WO2000039564A1 - Method and device for optically detecting a particle immobilized on a surface - Google Patents

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WO2000039564A1
WO2000039564A1 PCT/DE1999/004105 DE9904105W WO0039564A1 WO 2000039564 A1 WO2000039564 A1 WO 2000039564A1 DE 9904105 W DE9904105 W DE 9904105W WO 0039564 A1 WO0039564 A1 WO 0039564A1
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particles
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PCT/DE1999/004105
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Jörg Enderlein
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Enderlein Joerg
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for optical detection of a particle immobilized on a surface
  • the optical detection of individual particles down to individual molecules is an established technique.
  • An overview of the detection of individual molecules in liquids and on surfaces and their applications in chemistry, biology and nanotechnology can be found, for example, in the review by Nie and Zare [SM Nie and RN Zare "Optical Detection of Single Molecules", Annual Review of Biophysical and Biomolecular Structure, Volume 1997, Volume 26, pages 567-596]
  • a standard method for the optical detection of particles is that the particle to be detected is focused by a Laser beam is optically excited and then an optical signal generated by the particle (fluorescence, Raman scattering or the like) is detected.
  • the particles can be freely in solution or immobilized on a surface
  • the detection area is restricted in space by means of strong focusing of the exciting laser beam and additional introduction of spatial diaphragms into the detection channel.
  • the particle to be detected is introduced into this detection area either by free diffusion, by hydrodynamic convection, or, if it is surface - immobilized particles, by shifting the detection area over the surface
  • the measured quantity of the optical signal generated by the particle depends not only on its intrinsic brightness, which is essentially determined by the absorption cross section and the quantum efficiency of the optical signal generation of the particle, but also on the way in which the particle is generated by the
  • the intensity profile of the exciting laser beam is passed through the detection area as well as the detection efficiency of the detecting optics are generally both functions of the location, so that the particle is excited differently at different locations and is detected differently well.
  • the disadvantage of this technique is the difficulty in achieving a spatially completely homogeneous illumination and optical detection, and especially in the very high cost of the camera, which must be sensitive to single photons in the case of a weak optical signal (such as for individual molecules).
  • the high intensity of the background signal is a serious problem with this method, in particular since the detection efficiency or numerical aperture is low due to the large distance between the surface and the optics.
  • the object of the invention is to provide a device and a method which allow a quantitative analysis of the optical brightness of particles immobilized on a surface with simple means.
  • Detection conditions for the optical detection of individual particles, which are immobilized on a surface are configured essentially identically for each particle, that is to say standardized.
  • the area is defined by the optical mapping of the screen onto the surface optimal detection efficiency within the approximately homogeneously exciting central region of the elongated focus.
  • the particles pass through the focus perpendicular to its longitudinal axis due to the displacement. You will therefore experience an essentially uniform suggestion profile.
  • the optical signal detected per particle is then proportional to the intrinsic brightness of the particles and independent of the position of the particle on the surface. The inherent brightness can thus be evaluated quantitatively for chemo and bioanalytical purposes.
  • a brightness distribution (histogram of the strength of the optical signal detected per particle) can be created for an ensemble of detected individual particles. Since all particles that are detected are exposed to essentially the same excitation and detection conditions, these statistics directly reflect the distribution of the intrinsic brightness of the detected particles. Is the ensemble of particles e.g. composed of a discrete number of different particle types with different inherent brightness, each particle type will correspond to a maximum in the brightness distribution. Thus, the presence (or absence) of a certain type of particle can be read directly from the brightness distribution. In addition, by knowing the number of particles detected in one of the maxima of the brightness distribution, the surface concentration of the particle type corresponding to the maximum can be determined.
  • the brightness distribution directly reflects the statistical distribution of this chemo or bioanalytically relevant property.
  • the procedure is e.g. directly applicable to the determination of the size distribution of particles which have been marked with optically excitable and detectable markers such that the number of markers per particle is proportional to the size of the marked particles.
  • the method and the device are applicable to any light-excitable optical signal from particles, such as fluorescence, Raman scattering or Rayleigh scattering.
  • the method and the device can be applied to any type of particle which generates an optical signal upon optical excitation, be it multi-atomic particles or individual molecules.
  • the method and the device can also be applied to particles in which the optical signal is not generated by optical excitation but, for example, by chemiluminescence. For quantitative analysis of the strength of the optical signal and
  • the shift should be continuous or with a step size that is smaller than the length of the transverse axis.
  • the detection must be designed to match the shift. That with a continuous shift of the surface or particle and optical arrangement, the detection must take place in sufficiently small time intervals. If the focus is shifted rather than the surface during the relative shift, the collecting optics, the diaphragm and the detector must also be moved over the fixed surface. For this purpose, they advantageously form a structural unit.
  • the diaphragm can be both a slit diaphragm, the gap of which is aligned parallel to the surface and the transverse axis of the elongated focus, and a rectangular diaphragm, the longitudinal axis of which is aligned parallel to the surface and the longitudinal or transverse axis of the elongated focus.
  • the decisive factor is the spatial limitation of the detection to the central region of the longitudinal axis of the elongated focus.
  • a further reduction in the variance in the brightness distribution can be achieved in the following way.
  • the aperture is vibrated in the direction of the longitudinal axis of the elongated focus.
  • the amplitude of the oscillation is corresponding to the spatial extent of the transition from essentially maximum collection efficiency to essentially disappearing collection efficiency in the plane of the elongated one Focus selected Particles that pass through the focus on the edge of the image of the aperture then alternately experience a vanishing and a maximum excitation.
  • the strength of their optical signals then has characteristic modulations.
  • the frequency of the oscillation becomes the Time intervals of the sampling selected appropriately During data evaluation, the optical signals detected in each case are examined for a modulation of their strength.
  • the surface is irradiated with a circularly polarized light beam.
  • the spatial distribution of field strength and polarization direction of the light beam in the central region of the elongated focus as well as the collecting optics and the diaphragm can be coordinated with one another in such a way that this over the duration of the shift caused passage of the particle through the elongated focus integrated detected optical signal for all particles of one type is approximately equally strong on average. This results in a further reduction in the variance in the brightness distribution of the detected signals of the particles.Another possibility is the background signal for the detection of the individual
  • the light beam is irradiated from the side of the surface facing away from the particle at an angle which causes a total internal reflection of the light beam on the surface carrying the particle, whereby the particle is excited evanescently. This causes jerk reflections of the excitation light avoided
  • FIG. 1 shows a perspective view of the detection device with incident light excitation
  • FIG. 2 shows the intensity profile of the excitation light
  • FIG. 3 shows the intensity profiles of the x, y and z polarization in the object focal plane of the objective
  • FIG. 4 shows a perspective view of the detection device with evanescent excitation in total reflection
  • the particles to be detected be immobilized on a planar sample surface 8 (eg cover glasses).
  • the optical excitation of these particles takes place by means of a laser beam 5 with an elongated (eg elliptical) intensity profile which is transmitted via the dichroic mirror 4 and the optics 6 (eg Microscope objective) is focused on the sample surface 8, the elongated excitation spot 7 is thus formed on the sample surface 8.
  • the laser beam can be polarized so that the polarization of the excitation light in the excitation spot 7 is circular, so that the excitation efficiency of the particles is independent of the orientation parallel to the surface
  • the optical signal generated by the particles in this excitation spot 7 is collected via the optics 6.
  • the dichroic mirror 4 is reflective for the excitation wavelength of the laser and transmissive for the wavelength of the optical signal generated by the particles
  • the light emitted by the particles passes through the slit diaphragm 2 into the photoelectric detector 1 (eg photoelectron multiplier), which converts the incident light into an electrical signal, which can be processed and evaluated by subsequent electronics.
  • the longitudinal axis of the excitation spot 7 stands perpendicular to the slit direction of the slit 2, and the longitudinal extent of the excitation spot 7 is larger than the image of the slit width of the slit 2, so that the detection efficiency in the detection area is almost independent of the position of the particles perpendicular to the slit direction (along the longitudinal axis of the excitation spot 7) is
  • the magnification of the optics 6 must be chosen so that the detector 1 detects every point of the detection area with equal sensitivity. The detection efficiency then essentially depends only on the position of the particles along the direction of the slit of the slit diaphragm 2 (transverse to the longitudinal axis of the excitation - spots 7)
  • the particles to be detected are transported in and out of the detection area by uniform relative displacement of the sample surface 8 in the direction 9.
  • the displacement can take place continuously or in discrete steps.
  • the extent of the transverse axis of the focus 7 in the diffraction-limited case is approximately 1 ⁇ m , a step size of the displacement of significantly less than 0.5 ⁇ m is recommended, ideally about 0.1 ⁇ m.
  • the step size larger can also be selected
  • the intensity of the optical signal generated by the particles is measured in time intervals.
  • the length of these time intervals is considerably shorter than the dwell time of the particles in the excitation spot 7.
  • each particle passage can then be one Overall brightness is assigned Since each particle experiences the same excitation and detection conditions as it passes through the detection area, this overall brightness will be proportional to the intrinsic brightness of the particles, which enables an evaluation of the overall brightness determined for chemo and bioanalytical purposes
  • the excitation light is not only circularly polarized in order to also eliminate any influence of the orientation of the absorption dipole moment perpendicular to the surface.
  • the following orientation-dependent factors influence the strength of the detected light
  • the absorption of light by a molecule takes place most efficiently, or the absorption cross section is greatest when the polarization of the exciting light and the absorption dipole moment are aligned parallel to each other. There is thus an influence on the strength of the detected optical signal through the polarization of the exciting light and through the orientation of the absorption dipole moment.
  • the absorption is partly followed by the emission.
  • the particle is emitted according to the field distribution of a dipole emitter.
