WO2001057211A1 - Proteine recepteur de lymphocyte t soluble et procede d'elaboration - Google Patents

Proteine recepteur de lymphocyte t soluble et procede d'elaboration Download PDF

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cell receptor
chain
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Tekehiko Sasazuki
Yoshinori Fukui
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Japan Science And Technology Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a protein that can be applied to disease state analysis, treatment or prevention of a disease involving an immune response, and in particular, to a soluble ⁇ -cell receptor (T) having extremely high affinity for an MHC-peptide complex (CR) Regarding proteins and how to make them.
  • T soluble ⁇ -cell receptor
  • CR MHC-peptide complex
  • the immune response is an essential defense mechanism of the organism against microbial infections such as bacteria, viruses, fungi, or parasites, and consists of a chain and a ⁇ -cell receptor (hereinafter referred to as TCR and (May be abbreviated in some cases) by recognizing an antigenic peptide bound to major histocompatibility complex (MHC).
  • TCR ⁇ -cell receptor
  • MHC major histocompatibility complex
  • an object of the present invention is to specifically target the MHC_peptide complex serving as a ligand. Interact and, as a result, establish a high-affinity soluble TCR5 that can directly isolate and identify the MHC-peptide complex.
  • the present inventors have found that the splice chain and the five-chain certainly form a heterodimer and multimerize when interacting with the MHC-peptide complex.
  • the present inventors have devised the present invention by devising a genetic engineering technique capable of producing an extracellular domain of a TCR that is constructed so as to be capable of performing the above-mentioned steps.
  • the extracellular domain of the heavy chain and / or the? Chain is a heterodimerized soluble T cell receptor protein, wherein one of the extracellular domains of the heavy chain and the?
  • a basic leucine zipper peptide is linked to the carboxyl terminus of the protein, and an acidic leucine zipper peptide is linked to the other carboxyl terminus.
  • a soluble T cell receptor is provided in which the cysteine residue is located.
  • the soluble T cell receptor protein of the present invention is used by binding to a magnetic bead in which the cysteine residue at the end of the lipoxyl is biotinylated, for example, coated with streptavidin.
  • the present invention provides a method for producing the above-mentioned soluble T cell receptor protein.
  • a DNA encoding the extracellular domain of the heavy chain is introduced into a first vector having a DNA encoding one of a basic leucine zipper peptide and an acidic leucine zipper peptide
  • First gene construct in which DNA encoding either basic leucine dipeptide peptide or acidic leucine zipper peptide is linked to the 3 'side of DNA encoding the extracellular domain of the heavy chain.
  • DNA encoding the extracellular domain of the // chain into a second vector having DNA encoding the other of the basic leucine zipper peptide and the acidic leucine zipper peptide.
  • the basic leucine zipper on the 3 'side of the DNA encoding the extracellular domain of the? Prepare a second gene construct in which DNA encoding the other of the perpeptide and the acid leucine zipper peptide is ligated. At this time, a cysteine residue is encoded at the carboxyl terminus of basic leucine zipper peptide or acidic leucine gut.
  • the soluble T cell receptor protein is expressed using the first gene construct and the second gene construct thus obtained.
  • FIG. 1 shows the structure of a vector used to prepare the soluble T cell receptor protein of the present invention.
  • FIG. 2 schematically shows the structure of the soluble T cell receptor protein of the present invention.
  • FIG. 3 shows the results of analysis performed to examine the structure of the soluble T cell receptor protein of the present invention.
  • FIG. 4 shows the results of surface plasmon resonance measurements performed to investigate the interaction between the T cell receptor protein of the present invention and the MHC-peptide complex.
  • FIG. 5 shows the results of experiments for isolating and purifying MHC-peptide complex-expressing cells using the soluble T cell receptor protein of the present invention.
  • FIG. 6 shows the results of an experiment using a soluble T cell receptor protein of the present invention to identify a peptide recognized by the protein.
  • leucine zipper leucine zipper peptide
  • the acidic leucine zipper peptide which is mainly composed of an acidic amino acid and has an overall negative charge, between the leucine (L) that appears for each amino acid, and the basic amino acid that is present, and has an overall positive charge
  • This structure is capable of forming a heterodimer by binding to a basic leucine zipper peptide.
  • Many sequences are known in addition to the leucine zipper consisting of the amino acid sequence shown in FIG. 1 (eg, Current Biology). (1993) 3: 658-667).
  • any leucine zipper capable of forming a heterodimer by combining a basic leucine zipper peptide and an acidic leucine zipper peptide can be used, and is not particularly limited.
  • the soluble T cell receptor protein of the present invention comprises a leucine zipper peptide as described above at the carboxyl terminus of the extracellular domain of TCR o: chain and three chains (domains from which transmembrane and intracellular regions have been excised). Is created by expressing TCR o :? using a pair of linked gene constructs. That is, by introducing DNA encoding the extracellular domain of the heavy chain into the first vector having DNA encoding either the basic leucine zipper peptide or the acidic leucine zipper peptide, Prepare a first gene construct in which one of basic leucine zipper peptide and acidic leucine zipper peptide is ligated on the 3rd side of the DNA encoding the extracellular domain of the heavy chain.
  • TCR heavy chain or /? Chain In the actual operation, it encodes the extracellular domain of the TCR heavy chain or /? Chain. Is amplified by PCR (polymerase chain reaction), and the DNA encoding the basic leucine zipper peptide is introduced into an appropriate vector (for example, pBluescript available from Stratagene) as described above. Subcloning is carried out via a suitable linker sequence into an acidic vector into which a basic vector or a DNA encoding an acidic leucine zipper peptide has been introduced. After further subcloning the pair of gene constructs thus obtained, T cells are cultured by culturing an appropriate host cell co-transfected with these gene constructs. A soluble T-cell receptor protein with the cell receptor heavy chain and 5-chain extracellular domain bound is expressed.
