WO2001053823A1 - Recherche ou dosage de perturbateurs endocriniens - Google Patents

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Takashi Minegishi
Kaoru Miyamoto
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting or quantifying environmental hormones, particularly dioxins, in a sample using granulosa cells or the like.
  • a change in the expression level of a luteinizing hormone (hereinafter referred to as LH) receptor induced by follicle stimulating hormone (hereinafter referred to as FSH) in granulosa cells is used as an index for detecting or quantifying dioxins.
  • LH luteinizing hormone
  • FSH follicle stimulating hormone
  • Dioxins are a general term for polychlorinated dibenzo-p-dioxin (PCDD) and its analogous substance, polychlorinated dibenzofuran (PCDF).
  • PCDD polychlorinated dibenzo-p-dioxin
  • PCDF polychlorinated dibenzofuran
  • a common method for detecting dioxins is to extract with an organic solvent such as methanol, purify by silica gel chromatography, concentrate again, and measure by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Chemistry, January, 38-43 (1999)].
  • a highly sensitive detection method that can be directly measured with an aqueous solution is not known.
  • detection in aqueous solution samples depends on the concentration of dioxins (the regulated value is 0.5 to 2.5 pg / L in wastewater), but the lower limit of quantification is 500 ng / L. It requires a large amount of sample of several to several tens of liters in terms of concentration (Q & A, Environmental Hormones and Dioxins I want to know more about, 1999).
  • Methods for detecting or quantifying dioxins by biological methods include the following methods: (1) an immunological analysis method of dioxin using an antibody (JP-A-62-272972, JP-A-63-14691, JP-A-1-288766, JP-A-11-75841, USP4798807, USP5429925, USP5674697, USP4238472), (2) Analysis method using aryl hydrocarbon (Ah) receptor which is said to be a target protein in the liver of dioxin or Methods for increasing Ah activity (JP-A-63-58163, JP-T-Hei-7-501883, USP4865972, USP5496703, USP5529899, USP5128244, USP5378822, USP5650283, W098 / 03676, USP5854010), (3) Stress promotion in mammals (4) A method of measuring cyclin kinase in cultured cells (W094 / 17413, W097 / 04316, USP5753519
  • the immunization method can only be used to detect dioxins of known structure, and the detection method using Ah receptor, the stress promoter, and the detection method using cyclokinase detect dioxin that induces liver damage or skin injury and carcinogenesis, respectively. These systems have not yet been put to practical use, nor are they systems for detecting dioxins that affect the endocrine system.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting or quantifying environmental hormones, particularly dioxins, in a sample with high sensitivity and simple operation.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have come to invent a method capable of detecting or quantifying environmental hormones in a sample with high sensitivity and easy.
  • the present invention includes the following (1) to (11).
  • a method for detecting or quantifying an environmental hormone in a sample comprising contacting the sample with an animal cell and measuring a change in the expression level of a luteinizing hormone (hereinafter referred to as LH) receptor in the animal cell. .
  • LH luteinizing hormone
  • animal cell is an animal cell selected from granulosa cells, ovarian capsular cells, and testicular Leydig cells.
  • animal cell is an animal cell derived from an animal selected from human, monkey, rat, mouse, guinea pig, and egret.
  • LH receptor is induced and expressed by substances selected from follicle-stimulating hormone (hereinafter referred to as FSH), insulin-like growth factor I (hereinafter referred to as IGF-1), and cyclic AMP (hereinafter referred to as cAMP) Any one of the above (1) to (4), which is a receptor.
  • FSH follicle-stimulating hormone
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • cAMP cyclic AMP
  • the environmental hormone is an environmental hormone selected from dioxins and polychlorinated biphenyls (hereinafter referred to as PCBs).
  • the sample is selected from food and drink, pesticides, waste incineration, and PCB products
  • a contraceptive method comprising suppressing expression of a luteinizing hormone receptor induced by follicle-stimulating hormone in granulosa cells.
  • a contraceptive containing as an active ingredient a substance that suppresses the expression of luteinizing hormone receptor.
  • the measurement of environmental hormones according to the present invention is characterized in that a sample is brought into contact with an animal cell and a change in the expression level of the LH receptor in the animal cell is measured.
  • any environmental hormone can be detected or quantified as long as the environmental hormone affects the expression level of LH receptor.
  • the environmental hormones include dioxins such as 1,3,7,8-tetrachloride dibenzo-P-dioxin (2,3,7,8-tetachlo lodiobenzo-pdiox in) and polychlorinated chlorides. Biphenyl (PCB) and the like.
  • the sample to be subjected to the present invention may be any sample as long as the presence of the above-mentioned environmental hormones is suspected. Examples thereof include foods and drinks, pesticides, waste products, PCB products and the like.
  • the sample suspected of containing the environmental hormone may be used as it is in the method of the present invention, but it may be dissolved, dispersed or emulsified in a medium such as lower alcohols such as methanol, ethanol and propanol, dimethyl sulfoxide and dimethylformamide. May be used.
  • the emulsification can be performed by a known method.
  • Any animal cell that expresses the LH receptor can be used. Examples of the animal cells include granulosa cells, ovarian capsular cells and testicular Leydig cells.
  • vertebrate-derived granulosa cells are used.
  • Can be Vertebrate animals include humans, monkeys, rats, mice, guinea pigs, and egrets, with rats being most preferred.
