WO2001057246A1 - VERWENDUNG EINER GENVERÄNDERUNG IM GEN FÜR DIE β3-UNTEREINHEIT DES HUMANEN G-PROTEINS - Google Patents

VERWENDUNG EINER GENVERÄNDERUNG IM GEN FÜR DIE β3-UNTEREINHEIT DES HUMANEN G-PROTEINS Download PDF

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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to new sequence variants of the human gene GNB3, which codes for the Gß3 subunit of human G proteins, and their use for predicting physiological and pathophysiological processes in the human body, in particular for diagnosing a wide spectrum of diseases, in particular for determining the disposition high blood pressure and obesity, the disposition to a variety of diseases that are associated with a malfunction of the immune system, the disposition to psychiatric diseases and
  • the human Gß3 subunit is an important component in signal transmission systems found in all human cells.
  • the sequence variants in GNB3 are associated with the accumulation of the G protein ß3 splice variants Gß3s and Gß3s2. These are responsible for increased signal transmission in cells that express Gß3s and Gß3s2.
  • Gß3 occurs in all cells examined so far, the increased signal transmission mediated by Gß3s and Gß3s2 leads to an increase in physiological and pathophysiological responses to a variety of non-hormonal and hormonal stimuli.
  • Gß3, Gß3s and Gß3s2 are interesting targets for pharmaceuticals and therapeutics with a wide range of indications.
  • Gß3, Gß3s and G ß3s2 play a role in the pathogenesis / pathophysiology of a number of common diseases such as hypertension, heart attack, coronary artery disease and other cardiovascular diseases, stroke, metabolic diseases such as obesity and diabetes play a role. They also play a role in other functional disorders such as erectile dysfunction.
  • the variants are particularly involved in changes in the immune regulation and are therefore suitable for predicting the disposition to or the course of a large number of immunological diseases in which an increased or reduced function of immune cells is important.
  • Such diseases include HIV infection, asthma, psoriasis, so-called atopic diseases such as atopic dermatitis, hepatitis B and hepatitis C, graft rejection, Crohn's disease, ulcerative colitis, and much more.
  • atopic diseases such as atopic dermatitis, hepatitis B and hepatitis C, graft rejection, Crohn's disease, ulcerative colitis, and much more.
  • these variants play a role in pre-eclampsia / gestosis, spontaneous abortion, the success of in-vitro fertilization, etc.
  • the aim of the invention is to determine variants, polymorphisms, mutations and resulting haplotypes in the DNA sequence of the human Gß3 gene (GNB3) and to determine their correlation with disease dispositions.
  • an individually optimal therapeutic agent can be predicted or developed for each GNB3 genotype.
  • Human heterotrimeric G proteins are composed of the subunits ⁇ , ⁇ and ⁇ .
  • a number of isoforms are in turn known which are encoded by different genes.
  • ⁇ -isoforms ⁇ l - ⁇ l3
  • ß-isoforms ßl-ß5
  • ⁇ s (short and long) ß-isoforms (ßl-ß5)
  • ⁇ s (short and long) ß-isoforms (s (short and long)
  • ⁇ s (s (short and long) ß-isoforms (ßl-ß5)
  • ⁇ s (s (short and long) ß-isoforms (s (short and long)
  • ⁇ o, ⁇ il-3 ⁇ q, ⁇ ll- 16, ⁇ olf etc.
  • function-changing mutations become particularly important and predictive. This is in contrast to mutations in other genes which code for other proteins, for example hormones or hormone receptors.
  • Pacheco MA Stockmeier C
  • Meltzer HY Overholser JC
  • Dilley GE Jope RS. Alterations in phosphoinositide signaling and G-protein levels in depressed suicide brain. Brain Res. 1996 Jun 3; 723 (1-2): 37-45.
  • lymphocytes In these diseases, the activity and activability of cells of the immune system (lymphocytes, granulocytes, etc.) is known to play an outstanding role in the course of the disease. The activation of these cells is in turn controlled by pertussis toxin-sensitive G protein.
  • Modified G proteins can cause malignant cells to degenerate. On the other hand, every cancer is characterized by the proliferation of tumor cells and metastasis, since proliferation and cell migration are G-protein-mediated processes. A modified G protein activation must therefore have an impact on the course of tumor diseases. Examples from the scientific literature are:
  • the therapy may also include the use of glucorocorticoids to suppress the immune response or leukotriene receptor antagonists to reduce leukocyte activation.
  • HCV hepatitis C virus
  • this therapy leads to the permanent elimination of the HCV and such patients are called "sustained responders".
  • a number of patients do not respond to this therapy or only at the beginning of the therapy, with a subsequent increase in the viral load.
  • Such patients are referred to as “non-responders” or as patients with "relaps”.
  • This example illustrates that gene changes in the GNB3 gene are particularly suitable for responding to certain ones To predict pharmaceuticals or a therapy success or therapy failure.
  • the structure of the GNB3 gene is shown in Figure 1. It consists of 11 exons, with the start codon ATG located in exon 3, while the stop codon is located in exon 11.
  • the cDNA encoding the Gß3 protein has been described previously (MA Levine, PM Smallwood, PT Moen, Jr., LJ Helman, and TG Ahn. Molecular cloning of beta 3 subunit, a third form of the G protein beta -subunit polypeptides Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 (6): 2329-2333, 1990).
  • GNB3 genomic sequence of GNB3 was published (MA Ansari-Lari, DM Muzny, J. Lu, F. Lu, CE Lilley, S. Spanos, T. Malley, and RA Gibbs. A gene- rial cluster between the CD4 and triosephosphate isomerase genes at human chromosome 12pl3. Genome Research 6: 314-326, 1996)
  • the invention then relates to the sequence of the human Gß3 gene which is mutated in whole or in part at positions 657, 814, 825 and 1429 of the cDNA or at positions (-350), 3882, 5177, 5249 and 6496 of the genomic sequence ,
  • Fig. 1 of the drawing shows the gene structure of GNB3 and new polymorphisms.
  • the exon-intron structure of GNB3 is shown.
  • the gene consists of 11 exons, polyrorphisms previously described are found in exon 10 (C825T) and exon 11 (C1429T).
  • the numbering corresponds to the cDNA sequence, with the start codon ATG in exon 3 being assigned position +1.
  • exon 9 and exon 10 are also shown which are alternatively spliced when the mutations are at positions 825 and 1429 of the cDNA or 3882, 5177, 5249 and / or 6496 of the DNA sequence.
  • the numbering of polymorphisms is shown in square brackets if position 1 is the transcription start point in exon 1.
  • the mutations are characterized in detail below.
  • the numbering refers to the transcription start point of GNB3 ( Figure 1).
  • This starting point corresponds to nucleotide 52221 that of Ansari-Lari et al. published sequence of a section of human chromosome 12 (MA Ansari-Lari, DM Muzny, J. Lu, F. Lu, CE Lilley, S. Spanos, T. Malley, and RA Gibbs.
  • the Polymorphism C825T corresponds, for example, to the genomic sequence C5500T.
  • Base exchange G5249A the sequence within intron 9
  • the invention further relates to a method for determining disease dispositions, wherein all sequences and variants of GNB3 from the individual mutation to all possible variants (including any absolute number of variants that can be included) can be genotyped and the corresponding statements about Allow disease disposition.
  • the method is characterized in that the DNA of a test subject is isolated and genotyped at least at one of the exchanged positions and subsequently compared with the reference DNA sequence.
  • Embodiments are preferred in which at least position 3882, position 5177, position 5249 or position 6496, at least the two positions 825 and 3882, 825 and 5177, 825 and 5249 or 825 and 6496, at least the three positions 825, 3882 and 5249, 825, 3882 and 6496, 825, 5249 and 6496, at least the four positions 825, 3882, 5249 and 1429, or 825, 3882, 5249 and 6496 or at least the five positions 825, 3882, 5249, 1429 and 6496 can be genotyped.
  • Genotyping is performed by sequencing or by other methods that are suitable for the detection of point mutations. These include PCR-supported genotyping methods such as allele-specific PCR, PCR reactions and restriction fragment length analysis, PCR reactions using the Taqman system or molecular beacons, genotyping methods under Use of oligonucleotides (examples here would be dot blotting and hybridization, single nucleotide primer extension analyzes, oligonucleotide ligation assays), methods using restriction enzymes and single nucleotide polymorphism (SNP) analysis using matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI) , as well as in principle any future method for variant detection including the gen-chip technology in all its technological versions.
  • PCR-supported genotyping methods such as allele-specific PCR, PCR reactions and restriction fragment length analysis, PCR reactions using the Taqman system or molecular beacons, genotyping methods under Use of oligonucleotides (exa
  • the method according to the invention is suitable for determining a wide spectrum of the most diverse disease dispositions ex vivo.
  • cardiovascular diseases including myocardial infarction, heart failure and stroke, and cardiac arrhythmias.
  • the development of terminal renal insufficiency (need for dialysis) or the risk of mortality during dialysis is also included.
  • the disposition for metabolic diseases such as obesity, obesity and type II diabetes mellitus, including a prediction of the weight range as such or a disposition for weight changes, is finally a prediction of the ratio of the Body mass as determined, as expressed, for example, in the Body Mass Index (BMI).
  • BMI Body Mass Index
  • the method is used to predict weight development after drastic personal events, such as after births in women or in convalescence after serious illnesses.
  • the method also serves to estimate the possible birth weight and the weight development after birth.
  • the procedure is used to predict premature birth, the weight development of premature babies, the risk of preeclampsia / gestosis, with or without HELLP syndrome, abortion, the success of in-vitro fertilization.
  • the diagnosis is provided for disposition to changed immune reactions. This includes predicting the response to vaccination, the course of infectious and autoimmune diseases, and rejection of transplanted organs. Infectious and immune diseases include HIV infection and progression to AIDS, caposis sarcoma, hepatitis C and B, allergic asthma and other atopic diseases such as Crohn's disease, ulcerative colitis, atopic dermatitis and psoriasis. Furthermore, diseases of the rheumatic type, e.g. rheumatoid arthritis.
  • the diagnosis is made with regard to the predisposition to the development of malignant tumors and their course, in particular the tendency to metastasis, the tendency to occur of tumor recurrence and tendency for tumor progression.
  • AI 3 such tumors should be mentioned in particular breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer, colon and rectal cancer, stomach, liver, gall and pancreatic cancer, small bowel cancer, malignant skin tumors, all forms of leukemia, all forms of lymphoma incl Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphomas, the caposis sarcoma, lung and larynx carcinoma, the bladder, prostate and renal cell carcinoma, the testicular carcinoma, all forms of brain tumors, e.g. glioblastoma, astrocytoma etc.
  • Oncogene 9 2559-2565, 1994.
  • somatic muations may be present in ⁇ -subunits of heterotrimeric G proteins (J. Lyons, CA Landis, G. Harsh, L. Vallar, K. Grünewald, H. Feichtinger, Q. -Y. Duh, 0. H. Clark, E. Kawasaki, H. Bourne, and F. McCormick.
  • heterotrimeric G proteins play a crucial role in the transformation to tumor cells, but also in that Migration and proliferation of tumor cells can be attributed.
  • Fig. 4 shows the outstanding role of mutations in the GNB3 gene for the progression of human tumors using the example of bladder cancer.
  • patients with bladder carcinoma were genotyped for the C825T polymorphism and the course of the disease was followed for 10 years. It can be seen that in 825T allele carriers and in the presence of a differentiated tumor (grading 1-2), metastasis occurs on average within 29 months, while metastases in homozygous C825 allele carriers only occur after 69 months on average.
  • the time from the initial diagnosis of the tumor to the onset of progression can be described in such a way that this event occurs particularly early in 825T allele carriers (FIG. 5).
  • mutations or polymorphisms in the GNB3 gene can be used to predict the responsiveness to tumor therapy. This applies to all chemotherapeutic agents which intervene in the broadest sense in the cell cycle and which inhibit the proliferation of rapidly proliferating cells in a relatively non-specific manner. It is known that cells from individuals carrying the 825T allele are increasingly observed in the mitotic phase of the cell cycle (Rosskopf D, Schröder KJ, Siffert W., Role of sodium-hydrogen exchange in the proliferation of immortalized lymphoblasts from patients with essential hypertension normotensive subjects. Cardiovasc Res. 1995 Feb; 29 (2): 254 -9).
  • newer tumor therapeutics for example antibodies, cGp nucleotides, and inhibitors of signal transduction in general, for example tyrosine kinase inhibitors, act differently in 825T allele carriers than in C825 allele carriers. This is due to the fact that an increased activatability of G proteins, as can be observed in 825T allele carriers, also has downstream signal transduction pathways (rapid MAP kinase path; PI3 kinase activation, activation of Protein kinases and phospholipases etc.) activated more.
  • MAP kinase path PI3 kinase activation, activation of Protein kinases and phospholipases etc.
  • the diagnosis is made with regard to the predisposition to intelligence, learning ability, emotional states, addiction and psychiatric disorders such as schizophrenia, depression etc.
  • a large number of processes that take place in the human brain are caused by hormones and so-called Neurotransmitters can be controlled.
  • drugs exist that inhibit the reuptake of serotonin and / or noradrenaline in the presynaptic nerve endings.
  • the resulting higher concentration of transmitter in the synaptic cleft then influences behavior and thinking (for example, the administration of sibutramine as an appetite suppressant, imipramine as an antidepressant).
  • G protein subunit Gß3 occurs in high concentration in the brain, it can be assumed that gene changes in the GNB3 gene have lasting effects on behavior, thinking, intelligence, emotional states, learning ability, processing of sensory perceptions (hearing, seeing, smelling, tasting, feeling pain); Cold, warmth). This also includes the tendency to psychiatric illnesses such as schizophrenia, depression etc. and the tendency to addiction (nicotine, alcohol, drug addiction), the tendency to exercise violence and much more.
  • Figure 6 shows that already healthy 825T allele carriers have a higher tendency to depressive mood, achieve a higher score with regard to self-aggression and a lower score for life satisfaction.
  • the method also allows the course and severity of diseases to be determined, as well as the prediction of survival in and after severe medical diseases, for example after myocardial infarction, heart failure, stroke and / or heart failure.
  • severe medical diseases for example after myocardial infarction, heart failure, stroke and / or heart failure.
  • polymorphisms further described here can be used for the diagnosis described.
  • the applicability of the first teaching according to the invention for pharmacogenetics i.e. the diagnosis of the effectiveness of pharmaceuticals, the potency and efficiency of pharmaceuticals and the occurrence of undesirable effects.
  • the effectiveness of drugs and / or the occurrence of undesirable side effects is defined in addition to the specific substance properties of the chemically defined products by a number of parameters. Two important parameters, the achievable plasma concentration and the plasma half-life largely determine the effectiveness or ineffectiveness of parameters or the occurrence of undesirable effects.
  • Plasma half-life is determined, among other things, by the rate at which certain pharmaceuticals are metabolized in the liver or other body organs to form effective or inactive metabolites and the rate at which they are excreted from the body, with excretion via the kidneys, via the air we breathe, through sweat can take place via the sperm fluid, the stool or other body secretions.
  • the effectiveness in the case of oral administration is limited by the so-called "first pass effect", since after absorption of pharmaceuticals via the intestine, a certain one Portion in the liver is metabolized to inactive metabolites.
  • Mutations or polymorphisms in genes of metabolizing enzymes can change their activity by changing their amino acid composition, which increases or decreases the affinity for the metabolizing substrate and thus the metabolism can be accelerated or slowed down.
  • mutations or polymorphisms in transport proteins can change the amino acid composition in such a way that the transport and thus the excretion from the body is accelerated or slowed down.