  • the absorption and emission dipole moments are often parallel to each other. However, they can lose their parallel orientation due to the rotation diffusion of the particle between the time of absorption and the time of emission. With larger molecules, this effect only plays a minor role.
  • the radiation characteristics of the dipole emitter can still be influenced by the surface and the medium on or in which it is located.
  • the radiation characteristic of the dipole radiator is not equally well detected in every direction by the collecting optics.
  • the excitation and detection is carried out by an oil immersion objective with a numerical aperture of 1.4 NA. It was found that for such an objective and for dipole emitters at a water / glass transition (immobilized on the glass from the water), the detection efficiency is independent of the emission dipole orientation of the particle or emitter [Enderlein J., Ruckayne T., Seeger S .: "Highly Efficient Optical Detection of Surface-Generated Fluorescence"; Applied Optics, volume 1999, volume 38, issue 4, pages 724 - 732]. Thus, the only influencing factor remains the relative orientation of the polarization of the exciting light and the absorption dipole moment.
  • FIG. 2 The complete homogenization of the polarization of the stimulating light in all three spatial directions, integrated via the scan path, is achieved in that a linear profile parallel to the x-axis is impressed on the stimulating laser beam by beam shaping (with the aid of lenses or diffractive optical elements) (see Fig. 2).
  • the profile along the y axis is a Gauss profile.
  • the y-axis corresponds to the direction of the longitudinal axis of the elongated focus 7 according to FIG. 1
  • the x-axis corresponds to the scan direction 9 according to FIG. 1.
  • 20% are faded out in the middle of this light strip, so that the the lens incident light has the intensity profile seen in FIG. 2.
  • This intensity profile is focused in the rear focal plane of the lens.
  • the rear focal plane is the focal plane of the microscope objective on the side of the image in the microscope body facing away from the object.
  • the excitation light in the object focal plane emerges in the y / z plane in parallel and with an almost uniform intensity.
  • An almost uniform illumination (Köhler illumination) is created along the y axis, which drops very slowly with large y values.
  • the incident light is elliptically polarized, with an intensity ratio of x to y polarization of 2.
  • the excitation light is thus more x-polarized in the rear focal plane. Since the excitation light is not focused in the direction of the x-axis, but strikes the rear focal plane approximately parallel, it is focused on the object. This leads to a strong change in direction of the light waves in the x / z plane. This also gives rise to polarization components in the z direction which the approximately plane wave of the excitation light was initially unable to exhibit. In this way, the stronger x polarization is converted into a uniform x and z polarization.
  • the intensity profiles of the x, y and z polarization in the object focal plane of the objective have the shape shown in FIG. 3.
  • the intensity profiles of the x and y polarization are identical.
  • a particle that is scanned with such illumination along the x-axis - or direction 9 - always experiences the same optical excitation when integrated, regardless of the orientation of its absorption dipole moment.
  • An inte- grail parallel to the x-axis for a fixed y-value has the same value in both graphs.
  • the time course of the detected optical signal can change, but not the total sum of the detected photons.
  • the step size of the relative shift must not only be selected to be significantly smaller than the width of the focus 7, but also smaller than the width of the maxima and minima. Otherwise you run the risk of only hitting individual maxima or minima. As a result, the required integration along the scan path would not take place in the required manner.
  • a so-called SPAD is used as detector 1, ie a "single photon counting avalanche photodiode".
  • SPADS have a relatively small dynamic range. You can detect from 1 to about 10 7 photons per second. Since approximately 10 to 100 photons should be detected per particle observed, the effective dynamic range is limited to approximately 5 to 6 orders of magnitude. If you think of an application such as DNA fragment sizing, a larger dynamic range may be necessary. For this reason, a modified detection can be used: a quickly switchable and gradually adjustable absorber is placed in the detection beam path, for example an electro-optical or acousto-optical modulator.
  • this switchable absorber is regulated in such a way that the detected photon rate does not exceed the limit value. This can be achieved using a control loop that evaluates the SPAD signal and controls the absorber.
  • the control signal itself can be processed in the signal evaluation. In this way, the dynamic range of the detection can be expanded as desired.
  • the structure is similar to that according to exemplary embodiment 1, but the optical excitation now takes place with a laser beam 10 in total reflection, as shown in FIG. 4.
  • the longitudinal axis of the excitation spot 7, the column width of the slit diaphragm 2, their mutual arrangement and the magnification of the optics 6 must be selected such that the detection efficiency in the detection area is almost independent of the position on the particle is transverse to the direction of splitting (along the longitudinal axis of the excitation spot 7).
  • the transport of the particles immobilized on the surface and the manner in which the optical signal is recorded are also carried out as in Example 1.
  • the laser beam of the optical excitation can be designed in any way by prior beam shaping and / or phase modulation (with the aid of lenses or diffractive optical elements) in such a way that the same number of photons is detected on average for one and the same type of particle during scanning, regardless of the orientation of the emission and absorption dipole moment of the particles.
  • smoother excitation profiles can be generated in the object focal plane by means of phase and intensity modulation using methods other than those described. The only important thing is that all three possible orientations of the absorption dipole moment are integrally excited equally well.
  • Suitable modules for beam shaping are e.g. described in: F. Wyrowski and W. T. Rhodes: "Use of holographic concepts for the design of optical systems”; in: “50 Years of Holography”, Ed. Jean-Marc Fournier, Springer Berlin 1999. It is also possible, with the help of suitable shaping of the excitation light, if necessary
  • the optimization to be carried out is based on the same principles, that is to say the coordination of the spatial distribution of field strength and polarization direction of the light beam in the central region of the elongated focus, and of the collecting optics and the diaphragm, in such a way that this lasts for the duration of the passage of the particle through the displacement elongated focus integrated detected optical signal for all particles of one type is approximately equally strong on average and is independent of the orientation of the transition moments of the particles.

Abstract

The aim of the invention is to facilitate a quantitative analysis of the optical brightness of particles immobilized on a surface. According to the inventive method, the surface (8) is irradiated with a light beam (5) in such a manner that an elliptic focus (7) with a longitudinal axis and a shorter transversal axis is produced on the surface. The surface (8) with the immobilized particles is displaced in the direction (9) of the transversal axis of the elliptic focus, causing the particles to migrate across the focus. The optical signal of the particles produced in the focus (7) is imaged via a collection optics onto a slit diaphragm. Through said slit diaphragm only particles from a center section of the elliptic focus are detected. These particles are subjected to substantially the same excitation intensity. Therefore, their signals have a better definition in terms of quantity, thereby allowing a quantitative evaluation of the signal intensities.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur optischen Detektion eines auf einer Oberfläche immobilisierten Partikels Method and device for the optical detection of a particle immobilized on a surface
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur optischen Detektion eines auf einer Oberflache immobilisierten PartikelsThe invention relates to a method and a device for optical detection of a particle immobilized on a surface
Die optische Detektion einzelner Partikel bis hinunter zu einzelnen Molekülen ist eine etablierte Technik Eine Überblick über die Detektion einzelner Moleküle in Flüssigkeiten und auf Oberflachen und deren Anwendungen in Chemie, Biologie und Nanotechnologie findet man z B in der Über Sichtsarbeit von Nie und Zare [S M Nie und R N Zare "Optical detection of Single molecules", Annual Review of Biophysical and Bio- molecular Structure, Jahrgang 1997, Band 26, Seiten 567 - 596] Ein Standardverfahren zur optischen Detektion von Partikeln besteht darin, daß das zu detektierende Partikel durch einen fokussierten Laserstrahl optisch angeregt und dann ein durch das Partikel generiertes optisches Signal (Fluoreszenz, Ramanstreuung o a ) detektiert wird Die Partikel können sich dabei frei in Losung oder immobilisiert auf einer Oberflache befindenThe optical detection of individual particles down to individual molecules is an established technique. An overview of the detection of individual molecules in liquids and on surfaces and their applications in chemistry, biology and nanotechnology can be found, for example, in the review by Nie and Zare [SM Nie and RN Zare "Optical Detection of Single Molecules", Annual Review of Biophysical and Biomolecular Structure, Volume 1997, Volume 26, pages 567-596] A standard method for the optical detection of particles is that the particle to be detected is focused by a Laser beam is optically excited and then an optical signal generated by the particle (fluorescence, Raman scattering or the like) is detected. The particles can be freely in solution or immobilized on a surface
Um Hintergrundsignale zu minimieren, wird eine raumliche Einschränkung des Detektionsgebietes vermittels einer starken Fokussierung des anregenden Laserstrahls und zusatzlicher Einbringung von raumlichen Blenden in den Detektionskanal vorgenommen Das zu detektierende Partikel wird in dieses Detektionsgebiet eingebracht entweder durch freie Diffusion, durch hydrodynamische Konvektion, oder, bei oberflache- nimmobilisierten Partikeln, durch Verschiebung des Detektionsgebietes über die Oberfla- eheIn order to minimize background signals, the detection area is restricted in space by means of strong focusing of the exciting laser beam and additional introduction of spatial diaphragms into the detection channel. The particle to be detected is introduced into this detection area either by free diffusion, by hydrodynamic convection, or, if it is surface - immobilized particles, by shifting the detection area over the surface
Für chemo- und bioanalytische Zwecke ist es von großem Interesse, nicht nur einzelne Partikel an sich zu detektieren, sondern auch Aussagen über deren Eigenschaften machen zu können Ein Weg dahin besteht darin, die optische Helligkeit (der Fluoreszenz, Ramanstreuung o a ) des Partikels quantitativ zu messen Im allgemeinen hangt die gemessene Quantität des vom Partikel generierten optischen Signals nicht nur von seiner Eigenhelligkeit ab, welche im wesentlichen durch den Absorptionsquerschnitt und die Quantenausbeute der optischen Signalgenerierung des Partikels bestimmt ist, sondern auch von der Art und Weise, wie das Partikel durch das Detektionsgebiet hindurch geführt wird Das Intensitatsprofil des anregenden Laserstrahls wie auch die Detektionseffizienz der detektierenden Optik sind im allgemeinen beide Funktionen des Ortes, so daß das Partikel an verschiedenen Orten unterschiedlich stark angeregt und unterschiedlich gut detektiert wird. Befindet sich somit ein Partikel mit hoher Eigenhelligkeit am Rande des anregenden Laserstahls und/oder des durch die Detektionsoptik definierten Detektionsgebietes, so kann seine Helligkeit scheinbar wesentlich dunkler erscheinen als die eines Partikels mit geringer Eigenhelligkeit, welches jedoch im Zentrum des anregenden Laserstrahls und/oder des Detektionsgebietes positioniert ist. Wird eine Oberfläche, auf der Partikel immobilisiert sind, mit einem kleinen Fokus abgetastet, so werden von ein und demselben Partikel die unterschiedlichsten Signal- stärken erfaßt, i.d.R. jedoch kleine Signalstärken, da das Partikel nur selten zentral durch den Fokus tritt. Eine quantitative Analyse der Signale ist nicht möglich.For chemo and bioanalytical purposes, it is of great interest not only to be able to detect individual particles per se, but also to be able to make statements about their properties. One way to do this is to quantitatively increase the optical brightness (of the fluorescence, Raman scattering or the like) measure In general, the measured quantity of the optical signal generated by the particle depends not only on its intrinsic brightness, which is essentially determined by the absorption cross section and the quantum efficiency of the optical signal generation of the particle, but also on the way in which the particle is generated by the The intensity profile of the exciting laser beam is passed through the detection area as well as the detection efficiency of the detecting optics are generally both functions of the location, so that the particle is excited differently at different locations and is detected differently well. If there is a particle with high intrinsic brightness at the edge of the exciting laser steel and / or the detection area defined by the detection optics, its brightness may appear to be significantly darker than that of a particle with low intrinsic brightness, which, however, is in the center of the exciting laser beam and / or Detection area is positioned. If a surface on which particles are immobilized is scanned with a small focus, the most varied signal strengths are recorded by one and the same particle, but usually small signal strengths, since the particle rarely passes through the focus centrally. A quantitative analysis of the signals is not possible.