  • Granulosa cells can be prepared by the method of Nakamura et al. [Nakamura, M. et al. (1993) Endocrinology 133, 538-544]. Culture of granulosa cells can also be performed by the method of Nakamura et al. For example, the ovary of an animal is collected, and granulosa cells are removed by making a hole in the follicle. The obtained granulosa cells were plated on a plate using an animal cell culture medium, for example, Ham's F-12 / DME medium (manufactured by Gibco Laboratories) at 37 ° C. in air (5% C02, 95 ° air). Incubate in the vicinity of C for at least 40 hours.
  • an animal cell culture medium for example, Ham's F-12 / DME medium (manufactured by Gibco Laboratories) at 37 ° C. in air (5% C02, 95 ° air). Incubate in the vicinity of C
  • the sample is added to a culture solution of the animal cells, and cultured by the above method.
  • the sample may be added before the start of the culture or during the culture.
  • LH receptor expression is induced by follicle-stimulating hormone (FSH), insulin-like growth factor I (hereinafter IGF-1), cyclic AMP (hereinafter cAMP), and the like. Therefore, by comparing the expression level of LH receptor when only these inducers act on animal cells and the expression level of LH receptor when activators and environmental hormones act on animal cells, Perform detection or quantification. Usually, since the expression of LH receptor is suppressed in proportion to the amount of the endocrine disrupter due to the presence of the endocrine disrupter, the amount of decrease in the expression level of the LH receptor can be measured to detect or quantify the endocrine disrupter.
  • FSH follicle-stimulating hormone
  • IGF-1 insulin-like growth factor I
  • cAMP cyclic AMP
  • the measurement of the expression level of the LH receptor can be performed using cells in which a marker gene, for example, a luciferase gene, has been incorporated into the LH receptor gene. It can be performed by measuring the degree of luminescence.
  • a marker gene for example, a luciferase gene
  • Methods for measuring the amount of mRNA include methods using fluorescence and radioactivity, such as "Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring 'Harbor' Laboratory 'Press (1989)", but are not limited thereto. Any method can be used as long as mRNA can be measured directly or indirectly. Specifically, the present invention And the method for measuring the amount of niRNA described in Examples. The method of quantifying the expression level of LH receptor based on the amount of mRNA enables detection or quantification of environmental hormones up to 1 pmol / 1.
  • the present invention also relates to a contraceptive method characterized by suppressing expression of an LH receptor induced by FSH in granulosa cells.
  • a contraceptive method characterized by suppressing expression of an LH receptor induced by FSH in granulosa cells.
  • any method can be used to suppress LH receptor expression.
  • a method of administering a substance having an effect of suppressing LH receptor expression (hereinafter, abbreviated as LH receptor expression inhibitor) is used. Is raised.
  • the substance may be any substance as long as it suppresses the expression of the LH receptor, and examples include environmental hormones.
  • the endocrine disrupter the above endocrine disrupters can be used. However, it is preferable to use an endocrine disrupter which suppresses the expression of LH receptor and has lower toxicity to the human body.
  • the contraceptive of the present invention is obtained by mixing the above-mentioned LH receptor expression inhibitor and, if necessary, other active ingredients together with one or more pharmacologically acceptable carriers, and is well known in the technical field of pharmaceuticals. Manufactured by any known method.
  • the route of administration of the contraceptive of the present invention is preferably an effective contraceptive, and may be oral or parenteral, for example, intravenous.
  • Examples of the administration form include tablets, capsules, injections, drops, syrups, sublingual tablets, various creams, suppositories and the like.
  • Liquid preparations suitable for oral administration include water, sugars such as sucrose, sorbitol, fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil, soybean oil and the like. , P—hydroxy It can be manufactured using preservatives such as benzoic acid esters and flavors such as strawberry flavor and peppermint. Tablets, powders, granules and the like include excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, and polysaccharides. It can be produced using a binder such as vinyl alcohol, hydroxypropylcellulose, and gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin.
  • a binder such as vinyl alcohol, hydroxypropylcellulose, and gelatin, a surfactant such as a
  • Formulations suitable for parenteral administration comprise a sterile aqueous preparation containing the active compound, which is preferably isotonic with the blood of the recipient.
  • a solution for injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of saline and a glucose solution.
  • parenteral preparations are also selected from the diluents, preservatives, flavors, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers, etc. exemplified for the oral preparations.
  • One or more auxiliary components can also be added.
  • the content of the LH receptor expression inhibitory substance in the contraceptive of the present invention is 1 to 1000 mg, preferably 10 to 500 mg, particularly preferably 100 to 200 mg per 1 g of the contraceptive of the present invention.
  • the dose and frequency of administration of the contraceptive of the present invention vary depending on the administration form, age, body weight, and the like.
  • LH receptor expression inhibitory substances each have a body weight of l kg—per person: 0 :! to 100 mg, preferably about 0.1 to: lOmg, and are usually administered once or several times a day.
  • 0.01 to 10 mg preferably about 0.01 to 1 mg, as an LH receptor expression inhibitor per adult, is administered once to several times a day.
  • the contraceptive of the present invention By administering the contraceptive of the present invention, expression of the LH receptor can be suppressed, and contraception can be performed.
  • the contraceptive of the present invention can be used not only for humans but also for animals other than humans.
  • the dosage for use in animals is similar to that for humans.
  • the method for measuring the expression of the LH receptor is the same as described above.
