WO2001020021A2 - Komplex mit spezifischen dephosphorylierenden enzymen, deren effektoren und verfahren zu ihrer gewinnung - Google Patents

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WO2001020021A2
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Definitions

  • the present invention relates to a complex involved in the control of cell regulation, containing a dephosphorylating enzyme and a phosphorylated protein, effectors of the complex and methods for obtaining or identifying them.
  • Tyrosine peptide units then become binding or docking sites for numerous proteins in the signal transduction network, which is involved in general mechanisms for regulating processes in the cell, cell proliferation or cell differentiation (Ullrich and Schlessinger, 1990, Cell 61: 203-212).
  • PTKs prottytyrosine kinases
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • insulin receptor kinases from the Src family
  • PTP protein tyrosine phosphatases
  • the protein tyrosirikinases of the Src family are activated by protein tyrosine phosphatases, while the EGF receptor kinase or the suli receptor kinase are subject to negative regulation by tyrosine phosphatases.
  • UV + ultraviolet radiation
  • the response to UV appears to depend on several primary radiation target molecules. It is interesting that part of the immediate response to UV is mediated by ligand-independent activation of growth factor receptors.
  • the epidermal growth factor receptor (EGFR) and the platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) are autophosphorylated within seconds when cultured cells are exposed to UV radiation. It appears that autophosphorylation leads to complete functional signaling at the receptor, with the ligands dimensioning the subunits of the receptor tyrosine kinases. This process is necessary for autophosphory production.
  • UV radiation is an unspecific agent. Covalent crosslinking of the receptor tyrosine kinase subunits by UV was excluded. The UV dose required for crosslinking proteins is at least one order of magnitude higher than the dose required for the effective activation of the receptors. Although UV strongly induces the receptor kinase activity, ie the PDGFß receptor kinase activity, it does not bring the receptor subunits into the same chemically cross-linkable configuration as the PDGF ligand itself.
  • the present invention provides evidence that UV radiation leads to inactivation of the catalytic function of protein tyrosine phosphatase.
  • UV treatment inactivates protein tyrosine phosphatases, but does not induce cross-linking of the receptors and also no association of receptors that could be chemically cross-linked. It is known that UV irradiation of cells leads to effective autophosphorylation of both the EGF receptor and the PDGF receptor. Investigations were carried out to determine whether ligand-independent activation of growth factor receptors by UV radiation involved induced dimerization.
  • the crosslinking conditions for the PDGF receptor are already known. In addition to activation in intact cells, conditions for sufficiently strong UV-induced autophosphorylation in vitro were also developed. For the UV radiation, isolated PDGF receptors in Triton-X-100-containing membrane fractions of TRMP cells were used, which are stably transfected with a human PDGFß receptor expression construct known per se.
  • UV treatment of these preparations greatly increased the autophosphorylation of the PDGF ⁇ receptors (FIG. 1A, lanes 3 and 8 compared to 1 and 6). If the reducing agent NAC was added before the UV radiation, this increase was almost completely prevented (lanes 5 and 10). An addition of NAC after UV irradiation led to a partial reduction in the phosphorylation "signal" (lanes 4 and 9), which suggests that the UV effect can be partially reversed to the phosphorylation of the receptor by the reducing agent.
  • Increased phosphorylation of the PDGFß receptor therefore correlates strongly with inactivation of endogenous PTPs.
  • Receptor tyrosine kinases are in the active state of dimers or multimers, and it is believed that the specific ligand induces the formation of dimers, thereby triggering autophosphorylation and subsequent signaling.
  • a large number of observations speak for this model, e.g. the fact that some ligands themselves act as dimers and trigger a corresponding adaptation of receptor subunits, which is particularly well documented for PDGF heterodimers.
  • Other growth factors must be bound to a macromolecular matrix such as heparan sulfate; a structural order that can be transferred to the specific receptors, which in turn brings the receptor subunits into steric proximity, that is, they are oligomerized.
  • Receptor tyrosine kinases in the absence of their specific ligands, suggesting that a substantial proportion of the receptors are in the form of a dimer association prior to interaction with the ligand. The possibility that a naturally occurring transient association is stabilized and prolonged by treatment with these “non-ligands” is unlikely due to the different nature of these treatments.
  • PTP substrate receptor
  • the present invention shows that UV radiation does not promote the formation of receptor dimers.
  • the chemical crosslinking agents are known to successfully link receptor chains after stimulation with PDGF. UV radiation was under no conditions capable of making the receptors crosslinkable, although similar
  • receptor dimers therefore takes place in the absence of ligands and can be demonstrated by the (relatively ineffective) chemical crosslinking if the equilibrium is shifted sufficiently towards the dimer state, either by overexpression or by ligand binding. Such a shift cannot be demonstrated with UV radiation. It can therefore be said that the present invention makes available data that do not support the hypothesis that UV-induced activation of receptor tyrosine kinases is mediated by cross-linking of receptors or by increased association (cluster formation).
  • the present invention also clearly shows that UV-enhanced receptor phosphorylation requires intrinsic PDGF receptor kinase activity, but does not increase it.
  • the dephosphorylation of receptors is delayed by UV radiation in a PDGF ⁇ receptor preparation which has a receptor-directed PTP activity.
  • the tyrosine phosphorylation of the receptor is enhanced.
  • This enhancement is a function of the receptor itself and not the function of another tyrosine kinase, e.g. one of the Src family which has been known to interact with the PDGFß receptor and is capable of phosphorylating the receptor.
  • the present investigations show that the specific PDGF receptor kinase inhibitor AG 1296, which is not active against kinases of the Src family, completely destroyed the UV-caused increase in the phosphorylation level of the PDGF receptor.
  • Receptor is required and involvement of other kinases is unlikely.
  • the PDGFß receptor is thought to be activated by autophosphorylation on tyrosine 857 within the kinase domain.
  • receptor variants with a mutation on the tyrosine 857 have a reduced signal transmission activity.
  • previous studies have shown that mutating this residue or inhibiting its phosphorylation leaves much of the kinase activity unchanged, suggesting that PDGF ⁇ receptor kinase activity is less is strictly regulated by autophosphorylation than is the case with other receptor tyrosine kinases.
  • the expectation that differences in receptor phosphorylation with or without UV treatment in vitro would lead to changes in receptor activity compared to an exogenous substrate was not observed.
  • the dephosphorylation of the receptor by endogenous PTP (s) can differ
  • the present invention provides evidence that UV defined receptor-directed PTP (s), in particular that of the EGF and PDGF receptors, are inactivated. It can be assumed that the physiological regulation of receptor tyrosine kinases by dephosphorylation requires a certain degree of substrate specificity of the respective PTPs, which does not exclude that depending on the cell, different PTP (s) may have the ability to dephosphorylate a given receptor. In addition, receptor dephosphorylation with specificity of a given PTP for certain phosphorylation sites can occur, and therefore a complete down regulation of the receptor activity could require several PTP (s). From previous experience regarding the relatively low PTP
  • PTP substrate specificity in the intact cell is achieved by the substrate receptor being present in a highly compartmentalized manner with its specific PTP.
  • the specific dephosphorylation observed in enriched membrane vesicles containing PDGF receptors suggests a localization of the relevant PTP in the membrane in close association with the receptor.
  • PTP (s) bound to the plasma membrane e.g. transmembrane PTP (s) are therefore likely candidates for negative regulation of the receptors.
  • the overexpression of such PTP (s) in question e.g. RPTP ⁇ (Fig. 4) or DEP-1 and RPTP ⁇ , has actually downregulated the autophosphorylation activity of the two receptors chosen here.
  • Another possible PTP for the dephosphorylation of the EGF receptor and possibly the PDGF receptor is the SH2 domain PTP SHP-1. It is demonstrated here that the UV treatment of intact
  • PTPs oxidize essential cysteine via a reactive intermediate. It is very likely that PTP (s) are also physiologically regulated by redox mechanisms. UV and other agents, for example H 2 O 2 , mislead the system in that they oxidize PTP (s) and trigger signal transmission of the receptor in the absence of a ligand.
  • the UV-inactivated PTP (s) are a suitable system for the effective determination of specific, an interaction of incoming pairs of prottytyrosine kinases and their phosphatases and vice versa.
  • the present UV-inactivated PTP (s) have the unexpected feature that they bind specifically to their substrate without catalytically metabolizing it. This means that they remain bound while an active PTP releases the substrate after cleavage.
  • the UV-inactivated PTP (s) are therefore suitable for "capturing" their specific substrates, ie the Cell surface receptor kinases.
  • kinase-phosphatase substrate-enzyme complexes Due to the relatively stable complex formation of the kinase-phosphatase substrate-enzyme complexes, these specific partners can be identified. If a tyrosine kinase is known, the complex can be precipitated with specific antibodies against the tyrosine kinase and the associated specific phosphatase can be identified. Conversely, in the case of known phosphatase, the associated substrate kinase can be precipitated and identified. It is conceivable to use the interaction between oxidized phosphatase and substrate to discover interfering substances (drugs).
  • the present invention relates to a specific complex which is involved in the control of cell regulation and which contains a dephosphorylating enzyme which is deactivated by oxidation and a phosphorylated protein.
  • the dephosphorylating enzyme and the phosphorylated protein are subject to a specific mutual interaction in the form of a specific chemical bond, i.e. they bind specifically to one another in the sense of an enzyme-substrate bond.
  • the dephosphorylating enzyme contained in the present complex is further modified so that it binds to the phosphorylated protein without catalytically converting this phosphorylated protein.
  • the amino acid in the active center which is responsible for the catalytic function of the dephosphorylating enzyme, is oxidized.
  • Deactivation of the dephosphorylating enzyme present in the present complex is reversible.
  • the modification of the dephosphorylating enzyme is effected by means from the group consisting of radiation, preferably UV radiation, oxidants, preferably hydrogen peroxide, alkylating agents and / or combinations thereof.
  • the modification of the dephosphorylating enzyme is carried out by UVA irradiation with a wavelength of 320 to 400 nm, preferably from 335 to 370 nm, particularly preferably 335 nm or by means of UVB irradiation with a wavelength of 280 to 320 nm, preferably 285 up to 330 nm, particularly preferably 312 nm, or UVC radiation with a wavelength of 200 to 280 nm and / or combinations thereof.
  • the present complex has a dephosphorylating enzyme from the group of protein tyrosine phosphatases.
  • the present complex has a phosphorylated protein from the group of the prottyrosine kinases, preferably from the group of the cell surface receptors with receptor tyrosine kinase activity.
  • the substrates of the receptor tyrosine kinases are also the subject of the complex according to the invention.
  • the present complex is characterized in that it is located in an artificial system (in vitro system) or in a system of natural origin, preferably living cells, particularly preferably living cells of higher organisms, in particular mammalian cells.
  • the present invention also relates to dephosphorylating
  • the dephosphorylating enzymes according to the invention are also distinguished by the fact that they form a complex with the substrates of the phosphorylated proteins of the aforementioned complex. That the dephosphorylating enzymes according to the invention also bind to the substrates of the phosphorylated proteins. In particular, this means that the substrates of the protein tyrosine kinases are regulated by the protein tyrosine phosphatases.
  • the present invention further relates to phosphorylated proteins which are contained in this complex, the phosphorylated proteins coming from the group of prottytyrosine kinases, preferably from the group consisting of cell surface receptors with receptor tyrosine kinase activity.
  • the present invention also relates to substrates of the phosphorylated proteins.
  • the present invention relates to a method for identifying said complex or the dephosphorylating enzymes or phosphorylated proteins contained therein, in which a system is used with at least one dephosphorylating enzyme and at least one phosphorylated protein, the phosphorylating enzymes are oxidatively deactivated, which deactivate phosphorylating enzymes are specifically bound to a particular phosphorylated protein contained in this system, thereby forming a certain complex that is not catalytically reacted, thereby causing the particular one so formed Complex is obtained, and the specific components contained in this particular complex are identified.
  • the method can be carried out in an artificial system or in a system derived from nature, preferably in a living cell, particularly preferably in living cells of higher organisms, in particular of mammals.
  • the living cells or the isolated dephosphorylating enzymes are treated by radiation, preferably UV radiation, oxidants, preferably hydrogen peroxide, alkylating agents and / or combinations thereof.
  • the dephosphorylating enzymes are preferred by UVA irradiation with a wavelength of 320 to 400 nm, preferably from 335 to 370 nm, particularly preferably 335 nm or by means of UVB irradiation with a wavelength of 280 to 320 nm 285 to 330 nm, particularly preferably 312 nm, or UVC radiation with a wavelength of 200 to 280 nm and / or their combinations causes deactivated.
  • the resulting deactivation of the present dephosphorylating enzymes in the present process is reversible.
  • the dephosphorylating enzymes are deactivated by a redox reaction, preferably an oxidation of the amino acid in active centers, which is responsible for the catalytic function of the enzymes.
  • the present method is further characterized in that the dephosphorylating enzymes come from the group of protein tyrosine phosphatases and that the phosphorylated proteins come from the group of protein tyrosine kinases, preferably from the group consisting of cell surface receptors with receptor tyrosine kinase activity.
  • the present invention relates to a specific complex or dephosphorylating enzymes or phosphorylated proteins or phosphorylated enzyme substrates, each of which was obtained by means of the method mentioned.
  • the present invention comprises a (screening) method for identifying substrates of the phosphorylated proteins, the dephosphorylated enzymes according to the invention and / or the phosphorylated proteins Proteins are incubated under physiological conditions with compounds which represent potential candidates for substrates of the PTKs, then the PTP-substrate complexes or PTK-substrate complexes formed are isolated and the respective substrate component is characterized in more detail.
  • the present invention relates to a method for deactivating dephosphorylating enzymes, in which living cells or isolated dephosphorylating enzymes are treated with agents from the group consisting of radiation, preferably UV radiation, oxidants, preferably hydrogen peroxide, alkylating agents and / or combinations thereof become.
  • the deactivation is carried out by UVA radiation with a wavelength of 320 to 400 nm, preferably from 335 to 370 nm, particularly preferably 335 nm or by means of UVB irradiation with a wavelength of 280 to 320 nm, preferably 285 to 330 nm. particularly preferably 312 nm, or UVC radiation with a wavelength of 200 to 280 nm and / or combinations thereof.
  • UVA radiation with a wavelength of 320 to 400 nm, preferably from 335 to 370 nm, particularly preferably 335 nm or by means of UVB irradiation with a wavelength of 280 to 320 nm, preferably 285 to 330 nm. particularly preferably 312 nm, or UVC radiation with a wavelength of 200 to 280 nm and / or combinations thereof.
  • this process is characterized in that the deactivation of the dephosphorylating enzymes is achieved by means of a redox reaction, preferably an oxidation of an amino acid in the activity centers which are responsible for the catalytic function of the enzymes.
  • the method uses dephosphorylating enzymes from the group of protein tyrosine phosphatases and phosphorylated proteins from the group of protein tyrosine kinases, preferably from the group of cell surface receptors with receptor tyrosine kinase activity.
  • the present invention also relates to the deactivated dephosphorylated enzymes produced by said process.
  • the invention further relates to a method for determining the effectors of this complex or these dephosphorylating enzymes or these phosphorylated proteins or their substrates, comprising the steps of obtaining this complex , this enzyme or protein is incubated with at least one test substance or one Undergoes radiation treatment, then determines the specific activity and / or the extent of the phosphorylation of the respective components, using known methods as such, additionally measures the specific activity or the extent of the phosphorylation of the respective components in the absence of the test substance or in the absence of the radiation compares the respective specific activities or the respective extent of the phosphorylation which are achieved in the above-mentioned steps, and thus identifies the test substance or substances or radiation which exert a regulatory effect on the test components.
  • test substances come from the group of natural, semi-synthetic or synthetic chemicals or biologically or pharmaceutically active compounds.
  • the invention also relates to effectors of the complex or substrates of the phosphorylated proteins, which are determined by means of this method.
  • the effectors or substrates come from the group of natural, semi-synthetic or synthetic chemicals or biologically or pharmaceutically active compounds or radiation.
  • the present invention relates to the use of said complex or these dephosphorylating enzymes or these phosphorylated proteins or their substrates for determining the effectors of proteins which are involved in the control mechanisms of cell regulation.
  • present complex or the present dephosphorylating enzymes or phosphorylated proteins can be used for the production of modified effectors or substrates of proteins which are involved in the control mechanisms of cell regulation (drug design).
  • the present ones can be deactivated dephosphorylating enzymes can be used for the specific determination of phosphorylated proteins by means of substrate "trapping".
