Reuther, J.Y., Pesteil, R.G. & Baldwin, A.S., Jr.
(1999) Mol Cell Bi ol 19, 5785-99; Hinz, M., Krappmann,(1999) Mol Cell Bi ol 19, 5785-99; Hinz, M., Krappmann,
D., Eichten, A., Heder, A. , Scheidereit, C. & Strauss, M. (1999) Mol Cell Biol 19, 2690-8; Karin, M. (1999) J Bi ol Chem 274 , 27339-27342; Zandi, E. & Karin, M. (1999) Mol Cell Bi ol 19, 4547-51) . Weiterhin liegen fundierte Belege für eine Rolle der NF-κB Transkriptionsfaktoren in verschiedenen pathophysiologischen Prozessen, einschließlich Krebs, vor (Foo, S. Y. & Nolan, G. P. (1999) Trends Geriet 15, 229-35) . Die Bindung eines der drei Inhibitorproteine IκBα, IκBß oder IκBε hieran ist verantwortlich für die Sequestrierung des NF-κB/IκB Komplexes in dem Zytoplasma (Whiteside, S.T. & Israel, A. (1997) Sem . Xancer Bi ol . 8, 75-82) . Eine große Vielfalt von Stoffen triggern Signaltransdukti- onskaskaden, welche zur Phospho- rylierung spezifischer Serin Reste in den NH2-terminalen Domänen der IκB Proteinen führen. Die phosphorylierten IκB Moleküle werden danach poly- ubiquitiniert und abgebaut über den Proteaso -Komplex. Dies resultiert in der Freisetzung von NF-κB, welches in den Kern wandern kann. Durch NF-κB regulierte Targetgene spielen wichtige Rollen in Immun-, inflammato- rischen und Stressreaktionen, in der Zelladhäsion sowie dem Schutz gegen Apoptose (Baeuerle, P. A. & Renkel, T. (1994) Annu . Rev. Immuno 1 . 12, 141-179; Siebenlist, TJ., Franzoso, G. & Brown, K. (1994) Annu . Rev. Cell . Biol . 10, 405-455). Der Status der Zelldifferenzierung und das spezifische Signal verantwortlich für die Zellaktivierung bestimmen, welches Set von Targetgenen durch die Induktion mittels NF-κB zur Transkription kommt.D., Eichten, A., Heder, A., Scheidereit, C. & Strauss, M. (1999) Mol Cell Biol 19, 2690-8; Karin, M. (1999) J Bi ol Chem 274, 27339-27342; Zandi, E. & Karin, M. (1999) Mol Cell Bi ol 19, 4547-51). Furthermore, there is solid evidence for a role of the NF-κB transcription factors in various pathophysiological processes, including cancer (Foo, SY & Nolan, GP (1999) Trends Geriet 15, 229-35). The binding of one of the three inhibitor proteins IκBα, IκBß or IκBε to this is responsible for the sequestration of the NF-κB / IκB complex in the cytoplasm (Whiteside, ST & Israel, A. (1997) Sem. Xancer Bi ol. 8, 75-82 ). A large variety of substances trigger signal transduction cascades, which lead to the phosphorylation of specific serine residues in the NH 2 -terminal domains of the IκB proteins. The phosphorylated IκB molecules are then poly- ubiquitinated and broken down via the Proteaso complex. This results in the release of NF-κB, which can migrate into the core. Target genes regulated by NF-κB play important roles in immune, inflammatory and stress reactions, in cell adhesion and protection against apoptosis (Baeuerle, PA & Renkel, T. (1994) Annu. Rev. Immuno 1, 12, 141- 179; Siebenlist, TJ., Franzoso, G. & Brown, K. (1994) Annu. Rev. Cell. Biol. 10, 405-455). The status of cell differentiation and the specific signal responsible for cell activation determine which set of target genes is transcribed by induction using NF-κB.
IκB Abbau und folglich NF-κB Aktivierung kann in vielen Zelltypen durch multiple verschiedene Stimuli induziert werden. Daher müssen mehrere parallele Transduktionspfade existieren, welche alle letztendlich zur IκB-Kinase Aktivierung und zum IκB Abbau führen. Zu den am besten bekannten Signalisierungs- pfaden gehören jene für für den inflammatory cytokines tumor necrosis factor alpha (TNFα) und Interleukin 1 (IL1) (Malinin, N. L., Boldin, M. P., Kovalenko, A. V. & Wallach, D. (1997) Na ture 385, 540-544) . Die Bindung von Liganden an Rezeptoren führen in beiden Fällen zur Einschaltung von TRAF Proteinen (TRAF2 und TRAF6 für TNF-RI/TNF-RII und IL1R) (Takeuchi, M., Rothe, M. & Goeddel, D. V. (1996) J Bi ol Chem 271, 19935-4214; Cao, Z., Xiong, 3., Takeuchi, M., Kurama, T. & Goed¬ del, D. V. (1996) Na ture 383, 443-6) . Es konnte gezeigt werden, daß zwei Membran Schüttle Kinasen, nämlich MEKKl und NIK (NF-κB inducing kinase) in der Übertragung des Signals auf den IkB-kinase Komplex involviert sind. TRAF Proteine wechselwirken mit NIK direkt und es erscheint plausible, daß sie NIK aktivieren (Malinin, N. L., Boldin, M. P., Kovalenko, A. V. & Wallach, D. (1997) Na ture 385, 540-544) . Weitere wichtige, in diesen Signaltransduktionsprozessen in- volvierte Proteine sind RIP und IRAK für TNF und IL1 (Lee, S. Y., Reichlin, A. , Santana, A. , Sokol, K. A. , Nussenzweig, M. C. & Choi, Y. (1997) Immuni ty 1 , 703-713; Yeh, W.-C., Shahinian, A., Speiser, D.,IκB degradation and consequently NF-κB activation can be induced in many cell types by multiple different stimuli. Therefore, several parallel transduction pathways must exist, all of which ultimately lead to IκB kinase activation and IκB degradation. The best known signaling pathways include those for inflammatory cytokines tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin 1 (IL1) (Malinin, NL, Boldin, MP, Kovalenko, AV & Wallach, D. (1997) Nature 385, 540-544). The binding of ligands to receptors in both cases leads to the activation of TRAF proteins (TRAF2 and TRAF6 for TNF-RI / TNF-RII and IL1R) (Takeuchi, M., Rothe, M. & Goeddel, DV (1996) J Bi ol Chem 271, 19935-4214; Cao, Z., Xiong, 3., Takeuchi, M., Kurama, T. & Goed ¬ del, DV (1996) Nature 383, 443-6). It could be shown that two membrane Schüttle kinases, namely MEKKl and NIK (NF-κB inducing kinase) in the Transmission of the signal to the IkB-kinase complex are involved. TRAF proteins interact directly with NIK and it seems plausible that they activate NIK (Malinin, NL, Boldin, MP, Kovalenko, AV & Wallach, D. (1997) Nature 385, 540-544). Other important proteins involved in these signal transduction processes are RIP and IRAK for TNF and IL1 (Lee, SY, Reichlin, A., Santana, A., Sokol, KA, Nussenzweig, MC & Choi, Y. (1997) Immuni ty 1, 703-713; Yeh, W.-C., Shahinian, A., Speiser, D.,
Kraunus, 3., Billia, F., Wakeham, A., de la Pompa, J. L., Ferrick, D., Hum, B., Iscove, N., Ohashi, P., Rothe, M., Goeddel, D. & Mak, T.W. (1997) Immuni ty 7,715-725; Kelliher, M. A., Grimm, S., Ishida, Y., Kuo, F., Stanger, B. Z. & Leder, P. (1998) Immuni ty 8,Kraunus, 3rd, Billia, F., Wakeham, A., de la Pompa, JL, Ferrick, D., Hum, B., Iscove, N., Ohashi, P., Rothe, M., Goeddel, D. & Mak, TW (1997) Immunité 7.715-725; Kelliher, M.A., Grimm, S., Ishida, Y., Kuo, F., Stanger, B.Z. & Leder, P. (1998) Immuni ty 8,
297-303; Kanakaraj, P., Schafer, P. H., Cavender, D.,297-303; Kanakaraj, P., Schafer, P.H., Cavender, D.,
Wu, Y., Ngo, K., Grealish, P. F., Wadsworth, S. A. ,Wu, Y., Ngo, K., Grealish, P.F., Wadsworth, S.A.,
Peterson, P. A. , Stierkierka, J. J., Harris, C. A. &Peterson, P.A., Stierkierka, J.J., Harris, C.A. &
Fung-Leung, W.-P. (1998) J. Exp . Med. 187, 2073-2079) .Fung-Leung, W.-P. (1998) J. Exp. Med. 187, 2073-2079).
Das Verständnis des Mechanismus der induzierbaren IκBUnderstanding the mechanism of inducible IκB
Phosphorylierung wurde erheblich verbessert durch diePhosphorylation has been significantly improved by that
Identifizierung und Klonierung von zwei verwandten zytokininduzierbaren Kinasen, nämlich IKK-1 und IKK-2Identification and cloning of two related cytokine-inducible kinases, namely IKK-1 and IKK-2
(DiDonato, J. A. , Hayakawa, M., Rothwarf, D. M.,(DiDonato, J.A., Hayakawa, M., Rothwarf, D.M.,
Zandi, E. & Karin, M. (1997) Nature 388, 548-554;Zandi, E. & Karin, M. (1997) Nature 388, 548-554;
Regnier, C, Song, H. Y., Gao, X., Goeddel, D. V.,Regnier, C, Song, H. Y., Gao, X., Goeddel, D. V.,
Cao, Z. & Rothe, M. (1997) CeJl 90, 373-383; Zandi,Cao, Z. & Rothe, M. (1997) CeJl 90, 373-383; Zandi,
E., Rothwarf, D. M., Deihase, M., Hayakawa, M. &E., Rothwarf, D. M., Deihase, M., Hayakawa, M. &
Karin, M. (1997) Cell 91, 243-252; Mercurlo, F., Zhu,Karin, M. (1997) Cell 91, 243-252; Mercurlo, F., Zhu,
H., Murray, B. W., Shevchenko, A. , Bennett, B. L., Li,H., Murray, B.W., Shevchenko, A., Bennett, B.L., Li,
J. W., Young, D. B., Barbosa, M., Mann, M., Manning,J.W., Young, D.B., Barbosa, M., Mann, M., Manning,
A. & Rao, A. (1997) Sci ence 278, 860-866; Woronicz, J. D., Gao, X., Cao, Z., Rothe, M. & Goeddel, D. V.A. & Rao, A. (1997) Sci ence 278, 860-866; Woronicz, J. D., Gao, X., Cao, Z., Rothe, M. & Goeddel, DV
(1997) Sci ence 278, 866-869) . Diese sind Teil eines großen 700-900kD großen Multisubunit IκB-Kinase Komplexes, welcher verantwortlich für die Phospho- rylierung der IκB Proteine ist. Es konnte gezeigt werden, daß ein gereinigter 700kD IκB-Kinase Komplex in vitro entweder durch Ubiquitinierung oder durch Phosphorylierung aktiviert wird (Chen, Z. J., Parent, L. & Maniatis, T. (1996) Cell 84, 853-862; Lee, F. S., Hagler, 3., Chen, Z. J. & Maniatis, T. (1997) Cell 88, 213-222) . IKK-1 und IKK-2 wurden unabhängig voneinander identifiziert durch biochemische Reinigung der aktiven Kinase und durch ein Hefe Two Hybrid Screening mit NIK als Köder (IKK-1) . IKK-1 und IKK-2 phospho- rylieren IκB Proteine direkt und zeigen eine höhere(1997) Sci ence 278, 866-869). These are part of a large 700-900kD multisubunit IκB kinase complex, which is responsible for the phosphorylation of the IκB proteins. It has been shown that a purified 700kD IκB kinase complex is activated in vitro either by ubiquitination or by phosphorylation (Chen, ZJ, Parent, L. & Maniatis, T. (1996) Cell 84, 853-862; Lee, FS , Hagler, 3., Chen, ZJ & Maniatis, T. (1997) Cell 88, 213-222). IKK-1 and IKK-2 were identified independently of one another by biochemical purification of the active kinase and by a yeast two hybrid screening with NIK as bait (IKK-1). IKK-1 and IKK-2 phosphorylate IκB proteins directly and show a higher one
Affinität für mit NF-κB komplexiertes IκB (Zandi, E.,Affinity for IκB complexed with NF-κB (Zandi, E.,
Chen, Y. & Karin, M. (1998) Science 281, 360-363) .Chen, Y. & Karin, M. (1998) Science 281, 360-363).
Zwei weitere Komponenten des hochmolekulargewichtigenTwo other components of the high molecular weight
IκB-kinase Komplexes konnten bislang identifiziert werden: ein NEMO (NF-κB essential modulator) /IKKγ genanntes Protein, welches für die Assoziation bzw. die Funktion des Komplexes wichtig erscheint (Yamaoka, S., Courtois, 0., Bessia, C, Whiteside, S.T., Weil, R., Agou, F., Kirk, H. E., Kay, R. J. & Israel, A.IκB-kinase complex has so far been identified: a protein called NEMO (NF-κB essential modulator) / IKKγ, which appears to be important for the association or the function of the complex (Yamaoka, S., Courtois, 0., Bessia, C, Whiteside, ST, Weil, R., Agou, F., Kirk, HE, Kay, RJ & Israel, A.
(1998) Cell 93, 1231-1240; Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G. & Karin, M. (1998) Na ture 395, 297-300), sowie IKAP, welches als Scaffold Protein für NIK, IKK-1 und IKK-2 wirkt (Cohen, L., Henzel, W. J. & Baeuerle, P. A. (1998) Na ture 395, 292-6) . Kinasen, von welchen bekannt ist, daß sie in der Lage sind, Teile des IκB-Kinase Komplexes in vivo und/oder in vitro zu phosphorylieren sind NIK und MEKKl (Ling, L., Zhaodan, C. & Goeddel, D. V. (1998) Proc . Na tl . Acad.(1998) Cell 93, 1231-1240; Rothwarf, DM, Zandi, E., Natoli, G. & Karin, M. (1998) Nature 395, 297-300), as well as IKAP, which acts as a scaffold protein for NIK, IKK-1 and IKK-2 (Cohen , L., Henzel, WJ & Baeuerle, PA (1998) Nature 395, 292-6). Kinases which are known to be able to phosphorylate parts of the IκB-kinase complex in vivo and / or in vitro are NIK and MEKKl (Ling, L., Zhaodan, C. & Goeddel, DV (1998) Proc. Of course. Acad.
