WO2000008056A1 - NOUVEAU POLYPEPTIDE, ADNc LE CODANT ET SON UTILISATION - Google Patents

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WO2000008056A1
WO2000008056A1 PCT/JP1999/004265 JP9904265W WO0008056A1 WO 2000008056 A1 WO2000008056 A1 WO 2000008056A1 JP 9904265 W JP9904265 W JP 9904265W WO 0008056 A1 WO0008056 A1 WO 0008056A1
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WO
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cdna
polypeptide
present
cells
activity
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Application number
PCT/JP1999/004265
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English (en)
French (fr)
Inventor
Daikichi Fukushima
Shiro Shibayama
Hideaki Tada
Original Assignee
Ono Pharmaceutical Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide, a method for producing the same, a cDNA encoding the polypeptide, a vector comprising the cDNA, a host cell transformed with the vector, an antibody of the polypeptide, and the peptide. Or a pharmaceutical composition comprising the antibody.
  • the present inventors have so far studied the cloning of genes for growth / differentiation factors that work in the hematopoietic and immune systems.
  • Most of secretory proteins such as growth / differentiation factors (eg, various cytokines) and membrane proteins such as their receptors (hereinafter collectively referred to as secretory proteins, etc.) are mostly N-proteins. Focusing on the fact that it has a sequence called a signal peptide at the end, the inventors have intensively studied a method for efficiently and selectively cloning a gene encoding a signal peptide.
  • the cDNA sequence provided by the present invention has been identified as clone OAH047, Based on the information obtained using the yeast SST method, it was isolated from a cDNA library prepared from a human umbilical vein endothelial cell line (HUV-EC-C).
  • the clone OAH047 is a full-length cDNA containing the complete cDNA sequence encoding a membrane protein (here represented as OAH047 protein).
  • the present invention is a.
  • the present invention relates to a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in a substantially pure form, a homolog thereof, a fragment of the sequence thereof, and a homolog thereof.
  • the invention further relates to cDNAs encoding those polypeptides. More specifically, a cDNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a flag selectively hybridizing to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3 For cDNAs containing the same
  • the hybridizing cDNA also includes the complementary sequence of the above-mentioned sequence ij.
  • a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 which is in a substantially pure form generally refers to at least 90%, for example, 95, 98 or 99% of the polypeptide at the time of production, as shown in SEQ ID NO: 1. It means a polypeptide having an amino acid sequence.
  • a homolog of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is generally a region of at least 20, preferably at least 30, for example 40, 60 or 100 contiguous amino acids, at least 70%, preferably at least 70%. Those that are at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such homologs are hereinafter referred to as polypeptides of the present invention.
  • a fragment of a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a fragment of a homolog thereof is at least 10 amino acids, preferably at least 15 amino acids, for example, 20, 25, 30, 40, 50 or 60 Means the amino acid portion.
  • a cDNA that selectively hybridizes to cDNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 3 is generally at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 100 contiguous It is at least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous in the nucleotide sequence region, and such a cDNA is hereinafter referred to as cDNA of the present invention.
  • the fragment of the cDNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3 means at least 10 bases, preferably at least 15 bases, for example, 20, 25, 30 or 40 bases.
  • the present invention includes a replication or expression vector comprising the cDNA of the present invention.
  • the vector include a plasmid, a virus or a phage vector comprising an ori region and, if necessary, a promoter for expression of the above cDNA, a regulator of a promoter, and the like.
  • the vector may contain one or more selectable marker genes, for example, an ampicillin resistance gene.
  • the vector can be used in vitro, for example, for producing RNA corresponding to cDNA and transforming host cells.
  • the present invention provides a method for transforming a vector for replicating or expressing the cDNA of the present invention containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 3 or the cDNA having the open reading frame thereof.
  • Host cells include, for example, bacteria, yeast, insect cells or mammalian cells.
  • the present invention includes a method for producing the polypeptide of the present invention, which comprises culturing the host cell of the present invention under conditions for expressing the polypeptide of the present invention.
  • the cultivation is preferably performed under conditions in which the polypeptide of the present invention is expressed and produced from host cells.
  • An antisense RNA can also be produced by inserting the cDNA of the present invention into an antisense region of a vector as described above. Such antisense RNA can also be used to control the level of a polypeptide of the invention in cells.
  • the present invention also includes monoclonal or polyclonal antibodies of the polypeptides of the present invention. Further, the present invention also includes a method for producing a monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide of the present invention. Monoclonal antibodies can be produced by ordinary hybridoma technology using the peptide of the present invention or a fragment thereof as an antigen. Polyclonal antibodies are used in host animals (eg, (Rats, rabbits, etc.) can be produced by an ordinary method in which the polypeptide of the present invention is inoculated to recover immune serum.
  • host animals eg, (Rats, rabbits, etc.
  • the present invention also includes a pharmaceutical composition comprising the polypeptide of the present invention, an antibody thereof, a pharmaceutically acceptable excipient, and Z or a carrier.
  • polypeptide of the present invention of (1) a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a part thereof deleted (for example, a sequence essential for expression of a biological activity in SEQ ID NO: 1) ), Polypeptides of the present invention substituted with other amino acids (for example, those substituted with amino acids having similar physical properties), and those in which other amino acids are added or inserted into a part thereof. Is also included.
  • nucleotide sequence of cDNA can be changed without changing the amino acid sequence of the polypeptide.
  • the cDNA of the present invention specified by (2) includes all base sequence groups encoding the polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 in (1). By changing the nucleotide sequence, the productivity of the polypeptide may be improved.
  • the cDNA specified in (3) is an embodiment of the cDNA shown in (2) and represents a natural sequence.
  • the cDNA shown in (4) shows the sequence obtained by adding the natural untranslated portion to the cDNA specified in (3).
  • the enzyme In order to utilize sugar or raffinose as an energy or carbon source, the enzyme must secrete ymbelose in the culture medium. It is an enzyme that breaks down into glucose and glucose.) It is also known that many known mammalian signal peptides are capable of secreting yeast inbellase. Based on these findings, this method was developed as a method for screening a novel signal peptide that enables secretion of yeast ymbelose from a mammalian cDNA library using the growth of yeast on raffinose medium as an indicator.
  • Translation start site The non-secreted invertase gene S UC'2 (GENBANK accession No.
  • V01311) from which the ATG has been deleted is expressed in a yeast expression vector [promoter for expression (ADH promoter) and terminator (ADH terminator)] Is derived from the AAH5 plasmid (Gammerer, Methods in Enzymol. 101, 192-201, 1983), the yeast origin of replication is 2 ori, the yeast selection marker is TRP 1, the E. coli origin of replication is Co 1 E 1 ori, and the E. coli drug resistance marker Uses ampicillin.
  • yeast SST vector pSUC2 A mammalian SST cDNA library was prepared by incorporating mammalian cDNAs upstream of the SUC2 gene. This library was transformed into an enzyme deficient in secreted invertase.
  • the integrated mammalian cDNA encodes a signal peptide, it is also considered to have a secretory effect on invertase expressed in yeast, which allows growth on raffinose medium. . Therefore, a yeast was cultured from the colonies that appeared, a plasmid was prepared, and the nucleotide sequence of the insert cDNA was determined.
  • mRNA is isolated from the target cells, and a double-stranded cDNA is synthesized using a random primer linked to a specific restriction enzyme (enzyme I) site.
  • Enzyme I specific restriction enzyme
  • An adapter containing a specific restriction enzyme (enzyme ⁇ ) site different from enzyme I is ligated, digested with enzyme I, and fractionated to an appropriate size.
  • the method comprises a step of ligating and transforming the cDNA fragment obtained upstream of the invertase gene from which the sialnal peptide in the yeast expression vector has been deleted.
  • step (1) after stimulating with a suitable stimulant from a target mammalian organ or cell line as necessary, a known method (hereinafter, known methods are not particularly described). if Molecular Cloning (Sambrook, J., Fritsch , EF and Maniatis, T.
  • the target cells include HUV-EC-C (human umbilical vein endothelial cell line: ATCC No. CRL-1730). Synthesis of double-stranded CDNA using a random primer is performed by a known method.
  • the restriction enzyme (enzyme I) site connected to the adapter 1 and the restriction enzyme (enzyme II) site used in the next step (2) may be any as long as they are different from each other.
  • XhoI is used as enzyme I
  • EcoRI is used as enzyme II.
  • step (2) the ends are blunted with T4 DNA polymerase, the enzyme II is ligated, then digested with enzyme I, and 300 to 800 bp of cDNA is fractionated by agarose electrophoresis (AGE).
  • Enzyme II may be anything that is different from enzyme I as described above.
  • Step (3) is a step of transforming Escherichia coli by incorporating the cDNA fragment obtained in (2) upstream of the invertase gene from which the signal peptide linked to the yeast expression plasmid vector has been deleted.
  • various plasmid vectors for yeast expression are known, for example, in E. coli. YEp24 or the like, which also functions, is used.
  • the plasmid pSUC2 described above is used.
  • Many host E. coli strains for transformation are already known, and are preferably DH10B competent cells.
  • the transformation may be performed by any known method, but is preferably performed by an electroporation method.
  • the transformant is cultured by a conventional method to obtain a cDNA library for yeast SST.
  • the cDNA library may be prepared from yeast Saccharomyces cerevisiae (for example, YT455 strain etc.) which does not have the invernase gene or a strain in which the invernase gene is artificially deleted (known in the art). Can be prepared according to the method).
  • the yeast is transformed by a known method, for example, the lithium acetate method. After the transformants are grown on a selective medium, they are transferred to a medium containing raffinose as a carbon source, viable colonies are selected, and a plasmid is recovered. The fact that the yeast grew using raffinose as a carbon source indicates that a signal peptide of some secreted protein was incorporated into the library.
  • nucleotide sequence of the isolated positive clone was determined, and for cDNA that was found to encode an unknown protein, a full-length clone was isolated using it as a probe, and the full-length clone was isolated.
  • the nucleotide sequence can be determined.
  • the cDNA encoding the protein of the present invention or the protein of the present invention exists in mammals Oligonucleotides having an appropriate nucleotide sequence capable of obtaining cDNAs encoding homologues and subsets of high quality are synthesized, and the resulting oligonucleotides are used for PCR from mammalian cDNA libraries or mRNAs, or By hybridizing a fragment having an appropriate nucleotide sequence as a probe, cDNA encoding another mammalian type of the protein can be obtained from another mammalian cDNA library or genomic library. it can.
  • the cDNA obtained in this way contains the base sequence of the cDNA fragment obtained by SST (or a homologous sequence thereof), it means that the signal peptide is coded. It is clear that the cDNA is full-length or nearly full-length. (Because the signal peptide is at the N-terminus of the protein without exception, it is encoded at the 5 'end of the open reading frame of cDNA.)
  • the full length may be confirmed by Northern analysis using the cDNA as a probe.
  • the size of the mRNA obtained from the hybridized band is compared with the size of the cDNA, and if they are almost the same, the cDNA is considered to be almost full length.
  • the cDNA of the present invention is obtained by chemical synthesis or by chemically synthesizing a fragment of the nucleotide sequence and hybridizing it with a probe. be able to. Furthermore, a required amount of the desired cDNA can be obtained by introducing the vector cDNA containing the present cDNA into an appropriate host and growing the vector.
  • an initiation codon is added to the 5 'end of cDNA encoding the mature protein portion, and the resulting cDNA is cloned into an appropriate promoter (eg, trp promoter).
  • an appropriate promoter eg, trp promoter.
  • a vector that functions in E. coli eg, pBR322, pUC 18, pUC 19
  • Escherichia coli for example, E. Coli DH1, E. Coli JMl09, E. Coli HB101 strain, etc. transformed with this expression vector is cultured in an appropriate medium, and the target cells are transformed from the cells.
  • a peptide can be obtained.
  • a bacterial signal peptide eg, peIB signal peptide
  • the desired polypeptide can be secreted into the periplasm.
  • it can produce fusion proteins with other polypeptides.
  • a cDNA encoding the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 can be prepared by using a suitable vector (for example, retrovirus vector, papilloma virus vector, vaccinia). Insert an appropriate promoter (for example, SV40 promoter, LTR promoter, meta-mouth thionein promoter, etc.) in a viral vector, SV40 vector, etc. into an expression vector. Next, appropriate mammalian cells (eg, monkey COS-7 cells, Chinese hamster CHO cells, mouse L cells, etc.) are transformed with the obtained expression vector, and the transformant is cultured in an appropriate medium.