  • the optimal dosage To select the most suitable substance for a patient, the optimal dosage, the optimal dosage form and to avoid undesired, sometimes Knowledge of genetic polymorphisms or mutations that lead to changes in gene products is of outstanding importance for health-endangering or fatal side effects.
  • the receptors can be divided into specific groups, depending on the activability by defined hormones. Those skilled in the art are aware that mutations or polymorphisms in certain receptors can determine the effectiveness of certain agonists or antagonists at these receptors.
  • a common Glyl6Arg polymorphism in the gene encoding the ß2 adrenoceptor affects the level of responsiveness to the ß2 sympathomimetic salbutamol (Martinez FD, et al. Association between genetic polymorphisms of the ß2- adrenoceptor and response to albuterol in children with and without a history of wheezing. J Clin Invest. 1997 Dec 15; 100 (12): 3184-8).
  • Polymorphisms in the D2 receptor gene determine the frequency of the occurrence of dyskinesia in the treatment of Parkinson's disease (Parkinson's disease) with Levadopa (Oliveri RL, et al.; Dopamine D2 receptor gene polymorphism and the risk of levodopa- induced dyskinesias in PD. Neurology. 1999 Oct 22; 53 (7): 1425-30): Polymorphisms in the ⁇ -opiate receptor gene determine the analgesic effectiveness of opiates (Uhl GR, et al. The ⁇ opiate receptor as a candidate gene for pain: polymorphisms, variations in expression, nociception, and opiate responses. Proc Natl Acad Sei US A. 1999 Jul 6; 96 (14): 7752-5).
  • angiotensin II stimulates an increased absorption of sodium in the kidney, stimulates salt absorption, increases blood pressure through a direct vasoconstrictive effect on smooth vascular muscle cells and induces proliferation processes. It is well known that these mechanisms caused by angiotensin II follow The hormone is coupled to receptors, which act by activating heterotrimeric G proteins. The efficiency of these effects can be predicted if the strength of the activability of G proteins can be diagnosed. Other drugs exert their effect by inhibiting the reuptake of transmitters released from neurons, for example noradrenaline, adrenaline, serotonin or dopamine.
  • sibutramine which inhibits the reuptake of serotonin and norepinephrine in the central nervous system, thereby reducing the feeling of hunger and increasing thermogenesis. Accordingly, sibutramine can be used to treat obesity. Since norepinephrine and sibutramine activate G protein-coupled receptors, the diagnosis of the activability of G proteins is particularly suitable for predicting the effectiveness of sibutramine and the occurrence of typical sibutramine-associated side effects (eg increase in heart rate and blood pressure).
  • the first teaching of the invention makes it possible to predict which specific medications will work in defined disease situations.
  • the invention is based on the fact that a method has been developed which is generally suitable for the diagnosis of the activatability of G proteins.
  • one or more polymorphisms in the GNB3 gene are investigated, which codes for the human Gß3 subunit of heterotrimeric G proteins.
  • Polymorphisms which diagnose the occurrence or non-occurrence of an alternative are particularly suitable for this purpose Predict the splicing process of the gene, whereby a new splicing variant of the gene and protein with a maximum of 6 WD repeat domains is created or its formation is suppressed.
  • this splicing variant occurs, there is a predictable increase in the activatability of heterotrimeric G proteins and the increased activatability of all cells of the human body.
  • a determination of the presence of polymorphisms in GNB3 thus enables the diagnosis of the effectiveness and undesirable effects of drugs, in particular agonists and antagonists of all receptors, the effects of which are mediated by heterotrimeric G proteins.
  • polymorphisms in GNB3 can be used to diagnose the effects of drugs that either indirectly or as a result of body counter-regulation mechanisms increase or decrease the concentrations of endogenous hormones whose receptors activate heterotrimeric G proteins.
  • the invention allows the diagnosis of effects and undesirable effects of all pharmaceuticals and is not limited to pharmaceuticals which influence specific receptors in an agonistic or antagonistic manner.
  • the detection of the polymorphisms C825T, C1429T, A657T and G814A is used in each case alone or in any combination as a haplotype analysis (numbering according to the cDNA, the position +1 being assigned to the start codon ATG).
  • GNB3 all other gene changes in GNB3 can be used for diagnosis, which in one Coupling unbalanced to C825T or C1429T and / or promote or inhibit the alternative splicing process. This applies in particular to genetic polymorphisms in intron 9 of GNB3, e.g. B. A3882C, G5177A, G5249A and the CACA insert in intron 10 (Fig. 1).
  • genes changes can be detected by any method known to those skilled in the art, e.g. direct sequencing, restriction analysis, reverse hybridization, dot blot or slot blot method, mass spectrometry, etc.
  • these gene polymorphisms can be detected simultaneously after multiplex PCR and hybridization to a DNA chip.
  • other methods can be used to diagnose an increased activatability of G proteins, which serve the direct detection of the formation and expression of isoforms of the Gß3 subunit, which represent splice variants.
  • Performing the analysis for pharmacogenetic studies includes predicting response to therapy e.g. with antihypertensives (including ACE drugs, ATI receptor blockers, ⁇ -blockers, ⁇ -receptor blockers, Ca antagonists, vasodilators), medications for the treatment of heart failure, medications for the treatment of cardiac arrhythmias, asthma, depression, schizophrenia, Alzheimer's disease, the use of vaccines, the treatment of erectile dysfunction.
  • antihypertensives including ACE drugs, ATI receptor blockers, ⁇ -blockers, ⁇ -receptor blockers, Ca antagonists, vasodilators
  • the method mentioned is particularly suitable for diagnosing the action of agonists or antagonists on receptors, the effects of which are known to Proteins are mediated.
  • the applicability of this method has already been demonstrated for the ⁇ 2-adrenergic receptor, the fMLP receptor and the interleukin-8 receptor (see PCT / EP99 / 06534) and published (Baumgart D, et al. G protein ß3 subunit 825T allele and enhanced coronary vasoconstriction on ⁇ 2-adrenoceptor activation. Circ Res.
  • Adrenergic receptors especially ⁇ and ⁇ adrenoceptors and their isoforms and subgroups, i.e. ⁇ l and ⁇ 2 adrenoceptors as well as ßl, ß2, ß3 and ß4 adrenoceptors
  • Muscarinic receptors and their isoforms e.g. ml, m2, m3 and m4 muscarinic receptors and their subtypes.
  • Typical antagonists on muscarinic receptors are, for example, atropine, scopolamine, ipratroprium, pirenzepin and N-butylscopolamine.
  • Typical agonists are carbachol, bethanechol, pilocarpine etc.
  • Dopamine receptors eg D1, D2, D3, D4, and D5 receptors and their isoforms and splice variants
  • Serotonin receptors eg 5-HT1, 5-HT2, 5-HT3 and 5-HT4 receptors and their subtypes.
  • Typical agonists are sumatriptan and cisapride, antagonists are for example ondansetron, methysergide, buspirone and urapidil.
  • Bradykinin receptors e.g. Bl and B2 receptors
  • Angiotensin receptors e.g. AT II type and type 2 receptor
  • typical antagonists on the AT II receptor are losartan and other sartans.
  • Receptors for endorphins and opiates e.g. the ⁇ -opiate receptor
  • Chemokine receptors CCR1-12 and CXCR1-8 for e.g. Interleukin-1/2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12, RANTES, MlP-l ⁇ , MlP-lß, stromal cell-derived factor, MCP1-5, TARC, lympnotactin, Fractalkine, Eotaxin 1-2, NAP-2, LIX etc.
  • Receptors for lysophosphatidic acid, phosphatidic acid, receptors for sphingosine phosphates and their derivatives Receptors for prostaglandins and thromboxanes, e.g. B. for PGE1, PGE2, PGF, PGD2, PGI2, PGF2 ⁇ , thromboxane A2, etc.
  • Receptors for neuropeptides e.g. NPY1-5
  • Histamine receptors e.g. Hl-H3 receptors
  • Receptors for insulin, glucagon, insulin-like growth factor (IGF-1 and IGF-2), epidermal growth factor (EGF) and platelet-derived growth factor (PDGF) Receptors for insulin, glucagon, insulin-like growth factor (IGF-1 and IGF-2), epidermal growth factor (EGF) and platelet-derived growth factor (PDGF)
  • GH growth hormone
  • SSTR1-5 somatostatin
  • TSH thyreotropic hormone
  • oxytocin prolactin
  • the effects of pharmaceuticals which influence the reuptake, breakdown or re-synthesis of neurotransmitters or in which changes in expression during therapy can also be diagnosed or responsiveness of the abovementioned receptors occur (for example Sib ⁇ tra in, fluoxetine).
  • the effects of all pharmaceuticals can be diagnosed, which directly or indirectly change the concentrations of agonists that activate the above-mentioned receptors as a result of a physiological counter-reaction.
  • Antihypertensives e.g. ß-blocker (propanolol, bisoprolol, etc.), diuretics (hydrochlorothiazide and other thiazide diuretics; furosemide, piretanide and other loop diuretics, chlorthalidone, spironolactone), ⁇ l adrenoceptor blockers (e.g. doxazosin, prazosinine, e.g. losartanine), angiotanin)
  • ACE inhibitors enalapril, captopril, ramipril etc.
  • Ca 2+ channel blockers e.g. nifedipine, verapamil, amlodipine, felodipine
  • clonidine e.g. clonidine, reserpine
  • ⁇ -blockers e.g. propanolol, metoprolol
  • ACE inhibitors e.g. captopril, enalapril, ramipril, etc.
  • angiotensin receptor blockers e.g. losartan
  • Morphine-type analgesics (morphine, codeine, etc.)
  • adenosine e.g. propanolol, acebutolol
  • nitrate esters e.g. molsidomine
  • platelet aggregation inhibitors e.g. adenosine, ⁇ -blockers (e.g. propanolol, acebutolol), nitrate esters and other NO donors (e.g. molsidomine), platelet aggregation inhibitors
  • psychiatric disorders such as alcoholism, schizophrenia, manic-depressive disorders, psychoses, depression (e.g. fluoxetine, paoxetine, imipramine, desipramine, doxepin, Mianserin, trazodone, lofepramine), anxiety syndromes (diazepam, etc.), which e.g. affect the dopaminergic, serotonergic or adrenergic system
  • compositions for the treatment of Alzheimer's disease e.g. tacrine
  • Parkinson's disease e.g. bromocriptine, L-DOPA, carbidopa, biperiden, selegiline, etc.
  • transmitter concentrations at e.g. muscarinic or dopaminergic substances e.g. muscarinic or dopaminergic substances.
  • bronchial asthma which, for example, either have a direct bronchodilating or anti-inflammatory effect, for example salbutamol, terbutaline, albuterol, theophylline, montelukast, zafirlukast, cromoglicinic acid, ipratropium bromide
  • gastric or intestinal motility disorders e.g. N-butylscopolamine, pirenzepin, metoclopramide
  • compositions for the treatment of obesity which either directly activate lipolytically active receptors, e.g. ⁇ 3 -adrenergic agonists, or are centrally active, e.g. Sibutramine, or similar substances
  • Interferons for the treatment of viral hepatitis or interleukin-2 for HIV infection
  • antidiabetic drugs acarbose, insulin, troglitazone, metformin, etc.
  • erectile dysfunction for example the C825T polymorphism
  • gene changes in the GNB3 gene can be used to predict a subject's responsiveness to oligonucleotides with CpG motifs.
  • Such nucleotides can be administered to activate a patient's immune system (Krieg AM. Immune effects and mechanisms of action of CpG motifs. Vaccine. 2000 Nov 8; 19 (6): 618-622.)
  • tumor diseases but also immunological ones Diseases such as asthma are treated.
  • subjects with gene changes in the GNB3 gene generally have an increased activability of immune cells due to genetic factors (e.g. S. Virchow, N.
  • G protein ß3 subunit splice variant Gß3-s causes enhanced chemotaxis of human neutrophils in response to interleukin-8. Naunyn-Schmiedeberg 1 s Arch. Pharmacol. 360: 27-32, 1999), they also respond with an increased immune response to such immune stimulation with CpG oligonucleotides.
  • the generally increased cellular activatability which is present in patients with the gene changes mentioned, also leads to the target cells of these patients (eg tumor cells) reacting more strongly to activated immune cells and their released products. It is therefore possible to predict the response of such patients to therapy with oligonucleotides that receive a CpG motif by determining the presence of gene changes in the GNB3 gene.
  • the invention relates to the use of a gene modification in the human G-protein subunit Gß3 (gene: GNB3) for Finding new disease genes and for discovering and developing new targets for drugs (drug targets) people who have one of the polymorphisms mentioned in GNB3, e.g. A (-350) G, C825T, A3882C, G5177A, G5249A, C1429T or the CACA insert in intron 10 (FIG. 1) or further gene changes in GNB3 or combinations of the alleles (haplotypes) mentioned are characterized in that in their body cells there is a predictably increased or decreased signal transduction via heterotrimeric G proteins by gene analysis (S. Virchow, N. Ansorge, D.
  • the gene status can be demonstrated by means of suitable methods known to the person skilled in the art.
  • the predisposition for certain diseases, in which an increased or decreased G protein activation is important, can take place via different mechanisms.
  • Such splice variants with a maximum of 6 WD repeats occur as functional proteins in human cells and can be expressed in a variety of expression systems using suitable vectors, for example in HEK-TS cells.
  • G-protein ß ⁇ subunits can interact biochemically with a variety of cellular effector systems, e.g.
  • HEK cells are transfected with a hemagglutin-labeled MAP kinase construct (HA-erk), the hemagglutin being used for the specific precipitation of the construct by specific antibodies.
  • HA-erk hemagglutin-labeled MAP kinase construct
  • the Gß3s splice variant has an increased activation of the MAP kinase compared to the wild type (Gß3).
  • the cells of the expression system are additionally transfected with vectors which code for Gß3-sl or Gß3.
  • the activation of the MAP kinase is quantified after immunoprecipitation using standard biochemical methods known to those skilled in the art.
  • Transfection systems bacteria, yeast or mammalian cells
  • a large number of different vectors are used, which are familiar to the person skilled in the art.
  • yeast two-hybrid system known to the person skilled in the art or similar systems can be used to identify new interaction partners.
  • suitable drug targets are identified by examining the interaction of Gß3s and Gß3s2 with known biochemical interaction partners and / or reaction pathways.
  • G-protein - ß-subunits also control the translocation of other effectors into the cell nucleus, which can then control transcription there (Metjian A, Roll RL, Ma AD, Abrams CS: Agonists cause nuclear translocation of phosphatidylinositol 3-kinase gamma.
  • FIG. 3 of the drawing shows a strategy for finding new drug targets based on the genotyping at the GNB3 locus.
  • the procedure that can be used to develop new drugs against HIV is shown as an example.
  • cells from 825T allele carriers and 825C allele carriers are inoculated with HI virus and the virus replication is carried out quantified. Reduced virus replication is found in 825T allele carriers.
  • the total mRNA is extracted from the infected cells of 825T and 825C allele carriers and rewritten into cDNA. This is followed by a comparative quantitative and qualitative analysis of gene expression. Since the genes 3, 4 and 5 are expressed equally, their gene products are eliminated as drug targets. In contrast, the differently expressed genes 1 and 2 are potential drug targets. Their gene products are identified and these can then be used for drug screening.
  • T lymphocytes for example CD 4+ positive T lymphocytes, or macrophages isolated from homozygous 825C or 825T allele carriers and cultured.
  • HI virus T or M tropic viruses
  • suitable laboratory strains After this infection there is an increase in such viruses, which can be quantified using methods known to those skilled in the art, for example by quantitative detection of the virus genome using RT-PCR, Northern blot analysis or detection of p24 antigen. This shows that a reduced reproduction of HI virus in cells of homozygous 825T allele carriers can be observed in vitro.
