WO1999057966A1 - Transgene sulfonylharnstoff-tolerante zuckerrüben - Google Patents

Transgene sulfonylharnstoff-tolerante zuckerrüben Download PDF

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WO1999057966A1
WO1999057966A1 PCT/EP1999/003361 EP9903361W WO9957966A1 WO 1999057966 A1 WO1999057966 A1 WO 1999057966A1 EP 9903361 W EP9903361 W EP 9903361W WO 9957966 A1 WO9957966 A1 WO 9957966A1
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WO
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alkyl
alkoxy
halogen
unsubstituted
substituted
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Application number
PCT/EP1999/003361
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French (fr)
Inventor
Hermann Stuebler
Arno Schulz
Günter Donn
Hermann Bieringer
Erwin Hacker
Lothar Willms
Original Assignee
Aventis Cropscience Gmbh
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of transgenic herbicide-tolerant cells, transgenic sulfonylurea-tolerant sugar beets and methods for controlling unwanted vegetation in crops of transgenic sulfonylurea-tolerant sugar beets.
  • herbicidal agents e.g. Sulfonylureas
  • Sulfonylureas for controlling undesirable plant growth in crops
  • herbicides are widely used in agriculture.
  • the possibility of controlling the harmful plants by the herbicides is not always satisfactory.
  • highly effective herbicides are applied to control harmful plants, the growth of crops is often impaired. For this reason, herbicide-tolerant crops are of particular interest for agriculture.
  • EP-A-0360750 describes e.g. the production of AHAS inhibitor-tolerant plants by selection or genetic engineering methods.
  • the herbicide tolerance of the plants to certain ortho-substituted N-arylsulfonyl-N'-pyrimidinylureas is generated here by an increased AHAS content in the plants.
  • BES JiGUNGS OPiE EP-B-01 54204 describes transgenic plants which act against a 2- (2-imidazolin-2-yl) pyridine, a 2- (2-imidazolin-2-yl) quinoline, or a sulfonamide herbicide on the basis of the expression of a modified one AHAS genes are resistant.
  • WO 98/02527 also mentions sugar beets which are resistant to certain sulfonylureas and herbicides of the imidazolinone type.
  • the principle of resistance described in WO 98/02527 is based on two point mutations within the ALS gene in positions 337 and 562, which lead to the amino acid substitutions Ala 113 Thr and Pro 188 Ser in the enzyme.
  • transgenic sugar beets described so far in the prior art do not always enable adequate control of all harmful plants or do not always show a satisfactory tolerance towards newer sulfonylurea herbicide generations, in particular one or more of the sulfonylurea herbicides of group A, consisting of A1) compounds of the formula (I) and their inorganic or organic salts,
  • Q is oxygen, sulfur or -N (R 3 4 ⁇ , Y CH or N, R hydrogen (H), (CC 12 ) alkyl; (C 2 -C 10 ) alkenyl; (C 2 -C 10 ) alkynyl; (C, -
  • C 4 ) -alkyl which is unsubstituted in the phenyl radical or by one or more radicals from the group halogen, (C, -C 4 ) -alkyl, (C r C 4 ) -alkoxy, (C.-C 4 ) -haloalkyl.
  • R 1 is hydrogen or (C r C 3 ) alkyl
  • R 2 is hydrogen, halogen, (CC 3 ) alkyl or (C r C 3 ) alkoxy, the latter two radicals being unsubstituted or substituted one or more times by halogen or (C - C 3 ) alkoxy;
  • R is hydrogen, halogen, (CC 3 ) -alkyl, (C - C 3 ) -alkoxy or (C, -C 3 ) - alkylthio, where the abovementioned alkyl-containing radicals are unsubstituted or one or more times by halogen or one or two times are substituted by (C - C 3 ) alkoxy or (C - C 3 ) alkylthio; or a radical of the formula NR 5 R 6 , (C 3 -C 6 ) cycloalkyl, (C 2 -C 4 ) alkenyl, (C 2 -C 4 ) alkynyl, (C 3 -C 4 ) alkenyioxy or (C 3 -C 4 ) alkynyloxy;
  • R is hydrogen, (C - C 4 ) -alkyl or (C r C 4 ) -alkoxy and R 5 and R 6 are independently hydrogen, (C ⁇ -C -alkyl, (C 3 -C 4 ) -alkenyl, ( C 1 -C 4 -haloalkyl or (CC 4 ) -alkoxy;
  • R 2 , R 3 independently of one another are H or (C - C 4 ) alkyl, R 4 H, (C 1 -C 4 alkyl, hydroxy or (C r C 4 ) alkoxy,
  • R 5 (C - C 4 ) alkylsulfonyl, CHO, [(C, -C 4 ) alkyl] carbonyl, which is unsubstituted or substituted by one or more halogen atoms, [(C-- C 4 ) alkoxy] oxalyl, [(C 3 -C 6 ) Cycloalkyl] carbonyl or a group of the formula WWW or
  • W is an oxygen or sulfur atom (O or S)
  • R 9 H (C - C 4 ) alkyl, which is unsubstituted or by one or more
  • R 1 1 is different from hydrogen, the radicals R 12 together with the N atom form a heterocyclic ring with 5 or 6 ring members, which is another hetero atom from the group N, O and S can be present in the various oxidation states and is unsubstituted or substituted by (C - C 4 ) alkyl or the oxo group, and QO, S or -NR 13 -,
  • R 6 H (C r C 3 ) alkyl, (C r C 3 ) alkoxy, halogen, R 8 independently of one another (C r C 4 ) alkyl which is unsubstituted or substituted by one or more halogen atoms, or (C 3 - C 4 ) alkenyl or
  • A is a radical of the formula
  • Z is CH or N and one of the radicals X and Y is halogen, (C r C 2 ) alkyl, (CC 2 ) alkoxy, OCF 2 H, CF 3 or OCH 2 CF 3 and the other of the radicals X and Y (C r C 2 ) Alkyl, (C - C 2 ) alkoxy or (C, -C 2 ) haloalkoxy mean R 7 H or CH 3 , R 13 H, (C r C 4 ) alkyl, which is unsubstituted or by one or more
  • Halogen atoms is substituted, or (C 3 -C 4 ) alkenyl or (C 3 -C 4 ) alkynyl;
  • R. H halogen, (CC 4 ) alkyl which is unsubstituted or substituted once or more by halogen, (CC 4 ) alkoxy, (CC 4 ) alkylithio;
  • R 2 is H or methyl; R, methyl or methoxy;
  • Halogen (CC 6 -) alkoxy, (C 3 -C 6 ) alkenyloxy, (C 3 -C 6 ) alkynyloxy or
  • R, H, (CC 6 ) alkyl which is unsubstituted or one or more times
  • R 7 (CC 6 ) alkyl which is unsubstituted or by (C, -C 4 ) alkoxy, (C 3 -C 6 ) -
  • Cycloalkyl, Cyano, COOR 19 , or CONR 26 R 27 is substituted, (CC 6 ) -
  • Haloalkyl (C 3 -C 6 ) alkenyl, (C 3 -C 6 ) haloalkenyl, (C 3 -C 6 ) alkynyl, (C 3 -C 6 ) - Haloalkynyl, oxetan-3-yi, or (C 4 -C 6 ) cycloalkyl which is unsubstituted or partially substituted by halogen, (C - C 4 ) alkyl or (C r C 4 ) alkoxy or phenyl, benzyl or naphthyl which is unsubstituted or in each case by (C r C 4 ) -alkyl, (C, -C 4 ) -haloalkyl, (CC 4 ) -alkoxy, (CC 4 ) - haloalkoxy, (C r C 4 ) -alkylthio, (CC 4 ) -haloalkylthio, (
  • R 10 and R or R 12 and R 13 or R 16 and R 17 or R 20 and R 21 or R 23 and R 24 or R 25 and R 9 or R 26 and R 27 together form a (C 4 -C 5 ) - Form alkylene chain, which may be interrupted in part by oxygen or NR 14 , wherein R 14 is H, (CC 4 ) alkyl, (C 3 -C 6 ) alkenyl or (C 3 -C 6 ) alkynyl;
  • R 15 and R 29 each independently of one another (C, -C 4 ) alkyl or (C, -C 4 ) -
  • R 18 and R 30 are each independently (C-- C 4 ) alkyl substituted with COOR 28 ;
  • R, 9 , R 22 and R 28 each independently of one another H or (C, -C 4 ) -alkyl,
  • X, and X 3 each independently of one another S, SO or S0 2 ;
  • X 2 and X 4 are each independently 0 or S;
  • X 5 represents O or NR 14 ;
  • the object of the present invention is to overcome these disadvantages.
  • the object is achieved by the present invention by providing sugar beets which have one or more sulfonyureas of the abovementioned (above) general formulas I to III, amidosulfuron, ethoxysulfuron, triasulfuron, metsulfuron, tribenuron, flupyrsulfuron, nicosulfuron, rimsulfuron, prosulfuron and sulfosuron , Oxasulfuron, etametsulfuron, imazosulfuron and / or compounds of the above formula V have a very good tolerance, ie have a high tolerance.
  • Another object of the present invention is to improve methods for controlling unwanted plant growth in transgenic sugar beet crops according to the invention.
  • Sugar beet has now been found by selection on nutrient media containing sulfonylurea, which surprisingly has the desired resistance to sulfonylurea herbicides of the general formulas I to III, amidosulfuron, ethoxysulfuron, triasulfuron, metsulfuron, tribenuron, flupyrsulfuron, nicosulfuronuron, rimsulfuron, rimsulfuron, rims Etametsulfuron, imazosulfuron and / or compounds of the above Have formula V.
  • the genes contained in the sugar beet according to the invention which cause this sulfonylurea resistance can be identified, isolated and used for the production of transgenic plants, in particular sugar beet, by methods known to those skilled in the art.
  • sugar beets according to the invention have further surprising advantages, for example by are promoted in their growth by the said sulfonylureas or have a changed content of carbohydrates or nitrogen-containing compounds (e.g. amino acid content, proteins).
  • the present invention also has further advantages because it enables the control of a broad spectrum of harmful plants in the transgenic sugar beet crops according to the invention, so
  • the post-emergence application is particularly preferred, especially in a period between the cotyledon and the 1 2-leaf stage of the harmful plants or between the piercing of the sugar beets and their 1 2-leaf stage.
  • the present invention therefore relates to transgenic sulfonylurea-tolerant sugar beets, their seeds or propagation material and their cells which are selected from group A, consisting of one or more sulfonylureas
  • sulfonylureas selected from group A consisting of A1 to A1 8.
  • transgenic sulfonylurea-tolerant sugar beets, their seeds or propagation material and their cells can e.g. by conventional crossing methods, in addition to the feature of the sulfonylurea resistance according to the invention, also have a further herbicide resistance (e.g. against glufosinates or glyphosates) or contain a further genetic modification, e.g.
  • a Bt toxin e.g., insect, fungus or virus resistance
  • a Bt toxin e.g., insect, fungus or virus resistance
  • a chitinase e.g., glucanase
  • a qualitative and / or quantitative change in ingredients e.g the energy carbohydrate -, fatty acid or nitrogen metabolism or metabolite flows associated with the metabolic processes
  • Another object of the present invention is also a process for the production of transgenic herbicide-tolerant plants, preferably sulfonylurea-tolerant plants and very particularly sulfonylurea-tolerant sugar beets, characterized in that a) cells in a herbicide-containing nutrient medium in the presence of a or several safeners are cultivated and selected, b) the cells obtained under a) are cultivated and selected on a herbicide-containing nutrient medium and c) the genes which cause the herbicide tolerance are identified and isolated from the cells obtained under b), d) the genes obtained from c) are stably integrated into the genome of plant cells and e) intact plants are regenerated from the cells obtained under d).
  • Another object of the invention is also a transgenic herbicide-resistant plant, preferably transgenic sulfonylurea-tolerant plant and in particular transgenic sulfonylurea-tolerant sugar beet, which can be obtained by the process according to the invention for the production of transgenic herbicide-tolerant and in particular sulfonylurea-tolerant plants.
  • eu or prokaryotic cells are used in the process according to the invention for the production of transgenic herbicide-tolerant plants, in particular those from plants, bacteria or yeasts, which are cultivated and selected in the presence of at least one herbicidally active compound and at least one safener under suitable conditions.
  • the selection is carried out in the presence of herbicide concentrations which are> 50%, preferably> 90%, particularly preferably> 95% and very particularly preferably> 99% lethal for the cells, especially in the presence of sulfonylurea herbicides.
  • the cells for example for the qualitative and / or quantitative improvement of the mutant yield, the cells, preferably cell suspensions, in the presence of one or more herbicides and one or more safeners are used in a concentration range from 10 "3 M to 10 '7 M, preferably in the range of ' ⁇ 0 A M to 10 "6 M treated and after a period of about a day to 2 weeks, preferably about 3-10 days, for example a week, the cells were mixed with fresh cell culture medium without herbicide but with safener and this subculture step was about 3 - 5 cycles continued.
  • the cell suspensions are then applied, for example, to agar media with the particular herbicidal active ingredient (in the concentration range from 10 "3 M to 10 '7 M, preferably 10 " 4 M to 10 "6 M) with and without safener (in the concentration range 10 " 3 M to 10 7 M, preferably 10 -4 M to 10 "6 M).
  • the concentration ratio of safener to herbicidal active ingredient in the mixture can differ in a ratio of 100: 1 to 1: 100, preferably in the range 10: 1 to 1: 10.
  • the herbicide-resistant cell clones can be transferred to fresh selection medium, either maintaining the herbicide concentration or by a factor of 2-100, preferably around by a factor of 2 to 10.
  • Cell mutants with a herbicide resistance that is significantly higher than that of wild-type cells are used for the subsequent plant regeneration utanten subcultivated on / in culture media which have the content of cytokinins and / or auxins necessary for the respective genotype.
  • Plant regeneration can take place in the presence or absence of herbicide or
  • herbicide-safener mixture can be carried out.
  • safener means a compound by means of which the damage to a crop plant possibly caused by a herbicide can be reduced or avoided.
  • suitable safeners are those which, in combination with sulfonylurea herbicides, preferably phenylsulfonylureas, have a safener effect.
  • Suitable safeners are known from WO-A-96/14747 and the literature cited therein. The following groups of compounds are suitable, for example, as safeners for the herbicidal active compounds (A) mentioned above: a) compounds of the dichlorophenylpyrazoline-3-carboxylic acid type, preferably compounds such as
  • active substances of the phenoxyacetic or propionic acid derivative or aromatic carboxylic acid type e.g. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (ester) (2,4-D), 4-chloro-2-methylphenoxy-propionester (Mecoprop), MCPA or
  • plant mutants or cell lines can also be selected by, for example, growing seeds or cell cultures (callus or suspension cultures) in a suitable medium in the presence of increasing herbicide concentrations.
