Vorrichtung und Verfahren zur schnellen Auswertung von Bindungsreaktionen in strukturierten interferometrisehen Device and method for the rapid evaluation of binding reactions in structured interferometrisehen
MikrσtiterplattenMicriter plates
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur schnellen Auswertung von Bindungsreaktionen in strukturierten interferometrischen Mikrotiter- platten, insbesondere eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Bestimmen der Änderung der optischen Dicke einer Schicht mittels Lichtinterferenz.The present invention relates to a device and a method for rapidly evaluating binding reactions in structured interferometric microtiter plates, in particular a device and a method for determining the change in the optical thickness of a layer by means of light interference.
Eine Reihe von immunologischen Tests setzt voraus, daß entweder das Antigen oder der Antikörper an eine Festkörperoberfläche gekoppelt werden. Dazu werden Festkörperträger wie Latexkugeln, Plastikröhrchen etc. verwendet. Der bei weitem erfolgreichste und am weitesten verbreitete Träger ist allerdings die Mikrotiterplatte. Techniken wie der ELISA- (enzyme-linked i munosorbent assay) Test oder radiologische Immun-Tests werden standardmäßig in wegwerfbaren Mikrotiterplatten durchgeführt. Mikrotiterplatten sind Plastiktabletts aus transparenten Kunststoffen (Polystyrol, Polypropylene etc.) mit einer Anzahl (typischerweise 96) kleiner Reak- tionstöpfchen. Proteine, wie beispielsweise Antikörper, können in den hydrophoben Behältern durch Physisorption gebundenen werden. Die Zugabe der zu testenden Lösungen und die folgenden Waschzyklen werden häufig durch automatisierte Pippettierautomaten ausgeführt. Auch das Auslesen der Platten kann automatisiert werden. Für
ELISA-Tests wird dabei die Farbreaktion anhand der optischen Absorption der Lösung gemessen, bei radiologischen Tests die Menge radioaktiv markierter Substanzen. Allerdings sind für diese Art Tests erstens Fluoreszenzoder radioaktive Markierungen notwendig und zweitens insbesondere ELISA-Tests nicht immer quantitativ, d.h. weisen lediglich das Vorhandensein, nicht aber die exakte Menge einer Substanz nach.A number of immunological tests require that either the antigen or the antibody be coupled to a solid surface. Solid supports such as latex balls, plastic tubes etc. are used for this. By far the most successful and most widespread carrier is the microtiter plate. Techniques such as the ELISA (enzyme-linked i munosorbent assay) test or radiological immune tests are carried out as standard in disposable microtiter plates. Microtiter plates are plastic trays made of transparent plastics (polystyrene, polypropylene etc.) with a number (typically 96) of small reaction pots. Proteins, such as antibodies, can be bound in the hydrophobic containers by physisorption. The addition of the solutions to be tested and the subsequent washing cycles are often carried out by automated pipetting machines. The reading of the plates can also be automated. For In ELISA tests, the color reaction is measured based on the optical absorption of the solution, in radiological tests the amount of radioactive substances. However, for this type of tests, firstly fluorescence or radioactive labels are necessary and secondly, in particular ELISA tests are not always quantitative, ie only detect the presence but not the exact amount of a substance.
Im Gegensatz dazu stehen Biosensoren, welche exakte Werte, beispielsweise der optischen Schichtdicke eines Ad- sorbates oder der Massenbelegung einer Oberfläche liefern. Biosensoren sind reversibel und kontinuierlich arbeitende Meßaufnehmer zum Nachweis von Proteinen, Nukleinsäuren oder Polyzuckern. Solche hochempfindlichen Meßwandler spielen dann eine große Rolle, wenn außer dem Vorhandensein eines Liganden auch noch dessen Konzentration bestimmt werden soll. Quantitative Meßaufnehmer können insbesondere dazu dienen, die Bindungskonstante eines Liganden zu bestimmen. Neben der Entwicklung geeigneter Substrate und chemischer Ankopplungsverfahren ist die Automatisierung der quantitativen Bestimmung der Rezeptor-Ligand Bindung nach wie vor zu optimieren.In contrast to this are biosensors, which deliver exact values, for example the optical layer thickness of an adsorbate or the mass coverage of a surface. Biosensors are reversible and continuously working sensors for the detection of proteins, nucleic acids or poly sugars. Such highly sensitive transducers play a major role if, in addition to the presence of a ligand, its concentration is also to be determined. Quantitative sensors can be used in particular to determine the binding constant of a ligand. In addition to the development of suitable substrates and chemical coupling processes, the automation of the quantitative determination of the receptor-ligand binding must still be optimized.