  • the fat cells of 825T allele carriers show an increased tendency towards fat accumulation and a reduced lipolysis, and their preadipocytes show an increased tendency towards proliferation and terminal differentiation.
  • pradaipocytes or adipocytes are introduced into the cell culture after genotyping the corresponding test subjects using standard methods to form an expression system.
  • the terminal differentiation to adipocytes or an inhibition of lipolysis can be brought about by adding insulin to the culture medium.
  • the quantitatively different or differential expression of genes can, for example, after reverse transcription of the mRNA to cDNA by means of quantitative PCR methods, Northern blot methods, differential display, hybridization on DNA chips or Similar, suitable techniques known to those skilled in the art are examined.
  • the use according to the invention of genotyping at the GNB3 locus and use and detection of the variants and haplotypes described therefore represent a new method for identifying the proteins, genes and their gene products which are additionally responsible for the development of all of the diseases mentioned, and suitable pharmaceuticals for their therapy to develop.
  • the methods described under a) and b) for determining the availability of interaction partners or genes which are influenced in their transcription can be transferred from the gene for the ⁇ 3 subunit of the human G protein to other genes.
  • the invention further relates to the following teachings:

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Genveränderung im Gen für die β3-Untereinheit des humanen G-Proteins, wobei im Exon 9 an Position 657 in Anlage 1 eine Substitution von Adenin durch Thymin vorliegt und/oder wobei im Exon 10 an Position 814 in Anlage 1 eine Substitution von Guanin durch Adenin vorliegt und/oder wobei im Promotorbereich an Position (-350) in Anlage 1 eine Substitution von Adenin durch Guanin vorliegt und/oder wobei im Intron 9 an Position 3882 in Anlage 1 eine Substitution von Adenin durch Cytosin vorliegt und/oder wobei im Intron 9 an Position 5177 in Anlage 1 eine Substitution von Guanin durch Adenin vorliegt und/oder wobei im Intron 9 an Position 5249 in Anlage 1 eine Substitution von Guanin durch Adenin vorliegt und/oder wobei im Intron 10 an Position 6496 in Anlage 1 ein Insert bestehend aus den Nukleotiden Cytosin-Adenin-Cytosin-Adenin vorliegt, zur Vorhersage physiologischer und pathophysiologischer Abläufe im menschlichen Körper.

Description

Verwendung einer Genveränderung im Gen für die ß3- Untereinheit des humanen G-Proteins
Die Erfindung betrifft neue Sequenzvarianten des menschlichen Gens GNB3 , das für die Gß3 -Untereinheit menschlicher G-Proteine kodiert, und ihrer Verwendung zur Vorhersage physiologischer und pathophysiologischer Abläufe im menschlichen Körper, insbesondere zur Diagnose eines weiten Spektrums von Erkrankungen, insbesondere zur Feststellung der Disposition zu hohem Blutdruck und des Übergewichtes, der Disposition zu einer Vielzahl von Erkrankungen, die mit einer Fehlsteuerung des Immunsystems einhergehen, der Disposition zu psychiatrischen Erkrankungen sowie zur
Therapeutikaentwicklung und gezieltem Einsatz bekannter und noch zu entwickelnder Pharmaka auf der Basis pharmakogenetischer Prinzipien.
Die menschliche Gß3 Untereinheit ist eine wichtige Komponente in Signalübertragungssystemen, die in allen Zellen des Menschen vorkommen. Die Sequenzvarianten in GNB3 sind mit dem gehäuften Vorkommen der G Protein ß3 Spleißvarianten Gß3s und Gß3s2 assoziiert. Diese sind verantwortlich für eine gesteigerte Signalübertragung in Zellen, die Gß3s und Gß3s2 exprimieren.
Da Gß3 in allen bislang untersuchten Zellen vorkommt, führt die gesteigerte Signalübertragung vermittelt durch Gß3s und Gß3s2 zu einer Steigerung der physiologischen und pathophysiologischen Antworten auf eine Vielzahl von nicht-hormoneilen und hormoneilen Reizen.
Diese Funktionsänderung macht sich in einem weiten Spektrum zentralnervöser und peripherer Funktionen bemerkbar, so im Herz-Kreislaufsystem, bei metabolischen Funktionen, zentralnervösen Funktionen und der Neurosekretion. So sind Gß3 , Gß3s und Gß3s2 interessante Angriffspunkte für Pharmaka und Therapeutika mit einem breiten Indikationsschwerpunkt .
Vielfältige Befunde weisen darauf hin, daß Gß3 , Gß3s und G ß3s2 eine Rolle in der Pathogenese / Pathophysiologie einer Reihe häufiger Erkrankungen, wie z.B. der Hypertonie, Herzinfarkt, koronare Herzkrankheit und anderen Herzkreislauf Erkrankungen, dem Schlaganfall, metabolischen Erkrankungen wie der Fettsucht und dem Diabetes eine Rolle spielen. Ferner spielen sie eine Rolle bei weiteren Funktionsstörungen wie z.B. der erektilen Dysfunktion. Die Varianten sind insbesondere bei Änderungen der Immunregulation beteiligt und eignen sich daher zur Vorhersage der Disposition zu oder des Verlaufs einer Vielzahl von immunologischen Erkrankungen, bei denen eine gesteigerte oder reduzierte Funktion von Immunzellen bedeutsam ist. Zu solchen Erkrankungen gehören u.a. die HIV-Infektion, Asthma, Psoriasis, sog. atopische Erkrankungen wie die atopische Dermatitis, Hepatitis B und Hepatitis C, Transplantatabstossung, Morbus Crohn, Colitis Ulcerosa, u.v. . Daneben spielen diese Varianten eine Rolle bei der Präeklampsie/Gestose, dem Spontanabort, dem Erfolg einer in-vitro- Fertilisation, etc. Die Erfindung hat das Ziel, Varianten, Polymorphismen, Mutationen und resultierende Haplotypen in der DNA- Sequenz des menschlichen Gß3 Gens ( GNB3) zu ermitteln und deren Korrelation mit Krankheitsdispositionen festzustellen. Ausgehend von dieser Korrelation soll ein Verfahren zur Diagnose dieser Krankheitsdispositionen, zur Prädiktion von Schweregrad, Verlauf und Überlebenszeit, ein System zur Prädiktion der individuellen Ansprechbarkeit auf verschiedene Pharmakaklassen und ein System zur Entwicklung einer neuen Klasse von Gß3 bzw. Gß3s und Gß3s2 wirksamen Therapeutika, sowie die Entwicklung von Testsystemen zur Erforschung pathophysiologischer Zusammenhänge und Entwicklung obg . Therapeutika entwickelt werden. Zusammenfassend kann für jeden GNB3 Genotyp ein individuell optimales Therapeutikum vorhergesagt oder entwickelt werden.
Zur Bedeutung einer geänderten Aktivierung von G- Proteinen bei unterschiedlichen Erkrankungen
Menschliche heterotrimere G-Proteine sind aus den Untereinheiten α, ß und γ zusammengesetzt. Hiervon sind wiederum eine Reihe von Isoformen bekannt, die durch unterschiedliche Gene kodiert werden. Beispielweise gibt es 13 unterschiedliche γ-Isoformen (γl - γl3) , mindestens 5 unterschiedliche ß-Isoformen (ßl-ß5) und eine Vielzahl unterschiedlicher α-Isoformen (αs (short and long) , αo, αil-3, αq, αll-16, αolf etc.) Da G-Proteine bekannverweise eine zentrale Rolle bei der Steuerung der Funktion aller menschlichen Zellen einnehmen, unabhängig davon, welche Zellrezeptoren aktiviert werden, so ist unmittelbar zu erwarten, daß der Verlauf vielfältiger und ganz unterschiedlicher Erkrankungen bei einer genetisch determinierten, verstärkten Aktivierbarkeit von G-Proteinen beeinflußt wird. Gerade bei den vielfältigen Funktionen von G- Proteinen erlangen funktionsverändernde Mutationen eine ganz besonders herausragende Bedeutung und Vorhersagekraft. Diese steht im Gegensatz zu Mutationen in anderen Genen, welche für andere Proteine, z.B. Hormone oder Hormonrezeptoren kodieren.
Zur Veranschaulichung dieser Aussage sollen zwei Beispiele dienen:
Findet man eine funktionsverändernde Mutation in Opioidrezeptoren, so wird der Fachmann zunächst an eine verminderte oder verstärkte Wirkung von exogen zugeführten Opiaten oder eine verstärkte oder verminderte Opioidabhängigkeit denken. Weiterhin könnten Verhalten, Schmerz etc. moduliert werden. Keinesfalls würde der Fachmann unmittelbar daran denken, daß Mutationen in Opioidrezeptoren den Verlauf der HIV-Infektion oder die Tumorprogression nachhaltig beeinflussen.
Findet man eine Mutation im Sehfarbstoff Rhodopsin oder beispielsweise im G-Protein - Golf, welches nur im Riechorgan des Menschen exprimiert wird, so ist wegen der extremen Einschränkung der Expression der Genprodukte in Auge bzw. Nase nur eine Auswirkung auf das Sehen bzw. das Riechen zu erwarten, jedoch kein Zusammenhang mit Herz- Kreislauferkrankungen.
Dies bedeutet demnach, daß im Gegensatz zu den genannten Beispielen, durch Genveränderungen in Proteinen - wie den G-Proteinen -, die in allen menschlichen Körperzellen exprimiert werden und dort an zentraler Stelle Zellfunktionen regulieren, alle physiologischen und pathophysiologischen Vorgänge entscheidend beeinflusst oder zumindest moduliert werden.
Es wurde in der wissenschaftlichen Literatur wiederholt postuliert, dass Funktionsveränderungen von G-Proteinen einen nachhaltigen Einfluß auf vielfältige Erkrankungen bzw. auf den Verlauf vielfältiger Erkrankungen haben. Solche Genveränderungen können strukturverändernde Mutationen in G-Protein-Untereinheiten sein, die beispielsweise die Aktivierbarkeit durch einen Rezeptor verändern oder die Dimerisierung von ßγ-Untereinheiten beeinflussen. Daneben könnten solche Veränderungen die Zusammensetzung heterotrimerer G-Proteine verändern. Ferner könnte das Expressionsniveau solcher G- Proteinuntereinheiten verändert sein. Auch hierzu sollen einige Beispiele gegeben werden:
Bedeutung von geänderter G-Proteinaktivierung bei psychiatrischen Erkrankungen wie Depression, Angst, Schizophrenie
Seit vielen Jahren ist bekannt, dass bei solchen Erkrankungen eine geänderte intrazelluläre Signaltransduktion vorliegt, deren Ursache eine geänderte G-Proteinfunktion sein könnte. Ferner gibt es Belege dafür, dass der Therapieerfolg einer beispielsweise antidepressiven Therapie zur veränderten G- Proteinfunktion führt. Hierzu können vielfältige Publikationen aus der Literatur angeführt werden, z.B.:
Odagaki Y, Koyama T, Yamashita I. Platelet pertussis toxin-sensitive G proteins in affective disorders. J Affect Disord. 1994 Jul ; 31 (3) : 173-7.
Garcia-Sevilla JA, Walzer C, Busquets X, Escriba PV, Balant L, Guimon J. Density of guanine nucleotide-binding proteins in platelets of patients with major depression: increased abundance of the Gαi2 subunit and down- regulation by antidepressant drug treat ent . Biol Psychiatry. 1997 Oct 15 ; 42 (8) : 704-12.
Pacheco MA, Stockmeier C, Meltzer HY, Overholser JC, Dilley GE, Jope RS . Alterations in phosphoinositide signaling and G-protein levels in depressed suicide brain. Brain Res . 1996 Jun 3 ; 723 (1-2) : 37-45.
Diese ausgewählten Beispiele belegen bereits, daß bereits seit vielen Jahren ein Zusammenhang zwischen G- Proteinaktivität und affektiven Erkrankungen bekannt war. Allerdings fokussierten sich diese Untersuchungen aussschließlich auf Untersuchungen zu möglichen Genveränderungen in α-Untereinheiten bzw. auf Änderungen der Expression solcher G-Protein α-Untereinheiten. Ein Zusammenhang zwischen diesen Erkrankungen und einer veränderten Funktion von ß- oder γ-Untereinheiten wurde nicht vermutet .
Bedeutung von geänderter G-Proteinaktivierung bei entzündlichen Erkrankungen, Infektionskrankheiten, Autoimmuner rankungen (Rheuma, Asthma, Psoriasis, HIV, Hepatitis etc.)
Bei diesen Erkrankungen spielt bekanntermaßen die Aktivität und Aktivierbarkeit von Zellen des Immunsystems (Lymphozyten, Granulozyten etc) eine herausragende Rolle für den Krankheitsverlauf. Die Aktiverung dieser Zellen wird wiederum durch Pertussistoxin-sensitive G-Protein gesteuert .
Beispiele aus der wiss. Literatur dazu sind:
Thomazzi SM, Souza MH, Melo-Filho AA, Hewlett EL, Lima AA, Ribeiro RA. Pertussis toxin from Bordetella pertussis blocks neutrophil migration and neutrophil-dependent edema in response to inflammation. Braz J Med Biol Ren . 1995 Jan;28 (1) : 120-4.
Stanley JB, Gorczynski RM, Delovitch TL, Mills GB . IL-2 secretion is pertussis toxin sensitive in a T lymphocyte hybridoma. J Immunol . 1989 May 15; 142 (10) : 3546-52.
Bacon KB, Camp RD . Interleukin (IL) -8-induced in vitro human lymphocyte migration is inhibited by cholera and pertussis toxins and inhibitors of protein kinase C. Biochem Biophys Res Commun. 1990 Jun 29; 169 (3 ): 1099-104. I. H. Chowdhury, Y. Koyanagi, O. Hazeki, M. Ui, and N. Yamamoto. Pertussis toxin inhibits induction of human immunodeficiency virus type 1 in infected monocytes. Virology 203 (2):378-383, 1994.
Wenn also genetisch bedingt eine gesteigerte Aktivierbarkeit von G-Proteinen vorliegt, so ist zu erwarten, dass die Aktivierung von Leukozyten, deren Proliferation und Migration, die Freisetzung von Entzündungsmediatoren etc. ebenfalls gesteigert sind. Damit ergibt sich für eine betroffene Person eine grundsätzlich höhere Bereitschaft, an Erkrankungen mit geänderter Immunfunktion zu erkranken, bzw. einen anderen Krankheitsverlauf aufzuweisen.
Neu ist in der vorliegenden Anmeldung allerdings, dass im Gegensatz zur allgemeinen Erwartung entscheidende Genveränderungen im Gen GNB3 beschrieben werden, denen die genannten Auswirkungen zuzuschreiben sind und das für die ß3 -Untereinheit heterotrimerer G-Proteine kodiert.
Tu ore / Krebs
Veränderte G-Proteine können einerseits Zellen maligne entarten lassen. Andererseits ist jede Krebserkrankung durch Proliferation von Tumorzellen und Metastasierung gekennzeichnet, da Proliferation und Zellmigration G- Protein-vermittelte Prozesse sind. Somit muß eine veränderte G-Proteinaktivierung Auswirkungen auf den Verlauf von Tumorerkrankungen haben. Beispiele aus der wiss. Literatur dazu sind:
J. Lyons, C. A. Landis, G. Harsh, L. Vallar, K. Grünewald, H. Feichtinger, Q.-Y. Duh, 0. H. Clark, E. Kawasaki, H. Bourne, and F. McCormick. Two G protein oncogenes in human endocrine tumors. Science 249:655-659, 1990.