Für oberflächenimmobilisierte Partikel wurde in der Literatur die Möglichkeit beschrieben, die Oberfläche insgesamt möglichst homogen auszuleuchten und das durch die Partikel generierte optische Signal durch eine hochsensitive Kamera zu erfassen [M. Ishi- kawa, K. Hirano, T. Hayakawa, S. Hosoi und S. Brenner, "Single-Molecule Detection by Laser-Induced Fluorescence Technique with a Position- Sensitive Photon-Counting Appa- ratus", Japanese Journal of Applied Physics Part 1 33(3 A), 1571-6, 1994]. Der Nachteil dieser Technik besteht in der Schwierigkeit, eine räumlich völlig homogene Ausleuchtung und optische Detektion zu erreichen, und besonders in den sehr hohen Kosten der Kamera, welche bei schwachem optischen Signal (wie etwa bei einzelnen Molekülen) einzelphotonenempfindlich sein muß. Außerdem stellt die hohe Intensität des Hintergrundsignals ein ernsthaftes Problem bei diesem Verfahren dar, insbesondere, da die Detektionseffizienz bzw. numerische Apertur aufgrund des großen Abstands zwischen Oberfläche und Optik gering ist. Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, die ein quantitatives Analysieren der optischen Helligkeit von auf einer Oberfläche immobilisierten Partikeln mit einfachen Mitteln erlauben.For surface-immobilized particles, the possibility has been described in the literature of illuminating the surface as homogeneously as possible and capturing the optical signal generated by the particles using a highly sensitive camera [M. Ishikawa, K. Hirano, T. Hayakawa, S. Hosoi and S. Brenner, "Single-Molecule Detection by Laser-Induced Fluorescence Technique with a Position-Sensitive Photon-Counting Apparatus", Japanese Journal of Applied Physics Part 1 33 (3A), 1571-6, 1994]. The disadvantage of this technique is the difficulty in achieving a spatially completely homogeneous illumination and optical detection, and especially in the very high cost of the camera, which must be sensitive to single photons in the case of a weak optical signal (such as for individual molecules). In addition, the high intensity of the background signal is a serious problem with this method, in particular since the detection efficiency or numerical aperture is low due to the large distance between the surface and the optics. The object of the invention is to provide a device and a method which allow a quantitative analysis of the optical brightness of particles immobilized on a surface with simple means.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Verfahren mit den Merkmalen des Anspruch 1 bzw. durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruch 7 gelöst. Durch das Verfahren bzw. die Vorrichtung werden die optischen Anregungs- undThis object is achieved according to the invention by a method with the features of claim 1 or by a device with the features of claim 7. Through the method or the device, the optical excitation and
Detektionsbedingungen für die optische Detektion einzelner Partikel, welche auf einer Oberfläche immobilisiert sind, für jedes Partikel im wesentlichen identisch gestaltet, also normiert. Die optische Abbildung der Blende auf die Oberfläche definiert den Bereich optimaler Detektionseffizienz innerhalb des annähernd homogen anregenden mittleren Bereichs des elongierten Fokus. Die Partikel treten aufgrund der Verschiebung durch den Fokus senkrecht zu dessen Längsachse hindurch. Sie erfahren daher ein im wesentlichen einheitliches Anregungsprofil. Das pro Partikel detektierte optische Signal ist dann pro- portional zur Eigenhelligkeit der Partikel und unabhängig von der Position des Partikels auf der Oberfläche. Die Eigenhelligkeit kann somit für chemo- und bioanalytische Zwek- ke quantitativ ausgewertet werden.Detection conditions for the optical detection of individual particles, which are immobilized on a surface, are configured essentially identically for each particle, that is to say standardized. The area is defined by the optical mapping of the screen onto the surface optimal detection efficiency within the approximately homogeneously exciting central region of the elongated focus. The particles pass through the focus perpendicular to its longitudinal axis due to the displacement. You will therefore experience an essentially uniform suggestion profile. The optical signal detected per particle is then proportional to the intrinsic brightness of the particles and independent of the position of the particle on the surface. The inherent brightness can thus be evaluated quantitatively for chemo and bioanalytical purposes.
Mit Hilfe der Vorrichtung kann für ein Ensemble von detektierten einzelnen Partikeln eine Helligkeitsverteilung (Histogramm der Stärke des pro Partikel detektierten opti- sehen Signals) erstellt werden. Da alle Partikel, welche detektiert werden, den im wesentlichen gleichen Anregungs- und Detektionsbedingungen ausgesetzt sind, widerspiegelt diese Statistik direkt die Verteilung der Eigenhelligkeiten der detektierten Partikel. Setzt sich das Ensemble von Partikeln z.B. aus einer diskreten Anzahl verschiedener Partikelsorten unterschiedlicher Eigenhelligkeit zusammen, so wird jeder Partikelsorte ein Maximum in der Helligkeitsverteilung entsprechen. Somit läßt sich aus der Helligkeitsverteilung direkt das Vorhandensein (bzw. die Abwesenheit) einer bestimmten Partikelsorte ablesen. Außerdem kann über die Kenntnis der Zahl der detektierten Partikel in einem der Maxima der Helligkeitsverteilung die Oberflächenkonzentration der dem Maximum entsprechenden Partikelsorte bestimmt werden. Wenn die Eigenhelligkeit der Partikel proportional ist zu einer chemo- oder bioanalytisch relevanten Eigenschaft der Partikel, so spiegelt die Helligkeitsverteilung direkt die statistische Verteilung auch dieser chemo- oder bioanalytisch relevanten Eigenschaft wider. Das Verfahren ist z.B. direkt anwendbar auf die Bestimmung der Größenverteilung von Partikeln, welche mit optisch anregbaren und detektierbaren Markern derartig markiert wurden, daß die Zahl der Marker per Partikel proportional ist zur Größe der markierten Partikel.With the aid of the device, a brightness distribution (histogram of the strength of the optical signal detected per particle) can be created for an ensemble of detected individual particles. Since all particles that are detected are exposed to essentially the same excitation and detection conditions, these statistics directly reflect the distribution of the intrinsic brightness of the detected particles. Is the ensemble of particles e.g. composed of a discrete number of different particle types with different inherent brightness, each particle type will correspond to a maximum in the brightness distribution. Thus, the presence (or absence) of a certain type of particle can be read directly from the brightness distribution. In addition, by knowing the number of particles detected in one of the maxima of the brightness distribution, the surface concentration of the particle type corresponding to the maximum can be determined. If the intrinsic brightness of the particles is proportional to a chemo or bioanalytically relevant property of the particles, the brightness distribution directly reflects the statistical distribution of this chemo or bioanalytically relevant property. The procedure is e.g. directly applicable to the determination of the size distribution of particles which have been marked with optically excitable and detectable markers such that the number of markers per particle is proportional to the size of the marked particles.