  • the present effectors or their modifications involved in the control of cell regulation can be used for the development and production of agents for the treatment of defects in the transmission of cell signals or cell regulation or cell proliferation and / or cell differentiation, as well as for the development and manufacture of a agent for treatment of neurodegenerative diseases, diabetes mellitus, arteriosclerosis or cancer.
  • Plasmids - The cDNAs for mouse RPTP ⁇ (1), mouse RPTP ⁇ (2), human DEP-1 (3) and human SHP-1 (4,5) are available from Dr. M. Thomas (St. Louis), Dr. M. Ogata (Osaka), Dr. A. ⁇ stman (Uppsala) and Dr. A. Ullrich (Martinsried) available.
  • the PDGF ⁇ receptor cDNA is subcloned into the vector PCDNA3 (Invitrogen) digested with EcoRI / HindIII.
  • a site-directed mutagenesis of the cDNAs of RPTP ⁇ and DEP-1 to create the mutants C1545S RPTP ⁇ and C1239S PTP DEP-1 in pRK5RS is carried out with the help of the U-labeled template according to Kunkel (7) and the Bio-Rad (Munich) Mutagene Kit used.
  • the C433 S mutation of RPTP ⁇ is generated by PCR-based mutagenesis using primers that match the desired mutations and suitable interfaces to replace the original fragment of the phosphatase DNA with the mutated fragment. The structure of all constructs is checked by DNA sequencing.
  • A431 cells stably transfected with SHP-1 DNA or corresponding sham-transfected A431 cells are obtained as described in (Tenev et al.,) And in DMEM / 10% FCS in the presence of 0.8 mg / ml G418 (life sciences) bred. Treatments with UV and with growth factors - The cells are grown in 60 mm or 35 mm plates with six wells and overnight in DMEM / 0.5% FCS (transfected 293 cells) or four hours in serum-free DMEM (A431 - Cells) grown without food.
  • the cells are sham-treated or irradiated through the medium (2 ml in 60 mm or 1 ml in 35 mm dishes) with Vetter lamps (Wiesloch) with the following properties:
  • Half the maximum k emission is from the UVA lamp (UVL15) between 335 and 370 nm with 11.5 W / m 2 emitted at a distance of 8 cm, the peak of the maximum emission being 355 nm.
  • Half of the maximum ⁇ emission is emitted by the UVB lamp (UVM 15) between 285 and 330 nm, the maximum peak being 312 nm.
  • the total luminous flux emitted is determined at a distance of 8 cm to 9 W / m 2 .
  • the Stratalinker 1800 (Stratagene) is used for UVC treatment. For all irradiations, the air in the stratalinker was replaced by nitrogen gas in order to avoid ozone effects, and 2kJ / m 2 are used unless otherwise stated.
  • the cell lysates are irradiated directly in the dishes and the PDGF receptor preparations are irradiated on slides (tissue chamber slides with 8 wells from Nunc). To stimulate the growth factor, the cells are treated with 100 ng / ml PDGF-BB (TEBU, Frankfurt or 10-100 ng / ml EGF (recombinant human EGF, Dr. R. Perez, Havana, Cuba) for 5 minutes at 37 ° C ,
  • MAPKAP Kinase-2 Assay Approximately 10 x 6 sham-transformed or SHP-1 transfected A431 cells in 60 mm dishes are grown for four hours in serum-free DMEM and grown with EGF (100 ng / ml, 5 minutes at 37 ° C) or the corresponding solvent treated and then sham-treated or irradiated with UVC light (2kJ / m 2 ) as described above. After 30 minutes at 37 ° C, the cells are washed once with PBS and then harvested by scraping into PBS and centrifuging at 2000 g for 5 minutes. The pellets are either rapidly frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
  • lysis buffer (20 mM Tris / acetate, pH 7.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM EGTA, InM Na 3 VO 4 , 10 mM ß-glycerophosphate, 50mM NaF, 5mM pyrophosphate, 1% Triton X-100, ImM benzamidine, 0.27M sucrose, 0.1% ß-mercaptoethanol, 0.2mM phenylmethylsulphonylfiuoride), namely 15 minutes on ice, and 10 minutes on 15000g centrifuged.
  • lysis buffer 20 mM Tris / acetate, pH 7.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM EGTA, InM Na 3 VO 4 , 10 mM ß-glycerophosphate, 50mM NaF, 5mM pyrophosphate, 1% Triton X-100, ImM benzamidine, 0.27M sucrose, 0.1% ß-mercapto
  • the PDGFß receptor is isolated from TRMP cells overexpressing hPDGFßR (9), as described in (10), and partially purified. Micelle fractions containing PDGFR are sham-treated or irradiated as described above. 10 ul of this approach are mixed with 10 ul 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM MnCl 2 , 1 mM DTT.
  • Effectors are added in the following concentrations as indicated in the legends of the figure: sodium orthovanadate - 0.1 mM; N-acetylcysteine (NAC) - 10mM; Iodoacetamide (IAA) - 5 mM.
  • the samples are incubated on ice for 20 minutes with PDGF-BB (final concentration 1 ⁇ g / ml) or the corresponding solvent on ice.
  • the specific PDGF receptor blocker AG 1 296 (11) is included in a final concentration of 10 ⁇ M.
  • ATP is then added (2.5 ⁇ Ci, final concentration 12.5 ⁇ M) and the samples are incubated on ice for 10 minutes.
  • reaction is then either stopped with the SDS-PAGE sample buffer or a mixture of ATP and phenyl phosphate is added to a final concentration of 2 mM or 6 mM and at 30 minutes Incubated 25 ° C and then stopped by adding SDS-PAGE sample buffer.
  • SDS-PAGE sample buffer For the crosslinking, disuccinimidyl suberate (Pierce, final concentration 0.3 mM) or the corresponding solvent DMSO (final concentration 5%) are added during the 30-minute incubation and, before stopping with SDS-PAGE sample buffer, methylamine / HCl, pH 7, 4 (final concentration 70 mM).
  • the samples are analyzed by SDS-PAGE on gels with a gradient of 4-9% and then by car radio or immunoblotting using the anti-PDGFR antibody DIG-1 (11) for detection.
  • the slightly modified method of Tomaska and Resnick (12) was used to cross-link PDGFR in intact cells.
  • 293 cells transiently transfected with HPDGFßR were irradiated with UVC as described above and then stimulated at 37 ° C. with 100ng / ml PDGF-BB or sham-treated with the appropriate solvent.
  • the cells are suspended, placed in microcentrifuge tubes on ice and washed four times with ice-cold PBS.
  • the cell pellets are extracted with lysis buffer as described below and the glycoproteins were enriched by adsorption on wheat germ agarose beads by incubating the lysates with 30 ml of a 1: 1 suspension of wheat germ agarose (Pharmacia) and for 45 minutes at 4 ° C rotated overhead.
  • the beads are washed once with lysis buffer and the adsorbed proteins are extracted with SDS-PAGE sample buffer and with 4-9% PAGE gels and immunoblotting with the anti-PDGFR antibodies DIG-1 or the anti-phosphotyrosine antibodies RC20 (E120H, Transduction Laboratories) analyzed.
  • An autophosphorylation as described above is carried out to monitor the receptor dephosphorylation kinetics.
  • reaction is then stopped by adding unlabelled ATP and phenylphosphate (final concentrations 2 mM and 6 mM, respectively), the reaction mixture is left to stand at 25 ° C., and aliquots are removed and mixed with SDS-PAGE sample buffer at different times (see legends for Figures 2 and 3.
  • the samples are placed on ice and the substrate peptide KY751 (according to the sequence around the tyrosine 751 of the PDGFß receptor (10)) is mixed with MnCl 2 (10 mM), sodium orthovanadate (1 mM) and [ ⁇ 32 P] ATP ( 5 ⁇ Ci sample) in a final volume of 20 ⁇ l to a final concentration of 3 mM.
  • MnCl 2 10 mM
  • sodium orthovanadate 1 mM
  • [ ⁇ 32 P] ATP 5 ⁇ Ci sample
  • the mixture is incubated for 20 minutes and then the reaction is stopped by adding 10 ⁇ l 15 mM EDTA, 1.5 mg / ml BSA and 10 ⁇ l 40% (w / v) trichloroacetic acid.
  • the samples are centrifuged for 10 minutes in a cooling microfuge and 25 ⁇ l of the supernatant are removed and subjected to an analysis of the phosphorylation of the KY 751 peptide as described earlier (10).
  • Immunfilling and Immunoblotting - Appropriately pretreated cells are harvested with ice-cold lysis buffer (0.2 ml per 35 mm dish) containing 50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 1 mM EGTA, Contains 10% glycerol, 1% Triton X 100, 1mM PMSF, 1% aprotinin and 1mM sodium orthovanadate.
  • the lysates are prepared in the absence of vanadate. The lysates are centrifuged for 20 minutes at 4 ° C.
  • the lysates are incubated with a monoclonal antibody against VSV-G (V-5507 Sigma, 2 ⁇ g per lysate of a 35 mm dish) on a rotating wheel at 4 ° C. for one hour.
  • VSV-G V-5507 Sigma, 2 ⁇ g per lysate of a 35 mm dish
  • the blots are blocked with 1% BSA and with probes of a polyclonal antiphosphotyrosantantibody (P 11230 Transduction Laboratories) in a dilution of 1: 500, an antibody against SHP-1 (P17420 Transduction Laboratories ) in a dilution of 1: 2500 or an antibody against EGFR (sc-03 Santa Cruz) in a dilution of 1: 1000 and then with goat-anti-rabbit-antibody-peroxidase conjugate (sc-2004 Santa Cruz) in treated at a dilution of 1: 4000.
  • P 11230 Transduction Laboratories an antibody against SHP-1 (P17420 Transduction Laboratories ) in a dilution of 1: 2500 or an antibody against EGFR (sc-03 Santa Cruz) in a dilution of 1: 1000
  • sc-2004 Santa Cruz goat-anti-rabbit-antibody-peroxidase conjugate
  • the blots are blocked with 3% fat-free dry milk and with a polyclonal antibody against PDGFßR (06-498, UBI) in a dilution of 1: 1000 and then with goat anti- Rabbit-antibody-peroxidase conjugate or with a monoclonal antibody against VSV-G (V-5507 Sigma) in a dilution of 1: 5000 and then with a goat-anti-mouse-antibody-peroxidase conjugate (sc-2005 Santa Cruz ) developed in a dilution of 1: 4000.
  • PTP-Assa ⁇ s - cell lysates, PTP-immunoprecipitate and PDGFß - receptor preparations are obtained in the absence of phosphatase inhibitors and tested for PTP activity with [ 32 P] raytide as substrate as described above in an assay (8).
  • Raytide (Oncogene Research Products) is three hours at 30 ° C with pp60 src kinase (UBI) in a total volume of 30 ul 50 mM HEPES, pH 7.5, 0.015% Brij 35, 0.1 mM EDTA, 0, 1 mg / ml BSA, 0.2% P-mercaptoethanol, 20 mM MgCl 2 , 100 ⁇ M ATP and 30 ⁇ Cif ⁇ ⁇ PJATP incubated.
  • UBI pp60 src kinase
  • the labeling mixture is applied to a Dowex 1X-8 0.5 ml column equilibrated with 30% acetic acid and the 32 P labeled Raytide is eluted with acetic acid and stored in aliquots at -80 ° C ,
  • an aliquot is dried in a vacuum centrifuge and dissolved in assay buffer (50 mM MES, pH 6.0, 20 mM DTT).
  • assay buffer 50 mM MES, pH 6.0, 20 mM DTT
  • the lysates or immunoprecipitates (which are diluted accordingly in order to achieve activities in the linear region of the assay) are incubated for 30 minutes at 37 ° C. in 40 ⁇ l assay buffer with [12 P] Raytide (30,000-50,000 cpm).
  • the reaction is ice-cold by adding 750 ⁇ l Stop solution (0.9 M HC1, 90 mM sodium pyrophosphate, 2 mM NaH 2 PO 4 , 4% Norit A) stopped. After centrifugation for 10 minutes, 400 ⁇ l of the supernatant are subjected to a liquid scintillation counting.
  • Stop solution 0.9 M HC1, 90 mM sodium pyrophosphate, 2 mM NaH 2 PO 4 , 4% Norit A
  • UV treatment inactivates protein tyrosine phosphatases, but does not induce cross-linking of receptors or association of receptors that could be chemically cross-linked. It is known that the irradiation of cells with UV leads to an effective autophosphorylation of both the EGF receptor and the PDGF receptor. Studies are being carried out to determine whether induced dimerization is involved in the ligand-independent activation of the growth factor receptor by UV radiation. Studies on the PDGF receptor are described below, but the invention is not restricted to this. Crosslinking conditions for the PDGF receptor are already known. In addition to activation in intact cells, conditions of sufficiently strong UV-induced autophosphorylation are being developed in vitro. For the UV radiation, isolated PDGF receptor in Triton-X-100-containing membrane fractions of TRMP cells, which have been stably transfected with a known human PDGFP receptor expression construct, is used.
  • Vanadate or UV on the receptor phosphorylation as described above required incubating the phosphorylation reaction mixture at a higher temperature (25 ° C, see examples), in line with the previously made observation that no PDGF receptor dephosphorylation by endogenous PTP (s) in membranes or on ice Receptor preparations takes place.
  • the kinetics of the receptor dephosphorylation is investigated with or without preceding UV irradiation.
  • PDGF ⁇ receptor autophosphorylation is performed on ice and the kinase reaction is then stopped by adding unlabeled ATP and the samples are placed in a 25 ° C environment. Aliquots are removed at different times to evaluate the extent of receptor phosphorylation. As shown in Figures IC and 1D, receptor dephosphorylation is clearly inhibited by UV radiation.
  • the receptor is autophosphorylated and then incubated with endogenous PTP (s).
  • the phosphorylation of a synthetic peptide substrate is then measured under conditions of inhibited PTP (s).
  • Receptor phosphorylation at the dimer and monomer positions (FIG. 2B, lane 2, in comparison to control lane 1), the latter presumably due to the fact that the crosslinking is always incomplete for technical reasons.
  • UV treatment resulted in a strong enhancement of receptor phosphorylation, which is only visible at the monomer position in the absence of PDGF and at both the monomer and dimer positions in the presence of PDGF.
  • UV radiation instead modulates PDGF receptor phosphorylation by its effect on receptor-directed PTP (s).
  • UV inactivates PTP (s) in intact cells A hypothesis for such a mechanism, which is based on an UV-dependent increase in receptor phosphorylation, would be that the level of expression of receptor-directed PTP (s) influences the UV reaction. High PTP levels reduce the impact of UV.
  • the PTP SHP-1 was claimed to be involved in the negative regulation of the EGFR in A431 cells. Treatment of these cells with UV to enhance EGFR phosphorylation to an extent similar to ligand-induced receptor phosphorylation. The activation of MAPKAP K2 is a typical indicator and presumably an important mediator of various stress reactions. Treatment of A431 cells with UVC resulted in an essential one Increased activity of MAPKAP K2.
  • RPTP ⁇ and DEP-1 dephosphorylate growth factor receptors in transient coexpression.
  • Variants of these PTP (s) labeled with VSV were transiently overexpressed in 293 cells, the cells were irradiated with UV, and the effect on PTP activity was evaluated by testing PTP immunoprecipitates with [ 32 P] Raytide as substrate. As shown in Fig. 6, the activity of all three PTP (s) decreased with UV irradiation.
  • RPTP ⁇ was chosen to investigate the effects of UV inactivation of PTP on the interaction with the autophosphorylated PDGFß receptor.
  • RPTP ⁇ had a strong dephosphorylating effect on the PDGF receptor (Fig. 7, lane 6 compared to lane 1, lane 10 compared to lane 5).
  • the UV-treatment made the phosphorylation of the PDGFß receptor easily compared to non-irradiated cells (lane 6) in the absence of cotransfected PTP (FIG. 7, lane 2-4) and in the presence of cotransfected RPTP ⁇ significantly more drastic (FIG.
  • a cysteine-to-serine mutation of various PTP (s) led to inactive phosphatases, which nevertheless bind to substrates and remain associated with them (substrate trapping).
  • the present invention shows that the Inactivation of the catalytically active RPTP ⁇ cysteine by UV may produce a similar "substrate-trapping" enzyme conformation and can be coprecipitated with the receptor. This was investigated by coprecipitation experiments with the PDGFß receptor and RPTP ⁇ .
  • the essence of the present invention generally applies to dephosphorylating enzymes, for example protein tyrosine phosphatases and phosphorylated proteins, for example receptor tyrosine kinases.
  • dephosphorylating enzymes for example protein tyrosine phosphatases and phosphorylated proteins, for example receptor tyrosine kinases.