  • a suitable vector for example, retrovirus vector, papilloma virus vector, vaccinia.
  • an appropriate promoter for example, SV40 promoter, LTR promoter, meta-mouth thionein promoter, etc.
  • appropriate mammalian cells eg, monkey COS-7 cells, Chinese hamster CHO cells, mouse L cells, etc.
  • the transformant
  • fusion protein can also be produced by ligating with other polypeptides, for example, a cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of an antibody.
  • the protein of the present invention is a membrane protein
  • the desired polypeptide is expressed on the cell membrane.
  • a deletion lacking the transmembrane region of the cDNA encoding the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is inserted into the above vector, and the resulting vector is used to transform an appropriate mammalian cell.
  • the desired soluble polypeptide is secreted into the culture solution.
  • the fusion protein is then ligated by linking the cDNA fragment encoding the deletion lacking the transmembrane region to another polypeptide, for example, a cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of the antibody. (Fusion protein).
  • polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method. Industrial applicability
  • polypeptides of the present invention and the cDNA coding for them will exhibit one or more effects or biological activities, including those associated with Atsesse listed below.
  • the effects or biological activities described with respect to the proteins of the invention may be dependent upon the administration or use of the protein, or the administration or use of a cDNA encoding the protein (eg, a vector suitable for gene therapy or cDNA transfer). , Provided.
  • the protein of the present invention may exhibit cytodynamic activity and cell proliferation (induction or inhibition), or differentiation activity (induction or inhibition), or may have a certain cell population. Is thought to induce or suppress cytokine production. Many of the currently discovered proteinaceous factors, including all known cytokins, have been active in one or more factor-dependent cell proliferation assays, so that It functions as a convenient method of confirming site force-in activity. The activity of the proteins of the present invention can be demonstrated by any of a number of conventional factor-dependent cell line cell proliferation assays.
  • proteins of the present invention also exhibit immunostimulatory and immunosuppressive activities. Certain proteins may also regulate (stimulate or inhibit) the growth and proliferation of, for example, T and / or B lymphocytes, as well as affect the cytotoxic activity of NK cells and other populations. By giving, it is considered to be effective for the treatment of various immunized individuals and diseases, including severe combined immunodeficiency (SCID). These immunodeficiencies can be hereditary or can be caused by a virus, for example, AIDS (HIV), as well as by bacterial or viral infections. Alternatively, it may come from an autoimmune disease.
  • SCID severe combined immunodeficiency
  • HIV HIV
  • hepatitis viruses herpes viruses
  • mycobacteria mycobacteria
  • leshmania malaria
  • Candida the causes of infectious diseases caused by viruses, bacteria, fungi or other infections, including various fungal infections, can be treated by using the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention is effective in places where it is generally suggested that the immune system is increased, that is, in the treatment of cancer.
  • the proteins of the present invention are also believed to be effective in treating allergic reactions and conditions such as asthma and other respiratory diseases. I want immunosuppression It is believed that other conditions (including, for example, asthma and related respiratory diseases) can be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention may be used, for example, for inflammatory bowel disease such as septic shock or systemic inflammatory response syndrome (SIRS), Crohn's disease, or TNF such as the effect demonstrated by IL-11. It may also suppress chronic or acute inflammation associated with infections resulting from overproduction of cysteine-ins such as IL-1 and IL-1.
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • TNF TNF
  • cysteine-ins such as IL-1 and IL-1.
  • the protein of the present invention is expected to be effective in controlling hematopoietic cells and, correspondingly, in treating myeloid or lymphoid cells deficiency. Even weak bioactivity with the help of colony forming cells or factor-dependent cell lines suggests that they may be involved in the control of hematopoietic cells.
  • the biological activity relates to one or all of the following examples.
  • erythroid progenitors alone, or in combination with other cytokins, and suggests their efficacy, such as treating various anemias, or producing erythroid progenitors and / or erythrocytes Stimulating radiation therapy Used in combination with Z chemotherapy; supports the growth and proliferation of myeloid cells, such as granulocytes and monocytes macrophages (ie, classical CSF activity), to prevent myelosuppression associated with chemotherapy Combination with chemotherapy; during platelet transfusion to support the growth and proliferation of megakaryocytes and the subsequent growth and proliferation of platelets, thereby preventing and treating various platelet disorders such as thrombocytopenia; Complementary general use; growth and expansion of hematopoietic stem cells that can mature into some or all of the above hematopoietic cells Support, slave connection, (but not limited to, aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, something as commonly treated with transplantation) various stem cell disorders therapeutic effect on And either
  • the protein of the present invention can be measured by the following method, among other methods.
  • the proteins of the present invention are believed to be used in any of bone, cartilage, tendons, ligaments, and nerve tissue growth or regeneration, as well as wound healing and tissue repair, and treatment of burns, incisions, and ulcers. Can be
  • Proteins of the invention that induce cartilage and / or bone or any growth in an environment that does not form bone normally have application in the healing of fractures and cartilage damage or defects in humans and other animals. It is thought that the preparation using the protein of the present invention can be used for reduction of closed fracture as well as open fracture, improvement of fixation of artificial joint, and prevention. New bone formation induced by osteogenic agents contributes to the restoration of craniofacial defects induced by congenital, traumatic, carcinomactomy. It is also effective in the field of cosmetic plastic surgery.
  • the proteins of the present invention are also believed to be used in the treatment of periodontosis and other dental restorations. Such drugs are thought to provide an environment that attracts osteogenic cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate.
  • the protein of the present invention provides osteoporosis by stimulating the repair of bone and / or cartilage or any of them, or by inhibiting the process of inflammation or tissue destruction (collagenase activity or osteoclast activity) mediated by the inflammatory process. It is considered effective for the treatment of osteoarthritis.
  • tissue regeneration activity that may be attributed to the proteins of the present invention is tendon z Ligament formation.
  • the protein of the present invention induces such tissue formation in an environment where tendon ligament-like tissue or other tissue is not properly formed. Applicable to healing of tendon ligament disorders.
  • Formulations that use proteins that induce tendon or ligament-like tissue can be used to improve the fixation of tendon Z ligaments to bone or other tissues and to repair tendon / ligament tissue defects, as well as tendons or ligaments Preventive use may be considered to protect against damage.
  • Neotendon ligament-like tissue formation induced by the compositions of the present invention contributes to the repair of congenital, traumatic, or tendon or ligament defects of other origin. It is also effective in cosmetic plastic surgery in which tendons or ligaments are attached or repaired.
  • the constructs of the present invention provide an environment that attracts the tendon ligament forming cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate. Alternatively, they induce tendon ligament cells or their progenitor cells ex vivo to prepare for in vivo reversion to achieve tissue repair.
  • the compositions of the present invention are also effective in treating tendinitis, Carpal tunnel syndrome, and other tendon or ligament defects.
  • the compositions also include sequestering agents well known to those skilled in the art, as well as suitable matrices and carriers.
  • the protein of the present invention may be used for the growth of nerve cells and the regeneration of nerve and brain tissue, i.e., central and central injury as well as mechanical and traumatic disorders including degeneration, death, or trauma to nerve cells or nerve tissue. It may also be effective in treating peripheral nervous system diseases and neurological diseases. Specifically, certain proteins are diseases of the peripheral nervous system, such as peripheral neuropathy, peripheral neuropathy, and focal neuropathy, and Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic laterality ), It is considered to be effective for the treatment of central nervous system diseases such as Shy-Drager 3 ⁇ 4E syndrome. Conditions that can be treated according to the present invention include spinal cord disorders Cerebrovascular diseases such as head trauma and stroke Includes mechanical and trauma disorders such as illness. Peripheral neurosis resulting from chemotherapy or other treatments can also be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention has an activity of producing other tissues such as, for example, knee, liver, intestine, kidney, skin, organs including endothelium, smooth, skeletal or cardiac muscle, and vascular tissues including vascular endothelium, or the like. It is also expected to exhibit the activity of promoting the proliferation of cells constituting such tissues. Some of the desired effects may also be mediated by the inhibition of fibrous scarring, which regenerates normal tissue.
  • the protein of the present invention is also considered to be effective for gastrointestinal tract protection or regeneration, and for treatment of conditions caused by fibrosis of lung or liver, reperfusion injury of various tissues, and systemic site force-in disorder. .
  • the protein of the present invention is considered to show activity related to activin inhibin.
  • Activin is characterized by its ability to stimulate the release of follicle-stimulating hormone (FSH)
  • inhibin is characterized by its ability to inhibit the release of follicle-stimulating hormone (FSH). Therefore, the protein of the present invention is a heterodimer alone or in a heterodimer with a member of the inhibin a family, which reduces the fertilization rate of female mammalian animals and contraception based on the activity of inhibin, which reduces spermatogenesis in males. It is believed to be effective as a modulator. Administration of a sufficient amount of other inhibin can induce infertility in mammals.
  • the protein of the present invention is a homodimer or heterodimer with other protein subunits of the inhibin b group, and is a therapeutic dimer based on the activity of an activin molecule that stimulates FSH release from cells of the pituitary gland. It is believed to be effective as a fertility inducer (see US Patent No. 4,798,885).
  • the proteins of the present invention are believed to be effective in hastening the onset of pregnancy in sexually immature mammals to extend the lifespan of livestock such as cattle, sheep and pigs. [Chemotaxis chemokinetic activity]
  • the protein of the present invention may be used as a chemokine for mammalian cells, including, for example, monocytes, neutrophils, T cells, mast cells, eosinophils, and endothelial cells, or any of them. It is thought to have sex Z chemokinetic activity. Chemotactic / chemokinetic proteins can be used to immobilize or attract the desired cell population to the desired site of the reaction. Chemotactic chemokinetic proteins offer special advantages in treating wounds and other trauma, as well as local infections. For example, attracting lymphocytes, monocytes, or neutrophils to a tumor or site of infection may result in an improved immune response to the tumor or site of infection.
  • a protein or peptide retains chemotactic activity on a particular cell population if it can directly or indirectly stimulate the indicated direction or movement of that cell population. Desirably, the protein or peptide retains the activity of directly stimulating the directed movement of the cell. Whether a particular protein retains chemotactic activity for a population of cells or not can be readily determined using such a protein or peptide in any known cell chemotaxis assay. [Coagulation and thrombotic activity]
  • proteins of the present invention also exhibit clotting or thrombotic activity. As a result, such proteins are expected to be effective in treating a variety of coagulation disorders, including hereditary disorders such as hemophilia. Alternatively, it is expected to promote clotting and other clotting events in the treatment of wounds caused by trauma, surgery or other causes. It is believed that the protein of the present invention is also effective in dissolving or inhibiting the formation of thrombus, and in treating and preventing conditions caused by thrombus or stroke.
  • receptors and ligands examples include cytokine receptors and their ligands, receptor kinases and their ligands, receptor phosphatases and their ligands, receptors involved in cell-cell interactions (Selectin), Integrins and their ligands, cell adhesion molecules including receptor kinases) and their ligands, and combinations of receptor Z ligands involved in antigen presentation, antigen recognition, and development of cellular and humoral immune responses But does not limit the invention. Receptors and ligands are also effective in screening for possible peptides or small molecules for their interaction.
  • the proteins of the present invention (including but not limited to receptor and ligand fragments) are themselves considered to be effective inhibitors of receptor noligand interactions.
  • the proteins of the present invention may exhibit one or more of the following additional activities or effects: Kills infectious substances, including bacteria, viruses, molds, and other parasites; Has the effect of suppressing or promoting physical characteristics such as height, weight, hair color, eye color, skin or other tissue pigmentation, or organ size (eg, breast gain or loss); dietary fat Has an effect on the degradation of proteins, carbohydrates, or carbohydrates; has an effect on appetite, libido, stress, cognitive (cognitive impairment), depression, violent behavioral behavioral features; has an analgesic or other pain-reducing effect.
  • Embryonic stem cell lineage other than hematopoietic lineage Promotes differentiation and growth into cells; and, in the case of enzymes, compensates for the deficiency of the enzyme and treats related disorders.
  • proteins having the above activities include: proliferation or cell death of B cells, T cells, mast cells, class-specific induction of immunoglobulin by promoting class switching, differentiation of B cells into antibody-producing cells, granulocyte precursor cells Proliferation or differentiation, cell death, monocyte / macrophage progenitor cell proliferation or differentiation, cell death, neutrophils, monocytes.