  • an appropriate vector for example, pBluescript available from Stratagene
  • the protein is expressed in high yield and undergoes sugar chain modification. For this reason, it is preferable to transfect insect cells using a baculovirus vector as an expression vector.
  • a preferred baculovirus vector is p FastBacl (commercially available from Gibco BRL, USA). By combining this vector with DH10Bac Escherichia coli (Gibco BRL), homologous recombination usually performed in insect cells can be performed in Escherichia coli, and the plaque assay can be omitted.
  • a preferred example of the host cell is Sf9 cell (commercially available from In vitrogen).
  • the obtained T cell receptor protein is purified by a suitable purification means, for example, affinity chromatography using a monoclonal antibody against the heavy chain or the negative chain of TCR.
  • FIG. 2 schematically shows the structure of the T cell receptor protein obtained by the present invention.
  • a feature of the soluble TCR5 protein of the present invention is that a cysteine residue is introduced at the carboxyl terminus of one of the leucine gut sequences, so that it can be specifically biotinylated.
  • the soluble TCR protein of the present invention in which the carboxyl-terminal cysteine residue is biotinylated, has an extremely slow dissociation rate when interacting with the MHC-peptide complex by binding to streptadipin. It exhibits an extremely high affinity for the MHC-peptide complex, which is incomparable with those reported hitherto (see Example 4 below). This is because the biotinylated soluble TCR-h / 5 of the present invention is multimerized (maximum tetramerization) by specifically binding to streptadipin via biotin, and forms an MHC-peptide complex. It is presumed to be due to the interaction.
  • the biotinylated soluble T cell receptor protein of the present invention when carried on a suitable carrier together with streptavidin, specifically interacts with the MHC-peptide complex to isolate the complex. It can be used as an active substance.
  • beads in which the biotinylated soluble T cell receptor protein of the present invention is bound to the surface of streptavidin-coated magnetic beads can be used to bind a specific MHC-peptide complex targeted by the TCR.
  • Expressing cells can be purified or isolated (see Example 5 below), and by screening such beads for antigenic peptides covalently linked to MHC, the cells are recognized by the TCR.
  • the peptide can be identified by simply performing sequence analysis of the PCR product (see Example 6 below).
  • mouse MH C class is II molecule I one A b to peptide E monument 5 2 - 6 8 ( hereinafter, p E may be human abbreviation) is I one a b _p E a complex bound is (Rudensky, A. others, Nature 353, 660-662 (1991) ; Fukui, Y. others, Immunity 6 , 401-410 (1997)).
  • Soluble I one A b - p E shed complex I _A b - After mass culture using p E shed CH 0 that expressed the complex (Chinese hamster ovary) cells rollers one bottle, the pellet of cells lysis buffer and solubilized with (1% NP 40, PB S containing various protease one peptidase inhibitor), Y 3 P (Jane way an anti-I _A b antibody, CA others, J. Immunol. 132, 662- 669 (1984)).
  • T CR monument / are using, the above-mentioned I- recognize peptide p E monument bound to A b N 3 -? 5 and named T CR monument / a (Gyotoku, T. other, Eur. J. Immunol. 28: 4050-4061, 1998).
  • the extracellular domain of the N3-5 TCR heavy chain (the amino acid sequence thereof is SEQ ID NO: 3; see below) and the extracellular domain of the cDNA and /? Chain (the amino acid sequence of which is SEQ ID NO:
  • the cDNA encoding the following was amplified by the PCR method.
  • the nucleotide sequence of the primer used for PCR is as follows.
  • N 3-5 T CR heavy chain MRPVTCSVLVLLLMLRRSNGDSVTQTEGLVTVTEGL GAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPC (SEQ ID NO: 3).
  • the PCR product thus obtained was introduced into a basic vector or an acidic vector having a basic or acidic leucine zipper sequence to which a linker sequence was linked, respectively. That is, as shown in FIG. 1, a PCR product of DNA encoding the extracellular domain of the N3-5 TCR heavy chain is encoded by the amino acid sequence SSADLVPRGS TTAPSAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQC (SEQ ID NO: 2). Encoding the amino acid sequence SSA DLVPRGSTTAPSAQLEKELQALQKENAQLEWELQALEKELAQ (SEQ ID NO: 1) into the basic pBluescript vector containing NA and the PCR product of DNA encoding the extracellular domain of the N3-5 TCR?
  • C in Fig. 3 shows the purified product as H28 (anti-TCR heavy chain monoclonal antibody), H57-597 (anti-TCR-chain monoclonal antibody) and L243 (anti-HLA-DR monoclonal antibody) as a control.
  • This figure shows the detection results by ELISA using (obtained from ATCC). It is shown that the purified product obtained as described above binds to both H28 and H57-597. As a result, it was confirmed that the splice chain and / or the? -Chain were heterodimerized.
  • the yield of the soluble N 3-5 TCR cell 5 thus obtained was about 500 g from 1 L of Hi-5 cell culture supernatant, which was very good.
  • the purified cysteine residue at the carboxyl terminus of the heavy chain was specifically biotinylated by reacting the purified soluble N 3-5 TCR protein with EZ-link TM Biotin-BMCC (Pierce) at room temperature for 8 hours. After the reaction, unbound biotin was removed by centrifuging the sample using Centicon-50 (Millipore). After incubating N3-5 TCR with the carboxyl terminal biotinylated in this manner with streptavidin, the mixture was subjected to gel filtration using Superdex-2000 (manufactured by Amersham Pharmacia). The results are shown in Fig. 3D.