L. S. Weinstein and A. Shenker. G protein mutations in human disease. Clin . Biochem . 26:333-338, 1993.
Vallar L. Oncogenic role of heterotrimeric G proteins. Cancer Surv. 1996;27:325-38. Review.
Pace AM, Wong YH, Bourne HR. A mutant α subunit of Gi2 induces neoplastic transformation of Rat-1 cells . Proc Natl Acad Sei U S A. 1991 Aug 15 ; 88 (16) : 7031-5.
Bislang wurden in der wissenschaftlichen Fachliteratur ausschließlich α-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine daraufhin untersucht, ob Mutationen kausal oder modulierenden zu Krebserkrankungen beitragen. In keiner bekannten Publikation wurde postuliert, dass solche kausal wirksamen oder den Krankheitsverlauf beeinflussenden Genveränderungen auch in ß-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine vorliegen könnten.
Ferner gibt es in der wissenschaftlichen Literatur Hinweise dazu, dass die Bedeutung von G-Proteinen für Krankheitentstehung und Krankheitsverlauf allgemein postuliert wurden. Weinstein and Shenker schreiben in einer Übersichtsarbeit bereits im Jahr 1993 (S. Weinstein and A. Shenker. G protein mutations in human disease. Clin . Biochem . 26:333-338, 1993.): "Die heterotrimeren G- Proteine sind an Zeiloberflächenrezeptoren, die extrazelluläre Signale an intrazelluläre Effektoren vermitteln, die sekundäre Botenstoffe erzeugen, gekoppelt. Eine gestörte G-Protein Signalweiterleitung, die durch posttranslationale Modifikation durch Bakterientoxine, einer veränderten Genexpression oder von Genmutationen hervorgerufen wird, führt zu diversen biologischen Konsequenzen. Mutationen innerhalb eines Gens, das für eine G-Protein Untereinheit kodiert, die entweder zu einer konstitutiven Aktivierung oder einem Verlust der Funktion führen, wurden identifiziert. Solche G-Proteinmutationen spielen in der Pathogenese von verschiedenen humanen Krankheiten eine Rolle, einschließlich bei einigen endokrinen Tumoren, bei dem McCune/Albright Syndrom und der vererbten Osteodystropie (Albright Syndrom) . "
Dieser genannte Übersichtsartikel bezieht sich damit wiederum nur auf gefundene somatische Mutationen in α- Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine.
Spiegel AM schreibt 1997 (Inborn errors of signal transduction: mutations in G proteins and G protein- coupled receptors as a cause of disease. J Inherit Metab Dis 1997 Jun;20 (2) .113-21) : "Ein breites Spektrum von Neurotransmittern, Polypeptidhormonen und anderen Molekülen verwenden G-Protein gekoppelte Wege zur transmembranären Signaltransduktion. In den letzten Jahren wurden Mutationen in G-Protein gekoppelten Rezeptoren in α-Untereinheiten von G-Proteinen als Ursache von einer Vielzahl von humanen Krankheiten identifiziert. Mutationen, die zum Verlust oder zur Verstärkung von Funktionen führten, wurden bei Erkrankungen wie der vererbbaren Albright- Osteodystrophie, dem nephrogenen Diabetes insipidus, dem McCune-Albright-Syndrome und bei der männlichen Pubertas praecox beschrieben. Die Identifizierung von Mutationen in G-Protein gekoppelten Rezeptoren und in G-Proteinen brachten bei humanen Krankheiten einzigartige Einblicke in die G-Protein gekoppelte Signaltransduktion, wichtige Implikationen zur Diagnose und möglichen Behandlungen und sollten die Suche nach zusätzlichen Defekten in G-Protein gekoppelter Signaltransduktion bei anderen Krankheiten vorantreiben. "
Auch diese Arbeit beschreibt die herausragende Rolle von G-Proteinen für vielfältige Erkrankungen, hebt aber wiederum ausschließlich die Bedeutung von α- Untereinheiten hervor.
Lefkowitz schreibt 1995: (R. J. Lefkowitz. G proteins in medicine. N. Engl . J.Med. 332:186-187, 1995):
"Wenn man sich die allgegenwärtige Verbreitung von G- Proteinen und die bemerkenswerte Vielfalt ihrer Funktionen betrachtet, so sollte man nicht überrascht sein, daß Veränderungen in der Struktur oder der Expression von G-Proteinen zu ernsten patho- physiologischen Konsequenzen führen können. Diese Veränderungen führen entweder zu einer Erhöhung oder Erniedrigung der Aktivität der betroffenen G-Proteine."
Gesteigerte G-Proteinaktivität und Risiko für Asthma bronchiale
Bei Vorliegen einer gesteigerten Aktivierbarkeit von G- Proteinen und damit einhergehender vermehrten Aktivierbarkeit von Immunzellen, ist ein erhöhtes Risiko für 825T-Allelträger anzunehmen, an Asthma zu erkranken. Bei dieser Atemwegserkrankung liegt häufig ein hyperreagibles Bronchialsystem vor, und die Aktivierung von Immunzellen mit vermehrter Migration und vermehrter Sekretion von Antikörpern z.B des Typs IgE ist allgemein bekannt. Nicht zuletzt wegen dieser Bedeutung des Immunsystems für Auftreten und Schweregrad des Asthma bronchiale beinhaltet die Therapie gegebenenfalls auch den Einsatz von Glukorkortikoiden zur Unterdrückung der Immunantwort oder von Leukotrien-Rezeptorantagonisten zur Verminderung der Leukozytenaktivierung.
Es wurde untersucht, ob bei Kindern mit Asthma im Vergleich zu einem gesunden Kontrollkollektiv Genveränderungen im Gen GNB3 gehäuft auftreten. Dazu wurden 101 Kinder mit Asthma bronchiale bezüglich des C825T-Polymorphismus im Gen GNB3 genotypisiert und mit 332 gesunden Kontrollpersonen, die bis zum 25. Lebensjahr kein Asthma bronchiale aufwiesen, verglichen. Bei Kindern mit Asthma bronchiale fand sich am 825-Locus die folgende Genotypverteilung: 13 TT (13 %) , 54 TC (53 %) und 34 CC (34 %) . Die 825T-Allelfrquenz beträgt damit 39.6 %. Diese hohe 825T-Allelfrequenz innerhalb einer rein kaukasischen Kohorte ist bereits per se auffällig und ähnelt derjenigen, die man sonst nur bei Ostasiaten findet ( Siffert et al . , 1999; J. Am. Soc.Nephrol. Vol 10, 1921- 1930) . Im Gegensatz dazu war bei 332 gesunden Kontrollen die 825T-Allelfrequenz mit 29.7 % deutlich erniedrigt und die ermittelte Genotypverteilung ergab 25 TT (7,5 %) , 147 TC (44,3 %) und 160 CC (48,2 %) . Der Unterschied der Genotypverteilung gegenüber Patienten mit Asthma bronchiale ist statistisch signifikant (chi2 - Test; p = 0.023; chi2= 7.6, 2 Freiheitsgrade). Damit ist das Asthma-Risiko für einen homozygoten 825T-Allelträger (TT- Genotyp) gegenüber dem CC-Genotyp um das 2.4 -fache erhöht (p = 0,019) und für einen heterozygoten 825T-Allelträger (TC- Genotyp) um das 1,7-fache erhöht (p = 0,0257).
Gesteigerte G-Protein - Aktivierung und Therapieantwort auf die Gabe von Interferon plus Ribavirin bei Patienten mit Hepatitis-C-Infektion
Nach Infektion mit dem Hepatitis C- Virus (HCV) können manche Patienten das Virus spontan eliminieren, während bei anderen Patienten die Virusinfektion persistiert. Typische Spätfolgen bei Patienten mit persistierender HCV- Infektion sind die Ausbildung einer Leberzirrhose gegebenenfalls mit einem Leberzellkarzinom. Bei Dekompensation der Erkrankung tritt gegebenenfalls ein tödliches Leberversagen ein. Ein Teil dieser Patienten wird der Lebertransplantation zugeführt. Daneben wird versucht, das HCV medikamentös zu eliminieren z. B. durch die kombinierte Gabe von Ribavirin, was die Replikation des HCV unterbindet, in Kombination mit der Gabe von Interferonen. Der Erfolg dieser Therapie wird über die Bestimmung der Anzahl von HCV - Kopien im Serum kontinuerlich kontrolliert. Bei ca. 50-70 % der Patienten führt diese Therapie zur andauernden Elimination des HCV und solche Patienten werden als "sustained responder" bezeichnet. Eine Reihe von Patienten spricht auf diese Therapie nicht oder nur zu Beginn der Therapie an, mit nachfolgendem Wiederanstieg der Viruslast. Solche Patienten werden als "Non-Responder" bzw. als Patienten mit "relaps" bezeichnet.
Es wurde untersucht ob Genveränderungen im Gen GNB3 zur Vorhersage des Erfolgs einer Kombinationstherapie mit Ribavirin und Interferon verwendet werden können. Hierzu wurden 85 HCV- Patienten bezüglich des C825T- Polymorphismus genotypisiert . Bei den Patienten mit "sustained response" wurde die folgende Genotypverteilung beobachtet: 8 TT, 37 TC, 39 CC. Bei den "Non-respondern" war die entsprechende Genotypverteilung 1 TT, 12 TC, 17 CC. Somit ergibt sich bei den "Respondern" im Vergleich zu den "Non-Respondern" eine signifikant erhöhte Anhäufung des 825T-Allels (p = 0.016). Bei homozygoten 825T-Allelträgern (TT-Genotyp) finden sich 89 % der Responder, bei heterozygoten 825T-Allelträgern (TC- Genotyp) 68 % Responder, bei homozygoten C825- Allelträgern (CC-Genotyp) hingegen nur 31 % Responder. Hieraus ergibt sich für Patienten mit TT-Genotyp gegenüber dem CC- Genotyp eine um das 11,3 -fach erhöhte Wahrscheinlichkeit zur Gruppe der "Responder" zu gehören (p = 0.012), und für Patienten mit TC-Genotyp gegenüber dem CC-Genotyp eine 2.9-fach erhöhte Wahrscheinlichkeit, zu den "Respondern" zu gehören (p= 0.03) . Dieses Beispiel illustriert, dass Genveränderungen im Gen GNB3 in besonderer Weise geeignet sind, die Antwort auf bestimmte Pharmaka bzw. einen Therapieerfolg oder Therapieversagen vorherzusagen.
Aus den vorstehend genannten und erläuterten Beispielen geht demnach folgendes hervor:
1. Genveränderungen in Genen, die für ubiquitär exprimierte Proteine kodieren, beeinflussen vielfältige Erkrankungen bzw. verursachen vielfältige Erkrankungsrisiken
2. G-Proteine steuern nahezu alle Signaltransduktionsvorgänge im menschlichen Körper
3. Veränderungen bei G-Proteinen haben vielfältige Auswirkungen bei ganz unterschiedlichen Erkrankungen. Sie können die Entstehung von Erkrankungen begünstigen oder deren Verlauf beeinflussen
4. Während aus der zitierten Literatur eindeutig hervorgeht, dass man ganz allgemein davon auszugehen hat, dass G-Proteinmutationen solche Erkrankungen hervorrufen können, so wurde ein Zusammenhang mit ß- oder γ-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine mit Erkrankungsrisiken in der Literatur weder beschrieben noch vermutet .
Damit stehen die im folgenden beschriebenen Zusammenhänge zwischen Genveränderungen im Gen GNB3 und unterschiedlichen Erkrankungen bzw. Erkrankungsverläufen oder die Verwendung solcher Genveränderungen zur Vorhersage von Erkrankungen und Erkrankungsverläufen und zur Vorhersage der Reaktion auf Pharmaka auf einem wissenschaftlich nachvollziehbaren Fundament. Neu und unerwartet ist allerdings die Tatsache, dass diese Vorhersagbarkeit durch Genveränderungen in spezifisch diesem Gen ( GNB3) realisiert werden kann.
Struktur des Gens GNB3
Die Struktur des Gens GNB3 ist in Abbildung 1 dargestellt. Es besteht aus 11 Exons, wobei sich das Startcodon ATG in Exon 3 befindet, während das Stoppcodon in Exon 11 lokalisiert ist. Die cDNA, welche für das Gß3- Protein kodiert, wurde bereits früher beschrieben (M. A. Levine, P. M. Smallwood, P. T. Moen, Jr . , L. J. Helman, and T. G. Ahn. Molecular cloning of beta 3 subunit, a third form of the G protein beta-subunit polypeptide. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 (6) : 2329-2333 , 1990). In Abweichung von dieser publizierten cDNA-Sequenz wurden von dem Anmelder früher die Mutationen C825T (Abbildung 1) und C1429T (Abbildung 1) beschrieben (vgl. DE 196 19 362 AI, DE 196 37 518 AI und die nachveröffentlichte PCT/EP99/06534) . Die Numerierung der vorstehend genannten Polymorphismen bezieht sich auf die cDNA-Sequenz, wobei dem Startcodon ATG die Position +1 zugeordnet wird. Zudem wurde bereits früher beschrieben, daß durch alternatives Spleißen von Exon 9 eine neue Spleißvariante mit 6 WD-repeats entsteht (Gß3s) (W. Siffert, D. Rosskopf, G. Siffert, S. Busch, A. Moritz, R. Erbel, A. M. Sharma, E. Ritz, H. E. Wichmann, K. H. Jakobs, and B. Horsthemke. Association of a human G-protein ß3 subunit variant with hypertension. Nat . Genet . 18 (1) :45-48, 1998) und daß alternatives Spleißen von Exon 10 zur Entstehung einer weiteren Spleißvariante mit 6WD-repeats führt (vgl. die nachveröffentlichte PCT/EP99/06534) . Es wurde gefunden, daß das 825T-Allele bzw. das 1429T-Allel prädiktiv für die Generierung dieser Spleißvarianten sind. Da die Expression dieser Spleißvarianten in Zellen generell zu einer gesteigerten Aktivierbarkeit von G-Proteinen führt, läßt sich über die Genotypisierung des C825T- oder des C1429T-Polymorphimus die Stärke der intrazellulären Signaltransduktion vorhersagen.
Daneben wurde die genomische Sequenz von GNB3 publiziert (M. A. Ansari-Lari, D. M. Muzny, J. Lu, F. Lu, C. E. Lilley, S. Spanos , T. Malley, and R. A. Gibbs . A gene- rich cluster between the CD4 and triosephosphate isomerase genes at human chromosome 12pl3. Genome Research 6:314-326, 1996)
Es wurde nun gefunden, daß im Intron 9 der Sequenz des menschlichen Gß3 Gens ( GNB3) in Abweichung zu der von Ansari-Lari et al . beschriebenen Sequenz neben den Mutationen in der cDNA (C825T, A657T, G814A, C1429T) und einer Mutation im Promotor (A-350G) weitere Varianten vorhanden sind. Es wurde ferner gefunden, daß diese genetischen Varianten mit der Disposition für verschiedene Erkrankungen, u.a. Bluthochdruck, Fettsucht, Übergewicht, korrelieren.
Gegenstand der Erfindung ist danach die Sequenz des menschlichen Gß3 Gens, die an den Positionen 657, 814, 825 und 1429 der cDNA bzw. an den Positionen (-350), 3882, 5177, 5249 und 6496 der genomischen Sequenz ganz oder teilweise mutiert ist.