  • Macrophage eosinophil, basophil proliferation or hyperactivity, cell death, megakaryocyte precursor Cell proliferation or cell death, neutrophil precursor cell proliferation or differentiation, cell death, B or T precursor cell proliferation or differentiation, cell death, erythrocyte production promotion, erythrocyte, neutrophil, eosinophil, basophil Spheres, monocytes, macrophages, mast cells, megakaryocyte progenitor cells, neutrophils, monocytes, macrophages, B cell or T cell migration, thymocyte proliferation or cell death, Inhibition of fat cell differentiation, proliferation or cell death of natural killer cells, proliferation or cell death of hematopoietic stem cells, suppression of proliferation of stem cells and various hematopoietic progenitor cells, osteoblasts and chondrocytes from mesenchymal stem cells
  • This polypeptide alone acts to promote the differentiation or proliferation of cells, promotes cell death, or promotes bone resorption by activating osteoclasts and promoting differentiation from monocytes to osteo
  • the peptide of the present invention since the peptide of the present invention is also expected to act on the nervous system, it differentiates into various neurotransmitter-operated neurons and maintains their survival or cell death, promotes the proliferation of glial cells or cell death, Neurite outgrowth, ganglion cell survival or cell death, astrocyte proliferation or differentiation promotion or cell death, peripheral nerve proliferation or survival, cell death, Schwann cell proliferation or cell death, motor nerve proliferation or It is thought that it also has the effect of maintaining survival and cell death.
  • the polypeptide of the present invention is used in the early embryonic development process to form the epidermis, brain, spine, and nerves by ectoderm-inducing action, and to establish the dorsal ligament by mesoderm-inducing action Synthetic tissue (bones, muscles, tendons), blood cells, heart, kidney, gonad organ formation, or endoderm-inducing digestive organs (stomach, intestine, liver, kidney), respiratory system ( It is thought to have a promoting or inhibiting effect on the formation of the lungs and trachea) and also to have the effect of inhibiting the growth or growth of the above-mentioned organs in a living body.
  • the polypeptide of the present invention itself may be a disease relating to a decrease or increase in the function of the immune system or nervous system or bone metabolism, or a hypoplasia or abnormal proliferation of hematopoietic cells, such as an inflammatory disease (rheumatic disease).
  • a disease relating to a decrease or increase in the function of the immune system or nervous system or bone metabolism, or a hypoplasia or abnormal proliferation of hematopoietic cells, such as an inflammatory disease (rheumatic disease).
  • Hematopoietic stem cell depletion after bone marrow transplantation Cancer, Leukemia, platelets, B-cell or T-cell depletion after radiation or chemotherapy for leukemia, Anemia, Infectious disease, Cancer It is expected to be used as a prophylactic or therapeutic agent for leukemia, AIDS, abnormal bone metabolism (osteoporosis, etc.), various degenerative diseases (Alzheimer's disease, multiple sclerosis, etc.), or nerve damage.
  • the polypeptide of the present invention is considered to have an action of dividing or proliferating ectoderm, mesoderm, or endoderm-derived organs, the polypeptide (epidermal, bone, muscle, tendon, heart, kidney, stomach, intestine, It is also expected to be used as a tissue repair agent for liver, kidney, lung, trachea, etc.).
  • polypeptide of the present invention can be quantified in vivo by using a polypeptide monoclonal antibody or a monoclonal antibody, whereby a study on the relationship between the polypeptide and a disease or diagnosis of a disease is performed. And so on.
  • Polyclonal and monoclonal antibodies can be produced by a conventional method using the polypeptide or a fragment thereof as an antigen.
  • polypeptide of the present invention preferably, the polypeptide of the extracellular domain thereof
  • an affinity column is prepared, and a known or unknown protein (ligand) that binds to the present polypeptide is synthesized. Identification, purification or gene cloning can be performed.
  • the polypeptide of the present invention (preferably, its transmembrane region or intracellular domain).
  • the polypeptide of the present invention preferably, its transmembrane region or intracellular domain.
  • the downstream signaling gene that interacts with the polypeptide in the cytoplasm can be identified and the gene can be cloned by the yeast 2-hybrid method.
  • polypeptide of the present invention screening for the polypeptide receptor of the present invention, an antagonist, an inhibitor between a receptor and a signaling molecule, and the like can be performed.
  • the cDNA of the present invention is not only an important and essential type II for producing the polypeptide of the present invention, which is expected to have tremendous utility, but also the diagnosis and treatment of genetic diseases (such as gene deficiency). It can be used for treatment or treatment by stopping the expression of polypeptide by antisense DNA (RNA). Further, genomic DNA can be separated using the cDNA of the present invention as a probe. Similarly, it is possible to isolate a gene for a human-related polypeptide highly homologous to the cDNA of the present invention and a gene for a polypeptide highly homologous to the polypeptide of the present invention in an organism other than a mouse. It is possible.
  • the polypeptide of the present invention or an antibody against the polypeptide of the present invention is usually administered systemically or locally, generally orally or parenterally.
  • Preferred are oral administration, intravenous administration and intraventricular administration.
  • the dosage varies depending on the age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but is generally within the range of 100 to 100: 118 per adult. It is administered orally once to several times a day or parenterally once a day, several times a day, in the range of 1 Og to 100 mg per adult. It is.
  • the dose varies depending on various conditions, so that a dose smaller than the above-mentioned dose may be sufficient, or may be required outside the range.
  • the compound of the present invention When the compound of the present invention is administered, it is used as a solid composition, a liquid composition and other compositions for oral administration, an injection for parenteral administration, an external preparation, a suppository and the like.
  • Solid compositions for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like.
  • Capsules include soft capsules and hard capsules.
  • the one or more active substances may include at least one inert diluent (e.g., lactose, mannitol, dulose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polish). (Rivinyl pyrrolidone, magnesium aluminate metasilicate, etc.).
  • the composition may contain additives other than an inert diluent, such as a lubricant (eg, magnesium stearate), a disintegrant (eg, calcium cellulose glycolate), a stabilizer (eg, human serum albumin, lactose). Etc.) and solubilizing agents (arginine, aspartic acid, etc.).
  • Tablets or pills may be coated with a gastric or enteric film, such as sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, etc., if necessary. May be coated. Also included are capsules of absorbable materials such as gelatin.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs and the like, and commonly used inert diluents (eg, purified water, Ethanol etc.). Such compositions may contain, in addition to inert diluents, adjuvants such as wetting agents, suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, It may contain a fragrance and a preservative.
  • inert diluents eg, purified water, Ethanol etc.
  • Such compositions may contain, in addition to inert diluents, adjuvants such as wetting agents, suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, It may contain a fragrance and a preservative.
  • compositions for oral administration include sprays which contain one or more active substances and are formulated in a manner known per se.
  • the composition may contain, in addition to an inert diluent, a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity, an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. May be contained.
  • a stabilizer such as sodium bisulfite to provide isotonicity
  • an isotonic agent such as sodium chloride, sodium citrate or citrate. May be contained.
  • the method for producing the spray is described in detail in, for example, US Pat. Nos. 2,868,691 and 3,095,355.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • aqueous or non-aqueous solution, suspension one or more active substances is mixed with at least one inert diluent.
  • Aqueous diluents include, for example, distilled water for injection and saline.
  • non-aqueous diluent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, Polysorbate 80 (registered trademark) and the like.
  • compositions may also contain preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, stabilizers (eg, human serum albumin, lactose, etc.), solubilizing agents (eg, arginine, aspartic acid, etc.). It may contain various adjuvants.
  • NA Pyurifiche's kit mRNA Purification Kit, trade name, sold by Pharmacia
  • a plasmid of this cDNA library is prepared and transformed into the yeast Y ⁇ ⁇ 12 strain by the lithium acetate method (see Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1), and a yeast transformant not containing tributofan (T rp) is obtained. After plating on a plate of selective medium (CMD-Trp medium) and incubating at 30 for 48 hours, it is obtained using Accutran Replica Plater (trade name, sold by Schleicher & Schuell). The replica of the colony (transformant) is placed on a YPR plate using raffinose as a carbon source. Incubated for 14 days.
  • each colony that has emerged is streaked one by one again on the YPR plate and incubated at 30 for 48 hours, and then a single colony is inoculated on YPD medium and incubated at 30 for 48 hours. After incubation, the plasmid was prepared. Subsequently, PCR was performed according to a known method using two types of primers (the sense strand was a biotinylated primer) having the sequences at both ends of the pSUC2 closing site, and the insert cDNA was amplified.
  • nucleotide sequence was determined by DNA sequencing kit (Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction, trade name, Applied Biosystems Inc.). Then, reading was carried out with an automatic DNA sequencer 373 (Applied Biosystems Inc.) (hereinafter, all nucleotide sequences were determined by this method).
  • Cloning of the full-length cDNA was performed using the 3 'RACE (Rapid Amplification of cDNA End) method using the Marathon cDNA Amplification Kit (trade name, sold by Clontech).
  • the origin of each clone that is, po1y (A) + RNA of human umbilical vein endothelial cell line (HUV-EC-C) was prepared.
  • a primer of 27mer upstream of the predicted translation start site ATG region ⁇ AH047-F1: 5'-GCGACACGTGG ATCCAAGATGGCGACG-3 '(SEQ ID NO: 5) was prepared, and PCR was performed with the adapter and primer attached to the kit.
  • 'C DN' which was specifically amplified to clone ⁇ 047, was fractionated by agarose gel electrophoresis, ligated into pT7Blue-2 T-Vector (trade name, sold by Novagen), transformed into Escherichia coli DH5a and plasmid was prepared.
  • nucleotide sequence on the 5 ′ side was determined to confirm that the nucleotide sequence of OAH047 SST cDNA was present. Then, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained. Furthermore, the open reading frame was determined and translated into amino acids to obtain the sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2.
  • clone OAH047 region between amino acid sequences 12 to 642 of SEQ ID NO: 1
  • yeast 'end endomembrane protein' yeast endomembrane protein, Genbank Accession U53880
  • clone OAH047 is expected to function as a transposon for the transport of hormones or equivalent molecules from cell membranes to lysosomes.