Sei . USA 95, 3792-3797; Nakano, H., Shindo, M., Sakon,Be . USA 95, 3792-3797; Nakano, H., Shindo, M., Sakon,
S., Nishinaka, S., Mihara, M., Yagita, H. & Okumara,S., Nishinaka, S., Mihara, M., Yagita, H. & Okumara,
K. (1998) Proc . Na tl . Acad. Sei . USA 95, 3537-3542).K. (1998) Proc. Of course. Acad. Be . USA 95, 3537-3542).
Die Rolle von raf bei der Aktivierung von NF-κB is hingegen weniger klar. In Verfolg von Untersuchungen, welche demonstrierten, daß NF-κB gesteuerte Genkon- strukte auf raf reagieren (Bruder, J. T., Heidecker, 0., Tan, T.-H., Weske, J. C, Derse, D. & Rapp, U. R.However, the role of raf in the activation of NF-κB is less clear. Following studies that demonstrated that NF-κB-controlled gene constructs react to raf (Bruder, JT, Heidecker, 0., Tan, T.-H., Weske, J. C, Derse, D. & Rapp, UR
(1993) Nucl . Acids Res . 21, 5229-5234; Finco, T. S. &(1993) Nucl. Acids Res. 21, 5229-5234; Finco, T. S. &
Baldwin, A. S. (1993) J. Biol . Chem 268, 17676-17679), wurde in verschiedenen Publikationen eine direkteBaldwin, A. S. (1993) J. Biol. Chem 268, 17676-17679), has been a direct in various publications
Wechselwirkung mit bzw. Phosphorylierung von IκBα durch raf-1 Kinase vermutet (Li, S. & Sedivy, L. M.Interaction with or phosphorylation of IκBα by raf-1 kinase suspected (Li, S. & Sedivy, L. M.
(1993) Proc . Na tl . Acad. Sei . USA 90, 9247-9251;(1993) Proc. Of course. Acad. Be . USA 90, 9247-9251;
Hafner, S., Adler, H. S., Mischak, H., Janosch, P.,Hafner, S., Adler, H. S., Mischak, H., Janosch, P.,
Heidecker, 0., Wolfman, A. , Pippig, S., Lohse, M.,Heidecker, 0., Wolfman, A., Pippig, S., Lohse, M.,
Uefflng, M. & Koich, W. (1994) Mol Cell Biol 14,Uefflng, M. & Koich, W. (1994) Mol Cell Biol 14,
6696-703; Li, S., Janosch, P., Tanji, M., Rosenfeld, G. C, Waymire, J. C, Mischak, H., Koich, W. & Sedivy, J. M. (1995) EMBO J. 14, 685-96) . Andere Publikationen haben dagegen Hinweise geliefert, daß raf Aktivierung als solche möglicherweise nicht für eine NF-κB Induktion ausreicht, und daß raf Kinase IκB nicht direkt phosphoryliert (Belka, C, Wiegmann, K., Adam, D., Holland, R., Neuloh, M., Herrmann, F., Kronke, M. & Brach, M. A. (1995) EMBO J 14, 1156-1165; Janosch, P., Scheuerer, M., Seitz, T., Reim, P., Eul- itz, M., Brielrneier, M., Kölch W., Sedivy, J. M. & Mischak, H. (1996) J Bi ol . Chem. 271, 13868-13874). Es wurde gezeigt, daß raf NF-κB in embryonalen Nierenzellen (HEK 293) durch Induktion von Signalis- ierungspfaden aktiviert, welche gleichfalls in der Aktivierung von Streß Kinasen resultieren (Troppmair, 3., Hartkamp, J. & Rapp, U. R. (1998) Oncogene 17, 685-90) . Dieser Mechanismus is abhängig von einer autokrine loop aufgrund der Expression von heparin binding epidermal growth factor (hbEGF) (McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A. , Abraham, J. A. & McMahon, M. (1995) Genes Dev 9, 1953-64; Kerkhoff, E. & Rapp, U. R. (1997) Mol Cell Biol 17, 2576-86) . Dies steht für eine verzögerte Form der NF-κB Aktivierung, welche scheinbar auf eine nur geringe Anzahl von Zelltypen beschränkt ist (Heidecker, 0., Cleveland, J.6696-703; Li, S., Janosch, P., Tanji, M., Rosenfeld, G.C, Waymire, J.C, Mischak, H., Koich, W. & Sedivy, JM (1995) EMBO J. 14, 685- 96). In contrast, other publications have indicated that raf activation as such may not be sufficient for NF-κB induction and that raf kinase IκB does not directly phosphorylate (Belka, C, Wiegmann, K., Adam, D., Holland, R., Neuloh, M., Herrmann, F., Kronke, M. & Brach, MA (1995) EMBO J 14, 1156-1165; Janosch, P., Scheuerer, M., Seitz, T., Reim, P., Eul - itz, M., Brielrneier, M., Kölch W., Sedivy, JM & Mischak, H. (1996) J Bi ol. Chem. 271, 13868-13874). It has been shown that raf NF-κB in embryonic Kidney cells (HEK 293) activated by induction of signaling paths, which likewise result in the activation of stress kinases (Troppmair, 3rd, Hartkamp, J. & Rapp, UR (1998) Oncogene 17, 685-90). This mechanism is dependent on an autocrine loop due to the expression of heparin binding epidermal growth factor (hbEGF) (McCarthy, SA, Samuels, ML, Pritchard, CA, Abraham, JA & McMahon, M. (1995) Genes Dev 9, 1953- 64; Kerkhoff, E. & Rapp, UR (1997) Mol Cell Biol 17, 2576-86). This stands for a delayed form of NF-κB activation, which is apparently limited to only a small number of cell types (Heidecker, 0., Cleveland, J.
L., Beck, T., Huleihel, M., Kölch, W., Storm, S.M. &L., Beck, T., Huleihel, M., Kölch, W., Storm, S.M. &
Rapp, U. R. (1989) in Genes and Signal transdueti on in mul tistage carcinogenesis , eds. Colburn, N. H. (MarcelRapp, U. R. (1989) in Genes and Signal transduction in multiple days carcinogenesis, eds. Colburn, N.H. (Marcel
Dekker, Inc., New York) , pp.339-374).Dekker, Inc., New York), pp.339-374).
Technisches ProblemTechnical problem
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, einen Ansatz zur Hemmung der NF-κB Aktivierung zu finden, und daran anschließend Wirkstoffe zu finden, welche eine NF-κB Aktivierung wirksam zu unterdrücken vermögen und folglich eine Proliferation von Tumorzellen zu unterbinden.The invention is based on the technical problem of finding an approach for inhibiting NF-κB activation and then subsequently finding active substances which are able to effectively suppress NF-κB activation and consequently to prevent proliferation of tumor cells.
Der Erfindung zugrundeliegende ErkenntnisseFindings on which the invention is based
Es wurde die Rolle der NF-κB Aktivierung in der raf- vermittelten Zelltransformation untersucht sowie der Mechanismus, mittels welchem PMA und raf NF-κB Aktivität induzieren. Es wurde gefunden, daß Hemmung der NF-KB Aktivierung die raf Transformation blockiert. Die NF-κB Aktivierung durch raf und PMA hangt sehr kritisch von dem IκB Kinase Komplex ab, msbeson- dere IKK-2. raf phosphoryliert die IκB Kinase Proteine nicht direkt. Vielmehr geschieht dies über die mem- brane Shuttle kinase MEKKl. raf abhangige Aktivierung wird blockiert durch eine dominant negative Form vonThe role of NF-κB activation in raf-mediated cell transformation was examined as well as the mechanism by which PMA and raf NF-κB Induce activity. Inhibition of NF-KB activation was found to block raf transformation. The NF-κB activation by raf and PMA depends critically on the IκB kinase complex, especially IKK-2. raf does not directly phosphorylate the IκB kinase proteins. Rather, this happens via the membrane kinase MEKKl. raf dependent activation is blocked by a dominant negative form of
MEKKl .MEKKl.
In diesen Zusammenhangen ist auch wesentlich, daß verschiedene Inhibitoren der klassischen mitogenen cyto- plasmalen Kinase Kaskade dagegen nicht die NF-κBIn these contexts it is also essential that various inhibitors of the classic mitogenic cytoplasmic kinase cascade do not have the NF-κB
Aktivierung durch raf und PMA blockieren. Hieraus folgt, daß die NF-κB Aktivierung mittels raf unabhängig von der klassischen Kaskade in einer separaten Reaktionskaskade erfolgt und insofern ein unabhängiger Pfad zur Transformation bzw. Induktion der Proliferation m Tumorgewebe existiert.Block activation by raf and PMA. It follows from this that the NF-κB activation by means of raf takes place independently of the classic cascade in a separate reaction cascade and, in this respect, there is an independent path for the transformation or induction of the proliferation in tumor tissue.
MEKKl ist daher ein neues Target für die Inhibierung der raf induzierten Transformation, raf ist ein neuesMEKKl is therefore a new target for the inhibition of the raf-induced transformation, raf is a new one
Tool zur Untersuchung der Transformation über NF-κB sowie zur Findung von Inhibitoren der NF-κB vorgeschalteten Reaktionskaskade .Tool for examining the transformation via NF-κB and for finding inhibitors of the NF-κB upstream reaction cascade.
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Die Erfindung lehrt zunächst eine Nukleinsaure codierend für zumindest eine raf Teilsequenz, wobei die Teilsequenz eine MEKKl Bindungsstelle enthalt, oder codierend für zumindest eine eine Bindungsstelle für raf enthaltende Teilsequenz von MEKKl, oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierende Nukleinsaure. Der Begriff der Nuklein- säure umfaßt DNA, RNA und PNA. Der in denThe invention first teaches a nucleic acid coding for at least one raf partial sequence, the partial sequence containing a MEKK1 binding site, or coding for at least one binding site for raf containing partial sequence of MEKKl, or silent mutation of such a nucleic acid or nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or its silent mutation. The term nucleic acid encompasses DNA, RNA and PNA. The one in the
Patentansprüchen verwendete Begriff der raf Teilsequenz bezieht sich auf Protein bzw. dessen Aminosäuresequenz. Die raf Teilsequenz enthält vorzugsweise die enzymatisch aktive Domäne von raf Protein. Ebenfalls subsumiert unter den Begriff sind doppelsträngige Nukleinsäuren sowie einzelsträngige Nukleinsäuren und folglich auch zueinander komplementäre Nukleinsäuren. Stille Mutationen meint Varianten in der Sequenz, die zu keinem funktionalen Unterschied, bezogen auf die Bindungsstelle des Proteins für MEKKl, der Variante gegenüber der natürlichen, nicht mutierten Sequenz führen. Stille Mutationen können Allele oder künstliche Mutationen sein. Ebenfalls umfaßt sind Derivate, i.e. in Resten synthetisch veränderte Nukleinsäuren, deren Funktionalität, bezogen auf die Bindungsstelle für MEKKl, unberührt, vielleicht sogar verstärkt, ist. Wesentlich ist, daß jedenfalls ein Fragment mit der Bindungsstelle für MEKKl vorhanden ist. Mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisierende Nuklein- säuren sind solche bezeichnet, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Stringenz tritt typischerweise in einem Temperaturbereich von 5°C bis 25°C unterhalb der AufSchmelztemperatur bei der Hybridisierung ein. Unter stringenten Bedingungen wird eine Hybridisierung bei zumindest 95% Sequenzidentität, vorzugsweise 98% Sequenzidentität, verstanden. Hinsichtlich der diesen Definitionen zugrundeliegenden Hybridisierungsmethode wird auf die Literaturstelle Sambrook, J.M.; Fritsch, E.F; Manaitis, T; Molecular Cloning. A laboratory manual; Cold Spring Harbor Labo- ratory Press (1989), sowie ergänzend auf Southern, E.M.; Detektion of specific sequences among DNA frag- ments separated by gel electrophoresis; J. Mol. Biol. 98, 503 (1975) verwiesen.The term raf part-sequence used in patent claims refers to protein or its amino acid sequence. The raf partial sequence preferably contains the enzymatically active domain of raf protein. Also subsumed under the term are double-stranded nucleic acids and single-stranded nucleic acids and consequently also nucleic acids complementary to each other. Silent mutations mean variants in the sequence which do not lead to any functional difference, based on the binding site of the protein for MEKK1, of the variant compared to the natural, non-mutated sequence. Silent mutations can be alleles or artificial mutations. Also included are derivatives, ie nucleic acids that are synthetically modified in residues, the functionality of which, in relation to the binding site for MEKK1, is unaffected, perhaps even enhanced. It is essential that there is in any case a fragment with the binding site for MEKK1. Nucleic acids hybridizing with nucleic acids according to the invention are those which hybridize under stringent conditions. Stringency typically occurs in a temperature range from 5 ° C to 25 ° C below the melting temperature during hybridization. Stringent conditions mean a hybridization with at least 95% sequence identity, preferably 98% sequence identity. With regard to the hybridization method on which these definitions are based, reference is made to the literature reference Sambrook, JM; Fritsch, EF; Manaitis, T; Molecular cloning. A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), and in addition to Southern, EM; Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis; J. Mol. Biol. 98, 503 (1975).
Mittels solcher Nukleinsäuren kann nach Inhibitoren der gefundenen Signalisierungskaskade gesucht werden. Insbesondere kann nach Substanzen gesucht werden, welche die MEKKl Bindungsstelle der Nukleinsaure blockieren. Auch kann nach Substanzen gesucht werden, welche die natürlichen Nukleinsäuren mimikrieren, i.e. an MEKKl binden, dieses jedoch für dessen Folgereak- tionen blockieren. Die Nukleinsäuren sind daher als screening tool brauchbar sowie zur Suche nach geeigneten Mimikrie-Substanzen für die natürlichen Nukleinsäuren .Such nucleic acids can be used to search for inhibitors of the signaling cascade found. In particular, it is possible to search for substances that block the MEKK1 binding site of the nucleic acid. You can also search for substances that mimic the natural nucleic acids, i.e. bind to MEKKl, but block it for its subsequent reactions. The nucleic acids can therefore be used as a screening tool and to search for suitable facial expression substances for the natural nucleic acids.
Bevorzugterweise ist eine erfindungsgemäße Nukleins ure eine cDNA.A nucleic acid according to the invention is preferably a cDNA.
Die Erfindung lehrt weiterhin einen isolierten rekom- binanten Vektor enthaltend eine erfindungsgemäße Nuk- leinsäure bzw. ein Expressionsplasmid mir dieserThe invention further teaches an isolated recombinant vector containing a nucleic acid according to the invention or an expression plasmid with this
Nukleinsaure. Hierbei kann zwecks stabiler Expression ein für ein geeignetes virales Protein codierendes DNA Fragment, beispielsweise gag, mit eingesetzt sein (Fusion gag mit beispielsweise raf oder raf Fragment) . Eine konstitutiv aktive Variante kann auch durch Fusion mit der carboxylterminalen Domäne von ras an die Kinase Domäne von raf geschaffen werden. Mittels des Expressionsplasmids läßt sich eine Transformante bilden, welche wiederum zur Herstellung des durch die Nukleinsaure codierten Proteins bzw. Peptids verwendet werden kann. Hierzu wird die Transformante nach üblichen Methoden auf geeignete Weise kultiviert.Nucleic acid. For stable expression, a DNA fragment coding for a suitable viral protein, for example gag, can also be used (fusion gag with, for example, raf or raf fragment). A constitutively active variant can also be created by fusion with the carboxyl-terminal domain from ras to the kinase domain from raf. A transformant can be generated using the expression plasmid form, which in turn can be used to produce the protein or peptide encoded by the nucleic acid. For this purpose, the transformant is cultivated in a suitable manner using customary methods.
