WO2000050887A1 - Verwendung von trägermaterial in der kapillar-elektrochromatographie - Google Patents

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WO2000050887A1
WO2000050887A1 PCT/EP2000/001393 EP0001393W WO0050887A1 WO 2000050887 A1 WO2000050887 A1 WO 2000050887A1 EP 0001393 W EP0001393 W EP 0001393W WO 0050887 A1 WO0050887 A1 WO 0050887A1
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detector
cec
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PCT/EP2000/001393
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Angelika Muscate-Magnussen
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Evotec Biosystems Ag
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture

Definitions

  • the invention relates to the use of carrier materials in capillary electrochromatography (CEC).
  • CEC capillary electrochromatography
  • the sample is dissolved in a mobile phase, which is e.g. can be a gas, a liquid or a supercritical fluid.
  • the mobile phase is moved by an immiscible stationary phase, which e.g. located in a column or fixed to a solid surface.
  • the two phases are chosen so that the sample components are distributed to different degrees between the mobile and stationary phases.
  • the components that are strongly retained by the stationary phase only move slowly with the mobile phase. In contrast, the components that are only slightly retained by the stationary phase move quickly. Because of these differences, the sample components separate into discrete bands.
  • CEC capillary electrochromatography
  • HPLC high-density liquid chromatography
  • CE capillary electrophoresis
  • HPLC the components of a sample are separated by different distribution between a stationary and a mobile phase.
  • an electroosmotic flow is generated by applying an electrical voltage. The separations can be carried out isocratically or with a gradient.
  • the columns are preferably filled with silica gel particles, which typically have particle diameters in the range from 1 to 5 ⁇ m.
  • the advantage of this method is the possibility to separate anionic, cationic and neutral molecules.
  • a major problem is the analysis of complex, especially biological, samples. These, e.g. Hemolyzed blood, plasma, serum, milk, saliva, spinal fluid, fermentation broth, urine, supernatants from cell culture, food and tissue homogenates or natural product extracts contain a large proportion of matrix components, such as proteins and salts, in addition to the analyte.
  • Proteins and other macromolecules are precipitated, for example, by high proportions of organic solvents in the mobile phase or unspecifically, irreversibly bound or denatured by residual silanol groups on the surface of a chromatographic support (JR Verart et al., J. Chromatography A 1999; 471-475).
  • the proteins and other macromolecules block access to the pores when using a porous stationary phase and thus reduce the number of chromatographic adsorption centers.
  • Non-specific adsorption also leads to fluctuations in the electroosmotic flow and to non-reproducible re retention times of the analytes.
  • the CEC column is severely damaged or rendered unusable. It is therefore necessary to remove these matrix components from the sample before CEC analysis.
  • Common sample preparation methods include methods of dialysis, ultrafiltration, protein precipitation, liquid / liquid extraction, in particular methods of solid phase extraction e.g. Cartridge process or the use of guard columns, which are preferably filled with silica gel particles, the elution of the analyte preferably being carried out by liquid desorption (HPLC).
  • HPLC liquid desorption
  • guard columns for the separation of analytes from protein or matrix-containing samples in HPLC is described, for example, by Rudolphi and Boos (LOGC 15 (9) 814-823, 1997).
  • sample pretreatment steps are often time, cost and labor intensive and lead to an increase in the volume of the sample due to the necessary transfer of the analyte to a separation column, which leads to a loss of selectivity and sensitivity of the separation process.
  • sample volumes of at least 10 ⁇ l are required to carry out these sample pretreatment steps, which renders the use for sample preparation in high-throughput processes in which only nl to a few ⁇ l sample available, impossible.
  • Pinkerton et al. US Pat. No. 4,544,485) claim a carrier material for liquid chromatography based on silica or glass which enables proteins or macromolecules to be separated from a sample.
  • the so-called Internal Surface Reverse Phase (ISRP) material is characterized by a hydrophilic outer surface and a hydrophobic inner or pore surface.
  • glycine is bound to the outer particle surface.
  • the pore surface is characterized by polypeptides bound via glycerol propyl, in particular tripeptides. These lead to limited access to the pores. Smaller target molecules (analytes) have access to the pores, while the large matrix molecules remain excluded.
  • Boos et al. (LC-GC 1997, 15, 602-611; LOGC 1996, 14, 554-560) describe a carrier material based on alkyl-diol-silica (ADS), which ensures quantitative separation of proteins and other macromolecular components. It is characterized by a surface that is inert to biomolecules and is coated with alkyl groups in the pores. The pore size allows small target molecules (analytes) access, while the large matrix molecules remain excluded. This material was specially developed for HPLC analysis.
  • ADS alkyl-diol-silica
  • LJ Glunz et al. J. of Liquid Chromatography 1992, 15, 1361-1379 also developed a so-called restricted access material based on silica for HPLC, the functioning of which is based on a semipermeable membrane (SPS) on the particle surface.
  • SPS semipermeable membrane
  • carrier material which is characterized in that it is porous and whose surface is composed of an outer and a pore surface, the outer surface being distinguishable from the pore surface areas of different derivatization and / or functionality has, in capillary electrochromatography enables an essentially quantitative separation of the analyte from other sample components, in particular proteins and other macromolecular components (sample matrix) of the sample.
  • the term "derivatization” refers to a covalent or, in particular, adsorptive binding of molecules to the surface of the carrier material. This can be, for example, synthetic or natural polymers which, as a chemical diffusion barrier, prevent macromolecules of the sample matrix on the carrier material adsorb or denature.
  • the term “functionalization” denotes in particular the properties of a particular area. Certain areas of the carrier material can be made hydrophobic, while other areas have hydrophilic properties. Such functionalization can be achieved by different derivatization of the areas. Different molecules (eg fatty acids in one area, alcohols in another area) can be used for this. However, it is also possible to achieve a different functionalization by varying the occupancy density of areas with the same molecules.
  • the reproducibility with regard to the number of plates, retention time and dissolution of the column is retained even after repeated injection of complex samples, in particular samples containing serum and cell culture media.
  • the use of the carrier material according to the invention even allows the combined sample preparation and separation of complex samples on a single CEC column. This is in relation to separation performance, sensitivity, signal-to-noise ratio, selectivity, column life and cost of sample preparation and separation carried out on separate columns equal or even superior. For the first time, this enables the use of such a system in high-throughput processes, such as high-throughput screening for potential pharmacologically active substances.
  • the analyte can be concentrated at the top of the column and quantitatively separated and separated independently of the matrix
  • Chiral phases with the following functional ligands are particularly suitable for separating enantiomer mixtures: cyclodextrin, amylose tris (3,5-dimethylphenyl-carbamate), bovine serum albumin, ristocetin, 1,2-diphenylethyldiamine and vancomycin.
  • ChromSper 5 Biomatrix Chrompack
  • ISRP GFF II ISRP GFF II
  • SPS Registered Technologies
  • Hisep Hisep
  • Capcell Pak MF Capcell Pak MF
  • Inorganic materials e.g. silicate-containing, in particular porous, silicate-containing, materials or glass are used. These can be modified, for example as described in US Pat. No. 4,544,485, on their outer and / or pore surface with glycerol propyl.
  • a large number of starting materials are also commercially available, such as, for example, Hypersil (Separations Group), Spherisorb (Phase Separations), Nucleosil (Macherey-Nagel Co.), Zorbax Sil (DuPont), Micropack Si (Varian Associates) or Baker Silica gel (Baker Chem. Co.).
  • Copolymers of glycidyl methacrylate and ethylene dimethacrylate, dihydroxypropyl methacrylate and ethylene dimethacrylate or of glycerol monomethacrylate and glycerol dimethacrylate are also particularly suitable.
  • the surface of the starting material is already covered with epoxy groups.
  • Crosslinked polymers consisting of so-called copolymers such as glycidyl methacrylate and ethylene dimethacrylate already contain epoxy groups.
  • epoxy groups it is also possible to introduce epoxy groups into starting materials by a procedure known to the person skilled in the art. This can be done in particular by reacting a starting material with 3-glycidoxypropylsilane, or by reacting a copolymer of, for example, dihydroxypropyl methacrylate and ethylenedimethacrylate with epichlorohydrin.
  • the peptide unit on the outer surface of the carrier is hydrolyzed with the aid of a peptidase, for example carboxypeptidase A (exopeptidase, which is a peptide bond at the carboxy terminus) (Williams et al., FEBS Letters, 54, 353-357, 1975).
  • a peptidase for example carboxypeptidase A (exopeptidase, which is a peptide bond at the carboxy terminus)
  • carboxypeptidase A exopeptidase, which is a peptide bond at the carboxy terminus
  • Starting materials are carrier materials that are coated with ion exchange groups such as carboxypropyl on the outer and pore surface.
  • the functional groups on the outer surface are converted into silanol groups by a plasma treatment, while the ion exchange groups on the inner surfaces of the pores are retained.
  • the silanol groups are reacted with 3-glycidoxy-trimethylsilanes and the epoxy group is then hydrolyzed with dilute sulfuric acid in order to obtain a hydrophilic outer surface.
  • a modification of the manufacturing method described under EP 0 537 461 can also be used.
  • diols modified with diols are used, which are reacted with fatty acid derivatives to form an ester bond to give, for example, carboxylic acid-derivatized silica gels.
  • the ester bonds on the outer surface are hydrolyzed with particle-bound or free esterases and / or lipases.
  • epoxy-containing starting materials which, as described in DE 43 33 821, are converted into fatty acid-containing ion exchangers and hydrolyzed with esterases and / or lipases as described above.
  • carrier material which has regions on its outer and / or pore surface which contain a functional group in different densities. It is particularly preferred to use carrier material whose pores and / or outer surface have regions which are derivatized and / or functionalized with alkyl residues of the length C1 to C50, preferably C4 to C22, particularly preferably C4, C8 and C18.
  • carrier material whose surface has areas which are derivatized and / or functionalized with diols.
  • carrier material which is modified on its outer surface by glycine and whose pore surface is modified by polypeptides, in particular tripeptides
  • carrier material which is modified on its outer surface with polyethylene glycol and / or polyoxyethylene and whose pore surface is modified with hydrophobic groups, in particular phenyl groups and / or C18 and / or C8 and / or nitrile.
  • carrier material which is essentially spherical, with particularly good separation results being achieved when using carrier materials with an outside diameter D of 0.05 ⁇ D ⁇ 20 ⁇ m, preferably 0.1 ⁇ D ⁇ 5 ⁇ m.
  • carrier materials of the size 0.5 ⁇ D ⁇ 3 ⁇ m can be used.
  • the outside diameter of the particles can be determined in particular using a laser diffraction system, for example the Malvern Mastersizer from Malvern Instruments GmbH,dorfberg. The principle of laser scattering according to Mie theory and Fraunhofer analysis is applied. The scattered light is measured. From these stray « . " -, " -.- O 00/50887
  • the particle size distribution can be derived from light data.
  • Another system for determining the particle size distribution uses the Sigraph 5100 Particle Sizer from Micrometrics. In this method, the particles to be determined are irradiated with X-ray radiation in a sedimentation solution and the radiation is detected after passing through the sample. The particle size distribution is then determined from the detected radiation.
  • the support material is porous, it is advantageous for it to have a pore diameter d of 0.5 d d 100 100 nm, preferably 1 d d 50 50 nm, particularly preferably 2 d d ⁇ 6 nm.
  • the pore diameter is preferably measured using the principle of gas adsorption, for example devices from Beckann Coulter (OMNISORB or SA3100) use this principle.
  • any adsorbed gas is removed from the dry sample in a vacuum and the sample is cooled to 77K. At this temperature, inert gases such as. B. nitrogen, argon or krypton on the surface of the particles of the sample.
  • An adsorption isotherm is recorded, i.e. the adsorbed volume of gas is plotted against the applied pressure.
  • the pore size of the particles can then be determined from these isotherms using the BET (Brunauer, Emmet, Teller) equation. Devices for carrying out these measurements are offered in particular by Beckman Coulter
  • Comparable results for the pore diameter are provided by a method according to Walfort ("Chemically and enzymatically modified reverse-phase support materials for HPLC-integrated sample preparation", dissertation GH Paderborn, 1992), which uses the exclusion chromatographic properties of the support materials.
  • Protein calibration Standards of gel permeation chromatography such as lactate dehydrogenase, ovotransferrin, ovalbumin, caboanhydrase or cytochrome C with different molecular weights, are dissolved in a suitable buffer and injected onto columns filled with the carrier material and eluted with a suitable buffer or gradient.
  • the composition of the eluate is determined by means of UV detection.
  • the pore diameter results from the molecular weight of the retained molecules.
  • the Pinkerton method can be modified in accordance with methods known to the person skilled in the art.
  • the particle surfaces activated with 1,1-carboxydiimidazoles could, for example, be reacted with phenylalanine-L-glycine-L-glycine.
  • an enzyme such as carboxypeptidase A
  • the peptide unit on the outer surface is removed, so that a hydrophobic surface is formed by the derivatization with phenylalanine.
  • a modification of the Takahata method can be used to produce carrier material with a chiral inner surface and a hydrophilic outer surface.
  • a support material coated with oxirane groups is reacted with 6-monodeoxy-6-monoamino-b-cyclodextrin and, in a second step, treated with plasma to remove the chiral ligands on the outer surface.
  • sample matrix the carrier material according to the invention in a CEC method for sample preparation.
  • An electroosmotic flow is generated by applying an electrical voltage, through which the sample molecules are moved and / or the sample molecules migrate due to their charge-to-mass ratio,
  • the sample matrix is eluted by applying a washing buffer
  • a CEC column in the sense of the method according to the invention is to be understood as a carrier material receiving device which can in particular be designed as a capillary column or part of a channel system on a chip.
  • An electroosmotic flow is generated by applying an electrical voltage, through which the sample molecules are moved and / or the sample molecules migrate due to their charge-to-mass ratio,
  • Stationary phases in CEC columns made of carrier materials with a hydrophilic outer surface, preferably by derivatization with alcohols and a pore surface modified with ion exchange groups, are particularly suitable for the purification of small charged organic molecules from complex aqueous solutions in the CEC.
  • Examples are the purification of charged drugs such as antisense molecules from biological body fluids, for example serum, plasma or urine.
  • Other applications are the purification of crop protection agents from extracts from soil samples or parts of plants or the monitoring of syntheses such as labeling of proteins with fluorescent dyes.
  • An alternative application is the use of ion exchange materials for the targeted increase in the rate of separation in the CEC, especially at low pH.
  • a carrier material with affinity ligands such as borate groups on the pore surface and a hydrophilic outer surface is particularly suitable for the separation of carbohydrate-containing compounds, such as for example the control of the enzymatic reaction of phosphorylases with poly sugars such as (glucose) n .