  • a is a tetramerized or trimerized TCR protein
  • b is a dimerized TCR protein
  • c is a monomeric TCR protein
  • d is streptavidin. It is a peak corresponding to that. From the results shown in this figure, it is understood that most of the biotinylated soluble N 3-5 TCR is multimerized by specifically binding to streptavidin via biotin.
  • the magnetic beads encoding streptavidin were incubated with the soluble N3-5 TCR, which had been phosphorylated as described in the Examples, to provide N3-5 TCR. Coated magnetic beads were prepared. The adsorption of the TCR to the magnetic beads was confirmed by flow cytometry observation of the magnetic beads stained with H57-597 to which FITC was bound.
  • Figure 5A shows the cytometry profile before incubation (dashed area) and after incubation (solid line area).
  • I- A b - ⁇ ⁇ ; LB 2 7. 4 is a B cell line expressing complex (... Kappl er, other, Proc, Natl Acad Sci USA 79 , 3604-3607 (1982)) mixed with 9 ratio of: - the I- a b p E Facial M 1 is a cell line that does not express complex 2.
  • C 3 (Glimcher, LH another, J. Im munol 135, 3542-3550. ) and 1 The cells bound thereto were incubated for 8 days using magnetic beads coated with the above N3-5 TCR cells.
  • B of FIG. 5 is a Furosai sensitometric profiles related to expression of I one A b _p E uncomplexed in each cell line.
  • the peptide recognized by the protein is simply the sequence of its PCR (polymerase chain reaction) product. It indicates that it can be identified by analysis.
  • an antigen peptide recognized by a certain TCR protein is converted into a biotinylated soluble TCR protein according to the present invention, and the soluble TCR protein is After isolation of cells expressing the MH peptide complex, identification can be performed simply by sequencing the PCR product, eliminating the need for complicated analysis based on protein biochemistry.
  • a soluble T cell receptor protein having extremely high affinity for the MHC-peptide complex serving as its ligand can be easily obtained without impairing antigen specificity.
  • the soluble T cell receptor protein obtained by the present invention enables identification and isolation of an antigen peptide recognized by T cells infiltrating a lesion or cancer tissue of an immune disease patient. Yes, it is expected to contribute to the development of new drugs, treatments or prophylaxis that target it.

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Description

明 細 書 可溶性 T細胞受容体タンパク質およびその作成方法 技術分野
本発明は、 免疫応答が関与する疾病の病態解析、 治療または予防に応用するこ とができるタンパク質に関し、 特に、 MHC—ペプチド複合体に対してきわめて 高い親和性を有する可溶性 Τ細胞受容体 （T CR) タンパク質とその作成方法に 関する。
背景技術