Der Erfindungskomplex umfaßt auch Stoffe zur Hemmung der Wirkung von MEKKl. Dies kann sein eine antisense Nukleinsaure oder ein Ribozym bindend an eine er- findungsgemaße Nukleinsaure, insbesondere RNA. Hier- durch wird die Bildung des durch die erfindungsgemaße Nukleinsaure codierten Proteins gehemmt. Dies kann aber auch sein eine Substanz mit einer Bindungsstelle für ein durch eine erfindungsgemaße Nukleinsaure codiertes Protein oder Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) deaktiviertes MEKKl (beispielsweise dominant negativ) , b) inaktive Proteine oder Peptide (inaktive MEKKl Analoge, i.e. Proteine, die die MEKKl Bindungsstelle an raf aufweisen, jedoch MEKKl-inaktiv sind), c) Aptamere. Durch diese Substanzen wird das durch die erfindungsgemaße Nukleinsaure codierte Protein selbst gehemmt. Bei den Aptameren empfiehlt es sich, diese gegen nukleinsaurespaltende Enzyme zu stabilisieren. Im Falle der Proteine bzw. Peptide handelt es sich um "geschneiderte", für die MEKKl Bmdungsstelle des durch die erfindungsgemaße Nukleinsaure codierten Proteins hochspezifische synthetische Moleküle. Schließlich gehört zum Erfindungskomplex auch eine Substanz mit einer Bindungsstelle für die Bindungsstelle von MEKKl an eine durch eine er- findungsgemaße Nukleinsaure codiertes Protein oder Peptid, insbesondere kinase-inaktive Analoge/Homologe von raf. Analoge sind Proteine, die die Bindungsstelle des raf für MEKKl aufweisen, jedoch kinase-inaktiv sind. Mit einer solchen Substanz wird das MEKKl für eine Bindung an raf blockiert. Ein Beispiel hierfür ist eine kinaseinaktive Variante von raf, insbesondere raf-BxB-CX 375W.The complex of the invention also includes substances for inhibiting the action of MEKKl. This can be an antisense nucleic acid or a ribozyme binding to a nucleic acid according to the invention, in particular RNA. This inhibits the formation of the protein encoded by the nucleic acid according to the invention. However, this can also be a substance with a binding site for a protein or peptide encoded by a nucleic acid according to the invention selected from the group consisting of a) deactivated MEKKl (for example dominant negative), b) inactive proteins or peptides (inactive MEKKl analogs, ie proteins, which have the MEKKl binding site on raf, but are MEKKl-inactive), c) aptamers. The protein itself, which is encoded by the nucleic acid according to the invention, is inhibited by these substances. It is advisable to stabilize the aptamers against enzymes that cleave nucleic acids. In the case of the proteins or peptides, these are “tailor-made”, highly specific synthetic molecules for the MEKKl binding site of the protein encoded by the nucleic acid according to the invention. Finally, the invention also includes a substance with a binding site for the binding site of MEKK1 to a protein or peptide encoded by a nucleic acid according to the invention, in particular kinase-inactive analogs / homologs from raf. Analogs are proteins that have the binding site of the raf for MEKKl, but are kinase-inactive are. With such a substance, the MEKKl is blocked for binding to raf. An example of this is a kinase-active variant of raf, in particular raf-BxB-CX 375W.
Die Erfindung lehrt weiterhin die Verwendung einer erfindungsgemäßen Substanz zur Blockierung der Bindung von raf an MEKKl sowie deren Verwendung zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von Krebserkrankungen.The invention further teaches the use of a substance according to the invention for blocking the binding of raf to MEKKl and its use for the production of a pharmaceutical preparation for the treatment of cancer.
Die Erfindung lehrt desweiteren die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsaure oder eines hierdurch codierten Proteins oder Peptids oder einer für zumind- est eine eine Bindungsstelle bzw. Bindungsregion an raf enthaltende Teilsequenz von MEKKl Protein codierenden Nukleinsaure oder eines oder mehrer durch eine solche Nukleinsaure codierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung einer Sub- stanz, welche die Bindung von raf an MEKKl blockiert. Dabei ist die Vorgehensweise wie folgt. Ein Protein oder Peptid enthaltend die oder bestehend aus der Bindungsregion von raf oder von MEKKl für die Bindung raf/MEKKl (Bestimmung siehe unten) wird hergestellt. Einer Lösung enthaltend dieses Protein oder Peptid wird ein prospektiver Inhibitor zugegeben und die Bindung untersucht. Bindende prospektive Inhibitoren werden selektiert, nicht bindende verworfen. Es kann auch mit einer Mischung prospektiver Inhibitoren gear- beitet werden, wobei dann sich eine Deconvolution (Testung von einzelnen Inhibitoren der Mischung oder von Untergruppen der Mischung der Inhibitoren) empfe¬ hlen wird, wenn für eine Mischung Bindung festgestellt worden ist. Im Falle eines identifizierten Inhibitors wird es zweckmäßig sein, in vitro oder in vivo die Inhibitorwirkung durch kompetitive Bindung zu verifizieren bzw. nachzuselektieren. Kompetitive Bindung meint, daß der prospektive Inhibitor die Anzahl der Bindungsereignisse raf/MEKKl in einem Versuch reduziert gegenüber der Anzahl der Bindungsereignisse ohne den prospektiven Inhibitor oder mit einer Placebosub- stanz .The invention furthermore teaches the use of a nucleic acid according to the invention or a protein or peptide encoded thereby or a nucleic acid coding for at least one partial sequence of MEKKl protein containing a binding site or binding region to raf or one or more proteins or peptides encoded by such a nucleic acid a screening process to determine a substance that blocks the binding of raf to MEKKl. The procedure is as follows. A protein or peptide containing or consisting of the binding region of raf or MEKKl for binding raf / MEKKl (determination see below) is produced. A prospective inhibitor is added to a solution containing this protein or peptide and the binding is examined. Binding prospective inhibitors are selected, non-binding ones are discarded. It can be already drafted gear- with a mixture of prospective inhibitors, in which case a deconvolution (testing of individual inhibitors of the mixture or of sub-groups of the mixture of inhibitors) recomme ¬ choose, when determined for a mixture bond has been. In the case of an identified inhibitor, it will be expedient to verify or to re-select the inhibitory effect by competitive binding in vitro or in vivo. Competitive binding means that the prospective inhibitor reduces the number of binding events raf / MEKK1 in one experiment compared to the number of binding events without the prospective inhibitor or with a placebo substance.
Die erfindungsgemäßen Substanzen lassen sich in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers mit Tumorzellen verwenden, in dem dem Körper ein pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 9 verabreicht wird, oder wobei eine Substanz nach einem der Ansprüche 4 bis 7 mittels gentherapeutischer Methoden in den Tumorzellen zur Expression gebracht wird.The substances according to the invention can be used in a method for treating a human or animal body with tumor cells, in which a pharmaceutical preparation according to claim 9 is administered to the body, or wherein a substance according to one of claims 4 to 7 is used in the tumor cells by means of gene therapy methods Expression is brought.
Die exakte raf-seitige Bindungsstelle für MEKKl läßt sich unschwer bestimmen bzw. einkreisen, indem gezielt mit unterschiedlichen (hinsichtlich der Lage und der Größe von Teilsequenzen) raf Fragmenten die Bindungsfähigkeit von MEKKl untersucht wird. Fragmente, die keine Bindung zeigen, enthalten die Bindungsstelle nicht; Fragmente, die Bindung zeigen umfassen dagegen die Bindungsstelle. Die MEKKl-seitige Bindungsstelle für raf läßt sich analog durch Einsatz unterschiedlicher Teilsequenzen von MEKKl und Bindung- sassay gegenüber raf ermitteln. Es kann sich empfe- hlen, in ersterem Falle mit vollständigem raf Protein und in letzterem Falle mit vollständigem MEKKl Protein zu arbeiten. Wenn jedoch von einem Bindungspartner bereits die Bindungsregion bekannt ist, so kann auch in dem Bindungsassay zur Suche der Bindungsregion des anderen Bindungspartners lediglich mit der Bindungsregion des einen Bindungspartners gearbeitet werden. Entsprechend den vorstehenden Ausfuhrungen umfaßt die Erfindung auch ein Verfahren zur Identifizierung der Bindungsregionen von raf und/oder MEKKl des Bindungspaares raf/MEKKl.The exact raf-side binding site for MEKKl can be easily determined or circled by specifically investigating the binding ability of MEKKl with different (with regard to the position and size of partial sequences) raf fragments. Fragments that show no binding do not contain the binding site; In contrast, fragments that show binding comprise the binding site. The MEKKl-side binding site for raf can be determined analogously by using different partial sequences of MEKKl and binding assay compared to raf. It may be advisable to work with complete raf protein in the former case and with complete MEKKl protein in the latter case. However, if the binding region of a binding partner is already known, it can also only the binding region of one binding partner is used in the binding assay to search for the binding region of the other binding partner. In accordance with the above statements, the invention also includes a method for identifying the binding regions of raf and / or MEKKl of the binding pair raf / MEKKl.
Die Erfindung lehrt schließlich die Verwendung einer Nukleinsaure codierend für zumindest eine Teilsequenz von raf oder einer stillen Mutation einer solchen Nukleinsaure oder einer mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierenden Nukleinsaure in einem screening Verfahren zur Untersuchung der Wechselwirkung des von der Nukleinsaure codierten Proteins oder Peptids mit der der Aktivierung von NF-κB vorgeschalteten Signalisierungskaskade sowie die Verwendung einer Nukleinsaure codierend für zumindest eine Teilsequenz von raf oder einer stillen Mutation einer solchen Nukleinsaure oder einer mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierenden Nukleinsaure oder von solchen Nukleinsäuren codierten Proteinen oder Peptiden, insbesondere auch von Proteinen oder Peptiden, die in dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Indentifizierung von Bindungsregionen erhaltene Teilsequenzen enthalten, vorzugsweise hieraus bestehen, in einem screening Verfahren zur Ermittelung von Inhibitoren der Transformation von Zellen durch raf vermittelte Aktivierung von NF-κB.Finally, the invention teaches the use of a nucleic acid coding for at least a partial sequence of raf or a silent mutation of such a nucleic acid or a nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or its silent mutation in a screening method for examining the interaction of the protein or peptide encoded by the nucleic acid with the signaling cascade preceding the activation of NF-κB and the use of a nucleic acid coding for at least a partial sequence of raf or a silent mutation of such a nucleic acid or a nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or its silent mutation or proteins or peptides coded by such nucleic acids, in particular also of proteins or peptides which contain partial sequences obtained in the above-described method for identifying binding regions, preferably consisting of them, in a screening Method for determining inhibitors of the transformation of cells by raf-mediated activation of NF-κB.
Die Erläuterung für eine Anspruchskategorie gelten entsprechend auch f r andere Anspruchskategorien. Im folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausfürhungsbeispiel darstellenden Figuren und Experimenten näher erläutert. Es zeigen:The explanations for one claim category also apply accordingly to other claim categories. The invention is explained in more detail below with the aid of figures and experiments which merely illustrate exemplary embodiments. Show it:
Fig. la-d: Ergebnisse, welche die Blockierung der raf und PMA vermittelten NF-κB Aktivierung durch dominant negatives IKK-2 belegen,La-d: results which demonstrate the blocking of the raf and PMA-mediated NF-κB activation by dominant negative IKK-2,
Fig. 2a-c: Stimulation der IKK-2 Kinase Aktivität durch raf,2a-c: stimulation of the IKK-2 kinase activity by raf,
Fig. 3a-d: Ergebnisse, welche zeigen, daß der MEK In- hibitor PD98059 nicht die raf und PMA vermittelte NF-κB Aktivierung beeinflußt,3a-d: Results which show that the MEK inhibitor PD98059 does not influence the raf and PMA-mediated NF-κB activation,
Fig. 4a-d: Ergebnisse entsprechend Fig. 3 für dominant negatives MEK,4a-d: Results corresponding to FIG. 3 for dominant negative MEK,
Fig. 5a-b: Ergebnisse, welche zeigen, daß unterschiedlich Reaktionspfade von raf gesteuert werden,5a-b: results which show that different reaction paths are controlled by raf,
Fig. 6: Ergebnisse, die zeigen, daß raf und PMA NF-κB in HeLa Zellen unabhängig von der MAPK Kaskade induzieren,Fig. 6: Results showing that raf and PMA induce NF-κB in HeLa cells independent of the MAPK cascade.
Fig. 7a-c: Ergebnisse, die zeigen, daß raf in vitro IKK Aktivität induziert, jedoch nicht di¬ rekt die IKK Proteine phosphoryliert, Fig. 8a-c: Ergebnisse, die die Wechselwirkung raf mit MEKKl belegen,Fig. 7a-c: results, which show that in vitro raf induced IKK activity, but not di rectly ¬ IKK proteins phosphorylated, 8a-c: results which demonstrate the interaction raf with MEKKl,
Fig. 9: Verschiedene synergistische Pfade der raf induzierten Zelltransformation.Fig. 9: Different synergistic paths of the raf-induced cell transformation.