Zu den bekanntesten quantitativen Oberflächentechniken, welche optische Schichtdicken bestimmen, gehören die Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (Liedberg, et al . 1983; Surface Plasmon Resonance for Gas Detection and Biosen- sing, Sensors and Actuators , 4:299-304), die reflekto e- trische Interferenz-Spektroskopie (Brecht et al. 1993; Interferometric immunoasay in a FIA-system: a sensitive and rapid approach in lable-free immunosensing. Biosensors & Bi oelectronics . 8:387-392), sowie Quarzwaagen. Die ersten beiden Techniken messen optische Schichtdik- ken mit einer Auflösung im Ängström-Bereich, während die
Quarzwaage Massenbelegungen mit einer Nachweisgrenze im μg-Bereich mißt.The best known quantitative surface techniques that determine optical layer thicknesses include surface plasmon resonance (Liedberg, et al. 1983; Surface Plasmon Resonance for Gas Detection and Biosensing, Sensors and Actuators, 4: 299-304), which reflecto Electric interference spectroscopy (Brecht et al. 1993; Interferometric immunoasay in a FIA system: a sensitive and rapid approach in label-free immunosensing. Biosensors & Bioelectronics. 8: 387-392), as well as quartz scales. The first two techniques measure optical layer thicknesses with a resolution in the Angstrom range, while the Quartz scale measures mass loadings with a detection limit in the μg range.
In R dler, et al . 1993, Imaging optical thicknesses and Separation distances of phospholipid vesicles at solid surfaces, J. Physics II France 3:727-748, wird gezeigt, daß die Reflexions-Interferenz-Contrast-Mikroskopie (RICM) für einfache Schichtsysteme quantitativ auswertbare Interferenzintensitäten abbildet. Es werden insbesondere planare Systeme von aufgedampften Magnesiumfluorit mit adhärierenden Vesikeln, gespreiteten Membranen oder durch Langmuir-Blodgett Technik übertragenen Lipid- Monolagen abgebildet. Es wird gezeigt, daß die (beispielsweise in Fig. lb dargestellte) Intensitätsänderung bei Proteinadsoprtion an eine Interferenzschicht von konstanter Dicke D (in diesem Fall 48nm) meßbar bzw. mit RICM auf eine CCD Kamera abbildbar ist. Bei der Messung von Schichtdickenänderungen liefert eine planare Interferenzschicht jedoch lediglich ein Signal, welches zahlreichen Störungen unterworfen ist.In R dler, et al. 1993, Imaging optical thicknesses and Separation distances of phospholipid vesicles at solid surfaces, J. Physics II France 3: 727-748, shows that reflection-interference-contrast-microscopy (RICM) shows quantitatively evaluable interference intensities for simple layer systems. In particular, planar systems of evaporated magnesium fluorite with adhering vesicles, spread membranes or lipid monolayers transferred by Langmuir-Blodgett technique are imaged. It is shown that the change in intensity (shown for example in FIG. 1b) in the case of protein adsorption to an interference layer of constant thickness D (in this case 48 nm) can be measured or can be imaged on a CCD camera using RICM. When measuring changes in layer thickness, however, a planar interference layer only provides a signal which is subject to numerous interferences.
Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung, ein Verfahren und ein Verfahren zum Herstellen der Vorrichtung bereitzustellen, welche (s) erlaubt, die Änderung der optischen Dicke einer Schicht, vorzugsweise einer Adsorbatschicht in Mikrotiterplatten zu bestimmen. Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen der Ansprüche gelöst.In contrast, the object of the invention is to provide a device, a method and a method for producing the device which allow (s) to determine the change in the optical thickness of a layer, preferably an adsorbate layer in microtiter plates. This object is achieved with the features of the claims.