Die Fig. 1 der Zeichnung zeigt die Genstruktur von GNB3 und neue Polymorphismen. Dargestellt ist die Exon-Intron-Struktur von GNB3. Das Gen besteht aus 11 Exons, früher beschriebene Polyrorphismen befinden sich in Exon 10 (C825T) und Exon 11 (C1429T) . Die Numerierung entspricht dabei der cDNA- Sequenz, wobei dem Startcodon ATG in Exon 3 die Position +1 zugeordnet wird. Ferner dargestellt ist der Start der Transkription in Exon 1. Bezogen auf diesen Transkriptionsstartpunkt findet sich eine Mutation im Promotor (A-350G) sowie die dargestellten Mutationen in Intron 9, A3882C, G5177A, und G5249A. Unter Benutzung dieser Numerierung (Transkriptionsstartpunkt = 1) liegt der C825T-Austausch bei Position 5500. Weiterhin findet sich eine CACA-Insertion an Position 6496.
Dargestellt sind ferner die Bereiche von Exon 9 und Exon 10, die bei Vorliegen der Mutationen an Position 825 und 1429 der cDNA bzw. 3882, 5177, 5249 und/oder 6496 der DNA-Sequenz alternativ gespleißt werden. In eckigen Klammern dargestellt ist die Numerierung von Polymorphismen, wenn als Position 1 der Transkriptionsstartpunkt in Exon 1 festgelegt wird.
Im einzelnen sind die Mutationen im Nachfolgenden charakterisiert. Die Numerierung bezieht sich auf den Transkriptionsstartpunkt von GNB3 (Abbildung 1) . Dieser Startpunkt entspricht dem Nukleotid 52221 der von Ansari- Lari et al . publizierten Sequenz eines Abschnitts des humanen Chromosoms 12 (M. A. Ansari-Lari, D. M. Muzny, J. Lu, F. Lu, C. E. Lilley, S. Spanos, T. Malley, and R. A. Gibbs . A gene-rich cluster between the CD4 and triosephosphate isomerase genes at human chromosome 12pl3. Genome Research 6:314-326, 1996). Der Polymorphismus C825T entspricht dabei bspw. der genomischen Sequenz C5500T.
Der Basenaustausch A3882C: die Sequenz innerhalb von Intron 9
ttccctagcc ctttcttact gtattttttt tttttttttt tttttttttg agacagagtc
wird also in folgende Basenabfolge mutiert:
ttccctagcc ctttcttact gtcttttttt tttttttttt tttttttttg agacagagtc
Der Basenaustausch G5177A: die Sequenz innerhalb von Intron 9
gctgtatagt gcagagcggg cgaggggcat agggaagtca
wird also in die folgende Basenabfolge mutiert:
gctgtatagt gcagagcagg cgaggggcat agggaagtca
Der Basenaustausch G5249A: die Sequenz innerhalb von Intron 9
ttctcacccc aaaccaaggg agggacaggca gggaggctg agagcagcgg
wird also in die folgende Basenabfolge mutiert:
ttctcacccc aaaccaagga agggacaggca gggaggctg agagcagcgg Das CACA Insert: die Sequenz innerhalb von Intron 10 ccccccacac acccacatac acacacacac ccacacaccc acacatacac ttacacgcat wird also in die Basenabfolge mutiert
ccccccacac acccacatac acacacacac ccacacacac acccacacat acacttacac gcat
(siehe auch Fig. 1) .
Besonders wichtig sind die folgenden Sequenzen (Haplotypen)
Sequenz mit den Mutationen 825C - 1429C - 3882A - 5249G und ohne das CACA-Insert in Intron 10
Sequenz mit den Mutationen 825T - 1492T - 3882C - 5249G und mit dem CACA-Insert in Intron 10
Es wurde ferner gefunden, daß alle untersuchten Individuen mit einem 825T-Allel und/oder einem 1429T- Allel gleichzeitig ein 3882C-Allel, ein 5249A-Allel und ein CACA- Insert tragen. Somit besteht ein nahezu hundertprozentiges Kopplungsungleichgewicht zwischen den Position 825 und 1429 der cDNA sowie den Positionen 3882 und 5249 der DNA Sequenzen innerhalb von Intron 9 und dem CACA-Insert an Position 6496 der DNA Sequenzen innerhalb von Intron 10. Damit erlaubt insbesondere die Genotypisierung an den Positionen 3882 (Intron 9) und/oder 5249 (Intron 9) und/oder 6496 (Intron 10) ebenso wie die Genotypisierung an den cDNA-Positionen 825 und 1429 die Vorhersage eines alternativen Spleißvorganges, welcher zum alternativen Spleißen des Exons 9 und 10 führt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Bestimmung von Krankheitsdispositionen, wobei alle Sequenzen und Varianten von GNB3 von der Einzelmutation bis zu allen möglichen Varianten (einschließlich jeder beliebigen absoluten Anzahl von Varianten, die mit einbezogen werden können) genotypisiert werden können und die entsprechenden Aussagen über Krankheitsdispositionen erlauben.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA eines Probanden isoliert und mindestens an einer der ausgetauschten Postionen genotypisiert und nachfolgend mit der Referenz-DNA-Sequenz verglichen wird. Bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen mindestens die Position 3882, die Position 5177, die Position 5249 oder die Position 6496, mindestens die beiden Positionen 825 und 3882, 825 und 5177, 825 und 5249 oder 825 und 6496, mindestens die drei Positionen 825, 3882 und 5249, 825, 3882 und 6496, 825, 5249 und 6496, mindestens die vier Positionen 825, 3882, 5249 und 1429, bzw. 825, 3882, 5249 und 6496 bzw. mindestens die fünf Positionen 825, 3882, 5249, 1429 und 6496 genotypisiert werden.
Die Genotypisierung erfolgt durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für die Detektion von Punktmutationen geeignet sind. Dazu gehören PCR-gestützte Genotypisierungsverfahren wie z.B. allelspezifische PCR, PCR-Reaktionen und Restriktionsfragmentlängenanalyse, PCR-Reaktionen unter Verwendung des Taqman Systems oder Molecular beacons , Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden (Beispiele hier wären dot-blotting und Hybridisierung, Single Nucleotide Primer Extension Analysen, Oligonucleotide Ligation Assays) , Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen und Single nucleotide polymorphism (SNP) Analyse mittels Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry (MALDI) , sowie prinzipiell jedwede zukünftig zur Verfügung stehende Methode zur Variantendetektion einschließlich der Gen-Chip Technologie in all ihren technologischen Ausführungen.
Ausgehend davon ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung eines breiten Spektrums verschiedenster Krankheitsdispositionen ex vivo geeignet.
In einer Ausführungsvariante ist vorgesehen, die Bestimmung zur Klärung einer Disposition für Bluthochdruck, der Vorhersage der individuellen Blutdruckwerte als solche, und anderer kardiovaskulärer Erkrankungen, einschließlich Myokardinfarkt , Herzinsuffizienz und Schlaganfall sowie von Herzrhythmusstörungen. Im weiteren Sinn wird auch die Entstehung einer terminalen Niereninsuffizienz (Dialysebedarf) oder Risiko der Mortalität unter Dialyse mit eingeschlossen.
In einer weiteren Ausführungsvariante wird die Disposition für metabolische Erkrankungen wie Übergewicht, Fettsucht und Typ II Diabetes mellitus, einschließlich einer Vorhersage des Gewichtsbereiches als solchen oder einer Disposition für Gewichtsveränderungen, schließlich eine Voraussage des Verhältnisses der Körpermasse als solche, wie sie sich z.B. im Body Mass Index (BMI) ausdrücken, festgestellt.
Darüber hinaus dient das Verfahren zur Voraussage der Gewichtsentwicklung nach einschneidenden persönlichen Ereignissen, wie z.B. nach Geburten bei Frauen oder in der Rekonvaleszenz nach schweren Erkrankungen. Weiterhin dient das Verfahren zur Abschätzung des möglichen Geburtsgewichtes und der Gewichtsentwicklung nach der Geburt . Zudem dient das Verfahren der Vorhersage von Frühgeburten, der Gewichtsentwicklung von Frühgeborenen, des Risikos einer Präeklampsie/Gestose, mit oder ohne HELLP-Syndrom, von Aborten, des Erfolgs einer in -vi tro Fertilisation.
In einer weiteren Ausführungsvariante ist die Diagnostik zur Disposition zu veränderten Immunreaktionen vorgesehen. Dies schließt ein, die Voraussage der Reaktion auf Impfungen, den Verlauf von Infektions- und Autoimmunerkrankungen und der Abstoßung transplantierter Organe. Als Infektions- und Immunerkrankungen sind hier beispielsweise zu nennen, die HIV-Infektion und die Progression zu AIDS, Kaposisarkom, Hepatitis C und B, allergisches Asthma und weitere atopische Erkrankungen, wie Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, atopische Dermatitis und Psoriasis. Des weiteren sind hier auszuführen Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, z.B. die rheumatoide Arthritis.
In einer weiteren Ausführungsvariante erfolgt die Diagnostik bezüglich der Prädisposition zur Entstehung bösartiger Tumore und deren Verlauf, insbesondere die Metastasierungsneigung, die Neigung für das Auftreten eines Tumorrezidivs und die Neigung für die Tumorprogression. AI 3 solche Tumoren sind insbesondere zu nennen das Mammakarzinom, das Ovarialkarzinom, das Uteruskarzinom, das Kolon- und Rektumkarzinom, Magen-, Leber, Gallen- und Pankreaskarzinome, Dünndarmkarzinome, maligne Tumore der Haut, alle Formen der Leukämie, alle Formen vom Lymphomen inkl. Hodgkin- und Non-Hodgkin- Lymphome, das Kaposisarkom, Lungen- und Kehlkopfkarzinom, das Harnblasen- Prostata- und Nierenzellkarzinom, das Hodenkarzinom, alle Formen von Gehirntumoren, z.B. das Glioblastom, das Astrozytom usw.
Es ist bekannt, daß die Aktivierung heterotrimerer G- Proteine bei der Migration von Tumorzellen entscheidend beteiligt ist. Eine solche Migration ist verantwortlich für die Metastasierung. Nachgewiesen wurde dies u.a. für die Migration von Harnblasentumorzellen, welche durch Pertussistoxin stark inhibiert wird (Lümmen G et al . , Identification of G protein-coupled receptors potently stimulating migration of human transitional-cell carcinoma cells. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol . 1997 Dec;356 (6) :769-76. ) Hier versucht man bereits therapeutisch, solche Gi-Proteine durch intravesikuläre Gabe von Pertussitoxin zu inhibieren (Otto T et al : Intravesical therapy with pertussis toxin before radical cystectomy in patients with bladder cancer : a Phase I study. Urology. 1999 Sep; 54 (3) : 458-60. ) . Nahezu identische Beobachtung hinsichtlich der Bedeutung von G- Proteinen liegen für das Prostatakarzinom (Essential role for G proteins in prostate cancer cell growth and signaling. J Urol . 2000 Dec; 164 (6) : 2162-7) und für Astrozytomzellen vor (Hernandez M, et al . ; Lysophosphatidic acid inhibits Ca2+ signaling in response to epidermal growth factor receptor Stimulation in human astrocytoma cells by a mechanism involving phospholipase Cγ and a Gαi protein. J Neurochem. 2000 Oct;75(4) :1575- 82) . Eine Hemmung der G-Proteinaktivierung hemmt auch die Proliferation von Mammakarzinomzellen (Wickramasinghe NS, Jo H, McDonald JM, Hardy RW. Stearate inhibition of breast cancer cell proliferation. A mechanism involving epidermal growth factor receptor and G-proteins. Am J Pathol. 1996 Mar;148 (3) :987-95) .
Umgekehrt ist bekannt, daß die Expression übermäßig aktivierbarer G-Proteine, wie dies bei künstlich erzeugten, konstitutiv aktiven α-Untereinheiten der Fall ist, einen tumorähnlichen zellulären Phanotyp erzeugt (N. Xu, T. Voyno Yasenetskaya, and J. S. Gutkind. Potent transforming activity of the G13 α subunit defines a novel family of oncogenes. Biochem. Biophys .Res . Commun. 201:603-609, 1994; T. A. Voyno-Yasenetskaya, A. M. Pace, and H. R. Bourne. Mutant a subunits of G12 and G13 proteins induce neoplastic transformation of Rat-1 fibroblasts. Oncogene 9:2559-2565, 1994). Daneben wurde in einigen seltenen Fällen gefunden, daß in manchen Tumoren somatische Muationen in α-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine vorliegen können (J. Lyons, C. A. Landis, G. Harsh, L. Vallar, K. Grünewald, H. Feichtinger, Q.-Y. Duh, 0. H. Clark, E. Kawasaki, H. Bourne, and F. McCormick. Two G protein oncogenes in human endocrine tumors. Science 249:655-659, 1990).
Zusammenfassend kann damit festgestellt werden, daß heterotrimeren G-Proteinen eine entscheidende Rolle bei der Transformation zu Tumorzellen aber auch bei der Migration und Proliferation von Tumorzellen zugesprochen werden kann.
Allerdings konnte bislang kein generell einsetzbarer genetischer Marker gefunden werden, der eine Vorhersagbarkeit bezüglich Tumorentstehung und/oder Progression bzw. Verlauf der Tumorerkrankung ermöglicht. Ebensowenig war es auf Grund dieser Beobachtungen und bekannter Befunde vorhersagbar, in welcher Isoform heterotrimer G-Proteine sich ein solcher generell einsetzbarer genetisch Marker finden läßt.
Abb. 4 belegt die herausragende Rolle von Mutationen im Gen GNB3 für die Progression menschlicher Tumore am Beispiel das Harnblasenkarzinoms. Hierzu wurden Patienten mit Harnblasenkarzinom bezüglich des C825T-Polymorphismus genotypisiert, und der Verlauf der Erkrankung wurde 10 Jahre lang verfolgt. Es zeigt sich, daß bei 825T- Allelträgern und Vorliegen eines noch differenzierten Tumors (Grading 1-2) eine Metastasierung im Mittel innerhalb von 29 Monaten auftritt, während Metastasen bei homozygoten C825-Allelträgern im Mittel erst nach 69 Monaten auftreten. In ähnlicher Weise läßt sich die Zeit von der Erstdiagnose des Tumors bis zum Auftreten der Progression (= Rezidiv oder Metastasen) dahingehend beschreiben, daß dieses Ereignis bei 825T-Allelträgern besonders früh auftritt (Fig. 5) . Bei wenig infiltrierenden Tumoren (Tl/2 -Tumore) beträgt für 825T- Allelträger die Zeit bis zur Progression im Mittel 18,3 Monate, bei homozygoten C825-Allelträgern beträgt diese Zeit hingegen 47,9 Monate. Hierbei ist insbesondere darauf zu verweisen, daß nahezu bei allen 825T- Allelträgern die Tumorprogression innerhalb von zwei Jahren nach Erstdiagnose auftritt.
Da die zellulären Mechanismen für Proliferation und Migration (Metastasierung) unabhängig von der Tumorart oder seiner Lokalisation im Körper immer die Aktivierung von heterotrimeren G-Proteinen beinhalten, läßt sich das hier beschriebene Phänomen verallgemeinern. Damit können Polyτnorphismen im Gen GNB3 generell als diagnostisches Prinzip bei allen Tumorarten eingesetzt werden.