Description

明 现 曞 新芏なポリペプチド、 そのポリペプチドをコヌドする c D NA、 およびその甚途 技術分野
本発明は、 新芏なポリペプチド、 その補造方法、 そのポリペプチドをコヌ ドする c D N A、 その c D NAからなるベクタヌ、 そのベクタヌで圢質転換 された宿䞻现胞、 そのポリペプチドの抗䜓、 およびそのペプチドたたは抗䜓 を含有する薬孊的組成物に関する。 背景技術
埓来、 ある特定のポリペプチドたたはそれをコヌドする c D NAを埗よう ずする堎合、 組織や现胞培逊液䞭に目的ずする生物掻性を確認し、 次いでポ リペプチドの単離粟補を経お、 遺䌝子をクロヌニングするずいう方法、 ある いはその生物掻性を指暙ずしお遺䌝子を発珟クロヌニングする方法が䞀般的 に甚いられおきた。 しかし、 生䜓内生理掻性ポリペプチドは、 倚様な生物掻 性を有しおいる堎合が倚いので、 あるひず぀の掻性を指暙にしお遺䌝子をク ロヌニングした結果、 それが既知のポリペプチドず同䞀であるこずが埌にな ぀お刀明するずいう事䟋が増えおいる。 たた、 埮量しか産生されなかったり、 特別な生理的条件でのみ発珟する因子も倚く、 そのこずが単離、 粟補および 生物掻性の確認を困難なものずしおいる。
近幎、 c D NAの䜜補技術やシヌクェンス技術は急速に発展し、 倧量の c D NAのシヌクェンスを迅速に行うこずができるようになった。 そこでこれ らの技術を利甚しお、様々な现胞や組織から c D NAラむブラリヌを䜜補し、 ランダムに c D N Aをクロヌニングしお塩基配列を決定し、 新芏なポリぺプ チドをコヌドする遺䌝子を単離する方法が発展しおいる。 この方法は、 生化 孊的、 遺䌝孊的な解析を䞀切必芁ずせずに遺䌝子をクロ䞀ニングし、 その塩 基配列の情報を埗るこずができるずいう特城を有しおいるが、 目的ずする遺 䌝子の発芋は偶発的芁玠が倧きい。 発明の開瀺
本発明者らは、 これたで造血系や免疫系で働く増殖分化因子の遺䌝子のク ロヌニングを研究しおきた。 そしお、 増殖分化因子 䟋えば、 各皮サむトカ むン等 のような分泌蛋癜質やそのレセプ倕䞀のような膜蛋癜質 以䞋、 こ れらをたずめお分泌蛋癜質等ず呌ぶ。  の倧郚分がその N末端にシグナルべ プチドず呌ばれる配列を有しおいるこずに着目しお、 シグナルべプチドをコ —ドする遺䌝子を効率的か぀遞択的にクロヌニングする方法を鋭意怜蚎した。 その結果、 動物现胞を甚いお、 シグナルペプチドの有無を簡単に怜玢できる 方法 シグナルシヌクェンストラップ S S T) 法 を芋出した 欧州特蚱 公開第 0607054号参照 。 さらに同じ抂念のもずに、 酵母を甚いおさらに倧 量か぀簡䟿にシグナルペプチドをコヌドする遺䌝子を単離する方法 酵母 S S T法 も開発された 米囜特蚱第 5,536,637号参照 。
本方法を甚いお、 治療、 蚺断、 あるいは研究䞊有益な新芏な因子 ポリべ プチド 、 特に分泌シグナルを有する分泌蛋癜質および膜蛋癜質に着目しお それを芋出すべく、 鋭意怜蚎を行った。 その結果、 倚皮倚様な分泌蛋癜およ び膜蛋癜を産生しおいるず予想される现胞株および組織、 䟋えばヒト胎盀、 成人の脳組織および脳組織由来の现胞株、 ヒト骚および骚髄由来の现胞株、 およびヒト臍垯静脈内皮现胞株 HUV— E C— C ) が産生しおいる新芏な 分泌蛋癜質あるいは膜蛋癜質、 およびそれをコヌドする c D N Aを芋出すこ ずに成功し、 本発明を完成した。
本発明が提䟛する c D N A配列は、 クロヌン OAH 0 4 7ずしお同定され、 䞊蚘酵母 S ST法を䜿甚しお埗た情報を基にヒト臍垯静脈内皮现胞株 HU V-EC-C) から䜜補した cDNAラむブラリ䞀より単離された。 クロ䞀 ン OAH047は膜蛋癜質 ここでは OAH047蛋癜ずしお衚される。  をコヌドする完党な c DNA配列を含む党長鎖 c DNAである。
栞酞配列デヌ倕ベヌスに登録されおいる既知の栞酞配列に察しお BLAS TNおよび FAS T Aにより、 たたアミノ酞配列デヌタベヌスに登録されお いる既知のポリペプチドのアミノ酞配列に察しお B LAS TX、 BLAST Pおよび FAS TAにより怜玢した結果、 本発明のポリペプチド O AH 04 7およびそれぞれをコヌドする栞酞配列ず䞀臎する配列はなかった。 さらに 埗られたアミノ酞配列の疎氎性プロットによる解析から本発明のポリべプチ ドは膜貫通領域を持぀こずが予想された。 これらのこずから、 本発明のポリ ペプチド OAH047は新芏の膜蛋癜質であるこずが刀明した。
本発明は、
( 1 ) 配列番号 1で瀺されるアミノ酞配列からなるポリぺプチド、
(2) 前蚘 1) に蚘茉したポリペプチドをコヌドする cDNA、
(3) 配列番号 2で瀺される塩基配列を有する cDNA、
(4) 配列番号 3で瀺される塩基配列を有する cDNA、
に関する。 発明の詳现な説明
本発明は、 実質的に玔粋な圢である配列番号 1で瀺されるアミノ酞配列か らなるポリペプチド、 そのホモロヌグ、 その配列のフラグメントおよびその ホモロヌグに関する。
本発明はさらにそれらのポリペプチドをコヌドする c DNAに関する。 よ り具䜓的には、 配列番号 2で瀺される塩基配列を有する cDNA、 および配 列番号 2たたは 3で瀺される塩基配列に遞択的にハむプリダむズするフラグ メントを有する cDNAに関する。 ハむブリダィズする cDNAには、 䞊蚘 配^ ijの盞補配列も含たれる。
実質的に玔粋な圢である配列番号 1で瀺されるアミノ酞配列を有するポリ ペプチドずは、 䞀般に、 生産時のポリペプチドの 90%以䞊、 䟋えば、 95、 98たたは 99 %が配列番号 1で瀺されるアミノ酞配列を有するポリべプチ ドであるこずを意味する。
配列番号 1で瀺されるアミノ酞配列からなるポリペプチドのホモロヌグず は、 䞀般に少なくずも 20個、 奜たしくは少なくずも 30個、 䟋えば 40、 60たたは 100個の連続したアミノ酞領域で、 少なくずも 70%、 奜たし くは少なくずも 80たたは 90 %、 より奜たしくは 95%以䞊盞同性である ものであり、 そのようなホモロヌグは、 以埌本発明のポリペプチドずしお蚘 茉される。
さらに、 配列番号 1で瀺されるァミノ酞配列からなるポリペプチドのフラ グメント、 たたはそれらのホモロヌグのフラグメントずは、 少なくずも 10 アミノ酞、 奜たしくは少なくずも 15アミノ酞、 䟋えば 20、 25、 30、 40、 50たたは 60アミノ酞郚分を意味する。
配列番号 2たたは 3で瀺される塩基配列を有する c DN Aに遞択的にハむ ブリダィズする cDNAずは、 䞀般に、 少なくずも 20個、 奜たしくは少な くずも 30個、 䟋えば 40、 60たたは 100個の連続した塩基配列領域で、 少なくずも 70%、 奜たしくは少なくずも 80たたは 90%、 より奜たしく は 95 %以䞊盞同性であるものであり、 そのような cDNAは、 以埌本発明 の c DN Aずしお蚘茉される。
配列番号 2たたは 3で瀺される塩基配列を有する cDNAのフラグメント ずは、 少なくずも 10塩基、 奜たしくは少なくずも 15塩基、 䟋えば 20、 25、 30たたは 40塩基郚分を意味し、 そのようなフラグメントも本発明 の c DNAに含たれる。 さらに、 本発明には、 本発明の c D N Aからなる耇補たたは発珟べクタ䞀 が含たれる。 ベクタヌずしおは、 䟋えば、 o r i領域ず、 必芁により䞊蚘 c D N Aの発珟のためのプロモ タ䞀、 プロモヌタヌの制埡因子などからなる プラスミド、 りィルスたたはファヌゞベクタ䞀が挙げられる。 ベクタヌはひ ず぀たたはそれ以䞊の遞択的マヌカヌ遺䌝子、 䟋えばアンピシリン耐性遺䌝 子を含んでいおもよい。 ベクタヌは、 むン 'ビトロ in vitro) においお、 䟋 えば c D NAに察応する R N Aの補造、 宿䞻现胞の圢質転換に甚いるこずが できる。
さらに、 本発明には、 配列番号 2たたは 3で瀺される塩基配列、 たたはそ れらのオヌプンリヌディングフレヌムを有する c D N Aを含む本発明の c D NAを耇補たたは発珟させるためのベクタヌで圢質転換された宿䞻现胞も含 たれる。 现胞ずしおは、 䟋えば现菌、 酵母、 昆虫现胞たたは哺乳動物现胞が 挙げられる。
さらに、 本発明には、 本発明のポリペプチドを発珟させるための条件䞋で、 本発明の宿䞻现胞を培逊するこずからなる本発明のポリペプチドの補造方法 も含たれる。 培逊は、 本発明のポリペプチドが発珟し、 宿䞻现胞より補造さ れる条件䞋で行われるこずが奜たしい。
本発明の c D NAは、 䞊蚘のようなベクタ䞀のアンチセンス領域に挿入す るこずでアンチセンス R N Aを補造するこずもできる。 このようなアンチセ ンス R NAは、 现胞䞭の本発明のポリペプチドのレベルを制埡するこずに甚 いるこずもできる。
本発明は、 本発明におけるポリぺプチドのモノクロヌナルたたはポリク口 —ナル抗䜓も含む。 さらに本発明におけるポリペプチドのモノクロヌナルた たはポリクロヌナル抗䜓の補造方法も含む。 モノクロヌナル抗䜓は、 本発明 のペプチドたたは、 その断片を抗原ずしお甚い、 通垞のハむプリドヌマの技 術により補造するこずができる。 ポリクロヌナル抗䜓は、 宿䞻動物 䟋えば、 ラットやゥサギ等 に本発明のポリペプチドを接皮し、 免疫血枅を回収する、 通垞の方法により補造するこずができる。
本発明には、 本発明のポリペプチド、 その抗䜓ず薬孊的に蚱容される賊圢 剀および Zたたは担䜓を含有する薬孊的組成物も含たれる。
(1) の本発明のポリペプチドずしおは、 配列番号 1で瀺されたアミノ酞 配列を有するもの以倖に、 その䞀郚が欠損したもの 䟋えば、 配列番号 1䞭、 生物掻性の発珟に必須な郚分だけからなるポリペプチド等 、 本発明のポリ ペプチドが他のアミノ酞ず眮換したもの 䟋えば、 物性の類䌌したアミノ酞 に眮換したもの 、 およびその䞀郚に他のアミノ酞が付加たたは挿入された ものも含たれる。
よく知られおいるように、 ひず぀のアミノ酞をコヌドするコドンは 1〜6 皮類 䟋えば、 Me tは 1皮類、 L euは 6皮類 知られおいる。 埓っお、 ポリペプチドのアミノ酞配列を倉えるこずなく c DNAの塩基配列を倉える こずができる。
(2) で特定される本発明の c DN Aには、 1) の配列番号 1で瀺され るポリペプチドをコヌドするすべおの塩基配列矀が含たれる。 塩基配列を倉 えるこずによっお、 ポリべプチドの生産性が向䞊するこずがある。
(3) で特定される cDNAは、 2) で瀺される c DNAの䞀態様であ り、 倩然型配列を衚わす。
(4) に瀺される cDNAは、 3) で特定される c D N Aに倩然の非翻 蚳郚分を加えた配列を瀺す。
配列番号 3で瀺される塩基配列を有する cDNAの䜜補は、 以䞋の方法に 埓っお行われる。
はじめに酵母 S ST法米囜特蚱第 5,536,637号に蚘茉 の抂芁に぀いお説 明する。