Bei der Lösung geht die Erfindung von dem Grundgedanken aus, daß sich aufgrund von Variationen im Abstand von Oberseite und Unterseite einer Schicht, beispielsweise einer Adsorbatschicht, bei einer Bestrahlung mit Licht variierende Ir-terferenzmuster ergeben, wenn sich die optische Dicke der Schicht ändert. Dazu werden in oder auf einen Träger einer biofunktionalisierten Mikrotiterplat-
te mikrostrukturierte Interferenzschichten ein- bzw. aufgebracht .In the solution, the invention is based on the basic idea that due to variations in the spacing between the top and bottom of a layer, for example an adsorbate layer, there are varying interference patterns when irradiated with light if the optical thickness of the layer changes. For this purpose, a biofunctionalized microtiter plate microstructured interference layers introduced or applied.
Die optische Reflexions-Interferenz der Platte wird abgebildet und mit Hilfe von Bildverarbeitung ausgewertet. Dabei wird die mittlere quadratische Differenz der no- mierten Intensitäten der Interferenzmuster vor und nach Adsorption zum Bestimmen der Änderung der optischen Schichtdicke des Adsorbats genutzt. Die erfindungsgemäße Vorrichtung/das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf optischer Interferenz, wobei die Dicke der interferenzfähigen Beschichtung variiert. Diese wird durch optische Abbildung aufgelöst und durch ein einfaches Bildverarbeitungsverfahren ausgewertet .The optical reflection interference of the plate is imaged and evaluated with the help of image processing. The mean square difference of the nominal intensities of the interference patterns before and after adsorption is used to determine the change in the optical layer thickness of the adsorbate. The device / method according to the invention is based on optical interference, the thickness of the interference-capable coating varying. This is resolved by optical imaging and evaluated by a simple image processing method.
Die Vorteile der Erfindung sind vielfältig:The advantages of the invention are numerous:
1. Die nachzuweisenden Liganden müssen nicht vorbehandelt oder markiert werden.1. The ligands to be detected do not have to be pretreated or labeled.
2. Die Auswertung einer Platte mit einer großen Anzahl Tests ist in einem Schritt möglich und mit Hilfe eines schnellen Rechners in Sekunden zu bewerkstelligen.2. The evaluation of a plate with a large number of tests is possible in one step and can be accomplished in seconds with the help of a fast computer.
3. Die Bestimmung der Änderung der optischen Schichtdicke des Adsorbats aus der mittleren quadratischen Differenz der nomierten Intensitäten hat eine hohe Empfindlichkeit mit einer Schichtdickenauflösung von einem Ängström (1 Ä) .3. The determination of the change in the optical layer thickness of the adsorbate from the mean square difference of the nominated intensities has a high sensitivity with a layer thickness resolution of one angstrom (1 Å).
4. Das Verfahren ist robust gegen äußere Schwankungen der Beleuchtungsintensität, als auch gegen Unregelmäßigkeiten in der genauen Mikrostrukturierung der Platte.4. The method is robust against external fluctuations in the lighting intensity, as well as against irregularities in the exact microstructuring of the plate.
5. Da der beschriebene Mikrotitertest auf einem bildgebendem Verfahren beruht, können durch weitere intelligente Bildverarbeitung oder durch visuelle Kontrolle offensichtliche Störungen, wie das Aus-
fällen von Reagenzien oder die Anlagerung eines Staubkorns, leicht bemerkt werden. 6. Das bildgebende Verfahren läßt sich leicht mit Fluoreszenztechniken kombinieren.5. Since the described microtitre test is based on an imaging process, obvious malfunctions such as the Precipitation of reagents or the accumulation of a speck of dust can easily be noticed. 6. The imaging process can be easily combined with fluorescence techniques.
Das Verfahren sollte daher Anwendung als interferometri- scher Immunoassay finden, wobei die Vorteile insbesondere in automatisierten Anlagen mit hohem Durchsatz von Mikrotiterplatten zum Tragen kommen. Es wird daher im folgenden auch erläutert, wie strukturierte Mikrotiterplatten kostengünstig auf Kunststoffbasis hergestellt werden können.The method should therefore be used as an interferometric immunoassay, the advantages being particularly evident in automated systems with a high throughput of microtiter plates. It is therefore also explained below how structured microtiter plates can be produced inexpensively on a plastic basis.