免疫応答は、 細菌、 ウィルス、 真菌、 あるいは寄生虫といった微生物感染に対 する生体の必須の防御機構であり、 これはひ鎖と ?鎖から成る Τ細胞受容体 （以 下、 T CRひ ?と略称することがある） が主要組織適合抗原 （MH C) に結合し た抗原ペプチドを認識することにより惹起される。 この相互作用は、 抗体とその リガンドとの相互作用と比較して極めて低親和性であり、 特に解離速度が極めて 速いという特徴を有している。
自己免疫疾患、 移植に伴う拒絶や GvH病等免疫応答したための疾病の病態解 析およびその治療や予防は現代医学が解決を迫られている問題として、 クローズ アップされている。 これらの疾病は、 未知の抗原ペプチドに対する T細胞応答の 結果惹起されると考えられることにより、 原因となる抗原ペプチドが同定できれ ば抗原特異的に免疫応答を抑制することで、 その発症を制御し治療や予防に資す ることが可能である。 しかしながら、 上述したように、 丁〇1 ひ 5と1 11 ( _ぺ プチド複合体間の相互作用は、 極めて低親和性であるため、 仮に組織に浸潤して いる T細胞が発現している T CRひ 5を同定しても、 これが認識する MH C—ぺ プチド複合体を同定することは容易ではない。
そこで、 本発明の目的は、 リガンドとなる MH C _ペプチド複合体に特異的に 相互作用し、 その結果、 M H C—ペプチド複合体を直接単離、 同定し得る高親和 性可溶性 T C R ひ 5を樹立することにある。
発明の開示
本発明者は、 上記の目的を達成するために研究を重ねた結果、 ひ鎖と 5鎖が確 実にへテロダイマーを形成し且つ M H C—ぺプチド複合体と相互作用するに際し て多量体化 （multimerize) し得るように構成された T C R ひ ?の細胞外ドメイ ンを作成することができる遺伝子工学的手法を案出し、 本発明を導き出した。 かく して、 本発明に従えば、 ひ鎖および/?鎖の細胞外ドメインがヘテロダイマ —化された可溶性 T細胞受容体夕ンパク質であって、 ひ鎖および ?鎖の細胞外ド メインの一方のカルボキシル末端に塩基性ロイシンジッパーぺプチドが連結され、 他方のカルボキシル末端に酸性ロイシンジッパーぺプチドが連結されており、 塩 基性ロイシンジッパーぺプチドまたは酸性ロイシンジッパーぺプチドのいずれか のカルボキシル末端にシスティン残基が配置されている可溶性 T細胞受容体が提 供される。 好ましい態様として、 本発明の可溶性 T細胞受容体タンパク質は、 力 ルポキシル末端の前記システィン残基がピオチン化されており、 例えば、 ストレ ブトアビジンがコートされた磁気ビーズに結合させて使用する。
さらに、 本発明は、 上記の可溶性 T細胞受容体タンパク質を作成する方法を提 供する。 この方法においては、 塩基性ロイシンジッパーペプチドおよび酸性ロイ シンジッパーぺプチドのいずれか一方をコードする D N Aを有する第 1のべクタ —にひ鎖の細胞外ドメインをコードする D N Aを導入することにより、 ひ鎖の細 胞外ドメインをコ一ドする D N Aの 3 ' 側に塩基性ロイシンジツバ一ぺプチドぉ よび酸性ロイシンジッパーべプチドのいずれか一方をコードする D N Aが連結さ れた第 1の遺伝子コンス トラク トを調製する。 さらに、 塩基性ロイシンジッパー ぺプチドおよび酸性ロイシンジッパーぺプチドの他方をコードする D N Aを有す る第 2のべクタ一に/?鎖の細胞外ドメインをコ一ドする D N Aを導入することに より、 ?鎖の細胞外ドメインをコードする D N Aの 3 ' 側に塩基性ロイシンジッ パーペプチドおよび酸性ロイシンジッパーペプチドの他方をコードする D N Aが 連結された第 2の遺伝子コンストラク トを調製する。 この際、 塩基性ロイシンジ ッパ一ぺプチドまたは酸性ロイシンジツバ一のカルボキシル末端にシスティン残 基がコードされているようにする。 このようにして得られた第 1の遺伝子コンス トラク 卜と第 2の遺伝子コンストラク トを用いて前記可溶性 T細胞受容体タンパ ク質を発現させる。
図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の可溶性 T細胞受容体タンパク質を作成するのに用いられる ベクターの構造を示す。
第 2図は、 本発明の可溶性 T細胞受容体タンパク質の構造を模式的に示す。 第 3図は、 本発明の可溶性 T細胞受容体夕ンパク質の構造を調べるために行つ た分析結果を示す。
第 4図は、 本発明の T細胞受容体タンパク質と M H C—べプチド複合体との相 互作用を調べるために行った表面プラズモン共鳴による測定結果を示す。
第 5図は、 本発明の可溶性 T細胞受容体タンパク質を用いて M H C—ペプチド 複合体発現細胞を単離、 精製する実験結果を示す。
第 6図は、 本発明の可溶性 T細胞受容体タンパク質を用いて、 該タンパク質が 認識するぺプチドを同定する実験結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
可溶性 T C Rひ ^を得る目的で T C Rのひ鎖と/?鎖の細胞外ドメインを発現さ せることは従来も試みられていたが、 T C R ひ ?をその細胞外ドメインのみで発 現させると十分量のひ 5ヘテロダイマ一が回収できなかった。 これは一つに、 ひ 鎖と/?鎖の会合不全によると考えられる。 そこで、 本発明においては、 T C Rの ひ鎖および ?鎖の細胞外ドメインの C端 （カルボキシル末端） にロイシンジッパ —のアミノ酸配列を導入した。
既知のように、 ロイシンジッパー （ロイシンジッパーペプチド） とは、 数個の アミノ酸毎に現われるロイシン （L ) の間に、 主として酸性アミノ酸が存在し全 体的に負の電荷を示す酸性ロイシンジッパーぺプチドと、 主として塩基性アミノ 酸が存在し全体的に正の電荷を示す塩基性ロイシンジッパーべプチドとが結合し てへテロダイマ一を形成し得る構造であり、 図 1に例示するアミノ酸配列から成 るロイシンジッパーの他、 多くの配列が知られている （例えば、 Current Biology (1993) 3 ： 658-667参照）。 本発明においては、 塩基性ロイシンジッパーペプチド と酸性ロイシンジッパーべプチドが結合してヘテロダイマーを形成し得るいずれ のロイシンジッパーも使用でき、 特に限定されない。