Das Verfahren und die Vorrichtung sind auf jedes beliebige durch Licht anregbare optische Signal von Partikeln anwendbar, wie z.B. Fluoreszenz, Ramanstreuung oder Rayleighstreuung. Das Verfahren und die Vorrichtung sind auf jede Art von Partikeln anwendbar, welche bei optischer Anregung ein optische Signal generieren, seien es viel- atomige Teilchen oder einzelne Moleküle. Das Verfahren und die Vorrichtung sind auch auf Partikel anwendbar, bei denen das optische Signal nicht durch optische Anregung, sondern z.B. durch Chemolumineszenz entsteht. Zur quantitativen Analyse der Stärke des optischen Signals und zurThe method and the device are applicable to any light-excitable optical signal from particles, such as fluorescence, Raman scattering or Rayleigh scattering. The method and the device can be applied to any type of particle which generates an optical signal upon optical excitation, be it multi-atomic particles or individual molecules. The method and the device can also be applied to particles in which the optical signal is not generated by optical excitation but, for example, by chemiluminescence. For quantitative analysis of the strength of the optical signal and
Bestimmung der Eigenhelligkeit des Partikels ist es entscheidend, daß die Stärke des optischen Signals während des Durchtritts durch den Fokus in ihrem Verlauf erfaßt wird. Dies erlaubt eine Integration oder sonstige Verarbeitung. Zu vermeiden ist, daß das Parti- kel nur an einzelnen Stellen knapp vor oder nach dem Fokus beobachtet wird. Dazu sollte die Verschiebung kontinuierlich oder mit einer Schrittweite erfolgt, die kleiner als die Länge der Querachse ist. Die Detektion muß zur Verschiebung passend ausgelegt sein. D.h. bei einer kontinuierlichen Relatiwerschiebung von Oberfläche bzw. Partikel und optischer Anordnung muß die Detektion in hinreichend kleinen Zeitintervallen erfolgen. Wird bei der Relatiwerschiebung nicht die Oberfläche, sondern der Fokus verschoben, so müssen auch die Sammeloptik, die Blende und der Detektor über die fixe Oberfläche bewegt werden. Dazu bilden sie vorteilhafterweise eine bauliche Einheit.Determining the intrinsic brightness of the particle, it is crucial that the strength of the optical signal is detected during its passage through the focus. This allows integration or other processing. It should be avoided that the particle is only observed at individual points just before or after the focus. For this purpose, the shift should be continuous or with a step size that is smaller than the length of the transverse axis. The detection must be designed to match the shift. That with a continuous shift of the surface or particle and optical arrangement, the detection must take place in sufficiently small time intervals. If the focus is shifted rather than the surface during the relative shift, the collecting optics, the diaphragm and the detector must also be moved over the fixed surface. For this purpose, they advantageously form a structural unit.
Die Blende kann sowohl eine Spaltblende, deren Spalt parallel zur Oberfläche und zur Querachse des elongierten Fokus ausgerichtet ist, als auch eine Rechteckblende sein, deren Längsachse parallel zur Oberfläche und zur Längs- oder Querachse des elongierten Fokus ausgerichtet ist. Entscheidend ist die räumliche Eingrenzung der Detektion auf den zentralen Bereich der Längsachse des elongierten Fokus.The diaphragm can be both a slit diaphragm, the gap of which is aligned parallel to the surface and the transverse axis of the elongated focus, and a rectangular diaphragm, the longitudinal axis of which is aligned parallel to the surface and the longitudinal or transverse axis of the elongated focus. The decisive factor is the spatial limitation of the detection to the central region of the longitudinal axis of the elongated focus.
Auch bei dieser optischen Anordnung ist es noch möglich, daß ein Partikel am Rand des elongierten Fokus bzw. des Abbilds der Blende angeregt wird und ein schwa- ches Signal liefert, obwohl seine Eigenhelligkeit im Prinzip groß ist. Die Mehrzahl der Partikel wird jedoch durch den wesentlich größeren zentralen Bereich des elongierten Fokus und des Abbilds der Blende hindurchtreten. Dies führt jeweils zu im wesentlichen konstanten und starken optischen Signalen. Die Varianz der Stärke der optischen Signale einer Vielzahl von einzelnen Partikeln (Helligkeitsverteilung) wird somit gegenüber ei- nem einfachen konfokalen Aufbau verkleinert. Die Verteilung der optischen Signalstärke weißt ein Maximum in der Nähe des Erwartungswerts auf. Dieses kann zur quantitativen Charakterisierung der Partikel mit hinreichender statistischer Zuverlässigkeit verwendet werden.With this optical arrangement, too, it is still possible for a particle at the edge of the elongated focus or the image of the diaphragm to be excited and to deliver a weak signal, although its inherent brightness is in principle high. However, the majority of the particles will pass through the much larger central area of the elongated focus and the image of the aperture. This leads to essentially constant and strong optical signals. The variance in the strength of the optical signals of a large number of individual particles (brightness distribution) is thus reduced in comparison with a simple confocal structure. The distribution of the optical signal strength has a maximum close to the expected value. This can be used for the quantitative characterization of the particles with sufficient statistical reliability.
Eine weitere Verkleinerung der Varianz der Helligkeitsverteilung kann auf folgen- de Weise erreicht werden. Die Blende wird in Richtung der Längsachse des elongierten Fokus in Schwingung versetzt. Dabei wird die Amplitude der Schwingung entsprechend der räumlichen Ausdehnung des Übergangs von im wesentlichen maximaler Sammeleffizienz zu im wesentlichen verschwindender Sammeleffizienz in der Ebene des elongierten Fokus gewählt Partikel, die am Rand des Abbilds der Blende durch den Fokus treten, erfahren dann abwechselnd eine verschwindende und eine maximale Anregung Die Starke ihrer optischen Signale weißt dann charakteristische Modulationen auf Um diese de- tektieren zu können, wird die Frequenz der Schwingung zu den Zeitintervallen der Abta- stung passend gewählt Bei der Datenauswertung werden die jeweils detektierten optischen Signale auf eine Modulation ihrer Starke hin untersucht Wird eine Modulation mit der genannten Frequenz der Schwingung festgestellt, so liegt ein Signal eines Partikels vor, das am Rande des Abbilds der Blende durch den Fokus trat Diese Signale sind i d R schwacher als es die Eigenhelligkeit erwarten laßt Um eine Fehleinschätzung der Eigen- helligkeit dieser Partikel zu vermeiden, können sie bei einer weitergehenden Auswertung unberücksichtigt bleiben, oder ihre reduzierte Eigenhelligkeit wird rechnerisch berücksichtigt Auf diese Weise wird die Varianz der Helligkeitsverteilung weiter verkleinertA further reduction in the variance in the brightness distribution can be achieved in the following way. The aperture is vibrated in the direction of the longitudinal axis of the elongated focus. The amplitude of the oscillation is corresponding to the spatial extent of the transition from essentially maximum collection efficiency to essentially disappearing collection efficiency in the plane of the elongated one Focus selected Particles that pass through the focus on the edge of the image of the aperture then alternately experience a vanishing and a maximum excitation. The strength of their optical signals then has characteristic modulations. In order to be able to detect these, the frequency of the oscillation becomes the Time intervals of the sampling selected appropriately During data evaluation, the optical signals detected in each case are examined for a modulation of their strength. If a modulation with the named frequency of the oscillation is found, then a signal of a particle is present that passes through the edge of the image of the aperture the focus came These signals are usually weaker than the inherent brightness would suggest. In order to avoid a misjudgment of the intrinsic brightness of these particles, they can be disregarded in a further evaluation, or their reduced inherent brightness is taken into account in this way Bright ity distribution further reduced
In vorteilhafter Weiterbildung der Erfindung wird die Oberflache mit einem zirkulär polarisierten Lichtstrahl bestrahlt Dadurch wird ein eventueller Einfluß der oberfla- chenparallelen Orientierung des Absorptionsdipolmoments des Partikels auf die Anregungseffizienz ausgemitteltIn an advantageous further development of the invention, the surface is irradiated with a circularly polarized light beam. As a result, a possible influence of the surface-parallel orientation of the absorption dipole moment of the particle on the excitation efficiency is averaged out
Um auch einen eventuellen Einfluß der Orientierung des Absorptionsdipolmoments senkrecht zur Oberflache zu eliminieren, können die raumliche Verteilung von Feldstarke und Polarisationsrichtung des Lichtstrahls im Mittelbereich des elongierten Fokus sowie die Sammeloptik und die Blende derart aufeinander abgestimmt werden, daß das über die Dauer des durch die Verschiebung bewirkten Durchtritts des Partikels durch den elongierten Fokus integrierte delektierte optische Signal für alle Partikel einer Sorte im Mittel annähernd gleich stark ist Dadurch ergibt sich eine weitere Verkleinerung der Varianz der Helligkeitsverteilung der detektierten Signale der Partikel Eine weitere Möglichkeit, das Hintergrundsignal für die Detektion der einzelnenIn order to also eliminate any influence of the orientation of the absorption dipole moment perpendicular to the surface, the spatial distribution of field strength and polarization direction of the light beam in the central region of the elongated focus as well as the collecting optics and the diaphragm can be coordinated with one another in such a way that this over the duration of the shift caused passage of the particle through the elongated focus integrated detected optical signal for all particles of one type is approximately equally strong on average.This results in a further reduction in the variance in the brightness distribution of the detected signals of the particles.Another possibility is the background signal for the detection of the individual
Partikel zu verkleinern, wird dadurch erreicht, daß der Lichtstrahl von der dem Partikel abgewandten Seite der Oberfläche aus unter einem Winkel eingestrahlt wird, der eine totale interne Reflexion des Lichtstrahls an der das Partikel tragenden Oberflache bewirkt, wodurch das Partikel evaneszent angeregt wird Dadurch werden Ruckreflexionen des Anregungslichts vermiedenTo reduce the particle size is achieved in that the light beam is irradiated from the side of the surface facing away from the particle at an angle which causes a total internal reflection of the light beam on the surface carrying the particle, whereby the particle is excited evanescently. This causes jerk reflections of the excitation light avoided