  • carrier materials which are functionalized on the pore surface by hydrocortisone-specific Fab fragments and whose outer surface e.g. is made hydrophilic by diol groups.
  • the hydrophilic outer surface prevents the sample components from being absorbed in aqueous solutions.
  • the method is particularly suitable for complex samples with a very large number of ingredients such as serum and plasma.
  • carrier material is used as the stationary phase, which is coated with alcohol groups on the inner surface of the pores and phenyl groups on the outer surface of the pores.
  • the reaction product can be separated from synthesis mixtures which contain hydrophilic polymers, in particular polyethylene glycol and hydrophilic reactants, such as oligonucleotides, for example, by using carrier materials as the stationary phase, which have the following properties: the pore surface is derivatized with diols or sugars. Its outer surface has hydrophobic properties due to derivatization with C8 alkyl residues.
  • a carrier material that has a hydrophilic outer surface and a chiral inner pore surface is suitable for the separation of enantiomer mixtures such as temazepam or warfarin in biological liquids.
  • the support can be coated with alcohols on the outer surface and with cyclodextrins on the inner surface of the pores.
  • the chiral ligand 1,2-diphenylethyldiamine is particularly suitable for the separation of aryl carbinols.
  • HBSS Hengst Buffered Saline Solution
  • a carrier material is used as the stationary phase, which is coated with carboxylic acid groups on the inner surface of the pore and diol groups on the outer surface of the pore.
  • the column is preferably equilibrated here with an aqueous buffer at a pH greater than 6, the sample is then applied to the column and the HBSS constituents are removed by applying an electrical field.
  • change to a buffer with a pH less than 3 and carry out the separation by applying an electrical field. Particularly good separation results are obtained if the composition of the mobile phase is individually matched to the carrier material.
  • aqueous buffer can be used, but it can also be preferred to equilibrate the CEC column with an organic buffer, for example 95% acetonitrile in water, for example in the presence of ammonium acetate, pH 4.7.
  • organic buffer for example 95% acetonitrile in water, for example in the presence of ammonium acetate, pH 4.7.
  • a carrier material is suitable that is coated with C-8 on the outer surface and diol on the pore surface.
  • the column is equilibrated with a buffer containing, for example, more than 90% acetonitrile.
  • the sample is applied and the hydrophobic components are removed by applying an electric field.
  • a change is made to a buffer which contains more than 60% aqueous phase, and the separation is carried out by applying an electrical field.
  • the separation can be optimized by adjusting the hydrophibicity of the mobile phase.
  • hydrocortisone-specific Fab fragments are coated on the inner surface of the pores and alcohols on the outer surface of the pores.
  • the Fab fragment is selected so that the binding and elution of the antigen can be carried out at two different pH's. The binding takes place, for example, at a pH O 00/50887
  • the mobile phase is preferably composed of buffer salts in the presence of anionic and / or cationic and / or zwitterionic ion pair reagents, whereby their composition can be directly adapted to the nature and properties of the analyte to obtain good separation performance, as is e.g. the examples demonstrate.
  • wash buffer and elution buffer contain organic solvents, wherein wash buffer should contain at least 1% and elution buffer at least 20% organic solvent.
  • the stationary and mobile phase should be selected so that the electro-osmotic flow remains constant or changes reproducibly during the binding and elution of the analyte, an electro-osmotic flow in the range from 0.5 to 10 mm / s is preferred.
  • a DC high voltage is preferably used to generate the electroosmotic flow.
  • the sample can also be preferred to apply the sample to the column and wash it using the flash-back method. This reduces possible contamination of the column with matrix components and also leads to a concentration of the sample at the top of the column.
  • Electroosmotic elution and separation of the analytes is particularly preferred in order to obtain a sufficient number of trays even when using very short columns, preferably ⁇ 10 cm.
  • a further concentration of the analyte by a factor of 10 to 1000 is achieved during the elution by isotachophoresis.
  • the analyte can be transferred from a separate sample preparation column to a separation column without a large change in volume.
  • mixtures of different carrier materials are preferably also used as the stationary phase.
  • the particular advantage of these mixtures is that they allow an optimal adaptation to the properties of the mobile phase and the sample and thus ensure a sensitive and selective separation.
  • the buffer salts and / or anionic and / or cationic and / or zwitterionic ion pair reagents are volatile at room temperature.
  • the methods of mass spectrometry and / or optical detection are particularly advantageous here, e.g. by light scattering, in particular condensation nucleation light scattering detection (Szostek et al., 1997, Analytical Chemistry, 69, 2955-2962) and / or fluorescence detection and / or electrochemical detection and / or conductivity detection and / or refractive index detection, in particular laser-based Refractive index detection coupled with absorption detection (Anal. Chem.
  • analyte fractions can also be preferred to feed the analyte fractions to a fraction collector after the separation, thus to collect them individually and to use them for further use.
  • the transfer to a further column system for further separation may also be desirable.
  • the possibility of carrying out the method in parallel in a multiplicity of CEC column systems which are connected to one another is particularly advantageous.
  • a CEC device preferably contains the following components:
  • Carrier material receiving unit with at least one inlet and at least one outlet, packed with carrier material, which is porous and whose surface is composed of an outer and a pore surface, the outer surface having areas of different derivatization and / or functionality that can be distinguished from the pore surface,
  • a CEC device is particularly preferred, in which a pressure generating device is additionally provided for pressurizing the carrier material receiving unit.
  • a system for automated changing of the vessels is provided for taking up the mobile phase.
  • the carrier material receiving unit to at least one detector, the detector in particular as a mass spectrometer and / or optical detector, in particular UV detector, light scattering detector, particularly preferably condensation nucleation light scattering detector and / or fluorescence detector and / or electrochemical detector and / or conductivity detector and / or refractive index detector, in particular laser-based refractive index detector coupled with absorption detection and / or laser-based refractive index detector using backscatter and / or chemiluminescence nitrogen specific detector and / or thermo-optical detector Detector, in particular thermo-optical absorption detector and / or laser-induced capillary vibration detector.
  • the detector in particular as a mass spectrometer and / or optical detector, in particular UV detector, light scattering detector, particularly preferably condensation nucleation light scattering detector and / or fluorescence detector and / or electrochemical detector and / or conductivity detector and / or refractive index detector, in particular laser-based refractive index detector coupled with absorption detection and
  • the carrier material receiving unit is designed as a capillary column.
  • the carrier material receiving unit of the device according to the invention is designed as part of a channel system on a chip.
  • the capillary column and the chip consist of plastic and / or glass and / or fused silica and / or ceramic and / or elastomer and / or polymers.
  • At least two carrier material receiving units are provided, which are connected to one another via a capillary system and / or a channel system, the channel system and / or capillary system preferably having at least one outlet.
  • the outlet of the carrier material receiving unit it is advantageous for the outlet of the carrier material receiving unit to have an inside and / or outside diameter that deviates from the inlet.
  • the outlet is designed as an electrospray device.
  • a multiplicity in particular 2 to 50, particularly preferably 2 to 16 carrier material receiving units are arranged in parallel and / or in two dimensions.
  • the at least one carrier material receiving unit of the device according to the invention contains a mixture of different types of carrier materials, wherein each type of carrier material is porous and its surface is composed of an outer and a pore surface, the outer surface being distinguishable from the pore surface areas of different derivatization and / or has functionality.
  • the sample receiving device is designed for receiving samples with a volume V of 0.5 nl V V 100 100 ⁇ l.
  • V volume of 0.5 nl V V 100 100 ⁇ l.
  • a CEC column in the sense of the device according to the invention is to be understood as a carrier material take-up unit, which can in particular be designed as a capillary column or part of a channel system on a chip.
  • Figure 1 shows a CEC column system consisting of a single column for sample preparation and / or separation.
  • Figure 2 shows the coupling of a CEC column system to a de- tector, here a mass spectrometer.
  • Figure 5 shows a CEC chip system
  • Figure 7 shows an example of a possible embodiment of a ⁇ -total analysis system.
  • Figure 9 shows the electropherogram of an analyte mixture, separated on a CEC column packed with ISPR GFFII-S5-80.
  • Figure 10 shows the electropherogram of an analyte mixture, separated on a CEC column packed with SPS 5 PM-S5-100-phenyl.
  • Figure 11 shows the electropherogram of an analyte mixture, separated on a CEC column packed with SPS 5 PM-S5-100-CN.
  • Figure 12 shows the electropherogram of benzocaine from pure rat serum, separated on a CEC column packed with SPS 5 PM-S5-100-CN.
  • Figure 13 shows the electropherogram of benzocaine from pure dog plasma, separated on a CEC column packed with SPS 5 PM-S5-100-CN.
  • the column system consists of at least one CEC column for sample preparation and at least one CEC column for separating the analyte, which are connected to one another via a capillary system, this capillary system at least in a particularly preferred embodiment has an outlet through which the sample matrix can be removed.
  • a CEC column (30) only for sample preparation.
  • Figure 3 shows the combination of a CEC column (30) with a further column (170), which are arranged on a chip. It is also possible to transfer the analyte to other analysis or separation systems after the sample matrix has been separated.
  • the device can also couple the column system to at least one detector, in particular mass spectrometer and / or light scattering detector or other optical detector and / or electrochemical detector and / or fluorescence detector and / or conductivity detector and / or refractive index detector, in particular laser-based refractive index detector coupled with absorption detection and / or laser-based refractive index detector using backscatter and / or chemiluminescence nitrogen-specific detector and / or thermo-optical detector, in particular thermo-optical absorption detector and / or laser-induced capillary vibration detector (150).
  • This preferred embodiment is outlined in Figure 2 using the coupling to a mass spectrometer which has an electrospay device (230).
  • the outlet of the column system has an inside and / or outside diameter that deviates from the inlet.
  • the CEC column system is arranged on a chip (300) ( Figure 5). Shown here is a column system consisting of a carrier material receiving unit (30) with a carrier material (60) according to the invention, a sample reservoir (290) and three buffer reservoirs (260). The system is designed so that each reservoir can hold one electrode. In this way, a voltage can optionally be applied between different reservoirs. In a preferred embodiment, the control and switching of the electrodes takes place automatically, and the exact circuit diagrams can be managed by computer programs.
  • materials such as plastic, glass, fused silica, ceramic, elastomers or polymers.
  • Suitable chips can be produced, for example, by using photolithography in conjunction with etching techniques. This was described, for example, by JP Landers (Handbook of Capillary Electrophoresis, 1997, CRC Press, p. 828) for the production of chips for use in capillary electrophoresis.
  • Materials such as glass or fused silica are coated with a photosensitive substance.
  • the desired channel system is transferred to the substrate by exposure with the aid of a mask and is etched into the substrate, for example in a bath of dilute HF / NH 4 F.
  • the capillaries or support material receiving units for the CEC columns and chip systems it may be desirable to prevent unspecific reactions of the sample with, for example, free silanol groups on the inside of the capillary, to coat them. This is advantageously done with PVA or polyacrylamide.
  • the column system is a component of a total analysis system.
  • Another embodiment provides for the parallelization of a large number of CEC column systems in which the sample preparation and - separation is carried out in parallel.
  • These column systems are chip systems or capillary systems or combinations of both. This coupling of several systems is particularly advantageous in high-throughput screening because it allows the parallel preparation and separation of a large number of samples, which can then be further examined.
  • Figure 8 shows an example of a particle of a porous carrier material.
  • the surface of this carrier material can be divided into an outer surface (510) and a pore surface (540).
  • Figure 9 shows the electropherogram of an analyte mixture in a model matrix.
  • the procedure was carried out using a CEC column filled with ISRP GFFII-S5-80 (pore size 8 nm).
  • the length of the packed capillary 8.3 cm. Inside diameter 100 ⁇ m.
  • Detection wavelength 210 nm.
  • embodiment 1 For further conditions see embodiment 1.
  • Figure 11 shows the electropherogram of an analyte mixture in a model matrix.
  • the procedure was carried out with a CEC column, filled with SPS 5 PM-S5-100-CN pore size 10 nm). Length of the packed capillary: 8.3 cm. Inner diameter: 100 ⁇ m. Detection wavelength: 210 nm. For further conditions see embodiment 3.
  • Figure 12 shows the electropherogram of benzocaine from pure rat serum. The procedure was a CEC column PLC 5 PM-S5-100-CN Company Regis ® (pore size 10 nm). Length of the packed capillary: 8.3 cm. Inner diameter: 100 ⁇ m. Detection wavelength: 210 nm. For further conditions see embodiment 4.
  • Figure 13 shows the electropherogram of benzocaine from pure dog plasma. The procedure was carried out using a CEC column, SPS 5 PM-S5-100-CN from Regis ® (pore size 10 nm). Length of the packed capillary: 8.3 cm. Inner diameter: 100 ⁇ m. Detection wavelength: 210 nm. For further conditions see embodiment 5.
  • the CEC column having a length of 8.3 cm and an inner diameter of 100 microns was with Pinkerton ISRP GFFII-S5-80 Company ® Regis Technologies, Inc., Austin, USA, packed.
  • the particles used had a diameter of 5 ⁇ m and a pore size of 8 nm.
  • the wash buffer consisted of 5% acetonitrile, 95% water, 5 mM ammonium acetate (pH 8.5).
  • the elution buffer consisted of 40% acetonitrile, 60% water, 5 mM ammonium acetate (pH 8.5).
  • the solution contained FBS (Fetal Bovine Serum) in a concentration of 10 mg / ml, thiourea, acetaminophen, benzocaine, propranolol and quinine each 1 mg / ml.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • This sample solution is referred to in the text below as "analyte mixture in model matrix”.
  • the column preparation was carried out in two stages at 15 ° C: The column was first equilibrated with separation buffer. During this process, the voltage was increased in steps of 5 kV from -5 kV to -20 kV every 5 minutes. The inlet buffer tank (buffer tank into which the column inlet is immersed) was pressurized to 5 bar. Then both buffer vessels were pressurized with 10 bar and a voltage of -15 kV was applied. The stability of the column was checked in the meantime by measuring the current and the UV adsorption (210 nm).
  • the buffers, the samples and the separation capillary were kept at 15 ° C.
  • the sample (analyte mixture in model matrix) was electrokinetically charged to the column by applying a voltage of -5 kV for 3 seconds. Subsequently, a small amount of washing buffer, a so-called buffer plug, was loaded onto the column under the same conditions to prevent a possible diffusion of the sample into the buffer vessel.
  • the sample was then applied by applying the washing buffer at a voltage of -15 kV and applying pressure Both ends of the column were washed at 10 bar and the proteins and salts from the model matrix were removed from the CEC column. After 3 min there was a change from the wash buffer to the elution buffer. The conditions -15 kV and 10 bar were maintained. The thiourea eluted at 1.48 min, acetaminophen at 2.27 min, benzocaine at 4.88 min, propranolol at 4.99 min and quinine at 5.67 min. The electropherogram of this separation is shown in Figure 9.