  • a suitable mutagen cf. for example US Pat. No. 4,443,971
  • transgenic sulfonylurea-resistant sugar beet according to the invention can also be found in e.g. transgenic sugar beets are crossed using conventional breeding methods known to those skilled in the art.
  • the mutated genes which cause the resistance phenomenon can be identified and isolated using the genetic engineering methods known to the person skilled in the art. With the help of the isolated genes, selected plants, preferably sugar beets, can then be transformed by methods known to those skilled in the art so that transgenic plants can be obtained. These can be characterized by further advantageous properties, for example by an increased yield, resistance to certain pesticides, especially to certain herbicides or insect pests, resistance to plant diseases or pathogens of plant diseases such as certain insects or mites or microorganisms such as fungi, bacteria or viruses. Other properties concern e.g. B. also the crop in terms of quantity, quality, shelf life, composition or special ingredients.
  • Suitable nucleic acid molecules can be used for such genetic engineering manipulations e.g. by means of suitable vectors, the mutagenesis or a sequence change by recombination of DNA sequences
  • z. B. base exchanges partial sequences removed or natural or synthetic sequences added.
  • the naturally occurring genes can also be completely replaced by heterologous or synthetic genes, preferably under the control of a promoter active in plant cells (“gene replacement”).
  • Adapters or linkers can be attached to the fragments for connecting the DNA fragments to one another .
  • the production of plant cells with a reduced activity of a gene product can be achieved, for example, by the expression of at least one corresponding antisense-RNA, a sense-RNA to achieve a cosuppression effect or the expression of at least one appropriately constructed ribozyme which specifically cleaves transcripts of the above-mentioned gene product.
  • DNA molecules can be used that comprise the entire coding sequence of a gene product, including any flanking sequences that may be present, as well as DNA molecules that only comprise parts of the coding sequence, these parts having to be long enough to be in the cells to cause an antisense effect. It is also possible to use DNA sequences which have a high degree of homology to the coding sequences of a gene product, but which are not completely identical.
  • the synthesized protein When expressing nucic acid molecules in plants, the synthesized protein can be located in any compartment of the plant cell. However, in order to achieve localization in a particular compartment, z. B. the coding region can be linked to DNA sequences that localize in a particular compartment or to
  • the transgenic plant cells can be regenerated into whole plants using known techniques.
  • transgenic sugar beets can be obtained which have altered properties as a result of overexpression, suppression or inhibition of homologous (i.e. endogenous) genes or gene sequences or expression of heterologous (i.e. exogenous) genes or gene sequences.
  • an object of the invention is the use of sugar beets according to the invention, which can be obtained by a method according to the invention in agriculture, as animal feed or for the food industry, in particular for sugar production.
  • Yet another object of the present invention is also a method for controlling undesired plant growth in crops of the transgenic sugar beets according to the invention, characterized in that one or more sulfonylureas selected from group A consisting of group A are present on the plants, their seeds or propagation material or their cultivated area A1 to A1 8, optionally in combination with one or more herbicides selected from group B consisting of B1) herbicides from the class of the imidazolinones, preferably imazethapyr (41 5, p. 701), imazamethapyr (2, p. 5, AC 263.222 ), Imazapyr (41 3, p.697), imazaquin (41 4, p.699), imazamox (41 2, p.696);
  • 20th Electron transport preferably the biscarbamates, particularly preferably Phenmedipham (563, p.948), Desmedipham (206, p.349); B3) a herbicide from the class of the PPO inhibitors, for example the diphenyl ether or the azoles, preferably azifluorfen (7, p.1 2), oxyfluorfen (547, p.91 9), pyraflufen (61 7, p.1 048) , Carfentrazone (1 1 2, p.1 91), lactofen (442, p.747), nitrofen (S1 1 93, p.1 343), oxadiargyi (538, p.904), fluoroglycofen (344, p.580 ), Sulfentrazone (665, p.1 1 26) or a CF 3 uracil of the formula IV as disclosed in US Pat. No. 5, 1 83,492:
  • HPPDO hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase
  • the triketones preferably isoxaflutole (436, p.737), isoxachlortole (RPA-201 735) or sulcotrione (664, p.1 1 24);
  • B5 a herbicide from the class of herbicidally active, optionally synthetic auxins or their transport inhibitors, preferably Quinmerac (636, S.1 080), clopyralid (1 53, S.260), diflufenzopyr (50, S.81, BAS 65400H) ;
  • B6 a herbicide from the class of lipid or fatty acid synthesis inhibitors, preferably aryloxyphenoxycarboxylic acids or cyclohexanedione oximes, particularly preferably fenoxaprop (309, p.51 9), haloxyfop (390, p.659), fluaz
  • a herbicide from the class of glutamine synthetase inhibitors preferably phosphinoamino acid derivatives, particularly preferably glufosinate
  • Synthase inhibitors preferably glyphosate (383, p.646);
  • a herbicide from the class of benzofuranylalkanesulfonates, preferably ethofumesate (285, p.484) or herbicidal compositions containing these active ingredients from group A or B are administered simultaneously or in succession.
  • an object of the invention is also the use of one or more sulfonyureas selected from group A (A1 to A1 8) as defined, optionally in combination with one or more herbicides selected from group B, consisting of B1 to B9, or these herbicidal compositions on areas of sugar beet crops according to the invention.
  • the active substances mentioned under A1 to A1 8 and under B1 to B9 include both their racemic mixtures and their active enantiomers.
  • the salts of the active substances mentioned under A1 to A1 8 and under B1 to B9 with organic or inorganic acids or bases are also included, provided that they are salt formers.
  • the esters of the active ingredients mentioned under A1 to A1 8 and under B1 to B9 are also included, if they are herbicidally active.
  • the advantages are e.g. in a positive growth regulatory effect, a reduced number of
  • herbicidal active ingredients from group A i.e. sulfonylureas A1 to A1
  • herbicides from group B i.e. herbicides B1 to B9
  • herbicide-tolerant in the sense of the present application is to be understood that the herbicide-tolerant transgenic sugar beets in the presence of one or more herbicides, in particular sulfonylureas of group A, and, if appropriate, in combination with herbicides of group B, do not adversely affect them show physiological functions, the same herbicides or sulfonylureas in non-tolerant plants having a growth-impairing or phytotoxic effect, the type and extent of the herbicide tolerance depending on the particular herbicide, the respective dosage and general growth conditions.
  • transgenic sugar beets according to the invention, their seeds or propagation material or their cells particularly preferably have a tolerance towards compounds of the general formula I in a concentration range from 0.5-40, in particular 1-20 and very particularly 3-10 g ai / ha
  • seed or propagation material includes both vegetative and sexual propagation material such as fruits, seeds, tubers, rhizomes, seedlings, cuttings, calli, protoplasts, cell cultures etc.
  • These can be characterized by further advantageous properties, for example by an increased yield, resistance to certain pesticides, especially to certain herbicides or insect pests, resistance to plant diseases or pathogens of plant diseases such as certain insects or mites or microorganisms such as fungi, bacteria or viruses.
  • Other properties concern e.g. B. also the crop in terms of quantity, quality, shelf life, composition or special ingredients.
  • a wide range of economically important monocotyledonous and dicotyledonous harmful plants can be combated excellently with the methods according to the invention for controlling (controlling) undesired plant growth.
  • Perennial weeds which are difficult to control and which sprout from rhizomes, rootstock or other permanent organs are also recorded excellently by the method. It does not matter whether the substances or agents are applied in the pre-sowing, pre-emergence or post-emergence process.
  • some representatives of the monocotyledonous and dicotyledonous weed flora may be mentioned, which can be controlled by the methods according to the invention, without any intention that the name should limit them to certain species.
  • the spectrum of activity extends to species such as Galium, Viola, Veronica, Lamium, Stellaria, Amaranthus, Sinapis, Matricaria, Abutilon, Polygonum, Galinsoga, Mercurialis, Solanum, Chinopodium, Kochia, Anthemis and Sonchus on the annual side as well as Convolvulus, Cirsium and Rumex for the perennial weeds and also crops such as Potato, rapeseed etc.
  • the compounds or agents are applied to the surface of the earth before germination in the processes according to the invention, either the weed seedlings emerge completely or the weeds grow to the cotyledon stage, but then stop growing and finally die after three to four Weeks off completely.
  • the following harmful plants such as Anthemis, Agropyron, Chinopodium, Cirsium, Kochia, Polygonum, Matriciaria, as well as growth / failure crops and generally weeds in later growth stages, are suitable application of the herbicidal active ingredients or combinations thereof well, that is preferably> 80% and
  • the crop plants according to the invention are only insignificantly or not at all damaged. For these reasons, the present methods are very well suited for the selective control of undesired plant growth in agricultural crops of the sugar beets according to the invention.
  • the compounds or agents used in the process according to the invention can be used in the form of wettable powders, emulsifiable concentrates, sprayable solutions, dusts or granules in the customary formulations and can be formulated in various ways, depending on which biological and / or chemical-physical parameters are specified. Possible formulation options include, for example: wettable powder (WP), water-soluble powder (SP), water-soluble concentrates, emulsifiable concentrates (EC), emulsions (EW), such as oil-in-water and water-in-oil emulsions, sprayable solutions , Suspension concentrates (SC), dispersions on oil or
  • Water-based, oil-miscible solutions capsule suspensions (CS), dusts (DP), pickling agents, granules for spreading and soil application, granules (GR) in the form of micro, spray, elevator and adsorption granules, water-dispersible granules (WG), water-soluble Granules (SG), ULV formulations, microcapsules and waxes.
  • CS capsule suspensions
  • DP dusts
  • pickling agents granules for spreading and soil application
  • granules granules
  • GR granules in the form of micro, spray, elevator and adsorption granules
  • WG water-dispersible granules
  • SG water-soluble Granules
  • ULV formulations microcapsules and waxes.
  • combinations with other pesticidally active substances e.g. Apply insecticides, acaricides, fungicides, safeners, fertilizers and / or growth regulators, e.g. in the form of a finished formulation or as a tank mix.
  • the agrochemical preparations generally contain 0.1 to 99% by weight, in particular 1 to 95% by weight, of active compounds or their salts.
  • the active substance concentration in wettable powders is e.g. about 10 to 90% by weight, the remainder to 100% by weight consists of conventional formulation components.
  • the active substance concentration can be about 1 to 90, preferably 5 to 80,% by weight.
  • Dust-like formulations contain 1 to 30, preferably mostly 5 to 20% by weight of active ingredient, sprayable solutions about 0.05 to 80, preferably 2 to 50% by weight of active ingredient.
  • the active ingredient content depends in part on whether the active compound is in liquid or solid form and which granulating aids, fillers, etc. are used.
  • the active ingredient content of the water-dispersible granules is, for example, between 1 and 95% by weight, preferably between 10 and 80% by weight.
  • the active ingredient formulations mentioned may contain the usual adhesives, wetting agents, dispersing agents, emulsifying agents, penetration agents, preservatives, antifreeze agents and solvents, fillers, carriers and dyes, defoamers, evaporation inhibitors and the pH and viscosity
  • the herbicidal combination partners of group B (B1 to B9) with the sulfonyureas of group A (A1 to A1 8) can be used in mixture formulations or in a tank mix, for example known active compounds, such as those e.g. in Weed Research 26, 441 -445 (1 986), or "The Pesticide Manual", 1 1 th edition, The British Crop Protection Council, 1 997, Bracknell, England, and the literature cited therein.
  • the individual connections listed under A4 to A1 7 and B1 to B9 are generally designated with the "common name" according to the International Organization for Standardization (ISO).
  • the formulations present in the commercial form are optionally diluted in the customary manner, e.g. in the case of wettable powders, emulsifiable concentrates, dispersions and water-dispersible granules by means of water, and then applied to the plants, parts of plants or the agricultural soil on which the plants stand or in which they grow or are present as seeds.
  • Preparations in the form of dust, ground granules or scattering granules and sprayable solutions are usually no longer diluted with other inert substances before use.
  • the required application rate of the herbicidal compounds varies within wide limits, e.g. between 0.001 and 10.0 kg / ha or more of active substance, but it is preferably between 0.005 and 5 kg / ha.
  • the modified Murashige-Skoog medium (MS medium) used for the experiments is shown in Table 1.
  • the pH of the medium was adjusted to 5.8 after autoclaving.
  • the vitams were added to the medium before autoclaving (1 20 ° C; 1 5 min).
  • the phytohormone concentrations were varied for callus initiation, callus subculture and plant regeneration as described in the text.
  • the explants were cultivated on MS medium with a content of 0.05-0.5 mg naphthylacetic acid per liter medium at 25 ⁇ 2 ° C in a 1 2 h light / dark rhythm at approx. 500-2000 lux. Under these conditions, explants from some seedlings formed morphogenic callus within 2-3 weeks, which could be subcultured on the respective medium for months while maintaining its regenerative capacity.
  • Morphogenic sugar beet callus pieces are in medium with 0.1 to 1% ethyl methanesulfonate for 10 to 120 min. incubated, washed 3 times and cultivated in the medium. The surviving morphogenic callus segments are subcultured on fresh medium after 2 to 4 weeks. After a further 2 to 4 weeks, the calli can be used for selection experiments.
  • calli are transferred to the herbicidal (LD 98 ) agar media (0.8% agar) and evaluated after 6 to 8 weeks.
  • the Petri dishes are incubated with 1 to 2 hours of illumination per day at 1,000 to 2,000 lux and 25 ° C. Calli are formed in the media with the herbicides, which grow with the formation of shoot primordia.
  • Example 4 Selection of sulfonylurea tolerant sugar beet mutants in the presence of herbicide and safener.
  • the agar medium contained MS salts, vitamins and usual trace elements, 20 g sucrose, 0.8% agar, 0.5 mg / l BAP and 0.5 mg / l 2,4-D, pH 5.8.
  • Example 5 Regeneration of the sugar beet mutants, isolation of the mutated genes and production of transgenic sugar beets
  • regeneration medium hormone-free or hormone-containing medium differentiate from the embryogenic herbicide-compatible calli or cell colonies obtained according to Examples 3 and 4 within 1-2
  • Subculture periods (1-2 months) sprouts that root on hormone-free medium (i.e. without naphthylacetic acid and benzylaminopurine) during the following 1-3 subcultures.
  • hormone-free medium i.e. without naphthylacetic acid and benzylaminopurine
  • the plants are transferred to an inorganic substrate (e.g. vermiculite, pearlite) after the agar residues have been removed as completely as possible from the roots.
  • the plants are cultivated at 90 to 100% relative atmospheric humidity for the first 3-6 days.
  • the plants can then be cultivated either in the climatic chamber or in the greenhouse.
  • the regenerates are kept in hydroponic until a further 2 to 4 leaves are formed. Then the sugar beets can be transplanted into soil.