本発明の可溶性 T細胞受容体夕ンパク質は、 T C R o:鎖および 3鎖の細胞外ド メイン （膜貫通領域および細胞内領域を切除したドメイン） のカルボキシル末端 に上記のようなロイシンジッパーぺプチドが連結された 1対の遺伝子コンス トラ クトを用いて T C R o: ?を発現させることによって作成される。 すなわち、 塩基 性ロイシンジッパーぺプチドおよび酸性ロイシンジッパーぺプチドのいずれか一 方をコードする D N Aを有する第 1のべクタ一に、 ひ鎖の細胞外ドメインをコ一 ドする D N A導入することにより、 ひ鎖の細胞外ドメインをコードする D N Aの 3， 側に塩基性ロイシンジッパーべプチドおよび酸性ロイシンジッパーぺプチド の一方が連結された第 1の遺伝子コンストラク トを調製する。 また、 塩基性ロイ シンジッパ一ぺプチドおよび酸性ロイシンジヅパ一ぺプチドの他方をコードする D N Aを有する第 2のべクタ一に、 ?鎖の細胞外ドメインをコードする D N Aを 導入することにより、 5鎖の細胞外ドメインをコードする D N Aの 3 ' 側に塩基 性ロイシンジッパーぺプチドおよび酸性ロイシンジヅパ一ぺプチドの他方が連結 された第 2の遺伝子コンストラク トを調製する。 ここで、 本発明において用いる 遺伝子コンストラク トの更なる特徴は、 前記のような塩基性ロイシンジッパーべ プチドまたは酸性ロイシンジッパーぺプチドをコ一ドする D N Aのいずれかの 3' 末端にシスティン残基をコ一ドするよう工夫されている点である。
実際の操作に当たっては、 T C Rのひ鎖または/?鎖の細胞外ドメインをコード する遺伝子 （D N A ) を P C R (ポリメラ一ゼチェインリアクション） によって 増幅した後、 適当なベクタ一 （例えば Stratagene社より市販の pBluescript) に 上記のように塩基性ロイシンジッパーぺプチドをコードする D N Aが導入された 塩基性ベクターまたは酸性ロイシンジッパーべプチドをコードする D N Aが導入 された酸性べクタ一に適当なリンカ一配列を介してサブクローニングする。 この ようにして得られた 1対の遺伝子コンストラク トを更にサブクロ一ニングした後、 これらの遺伝子コンス トラク トで共トランスフエクシヨン （coti'ansfection) さ れた適当な宿主細胞を培養することにより T細胞受容体のひ鎖および 5鎖の細胞 外ドメインが結合した可溶性 T細胞受容体タンパク質が発現される。 これらの操 作は、 当業者に周知の材料と手法を用いて実施することができ、 特に限定される ものではないが、 当該夕ンパク質が高収量で発現され且つ糖鎖の修飾を受ける等 の理由から、 発現べクタ一としてバキュロウィルスベクターを用い、 昆虫細胞を トランスフエクシヨンするのが好ましい。 例えば、 好ましいバキュロウィルスべ クタ一として p FastBacl (米国 Gibco BRLより巿販） が挙げられる。 このべク 夕一は、 DH 1 0 B a c大腸菌 （Gibco BRL) と組み合わせることにより、 通常 は昆虫細胞で行う相同組み換えを大腸菌で行うことが可能となり、 プラークアツ セィの手間を省略できる。 また、 宿主細胞として好ましい例は、 S f 9細胞 （In vitrogen社より市販） である。 得られた T細胞受容体タンパク質は、 適当な精製 手段、 例えば、 T C Rのひ鎖または/?鎖に対するモノクローナル抗体を用いるァ フィニティクロマトグラフィーに供されて精製される。
以上のような本発明の方法に従えば、 T C Rのひ鎖と^鎖のカルボキシル末端 にロイシンジッパー構造が連結されているのでそれらのひ鎖と 5鎖が効率よくへ テロダイマ一を形成し、 且つ、 ひ鎖と 3鎖のいずれかのカルボキシル末端にシス ティン残基を有する細胞外ドメインから成る可溶性 T C R ひ ?タンパク質が得ら れる。 図 2は、 本発明によって得られる T細胞受容体タンパク質の構造を模式的 に示したものである。 本発明の可溶性 T CRひ 5タンパク質の特徴は、 一方のロイシンジツバ一配列 のカルボキシル末端にシスティン残基が導入されていることにより、 ここを特異 的にピオチン化できることにある。 このようなカルボキシル末端のシスティン残 基がピオチン化された本発明の可溶性 T CRひ 5タンパク質は、 ストレプトアジ ピンと結合させることにより、 MH C—ペプチド複合体に相互作用するに際して 解離速度がきわめて遅く、 MHC—ペプチド複合体に対して、 従来から報告され ているものとは比肩できないきわめて高い親和性を発揮する （後述の実施例 4参 照）。 これは、 本発明のピオチン化可溶性 T CRひ /5が、 ピオチンを介してストレ ブトアジピンに特異的に結合することにより多量体化 （最大 4量体化） した状態 で、 MHC—ペプチド複合体と相互作用することに因るものと推察される。 かく して、 本発明のピオチン化可溶性 T細胞受容体タンパク質は、 適当な担体 にストレブトアビジンとともに担持されることにより、 MHC—べプチド複合体 に特異的に相互作用し該複合体を単離し得る作用物質として使用することができ る。 例えば、 ストレプトアビジンがコートされた磁気ビーズの表面に本発明のビ ォチン化可溶性 T細胞受容体夕ンパク質が結合されたビーズは、 該 T C Rが対象 とする特定の MH C—ぺプチド複合体を発現する細胞を精製または単離すること ができ （後述の実施例 5参照）、 さらに、 このようなビーズで、 MHCに共有結合 された抗原べプチドをスクリーニングすることにより、 該 T CRによって認識さ れるぺプチドは、 単にその P CR生成物の配列分析を行うことにより同定できる (後述の実施例 6参照）。
実施例
以下に本発明の特徴を更に明らかにするため実施例を示すが、 本発明はこの実 施例によって限定されるものではない。 例えば、 以下の実施例は、 T CRのひ鎖 および/?鎖の細胞外ドメインとしてマウス由来のものを使用した場合に沿って記 述しているが、 本発明はヒト由来のものを含むその他の各種の動物由来の可溶性 T CRひ ?夕ンパク質の作成にも同様に適用されることは当業者には自明であろ Ό。