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteranspruchen gekennzeichnetAdvantageous developments of the invention are characterized in the subclaims
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführangsbeispielen naher erlau- tert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Figuren bezeichnen dabei gleiche Elemente Im einzelnen zeigtThe invention is explained in more detail below with reference to exemplary embodiments. tert, which are shown schematically in the figures. The same reference numerals in the individual figures denote the same elements
Fig 1 eine perspektivische Ansicht der Detektionsvorrichtung mit Auflichtanre- gung, Fig 2 das Intensitatsprofil des Anregungslichts,1 shows a perspective view of the detection device with incident light excitation, FIG. 2 shows the intensity profile of the excitation light,
Fig 3 die Intensitatsprofile der x-, y- und z-Polarisation in der Objekt-Fokalebene des Objektivs, und Fig 4 eine perspektivische Ansicht der Detektionsvorrichtung mit evaneszenter Anregung in Totalreflexion3 shows the intensity profiles of the x, y and z polarization in the object focal plane of the objective, and FIG. 4 shows a perspective view of the detection device with evanescent excitation in total reflection
1 Ausführungsbeispiel1 embodiment
Auf einer planaren Probenoberflache 8 (z B Deckglaschen) seien die zu detektie- renden Partikel immobilisiert Die optische Anregung dieser Partikel erfolgt durch einen Laserstrahl 5 mit elongiertem (z B elliptischem) Intensitatsprofil, welcher über den dichroitischen Spiegel 4 und die Optik 6 (z B Mikroskopobjektiv) auf die Probenoberflache 8 fokussiert wird Auf der Probenoberflache 8 wird damit der elongierte Anregungsfleck 7 gebildet Der Laserstrahl kann dabei so polarisiert sein, daß die Polarisation des Anregungslichtes im Anregungsfleck 7 zirkulär ist, um somit die Anregungseffizienz der Partikel unabhängig von der oberflachenparallelen Orientierung der Partikelabsorptions- dipole zu gestalten Das von den Partikeln in diesem Anregungsfleck 7 erzeugte optische Signal wird über die Optik 6 gesammelt Der dichroitische Spiegel 4 ist reflektierend für die Anregungswellenlange des Lasers und durchlassig für die Wellenlange des von den Partikeln generierten optischen Signals Somit gelangt das von den Partikeln emittierte Licht über die Spaltblende 2 in den photoelektrischen Detektor 1 (z B Photoelektronen- vervielfacher), welcher das einfallende Licht in ein elektrisches Signal umwandelt, was durch eine nachfolgende Elektronik verarbeitet und ausgewertet werden kann Die Langsachse des Anregungsflecks 7 steht senkrecht zur Spaltrichtung der Spaltblende 2, und die Langsausdehnung des Anregungsflecks 7 ist großer als das Abbild der Spaltenbreite der Spaltblende 2, so daß die Detektionseffizienz im Detektionsgebiet nahezu un- abhangig von der Position der Partikel senkrecht zur Spaltrichtung (entlang der Langsachse des Anregungsflecks 7) istLet the particles to be detected be immobilized on a planar sample surface 8 (eg cover glasses). The optical excitation of these particles takes place by means of a laser beam 5 with an elongated (eg elliptical) intensity profile which is transmitted via the dichroic mirror 4 and the optics 6 (eg Microscope objective) is focused on the sample surface 8, the elongated excitation spot 7 is thus formed on the sample surface 8. The laser beam can be polarized so that the polarization of the excitation light in the excitation spot 7 is circular, so that the excitation efficiency of the particles is independent of the orientation parallel to the surface To design particle absorption dipoles The optical signal generated by the particles in this excitation spot 7 is collected via the optics 6. The dichroic mirror 4 is reflective for the excitation wavelength of the laser and transmissive for the wavelength of the optical signal generated by the particles The light emitted by the particles passes through the slit diaphragm 2 into the photoelectric detector 1 (eg photoelectron multiplier), which converts the incident light into an electrical signal, which can be processed and evaluated by subsequent electronics. The longitudinal axis of the excitation spot 7 stands perpendicular to the slit direction of the slit 2, and the longitudinal extent of the excitation spot 7 is larger than the image of the slit width of the slit 2, so that the detection efficiency in the detection area is almost independent of the position of the particles perpendicular to the slit direction (along the longitudinal axis of the excitation spot 7) is
Um einen Einfluß der Abhängigkeit der photoelektrischen Empfindlichkeit des photoelektrischen Detektors 1 über dessen Detektorflache auf die Detektionsempfind- lichkeit auszuschließen, muß die Vergrößerung der Optik 6 so gewählt werden, so daß der Detektor 1 jeden Punkt des Detektionsgebiets gleich empfindlich detektiert Die Detektionseffizienz hangt dann im wesentlichen nur ab von der Position der Partikel längs der Spaltrichtung der Spaltblende 2 (quer zur Langsachse des Anregungs- flecks 7)In order to influence the dependence of the photoelectric sensitivity of the photoelectric detector 1 on the detector surface on the detection sensitivity. exclusion, the magnification of the optics 6 must be chosen so that the detector 1 detects every point of the detection area with equal sensitivity. The detection efficiency then essentially depends only on the position of the particles along the direction of the slit of the slit diaphragm 2 (transverse to the longitudinal axis of the excitation - spots 7)
Durch gleichmaßige relative Verschiebung der Probenoberflache 8 entlang der Richtung 9 werden die zu detektierenden Partikel in das Detektionsgebiet hinein- und wieder hinaustransportiert Die Verschiebung kann dabei kontinuierlich oder in diskreten Schritten erfolgen Betragt die Ausdehnung der Querachse des Fokus 7 im beugungsbe- grenzten Fall etwa 1 μm, so empfiehlt sich eine Schrittweite der Verschiebung von deutlich unter 0,5 μm, idealerweise etwa 0,1 μm Bei größeren Abmessungen der Querachse kann auch die Schrittweite großer gewählt werdenThe particles to be detected are transported in and out of the detection area by uniform relative displacement of the sample surface 8 in the direction 9. The displacement can take place continuously or in discrete steps. The extent of the transverse axis of the focus 7 in the diffraction-limited case is approximately 1 μm , a step size of the displacement of significantly less than 0.5 μm is recommended, ideally about 0.1 μm. For larger dimensions of the transverse axis, the step size larger can also be selected
Simultan zur Verschiebung wird die Intensität des von den Partikeln generierten optischen Signals in Zeitintervallen gemessen Die Lange dieser Zeitintervalle ist we- sentlich kurzer als die Verweilzeit der Partikel im Anregungsfleck 7 Damit entsteht ein kontinuierlicher Datenstrom, der jedem Zeitintervall die Quantität des darin gemessenen optischen Signals zuordnet Da die Lange eines Zeitintervalls wesentlich kurzer ist als die Verweilzeit eines Partikels im Anregungsfleck 7, wird beim Eintritt eines Partikels in das Detektionsgebiet die Quantität des gemessenen optischen Signals von Zeitintervall zu Zeitintervall langsam steigen und nach Erreichen eines Maximums wieder fallen, entsprechend dem Intensitatsprofil des Anregungslichts quer zur Elongation des Anregungsflecks 7 Damit können diese Partikeldurchgange als Intensitatspeaks im erfaßten Datenstrom identifiziert werden Durch Aufsummieren des optischen Signals in diesen Intensitatspeaks kann dann jedem Partikeldurchgang eine Gesamthelligkeit zugeordnet werden Da jedes Partikel beim Durchgang durch das Detektionsgebiet dieselben Anregungs- und Detektionsbedingungen erfahrt, wird diese Gesamthelligkeit proportional zur Eigenhelligkeit der Partikel sein, was eine Auswertung der ermittelten Gesamthelligkeiten für chemo- und bioanalytische Zwecke ermöglichtSimultaneously to the shift, the intensity of the optical signal generated by the particles is measured in time intervals. The length of these time intervals is considerably shorter than the dwell time of the particles in the excitation spot 7. This creates a continuous data stream which assigns the quantity of the optical signal measured therein to each time interval Since the length of a time interval is significantly shorter than the dwell time of a particle in the excitation spot 7, when a particle enters the detection area, the quantity of the measured optical signal will slowly increase from time interval to time interval and fall again after reaching a maximum, in accordance with the intensity profile of the excitation light transversely to the elongation of the excitation spot 7 These particle passages can thus be identified as intensity peaks in the recorded data stream. By summing up the optical signal in these intensity peaks, each particle passage can then be one Overall brightness is assigned Since each particle experiences the same excitation and detection conditions as it passes through the detection area, this overall brightness will be proportional to the intrinsic brightness of the particles, which enables an evaluation of the overall brightness determined for chemo and bioanalytical purposes
Bei dem gegenwartig bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Anregungslicht nicht lediglich zirkulär polarisiert, um auch einen eventuellen Einfluß der Orientierung des Absorptionsdipolmoments senkrecht zur Oberflache zu eliminieren Folgende orien- tierungsabhangige Faktoren beeinflussen die Starke des detektierten Lichts Die Absorption des Lichts durch ein Molekül erfolgt dann am effizientesten bzw. der Absorptionswirkungsquerschnitt ist dann am größten, wenn die Polarisation des anregenden Lichts und das Absorptionsdipolmoment parallel zueinander ausgerichtet sind. Es gibt somit einen Einfluß auf die Stärke des detektierten optischen Signals durch die Polarisation des anregenden Lichts und durch die Orientierung des Absorptionsdipolmoments.In the presently preferred exemplary embodiment, the excitation light is not only circularly polarized in order to also eliminate any influence of the orientation of the absorption dipole moment perpendicular to the surface. The following orientation-dependent factors influence the strength of the detected light The absorption of light by a molecule takes place most efficiently, or the absorption cross section is greatest when the polarization of the exciting light and the absorption dipole moment are aligned parallel to each other. There is thus an influence on the strength of the detected optical signal through the polarization of the exciting light and through the orientation of the absorption dipole moment.