  • the CEC column having a length of 8.3 cm and an inner diameter of 100 microns was packed with SPS 5 PM-S5-100-Phenyl Company ® Regis Technologies, Inc., Austin, USA.
  • the particles used had a diameter of 5 ⁇ m and a pore size of 10 nm.
  • the wash buffer consisted of 5% acetonitrile, 95% water, 5 mM ammonium acetate (pH 4.7).
  • the elution buffer consisted of 15% acetonitrile, 85% water, 5 mM ammonium acetate (pH 4.7).
  • the solution contained FBS (Fetal Bovine Serum) in a concentration of 10 mg / ml, thiourea, acetaminophen, benzocaine, propranolol and quinine each 1 mg / ml.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • This sample solution is referred to in the text below as "analyte mixture in model matrix”.
  • the device shown in Figure 1 was used to carry out the separation of the analyte mixture in a model matrix.
  • the column packed with SPS 5 PM-S5-100-Phenyl was immersed at one end in a container for the buffer solution.
  • a voltage was applied between both ends of the column using a voltage source (10).
  • the column preparation was carried out according to embodiment 1.
  • the buffers, the samples and the separation capillary were kept at 15 ° C.
  • the sample (analyte mixture in model matrix) was electrokinetically charged to the column by applying a voltage of -5 kV for 3 seconds. Subsequently, a small amount of washing buffer, a so-called buffer plug, was loaded onto the column under the same conditions to prevent a possible diffusion of the sample into the buffer vessel.
  • the CEC column having a length of 8.3 cm and an inner diameter of 100 microns was the firm ® Regis Technologies, Inc., Austin, USA packed with SPS 5 PM-S5-100-CN.
  • the particles used had a diameter of 5 ⁇ m and a pore size of 10 nm.
  • the wash buffer consisted of 5% acetonitrile, 95% water, 5 mM ammonium acetate pH 4.7.
  • the elution buffer consisted of 15% acetonitrile, 85% water, 5 mM, pH 4.7.
  • the solution contained FBS (Fetal Bovine Serum) in a concentration of 10 mg / ml, thiourea, acetaminophen, benzocaine, propranolol and quinine each 1 mg / ml.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • This sample solution is referred to in the following text as an analyte mixture in a model matrix.
  • the device shown in Figure 1 was used to carry out the separation of the analyte mixture in a model matrix.
  • a voltage source (10) was used to apply a voltage between the two ends of the column.
  • the buffers, the samples and the separation capillary were kept at 15 ° C.
  • the sample (analyte mixture in model matrix) was electrokinetically charged to the column by applying a voltage of -5 kV for 3 seconds. Subsequently, a small amount of washing buffer, a so-called buffer plug, was loaded onto the column under the same conditions to prevent a possible diffusion of the sample into the buffer vessel.
  • the CEC column having a length of 8.3 cm and an inner diameter of 100 microns was the firm ® Regis Technologies, Inc., Austin, USA packed with SPS 5 PM-S5-100-CN.
  • the particles used had O 00/50887
  • the wash buffer consisted of 5% acetonitrile, 95% water, 5 mM ammonium acetate pH 4.7.
  • the elution buffer consisted of 15% acetonitrile, 85% water, 5 mM, pH 4.7.
  • the sample consisted of rat serum doped with benzocaine in a concentration of 0.5 mg / ml serum.
  • the device corresponded to that from exemplary embodiment 3.
  • the buffers, the samples and the separation capillary were kept at 15 ° C.
  • the sample was electrokinetically charged to the column by applying a voltage of -5 kV for 3 sec.
  • a small amount of washing buffer, a so-called buffer plug, was then loaded onto the column under the same conditions to prevent the sample from diffusing into the buffer vessel.
  • the CEC column having a length of 8.3 cm and an inner diameter of 100 microns was the firm ® Regis Technologies, Inc., Austin, USA packed with SPS 5 PM-S5-100-CN.
  • the particles used had a diameter of 5 ⁇ m and a pore size of 10 nm.
  • the wash buffer consisted of 5% acetonitrile, 95% water, 5 mM ammonium acetate pH 4.7.
  • the elution buffer consisted of 15% acetonitrile, 85% water, 5 mM, pH 4.7.
  • the sample consisted of dog plasma doped with benzocaine in a concentration of 0.5 mg / ml plasma
  • the sample was then washed by applying the washing buffer at a voltage of -15 kV and applying pressure to both ends of the column at 10 bar.
  • the proteins and salts were removed from the model matrix.
  • the wash buffer was replaced by an elution buffer.
  • the conditions -15 kV and 10 bar were maintained.
  • the benzocaine eluted at 11.38 min.
  • the electropherogram of this separation is shown in Figure 13.

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Abstract

Verwendung von Trägermaterial für die Kapillar-Elektrochromatographie (CEC), dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial porös ausgestaltet ist und die Oberfläche sich aus einer äußeren und einer Porenoberfläche zusammensetzt, wobei die äußere Oberfläche von der Porenoberfläche unterscheidbare Bereiche unterschiedlicher Derivatisierung und/oder Funktionalität aufweist.

Description

Verwendung von Tragermaterial in der Kapillar- Ele trochromatographie
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Trägermaterialien in der Ka- pillar-Elektrochromatographie (CEC).
Im allgemeinen sind Analysenmethoden im günstigsten Fall selektiv; nur wenige, wenn überhaupt, sind jedoch wirklich spezifisch. Folglich ist im Rahmen einer Analyse die Abtrennung des Analyten von störenden Begleitsubstanzen unumgänglich.
In chromatographischen Trennungen wird die Probe in einer mobilen Phase gelöst, bei der es sich z.B. um ein Gas, eine Flüssigkeit oder ein überkritisches Fluid handeln kann. Die mobile Phase wird durch eine mit ihr nicht mischbare stationäre Phase bewegt, die sich z.B. in einer Säule befindet oder an einer festen Oberfläche fixiert ist. Die beiden Phasen werden so gewählt, dass sich die Probenkomponenten in verschiedenem Maße zwischen der mobilen und stationären Phase verteilen. Die Komponenten, die von der stationären Phase in starkem Maße zurückgehalten werden, bewegen sich nur langsam mit der mobilen Phase weiter. Demgegenüber bewegen sich die Komponenten, die nur schwach von der stationären Phase zurückgehalten werden, schnell. Aufgrund dieser Unterschiede trennen sich die Probenkomponenten in diskrete Banden auf.
Ein Chromatographiekonzept, das die Vorteile der Kapillarflüssigkeit- schromatographie (z.B. HPLC) und der Kapillarelektrophorese (CE) verbindet, ist die sogenannte Kapillar-Elektrochromatographie (CEC). Im wesentlichen kann CEC als Hybrid aus HPLC und CE angesehen werden (Colon et al., Analytical Chemistry News & Features 1995; August 1, 461A-467A). Wie in der HPLC werden die Komponenten einer Probe durch unterschiedliche Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase aufgetrennt. Zusätzlich wird aber, wie in der CE, durch Anlegen einer elektrischen Spannung ein elektroosmotischer Fluss erzeugt. Die Trennungen können isokratisch oder mit einem Gradienten durchgeführt werden. Die Säulen sind bevorzugt mit Kieselgelpartikeln gefüllt, die typischerweise Partikeldurchmesser im Bereich von 1 bis 5 μm haben.
Der Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit der Trennung von anionischen, kationischen und neutralen Molekülen. Allerdings besteht ein großes Problem in der Analyse komplexer, insbesondere biologischer Proben. Diese, wie z.B. hämolysiertes Blut, Plasma, Serum, Milch, Speichel, Rückenmarksflüssigkeit, Fermenterbrühe, Urin, Überstände von Zellkultur-, Lebensmittel- und Gewebehomogenaten oder Naturstoffextrakte, enthalten neben dem Analyten einen großen Anteil an Matrixkomponenten, wie Proteine und Salze.
Proteine und andere Makromoleküle werden z.B. durch hohe Anteile von organischen Lösungsmitteln in der mobilen Phase ausgefällt oder durch Restsilanolgruppen an der Oberfläche eines chromatographischen Trägers unspezifisch, irreversibel gebunden oder denaturiert (J. R. Verart et al., J. Chromatography A 1999; 471-475). Die Proteine und andere Makromoleküle blockieren bei Verwendung einer porösen stationären Phase den Zugang zu den Poren und verringern damit die Anzahl der chromatographischen Adsorptionszentren. Durch den damit verbundenen verringerten Stoffaustausch zwischen stationärer und mobiler Phase führen diese Vorgänge zu einem Kapazitäts- und Selektivitätsverlust der Säule. Nichtspezifische Adsorption führt darüber hinaus zu Schwankungen des elektroosmotischen Flusses und zu nicht reproduzierbaren Re- tentionszeiten der Analyten. In allen Fällen wird die CEC-Säule schwer geschädigt oder unbrauchbar gemacht. Daher ist es notwendig, diese Matrixkomponenten vor der CEC-Analyse aus der Probe zu entfernen.
Diese Problematik wiegt umso schwerer, da sie Bestimmungen betrifft, die in großer Anzahl durchgeführt werden: z.B. Metabolismusstudien, Therapiekontrolle, Bestimmung von körpereigenen Substanzen, Qualitätskontrolle von Lebensmitteln oder auch das Hochdurchsatzscreening nach potenziellen pharmakologischen Wirkstoffen, insbesondere unter Verwendung von Naturstoffextra ten.
Gängige Probenaufbereitungsverfahren sind neben Verfahren der Dialyse, Ultrafiltration, Proteinpräzipitation, Flüssig/Flüssig-Extraktion insbesondere Verfahren der Festphasenextraktion z.B. Kartuschenverfahren oder die Verwendung von Vorsäulen, die vorzugsweise mit Kieselgelpartikeln gefüllt sind, wobei die Elution des Analyten bevorzugt durch Flüs- sigdesorption (HPLC) erfolgt. Die Verwendung von Vorsäulen zur Abtrennung von Analyten aus protein- bzw. matrixhaltigen Proben in der HPLC wird beispielsweise von Rudolphi und Boos (LOGC 15 (9) 814- 823, 1997) beschrieben.
Allerdings sind die notwendigen Probenvorbehandlungsschritte oft zeit-, kosten- und arbeitsintensiv und führen durch den notwendigen Transfer des Analyten auf eine Trennsäule zu einer Volumenvergrößerung der Probe, die zu einem Verlust an Selektivität und Empfindlichkeit des Trenn Verfahrens führt. Darüber hinaus sind zur Durchführung dieser Probenvorbehandlungsschritte Probenvolu-mina von mindestens 10 μl erforderlich, was insbesondere den Einsatz zur Probenaufbereitung in Hochdurchsatzverfahren, in denen nur nl bis wenige μl Probe zur Verfügung stehen, unmöglich macht. Pinkerton et al. (US-Patent 4,544,485) beanspruchen ein Trägermaterial für die Flüssigkeitschromatographie auf Silika- oder Glas-Basis, das eine Abtrennung von Proteinen bzw. Makromolekülen aus einer Probe ermöglicht. Das sogenannte Internal Surface Reverse Phase (ISRP)- Material zeichnet sich durch eine hydrophile äußere Oberfläche und eine hydrophobe innere bzw. Porenoberfläche aus. In einer Modifikation ist beispielsweise an der äußeren Partikeloberfläche Glycin gebunden. Die Porenoberfläche zeichnet sich durch über Glycerolpropyl gebundene Polypeptide insbesondere Tripeptide aus. Diese führen zu einer begrenzten Zugängigkeit der Poren. Kleinere Zielmoleküle (Analyten) erhalten Zugang zu den Poren, während die großen Matrixmoleküle ausgeschlossen bleiben.
Boos et al. (LC-GC 1997,15, 602-611; LOGC 1996,14, 554-560) beschreiben ein Trägermaterial auf Alkyl-Diol-Silika-Basis (ADS), das quantitative Abtrennung von Proteinen und anderen makromolekularen Bestandteilen gewährleistet. Es zeichnet sich durch eine für Biomoleküle inerte Oberfläche aus und ist in den Poren mit Alkylgruppen belegt. Die Porengröße ermöglicht kleinen Zielmolekülen (Analyten) Zugang, während die großen Matrixmoleküle ausgeschlossen bleiben. Dieses Material wurde speziell für HPLC-Analysen entwickelt.
L. J. Glunz et al. (J. of Liquid Chromatography 1992, 15, 1361-1379) entwickelten ebenfalls ein sogenanntes Restricted Access Material auf Silika-Basis für die HPLC, dessen Funktionsweise auf einer semiperme- ablen Membran (SPS) an der Partikeloberfläche beruht. Durch Oberflächenbelegung des Trägermaterials mit Polyethylenglycol oder Po- lyoxyethylen entsteht ein Netzwerk, das nur kleinen Analyten einen Zugang zu den Poren ermöglicht. Makromolekülen ist damit der Zugang zu den Poren nicht möglich. Die Porenoberfäche ist mit hydrophoben Gruppen insbesondere Phenylgruppen, C18, C8 und Nitril belegt.
Weitere speziell für die HPLC entwickelte Restricted Access Trägermaterialien auf der Basis poröser Materialien, dessen äußere Oberfläche eine andere Derivatisierung als die Porenoberfläche aufweist, sind insbesondere ChromSper 5 Biomatrix (Chrompack), Hisep (Supleico) und Capcell Pak MF (Shiseido).
Die Verfahren der Kapillar-Elektrochromatographie und der HPLC unterscheiden sich insbesondere durch die in der CEC auftretenden elek- troosmotischen Kräfte erheblich voneinander. Für die HPLC geeignete Materialien und Bedingungen sind somit nicht einfach auf das Verfahren der CEC zu übertragen (Colon et al., Analytical Chemistry & Features 1997; August 1).
Daher war es um so überraschender, dass die Verwendung von Trägermaterial, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es porös ausgestaltet ist und dessen Oberfläche sich aus einer äußeren und einer Porenoberfläche zusammensetzt, wobei die äußere Oberfläche von der Porenoberfläche unterscheidbare Bereiche unterschiedlicher Derivatisierung und/oder Funktionalität aufweist, in der Kapillar- Elektrochromatographie eine im wesentlichen quantitative Abtrennung des Analyten von anderen Probenkomponenten, insbesondere Proteinen und anderen makromolekularen Bestandteilen (Probenmatrix) der Probe ermöglicht.