  • the present results are therefore of great interest for the further investigation of medically highly relevant receptors, for example for the insulin receptor or the receptor which is involved in neurodegenerative diseases or cancer diseases, but also for those which have not yet been precisely characterized.
  • the following references were given in the examples:
  • Fig. 1 Effect of UV irradiation on the extent of RTK phosphorylation and on the PTP activity in PDGFßR-enriched membrane micelle fractions.
  • the PDGFß receptor was partially purified from TRMP cells overexpressing hPDGFßR by several chromatography steps. The resulting Triton-X-100-containing receptor fractions were treated with different agents as indicated or irradiated with UVC (2 kJ / M 2 ).
  • (A) PDGF-BB or the appropriate solvent was added and the PDGFß receptor was allowed to autophosphorylate on ice for 10 minutes in the presence of [ ⁇ ⁇ PJATP. The reaction was stopped by adding 2 mM unlabeled ATP and the samples were incubated at 25 ° C.
  • Fig. 2 Effect of PDGF stimulation and UV treatment on the formation of crosslinkable PDGF receptor dimers in vitro.
  • the partially purified PDGFß receptor was treated with UVC (2 kJ / m 2 ), PDGF-BB or both as indicated, then subjected to an autokinase reaction in the presence of [ ⁇ 32 P] ATP as described in the legend of Figure 1A and finally with treated with the crosslinking agent disuccinimidyl suberate.
  • the samples were on PAGE gels with a gradient of 4-9% separated and analyzed by immunoblotting with antibodies against PDGFR (A) or autoradiography (B).
  • Fig. 3 Effect of PDGF stimulation and UV treatment on the formation of cross-linkable PDGF receptor dimers in intact cells.
  • 293 cells were transiently transfected with hPDGFßR, treated with radiation or treated with UVC (2 kJ / m 2 ) or PDGF-BB or both, and subjected to a crosslinking reaction with the bis [sulfosuccinimidyl] suberate agent, which can penetrate the cells, or to radiation treatment .
  • the cell PDGF ⁇ -receptor-containing glycoprotein fraction obtained by adsorption on wheat germ agglutinin agarose was examined by gradient PAGE and immunoblotting with antibodies against PDGFR (A) or antibodies against phosphotyrosine (B).
  • FIG. 4 Effect of overexpression of PTP on the UV-induced stress response in A431 cells.
  • A431 cells overexpressing the PTP SHP-1 or radiation-transfected A431 cells were subjected to radiation treatment or UVC (2 kJ / m 2 ) treatment as indicated.
  • the cell extracts were examined with Hsp25 as substrate for MAPKAP -K2 activity (A).
  • the overexpression of SHP-1 was detected using immunoblots (B).
  • FIG. 5 Effect of UV treatment on PTP activity in anti-SHP-1 immunoprecipitates from A431 cells that overexpress SHP-1.
  • A431 cells that stably overexpress SHP-1 were radiation treated as indicated or treated with radiation of different wavelengths (2 kJ / m 2 ) or treated with IAA, with and without prior incubation of the cells with NAC.
  • the lysates were immunoprecipitated and the activity of immunoprecipitated SHP-1 was assessed
  • Fig. 6 Effect of UV treatment on the activity of three transmembrane PTP (s) in intact cells.
  • 293 cells were transiently transfected with radiation constructs with expression constructs for the VSV-labeled PTP (s) RPTP ⁇ , DEP-1 or RPTP ⁇ or with the corresponding catalytically inactive CS mutants and treated with UVC (2.5 kJ / m 2 ).
  • the lysates were immunoprecipitated with antibodies against VSV and the PTP activities in the immunoprecipitates were compared with the substrate [ 32 P] Raytide checked.
  • Fig. 7 Effect of UV treatment on the activity of the transmembrane PTP RPTP ⁇ against coexpressed PDGFß receptor.
  • 293 cells were transiently transfected with expression constructs for PDGFßR alone or in combination with RPTP ⁇ . The cells were treated with UV at different wavelengths or with PDGF as indicated and the cell lysates were analyzed for the extent of tyrosine phosphorylation of PDGFR (A) and for the expression levels of PDGFR (B).
  • Fig. 8 Coimmunfall of PDGFß receptor with the PTP RPTP ⁇ , and effect of UV radiation.
  • 293 cells were transiently transfected with expression constructs for PDGFßR alone or in combination with VSV-labeled RPTP ⁇ (wt) or the catalytically inactive CS mutant of RPTP ⁇ (CS).
  • the cells were treated with radiation (as indicated) or with UVC (2 kJ / m 2 ), with PDGF-BB or with both, and the PTP (s) were immunoprecipitated from the cell lysates with antibodies against VSV. Comparable amounts of PTP were immunoprecipitated and the expression level of the PDGFß receptor was similar in the different cell populations (not shown).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Komplex, der an der Kontrolle der Zellregulation beteiligt ist, umfassend ein dephosphorylierendes Enzym und ein phosphoryliertes Protein, deren Effektoren und/oder Substrate, sowie Verfahren zu ihrer Gewinnung und/oder Bestimmung, sowie ihre Anwendung.

Description

Komplex mit spezifischen dephosphorylierenden Enzymen, deren Effektoren und Verfahren zu ihrer Gewinnung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen an der Kontrolle der Zellregulation beteiligten Komplex enthaltend ein dephosphorylierendes Enzym und ein phosphoryliertes Protein, Effektoren des Komplexes und Verfahren zu deren Gewinnung bzw. Identifizierung.
Veränderungen der Genexpression werden durch extrazelluläre Reize ausgelöst, die in den meisten Fällen von Zelloberflächenrezeptoren wahrgenommen werden. Eine Hauptklasse von Zelloberflächenrezeptoren, die Rezeptoilyrosinkinasen, ist so ausgerüstet, daß sie mit spezifischen Wachstumsfaktoren reagiert. Bei der Bindung eines Liganden phosphorylieren die Rezeptoruntereinheiten einander. Die phosphorylierten
Tyrosinpeptideinheiten werden anschließend zu Binde- bzw. Andockstellen für zahlreiche Proteine des Signaltransduktionsnetzwerks, das an allgemeinen Mechanismen zur Regulation von Vorgängen in der Zelle, der Zellproliferation oder von Zelldifferenzierungen beteiligt ist (Ullrich und Schlessinger, 1990, Cell 61 : 203-212).
Zahlreiche Protemtyrosinkinasen (PTKs) sind bereits genau charakterisiert, wie zum Beispiel der PDGF (platelet-derived growth factor)- Rezeptor, der EGF (epidermal growth factor)-Rezeptor sowie der Insulinrezeptor, Kinasen der Src -Familie, sowie viele andere. In jüngster Zeit wurde gezeigt, daß auch die Proteintyrosinkinasen selbst entweder positiv oder negativ reguliert werden, und zwar von den Proteintyrosinphosphatasen (PTP(s)) (Charbonneau und Tonks, 1992, Annu. Rev. Cell Biol., 8: 463-493 und Pot und Dixon, 1992, Biochim. Biophys. Acta, 1136:35-43). Zum Beispiel werden die Protemtyrosirikinasen der Src -Familie durch Proteintyrosinphosphatasen aktiviert, während die EGF-Rezeptorkinase oder die suli rezeptorkinase einer negativen Regulation durch Tyrosinphosphatasen unterliegen. Ferner werden auch Substrate der PTKs, die eine intrazelluläre
Signalübertragung von Zelloberflächenrezeptoren vermitteln, durch PTPs reguliert.
In den meisten Fällen sind jedoch die spezifischen Phosphatasen der jeweiligen Zelloberflächenrezeptoren, d.h. die spezifischen (Enzym-Substrat)- Paare von Phosphatasen und Rezeptorkinasen unbekannt. Kenntnisse über spezifische Effektoren oder Substrate, die für beide Enzymklassen von medizinisch hoher Relevanz sind, sind daher ebenfalls nur beschränkt verfügbar.
Beispielsweise ist die gezielte Inaktivierung der Tyrosinphosphatase PTPα bei der Maus von Ponniah, S. et al. (Current Biology, Band. 9, Nr. 10: 535-538) offenbart. Hier wurde die positive Regulierung von Src-Kinasen durch PTPα- vermittelte Dephosphorylierung gezeigt. Dieses Verfahren der gezielten Inaktivierung von spezifischen PTP-Genen erfordert jedoch bereits eine genaue Kenntnis der zu untersuchenden Phosphatase. Außerdem ist es sehr zeitaufwendig und erfordert immensen technischen Aufwand. Es stellt daher nicht das Verfahren der Wahl zur Identifizierung einer Vielzahl spezifischer Phosphatase-Kinase-Paare dar.
Die oben angeführten Probleme werden nun durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Aus Untersuchungen geht hervor, daß zusätzlich zu den physiologischen Reizen auch viele schädliche Agenzien wie Carcinogene, metallische Toxine, Oxidanzien sowie Strahlung zur Induktion von Signaltransduktions-Kaskaden und zu Veränderungen bei der Genexpression führen können. Am intensivsten wurden bisher die Auswirkungen von ultravioletter Strahlung (UV+) unterschiedlicher Wellenlängen untersucht.
Die Reaktion auf UV scheint von mehreren primären Strahlungszielmolekülen abzuhängen. Interessant ist, daß ein Teil der unmittelbaren Reaktion auf UV durch eine ligandenunabhängige Aktivierung von Wachstumsfaktorrezeptoren vermittelt wird.
Es werden zum Beispiel der epidermal growth factor receptor (EGFR) und der platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) bei UV-Bestrahlung von kultivierten Zellen innerhalb von Sekunden autophosphoryliert. Es scheint, daß die Autophosphorylierung zu einer vollständigen funktioneilen Signalvermittlung beim Rezeptor fuhrt, wobei durch die Liganden die Untereinheiten der Rezeptortyrosinkinasen dimensiert werden. Dieser Vorgang ist für die AutophosphoryHerung notwendig.
Bei der UV-Strahlung handelt es sich jedoch um ein unspezifisches Agens. Eine kovalente Vernetzung der Rezeptortyrosinkinase-Untereinheiten durch UV wurde ausgeschlossen. Die für eine Vernetzung von Proteinen erforderliche UV- Dosis liegt um mindestens eine Größenordnung höher als die zur wirksamen Aktivierung der Rezeptoren nötige Dosis. Obwohl UV die Rezeptorkinaseaktivität, d.h. die PDGFß-Rezeptorkinaseaktivität stark induziert, bringt sie die Rezeptor-Untereinheiten nicht in die gleiche chemisch vernetzbare Konfiguration wie der PDGF-Ligand selbst.
Im folgenden bringt die vorliegende Erfindung den Beweis, daß UV- Strahlung zur Inaktivierung der katalytischen Funktion der Proteintyrosinphosphatase führt.
Eine UV-Behandlung inaktiviert Proteintyrosinphosphatasen, induziert jedoch keine Vernetzung der Rezeptoren und auch keine Assoziation von Rezeptoren, die chemisch vernetzt werden könnten. Es ist bekannt, daß die UV-Bestrahlung von Zellen zu einer wirksamen Autophosphorylierung sowohl des EGF-Rezeptors als auch des PDGF-Rezeptors führt. Es wurden Untersuchungen dahingehend durchgeführt, ob eine ligandenunabhängige Aktivierung von Wachstumsfaktorrezeptoren durch UV-Bestrahlung eine induzierte Dimerisierung beinhalte.
Im folgenden werden Untersuchungen am PDGF-Rezeptor beschrieben, die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschränkt.
Für den PDGF-Rezeptor sind die Vernetzungsbedingungen bereits bekannt. Außer der Aktivierung in intakten Zellen wurden Konditionen einer genügend starken UV-induzierten Autophosphorylierung in vitro erarbeitet. Für die UV- Bestrahlung wurden isolierte PDGF-Rezeptoren in Triton-X-100-haltigen Membranfraktionen von TRMP -Zellen verwendet, die mit einem aus sich bekannten Human-PDGFß-Rezeptor-Expressionskonstrukt stabil transfϊziert sind.
Eine UV-Behandlung dieser Präparate erhöhte sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart von PDGF die Autophosphorylierung der PDGFß -Rezeptoren stark (Fig. 1A, Bahn 3 und 8 im Vergleich zu 1 und 6). Wurde vor der UV- Bestrahlung das Reduktionsmittel NAC zugegeben, so wurde diese Erhöhung fast vollständig verhindert (Bahn 5 und 10). Ein NAC-Zusatz nach der UV- Bestrahlung führte zu einer teilweisen Verringerung des Phosphorylierungs"signals" (Bahn 4 und 9), was nahelegt, daß die UV- Wirkung auf die Phosphorylierung des Rezeptors durch das Reduktionsmittel teilweise rückgängig gemacht werden kann. Eine Behandlung des Präparats mit dem bekannten PTP -Hemmstoff Vanadat erhöhte die Phosphorylierung des Rezeptors auf ein ähnliches Niveau wie bei der UV-Bestrahlung (Bahn 2 und 7), was anzeigt, daß in dem Rezeptorpräparat PTP(s) vorliegen, die das Ausmaß der Phosphorylierung des Rezeptors negativ beeinflussen. Obwohl das Präparat mehrere Male gereinigt wurde, ist tatsächlich mit [32P]Raytide als Substrat eine endogene PTP-Aktivität leicht nachzuweisen (Fig. 1B), was nahelegt, daß PTK und PTP möglicherweise in der Plasmamembran in natürlicher Assoziation vorliegen. Diese PTP-Aktivität wurde durch Behandlung sowohl mit UV als auch mit Vanadat stark gehemmt, während NAC eine Inaktivierung durch UV verhinderte und teilweise rückgängig machte (Fig. 1B).
Eine erhöhte Phosphorylierung des PDGFß -Rezeptors korreliert daher stark mit einer Inaktivierung endogener PTPs.
Rezeptortyrosinkinasen sind im aktiven Zustand Dimere oder Multimere, und es wird angenommen, daß der spezifische Ligand die Bildung von Dimeren induziert und so die Autophosphorylierung und die anschließende Signalübertragung auslöst. Für dieses Modell spricht eine Vielzahl von Beobachtungen, z.B. die Tatsache, daß manche Liganden selbst als Dimere agieren und eine entsprechende Adaptierung von Rezeptor-Untereinheiten auslösen, was besonders gut für PDGF-Heterodimere dokumentiert ist. Andere Wachstumsfaktoren müssen an eine makromolekulare Matrix wie Heparansulfat gebunden vorliegen; eine strukturelle Ordnung, die auf die spezifischen Rezeptoren übertragen werden kann, wodurch wiederum die Rezeptor- Untereinheiten in sterische Nähe gebracht, also oligomerisiert werden. Es ist klar, daß die Autophosphorylierung durch gegenseitige Katalyse der Rezeptor- Untereinheiten stattfindet, was am besten durch die Erkenntnis belegt ist, daß eine transfizierte katalytisch inaktive Untereinheit durch das Wildtyp- Partnerdimer phosphoryliert wird. Schließlich führt die Wechselwirkung des Liganden mit dem Rezeptor zu einer „Nähe" von Rezeptor-Untereinheiten, die durch chemische Vernetzungsmittel fixiert werden kann.
Die Beobachtung der ligandenunabhängigen Aktivierung von Rezeptortyrosinkinasen macht es erforderlich, dieses Modell neu zu überdenken. Unter dem Einfluß von UV-Bestrahlung, von Oxidanzien, von metallorganischen Verbindungen oder der Aktivierung einer anderen Rezeptorklasse, von mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren, tritt eine gegenseitige Untereinheiten-Autophosphorylierung von mehreren
Rezeptortyrosinkinasen in Abwesenheit ihrer spezifischen Liganden auf, was nahelegt, daß ein beträchtlicher Teil der Rezeptoren vor der Wechselwirkung mit dem Liganden in Form einer Dimerassoziation vorliegt. Die Möglichkeit, daß eine natürlich vorkommende transiente Assoziation durch Behandlung mit diesen „Nichtliganden" stabilisiert und verlängert wird, ist aufgrund der unterschiedlichen Natur dieser Behandlungen unwahrscheinlich. Durch die Erkenntnis, daß die Wirkung von UV, Oxidanzien und metallorganischen Verbindungen von dem Substratrezeptor getrennt und mit PTP(s) verbunden werden kann, wird dies noch unwahrscheinlicher. Aufgrund der dieser Erfindung zugrundeliegenden Resultate wird angenommen, daß die Regulation der Rezeptortyrosinkinasen zum Großteil durch eine Modifizierung der Dephosphorylierung von Rezeptortyrosinkinasen ausgeübt wird. Durch die transiente oder permanente Inaktivierung spezifischer PTP(s) wird die Hemmung der spontan aktiven Rezeptortyrosinkinase aufgehoben.