  • the plants are sprayed with herbicide solutions in customary application rates.
  • the herbicides are applied as 0.1 to 1% aqueous solutions.
  • the treated plants are rated visually after 1 4 to 28 days.
  • the test for herbicide resistance is carried out under conditions which lead to serious damage (degree of damage> 80%) in commercial (control plants).
  • transgenic sugar beets show a well-defined tolerance towards the applied sulfonyureas, i.e. comparatively little damage.
  • Example 7 Herbicidal action on harmful plants in crops of transgenic sugar beets
  • herbicidal scores are obtained in the further course of growth at intervals of 3-6 weeks

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung transgener Herbizid-toleranter Zellen, transgene Sulfonylharnstoff-tolerante Zuckerrüben sowie Verfahren zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs in Kulturen von transgenen Sulfonylharnstoff-toleranten Zuckerrüben.

Description

Transgene Sulfonylharnstoff-tolerante Zuckerrüben
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung transgener Herbizid-toleranter Zellen, transgene Sulfonylharnstoff-tolerante Zuckerrüben sowie Verfahren zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs in Kulturen von transgenen Sulfonylharnstoff-toleranten Zuckerrüben.
Die Verwendung von herbiziden Wirkstoffen, z.B. Sulfonylharnstoffen, zur Kontrolle von unerwünschtem Pflanzenwuchs in Nutzpflanzenkulturen ist in der Landwirtschaft weit verbreitet. Hierbei besteht häufig das Problem, daß die Kontrollmöglichkeit der Schadpflanzen durch die Herbizide nicht immer befriedigend ist. Werden hochwirksame Herbizide appliziert, um die Schadpflanzen zu bekämpfen, wird oftmals auch das Wachstum der Nutzpflanzenkulturen beeinträchtigt. Aus diesem Grunde sind herbizidtolerante Nutzpflanzen für die Landwirtschaft von besonderem Interesse.
Es sind bereits mehrfach Zuckerrüben beschrieben worden, die eine Toleranz gegenüber herbiziden Wirkstoffen, beispielsweise Sulfonylharnstoffe, Imidazolinone oder Inhibitoren des Enzyms Acetohydroxysäure Synthase (AHAS), aufweisen:
EP-A-0360750 beschreibt z.B. die Herstellung von AHAS-Inhibitor- toleranten Pflanzen durch Selektions- oder gentechnische Verfahren. Die Herbizid-Toleranz der Pflanzen gegenüber bestimmten ortho-substituierten N-Aryl-sulfonyl-N'-Pyrimidinylharnstoffen (Chlorsulf uron, Sulfometuronmethyl, Triasuifuron u.a.) wird hierbei durch einen erhöhten AHAS-Gehalt in den Pflanzen erzeugt.
BES JiGUNGS OPiE EP-B-01 54204 beschreibt transgene Pflanzen, die gegen ein 2-(2-lmidazolin- 2-yl)pyridin, ein 2-(2-lmidazolin-2-yl)chinolin, oder ein Sulfonamid-Herbizid aufgrund der Expression eines modifizierten AHAS-Gens resistent sind.
US 5, 1 98,599 beschreibt Sulfonylharnstoff- und Imidazolinon-tolerante Pflanzen, die durch Selektionsverfahren gewonnen wurden und u.a. eine Toleranz gegenüber Chlorsulfuron, Bensulfuron, Chlorimuron, Thifensulfuron und Sulfometuron aufweisen.
Desweiteren beschreiben US 5,01 3,659; US 5, 1 41 ,870 und US 5,378,824 die Einführung eines modifizierten Acetolactat-Synthase (ALS)-Gens aus Hefe in Zuckerrüben mittels gentechnischer Verfahren sowie die Herstellung von auf diesem Resistenzprinzip beruhenden Herbizid-toleranten pflanzlichen Mutanten auf entsprechenden Herbizid-haltigen Nährmedien. Darüber hinaus wird auch von Saunders et al. (Crop Science, 1 992, 32, 1 31 7-1 320) die
Herstellung von Sulfonylharnstoff-resistenten Zuckerrüben durch somatische Zellselektion geschildert.
In WO 98/02527 werden außerdem Zuckerrüben genannt, die gegenüber bestimmten Sulfonylharnstoffen und Herbiziden vom Imidazolinon-Typ resistent sind. Das in der WO 98/02527 beschriebene Resistenzprinzip beruht dabei auf zwei Punktmutationen innerhalb des ALS-Gens in den Positionen 337 und 562, die zu den Aminosäuresubstitutionen Ala113Thr und Pro188Ser in dem Enzym führen.
Die bislang im Stand der Technik beschriebenen transgenen Zuckerrüben ermöglichen jedoch nicht immer eine ausreichende Bekämpfung aller Schadpflanzen bzw. zeigen nicht immer eine befriedigende Toleranz gegenüber neueren Sulfonylharnstoff-Herbizid-Generationen, insbesondere einem oder mehreren der Sulfonylharnstoff-Herbizide der Gruppe A, bestehend aus A1 ) Verbindungen der Formel (I) und deren anorganische oder organische Salze,
Q-R
O i O o f
N — Y (I)
O H N
R1 Q 3
worin
Q Sauerstoff, Schwefel oder -N(R 34ι , Y CH oder N, R Wasserstoff (H), (C C12)-Alkyl; (C2-C10)-Alkenyl; (C2-C10)-Alkinyl; (C,-
C6)-Alkyl, das ein- bis vierfach durch Reste aus der Gruppe Halogen, (CrC4)-Alkoxy, (CrC4)-Thioalkyl, CN, (C2-C5)-Alkoxycarbonyl und (C2- C6)-Alkenyl substituiert ist; oder (C3-C8)-Cycloalkyl, das unsubstituiert oder durch Reste aus der Gruppe (CrC4)-Alkyl, (CrC4)-Alkoxy, (CrC4)- Alkylthio und Halogen substituiert ist; (C5-C8)-Cycloalkenyl; Phenyl-(Cr
C4)-alkyl, das im Phenylrest unsubstituiert oder durch einen oder mehrere Reste aus der Gruppe Halogen, (C,-C4)-Alkyl, (CrC4)-Alkoxy, (C.-C4)-Haloalkyl. (CrC4)-Thioalkyl, (C2-C5)-Alkoxycarbonyl, (C2-C5)- Alkylcarbonyloxy, Carbonamid, (C2-C5)-Alkylcarbonylamino, (C2-C5)- Alkylaminocarbonyl, Di-[(C C4)-alkyl]-carbonyl und Nitro substituiert ist; oder einen Rest der Formeln A-1 bis A-1 0
( } - C -Hπ,2 < v ) CH 2 — X — X
Figure imgf000005_0001
A-2 A-3 •CH, • CH, CH, CH,
Figure imgf000006_0002
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0003
Figure imgf000006_0004
A-4 A-5 A-6 A-7
-O
CH,
Figure imgf000006_0005
Figure imgf000006_0006
-o
A-8 A-9 A-10
worin X O, S, S(O) oder S02;
R1 Wasserstoff oder (CrC3)-Alkyl; R2 Wasserstoff, Halogen, (C C3)-Alkyl oder (CrC3)-Alkoxy, wobei die beiden letztgenannten Reste unsubstituiert oder durch ein- oder mehrfach durch Halogen oder (C--C3)-Alkoxy substituiert sind;
R Wasserstoff, Halogen, (C C3)-Alkyl, (C--C3)-Alkoxy oder (C,-C3)- Alkylthio, wobei die vorgenannten alkylhaltigen Reste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch Halogen oder ein- oder zweifach durch (C--C3)-Alkoxy oder (C--C3)-Alkylthio substituiert sind; oder einen Rest der Formel NR5R6, (C3-C6)-Cycloalkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C2-C4)-Alkinyl, (C3-C4)-Alkenyioxy oder (C3-C4)-Alkinyloxy;
R Wasserstoff, (C--C4)-Alkyl oder (CrC4)-Alkoxy und R5 und R6 unabhängig voneinander Wasserstoff, (C^-C -Alkyl, (C3-C4)-Alkenyl, (C^C -Haloalkyl oder (C C4)-Alkoxy bedeuten;
A2) Verbindungen der allgemeinen Formel II und deren anorganische oder organische Salze, W
Figure imgf000007_0001
2 N H - C - N R 7 - A (i i )
R 2 - C - R
N R R 5
worin
R1 CO-Q-R8,
R2, R3 unabhängig voneinander H oder (C--C4)Alkyl, R4 H, (C.-CJAlkyl, Hydroxy oder (CrC4)Alkoxy,
R5 (C--C4)Alkylsulfonyl, CHO, [(C,-C4)Alkyl]-carbonyl, das unsubstituiert oder durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert ist, [(C-- C4)Alkoxy]-oxalyl, [(C3-C6)Cycloalkyl]-carbonyl oder eine Gruppe der Formel W W W oder
- C - T - R9 -C - NR10R11 oder -C - N(R12)2
bedeuten, worin
W ein Sauerstoff- oder Schwefelatom (O oder S),
T O oder S,
R9 H, (C--C4)Alkyl, das unsubstituiert oder durch ein oder mehrere
Halogenatome oder durch (C,-C4)Alkoxy, (C--C4)Alkylthio,
[(CrC4)Alkoxy]-carbonyl und [(CrC4)Alkyl]-carbonyl substituiert ist, R10 und R1 1 unabhängig voneinander H, (C--C4)Alkyl, das unsubstituiert oder durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert ist, oder (C3-C4)-
Alkenyl oder (C3-C4)Alkinyl, wobei mindestens einer der Reste R10 und
R1 1 von Wasserstoff verschieden ist, die Reste R12 gemeinsam mit dem N-Atom einen heterocyclischen Ring mit 5 oder 6 Ringgliedern, der ein weiteres Heteroatom aus der Gruppe N, O und S in den verschiedenen Oxidationsstufen enthalten kann und unsubstituiert oder durch (C--C4)Alkyl oder die Oxogruppe substituiert ist, und Q O, S oder -NR13-,
R6 H, (CrC3)Alkyl, (CrC3)Alkoxy, Halogen, R8 unabhängig voneinander (CrC4)Alkyl, das unsubstituiert oder durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert ist, oder (C3-C4)-Alkenyl oder
(C3-C4)Alkinyl, A einen Rest der Formel
N-
woπn
Z CH oder N und einer der Reste X und Y Halogen, (CrC2)Alkyl, (C C2)Alkoxy, OCF2H, CF3 oder OCH2CF3 und der andere der Reste X und Y (CrC2)Alkyl, (C--C2)Alkoxy oder (C,-C2)Haloalkoxy bedeuten, R7 H oder CH3, R13 H, (CrC4)Alkyl, das unsubstituiert oder durch ein oder mehrere
Halogenatome substituiert ist, oder (C3-C4)-Alkenyl oder (C3-C4)Alkinyl bedeuten;
A3) Verbindungen der allgemeinen Formel III, deren N-Oxide oder anorganischen oder organischen Salze, f
\ N
S02NH
Figure imgf000009_0001
worin R . H, Halogen, (C C4)-Alkyl, das unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch Halogen substituiert ist, (C C4)-Alkoxy, (C C4)-Alkyithio ;
R2 H oder Methyl; R, Methyl oder Methoxy;
-N-(R4) R5;
RΛ H, (C^C^-Alky!, das unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch
Halogen, (C C6-)-Alkoxy, (C3-C6)-Alkenyloxy, (C3-C6)-Alkinyloxy oder
(C--C6)-Alkylthio substituiert ist;
R, H, (C C6)-Alkyl, das unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch
Halogen, (C--C6)-Alkoxy, (C3-C6)-Alkenyloxy, (C3-C6)-Alkinyloxy oder (C--
C6)-Alklythio substituiert ist, oder C(0)R6;
R« H, (C--C6)-Alkyl oder (C3-C6)-Cycloalkyl, die unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch Halogen oder (C C4)-Alkoxy substituiert sind, (C2-C6)-
Alkenyl, das unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch Halogen substituiert ist, (C2-C6)-Alkinyl, Phenyl, Benzyl oder Naphthyl, die unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch Halogen, (C1-C4)-Alkyl,
(C C4)-Haloalkyl, (CrC4)-Alkoxy, (CrC4)-Haloalkoxy, (C3-C6)-
Alkenyloxy, (C3-C6)-Alkinyloxy, Nitro, Cyano, COOR8, NR10R1 1 (
C(O)NR12R13 X, R15, S02NR16R17 oder durch X2R18 substituiert sind oder
OR7; R7 (C C6)-Alkyl, das unsubstituiert oder durch (C,-C4)-Alkoxy, (C3-C6)-
Cycloalkyl, Cyano, COOR19, oder CONR26R27 substituiert ist, (C C6)-
Haloalkyl, (C3-C6)-Alkenyl, (C3-C6)-Haloalkenyl, (C3-C6)-Alkinyl, (C3-C6)- Haloalkinyl, Oxetan-3-yi, oder (C4-C6)-Cycloalkyl, das unsubstituiert oder teilweise durch Halogen, (C--C4)-Alkyl oder (CrC4)-Alkoxy substituiert ist oder Phenyl, Benzyl oder Naphthyl, das unsubstituiert oder jeweils durch (CrC4)-Alkyl, (C,-C4)-Haloalkyl, (C C4)-Alkoxy, (C C4)- Haloalkoxy, (CrC4)-Alkylthio, (C C4)-Haloalkylthio, (C C4)-
Alkylsulfonyl, (CrC4)-Alkylsulfinyl, Nitro, Cyano, COOR22, NR20R21 , CONR23R24 oder durch S02NR25R9 substituiert ist; oder (CrC6)-Alkyl, X3R29 oder X4R30; R8 H, (C C6)-Alkyl, (C3-C6)-Alkenyl, (C3-C6)-Alkinyl oder Oxetan-3-yl; R9, R10, R- - , R12, R13, R16, R17, R20, R21 , R23, R24, R25, R26 und R27 jeweils unabhängig voneinander H, (CrC4)-Alkyl, (C3-C6)-Alkenyl oder (C3-C6)- Alkinyl; oder R-o und R20 jeweils unabhängig voneinander die Gruppen -C(0)-X5-(CrC4)-Alkyl oder -CfOMCT-C -Alkyl, die teilweise durch Halogen substituiert sein können; oder
R10 und R oder R12 und R13 oder R16 und R17 oder R20 und R21 oder R23 und R24 oder R25 und R9 oder R26 und R27 gemeinsam eine (C4-C5)-Alkylen-Kette bilden, die teilweise durch Sauerstoff oder NR14 unterbrochen sein kann, worin R14 H, (C C4)-Alkyl, (C3-C6)-Alkenyl oder (C3-C6)-Alkinyl;
R15 und R29 jeweils unabhängig voneinander (C,-C4)-Alkyl oder (C,-C4)-
Haloalkyl; R18 und R30 jeweils unabhängig voneinander durch COOR28 substituiertes (C-- C4)-Alkyl; R,9, R22 und R28 jeweils unabhängig voneinander H oder (C,-C4)-Alkyl, X, und X3 jeweils unabhängig voneinander S, SO oder S02; X2 und X4 jeweils unabhängig voneinander 0 oder S; X5 O oder NR14 bedeuten; A4) Amidosulfuron (21 , S.37); A5) Ethoxysulfuron (287, S.488); A6) Triasulfuron (723, S.1 222); A7) Metsulfuron (498, S.842); A8) Tribenuron (728, S.1 230);
A9) Flupyrsulfuron (348, S.586);
A10) Nicosulfuron (51 9, S.877);
A1 1 ) Rimsulfuron (644, S.1 095);
A1 2) Primisulfuron (589, S.997);
A1 3) Prosulfuron (61 3, S.1 041 );
A14) Sulfosulfuron (668, S.1 1 30);
A1 5) Oxasulfuron (542, S.91 1 );
A1 6) Ethametsulfuron (280, S.475);
A1 7) Imazosulfuron (41 6, S.703) und
A1 8) Verbindungen der Formel V,wie in EP-A-0496701 offenbart:
^CH3
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
Die suboptimale Toleranz der bislang verfügbaren transgenen Zuckerrüben gegenüber den genannten Sulfonyiharnstoffen führt bei den Aufwandmengen, wie sie z.B. bei schwer bekämpfbaren Schadpflanzen (z.B. Anthemis arvensis) erforderlich sind, oftmals zu einer eine Schädigung der Kulturpflanzen, die mit einer Ertragsminderung verbunden ist und somit einen erheblichen wirtschaftlichen Nachteil darstellt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Überwindung dieser Nachteile. Die Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst, indem Zuckerrüben bereitstellt werden, die gegenüber einem oder mehreren Sulfonyiharnstoffen der oben genannten (o.g.) allgemeinen Formeln I bis III, Amidosulfuron, Ethoxysulfuron Triasulfuron, Metsulfuron, Tribenuron, Flupyrsulfuron, Nicosulfuron, Rimsulfuron, Prosulfuron, Sulfosulfuron, Oxasulfuron, Etametsulfuron, Imazosulfuron und/oder Verbindungen der o.g. Formel V eine sehr gute Verträglichkeit, d.h. eine hohe Toleranz aufweisen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht auch in der Verbesserung von Verfahren zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs in erfindungsgemäßen transgenen Zuckerrüben-Kulturen.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch die Zugabe von Safenern zu Selektionsmedien, die herbizid wirksame Verbindungen enthalten, die Qualität und Quantität herbizidresistenter Zellen (Mutanten) verbessert wird, die aus den erfindungsgemäßen Selektionsverfahren resultieren. Die Zugabe von Safenern zu herbizidhaltigen Medien zum Auffinden von herbzidtoleranten Zellen (Mutanten) in vitro ist bisher nicht beschrieben worden.