Der Begriff "Derivatisierung" bezieht sich auf eine kovalente oder auch insbesondere adsorptive Bindung von Molekülen an der Oberfläche des Trägermaterials. Hierbei kann es sich beispielsweise um synthetische oder natürliche Polymere handeln, die als chemische Diffusionsbarriere verhindern, dass Makromoleküle der Probenmatrix am Trägermaterial adsorbieren bzw. denaturieren. Der Begriff "Funktionalisierung" bezeichnet insbesondere die Eigenschaften eines jeweiligen Bereiches. So können bestimmte Bereiche des Trägermaterials hydrophob ausgestaltet sein, während andere Bereiche hydrophile Eigenschaften aufweisen. Eine derartige Funktionalisierung kann durch unterschiedliche Derivatisierung der Bereiche erzielt werden. Hierzu können verschiedene Moleküle (z.B. Fettsäuren in einem Bereich, Alkohole in einem anderen Bereich) eingesetzt werden. Es ist jedoch auch möglich, eine unterschiedliche Funktionalisierung durch Variation der Belegungsdichte von Bereichen mit gleichen Molekülen zu erzielen.
Die erfindungsgemäße Verwendung des Trägermaterials in der CEC ermöglicht es, den Analyten von anderen Komponenten der Probe zu trennen, ohne diesen zu verdünnen. In Verbindung mit Isotachophorese ist es in einer Ausführungsform möglich, den Analyten ohne signifikante Erhöhung des Volumens auf eine Trennsäule, insbesondere eine weitere CEC-Säule oder eine μ-HPLC-Säule, zu überführen. Es können sogar Probenvolumina < 10 μl aufbereitet werden.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung des Trägermaterials bleibt auch nach wiederholter Injektion komplexer Proben, insbesondere von serum- und zellkulturmedien-haltigen Proben, die Reproduzierbarkeit hinsichtlich Bodenzahlen, Retentionszeit und Auflösung der Säule erhalten.
Die erfindungsgemäße Verwendung des Trägermaterials erlaubt in einer weiteren Ausführungsform sogar die kombinierte Probenaufbereitung und -trennung von komplexen Proben auf einer einzigen CEC-Säule. Diese ist in Bezug auf Trennleistuhg, Empfindlichkeit, Signal-zu-Rausch- Verhältnis, Selektivität, Lebensdauer der Säule und Kosten der einer auf getrennten Säulen durchgeführten Probenaufbereitung und -trennung gleichgestellt oder sogar überlegen. Dies ermöglicht erstmals den Einsatz eines solchen Systems in Hochdurchsatz-Verfahren, wie z.B. dem Hochdurchsatzscreening nach potenziellen pharmakologisch aktiven Substanzen.
Es kann bevorzugt sein, die mittels CEC getrennten Analyten vorzugsweise vollautomatisch einer weiteren Analyse, insbesondere unter Anwendung der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, zuzuführen, im Rahmen derer insbesondere die Wechselwirkung des Analyten mit anderen Molekülen detektiert wird. Hierbei kann es sich z.B. um Rezeptor- Ligand-Interaktionen handeln.
Die erfindungsgemäße Verwendung des Trägermaterials zeichnet sich somit insgesamt durch folgende Eigenschaften aus:
• es besteht die Möglichkeit der wiederholten direkten Injektion unbe- handelter Proben, insbesondere biologischer Proben auf einer CEC- Säule,
• die Proteinmatrix wird quantitativ entfernt,
• der Analyt kann am oberen Rand der Säule auf konzentriert und unabhängig von der Matrix quantitativ ab- und aufgetrennt werden,
• hohe Trennleistung, Empfindlichkeit, Genauigkeit, sehr gutes Signal- zu-Rausch-Verhältnis,
• hohes Maß an Reproduzierbarkeit hinsichtlich Bodenzahlen, Retenti- onszeit und Auflösung der Trennung in der Säule,
• automatischer Betrieb möglich,
• hohe Anzahl an Analysendurchgängen, kontinuierlicher Betrieb der Säule,
• geringe Kosten pro Analyse. Es ist besonders vorteilhaft, wenn die äußere und/oder Porenoberfiäche des Trägermaterials mit hydrophoben und/oder hydrophilen Gruppen und/oder Ionenaustauschergruppen und/oder Affinitätsiigandeπ und/oder chiralen Gruppen derivatisiert und/oder funktionalisiert ist. Das Trägermaterial lässt sich somit individuell hinsichtlich seiner chemischen und/oder physikalischen Trenneigenschaften gestalten.
Die im folgenden aufgeführten funktionalen Gruppen sind besonders geeignet:
Figure imgf000010_0001
Zur Trennung von Enantiomerengemischen sind chirale Phasen mit folgenden funktionalen Liganden besonders gut geeignet: Cyclodextrin, Amylose tris(3,5-dimethylphenyl-carbamate), Bovine Serum Albumin, Ristocetin, 1,2-Diphenylethyldiamine und Vancomycin.
Eine Reihe von geeigneten Trägermaterialien sind mit einem Außendurchmesser von 5 μm erhältlich, insbesondere ChromSper 5 Biomatrix (Chrompack), ISRP GFF II und SPS (Regis Technologies), Hisep (Supleico) und Capcell Pak MF (Shiseido).
Der Fachmann kann neben Materialien, wie beispielsweise ChromSper 5 Biomatrix (Chrompack), ISRP GFF II und SPS (Regis Technologies), Hisep (Supleico) und Capcell Pak MF (Shiseido), auf unterschiedliche Verfahren zur Herstellung der stationären Phasen für die erfindungsgemäße Verwendung zurückgreifen.
Als Ausgangsmaterial können anorganische Materialien z.B. silikathaltige, insbesondere poröse, silikathaltige, Materialien oder Glas eingesetzt werden. Diese können, beispielsweise wie in US 4,544,485 beschrieben, auf ihrer äußeren und/oder Porenoberfläche mit Glycerinpropyl modifiziert sein. Eine große Anzahl von Ausgangsmaterialien sind auch kommerziell erhältlich, wie beispielsweise Hypersil (Separations Group), Spherisorb (Phase Separations), Nucleosil (Macherey-Nagel Co.), Zor- bax Sil (DuPont), Micropack Si (Varian Associates) oder Baker Silica gel (Baker Chem. Co.).
Auch hydroxylgruppenhaltige organische Polymere oder Copolymere können als Ausgangsmaterial verwendet werden. Als Ausgangsmaterial eignen sich auch hydrophile organische Copoly- mere aus beispielsweise Oligoethylenglycol, Glycidylmethacrylat oder Pentaerythroldimethacrylat. Diese können durch Acrylamidderivate der Formel CH =CH-CO-NHR, wobei R beispielsweise eine lineare und/oder verzweigtkettige aliphatische Sulfonsäuregruppe und/oder Carbonsäuregruppe ist, funktionalisiert werden. Insbesondere eignen sich auch Mischpolymerisate aus Glycidylmethacrylat und Ethylendimethacrylat, Dihydroxypropylmethacrylat und Ethylendimethacrylat oder aus Glyce- rinmonomethacrylat und Glycerindimethacrylat.
Für die Synthese insbesondere von Basismaterialien im Korngrößenbereich kleiner 5 μm kann eine Modifikation der Methode von Stöber (Christian Kaiser, Dissertation, Johannes-Gutenberg-Universität, 1996, W. Stöber et al., J. Colloid Interface Sei. 26, 62, 1968) zur Herstellung von hochgeordneten mesoporösen Materialien auf Kieselgelbasis verwendet werden. Der Fachmann kann beispielsweise auch auf das unter DE 195 30 031 beschriebene Verfahren zurückgreifen. Alternativ können auch polydisperse Kieselgele, wie unter US 3,489,516, US 3,656,901 oder US 2,385,217 beschrieben, hergestellt werden. Durch ein Sichtungsverfahren werden Partikel in einem Größenbereich von insbesondere kleiner 5 μm stark angereichert, die dann als Ausgangsmaterial für erfindungsgemäßes Trägermaterial dienen können.
Abhängig davon, mit welchen Liganden das Basismaterial derivatisiert werden soll, kann es vorteilhaft sein, dass die Oberfläche des Ausgangsmaterials bereits mit Epoxygruppen belegt ist. Vernetzte Polymere bestehend aus sogenannten Mischpolymerisaten wie beispielsweise Glycidylmethacrylat und Ethylendimethacrylat enthalten bereits Epoxygruppen. Es ist aber ebenfalls möglich, Epoxygruppen nach einer dem Fachmann bekannten Vorgehensweise in Ausgangsmaterialien einzuführen. Dies kann insbesondere durch Umsetzung eines Ausgangsmaterials mit 3- Glycidoxypropylsilan, oder durch Umsetzung eines Mischpolymerisates aus beispielsweise Dihydroxypropylmethacrylat und Ethlylendi- methacrylart mit Epichlorhydrin geschehen.
Alternative Vorschriften für die Herstellung von Ionenaustauschermate- rialien, die auf der Umsetzung von Oxiranringen beruhen, sind in DE 43 33 674 (WO 95/09 964) und in DE 43 33 821 (WO/95/09695) beschrieben worden: Der Fachmann kann diese Vorgehensweisen auch auf Ausgangsmaterialien übertragen, die nur auf der Porenoberfläche mit Oxi- rangruppen derivatisiert sind.
Weitere Synthese Ansätze sind von Pinkerton (EP 0 173 233) beschrieben worden. Diolhaltige Basisträger werden mit 1,1-Carboxydiimidazole aktiviert (Bethell et al., J. Biol. Chem. 254, 2572, 1979; J. Cjrom., 219, 361, 1981) und anschließend mit einem Tripeptid, insbesondere Glyci- ne-L-Asparginsäure-L-Asparginsäure oder Glycine-L-Serine-L-
Glutaminsäure umgesetzt. In einem weiteren Schritt wird die Peptidein- heit auf der Außenoberfläche des Trägers mit Hilfe einer Peptidase, beispielsweise Carboxypeptidase A (Exopeptidase, die am Carboxyterminus einer Peptidbindung) hydrolysiert (Williams et al., FEBS Letters, 54, 353-357, 1975). Bei der Verwendung eines Porendurchmessers von zum Beispiel 4 nm kann das Enzym nicht in die Poren eindringen, da es ein Molekulargewicht von 34 Dalton besitzt. Die Auswahl eines geeigneten Enzymes hängt von der Natur des Peptides und der Größe des Porendurchmessers ab. Für die Synthese kann alternativ auch eine Modifikation des unter US 4,694,092 beschriebenen Verfahrens verwendet werden. Ausgangsmaterialien sind Trägermaterialien, die mit Ionenaustauschergruppen wie beispielsweise Carboxypropyl auf der äußeren und Porenoberfläche belegt sind. Durch eine Plasmabehandlung werden die funktioneilen Gruppen auf der Außenoberfläche zu Silanolgruppen umgewandelt, während die Ionenaustauschergruppen auf den Poreninnenoberflächen erhalten bleiben. In einem weiteren Schritt werden die Silanolgruppen mit 3- Glycidoxy-trimethylsilane umgesetzt und anschließend die Epoxygruppe mit verdünnter Schwefelsäure hydrolysiert, um eine hydrophile Außenoberfläche zu erhalten.
Alternativ kann auch eine Modifikation der unter EP 0 537 461 beschriebenen Herstellungsmethode verwendet werden. Als Ausgangsmaterial werden mit Diolen modifizierte Kieselgele verwendet, die mit Fettsäurederivaten unter Ausbildung einer Esterbindung zu beispielsweise Carbonsäure derivatisierten Kieselgelen umgesetzt werden. In einem zweiten Schritt werden die auf der Außenoberfläche befindlichen Esterbindungen mit partikelgebundenen oder freien Esterasen und/oder Lipa- sen hydrolysiert.
Beispielsweise können auch epoxyhaltige Ausgangsmaterialien verwendet werden, die wie nach DE 43 33 821 zu fettsäurehaltige Ionenaustauschern umgesetzt und wie oben beschrieben mit Esterasen und/oder Lipasen hydrolysiert werden.
Erfindungsgemäß kann es wünschenswert sein, Trägermaterial zu verwenden, das Bereiche auf seiner äußeren und/oder Porenoberfläche aufweist, die eine funktionelle Gruppe in verschiedener Dichte enthalten. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Trägermaterial dessen Poren und/oder äußere Oberfläche Bereiche aufweist, die mit Alkylre- sten der Länge Cl bis C50, vorzugsweise C4 bis C22, besonders bevorzugt C4, C8 und C18 derivatisiert und/oder funktionalisiert sind.
Es ist ebenfalls vorteilhaft, Trägermaterial zu verwenden, dessen Oberfläche Bereiche aufweist, die mit Diolen derivatisiert und/oder funktionalisiert sind.
Ebenso ist es bevorzugt Trägermaterial zu verwenden, das auf seiner äußeren Oberfläche durch Giycin modifiziert ist und dessen Porenoberfläche durch Polypeptide insbesondere Tripeptide modifiziert ist
Ebenso eignet sich Trägermaterial, das auf seiner äusseren Oberfläche mit Polyethylengylcol und/oder Polyoxyethylen modifiziert ist und dessen Porenoberfläche mit hydrophoben Gruppen insbesondere Phenyl- gruppen und/oder C18 und/oder C8 und/oder Nitril modifiziert ist.
Ebenfalls bevorzugt ist die Verwendung von Trägermaterial, welches im wesentlichen kugelförmig ausgestaltet ist, wobei besonders gute Trennergebnisse bei Verwendung von Trägermaterialien mit einem Aussen- durchmesser D von 0.05 < D < 20 μm, bevorzugt 0.1 ≤ D ≤ 5 μm erzielt werden. So können z.B. Trägermaterialien der Grosse 0.5 ≤ D < 3 μm eingesetzt werden.
Der Aussendurchmesser der Partikel lässt sich insbesondere mit einem Laser Diffraktions System beispielsweise dem Malvern Mastersizer der Firma Malvern Instruments GmbH, Herrenberg, bestimmen. Es wird das Prinzip der Laser Streuung nach der Mie Theorie und der Fraunhofer Analyse angewendet. Das Streulicht wird gemessen. Aus diesen Streu- «.«-,«-.- O 00/50887
- 14 - lichtdaten lässt sich die Partikelgrößenverteilung ableiten. Ein weiteren System zur Bestimmung der Partikelgrößenverteilung nutzt der Se- digraph 5100 Particle Sizer der Firma Micrometrics. In diesem Verfahren werden die zu bestimmenden Partikel in einer Sedimentationslösung mit Röntgenstahlung bestrahlt und die Strahlung nach Durchgang durch die Probe detektiert. Aus der detektierten Strahlung wird dann die Partikelgrößenverteilung ermittelt.
Ist das Trägermaterial porös ausgestaltet, so ist es vorteilhaft, dass es einen Porendurchmesser d von 0.5 ≤ d < 100 nm, bevorzugt von 1 < d ≤ 50 nm, besonders bevorzugt von 2 < d < 6 nm aufweist.