Die Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:The invention is explained in more detail below with reference to the accompanying drawings. Show it:
Fig. la eine Darstellung einer integrierten Interferenzschicht mit lateral variierender Schichtdicke D, wobei die Adsorbatschicht δ Rezeptoren trägt und eine optische Schichtdickenänderung Δδ gemessen wird;La shows a representation of an integrated interference layer with a laterally varying layer thickness D, the adsorbate layer δ carrying receptors and an optical layer thickness change Δδ being measured;
Fig. lb eine Simulation der Reflektivität als Funktion der ortsabhängigen Schichtdicke D der Interferenzschicht; die Kurven entsprechen Adsorbatschichtdik- ken von δ = 10, 20 und 30 Ä;1b shows a simulation of the reflectivity as a function of the location-dependent layer thickness D of the interference layer; the curves correspond to adsorbate layer thicknesses of δ = 10, 20 and 30 Å;
Fig. lc eine Darstellung der mittleren quadratischen Differenz der normierten Intensitäten S als Funktion der optischen Schichtdickenänderung Δδ;FIG. 1c shows the mean square difference of the normalized intensities S as a function of the optical layer thickness change Δδ;
Fig. 2a eine Darstellung einer Mikrotiterplatte mit 12 Reaktionstöpfchen;2a shows a representation of a microtiter plate with 12 reaction droplets;
Fig. 2b eine in jedes Töpfchen integrierte (und mit dem Kunststoff 2 aufgefüllte) interferierende Vertiefung;
Fig. 2c eine Darstellung eines Interferenzmusters .einer Vertiefung, wie es in der abbildenden Reflexions- Interferenz-Mikroskopie sichtbar wird;2b shows an interfering recess integrated in each potty (and filled with the plastic 2); 2c shows a representation of an interference pattern. Of a depression, as can be seen in the imaging reflection interference microscopy;
Fig. 3 einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflek- tivität der Mikrotiterplatte mittels Reflexions- Interferenz-Kontrast-Mikroskopie; und3 shows a structure for the optical imaging of the reflectivity of the microtiter plate by means of reflection-interference-contrast microscopy; and
Fig. 4 einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflek- tivität der Mikrotiterplatte mittels Laser- Abtastung.4 shows a structure for the optical imaging of the reflectivity of the microtiter plate by means of laser scanning.
Die Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, eine biofunktionalisierte Schicht unmittelbar auf ein interferenzfähiges Substrat aufzutragen. Im einfachsten Fall wird auf einen Abschnitt eines Trägers 1 (z.B. Glas oder Kunststoff) mit Brechungsindex nl (beispielsweise nl=l,5) eine erste dünne (vorzugsweise heterogene) Schicht 2 mit einem zu nl unterschiedlichem Brechungsindex n2 aufgetragen (siehe Fig. la) , mit n2 vorzugsweise im Bereich von 1,3 bis 1,4. Diese erste Schicht ist mit einer biokompatiblen Adsorbatschicht 3 mit Berechnungsindex n3, vorzugsweise einer Polymerschicht versehen, welche Antikörper oder Rezeptoren enthält. Die optischeThe basis of the method according to the invention is to apply a biofunctionalized layer directly to an interference-capable substrate. In the simplest case, a first thin (preferably heterogeneous) layer 2 with a refractive index n2 different from nl is applied to a section of a carrier 1 (for example glass or plastic) with a refractive index nl (for example nl = 1.5) (see FIG. 1a) , with n2 preferably in the range from 1.3 to 1.4. This first layer is provided with a biocompatible adsorbate layer 3 with calculation index n3, preferably a polymer layer, which contains antibodies or receptors. The optical
Schichtdicke δ dieser biokompatiblen Schicht 3 nimmt bei der Bindung von Liganden 4 aus einer wäßrigen Lösung 17 mit Berechnungsindex / zu. Zur Detektion der Schichtdickenzunahme wird das Substrat von unten, d.h. von der der biofunktionalisierten Schicht 3 abgewandten Seite, mit vorzugsweise monochromatischem Licht beleuchtet und das entstehende Interferenzmuster auf eine Kamera abgebildet. Die Intensität des reflektierten Lichts bestimmt sich aus der Überlagerung aller reflektierter Teilstrahlen (siehe: Azza , R. et al . 1975; Ellipsome- trie and polarized light, Amsterdam, North Holland) . Dabei geht sowohl die Dicke D der Interferenzschicht 2,
als auch die Dicke δ des Adsorbatfilms 3 ein. Zur genauen Bestimmung einer Schichtdickenänderung Δδ wird nun ausgenutzt, daß die Dicke D der Interferenzschicht 2 lateral variiert, so daß eine Vielzahl von Interferenz- Maxima und -Minima entsteht.Layer thickness δ of this biocompatible layer 3 increases when ligands 4 are bound from an aqueous solution 17 with a calculation index /. To detect the increase in layer thickness, the substrate is illuminated from below, ie from the side facing away from the biofunctionalized layer 3, with preferably monochromatic light, and the resulting interference pattern is imaged on a camera. The intensity of the reflected light is determined by the superposition of all reflected partial beams (see: Azza, R. et al. 1975; Ellipsometry and polarized light, Amsterdam, North Holland). Both the thickness D of the interference layer 2 as well as the thickness δ of the adsorbate film 3. For the exact determination of a change in layer thickness Δδ, use is now made of the fact that the thickness D of the interference layer 2 varies laterally, so that a large number of interference maxima and minima are produced.