Fig. 10: Sequenz von humanem c-raf 1Figure 10: Sequence of human c-raf 1
Fig. 11: Sequenz von humanem MEKKl11: Sequence of human MEKKl
1: Materialien und Methoden1: Materials and methods
1.1 Plasmide und Antikörper1.1 Plasmids and antibodies
Das v-raf Expressionsplasmid ist beschrieben worden in der Literaturstelle Troppmair, J., Potter, M., Wax, J.S. & Rapp, U. R. (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86, 9941-5. Die Konstruktion von Hemagglutininn (HA-) tagged wild type raf BxB, BxB-CX und kinase-inaktivem BxB-CX, welches in der Position 375 eine Substitution von K durch W trägt, ist in der Literaturstelle Flory, E., Weber, C. K., Chen, P., Hoffmeyer, A., Jassoy, C. & Rapp, U. R. (1998) J. Virol . 72, 2788-2794, beschrieben, raf BxB ist eine in frame Deletion der Aminosäuren 22 - 303 aus humanem c-raf-1, CX ist die C-terminale targeting Domäne von Ki-ras. VSV tagged IKK-2 und VSV tagged kinase-inaktives IKK-2 ist beschrieben worden in der Literaturstelle Yamaoka, S., Courtois, G., Bessia, C, Whiteside, S.T., Weil, R., Agou, F., Kirk, H.E., Kay, R.J. & Israel, A. (1998) Cell 93, 1231 - 1240. Dominant negatives MEK-1 (MEK-S217A) wurde erhalten von S. Cowley (Cowley, S., Paterson, H., Kemp, P. & Marschall, C.J. (1994) Cell 77, 841 - 852, und kinase inaktives MEK1 (MEK-K97M) wurde von N. Ahn ( Mansour, S. 3., Matten, W. T., Hermann, A. S., Candia, J. M., Rong, S., Fukasawa, K., Vande Woude, G. F. & Alin, N. G. (1994) Sci ence 265, 966-970) zur Verfügung gestellt. Alle inserts wurden in die mutiple Klonierungsstelle von pcDNA3 (Invitrogen) subkloniert. HA-BxB-DD wurde durch site-gerichtete Mutagenese unter Verwendung des quick change mutagenesis kits (Stratagene) aus KRSPA-HA-BxB (Flory, E., Weber, C. K., Chen, P., Hoffmeyer, A. , Jassoy, C. & Rapp, U. R. (1998) J. Virol . 72, 2788-2794) generiert. Das Insert wurde in pcDNA3 (Invitrogen) mittels der Hindill und Xbal Sites subkloniert. pGEX-IκB (1-72) wild type und pGEX-IκBThe v-raf expression plasmid has been described in Troppmair, J., Potter, M., Wax, JS & Rapp, UR (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86, 9941-5. The construction of hemagglutinin (HA-) tagged wild type raf BxB, BxB-CX and kinase-inactive BxB-CX, which carries a substitution of K by W in position 375, is described in the literature reference Flory, E., Weber, CK , Chen, P., Hoffmeyer, A., Jassoy, C. & Rapp, UR (1998) J. Virol. 72, 2788-2794, raf BxB is an in-frame deletion of amino acids 22-303 from human c-raf-1, CX is the C-terminal targeting domain of Ki-ras. VSV tagged IKK-2 and VSV tagged kinase-inactive IKK-2 have been described in the reference Yamaoka, S., Courtois, G., Bessia, C, Whiteside, ST, Weil, R., Agou, F., Kirk, HE, Kay, RJ & Israel, A. (1998) Cell 93, 1231 - 1240. Dominant negative MEK-1 (MEK-S217A) was obtained from S. Cowley (Cowley, S., Paterson, H., Kemp, P. & Marschall, CJ (1994) Cell 77, 841-852, and kinase inactive MEK1 (MEK-K97M) by N. Ahn (Mansour, p. 3., Matten, WT, Hermann, AS, Candia, JM, Rong, S., Fukasawa, K., Vande Woude, GF & Alin, NG (1994) Sci ence 265, 966 -970) All inserts were subcloned into the multiple cloning site of pcDNA3 (Invitrogen) HA-BxB-DD was determined by site-directed mutagenesis using the quick change mutagenesis kit (Stratagene) from KRSPA-HA-BxB (Flory , E., Weber, CK, Chen, P., Hoffmeyer, A., Jassoy, C. & Rapp, UR (1998) J. Virol. 72, 2788-2794) The insert was in pcDNA3 (Invitrogen) using the Hindill and Xbal sites subcloned pGEX-IκB (1-72) wild type and pGEX-IκB
(1-72)AA (mit S nach A Substitutionen an den(1-72) AA (with S after A substitutions to the
Positionen 32 und 36) sind in der LiteraturstellePositions 32 and 36) are in the reference
Yamaoka, S., Courtois, G., Bessia, C, Whiteside,Yamaoka, S., Courtois, G., Bessia, C, Whiteside,
S.T., Weil, R., Agou, F., Kirk, H.E., Kay, R.J. &S.T., Weil, R., Agou, F., Kirk, H.E., Kay, R.J. &
Israel, A. (1998) Cell 93, 1231 - 1240, beschrieben.Israel, A. (1998) Cell 93, 1231-1240.
Die Luciferase Reporter Plasmide (3xκB.luc, 4x17. TATA,The Luciferase Reporter Plasmids (3xκB.luc, 4x17. TATA,
HSV-tk-luc sowie der Gal-Elk Expressionsvektor wurden in den folgenden Literaturstellen beschrieben:HSV-tk-luc and the Gal-Elk expression vector have been described in the following references:
Kirillov, A., Kistler, B., Mostoslavsky, R., Cedar,Kirillov, A., Kistler, B., Mostoslavsky, R., Cedar,
H., Wirth, T. & Bergman, Y. (1996) Nature Geneti cs 13,H., Wirth, T. & Bergman, Y. (1996) Nature Geneti cs 13,
435-441; Annweiler, A. , Zwilling, S. & Wirth, T.435-441; Annweiler, A., Zwilling, S. & Wirth, T.
(1994) Nucl . Acids Res . 22, 4250-4258; sowie Janknecht,(1994) Nucl. Acids Res. 22, 4250-4258; as well as Janknecht,
R., Ernst, W. H., Pingoud, V. & Nordheim, A. (1993)R., Ernst, W.H., Pingoud, V. & Nordheim, A. (1993)
EMBO J. 12, 5097-104) . Monoklonale anti-HA Antikörper (Klon 12CA5) wurden mittels Standardprozeduren von Zellkulturüberständen mittels einer HiTrap protein G sepharose Säule (Pharmacia) aufgereinigt . Anti VSV Antikörper (Klon P5D4) wurden von Sigma gekauft und Antiseren gegen IKK-1, IKK-2 und ERK-2 wurden von Santa Cruz erhalten.EMBO J. 12, 5097-104). Monoclonal anti-HA antibodies (clone 12CA5) were purified using standard cell culture supernatant procedures using a HiTrap protein G sepharose column (Pharmacia). Anti VSV antibodies (clone P5D4) were purchased from Sigma and antisera against IKK-1, IKK-2 and ERK-2 were obtained from Santa Cruz.
1.2 Focus assay1.2 Focus assay
1 x 105 NIH/3T3 Zellen wurden in eine 30 mm Schale gesät und am folgenden Tag mittels Lipofectamine (Gibco BRL) mit 250 ng des v-raf Plasmids EHneo zusammen mit den beschriebenen Expressionskonstrukten für wild type oder dominant negativen Formen von IKK-1 und IKK-2 transfiziert. Nach weiteren 48 Stunden wurden die Zellen trypsinisiert und auf eine 10 cm Schale umgesiedelt. Im Mittel war der focus yield 650 Foci je μg EHneo DNA.1 x 10 5 NIH / 3T3 cells were sown in a 30 mm dish and the following day using Lipofectamine (Gibco BRL) with 250 ng of the v-raf plasmid EHneo together with the described expression constructs for wild-type or dominant negative forms of IKK-1 and IKK-2 transfected. After a further 48 hours, the cells were trypsinized and transferred to a 10 cm dish. The mean yield was 650 foci per μg of EHneo DNA.
1.3 Zellkulturen und Transfektionsexperimente1.3 Cell cultures and transfection experiments
Jurkat T-Zellen und Heia Zellen wurden inJurkat T cells and Heia cells were in
DMEM/Glutamax (Gibco BRL) , welches mit 10% fetal bovine serum, 50 μM ß-Mercaptoethanol und Antibiotika supplementiert war, gezogen. Das gleiche Medium, jedoch ohne ß-Mercaptoethanol, wurde für die NIH/3T3 Zellen verwendet. Für transiente Transfektionen wurden 3 μg des κB-abhängigen Luciferase Reporters (3xκB.luc) oder 4 μg an 4x17. TATA Reporter zusammen mit 1 μg RSV-Lac-Z verwendet. Die Gesamtmenge an DNA betrug 25-30 μg und wurde aufgefüllt mit Expressionsvektoren. Typischerweise wurden 10 μg des betreffenden Expressionsvektors und/or leeren Expressionsvektors eingesetzt. Jurkat T Zellen, S107 Zellen und Heia Zellen (l-2xl07) wurden zweimal in PBS gewaschen, schließlich in 200 μl oder 500 μl PBS resuspendiert und dann in Kuvetten (BioRad, 4mm Durchmesser) transferiert. Dann wurde das DNA-mix zugegeben, mit der Zellsuspension gemischt und die Mischung wurde einer Elektroporation unter Verwendung eines BioRad gene pulsers bei 960 μF und 220V (Jurkat), 230V (S107) oder 250V (Heia) unterworfen. Unmittelbar nach der Elektroporation wurden die Zellen auf Eis gesetzt (5 min.) und anschließend für 5 min. bei 20°C inkubiert, gefolgt von dem Einbringen auf Medium (1/3 konditioniert, 2/3 frisch) . Die Proben wurden in Aliquoten geteilt und 16 Stunden nach der Transfektion gemäß der beschreibungen zu den Figuren behandelt. Die Zellen wurden 6 Stunden später geerntet. Die Luciferase Aktivitäten wurden bestimmt und ß-Galactosidase Niveaus wurden zur Normalisierung bezüglich unterschiedlicher Transfektioneffektivitäten verwendet .DMEM / Glutamax (Gibco BRL) supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 μM ß-mercaptoethanol and antibiotics. The same medium, but without β-mercaptoethanol, was used for the NIH / 3T3 cells. 3 μg of the κB-dependent luciferase reporter (3xκB.luc) or 4 μg of 4x17 were used for transient transfections. TATA Reporter used together with 1 μg RSV-Lac-Z. The total amount of DNA was 25-30 μg and was filled up with expression vectors. Typically, 10 μg of the expression vector in question and / or empty expression vector were used. Jurkat T cells, S107 cells and Heia cells (l-2xl0 7 ) were washed twice in PBS, finally resuspended in 200 μl or 500 μl PBS and then transferred into cuvettes (BioRad, 4mm diameter). Then the DNA mix was added, mixed with the cell suspension and the mixture was subjected to electroporation using a BioRad gene pulser at 960 μF and 220V (Jurkat), 230V (S107) or 250V (Heia). Immediately after the electroporation, the cells were placed on ice (5 min.) And then for 5 min. Incubated at 20 ° C, followed by placing on medium (1/3 conditioned, 2/3 fresh). The samples were aliquoted and treated 16 hours after transfection as described for the figures. The cells were harvested 6 hours later. Luciferase activities were determined and ß-galactosidase levels were used to normalize for different transfection efficiencies.
1.4 Präparation und Analyse von Proteinextrakten1.4 Preparation and analysis of protein extracts
Die Präparationsbedingungen von Ganzzellen Extrakten mittels der freeze-thaw Methode sowie die Bedingungen für die Durchführung von EMSA unter Verwendung von radiomarkierten Proben enthalten die Ig-κ-enhancer consensus NF-κB Bindungsstelle sind beschrieben in der Literaturstelle Lernbecher, T., Muller, U. & Wirth, T. (1993) Na ture 365, 767-770. Die Qualltat der Extrakte wurde mittels paralleler EMSA Experimente mit einer die Octl (und Oct2) Transkriptionsfaktoren detektierenden Octamer Probe verifiziert. Für Western Immunoblots wurden 50 bis 100 μg Proteinextrakt auf 12,5% SDS Polyacrylamidgelen separiert. Nach Übertragung auf PVDF Membrane wurde die Proteine mittels der angegebenen Antikörper detektiert und blots wurden unter Verwendung des ECL Systems (Amersham) entwickelt.The preparation conditions of whole cell extracts using the freeze-thaw method and the conditions for carrying out EMSA using radiolabeled samples contain the Ig-κ enhancer consensus NF-κB binding site are described in the literature reference Lernbecher, T., Muller, U. & Wirth, T. (1993) Nature 365, 767-770. The quality of the extracts was verified by means of parallel EMSA experiments with an octamer sample that detects the Octl (and Oct2) transcription factors. For western immunoblots, 50 to 100 μg protein extract were separated on 12.5% SDS polyacrylamide gels. After transfer to the PVDF membrane, the proteins were detected using the specified antibodies and blots were developed using the ECL system (Amersham).
1.5 Zellysis und Immunoprazipitation1.5 Cell lysis and immunoprecipitation
Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion in PBS bei 0°C gewaschen. Für die IKK Aktivitatsassays wurden die Zellen in NP-40 Lysispuffer (enthaltend 25 mM Tris-HCl (ph 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM Na-Pyrophosphat, 25 mM Na-Glycerophosphat, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% Glycerol, 0,5% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 1 mM NaV04, 5 mM Benzamidm, 5 μg/ml Aprotinin, sowie 5 μg/ml Leupeptm) lysiert. Lysate wurden durch Zentrifugieren bei 14000 g für 30 min. geklart und auf Proteingehalt normalisiert. Die Immunoprazipitation wurde für 2 Stunden bei 4°C auf einer rocking plattform unter Verwendung von entweder an protein G sepharose praadsorbierten anti-VSV Antikörpern (für transfektierte Zellen) oder an protein A beads praadsorbiertem IKK-2 Antiserum (zur Prazipitation engenen IKK) durchgeführt. Für das ERK Aktivitatsassay wurden Zellen in RIPA Puffer (25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% Deoxycholat, 1% Nonidet P-40, 10% Glycerol, 2 mM EDTA, pH 8,0, supplementiert mit ImM Na-Orthovanadat, 1 mM PMSF, 5 mM Benzamidin, 5 μg/ml Aprotinin, sowie 5 μg/ml Leupeptin) lysiert gefolgt 5 von einer Klärung bei 40000g für 30 min. Lysate wurden auf Proteingehalt normalisiert und für 2 Stunden bei 4°C mit an protein A agarose (Boehringer Mannheim) präadsorbierten 8 μg anti-HA Antikörper (für transfektierte Zellen) oder anti-ERK-2 Antiserum (für 10 endogenes ERK2) inkubiert.Cells were washed in PBS at 0 ° C 24 hours after transfection. For the IKK activity assays, the cells were in NP-40 lysis buffer (containing 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM Na pyrophosphate, 25 mM Na glycerophosphate, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% glycerol, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 1 mM NaV0 4 , 5 mM Benzamidm, 5 μg / ml aprotinin, and 5 μg / ml Leupeptm) lysed. Lysates were removed by centrifugation at 14,000 g for 30 min. cleared and normalized for protein content. The immunoprecipitation was carried out for 2 hours at 4 ° C. on a rocking platform using either anti-VSV antibodies pre-adsorbed on protein G sepharose (for transfected cells) or on protein A beads pre-adsorbed IKK-2 antiserum (ICK-2 to prevent narrowing). For the ERK activity assay, cells were placed in RIPA buffer (25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate, 1% Nonidet P-40, 10% glycerol, 2 mM EDTA, pH 8.0, supplemented with ImM Na orthovanadate, 1 mM PMSF, 5 mM benzamidine, 5 μg / ml aprotinin, and 5 μg / ml leupeptin) lysed, followed by 5 clarification at 40,000 g for 30 min. Lysates were normalized for protein content and incubated for 2 hours at 4 ° C. with 8 μg anti-HA antibody (for transfected cells) or anti-ERK-2 antiserum (for 10 endogenous ERK2) pre-adsorbed on protein agarose (Boehringer Mannheim).