  • Fig. 1 (A) shows that granulosa cells obtained from DES (diethylstilbestrol) -treated immature rats were cultured alone for 24 hours, and then FSH (30 ng / ml) and TCDD were incubated in the presence of FSH (30 ng / ml).
  • (10 pmol / 1) shows the appearance of LH-R mRNA (5.4 kb) and GAPDH mRNA after 24, 48, and 72 hours, respectively, when allowed to stand in the presence of (10 pmol / 1).
  • FIG. 2 shows that granulosa cells obtained from DES-treated immature female rats were cultured alone for 24 hours and then mixed with FSH (30 ng / ml) at various concentrations (1, 10, 100 pmol / l).
  • L shows the expression of LH-R mRNA (5.4 kb) and GAPDH mRNA when cultured in the presence of TCDD for 48 hours.
  • B shows the results of (A) quantified by densitometry overnight.
  • Rat granulosa cells were injected from a young female Wistar rat (purchased from Charles River), which was injected with 2 mg getylstilbest (dissolved in sesame oil) once a day for 4 days. ). Specifically, the ovaries of the immature female wisdom rat were excised and the follicles were punctured with a 25 gauge needle to remove the granulosa cells. The handling of rats during the series of operations was performed according to the guidelines of NIH (Biosafty in microbiological and biomedical laboratories; following this). It was determined by the blue exclusion method.
  • the rat granulosa cells obtained in Reference Example 1 were treated with 5 ml of a non-serum medium [in Ham's F-12 / DME (1: 1 vol / vol) medium], containing 5 X 10 fi viable cells. After incubation in a dish of 60 bandits for 24 hours, 30 ng / ml rat FSH (g 8) (obtained from the National Hormone and Pituitary Distribution Program (Bethesda MD)) in the presence and with FSH (30 ng / ml) The mixture was allowed to stand in the presence of 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) (manufactured by Sigma) (1, 10, 100 pmol / 1). TCDD used was dissolved in dimethyl sulfoxide.
  • TCDD 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin
  • RNA generated in the cells was extracted to obtain a pellet of the RN'A mixture. 15 / xg of the obtained pellets was dissolved in water treated with getyl.pyro-force-poneto for RNase inhibition. The solution was subjected to denaturing agarose gel electrophoresis, transferred to a nylon membrane (trade name: Biodyne, manufactured by ICN) and subjected to Northern blot analysis.
  • a film (trade name: Kodak X-0mat, manufactured by Kodak Co.) was exposed to the nylon membrane according to the standard instructions for use of a nucleic acid detection kit (manufactured by Behringer Mannheim), and a 2202 unit nitro scan laser densitometer manufactured by LKB was used. Fluorescence detection was performed, and mRNA was quantified.
  • Rat LH-R mRNA was prepared as described in Mol. Cell. Endocrinol., 82, 259-263 (1991). The obtained rat LH-R mRNA was inserted into the EcoRI restriction site of Bluescript ks (+) vector, subcloned, and made into a chain with Bglll. [Nakamura, K., Nakamura, M., Igarashi, S., Miyamoto, K., Eto, Y., Ibuki, Y., and Minegishi, T. Endocrinology 134, 2329-2335 (1994)]. Thereafter, digoxigenin-labeled LH-R cRNA corresponding to base numbers 440-2560 of rat LH-R mRNA was prepared by in vitro transcription using T3 RNA polymerase and an RNA labeling kit.
  • Each rat LH-R mRNA (5.4 kb) obtained in (1) above was quantified by a luminescence intensity measurement method.
  • the probe prepared in the above (2) was used as a probe, and the luminescence intensity was measured with an LKB 2202 UnitroScan Laser Densitometer (manufactured by LKB).
  • each rat LH-R mRNA was quantified using GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) mRNA expression level as a reference value, and a relative value (%) to the control [only FSH (30 ng / ml) added] value was obtained.
  • the data were expressed as the mean of the values obtained by performing three cultures for one condition as SE.
  • the comparison between various conditions was performed by one-way analysis of variance (one-way AN0VA). The significance of the difference between the mean value of the control and the mean value under various conditions was determined by the Duncan's multiple comparison test.
  • Fig. 1 (B) shows the results of quantification of the results of Fig. 1 (A) using Densitome Ichiichi (LKB2202 UnitroScan Laser Densitometer, manufactured by LKB Rescueer).
  • the amount of LH-R mRNA obtained after 24 hours of culture in the presence of FSH (30 ng / ml) was defined as 100%, and the GAPDH mRNA amount was quantified using all the data as a reference value.
  • the addition of 10 pmol / 1 of TCDD suppressed the LH-R mRNA expression to 50 or less as compared to the case where TCDD was not added.
  • Example 2 Concentration Dependence of Dioxin Trace Detection Using LH-R Expression as an Index
  • the results of the Northern plot method under each condition 48 hours after standing were This is shown in FIG.
  • the results also show the results when neither FSH nor TCDD was added, when only FSH (30 ng / ml) was added, or when only TCDD (100 pmol / 1) was added.
  • the addition of 1 pmol / 1 TCDD slightly reduced the amount of LH-R mRNA expression, and the addition of 10 pmol / 1 TCDD clearly suppressed LH-R mRNA expression.
  • Fig. 2 (A) shows the results of Densitome Ichiichi (LKB 2202 UnitroScan Laser
  • the LH-R mRNA expression level when cultured for 24 hours with FSH (30 ng / ml) alone was defined as 100%. All data were quantified using the GAPDH mRNA level as a reference value and expressed as a relative value to the control (n 3). LH-R mRNA expression decreased in a manner dependent on the amount of TCDD added, indicating that it was possible to quantify the amount of TCDD contained in the sample.