In der vorliegenden Erfindung wird gezeigt, daß UV-Bestrahlung die Bildung von Rezeptordimeren nicht fördert. Es ist bekannt, daß die chemischen Vemetzungsmittel nach Stimulation mit PDGF erfolgreich Rezeptorketten verbinden. UV-Bestrahlung war unter keinen Bedingungen dazu im Stande, daß die Rezeptoren vernetzbar wurden, obwohl ähnliche
Autophosphorylierungsgrade erzielt wurden. Dies bedeutet, daß entweder die Dimerisierung von Rezeptoren in der Abwesenheit eines Liganden zu kurz oder zu unstabil ist, um eine wesentliche Vernetzung zu gestatten, jedoch bei Hemmung der PTP(s) zur Autophosphorylierung der Rezeptoren führt, oder daß die Rezeptorketten immer assoziiert sind und eine Vernetzung durch das jeweilige chemische Vernetzungsmittel eine durch den Liganden, jedoch nicht durch UV, verursachte Konformationsänderung anzeigt. Bei der Überexpression wird jedoch ein Teil der Rezeptoren auch in Abwesenheit eines Liganden vernetzbar. (Offenbar wird durch die Überexpression der Anteil an Rezeptoren sichtbar, die spontan eine solche Konformation einnehmen). Dies ist in der vorliegenden Erfindung deutlich gezeigt, für den Fall der Überexpressionen von PDGFß-Rezeptoren in 293-Zellen (Fig. 3). Die Bildung von Rezeptordimeren findet daher in Abwesenheit von Liganden statt und wird durch die (relativ unwirksame) chemische Vernetzung nachweisbar, wenn das Gleichgewicht in ausreichendem Maß in Richtung des Dimerzustands verlagert wird, und zwar entweder durch Überexpression oder durch Ligandenbindung. Solch eine Verlagerung ist bei UV-Bestrahlung nicht nachzuweisen. Es kann daher gesagt werden, daß die vorliegende Erfindung Daten zugänglich macht, die die Hypothese, daß eine UV-induzierte Aktivierung von Rezeptortyrosinkinasen durch Vernetzung von Rezeptoren oder durch verstärkte Assoziation (Cluster- Bildung) vermittelt wird, nicht unterstützen.
Die vorliegende Erfindung zeigt außerdem deutlich, daß eine durch UV hervorgerufene verstärkte Phosphorylierung von Rezeptoren eine intrinsische PDGF-Rezeptorkinaseaktivität erfordert, sie jedoch nicht steigert. Wie bereits an Präparaten von intakten Zellen und Zellmembranen gezeigt wurde, wird die Dephosphorylierung von Rezeptoren durch UV-Bestrahlung in einem PDGFß -Rezeptorpräparat, das eine Rezeptor-gerichtete PTP-Aktivität aufweist, verzögert. Infolge dessen wird die Tyrosmphosphorylierung des Rezeptors verstärkt. Bei dieser Verstärkung handelt es sich um eine Funktion des Rezeptors selbst und nicht um die Funktion einer anderen Tyrosinkinase, z.B. einer der Src -Familie, von der bekannt geworden ist, daß sie mit dem PDGFß - Rezeptor in Wechselwirkung steht und fähig ist, den Rezeptor zu phosphorylieren.
Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, daß der spezifische PDGF- Rezeptorkinasehemmstoff AG 1296, der gegenüber Kinasen der Src -Familie nicht aktiv ist, die durch UV verursachte Erhöhung des Phosphorylierungsniveaus des PDGF-Rezeptors vollständig zunichte machte. Zur Reaktion auf UV ist daher die intrinsische Kinaseaktivität des PDGFß -
Rezeptors erforderlich, und die Beteiligung anderer Kinasen ist unwahrscheinlich.
Es wird vermutet, daß der PDGFß -Rezeptor durch Autophosphorylierung am Tyrosin 857 innerhalb der Kinasedomäne aktiviert wird. In Übereinstimmung mit diesem Konzept weisen Rezeptorvarianten mit einer Mutation am Tyrosin 857 eine verringerte Signalübertragungs-Aktivität auf. Trotzdem wurde in früheren Untersuchungen gezeigt, daß eine Mutation dieses Rests oder eine Hemmung seiner Phosphorylierung einen Großteil der Kinaseaktivität unverändert läßt, was nahelegt, daß die PDGFß -Rezeptorkinaseaktivität weniger streng durch Autophosphorylierung reguliert wird als dies bei anderen Rezeptortyrosinkinasen der Fall ist. Die Erwartung, daß Unterschiede bezüglich der Rezeptorphosphorylierung mit oder ohne UV-Behandlung in vitro zu Veränderungen der Rezeptoraktivität gegenüber einem exogenen Substrat führen würden, wurde nicht beobachtet. Andererseits kann die Dephosphorylierung des Rezeptors durch endogene PTP(s) unterschiedliche
Autophosphorylierungsstellen unterschiedlich stark betreffen und die Unterschiede bezüglich der Gesamtphosphorylierung, die in vitro beobachtet wurde, spiegeln gegebenenfalls die Phosphorylierung am Tyrosin 857 nicht wider. Hier sind zukunftig intensivere Untersuchungen erforderlich. Aus den vorliegenden Untersuchungen geht jedoch hervor, daß UV die Rezeptorkinase nicht direkt aktiviert, was wiederum mit einem PTP- vermittelten Mechanismus einer durch UV induzierten Hyperphosphorylierung in Einklang steht. Diese letztgenannte Beobachtung, die an einem in-vitro- System gemacht wurde, schließt nicht aus, daß eine durch UV induzierte verstärkte Rezeptorphosphorylierung, die gegenüber der Inaktivierung von PTP sekundär ist, bei intakten Zellen zu einer verstärkten Kinaseaktivität führt. Zum Beispiel ist anzunehmen, daß in intakten Zellen zusätzliche Rezeptor-spezifische PTP(s) vorliegen, deren Inaktivierung möglicherweise dazu führt, daß auf einzelne Phosphorylierungsstellen eine andere Wirkung als in der in-vitro- Situation ausgeübt wird. Eine Signalübertragung könnte jedoch als Alternative oder zusätzlich zu einer Erhöhung der Kinaseaktivität auch durch eine verstärkte Bindung von SH2-Domäneproteinen an die hyperphosphorylierten Rezeptoren ausgelöst werden.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein Beweis dafür bereitgestellt, daß UV definierte, an Rezeptoren gerichtete PTP(s), insbesondere das der EGF- und PDGF-Rezeptoren, inaktiviert. Es ist anzunehmen, daß die physiologische Regulation von Rezeptortyrosinkinasen durch Dephosphorylierung einen gewissen Grad an Substratspezifϊtät der jeweiligen PTPs erfordert, was nicht ausschließt, daß je nach Zelle, unterschiedliche PTP(s) die Fähigkeit aufweisen könnten, einen gegebenen Rezeptor zu dephosphorylieren. Außerdem kann eine Rezeptor-Dephosphorylierung mit einer Spezifität einer gegebenen PTP für bestimmte Phosphorylierungsstellen auftreten, und ein vollständiges Herabregulieren der Rezeptoraktivität könnte daher mehrere PTP(s) erfordern. Aus früheren Erfahrungen bezüglich der relativ niedrigen PTP-
Spezifität in vitro ist anzunehmen, daß die PTP-Substrat-Spezifität in der intakten Zelle dadurch erreicht wird, daß der Substratrezeptor mit seiner spezifischen PTP stark kompartimentiert vorliegt. Die in angereicherten PDGF- rezeptorhaltigen Membranvesikeln beobachtete spezifische Dephosphorylierung, die im vorliegenden Text vorgestellt wird, läßt an eine Lokalisierung der betreffenden PTP in der Membran in enger Assoziation mit dem Rezeptor denken. PTP(s), die an die Plasmamembran gebunden sind, z.B. transmembrane PTP(s), sind daher wahrscheinliche Kandidaten für die Negativregulation der Rezeptoren. Die Überexpression solcher in Frage kommenden PTP(s), z.B. RPTPα (Fig. 4) oder DEP-1 und RPTPσ, hat tatsächlich die Autophosphorylierungsaktivität der hier gewählten beiden Rezeptoren herunterreguliert. Eine weitere mögliche PTP für die Dephosphorylierung des EGF-Rezeptors und möglicherweise des PDGF-Rezeptors ist die SH2-Domänen- PTP SHP-1. Es wird hier nachgewiesen, daß die UV-Behandlung von intakten
Zellen zur Inaktivierung von gegen Wachstumsfaktor-Rezeptor gerichteter PTP(s) führt und so eine durch UV hervorgerufene Signalübertragung auslöst, welche Zellvorgänge im allgemeinen sowie Zellproliferation- oder Zeildifferenzierungsvorgänge reguliert. Die Erklärung hierfür ist, daß UV im katalytischen Zentrum der
PTPs über ein reaktionsfähiges Zwischenprodukt das essentielle Cystein oxidiert. Es ist sehr wahrscheinlich, daß PTP(s) auch physiologisch durch Redoxmechanismen reguliert werden. UV und andere Agenzien, z.B. H2O2, führen das System dadurch „irre", daß sie PTP(s) oxidieren und eine Signalübertragung des Rezeptors in Abwesenheit eines Liganden auslösen.
Zusätzlich ist ein überraschendes Ergebnis der vorliegenden Erfindung, daß es sich bei den UV-inaktivierten PTP(s) um ein geeignetes System zur wirksamen Bestimmung spezifischer, eine Wechselwirkung eingehender Paare von Protemtyrosinkinasen und ihren Phosphatasen und umgekehrt handelt. Die vorliegenden UV-inaktivierten PTP(s) weisen das unerwartete Merkmal auf, daß sie spezifisch an ihr Substrat binden, ohne es katalytisch zu metabolisieren. Das bedeutet, daß sie gebunden bleiben, während eine aktive PTP das Substrat nach der Spaltung freisetzt. Die UV-inaktivierten PTP(s) eignen sich daher zum „Einfangen" ihrer spezifischen Substrate, d.h. der Zelloberflächenrezeptorkinasen.
Durch die relativ stabile Komplexbildung der Kinase-Phosphatase Substrat-Enzym-Komplexe können diese spezifischen Patner identifiziert werden. Ist eine Tyrosinkinase bekannt, kann mit spezifischen Antikörpern gegen die Tyrosinkinase der Komplex präzipitiert werden und die assoziierte spezifische Phosphatase identifiziert werden. Umgekehrt kann bei bekannter Phosphatase die zugehörige Substrat-Kinase präzipitiert und identifiziert werden. Es ist denkbar, die Interaktion zwischen oxidierter Phosphatase und Substrat zur Entdeckung von interferierenden Substanzen (Drugs) zu nutzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen spezifischen Komplex, der an der Kontrolle der Zellregulation beteiligt ist und ein durch Oxidation desaktiviertes dephosphorylierendes Enzym und ein phosphoryliertes Protein enthält.
Bei diesem Komplex unterliegen das dephosphorylierende Enzym und das phosphorylierte Protein einer spezifischen gegenseitigen Wechselwirkung in Form einer spezifischen chemischen Bindung, d.h. sie binden spezifisch aneinander im Sinn einer Enzym-Substrat-Bindung.
Das in dem vorliegenden Komplex enthaltene dephosphorylierende Enzym ist weiterhin so modifiziert, daß es an das phosphorylierte Protein gebunden wird, ohne dieses phosphorylierte Protein katalytisch umzuwandeln. Innerhalb des dephosphorylierenden Enzyms dieses Komplexes ist die Aminosäure im aktiven Zentrum, das für die katalytische Funktion des dephosphorylierenden Enzyms verantwortlich ist, oxidiert. Die Desaktivierung des dephosphorylierenden Enzyms, das in dem vorliegenden Komplex vorhanden ist, ist reversibel. Die Modifikation des dephosphorylierenden Enzyms wird durch Mittel aus der Gruppe Bestrahlung, vorzugsweise UV- Bestrahlung, Oxidanzien, vorzugsweise Wasserstoffperoxid, alkylierende Mittel und/oder Kombinationen davon bewirkt. Bei dem vorliegenden Komplex wird die Modifikation des dephosphorylierenden Enzyms durch UVA-Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 320 bis 400 nm, vorzugsweise von 335 bis 370 nm, besonders bevorzugt 335 nm oder mittels UVB-Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 280 bis 320 nm, vorzugsweise 285 bis 330 nm, besonders bevorzugt 312 nm, oder UVC -Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 200 bis 280 nm und/oder Kombinationen davon bewirkt.
Der vorliegende Komplex weist ein dephosphorylierendes Enzym aus der Gruppe der Proteintyrosinphosphatasen auf.
Außerdem weist der vorliegende Komplex ein phosphoryliertes Protein aus der Gruppe der Protemtyrosinkinasen, vorzugsweise aus der Gruppe der Zelloberflächenrezeptoren mit Rezeptortyrosinkinase-aktivität, auf. Femer sind auch die Substrate der Rezeptortyrosinkinasen Gegenstand des erfindungs gemäßen Komplexes.
Der vorliegende Komplex ist dadurch gekennzeichnet, daß er sich in einem künstlichen System (in-vitro-System) oder in einen System natürlicher Herkunft, vorzugsweise lebender Zellen, besonders bevorzugt lebende Zellen höherer Organismen, insbesondere Säugetierzellen, befindet. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung dephosphorylierende
Enzyme, die in dem genannten Komplex enthalten sind, wobei die dephosphorylierenden Enzyme aus der Gruppe der Proteintyrosinphosphatasen stammen. Die erfindungsgemäßen dephosphorylierenden Enyzme bilden zeichnen sich ferner dadurch aus, daß sie einen Komplex mit den Substraten der phosphorylierten Proteine des zuvor genannten Komplexes bilden. D.h. die erfindungsgemäßen dephosphorylierenden Enzyme binden ebenfalls an die Substrate der phosphorylierten Proteine. Insbesondere heißt das, daß die Substrate der Protemtyrosinkinasen durch die Proteintyrosinphosphatasen reguliert werden. Femer betrifft die vorliegende Erfindung phosphorylierte Proteine, die in diesem Komplex enthalten sind, wobei die phosphorylierten Proteine aus der Gruppe der Protemtyrosinkinasen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenrezeptoren mit Rezeptortyrosinkinaseaktivität, stammen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind außerdem Substrate der phosphorylierten Proteine.
Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Identifizierung des genannten Komplexes oder der darin enthaltenen dephosphorylierenden Enzyme oder phosphorylierten Proteine, bei dem ein System mit mindestens einem dephosphorylierenden Enzym und mindestens einem phosphorylierten Protein verwendet wird, die phosphorylierenden Enzyme oxidativ desaktiviert werden, die desaktivierten phosphorylierenden Enzyme spezifisch an ein bestimmtes phosphoryliertes Protein gebunden werden, das in diesem System enthalten ist, wodurch ein bestimmter Komplex gebildet wird, der nicht katalytisch umgesetzt wird, wodurch der so gebildete bestimmte Komplex gewonnen wird, und die bestimmten, in diesem bestimmten Komplex enthaltenen Bestandteile indentifiziert werden.
Das Verfahren kann in einem künstlichen System oder in einem von der Natur stammenden System durchgeführt werden, vorzugsweise in einer lebenden Zelle, besonders bevorzugt in lebenden Zellen höherer Organismen, insbesondere von Säugetieren.
Weiterhin werden bei dem vorliegenden Verfahren die lebenden Zellen oder die isolierten dephosphorylierenden Enzyme durch Bestrahlung, vorzugsweise UV-Bestrahlung, Oxidanzien, vorzugsweise Wasserstoffperoxid, Alkyliermittel und/oder deren Kombinationen behandelt. In einer speziellen Variante des vorliegenden Verfahrens werden die dephosphorylierenden Enzyme durch UVA-Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 320 bis 400 nm, vorzugsweise von 335 bis 370 nm, besonders bevorzugt 335 nm oder mittels UVB-Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 280 bis 320 nm, vorzugsweise 285 bis 330 nm, besonders bevorzugt 312 nm, oder UVC- Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 200 bis 280 nm und/oder deren Kombinationen bewirkt desaktiviert. Die entstandene Desaktivierung der vorliegenden dephosphorylierenden Enzyme in dem vorliegenden Verfahren ist reversibel.
Innerhalb des obengenannten Verfahrens wird die Desaktivierung der dephosphorylierenden Enzyme durch eine Redoxreaktion, vorzugsweise eine Oxidation der Aminosäure in aktiven Zentren, die für die katalytische Funktion der Enzyme verantwortlich ist, erzielt.