Es wurden nun durch Selektion auf Sulfonylharnstoff-haltigen Nährmedien Zuckerrüben gefunden, die überraschenderweise die gewünschte Resistenz gegenüber Sulfonylharnstoff-Herbiziden der allgemeinen Formeln I bis III, Amidosulfuron, Ethoxysulfuron Triasulfuron, Metsulfuron, Tribenuron, Flupyrsulfuron, Nicosulfuron, Rimsulfuron, Prosulfuron, Sulfosulfuron, Oxasulfuron, Etametsulfuron, Imazosulfuron und/oder Verbindungen der o.g. Formel V aufweisen. Die in den erfindungsgemäßen Zuckerrüben enthaltenen Gene, die diese Sulfonylharnstoff-Resistenz verursachen, lassen sich nach dem Fachmann bekannten Methoden identifizieren, isolieren und zur Herstellung von transgenen Pflanzen, insbesondere Zuckerrüben verwenden.
Die erfindungsgemäßen Zuckerrüben weisen weitere überraschende Vorteile auf, indem sie z.B. durch die besagten Sulfonylharnstoffe in ihrem Wachstum gefördert werden oder einen veränderten Gehalt an Kohlenhydraten oder Stickstoff-haltigen Verbindungen (z.B. Aminosäuregehalt, Proteinen) aufweisen.
Darüber hinaus weist die vorliegende Erfindung auch noch weitere Vorteile auf, denn sie ermöglicht die Bekämpfung eines breiteren Spektrums von Schadpflanzen in den erfindungsgemäßen transgenen Zuckerrübenkulturen, so
10 daß eine schnellere und sicherere Wirksamkeit gegenüber den Schadpflanzen und/oder erheblich vereinfachte Kontrolle der Schadpflanzen möglich ist, indem z.B. eine einzige oder nur wenige Applikationen erforderlich sind. Neben der Applikation im Vorauflauf ist insbesondere die Nachauflauf-Applikation bevorzugt, ganz besonders in einem Zeitraum zwischen dem Keimblatt- und dem 1 2-Blatt-Stadium der Schadpflanzen oder zwischen dem Durchstoßen der Zuckerrüben und deren 1 2-Blatt-Stadium.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher transgene Sulfonylharnstoff-tolerante Zuckerrüben, deren Saat- oder Vermehrungsgut sowie deren Zellen, die gegenüber einem oder mehreren Sulfonyiharnstoffen, ausgewählt aus der Gruppe A, bestehend aus
A1 ) Verbindungen der o.g. allgemeinen Formel I,
A2) Verbindungen der o.g. allgemeinen Formel II, A3) Verbindungen der o.g. allgemeinen Formel III,
A4) Amidosulfuron (21 , S.37),
A5) Ethoxysulfuron (287, S.488),
A6) Triasulfuron (723, S.1 222),
A7) Metsulfuron (498, S.842), A8) Tribenuron (728, S.1 230),
A9) Flupyrsulfuron (348, S.586),
A1 0) Nicosulfuron (51 9, S.877),
A1 1 ) Rimsulfuron (644, S.1095)
A1 2) Primisulfuron (589, S.997) A1 3) Prosulfuron (61 3, S.1 041 )
A14) Sulfosulfuron (668, S.1 1 30)
A1 5) Oxasulfuron (542, S.91 1 );
A1 6) Ethametsulfuron (280, S.475);
A1 7) Imazosulfuron (41 6, S.703) und A1 8) Verbindungen der Formel V, wie in EP-A-0496701 offenbart,
11 Formel V:
SO.NHCONH
Figure imgf000014_0001
tolerant sind und die vorzugsweise durch ein oder mehrere Sulfonylharnstoffe ausgewählt aus der Gruppe A bestehend aus A1 bis A1 8 in ihrem Wachstum gefördert werden.
Es wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß die unter A4 bis A17 sowie B1 bis B9 (unten) im einzelnen aufgeführten Herbizide im "The Pesticide Manual", 1 1 th edition, The British Crop Protection Council, 1 997, Bracknell, England, und der dort zitierten Literatur beschrieben sind. Die einzelnen Verbindungen sind in der Regel mit dem "common name" nach der International Organization for Standardization (ISO) bezeichnet; die in Klammern angegebenen Ziffern kennzeichnen die Nummer des Eintrags sowie die Seitenzahl.
Die erfindungsgemäßen transgenen Sulfonylharnstoff-toleranten Zuckerrüben, deren Saat- oder Vermehrungsgut sowie deren Zellen können z.B. durch herkömmliche Kreuzungsverfahren neben dem erfindungsgemäßen Merkmal der Sulfonylharnstoff-Resistenz auch eine weitere Herbizidresistenz (z.B. gegen Glufosinate oder Glyphosate) aufweisen oder eine weitere gentechnische Modifikation enthalten, z.B. durch Einführung einer Insekten-, Pilz- oder Virusresistenz (z.B. durch Expression eines Bt-Toxins, einer Chitinase, Glucanase) oder auch in ihren metabolischen Eigenschaften modifiziert sein, so daß eine qualitative und/oder quantitative Änderung von Inhaltsstoffen (z.B. des Energie- Kohlenhydrat-, Fettsäure- oder Stickstoffstoffwechsels bzw. mit den Stoffwechselvorgängen in Zusammenhang stehenden Metabolitflüssen) resultiert.
12 Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Herbizid-toleranten Pflanzen, vorzugsweise von Sulfonylharnstoff-toleranten Pflanzen und ganz besonders von Sulfonylharnstoff-toleranten Zuckerrüben, dadurch gekennzeichnet, daß a) Zellen auf einem Herbizid-haltigen Nährmedium in Gegenwart eines oder mehrerer Safener kultiviert und selektioniert werden, b) die unter a) erhaltenen Zellen auf einem Herbizid-haltigen Nährmedium kultiviert und selektioniert werden und c) aus den unter b) erhaltenen Zellen die Gene, die die Herbizid-Toleranz verursachen identifiziert und isoliert werden, d) die aus c) erhaltenen Gene stabil in das Genom von Pflanzenzellen integriert werden und e) aus den unter d) erhaltenen Zellen intakte Pflanzen regeneriert werden.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist auch eine transgene Herbizid-resistente Pflanze, vorzugsweise transgene Sulfonylharnstoff-tolerante Pflanze und insbesondere transgene Sulfonylharnstoff-tolerante Zuckerrübe, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von transgenen Herbizidtoleranten und insbesondere Sulfonylharnstoff-toleranten Pflanzen erhältlich ist.
Vorzugsweise werden in dem erfiπdungsgemäßen Verfahren zur Herstellung transgener Herbizid-toleranten Pflanzen eu- oder prokaryontischen Zellen eingesetzt, insbesondere solchen aus Pflanzen, Bakterien oder Hefen, die in Gegenwart mindestens einer herbizid wirksamen Verbindungen und mindestens eines Safeners unter geeigneten Bedingungen kultiviert und selektiert werden. Insbesondere erfolgt die Selektion in Gegenwart von Herbizidkonzentrationenen, die zu > 50%, vorzugsweise zu >90%, besonders bevorzugt zu > 95% und ganz besonders bevorzugt zu >99 % für die Zellen letal sind, speziell in Gegenwart von Sulfonylharnstoff-Herbiziden.
13 Überraschenderweise wurde eine Steigerung der Quantität und/oder eine Verbesserung der Qualität der selektierten Mutanten nicht nur in Gegenwart von Herbizid-Safener-Mischungen beobachtet, deren agronomische Verwendung an der Kulturpflanze bekannt ist, sondern auch in Gegenwart von Herbizid-Safener- Mischungen von denen eine agronomisch geeignete Verwendung bisher völlig unbekannt ist.
In den erfindungsgemäßen Verfahren werden beispielsweise zur qualitativen und/oder quantitativen Verbesserung der Mutantenausbeute die Zellen, vorzugsweise Zellsuspensionen in Gegenwart von einem oder mehreren Herbizid und einem oder mehreren Safener in einem Konzentrationsbereich von 10"3 M bis 10'7 M, vorzugsweise im Bereich von '\0A M bis 10"6 M behandelt und nach einem Zeitraum von etwa einem Tag bis 2 Wochen, vorzugsweise etwa 3-10 Tagen, z.B. einer Woche die Zellen mit frischem Zellkulturmedium ohne Herbizid, aber mit Safener versetzt und dieser Subkulturschritt über etwa 3 - 5 Zyklen fortgesetzt. Danach werden die Zellsuspensionen z.B. auf Agarmedien mit dem jeweiligen herbiziden Wirkstoff (im Konzentrationsbereich von 10"3 M bis 10'7 M, vorzugsweise 10"4 M bis 10"6 M) mit und ohne Safener (im Konzentrationsbereich 10"3 M bis 10'7 M, vorzugsweise 10-4 M bis 10"6 M) ausplattiert. Das Konzentrationsverhältnis von Safener zu herbizidem Wirkstoff in der Mixtur kann dabei im Verhältnis von 100:1 bis 1 :100 differieren, vorzugsweise im Bereich 10:1 bis 1 :10. Etwa 2 - 8 Wochen nach dem Ausplattieren der Zellsuspension, vorzugsweise etwa 3 - 6 Wochen nach dem Ausplattieren, lassen sich die herbizidresistenten Zeilklone auf frisches Selektionsmedium überführen. Dabei kann entweder die Herbizidkonzentration beibehalten werden oder um den Faktor 2 - 100, vorzugsweise um den Faktor 2 - 10 erhöht werden. Zellmutanten mit einer gegenüber den Wildtypzellen signifikant erhöhten Herbizidresistenz werden für die sich anschließende Pflanzenregeneration verwendet. Dazu werden die Mutanten auf/in Kulturmedien subkultiviert, die den für den jeweiligen Genotyp notwendigen Gehalt an Cytokininen und/oder Auxinen aufweisen. Die
Pflanzenregeneration kann dabei in An- oder Abwesenheit von Herbizid oder
14 gegebenenfalls Herbizid-Safener-Mixtur durchgeführt werden.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet "Safener" eine Verbindung, mittels derer der durch ein Herbizid möglicherweise verursachte Schaden an einer Kulturpflanze reduziert oder vermieden werden kann. Beispiele für geeignete Safener sind solche, die in Kombination mit Sulfonylharnstoff-Herbiziden, vorzugsweise, Phenylsulfonylharnstoffen Safenerwirkung entfalten. Geeignete Safener sind aus WO-A-96/14747 und der dort zitierten Literatur bekannt. Folgende Gruppen von Verbindungen sind beispielsweise als Safener für die oben erwähnten herbiziden Wirkstoffe (A) geeignet: a) Verbindungen vom Typ der Dichlorphenylpyrazolin-3-carbonsäure, vorzugsweise Verbindungen wie
1-(2,4-Dichlorphenyl)-5-(ethoxycarbonyl)-5-methyl-2-pyrazolin-3- carbonsäureethylester, und verwandte Verbindungen, wie sie in der WO 91/07874 beschrieben sind, b) Derivate der Dichlorphenylpyrazolcarbonsäure, vorzugsweise Verbindungen wie 1-(2,4-Dichlorphenyl)-5-methyl-pyrazol-3-carbonsäureethylester, 1-(2,4-Dichlorphenyl)-5-isopropyl-pyrazol-3-carbonsäureethylester, 1-(2,4-Dichlorphenyl)-5-(1 ,1-dimethyl-ethyl)pyrazol-3-carbonsäureethyi-ester (S1-4), 1-(2,4-Dichlorphenyl)-5-phenyi-pyrazol-3-carbonsäureethylester
(S1-5) und verwandte Verbindungen, wie sie in EP-A-333 131 und EP-A-269 806 beschrieben sind. c) Verbindungen vom Typ der Triazolcarbonsäuren, vorzugsweise Verbindungen wie Fenchlorazol, d.h. 1 -(2,4-Dichlorphenyl)-5-trichlormethyl-(1 H)-1 ,2,4-triazol-3- carbonsäureethyiester, und verwandte Verbindungen (siehe EP-A-174 562 und EP-A-346 620); d) Verbindungen vom Typ der 5-Benzyl- oder 5-Phenyl-2-isoxazolin-3- carbonsäure, oder der 5,5-Diphenyl-2-isoxazolin-3-carbonsäure vorzugsweise Verbindungen wie 5-(2,4-Dichlorbenzyl)-2-isoxazolin-3- carbonsäureethylester oder 5-Phenyl-2-isoxazolin-3-carbonsäureethylester
15 und verwandte Verbindungen, wie sie in WO 91/08202 beschrieben sind, bzw. der 5,5-Diphenyl-2-isoxazolin-carbonsäureethylester oder -n- propylester oder der 5-(4-Fluorphenyl)-5-phenyl-2-isoxazolin-3- carbonsäureethylester, wie sie in WO-A-95/07897 beschrieben sind. e) Verbindungen vom Typ der 8-Chinolinoxyessigsäure, vorzugsweise (5-Chlor-8-chinolinoxy)-essigsäure-(1 -methyl-hex-1 -yl)-ester, (5-Chlor-8-chinolinoxy)-essigsäure-(1 ,3-dimethyl-but-1-yl)-ester, (5-Chlor-8-chinolinoxy)-essigsäure-4-allyl-oxy-butylester, (5-Chlor-8-chinolinoxy)-essigsäure-1-allyloxy-prop-2-ylester, (5-Chlor-8-chinolinoxy)-essigsäureethylester,
(5-Chlor-8-chinolinoxy)-essigsäuremethylester, (5-Chlor-8-chinolinoxy)-essigsäureallylester, (5-Chlor-8-chinolinoxy)-essigsäure-2-(2-propyiiden-iminoxy)-1- ethyiester, (5-Chlor-8-chinolinoxy)-essigsäure-2-oxo-prop-1-ylester und verwandte Verbindungen, wie sie in EP-A-86 750, EP-A-94 349 und EP-A-191 736 oder EP-A-0 492 366 beschrieben sind. f) Verbindungen vom Typ der (5-Chlor-8-chinolinoxy)-malonsäure, vorzugsweise Verbindungen wie (5-Chlor-8-chinolinoxy)-malonsäure- diethylester, (5-Chlor-8-chinolinoxy)-malonsäurediallylester,
(5-Chlor-8-chinolinoxy)-malonsäure-methyl-ethylester und verwandte Verbindungen, wie sie in EP-A-0 582 198 beschrieben sind. g) Wirkstoffe vom Typ der Phenoxyessig- bzw. -propionsäurederivate bzw. der aromatischen Carbonsäuren, wie z.B. 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure(ester) (2,4-D), 4-Chlor-2-methyl-phenoxy-propionester (Mecoprop), MCPA oder
3,6-Dichlor-2-methoxy-benzoesäure(ester) (Dicamba).