サッカロミセス *セレビシェ Saccharomvces cerevisiae) などの酵母が、ショ 糖たたはラフむノヌスを゚ネルギヌ源や炭玠源ずしお利甚するためにはィン ベル倕䞀れを培地䞭に分泌しなければならない むンベル倕ヌれはラフィノ ヌスをショ糖ずメリビオヌスに、 ショ糖をフルクト䞀スずグルコヌスに分解 する酵玠である。  。 たた数倚くの既知の哺乳類のシグナルペプチドは酵母 のむンベル倕䞀れを分泌させうるこずが知られおいる。 これらの知芋から、 酵母のィンベル倕ヌれの分泌を可胜にする新芏のシグナルべプチドを哺乳類 の cDNAラむブラリ䞀からラフィノヌス培地䞊での酵母の生育を指暙にス クリヌニングする方法ずしお本方法は開発された。 翻蚳開始点 ATGを削陀 した非分泌型のむンベル倕ヌれ遺䌝子 S UC'2 (GENBANK accession No.V01311)を酵母の発珟ベクタヌ [発珟甚プロモヌタヌ ADHプロモヌ倕 ―) およびタヌミネヌタ䞀 ADHタヌミネヌタ䞀 は AAH5プラスミド (Gammerer, Methods in Enzymol.101,192-201,1983) 由来で、 酵母耇補起点は 2 o r i、 酵母遞択マヌカ䞀には TRP 1、 倧腞菌耇補起点は C o 1 E 1 o r i、 倧腞菌薬剀耐性マヌカヌにはアンピシリンが䜿甚されおいる。 ] に 組み蟌んで酵母 S ST甚ベクタヌ p SUC 2を䜜補した。 その SUC 2遺䌝 子の䞊流に哺乳類の c DN Aを組み蟌んで、酵母 SST cDNAラむブラリ 䞀を調補した。 このラむブラリ䞀を分泌型むンベルタ䞀れを欠損しおいる酵 母に圢質転換した。 組み蟌たれた哺乳類 cDNAがシグナルペプチドをコ䞀 ドしおいる堎合、 酵母で発珟されたむンベル倕ヌれに察しおも分泌䜜甚をも ぀ず考えられ、 その結果ラフむノヌス培地䞊での生育が可胜ずなる。 よっお 出珟したコロニヌから酵母を培逊しおプラスミドを調補し、 むンサヌト cD N Aの塩基配列を決定するこずによっお、 新芏シグナルペプチドの怜玢を迅 速か぀容易にした。
酵母 SST c DN Aラむブラリヌの䜜補は
(1) 察象ずなる现胞より mRNAを単離し、 特定の制限酵玠 酵玠 I ) サむトを連結したランダムプラむマ䞀を甚いお二本鎖 c DNAを合成し、 (2) 酵玠 Iずは異なる特定の制限酵玠 酵玠 Π) サむトを含むアダプタ 䞀を連結しお、 酵玠 Iで消化した埌、 適圓なサむズで分画し、
( 3 ) 酵母発珟べクタ䞀内のシダナルぺプチドを削陀したむンベル倕䞀れ 遺䌝子の䞊流に埗られた cDN A断片を連結し、圢質転換する工皋よりなる。 各工皋を詳しく説明するず、 工皋 1) では、 察象ずなる哺乳類の臓噚や 现胞株などより、 必芁により適圓な刺激剀で刺激した埌、 公知の方法以䞋、 公知の方法は特に蚘茉がなければ Molecular Cloning (Sambrook, J. Fritsch, E. F. および Maniatis, T.著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989幎に発 å¹²1 J) たは Current Protocol in Molecular Biology (F.M.Ausubel ら線、 John Wiley&Sons,Incより発刊に蚘茉の方法である。 に埓っお mRNAの単離が 行われる。
察象ずなる现胞ずしおは、 HUV— EC— C (ヒト臍垯静脈内皮现胞株 ATCC No.CRL-1730)が挙げられる。 ランダムプラむマ䞀を甚いる二本鎖 C D N Aの合成は公知の方法により行われる。
アダプタ䞀に連結される制限酵玠 酵玠 I) サむトず次の工皋 2) で甚 いられる制限酵玠 酵玠 II) サむトは、 互いに異なるものであれば䜕を甚い おもよい。 奜たしくは、 酵玠 Iずしお Xh o I、 酵玠 IIずしおは E c oR I が甚いられる。
工皋 2) では T4DNAポリメラ䞀れで末端を平滑化し、 酵玠 IIァダプ 倕䞀を連結した埌、 酵玠 Iで消化し、 ァガロヌス電気泳動 AGE) により 300〜800 b pの c DNAを分画する。 酵玠 IIは、 前蚘したように酵玠 Iず異なるものなら䜕でもよい。
工皋 3) は、 酵母発珟甚プラスミドベクタ䞀に連結されたシグナルぺプ チドを削陀したむンベル倕䞀れの遺䌝子の䞊流に 2) で埗られた cDNA 断片を組み蟌んで倧腞菌に圢質転換する工皋である。 ここで酵母発珟甚ブラ スミドベクタヌずしおは皮々のものが知られおいるが、 䟋えば、 倧腞菌内で も機胜する YEp24などが甚いられるが、 奜適には前述したプラスミド p S U C 2が甚いられる。
圢質転換のための宿䞻倧腞菌株はすでに倚くのものが知られおおり、 奜た しくは D H 1 0 Bのコンビテントセルである。 たた圢質転換方法は公知のい ずれを甚いおもよいが、 奜たしくぱレクトロボレ䞀シペン法により行われ る。 圢質転換䜓は垞法により培逊され、 酵母 S S T甚の c D N Aラむブラリ —が埗られる。
この c D NAラむブラリ䞀は、 すべおのクロヌンが該断片を含んでいる蚳 ではないし、 たたすべおが未知の 新芏の シグナルペプチドをコヌドする 遺䌝子断片ずは限らない。 そこで、 次に該ラむブラリ䞀から未知のシグナル ぺプチドをコ䞀ドする遺䌝子断片をスクリ䞀ニングする必芁がある。
すなわち、 c D N Aラむブラリヌをむンベル倕䞀れ遺䌝子をもたない酵母 サッカロミセス 'セレビシェ Saccharomycs cerevisiae) (䟋えば Y T 4 5 5 株など たたはむンベル倕䞀れ遺䌝子を人為的に欠損させた株 公知の方法 に埓い䜜補可胜 を甚いるこずができる。 酵母の圢質転換は公知の方法、 䟋 えば酢酞リチりム法によっお行われる。 圢質転換䜓を遞択培地で生育埌、 ラ フィノヌスを炭玠源ずする培地に移し、 生育可胜なコロニヌを遞択し、 ブラ スミドを回収する。 ラフむノヌスを炭玠源ずしお酵母が生育したずいうこず は、 ラむブラリ䞀䞭に䜕らかの分泌蛋癜質のシグナルぺプチドが組み蟌たれ おいたこずを瀺しおいる。
次に、 単離した陜性クロヌンに぀いお、 塩基配列を決定し、 未知の蛋癜質 をコ䞀ドするこずが明らかになった c D NAに぀いおは、 それをプロヌブず しお党長クロヌンを単離し、 党長の塩基配列を決定するこずができる。 これ らの操䜜は、 圓業者にずっおすベお公知の方法で行われる。
配列番号 2で瀺される塩基配列が、 䞀郚、 奜たしくは党おが確定されるず 哺乳類に存圚する本発明の蛋癜質をコヌドする c D N Aもしくは本発明蛋癜 質のホモロヌグおよびサブセットをコヌドする c DNAを埗るこずができる 適圓な塩基配列を有するオリゎヌクレオチドを合成し、 それを甚いお、 哺乳 類由来の c DNAラむブラリヌあるいは mRNAから PCR法により、 ある いは適圓な塩基配列の断片をプロヌブずしおハむブリダィズさせるこずによ り、 他の哺乳類 c DN Aラむブラリヌあるいは該ゲノムラむブラリヌから、 他の哺乳類型の圓該蛋癜質をコ䞀ドする c DN Aを埗るこずができる。
このようにしお埗られた c DN Aが、 S STで埗られた c DNA断片の塩 基配列 たたはその盞同配列 を含んでいるならばシグナルペプチドをコヌ ドしおいるこずになるので、 該 cDNAが党長、 たたはほが党長であるこず は明らかである。 シグナルペプチドは䟋倖なく蛋癜質の N末端に存圚する こずから、 c DN Aのオヌプンリヌディングフレヌムの 5'末端にコヌドされ おいる。 
さらに公知の方法に埓い、 該 c DNAをプロヌブずしおノザンNorthern) 解析によっお党長の確認しおもよい。 ハむブリダィズしたバンドから埗られ る mRNAのサむズず該 c DNAのサむズを比范し、 ほが同じであれば該 c DNAはほが党長であるず考えられる。
配列番号 2で瀺される塩基配列が䞀旊確定されるず、 その埌は、 化孊合成 によっお、 あるいは該塩基配列の断片を化孊合成し、 これをプロヌブずしお ハむプリダむズさせるこずにより、 本発明の c D N Aを埗るこずができる。 さらに、 本 c DNAを含有するベクタヌ c DNAを適圓な宿䞻に導入し、 こ れを増殖させるこずによっお、 目的ずする c DNAを必芁量埗るこずができ る。
本発明のポリぺプチドを取埗する方法ずしおは、
(1) 生䜓たたは培逊现胞から粟補単離する方法、
(2) ペプチド合成する方法、 たたは
(3) 遺䌝子組み換え技術を甚いお生産する方法、 などが挙げられるが、 工業的には 3) に蚘茉した方法が奜たしい。
遺䌝子組み換え技術を甚いおポリペプチドを生産するための発珟系 宿䞻 䞀ベクタヌ系 ずしおは、 䟋えば、 现菌、 酵母、 昆虫现胞および哺乳動物现 胞の発珟系が挙げられる。
䟋えば、 倧腞菌で発珟させる堎合には、 成熟蛋癜郚分をコヌドする cDN Aの 5'末端に開始コドン ATG) を付加し、 埗られた cDNAを、 適圓な プロモ䞀倕䞀 䟋えば、 t r pプロモ䞀倕䞀、 l a cプロモヌ倕䞀、 APL プロモヌ倕䞀、 T 7プロモヌタヌ等 の䞋流に接続し、 倧腞菌内で機胜する ベクタ䞀 䟋えば、 pBR322、 pUC 18、 pUC 19等 に挿入しお 発珟べクタ䞀を䜜補する。
次に、 この発珟ベクタヌで圢質転換した倧腞菌 䟋えば、 E.Coli DH1、 E. Coli JMl 09、 E. Coli HB 101株等 を適圓な培地で培逊しお、 その 菌䜓より目的ずするポリペプチドを埗るこずができる。 たた、 バクテリアの シグナルペプチド 䟋えば、 p e I Bのシグナルペプチド を利甚すれば、 ペリブラズム䞭に目的ずするポリペプチドを分泌するこずもできる。さらに、 他のポリペプチドずのフュヌゞョン ·プロティン fusion protein) を生産する こずもできる。
たた、 哺乳動物现胞で発珟させる堎合には、 䟋えば、 配列番号 3で瀺され る塩基配列をコヌドする c DNAを適圓なベクタ䞀 䟋えば、 レトロりィル スベクタ䞀、 パピ口䞀マりィルスベクタ䞀、 ワクシニアりィルスベクタ䞀、 SV40系べクタ䞀等 䞭の適圓なプロモヌタ䞀 䟋えば、 SV40プロモ 䞀倕䞀、 LTRプロモヌ倕䞀、 メタ口チォネむンプロモヌタヌ等 の䞋流に 挿入しお発珟ベクタヌを䜜補する。 次に、 埗られた発珟ベクタヌで適圓な哺 乳動物现胞 䟋えば サル COS— 7现胞、 チャむニヌズハムスタヌ CHO 现胞、 マりス L现胞等 を圢質転換し、 圢質転換䜓を適圓な培地で培逊する こずによっお、 本発明の蛋癜が分泌蛋癜の堎合ず膜蛋癜の堎合で、 次のよう に発珟される。
本発明の蛋癜が分泌蛋癜の堎合、 その现胞䞊枅䞭に目的ずするポリべプチ ドが発珟される。 さらに、その他のポリペプチド、䟋えば抗䜓の定垞領域Fc portion)をコヌドする c D N A断片ず連結するこずによっお、フュヌゞョン · プロテむン fusion protein) を生産するこずもできる。