15 1.6 Immun Komplex Kinase assays15 1.6 Immune complex kinase assays
Zur Bestimmung der IKK Aktivität wurden Immuno- präzipitate zweimal in NP-40 Lysispuffer gewaschen und einmal mit Kinasepuffer enthaltend 20mM HEPES (pHTo determine the IKK activity, immunoprecipitates were washed twice in NP-40 lysis buffer and once with kinase buffer containing 20 mM HEPES (pH
20 7,5), 150 mM NaCl, 25 mM Na-Glycerophosphat, 10 mM MgCl2. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 30 μl Kinasepuffer für 20 min. bei 30°C und unter ständigem Rühren in der Gegenwart von 1 mM DTT, 10μCi[γ32P]ATP (spezifische Aktivität: 3000Ci/mmol) ,20 7.5), 150 mM NaCl, 25 mM Na glycerophosphate, 10 mM MgCl 2 . The reaction was carried out in a total volume of 30 μl kinase buffer for 20 min. at 30 ° C and with constant stirring in the presence of 1 mM DTT, 10μCi [γ 32 P] ATP (specific activity: 3000Ci / mmol),
25 50μM kaltem ATP und 600 ng gereinigtem GST-IκBα (wild type) oder GST-IκBαAA durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Laemmlipuffer und fünfminütiges Kochen beendet. Proteine wurden mittels SDS-PAGE getrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Die 0 Aktivität wurde mittels Autoradiographie bestimmt und mit einem BAS 2000 Biolmaging Analyser (Fuji) quantifiziert. Immunpräzipitierte Proteine wurden mittels western blot unter Verwendung von anti-VSV oder anti-IKK-2 Antikörpern und anschließender Standard enhanced Chemiluminescenz (Amersham) analysiert. Die Aktivität von ERK-2 wurde unter Verwendung von myelin basic protein als Substrat (Gibco BRL) bestimmt gemäß der Literaturstelle Hoffmeyer, A. , Avots, A., Flory, E., Weber, C. K. Serfling E. & Rapp, U. R. (1998) J Biol Chem273, 10112-9.25 50μM cold ATP and 600 ng purified GST-IκBα (wild type) or GST-IκBαAA. The reaction was stopped by adding Laemmlipuffer and boiling for five minutes. Proteins were separated using SDS-PAGE and blotted onto nitrocellulose. The activity was determined by means of autoradiography and quantified using a BAS 2000 biolmaging analyzer (Fuji). Immunoprecipitated proteins were western blotted using anti-VSV or anti-IKK-2 antibodies and subsequent standard enhanced chemiluminescence (Amersham). The activity of ERK-2 was determined using myelin basic protein as substrate (Gibco BRL) according to the literature Hoffmeyer, A., Avots, A., Flory, E., Weber, CK Serfling E. & Rapp, UR (1998 ) J Biol Chem273, 10112-9.
1.7 Präparation der rekombinaten IKKß Kinase Domäne aus E.coli1.7 Preparation of the recombinant IKKß kinase domain from E. coli
Die pGEX-GST-IKKß Kinase Domäne wurde erhalten durch subklonierung des N-terminalen Fragments (Aminosäuren 1-291) von VSV-IKKß in pGEX-2T (Pharmacia) unter Verwendung der endogenen BamHl sites. E.coli bl21 wurden mit dem Plasmid transformiert und die Proteinexpression wurde durch Zugabe von Isopropyl- ß-D-thiogalactosid für 4 Stunden bei 30°C induziert. Das bakterielle Pellet wurde schallbehandelt in PBS enthaltend 1% Triton X-100. GST Fusionsprotein wurde mittels glutathion sepharose beads (Pharmacia) präzipitiert . Das IKKß Protein wurde nach Eluierung von den beads weiter aufgereinigt mittels Chromatographie durch eine mon Q column (Pharmacia) . Die Reinheit des eluierten Proteins war besser als 90%, wie durch SDS-PAGE und subsequentem Coomassie Färben des Gels belegt. 1.8 Aufreinigung von aktivem c-raf aus Sf9 ZellenThe pGEX-GST-IKKß kinase domain was obtained by subcloning the N-terminal fragment (amino acids 1-291) from VSV-IKKß in pGEX-2T (Pharmacia) using the endogenous BamHl sites. E. coli bl21 was transformed with the plasmid and the protein expression was induced by adding isopropyl-β-D-thiogalactoside for 4 hours at 30 ° C. The bacterial pellet was sonicated in PBS containing 1% Triton X-100. GST fusion protein was precipitated using glutathione sepharose beads (Pharmacia). After elution from the beads, the IKKβ protein was further purified by means of chromatography through a mon Q column (Pharmacia). The purity of the eluted protein was better than 90%, as evidenced by SDS-PAGE and subsequent Coomassie staining of the gel. 1.8 Purification of active c-raf from Sf9 cells
Sf9 Insektenzellen wurden mit einer MOI (multiplicity 5 of infection) von 5 mit einem GST-rafΔl.302YY340-341DD (GST-BxB-DD, von Dr. P. Cohen, Dundee, zur Verfügung gestellt) exprimierenden Baculovirus infiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Infektion geerntet und in RIPA Puffer (25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 0,1% 0 SDS, 0,5% Deoxycholat, 1% Nonidet P-40, 10% Glycerol, 2 mM EDTA, pH 8,0, supplementiert mit ImM Na-Orthovanadat, 1 mM PMSF, 5 mM Benzamidin, 5 μg/ml Aprotinin, sowie 5 μg/ml Leupeptin) lysiert. Alle darauf folgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. 5 GST-BxB-DD wurde mittels Gluthation beads präzipitiert . Die beads wurden zweimal mit RIPA Puffer, wie vorstehend, gewashen und einmal für 5 min. in Ripa Puffer mit zusätzlich 500mM LiCl. Nach der Eluierung wurde das Fusionsprotein in 20 mM HEPES (pH 0 7,5), 150 mM NaCl, 10% Glycerol und 1 mM DTT dialysiert. Die Reinheit von GST-BxB-YY340-341DD war ca. 70% gemäß SDS-PAGE und Coomassie Färbung. Die Aktivität des Fusionsproteins wurde getestet in einem in vitro kinase assay unter Verwendung von 5 rekombinantem kinaseinaktivem MEK als Substrat gemäß der folgenden Literaturstellen: Baldwin, A. S. (1996) Annu . Rev. Immuno 1 . 14, 649-681; Schreck, R., Kistler, B. & Wirth. (1997) in Transcription Factors in Eukarotes, eds. Papavassiliou, A. G. (R.G.Landes ° Company, Austin, Texas), pp.153-188. 1.9 raf Aktivitatsassay mit gereinigter IKK Kinase DomäneSf9 insect cells were treated with an MOI (multiplicity 5 of infection) of 5 with a GST-raf Δl . 302 YY340-341DD (GST-BxB-DD, provided by Dr. P. Cohen, Dundee,) expressing baculovirus. The cells were harvested 48 hours after infection and in RIPA buffer (25mM Tris-HCl, 137mM NaCl, 0.1% O SDS, 0.5% Deoxycholat, 1% Nonidet P-40, 10% Glycerol, 2mM EDTA, pH 8.0, supplemented with ImM Na orthovanadate, 1 mM PMSF, 5 mM benzamidine, 5 μg / ml aprotinin, and 5 μg / ml leupeptin) lysed. All subsequent steps were carried out at 4 ° C. 5 GST-BxB-DD was precipitated using glutation beads. The beads were washed twice with RIPA buffer as above and once for 5 min. in Ripa buffer with an additional 500mM LiCl. After elution, the fusion protein was dialyzed in 20 mM HEPES (pH 0 7.5), 150 mM NaCl, 10% glycerol and 1 mM DTT. The purity of GST-BxB-YY340-341DD was approx. 70% according to SDS-PAGE and Coomassie staining. The activity of the fusion protein was tested in an in vitro kinase assay using 5 recombinant kinaseinactive MEK as a substrate according to the following references: Baldwin, AS (1996) Annu. Rev. Immuno 1. 14, 649-681; Schreck, R., Kistler, B. & Wirth. (1997) in Transcription Factors in Eukarotes, eds. Papavassiliou, AG (RGLandes ° Company, Austin, Texas), pp.153-188. 1.9 raf activity assay with purified IKK kinase domain
HA tagged raf Proteine wurden aus transflzierten Jurkatzellen gemäß der Literaturstelle Baldwin, A. S. (1996) Annu . Rev. Immunol . 14, 649-681, lmmuno- geremigt. 500 ng gereinigter GST-IKKß Kinase Domäne wurden mit den angegebenen raf Proteinen oder gereinigtem GST-BxB-DD aus Sf9 Zellen m Kinasepuffer (25 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 25 mM ß-Glycerophosphat, 10 mg MgCl2, lOOμg ATP, 1 mM DTT) in der Gegenwart von 10 μCi [γ32P]ATP für 20 mm. bei 30°C mkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Laemmlipuffer und anschließendem Kochen gestoppt. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE getrennt und durch Autoradiographie visualisiert . Kinase Reaktionen mit rekombmatntem MEK als Substrat wurden durchgeführt wie folgenden Literaturstellen beschrieben: Flory, E., Weber, C. K., Chen, P., Hoffmeyer, A. , Jassoy, C. & Rapp, U. R. (1998) J. Virol . 72, 2788-2794; Daub, M., Jockei, 3., Quack, T., Weber, C. K., Schmitz, F., Rapp, U. R., Wittmghofer, A. & Block, C. (1998) Mol Cell Bi ol 18, 6698-710.HA tagged raf proteins were obtained from transfected Jurkat cells according to Baldwin, AS (1996) Annu. Rev. Immunol. 14, 649-681, immune-reduced. 500 ng of purified GST-IKKβ kinase domain were extracted with the specified raf proteins or purified GST-BxB-DD from Sf9 cells in kinase buffer (25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 25 mM β-glycerophosphate, 10 mg MgCl 2 , 100 μg ATP, 1 mM DTT) in the presence of 10 μCi [γ 32 P] ATP for 20 mm. incubated at 30 ° C. The reaction was stopped by adding Laemmlipuffer and then boiling. The proteins were separated by SDS-PAGE and visualized by autoradiography. Kinase reactions with recombined MEK as substrate were carried out as described in the following references: Flory, E., Weber, CK, Chen, P., Hoffmeyer, A., Jassoy, C. & Rapp, UR (1998) J. Virol. 72, 2788-2794; Daub, M., Jockei, 3., Quack, T., Weber, CK, Schmitz, F., Rapp, UR, Wittmghofer, A. & Block, C. (1998) Mol Cell Bi ol 18, 6698-710.
1.10 IKK Aktivitatsassay in Rohzellen-Lysaten1.10 IKK activity assay in raw cell lysates
Jurkat Zellen wurden in hypotonischem Puffer (siehe: Digna , J. D., Lebovitz, R. M. & Roeder, R. G. (1983) Nuel . Acids Res . 11, 1475-1489) mkubiert und lysiert im Wege der mehrfachen Passage durch eine 21 gauge Nadel. Lysate wurden mittels Zentrifugation geklart und auf Proteingehalt normalisiert. Für jedes assay wurden 1 mg Lysatprotein mit 10 μg gereinigtem GST-BxB-DD aus Sf9 Zellen inkubiert. Thermisch deaktiviertes GST-BxB-DD (90°C für 10 min.) wurde als Kontrolle verwendet. Die Inkubation wurde bei 20°C für 5 20 min. und unter ständigem Rühren in der Gegenwart von 10 uM ATP durchgeführt. Die Bestimmung der Aktivität wurde gemäß 1.6 durchgeführt. Immunoprä- zipitiertes IKK wurde mittels Western blotting und anschließendem Probing mit Antiseren gegen IKKα und 10 IKKß (Santa Cruz) quantifiziert (IKKα und IKKß entspricht IKK-1 und IKK-2) .Jurkat cells were incubated in hypotonic buffer (see: Digna, JD, Lebovitz, RM & Roeder, RG (1983) Nuel. Acids Res. 11, 1475-1489) and lysed by multiple passage through a 21 gauge needle. Lysates were cleared by centrifugation and normalized for protein content. For every assay 1 mg of lysate protein were incubated with 10 μg of purified GST-BxB-DD from Sf9 cells. Thermally deactivated GST-BxB-DD (90 ° C for 10 min.) Was used as a control. The incubation was at 20 ° C for 5 20 min. and carried out with constant stirring in the presence of 10 µM ATP. The activity was determined in accordance with 1.6. Immunoprecipitated IKK was quantified by Western blotting and subsequent probing with antisera against IKKα and 10 IKKß (Santa Cruz) (IKKα and IKKß corresponds to IKK-1 and IKK-2).
15 l.n in vitro IKK Aktivitatsassay15 l.n in vitro IKK activity assay
Rekombinates IKKα oder IKKß (zur Verfügung gestellt von Dr. J. Li : Li, J., Peet, G. W., Pullen, S. S., Schembri-King, 3., Warren, T. C, Marcu, K. B., Kehry, 20 M.R., Barton, R. & Jakes, S. (1998) J Bi ol Chem 273, 30736-41) wurde mit gereinigtem GST-BxB-DD in Kinasepuffer (25 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 25 mM ß-Glycerophosphat, 10 mg MgCl2, lOOμg ATP, 1 mM DTT) inkubiert. Pro assay wurden 800 ng rekombinates IκBα zugegeben und die Reaktion wurde bei 30°C für 20 min. in der Gegenwart von 50 uM ATP und 10 μCi [γ32P]ATP durchgeführt. Thermisch deaktiviertes (siehe 1.10) GST-BxB-DD wurde als Kontrolle verwendet. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Laemmlipuffer und Kochen beiRecombinant IKKα or IKKß (provided by Dr. J. Li: Li, J., Peet, GW, Pullen, SS, Schembri-King, 3., Warren, T. C, Marcu, KB, Kehry, 20 MR, Barton, R. & Jakes, S. (1998) J Bi ol Chem 273, 30736-41) was purified with purified GST-BxB-DD in kinase buffer (25 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 25 mM ß- Glycerophosphate, 10 mg MgCl 2 , 100 μg ATP, 1 mM DTT) incubated. 800 ng of recombinant IκBα were added per assay and the reaction was carried out at 30 ° C. for 20 min. performed in the presence of 50 µM ATP and 10 µCi [γ 32 P] ATP. Thermally deactivated (see 1.10) GST-BxB-DD was used as a control. The reaction was accomplished by adding Laemmlipuffer and boiling
30 95°C für 4 min. beendet. Die Proteine wurden mittels30 95 ° C for 4 min. completed. The proteins were analyzed using
SDS PAGE getrennt. Gleichmäßige Beladung wurde mittelsSDS PAGE separately. Uniform loading was by means of
Coomassie Färbung geprüft. Die Gele wurden getrocknet und phosphorylierte Proteine wurden durch Autoradiographie visualisiert .Coomassie coloring checked. The gels were dried and phosphorylated proteins were visualized by autoradiography.