  • a method for detecting or quantifying an environmental hormone in a sample is provided.
  • environmental hormones, especially dioxins can be easily detected or quantified with high sensitivity by using granulosa cells and using the expression level of LH receptor as an index.

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Description

明 細 書
環境ホルモンの検出または定量方法 技術分野
本発明は、 試料中の環境ホルモン、 特にダイォキシン類を顆粒膜細胞等を用 いて検出または定量する方法に関する。 本発明においてダイォキシン類を検出 または定量するための指標としては顆粒膜細胞中で卵胞刺激ホルモン （以下 FSH という） 等により誘導される黄体形成ホルモン （以下 LHという） 受容体の発現 量の変化を用いる。 背景技術
最近、 内分泌系を乱す環境ホルモン （別称、 内分泌撹乱物質） が人体へ影響 を及ぼすことから、 注目されてきている [Bi rnbaum, L. S. (1995) Tox i co l. Le t t. 82-83, 743-750]。 この環境ホルモンの中でも特に毒性が高い物質がダイォキシ ン類である [DeVi to, M. J. and Bi rnbaum, L. S. (1995) Tox i co l ogy 102, 1 15- 123]。 ダイォキシン類とは、 ポリ塩化ジベンゾー p—ジォキシン （PCDD) およ びその類似物質であるポリ塩化ジベンゾフラン （PCDF) の総称である。 ダイォ キシン類は、 農薬の製造、 ごみの焼却、 紙の漂白過程等で副次的に生成される 化学物質であり、 塩素原子の付く位置、 数により 2 1 0種の同族、 異性体があ る。
ダイォキシン類の一般的な検出方法としては、 メタノール等有機溶媒で抽出 し、 シリカゲルクロマトグラフィーによる精製を行った後に再度濃縮し、 ガス クロマトグラフ質量分析 （GC- MS) で測定する方法がある [現代化学、 1月号， 38-43 (1999) ] 。
しかしながら、 これら従来の方法を用いてダイォキシン類を測定する場合、 検出感度が悪く、 多段階の工程、 多くの時間が必要である。 最近では高分解能 GC - MS装置が作られてはいるが、 該装置を使ったとしても、 不純物を除き、 高濃 度にするために濃縮が不可欠であり、 最終的な評価量も、 数十; Lが限界であ る。
すなわち、 これまでに、 ダイォキシン類を低濃度で簡便に検出できる方法は 知られていない。
また、 試料の形態として水溶液で直接測定できる高感度の検出法も知られて いない。 実際に、 水溶液サンプルでの検出では、 ダイォキシン類の濃度 (排水で 0. 5〜2. 5pg/Lが規制値）にもよるが、 定量下限が 500 ng/Lレベルであるので、 通 常の濃度ではで数〜数十 Lと言う多量のサンプルを必要とする （Q & Aもっと 知りたい環境ホルモンとダイォキシン 環境総合研究所編 1999) 。
生物学的方法でダイォキシン類を検出または定量する方法としては以下の方 法、 すなわち、 （1 ) 抗体を用いるダイォキシンの免疫学的分析法 （特開昭 62-272972、 特開昭 63- 14691、 特開平 1 -288766、 特開平 1 1 -75841、 USP4798807, USP5429925, USP5674697, USP4238472) 、 ( 2 ) ダイォキシンの肝臓における 標的タンパク質であると言われるァリール炭化水素 （Ah) レセプ夕一を用いる 分析法又は Ah活性を増加する方法 （特開昭 63- 58163、 特表平 7 - 501883、 USP4865972, USP5496703, USP5529899, USP5128244, USP5378822, USP5650283, W0 98/03676、 USP5854010) 、 ( 3 ) 哺乳動物のストレスプロモー夕一を利用 する方法 （特表平 9- 503121、 USP581 1231 ) 、 （4 ) 培養細胞のサイクリンキナ ーゼを測定する方法 (W094/17413, W097/0431 6, USP5753519) などが知られて いる。
しかしながら、 免疫法は構造公知のダイォキシンの検出にしか用いることが できず、 Ahレセプターによる検出法、 ストレスプロモーター、 サイクロキナー ゼによる検出法は各々肝障害又は皮膚傷害、 発癌を誘起するダイォキシンを検 出するための検出 ·測定系であり、 いずれも未だ実用化には至っておらず、 ま た、 内分泌系に影響のあるダイォキシンを検出する系でもない。
以上のことから、 生殖等に影響を与える内分泌系に作用する低濃度のダイォ キシン類等の環境ホルモンを簡便に検出する方法の開発が望まれている。 発明の開示
本発明の目的は、 試料中の環境ホルモン、 特にダイォキシン類を高感度に、 簡便な操作で検出または定量できる方法を提供することにある。
上記課題を解決するため、 本発明者らは鋭意検討を行った結果、 試料中の環 境ホルモンを高感度に、 かつ簡便に検出または定量できる方法を発明するに至 つた。
すなわち、 本発明とは、 以下の （1) 〜 （1 1) である。
(1) 動物細胞と試料を接触させ、 該動物細胞中の黄体形成ホルモン （以 下 LHという） 受容体の発現量の変化を測定することを特徴とする試料中の環境 ホルモンの検出または定量方法。