Der Absorption folgt teilweise die Emission. In guter Näherung erfolgt die Emission des Partikels gemäß der Feldverteilung eines Dipolstrahlers. Somit gibt es einen Einfluß auf die Stärke des detektierten optischen Signals durch die Orientierung des Emissi- onsdipolmoments. Absorptions- und Emissionsdipolmoment sind häufig parallel zueinander. Sie können jedoch ihre parallele Orientierung durch Rotationsdiff sion des Partikels zwischen dem Zeitpunkt der Absorption und dem Zeitpunkt der Emission verlieren. Bei größeren Molekülen spielt dieser Effekt nur eine untergeordnete Rolle.The absorption is partly followed by the emission. In a good approximation, the particle is emitted according to the field distribution of a dipole emitter. Thus there is an influence on the strength of the detected optical signal through the orientation of the emission dipole moment. The absorption and emission dipole moments are often parallel to each other. However, they can lose their parallel orientation due to the rotation diffusion of the particle between the time of absorption and the time of emission. With larger molecules, this effect only plays a minor role.
Die Abstrahlcharakteristik des Dipolstrahlers kann noch durch die Oberfläche und das Medium beeinflußt werden, auf bzw. in dem er sich befindet.The radiation characteristics of the dipole emitter can still be influenced by the surface and the medium on or in which it is located.
Ferner wird die Abstrahlcharakteristik des Dipolstrahlers durch die Sammeloptik nicht in jeder Richtung gleich gut detektiert.Furthermore, the radiation characteristic of the dipole radiator is not equally well detected in every direction by the collecting optics.
Einige dieser Effekte können sich durch die Integration über den durch die Verschiebung bewirkten Durchtritt des Partikels durch den elongierten Fokus 7 (Scanweg) teilweise ändern.Some of these effects can partially change due to the integration via the passage of the particle through the elongated focus 7 (scan path) caused by the displacement.
Alle diese Gegebenheiten beeinflussen prinzipiell die Stärke des detektierten optischen Signals.In principle, all of these conditions influence the strength of the detected optical signal.
Im bevorzugten Ausführungsbeispiel erfolgt die Anregung und Detektion durch ein Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1.4 NA. Es wurde festgestellt, daß für ein solches Objektiv und für Dipolstrahler an einem Wasser/Glas-Übergang (aus dem Wasser auf dem Glas immobilisiert) die Detektionseffizienz unabhängig von der Emissionsdipolorientierung des Partikels bzw. Strahlers ist [Enderlein J., Ruckstuhl T., Seeger S.: "Highly Efficient Optical Detection of Surface-Generated Fluorescence"; Applied Optics, Jahrgang 1999, Band 38, Heft 4, Seiten 724 - 732]. Damit verbleibt als einziger Einflußfaktor die relative Orientierung der Polarisation des anregenden Lichts und des Absorptionsdipolmoments. Durch die im Folgenden geschilderten Maßnahmen kann jedoch die Polarisation des anregenden Lichts über den Scanweg integriert in allen drei Raumrichtungen vollkommen homogenisiert werden. Damit verbleibt kein Einfluß der Orientierung des Absorptionsdipolmoments mehr. Eine vollkommene Homogenisierung kann erreicht werden, mit der Folge des im Mittel annähernd gleichstarken detektierten optischen Signals aller Partikel.In the preferred embodiment, the excitation and detection is carried out by an oil immersion objective with a numerical aperture of 1.4 NA. It was found that for such an objective and for dipole emitters at a water / glass transition (immobilized on the glass from the water), the detection efficiency is independent of the emission dipole orientation of the particle or emitter [Enderlein J., Ruckstuhl T., Seeger S .: "Highly Efficient Optical Detection of Surface-Generated Fluorescence"; Applied Optics, volume 1999, volume 38, issue 4, pages 724 - 732]. Thus, the only influencing factor remains the relative orientation of the polarization of the exciting light and the absorption dipole moment. The measures described below, however, allow the polarization of the exciting light to be completely homogenized in all three spatial directions via the scan path. This means that there is no longer any influence on the orientation of the absorption dipole moment. A perfect homogenization can be achieved, with the consequence of the detected optical signal of all particles, which is approximately equally strong on average.
Im Folgenden wird auf Fig. 2 Bezug genommen. Die vollkommene Homogenisie- rung der Polarisation des anregenden Lichts in allen drei Raumrichtungen, integriert über den Scanweg, wird dadurch erreicht, daß dem anregenden Laserstrahl durch Strahlformung (mit Hilfen von Linsen oder diffraktiven optischen Elementen) ein linienförmiges Profil parallel zur x- Achse aufgeprägt wird (siehe Fig. 2). Dabei ist das Profil entlang der y- Achse ein Gauss-Profil. Die y- Achse entspricht der Richtung der Längsachse des elon- gierten Fokus 7 gemäß Fig. 1, die x- Achse entspricht der Scan-Richtung 9 gemäß Fig. 1. Weiterhin werden 20 % in der Mitte dieses Lichtstreifens ausgeblendet, so daß das in das Objektiv einfallende Licht das in Fig. 2 zu sehende Intensitätsprofil hat.In the following, reference is made to FIG. 2. The complete homogenization of the polarization of the stimulating light in all three spatial directions, integrated via the scan path, is achieved in that a linear profile parallel to the x-axis is impressed on the stimulating laser beam by beam shaping (with the aid of lenses or diffractive optical elements) (see Fig. 2). The profile along the y axis is a Gauss profile. The y-axis corresponds to the direction of the longitudinal axis of the elongated focus 7 according to FIG. 1, the x-axis corresponds to the scan direction 9 according to FIG. 1. Furthermore, 20% are faded out in the middle of this light strip, so that the the lens incident light has the intensity profile seen in FIG. 2.
Dieses Intensitätsprofil wird in die hintere Fokalebene des Objektivs fokussiert. Die hintere Fokalebene ist die Brennebene des Mikroskopobjektivs auf der vom Objekt ab- gewandten Bildseite im Mikroskopkörper. Dadurch tritt das Anregungslicht in der Objekt-Fokalebene in der y/z-Ebene parallel und mit nahezu gleichförmiger Intensität aus. Es entsteht entlang der y-Achse eine nahezu gleichförmige Ausleuchtung (Köhlerbeleuchtung), die nur sehr langsam bei großen y- Werten abfällt.This intensity profile is focused in the rear focal plane of the lens. The rear focal plane is the focal plane of the microscope objective on the side of the image in the microscope body facing away from the object. As a result, the excitation light in the object focal plane emerges in the y / z plane in parallel and with an almost uniform intensity. An almost uniform illumination (Köhler illumination) is created along the y axis, which drops very slowly with large y values.
Ferner wird das einfallende Licht elliptisch polarisiert, mit einem Intensitätsver- hältnis von x- zu y-Polarisation von 2 . Das Anregungslicht ist somit in der hinteren Fokalebene stärker x-polarisiert. Da das Anregungslicht in Richtung der x-Achse nicht fokussiert ist, sondern annähernd parallel auf die hintere Fokalebene trifft, wird es auf das Objekt fokussiert. Es kommt somit zu einer starken Richtungsänderung der Lichtwellen in der x/z-Ebene. Dadurch entstehen auch Polarisationsanteile in z-Richtung, die die an- nähernd ebene Welle des Anregungslichts anfänglich nicht aufweisen konnte. Die stärkere x-Polarisation wird auf diese Weise in eine gleichmäßige x- und z-Polarisation umgesetzt.Furthermore, the incident light is elliptically polarized, with an intensity ratio of x to y polarization of 2. The excitation light is thus more x-polarized in the rear focal plane. Since the excitation light is not focused in the direction of the x-axis, but strikes the rear focal plane approximately parallel, it is focused on the object. This leads to a strong change in direction of the light waves in the x / z plane. This also gives rise to polarization components in the z direction which the approximately plane wave of the excitation light was initially unable to exhibit. In this way, the stronger x polarization is converted into a uniform x and z polarization.
Unter diesen Voraussetzungen haben die Intensitätsprofile der x-, y- und z- Polarisation in der Objekt-Fokalebene des Objektivs die in Fig. 3 gezeigte Form. Die In- tensitätsprofile der x- und y-Polarisation sind in diesem Fall identisch.Under these conditions, the intensity profiles of the x, y and z polarization in the object focal plane of the objective have the shape shown in FIG. 3. In this case, the intensity profiles of the x and y polarization are identical.
Ein Partikel, welches mit einer derartigen Beleuchtung entlang der x-Achse - bzw. Richtung 9 - gescannt wird, erfährt über den Scanweg integriert stets die gleiche optische Anregung, unabhängig von der Orientierung seines Absorptionsdipolmoments. Ein Inte- gral parallel zur x-Achse für einen festen y- Wert hat in beiden Graphen den gleichen Wert. Es kann sich zwar je nach Dipolorientierung, der zeitliche Verlauf des detektierten optischen Signals ändern, jedoch nicht die Gesamtsumme der detektierten Photonen.A particle that is scanned with such illumination along the x-axis - or direction 9 - always experiences the same optical excitation when integrated, regardless of the orientation of its absorption dipole moment. An inte- grail parallel to the x-axis for a fixed y-value has the same value in both graphs. Depending on the dipole orientation, the time course of the detected optical signal can change, but not the total sum of the detected photons.
Wichtig ist auch, daß aufgrund der verschiedenen, in Fig. 3 erkennbaren Maxima und Minima die Schrittweite der Relatiwerschiebung nicht nur deutlich kleiner als die Breite des Fokus 7 gewählt werden muß, sondern auch kleiner als die Breite der Maxima und Minima. Andernfalls läuft man Gefahr, nur einzelne Maxima oder Minima zu treffen. Dadurch würde die erforderliche Integration entlang des Scanwegs nicht in der erforderlichen Weise erfolgen.It is also important that, due to the different maxima and minima that can be seen in FIG. 3, the step size of the relative shift must not only be selected to be significantly smaller than the width of the focus 7, but also smaller than the width of the maxima and minima. Otherwise you run the risk of only hitting individual maxima or minima. As a result, the required integration along the scan path would not take place in the required manner.