Das vorliegende Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die dephosphorylierenden Enzyme aus der Gruppe der Proteintyrosinphosphatasen stammen und daß die phosphorylierten Proteine aus der Gruppe der Protemtyrosinkinasen, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenrezeptoren mit Rezeptortyrosinkinaseaktivität, stammen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen spezifischen Komplex oder dephosphorylierende Enzyme oder phosphorylierte Proteine oder phosphorylierte Enzymsubstrate, die jeweils mittels des genannten Verfahrens gewonnen wurden.
Außerdem umfaßt die vorliegende Erfindung ein (Screening)-Verfahren zur Identifizierung von Substraten der phosphorylierten Proteine, wobei die erfindungsgemäßen dephosphorylierten Enzyme und/oder die phosphorylierten Proteine unter physiologischen Bedingungen mit Verbindungen inkubiert werden, die potentielle Kandidaten für Substrate der PTKs darstellen, anschließend die gebildeten PTP-Substrat-Komplexe oder PTK-Substrat- Komplexe isoliert werden und die jeweilige Substratkomponente näher charakterisiert wird.
Außerdem und aufgrund der obengenannten Ergebnisse betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Desaktivierung von dephosphorylierenden Enzymen, bei dem lebende Zellen oder isolierte dephosphorylierende Enzyme mit Mitteln aus der Gruppe Bestrahlung, vorzugsweise UV-Bestrahlung, Oxidanzien, vorzugsweise Wasserstoffperoxid, Alkyliermittel und/oder deren Kombinationen behandelt werden.
Bei diesem Verfahren wird die Desaktivierung durch UVA- Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 320 bis 400 nm, vorzugsweise von 335 bis 370 nm, besonders bevorzugt 335 nm oder mittels UVB-Bestxahlung mit einer Wellenlänge von 280 bis 320 nm, vorzugsweise 285 bis 330 nm, besonders bevorzugt 312 nm, oder UVC-Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 200 bis 280 nm und/oder deren Kombinationen erzielt. Die nach diesem Verfahren erzielte Desaktivierung der dephosphorylierenden Enzyme ist reversibel. Außerdem ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die Desaktivierung der dephosphorylierenden Enzyme mittels einer Redoxreaktion, vorzugsweise eine Oxidation einer Aminosäure in den Aktivitätszentren, die für die katalytische Funktion der Enzyme verantwortlich sind, erzielt wird. Bei dem Verfahren werden dephosphorylierende Enzyme aus der Gruppe der Proteintyrosinphosphatasen und phosphorylierte Proteine aus der Gruppe der Protemtyrosinkinasen, vorzugsweise aus der Gruppe der Zelloberflächenrezeptoren mit Rezeptortyrosinkinaseaktivität, verwendet. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die durch das genannte Verfahren hergestellten desaktivierte dephosphorylierten Enzyme.
Da die vorliegende Erfindung die Komponenten, die an der Kontrolle der Zellregulation beteiligt sind, bereitstellen, betrifft die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung der Effektoren dieses Komplexes oder dieser dephosphorylierenden Enzyme oder dieser phosphorylierten Proteine oder deren Substrate, umfassend die Schritte, daß man diesen Komplex, dieses Enzym oder dieses Protein mit mindestens einer Testsubstanz inkubiert oder sie einer Bestrahlungsbehandlung unterzieht, anschließend die spezifische Aktivität und/oder das Ausmaß der Phosphorylierung der jeweiligen Komponenten bestimmt, wobei man als solche bekannte Verfahren verwendet, zusätzlich die spezifische Aktivität bzw. das Ausmaß der Phosphorylierung der jeweiligen Komponenten in Abwesenheit der Testsubstanz oder in Abwesenheit der Bestrahlung mißt, die jeweiligen spezifischen Aktivitäten bzw. das jeweilige Ausmaß der Phosphorylierung, die in den obengenannten Schritten erzielt werden, vergleicht, und so die Testsubstanz oder Substanzen bzw. Bestrahlung, die auf die Testkomponenten eine Regulationswirkung ausüben, identifiziert.
Innerhalb dieses Verfahrens stammen die Testsubstanzen aus der Gruppe der natürlichen, halbsynthetischen oder synthetischen Chemikalien bzw. biologisch bzw. pharmazeutisch wirksamen Verbindungen.
Außerdem betrifft die Erfindung Effektoren des Komplexes oder Substrate der phosphorylierten Proteine, die mittels dieses Verfahrens bestimmt werden. Dabei stammen die Effektoren oder Substrate aus der Gruppe der natürlichen, halbsynthetischen oder synthetischen Chemikalien bzw. biologisch bzw. pharmazeutisch wirksamen Verbindungen bzw. Bestrahlung.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des genannten Komplexes oder dieser dephosphorylierenden Enzyme oder dieser phosphorylierten Proteine oder deren Substrate zur Bestimmung der Effektoren von Proteinen, die an den Kontrollmechanismen der Zellregulation beteiligt sind.
Außerdem können der vorliegende Komplex bzw. die vorliegenden dephosphorylierenden Enzyme oder phosphorylierten Proteine zur Herstellung von modifizierten Effektoren oder Substraten von Proteinen, die an den Kontrollmechanismen der Zellregulation beteiligt sind, verwendet werden (Drug Design).
Außerdem kann man den oben beschriebenen Komplex oder die oben beschriebenen dephosphorylierenden Enzyme oder die phosphorylierten Proteine oder deren Substrate zur Entwicklung und Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Defekten bei der Übertragung von Zellsignalen bzw. Zellregulation bzw. Zellproliferation und/oder Zelldifferenzierung verwenden, vorzugsweise zur Entwicklung und Herstellung eines Mittels zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, Diabetes mellitus, Arteriosklerosis oder Kxebskrankheiten.
Vorzugsweise können die vorliegenden desaktivierten dephosphorylierenden Enzyme zur spezifischen Bestimmung von phosphorylierten Proteinen mittels Substrat-„trapping" verwendet werden.
Die vorliegenden Effektoren oder ihre an der Kontrolle der Zellregulation beteiligten Modifikationen können zur Entwicklung und Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Defekten bei der Übertragung von Zellsignalen bzw. Zellregulation bzw. Zellproliferation und/oder Zelldifferenzierung verwendet werden, außerdem zur Entwicklung und Herstellung eines Mittels zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, Diabetes mellitus, Arteriosklerosis oder Krebskrankheiten.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele beschrieben, die nicht limitierend sind:
Plasmide - Die cDNAs für Maus-RPTPα (1), Maus-RPTPσ (2), Human-DEP-1 (3) und Human-SHP-1 (4,5) sind über Dr. M. Thomas (St. Louis), Dr. M. Ogata (Osaka), Dr. A. Östman (Uppsala) und Dr. A. Ullrich (Martinsried) erhältich. Zur Einführung eines VSV-G-Epitopmarkers in RPTPα, RPTPσ und DEP-1 wird die entsprechenden DNAs in den Vektor pBluesrcipt II KS (Stratagene) subkloniert, und eine Sαcl-Stelle wurde stromaufwärts vom Stop- Codon mittels PCR eingefügt. Die für das VSV-G-Epitop kodierenden Oligonucleotide VSV1 (5'CTACACCGACATCG AGATGAACCGGCTGGGCAAGGAGCT3') und VSV2
(5'CCTTGCCCAGCCGGTTCATC TCGATGTCGGTGTAGAGCT3'), die von zu Sacl komplementären, überhängenden Sequenzen flankiert sind, werden in vitro annealed und in die neugeschaffene «Sßcl-Stelle der Phosphatase-DNAs kloniert. Die entstehenden DNAs werden anschließend in den Säugetierexpressionsvektor pRK5RS (6) subkloniert. cDNAs für den Human- EGF-Rezeptor (in pRK5RS) und den Human-PDGFß -Rezeptor sind über Dr. A. Ullrich (Martinsried) bzw. Dr. C.H. Heldin (Uppsala) erhältlich. Für eine transiente Expression wird die PDGFß -Rezeptor-cDNA in den mit EcoRI/Hindlll verdauten Vektor pcDNA3 (Invitrogen) subkloniert. Eine orts gerichtete Mutagenese der cDNAs von RPTPσ und DEP-1 zur Schaffung der Mutanten C1545S RPTPσ und C1239S PTP DEP-1 in pRK5RS erfolgt mit Hilfe des Verfahrens des U-markierten Templates nach Kunkel (7) und des Bio-Rad (München) Mutagene-Kit verwendete. Die C433 S -Mutation von RPTPα werden durch Mutagenese auf PCR-Grundlage unter Verwendung von Primern, die die gewünschten Mutationen und geeignete Schnittstellen zum Ersatz des ursprünglichen Fragments der Phosphatase-DNA durch das mutierte Fragment tragen, erzeugt. Die Struktur aller Konstrukte wird durch DNA-Sequenzierung überprüft.
Zellkultur und Transfektionen - 293 humane Embryonalnierenzellen werden gezüchtet und wie oben beschrieben (8) transient transfiziert. Stabil mit SHP-1-DNA transfizierte A431 -Zellen oder entsprechende scheintransfizierte A431-Zellen werden wie bei (Tenev et al., beschrieben) erhalten und in DMEM/10%FKS in Anwesenheit von 0,8 mg/ml G418 (Life Sciences) gezüchtet. Behandlungen mit UV und mit Wachstumsfaktoren - Die Zellen werden in 60-mm- oder 35-mm-Platten mit sechs Näpfchen gezüchtet und über Nacht in DMEM/0,5% FKS (transfizierte 293 Zellen) oder vier Stunden in serumfreiem DMEM (A431 -Zellen) nahrungsfrei gezüchtet. Die Zellen werden scheinbehandelt oder durch das Medium hindurch bestrahlt (2 ml in 60-mm- bzw. 1 ml in 35-mm-Schalen) mit Vetter-Lampen (Wiesloch) mit den folgenden Eigenschaften: Die halbe maximale k-Emission wird von der UVA-Lampe (UVL15) zwischen 335 und 370 nm mit 11,5 W/m2 in einem Abstand von 8 cm abgegeben, wobei der Peak der Maximalemission bei 355 nm liegt. Die halbe maximale λ-Emission wird von der UVB-Lampe (UVM 15) zwischen 285 und 330 nm abgegeben, wobei der Maximalpeak bei 312 nm liegt. Der insgesamt emittierte Lichtstrom wird in einem Abstand von 8 cm zu 9 W/m2 bestimmt. Zur UVC-Behandiung wird der Stratalinker 1800 (Stratagene) verwendet. Für alle Bestrahlungen wurde die Luft im Stratalinker durch Stickstoffgas ersetzt, um Ozoneffekte zu vermeiden, und falls nicht anders angegeben werden 2kJ/m2 eingesetzt. Die Zellysate werden direkt in den Schalen bestrahlt und die PDGF-Rezeptorpräparate werden auf Objektträgem bestrahlt (Gewebekammer-Objektträger mit 8 Näpfchen von Nunc). Zur Stimulierung des Wachstumsfaktors werden die Zellen mit 100 ng/ml PDGF-BB (TEBU, Frankfurt oder 10-100 ng/ml EGF (rekombinanter Human- EGF, Dr. R. Perez, Havana, Kuba) 5 Minuten bei 37°C behandelt.
MAPKAP-Kinase-2-Assay - Ungefähr lxlO"6 scheintransformierte oder mit SHP-1 transfizierte A431 -Zellen in 60-mm-Schalen werden vier Stunden in serumfreiem DMEM nahrungsfrei gezüchtet und mit EGF (100 ng/ml, 5 Minuten bei 37°C) oder dementsprechenden Lösungsmittel behandelt und anschließend scheinbehandelt oder wie oben beschrieben mit UVC-Licht (2kJ/m2) bestrahlt. Nach 30 Minuten bei 37°C werden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und dann durch Abschaben in PBS und 5-minütiges Zentrifugieren bei 2000 g geemtet. Die Pellets werden entweder in flüssigem Stickstoff schnellgefroren und bei -80°C aufbewahrt oder direkt in Lysepuffer lysiert (20 mM Tris/Acetat, pH 7,0, 0,1 mM EDTA, 1 mM EGTA, InM Na3VO4, 10 mM ß-Glycerophosphat, 50mM NaF, 5mM Pyrophosphat, 1% Triton X-100, ImM Benzamidin, 0,27M Saccharose, 0,1% ß-Mercaptoethanol, 0,2mM Phenylmethylsulphonylfiuorid), und zwar 15 Minuten auf Eis, und 10 Minuten bei 15000g zentrifugiert. Aliquotes an Gesamtzellprotein (50μg) wurden 10 Minuten bei 30°C in dem Assay-Puffer 20 mM HEPES pH 7,4, 50mM ß- Glycerophosphat, 0,lmM EDTA, 0,lmM ATP, 4mM Magnesiumacetat, 20μM H7, 20μM HA1077, 2,5 μM PK1, lμCi [ 2?] (ATP), der lOμg rekombinantes Hsp25 enthält, inkubiert. Die Kinasereaktion wird durch Zugabe von vierfach konzentriertem SDS-PAGE-Auftragspuffer gestoppt. Die 32P-Markierung von Hsp25 wird nach SDS-PAGE mit dem Cyclone Imaging System und dem OptiQuant-Softwarepaket (Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA) nachgewiesen und quantitativ bestimmt.
Vernetzungsversuche und in-vitro-Autophosphorγlierung des PDGF- Rezeptors (PDGFR) - Der PDGFß -Rezeptor wird aus hPDGFßR- überexprimierenden TRMP -Zellen (9), wie bei (10) beschrieben isoliert, und teilweise aufgereinigt. PDGFR-haltige Micellenfraktionen werden wie oben beschrieben scheinbehandelt oder bestrahlt. 10 μl dieses Ansatzes werden mit 10 μl 20 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM MnCl2, 1 mM DTT vermischt. Effektoren werden wie in den Legenden der Figur angegeben in den folgenden Konzentrationen zugegeben: Natriumorthovanadat - 0,1 mM; N-Acetylcystein (NAC) - 10 mM; Jodacetamid (IAA) - 5 mM. Die Proben werden 20 Minuten auf Eis mit PDGF-BB (Endkonzentration 1 μg/ml) oder dementsprechenden Lösungsmittel auf Eis inkubiert. Entsprechend der Legenden zu den Figuren 2 und 3 wird der spezifische PDGF-Rezeptorblocker AG 1 296 (11) in einer Endkonzentration von 10 μM miteinbezogen. Dann wird mit ATP versetzt (2,5 μ Ci, Endkonzentration 12,5 μM), und die Proben werden 10 Minuten auf Eis inkubiert. Hiemach wird die Reaktion entweder mit dem SDS-PAGE- Probenpuffer gestoppt oder es wird eine Mischung aus ATP und Phenylphosphat auf eine Endkonzentration von 2 mM bzw. 6 mM zugegeben und 30 Minuten bei 25°C weiterinkubiert und anschließend durch Versetzen mit SDS-PAGE- Probenpuffer gestoppt. Zur Vernetzung werden während der 30-minütigen Inkubation Disuccinimidylsuberat (Pierce, Endkonzentration 0,3 mM) oder das entsprechende Lösungsmittel DMSO (Endkonzentration 5%) zugegeben, und vor dem Stoppen mit SDS-PAGE-Probenpuffer wird mit Methylamin/HCl, pH 7,4 (Endkonzentration 70 mM) versetzt. Die Proben werden mittels SDS-PAGE auf Gelen mit einem Gradienten von 4-9% und anschließend mit Autoradio graphie oder Immunblotting unter Verwendung des Anti-PDGFR- Antikörpers DIG-1 (11) zwecks Nachweis analysiert. Zur Vernetzung von PDGFR in intakten Zellen wurde die leicht abgewandelte Methode von Tomaska und Resnick (12) verwendet. 293 transient mit HPDGFßR transfizierte Zellen wurden wie oben beschrieben mit UVC bestrahlt und dann bei 37°C mit lOOng/ml PDGF-BB stimuliert oder mit dem entsprechenden Lösungsmittel scheinbehandelt. Die Zellen werden suspendiert, in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis gegeben und viermal mit eiskaltem PBS gewaschen. Pro Röhrchen werden 1 ml eiskaltes PBS, 25 mM HEPES, pH 7,4, und entweder das Vemetzungsmittel Bis[sulfosuccinimidyl]-suberat (Pierce, Endkonzentration 1,5 mM) oder DMSO (Endkonzentration 1%) zugesetzt und 8 Minuten auf Eis stehen gelassen. Hiemach werden die Zellen zentrifugiert und 2 Minuten in PBS und lOmM Ammoniumacetat suspendiert und anschließend zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellpellets werden mit Lysepuffer wie unten beschrieben extrahiert und die Glycoproteine wurden durch Adsorption an Weizenkeim-Agaroseperlen angereichert, und zwar dadurch, daß man die Lysate mit 30 ml einer 1 : 1 Suspension von Weizenkeimagarose (Pharmacia) inkubiert und 45 Minuten bei 4°C über Kopf rotierten. Die Perlen werden einmal mit Lysepuffer gewaschen und die adsorbierten Proteine werden mit SDS-PAGE-Probenpuffer extrahiert und mit 4-9%-igen PAGE-Gelen und Immunblotting mit den Anti-PDGFR- Antikörpern DIG-1 oder den Antiphosphotyrosinantikörpem RC20 (E120H, Transduction Laboratories) analysiert. Zur Verfolgung der Rezeptorentphosphorylierungskinetik wird eine wie oben beschriebene Autophosphorylierung durchgeführt. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von unmarkiertem ATP und Phenylphosphat (Endkonzentrationen 2 mM bzw. 6 mM) gestoppt, die Reaktionsmischung bei 25°C stehen gelassen, und aliquote Teile entnommen und zu unterschiedlichen Zeiten mit SDS-PAGE-Probenpuffer vermischt (siehe Legenden zu Figuren 2 und 3.