Daneben läßt sich unmittelbar ableiten, daß Mutationen bzw. Polymorphismen im Gen GNB3 für die Vorhersage der Ansprechbarkeit auf eine Tumortherapie eingesetzt werden können. Dies gilt für alle Chemotherapeutika, die im weitesten Sinne in den Zellzyklus eingreifen und relativ unspezifisch die Vermehrung schnell proliferierender Zellen inhibieren. Es ist bekannt, daß Zellen von Individuen die das 825T-Allel tragen vermehrt in der Mitosephase des Zellzyklus beobachtet werden (Rosskopf D, Schröder KJ, Siffert W., Role of sodium-hydrogen exchange in the proliferation of immortalised lymphoblasts from patients with essential hypertension normotensive subjects. Cardiovasc Res . 1995 Feb; 29 (2 ) : 254 -9) . Daneben kann vorhergesagt werden, daß neuere Tumortherapeutika, z.B. Antikörper, cGp-Nukleotide, und Inhibitoren der Signaltransduktion allgemein, z.B. Tyrosinkinase- Inhibitoren, bei 825T-Allelträgern anders wirken als bei C825-Allelträgern. Dies ist darauf zurückzuführen, daß eine gesteigerte Aktivierbarkeit von G-Proteinen, wie sie bei 825T-Allelträgern zu beobachten ist, auch nachgeschaltete Signaltransduktionswege (ras- raf- MAP- Kinase-Weg; PI3 -Kinase-Aktivierung, Aktivierung von Proteinkinasen und Phospholipasen etc.) verstärkt aktiviert .
In einer weiteren Ausführungsvariante erfolgt die Diagnostik bezüglich der Prädisposition für Intelligenzleistungen, Lernfähigkeit, emotionale Zustände, Suchtneigung und psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie, Depression etc.. Es ist allgemein bekannt, daß eine Vielzahl von Prozessen, die im menschlichen Gehirn ablaufen, durch Hormone und sog. Neurotransmitter gesteuert werden. Beispielsweise existieren Pharmaka, welche die Wiederaufnahme von Serotonin und/oder Noradrenalin in die präsynaptische Nervenendigung hemmen. Die hierdurch entstehende höhere Konzentration von Transmitter im synaptischen Spalt beeinflußt dann Verhalten und Denken (beispielsweise die Gabe von Sibutramin als Appetitzügler, Imipramin als Antidepressivum) . Da die G-Proteinuntereinheit Gß3 in hoher Konzentration im Gehirn vorkommt, ist davon auszugehen, daß Genveränderungen im Gen GNB3 nachhaltige Auswirkungen auf Verhalten, Denken, Intelligenz, emotionale Zustände, Lernfähigkeit, Verarbeitung von Sinneswahrnehmungen (Hören, Sehen , Riechen, Schmecken, Schmerzempfinden; Kälte, Wärme) haben muß. Dazu gehört auch die Neigung zu psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie, Depression etc. und die Neigung zur Sucht (Nikotin-, Alkohol-, Drogensucht), die Neigung zur Gewaltausübung und vieles mehr.
Um einen solchen Effekt prinzipiell nachzuweisen, wurden 190 junge, gesunde Medizinstudenten bezüglich des C825T- Polymorphismus genotypisiert und mittels psychologischer Testverfahren charakterisiert. Für diese Charakterisierung wurden Standardtests wie das "Freiburger Persönlichkeitsinventar (FPIR)" oder das "Beck Depressionsinventar (BDI)" eingesetzt, welche in der Psychiatrie, Psychosomatik und in der psychologischen Forschung routinemäßig zur
Persönlichkeitscharakterisierung herangezogen werden. Abbildung 6 belegt, daß bereits gesunde 825T-Allelträgern eine höhere Neigung zur depressiven Stimmung haben, einen erhöhten Score bezüglich Selbstaggression erreichen und einen erniedrigten Score für Lebenszufriedenheit aufweisen.
Damit ist nachgewiesen, daß grundlegende Prozesse der Emotion und des Denkens sich bei 825T-Allelträgern und bei C825-Allelträgern unterscheiden. Wegen der bei Vorliegen eines 825T-Allelträger verstärkten Signaltransduktion über G-Proteine kann zudem abgeleitet werden, daß eine Genotypisierung im Bereich des GN_B3-Gens zur Vorhersage dazu eingesetzt werden kann, in welcher Weise Individuen auf Pharmaka und Substanzen reagieren, welche Gefühle, Lernvermögen, psychiatrische Erkrankungen, aber auch Sinneswahrnehmungen beeinflussen.
Solche Vorhersagen sind wie hier belegt bereits bei gesunden Individuen möglich.
Des weiteren erlaubt das Verfahren auch die Bestimmung des Verlaufs und des Schweregrades von Erkrankungen, sowie die Prädiktion der Überlebensdauer bei und nach schweren medizinischen Erkrankungen, z.B. nach Myokardinfarkt , Herzversagen, Schlaganfall und/oder Herzinsuffizienz . Selbstverständlich können für die beschriebene Diagnostik die hier weiter beschriebenen Polymorphismen eingesetzt werden.
Im weiteren wird im einzelnen auf Anwendbarkeit der ersten erfindungsgemäßen Lehre für die Pharmakogenetik eingegangen, d.h. die Diagnostik der Wirksamkeit von Pharmaka, der Potenz und Effizienz von Pharmaka und dem Auftreten unerwünschter Wirkungen.
Grundlagen und Ziele der Pharmakogenetik
Die Wirksamkeit von Arzneimitteln und/oder das Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen wird neben den spezifischen Stoffeigenschaften der chemisch definierten Produkte durch eine Reihe von Parametern definiert. Zwei wichtige Parameter, die erzielbare Plasmakonzentration und die Plasmahalbwertszeit bestimmen in hohen Maße die Wirksamkeit oder Unwirksamkeit von Parametern oder das Auftreten unerwünschter Wirkungen. Die
Plasmahalbwertszeit wird unter anderem dadurch bestimmt, mit welcher Geschwindigkeit bestimmte Pharmaka in der Leber oder anderen Körperorganen zu wirksamen oder unwirksamen Metaboliten verstoffwechselt und mit welcher Geschwindigkeit sie aus dem Körper ausgeschieden werden, wobei die Ausscheidung über die Nieren, über die Atemluft, über den Schweiß, über die Spermaflüssigkeit, über den Stuhl oder über andere Körpersekrete erfolgen kann. Daneben wird die Wirksamkeit bei oraler Gabe durch den sog. "first-pass-Effekt " limitiert, da nach Resorption von Pharmaka über den Darm ein bestimmter Anteil in der Leber zu unwirksamen Metaboliten verstoffwechselt wird.
Mutationen oder Polymorphismen in Genen metabolisierender Enzyme können die Aktivität derselben in der Weise verändern, daß deren Aminosäurezusammensetzung verändert wird, wodurch die Affinität zum metabolisierende Substrat erhöht oder erniedrigt wird und damit der Metabolismus beschleunigt oder verlangsamt sein kann. In ähnlicher Weise können Mutationen oder Polymorphismen in Transportproteinen die Aminosäurezusammensetzung in der Weise verändern, daß der Transport und damit die Ausscheidung aus dem Körper beschleunigt oder verlangsamt wird.
Zur Auswahl der für einen Patienten optimal geeigneten Substanz, der optimalen Dosierung, der optimalen Darreichungsform und zur Vermeidung unerwünschter, z.T. gesundheitsschädlicher oder tödlicher Nebenwirkungen ist die Kenntnis von genetischen Polymorphismen oder von Mutation, die zur Änderung der Genprodukte führen, von herausragender Bedeutung.
Die Wirkung von Hormonen im menschlichen Körper und die Bedeutung von Polymorphismen in Hormonrezeptoren
Eine Vielzahl von Hormonen und Peptidhormonen des menschlichen Körpers üben ihre Wirkung an sogenannten Rezeptoren der Körperzellen aus. Dies sind Proteine unterschiedlicher Zusammensetzung. Nach Aktivierung dieser Rezeptoren müssen diese Signale ins Zellinere geleitet werden, was über die Aktivierung von heterotrimeren G-Proteinen vermittelt wird. Solche G- Proteine sind aus unterschiedlichen α-, ß- und γ- Untereinheiten zusammengesetzt sind. Die Rezeptoren lassen sich, je nach Aktivierbarkeit durch definierte Hormone, in bestimmte Gruppen unterteilen. Dem Fachmann ist bekannt, daß Mutationen oder Polymorphismen in bestimmten Rezeptoren die Wirksamkeit bestimmter Agonisten oder Antagonisten an diesen Rezeptoren determinieren können. So beeinflußt ein häufiger Glyl6Arg- Polymorphismus im Gen, das für den ß2- Adrenozeptor kodiert, die Stärke der Ansprechbarkeit auf das ß2-Sympathomimetikum Salbutamol (Martinez FD, et al . Association between genetic polymorphisms of the ß2- adrenoceptor and response to albuterol in children with and without a history of wheezing. J Clin Invest. 1997 Dec 15; 100 (12) :3184-8) . Polymorphismen im D2 -Rezeptorgen bestimmen die Häufigkeit des Auftretens von Dyskinesien bei der Behandlung des Morbus Parkinson (Parkinson 's disease) mit Levadopa (Oliveri RL, et al . ; Dopamine D2 receptor gene polymorphism and the risk of levodopa- induced dyskinesias in PD. Neurology. 1999 Oct 22 ; 53 (7) : 1425-30) : Polymorphismen im μ-Opiatrezeptor-Gen bestimmen die analgetische Wirksamkeit von Opiaten (Uhl GR, et al . The μ opiate receptor as a candidate gene for pain: polymorphisms, variations in expression, nociception, and opiate responses. Proc Natl Acad Sei U S A. 1999 Jul 6;96(14) :7752-5) .
Die genannten Genveränderungen in spezifischen Rezeptoren können nur in der Weise zur Diagnostik der Wirkungen von Pharmaka benützt werden, als diese Pharmaka spezifische Agonisten oder Antagonisten an den betrachteten Rezeptoren sind. Wünschenswert ist hingegen eine individuelle Diagnostik der generellen Ansprechbarkeit gegenüber Pharmaka und die individuelle Vorhersage des Risikos unerwünschter Wirkungen unter Therapie mit Pharmaka .
Die Diagnostik der Aktivierbarkeit von G-Proteinen erlaubt eine generelle Diagnostik der Wirksamkeit von Pharmaka und Nebenwirkungen.
Die meisten zur Behandlung von Krankheiten, körperlichen Fehlfunktionen oder Befindlichkeitsstörungen eingesetzten Pharmaka sind Hormone, Agonisten an Hormonrezeptoren, Antagonisten an Hormonrezeptoren oder andere Substanzen, welche die Expression von Rezeptoren oder die Konzentration von Hormonen direkt oder indirekt beeinflussen. Eine Reihe von Pharmaka übt diesen Einfluß dadurch aus, daß unter Therapie mit solchen Substanzen physiologische Gegenregulationen erfolgen, welche die Konzentrationen von Hormonen erhöhen, die G-Protein- gekoppelte Rezeptoren aktivieren. Als allgemein bekanntes Beispiel sei hier die Therapie mit harntreibenden Substanzen (Diuretika) , insbesondere Schleifendiuretika und Thiaziddiuretika genannt. Der bei Therapie auftretende Verlust von Kochsalz und die Blutdrucksenkung führen zur Aktivierung des Renin-Angiotensin- Aldosteronsystems . Das vermehrt gebildete Hormon Angiotensin II stimuliert eine vermehrte Resorption von Natrium in der Niere, stimuliert die Salzaufnahme, erhöht den Blutdruck durch einen direkten vasokonstriktorischen Effekt auf glatte Gefäßmuskelzellen und induziert Proliferationsvorgänge . Es ist allgemein bekannt, daß diese von Angiotensin II hervorgerufenen Mechanismen nach Kopplung des Hormons an Rezeptoren erfolgt, welche ihre Wirkung über eine Aktivierung heterotrimerer G-Proteine vermitteln. Die Effizienz dieser Wirkungen sind dann vorhersagbar, wenn die Stärke der Aktivierbarkeit von G- Proteinen diagnostiziert werden kann. Andere Pharmaka üben Ihre Wirkung dadurch aus, daß sie die Wiederaufnahme von aus Neuronen freigesetzten Transmittern, z.B. Noradrenalin, Adrenalin, Serotonin oder Dopamin, hemmen. Hier kann als Beispiel das Pharmakon Sibutramin genannt werden, welches im Zentralnervensystem die Wiederaufnahme von Serotonin und Noradrenalin hemmt, dadurch das Hungergefühl reduziert und die Thermogenese steigert. Entprechend kann Sibutramin zur Therapie der Adipositas eingesetzt werden. Da Noradrenalin und Sibutramin G- Protein-gekoppelte Rezeptoren aktivieren, ist die Diagnostik der Aktivierbarkeit von G-Proteinen zur Vorhersage der Wirksamkeit von Sibutramin und dem Auftreten typischer, Sibutramin-assoziierte Nebenwirkungen (z.B. Anstieg von Herzfrequenz und Blutdruck) in besonderem Maße geeignet.
Weiterhin ermöglicht die erste Lehre der Erfindung die Voraussage welche spezifischen Medikamente in definierten Krankheitssituationen wirken.
Der Erfindung liegt nun zugrunde, daß ein Verfahren entwickelt wurde, daß generell zur Diagnostik der Aktivierbarkeit von G-Proteinen geeignet ist. Hier zu werden eine oder mehrere Polymorphismen im Gen GNB3 untersucht, daß für die humane Gß3 -Untereinheit heterotrimerer G-Proteine kodiert. Besonders geeignet sind hierfür Polymorphismen, welche die Diagnose des Auftretens oder des Nichtauftretens eines alternativen Spleißvorgangs des Gens vorhersagen, wodurch eine neue Spleißvariante des Gens und Proteins mit höchstens 6 WD- Repeat Domänen entsteht oder deren Entstehung unterdrückt wird. Bei Auftreten dieser Spleißvariante kommt es vorhersagbar zu einer gesteigerten Aktivierbarkeit von heterotrimeren G-Proteinen und zur verstärkten Aktivierbarkeit aller Zellen des menschlichen Körpers. Damit erlaubt eine Bestimmung des Vorliegens von Polymorphismen in GNB3 die Diagnostik der Wirksamkeit und unerwünschten Wirkungen von Arzneimitteln, insbesondere Agonisten und Antagonisten aller Rezeptoren, deren Wirkungen über heterotrimere G-Proteine vermittelt werden. Daneben können solche Polymorphismen in GNB3 dazu verwendet werden, die Wirkungen von Pharmaka zu diagnostizieren, die entweder indirekt oder infolge von Gegenregulationsmechnanismen des Körpers die Konzentrationen von endogenen Hormonen erhöhen oder erniedrigen, deren Rezeptoren heterotrimere G-Proteine aktivieren. Somit erlaubt die Erfindung eine Diagnostik von Wirkungen und unerwünschten Wirkungen aller Pharmaka und beschränkt sich nicht auf Pharmaka die in agonistischer oder antagonistischer Weise spezifische Rezeptoren beeinflussen.
Zur Diagnostik einer gesteigerten oder reduzierten Aktivierbarkeit von G-Proteinen dient insbesondere der Nachweis der Polymorphismen C825T, C1429T, A657T und G814A jeweils alleine oder in beliebiger Kombination als Haplotypanalyse (Numerierung entsprechend der cDNA, wobei dem Startcodon ATG die Position +1 zugeordnet wird) .
Daneben können zur Diagnostik alle weiteren Genveränderungen in GNB3 verwendet werden, die in einem Kopplungsungleichge icht zu C825T oder C1429T stehen und/oder den alternativen Spleißvorgang fördern oder hemmen. Dies betrifft insbesondere genetische Polymorphismen in Intron 9 von GNB3 , z. B. A3882C, G5177A, G5249A und das CACA-Insert im Intron 10 (Fig. 1) .
Diese Genveränderungen können mit beliebigen, dem Fachmann geläufigen Verfahren nachgewiesen werden, z.B. direkte Sequenzierung, Restriktionsanalyse, reverse Hybridisierung, Dot-blot- oder slot-blot-Verfahren, Massenspektrometrie, etc. Ferner können diese Genpolymorphismen gleichzeitig nach Mulitplex-PCR und Hybridisierung an ein DNA-Chip detektiert werden. Daneben können zur Diagnostik einer gesteigerten Aktivierbarkeit von G-Proteinen auch andere Verfahren eingesetzt werden, die den direkten Nachweis der Bildung und Expression von Isoformen der Gß3 -Untereinheit dienen, welche Spleißvarianten darstellen.