実施例 1 ： MH C—ペプチド複合体の調製
本発明の可溶性 T CRひ ?タンパク質の特性を調べるために対象とした MH C —ぺプチド複合体は、 マウス MH Cクラス II分子である I一 Abにぺプチド Eひ 5 2 - 6 8 (以下、 p Eひと略称することがある） が結合した I一 Ab_p E a 複合体である （Rudensky, A.他、 Nature 353, 660-662 (1991) ； Fukui, Y.他、 Immunity 6, 401-410 (1997))。 可溶性 I一 Ab— p Eひ複合体は、 I _Ab— p Eひ複合体を発現した C H 0 (Chinese hamster ovary) 細胞をローラ一ボトル を用いて大量培養した後、 細胞のペレッ トを溶解バッファー （各種のプロテア一 ゼ阻害剤を含む 1 %NP 40、 PB S) で可溶化し、 抗 I _Ab抗体である Y 3 P (Jane way, C. A.他、 J. Immunol. 132, 662-669 (1984)) を用いたァフィ二 テイク口マトグラフィ一により精製することにより調製した。
実施例 2 ：可溶性 T CRひ ?の作成と同定
用いた T CRひ/?は、上述の I— Abに結合したぺプチド p Eひを認識する N 3 — 5と命名された T CRひ/?である （Gyotoku, T.他、 Eur. J. Immunol. 28 ： 4050-4061, 1998)。 この N 3— 5 T C Rのひ鎖の細胞外ドメイン （そのァミノ酸 配列を配列番号 ： 3とする。 下記参照） をコードする c DNAおよび/?鎖の細胞 外ドメイン （そのアミノ酸配列を配列番号： 4とする。 下記参照） をコードする cDNAを P CR法により増幅した。 P CRに用いたプライマ一の塩基配列は次 のとおりである。 ひ一センス、 AAGAATTCATGAACATGCGTCCTGTCACC (配 列番号： 9 )； ひ一アンチセンス、 TTGGATCCGCGCGGAACCAGGTCTGCTGA CGAACAGGGAACGTCTGAACTGGGGTA (配列番号： 1 0) ; ?—センス、 A AGAATTCATGCTGTACTCTCTCCTTGCC (配列番号 ： 1 1 ) ; ?—アンチセン CCAGGCCTC (配列番号： 1 2)。
N 3 - 5 T CRひ鎖： MRPVTCSVLVLLLMLRRSNGDSVTQTEGLVTVTEGL GAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPC (配列番号 ： 3)。
N3— 5 T CR ?鎖 ： MLYSLLAFLLGMFLGVSAQTIHQWPVAEIKAVGSPL
Figure imgf000010_0001
KVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSTWV GKEVHSGVSTDP KPVTQNISAEAWGRADC (配列番号： 4)。
このようにして得られた P CR生成物を、 それそれ、 リンカ一配列が結合され た塩基性または酸性ロイシンジッパー配列を有する塩基性ベクターまたは酸性べ クタ一に導入した。 すなわち、 図 1に示すように、 N 3— 5 T CRのひ鎖の細胞 外ドメインをコードする DN Aの P C R生成物を、 ァミノ酸配列 SSADLVPRGS TTAPSAQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQC (配列番号： 2) をコ —ドする D NAを含む塩基性 pBluescriptベクタ一に、 また、 N3— 5 T CRの ?鎖の細胞外ドメインをコ一ドする DNAの P CR生成物を、 アミノ酸配列 SSA DLVPRGSTTAPSAQLEKELQALQKENAQLEWELQALEKELAQ (配列番号 ： 1) をコードする D N Aを含む酸性 pBluescriptベクターに、 いずれも E c oR Iおよび B amH Iサイ ト （リンカ一配列にある） でクローニングした。 上記配 列から理解されるように、 この実施例では、 塩基性ロイシンジッパーペプチドの カルボキシル末端にシスティン残基が配置されている。
次に、 ロイシンジッパー配列を含むこれらの遺伝子コンストラク トを E c oR Iおよび N o t Iで切断してバキュロウィルスベクター p F a s t B a c 1にサ ブクローニングした後、 DH 10 BAC大腸菌内で相同組み換えを行うことにより、 2種類の発現べクタ一を調製した。 これらの発現べクタ一を S f 9細胞にトラン スフエクシヨンした後、 3日間培養し、 さらに H i— 5細胞 （Invitrogen) にて 増幅を行い、 その上清を抗 T 抗体である H 5 7— 5 97 (Kubo. R. T. 他、
J. Immunol. 142, 2736-2742 (1989)) を用いて精製した。
精製物を銀染色して S D S—PAGE分析に供したところ（第 3図の A参照）、 非還元下 （D T T—） で 80 KD (キロダルトン） の単一バンドが認められた。 このサンプルは加熱してもバンドサイズは変わらない （デ一夕示さず） 力 還元 下 （DTT+) では上記バンドの分子量は 4 1 KDに低下した。 ウエスタンプロ ッ ト分析によると、 80 KDおよび 4 1 KDのバンドはいずれも、 TCRひ鎖に 対するモノクローナル抗体である H 28 (米国 Stanford大学の Mark M. Davis 博士より供与される） に反応した （第 3図の B参照）。 これらのことから、 得ら れたタンパク質はひ鎖と 5鎖が会合したヘテロダイマ一として存在することが強 く示唆された。