Phosphorylierung eines exogenen Substratpeptids - Mit UV bestrahlte oder scheinbehandelte Proben von teilweise gereinigtem PDGFP -Rezeptor werden 30 Minuten auf Eis mit PDGF-BB (Endkonzentration 1 μg/ml) behandelt. Anschließend gibt man ATP zu (200 μM) und läßt die Autophosphorylierung 30 Minuten bei 25°C in Gegenwart von 2,5 mM MnCl2, 50 mM HEPES, pH 7,5 ablaufen. Die Kinasereaktion wird durch Zugabe von EDTA (2 mM) gestoppt und die Proben werden 60 Minuten bei 25 °C inkubiert. Die Proben werden auf Eis gegeben und das Substratpeptid KY751 (entsprechend der Sequenz um das Tyrosin 751 des PDGFß -Rezeptors herum (10)) wird zusammen mit MnCl2 (10 mM), Natriumorthovanadat (1 mM) und [γ 32P]ATP (5 μCi Probe) in einem Endvolumen von 20 μl zu einer Endkonzentration von 3 mM zugegeben. Der Ansatz wird 20 Minuten inkubiert und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 10 μl 15 mM EDTA, 1,5 mg/ml BSA und 10 μl 40%-ige (w/v) Trichloressigsäure gestoppt. Nach Inkubation der Proben für eine Stunde auf Eis, werden sie 10 Minuten in einer Kühlmikrofuge zentrifugiert und 25 μl des Überstands entnommen und wie füher beschrieben (10) einer Analyse der Phosphorylierung des KY 751-Peptids unterzogen.
Immunfάllung und Immunblotting - Geeignet vorbehandelte Zellen werden mit eiskaltem Lysepuffer (0,2 ml pro 35-mm-Schale) geemtet, der 50 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% Glycerol, 1% Triton X 100, 1 mM PMSF, 1% Aprotinin und 1 mM Natriumorthovanadat enthält. Für die Phosphatase-Assays und die Coprecipitationsversuche werden die Lysate in Abwesenheit von Vanadat hergestellt. Die Lysate werden 20 Minuten bei 4°C und 20 000 g zentrifugiert, und Aliquots des Lysatproteins (20 μg) wurden direkt mittels SDS-PAGE und Iπimunblotting analysiert. Zur Immunfällung der mit VSV markierten Phosphatasen werden die Lysate mit einem monoklonalen Antikörper gegen VSV-G (V-5507 Sigma, 2 μg pro Lysat einer 35-mm-Schale) eine Stunde bei 4°C auf einem rotierenden Rad inkubiert. Nach Zusatz von 2 μg Ziege-Anti-Maus-Ig (M 7023 Sigma) und nochmaliger einstündiger Inkubation bei 4°C werden 30 ml einer l :l-Aufschwemmung von Protein-A-Sepharose (Pharmacia) zugegeben und die Mischung nochmals eine Stunde bei 4°C inkubiert. Die Niederschläge werden abzentrifugiert (10 sec, 2000 g) und dreimal mit 0,75 ml eiskaltem Lysepuffer gewaschen. Immunkomplexe werden durch SDS-PAGE herausgetrennt und einem immunblotting unterworfen. Immunblots wurden unter Verwendung von Immobilon-PVDF-Membranen (Millpore, Bedford, GB) hergestellt. Zum Nachweis von Phosphotyrosin, SHP-I oder EGF-Rezeptor werden die Blots mit 1% BSA blockiert und mit Sonden eines polyklonalen Antiphosphotyrosmantikörpers (P 11230 Transduction Laboratories) in einer Verdünnung von 1:500, einem Antikörper gegen SHP-1 (P17420 Transduction Laboratories) in einer Verdünnung von 1 :2500 bzw. einem Antikörper gegen EGFR (sc-03 Santa Cruz) in einer Verdünnung von 1 :1000 und anschließend mit Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper-Peroxidase-Konjugat (sc-2004 Santa Cruz) in einer Verdünnung von 1 :4000 behandelt. Zum Nachweis von PDGF- Rezeptoren oder mit VSV markierten Phosphatasen werden die Blots mit 3%- iger fettfreier Trockenmilch blockiert und mit einem polyklonalen Antikörper gegen PDGFßR (06-498, UBI) in einer Verdünnung von 1 :1000 und anschließend mit Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper-Peroxidase-Konjugat oder mit einem monoklonalen Antikörper gegen VSV-G (V-5507 Sigma) in einer Verdünnung von 1:5000 und anschließend mit einem Ziege- Anti-Maus - Antikörper-Peroxidase-Konjugat (sc-2005 Santa Cruz) in einer Verdünnung von 1:4000 entwickelt.
PTP-Assaγs - Zellysate, PTP-Immunprecipitate und PDGFß - Rezeptorpräparate (siehe oben) werden in Abwesenheit von Phosphatasehemmstoffen gewonnen und auf PTP-Aktivität mit [32P]Raytide als Substrat wie zuvor beschrieben in einem Assay geprüft (8). Hierbei wird Raytide (Oncogene Research Products) drei Stunden bei 30°C mit pp60src-Kinase (UBI) in einem Gesamtvolumen von 30 μl 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,015% Brij 35, 0,1 mM EDTA, 0,1 mg/ml BSA, 0,2% P-Mercaptoethanol, 20 mM MgCl2, 100 μ M ATP und 30 μCifγ^PJATP inkubiert. Die Markierungsmischung wird auf eine Dowex 1X-8 0,5-ml-Säule, die mit 30%-iger Essigsäure equilibiert ist, aufgetragen, und das mit 32P markierte Raytide wird mit Essigsäure eluiert und in aliquoten Teilen bei -80°C aufbewahrt. Für den Assay wird ein Aliquot in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in Assaypuffer gelöst (50 mM MES, pH 6,0, 20 mM DTT). Die Lysate oder Immunprecipitate (die entsprechend verdünnt werden, um zu Aktivitäten im linearen Bereich des Assays zu gelangen) werden 30 Minuten bei 37°C in 40 μl Assay-Puffer mit [12 P]Raytide (30,000- 50,000 cpm) inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 750 μl eiskalter Stopplösung (0,9 M HC1, 90 mM Natriumpyrophosphat, 2 mM NaH2PO4, 4% Norit A) gestoppt. Nach 10-minütigem zentrifugieren werden 400 μl des Überstands einer Flüssigkeitscintillationszählung unterzogen.
• Ergebnisse: Die UV-Behandlung inaktiviert Proteintyrosinphosphatasen, induziert jedoch keine Vernetzung von Rezeptoren bzw. keine Assoziation von Rezeptoren, die chemisch vernetzt werden könnten. Es ist bekannt, daß die Bestrahlung von Zellen mit UV zu einer wirksamen Autophosphorylierung sowohl des EGF-Rezeptors als auch des PDGF-Rezeptors führt. Es werden Untersuchungen angestellt, ob an der ligandenunabhängigen Aktivierung des Wachstumsfaktorrezeptors durch UV-Bestrahlung eine induzierte Dimerisierung beteiligt ist. Im folgenden werden Untersuchungen am PDGF-Rezeptor beschrieben, die Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Vernetzungsbedingungen für den PDGF-Rezeptor sind bereits bekannt. Zusätzlich zur Aktivierung in intakten Zellen werden Bedingungen einer genügend starken UV-induzierten Autophosphorylierung in vitro ausgearbeitet. Für die UV-Bestrahlung wird isolierter PDGF-Rezeptor in Triton-X-100- haltigen-Membranfraktionen von TRMP-Zellen, die mit einem bekannten Human-PDGFP-Rezeptorexpressionskonstrukt stabil transfiziert worden sind, verwendet.
Eine Behandlung dieser Präparate mit UV erhöht die Autophosphorylierung von PDGFß -Rezeptor stark, und zwar sowohl in Abwesenheit als auch in der Gegenwart von PDGF (Fig. 1A, Bahn 3 und 8 im Vergleich zu 1 und 6). Diese Steigerung wird bei Zugabe des Reduktionsmittels NAC vor der UV-Bestrahlung beinahe vollständig verhindert (Bahn 5 und 10). Eine Zugabe von NAC nach Bestrahlung mit UV führt zu einer teilweisen Verringerung des Phosphorylierungssignals (Bahn 4 und 9), was darauf schließen läßt, daß die Wirkung von UV auf die Rezeptorphosphorylierung durch das Reduktionsmittel teilweise rückgängig gemacht werden kann. Eine Behandlung des Präparats mit dem bekannten PTP-Hemmstoff Vanadat erhöht die Phosphorylierung des Rezeptors auf ein ähnliches Niveau, wie dies bei UV- Bestrahlung der Fall ist (Bahn 2 und 7), woraus hervorgeht, daß PTP(s) in dem Rezeptorpräparat vorliegt bzw. vorliegen, wodurch das Phosphorylierungsniveau des Rezeptors negativ beeinflußt wird. Obwohl das Präparat in mehreren Schritten gereinigt wird, kann tatsächlich unter Verwendung von [32P]Raytide als Substrat eine endogene PTP-Aktivität leicht nachgewiesen werden (Fig. 1B), was nahelegt, daß PTK und PTP möglicherweise in der Plasmamembran in natürlich assoziierter Form vorkommen. Die PTP-Aktivität wird sowohl durch UV als auch durch Vanadatbehandlung stark gehemmt, während die durch UV verursachte Inaktivierung durch NAC verhindert und teilweise aufgehoben wird (Fig. 1B).
Eine Verstärkung der Phosphorylierung des PDGFP -Rezeptors ist daher stark mit einer Inaktivierung von endogener bzw. endogenen PTP(s) korreliert. Interessanterweise ist zur Beobachtung der Auswirkungen von
Vanadat oder UV auf die Rezeptorphosphorylierung wie oben beschrieben erforderlich, die Phosphorylierungsreaktionsmischung bei höherer Temperatur zu inkubieren (25°C, siehe Beispiele), was mit der vorher gemachten Beobachtung, daß auf Eis keine PDGF-Rezeptorentphosphorylierung durch endogene PTP(s) in Membranen oder Rezeptorpräparaten stattfindet, übereinstimmt. Um direkt nachzuweisen, daß UV die an Rezeptoren gerichtete PTP-Aktivität in den PDGFß -Rezeptorpräparaten beeinflußt, wird die Kinetik der Rezeptordephosphorylierung mit oder ohne vorangehende UV-Bestrahlung untersucht. Für diese Versuche wird eine PDGFß -Rezeptorautophosphorylierung auf Eis durchgeführt, und die Kinasereaktion wird anschließend durch Zugabe von nichtmarkiertem ATP gestoppt und die Proben werden in eine Umgebung mit 25°C gegeben. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten werden aliquote Teile entnommen, um das Ausmaß der Rezeptorphosphorylierung auszuwerten. Wie in Figuren IC und 1D dargestellt ist die Rezeptorentphosphorylierung durch UV- Bestrahlung eindeutig gehemmt.
Zur Frage, ob die verstärkte Rezeptorphosphorylierung, die in den mit UV bestrahlten Proben beobachtet wird, das Ergebnis einer intrinsischen PDGF- Rezeptortyrosinkinaseaktivität oder sekundär das Ergebnis der Aktivierung irgendeiner anderen Kinase im Präparat ist, wurden entsprechende Untersuchungen durchgeführt. Sowohl die Basalphosphorylierung des Rezeptors und die durch UV verursachte Erhöhung werden jedoch durch den spezifischen PDGF-Rezeptorkinasehemmstoff AG1296 vollständig blockiert (Fig. 1E), was den Beitrag einer heterologen Kinase zu den beobachteten Unterschieden in der Phosphorylierung unwahrscheinlich macht. Es ist bekannt, daß die Rezeptorphosphorylierung eine Determinante der Enzymaktivität ist, und so werden Versuche unternommen, eine mögliche Erhöhung der Rezeptorkinaseaktivität gegenüber einem exogenen Substrat im Anschluß an UV-Bestrahlung zu messen. Zu diesem Zweck wird der Rezeptor autophosphoryliert, und anschließend mit endogenen PTP(s) inkubiert. Hiemach wird die Phosphorylierung eines synthetischen Peptidsubstrats unter Bedingungen gehemmter PTP(s) gemessen. Bei dieser Versuchsanordnung (23,9 +1,7 willkürliche Einheiten ohne UV-Behandlung, 23,3+0,6 mit UV- Behandlung, n=4) werden jedoch keine Unterschiede bezüglich der Aktivität von mit UV bestrahlten oder scheinbehandelten Rezeptorpräparaten beobachtet. Zur direkten Prüfung, ob UV nicht nur die Dephosphorylierung beeinflußt, sondern auch zu kovalenten Rezeptorvernetzungen oder Monomer-Dimer- Rezeptorassoziationen in dem PDGFP-Rezeptorpräparat führt, was zu einer verstärkten Rezeptortransphosphorylierung führen würde, wird eine ligandeninduzierte Dimerbildung noch an sich bekannten Methoden unter Verwendung des chemischen Vernetzungsmittels Disuccinimidylsuberat sichtbar gemacht. Als Reaktion auf PDGF werden vernetzte Rezeptordimere tatsächlich in Form von immungefärbten verzögerten Proteinbanden nachgewiesen (Fig. 2A, Bahn 2). Eine UV-Behandlung der Membranpräparate führte zu keinen Rezeptorassoziationen, die mit Disuccinimidylsuberat vernetzt werden konnten (Fig. 2A, Bahn 3). Auch lag kein Synergismus mit PDGF vor, insofern als die Menge an vernetzbarem Rezeptor nach PDGF-Behandlung nicht durch UV erhöht wurde (Fig. 2A, Bahn 4). Diese mangelnde Vernetzung trat auf, obwohl UV die Autophosphorylierung in diesen Proben stark induzierte. In entsprechenden Autoradiogrammen wurde die induzierte Autophosphorylierung bestimmt. Eine Behandlung mit PDGF führte zu einer verstärkten
Rezeptorphosphorylierung an den Dimer- und Monomerpositionen (Fig. 2B, Bahn 2, im Vergleich zur Kontrollbahn 1), letzteres vermutlich aufgrund der Tatsache, daß die Vernetzung aus technischen Gründen immer unvollständig ist. In Übereinstimmung mit dem in Fig. 1 gezeigten Versuch führte eine Behandlung mit UV zu einer starken Verstärkung der Rezeptoφhosphorylierung, die in Abwesenheit von PDGF nur an der Monomerposition und in Gegenwart von PDGF sowohl an der Monomer- als auch der Dimerposition sichtbar ist.