(2) 動物細胞が、 顆粒膜細胞、 卵巣夾膜細胞および精巣ライディッヒ細 胞から選ばれる動物細胞である上記 （1) の方法。
(3) 動物細胞が、 ヒト、 サル、 ラット、 マウス、 モルモットおよびゥサ ギから選ばれる動物に由来する動物細胞である上記 （1) または （2) の方法。
(4) LH受容体の発現量を、 該動物細胞中に生成する LH受容体の mRNA量で 評価する上記 （1) 〜 （3) いずれか 1つの方法。
(5) LH受容体が、 卵胞刺激ホルモン （以下 FSHという）、 インスリン様成 長因子 I (以下 IGF- 1という） およびサイクリック AMP (以下 cAMPという） から選 ばれる物質により誘導されて発現する LH受容体である上記 （1) 〜 （4) いず れか 1つの方法。
(6) 環境ホルモンが、 ダイォキシン類およびポリ塩化ビフエ二ル （以下 PCBという） から選ばれる環境ホルモンである上記 （1) 〜 （5) いずれか 1つ の方法。
(7) ダイォキシン類が、 2, 3, 7, 8—四塩化ジベンゾ- p-ダイォキシン （2, 3, 7， 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin) である上記 （6) の方法。
(8) 試料が、 飲食品、 農薬、 ごみ焼却物および PCB製品から選ばれるもの である、 上記 （1 ) 〜 （7 ) いずれか 1つの方法。
( 9 ) FSH、 IGF-Iおよび cAMPからなる群より選ばれる物質のみを顆粒膜細 胞に作用させた系と、 FSH、 I GF- 1および cAMPからなる群より選ばれる物質と環 境ホルモンの存在が疑われる試料とを顆粒膜細胞に作用させた系とで発現する LH受容体の量を比較して該試料中の環境ホルモンを検出または定量する方法。
( 1 0 ) 顆粒膜細胞において卵胞刺激ホルモンにより誘導される黄体形成 ホルモン受容体の発現を抑制することを特徴とする避妊方法。
( 1 1 ) 黄体形成ホルモン受容体の発現を抑制する物質を有効成分として 含有する避妊剤。
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明における環境ホルモンの測定は、 動物細胞と試料を接触させ、 該動物 細胞中の LH受容体の発現量の変化を測定することを特徴とする。
本発明により検出または定量が可能な環境ホルモンとしては、 該環境ホルモ ンが LH受容体の発現量に影響するものであればいずれの環境ホルモンでも検出 または定量することができる。 該環境ホルモンとしては、 1, 3, 7， 8—四塩化 ジベンゾ- P-ダイォキシン （2, 3, 7, 8-t e t rach l orod i benzo-p-d i ox i n) 等のダ ィォキシン類、 ポリ塩化ビフエニル （PCB) などがあげられる。
本発明の対象となる試料としては、 上記の環境ホルモンの存在が疑われるも のであればどのようなものでもよいが、 例えば飲食品、 農薬、 ごみ消却物、 PCB 製品等があげられる。
該環境ホルモンの存在が疑われる試料はそのまま本発明の方法に用いてもよ いが、 メタノール、 エタノール、 プロパノール等の低級アルコール、 ジメチル スルホキシド、 ジメチルホルムアミド等の媒体に溶解、 分散またはェマルジョ ン化させて用いてもよい。 ェマルジョン化は周知の方法で行うことができる。 動物細胞としては、 LH受容体を発現するものならいずれの細胞でも用いられ る。 該動物細胞としては、 例えば、 顆粒膜細胞、 卵巣夾膜細胞および精巣ライ ディッヒ細胞などがあげられ、 好ましくは、 脊椎動物由来の顆粒膜細胞が用い られる。 脊椎動物としては、 ヒト、 サル、 ラッ卜、 マウス、 モルモット、 ゥサ ギなどがあげられるが、 ラットが最も好ましい。
顆粒膜細胞の調製は中村らの方法 [Nakamura, M. ら、 （1993) Endocr ino logy 133, 538- 544]で行える。 顆粒膜細胞の培養も中村らの方法で行える。 例えば、 動物の卵巣を採取し、 卵胞に穴をあけることにより顆粒膜細胞を取り出す。 得 られた顆粒膜細胞をプレート上で動物細胞用培地、 例えば Ham' s F- 12/DME培地 (ギブコ · ラボラトリーズ社製） 等を用いて、 大気下 （5% C02、 95¾ 空気） 、 37°C近傍で、 40時間以上培養する。
環境ホルモンの存在が疑われる試料を動物細胞に作用させるためには、 該動 物細胞の培養液に該試料を添加し、 上記方法で培養する。 該試料の添加は培養 開始前であっても、 培養中であってもよい。
LH受容体の発現は、 卵胞刺激ホルモン （FSH) 、 インスリン様成長因子 I (以 下 IGF- 1という） 、 サイクリック AMP (以下 cAMPという） などにより誘導される。 したがって、 動物細胞にこれら誘導物質だけを作用させたときの LH受容体の発 現量と、 誘導物質および環境ホルモンを作用させたときの LH受容体の発現量と を比較して、 環境ホルモンの検出または定量を行う。 通常、 LH受容体の発現は 環境ホルモンの存在によりその量に比例して抑えられるので、 LH受容体の発現 量の減少量を測定して環境ホルモンの検出または定量を行うことができる。
LH受容体の発現量の測定は、 LH受容体遺伝子にマーカ一遺伝子、 例えばルシ フェラ一ゼ遺伝子等を組み込んだ細胞を用レ ^、 転写活性の強さをマ一カーの量、 例えばルシフェラ一ゼ発光度を測定することで行うことができる。
また、 細胞中に生成する LH受容体をコードする mRNAの量を測定する方法によ つても測定することができ、 かかる方法は簡便で好ましい。