Für den Fachmann bestehen im allgemeinen verschiedene Möglichkeiten, Herbizid-tolerante pflanzliche Mutanten zu selektieren, wie z.B. in der US 5, 162,602 oder US 4,761 ,373 beschrieben.
16 Darüber hinaus können pflanzliche Mutanten bzw. Zellinien auch selektiert werden, indem z.B. Saatgut oder Zellkulturen (Kallus- oder Suspensionskulturen) in geeignetem Medium in Gegenwart steigender Herbizidkonzentrationen angezogen wird. Darüber hinaus kann bei diesem Selektionsverfahren der Zusatz eines geeigneten Mutagens (vgl. z.B. US 4,443,971 ) das Auftreten von Mutationen signifikant erhöhen.
Die erfindungsgemäßen Merkmale der transgenen Sulfonylharnstoff- resistenten Zuckerrüben können auch in z.B. transgene Zuckerrüben nach herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Züchtungsverfahren eingekreuzt werden.
Aus den erhaltenen Mutanten (Herbizid-toleranten Zellen) lassen sich mittels der dem Fachmann bekannten gentechnologischen Verfahren die mutierten Gene identifizieren und isolieren, die das Resistenzphänomen verursachen. Mit Hilfe der isolierten Gene lassen sich anschließend ausgewählte Pflanzen, vorzugsweise Zuckerrüben nach wiederum dem Fachmann bekannten Verfahren transformieren, so daß transgene Pflanzen erhalten werden können. Diese können sich durch weitere vorteilhafte Eigenschaften auszeichnen, beispielsweise durch einen gesteigerten Ertrag, Resistenzen gegenüber bestimmten Pestiziden, vor allem gegenüber bestimmten Herbiziden oder Schadinsekten, Resistenzen gegenüber Pflanzenkrankheiten oder Erregern von Pflanzenkrankheiten wie bestimmten Insekten oder Milben oder Mikroorganismen wie Pilzen, Bakterien oder Viren. Andere Eigenschaften betreffen z. B. auch das Erntegut hinsichtlich Menge, Qualität, Lagerfähigkeit, Zusammensetzung oder spezieller Inhaltsstoffe.
Wege zur Herstellung transgener Pflanzen, die im Vergleich zu natürlich vorkommenden Pflanzen modifizierte Eigenschaften aufweisen, bestehen beispielsweise in der Anwendung gentechnischer Verfahren (siehe z.B. Willmitzer L., 1 993, Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multivolume
17 Comprehensive Treatise, Rehm et al. (eds.) Vol.2, 627-659, VCH Weinheim, Germany; D ^ Halluin et al., 1 992, Biotechnology 1 0, 309-31 4, McCormick et al. Plant Cell Reports, 1 986, 5, 81 -84, EP-A-0221 044, EP-A-01 31 624) .
Beschrieben wurden beispielsweise die Herstellung von gentechnisch modifizierten Pflanzen in bezug auf Modifikationen des pflanzlichen Kohlenhydratstoffwechsels (z. B. WO 94/28146, WO 92/1 1 376, WO 92/14827, WO 91 /1 9806), Resistenzen gegen bestimmte Herbizide, z.B. vom Typ Glufosinate (vgl. z. B. EP-A-0242236, EP-A-242246) oder Glyphosate (z.B. WO 92/00377), Resistenzen gegen bestimmte Schädlinge, z.B. aufgrund der Fähigkeit bestimmte Bacillus thuringiensis-Toxine (Bt-Toxine) oder Amino- oder Metalloprotease-Inhibitoren zu produzieren (z.B. EP-A-0142924, EP-A-01 93259, WO 95/35031 ).
Insbesondere sind Verfahren zur Herstellung transgener Zuckerrüben mit verändertem Saccharose-Gehalt durch Modifikationen der Genexpression der Enzyme ADP-Glukose-Pyrophosphorylase, Sucrosephosphat-Synthase und Sucrose-Synthase in WO 94/28146 ausführlich beschrieben. Daher sei an dieser Stelle ausdrücklich auf WO 94/281 46 verwiesen, deren Inhalt durch Referenz in die vorliegende Anmeldung integriert wird.
Zahlreiche molekularbiologische Techniken, mit denen transgene Pflanzen mit veränderten Eigenschaften hergestellt werden können, sind dem Fachmann bekannt; siehe z.B. Sambrook et al., 1 989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; oder Winnacker "Gene und Klone", VCH Weinheim 2. Auflage 1 996 oder Christou, "Trends in Plant Science" 1 (1 996) 423-431 ).
Für derartige gentechnische Manipulationen können geeignete Nucleinsäuremoleküle z.B. mittels geeigneter Vektoren, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen
18 erlauben, in Pflanzen bzw. pflanzliche Zellen eingebracht werden. Mit Hilfe der obengenannten Standardverfahren können auch z. B. Basenaustausche vorgenommen, Teilsequenzen entfernt oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Es können auch z.B. die natürlich vorkommenden Gene vollständig durch heterologe bzw. synthetische Gene vorzugsweise unter der Kontrolle eines in Pflanzenzellen aktiven Promoters ersetzt werden („gene replacement"). Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Die Herstellung von Pflanzenzelleπ mit einer verringerten Aktivität eines Genprodukts kann beispielsweise erzielt werden durch die Expression mindestens einer entsprechenden antisense-RNA, einer sense-RNA zur Erzielung eines Cosuppressionseffektes oder die Expression mindestens eines entsprechend konstruierten Ribozyms, das spezifisch Transkripte des obengenannten Genprodukts spaltet.
Hierzu können zum einen DNA-Moleküle verwendet werden, die die gesamte codierende Sequenz eines Genprodukts einschließlich eventuell vorhandener flankierender Sequenzen umfassen, als auch DNA-Moleküle, die nur Teile der codierenden Sequenz umfassen, wobei diese Teile lang genug sein müssen, um in den Zellen einen antisense-Effekt zu bewirken. Möglich ist auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die einen hohen Grad an Homologie zu den codiereden Sequenzen eines Genprodukts aufweisen, aber nicht vollkommen identisch sind.
Bei der Expression von Nucieinsäuremolekülen in Pflanzen kann das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein. Um aber die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, kann z. B. die codierende Region mit DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in einem bestimmten Kompartiment oder zu
19 einem bestimmten Zeitpunkt (zu einem bestimmten Stadium oder chemisch oder biologisch induziert) gewährleisten (z.B. Transit- oder Signaipeptide, zeit- oder ortsspezifische Promotoren) . Derartige Sequenzen sind dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 1 1 (1 992), 321 9-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1 988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 ( 1 991 ), 95-106) .
Die transgenen Pflanzenzellen können nach bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden.
Auf diese Weise sind transgene Zuckerrüben erhältlich, die veränderte Eigenschaften durch Überexpression, Suppression oder Inhibierung homologer (d.h. endogener) Gene oder Gensequenzen oder Expression heterologer (d.h. exogener) Gene oder Gensequenzen aufweisen.
Außerdem ist ein Erfindungsgegenstand die Verwendung von erfindungsgemäßen Zuckerrüben, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind in der Landwirtschaft, als Futtermittel oder für die Lebensmittelindustrie, insbesondere zur Zuckergewinnung.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Kontrolle von unerwünschtem Pflanzenwuchs in Kulturen der erfindungsgemäßen transgenen Zuckerrüben, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Pflanzen, deren Saat- oder Vermehrungsgut oder deren Anbaufläche ein oder mehrere Sulfonylharnstoffe ausgewählt aus der Gruppe A bestehend aus A1 bis A1 8, gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren Herbiziden ausgewählt aus der Gruppe B bestehend aus B1 ) Herbiziden aus der Klasse der Imidazolinone, vorzugsweise Imazethapyr (41 5, S.701 ), Imazamethapyr (2, S.5, AC 263,222), Imazapyr (41 3, S.697), Imazaquin (41 4, S.699), Imazamox (41 2, S.696);
B2) Herbiziden aus der Klasse der Inhibitoren des photosynthetischen
20 Elektronentransports, vorzugsweise der Biscarbamate, besonders bevorzugt Phenmedipham (563, S.948), Desmedipham (206, S.349); B3) einem Herbizid aus der Klasse der PPO-Hemmer, z.B. der Diphenylether oder der Azole, vorzugsweise Azifluorfen (7, S.1 2), Oxyfluorfen (547, S.91 9), Pyraflufen (61 7, S.1 048), Carfentrazone (1 1 2, S.1 91 ), Lactofen (442, S.747), Nitrofen (S1 1 93, S.1 343), Oxadiargyi (538, S.904), Fluoroglycofen (344, S.580), Sulfentrazone (665, S.1 1 26) oder auch ein CF3-Uracil der Formel IV wie in US Patent 5, 1 83,492 offenbart:
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B4) einem Herbizid aus der Klasse der Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPDO)-Inhibitoren, z.B. der Triketone, vorzugsweise Isoxaflutole (436, S.737), Isoxachlortole (RPA-201 735) oder Sulcotrione (664, S.1 1 24); B5) einem Herbizid aus der Klasse der herbizid wirksamen, gegebenenfalls synthetischen Auxine oder deren Transporthemmer, vorzugsweise Quinmerac (636, S.1 080), Clopyralid (1 53, S.260), Diflufenzopyr (50, S.81 , BAS 65400H); B6) einem Herbizid aus der Klasse der Lipid- oder der Fettsäure-Synthese- Inhibitoren, vorzugsweise der Aryloxyphenoxycarbonsäuren oder der Cyclohexandionoxime, besonders bevorzugt Fenoxaprop (309, S.51 9), Haloxyfop (390, S.659), Fluazifop (327-328, S.553-557), Quizalofop (640- 641 , S.1 087-1092), Clodinafop (147, S.251 ), Propaquizafop (602, S.1 021 ), Clethodim (146, S.250), Sethoxidim (648, S.1 101 ), Tepraloxydim (49, S.80, BAS 620H, Caloxydim), Butroxidim (98, S.1 67) und Cycloxidim (1 74, S.290) oder Prosulfocarb (61 2, S.1040);
21 B7) einem Herbizid aus der Klasse der Glutamin-Synthetase-Inhibitoren, vorzugsweise Phosphinoaminosaure-Derivate, besonders bevorzugt glufosinate
(382, S.643);
B8) einem Herbizid aus der Klasse der 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-
Synthase-Inhibitoren, vorzugsweise glyphosate (383, S.646);
B9) einem Herbizid aus der Klasse der Benzofuranylalkansulfonate, vorzugsweise Ethofumesate (285, S.484) oder diese Wirkstoffe der Gruppe A oder B enthaltende herbizide Mittel zeitgleich oder aufeinanderfolgend appiiziert werden.
Und schließlich ist ein Erfindungsgegenstand auch die Verwendung von einem oder mehreren Sulfonyiharnstoffen ausgewählt aus der Gruppe A (A1 bis A1 8) wie definiert, ggf. in Kombination mit einem oder mehreren Herbiziden ausgewählt aus der Gruppe B, bestehend aus B1 bis B9, oder diese enthaltende herbizide Mittel auf Anbauflächen von erfindungsgemäßen Zuckerrübenkulturen.
Sofern es sich um chirale Verbindungen handelt, werden von den unter A1 bis A1 8 sowie unter B1 bis B9 genannten Wirkstoffen sowohl deren racemische Gemische als auch deren aktive Enantiomere umfaßt. Außerdem sind auch die Salze der unter A1 bis A1 8 sowie unter B1 bis B9 genannten Wirkstoffe mit organischen oder anorganischen Säuren oder Basen umfaßt, sofern es sich um Salzbildner handelt. Ebenso sind auch ggf. die Ester der unter A1 bis A1 8 sowie unter B1 bis B9 genannten Wirkstoffe umfaßt, sofern diese herbizid wirksam sind.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Kontrolle von Schadpflanzen in den erfindungsgemäßen Zuckerrübenkulturen mit den Sulfonyiharnstoffen der Gruppe A (A1 bis A1 8) eröffnen eine ökonomisch und ökologisch vorteilhafte Kontrolle von Schadpflanzen. Die Vorteile liegen z.B. in einem positiven wachstumsregulatorischen Effekt, einer verminderten Anzahl von
22 Applikationen bzw. einer Reduzierung der Aufwandmengen (im Vergleich zur konventionellen Anwendung herbizider Mittel), einer in der Regel guten biologischen Bodenabbaubarkeit, einer geringen Belastung im Nachanbau und/oder einer guten Nützlingsschonung.