䞀方、 本発明の蛋癜が膜蛋癜の堎合、 その现胞膜䞊に目的ずするポリぺプ チドが発珟される。 たた配列番号 3で瀺される塩基配列をコヌドする c D N Aの膜貫通領域を欠いた欠倱䜓を䞊蚘べクタ䞀に挿入し、 これを甚いお適圓 な哺乳類動物现胞を圢質転換するこずによっお、 その培逊液䞭に目的ずする 可溶性ポリペプチドが分泌される。 さらにその膜貫通領域を欠いた欠倱䜓を コ䞀ドする c D N A断片ずその他のポリべプチド、䟋えば抗䜓の定垞領域Fc portion)をコヌドする c D N A断片を連結するこずによっお、フュヌゞョン · プロテむン fusion protein) を生産するこずもできる。
以䞊のようにしお埗られたポリペプチドは、 䞀般的な生化孊的方法によっお 単離粟補するこずができる。 産業䞊の利甚の可胜性
本発明のポリべプチドおよびそれをコ䞀ドする c D N Aは、 䞀぀あるいは それ以䞊の効果あるいは生物掻性 以䞋に列挙するアツセィに関連するもの を含む。  を瀺すこずが考えられる。 本発明の蛋癜に関しお蚘述される効果 あるいは生物掻性は、 その蛋癜の投䞎あるいは䜿甚により、 あるいはその蛋 癜をコヌドする c D N Aの投䞎あるいは䜿甚 䟋えば、 遺䌝子療法や c D N A導入に適したベクタヌ により、 提䟛される。
[サむトカむン掻性および现胞増殖ノ分化掻性]
本発明の蛋癜は、 サむト力むン掻性および现胞増殖 誘導あるいは阻害 ノ分化掻性 誘導あるいは阻害 を瀺す可胜性、 あるいはある现胞集団に他 のサむトカむンの産生を誘導あるいは抑制するず考えられる。 党おの既知の サむト力むンを含む、 珟圚発芋されおいる倚くの蛋癜性因子は、 因子に䟝存 した䞀぀あるいはそれ以䞊の现胞増殖アツセィ法で、掻性を瀺しおきたので、 それらのアツセィは、 サむト力むン掻性の䟿利な確認法ずしお機胜する。 本 発明の蛋癜の掻性は、 倚くの埓来の因子䟝存性の现胞株の现胞増殖アツセィ のうちのいずれかによ぀お蚌明され埗る。
[免疫刺激/抑制掻性]
本発明の蛋癜は、 免疫刺激掻性および免疫抑制掻性も瀺すず考えられる。 たた、 ある蛋癜は、 䟋えば、 Tリンパ球および Bリンパ球あるいはどちらか 䞀方の成長および増殖を制埡 刺激あるいは抑制 するこずや、 同様に NK 现胞や他の集団の现胞傷害性掻性に圱響を䞎えるこずによっお、 様々な免疫 䞪党および 患、 (severe combined immunodeficiency ( S C I D) を含む。 ) の 治療に効果を瀺すず考えられる。 これらの免疫䞍党は遺䌝性である堎合もあ るし、 䟋えば゚むズ H I V) のようなりィルスや、 同様に现菌や力ビの感 染が原因で起こる堎合もある。 あるいは、 自己免疫疟患から由来する可胜性 もある。 より具䜓的には、 ゚むズH I V) 、肝炎りィルス hepatitis viruses) 、 ぞレぺスゥむリレス herpes viruses) 、 マむコバクテリア mycobacteria) 、 リ シュ䞀マニア leshmania) 、 マラリア malaria) およびカンゞダ Candida) のような様々なカビ感染を含む、 りィルス、 现菌、 カビあるいは他の感染に よる感染症の原因を、 本発明の蛋癜を甚いるこずによっお治療できるず考え られる。 もちろん、 この関連より、 本発明の蛋癜は、 免疫システムが増倧し おいるこずが䞀般的に瀺唆される堎所、 すなわち癌治療の箇所においお効果 を瀺すず考えられる。
本発明の蛋癜は、 アレルギヌ反応および喘息や他の呌吞噚系疟患のような 状況の治療に効果にも効果を瀺すず考えられる。 免疫抑制が望たれるような 他の状態 䟋えば、 喘息や関連呌吞噚疟患を含む。  にも、 本発明の蛋癜を 甩いお治療できるず考えられる。
本発明の蛋癜は、 䟋えば、 敗血病性のショックあるいは党身性炎症反応症 候矀 S I R S ) のような炎症性倧腞炎、 クロヌン病、 あるいは I L— 1 1 により蚌明された効果のような T N Fや I L— 1のようなサむ 力むンの過 剰産生から由来するような感染に関連した慢性あるいは急性の炎症を抑制す る可胜性もある。
[造血现胞制埡掻性]
本発明の蛋癜は、 造血现胞の制埡に、 たたそれに応じお骚髄球様现胞ある いはリンパ球様现胞の欠乏に察する治療にも効果を瀺すず考えられる。 コロ ニヌ圢成现胞あるいは因子䟝存性现胞株の揎助の䞋での極く匱い生物掻性で さえも、 造血现胞の制埡に係わるこずを瀺唆する。 その生物掻性ずは、 次に 挙げる䟋の党おあるいはそのいずれかで䟋えられるようなものに係わるもの である。 赀血球前駆现胞のみの成長および増殖を支持、 あるいは他のサむト 力むンずの組み合わせ、 たた、 それが瀺唆する有効性、 䟋えば様々な貧血の 治療、 あるいは赀血球前駆现胞および赀血球あるいはそのどちらかの産生を 刺激する攟射線療法 Z化孊療法ず組み合わせおの䜿甚顆粒球および単球 マクロファヌゞのような骚髄球の成長および増殖を支持 すなわち、 叀兞的 な C S F掻性 、 化孊療法に䌎う骚髄抑制を防ぐための化孊療法ずの䜵甚 巚栞球の成長および増殖およびそれに続く血小板の成長および増殖の支持、 それによ぀お血小板枛少症のような様々な血小板障害を防埡および治療を可 胜ずする血小板茞血の際あるいは盞補的に䞀般的䜿甚䞊蚘造血现胞の幟぀ かあるいは党おの现胞ぞ成熟可胜な造血幹现胞の成長および増殖の支持、 埓 ぀お、 様々な幹现胞障害 限定はされないが、 再生䞍良性貧血および発䜜性 倜間血色玠尿症を含む、 移怍で䞀般的に治療されるようなもの に治療的効 果を瀺し、 たた、 正垞现胞あるいは遺䌝子療法のため遺䌝的に操䜜された现 胞をむン · ビトロ in-vitro) あるいはェクス ·ビポ ex-vivo) (すなわち、 骚髄移怍に䌎う。 ) どちらかで、 攟射線療法 Z化孊療法埌の幹现胞分画の再 構築を行うこずも同様である。
本発明の蛋癜は、 他の方法の䞭で、 以䞋の方法により枬定するこずが可胜 である。
[組織生成 Z修埩掻性]
本発明の蛋癜は、 損傷治癒および組織修埩、 たた、 火傷、 切開、 および朰 瘍の治療ず同様に、 骚、 軟骚、 腱、 靭垯、 および神経組織成長あるいは再生 のいずれかに䜿甚されるず考えられる。
骚を正垞に圢成しない環境での軟骚および骚あるいはいずれかの成長を誘 導するような本発明の蛋癜は、 ヒトおよび他の動物の骚折および軟骚損傷あ るいは欠損の治癒に適甚される。 本発明の蛋癜を䜿甚しおいる補剀は、 開攟 骚折ず同様に閉鎖骚折の敎埩、 たた人工関節の固定の改良にも、 予防にも䜿 甚できるず考えられる。 骚圢成剀により誘導された新生骚圢成は、 先倩性、 倖傷性、 癌切陀術により誘発した頭蓋顔面の欠損の修埩に貢献する。 たた、 矎容圢成倖科分野にも有効である。
本発明の蛋癜は、 歯根膜症の治療および他の歯の修埩にも䜿甚されるず考 えられる。 そのような薬品は、 骚圢成现胞を匕き寄せ、 その现胞の増殖を刺 激し、 その前駆现胞の分化を誘導する環境を提䟛するず考えられる。 本発明 の蛋癜は、 骚および軟骚あるいはいずれかの修埩を刺激するこずを通しお、 あるいは、 炎症あるいは炎症過皋で介される組織砎壊 コラゲナヌれ掻性や 砎骚现胞の掻性 の過皋を阻止すこずにより、 骚粗鬆症および骚関節炎の治 療に有効ず考えられる。
本発明の蛋癜に起因するず考えられる組織再生掻性の別のカテゎリ䞀は腱 z靭垯圢成である。 本発明の蛋癜は、 腱 靭垯様組織あるいは他の組織が正 垞に圢成されない環境でそのような組織圢成を誘導するものであるが、 ヒト および他の動物における腱 Z靭垯の裂傷、 奇圢、 および他の腱 靭垯の障害 の治癒に適甚できる。腱ノ靭垯様組織を誘導する蛋癜を䜿甚しおいる補剀は、 骚あるいは他の組織ぞの腱 Z靭垯の固定の改良、 および腱/靭垯組織の欠損 の修埩での䜿甚はもちろん、 腱あるいは靭垯の損傷の防埡に察しお予防的䜿 甚も考えられる。 本発明の構成物により誘導された新生腱 靭垯様組織圢成 は、 先倩性、 倖傷、 あるいは他の起源の腱あるいは靭垯欠損の修埩に貢献す る。 たた、 腱あるいは靭垯の貌付あるいは修埩ずいう矎容圢成倖科でも有効 である。 本発明の構成物は、 腱ノ靭垯圢成现胞を匕き寄せ、 その现胞の増殖 を刺激し、 その前駆现胞の分化を誘導する環境を提䟛するず考えられる。 あ るいは、 組織修埩を果たすためむン ·ビポ in vivo) ぞの返還に備えおェク ス ·ビポ ex vivo) で腱 靭垯现胞あるいはその前駆现胞を誘導する。 本発 明の構成物は、 腱炎、 手根トンネル症候矀 Carpal tunnel syndrome) 、 および 他の腱あるいは靭垯欠損の治療にも有効である。 該構成物には、 適圓なマト リックスおよびキャリアヌず同様に圓業者に良く知られおいるシヌク゚ス倕 リング Sequestering) 剀も含たれる。 - 本発明の蛋癜は、 神経现胞の増殖、 および、 神経および脳組織の再生、 す なわち、 神経现胞あるいは神経組織に察する倉性、 死、 あるいは倖傷を含む 機械的および倖傷的障害ず同様に䞭枢および末梢神経系疟患および神経病の 治療に察しおも、 効果を瀺すず考えられる。 具䜓的には、 ある蛋癜は、 末梢 神経障害、 末梢神経症、 および局所的神経症のような末梢神経系の疟患、 お よびアルツハむマヌ病、 パヌキン゜ン病、 ハンチントン病、 筋萎瞮性偎策症 amyotropic lateral) 、 およひンャィ · ドレ䞀刀䞀 (Shy-Drager ŸE候矀のよ うな䞭枢神経系の疟患の治療に有効であるず考えられる。 曎に本発明に応じ お治療され埗る条件には、 脊髄障害、 頭郚倖傷、 および脳卒䞭等の脳血管疟 患のような機械的および倖傷的障害を含む。 化孊療法あるいは他の治療から 起因する末梢神経症も本発明の蛋癜を甚いお治療可胜である。
本発明の蛋癜は、 䟋えば膝臓、 肝臓、 腞、 腎臓、 皮膚、 内皮を含む臓噚、 平滑、 骚栌あるいは心臓筋肉、 および血管内皮を含む血管組織のような他の 組織を生成する掻性、 あるいはそのような組織を構成する现胞の増殖を促進 する掻性を瀺す可胜性も期埅される。 望たれる効果の䞀郚は、 正垞組織を再 生させる繊維性瘢痕 scarring) の阻害によっおも担われるず考えられる。 本発明の蛋癜は、 消化管保護あるいは再生、 および肺あるいは肝臓の繊維 化、 様々な組織の再還流損傷、 および党身性サむト力むン障害に起因する状 態に察する治療にも有効であるず考えられる。
[ァクチビン Zむンヒビン掻性]
本発明の蛋癜は、 ァクチビン むンヒビンに関連した掻性を瀺すず考えら れる。 ァクチビンは濟胞刺激ホルモン F S H) の攟出を刺激する掻性によ ぀お特埵づけられるが、 むンヒビンは、 濟胞刺激ホルモン F S H) の攟出 を阻害する掻性によっお特城づけられる。 よっお、 本発明の蛋癜は、 単独あ るいはィンヒビン aファミリヌのメンバ䞀ずのぞテロダむマ䞀で、 哺乳類動 物の雌の受粟率を枛少させ、 雄の粟子圢成を枛少させるむンヒビンの掻性に 基づく避劊調節剀ずしお有効であるず考えられる。 充分量の他のィンヒビン の投䞎によっお、 哺乳動物の䞍劊を誘導可胜である。 䞀方、 本発明の蛋癜は、 むンヒビン bグルヌプの他の蛋癜サブュニットずのホモダむマ䞀あるいはぞ テ口ダむマヌで、 前脳䞋垂䜓の现胞から F S H攟出を刺激するァクチビン分 子の掻性に基づいた治療的な䞍劊誘導ずしお有効であるず考えられる 米囜 特蚱第 4798885号を参照。 ) 。 本発明の蛋癜は、 牛、 矊、 および豚のような 家畜の生涯出産胜力可胜な期間を延ばすために、 性的に未熟なほ乳類動物に おける劊嚠開始を早めるこずに有効であるず考えられる。 [走化性 化孊運動性掻性]