mRNA量を測定する方法としては、 蛍光、 放射活性を用いる方法 「マニアチス 著、 モレキュラー · クローニング、 コールド ·スプリング 'ハーバー 'ラボラト リー'プレス （ 1 9 8 9 )」等があるが、 これらに限定されるものではなく、 mRNA を直接的、 間接的に測定できれば如何なる方法でもよい。 具体的には、 本発明 の実施例に記載された niRNA量を測定する方法などがあげられる。 mRNA量による LH受容体の発現量を定量する方法により、 1 pmo l/1までの環境ホルモンの検出 または定量が可能である。
本発明はまた、 顆粒膜細胞において FSHより誘導される LH受容体の発現を抑制 することを特徴とする避妊方法に関する。 LH受容体の発現を抑制することで顆 粒膜細胞は脳下垂体から分泌される LHに反応できなくなり、 排卵することがで きなくなる。 すなわち、 排卵を抑制することができるので避妊等に使用するこ とができる。
LH受容体の発現を抑制する方法は、 いずれの方法を用いてもよいが、 例えば LH受容体の発現を抑制する作用を有する物質 （以下、 LH受容体発現阻害物質と 略す） を投与する方法があげられる。 該物質としては、 LH受容体の発現を抑制 する物質であればいずれの物質であよいが、 例えば環境ホルモンがあげられる。 該環境ホルモンとしては上記の環境ホルモンも使用することができるが、 LH受 容体の発現を抑制し、 かつ人体に対して毒性のより低いものを使用するのが好 ましい。
以下、 LH受容体発現阻害物質を有効成分として含有する避妊剤について説明 する。 本発明の避妊剤は、 上記 LH受容体発現阻害物質、 必要に応じて他の有効成分 を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学 の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
本発明の避妊剤の投与経路は、 避妊剤として効果的なものを使用するのが望 ましく、 経口または、 例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、 例えば、 錠剤、 カプセル剤、 注射剤、 点滴剤、 シロップ 剤、 舌下錠、 各種クリーム剤、 坐剤等があげられる。
経口投与に適当な、 例えばシロップ剤のような液体調製物は、 水、 蔗糖、 ソ ルビット、 果糖などの糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール などのグリコール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油などの油類、 p —ヒドロキ シ安息香酸エステル類などの防腐剤、 ストロベリーフレーバー、 ペパーミント などのフレーバー類などを使用して製造できる。 また、 錠剤、 散剤および顆粒 剤などは、 乳糖、 ブドウ糖、 蔗糖、 マンニットなどの賦形剤、 澱粉、 アルギン 酸ソ一ダなどの崩壊剤、 ステアリン酸マグネシウム、 タルクなどの滑沢剤、 ポ リビニールアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼラチンなどの結合 剤、 脂肪酸エステルなどの界面活性剤、 グリセリンなどの可塑剤などを用いて 製造できる。
非経口投与に適当な製剤は、 好ましくは受容者の血液と等張である活性化合 物を含む滅菌水性剤からなる。 例えば、 注射剤の場合は、 塩溶液、 ブドウ糖溶 液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液 を調製する。
また、 これら非経口剤においても、 経口剤で例示した希釈剤、 防腐剤、 フレ 一バー類、 賦形剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 結合剤、 界面活性剤、 可塑剤などから選 択される 1種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
本発明の避妊剤中の LH受容体発現阻害物質の含有量は、 それぞれ本発明の避 妊剤 1 g当たり l〜1000mg、 好ましくは 10〜500mg、 とりわけ好ましくは 100〜 200mgである。
本発明の避妊剤を投与する場合の投与量及び投与回数は、 投与形態、 年齢、 体重等により異なる。
経口投与の場合、 LH受容体発現阻害物質として、 それぞれ体重 l k g—人当 たり 0.：!〜 100mg、 好ましくは約 0.1〜： lOmgであり、 これを通常 1日 1回ないし 数回投与する。
静脈内投与などの非経口投与の場合、 LH受容体発現阻害物質として、 それぞ れ成人一人当り 0.01〜： 10mg、 好ましくは約 0.01〜lmgを一日一回ないし数回投 与する。
本発明の避妊剤を投与することにより、 LH受容体の発現を抑制することがで き、 避妊を行うことができる。 なお、 本発明の避妊剤は、 ヒトだけでなく、 ヒト以外の動物に対しても使用 することができる。 動物に使用する場合の投与量はヒトの場合と同様である。 LH受容体の受容体の発現の測定法は前記と同様の方法が用いられる。
次に、 本発明の環境ホルモン検出方法について実施例で説明する。 図面の簡単な説明
第 1図（A)は、 DES(diethylstilbestrol)-処置 幼若ラットから得た顆粒膜細胞 を単独で 24時間培養した後、 FSH (30 ng/ml)存在下、 FSH (30ng/ml)および TCDD (10 pmol/1)存在下でそれぞれ静置したときの、 24, 48, 72時間後の LH- R mRNA (5.4 kb)と GAPDH mRNA発現の様子を表す。
(B)は、 （A)の結果をデンシトメ一夕一により定量化したものを表す。