Im bevorzugten Ausführungsbeispiel wird als Detektor 1 eine sog. SPAD verwendet, d.h. eine "Single Photon Counting Avalanche Photodiode". SPADS haben einen reativ kleinen dynamischen Bereich. Sie können von 1 bis ca. 107 Photonen pro Sekunde detektieren. Da pro beobachtetem Partikel ca. 10 bis 100 Photonen detektiert werden sollten, schränkt sich der effektive dynamische Bereich auf ca. 5 bis 6 Größenordnungen ein. Denkt man an eine Anwendung wie z.B. DNS-Fragmentgrößenbestimmung, könnte eventuell ein größerer dynamischer Bereich nötig sein. Aus dem Grunde kann eine modifizierte Detektion eingesetzt werden: In den Detektionsstrahlengang wird ein schnell schaltbarer und graduell regelbarer Absorber gestellt, z.B. ein elektrooptischer oder akustooptischer Modulator. Sobald die SPAD über einen Grenzwert in der Photonendetektionsrate gelangt, wird dieser schaltbare Absorber derart geregelt, daß die detektierte Photonenrate den Grenzwert nicht überschreitet. Das kann über einen Regelkreis, welcher das SPAD-Signal auswertet und den Absorber steuert, erreicht werden. Das Regelsignal selbst kann bei der Signalauswertung mit verarbeitet werden. Auf diese Weise kann der dynamische Bereich der Detektion beliebig ausgedehnt werden.In the preferred exemplary embodiment, a so-called SPAD is used as detector 1, ie a "single photon counting avalanche photodiode". SPADS have a relatively small dynamic range. You can detect from 1 to about 10 7 photons per second. Since approximately 10 to 100 photons should be detected per particle observed, the effective dynamic range is limited to approximately 5 to 6 orders of magnitude. If you think of an application such as DNA fragment sizing, a larger dynamic range may be necessary. For this reason, a modified detection can be used: a quickly switchable and gradually adjustable absorber is placed in the detection beam path, for example an electro-optical or acousto-optical modulator. As soon as the SPAD reaches a limit value in the photon detection rate, this switchable absorber is regulated in such a way that the detected photon rate does not exceed the limit value. This can be achieved using a control loop that evaluates the SPAD signal and controls the absorber. The control signal itself can be processed in the signal evaluation. In this way, the dynamic range of the detection can be expanded as desired.
2. Ausführungsbeispiel2nd embodiment
Der Aufbau ist ähnlich zu demjenigen gemäß Ausführungsbeispiel 1, aber die opti- sehe Anregung erfolgt jetzt mit einem Laserstrahl 10 in Totalreflektion, wie in Fig. 4 gezeigt. Wiederum muß die Längsachse des Anregungsflecks 7, die Spaltenbreite der Spaltblende 2, deren gegenseitige Anordnung und die Vergrößerung der Optik 6 so gewählt sein, daß die Detektionseffizienz im Detektionsgebiet nahezu unabhängig von der Positi- on der Partikel quer zur Spaltrichtung (entlang der Längsachse des Anregungsflecks 7) ist. Auch der Transport der auf der Oberfläche immobilisierten Partikel sowie die Art und Weise der Erfassung des optischen Signals erfolgen wie in Beispiel 1.The structure is similar to that according to exemplary embodiment 1, but the optical excitation now takes place with a laser beam 10 in total reflection, as shown in FIG. 4. Again, the longitudinal axis of the excitation spot 7, the column width of the slit diaphragm 2, their mutual arrangement and the magnification of the optics 6 must be selected such that the detection efficiency in the detection area is almost independent of the position on the particle is transverse to the direction of splitting (along the longitudinal axis of the excitation spot 7). The transport of the particles immobilized on the surface and the manner in which the optical signal is recorded are also carried out as in Example 1.
Im Rahmen der Erfindung sind zahlreiche Abwandlungen und Weiterbildungen der beschriebenen Ausführungsbeispiele verwirklichbar.Numerous modifications and developments of the exemplary embodiments described can be implemented within the scope of the invention.
Der Laserstrahl der optischen Anregung kann durch vorherige Strahlformung und/oder Phasenmodulation (mit Hilfen von Linsen oder diffraktiven optischen Elemen- ten) beliebig derart gestaltet werden, daß für ein und dieselbe Sorte Partikel beim Scannen im Mittel die gleiche Zahl Photonen detektiert wird, unabhängig von der Orientierung des Emissions- und Absorptionsdipolmoments der Partikel. So können beispielsweise mit anderen als den geschilderten Verfahren durch Phasen- und Intensitätsmodulation glattere Anregungsprofile in der Objekt-Fokalebene erzeugt werden. Wichtig ist einzig, daß alle drei möglichen Orientierungen des Absorptionsdipolmoments integral gleich gut angeregt werden.The laser beam of the optical excitation can be designed in any way by prior beam shaping and / or phase modulation (with the aid of lenses or diffractive optical elements) in such a way that the same number of photons is detected on average for one and the same type of particle during scanning, regardless of the orientation of the emission and absorption dipole moment of the particles. For example, smoother excitation profiles can be generated in the object focal plane by means of phase and intensity modulation using methods other than those described. The only important thing is that all three possible orientations of the absorption dipole moment are integrally excited equally well.
Für die Strahlformung geeignete Module sind z.B. beschrieben in: F. Wyrowski und W. T. Rhodes: "Use of holographic concepts for the design of optical Systems"; in: "50 Years of Holography", Ed. Jean-Marc Fournier, Springer Berlin 1999. Auch ist es möglich, mit Hilfe geeigneter Formung des Anregungslichts etwaigeSuitable modules for beam shaping are e.g. described in: F. Wyrowski and W. T. Rhodes: "Use of holographic concepts for the design of optical systems"; in: "50 Years of Holography", Ed. Jean-Marc Fournier, Springer Berlin 1999. It is also possible, with the help of suitable shaping of the excitation light, if necessary
Inhomogenitäten der Emission und Detektion auszugleichen. In dem geschilderten Ausführungsbeispiel traten solche räumlichen Inhomogenitäten nicht auf. Sie sind aber eher die Regel als die Ausnahme.Compensate for inhomogeneities in emission and detection. Such spatial inhomogeneities did not occur in the exemplary embodiment described. But they are the rule rather than the exception.
Der geschilderte Zusammenhang, daß die Absorption des Lichts durch ein Molekül dann am effizientesten erfolgt, wenn die Polarisation des anregenden Lichts und das Absorptionsdipolmoment parallel zueinander ausgerichtet sind, gilt insbesondere für EinPhotonen-Absorptionen, wie sie in der Fluoreszenz die Regel sind. Bei anderen optischen Nachweistechniken, z.B. der Raman-Spektroskopie, sind andere Übergangsmomente, teils höherer Ordnung, entscheidend. Dadurch kann sich die optimale relative räumliche Ausrichtung der Polarisation des Anregungslichts und des Übergangsmoments ändern. Entscheidend sind die quantenmechanischen bzw. quantenelektrodynamischen Übergangswahrscheinlichkeiten. In einem solchen Fall ist eine vom geschilderten Beispiel abweichende relative räumliche Ausrichtung der Polarisation des Anregungslichts und des Übergangsmoments vorzunehmen. Die vorzunehmende Optimierung basiert jedoch auf den gleichen Prinzipien, d.h. der Abstimmung der räumlichen Verteilung von Feldstärke und Polarisationsrichtung des Lichtstrahls im Mittelbereich des elongierten Fokus sowie der Sammeloptik und der Blende derart, daß das über die Dauer des durch die Verschiebung bewirkten Durchtritts des Partikels durch den elongierten Fokus integrierte detektierte optische Signal für alle Partikel einer Sorte im Mittel annähernd gleich stark und unabhängig von der Orientierung der Übergangsmomente der Partikel ist. The described relationship that the absorption of light by a molecule takes place most efficiently when the polarization of the exciting light and the absorption dipole moment are aligned parallel to one another applies in particular to one-photon absorption, as is the rule in fluorescence. With other optical detection techniques, such as Raman spectroscopy, other transition moments, some of higher order, are crucial. This can change the optimal relative spatial alignment of the polarization of the excitation light and the transition torque. The quantum mechanical or quantum electrodynamic transition probabilities are decisive. In such a case, the relative spatial orientation of the polarization of the excitation light and deviates from the example described of the transition torque. However, the optimization to be carried out is based on the same principles, that is to say the coordination of the spatial distribution of field strength and polarization direction of the light beam in the central region of the elongated focus, and of the collecting optics and the diaphragm, in such a way that this lasts for the duration of the passage of the particle through the displacement elongated focus integrated detected optical signal for all particles of one type is approximately equally strong on average and is independent of the orientation of the transition moments of the particles.