Die Messung des Porendurchmessers erfolgt bevorzugt unter Ausnutzung des Prinzips der Gasadsorption, beispielsweise Geräte der Firma Beckann Coulter (OMNISORB oder SA3100) nutzen dieses Prinzip. Dazu wird der trockenen Probe im Vakuum eventuell adsorbiertes Gas entzogen und die Probe auf 77K gekühlt. Bei dieser Temperatur adsorbieren inerte Gase, wie z. B. Stickstoff, Argon oder Krypton auf der Oberfläche der Partikel der Probe. Es wird eine Adsorptionsisotherme aufgenommen, d.h. die adsorbierte Volumen an Gas gegen den angelegten Druck aufgetragen. Aus dieser Isothermen lässt sich unter Anwendung der BET (Brunauer, Emmet, Teller)-Gleichung dann die Porengröße der Partikel ermitteln. Geräte zur Durchführung dieser Messungen werden insbesondere von Beckman Coulter angeboten
Vergleichbare Ergebnisse für den Porendurchmesser liefert ein Verfahren nach Walfort ("Chemisch und enzymatisch modifizierte Umkehrphasen-Trägermaterialien für die HPLC-Integrierte Probenaufbereitung", Dissertation GH Paderborn, 1992), das die ausschlusschromatographi- schen Eigenschaften der Trägermaterialien ausnutzt. Proteineich- Standards der Gel-Permeationschromatographie, wie beispielsweise Lactatdehydrogenase, Ovotransferrin, Ovalbumin, Caboanhydrase oder Cytochrom C mit unterschiedlichen Molekulargewichten werden in einem geeigneten Puffer gelöst und auf mit dem Trägermaterial gefüllte Säulen injiziert und mit einem geeigneten Puffer oder Gradienten eluiert. Die Zusammensetzung des Eluats wird mittels UV-Detektion bestimmt. Aus dem Molekulargewicht der retenierten Moleküle ergibt sich der Porendurchmesser.
Zur Ausgestaltung eines Trägermaterials mit Affinitätsliganden auf der Porenoberfäche und einer hydrophilen Aussenoberfläche können die oben beschriebenen Verfahren insbesondere das von Pinkerton (EP 0 173 233), Boss (0 537 461) und Takahata (US 4,694,092) ebenfalls angewendet werden. Als ein Beispiel ist hier die Reaktion von Oxiran- gruppen mit m-Aminophenylborsäure, gefolgt von einer Plasmabehandlung, einer Hydrophilisierung der Außenoberfläche mit 3-Glycidoxy- trimethylsilane und abschließender Hydrolyse der Epoxygruppen zu nennen. Ein weiteres Beispiel ist Herstellung von fettsäurehaltigen Affi- nitätssorbenzien nach DE 43 33 674, gefolgt von einer Hydrolyse der Esterbindungen auf der Außenoberfläche.
Zur Ausgestaltung eines Trägermaterials mit einer hydrophoben Porenoberfäche und einer hydrophilen Außenoberfläche ist das Verfahren von 3. Haginaka et al. (Anal. Chem. 61, 2445-2448, 1989), Pinkerton (US 4,544,485, EP 0 173 233), Boos (0 537 461), Kimata et al. (J. Chro- matogr. 515, 73-84, 1990) oder Takahata (US 4,694,092) geeignet. Als ein Beispiel ist hier die Derivatisierung der Porenoberfläche mit Glycine- L-Phenylalanine-L-Phenylalanine nach dem Verfahren von Pinkerton oder die Belegung der Poreninnenoberfläche mit C-18 Gruppen nach dem Verfahren von Takahata zu nennen. O 00/50887
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Zur Herstellung von Trägermaterialien mit einer hydrophilen Porenin- nenoberfläche und einer hydrophoben Außenoberfläche kann das Verfahren von Pinkerton gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren modifiziert werden. Die mit 1,1-Carboxydiimidazole aktivierten Partikeloberflächen könnten zum Beispiel mit Phenylalanin-L-Glycin-L- Glycin umgesetzt werden. Nach der Zugabe eines Enzyms wie Carboxy- peptidase A wird die Peptideinheit auf der Außenoberfläche entfernt, so daß eine hydrophobe Oberfläche durch die Derivatisierung mit Phenylalanin entsteht.
Zur Herstellung von Trägermaterial mit einer chiralen Innenoberfläche und einer hydrophilen Außenoberfläche kann eine Modifikation des Verfahrens von Takahata verwendet werden. Ein Oxirangruppen belegtes Trägermaterial wird mit 6-Monodeoxy-6-monoamino-b-cyclodextrin umgesetzt und in einem zweiten Schritt zur Entfernung der chiralen Liganden auf der Außenoberfläche mit Plasma behandelt.
Besonders vorteilhaft ist die erfindungsgemäße Verwendung des Trägermaterials in einem CEC-Verfahren zur Probenaufbereitung, wobei die Probe, bestehend aus Analyt und anderen Probenkomponenten (Probenmatrix),
• auf ein CEC-Säulensystem aufgebracht wird,
• durch Anlegen einer elektrischen Spannung ein elektroosmotischer Fluss erzeugt wird, durch den die Probenmoleküle bewegt werden und/oder die Probenmoleküle aufgrund ihres Ladung-zu-Masse- Verhältnisses migrieren,
• die Probenmatrix durch Aufbringen eines Waschpuffers eluiert wird,
• der Analyt durch Aufbringen eines Transferpuffers eluiert wird. Unter einer CEC-Säule im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Trägermaterialaufnahmevorrichtung zu verstehen, die insbesondere als Kapillarsäule oder Teil eines Kanalsystems auf einem Chip ausgebildet sein kann.
Ebenfalls bevorzugt ist die erfindungsgemäße Verwendung in einem CEC-Verfahren zur kombinierten Probenaufbereitung und Trennung, wobei die Probe, bestehend aus Analyt und anderen Probenkomponenten,
• auf ein CEC-Säulensystem aufgebracht wird,
• durch Anlegen einer elektrischen Spannung ein elektroosmotischer Fluss erzeugt wird, durch den die Probenmoleküle bewegt werden und/oder die Probenmoleküle aufgrund ihres Ladung-zu-Masse- Verhältnisses migrieren,
• die Probenmatrix durch Aufbringen eines Waschpuffers eluiert wird,
• der Analyt durch Aufbringen eines Elutionspuffers aufgetrennt und eluiert wird.
Stationäre Phasen in CEC-Säulen aus Trägermaterialien mit einer hydrophilen Außenoberfläche, bevorzugt durch Derivatisierung mit Alkoholen und einer mit Ionenaustauschergruppen modifizierten Porenoberfläche eignen sich besonders für die Aufreinigung von kleinen geladenen organischen Molekülen aus komplexen wässrigen Lösungen in der CEC. Beispiele sind die Aufreinigung von geladenen Drugs wie Antisense Molekülen aus biologischen Körperflüssigkeiten, zum Beispiel Serum, Plasma oder Urin. Weitere Anwendungen sind die Aufreinigung von Pflanzenschutzmitteln aus Extrakten von Bodenproben oder Pflanzenteilen oder die Überwachung von Synthesen wie zum Beispiel die Markierung von Proteinen mit Fluoreszenzfarbstoffen. Eine alternative Anwendung ist die Verwendung der Ionenaustauscher Materialien für die gezielte Erhöhung der Geschwindigkeit der Trennung in der CEC, insbesondere bei niedrigem pH.
Zur Aufreinigung von anionischen Antisense Oligonukleotiden aus Serum mit Verfahren der CEC ist es vorteilhaft in der CEC Trägermaterialien als stationäre Phase zu verwenden, die sich durch eine hydrophile äußere Oberfläche, bevorzugt durch Derivatisierung mit Alkoholen, auszeichnen und eine Porenoberfläche aufweisen, die durch Anionentauscher, bevorzugt -NR3 + "OH, mit R = -Ethyl, -Propyl, derivatisiert ist.
Ein Trägermaterial mit Affinitätsliganden wie Boratgruppen auf der Po- renoberfäche und einer hydrophilen Außenoberfläche ist besonders für die Auftrennung von kohlenhydrathaltigen Verbindungen geeignet, wie zum Beispiel die Kontrolle der enzymatischen Reaktion von Phosphory- lasen mit Polyzuckern wie (Glukose)n.
Weitere Anwendungen der Trägermaterialien sind die Auftrennung von Drugs wie zum Beispiel Hydrocortison aus Serum oder Plasma. Besonders bevorzugt sind hier Trägermaterialien zu verwenden, die auf der Porenoberfläche durch Hydrocortison spezifische Fab-Fragmente funktionalisiert sind und deren äußere Oberfläche z.B. durch Diolgruppen hydrophil gestaltet ist. Die hydrophile Außenoberfläche verhindert die Absorption der Probenkomponenten in wässrigen Lösungen. Die Methode ist insbesondere für komplexe Proben mit einer sehr grossen Anzahl von Inhaltsstoffen wie zum Beispiel Serum und Plasma geeignet.
Für die Aufreinigung von kleinen hydrophilen Molekülen mit dem erfindungsgemäßen CEC-Verfahren aus zum Beispiel organischen Extrakten von Cremes oder die Isolierung von wasserlöslichen Vitaminen aus Mar- O 00/50887
- 19 - garine wird Trägermaterial als stationäre Phase verwendet, das mit Alkoholgruppen auf der Poreninnenoberfläche und Phenylgruppen auf der Porenaußenoberfläche belegt ist.
Die Abtrennung des Reaktionsproduktes aus Synthesemischungen, die hydrophile Polymere, insbesondere Polyethylenglycol und hydrophile Reaktanden, wie beispielsweise Oligonukleotide enthalten, kann vorzugsweise durch Verwendung von Trägermaterialien als stationäre Phase geschehen, welche folgende Eigenschaften aufweisen: Die Porenoberfläche ist mit Diolen oder Zuckern derivatisiert. Ihre äußere Oberfläche weist durch Derivatisierung mit C8 Alkylresten hydrophobe Eigenschaften auf.
Für die Auftrennung von Enantiomerengemischen wie Temazepam oder Warfarin in biologischen Flüssigkeiten ist ein Trägermaterial geeignet, dass eine hydrophile Außenoberfläche und eine chirale Poreninnenoberfläche besitzt. Beispielsweise kann der Träger auf der Außenoberfläche mit Alkoholen und auf der Poreninnenoberfläche mit Cyclodextrinen belegt sein. Der chirale Ligand 1,2-Diphenylethyldiamine ist insbesondere für die Trennung von Aryl Carbinolen geeignet.
Für die Aufreinigung von kleinen kationischen Molekülen aus Hengst Buffered Saline Solution (HBSS) Puffer wie zum Beispiel Atenolol wird ein Trägermaterial als stationäre Phase verwendet, das mit Carbonsäuregruppen auf der Poreninnenoberfläche und Diolgruppen auf der Porenaußenoberfläche belegt ist. Die Säule wird hier bevorzugt mit einem wässrigen Puffer bei einem pH größer 6 equilibriert, anschließend die Probe auf die Säule aufgebracht und die HBSS Bestandteile durch Anlegen eines elektrischen Feldes entfernt. Zur effizienten Auftrennung und Detektion von Atenolol zu einem Puffer mit einem pH kleiner 3 gewechselt und durch Anlegen eines elektrischen Feldes die Trennung durchgeführt. Besonders gute Trennergebnisse werden erhalten, wenn die Zusammensetzung der mobilen Phase individuell auf das Trägermaterial abgestimmt wird. Insbesondere kann es gewünscht sein durch einen pH- Wert viele geladene Ionenaustauschermoleküle zu generieren oder die Ladung durch einen pH-Wert, der insbesondere die Protonierung der Ionenaustauschermoleküle begünstigt, zu minimieren. Dabei kann ein wässriger Puffer verwendet werden, es kann aber auch bevorzugt sein, die CEC-Säule mit einem organischen Puffer, zum Beispiel 95% Aceto- nitril in Wasser beipielsweise in Gegenwart von Ammoniumacetat, pH 4,7 zu equilibrieren. Darüber hinaus kann es bevorzugt sein zum Aufbringen der Probe auf die CEC-Säule einen anderen Puffer zu verwenden als zur Trennung und Detektion des Analyten.
Für die Aufreinigung von Vitamin C aus Flüssigcreme ist beispielsweise ein Trägermaterial geeignet, dass mit C-8 auf der Außenoberfläche und Diol auf der Porenoberfläche belegt ist. Die Säule wird mit einem Puffer equilibriert, der beispielsweise mehr als 90% Acetonitrile enthält. Die Probe wird aufgebracht und die hydrophoben Bestandteile durch Anlegen eines elektrischen Feldes entfernt. Zur effizienten Abtrennung und Detektion wird zu einem Puffer gewechselt, der mehr als 60% wässrige Phase enthält, und durch Anlegen eines elektrischen Feldes die Trennung durchgeführt. Über die Einstellung der Hydrophibizität der mobilen Phase kann die Trennung optimiert werden.
Die Abtrennung von Hydrocortison aus Serum ist insbesondere mit Trägermaterial geeignet, dass Hydrocortison spezifische Fab-Fragmente auf der Poreninnenoberfläche und Alkokole auf der Porenaußenoberfläche belegt ist. Beispielsweise ist das Fab- Fragment so ausgesucht, dass die Bindung und Elution des Antigens bei zwei verschiedenen pH's durchgeführt werden kann. Die Bindung erfolgt beispielsweise bei einem pH O 00/50887
- 21 - unter 6 in wässrigen Puffer, so dass die Serumbestandteile durch Anlegen eines elektrischen Feldes entfernt werden. Die Elution und Detektion wird nach dem Vorlegen eines Puffer größer pH 7.5 und Anlegen eines elektrischen Feldes durchgeführt.
Die mobile Phase setzt sich vorzugsweise aus Puffersalzen in Gegenwart von anionischen und/oder kationischen und/oder zwitterionischen Io- nenpaarreagenzien zusammen, wobei ihre Zusammensetzung der Natur und den Eigenschaften des Analyten zum Erhalt einer guten Trennleistung direkt angepasst werden kann, wie dies z.B. die Ausführungsbeispiele belegen. Es ist aber auch möglich, bei unbekannten Zusammensetzungen des Analyten sogenannte universelle Puffer einzusetzen, die für die Trennung und Elution von Anlyten unbekannter Zusammensetzung optimiert wurden.
Zur Erzielung besonders guter Trennergebnisse ist es auch wünschenswert, dass Waschpuffer und Elutionspuffer organische Lösungsmittel enthalten, wobei Waschpuffer mindestens 1% und Elutionspuffer mindestens 20% organisches Lösungsmittel enthalten sollten.