本発明の蛋癜は、 䟋えば、 単球、 奜䞭球、 T现胞、 マスト现胞、 奜酞球、 および内皮现胞、 あるいはそのいづれかを含む、 哺乳動物の现胞に察しお、 䟋えば、 ケモカむンずしお働く走化性 Z化孊運動性掻性を有するず考えられ る。 走化性/化孊運動性蛋癜は、 反応の望たれる郚䜍ぞ、 望たれる现胞集団 を固定化あるいは匕き寄せるため䜿甚されるこずが可胜である。 走化性ノ化 孊運動性蛋癜は、 局所的な感染ず同様に、 創傷および他の倖傷の治療に特別 な優䜍性を提䟛する。 䟋えば、 リンパ球、 単球、 あるいは奜䞭球を腫瘍ある いは感染郚䜍ぞ匕き寄せるこずは、 腫瘍あるいは感染郚䜍に察する.免疫応答 を改善する結果ずなるず考えられる。
蛋癜やペプチドは、 もしそれが盎接あるいは間接に特殊な现胞集団に察し お指瀺された方向あるいは運動を刺激可胜であれば、 そのような现胞集団に 察する走化性掻性を保持しおいる。 望たしくは、 その蛋癜やペプチドは、 现 胞の指瀺された運動を盎接的に刺激する掻性を保持する。 特別な蛋癜がある 集団の现胞に察し走化性掻性を保持するか吊かは、 どんな既知の现胞走化性 のアツセィ法にそのような蛋癜あるいはペプチドを䜿甚しおも容易に決定で さる。 [凝血および血栓掻性]
本発明の蛋癜は、 凝血あるいは血栓掻性も瀺すず考えられる。 結果ずしお、 そのような蛋癜は、 様々な凝固障害 血友病のような遺䌝性障害を含む。  の治療に有効であるず予期される。 あるいは、 倖傷、 手術あるいは他の原因 により生じた創傷の治療における凝固および他の凝血事象を促進させるこず が予期される。 本発明の蛋癜は、 血栓の圢成の溶解あるいは阻害、 および血 栓あるいは卒䞭等により生じる状態の治療および予防にも効果があるず考え られる。 [受容䜓ノリガンド掻性] - 本発明の蛋癜は、 受容䜓、 受容䜓ノリガンドあるいは受容䜓ノリガンドの むンヒビ倕䞀あるいはァゎニストずしおの掻性を瀺す可胜性もある。 そのよ うな受容䜓およびリガンドの䟋ずしお、 サむトカむン受容䜓およびそのリガ ンド、 受容䜓キナヌれおよびそのリガンド、 受容䜓フォスファタ䞀れおよび そのリガンド、 现胞間盞互䜜甚に関連した受容䜓 セレクチン Selectin) 、 むンテグリン Integurin) 、 およびそのリガンド、 受容䜓キナヌれを含む现胞 接着分子等 およびそのリガンド、 および抗原提瀺、 抗原認識、 および现胞 性および液性免疫反応の発達に係わる受容䜓 Zリガンドの組み合わせが挙げ られるが、 本発明を制限するものではない。 受容䜓およびリガンドは、 その 盞互䜜甚に察する可胜なペプチドあるいは小分子のむンヒビ倕䞀のスクリヌ ニングにも有効である。 本発明の蛋癜 受容䜓およびリガンドの断片を含む が、 制限されるものではない。  は、 それ自身受容䜓ノリガンドの盞互䜜甚 のむンヒビ倕䞀ずしお有効であるず考えられる。
[他の掻性]
本発明の蛋癜は、 以䞋に瀺す付加的な掻性あるいは効果の䞀぀あるいはそ れ以䞊を瀺すず考えられる 现菌、 りィルス、 カビ、 および他の寄生虫を含 む感染性の物質を殺傷する身長、 䜓重、 髪の色、 目の色、 肌あるいは他の 組織の色玠沈着、 あるいは噚官の倧きさ 䟋えば胞郚増量あるいは枛量 等、 身䜓的特城を抑制するあるいは促進する効果を及がす食逌脂肪、 蛋癜、 あ るいは炭氎化物の分解に効果を及がす食欲、 性欲、 ストレス、 認識 認識 障害 、 鬱病、 暎力行動を含む行動特城に効果を及がす鎮痛効果あるいは 他の痛みを枛少させる効果を提䟛する胚性幹现胞の造血系以倖の他の系統 ぞの分化および増殖を促進するおよび酵玠の堎合、 その酵玠の欠倱を補い、 たた関連疟患を治療する。
䞊蚘掻性を有する蛋癜は 䟋えば、 B现胞、 T现胞、 肥満现胞の増殖たた は现胞死、 免疫グロプリンのクラススィツチ促進によるクラス特異的誘導、 B现胞の抗䜓産生现胞ぞの分化、 顆粒球前駆现胞の増殖たたは分化、 现胞死、 単球 ·マクロファヌゞ前駆现胞の増殖たたは分化、 现胞死、 奜䞭球、 単球. マクロファヌゞ、 奜酞球、 奜塩基球の増殖たたは機胜亢進、 现胞死、 巚栞球 前駆现胞の増殖たたは现胞死、 奜䞭球前駆现胞の増殖たたは分化、 现胞死、 Bたたは T前駆现胞の増殖たたは分化、 现胞死、 赀血球の産生促進、 赀血球、 奜䞭球、 奜酞球、 奜塩基球、 単球 ·マクロファヌゞ、 肥満现胞、 巚栞球前駆 现胞の増殖支持、 奜䞭球、 単球 ·マクロファヌゞ、 B现胞たたは T现胞の遊 走促進、 胞腺现胞の増殖たたは现胞死、 脂肪现胞の分化抑制、 ナチュラルキ ラ䞀现胞の増殖たたは现胞死、 造血幹现胞の増殖たたは现胞死、 幹现胞およ び各皮造血前駆现胞の増殖抑制、 間葉系幹现胞からの骚芜现胞、 軟骚现胞ぞ の分化促進たたは増殖、 现胞死、 あるいは砎骚现胞の掻性化や単球から砎骚 现胞ぞの分化促進による骚吞収の促進の䜜甚を本ポリペプチドのみで、 たた リガンド䞀レセプ倕䞀間の結合を介しお、 あるいは他の分子ず盞乗的に働く こずにより有するず考えられる。
たた本発明のぺプチドは神経系にも䜜甚するこずが予枬されるので、 各皮 神経䌝達物質䜜動性神経现胞ぞの分化ならびにそれらの生存維持たたは现胞 死、 グリア现胞の増殖促進たたは现胞死、 神経突起の䌞展、 神経節现胞の生 存維持たたは现胞死、 ァストロサむ卜の増殖たたは分化促進たたは现胞死、 末梢神経の増殖たたは生存維持、 现胞死、 シュワン现胞の増殖たたは现胞死、 運動神経の増殖たたは生存維持、 现胞死の䜜甚もあるず考えられる。
さらに、 本発明のポリペプチドは初期胚の発生過皋においお、 倖胚葉誘導 䜜甚による衚皮、 脳、 背骚、 神経の噚官圢成、 䞭胚葉誘導䜜甚による背玢結 合組織 骚、 筋肉、 腱 、 血球现胞、 心臓、 腎臓、 生殖巣の噚官圢成、 ある いは内胚葉誘導䜜甚による消化噚系臓噚 胃、 腞、 肝臓、 脬臓 、 呌吞噚系 (肺、 気管 の圢成に促進的たたは抑制的に䜜甚するず考えられるずずもに、 生䜓においおも䞊蚘噚官の増殖あるいは増殖抑制䜜甚を有するず考えられる。 したがっお、 本発明のポリペプチドはそれ自身で、 免疫系たたは神経系も しくは骚代謝の機胜の䜎䞋たたは亢進に関する疟患、 たたは造血系现胞の発 育䞍党たたは異垞増殖、 䟋えば、 炎症性疟患 リりマチ、 朰瘍性倧腞炎等 、 骚髄移怍埌の造血幹现胞の枛少症、 ガン、 癜血病に察する攟射線照射たたは 化孊療法剀投䞎埌の癜血球、 血小板、 B现胞たたは T现胞の枛少症、 貧血、 感染症、 ガン、 癜血病、 ゚むズ A I D S ) 、 骚代謝異垞 骚粗鬆症等 、 各皮倉性疟患 アルツハむマヌ病、 倚発性硬化症等 、 あるいは神経損傷の 予防たたは治療薬ずしお甚いるこずが期埅される。
たた本発明のポリペプチドは、 倖胚葉、 䞭胚葉たたは内胚葉由来噚官の分 化たたは増殖䜜甚を有するず考えられるので、 各噚官 衚皮、 骚、 筋肉、 腱、 心臓、 腎臓、 胃、 腞、 肝臓、 塍臓、 肺、 気管等 の組織修埩剀ずしお甚いる こずも期埅される。
たた、 本発明のポリぺプチドのポリク口䞀ナル抗䜓たたはモノクロヌナル 抗䜓を甚いお、 生䜓における該ポリペプチドの定量が行え、 これによ぀お該 ポリぺプチドず疟患ずの関係の研究あるいは疟患の蚺断等に利甚するこずが できる。 ポリクロ䞀ナル抗䜓およびモノクロヌナル抗䜓は該ポリペプチドあ るいはその断片を抗原ずしお甚いお垞法により䜜補するこずができる。
たた、 本発明のポリペプチド 奜たしくはその现胞倖ドメむンのポリぺプ チド を甚いるこずにより、 䟋えばァフィ二ティヌカラムを䜜補しお、 本ポ リペプチドず結合する既知たたは未知の蛋癜 リガンド の同定、 粟補ある いはその遺䌝子クロヌニングを行うこずができる。
たた、 本発明のポリペプチド 奜たしくはその膜貫通領域たたは现胞内ド メむンのポリペプチド を甚いお、 䟋えばりェスト䞀り゚スタン法により、 たたは本発明の c D N A (奜たしくは該ポリぺプチドの膜貫通領域たたは现 胞内ドメむンをコヌドする c'D NA) を甚いお、 䟋えば酵母 2—ハむブリツ ド法により該ポリペプチドず现胞質内で盞互䜜甚する䞋流のシグナル䌝達分 子の同定、 遺䌝子クロヌニングを行うこずもできる。
さらに本発明のポリペプチドを甚いるこずによっお、 本発明のポリべプチ ドレセプ倕䞀ァゎニスト、 アンタゎニストおよび受容䜓䞀シグナル䌝達分子 間の阻害剀等のスクリヌニングを行うこずもできる。
本発明の c D N Aは、 倚倧な有甚性が期埅される本発明のポリペプチドを 生産する際の重芁か぀必須の铞型ずなるだけでなく、遺䌝病の蚺断や治療遺 䌝子欠損症の治療たたはアンチセンス D NA (R NA) によっお、 ポリぺプ チドの発珟を停止させるこずによる治療等 に利甚できる。 たた、 本発明の c D NAをプロヌブずしおゞ゚ノミック genomic) D NAを分離できる。 同 様にしお、本発明 c D N Aず盞同性の高いヒトの関連ポリぺプチドの遺䌝子、 たたマりス以倖の生物における本発明ポリぺプチドず盞同性の高いポリぺプ チドの遺䌝子を分離するこずも可胜である。
[医薬品ぞの適甚]
前蚘の疟患に適応するために、 本発明のポリペプチド、 あるいは本発明の ポリペプチドに察する抗䜓は通垞、 党身的又は局所的に、 䞀般的には経口た たは非経口の圢で投䞎される。 奜たしくは、 経口投䞎、 静脈内投䞎および脳 宀内投䞎である。
投䞎量は、 幎霢、 䜓重、 症状、 治療効果、 投䞎方法、 凊理時間等により異 なるが、 通垞、 成人䞀人あたり、 䞀回に぀き、 1 0 0 8から 1 0 011 8の 範囲で、 䞀日䞀回から数回経口投䞎されるかたたは、 成人䞀人あたり、 䞀回 にっき、 1 O gから 1 O O m gの範囲で、 䞀日䞀回から数回非経口投䞎さ れる。
もちろん前蚘したように、 投䞎量は、 皮々の条件により倉動するので、 侊 蚘投䞎量より少ない量で十分な堎合もあるし、 たた範囲を越えお必芁な堎合 もある。
本発明化合物を投䞎する際には、 経口投䞎のための固䜓組成物、 液䜓組成 物およびその他の組成物、 非経口投䞎のための泚射剀、 倖甚剀、 坐剀等ずし お甚いられる。
経口投䞎のための固䜓組成物には、 錠剀、 䞞剀、 カプセル剀、 散剀、 顆粒 剀等が含たれる。 カプセルには、 ゜フトカプセルおよびハヌドカプセルが含 たれる。
このような固䜓組成物においおは、 䞀぀たたはそれ以䞊の掻性物質が、 少 なくずも䞀぀の䞍掻性な垌釈剀 䟋えば、 ラクトヌス、 マンニトヌル、 ダル コヌス、 ヒドロキシプロピルセルロヌス、 埮結晶セルロヌス、 デンプン、 ポ リビニルピロリドン、 メタケむ酞アルミン酞マグネシりム等 ず混合される。 組成物は、 垞法に埓っお、䞍掻性な垌釈剀以倖の添加物、䟋えば、 最滑剀ス テアリン酞マグネシりム等 、 厩壊剀 繊維玠グリコヌル酞カルシりム等 、 安定化剀 ヒト血枅アルブミン、 ラクトヌス等 、 溶解補助剀 アルギニン、 ァスパラギン酞等 を含有しおいおもよい。