Ähnliche Versuche wurden an den intakten 293 Zellen, die den PDGFß -Rezeptor überexprimierten, durchgeführt (Fig. 3A und B). Bei diesen Zellen konnten die Rezeptoren (mit Bis[sulfosuccinimidyl]suberat) auch ohne Ligandenstimulation vernetzt werden (Fig. 3A, Bahn 3), höchstwahrscheinlich aufgrund der starken Überexpression des Rezeptors. Die gebildete Menge an vernetzbarem Dimer ist durch PDGF-Behandlung deutlich erhöht (Fig. 3A, Bahn 4). In Abwesenheit des chemischen Vemetzungsmittels werden keine Dimere nachgewiesen. Jedoch führte eine UV-Bestrahlung wie im in vitro System weder zu einer Verstärkung der Vernetzung noch zu einem Synergismus mit PDGF bei der Schaffung vernetzbarer Dimere (Fig. 3A, Bahn 7 und 8 im Vergleich mit Bahn 3 und 4). UV allein ohne chemisches Vemetzungsmittel konnte die Rezeptoruntereinheiten nicht kovalent assoziieren, nicht einmal dann, wenn ein Ligand vorlag (Fig. 3A, Bahn 5 und 6). Wie bei dem in-vitro- Versuch, ergab ein erneutes Blotting mit phosphotyrosinspezifischen Antikörpern, daß sowohl PDGF als auch UV die Autophosphorylierung des PDGF-Rezeptors stimulierten (Fig. 3B). Aufgrund der Überexpression des Rezeptors trat eine beträchtliche spontane Autophosphorylierung auf und die Wirkungen der Behandlung sind in Form relativ kleiner Erhöhungen, ausschließlich in der Monomerposition, sichtbar.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß UV nicht die gleiche vernetzbare Assoziation von Rezeptoren wie PDGF hervorruft, obwohl das Aktivierungsniveau des Rezeptors ähnlich ist. Es läßt sich daher annehmen, daß eine Bestrahlung mit UV stattdessen die PDGF-Rezeptorphosphorylierung durch ihre Auswirkung auf an Rezeptor-gerichtete PTP(s) moduliert.
Außerdem wird gezeigt, daß UV definierte PTP(s) in intakten Zellen inaktiviert. Eine Hypothese für solch einen Mechanismus, der auf einer UV- abhängigen Erhöhung der Rezeptorphosphorylierung beruht, wäre, daß das Expressionsniveau von Rezeptor-gerichteten PTP(s) die UV-Reaktion beeinflusst. Hohe PTP-Niveaus verringern die Auswirkung von UV. Von der PTP SHP-1 wurde behauptet, daß sie an der Negativregulation des EGFR in A431 -Zellen beteiligt ist. Eine Behandlung dieser Zellen mit UV zu einer Verstärkung der EGFR-Phosphorylierung, und zwar in einem Ausmaß, das der ligandeninduzierten Rezeptorphosphorylierung ähnelte. Bei der Aktivierung von MAPKAP K2 handelt es sich um einen typischen Indikator und vermutlicherweise einen wichtigen Mediator verschiedener Streßreaktionen. Eine Behandlung von A431 -Zellen mit UVC führte zu einer wesentlichen Steigerung der Aktivität von MAPKAP K2. Wie vorausgesagt, verringerte sich diese Reaktion bei stabiler Überexpression von SHP-1 in diesen Zellen stark (Fig. 4), was nahelegt, daß zumindest ein wesentlicher Anteil der durch UV induzierten Signalübertragung über den EGFR vermittelt wird. Um festzustellen, ob SHP-1 tatsächlich durch UV direkt inaktiviert wird, wird die Wirkung von UV-Bestrahlung auf die Aktivität von aus Lysaten von SHP-1 überexprimierenden A431 -Zellen gewonnener SHP-1 mittels Immunfällung geprüft. Die PTP-Aktivität wurde mit dem Phosphopeptidsubstrat [32P]Raytide gemessen. Ein technisches Problem bei diesen Assays besteht darin, daß bei einem Überschuß an Reduktionsmittel die durch UV induzierte Hemmung teilweise rückgängig gemacht wird (Fig. 1). Um die PTP-Aktivität in einem in- vitro-Assay zu messen, muß man jedoch das Cystein im aktiven Zentrum des Enzyms schützen. Trotzdem konnte in diesen Assays deutlich gezeigt werden, daß SHP-1 durch eine UV-Behandlung inaktiviert wird (Fig. 5), was nahelegt, daß nicht alle inaktivierten Moleküle durch die Thiolgruppen in dem Assay neu aktiviert werden. Sogar eine Bestrahlung mit physiologisch bedeutsamen UVA- und UVB-Dosen führte zu einer geringen, jedoch reproduzierbaren Inaktivierung von SHP-1, und die immunfällbare SHP-1 -Aktivität wurde durch UVC- Behandlung auf ungefähr 50% der aus strahlenbehandelten Zellen gewonnenen Aktivität reduziert (Fig. 5). Entsprechend der wesentlichen Rolle des „katalytischen Cysteins,, wurde die PTP-Aktivität von SHP-1 durch Behandlung der Zellen mit Iodacetamid gehemmt und eine Inaktivierung durch UV wurde durch NAC-Vorbehandlung teilweise verhindert.
Um diese Ergebnisse verallgemeinem zu können, wurde die Möglichkeit, daß andere PTP(s) durch UV-Behandlung von PTP -überexprimierenden Zellen inaktiviert werden können, geprüft. Drei Transmembran-PTP(s), nämlich RPTPα
, RPTPσ und DEP-1 dephosphorylieren Wachstumsfaktorrezeptoren bei transienter Coexpression. Mit VSV markierte Varianten dieser PTP(s) wurden in 293 Zellen transient überexprimiert, die Zellen wurden mit UV bestrahlt, und die Wirkung auf die PTP-Aktivität wurde durch Prüfen von PTP-Immunpräzipitaten mit [32P]Raytide als Substrat ausgewertet. Wie in Fig. 6 dargestellt, verringerte sich die Aktivität aller drei PTP(s) bei UV-Bestrahlung. Die beobachtete Hemmung war reproduzierbar und in mehrfachen Versuchen signifikant, es handelte sich jedoch nur um eine teilweise Hemmung, was möglicherweise mit der starken Überexpression der PTP(s) einerseits und den oben beschriebenen technischen Problemen andererseits in Zusammenhang stand (Nur der nichtreversibel inaktivierte Anteil der PTP(s) kann in diesen Assays nachgewiesen werden). Trotzdem zeigen die Ergebnisse deutlich, daß vier definierte PTP(s) gegen UV-Bestrahlung intakter Zellen empfindlich sind, was für die Existenz eines gemeinsamen Mechanismus der UV-Wirkung spricht. Eine weitere überraschende Tatsache, der vorliegenden Erfindung, besteht darin, daß UV-Bestrahlung RPTPα in ein „substratfangendes" (substrat- tropping) Derivat umwandelt. Da wir zeigten, daß an PDGFß -Rezeptoren gerichtete PTP(s) in dem Membranmicellenpräparat inaktiviert wurde (siehe oben), waren wir daran interessiert, die Wirkung der UV-Bestrahlung auf eine definierte PTP, die auf den Rezeptor einwirkt, zu untersuchen. Die Identität der PTP(s), die die Phosphorylierung des PDGFß-Rezeptors in vivo reguliert, ist noch nicht bekannt.
RPTPα wurde gewählt, um die Folgen von durch UV bedingter Inaktivierung von PTP auf die Wechselwirkung mit dem autophosphorylierten PDGFß-Rezeptor zu untersuchen. Bei 293 Zellen, die den PDGFß-Rezeptor und RPTPαwt coexprimierten, wies RPTPα eine starke dephosphorylierende Wirkung auf den PDGF-Rezeptor auf (Fig. 7, Bahn 6 im Vergleich zu Bahn 1, Bahn 10 im Vergleich zu Bahn 5). Durch UV-Behandlung wurde die Phosphorylierung des PDGFß-Rezeptors im Vergleich zu nichtbestrahlten Zellen (Bahn 6) in Abwesenheit von cotransfizierter PTP leicht (Fig. 7, Bahn 2-4) und in Gegenwart cotransfizierter RPTPα wesentlich drastischer (Fig. 7, Bahn 7-9) erhöht, was eine verringerte Aktivität des cotransfizierten PTP gegenüber dem Rezeptor anzeigt. Die Vorbeugung bzw. teilweise Umkehr der UV-Inaktivierung durch NAC und die gemeinsame Struktur des aktiven Zentrums aller PTP(s) zeigen, daß die Inaktivierung durch eine Oxidation des Cysteins in aktiven Zentren wird. Die Gewinnung von genügend PTP aus transfizierten und mit UV bestrahlten Zellen für einen formellen chemischen Beweis dieser Annahme ist technisch nicht möglich zu sein. Es wurde jedoch ein indirekter Beweis für eine Änderung im aktiven Zentrum der PTP(s) nachgewiesen. Der Versuch wurde analog zu Ergebnissen bei Aminosäure-Austauschmutanten von PTP(s) aufgebaut. Zum Beispiel führte eine Cystein-zu-Serin-Mutation verschiedener PTP(s) zu inaktiven Phosphatasen, die trotzdem an Substrate binden und mit ihnen assoziiert bleiben (substrat-trapping). Die vorliegende Erfindung zeigt, daß die Inaktivierung des katalytisch aktiven Cysteins von RPTPα durch UV möglicherweise eine ähnliche „substratfangende" (substrat-trapping) Enzymkonformation hervorruft und mit dem Rezeptor copräzipitierbar ist. Dies wurde durch Copräzipitations versuche mit dem PDGFß-Rezeptor und RPTPα untersucht. Erst wurden die Versuchsbedingungen unter Verwendung der PTP- Mutante ausgelotet. Wie in Fig. 8A dargestellt (Bahn 7 und 8) enthielten Anti- PTP-Immunpräzipitate von Zellen, die die katalytisch inaktive C433S-RPTPα- Mutante (RPTPαCS) und den PDGFß-Rezeptor coexprimierten, nachweisbare Mengen an PDGFß-Rezeptor, während mit RPTPαwt nur wenig Rezeptor copräzipitiert werden konnte (Fig. 8A, Bahn 5 und 6, ohne UV-Behandlung, wie angegeben). Interessanterweise veränderte eine zuvorige UVC -Behandlung der Zellen die Eigenschaften der RPTPαwt: nun wurden ähnliche Mengen an Rezeptor von Zellen, die RPTPαwt und PDGFß-Rezeptor coexprimierten, und von Zellen, die den Rezeptor und RPTPαCS coexprimierten, copräzipitiert (Fig. 8A, Bahnen 5 und 6 sowie 7 und 8 mit UV-Behandlung, wie angegeben). Der phosphorylierte Rezeptor ist in Immunpräzipitaten von RPTPαCS leicht nachweisbar (Fig. 8B, Bahn 7 und 8). Bei Copräzipitation des PDGFß-Rezeptors mit RPTPαwt war jedoch kein phosphorylierter Rezeptor zu beobachten, nicht einmal bei den mit UV bestrahlten Zellen (Fig. 8B, Bahn 5 und 6). Da diese Versuche in Abwesenheit von Vanadat durchgeführt wurden, um ein Konkurrieren dieses Übergangszustands-Analogs mit dem PDGFß-Rezeptor um die PTP-Bindung zu vermeiden, ist es sehr wahrscheinlich, daß aufgrund von überschüssigem PTP die Moleküle in dem Anti-RPTPαwt-Immunpräzipitat mit ihrer Restaktivität ausreichten, den copräzipitierten Rezeptor zu dephosphorylieren. Die erhaltenen Ergebnisse beruhen auf Untersuchungen, deren
Einzelheiten für den PDGF-Rezeptor oder den EGF-Rezeptor angegeben sind. Die Essenz der vorliegenden Erfindung gilt jedoch allgemein für dephosphorylierende Enzyme, z.B. Proteintyrosinphosphatasen und phosphorylierte Proteine, z.B. Rezeptortyrosinkinasen. Die vorliegenden Ergebnisse sind daher für die weitere Untersuchung von medizinisch hochrelevanten Rezeptoren von großem Interesse, z.B. für den Insulinrezeptor oder den Rezeptor, der an neurodegenerativen Krankheiten oder Krebs erkrankungen beteiligt ist, jedoch auch für solche, die bis jetzt noch nicht genau charakterisiert wurden. Die folgenden Literaturstellen wurden in den Beispielen angegeben:
1. Matthews, R.J., Cahir, E.D. und Thomas, M.L. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A-87, 4444-4448
2. Ogata, M., Sawada, M., Kosugi, A. und Hamaoka, T. (1994) J. Immunol 153, 4478-4487 3. Östman, A., Yang, Q. und Tonks, N.K. (1994) Proc. Natl Acad. Sei.
U.S.A. 91, 9680-9684
4. Shen, S.H., Bastien, L., Posner, B.I. und Chretien, P. (1991) Nature 352, 736-739
5. Tenev, T., Keilhack, H., Tomic, S., Stoyanov, B., Stein-Gerlach, M., Lammers, R., Krivtsov, A.V., Ullrich, A. und Böhmer, F.D. (1997) J.
Biol Chem. 272, 5966-5973
6. Lammers, R., Bossenmaier, B., Cool, D.E., Tonks, N.K., Schlessinger, J., Fischer, E.H. und Ullrich, A. (1993) J. Biol Chem. 268, 22456-22462
7. Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82, 488-492 8. Tomic, S., Greiser, U., Lammers, R., Kharitonenkov, A., Imyanitov, E., Ullrich, A. und Böhmer, F.D. (1995) 1 Biol. Chem. 270, 21277-21284
9. Valius, M. und Kazlauskas, A. (1993) Cell 73, 321-334
10. Kovalenko, M., Rönnstrand, L., Heldin, C.H., Loubtchenkov, M., Gazit, A., Levitzki, A. und Böhmer, F.D. (1997) Biochemistry 36, 6260-6269 11. Kovalenko, M., Gazit, A., Böhmer, A., Rorsman, C, Rönnstrand, L., Heldin, C.H., Waltenberger, J., Böhmer, F.D. und Levitzki, A. (1994) CancerRes. 54, 6106-6114 12. Tomaska, L. und Resnick, R.J. (1993) J. Biol Chem. 268, 5317-5322
LEGENDEN für Figur 1 A bis 8 :
Fig. 1 Wirkung von UV-Bestrahlung auf das Ausmaß der RTK- Phosphorylierung und auf die PTP-Aktivität in PDGFßR-angereicherten Membranmizellen-fraktionen. Der PDGFß-Rezeptor wurde aus hPDGFßR- überexprimierenden TRMP -Zellen durch mehrere Chromatographieschritte teilweise aufgereinigt. Die entstandenen Triton-X-100-haltigen Rezeptorfraktionen wurden wie angegeben mit unterschiedlichen Mitteln behandelt oder mit UVC (2 kJ/M2) bestrahlt. (A) Man versetzte mit PDGF-BB oder dem entsprechenden Lösungsmittel und ließ den PDGFß-Rezeptor 10 Minuten auf Eis in Gegenwart von [γ^PJATP autophosphorylieren. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 mM unmarkiertem ATP gestoppt und die Proben wurden noch 30 Minuten bei 25°C inkubiert, bevor die Reaktion mit SDS- PAGE-Probenpuffer beendet wurde. Die Autophosphorylierung des Rezeptors wurde durch SDS-PAGE und Phosphorimage-Analyse sichtbar gemacht. (B) Gleich behandelte Proben wurden unter Verwendung von [32P]Raytide als Substrat auf endogene PTP-Aktivität untersucht. (C, D) Die auf den Rezeptor gerichtete PTP-Aktivität mit und ohne vorherige UV-Bestrahlung wurde in einem Dephosphorylierungs- Assay verfolgt. Der PDGFß-Rezeptor wurde auf Eis wie unter (A) beschrieben autophosphoryliert und die Kinasereaktion wurde anschließend durch Zugabe von nichtmarkiertem ATP gestoppt und die Proben wurden in eine Umgebung mit 25°C gebracht. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden aliquote Teile entnommen, um das Ausmaß der Phosphorylierung des Rezeptors zu bestimmen. Es werden ein Autoradiogramm (C) und eine quantitative Auswertung des Rezeptor-[ 2P]-Phosphatgehalts (D), die für fünf Versuche mit gleichmäßigen Ergebnissen repräsentativ sind, gezeigt. (E) Die PDGFß R-Proben wurden mit UV behandelt oder unbehandelt gelassen und wie unter (A) beschrieben phosphoryliert, und zwar wie angegeben in Gegenwart oder Abwesenheit des spezifischen PDGFR-B lockers AG 1296 (10 μM).
Fig. 2 Wirkung der PDGF-Stimulierung und der UV-Behandlung auf die Bildung von vernetzbaren PDGF-Rezeptordimeren in vitro. Der teilweise gereinigte PDGFß-Rezeptor wurde wie angegeben mit UVC (2 kJ/m2), PDGF-BB oder beiden behandelt, anschließend wie in der Legende von Figur 1A beschrieben einer Autokinasereaktion in Gegenwart von [γ32P]ATP unterzogen und schließlich mit dem Vemetzungsmittel Disuccinimidylsuberat behandelt. Die Proben wurden auf PAGE-Gelen mit einem Gradienten von 4-9% aufgetrennt und durch Immunblotting mit Antikörpern gegen PDGFR (A) oder Autoradiographie (B) analysiert.