2. Experiment zur Blockierung der v-raf Transformation von Fibroblasten durch Inhibierung der NF-κB Induktion.2. Experiment to block the v-raf transformation of fibroblasts by inhibiting NF-κB induction.
NIH/3T3 Fibroblasten wurden mit dem v-raf Expressionsplasmid EHneo (250 ng) zusammen mit einemNIH / 3T3 fibroblasts were mixed with the v-raf expression plasmid EHneo (250 ng) together with a
4-fachen Überschuß (1 μg) der wild type und kinaseinaktiven Formen von IKK-2 transfiziert . Foci oder morphologisch transformierte Zellen wurden 144-fold excess (1 μg) of the wild type and kinase-inactive forms of IKK-2 transfected. Foci or morphologically transformed cells were 14
Tage nach der Transfektion gezählt. Wie aus der Tabelle 1 ersichtlich war die v-raf induzierteCounted days after transfection. As can be seen from Table 1, the v-raf was induced
Transformation nicht beeinflußt durch die Expression von wild type Kinase. Dagegen reduzierte kinaseinaktives IKK-2 die Focus Ausbeute dramatisch.Transformation not affected by wild type kinase expression. In contrast, kinase-inactive IKK-2 dramatically reduced the focus yield.
Es ist bekannt, daß kinaseinaktives IKK-2 als ein dominant negativer Regulator der Induktion von NF-κB durch TNFα und andere Stimuli funktioniert. Dies inKinase-active IKK-2 is known to function as a dominant negative regulator of the induction of NF-κB by TNFα and other stimuli. This in
Verbindung mit den gezeigten Ergebnissen belegt, daßCombination with the results shown shows that
NF-κB Induktion für eine v-raf vermittelteNF-κB induction for a v-raf mediated
Transformation erforderlich ist.Transformation is required.
Tabelle 1Table 1
Focus Ausbeute (%) v-raf + Vektor 100 v-raf + IKK-2 (WT) 111 + 28 v-raf + IKK-2 (KD) 13 + 11 3. Experimente, welche belegen, daß IiB-Kinase in die raf vermittelte NF-κB Induktion involviert istFocus yield (%) v-raf + vector 100 v-raf + IKK-2 (WT) 111 + 28 v-raf + IKK-2 (KD) 13 + 11 3. Experiments which show that IiB kinase is involved in the raf-mediated NF-κB induction
Um den Beitrag des IKK-Komplexes zur PMA- und raf-induzierten NF-KB Aktivität zu untersuchen, wurde der Effekt von kinaseinaktivem IKK-2 in Jurkat T Zellen untersucht. Jurkat T Zellen wurden cotransfiziert mit einem KB abhängigen ReporterTo investigate the contribution of the IKK complex to PMA and raf-induced NF-KB activity, the effect of kinaseinactive IKK-2 in Jurkat T cells was investigated. Jurkat T cells were cotransfected with a KB dependent reporter
(3xκB.luc) und entweder einem Expressionsvektor für dominant negatives IKK-2 (dn-IKK-2) oder dem leeren(3xκB.luc) and either an expression vector for dominant negative IKK-2 (dn-IKK-2) or the empty one
Expressionsvektor pcDNA3. 16 Stunden nach derExpression vector pcDNA3. 16 hours after the
Transfektion wurden die Zellen mit 20 ng/μl PMA oderThe cells were transfected with 20 ng / μl PMA or
80ng/μl TNFα für 6 Stunden stimuliert. Die80ng / μl TNFα stimulated for 6 hours. The
Luciferaseaktivität für nichtinduzierte Zellen, welche mit pcDNA3 cotransfiziert wurden, wurde auf 1 gesetzt und alle anderen Aktivitäten sind hierauf normiert.Luciferase activity for non-induced cells co-transfected with pcDNA3 was set to 1 and all other activities are normalized to this.
Die Ergebnisse sind im einzelnen in der Fig. la dargestellt. Hieraus entnimmt man, daß der Reporter atwa 15-fach bei Behandlung mit PMA und etwa 25-fach mit TNFα aktiviert wurde. Cotransfektion des dn-IKK-2The results are shown in detail in FIG. From this it can be seen that the reporter atwa was activated 15 times with treatment with PMA and approximately 25 times with TNFα. Cotransfection of the dn-IKK-2
Expressionsvektors blockierte die Aktivierung nicht nur im Falle von TNFα, sondern auch im Falle von PMA.Expression vectors blocked activation not only in the case of TNFα, but also in the case of PMA.
Als nächstes wurde der Effekt der dn-IKK-2 Expression auf constitutiv aktive Varianten der raf ProteinNext was the effect of dn-IKK-2 expression on constitutively active variants of the raf protein
Kinase untersucht. Dies wurde erhalten durch Fusion der ras carboxyterminalen Domäne an die Kinase Domäne von raf, was in Targeting von raf auf die Zellmembran resultiert (raf-BxB-CX) . Alternativ wurde ein rafKinase examined. This was obtained by fusion of the ras carboxy-terminal domain to the kinase domain of raf, which resulted in targeting of raf to the cell membrane (raf-BxB-CX). Alternatively, a raf
Protein mit zwei phosphomimetischen Aminosäuren benutzt (YY340-341DD) , welche Tyrosin Phophorylierung mimikrieren. Tyrosin Phosphorylierung von raf an diesen Stellen ist in der Aktivierung von raf in T-Zellen involviert. Jurkat T-Zellen wurden mit einer der vorstehenden Varianten, 3xκB.luc und ggf. dn-IKK-2 cotransfiziert . Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. lb dargestellt. Transfektion dieser raf Proteine induzierte NF-κB abhängige Transcription auf einem vergleichbaren Niveau wie PMA Behandlung. Diese Aktivität nahm zu bei PMA Behandlung der raf trans- fizierten Zellen. Bei cotransfektion von dn-IKK-2 waren allerdings alle Aktivitäten praktisch vollständig unterdrückt. Hieraus folgt, daß IKK-2 und vermutlich der IKK-Komplex ein kritisches Element in der PMA- und raf-induzierten NF-κB Aktivität sind.Protein with two phosphomimetic amino acids used (YY340-341DD) that mimic tyrosine phosphorylation. Tyrosine phosphorylation of raf at these sites is in the activation of raf T cells involved. Jurkat T cells were cotransfected with one of the above variants, 3xκB.luc and, if appropriate, dn-IKK-2. The results obtained are shown in FIG. 1b. Transfection of these raf proteins induced NF-κB dependent transcription at a level comparable to PMA treatment. This activity increased with PMA treatment of the raf-transfected cells. With cotransfection of dn-IKK-2, however, all activities were practically completely suppressed. It follows that IKK-2 and probably the IKK complex are a critical element in the PMA and raf-induced NF-κB activity.
Die Figur lc zeigt Aktivitäten in Jurkat Zellen, welche cotransfiziert sind mit dem Reporter HSV-tk.luc und Expressionsvektoren für entweder wild type IKK-2 oder dn-IKK-2. Auf 100 gesetzte Bezugsgröße ist das Expressionsniveau bei Cotransfektion des Reporters (lOμg) mit pcDNA3. Die Figur lc belegt, daß die zuvor gezeigten Effekte von IKK-2 und dn-IKK-2Figure lc shows activities in Jurkat cells which are cotransfected with the reporter HSV-tk.luc and expression vectors for either wild type IKK-2 or dn-IKK-2. The expression level upon co-transfection of the reporter (10 μg) with pcDNA3 is set to 100 reference value. FIG. 1c shows that the effects of IKK-2 and dn-IKK-2 shown above
Cotransfektionen spezifisch für den NF-kB abhängigen Reporter sind, da ein constitutiver Promotor (Herpes Virus Thymidin Kinase Promotor) nicht berührt war.Cotransfections are specific for the NF-kB dependent reporter, since a constitutive promoter (herpes virus thymidine kinase promoter) was not touched.
in den der Figur ld zugrundeliegenden Versuchen wurden Jurkat Zellen mit dem κB-abhängigen Reporter und aktivem raf transfiziert . 16 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit Suramin (1,5 mM f.c.) behandelt. Eine Stunde später wurden PMA oderIn the experiments on which FIG. 1d was based, Jurkat cells were transfected with the κB-dependent reporter and active raf. 16 hours after the transfection, the cells were treated with suramin (1.5 mM f.c.). An hour later, PMA or
TNFα zugegeben, wie ersichtlich und die Zellen wurden weitere 6 Stunden danach geerntet. Suramin ist eine heterozyklische polyanionische Verbindung, welche inTNFα added, as can be seen, and the cells were harvested an additional 6 hours after. Suramin is a heterocyclic polyanionic compound, which in
Ligand-Rezeptor Wechselwirkungen an der Zelloberfläche eingreift. Die Figur ld zeigt, daß TNFα vermittelte NF-κB Aktivität durch Behandlung mit Suramin reduziert wird, wie erwartet. Im Gegensatz hierzu wurde weder PMA- noch raf-induzierte NF-κB Aktivität berührt. Dies legt nahe, daß eine autocrine loop nicht involviert ist .Ligand-receptor interactions on the cell surface intervenes. Figure 1d shows that TNFα-mediated NF-κB activity is reduced by treatment with suramin, as expected. In contrast, neither PMA nor raf-induced NF-κB activity was touched. This suggests that an autocrine loop is not involved.
4. Experimente, die belegen, daß PMA und raf IκB Kinase Aktivität stimulieren.4. Experiments demonstrating that PMA and raf IκB stimulate kinase activity.
Die Figur 2a zeigt Ergebnisse, welche mit Jurkat Zellen erhalten wurden, die mit 3xkB.luc and aktivem raf (raf-BxB-CX) und7oder wild type IKK-2 cotrans- fiziert wurden. Stimulation erfolgte mit PMA, wie angegeben. Die Ergebnisse zeigt, daß Überexpression von wild type IKK-2 als solches die NF-κB abhängige Transkription signifikant stimuliert. Cotransfektion des constitutiv aktiven raf Konstrukts mit wild typeFIG. 2a shows results which were obtained with Jurkat cells which were cotransfected with 3xkB.luc and active raf (raf-BxB-CX) and 7 or wild type IKK-2. Stimulation was done with PMA as indicated. The results show that overexpression of wild type IKK-2 as such significantly stimulates NF-κB dependent transcription. Cotransfection of the constitutively active raf construct with wild type
IKK-2 führt zu einer zusätzlichen Erhöhung derIKK-2 leads to an additional increase in
Reportergen Aktivität. Entsprechendes wurde bei PMAReporter gene activity. The same was done at PMA
Behandlung gefunden.Treatment found.
In der Fig. 2b ist gezeigt, daß IKK-2 Überexpression in constitutiver Phosphorylierung von IκBα resultiert.2b shows that IKK-2 overexpression results in constitutive phosphorylation of IκBα.
Das obere Panel zeigt ein Autoradiogram eines ImmunThe top panel shows an autoradiogram of an immune
Komplex Assays unter Verwendung von GST-IκBα (AAl-72)Complex assays using GST-IκBα (AAl-72)
(GST = Glutathion-S-Transferase) als Substrat. Zellen wurden wie in Fig. 2a transfiziert . VSV-IKK-2 wurde immunopräzipitiert und entweder mit wild type (wt) oder mutiertem IκBa (AA) , worin Serin an den Positionen(GST = glutathione-S-transferase) as substrate. Cells were transfected as in Figure 2a. VSV-IKK-2 was immunoprecipitated and either wild type (wt) or mutated IκBa (AA), with serine at the positions
32 und 36 durch Alanin substituiert ist, inkubiert.32 and 36 is substituted by alanine.
Die Zahlen darunter zeigen die relative IκBα-spezifische Kinaseaktivität . Die background Phosphorylierung in pcDNA3 transfizierten Zellen wurde zu 1 gesetzt. Das untere Panel zeigt Western blot Analysen des immunopräzipitierten IKK-2. Die Spezifität der gefundenen Phosphorylierung ist durch die Abwesenheit einer Phosphorylierung im Falle des mutanten Substrats belegt.The numbers below show the relative IκBα-specific kinase activity. The background phosphorylation in pcDNA3 transfected cells was set to 1. The lower panel shows Western blot analyzes of the immunoprecipitated IKK-2. The specificity of the phosphorylation found is evidenced by the absence of phosphorylation in the case of the mutant substrate.
Die Figur 2c belegt, daß die IKK-2 Aktivität in Extrakten von Zellen, welche mit einem aktiven rafFIG. 2c shows that the IKK-2 activity in extracts from cells which have an active raf
Kinase Konstrukt cotransfiziert wurden, erhöht ist. In dem oberen Panel ist ein Immun Komplex Assay mit immunopräzipitiertem VSV-IKK-2 und IκBα als Substrat gezeigt. Der Stern zeigt autophosphoryliertes IKK-2 Protein. Die Zahlen unter dem Panel geben die relativen Kinaseaktivitäten an. Das untere Panel zeigt einen Western Immunoblot für präzipitiertes IKK-2 als Kontrolle. Die Größen der Protein Marker sind an der Seite angegeben. Nicht gezeigt ist, daß mutantes IκBα Protein nicht berührt war, was die Spezifität derKinase construct were cotransfected is increased. The upper panel shows an immune complex assay with immunoprecipitated VSV-IKK-2 and IκBα as substrate. The star shows autophosphorylated IKK-2 protein. The numbers below the panel indicate the relative kinase activities. The lower panel shows a Western immunoblot for precipitated IKK-2 as a control. The sizes of the protein markers are shown on the side. It is not shown that mutant IκBα protein was not affected, which impairs the specificity of the
Phosphorylierung belegt. Das mutante raf Konstrukt (im Bereich der ATP Bindungsstelle mutiert) ergibt ein kinaseinaktives Protein, welches eine IκBα-spezifischePhosphorylation proven. The mutant raf construct (mutated in the region of the ATP binding site) results in a kinaseinactive protein which is IκBα-specific
Kinaseaktivität von IKK-2 nicht stimuliert. Dieses mutante Protein stimuliert auch nicht κB-abhängιgeKinase activity not stimulated by IKK-2. This mutant protein also does not stimulate κB-dependent
Reportergenaktivität (nicht dargestellt) .Reporter gene activity (not shown).