Insbesondere die Kombinationsmöglichkeiten von herbiziden Wirkstoffen der Gruppe A (d.h. Sulfonylharnstoffe A1 bis A1 8) mit Herbiziden der Gruppe B (d.h. Herbizide B1 bis B9) erweisen sich in den erfindungsgemäßen Verfahren zur Kontrolle von Schadpfianzen als besonders vorteilhaft.
Unter dem Begriff „Herbizid-tolerant" ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung zu verstehen, daß die Herbizid-toleranten transgenen Zuckerrüben in Gegenwart eines oder mehrerer Herbizide, insbesondere Sulfonylharnstoffe der Gruppe A, und gegegebenenfalls in Kombination mit Herbiziden der Gruppe B keine appareπte Beeinträchtigung ihrer physiologischen Funktionen zeigen, wobei dieselben Herbizide bzw. Sulfonylharnstoffe bei nicht-toleranten Pflanzen, eine das Wachstum beeinträchtigende oder phytotoxische Wirkung zeigen. Art und Ausmaß der Herbizidtoleranz hängen dabei vom jeweiligen Herbizid, der jeweiligen Dosierung und allgemeinen Wachstumsbedingungen ab.
Besonders bevorzugt besitzen die erfindungsgemäßen transgenen Zuckerrüben, deren Saat- oder Vermehrungsgut oder deren Zellen eine Toleranz gegenüber Verbindungen der allgemeinen Formel I in einem Konzentrationsbereich von 0,5-40, insbesondere 1 -20 und ganz besonders 3- 10 g a.i./ha, gegenüber Verbindungen der allgemeinen Formel II in einem Konzentrationsbereich von 1 -40, insbesondere 2-20 und ganz besonders 6-1 0 g a.i./ha, gegenüber Verbindungen der allgemeinen Formel III in einem Konzentrationsbereich von 0,5-50, insbesondere 1 -25 und ganz besonders 3- 1 2,5 g a.i./ha, gegenüber Amidosulfuron in einem Konzentrationsbereich von 1 -60, insbesondere 2-30 und ganz besonders 6-1 5 g a.i./ha, gegenüber
23 Ethoxysulfuron in einem Konzentrationsbereich von 5-1 20, insbesondere 1 0- 60 und ganz besonders 20-30 g a.i./ha, gegenüber Triasulfuron in einem Konzentrationsbereich von 1 -80, insbesondere 2-40 und ganz besonders 6-20 g a.i./ha, gegenüber Metsulfuron in einem Konzentrationsbereich von 0, 1 -50, insbesondere 1 -25 und ganz besonders 3-1 2,5 g a.i./ha, gegenüber Tribenuron in einem Konzentrationsbereich von 3-1 00, insbesondere 6-50 und ganz besonders 1 0-25 g a.i./ha, gegenüber Flupyrsulfuron in einem Konzentrationsbereich von 1 -80, insbesondere 2-40 und ganz besonders 6-20 g a.i./ha, gegenüber Nicosulfuron in einem Konzentrationsbereich von 1 -1 20, insbesondere 2-60 und ganz besonders 6-30 g a.i./ha, gegenüber Rimsulfuron in einem Konzentrationsbereich von 0,1 -60, insbesondere 0,2-30 und ganz besonders 0,6-1 5 g a.i./ha, gegenüber Primisulfuron in einem Konzentrationsbereich von 1 -100, insbesondere 2-50 und ganz besonders 6- 25 g a.i./ha, gegenüber Prosulfuron in einem Konzentrationsbereich von 1 -90, insbesondere 2-45 und ganz besonders 6-25 g a.i./ha, gegenüber
Sulfosulfuron in einem Konzentrationsbereich von 1 -90, insbesondere 2-45 und ganz besonders 6-25 g a.i./ha, gegenüber Oxasulfuron in einem Konzentrationsbereich von 5-250, insbesondere 10-1 25 und ganz besonders 30-65 g a.i./ha, gegenüber Etametsulf uron in einem Konzentrationsbereich von 0, 1 -50, insbesondere 0,2- 25 und ganz besonders 0,6-1 2,5 g a.i./ha, gegenüber Imazosulfuron in einem Konzentrationsbereich von 1 0-250, insbesondere 20-1 25 und ganz besonders 30-65 g a.i./ha, und/oder gegenüber Verbindungen der Formel V in einem Konzentrationsbereich von 0,5-1 20, insbesondere 1 -60 und ganz besonders 3- 30 g a.i./ha.
Der Begriff „Saat- oder Vermehrungsgut" beinhaltet sowohl vegetatives als auch geschlechtliches Vermehrungsgut wie Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, Calli, Protoplasten, Zellkulturen etc..
Unter dem Begriff „Zuckerrübe" sind nicht nur ganze Pflanzen zu verstehen,
24 die durch Selektion erhalten bzw. erzeugt werden können, sondern ggf. auch deren Teile wie Wurzeln, Blätter, Stengel Knollen und weitere Zellverbände sowie von diesen Pflanzen abstammende Generationen.
Der Begriff „erfindungsgemäße Zuckerrübenkultur" umfaßt im allgemeinen
Kulturen der erfindungsgemäßen transgenen Zuckerrüben und deren Saat- oder Vermehrungsgut sowie ggf. auch die Anbauflächen solcher Pflanzen.
Diese können sich durch weitere vorteilhafte Eigenschaften auszeichnen, beispielsweise durch einen gesteigerten Ertrag, Resistenzen gegenüber bestimmten Pestiziden, vor allem gegenüber bestimmten Herbiziden oder Schadinsekten, Resistenzen gegenüber Pflanzenkrankheiten oder Erregern von Pflanzenkrankheiten wie bestimmten Insekten oder Milben oder Mikroorganismen wie Pilzen, Bakterien oder Viren. Andere Eigenschaften betreffen z. B. auch das Erntegut hinsichtlich Menge, Qualität, Lagerfähigkeit, Zusammensetzung oder spezieller Inhaltsstoffe.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren zur Kontrolle (Bekämpfung) von unerwünschtem Pflanzenwuchs kann ein breites Spektrum wirtschaftlich wichtiger mono- und dikotyler Schadpflanzen hervorragend bekämpft werden. Auch schwer bekämpfbare perennierende Unkräuter, die aus Rhizomen, Wurzeistöcken oder anderen Dauerorganen austreiben, werden durch die Verfahren ausgezeichnet erfaßt. Dabei ist es gleichgültig, ob die Substanzen oder Mittel im Vorsaat-, Vorauflauf- oder Nachauflaufverfahren ausgebracht werden. Im einzelnen seien beispielsweise einige Vertreter der mono- und dikotylen Unkrautflora genannt, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren kontrolliert werden können, ohne daß durch die Nennung eine Beschränkung auf bestimmte Arten erfolgen soll.
Auf der Seite der monokotylen Unkrautarten werden z.B. Avena, Lolium, Alopecurus, Apera, Poa, Phalaris, Echinochloa, Digitaria, Setaria sowie
25 Cyperusarten aus der annuellen Gruppe und auf seiten der perennierenden Spezies Agropyron, Cynodon, Sorghum, ausdauernde Cyperusarten und auch Ausfallgetreide wie Weizen, Gerste usw. gut erfaßt.
Bei dikotylen Unkrautarten erstreckt sich das Wirkungsspektrum auf Arten wie z.B. Galium, Viola, Veronica, Lamium, Stellaria, Amaranthus, Sinapis, Matricaria, Abutilon, Polygonum, Galinsoga, Mercurialis, Solanum, Chinopodium, Kochia, Anthemis und Sonchus auf der annuellen Seite sowie Convolvulus, Cirsium und Rumexbei den perennierenden Unkräutern und auch Ausfallkulturen wie Kartoffel, Raps usw..
Werden in den erfindungsgemäßen Verfahren die Verbindungen oder Mittel vor dem Keimen auf die Erdoberfläche appliziert, so wird entweder das Auflaufen der Unkrautkeimlinge vollständig verhindert oder die Unkräuter wachsen bis zum Keimblattstadium heran, stellen jedoch dann ihr Wachstum ein und sterben schließlich nach Ablauf von drei bis vier Wochen vollkommen ab.
Bei Applikation der Wirkstoffe oder Mittel auf die grünen Pflanzenteile im Nachauflaufverfahren tritt ebenfalls sehr rasch nach der Behandlung ein drastischer Wachstumsstop ein und die Unkrautpflanzen bleiben in dem zum Applikationszeitpunkt vorhandenen Wachstumsstadium stehen oder sterben nach einer gewissen Zeit ganz ab, so daß auf diese Weise eine für die Kulturpflanzen schädliche Unkrautkonkurrenz sehr früh und nachhaltig beseitigt wird.
In den erfindungsgemäßen Zuckerrübenkulturen sind durch geeignete Applikation der herbiziden Wirkstoffe bzw. deren Kombinationen die folgenden, bislang besonders schwer bekämpfbaren Schadpflanzen wie Anthemis, Agropyron, Chinopodium, Cirsium, Kochia, Polygonum, Matriciaria, sowie Durchwuchs/Ausfallkulturen und im allgemeinen auch Unkräuter in späteren Wachstumsstadien gut, d.h. vorzugsweise zu > 80% und
26 insbesondere zu > 90% zu kontrollieren.
Obgleich mit den erfindungsgemäßen Verfahren eine ausgezeichnete herbizide Wirkung gegenüber mono- und dikotylen Unkräutern erreicht wird, werden die erfindungsgemäßen Kulturpflanzen nur unwesentlich oder gar nicht geschädigt. Die vorliegenden Verfahren eignen sich aus diesen Gründen sehr gut zur selektiven Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs in landwirtschaftlichen Kulturen der erfindungsgemäßen Zuckerrüben.
Darüber hinaus werden mit den erfindungsgemäßen Verfahren hervorragende zusätzliche Effekte in den erfindungsgemäßen Zuckerrüben erzielt. Sie greifen regulierend in den pflanzeneigenen Stoffwechsel ein und können damit zur gezielten Förderung von Pfianzeninhaltsstoffen und des Ernteertrages eingesetzt werden.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Verbindungen oder Mittel können in Form von Spritzpulvern, emulgierbaren Konzentraten, versprühbaren Lösungen, Stäubemitteln oder Granulaten in den üblichen Zubereitungen angewendet werden und können auf verschiedene Art formuliert sein, je nachdem welche biologischen und/oder chemischphysikalischen Parameter vorgegeben sind. Als Formulierungsmöglichkeiten kommen beispielsweise in Frage: Spritzpulver (WP), wasserlösliche Pulver (SP), wasserlösliche Konzentrate, emulgierbare Konzentrate (EC), Emulsionen (EW), wie Öl-in-Wasser- und Wasser-in-ÖI-Emuisionen, versprühbare Lösungen, Suspensionskonzentrate (SC), Dispersionen auf Öl- oder
Wasserbasis, ölmischbare Lösungen, Kapselsuspensionen (CS), Stäubemittel (DP), Beizmittel, Granulate für die Streu- und Bodenapplikation, Granulate (GR) in Form von Mikro-, Sprüh-, Aufzugs- und Adsorptionsgranulaten, wasserdispergierbare Granulate (WG), wasserlösliche Granulate (SG), ULV- Formulierungen, Mikrokapseln und Wachse.
27 Diese einzelnen Formulierungstypen sind im Prinzip bekannt und werden beispielsweise beschrieben in: Winnacker-Küchler, "Chemische Technologie", Band 7, C. Hauser Verlag München, 4. Aufl. 1 986, Wade van Valkenburg, "Pesticide Formulations", Marcel Dekker, N.Y., 1 973, K. Martens, "Spray Drying" Handbook, 3rd Ed. 1 979, G. Goodwin Ltd. London.
Auf der Basis dieser Formulierungen lassen sich auch Kombinationen mit anderen pestizid wirksamen Stoffen, wie z.B. Insektiziden, Akariziden, Fungiziden, Safenern, Düngemitteln und/oder Wachstumsregulatoren applizieren, z.B. in Form einer Fertigformulierung oder als Tankmix.
Die agrochemischen Zubereitungen enthalten in der Regel 0, 1 bis 99 Gew.-%, insbesondere 1 bis 95 Gew.-%, Wirkstoffe oder deren Salze.
In Spritzpulvern beträgt die Wirkstoffkonzentration z.B. etwa 1 0 bis 90 Gew.- %, der Rest zu 1 00 Gew.-% besteht aus üblichen Formulierungsbestandteilen. Bei emulgierbaren Konzentraten kann die Wirkstoffkonzentration etwa 1 bis 90, vorzugsweise 5 bis 80 Gew.-% betragen. Staubförmige Formulierungen enthalten 1 bis 30, vorzugsweise meistens 5 bis 20 Gew.-% an Wirkstoff, versprühbare Lösungen etwa 0,05 bis 80, vorzugsweise 2 bis 50 Gew.-% Wirkstoff. Bei wasserdispergierbaren Granulaten hängt der Wirkstoffgehalt zum Teil davon ab, ob die wirksame Verbindung flüssig oder fest vorliegt und welche Granulierhilfsmittel, Füllstoffe usw. verwendet werden. Bei den in Wasser dispergierbaren Granulaten liegt der Gehalt an Wirkstoff beispielsweise zwischen 1 und 95 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 10 und 80 Gew.-%.
Daneben enthalten die genannten Wirkstofformulierungen gegebenenfalls die jeweils üblichen Haft-, Netz-, Dispergier-, Emulgier-, Penetrations-, Konservierungs-, Frostschutz- und Lösungsmittel, Füll-, Träger- und Farbstoffe, Entschäumer, Verdunstungshemmer und den pH-Wert und die Viskosität
28 beeinflussende Mittel.
In den erfindungsgemäßen Verfahren sind die herbiziden Kombinationspartner der Gruppe B (B1 bis B9) mit den Sulfonyiharnstoffen der Gruppe A (A1 bis A1 8) in Mischungsformuiierungen oder im Tank-Mix einsetzbar, beispielsweise bekannte Wirkstoffe, wie sie z.B. in Weed Research 26, 441 -445 (1 986), oder "The Pesticide Manual", 1 1 th edition, The British Crop Protection Council, 1 997, Bracknell, England, und der dort zitierten Literatur beschrieben sind. Die einzelnen, unter A4 bis A1 7 und B1 bis B9 aufgeführten Verbindungen sind in der Regel mit dem "common name" nach der International Organization for Standardization (ISO) bezeichnet.