Insgesamt sollten in einer besonders bevorzugten Form des Verfahrens die stationäre und mobile Phase so gewählt werden, dass der elek- troosmotische Fluss während Bindung und Elution des Analyten jeweils konstant bleibt oder sich reproduzierbar ändert, wobei ein elektroosmo- tischer Fluss im Bereich von 0.5 bis 10 mm/s bevorzugt ist. Zur Erzeugung des elektroosmotischen Flusses wird vorzugsweise eine Gleichstrom-Hochspannung eingesetzt.
Das Aufbringen der Probe auf die Säule und das quantitative Entfernen der Matrix wird bevorzugt hydrodynamisch und/oder elektroosmotisch und/oder elektrophoretisch durchgeführt, was zu einer Aufkonzentrie- rung des Analyten um einen Faktor 10 bis 1000 führt.
Es kann aber auch bevorzugt sein, die Probe im Flash-back Verfahren auf die Säule aufzubringen und zu waschen. Dies vermindert eine mögliche Kontamination der Säule mit Matrixbestandteilen und führt ebenfalls zu einer Aufkonzentrierung der Probe am Kopf der Säule.
Es ist ebenfalls vorteilhaft, die Elution und Trennung der Analyten hydrodynamisch und/oder elektroosmotisch und/oder elektrophoretisch durchzuführen.
Besonders bevorzugt ist die elektroosmotische Elution und Trennung der Analyten, um auch bei Verwendung sehr kurzer Säulen, vorzugsweise < 10 cm, eine ausreichende Bodenzahl zu erhalten.
In einer weiteren Ausführungsform wird während der Elution durch Iso- tachophorese eine weitere Aufkonzentrierung des Analyten um einen Faktor von 10 bis 1000 erreicht. Der Analyt kann so beispielsweise ohne große Volumenänderung von einer separaten Probenaufbereitungssäule auf eine Trennsäule überführt werden.
Zur Erhöhung der Selektivität des Verfahrens und/oder zur Erhöhung des elektroosmotischen Flusses werden bevorzugt auch Mischungen verschiedener Trägermaterialien als stationäre Phase eingesetzt. Der besondere Vorteil dieser Mischungen ist es, dass sie eine optimale Anpassung an die Eigenschaften der mobile Phase und der Probe erlauben und somit eine empfindliche und selektive Trennung gewährleisten.
Soll im Anschluss an Trennung und Elution eine Detektion der Analyte erfolgen, so ist es insbesondere bei massenspektrometrischer Detektion wünschenswert, dass die Puffersalze und/oder anionischen und/oder kationischen und/oder zwitterionischen Ionenpaarreagenzien bei Raumtemperatur flüchtig sind.
Zur genauen Charakterisierung der Zusammensetzung des Analyten sowohl qualitativ als auch quantitativ ist es in einer bevorzugten Ausführungsform möglich, im Anschluss an Trennung und/oder Elution verschiedene spektrometrische und spektroskopische Analysenverfahren durchzuführen. Besonders vorteilhaft sind hier die Verfahren der Mas- senspektrometrie und/oder optischen Detektion z.B. durch Lichtstreuung, insbesondere Condensation Nucleation Light Scattering Detection (Szostek et al., 1997, Analytical Chemistry, 69, 2955-2962) und/oder Fluoreszenzdetektion und/oder elektrochemischen Detektion und/oder Leitfähigkeitsdetektion und/oder Refractive Index Detektion, insbesondere Laser-based Refractive Index Detektion gekoppelt mit Absorpti- onsdetektion (Anal. Chem. 59, 1632-1636, 1987) und/oder Laser-based Refractive Index Detektion using Backscatter (US 5,325,170) und/oder Chemiluminescence Nitrogen specific Detection (LC-GC 12, 5, 287-293, 1999) und/oder Thermooptische Detektion, insbesondere Thermoopti- sche Absorptionsdetektion (Anal. Chem. 61, 37-40, 1989) und/oder Laser Induced Capillary Vibration (Anal. Chem. 63, 2216-2218, 1991). So wird z.B. im Ausführungsbeispiel 1 die UV-Detektion eingesetzt.
Es kann aber ebenfalls bevorzugt sein, die Analytfraktionen im Anschluss an die Trennung einem Fraktionssammler zuzuführen, somit einzeln zu sammeln und diese einer weiteren Verwendung zuzuführen.
In einer weiteren Ausführungsform kann auch der Transfer auf ein weiteres Säulensystem zur weiteren Trennung wünschenswert sein. Besonders vorteilhaft ist die Möglichkeit der parallelisierten Durchführung des Verfahrens in einer Vielzahl von CEC-Säulensystemen, die miteinander verbunden sind.
Erfindungsgemäß enthält eine CEC-Vorrichtung bevorzugt folgende Komponenten:
Trägermaterialaufnahmeeinheit mit mindestens einem Einlass und mindestens einem Auslass, gepackt mit Trägermaterial, welches porös ausgestaltet ist und dessen Oberfläche sich aus einer äusseren und einer Porenoberfläche zusammensetzt, wobei die äussere Oberfläche von der Porenoberfläche unterscheidbare Bereiche unterschiedlicher Derivatisierung und/oder Funktionalität aufweist,
mindestens zwei Gefässen zur Aufnahme mobiler Phase, und
mindestens einer Spannungsquelle.
Besonders bevorzugt ist eine CEC-Vorrichtung, in der zusätzlich eine Druckerzeugungseinrichtung zur Beaufschlagung der Trägermaterialaufnahmeeinheit mit Druck vorgesehen ist.
Ebenfalls ist es bevorzugt, dass ein System zum automatisierten Wechseln der Gefässe zur Aufnahme der mobilen Phase vorgesehen ist.
Darüber hinaus ist es vorteilhaft, die Trägermaterialaufnahmeeinheit an mindestens einen Detektor zu koppeln, wobei der Detektor insbesondere als Massenspektrometer und/oder optischer Detektor insbesondere UV-Detektor, Lichtstreudetektor, besonders bevorzugt Condensation Nucleation Light Scattering Detektor und/oder Fluoreszenzdetektor und/oder elektrochemischer Detektor und/oder Leitfähigkeitsdetektor und/oder Refractive Index Detektor, insbesondere Laser-based Refractive Index Detektor gekoppelt mit Absorptionsdetektion und/oder Laser- based Refractive Index Detektor using Backscatter und/oder Chemilu- minescence Nitrogen specific Detector und/oder Thermooptischer Detektor, insbesondere Thermooptischer Absorptionsdetektor und/oder Laser Induced Capillary Vibrationsdetektor ausgebildet ist.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Trägermaterialaufnahmeeinheit als Kapillarsäule ausgebildet.
Ebenso ist es bevorzugt, dass die Trägermaterialaufnahmeeinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Teil eines Kanalsystems auf einem Chip ausgebildet ist.
Weiterhin ist es vorteilhaft, dass die Kapillarsäule und der Chip aus Kunststoff und/oder Glas und/oder Fused Silica und/oder Keramik und/oder Elastomer und/oder Polymeren bestehen.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind mindestens zwei Trägermaterialaufnahmeeinheiten vorgesehen sind, die miteinander über ein Kapillarsystem und/oder ein Kanalsystem verbunden sind, wobei bevorzugt das Kanalsystem und/oder Kapillarsystem mindestens einen Auslass aufweist.
Darüber hinaus ist es in einer bevorzugten Ausführungsform vorteilhaft, dass der Auslass der Trägermaterialaufnahmeeinheit einen vom Einlass abweichenden Innen- und/oder Aussendurchmesser aufweist.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn der Auslass als Elektrospray- Einrichtung ausgebildet ist. In einer weiteren Ausführungsform ist eine Vielzahl, insbesondere 2 bis 50, besonders bevorzugt 2 bis 16 Trägermaterialaufnahmeeinheiten parallel und/oder zweidimensional angeordnet.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die mindestens eine Trägermaterialaufnahmeeinheit der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine Mischung verschiedener Sorten Trägermaterialien enthält, wobei jede Sorte Trägermaterial porös ausgestaltet ist und seine Oberfläche sich aus einer äusseren und einer Porenoberfläche zusammensetzt, wobei die äussere Oberfläche von der Porenoberfläche unterscheidbare Bereiche unterschiedlicher Derivatisierung und/oder Funktionalität aufweist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung ist die Probenaufnahmevorrichtung zur Aufnahme von Proben mit einem Volumen V von 0.5 nl ≤ V ≤ 100 μl ausgestaltet. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von CEC-Säulen mit einer Länge von 0.1 bis 100 cm und einem Durchmesser < 500 μm.
Unter einer CEC-Säule im Sinne der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist eine Trägermaterialaufnahmeeinheit zu verstehen, die insbesondere als Kapillarsäule oder Teil eines Kanalsystems auf einem Chip ausgebildet sein kann.
Ausführungsformen der Vorrichtung werden im folgenden unter Bezug auf die beigefügten Abbildungen erläutert.
Abbildung 1 zeigt ein CEC-Säulensystem, das aus einer einzelnen Säule zur Probenaufbereitung und/oder Trennung besteht.
Abbildung 2 zeigt die Kopplung eines CEC-Säulensystems an einen De- tektor, hier ein Massenspektrometer.
Abbildung 3 zeigt die Kopplung eines CEC-Säulensystems an eine weitere Säule.
Abbildung 4 zeigt die Kopplung eines CEC-Säulensystems an einen Fraktionssammler.
Abbildung 5 zeigt ein CEC-Chipsystem.
Abbildung 6 zeigt eine mögliche Ausführungsform eines CEC- Chipsystems, das mit einem Kapillarsystem gekoppelt ist.
Abbildung 7 zeigt beispielhaft eine mögliche Ausführungsform eines μ- Total Analysis Systems.
Abbildung 8 zeigt beispielhaft ein Partikel eines porösen Trägermaterials.
Abbildung 9 zeigt das Elektropherogramm eines Analytgemisches, getrennt auf einer CEC-Säule gepackt mit ISPR GFFII-S5-80.
Abbildung 10 zeigt das Elektropherogramm eines Analytgemisches, getrennt auf einer CEC-Säule gepackt mit SPS 5PM-S5-100-Phenyl.
Abbildung 11 zeigt das Elektropherogramm eines Analytgemisches, getrennt auf einer CEC-Säule gepackt mit SPS 5PM-S5-100-CN.
Abbildung 12 zeigt das Elektropherogramm von Benzocain aus reinem Rattenserum, getrennt auf einer CEC-Säule gepackt mit SPS 5PM-S5- 100-CN. Abbildung 13 zeigt das Elektropherogramm von Benzocain aus reinem Hundeplasma, getrennt auf einer CEC-Säule gepackt mit SPS 5PM-S5- 100-CN.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Vorrichtung ist in Abbildung 1 dargestellt. Eine CEC-Säule (30), die mit erfindungsgemäßem Trägermaterial (60) gepackt ist, taucht mit beiden Enden in Behälter (90) mit mobiler Phase (120) ein. Die Spannungsquelle (10) dient zum Anlegen einer Spannung zwischen beiden Enden der Säulen. Die Spannung ermöglicht die Ausbildung eines elektroosmotischen Flusses in der Säule. Zusätzlich kann noch eine Vorrichtung zur Beaufschlagung der Behälter mit Druck angebracht werden. Das Anlegen von Druck gleichmäßig an beiden Säulenenden wirkt einer Ausgasung der Pufferlösungen und somit der Bildung von Luftblasen in der Säule entgegen. Ein Säulenende ist zur Aufnahme der Probe ausgebildet. Eine Wechselvorrichtung ermöglicht das Wechseln der Behälter (90) und somit den Austausch bzw. die Anpassung der Pufferlösungen (120) an den Verfahrensschritt. Durch Anbringen beispielsweise, wie in Abbildung 1 skizziert, eines Detektors (150) direkt auf der Säule kann der Analyt direkt detektiert und analysiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Vorrichtung ist es bevorzugt, dass das Säulensystem aus mindestens einer CEC-Säule zur Probenaufbereitung und mindestens einer CEC-Säule zur Trennung des Analyten besteht, die miteinander über ein Kapillarsystem verbunden sind, wobei dieses Kapillarsystem in einer besonders bevorzugten Ausführungsform mindestens einen Auslass aufweist, über den die Probenmatrix entfernt werden kann. Darüber hinaus ist es ebenfalls möglich, eine CEC-Säule (30) nur zur Probenaufbereitung zu verwenden. Eine mögliche Ausführungsform ist in Abbildung 3 dargestellt. Dieses Beispiel zeigt die Kombination einer CEC-Säule (30) mit einer weiteren Säule (170), welche auf einem Chip angeordnet sind. Es ist auch möglich, den Analyten nach Abtrennung der Probenmatrix auf andere Analyse- bzw. Trennsysteme zu überführen.
Die Vorrichtung kann ebenfalls eine Kopplung des Säulensystems an mindestens einen Detektor, insbesondere Massenspektrometer und/oder Lichtstreudetektor oder sonstigen optischen Detektor und/oder elektrochemischen Detektor und/oder Fluoreszenzdetektor und/oder Leitfähigkeitsdetektor und/oder Refractive Index Detektor, insbesondere Laser-based Refractive Index Detektor gekoppelt mit Ab- sorptionsdetektion und/oder Laser-based Refractive Index Detektor using Backscatter und/oder Chemiluminescence Nitrogen specific De- tector und/oder Thermooptischer Detektor, insbesondere Thermooptischer Absorptionsdetektor und/oder Laser Induced Capillary Vibrationsdetektor (150), vorsehen. Diese bevorzugte Ausführungsform ist in Abbildung 2 anhand der Kopplung mit einem Massenspektrometer, welches eine Elektrospay-Vorrichtung (230) aufweist, skizziert. Zur Kopplung mit einem Detektor kann es bevorzugt sein, dass der Auslass des Säulensytems einen vom Einlass abweichenden Innen- und/oder Aussendurchmesser aufweist.