Claims

Patentansprüche claims
1 Verfahren zur optischen Detektion eines auf einer Oberflache (8) immobilisierten Partikels, a) wobei die Oberflache (8) mit einem Lichtstrahl (5) derart bestrahlt wird, daß sich auf der Oberflache ein elongierter Fokus (7) mit einer Langsachse und einer kürzeren Querachse bildet, b) wobei die Oberflache (8) mit dem immobilisierten Partikel und der Fokus (7) im wesentlichen in Richtung (9) der Querachse des elongierten Fokus relativ zueinander verschoben werden, wobei die Verschiebung kontinuierlich oder mit einer Schrittweite erfolgt, die kleiner als die Lange der Querachse ist, c) wobei das im elongierten Fokus (7) erzeugte optische Signal über eine Sammeloptik (6) auf eine Blende (2) abgebildet wird, wobei Sammeloptik (6) und Blende (2) derart aufeinander abgestimmt werden, daß sich eine Sammeleffizienz für das im Fokus erzeugte optische Signal ergibt, die entlang der Langsachse des elongierten Fokus in dessen Mittelbereich im wesentlichen homogen ist und die außerhalb des Mittelbereichs im wesentlichen verschwindet, und d) wobei das durch die Blende (2) tretende optische Signal von einer Detektionsein- richtung (1) in Zeitintervallen detektiert wird, die das Abtasten des durch die Verschiebung bewirkten Durchtritts des Partikels durch den elongierten Fokus (7) erlauben1 method for optical detection of a particle immobilized on a surface (8), a) wherein the surface (8) is irradiated with a light beam (5) in such a way that an elongated focus (7) with a longitudinal axis and a shorter axis is located on the surface Forms transverse axis, b) the surface (8) with the immobilized particle and the focus (7) being displaced relative to one another essentially in the direction (9) of the transverse axis of the elongated focus, the displacement taking place continuously or with a step size that is smaller than the length of the transverse axis, c) the optical signal generated in the elongated focus (7) being imaged onto a diaphragm (2) via a collecting optics (6), the collecting optics (6) and diaphragm (2) being matched to one another in this way, that there is a collection efficiency for the optical signal generated in the focus, which is substantially homogeneous along the longitudinal axis of the elongated focus in the central region thereof and which is outside the Mi The central area essentially disappears, and d) the optical signal passing through the diaphragm (2) is detected by a detection device (1) at time intervals which the scanning of the passage of the particle caused by the displacement through the elongated focus (7) allow
2 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Blende (2) eine Spaltblende gewählt wird, deren Spalt parallel zur Oberflache (8) und zur Querachse des elongierten Fokus ausgerichtet ist2 The method according to claim 1, characterized in that a slit diaphragm is selected as the diaphragm (2), the gap of which is aligned parallel to the surface (8) and to the transverse axis of the elongated focus
3 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtstrahl (5) von der dem Partikel abgewandten Seite der Oberflache (8) aus unter einem Winkel eingestrahlt wird, der eine totale interne Reflexion des Lichtstrahls an der das Partikel tra- genden Oberflache bewirkt, wodurch das Partikel evaneszent angeregt wird3. The method according to claim 1, characterized in that the light beam (5) is irradiated from the side of the surface (8) facing away from the particle at an angle which causes total internal reflection of the light beam on the surface carrying the particle, which excites the particle evanescently
4 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflache (8) mit einem zirkulär polarisierten Lichtstrahl (5) bestrahlt wird 4 The method according to claim 1, characterized in that the surface (8) is irradiated with a circularly polarized light beam (5)
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die räumliche Verteilung von Feldstärke und Polarisationsrichtung des Lichtstrahls (5) im Mittelbereich des elongierten Fokus (7) sowie die Sammeloptik (6) und die Blende (2) derart aufeinander abgestimmt werden, daß das über die Dauer des durch die Verschiebung bewirkten Durchtritts des Partikels durch den elongierten Fokus (7) integrierte detektierte optische Signal für alle Partikel einer Sorte im Mittel annähernd gleich stark und unabhängig von der Orientierung der Absorptions- bzw. Emissionsübergangsmomente der Partikel ist.5. The method according to claim 1, characterized in that the spatial distribution of field strength and direction of polarization of the light beam (5) in the central region of the elongated focus (7) and the collecting optics (6) and the diaphragm (2) are coordinated so that the Over the duration of the passage of the particle through the elongated focus (7) caused by the displacement, the detected optical signal integrated for all particles of one type is approximately equally strong on average and is independent of the orientation of the absorption or emission transition moments of the particles.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Blende in Richtung der Längsachse des elongierten Fokus in Schwingung versetzt wird, wobei die Amplitude der Schwingung entsprechend der räumlichen Ausdehnung des Übergangs von im wesentlichen maximaler Sammeleffizienz zu im wesent- liehen verschwindender Sammeleffizienz in der Ebene des elongierten Fokus gewählt wird, und wobei die Frequenz der Schwingung zu den Zeitintervallen der Abtastung passend gewählt wird, wodurch die optischen Signale von Partikeln, die am Rand des Abbilds der Blende durch den Fokus treten, in ihrer Stärke moduliert werden; und daß die detektierten optischen Signale auf eine Modulation ihrer Stärke hin untersucht und selektiert werden.6. The method according to claim 1, characterized in that the aperture in the direction of the longitudinal axis of the elongated focus is set into vibration, the amplitude of the vibration corresponding to the spatial extent of the transition from essentially maximum collection efficiency to essentially disappearing collection efficiency in the Plane of the elongated focus is selected, and wherein the frequency of the oscillation is selected to match the time intervals of the scanning, whereby the optical signals of particles which pass through the focus at the edge of the image of the diaphragm are modulated in their strength; and that the detected optical signals are examined for a modulation of their strength and selected.
7. Vorrichtung zur optischen Detektion eines auf einer Oberfläche (8) immobili- sierten Partikels, mit e) einer Lichtquelle zum Erzeugen eines Lichtstrahls (5); f) einer Fokussieroptik (6) zum Erzeugen eines elongierten Fokus (7) des Lichtstrahls (5) auf der Oberfläche (8), wobei der Fokus eine Längsachse und eine kürzere Querachse hat; g) einer Verschiebeeinrichtung zum Bewirken einer Relatiwerschiebung zwischen der Oberfläche (8) und dem Fokus (7), wobei die Verschiebung im wesentlichen in Richtung (9) der Querachse des elongierten Fokus (7) und kontinuierlich oder mit einer Schrittweite erfolgt, die kleiner als die Länge der Querachse ist; h) einer Sammeloptik (6) zum Sammeln des im Fokus (7) erzeugten optischen Signals, i) einer Blende (2), wobei das gesammelte optische Signal auf die Blende (2) abgebildet wird, und wobei Sammeloptik (6) und Blende (2) derart aufeinander abgestimmt sind, daß sich eine Sammeleffizienz für das im Fokus erzeugte optische Signal ergibt, die entlang der Langsachse des elongierten Fokus in dessen Mittelbereich im wesentlichen homogen ist und die außerhalb des Mittelbereichs im wesentlichen verschwindet, und mit j) einer Detektionseinrichtung (1) zum Detektieren des durch die Blende (2) tretenden optischen Signals, wobei die Detektionseinrichtung (1) das Abtasten des durch die Verschiebeeinrichtung bewirkten Durchtritts des Partikels durch den elongierten Fokus (7) erlaubt7. Device for the optical detection of a particle immobilized on a surface (8), with e) a light source for generating a light beam (5); f) focusing optics (6) for generating an elongated focus (7) of the light beam (5) on the surface (8), the focus having a longitudinal axis and a shorter transverse axis; g) a displacement device for effecting a relative displacement between the surface (8) and the focus (7), the displacement taking place essentially in the direction (9) of the transverse axis of the elongated focus (7) and continuously or with a step size which is smaller than is the length of the transverse axis; h) a collecting optics (6) for collecting the optical signal generated in the focus (7), i) a diaphragm (2), the collected optical signal being imaged on the diaphragm (2), and wherein collecting optics (6) and diaphragm ( 2) are coordinated with one another in such a way that there is a collection efficiency for the optical signal generated in the focus, which is essentially homogeneous along the longitudinal axis of the elongated focus in its central region and which essentially disappears outside the central region, and with j) a detection device ( 1) for detecting the optical signal passing through the diaphragm (2), the detection device (1) permitting the scanning of the passage of the particle caused by the displacement device through the elongated focus (7)
8 Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Blende (2) eine Spaltblende ist, deren Spalt parallel zur Oberflache (8) und zur Querachse des elongierten Fokus ausgerichtet ist8. The device according to claim 7, characterized in that the diaphragm (2) is a slit diaphragm, the gap of which is aligned parallel to the surface (8) and to the transverse axis of the elongated focus
9 Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtstrahl (5) zirkulär polarisiert ist9 Device according to claim 7, characterized in that the light beam (5) is circularly polarized
10 Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fokussierop- tik (6) zum Erzeugen einer raumlichen Verteilung von Feldstarke und Polarisationsrich- tung des Lichtstrahls (5) im Mittelbereich des elongierten Fokus (7) sowie die Sammeloptik (6) und die Blende (2) derart aufeinander abgestimmt sind, daß das über die Dauer des durch die Verschiebung bewirkten Durchtritts des Partikels durch den elongierten Fokus (7) integrierte detektierte optische Signal für alle Partikel einer Sorte im Mittel annähernd gleich stark und unabhängig von der Orientierung der Absorptions- bzw Emis- sionsubergangsmomente der Partikel ist10 Device according to claim 7, characterized in that the focusing optics (6) for generating a spatial distribution of field strength and polarization direction of the light beam (5) in the central region of the elongated focus (7) and the collecting optics (6) and the diaphragm (2) are matched to one another in such a way that the detected optical signal integrated over the duration of the particle's passage through the elongated focus caused by the displacement (7) is approximately equally strong on average for all particles of one type and independent of the orientation of the absorption or emission transition moments of the particles
11 Vorrichtung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch eine Vibrationseinrich- tung zum Versetzen der Blende in Schwingung in Richtung der Langsachse des elongierten Fokus, wobei die Amplitude der Schwingung der raumlichen Ausdehnung des Übergangs von im wesentlichen maximaler Sammeleffizienz zu im wesentlichen verschwindender Sammeleffizienz in der Ebene des elongierten Fokus entspricht, und wobei die Frequenz der Schwingung zu den Zeitintervallen der Abtastung paßt. 11 Device according to claim 7, characterized by a vibration device for setting the aperture in vibration in the direction of the longitudinal axis of the elongated focus, the amplitude of the vibration of the spatial extent of the transition from essentially maximum collection efficiency to essentially disappearing collection efficiency in the plane of corresponds to elongated focus, and being the frequency of the oscillation matches the time intervals of the sampling.
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