Die Durchführung der Analyse für pharmakogenetische Untersuchungen schließt ein die Voraussage des Ansprechens auf eine Therapie z.B. mit Antihypertensiva (u.a. ACE-He mstoffe, ATI-Rezeptor Blocker, ß-Blocker, α- Rezeptorblocker, Ca-Antagonisten, Vasodilatanzien) , Medikamenten zur Behandlung der Herzinsuffizienz, Medikamenten zur Behandlung von Herzrhythmusstörungen, Asthma, Depression, Schizophrenien, Alzheimer Erkrankung, dem Einsatz von Impfstoffen, der Behandlung der erektilen Dysfunktion.
Das genannte Verfahren eignet sich insbesondere zur Diagnostik der Wirkung von Agonisten oder Antagonisten an Rezeptoren, deren Wirkungen bekanntermaßen von G- Proteinen vermittelt werden. Die Anwendbarkeit dieses Verfahrens wurde bereits für den α2-adrenergen Rezeptor, den fMLP-Rezeptor und den Interleukin- 8 -Rezeptor belegt (vgl. PCT/EP99/06534) und publiziert (Baumgart D, et al.G protein ß3 subunit 825T allele and enhanced coronary vasoconstriction on α2-adrenoceptor activation. Circ Res. 1999 Nov 12 ; 85 (10) : 965-9; Virchow S, et al . , The G protein ß3 subunit splice variant Gß3-s causes enhanced chemotaxis of human neutrophils in response to interleukin-8. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol . 1999 Jul;360 (1) :27-32; Virchow S, et al . Enhanced fMLP- stimulated chemotaxis in human neutrophils from individuals carrying the G protein ß3 subunit 825 T- allele. FEBS Lett. 1998 Oct 2 ; 436 (2 ): 155-8) und kann auf weitere Rezeptoren angewandt werden. Hierzu werden die folgenden Beispiele genannt:
• Adrenerge Rezeptoren, inbesondere α- und ß- Adrenozeptoren und deren Isoformen und Untergruppen, d.h. αl- und α2-Adrenozeptoren sowie ßl-, ß2-, ß3 und ß4- Adrenozeptoren
• Muskarinrezeptoren und deren Isoformen, z.B. ml-,m2-, m3 - und m4 -Muskarinrezeptoren und deren Subtypen. Typische Antagonisten an Muskarinrezeptoren sind beispielsweise Atropin, Scopolamin, Ipratroprium, Pirenzepin und N-Butylscopolamin. Typische Agonisten sind Carbachol , Bethanechol, Pilocarpin etc.
• Dopaminrezeptoren, z.B. Dl-, D2-, D3-, D4-, und D5- Rezeptoren und deren Isoformen und Spleißvarianten • Serotoninrezeptoren, z.B. 5-HT1- 5-HT2-, 5-HT3- und 5- HT4 -Rezeptor und deren Subtypen. Typische Agonisten sind Sumatriptan und Cisaprid, Antagonisten sind beispielsweise Ondansetron, Methysergid, Buspiron und Urapidil .
• Endothelinrezeptoren
• Bradykininrezeptoren, z.B. Bl- und B2-Rezeptoren
• Angiotensinrezeptoren, z.B. AT II Typl und Typ2 Rezeptor, typische Antagonisten am AT II-Rezeptor sind Losartan und andere Sartane .
• Rezeptoren für Endorphine und Opiate, z.B. der μ- Opiatrezeptor
• Chemokinrezeptoren CCR1-12 und CXCR1-8 für z.B. Interleukin-1/2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12, RANTES, MlP-lα, MlP-lß, stromal cell-derived factor, MCP1-5, TARC, Lympnotactin, Fractalkine, Eotaxin 1-2, NAP-2, LIX etc.
• Adenosinrezeptoren
• Rezeptoren für Thrombin
• Rezeptoren für Lyso-Phophatidsäure, Phosphatidsäure, Rezeptoren für Sphingosinphosphate und deren Derivate • Rezeptoren für Prostaglandine und Thromboxane, z. B. für PGE1, PGE2, PGF, PGD2 , PGI2, PGF2α, Thromboxan A2 , etc .
• Rezeptoren für Neuropeptide, z.B. NPY1-5
• Histaminrezeptoren, z.B. Hl-H3-Rezeptoren
• Rezeptoren für Plättchen-aktivierender Faktor (PAF- Rezeptor)
• Rezeptoren für Leukotriene
• Rezeptoren für Insulin, Glucagon, Insulin-like growth factor (IGF-1 und IGF-2), Epidermal Growth Factor (EGF) und Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)
• Rezeptoren für Wachstumshormon (GH) , Somatostatin (SSTR1-5) , thyreotropes Hormon (TSH) , Oxytocin, Prolactin, Gonadotropine
• Rezeptoren für Interferone
• Rezeptoren für Purine
• Orphanrezeptoren, deren Wirkungen durch G- Proteine vermittelt werden.
Diagnostiziert werden können ferner die Wirkungen von Pharmaka, welche die Wiederaufnahme, den Abbau oder die Neusynthese von Neurotransmittern beeinflussen oder bei denen unter Therapie Veränderungen bei der Expression oder Ansprechbarkei der oben genannten Rezeptoren auftreten (z.B. Sibαtra in, Fluoxetin) . Diagnostiziert werden können außerdem die Wirkungen aller Pharmaka, welche auf direktem oder indirektem Wege auch in Folge einer physiologischen Gegenreaktion die Konzentrationen von Agonisten, welche die obengenannten Rezeptoren aktivieren, verändern.
Insbesondere die Wirkungen und unerwünschten Wirkungen der folgenden Pharmaka aus den folgenden Indikationsbereichen können diagnostiziert werden:
• Antihypertensiva, z.B. ß-Blocker (Propanolol, Bisoprolol, etc.), Diuretika (Hydrochlorothiazid und weitere Thiaziddiuretika; Furosemid, Piretanid und weitere Schleifendiuretika, Chlorthalidon, Spironolacton) , αl-Adrenozeptorblocker (z.B. Doxazosin, Prazosin) , Angiotensinrezeptor-Blocker (z.B. Losartan) ,
ACE-Hemmer (Enalapril, Captopril, Ramipril etc.), Ca2+- Kanalblocker (z.B. Nifedipin, Verapamil, Amlodipin, Felodipin) , Clonidin, Reserpin
• Pharmaka zur Behandlung der Herzinsuffizienz, z.B. ß- Blocker (z.B. Propanolol, Metoprolol), ACE-Hemmer (z.B. Captopril, Enalapril, Ramipril, etc.), Angiotensin- Rezeptorblocker (z.B. Losartan).
• Pharmaka zur Behandlung des niedrigen Blutdrucks oder einer Herzinsuffizienz, z.B. - und ß-Smpathomimetika (Etilefrin, Adrenalin, Noradrenalin, Dobuta in) • Pharmaka zur Behandlung der Migräne, z.B. Sumatriptan, Rizatriptan, Zolmitriptan und weitere Agonisten an Serotoninrezeptoren, ß-Blocker (Propanolol, Timolol) , Ergotamin und Dihydroergotamin
• Analgetika vom Morphintyp (Morphin, Codein, etc.)
• Pharmaka zur Behandlung der koronaren Herzkrankheit wie Adenosin, ß-Blocker (z.B. Propanolol, Acebutolol), Nitratester und andere NO-Donatoren (z.B. Molsidomin) , Thrombozytenaggregationshemmer
• Pharmaka zur Behandlung psychiatrischer Erkrankungen wie Alkoholismus, Schizophrenie, manisch-depressive Erkrankungen, Psychosen, Depressionen (z.B. Fluoxetin, Paoxetin, Imipramin, Desipramin, Doxepin, Mianserin, Trazodon, Lofepramin) , Angstsyndrome (Diazepam, etc.) , welche z.B. das dopaminerge, serotonerge oder adrenerge System beeinflussen
• Pharmaka zur Behandlung des Morbus Alzheimer (z.B. Tacrin) und zur Behandlung des Morbus Parkinson (z.B. Bromocriptin, L-DOPA, Carbidopa, Biperiden, Selegilin, etc.) welche Transmitterkonzentrationen an z.B. muskarinergen oder dopaminergen Substanzen, beeinflussen.
• Pharmaka zur Behandlung von Asthma bronchiale, welche z.B. entweder direkt bronchodilatierend oder antiinflammatorisch wirken, z.B. Salbutamol, Terbutalin, Albuterol, Theophyllin, Montelukast, Zafirlukast, Cromoglicinsäure, Ipratropiumbromid • Pharmaka zur Behandlung von Motilitätsstörungen des Magens oder Darms (z.B. N-Butylscopolamin, Pirenzepin, Metoclopramid)
• Pharmaka zur Behandlung der Adipositas, welche entweder direkt lipolytisch wirksame Rezeptoren aktivieren, z.B. ß3 -adrenerge Agonisten, oder zentral wirksam sind, z.B. Sibutramin, oder ähnliche Substanzen
• Pharmaka zur Behandlung chronischer Entzündungsvorgänge oder von Störungen des Immunsystems, z.B. Interferone bei der Therapie von Virushepatitiden oder Interleukin- 2 bei HIV-Infektion
• Pharmaka zur Behandlung der Gestose und der Präeklampsie/Eklampsie und des HELLP-Syndroms
• Pharmaka zur Behandlung von Fertilitätsstörungen oder zur Beseitigung von Zyklusstörungen bei der Frau
• Pharmaka zur Behandlung von Herzrhythmusstörungen
• Antidiabetika (Acarbose, Insulin, Troglitazone, Metformin, etc.)
• Hypnotika, Antiemetika und Antiepileptika
• Pharmaka zur Behandlung der erektilen Dysfunktion (Sildenafil, Prostaglandin El, Apomorphin) Ferner können Genveränderungen im Gen GNB3 , z.B. der C825T Polymorphimus dazu verwendet werden, die Ansprechbarkeit eines Probanden auf Oligonukleotide mit CpG-Motiven vorherzusagen. Solche Nukleotide können verabreicht werden, um das Immunsystem eines Patienten zu aktivieren (Krieg AM. Immune effects and mechanisms of action of CpG motifs. Vaccine. 2000 Nov 8 ; 19 (6) : 618-622. ) Somit können Tumorerkrankungen, aber auch immunologische Erkrankungen z.B. Asthma behandelt werden. Da bei Probanden mit Genveränderungen im Gen GNB3 generell eine gesteigerte Aktivierbarkeit von Immunzellen genetisch bedingt vorliegt ( z.B S. Virchow, N. Ansorge, D. Rosskopf, H. Rübben, and W. Siffert. The G protein ß3 subunit splice variant Gß3-s causes enhanced chemotaxis of human neutrophils in response to interleukin-8. Naunyn-Schmiedeberg1 s Arch. Pharmacol . 360:27-32, 1999), antworten diese auch mit einer verstärkten Immunreaktion auf eine solche Immunstimulation mit CpG- Oligonukleotiden. Daneben kann vorhergesagt werden, daß die generell gesteigerte zelluläre Aktivierbarkeit, welche bei Patienten mit den genannten Genveränderungen vorliegt, auch dazu führt, daß die Zielzellen dieser Patienten (z.B. Tumorzellen) verstärkt auf aktivierte Immunzellen und deren freigesetzte Produkte reagieren. Mithin ist durch eine Bestimmung des Vorliegens von Genveränderungen im Gen GNB3 eine Vorhersage über das Ansprechen solcher Patienten auf eine Therapie mit Oligonukleotiden, die ein CpG-Motiv erhalten, möglich.
Gemäß einer zweiten und dritten Lehre betrifft die Erfindung die Verwendung einer Genveränderung in der humanen G-Protein Untereinheit Gß3 (Gen: GNB3) zum Auffinden neuer Kraπkheitsgene und zur Entdeckung und Entwicklung neuer Angriffspunkte für Arzneimittel (Drug Targets) Menschen, bei denen einer der genannten Polymorphismen in GNB3 vorliegt, z.B. A(-350)G, C825T, A3882C, G5177A, G5249A, C1429T oder das CACA-Insert im Intron 10 (Fig. 1) oder weitere Genveränderungen in GNB3 oder Kombinationen der genannten Allele (Haplotypen) sind dadurch charakterisiert, daß in ihren Körperzellen eine durch Genanalyse vorhersagbar gesteigerte oder verminderte Signaltransduktion über heterotrimere G- Proteine stattfindet (S. Virchow, N. Ansorge, D. Rosskopf, H. Rübben, and W. Siffert. The G protein ß3 subunit splice variant Gß3-s causes enhanced chemotaxis of human neutrophils in response to interleukin-8. Naunyn Schmiedebergs Arch . Pharmacol . 360 (l):27-32, 1999. S. Virchow, N. Ansorge, H. Rübben, G. Siffert, and W. Siffert. Enhanced fMLP-stimulated chemotaxis in human neutrophils from individuals carrying the G protein ß3 subunit 825 T-allele. FEBS Lett . 436 (2):155-158, 1998. W. Siffert, D. Rosskopf, G. Siffert, S. Busch, A. Moritz, R. Erbel, A. M. Sharma, E. Ritz, H. E. Wichmann, K. H. Jakobs, and B. Horsthemke. Association of a human G- protein ß3 subunit variant with hypertension. Na t . Genet . 18 (1) :45-48, 1998) .
Der Genstatus läßt sich mittels geeigneter, dem Fachmann bekannter Verfahren nachweisen. Die Prädisposition für bestimmte Erkrankungen, bei denen eine gesteigerte oder verminderte G-Proteinaktivierung bedeutsam ist, kann sich über unterschiedliche Mechanismen vollziehen. a) Menschen, bei denen eine oder mehrere der genannten Genveränderungen auftreten, bilden vermehrt Spleißvarianten des Gß3-Proteins, z.B. die früher beschriebenen Varianten Gß3s und Gß3s-2, welche in früheren Patentanmeldungen beschrieben wurden. Solche Spleißvarianten mit höchstens 6 WD-Repeats kommen als funktionsfähige Proteine in menschlichen Zellen vor und lassen sich in einer Vielzahl von Expressionssystemen mittels geeigneter Vektoren exprimieren, z.B. in HEK-TS- Zellen. G-Protein ßγ-Untereinheiten können mit einer Vielzahl von zellulären Effektorsystemen biochemisch interagieren, z.B. mit Ionenkanälen, Phospholipase C - Isoformen, der PI3-Kinase, der Adenylylzyklase etc. (N. Gautam, G. B. Downes, K. Yan, and 0. Kisselev. The G- protein ßγ complex. Cell Signal . 10 (7):447-455, 1998). Die genannten Spleißvarianten interagieren verstärkt mit solchen Proteinen, wie in Fig. 2 anhand der Aktivierung der MAP-Kinase dargestellt ist.