Darüber hinaus ist es in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung vorgesehen, dass das Säulensystem (30) an einen Fraktionssammler und/oder ein weiteres Säulensystem gekoppelt sein kann. Dies kann beispielsweise durch direkte Kopplung geschehen. In einer bevorzugten Ausführungsform (Abbildung 4) wird zur Fraktions- Sammlung eine Spannung zwischen dem Einlaß der Säule und beispielsweise einer Gold-beschichteten Maldi-Platte (200) (Meeting Ab- stract, Advances in Mass Spectrometry, Jan 7-8, 1999, Orlando, Florida, USA) angelegt. Das Eluat wird zerstäubt und der Analyt wird gezielt in einzelnen Vertiefungen der Platte gesammelt.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist das CEC- Säulensystem auf einem Chip (300) angeordnet (Abbildung 5). Hier dargestellt ist ein Säulensystem bestehend aus einer Trägermaterialaufnahmeeinheit (30) mit erfindungsgemäßem Trägermaterial (60), einem Probenreservoir (290) und drei Pufferreservoiren (260). Das System ist so konzipiert, dass jedes Reservoir eine Elektrode aufnehmen kann. So kann wahlweise eine Spannung zwischen verschiedenen Reservoirs angelegt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die An- steuerung und Schaltung der Elektroden automatisch, wobei die genauen Schaltpläne durch Computerprogramme verwaltet werden können.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist das Chipsystem (300) mit Glaskapillaren bzw. CEC-Säulen (30) aus Fused-Silica kombiniert. Ein Beispiel für diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in Abbildung 6 skizziert.
Zur Herstellung der Kapillaren und Chipsysteme ist es bevorzugt, Materialien wie Kunststoff, Glas, Fused Silica, Keramik, Elastomere oder Polymere zu verwenden.
Die Herstellung geeigneter Chips kann beispielsweise durch die Anwendung der Photolithographie in Verbindung mit Ätztechniken erfolgen. Dies wurde z.B. von J. P. Landers (Handbook of Capillary Electrophore- sis, 1997, CRC Press, S. 828) für die Herstellung von Chips für die Anwendung in der Kapillarelektrophorese beschrieben. Materialien wie Glas oder Fused Silica werden mit einer photoempfindlichen Substanz beschichtet. Durch Belichtung wird mit Hilfe einer Maske das gewünschte Kanalsystem auf das Substrat übertragen und z.B. in einem Bad aus verdünnter HF/NH4F in das Substrat geätzt. Für Substrate aus Fused Silica ist es notwendig, als Ätzmaske einen dünnen Gold/Chrom-Film auf das Substrat aufzutragen.
Je nach Material, das zur Herstellung der Kapillaren bzw. Trägermaterialaufnahmeeinheiten für die CEC-Säulen und Chipsysteme eingesetzt wird, kann es zur Verhinderung von unspezifischen Reaktionen der Probe mit beispielsweise freien Silanol-Gruppen der Kapillarinnenseite wünschenswert sein, diese zu beschichten. Dies geschieht vorteilhaft mit PVA oder Polyacrylamid.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform der Vorrichtung stellt das Säulensystem eine Komponente eines Total Analysis Systems dar.
Ein mögliches Total Analysis System ist in Abbildung 7 dargestellt. Ein solches System stellt eine Gesamtheit eines Analysesystems dar und kann gleichermaßen Probenaufbereitung und Analyse und ggf. vorgelagerte und/oder nachfolgende Schritte umfassen. Das in Abbildung 7 dargestellte μTAS umfasst die Markierung eines Proteins mit einem Farbstoff, die Abtrennung des Farbstoffes und des nichtmarkierten Proteins über eine mit erfindungsgemäßem Trägermaterial (60) gepackte CEC-Säule (30) und der Detektion des markierten Proteins. Das hier skizzierte System kann z.B. auf einem Chip integriert sein, wobei die runden Vertiefungen jeweils Elektroden zur Anlegung von Spannung aufnehmen können.
Eine weitere Ausführungsform sieht eine Parallelisierung einer Vielzahl von CEC-Säulensystemen vor, in denen die Probenaufbereitung und - trennung parallel durchgeführt wird. Bei diesen Säulensystemen handelt es sich um Chipsysteme oder Kapillarsysteme oder Kombinationen aus beiden. Diese Kopplung mehrerer Systeme ist besonders im Hochdurchsatzscreening vorteilhaft, da sie die parallele Aufbereitung und Trennung einer Vielzahl von Proben erlaubt, die dann weiter untersucht werden können.
Abbildung 8 zeigt beispielhaft ein Partikel eines porösen Trägermaterials. Die Oberfläche dieses Trägermaterials lässt sich in eine äussere Oberfläche (510) und eine Porenoberfläche (540) unterteilen.
Abbildung 9 zeigt das Elektropherogramm eines Analytgemisches in einer Modellmatrix. Die Durchführung erfolgte mit einer CEC-Säule, gefüllt mit ISRP GFFII-S5-80 (Porengröße 8 nm). Die Länge der gepackten Kapillare: 8,3 cm. Innendurchmesser 100 μm. Detektionswel- lenlänge: 210 nm. Weitere Bedingungen siehe Ausführungsbeispiel 1.
Abbildung 10 zeigt das Elektropherogramm eines Analytgemisches in einer Modellmatrix. Die Durchführung erfolgte mit einer CEC-Säule, gefüllt mit SPS 5PM-S5-100-Phenyl (Porengröße 10 nm). Länge der gepackten Kapillare: 8.3 cm. Innendurchmesser 100 μm. Detektions- wellenlänge: 210 nm. Weitere Bedingungen siehe Ausführungsbeispiel 2.
Abbildung 11 zeigt das Elektropherogramm eines Analytgemisches in einer Modellmatrix. Die Durchführung erfolgte mit einer CEC-Säule, gefüllt mit SPS 5PM-S5-100-CN Porengröße 10 nm). Länge der gepackten Kapillare: 8,3 cm. Innendurchmesser: 100 μm. Detektionswel- lenlänge: 210 nm. Weitere Bedingungen siehe Ausführungsbeispiel 3. Abbildung 12 zeigt das Elektropherogramm von Benzocain aus reinem Rattenserum. Die Durchführung erfolgte mit einer CEC-Säule, SPS 5PM- S5-100-CN der Firma Regis® (Porengröße 10 nm). Länge der gepackten Kapillare: 8,3 cm. Innendurchmesser: 100 μm. Detektionswellenlänge: 210 nm. Weitere Bedingungen siehe Ausführungsbeispiel 4.
Abbildung 13 zeigt das Elektropherogramm von Benzocain aus reinem Hundeplasma. Die Durchführung erfolgte mit einer CEC-Säule, SPS 5PM-S5-100-CN der Firma Regis® (Porengröße 10 nm). Länge der gepackten Kapillare: 8,3 cm. Innendurchmesser: 100 μm. Detektionswellenlänge: 210 nm. Weitere Bedingungen siehe Ausführungsbeispiel 5.
Ausführungsbeispiel 1
Trennung eines Analytgemisches in Modellmatrix auf einer mit ISRP GFFII-S5-80 gepackten CEC-Säule
Verwendete Materialien :
Die CEC-Säule mit einer Länge von 8.3 cm und einem Innendurchmesser von 100 μm wurde mit Pinkerton ISRP GFFII-S5-80 der Firma Regis® Technologies, Inc., Austin, USA, gepackt. Die verwendeten Partikel hatten einen Durchmesser von 5 μm und eine Porengröße von 8 nm.
Der Waschpuffer bestand aus 5% Acetonitril, 95% Wasser, 5mM Am- moniumacetat (pH 8,5). Der Elutionspuffer bestand aus 40% Acetonitril, 60% Wasser, 5 mM Ammonium-acetat (pH 8,5).
Die Lösung enthielt FBS (Fetal Bovine Serum) in einer Konzentration von 10 mg/ml, Thioharnstoff, Acetaminophen, Benzocain, Propranolol und Chinin je 1 mg/ml. Diese Probenlösung wird in dem nachfolgenden Text als "Analytgemisch in Modellmatrix" bezeichnet.
Vorrichtung
Zur Durchführung der Trennung des Analytgemisches in einer Modellmatrix wurde die in Abbildung 1 dargestellte Vorrichtung eingesetzt. Die mit ISPR GFFII-S5-80 gepackte Säule tauchte mit je einem Ende in Behälter zur Aufnahme von Pufferlösung ein. Mit Hilfe einer Spannungsquelle (10) wurde eine Spannung zwischen beiden Enden der Säule angelegt.
Säulenvorbereitunα
Die Säulenvorbereitung wurde bei 15°C in 2 Stufen durchgeführt: Die Säule wurde zunächst mit Trennpuffer äquilibriert. Während dieses Vorgangs fand im Abstand von 5 min jeweils eine stufenweise Erhöhung der Spannung in 5 kV Schritten von -5 kV auf -20 kV statt. Dabei war der Inletpufferbehälter (Pufferbehälter, in den der Einlass der Säule eintaucht) mit einem Druck von 5 bar beaufschlagt. Dann wurden beide Puffergefäße mit 10 bar Druck beaufschlagt und eine Spannung von -15 kV angelegt. Die Stabilität der Säule wurde währenddessen durch Messung des Stroms und der UV-Adsorption (210 nm) kontrolliert.
Die 2. Äquilibrierungsphase erfolgte in Waschpuffer und dauerte 12 min. Dabei wurde eine Spannung von -15 kV und an beiden Pufferbehältern ein Druck von 10 bar angelegt. Der Strom und die Spannung wurden ebenfalls kontrolliert.
Nach Abschluss der 2. Phase waren der Strom und die UV-Adsorption stabil.
Trennungen
Während des gesamten Betriebes wurden die Puffer, die Proben und die Trennkapillare auf 15°C temperiert.
Die Probe (Analytgemisch in Modellmatrix) wurde elektrokinetisch durch Anlegen einer Spannung von -5kV über 3 sec auf die Säule geladen. Im Anschluss daran wurde zur Verhinderung einer möglichen Diffusion der Probe in das Puffergefäß eine geringe Menge Waschpuffer, ein sogenannter Pufferplug, unter denselben Bedingungen auf die Säule geladen.
Anschliessend wurde die Probe durch das Aufbringen des Waschpuffers bei einer Spannung von -15 kV und unter Anlegen eines Druckes auf beide Enden der Säule von 10 bar gewaschen dabei wurden die Proteine und Salze aus der Modellmatrix von der CEC-Säule entfernt. Nach 3 min erfolgte ein Wechsel vom Waschpuffer auf den Elutionspuffer. Die Bedingungen -15 kV und 10 bar wurden beibehalten. Der Thioharnstoff eluierte bei 1.48 min, Acetaminophen bei 2.27 min, Benzocain bei 4,88 min, Propranolol bei 4,99 min und Chinin bei 5,67 min. Das Elektropherogramm dieser Trennung ist in Abbildung 9 dargestellt.
Ausführungsbeispiei 2
Trennung eines Analytgemisches in Modellmatrix auf einer mit SPS 5PM- S5-100-Phenyl gepackten CEC-Säule
Verwendete Materialien:
Die CEC-Säule mit einer Länge von 8.3 cm und einem Innendurchmesser von 100 μm wurde mit SPS 5PM-S5-100-Phenyl der Firma Regis® Technologies, Inc., Austin, USA, gepackt. Die verwendeten Partikel hatten einen Durchmesser von 5μm und eine Porengröße von 10 nm.
Der Waschpuffer bestand aus 5% Acetonitril, 95% Wasser, 5 mM Am- moniumacetat (pH 4,7). Der Elutionspuffer bestand aus 15% Acetonitril, 85% Wasser, 5 mM Ammoniumacetat (pH 4,7).
Die Lösung enthielt FBS (Fetal Bovine Serum) in einer Konzentration von 10 mg/ml, Thioharnstoff, Acetaminophen, Benzocain, Propranolol und Chinin je 1 mg/ml. Diese Probenlösung wird im nachfolgenden Text als "Analytgemisch in Modellmatrix" bezeichnet.
Vorrichtuno
Zur Durchführung der Trennung des Analytgemisches in einer Modellmatrix wurde die in Abbildung 1 dargestellte Vorrichtung eingesetzt. Die mit SPS 5PM-S5-100-Phenyl gepackte Säule tauchte mit je einem Ende in Behälter zur Aufnahme von Pufferlösung ein. Mit Hilfe einer Spannungsquelle (10) wurde eine Spannung zwischen beiden Enden der Säule angelegt.
Säulenvorbereitung
Die Säulenvorbereitung wurde gemäß Ausführungsbeispiel 1 durchgeführt.
Trennungen
Während des gesamten Betriebes wurden die Puffer, die Proben und die Trennkapillare auf 15°C temperiert.
Die Probe (Analytgemisch in Modellmatrix) wurde elektrokinetisch durch Anlegen einer Spannung von -5kV über 3 sec auf die Säule geladen. Im Anschluss daran wurde zur Verhinderung einer möglichen Diffusion der Probe in das Puffergefäß eine geringe Menge Waschpuffer, ein sogenannter Pufferplug, unter denselben Bedingungen auf die Säule geladen.
Anschließend wurde die Probe durch das Aufbringen des Waschpuffers bei einer Spannung von -15 kV und unter Anlegen eines Druckes auf beide Enden der Säule von 10 bar gewaschen. Dabei wurden die Proteine und Salze aus der Modellmatrix entfernt. Nach 6 min wurde der Waschpuffer durch einen Elutionspuffer ersetzt. Die Bedingungen -15 kV und 10 bar wurden beibehalten. Der Thioharnstoff eluierte bei 1.94 min, Acetaminophen bei 4,23 min, Propranolol und Chinin bei 11,34 min und Benzocain bei 18,25 min. Das Elektropherogramm dieser Trennung ist in Abbildung 10 dargestellt. Ausführungsbeispiel 3
Trennung eines Analytgemisches in Modellmatrix auf mit SPS 5PM-S5- 100-CN gepackter CEC-Säule
Verwendete Materialien
Die CEC-Säule mit einer Länge von 8.3 cm und einem Innendurchmesser von 100 μm wurde mit SPS 5PM-S5-100-CN der Firma Regis® Technologies, Inc., Austin, USA, gepackt. Die verwendeten Partikel hatten einen Durchmesser von 5 μm und eine Porengröße von 10 nm.
Der Waschpuffer bestand aus 5% Acetonitril, 95% Wasser, 5 mM Am- moniumacetat pH 4,7. Der Elutionspuffer bestand aus 15% Acetonitril, 85% Wasser, 5 mM ,pH 4,7.
Die Lösung enthielt FBS (Fetal Bovine Serum) in einer Konzentration von 10 mg/ml, Thioharnstoff, Acetaminophen, Benzocain, Propranolol und Chinin je 1 mg/ml. Diese Probenlösung wird in nachfolgenden Text als Analytgemisch in Modellmatrix bezeichnet.
Vorrichtung
Zur Durchführung der Trennung des Analytgemisches in einer Modellmatrix wurde die in Abbildung 1 dargestellte Vorrichtung eingesetzt. Die mit SPS 5PM-S5-100-CN gepackte Säule tauchte mit je einem Ende in Behälter zur Aufnahme von Pufferlösung ein. Mit Hilfe einer Spannungs- queile (10) wurde eine Spannung zwischen beiden Enden der Säule angelegt.
Säulenvorbereitung
Die Säulenvorbereitung wurde gemäß Ausführungsbeispiel 1 durchge- O 00/50887
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führt.