Zur Anwendung werden die in handelsüblicher Form vorliegenden Formulierungen gegebenenfalls in üblicher Weise verdünnt, z.B. bei Spritzpulvern, emulgierbaren Konzentraten, Dispersionen und wasserdispergierbaren Granulaten mittels Wasser, und anschließend auf die Pflanzen, Pflanzenteile oder den landwirtschaftlich genutzten Boden, auf dem die Pflanzen stehen oder in dem sie heranwachsen oder als Saat vorliegen, appliziert. Staubförmige Zubereitungen, Boden- bzw. Streugranulate sowie versprühbare Lösungen werden vor der Anwendung üblicherweise nicht mehr mit weiteren inerten Stoffen verdünnt.
Mit den äußeren Bedingungen wie Temperatur, Feuchtigkeit, der Art des verwendeten Herbizids, u.a. variiert die erforderliche Aufwandmenge der herbiziden Verbindungen innerhalb weiter Grenzen, z.B. zwischen 0,001 und 10,0 kg/ha oder mehr Aktivsubstanz, vorzugsweise liegt sie jedoch zwischen 0,005 und 5 kg/ha.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung illustrieren und stellen insofern keine Beschränkung dar.
29 Beispiel 1 : Etablierung morphogener Zuckerrübenzellkulturen auf aminosäurefreiem Nährmedium
Reife Zuckerrübensamen wurden nach erfolgter Desinfektion der
Samenoberfläche auf hormonfreiem Medium unter aseptischen Bedingungen zum Keimen gebracht.
Das modifizierte Medium nach Murashige-Skoog (MS-Medium), das für die Experimente verwendet wurde, ist in Tabelle 1 wiedergeben. Vor dem
Autoklavieren wurde der pH-Wert des Mediums auf 5,8 eingestellt. Die Vitame wurden vor dem Autoklavieren (1 20°C; 1 5 min) dem Medium zugegeben. Die Phytohormonkonzentrationen wurden für die Kallusinitiation, Kallussubkultur und Pflanzenregeneration wie im Text beschrieben variiert.
Tabelle 1 MS-Medium [mg/L]
MgS04 * 7H20 370
CaCI2 * 2H20 440
KN03 1 900
(NH4)2S04 ~
NH4N03 1 650
KH2P04 1 70
MnS04 22,3 J 0,86
CoCI2 * 6H20 0,025
ZnS04 * 7HsO 8,6
CuS04 * 5H20 0,025
H3B03 6,2
Na2Mo04 * 2H20 0,25
Figure imgf000032_0001
EDTA 37,3
30 FeS04 * 7H20 27,3
Thiamin * Hcl 0,5
Nicotinsäure 0,2
Cyanocobalamin 0, 1
Pyridoxin 0,2 p-Aminobenzosäure 0,05
Ca-Panthothenat 0, 1
Biotin 0, 1
Folsäure 0,05
Nicotinsäure 0,2
Cholin HCI 0, 1
Ribofiavin 0,05
Inosit 1 00
Saccharose 30000
Agar 7000
Naphtylessigsäure 0, 1
Figure imgf000033_0001
Benzylaminopurin 1 ,0
Sobald die Keimblätter entfaltet waren, wurden sie abgetrennt und in 4-6 mm lange Stücke geschnitten. Die Hypocotylabschnitte wurden ebenfalls in 4-6 mm große Stücke zerlegt. Die Explantate wurden auf MS-Medium mit einem Gehalt von 0,05-0,5 mg Naphtylessigsäure pro Liter Medium bei 25 ± 2°C im 1 2h Licht/Dunkelrhythmus bei ca. 500-2000 lux kultiviert. Explantate einiger Sämlinge bildeten unter diesen Bedingungen innerhalb von 2-3 Wochen morphogenen Kallus, der sich auf dem jeweiligen Medium unter Beibehaltung seiner Regenerationsfähigkeit über Monate subkultivieren ließ.
Es wurden Zellinien etabliert, die auf dem in Tabelle 1 beschriebenen Medium länger als ein Jahr unter Beibehaltung der Regenerationsfähigkeit wachsen können.
31 Beispiel 2: In vitro Mutagenese
Morphogene Zuckerrübenkallusstücke werden in Medium mit 0, 1 bis 1 % Ethylmethansulfonat 10 bis 120 min. inkubiert, 3 x gewaschen und in dem Medium kultiviert. Die überlebenden morphogenen Kallussegmente werden nach 2 bis 4 Wochen auf frischen Medium subkultiviert. Nach weiteren 2 bis 4 Wochen können die Kalli für Selektionsexperimente herangezogen werden.
Beispiel 3: Selektion herbizidresistenter Kalluskulturen
Es wird zunächst ermittelt bei welcher Herbizidkonzentration im Medium 95 bis 99 % der Kalli sterben.
Es werden jeweils 1000 Kalli auf die herbizidhaltigen (LD98) Agar-Medien (0,8% Agar) transferiert und nach 6 bis 8 Wochen evaluiert. Die Petrischalen werden bei 1 2 h Beleuchtung pro Tag mit 1 000 bis 2000 Lux und 25 °C inkubiert. In den Medien mit den Herbiziden bilden sich Kalli aus, die unter Ausbildung von Sproßprimordien wachsen.
Durch wiederholte Subkultur der resistenten morphogenen Kalli können Zellinien etabliert werden, die eine relativ hohe Herbizidkonzentrationen tolerieren und noch zur Pflanzenregeneration befähigt sind.
Beispiel 4: Selektion von Sulfonylharnstofftoleranten Zuckerrübenmutanten in Gegenwart von Herbizid und Safener.
2 g einer Zellsuspension des regenerationsfähigen Zuckerrübengenotyps Rel2 wurden in Gegenwart von 1 x 1 0-5 M 5,5-Diphenyl-2-isoxazolin-3- carbonsäure-ethylester (DIC) als Safener und 1 x 10-5 M 1 -[3-(N-Ethyl-N- formyl-amino)-pyrid-2-yl-sulfonyl]-3-(4,6-dimethoxy-pyrimidin-2-yl)-harnstoff (SH) als Herbizid in 20 ml MS-Medium kultiviert. Dem MS-Medium wurden je
32 0,5 mg/1 Benzylaminopurin und 2,4-D (2,4-Dichlorphenoxyessigsäure) zugefügt. Die Zellsuspenison wurde 7 Tage lang bei 25 °C in einem Schüttler bei 1 20 rpm kultiviert.
Nach 7 Tagen wurden 20 ml frisches MS Medium der genannten
Zusammensetzung ohne SH hinzugefügt und die Kultur fortgesetzt. Nach weiteren 7 Tagen wurden nach dem Absedimentieren der Zellen 20 ml des zellfreien Überstands abgesaugt und durch frisches MS-Medium (ohne Herbizid, aber mit 10'5 M Safener) ersetzt. Nach weiteren 7 Tagen wurde dieser Vorgang wiederholt.
Nach Ablauf der 4. Subkulturperiode wurden die Zellen 2 x mit Safener- und herbizidfreiem Medium gewaschen, in 20 ml MS-Medium aufgenommen und auf Agarmedium ausplattiert. Das Agarmedium enthielt MS-Salze, Vitamine und übliche Spurenelemente, 20 g Saccharose, 0,8 % Agar, 0,5 mg/l BAP und 0,5 mg/l 2,4-D, pH 5.8.
Dem Medium wurden folgende Zusätze zugegeben:
1 ) keine
2) 1 x 10-5 M SH 3) 2,5 x 1 0-6 M SH
4) 1 x 10-5 M SH + 1 x 10'5 M DIC
5) 2.5x 1 0-6 M SH + 1 x 10"5 M DIC
Nach 6 Wochen wurde die Anzahl der Zellkolonien durch Auszählen ermittelt. Das Ergebnis ist in Tabelle 2 wiedergegeben.
33 Tabelle 2: Anzahl der Zellkolonien (Anzahl/1 0 Petrischalen)
Medium Anzahl
1 > 1 0.000
2 3
3 4
4 1 5
5 1 9
Figure imgf000036_0001
Beispiel 5: Regeneration der Zuckerübenmutanten, Isolierung der mutierten Gene und Herstellung von transgenen Zuckerrüben
Auf Regenerationsmedium (hormonfreiem oder hormonhaltigem Medium) differenzieren sich aus den nach Beispielen 3 und 4 erhaltenen embryogenen herbizidverträglichen Kalli bzw. Zellkolonien innerhalb von 1 -2
Subkulturperioden (1 -2 Monate) Sproße aus, die auf hormonfreiem Medium (d.h. ohne Naphtylessigsäure und Benzylaminopurin) während der folgenden 1 - 3 Subkulturen bewurzeln. Sobald sich genügend Wurzeln gebildet haben (ca. 8 - 1 2 Wochen), werden die Pflanzen in ein anorganisches Substrat (z.B. Vermiculit, Perlit) überführt, nachdem die Agarreste möglichst vollständig aus den Wurzeln entfernt wurden. Während der ersten 3-6 Tage werden die Pflanzen bei 90 bis 1 00% relativer Luftfeuchte kultiviert. Danach können die Pflanzen entweder in der Klimakammer oder im Gewächshaus weiterkultiviert werden. Bis zur Ausbildung von weiteren 2 bis 4 Blättern, werden die Regenerate in Hydrokultur gehalten. Danach können die Zuckerrüben in Erde verpflanzt werden.
Aus den erhaltenen Zellen oder Pflanzen werden die mutierten Gene, die das
34 Resistenzprinzip verursachen, identifiziert und isoliert, (z.B. das Acetolactat- Synthase-(ALS)-Gen) und analog der Dideoxy-Methode (Sanger et al., 1 977, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74, 5463-5467) sequenziert. Die isolierten Gene werden mittels der Agrobacterium-Transformation und geeigneter Vektorsysteme in Zuckerrübenzellen transformiert, positive Klone mittels eines Selektionsmarkers selektiert und aus den positiven Zellen ganze Pflanzen regeneriert.
Biologische Beispiele
Beispiel 6: Herbizidapplikation
im 4. und 5. Blattstadium werden die Pflanzen mit Herbizidlösungen in praxisüblichen Aufwandmengen besprüht. Die Herbizide werden als 0, 1 bis 1 %ige wäßrige Lösungen appliziert. Die behandelten Pflanzen werden nach 1 4 bis 28 Tagen visuell bonitiert. Der Test auf Herbizidresistenz wird unter Bedingungen durchgeführt, die bei kommerziellen (Kontrollpflanzen) zu einer schweren Schädigung (Schädigungsgrad > 80 %) führen.
Die transgenen Zuckerrüben zeigen eine gut ausgeprägte Toleranz gegenüber den applizierten Sulfonyiharnstoffen, d.h. eine vergleichsweise geringe Schädigung.
Beispiel 7: Herbizidwirkung an Schadpflanzen in Kulturen von transgenen Zuckerrüben
Verschiedene Klone der transgenen Zuckerrüben werden in Töpfen im Gewächshaus oder im Feld in Kleinparzellen ausgesät und bis zum Stadium von 2-4 Blättern angezogen. Gleichzeitig werden einige Unkräuter bzw. Ungräser ausgesät bzw. durch natürliches Keimen und Auflaufen werden in den Feldparzellen verschiedene Unkrautsituationen (bezüglich Unkräuter und
35 Blattstadien) erreicht.
Nach Behandlung mit den Sulfonyiharnstoffen der Gruppe A und ggf. in Kombination mit Herbiziden der Gruppe B werden im weiteren Verlauf des Wachstums in Zeitabständen von 3-6 Wochen Bonituren der herbiziden
Effektivität vorgenommen, um die Selektivität der verschiedenen Wirkstoffe und ihre herbizide Wirksamkeit zu beurteilen.
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, daß die Herbizide bzw. Herbizidkombinationen an den erfindungsgemäßen Zuckerrüben besonders gut verträglich sind, aber gleichzeitig hervorragende herbizide Wirksamkeit gegen unerwünschte breitblättrige und grasartige Unkräuter aufweisen und somit eine selektive Unkrautbekämpfung in den erfindungsgemäßen Zuckerrübenkulturen ermöglicht wird.