Fig. 3 Wirkung der PDGF-Stimulierung und der UV-Behandlung auf die Bildung von vernetzbaren PDGF-Rezeptordimeren in intakten Zellen.
293 Zellen wurden wie angegeben transient mit hPDGFßR transfiziert, strahlenbehandelt oder mit UVC (2 kJ/m2) oder PDGF-BB oder beiden behandelt und einer Vernetzungsreaktion mit dem Mittel Bis[sulfosuccinimidyl]suberat, das die Zellen durchdringen kann, oder einer Strahlenbehandlung unterworfen. Die durch Adsorption an Weizenkeim-Agglutinin-Agarose erhaltene Zell-PDGF ß-rezeptorhaltige Glycoproteinfraktion wurde durch Gradienten-PAGE und Immunblotting mit Antikörpern gegen PDGFR (A) oder Antikörpern gegen Phosphotyrosin (B) untersucht.
Fig. 4 Auswirkung der Überexpression von PTP auf die UV- induzierte Streßreaktion in A431-Zellen. A431-Zellen, die die PTP SHP-1 überexprimieren, oder strahlentransfizierte A431-Zellen wurden wie angegeben einer Strahlenbehandlung oder einer Behandlung mit UVC (2 kJ/m2) unterzogen.
Die Zellextrakte wurden mit Hsp25 als Substrat auf MAPKAP -K2-Aktivität untersucht (A). Die Überexpression von SHP-1 wurde mittels Immunblots nachgewiesen (B).
Fig. 5 Wirkung der UV-Behandlung auf die PTP-Aktivität in Anti-SHP-1-Immunpräzipitaten von A431-Zellen, die SHP-1 überexprimieren. A431 -Zellen, die SHP-1 stabil überexprimieren, wurden wie angegeben strahlenbehandelt oder mit Strahlung unterschiedlicher Wellenlängen behandelt (2 kJ/m2) oder mit IAA behandelt, und zwar mit und ohne vorherige Inkubation der Zellen mit NAC. Die Lysate wurden einer Immunfällung unterzogen, und die Aktivität von immunpräzipitierter SHP-1 wurde mit
[32P]Raytide als Substrat untersucht (A). Die Expression von SHP-1 ist in (B) dargestellt.
Fig. 6 Wirkung der UV-Behandlung auf die Aktivität von drei Transmembran-PTP(s) in intakten Zellen. 293 Zellen wurden mit Expressionskonstrukten für die VSV-markierten PTP(s) RPTPα, DEP-1 oder RPTPσ oder mit den entsprechenden katalytisch nichtaktiven CS-Mutanten transient transfiziert und strahlenbehandelt oder mit UVC behandelt (2,5 kJ/m2). Die Lysate wurden einer immunfällung mit Antikörpern gegen VSV unterzogen, und die PTP-Aktivitäten in den Immunpräzipitaten wurden mit dem Substrat [32P]Raytide überprüft. Die mit Immunpräzipitaten katalytisch nichtaktiver PTP(s) erhaltenen Hintergrundwerte wurden abgezogen und die Werte werden mit der mit nicht-UV-behandelten Zellen erhaltenen Kontrollaktivität (100%) standardisiert (es sind 3-4 repräsentative Versuche mit einheitlichen Ergebnissen dargestellt) (A). Jede PTP wird in den mit UV behandelten bzw. in den strahlenbehandelten Zellen gleich stark exprimiert (B).
Fig. 7 Wirkung der UV-Behandlung auf die Aktivität der Transmembran-PTP RPTPα gegenüber coexprimiertem PDGFß-Rezeptor. 293 Zellen wurden mit Expressionskonstrukten für PDGFßR allein oder in Kombination mit RPTPα transient transfiziert. Die Zellen wurden mit UV bei unterschiedlichen Wellenlängen oder mit PDGF wie angegeben behandelt, und die Zellysate wurden auf das Ausmaß der Tyrosmphosphorylierung von PDGFR (A) bzw. auf die Expressionsniveaus von PDGFR (B) analysiert.
Fig. 8 Coimmunfällung von PDGFß-Rezeptor mit der PTP RPTP α, und Wirkung der UV-Bestrahlung. 293 Zellen wurden wie angegeben mit Expressionskonstrukten für PDGFßR allein oder in Kombination mit VSV- markierter RPTPα(wt) oder der katalytisch nichtaktiven CS-Mutante von RPTPα (CS) transient transfiziert. Die Zellen wurden (wie angegeben) strahlenbehandelt oder mit UVC (2 kJ/m2), mit PDGF-BB oder mit beiden behandelt, und die PTP(s) wurden aus den Zellysaten mit Antikörpern gegen VSV immunpräzipitiert. Vergleichbare Mengen an PTP wurden immunpräzipitiert, und das Expressionsniveau des PDGFß-Rezeptors war in den unterschiedlichen Zellpopulationen ähnlich (nicht gezeigt). Die Menge und das Ausmaß der Phosphorylierung des PDGFß-Rezeptors, der mit den PTP(s) coimmunpräzipitiert wurde, wurde durch Immunblotting mit (A) Antiköφem gegen PDGFR oder (B) Antiköφem gegen Phosphotyrosin sichtbar gemacht (drei repräsentative Versuche mit gleichen Resultaten). Nur die Teile der Blots, die der Position der reifen 185kD-Form des PDGFßR entsprechen, sind dargestellt.

Claims

5 Ansprüche:
1. Komplex, der an der Kontrolle der Zellregulation teilnimmt, mit a) einem durch Oxidation desaktivierten dephosphorylierenden Enzym, und b) einem phosphorylierten Protein. 0
2. Komplex nach Anspruch 1, wobei das dephosphorylierende Enzym a) und das Protein b) über eine spezifische chemische Bindung reziprok aufeinander wirken.
3. Komplex nach Anspruch 1 oder 2, wobei das dephosphorylierende Enzym a) so modifiziert ist, daß es an das Protein b) gebunden wird, ohne 5 dieses Protein b) katalytisch umzuwandeln.
4. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine Aminosäure in dem Aktivitätszentrum, die an der katalytischen Funktion des dephosphorylierenden Enzyms beteiligt ist, oxidiert wird.
5. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Modifizierung des o dephosphorylierenden Enzyms durch Mittel aus der Gruppe Bestrahlung, vorzugsweise UV-Bestrahlung, Oxidanzien, vorzugsweise
Wasserstoffperoxid, Alkylierungsmittel bzw. deren Kombinationen durchgeführt wird.
6. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Modifikation des 5 dephosphorylierenden Enzyms durch UVA-Bestrahlung mit einer
Wellenlänge von 320 bis 400 nm, vorzugsweise von 335 bis 370 nm, besonders bevorzugt 335 nm oder mittels UVB-Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 280 bis 320 nm, vorzugsweise 285 bis 330 nm, besonders bevorzugt 312 nm, oder UVC-Bestrahlung mit einer o Wellenlänge von 200 bis 280 nm und/oder deren Kombinationen bewirkt wird.
7. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Enzym a) reversibel desaktiviert wird.
8. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Enzym a) aus der 5 Gruppe der Proteintyrosinphosphatasen stammt.
9. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Protein b) aus der Gruppe der Protemtyrosinkinasen, vorzugsweise aus der Gruppe der Zelloberflächenrezeptoren mit Rezeptortyrosinkinase-aktivität, stammt.
10. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sich dieser Komplex in einem künstlichen System oder in einem natürlich abgeleiteten System, vorzugsweise lebenden Zellen, befindet.
11. Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei den lebenden Zellen um Zellen höherer Organismen, vorzugsweise Säugetierzellen, handelt.
12. Dephosphorylierende Enzyme a) enthalten in einem Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
13. Dephosphorylierende Enzyme a) nach Anspruch 12 aus der Gruppe der Proteintyrosinphosphatasen.
14. Dephosphorylierende Enzyme a) nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Komplex mit den Substraten der phosphorylierten Proteine des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bilden.
15. Phosphorylierte Proteine enthalten in einem Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
16. Phosphorylierte Proteine nach Anspruch 15 aus der Gruppe der Protemtyrosinkinasen, vorzugsweise aus der Gmppe der Zelloberflächenrezeptoren mit Rezeptortyrosinkinaseaktivität.
17. Substrate der phosphorylierten Proteine nach einem der Ansprüche 15 oder 16, die mit den dephosphorylierenden Enzymen a) nach einem der Anprüche 12 bis 14 einen Komplex bilden.
18. Verfahren zur Bestimmung eines Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder von dephosphorylierenden Enzymen nach einem der Ansprüche 12 bis 14 oder von phosphorylierten Proteinen nach einem der Ansprüche 15 oder 16, umfassend die folgenden Schritte: 1) Verwendung eines Systems mit mindestens einem dephosphorylierenden Enzym a) und mindestens einem phosphorylierten Protein b),
2) Desaktivieren des phosphorylierenden Enzyms a) durch Oxidation,
3) Spezifisches Binden des desaktivierten phosphorylierenden Enzyms a) an ein bestimmtes phosphoryliertes Protein b), das in diesem System enthalten ist, wobei ein bestimmter Komplex gebildet wird, der nicht- katalytisch umgewandelt wird,
4) Isolieren dieses so gebildeten Komplexes, sowie
5) Identifizieren der in dem bestimmten Komplex enthaltenen bestimmten Komponenten a) und b).
5 19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem künstlichen System oder in einem von der Natur abgeleiteten System durchgeführt wird, vorzugsweise in einer lebenden Zelle.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei den lebenden Zellen um Zellen höherer Organismen, besonders bevorzugt von Säugetieren, 0 handelt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die lebenden Zellen oder die isolierten dephosphorylierenden Enzyme a) mittels Bestrahlung, vorzugsweise UV-Bestrahlung, Oxidanzien, vorzugsweise Wasserstoffperoxid, Alkylierungsmitteln und/oder deren Kombinationen 5 behandelt werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei die dephosphorylierenden Enzyme a) durch UVA-Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 320 bis 400 nm, vorzugsweise von 335 bis 370 nm, besonders bevorzugt 335 nm oder mittels UVB-Bestrahlung mit einer 0 Wellenlänge von 280 bis 320 nm, vorzugsweise 285 bis 330 nm, besonders bevorzugt 312 nm, oder UVC-Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 200 bis 280 nm und/oder deren Kombinationen desaktiviert werden.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei die 5 dephosphorylierenden Enzyme a) reversibel desaktiviert werden.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei die dephosphorylierenden Enzyme a) entweder mittels einer Redoxreaktion, vorzugsweise einer Oxidation einer Aminosäure in den Aktivitätszentren, die an der katalytischen Funktion des Enzyms a) beteiligt ist, desaktiviert o werden.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei die dephosphorylierenden Enzyme a) aus der Gruppe der Proteintyrosinphosphatasen stammen.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei die 5 phosphorylierten Proteine b) aus der Gruppe der Protemtyrosinkinasen, vorzugsweise aus der Gruppe der Zelloberflächenrezeptoren mit Rezeptortyrosin-kinaseaktivität, stammen.
27. Mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 26 gewonnener Komplex.
5 28. Mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 27 gewonnenes dephosphorylierendes Enzym.
29. Mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 28 gewonnenes phosphoryliertes Protein.
30. Verfahren zur Desaktivierung von dephosphorylierenden Enzymen, 0 umfassend den Schritt, daß man lebende Zellen oder isolierte dephosphorylierende Enzyme durch Mittel aus der Gruppe Bestrahlung, vorzugsweise UV-Bestrahlung, Oxidanzien, vorzugsweise
Wasserstoffperoxid, Alkylierungsmittel und/oder deren Kombinationen behandelt. 5
31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Desaktivierung durch UVA- Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 320 bis 400 nm, vorzugsweise von 335 bis 370 nm, besonders bevorzugt 335 nm oder mittels UVB- Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 280 bis 320 nm, vorzugsweise 285 bis 330 nm, besonders bevorzugt 312 nm, oder UVC-Bestrahlung 0 mit einer Wellenlänge von 200 bis 280 nm und/oder deren
Kombinationen bewirkt wird.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 oder 31, wobei die dephosphorylierenden Enzyme reversibel desaktiviert werden.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 32, wobei die 5 dephosphorylierenden Enzyme durch eine Redoxreaktion, vorzugsweise eine Oxidation einer Aminosäure in den Aktivitätszentren, die an der katalytischen Funktion der Enzyme teilnimmt, desaktiviert werden.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 33, wobei die dephosphorylierenden Enzyme aus der Gruppe der o Proteintyrosinphosphatasen stammen.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 34, wobei die phosphorylierten Proteine aus der Gruppe der Protemtyrosinkinasen, vorzugsweise aus der Gruppe der Zelloberflächenrezeptoren mit Rezeptortyrosinkinase-aktivität, stammen. 5
36. Mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 35 hergestellte dephosphorylierte Enzyme.
37. Verfahren zur Bestimmung der Effektoren des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder des dephosphorylierenden Enzyms nach einem der Ansprüche 12 bis 14 oder des phosphorylierten Proteins nach 5 einem der Ansprüche 15 oder 16, umfassend die folgenden Schritte:
1) Inkubieren dieses Komplexes, dieses Enzyms oder dieses Proteins mit mindestens einer Testsubstanz, oder Bestrahlen des Komplexes, des Enzyms oder des Proteins,
2) anschließende Messung der spezifischen Aktivität und/oder des 0 Phosphorylierungsgrads der jeweiligen Komponenten, wobei man als solche bekannte Verfahren verwendet,
3) zusätzliche Messung der spezifischen Aktivität und/oder des Phosphorylierungsgrads der jeweiligen Komponenten in Abwesenheit dieser Testsubstanz oder ohne Bestrahlung, 5 4) Vergleichen der jeweiligen spezifischen Aktivitäten und/oder der jeweiligen Phosphorylierungs grade, die in den Verfahrensschritten 3 und
4 erzielt wurden, und
5) aufgrund dessen Identifizieren der Testsubstanz, oder -Substanzen, bzw. der Bestrahlung, die auf die Testkomponenten eine Regulationswirkung o ausübt bzw. ausüben.
38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Testsubstanzen aus der Gruppe der natürlichen, halbsynthetischen oder synthetischen Chemikalien und/oder biologisch und/oder pharmazeutisch wirksamen Verbindungen stammen. 5
39. Effektoren identifiziert in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 37 oder 38.
40. Effektoren nach Anspruch 39 aus der Gruppe der natürlichen, halbsynthetischen oder synthetischen Chemikalien und/oder biologisch und/oder pharmazeutisch wirksamen Verbindungen sowie Bestrahlung. 0
41. Verwendung des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 11, der dephosphorylierenden Enzyme nach einem der Ansprüche 12 bis 14 oder der phosphorylierten Proteine nach einem der Ansprüche 15 oder 16 zur Bestimmung der Effektoren von Proteinen, die an Kontrollmechanismen der Zellregulation beteiligt sind. 5
42. Verwendung des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 11, der dephosphorylierenden Enzyme nach einem der Ansprüche 12 bis 14 oder der phosphorylierten Proteine nach einem der Ansprüche 15 oder 16 zur Herstellung von modifizierten Effektoren von Proteinen, die an Kontrollmechanismen der Zellregulation beteiligt sind (Drug Design).
43. Verwendung des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 11, der dephosphorylierenden Enzyme nach einem der Ansprüche 12 bis 14 oder der phosphorylierten Proteine nach einem der Ansprüche 15 oder 16 zur Entwicklung und Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Defekten bei der Übertragung von Zellsignalen und/oder bei der Zellregulation und/oder bei der Zellproliferation und/oder Zelldifferenzierung.
44. Verwendung des Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 11, der dephosphorylierenden Enzyme nach einem der Ansprüche 12 bis 14 oder der phosphorylierten Proteine nach einem der Ansprüche 15 oder 16 zur Entwicklung und Herstellung von Mitteln zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, Diabetes mellitus, Arteriosklerosis oder
Carcinomen.
45. Verwendung der dephosphorylierenden Enzyme nach einem der Ansprüche 12 bis 14 oder 36 für die spezifische Bestimmung von phosphorylierten Proteinen.
46. Verwendung der Effektoren nach Anspruch 39 oder ihrer Modifikationen zur Kontrolle von Proteinen, die an der Zeliregulation beteiligt sind, zur Entwicklung und Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Defekten bei der Übertragung von Zellsignalen und oder bei der Zellregulation und/oder bei der Zellproliferation und/oder bei der Zelldifferenzierung, und zur Entwicklung und Herstellung von Mitteln zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, Diabetes mellitus, Arteriosklerosis oder Carcinomen.
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