Trennungen
Während des gesamten Betriebes wurden die Puffer, die Proben und die Trennkapillare auf 15°C temperiert.
Die Probe (Analytgemisch in Modellmatrix) wurde elektrokinetisch durch Anlegen einer Spannung von -5kV über 3 sec auf die Säule geladen. Im Anschluss daran wurde zur Verhinderung einer möglichen Diffusion der Probe in das Puffergefäß eine geringe Menge Waschpuffer, ein sogenannter Pufferplug, unter denselben Bedingungen auf die Säule geladen.
Anschließend wurde die Probe durch das Aufbringen des Waschpuffers bei einer Spannung von -15 kV und unter Anlegen eines Druckes auf beide Enden der Säule von 10 bar gewaschen. Dabei wurden die Proteine und Salze aus der Modellmatrix entfernt. Nach 5 min wurde der Waschpuffer durch einen Elutionspuffer ersetzt. Die Bedingungen -15 kV und 10 bar wurden beibehalten. Der Thioharnstoff eluierte bei 1.87 min, Acetaminophen bei 3,43 min, Benzocain, Propranolol und Hydrocortison bei 10,39 min und Chinin bei 11,87 min. Das Elektropherogramm dieser Trennung ist in Abbildung 11 dargestellt.
Ausführungsbeispiel 4
Trennung von Benzocain in Rattenserum
Verwendete Materialien
Die CEC-Säule mit einer Länge von 8.3 cm und einem Innendurchmesser von 100 μm wurde mit SPS 5PM-S5-100-CN der Firma Regis® Technologies, Inc., Austin, USA, gepackt. Die verwendeten Partikel hatten O 00/50887
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einen Durchmesser von 5 μm und eine Porengröße von 10 nm.
Der Waschpuffer bestand aus 5% Acetonitril, 95% Wasser, 5 mM Am- moniumacetat pH 4,7. Der Elutionspuffer bestand aus 15% Acetonitril, 85% Wasser, 5 mM ,pH 4,7.
Die Probe bestand aus Rattenserum dotiert mit Benzocain in einer Konzentration von 0,5 mg/ml Serum.
Vorrichtung
Die Vorrichtung entsprach der aus Ausführungsbeispiel 3.
Säulenvorbereitung
Die Säulenvorbereitung wurde gemäß Ausführungsbeispiel 3 durchgeführt.
Trennungen
Während des gesamten Betriebes wurden die Puffer, die Proben und die Trennkapillare auf 15°C temperiert.
Die Probe wurde elektrokinetisch durch Anlegen einer Spannung von - 5kV über 3 sec auf die Säule geladen. Im Anschluß daran wurde zur Verhinderung einer möglichen Diffusion der Probe in das Puffergefäß eine geringe Menge Waschpuffer, ein sogenannter Pufferplug, unter denselben Bedingungen auf die Säule geladen.
Anschließend wurde die Probe durch das Aufbringen des Waschpuffers bei einer Spannung von -15 kV und unter Anlegen eines Druckes auf beide Enden der Säule von 10 bar gewaschen. Dabei wurden die Proteine und Salze aus der Modellmatrix entfernt. Nach 5 min wurde der Waschpuffer durch einen Elutionspuffer ersetzt. Die Bedingungen -15 kV und 10 bar wurden beibehalten. Das Benzocain eluierte bei 12,75 min. Das Elektropherogramm dieser Trennung ist in Abbildung 12 dargestellt.
Ausführungsbeispiel 5
Trennung von Benzocain in Hundeplasma
Verwendete Materialien
Die CEC-Säule mit einer Länge von 8.3 cm und einem Innendurchmesser von 100 μm wurde mit SPS 5PM-S5-100-CN der Firma Regis® Technologies, Inc., Austin, USA, gepackt. Die verwendeten Partikel hatten einen Durchmesser von 5μm und eine Porengröße von 10 nm.
Der Waschpuffer bestand aus 5% Acetonitril, 95% Wasser, 5 mM Am- moniumacetat pH 4,7. Der Elutionspuffer bestand aus 15% Acetonitril, 85 % Wasser, 5 mM, pH 4,7.
Die Probe bestand aus Hundeplasma dotiert mit Benzocain in einer Konzentration von 0,5 mg/ml Plasma
Vorrichtung
Die Vorrichtung entsprach der aus Ausführungsbeispiel 3.
Säulenvorbereituno
Die Säulenvorbereitung wurde gemäß Ausführungsbeispiel 3 durchgeführt.
Trennungen
Während des gesamten Betriebes wurden die Puffer, die Proben und die Trenn kapillare auf 15°C temperiert.
Die Probe wurde elektrokinetisch durch Anlegen einer Spannung von - 5kV über 3 sec auf die Säule geladen. Im Anschluß daran wurde zur Verhinderung einer möglichen Diffusion der Probe in das Puffergefäß eine geringe Menge Waschpuffer, ein sogenannter Pufferplug, unter denselben Bedingungen auf die Säule geladen.
Anschließend wurde die Probe durch das Aufbringen des Waschpuffers bei einer Spannung von -15 kV und unter Anlegen eines Druckes auf beide Enden der Säule von 10 bar gewaschen. Dabei wurden die Proteine und Salze aus der Modellmatrix entfernt. Nach 5 min wurde der Waschpuffer durch einen Elutionspuffer ersetzt. Die Bedingungen -15 kV und 10 bar wurden beibehalten. Das Benzocain eluierte bei 11,38 min. Das Elektropherogramm dieser Trennung ist in Abbildung 13 dargestellt.

Claims

Ansprüche
1. Verwendung von Trägermaterial für die Kapillar- Elektrochromatographie (CEC), dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial porös ausgestaltet ist und die Oberfläche sich aus einer äußeren und einer Porenoberfläche zusammensetzt, wobei die äußere Oberfläche von der Porenoberfläche unterscheidbare Bereiche unterschiedlicher Derivatisierung und/oder Funktionalität aufweist.
2. Verwendung von Trägermaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bereiche unterschiedlicher Derivatisierung und/oder Funktionalität homogen und/oder heterogen auf der äußeren und/oder Porenoberfl che verteilt sind.
3. Verwendung von Trägermaterial nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren- und/oder äußere Oberfläche mit hydrophoben und/oder hydrophilen Gruppen und/oder Ionenaustauschergruppen und/oder Affinitätsliganden und/oder chiralen Gruppen derivatisiert und/oder funktionalisiert ist.
4. Verwendung von Trägermaterial nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren- und/oder äussere Oberfläche Bereiche aufweist, die mit Alkylresten der Länge Cl bis C50, vorzugsweise C4 bis C22, besonders bevorzugt C4, C8 und C18 derivatisiert und/oder funktionalisiert sind.
5. Verwendung von Trägermaterial nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Poren- und/oder äussere Oberfläche Bereiche aufweist, die mit Diolen derivatisiert und/oder funktionalisiert sind.
6. Verwendung von Trägermaterial nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial im wesentlichen kugelförmig ausgestaltet ist und einen Aussen- durchmesser D von 0.05 < D < 20 μm, bevorzugt 1 < D < 5 μm, besonders bevorzugt 0.5 < D < 3 μm.
7. Verwendung von Trägermaterial nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Porendurchmesser d von 0.5 < d < 100 nm, bevorzugt von 1 < d < 50 nm, besonders bevorzugt von 2 < d < 6 nm.
8. Verwendung von Trägermaterial nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einem hydroxylgruppenhaltigen organischen organischen Polymer oder Copolymer besteht.
9. Verwendung von Trägermaterial nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es aus silikathalti- gem Material besteht, auf seiner äußeren Oberfläche mit Polyethy- lengylcol oder Polyoxyethylen modifiziert ist und die Porenoberfläche mit hydrophoben Gruppen insbesondere Phenylgruppen, C18, C8 und/oder Nitril modifiziert ist.
10. Verwendung von Trägermaterial nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es aus hydroxylhal- tigem Material besteht, auf seiner äußeren Oberfläche durch Glycin modifiziert ist und auf der Porenoberfläche durch Polypeptide insbesondere Tripeptide modifiziert ist.
11. Verwendung von Trägermaterial nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es aus mit Glyce- rinpropyl modifiziertem Kieselgel besteht.
12. Verwendung von Trägermaterial nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es aus mit Glyce- rinpropyl modifiziertem Glas besteht.
13. CEC-Vorrichtung mit folgenden Komponenten
• Trägermaterialaufnahmeeinheit mit mindestens einem Einlaß und mindestens einem Auslass, gepackt mit Trägermaterial, welches porös ausgestaltet ist und dessen Oberfläche sich aus einer äußeren und einer Porenoberfläche zusammensetzt, wobei die äußere Oberfläche von der Porenoberfläche unterscheidbare Bereiche unterschiedlicher Derivatisierung und/oder Funktionalität aufweist,
• mindestens zwei Gefäßen zur Aufnahme mobiler Phase, und
• mindestens einer Spannungsquelle.
14. CEC-Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine Druckerzeugungseinrichtung zur Beaufschlagung der Trägermaterialaufnahmeeinheit mit Druck vorgesehen ist.
15. CEC-Vorrichtung nach Anspruch 13 und/oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein System zum automatisierten Wechseln der Gefäße zur Aufnahme der mobilen Phase vorgesehen ist.
16. CEC-Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, das die Trägermaterialaufnahmeeinheit an mindestens einen Detektor gekoppelt ist.
17. CEC-Vorrichtung nach Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor als Massenspektrometer und/oder optischer Detektor insbesondere Lichtstreudetektor, UV-Detektor und/oder elektrochemischer Detektor und/oder Fluoreszenzdetektor und/oder Leitfähigkeitsdetektor und/oder Refractive Index Detektor, insbesondere Laser-based Refractive Index Detektor gekoppelt mit Absorptionsdetektion und/oder Laser-based Refractive Index Detektor using Backscatter und/oder Chemiluminescence Nitrogen specific Detector und/oder Thermooptischer Detektor, insbesondere Thermooptischer Absorptionsdetektor und/oder Laser Induced Capillary Vibrationsdetektor ausgebildet ist.
18. CEC-Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor ein Condensation Nucleation Light Scattering Detektor ist.
19. CEC-Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermaterialaufnahmeeinheit eine Kapillarsäule ist.
20. CEC-Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermaterialaufnahmeeinheit als Teil eines Kanalsystems auf einem Chip ausgebildet ist.
21. CEC-Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillarsäule und der Chip aus Kunststoff und/oder Glas und/oder Fused Silica und/oder Keramik und/oder Elastomer und/oder Polymeren bestehen.
22. CC-Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Trägermaterialaufnahmeeinheiten vorgesehen sind, die miteinander über ein Kapillarsystem und/oder ein Kanalsystem verbunden sind.
23. CEC-Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Kanalsystem und/oder Kapillarsystem mindestens einen Auslass aufweist.
24. CEC-Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Auslass der Trägermaterialaufnahmeeinheit einen vom Einlaß abweichenden Innen- und/oder Außendurchmesser aufweist.
25. CEC-Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Auslass als Elektrospray- Einrichtung ausgebildet ist.
26. CEC-Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl, insbesondere 2 bis 50, besonders bevorzugt 2 bis 16 Trägermaterialaufnahmeeinheiten parallel und/oder zweidimensional angeordnet sind.
27. CEC-Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Trägermaterialaufnahmeeinheit eine Mischung verschiedener Sorten Trägermaterialien enthält, wobei jede Sorte Trägermaterial porös ausgestaltet ist und seine Oberfläche sich aus einer äußeren und einer Poren- Oberfläche zusammensetzt, wobei die äußere Oberfläche von der Porenoberfläche unterscheidbare Bereiche unterschiedlicher Derivatisierung und/oder Funktionalität aufweist.
28. CEC-Säule mit mindestens einem Einlaß und mindestens einem Auslass, gepackt mit Trägermaterial, welches porös ausgestaltet ist und dessen Oberfläche sich aus einer äußeren und einer Porenoberfläche zusammensetzt, wobei die äußere Oberfläche von der Porenoberfläche unterscheidbare Bereiche unterschiedlicher Derivatisierung und/oder Funktionalität aufweist,
29. CEC-Verfahren zur Probenaufbereitung mit folgenden Schritten:
• Aufbringen einer Probe, bestehend aus Analyt und Probenmatrix, auf eine CEC-Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 28,
• Anlegen einer elektrischen Spannung zur Erzeugung eines elektroosmotischen Flusses,
• Aufbringen eines Waschpuffers,
• Elution der Probenmatrix,
• Aufbringen eines Transferpuffers,
• Elution des Analyten.
30. CEC-Verfahren zur kombinierten Probenaufbereitung und Trennung mit folgenden Schritten:
• Aufbringen einer Probe, bestehend aus Analyt und Probenmatrix, auf eine CEC-Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 28,
• Anlegen einer elektrischen Spannung zur Erzeugung eines elek- troosmotischen Flusses,
• Aufbringen eines Waschpuffers,
• Elution der Probenmatrix,
• Aufbringen eines Elutionspuffers,
• Auftrennung und Elution des Analyten.
31. CEC-Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Auftrennung des Analyten seine Bestandteile und/oder die Konzentration der Bestandteile durch einen Detektor bestimmt werden.
32. CEC-Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor ein Massenspektrometer und/oder optischer Detektor insbesondere Lichtstreudetektor, Condensation Nucleation Light Scattering Detektor und/oder elektrochemischer Detektor und/oder Leitfähigkeitsdetektor und/oder Refractive Index Detektor, insbesondere Laser-based Refractive Index Detektor gekoppelt mit Ab- sorptionsdetektion und/oder Laser-based Refractive Index Detektor using Backscatter und/oder Chemiluminescence Nitrogen specific Detector und/oder Thermooptischer Detektor, insbesondere Thermooptischer Absorptionsdetektor und/oder Laser Induced Capillary Vibrationsdetektor ist.
33. CEC-Verfahren nach mindestens einem der Anprüche 29 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufbringen der Probe auf die CEC-Vorrichtung hydrodynamisch und/oder elektroosmotisch und/oder elektrophoretisch durchgeführt wird.
34. CEC-Verfahren nach mindestens einem der Anprüche 29 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestandteile des Analyten nach der Auftrennung fraktioniert gesammelt werden.
35. CEC-Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt nach der Elution auf eine Trennungsvorrichtung insbesondere High Pressure Liquid Chromatographie Vorrichtung, Kapillarelektrophorese-Vorrichtung oder Flüssigkeitschromatographie- Vorrichtung überführt wird.
36. CEC-Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 29 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt nach der Trennung in seine Bestandteile beim Austritt aus der Trägermaterialaufnahmeeinheit durch eine Elektrosprayeinrichtung zerstäubt wird.
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