Zunächst werden HEK-Zellen mit einem Hämagglutin- markierten MAP-Kinase-Konstrukt (HA-erk) transfiziert , wobei das Hämagglutinin der spezifischen Präzipitation des Konstrukts durch spezifische Antikörper dient. Nachfolgend wird untersucht, ob die Gß3s-Spleißvariante im Vergleich zum Wildtyp (Gß3) eine verstärkte Aktivierung der MAP-Kinase bewirkt. Dazu werden die Zellen des Expressionssystems zusätzlich mit Vektoren, die für Gß3-sl oder Gß3 kodieren, transfiziert . Die Quantifizierung der Aktivierung der MAP-Kinase erfolgt nach Immunpräzipitation unter Verwendung dem Fachmann bekannter, biochemischer Standardverfahren. Nach Immunpräzipitation erkennt man eine deutlich gesteigerte Aktivierung der MAP-Kinase bei Co-Transfektion mit Gß3-sl, die nahezu doppelt so stark ist wie die Aktivierung nach Co-Transfektion mit Gß3-Wildtyp. Die zugrundeliegenden Verfahren der Transfektion und der Nachweis der Aktivierung solcher Proteine durch Immunpräzipitation erfolgt hier mit Standardverfahren, die dem Fachmann geläufig sind. Das Ergebnis zeigt, daß solche Spleißvarianten von Gß-Proteinen mit nur 6 WD -Repeats bestimmte Interaktionspartner verstärkt zu aktivieren vermögen. Hieraus ergibt sich die Konsequenz, daß z.B. Chemikalien identifiziert und Pharmaka entwickelt werden, welche die Interaktion von Gßγ-Dimeren, welche Gß3s oder Gß 3s-2 enthalten, mit solchen Effektorproteinen oder anderen biochemisch definierten Interaktionspartnern (Enzyme, Ionenkanäle, etc.) spezifisch beeinflussen. Solche Pharmaka können daher eine verstärkte Interaktion dieser Spleißvarianten mit Effektorproteinen hemmen oder reduzieren und damit zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheitszuständen eingesetzt werden. Das genannte Verfahren lässt sich auf beliebige andere Interaktionspartner von Gßγ -Untereinheiten erweitern. Zudem können unterschiedliche zelluläre
Transfektionssysteme (Bakterien, Hefen oder Säugerzellen) und eine Vielzahl unterschiedlicher Vektoren zum Einsatz kommen, welche dem Fachmann geläufig sind. Daneben kann zur Identifikation neuer Interaktionspartner das dem Fachmann bekannte Yeast-Two-Hybrid -System oder ähnliche Systeme zum Einsatz kommen.
Im dargestellten Beispiel erfolgt damit die Identifikation geeigneter Drug-Targets durch die Untersuchung der Interaktion von Gß3s und Gß3s2 mit bekannten biochemischen Interaktionspartner und/oder Reaktionswegen .
b) Daneben bewirkt die Signaltransduktion über heterotrimere G-Proteine nicht nur eine direkte Interaktion von α- und ßγ-Untereinheiten mit spezifischen Komponenten der intrazellulären Signaltransduktion, welche zu einer schnellen Beeinflussung von Effektorsystemen einer Zelle führen, die keiner Transkription von Genen bedarf, z.B. das Öffnen oder Schließen von Ionenkanälen (P. Kofuji, N. Davidson, and H. A. Lester. Evidence that neuronal G-protein-gated inwardly rectifiying K+ Channels are activated by Gßγ subunits and function as heteromultimers . Proc . Natl . Acad. Sei . USA 92:6542-6546, 1995). Vielmehr ist auch bekannt, daß eine G-Proteinvermittelte Signaltransduktion die Transkription einer Vielzahl von Genen aktivieren oder hemmen kann. So führt beispielsweise die Expression definierter, konstitutiv aktiver G-Protein -α-Untereinheiten zu einer verstärkten Aktivierung des Prolactin-Promoters (J. Tian, J. Chen, and C. Bancroft. Expression of constitutively active G3 a- subunits in GH3 pituitary cells stimulates prolactin Promoter activity. J. Biol . Che . 269:33-36, 1994). G-Protein - ßγ-Untereinheiten kontrollieren daneben die Translokation weiterer Effektoren in den Zellkern, welche dann dort die Transkription kontrollieren können (Metjian A, Roll RL, Ma AD, Abrams CS : Agonists cause nuclear translocation of phosphatidylinositol 3-kinase gamma . A Gßγ-dependent pathway that requires the pllOgamma amino terminus. J Biol Chem 1999 Sep 24 ; 274 (39) : 27943 -7) . Eine vermehrte Aktivierbarkeit von G-Proteinen, die bei Trägern des GNB3 825 V -Allels und weiterer Polymorphismen und Haplotypen von GNB3 vorliegt und durch Genanalyse nachgewiesen werden kann, führt damit zu einer vermehrten Hemmung bzw. Suppression der Transkription bestimmter Gene. Damit wird es ermöglicht, durch Genotypisierung eine differentielle Genaktivierung (quantitativ oder qualitativ) zu erfassen und nach Identifizierung der vermehrt, vermindert oder differentiell exprimierten Gene und nach Identifizierung der kodierten Genprodukte (zum Beispiel Proteine) neue Drug-Targets zu identifizieren und definieren. Anhand zweier Beispiele erfolgt eine Beschreibung des dazu technisch erforderlichen Vorgehens.
Beispiel 1:
Es wurde von dem Anmelder bereits früher beschrieben (vgl. PCT/EP99/06534) , daß Genveränderungen im Gen GNB3 mit einer beschleunigten Progression zur AIDS-Erkrankung assoziiert sind, wobei bei diesen Personen ebenfalls eine gesteigerte Vermehrung von human immunodeficieny Virus zu beobachten ist. Dieser Effekt wird damit durch eine gesteigerte Aktivierbarkeit heterotrimerer G-Proteine hervorgerufen. Zur Identifizierung neuer Gene oder vermehrt bzw. vermindert transkribierte Gene kann nun beispielsweise das folgende Verfahren zum Einsatz kommen, welches schematisch in Fig. 3 dargestellt ist.
In Fig. 3 der Zeichnung ist eine Strategie zur Findung neuer Drug-Targets basierend auf der Genotypisierung am GNB3-Locus dargestellt. Beispielhaft ist das Vorgehen dargestellt, das zur Entwicklung neuer Medikamente gegen die HIV-Erkrankung eingesetzt werden kann. Hierzu werden Zellen von 825T-Allelträgern und 825C-Allelträgern mit HI-Virus inokkuliert und die Virusvermehrung wird quantifiziert. Bei 825T-Allelträgern wird eine verminderte Virusreplikation gefunden. Aus den infizierten Zellen von 825T- und 825C-Allelträgern wird die totale mRNA extrahiert und in cDNA umgeschrieben. Anschließend erfolgt eine vergleichende quantitative und qualitative Analyse der Genexpression. Da die Gene 3,4, und 5 gleichermaßen exprimiert werden, scheiden deren Genprodukte als Drug-Targets aus. Hingegen sind die unterschiedlich exprimierten Gene 1 und 2 potentielle Drug-Targets. Deren Genprodukte werden identifiziert, und diese können dann für ein drug screening eingesetzt werden.
Zunächst werden zur Herstellung eines Expressionsystems
T-Lymphozyten, zum Beispiel CD4+-positive T-Lymphozyten, oder Makrophagen von homozygoten 825C- oder 825T- Allelträgern isoliert und in Kultur gebracht. Anschließend erfolgt eine Infektion mit HI-Virus (T-oder M-trope Viren) oder geeignete Laborstämme. Nach dieser Infektion kommt es zu einer Vermehrung solcher Viren, was mittels dem Fachmann bekannten Verfahren quantifiziert werden kann, z.B. über quantitativen Nachweis des Virusgenoms mittels RT-PCR, Northern Blot-Analyse oder Nachweis von p24-Antigen. Hierbei zeigt sich, daß eine reduzierte Vermehrung von HI-Virus in Zellen homozygoter 825T-Allelträger in vi tro zu beobachten ist. Daraus läßt sich schlußfolgern, daß bei Vorliegen einer gesteigerten Signaltransduktion die HI -Virusreplikation in vi tro vermindert ist, was durch eine differentielle Aktivierung und Transkription von Genen bei Zellen von 825T- Allelträgern im Gegensatz zu 825C-Allelträgern verursacht wird. Techniken zur Identifizierung der relevanten Gene, die vermehrt, vermindert oder differentiell aktiviert werden sind dem Fachmann geläufig. Hierzu können z.B. quantitative RT-PCR-Verfahren, Northern-Blot Analysen, Hybridisierung auf DNA-Chips nach reverser Transkription, Differential Display etc. eingesetzt werden. Somit können Gene und Genprodukte identifiziert werden, welche bei Vorliegen eines definierten Genotyps oder Haplotyps des Gens GNB3 die Vermehrung des HI-Virus beeinflussen. Nach Identifizierung der Genprodukte können Chemikalien, mithin Pharmaka, entwickelt werden, welche die Transkription der entsprechenden Gene, deren Expression oder die Funktion deren Genprodukte in der gewünschten Weise beeinflussen. Somit ist es Gegenstand der Erfindung, über die Feststellung des Genstatus am GNB3- Locus neue Drug-Targets zu entwickeln.
Beispiel 2 :
Es ist bekannt, daß 825T-Allelträger ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von Übergewicht und Adipositas aufweisen (W. Siffert et al . : Worldwide ethnic distribution of the G protein ß3 subunit 825T allele and its association with obesity in Caucasian, Chinese, and Black African individuals. J.Am. Soc .Nephrol . 10 (9):1921- 1930, 1999) . Dabei kommt es bei den Betroffenen zu einer starken Vermehrung des Köperfetts (R. A. Hegele, C. Anderson, T. K. Young, and P. W. Connelly. G-protein ß3 subunit gene splice variant and body fat distribution in nunavut inuit. Genome Res. 9 (10) : 972-977, 1999). Die Fettzellen von 825T-Allelträgern weisen dabei eine verstärkte Neigung zur Fettakkumulation und eine verminderte Lipolyse auf, und deren Praadipozyten zeigen eine verstärkte Tendenz zur Proliferation und zur terminalen Differenzierung. Zur Identifikation der für diese Prozesse verantwortlichen Gene werden Praadipozyten bzw. Adipozyten nach Genotypisierung entsprechender Probanden mittels Standardverfahren zur Bildung eines Expressionssystems in die Zellkultur eingebracht. Beispielsweise kann die terminale Differenzierung zu Adipozyten bzw. eine Hemmung der Lipolyse durch Zugabe von Insulin ins Kulturmedium mit bewirkt werden. Aus den Praadipozyten oder Adipozyten von 825C- oder 825T- Allelträgern kann die quantitativ unterschiedliche oder differentielle Expression von Genen beispielsweise nach reverser Transkription der mRNA zu cDNA mittels quantitativer PCR-Verfahren, Northern-Blot-Verfahren, Differential Display, Hybridiserung an DNA-Chips oder ähnlicher, geeigneter und dem Fachmann bekannter Techniken untersucht werden. Die Identifikation beispielsweise bei 825T-Allelträgern vermehrt oder differentiell exprimierter Gene führt nach Identifikation der Genprodukte zur Definition solcher "Drug-Targets", deren Hemmung durch geeignete Pharmaka der gesteigerten Adipogenese bzw. der verminderten Lipolyse entgegenwirkt. Diese können dann therapeutisch zur medikamentösen Behandlung der Adipositas eingesetzt werden.
Mithin stellt die erfindungsgemäße Verwendung der Genotypisierung am GNB3 Locus und Verwendung und Nachweis der beschriebenen Varianten und Haplotypen ein neues Verfahren dar, um die für die Entstehung sämtlicher der der genannten Erkrankungen zusätzlich verantwortliche Proteine, Gene und deren Genprodukte zu identifizieren und geeignete Pharmaka für deren Therapie zu entwickeln. Die unter a) und b) beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der Ak ivi.erbarkeit von Interaktionspartnern oder Genen die in ihrer Transkription beeinflußt werden läßt sich von dem Gen für die ß3-Untereinheit der humanen G-Proteins auf andere Gene übertragen.
Ferner betrifft die Erfindung die folgenden Lehren:
• Ein Gen das die dargestellte Intronsequenz von Intron 9 und Intron 10 mit allen möglichen Permutationen enthält, zwecks Einbringen des Gens in menschliche oder nicht-menschliche Zellen oder Geweben zum Herbeiführen des alternativen Spleißens und zur Expression der Spleißvarianten mit dem Ziel, eine gesteigerte Signaltransduktion hervorzurufen.
• Die Herstellung von Antisense-Konstrukten oder Medikamenten gegen die dargestellte Intronstruktur mit dem Ziel, alternatives Spleißen zu verhindern.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer Genveränderung im Gen für die ß3- Untereinheit des humanen G-Proteins, wobei im Exon 9 an Position 657 in Anlage 1 eine Substitution von Adenin durch Thymin vorliegt und/oder wobei im Exon 10 an Position 814 in Anlage 1 eine Substitution von Guanin durch Adenin vorliegt und/oder wobei im Promotorbereich an Position (-350) in Anlage 1 eine Substitution von Adenin durch Guanin vorliegt und/oder wobei im Intron 9 an Position 3882 in Anlage 1 eine Substitution von Adenin durch Cytosin vorliegt und/oder wobei im Intron 9 an Position 5177 in Anlage 1 eine Substitution von Guanin durch Adenin vorliegt und/oder wobei im Intron 9 an Position 5249 in Anlage 1 eine Substitution von Guanin durch Adenin vorliegt und/oder wobei im Intron 10 an Position 6496 in Anlage 1 ein Insert bestehend aus den Nukleotiden Cytosin-Adenin-Cytosin-Adenin vorliegt, zur Vorhersage physiologischer und pathophysiologischer Abläufe im menschlichen Körper.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß das Risiko für eine Erkrankung ermittelt wird.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß ein Erkrankungsverlauf vorhergesagt wird.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß das die Ansprechbarkeit eines Probanden auf Pharmaka vorhergesagt wird.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß die bei einem Probanden auftretenden Nebenwirkungen bei der Verabreichung eines Pharmakons vorhergesagt werden.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß im Exon 10 an Position 825 in Anlage 1 eine Substitution von Cytosin durch Thymin vorliegt und/oder daß im Exon 11 an Position 1429 in Anlage 1 eine Substitution von Cytosin durch Thymin vorliegt.
7. Verwendung von mindestens zwei Expressionssystemen mit zumindest unterschiedlichen Anteilen abweichender Ausprägung eines oder mehrerer Gene, wobei die Aktivierbarkeit eines Interaktionspartners der von den unterschiedlich ausgeprägten Genen codierten Proteine abhängig von der Ausprägung der Gene durch den Vergleich der Aktivierung des Interaktionspartners in den Expressionssystemen bestimmt wird.
8. Verwendung nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß die als abhängig von der Ausprägung der Gene aktivierbar identifizierten Interaktionspartner als Drug Target verwendet werden.
9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß beide Expressionssysteme mit mindestens einem Interaktionspartner der von den unterschiedlich ausgeprägten Genen codierten Proteine transfiziert oder injiziert werden.
10. Verwendung von mindestens zwei Expressionssystemen, insbesondere von Zellen, mit zumindest unterschiedlichen Anteilen abweichender Ausprägung eines oder mehrerer Gene, wobei die Transkription von anderen Genen abhängig von der Ausprägung der unterschiedlich ausgeprägten Gene durch den Vergleich der Transkription in den Expressionssystemen bestimmt wird.
11. Verwendung nach Anspruch 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß die eine Transkription abhängig von den unterschiedlich ausgeprägten Genen aufweisenden Gene als Drug Target verwendet werden.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß als unterschiedlich ausgeprägtes Gen das Gen für die ß3- Untereinheit des G-Proteins verwendet wird.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 12, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß es sich bei den Expressionssystemen um humane Expressionssystemen handelt.
14. Verwendung nach eine_m der Ansprüche 7 bis 13, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß die Expressionssysteme chemisch, z.B. hormoneil, oder physikalisch stimuliert werden.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 14, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß die Expressionsysteme durch Krankheitserreger, z.B. Viren, infiziert werden.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 15, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, d a ß die unterschiedliche Ausprägung der Gene durch Transfektion oder Injektion hergestellt wird.
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