錠剀たたは䞞剀は、 必芁により癜糖、 れラチン、 ヒドロキシプロピルセル ロヌス、 ヒドロキシプロピルメチルセル口䞀スフ倕レヌト等の胃溶性あるい は腞溶性のフィルムで被膜しおもよいし、 たた 2以䞊の局で被膜しおもよい。 さらにれラチンのような吞収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投䞎のための液䜓組成物は、 薬孊的に蚱容される乳濁剀、 溶液剀、 懞 濁剀、 シロップ剀、 ゚リキシル剀等を含み、 䞀般に甚いられる䞍掻性な垌釈 剀 䟋えば、 粟補氎、 ゚タノヌル等 を含んでいおもよい。 この様な組成物 は、 䞍掻性な垌釈剀以倖に湿最剀、 懞濁剀のような補助剀、 甘味剀、 颚味剀、 芳銙剀、 防腐剀を含有しおいおもよい。
経口投䞎のためのその他の組成物ずしおは、 ひず぀たたはそれ以䞊の掻性 物質を含み、 それ自䜓公知の方法により凊方されるスプレヌ剀が含たれる。 この組成物は䞍掻性な垌釈剀以倖に亜硫酞氎玠ナ卜リゥムのような安定剀ず 等匵性を䞎えるような安定化剀、 塩化ナトリりム、 クェン酞ナトリりムある いはクェン酞のような等匵剀を含有しおいおもよい。 スプレヌ剀の補造方法 は、 䟋えば米囜特蚱第 2,868,691号および同第 3095355号明现曞に詳しく蚘 茉されおいる。
本発明による非経口投䞎のための泚射剀ずしおは、 無菌の氎性たたは非氎 性の溶液剀、 懞濁剀、 乳濁剀を包含する。 氎性たたは非氎性の溶液剀、 懞濁 剀ずしおは、 䞀぀たたはそれ以䞊の掻性物質が、 少なくずも䞀぀の䞍掻性な 垌釈剀ず混合される。 氎性の垌釈剀ずしおは、 䟋えば泚射甚蒞留氎および生 理食塩氎が挙げられる。 非氎性の垌釈剀ずしおは、 䟋えばプロピレングリコ ヌル、 ポリ゚チレングリコヌル、 ォリヌブ油のような怍物油、 ゚タノヌルの ようなアルコヌル類、 ポリ゜ルべ䞀ト 8 0 (登録商暙 等が挙げられる。 このような組成物は、 さらに防腐剀、 湿最剀、 乳化剀、 分散剀、 安定化剀 (䟋えば、 ヒト血枅アルブミン、 ラクト䞀ス等 、 溶解補助剀 䟋えば、 ァ ルギニン、 ァスパラギン酞等 のような補助剀を含んでいおもよい。 発明を実斜するための最良の圢態
以䞋に本発明のクロヌン〇 AH 0 4 7に関する実斜䟋を挙げお本発明をよ り具䜓的に説明するが、 これらは本発明の範囲を制限するものではない。 実斜䟋 1  p o 1 y (A) + R N Aの調補
ヒト臍垯静脈内皮现胞株 H U V— E C— C ) より TRIzol è©Šè–¬ TRIzol reagent, 登録商暙 GIBCOBRLより販売 を甚いお党 R N Aを抜出し、 mR N Aピナリフィケ䞀シペン 'キット m R N A Purification Kit, 商品名 Pharmaciaより販売 を甚いお po 1 y (A) + RN Aを粟補した。 実斜䟋 2 酵母 S ST cDN Aラむブラリヌの調補
䞊蚘の p o 1 y (A) + RNAを铞型に Xh o I郚䜍を連結したランダム 9
NNNNNNN-3' (配列番号 4) をプラむマヌずしお、 スヌパ䞀スクリプ ト 'プフスミド 'システム Superscript Plasmid System for c DNA Synthesis and Plasmid Cloning, 商品名 GIBCOBRLより販売 を甚いお 2本鎖 c DNA の合成を行った。 Ec oR Iアダプタ䞀 GIBCOBRLより販売 を DNAラ ィゲヌシペンキット V e r 2 (DNA ligation kit ver.2, 商品名 宝酒造 株 より販売。 以䞋、 cDNAの連結はすべお本キットを䜿甚した。  を甚いお 連結した埌、 Xho lで消化し、 ァガロヌス電気泳動で 300〜800 b p の c DNAを切り出しお分画し、 pSUC2 (米囜特蚱第 5536637号参照 の E c o R I ZNo t I郚䜍に連結し、 倧腞菌 DH 10 B株に゚レクトロポ レ䞀ション法で圢質転換しお酵母 S ST甚の c DN Aラむブラリ䞀を埗た。 実斜䟋 3  S STによるスクリヌニングおよび S ST陜性クロヌンの塩基配 列の決定
この cDNAラむブラリヌのプラスミドを調補し、酢酞リチりム法Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1を参照により酵母 Y ΀ Κ 12株を圢質転 換し、 トリブトファン T r p) を含たない酵母圢質転換䜓の遞択培地 C MD— T r p培地 のプレヌト䞊にたき、 30でで 48時間むンキュベヌト した埌、 アキュトラン ·レプリカ ·プレヌ倕䞀 Accutran Replica Plater, 商品 名 Schleicher&Schuellより販売 を甚いお埗られたコロニヌ 圢質転換䜓 のレプリカをラフィノヌスを炭玠源ずする Y PRプレヌトにずり、 30 で 14日間むンキュベヌトした。 3日目以降、 出珟しおきた各々のコロニヌを 䞀぀ず぀再床 YPRプレヌトにストリヌクしお 30でで 48時間むンキュべ —卜した埌、 シングルコロニヌを YPD培地に怍菌し、 30でで 48時間ィ ンキュペヌトした埌、 プラスミドを調補した。 続いお p SUC 2のクロヌ二 ングサむトの䞡端の配列の 2皮類のプラむマヌ センス鎖はピオチン化ブラ むマ䞀 を甚いお公知の方法に埓っお PC Rを行い、 むンサヌト cDNAを 増幅した埌、 ダむナビヌズ Dynabeads, 商品名 DYNALより販売 を甚い おピオチン化 1本鎖 cDNAを粟補し、 塩基配列の決定を行った。 塩基配列 の決定は D N Aシ䞀ケンシング ·キット DNA Sequencing kit, Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction, 商品名 Applied Biosystems Inc.より fe冗ノ Ÿr 甚いた蛍光ダむ倕䞀ミネ䞀倕䞀サむクルシヌクェンス法で反応を行い、 自動 DNAシヌクェンサ䞀 373 (Applied Biosystems Inc.)で読み取りを行った (以䞋、 塩基配列決定はすべお本方法で行った。  。
埗られた塩基配列および掚定されるアミノ酞配列に぀いおデヌタベヌスず の盞同性怜玢を行い、 デヌタベヌスに登録されおいない新芏の c DNAであ るこずが明らかずなったクロヌンに぀いお、 å…šé•· c DNAのクロ䞀ニングを 詊みた。 実斜䟋 4 党長 c DN Aのクロヌニングおよび塩基配列の決定
å…šé•· c DNAのクロヌニングはマラ゜ン c DNAアンプリフィケヌショ ン 'キット Marathon cDNA Amplification Kit, 商品名 Clontech瀟より販売 による 3 ' RACE (Rapid Amplification of c DNA End) 法を甚いお行った。 2本鎖 c DNAの調補には、 各クロヌンの由来、 すなわちヒト臍垯静脈内皮 现胞株HUV— EC— C) の po 1 y (A) + RNAをより䜜補した。 SST で埗られた塩基配列の情報に基づいお掚定翻蚳開始点 AT G領域より䞊流の 27me rのプラむマヌ〇 AH 047 -F 1 5' -GCGACACGTGG ATCCAAGATGGCGACG- 3' (配列番号 5 )を䜜補しお、該キット に添付されたアダプタ䞀プラむマ䞀ずで PCRを行った。 クロヌン ΟΑΗ0 47に特異的に増幅された' c DN Αをァガロヌス電気泳動で分画埌、 pT7Blue-2 T- Vector (商品名 Novagenより販売 に連結し、 倧腞菌 DH5 a に圢質転換しおプラスミドを調補した。初めに 5'偎の塩基配列を決定しお O AH047 SST c DN Aの塩基配列が存圚するこずを確認した埌、 å…šå¡© 基配列を決定し、 配列番号 3に瀺す配列を埗た。 さらにオヌプンリヌデむン グフレヌムを決定し、 アミノ酞に翻蚳しお配列番号 1および 2に瀺す配列を 埗た。
栞酞配列デヌタベヌスに登録されおいる既知の栞酞配列に察しお B LAS TNおよび FASTAにより、 たたアミノ酞配列デヌタベヌスに登録されお いる既知のポリペプチドのアミノ酞配列に察しお B LAS TX、 BLAST Pおよび FASTAにより怜玢した結果、 本発明のポリペプチド O AH 04 7およびそれをコヌドする栞酞配列ず䞀臎する配列はなかった。 さらに埗ら れたアミノ酞配列の疎氎性プロットによる解析から本発明のポリペプチドに は膜貫通領域が存圚するこずが予想された。 これらのこずから、 本発明のポ リペプチドは、 新芏の膜蛋癜質であるこずが刀明した。 さらに盞同性怜玢の 結果、 BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 クロヌン OAH0 47 (配列番号 1のアミノ酞配列 12〜642間の領域 ずむヌスト 'ェン ドメノブレ぀ ノ '蛋癜 (yeast endomembrane protein, Genbank Accession U53880 のアミノ酞配列 1 1〜667間の領域 ずの間に有為な盞同性があるこずを 瀺した。 これらの盞同性に基づいお、 クロヌン OAH047は、 トランスポ —倕䞀ずしお现胞膜からリ゜゜ヌムぞのホルモンたたはそれに盞圓する分子 の茞送に機胜するず期埅される。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 実質的に玔粋な圢である配列番号 1で瀺されるアミノ酞配列からなる ポリペプチド、 そのホモロヌグ、 そのフラグメントたたはそのフラグメント のホモロヌグからなるポリペプチド。
2 . 配列番号 1で瀺されるアミノ酞配列からなる請求の範囲 1蚘茉のポリ ペプチド。
3 . 請求の範囲 1に蚘茉されたポリぺプチドをコ䞀ドする c D NA。
4. 配列番号 2で瀺される塩基配列を有する請求の範囲 3蚘茉の c D N A、 たたはその配列に遞択的にハむブリダィズするフラグメントからなる c D N
A。
5 . 配列番号 3で瀺される塩基配列を有する請求の範囲 3蚘茉の c D N A、 たたはその配列に遞択的にハむブリダィズするフラグメントからなる c D N A。
6 . 請求の範囲 3から 5のいずれかの項に蚘茉の c D NAからなる耇補た たは発珟ベクタヌ。
7 . 請求の範囲 6蚘茉の耇補たたは発珟ベクタヌで圢質転換された宿䞻现 胞。
8 . 請求の範囲 1たたは 2に蚘茉されたポリペプチドを発珟させるための 条件䞋で請求の範囲 7蚘茉の宿䞻现胞を培逊するこずからなる該ポリぺプチ ドの補造方法。
9 . 請求の範囲 1たたは 2に蚘茉されたポリぺプチドのモノクロヌナルた たはポリクロヌナル抗䜓。
1 0 . 請求の範囲 1たたは 2に蚘茉されたポリペプチドたたは請求の範囲 9蚘茉の抗䜓および薬孊的に蚱容される賊圢剀および たたは担䜓を含有す るこずを特城ずする薬孊的組成物。
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