5. Ergebnisse, welche belegen, daß die mitogene cytoplasmische Kinase Kaskade nicht essentiell für die NF-κB Induktion durch PMA und raf ist. Die mitogene Signalisierung via raf ist bereits ausführlich untersucht worden, raf wird aktiviert über multiple extrazelluläre Signale, i.e. über ras durch Liganden, welche an Tyrosin Kinase Rezeptoren binden. Der wesentliche nachgeschaltete Effektor ist MEK, welches die ERK Kinasen phosphoryliert und aktiviert. Es ist bekannt, daß ein Inhibitor niedrigen Molekulargewichts, PD98059, MEK Aktivierung in vielen Systemen blockiert (Dudley, D. T., Pang, L., Decker, s. J., Bridges, A. J. & Saltiel, A. R. (1995) Proc Na tl Acad Sei USA 92, 7686-9) .5. Results which demonstrate that the mitogenic cytoplasmic kinase cascade is not essential for NF-κB induction by PMA and raf. Mitogenic signaling via raf has already been extensively investigated; raf is activated via multiple extracellular signals, ie via ras by ligands that bind to tyrosine kinase receptors. The main downstream effector is MEK, which phosphorylates and activates the ERK kinases. A low molecular weight inhibitor, PD98059, is known to block MEK activation in many systems (Dudley, DT, Pang, L., Decker, S.J., Bridges, AJ & Saltiel, AR (1995) Proc Na tl Acad Sei USA 92, 7686-9).
Die Ergebnisse der Fig. 3 zeigen, daß PD98059 dagegen nicht in die raf oder PMA vermittelte NF-κB Aktivierung eingreift, woraus zu schließen ist, daß die mitogene cytoplasmische Kinase Kaskade bei der NF-κB Aktivierung nicht involviert ist.The results of FIG. 3 show that PD98059, on the other hand, does not interfere with NF-κB activation mediated by raf or PMA, from which it can be concluded that the mitogenic cytoplasmic kinase cascade is not involved in NF-κB activation.
Fig. 3a zeigt EMSA Versuche mit Ganzzellextrakten3a shows EMSA experiments with whole cell extracts
(5μg) aus Jurkat Zellen mit Behandlungen, wie angegeben, sowie eine κB-spezifische probe. PD98059(5μg) from Jurkat cells with treatments as indicated, as well as a κB-specific sample. 98059
(PD) wurde 2 STunden vor der PMA oder TNFα(PD) was 2 hours before the PMA or TNFα
Stimulierung zugegeben. Die Positionen der induziertenAdded stimulation. The positions of the induced
NF-κB Komplexe sowie der nichtspezifischen KomplexeNF-κB complexes as well as the non-specific complexes
(Stern) sind gekennzeichnet. Nur der relevante Teil des Autoradiogramms ist gezeigt. Unbehandelte Jurkat(Asterisk) are marked. Only the relevant part of the autoradiogram is shown. Untreated Jurkat
Zellen zeigen sehr niedrige Levels nuklearer NF-κBCells show very low levels of nuclear NF-κB
Bindungsaktivität, welche mit PMA Induktion sehr stark induziert werden konnte. Im Gegensatz zu den bereits nach 10 min. durch TNFα induzierten NF-κB Komplexen, war PMA Induktion leicht verzögert und maximal nach ca. 30 min. nach Behandlung. PD98059 Zugabe führte zu keiner Verringerung der TNFα oder PMA induzierten NF- B DNA Bindung.Binding activity, which could be induced very strongly with PMA induction. In contrast to the already after 10 min. due to TNFα-induced NF-κB complexes, PMA induction was slightly delayed and maximal after approx. 30 min. after treatment. PD98059 addition resulted in no reduction in TNFα or PMA induced NF-B DNA binding.
Fig. 3b zeigt Ergebnisse einer transienten Transfektion von Jurkat Zellen mit 3xκB.luc. Die Zellen wurden mit dem aktiven raf Expressionsvektor BxB-CX cotransfiziert und wie angegeben mit PMA und PD98059 behandelt. PD98059 wurde 4 STunden nach Transfektion zugegeben, PMA wurde weitere 12 Stunden später für 6 Stunden zugegeben. Man erkennt, daß PD98059 die PMA- oder raf-stimulierte κB-abhängige Reporter Aktivität nicht reduziert. Eine geringfügige Stimulation der κB-abhängigen Transkription ist zu erkennen.3b shows results of a transient transfection of Jurkat cells with 3xκB.luc. The cells were cotransfected with the active raf expression vector BxB-CX and treated with PMA and PD98059 as indicated. PD98059 was added 4 hours after transfection, PMA was added another 12 hours later for 6 hours. It can be seen that PD98059 does not reduce the PMA- or raf-stimulated κB-dependent reporter activity. A slight stimulation of the κB-dependent transcription can be seen.
Die Fig. 3c zeigt, daß PMA- und TNFα-stimulierte Aktivität des IKK Komplexes durch PD98059 nicht berührt wird. Endogene IKK Aktivität wurde zeitabhängig in Verfolg der STimulation von JurkatFigure 3c shows that PMA and TNFα stimulated activity of the IKK complex is not affected by PD98059. Endogenous IKK activity was time-dependent following Jurkat's stimulation
Zellen bestimmt. Die Panels zeigen Autoradiogramme eines Immun Komplex Assays unter Verwendung von IκBα als Substrat nach 10, 30 und 60 min. und in derCells determined. The panels show autoradiograms of an immune complex assay using IκBα as a substrate after 10, 30 and 60 min. and in the
Gegenwart oder Abwesenheit der angegebenen Stoffe.Presence or absence of the specified substances.
Maximale Phosphorylierung wurde nach 10 min. mit TNFα und nach 30 min. mit PMA beobachtet. Die Zahlenwerte geben die relativen IκBα-spezifischen KinaseMaximum phosphorylation was after 10 min. with TNFα and after 30 min. observed with PMA. The numerical values give the relative IκBα-specific kinase
Aktivitäten an. Die Aktivität in Extrakten aus unbehandelten Zellen wurde zu 1 gesetzt. Hinsichtlich der induzierten IKK-2 Aktivitäten ist kein signifikanter Effekt durch PD98059 auf die Induktion durch TNFα oder PMA zu beobachten. Der Figur 3d ist zu entnehmen, daß demgegenüber (und erwartungsgemäß) Die PMA Stimulation von endogenem ERK-2 durch PD98059 unterdrückt wird. Jurkat Zellen wurden mit den angegebenen Stoffen für 30 min. stimuliert. Die Aktivität von endogenem ERK wurde in einem Immun Komplex Assay unter Verwendung von myelin basic protein (MBP) als Substrat bestimmt. Das obere Panel zeigt ein Autoradiogramm der MBP Phosphorylierung, das untere ein Western blot des immunpräzipitierten ERK-2. Das mobility shift für phosphoryliertes ERK-2 ist aufgrund des kurzen Polyacrylamid Gels nicht detektierbar . MBP-spezifische Kiase Aktivitäten sind durch die Zahlenwerte angegeben.Activities. The activity in extracts from untreated cells was set to 1. With regard to the induced IKK-2 activities, no significant effect by PD98059 on the induction by TNFα or PMA can be observed. It can be seen from FIG. 3d that in contrast (and as expected) the PMA stimulation of endogenous ERK-2 is suppressed by PD98059. Jurkat cells were washed with the specified substances for 30 min. stimulated. The activity of endogenous ERK was determined in an immune complex assay using myelin basic protein (MBP) as a substrate. The upper panel shows an autoradiogram of the MBP phosphorylation, the lower one a Western blot of the immunoprecipitated ERK-2. The mobility shift for phosphorylated ERK-2 cannot be detected due to the short polyacrylamide gel. MBP-specific kiase activities are indicated by the numerical values.
Zur Bestätigung der Erkenntnisse aus den Ergebnissen der Fig. 3 wurde der Effekt von dominant negativem MEK untersucht. Für Fig. 4a wurden Jurkat Zellen transient transfiziert mit 3xkB.luc und Expressionsvektoren für raf (BxB-CX, wild type IKK-2 und zwei dominant negativen Varianten von MEK (MEK-S217A und MEK-K97M, jeweils 15μg) . Keines der beiden MEK Mutanten reduzierte die raf-induzierte Transaktivierung des NF-κB-abhängigen Reporters. Für Fig. 4b wurden Jurkat Zellen mit den angegebenen Plasmiden transfiziert wie zu 4a beschrieben. Das obere Panel zeigt ein Autoradiogramm eines Immun Komplex Assays der IKK-2 Aktivität unter Verwendung von IκBα als Substrat. Eine langsamer wandernde Bande (Stern) ist vermutlich Autophosphorylierung von immunpräzipitiertem IKK-2. Die Zahlenwerte geben die relative IKK-2 Kinase Aktivität an. Das untere Panel zeigt einen Western blot des immunpräzipitierten IKK-2. Wie bereits zuvor, erkennt man, daß IKK-2 Expression allein in einer meßbaren, für IκBα spezifische in vitro Kinase Aktivität resultiert. Cotransfektion von mutantem MEK berührt diese konstitutive Aktivität nicht. Dies belegt, daß MEK nicht für die raf vermittelte NF-κB Aktivierung erforderlich ist. Die Figuren 4c und 4d belegen auch, daß dieses Ergebnis nicht auf mangelnder Funktion der MEK Mutanten als dominant negativ beruht. Für Fig. 4c wurde ein GAL4 Reporter (4xl7.TATA) mit dem Expressionsvektor für das GAL-ERK Fusionsprotein cotransfiziert und raf BxB-CX sowie die genannten MEK Mutanten (jeweils 15μg) wurden eingeschlossen. Für Fig. 4d wurden Jurkat Zellen entweder mit pcDNA3 oder einem Expressionsvektor für HA-tagged ERK-2 zusammen mit den angegebenen Plasmiden transfiziert. ERK-2 wurde unter Verwendung des tag-spezifischen Antikörpers immunpräzipitiert und das obere Panel zeigt ein Autoradiogramm eines Immun Komplex Assays mit MBP als Substrat. Die Zahlenwerte geben die relativen Aktivitäten an. Das untere Panel zeigt einen Western blot des immunpräzipitierten ERK-2. Man erkennt, daß das verwendete dn-MEK erwartungsgemäß die raf-induzerte GAL-ELK Transkriptionsaktivität blockiert und daß die ERK-2 Aktivierung durch raf BxB-CX unterdrückt wird.To confirm the findings from the results in FIG. 3, the effect of dominant negative MEK was examined. For Fig. 4a, Jurkat cells were transiently transfected with 3xkB.luc and expression vectors for raf (BxB-CX, wild type IKK-2 and two dominant negative variants of MEK (MEK-S217A and MEK-K97M, each 15μg). Neither MEK mutants reduced the raf-induced transactivation of the NF-κB-dependent reporter.For Figure 4b, Jurkat cells were transfected with the plasmids indicated as described in Figure 4. The upper panel shows an autoradiogram of an immune complex assay using IKK-2 activity of IκBα as substrate. A slow migrating band (star) is probably autophosphorylation of immunoprecipitated IKK-2. The numerical values indicate the relative IKK-2 kinase activity. The lower panel shows a Western blot of the immunoprecipitated IKK-2. As before, it can be seen that IKK-2 expression alone results in a measurable, in vitro kinase activity specific for IκBα. Cotransfection of mutant MEK does not affect this constitutive activity. This proves that MEK is not required for raf-mediated NF-κB activation. Figures 4c and 4d also show that this result is not due to a lack of function of the MEK mutants as a dominant negative. For FIG. 4c, a GAL4 reporter (4xl7.TATA) was co-transfected with the expression vector for the GAL-ERK fusion protein and raf BxB-CX as well as the mentioned MEK mutants (15 μg each) were included. For Figure 4d, Jurkat cells were transfected with either pcDNA3 or an expression vector for HA-tagged ERK-2 together with the plasmids indicated. ERK-2 was immunoprecipitated using the tag-specific antibody and the top panel shows an autoradiogram of an immune complex assay with MBP as the substrate. The numerical values indicate the relative activities. The lower panel shows a Western blot of the immunoprecipitated ERK-2. It can be seen that the dn-MEK used, as expected, blocks the raf-induced GAL-ELK transcription activity and that ERK-2 activation is suppressed by raf BxB-CX.
Eine weitere Stützung der vorstehenden Ergebnisse wurde durch die der Fig. 5 zugrundeliegenden Versuche erhalten. Für Fig. 5a wurden S107 Zellen mit dem GAL4-abhängigen Reporter zusammen mit GAL-ELK oder 3xκB.luc, wie angegeben, transfiziert. Die Zellen wurden entweder mit raf BxB-CX cotransfiziert oder mit PMA stimuliert. Fig. 5b zeigt ein Cotransfektions- experi ent mit GAL-ELK und dem GAL4 Reporter in Jurkat Zellen zusammen mit Expressionsvektoren für raf BxB-CX und wild type IKK-2 und dn-IKK-2, wie angegeben. S107 ist eine mutantePlasmacytoma Zellinie, welchen die 5 Fähigkeit zur Aktivierung von NF-κB auf verschiedene Stimuli fehlt und dieser Defekt ist dem IKK Komplex vorgeschaltet. Der Fig. 5a entnimmt man, daß weder PMA noch raf den κB-abhängigen Reporter in diesen Zellen aktivieren. Dagegen zeigten die gleichen Stimuli eineA further support for the above results was obtained by the experiments on which FIG. 5 is based. For Fig. 5a, S107 cells were transfected with the GAL4-dependent reporter together with GAL-ELK or 3xκB.luc as indicated. The cells were either co-transfected with raf BxB-CX or stimulated with PMA. 5b shows a cotransfection Experi ent with GAL-ELK and the GAL4 reporter in Jurkat cells together with expression vectors for raf BxB-CX and wild type IKK-2 and dn-IKK-2, as indicated. S107 is a mutant plasmacytoma cell line which lacks the ability to activate NF-κB on different stimuli and this defect is upstream of the IKK complex. FIG. 5a shows that neither PMA nor raf activate the κB-dependent reporter in these cells. In contrast, the same stimuli showed one
10 hohe Aktivität in dem GAL-ELK Reportersystem. Dies belegt, daß eine intakte MAP-Kinase Kaskade nicht für eine NF-κB Aktivierung ausreicht. Die Fig. 5b belegt letztendlich, daß die raf-MEK-ERK und raf-IKK pathways unabhängig voneinander sind. Weder stimuliert wild i5 type IKK-2 GAL-ELK Aktivität, noch reduziert dn-IKK-2 raf stimulierte GAL-ELK Aktivität bei Cotransfektion in Jurkat Zellen.10 high activity in the GAL-ELK reporter system. This proves that an intact MAP kinase cascade is not sufficient for NF-κB activation. FIG. 5b ultimately proves that the raf-MEK-ERK and raf-IKK pathways are independent of one another. Neither wildly stimulates i5 type IKK-2 GAL-ELK activity, nor does dn-IKK-2 raf stimulate GAL-ELK activity upon cotransfection in Jurkat cells.
Schließlich wurde untersucht, ob die beobachteten 0 Effekte nur auf Jurkat Zellen beschränkt sind. DieFinally, it was examined whether the observed effects are only limited to Jurkat cells. The
Figur 6 zeigt Versuchsergebnisse in HeLa Zellen. Diese wurden transient transfiziert mit 3xkB.luc und Expressionsvektoren für raf-BxB-CX, dn-IKK-2 und dn-MEK (S217A) , wie angegeben. PMA Iduktion wurde wie 2^ zuvor angegeben durchgeführt. Die Ergebnisse an den HeLa Zellen stehen in voller Übereinstimmung mit jenen an Jurkat Zellen.Figure 6 shows test results in HeLa cells. These were transiently transfected with 3xkB.luc and expression vectors for raf-BxB-CX, dn-IKK-2 and dn-MEK (S217A) as indicated. PMA induction was carried out as previously indicated. The results on the HeLa cells are in full agreement with those on Jurkat cells.