同様の結論は、 E L I S Aを用いた解析結果からも導かれた。 第 3図の Cは、 精製物を、 H 28 (抗 T CRひ鎖モノクローナル抗体）、 H 57 - 597 (抗 T C R ?鎖モノクローナル抗体） および対照用として L 243 (抗 HLA— DRモノ クローナル抗体） （AT C Cより入手）を用いた E L I S Aによる検出結果を示す ものであるが、 上記のようにして得られた精製物は、 H 28および H 57— 59 7のいずれとも結合していることが示され、 ひ鎖と/?鎖がヘテロダイマー化して いることが確認された。 なお、 このようにして得られた可溶性 N 3— 5 T CRひ 5の収量は 1 Lの H i— 5細胞培養上清より約 500 gであり、 非常に良好で あった。
実施例 3 ： T CRひ ?タンパク質のビォチン化および多量体化
精製された可溶性 N 3— 5 T CRひ ?を E Z -link™Biotin-BMCC (Pierce 社製） と室温で 8時間反応させることでひ鎖カルボキシル末端のシスティン残基 を特異的にピオチン化した。 反応後、 サンプルを Centicon-50 (Millipore社製） を用いて遠心分離することにより未結合のピオチンを除去した。 このようにしてカルボキシル末端がピオチン化された N 3— 5 T CRひ ?をス トレプトアビジンとともにインキュベーションした後、 Superdex-2000 (Amers ham Pharmacia製） を用いるゲルろ過に供した。 その結果を第 3図の Dに示す。 図中、 aは 4量体化または 3量体化した T CRひ /?、 bは 2量体化した T CRひ β、 cは単量体の T CRひ ?、 dはス トレプトアビジンにそれそれ相当するピー クである。 この図に示される結果から、 ビォチン化された可溶性 N 3— 5 T CR は、 ビォチンを介してストレブトアビジンに特異的に結合することにより大 部分が多量体化することが理解される。
実施例 4 ： MH C—べプチド複合体に対する親和性試験
次に I _ Ab— ρ Εひ複合体に対する可溶性 N 3— 5 T CRひ ?の親和性を、 表面プラズモン共鳴装置 B I Acore2000 (Amersham Pharmacia) を用いた無 細胞系で検討した。
先ず、 比較としてピオチン化していない （したがって multimerizeしない） 可 溶性 T CRひ ?の親和性を調べるために、 非ピオチン化可溶性 N 3— 5 T CRひ ?をチォ一ルカヅプリング法にてセンサ一チップに 8000RUまで固定した後、可 容性 I _Ab— pEひ複合体を 1 0〃 1/mi nで 3分間注入した場合、 Koff (解 離定数） は 0. 176 s e c— 1であり t1/2 (半減期） は 3. 9秒であった （第 4 図の A；)。 この数値は、 これまでに報告されている MHCクラス 11/ペプチド複 合体と T CRひ ?の相互作用の結果とほぼ一致している。
これに対して、 ピオチン化した可溶性 T CRひ ?をストレプトアビジンをコー トしたセンサ一チップ上に 8,000RUまで固定した後、可溶性 I— Ab— p Eひ複 合体を 10〃 l/mi nで 3分間注入すると tI/2は 1 7. 5分、 Koffは 0. 00 065 9 s e c一1となり、 解離が顕著に遅くなることが示された （第 4図の B)。 また、 このピオチン化した （multimerize した） N 3— 5 T CRひ 5は、 Ε α 5 2— 68の TCRコンタク ト部位である 60位のロイシンをリジンに置換した 6 0 Kぺプチドを結合した I _Ab分子に対して明らかな結合を示さないことより、 抗原特異性を保持していることが示唆された （第 4図の C)。
実施例 5 ： MHC—ペプチド複合体発現細胞の精製
この実施例は、 本発明のピオチン可溶性 T CRタンパク質を用いれば、 MH C 一ペプチド複合体を発現する細胞を精製 （濃縮） または単離することができるこ とを示すものである。
先ず、 ス トレブ卜アビジンがコードされた磁気ビーズを、 実施例で記述したよ うにピオチン化された可溶性 N 3— 5 T CRひ ?とインキュベーションするこ とにより、 N 3— 5 T CRひ ?をコートした磁気ビーズを調製した。磁気ビーズ への該 T CRの吸着は、 F I T Cを結合させた H 5 7 - 5 9 7で染色した磁気ビ —ズをフローサイ トメ トリ一観察することにより確認した。 第 5図の Aに、 イン キュベーシヨン前 （破線域） およびインキュベーション後 （実線域） のサイ トメ トリープロフィルを示す。
次に、 I— Ab— ρΕ ο;複合体を発現する B細胞株である LB 2 7. 4 (Kappl er, 他、 Proc, Natl. Acad. Sci. USA 79, 3604-3607 (1982)) と I— Ab— p E ひ複合体を発現しない細胞株である M 1 2. C 3 (Glimcher, L. H. 他、 J. Im munol. 135, 3542-3550) とを 1 : 9の割合で混合し、 上記 N 3— 5 T C Rひ 5 をコ一トした磁気ビーズを用いて、 それに結合した細胞を 8日間ィンキュベ一シ ヨンした。第 5図の Bは、 各細胞株における I一 Ab_p Eひ複合体の発現に関す るフローサイ トメ トリープロフィルである。 また、 第 5図の Cは、 磁気ビーズと インキュベーション前 （左） およびインキュベーション後 （右） の B細胞株混合 物について I一 Ab— p Eひ複合体の発現をフローサイ トメ トリーで解析した結 果である。 なお、 これらのフローサイ トメ トリー観察においては、 各細胞株を I -Ab-p Eひ複合体に対するモノクローナル抗体で染色した。図に示されるよう に、 LB 2 7. 4の純度は 9. 4%から 97. 8%になっており、 ストレブトァ ビジンがコートされた磁気ビーズに本発明のピオチン化可溶性 T細胞受容体タン パク質をコートして用いることにより、 該ビーズに MH C—べプチド複合体が特 異的に吸着され該複合体を発現する細胞を精製することができる。
実施例 6 ：認識べプチドの同定
この実施例は、 本発明のピオチン化された可溶性 T細胞受容体夕ンパク質を用 いれば、 該タンパク質によって認識されるペプチドが、 単にその PC R (ポリメ ラ一ゼ連鎖反応） 生成物の配列分析を行うことによって同定できることを示すも のである。