Fig. la zeigt eine erste Ausführungsform. Darin ist beispielsweise eine dreiecksförmige Vertiefung und damit eine lineare Veränderung der Dicke D entsprechend dem schrägen Verlauf der Dreiecksflächen vom Ort dargestellt. Das Verhältnis der entsprechenden Interferenzintensitäten Irefl^O ist in Fig. lb gezeigt. Hier ist zu erkennen, daß sich die Lage der Maxima mit einer Zunahme der Dicke δ der Adsorbatschicht verschiebt. Die Interferenzbilder werden nun auf eine Weise verarbeitet, daß die Schichtdickenänderung Δδ lediglich aus der mittleren quadratischen Phasenverschiebung bestimmt wird. Dies entspricht der Verschiebung der in Fig. lb dargestellten Reflektivitätskurven. Durch diese Verarbeitung wird die Bestimmung der Dickenänderung der Adsorbatschicht 3 unabhängig sowohl von Schwankungen des einfallenden Lichts, als auch von der genauen Form und Güte der mikrostrukturierten Interferenzschicht. Zur Auswertung werden vorzugsweise eine Anzahl von Maxima und gleich vielen Minima verwendet.Fig. La shows a first embodiment. This shows, for example, a triangular depression and thus a linear change in the thickness D corresponding to the oblique course of the triangular surfaces from the location. The ratio of the intensities corresponding interference Irefl ^ O i st i n Fig. Lb. It can be seen here that the position of the maxima shifts with an increase in the thickness δ of the adsorbate layer. The interference images are now processed in such a way that the change in layer thickness Δδ is determined only from the mean square phase shift. This corresponds to the shift in the reflectivity curves shown in FIG. 1b. This processing makes the determination of the change in thickness of the adsorbate layer 3 independent both of fluctuations in the incident light and of the precise shape and quality of the microstructured interference layer. A number of maxima and the same number of minima are preferably used for the evaluation.
Der Darstellung in Fig. lb liegen folgende Brechungsindizes zugrunde: Träger 1 = Glas, n^ = 1,51; erste Schicht 2 = Interferenzschicht, n2 = 1,38; zweite Schicht 3 = Adsorbat (Protein), n3 = 1,55; wässrige Lösung 17, n4 = 1,33.The representation in FIG. 1b is based on the following refractive indices: support 1 = glass, n ^ = 1.51; first layer 2 = interference layer, n2 = 1.38; second layer 3 = adsorbate (protein), n3 = 1.55; aqueous solution 17, n4 = 1.33.
In einer weiteren Ausführungsform wird auf dem Träger 1 nur die erste Schicht 2 aufgebracht, so daß eine Anlagerung an die Schicht 2 stattfindet.
oIn a further embodiment, only the first layer 2 is applied to the carrier 1, so that an attachment to the layer 2 takes place. O
Als weitere Ausführungsform weist die erste Schicht 2 bzw. zweite Schicht 3 nicht die Rezeptoren auf, an die sich Liganden binden, sondern umgekehrt die Liganden, an die sich die Rezeptoren binden. Es wird hierbei die wechselseitige Bindungswirkung von Rezeptoren und Liganden genutzt.As a further embodiment, the first layer 2 or second layer 3 does not have the receptors to which ligands bind, but conversely the ligands to which the receptors bind. The mutual binding effect of receptors and ligands is used here.