第 2図 (A)は、 DES-処置 幼若メスラットから得た顆粒膜細胞を単独で 24時間培 養した後、 FSH (30 ng/ml)と共に種々の濃度（1, 10, 100 pmol/1)の TCDD存在下 で 48時間培養したときの LH-R mRNA (5.4 kb)と GAPDH mRNA発現の様子を表す。 (B)は、 （A)の結果をデンシトメ一夕一により定量化したものを表す。 発明を実施するための最良の形態
参考例 1 ラット顆粒膜細胞の調製
ラット顆粒膜細胞は、 0. lml ごま油に溶解した 2 mgジェチルスチルベスト口 ール （シグマ社製） を 1日 1回、 計 4日間注射投与した幼若メスウィスターラット (Charles River社より購入）から得た。 具体的には、 その幼若メスウイス夕一ラ ッ卜の卵巣を切除し、 25ゲージ針で卵胞に穴をあけることにより顆粒膜細胞を 取り出した。一連の操作中のラットの取り扱いは、 NIHのガイドライン（Biosafty in microbiological and biomedical laboratories; 【こ従った。 その後 ¾¾净し、 遠心分離して顆粒膜細胞を回収した。 細胞の生存率は周知の trypan blue exclusion法により求めた。
得られた顆粒膜細胞 （生存率 90%以上） を、 コラーゲン被覆プレート上、 1.1 g/liter NaHC03、 40 mg/1 i ter硫酸ゲン夕ミシン （シグマ社製） 、 1 mg/literフ アンギゾン （ギブコ ·ラボラトリ一ズ社製） 、 100 mg/1 iter牛血清アルブミン
(BSA) を添加した Ham's F-1 /DME (1:1 vol/vol)培地 （ギブコ · ラボラトリ一 ズ社製） 中、 湿った大気下（5 % C02， 95 % air), 37°Cで培養した [Nakamura, M. ら、 Endocrinology ]^, 538-544 (1993)]。 培養によって得られた顆粒膜細胞 を実施例で用いた。
実施例 1 LH-受容体 （LH-R)発現を指標にしたダイォキシンの微量検出
(1) RNA混合物の単離と分析
参考例 1で得られたラット顆粒膜細胞を、 5 mlの非血清培地 〔Ham' s F-12/DME (1:1 vol/vol)培地中〕 、 5 X10fi個の生細胞を含む直径 60 匪の皿で 24時間培養 した後、 30ng/mlラッ卜 FSH (ト 8) [Nat ional Hormone and Pi tui tary Distribution Program (Bethesda MD)より入手 〕 存在下および FSH (30ng/ml)と 2, 3, 7, 8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) (シグマ社製) (1, 10, 100 pmol/1)存在 下で静置した。 TCDDはジメチルスルホキシドに溶解したものを用いた。
AGTC法 [ (商品名 Isogen、 Nippon gene社製) Chomezynski, P. and Sacchi, N. Anal. Biochem. 162^ 156-159 (1987)]に従って、 24、 48、 72時間後に培養を停 止した後、 細胞内に生成した RNAを抽出して RN'A混合物のペレットを得た。 得ら れたペレツトのうち 15/xgを RNase阻害のためにジェチル . ピロ力一ポネィト処 理した水に溶解した。 溶液を変性ァガロースゲル電気泳動にかけ、 ナイロン膜 (商品名 Biodyne, ICN社製）に移しノーザンプロット分析を行った。 核酸検出キ ット（ベ一リンガーマンハイム社製）の標準使用書に従ってフィルム （商品名 Kodak X-0mat 、 コダック社製） を該ナイロン膜に曝し、 LKB社の 2202ュニトロ スキャンレーザーデンシトメ一夕一で蛍光検出を行い mRNAの定量を行った。
(2) ラット LH- R cRNAプローブの調製
Mol. Cell. Endocrinol. , 82, 259-263 (1991)の記載にしたがい、 ラット LH- R mRNAを調製した。 得られたラット LH- R mRNAを Bluescript ks (+) vectorの EcoRI 制限酵素サイトに組み込んでサブクローニングし、 Bglllで鎖状にした [Nakamura, K. , Nakamura, M. , Igarashi, S. , Miyamoto, K. , Eto, Y. , Ibuki, Y.， and Minegishi, T. Endocrinology 134, 2329-2335 (1994)]。 その後、 ラ ット LH-R mRNAの塩基番号 440- 2560に相当するジゴキシゲニン標識 LH-R cRNAを、 T3 RNAポリメラーゼと RNA標識キットを用いる in vitro転写により調製した。
(3) ラット LH-R mRNAの定量
上記 （1) で得られたラット LH- R mRNA (5.4kb)それぞれを、 発光強度測定法 で定量した。 プローブには上記 （2) で調製したプローブを用い、 発光強度は LKB 2202 UnitroScan Laser Densitometer (LKB社製）で測定した。
各ラット LH - R mRNAの発現量は、 GAPDH (Glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase] mRNA発現量を基準値として定量し、 コントロール [FSH (30 ng/ml)のみ添加] 値に対する相対値 (%)を得た。 データは、 1条件に対して 3回の 培養を行なって得られた値の平均値を SEとして表した。 種々の条件間での比較 は一元分散分析（one-way AN0VA)により行なった。コントロールの平均値と種々 の条件下での平均値との差の有意' 14は、 Duncan's multiple comparison testに より判定した。 Pく 0.05で統計的に有意差があった。