MH C—ペプチド複合体を発現する実験系として、 各種ペプチド pEひ、 p 6 0K、 ρ 50 Vまたは pOVAを共有結合させた I一 Abを発現する CHO (Chi nese hamster ovary)細胞を用いた。 なお、 p 60 K、 p 50Vまたは p OVA は、いずれも ρ Εひと同様にリンカーを介して I一 Abに結合して複合体を形成す るように設計されており、 各名称は本発明者によって付けられたものである。 こ れらの MHC—ぺプチド複合体を発現する CHO細胞は、 具体的には "Kozono, Η.他、 Nature 369, 151-154 (1994)"の記述に従い、 第 4図の Aに示すように、 I一 Abの/?鎖の第 3番目と第 4番目のアミノ酸残基の間に、 リンカ一配列（図中、 下線を施している） を介して各ペプチドに相当するアミノ酸配列 （pEひ、 6 0K、 ρ 50 Vおよび ρ 0 VAについて、 それそれ、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7および配列番号： 8とする） をコードする遺伝子コンストラク トを、 I—Abのひ鎖をコードする遺伝子コンストラク トとともにエレクトロボ一 レ一シヨンによってトランスフエクシヨンすることによって調製した。
I—Ab—ペプチド複合体を発現するこれらの CHO細胞を混合し （I— Ab— p Eひ発現細胞 8. 5 X 103； I— Ab— 50 V発現細胞 2 105； I一 Ab— 6 0 K発現細胞および I— Ab— 0 VA発現細胞、 それそれ l x l 05)、 この CHO 細胞混合物から DN Aを抽出し、 PCRで増幅した後、 塩基配列を分析したとこ ろ、 当初の CHO細胞の混合比に応じて、 p 60K、 p 50Vおよび pOVAに 相当する P CR生成物が認められたが pEひに相当する P CR生成物は認められ なかった （第 6図の [=]参照）。 一方、実施例 5と同様にして、 可溶性 N 3 - 5 T CRひ ?がコートされた磁気 ビーズを調製した。 次に、 上記の CH0細胞混合物を PB S (0. 1 %FC S添 カロ）に懸濁し、 N 3— 5 T CRo; ?をコートした磁気ビーズとともに 4°Cで 2時 間インキュベーションし、 軽く遠心分離した後、 上記 PB Sで洗浄した。 この操 作を 3回繰り返すことによりビーズに吸着された細胞を R PM I 1 640培地 ( 10%F C S添加） 中で培養し、 培養物から DNAを抽出し、 P CRで増幅し た後、 塩基配列を調べた。 その結果、 分析した全てのクローンが pEひに相当す る配列をコードしていることが認められた （第 6図 Bの 参照）。なお、 この実 施例で述べた P CRにおいて用いたプライマーは次のとおりである ： ATGGTGT GTCTGAAGCTCCCT (配列番号： 1 3) および ACGTACTCCTCCCGGTTGTA G (配列番号： 14)。
この実施例の結果が示すように、 或る T CRタンパク質が認識する抗原ぺプチ ドは、その T CRを本発明に従いピオチン化された可溶性 T CRタンパク質とし、 この可溶性 T CRタンパク質を用いて当該 MH ぺプチド複合体を発現した細 胞を単離した後、 P CR生成物の塩基配列を行うだけで簡単に同定することがで き、 蛋白生化学に基づく煩雑な解析を必要としない。
産業上の利用可能性
以上のように、 本発明に従えば、 抗原特異性を損なわず、 そのリガンドとなる MHC—べプチド複合体に対してきわめて高い親和性を示す可溶性 T細胞受容体 タンパク質が容易に得られる。 本発明によって得られる可溶性 T細胞受容体タン パク質は、 免疫疾患患者の病巣や癌組織に浸潤している T細胞が認識する抗原べ プチドを同定したり単離することを可能とするものであり、 これを標的とした新 しい薬剤、 治療法または予防法の開発に資するものと期待される。

Claims

請求の範囲
1 · ひ鎖および 5鎖の細胞外ドメインがヘテロダイマー化された可溶性 T細胞 受容体夕ンパク質であって、 ひ鎖および/?鎖の細胞外ドメインの一方のカルボキ シル末端に塩基性ロイシンジッパーペプチドが連結され、 他方のカルボキシル末 端に酸性ロイシンジッパーべプチドが連結されており、 塩基性ロイシンジッパー ぺプチドまたは酸性ロイシンジッパーぺプチドのいずれかのカルボキシル末端に システィン残基が配置されていることを特徴とする可溶性 T細胞受容体。
2 . カルボキシル末端の前記システィン残基がビォチン化されていることを特 徴とする請求項 1の可溶性 T細胞受容体タンパク質。
3 . ストレブトアビジンがコートされた磁気ビーズに結合されて使用すること を特徴とする請求項 2の可溶性 T細胞受容体タンパク質。
4 . 請求項 1の可溶性 T細胞受容体タンパク質を作成する方法であって、 ひ鎖 または/?鎖の細胞外ドメインをコードする D N Aを、 塩基性ロイシンジッパーべ プチドまたは酸性ロイシンジッパーペプチドを有する第 1のベクターまたは第 2 のべクタ一に導入することにより、 ひ鎖の細胞外ドメインをコードする D N Aの 3 ' 側に塩基性ロイシンジヅパ一ぺプチドまたは酸性ロイシンジッパ一ぺプチド をコードする D N Aが連結された第 1の遺伝子コンストラク トと、 鎖の細胞外 ドメインをコ一ドする D N Aの 3， 側に塩基性ロイシンジッパーべプチドおよび 酸性ロイシンジッパーべプチドの他方をコ一ドする D N Aが連結された第 2の遺 伝子コンストラクトとを調製し、 この際、 塩基性ロイシンジッパーペプチドまた は酸性ロイシンジッパーべプチドのカルボキシル末端にシスティン残基がコード されているようにした第 1の遺伝子コンストラク トと第 2の遺伝子コンストラク トを用いて前記可溶性 T細胞受容体タンパク質を発現させることを特徴とする方 法。
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