36

Claims

1 . Transgene Sulfonylharnstoff-tolerante Zuckerrüben, deren Saat- oder
Vermehrungsgut oder deren Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie tolerant sind gegenüber einem oder mehreren Sulfonyiharnstoffen ausgewählt aus der
Gruppe A bestehend aus
A1 ) Verbindungen der Formel (I) und deren anorganische oder organische
Salze,
(I)
Figure imgf000039_0001
worin
Q Sauerstoff, Schwefel oder -N(R4)-, Y CH oder N,
R Wasserstoff (H), (CrC12)-Alkyl; (C2-C10)-Alkenyl; (C2-C10)-Alkinyl; (C C6)-Alkyl, das ein- bis vierfach durch Reste aus der Gruppe Halogen, (CrC4)-Alkoxy, (CrC4)-Thioalkyl, CN, (C2-C5)-Alkoxycarbonyl und (C2- C6)-Alkenyl substituiert ist; oder (C3-C8)-Cycloalkyl, das unsubstituiert oder durch Reste aus der Gruppe (CrC4)-Alkyl, (C--C4)-Alkoxy, (CrC4)-
Alkylthio und Halogen substituiert ist; (C5-C8)-Cycloalkenyl; Phenyl-(C C4)-aikyl, das im Phenyirest unsubstituiert oder durch einen oder mehrere Reste aus der Gruppe Halogen, (CrC4)-Alkyl, (C C4)-Alkoxy, (C-'C.J-Haloalkyl, (CrC4)-Thioalkyl, (C2-C5)-Alkoxycarbonyl, (C2-C5)- Alkylcarbonyloxy, Carbonamid, (C2-C5)-Alkylcarbonylamino, (C2-C5)-
Alkylaminocarbonyl, Di-[(CrC4)-alkyl]-carbonyl und Nitro substituiert ist; oder einen Rest der Formeln A-1 bis A-1 0
37 CH,
Figure imgf000040_0001
A-3
•CH, CH, CH, CH,
Figure imgf000040_0003
Figure imgf000040_0004
Figure imgf000040_0005
A-4 A-5 A-6 A-7
-O
CH,
Figure imgf000040_0006
Figure imgf000040_0007
-o
A-8 A-9 A-10
worin X 0, S, S(0) oder S02;
R1 Wasserstoff oder (C1-C3)-Alkyl; R2 Wasserstoff, Halogen, (C--C3)-Alkyl oder (CrC3)-Alkoxy, wobei die beiden letztgenannten Reste unsubstituiert oder durch ein- oder mehrfach durch Halogen oder (CrC3)-Alkoxy substituiert sind;
R Wasserstoff, Halogen, (CrC3)-Alkyl, (CrC3)-Alkoxy oder (C--C3)- Alkylthio, wobei die vorgenannten alkylhaltigen Reste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch Halogen oder ein- oder zweifach durch (CT-CaJ-Alkoxy oder (C--C3)-Alkylthio substituiert sind; oder einen Rest der Formel NR5Rβ, (C3-C6)-Cycloalkyl, (C2-C4)-Alkenyl, (C2-C4)-Alkinyl, (C3-C4)-Alkenyloxy oder (C3-C4)-Alkinyioxy;
R Wasserstoff, (CrC4)-Alkyl oder (C C4)-Alkoxy und R5 und R6 unabhängig voneinander Wasserstoff, (C^C -Alkyl, (C3-C4)-Alkenyl, (CrC4)-Haloalkyl oder (C C4)-Alkoxy bedeuten;
38 A2) Verbindungen der Formel II und deren anorganische oder organische Salze,
W
Figure imgf000041_0001
(ii)
R2-C-R3
N R4R5
worin
R1 CO-Q-R8,
R2 und R3 unabhängig voneinander H oder (C--C4)Alkyl, R4 H, (C--C4)Alkyl, Hydroxy oder (CrC4)Alkoxy,
R5 (C C4)Alkylsulfonyl, CHO, [(CrC4)Alkyl]-carbonyl, das unsubstituiert oder durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert ist, [(C
C4)Alkoxy]-oxalyl, [(C3-C6)Cycloalkyl]-carbonyl oder eine Gruppe der Formel W W W
II II oder || -C-T-R9 , -C-NR10R11 oder -C - N(R12)2
bedeuten, worin
W ein Sauerstoff- oder Schwefelatom (0 oder S),
T O oder S, R R99 H, (C--C4)Alkyl, das unsubstituiert oder durch ein oder mehrere Halogenatome oder durch (CrC4)Alkoxy, (CT-C^Alkylthio, [(C1-C4)Alkoxy]-carbonyl und [(C C4)Alkyl]-carbonyi substituiert ist, R10 und R 1 unabhängig voneinander H, (C--C4)Alkyl, das unsubstituiert oder
39 durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert ist, oder (C3-C4)-
Alkenyl oder (C3-C4)Alkinyl, wobei mindestens einer der Reste R10 und
R1 1 von Wasserstoff verschieden ist, die Reste R12 gemeinsam mit dem N-Atom einen heterocyclischen Ring mit 5 oder 6 Ringgliedern, der ein weiteres Heteroatom aus der Gruppe N, O und S in den verschiedenen Oxidationsstufen enthalten kann und unsubstituiert oder durch (C,-C4)Alkyi oder die Oxogruppe substituiert ist, und Q 0, S oder -NR13-,
R6 H, (CrC3)Alkyl, (CrC3)Alkoxy, Halogen, R8 unabhängig voneinander (CrC4)Alkyl, das unsubstituiert oder durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert ist, oder (C3-C4)-Alkenyl oder
(C3-C4)Alkinyl, A einen Rest der Formel
N- . '/ X
<
worin
Z CH oder N und einer der Reste X und Y Halogen, (C--C2)Alkyl,
(CrC2)Alkoxy, OCF2H, CF3 oder OCH2CF3 und der andere der Reste X und Y (C C2)Alkyl, (C C2)Alkoxy oder (CrC2)Haloalkoxy bedeuten, R7 H oder CH3 und
R13 H, (C C4)Alkyl, das unsubstituiert oder durch ein oder mehrere
Halogenatome substituiert ist, oder (C3-C4)-Alkenyl oder (C3-C4)Alkinyl bedeuten;
A3) Verbindungen der Formel III, deren N-Oxide und deren anorganische oder organische Salze,
40
Figure imgf000043_0001
R.
\
N (III)
S02NH-
5 •
Figure imgf000043_0002
worin R, H, Halogen, (C^C^-Alky!, das unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch Halogen substituiert ist, (C--C4)-Alkoxy, (C C4)-Alkylthio ;
H oder Methyl;
R3 Methyl oder Methoxy;
A -N-(R4)R5;
R4 H, (CrC6)-Alkyl, das unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch
Halogen, (C--C6-)-Alkoxy, (C3-C6)-Alkenyloxy, (C3-C6)-Alkinyloxy oder
(C C6)-Alkylthio substituiert ist;
R< H, (C--C6)-Alkyl, das unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch
Halogen, (C--C6)-Alkoxy, (C3-C6)-Alkenyloxy, (C3-C6)-Alkinyloxy oder (C
C6)-Alklythio substituiert ist, oder C(0)R6;
R* H, (C^C^-Alkyl oder (C3-C6)-Cycloalkyl, die unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch Halogen oder (C--C4)-Alkoxy substituiert sind, (C2-C6)-
Alkenyl, das unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch Halogen substituiert ist, (C2-C6)-Alkinyl, Phenyl, Benzyl oder Naphthyl, die unsubstituiert oder ein- oder mehrfach durch Halogen, (C--C4)-Alkyl,
(CrC4)-Haloalkyl, (CrC4)-Alkoxy, (CrC4)-Haloalkoxy, (C3-C8)-
Alkenyloxy, (C3-C6)-Alkinyloxy, Nitro, Cyano, COOR8, NR10Rn ,
C(0)NRl 2R13, XT RT S, S02NR16R17 oder durch X2R18 substituiert sind oder
0R7; R7 (C C6)-Alkyl, das unsubstituiert oder durch (C--C4)-AIkoxy, (C3-C6)-
Cycloalkyl, Cyano, COOR19, oder CONR26R27 substituiert ist, (C--C6)-
41 Haloalkyl, (C3-C6)-Alkenyl, (C3-C3)-Haloalkenyl, (C3-C6)-Alkinyl, (C3-C6)- Haloalkinyl, Oxetan-3-yl, oder (C4-C6)-Cycloalkyl, das unsubstituiert oder teilweise durch Halogen, (C C4)-Alkyl oder (C C4)-Alkoxy substituiert ist oder Phenyl, Benzyl oder Naphthyl, das unsubstituiert oder jeweils durch (CrC4)-Alkyl, (C--C4)-Haloalkyl, (CrC4)-Alkoxy, (C--C4)-
Haloalkoxy, (C--CJ-Alky.tl.io, (CrC4)-Haloalkylthio, (C--C4)- Alkylsulfonyl, (CrC4)-Alkylsulfinyl, Nitro, Cyano, COOR22, NR20R21, CONR23R24 oder durch S02NR25R9 substituiert ist; oder (CT-CgJ-Alkyl, X3R29 oder X4R30; R8 H, (C--Cg)-Alkyl, (C3-C6)-Alkenyl, (C3-C6)-Alkinyl oder Oxetan-3-yl; R9, io, Rιτ R12' R.3» R.6' R17 20' R21. 23' R2 ' R25' 26 uπd 27 jeweils unabhängig voneinander H, (C--C4)-Alkyl, (C3-C6)-Alkenyl oder (C3-C6)-
Alkinyl; oder R10 und R20 jeweils unabhängig voneinander die Gruppen -ClOJ-Xg-tC-^J-Alkyl oder -C(0)-(C--C4)-Alkyl, die teilweise durch Halogen substituiert sein können; oder R10 und R-- oder R12 und R13 oder R16 und R17 oder R20 und R21 oder R23 und R24 oder R25 und R9 oder R26 und R27 gemeinsam eine (C4-C5)-Alkylen-Kette bilden, die teilweise durch Sauerstoff oder NR14 unterbrochen sein kann, worin
R14 H, (CrC4)-Alkyl, (C3-C6)-Alkenyl oder (C3-C6)-Alkinyl;
R15 und R29 jeweils unabhängig voneinander (C--C4)-Alkyl oder (C C4)-
Haloalkyl; R18 und R30 jeweils unabhängig voneinander durch COOR28 substituiertes (C--C4)-Alkyl;
R19, R22 und R28 jeweils unabhängig voneinander H oder (C,-C4)-Alkyl, X, und X3 jeweils unabhängig voneinander S, SO oder S02; X2 und X4 jeweils unabhängig voneinander 0 oder S; X5 O oder NR14 bedeuten; A4) Amidosulfuron; A5) Ethoxysulfuron;
42 A6) Triasulfuron;
A7) Metsulfuron;
A8) Tribenuron;
A9) Flupyrsulfuron;
A10) Nicosulfuron;
A1 1 ) Rimsulfuron;
A1 2) Primisulfuron;
A1 3) Prosulfuron;
A14) Sulfosulfuron;
A1 5) Oxasulfuron;
A1 6) Ethametsulfuron;
A1 7) Imazosulfuron und
A1 8) Verbindungen der Formel V
Formel V:
Figure imgf000045_0001
2. Transgene Sulfonylharnstoff-tolerante Zuckerrüben, deren Saat- oder Vermehrungsgut oder deren Zellen gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie durch ein oder mehrere Sulfonylharnstoffe ausgewählt aus der Gruppe A wie in Anspruch 1 definiert in ihrem Wachstum gefördert werden.
3. Verfahren zur Herstellung von transgenen Sulfonylharnstoff-toleranten Zuckerrüben gemäß Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß a) Zuckerrübenzellen auf einem Sulfonylharnstoff-haltigen Nährmedium in Gegenwart eines oder mehrerer Safener kultiviert werden, b) Kallus- oder Zeilsuspensionskulturen besagter Zellen unter Beibehaltung
43 ihrer embryogenen und morphogenen Kompetenz selektioniert werden, c) die unter b) erhaltenen Kulturen auf einem Sulfonylharnstoff-haltigen Nährmedium kultiviert und selektioniert werden, d) aus den unter c) erhaltenen Kulturen die Gene, die die Sulfonylharnstoff- Toleranz verursachen identifiziert und isoliert werden, e) die aus d) erhaltenen Gene stabil in das Genom von Zuckerrübenzellen integriert werden und f) aus den unter e) erhaltenen Zellen intakte Zuckerrüben regeneriert werden.
4. Verwendung von Zuckerrüben erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 3 in der Landwirtschaft, als Futtermittel oder für die Lebensmittelindustrie, insbesondere zur Zuckergewinnung.
5. Verfahren zur Kontrolle von unerwünschtem Pflanzenwuchs in Kulturen von transgenen Sulfonylharnstoff-toleranten Zuckerrüben gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Pflanzen, deren Saat- oder Vermehrungsgut oder deren Anbaufläche ein oder mehrere Sulfonylharnstoffe ausgewählt aus der Gruppe A wie in Anspruch 1 definiert oder diese enthaltende herbizide Mittel appliziert werden.
6. Verfahren zur Kontrolle von unerwünschtem Pflanzenwuchs gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß auf die Pflanzen, deren Saat- oder Vermehrungsgut oder deren Anbaufläche zeitgleich oder nachfolgend ein oder mehrere Herbizide ausgewählt aus der Gruppe B bestehend aus B1 ) Herbiziden aus der Klasse der Imidazoiinone, vorzugsweise Imazethapyr,
Imazamethapyr, Imazapyr, lmazaquin, Imazamox;
B2) Herbiziden aus der Klasse der Inhibitoren des photosynthetischen
Elektronentransports, vorzugsweise der Biscarbamate, besonders bevorzugt
Phenmedipham, Desmedipham; B3) einem Herbizid aus der Klasse der PPO-Hemmer, z.B. der Diphenyle oder der Azole, Azifluorfen, Oxyfluorfen, Pyraflufen, Carfentrazone, Lactofen,
44 Nitrofen, Oxadiargyl, Fluoroglycofen, Sulfentrazone oder auch ein CF3-Uracil der Formel IV:
Figure imgf000047_0001
B4) einem Herbizid aus der Klasse der Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase
(HPPDO)-Inhibitoren, z.B. der Triketone, vorzugsweise Isoxaflutole, Isoxachlorzole oder Sulcotrione;
B5) einem Herbizid aus der Klasse der herbizid wirksamen, gegebenenfalls synthetischen Auxine oder deren Transporthemmer, vorzugsweise Quinmerac,
Clopyralid, Diflufenzopyr;
B6) einem Herbizid aus der Klasse der Lipid- oder der Fettsäure-Synthese- Inhibitoren, vorzugsweise der Aryloxyphenoxycarbonsäuren oder der
Cyclohexandionoxime, besonders bevorzugt Fenoxaprop, Haloxyfop, Fluazifop,
Quizalofop, Clodinafop, Propaquizafop, Clethodim, Sethoxidim, Tepraloxydim ,
Butroxidim, Cycloxidim oder Prosulfocarb;
B7) einem Herbizid aus der Klasse der Glutamin-Synthetase-Inhibitoren, vorzugsweise Phosphinoaminosäuren, besonders bevorzugt glufosinate;
B8) einem Herbizid aus der Klasse der 5-Enoipyruvylshikimat-3-phosphat-
45 Synthase-Inhibitoren, vorzugsweise glyphosate;
B9) einem Herbizid aus der Klasse der Benzofuranylalkansulfonate, vorzugsweise Ethofumesate oder diese Verbindungen enthaltende herbizide Mittel appliziert werden.
7. Verwendung von einem oder mehreren Sulfonyiharnstoffen ausgewählt aus der Gruppe A wie in Anspruch 1 definiert oder diese enthaltende herbizide Mittel auf Anbauflächen von transgenen Zuckerrübenkulturen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Schadpflanzenkontrolle.
8. Verwendung gemäß Anspruch 7 von einem oder mehreren Sulfonyiharnstoffen ausgewählt aus der Gruppe A wie in Anspruch 1 definiert in Kombination mit einem oder mehreren Herbiziden ausgewählt aus der Gruppe B wie in Anspruch 6 definiert oder diese enthaltende herbizide Mittel.
9. Verfahren zur Herstellung von transgenen Herbizid-toleranten Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß a) Zellen auf einem Herbizid-haltigen Nährmedium in Gegenwart eines oder mehrerer Safener kultiviert und selektioniert werden, b) die unter a) erhaltenen Zellen auf einem Herbizid-haltigen Nährmedium kultiviert und selektioniert werden und c) aus den unter b) erhaltenen Zellen die Gene, die die Herbizid-Toleranz verursachen identifiziert und isoliert werden, d) die aus c) erhaltenen Gene stabil in das Genom von Pflanzenzellen integriert werden und e) aus den unter d) erhaltenen Zellen intakte Pflanzen regeneriert werden.
46
PCT/EP1999/003361 1998-05-14 1999-05-14 Transgene sulfonylharnstoff-tolerante zuckerrüben WO1999057966A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU42624/99A AU4262499A (en) 1998-05-14 1999-05-14 Transgenic sulfonylurea-tolerant sugar beets

Applications Claiming Priority (2)

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