(4) 顆粒膜細胞を用いたダイォキシンの検出
上記 （1) において、 TCDD濃度 0および lOpmol/1の場合の各条件下でのノ一ザ ンブロット法の結果を図 1 (A)に示した。 静置 24時間後で既に、 LH- R mRNAの発 現量に差が現れていた。すなわち、この検出系では少なくとも 24時間で 10 pmol/1 の TCDDを検出できることが示された。
図 1 (A)の結果をデンシトメ一夕一 （LKB2202 UnitroScan Laser Densitometer, LKBProdukter社製） により定量化した結果を図 1 (B)に示した。 FSH (30ng/ml) 存在下 24時間培養したときに得られる LH-R mRNA量を 100%とし、 いずれのデ一夕 も GAPDH mRNA量を基準値として定量し、 コントロールに対する相対値で示した 24, 48, 72時間後いずれにおいても、 10 pmol/1の TCDDの添加によって LH-R mRNA発現量は TCDDを添加しないときに比べて 50 以下に抑制されていた。 実施例 2 LH-R発現を指標にしたダイォキシンの微量検出の濃度依存性 上記実施例 1 ( 1 ) において、 静置 4 8時間後の各条件下でのノーザンプロ ット法の結果を第 2図（A)に示した。 FSHと TCDDいずれも添加しない場合、 FSH (30 ng/ml)のみ添加した場合、 TCDD (100 pmol/1)のみ添加した場合の結果も示した。 1 pmol/1の TCDD添加で LH-R mRNAの発現量が若干減少し、 10 pmol/1の TCDD添加 では、 LH- R mRNA発現が明らかに抑制されていた。
該結果により、 上記方法によれば 1 pmol/1の TCDDの検出も可能であり、 10 pmol/1の TCDDであれば充分に検出することが可能であることが示された。 なお、 多くの環境ではおよそ 10 pmo l/1の濃度で TCDDが存在すると考えられており、 本 検出系はこのようなサンプルの測定にも十分対応できる感度を有していると言 える。
第 2図 （A)の結果をデンシトメ一夕一 （LKB 2202 Uni t roScan Laser
Dens i tometer, LKB Produkter社製） により定量化した結果を第 2図（B)に示し た。
FSH (30 ng/ml)単独で 24時間培養した時の LH-R mRNA発現量を 100%とした。 い ずれのデータも GAPDH mRNA量を基準値として定量し、 コントロールに対する相 対値で表した（n=3)。 LH-R mRNA発現は添加した TCDD量依存的に減少しており、 この傾向からサンプルに含まれる TCDD量を定量することが可能であることが示 された。 産業上の利用可能性
本発明により、 試料中の環境ホルモンの検出または定量方法が提供される。 本法によれば顆粒膜細胞を用い、 LH受容体の発現レベルを指標とすることに より、 環境ホルモン、 特に、 ダイォキシン類を高感度で簡便に検出または定量 することができる。

Claims

請求の範囲
1. 動物細胞と試料を接触させ、 該動物細胞中の黄体形成ホルモン受容体の発 現量の変化を測定することを特徴とする試料中の環境ホルモンの検出または定 量方法。
2. 動物細胞が、 顆粒膜細胞、 卵巣夾膜細胞および精巣ライディッヒ細胞から 選ばれる動物細胞である請求項 1記載の方法。
3. 動物細胞が、 ヒト、 サル、 ラット、 マウス、 モルモットおよびゥサギから 選ばれる動物に由来する動物細胞である請求項 1または 2記載の方法。
4. 黄体形成ホルモン受容体の発現量を、 該動物細胞中に生成する黄体形成ホ ルモン受容体の mRNA量で評価する請求項 1〜 3いずれか 1項に記載の方法。
5. 黄体形成ホルモン受容体が、 卵胞刺激ホルモン、 インスリン様成長因子 I およびサイクリック AMPから選ばれる物質により誘導されて発現する黄体形成 ホルモン受容体である請求項 1〜4いずれか 1項に記載の方法。
6. 環境ホルモンが、 ダイォキシン類およびポリ塩化ビフエニル （から選ばれ る環境ホルモンである請求項 1〜 5いずれか 1項に記載の方法。
7. ダイォキシン類が、 1, 3, 7, 8—四塩化ジベンゾ -P-ダイォキシン （2, 3, 7， 8-t e t rach l orod i benzo-p-d i ox i n) である言言求項 6記載の方法。
8. 試料が、 飲食品、 農薬、 ごみ焼却物およびポリ塩化ビフエニル製品から選 ばれるものである、 請求項 1〜 7いずれか 1項に記載の方法。
9. 卵胞刺激ホルモン、 インスリン様成長因子 Iおよびサイクリック AMPからな る群より選ばれる物質のみを顆粒膜細胞に作用させた系と、 卵胞刺激ホルモン、 インスリン様成長因子 Iおよびサイクリック AMPからなる群より選ばれる物質と 環境ホルモンの存在が疑われる試料とを顆粒膜細胞に作用させた系とで発現す る黄体形成ホルモン受容体の量を比較して該試料中の環境ホルモンを検出また は定量する方法。
10. 顆粒膜細胞において卵胞刺激ホルモンにより誘導される黄体形成ホルモ ン受容体の発現を抑制することを特徴とする避妊方法。
1 1. 黄体形成ホルモン受容体の発現を抑制する物質を有効成分として含有す る避妊剤。
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