30 6. Experimente, welche belegen, daß die Stimulation von IκB Kinase durch raf indirekt ist und MEKKl involviert . Die folgenden Experimente dienten der Untersuchung der Frage, ob die Stimulation der IKK Kinase Aktivität durch raf direkt oder indirekt ist.3 0 6. Experiments which show that the stimulation of IκB kinase by raf is indirect and involves MEKKl. The following experiments investigated whether the stimulation of IKK kinase activity by raf is direct or indirect.
Zunächst wurde untersucht, ob auch rekombinates raf eine in vitro Stimulation von IKK Aktivität hervorruft. In Fig. 7a wurden cytosole Extrakte aus unbehandelten oder PMA-induzierten (30 min.) Jurkat Zellen mit aktivem (+) oder hitzedeaktiviertem (-) rekombinantem raf-BxB-DD Protein in Anwesenheit von unmarkiertem ATP inkubiert. Der endogene IKK Komplex wurde mit entweder IKK-1 oder IKK-2 erkennenden Antikörpern immunpräzipitiert und in einem in vitro Kinase Assay mit GST-IκBα getestet (oberes Panel) . Das untere Panel zeigt einen Kontroll-Immunblot der Immunpräzipitate mit einer Mischung aus IKK-1 und IKK-2 erkennenden Antikörpern. In allen Fällen wurde eine Stimulation von IKK Aktivitäten durch aktives rekombinantes raf Protein festgestellt. Da IKK-2 stets mit dem IKK-1 Antikörper präzipitierte, und umgekehrt, dürfte die bestimmte Aktivität von dem heterodimeren IKK-l/IKK-2 Komplex herrühren.First, it was investigated whether recombinant raf also stimulates IKK activity in vitro. In Fig. 7a, cytosolic extracts from untreated or PMA-induced (30 min.) Jurkat cells were incubated with active (+) or heat-deactivated (-) recombinant raf-BxB-DD protein in the presence of unlabeled ATP. The endogenous IKK complex was immunoprecipitated with either IKK-1 or IKK-2 recognizing antibodies and tested in an in vitro kinase assay with GST-IκBα (upper panel). The lower panel shows a control immunoblot of the immunoprecipitates with a mixture of antibodies recognizing IKK-1 and IKK-2. In all cases, stimulation of IKK activities by active recombinant raf protein was found. Since IKK-2 always precipitated with the IKK-1 antibody, and vice versa, the particular activity should come from the heterodimeric IKK-1 / IKK-2 complex.
In der Fig. 7b ist ein in vitro Kinase Assay mit rekombinatem GST, GST-MEK und die activation loop entahltende GST-IKK-2 (1-291) als Substrat wiedergegeben. Jurkat Zellen wurden mit HA-tagged raf-BxB-CX, einem HA-tagged kinaseinaktiven Mutant hiervon, oder pcDNA3 transfiziert. Extrakte wurden immunpräzipitiert mit HA-spezifischen Antikörpern und in einem Immun Komplex Assay mit den angegebenen Substraten getestet. Zusätzlich wurden Substratproteine auch mit 5 μg rekombinantem raf-BxB-DD, gereinigt aus Baculovirus-infizierten Sf9 Zellen umgesetzt. MEK wurde erwartungsgemäß durch raf phosphoryliert, hingegen konnte keine Phosphorylierung des GST-IKK-2 Fusionsproteins festgestellt werden. Das Gleiche wurde für rekombinates raf (rBxB-DD) oder immunpräzipitiertes raf (BxB-CX aus transfizierten Jurkat Zellen gefunden. Bei Benutzung von Vollängen rekombinantem IKK-1 und IKK-2 in einem coupled kinase assay mit IkBa als Substrat wurde entsprechenderweise keine Stimulation oder zusätzliche Phosphorylierung von IKK Proteinen in vitro und in Gegenwart von raf beobachtet, wozu auf die Fig. 7c verwiesen wird. Hierin wurden 500 ng rekombinantes und gereinigtes IKK-1, 50 ng rekombinantes und gereinigtes IKK-2 und 5 μg rekombinates raf-BxB-DD, wie angegeben, eingesetzt. Die Positionen des phosphorylierten IκBα und des autophosphorylierten IKK Proteins sind markiert.FIG. 7b shows an in vitro kinase assay with recombinant GST, GST-MEK and the activation loop containing GST-IKK-2 (1-291) as substrate. Jurkat cells were transfected with HA-tagged raf-BxB-CX, an HA-tagged kinase-inactive mutant thereof, or pcDNA3. Extracts were immunoprecipitated with HA-specific antibodies and tested in an immune complex assay with the specified substrates. In addition, substrate proteins were also mixed with 5 μg recombinant raf-BxB-DD, purified from baculovirus-infected Sf9 cells. As expected, MEK was phosphorylated by raf, but no phosphorylation of the GST-IKK-2 fusion protein was found. The same was found for recombinant raf (rBxB-DD) or immunoprecipitated raf (BxB-CX from transfected Jurkat cells. When using full-length recombinant IKK-1 and IKK-2 in a coupled kinase assay with IkBa as substrate, no stimulation or Additional phosphorylation of IKK proteins was observed in vitro and in the presence of raf, for which reference is made to Fig. 7c, in which 500 ng of recombinant and purified IKK-1, 50 ng of recombinant and purified IKK-2 and 5 μg of recombinant raf-BxB- DD as indicated, the positions of the phosphorylated IκBα and the autophosphorylated IKK protein are marked.
Die Beobachtung aus diesen Experimenten, daß raf IKK Aktivität in Rohlysaten induziert, nicht jedoch die Aktivitäten der gereinigten IKK Proteine berührt, zeigt an, daß keine direkte Bindung von raf an NF-κB erfolgt, sondern daß ein Intermediat involviert ist. In der Fig. 8 sind Ergebnisse mit den als Intermediate in Frage kommenden Substanzen MEKKl und NIK dargestellt. In der Fig. 8a sind Ergebnisse einer Cotransfektion von 3xκB.luc mit entweder 5 μg oder 2 μg MEKKl Expressionsvektor und absteigenden Mengen (10, 7, 5 μg) an raf-BxB-CX dargestellt. Die Aktivität des Reporters in Cotransfektion mit pcDNA3 wurde zu 1 gesetzt. Man erkennt, daß raf auf synergistische Weise MEKKl vermittelte Aktivität bei allen getesteten Konzentrationen steigert. Dagegen konnte kein Effekt durch raf in Cotransfektionen mit verschiedenen Mengen an "NIK Expressionsvektor gefunden werden (Daten nicht gezeigt) . Die Fig. 8b zeigt, daß die Synergie zwischen raf und MEKKl auch im Falle von raf-BxB-CX, raf-BxB-DD und interessanterweise auch von raf-BxB, welches als solches keinerlei NF-κB induzierende Aktivität in T-Zellen zeigt, gefunden wurde (Fig. 8b: 5 μg MEKKl und/oder jeweils 10 μg der raf Varianten) . Der kinaseinaktive Mutant raf-BxB-CX375W zeigte keine Wirkung auf MEKKl und wechselwirkte auch nicht mit der MEKKl vermittelten NF-κB Aktivierung, was zeigt, daß MEKKl in diesem pathway raf nachgeschaltet ist. In der Fig. 8c wurden schließlich die Effekte dominant negativer Varianten von MEKKl und NIK (jeweils 10 μg, 10 μg raf-BxB-CX, 3xκB.luc) getestet. Man erkennt, daß mit dnMEKKl eine Inhibierung der raf-induzierten κB-abhängigen Reporteraktivität erfolgt.The observation from these experiments that raf induces IKK activity in crude lysates, but does not affect the activities of the purified IKK proteins, indicates that raf is not directly bound to NF-κB, but that an intermediate is involved. In FIG. 8, results are presented with the intermediates i n candidate substances MEKKl and NIK. 8a shows results of a cotransfection of 3xκB.luc with either 5 μg or 2 μg MEKKl expression vector and decreasing amounts (10, 7, 5 μg) of raf-BxB-CX. The activity of the reporter in co-transfection with pcDNA3 was set to 1. It can be seen that raf synergistically increases MEKK1-mediated activity at all concentrations tested. However, there was no effect by raf found in co-transfections with various amounts of "NIK expression vector (data not shown). Fig. 8b shows that the synergy between raf and MEKKl even in the case of raf BXB CX, raf BXB DD and, interestingly, also of raf-BxB, which as such shows no NF-κB-inducing activity in T cells (FIG. 8b: 5 μg MEKKl and / or 10 μg each of the raf variants). The kinase-active mutant showed raf-BxB-CX375W no effect on MEKKl and did not interact with the MEKKl-mediated NF-κB activation, which shows that MEKKl is downstream in this pathway. Finally, the effects of dominant negative variants of MEKKl and NIK (10 μg, 10 μg raf-BxB-CX, 3xκB.luc) was tested and it can be seen that dnMEKKl inhibits the raf-induced κB-dependent reporter activity.
In der Figur 9 ist schließlich in schematischer Weise dargestellt, daß entsprechend der vorgestellten Untersuchungen zwei raf-induzierte pathways für die Zelltransformation existieren. Finally, FIG. 9 shows schematically that, according to the studies presented, there are two raf-induced pathways for cell transformation.

Claims

Patentansprüche :Claims:
1) Nukleinsaure codierend für zumindest eine raf Teilsequenz, wobei die Teilsequenz eine MEKKl Bmdungsstelle enthalt, oder codierend für zumindest eine eine Bmdungsstelle für raf enthaltende Teilsequenz von MEKKl, oder stille Mutation einer solchen Nukleinsaure oder mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybπdisier- ende Nukleinsaure.1) Nucleic acid coding for at least one raf partial sequence, the partial sequence containing an MEKKl binding site, or coding for at least one binding site for raf containing partial sequence of MEKKl, or silent mutation of such a nucleic acid or with such a nucleic acid or its silent mutation hybridizing end Nucleic acid.
2) cDNA nach Anspruch 1.2) cDNA according to claim 1.
3) Isolierter rekombmanter Vektor enthaltend eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 bis 2.3) Isolated recombinant vector containing a nucleic acid according to one of claims 1 to 2.
4) Antisense Nukleinsaure oder Ribozym bindend an eine Nukleinsaure, insbesondere RNA, nach Anspruch 1.4) Antisense nucleic acid or ribozyme binding to a nucleic acid, in particular RNA, according to claim 1.
5) Substanz mit einer Bmdungsstelle für ein durch eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 oder 2 codiertes Protein oder Peptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus5) Substance with an binding site for a protein or peptide encoded by a nucleic acid according to one of claims 1 or 2, selected from the group consisting of
a) deaktiviertes MEKKl, b) inaktive Proteine oder Peptide, c) Aptamere. 6) Substanz mit einer Bindungsstelle für diea) deactivated MEKKl, b) inactive proteins or peptides, c) aptamers. 6) Substance with a binding site for the
Bindungsstelle von MEKKl an eine durch eine Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 oder 2 codiertes Protein oder Peptid.Binding site of MEKKl to a protein or peptide encoded by a nucleic acid according to one of claims 1 or 2.
7) Substanz nach Anspruch 6 in Form einer kinase- inaktiven Variante von raf, insbesondere raf-BxB-CX (375W) .7) Substance according to claim 6 in the form of a kinase-inactive variant of raf, in particular raf-BxB-CX (375W).
8) Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 4 bis 7 zur Blockierung der Bindung von raf an MEKKl .8) Use of a substance according to one of claims 4 to 7 for blocking the binding of raf to MEKKl.
9) Verwendung einer Substanz nach einem der Ansprüche 4 bis 7 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Behandlung von Krebserkrankungen.9) Use of a substance according to one of claims 4 to 7 for the manufacture of a pharmaceutical preparation for the treatment of cancer.
10) Verwendung einer Nukleinsaure nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder eines hierdurch codierten Proteins oder Peptids oder einer für zumindest eine eine Bindungsstelle an raf enthaltende Teilsequenz von MEKKl Protein codierenden Nukleinsaure oder eines hierdurch codierten Proteins oder Peptids in einem screening Verfahren zur Ermittelung einer Substanz, welche die Bindung von raf an MEKKl blockiert. 11) Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers mit Tumorzellen, wobei dem Körper ein pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 9 verabreicht wird, oder wobei eine Substanz nach einem der Ansprüche 5 bis 7 mittels gentherapeutischer Methoden in den Tumorzellen zur Expression gebracht wird.10) Use of a nucleic acid according to one of claims 1 or 2 or a protein or peptide encoded thereby or a nucleic acid coding for at least one partial sequence of MEKKl protein containing a binding site to raf or a protein or peptide encoded thereby in a screening method for determining a substance , which blocks the binding of raf to MEKKl. 11) Method for treating a human or animal body with tumor cells, wherein the body is administered a pharmaceutical preparation according to claim 9, or wherein a substance according to one of claims 5 to 7 is expressed in the tumor cells by means of gene therapy methods.
12) Verwendung einer Nukleinsaure codierend für zumindest eine Teilsequenz von raf oder einer stillen Mutation einer solchen Nukleinsaure oder einer mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierenden Nukleinsaure in einem screening Verfahren zur Untersuchung der Wechselwirkung des von der Nukleinsaure codierten Proteins oder Peptids mit der der Aktivierung von NF-κB vorgeschalteten Signalisierungskaskade .12) Use of a nucleic acid coding for at least a partial sequence of raf or a silent mutation of such a nucleic acid or a nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or its silent mutation in a screening method for examining the interaction of the protein or peptide encoded by the nucleic acid with that Activation of NF-κB upstream signaling cascade.
13) Verwendung einer Nukleinsaure codierend für zumindest eine Teilsequenz von raf oder einer stillen Mutation einer solchen Nukleins ure oder einer mit einer solchen Nukleinsaure oder deren stillen Mutation hybridisierenden Nukleinsaure in einem screening Verfahren zur Ermittelung von Inhibitoren der Transformation von Zellen durch raf vermittelte Aktivierung von NF-κB.13) Use of a nucleic acid coding for at least a partial sequence of raf or a silent mutation of such a nucleic acid or a nucleic acid hybridizing with such a nucleic acid or its silent mutation in a screening method for the determination of inhibitors of the transformation of cells by raf-mediated activation of NF -κB.
14) Inhibitoren der raf induzierten Transformation von Zellen erhältlich durch ein screening Verfahren nach Anspruch 13. 14) Inhibitors of the raf-induced transformation of cells obtainable by a screening method according to claim 13.
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