In einer weiteren Ausführungsform wird anstelle eines Trägers mit Ausnehmungen ein ebener bzw. glatter Träger verwendet, auf den die Schicht 2 derart aufgebracht wird, daß der Abstand zwischen Ober- und Unterseite variiert. Auf diese Weise wird in dieser Ausführungsform erreicht, daß die Dicke D der Schicht 2 variiert. Vorzugsweise wird die Schicht 2 in Form von Tropfen oder Tröpfchen aufgebracht (beispielsweise aufgespritzt oder mit einer Pipette aufgetragen) . Diese läßt man eintrocknen oder polymerisieren. Alternativ wird eine ebene Schicht 2 aufgetragen, der anschließend eine Struktur aufgedruckt wird.In a further embodiment, instead of a carrier with recesses, a flat or smooth carrier is used, on which the layer 2 is applied in such a way that the distance between the top and bottom varies. In this way it is achieved in this embodiment that the thickness D of the layer 2 varies. Layer 2 is preferably applied in the form of drops or droplets (for example sprayed on or applied with a pipette). These are allowed to dry or polymerize. Alternatively, a flat layer 2 is applied, to which a structure is then printed.
Für die zweite Schicht 3 wird vorzugsweise ein quellfähiges Material verwendet, das im trockenen Zustand eine Dicke von etwa 5 bis 200 Ä, vorzugsweise etwa 10 bis 20 Ä hat, während sie im gequollenen Zustand Dicken zwischen 10 und 100000 Ä, vorzugsweise 10000 Ä aufweist. In diesem gequollenen Zustand weist diese Schicht vorzugsweise einen Brechungsindex n3 von 1,31 auf.A swellable material is preferably used for the second layer 3, which in the dry state has a thickness of approximately 5 to 200 Å, preferably approximately 10 to 20 Å, while in the swollen state it has thicknesses between 10 and 100,000 Å, preferably 10,000 Å. In this swollen state, this layer preferably has a refractive index n3 of 1.31.
Die zu bestimmende Änderung der optischen Dicke der Schicht kann beispielsweise auf folgende Arten erfolgen. Zum einen ändert sich aufgrund von Anlagerungen die physikalische Dicke und somit auch die optische Dicke der Schicht, zum anderen kann eine Änderung der optischen Dicke auf einer Änderung des Brechungsindexes beruhen, die sich aufgrund von Einlagerungen in die Schicht ergibt.
Es wird jeweils ein Interferenzbild vor und nach (bzw. während) der Zugabe des Liganden aufgenommen und folgende Operationen über der Fläche des Interferenzmusters ausgeführt. (Im Falle eines Vielfachtest, wie der weiter unten gezeigten Mikrotiterplatte, werden diese Operationen natürlich für jede Bindungsfläche getrennt durchgeführt.) Zunächst werden die Intensitäten normiert :The change in the optical thickness of the layer to be determined can take place, for example, in the following ways. On the one hand, the physical thickness and thus also the optical thickness of the layer change due to deposits, on the other hand, a change in the optical thickness can be based on a change in the refractive index, which results from deposits in the layer. An interference image is recorded before and after (or during) the addition of the ligand and the following operations are carried out over the surface of the interference pattern. (In the case of a multiple test, such as the microtiter plate shown below, these operations are of course carried out separately for each binding surface.) First, the intensities are standardized:
Wobei die <> die Mittelung über alle NxM Bildpunkte bedeutet. Dann wird die Differenz der normierten Intensitäten Iγ, N der Bilder vor und nach der Bindung gebildet und quadratisch ge ittelt :The <> means the averaging over all NxM pixels. Then the difference between the normalized intensities Iγ, N of the images before and after the binding is formed and divided into squares:
wobei die Mittelung über alle NxM Bildpunkte eines Bildausschnitts durchgeführt wird, welcher vorzugsweise gleich groß oder aber kleiner als das Interferenzmuster am Boden eines Mikrotiter-Töpfchens ist. Vorzugsweise wird über eine quadratische Fläche gemittelt. S wird bezeichnet als die "mittlere quadratische Differenz der normierten Intensitäten" zweier Interferenzmuster (Iv, Ijj) vor bzw. nach der Adsorption. Für den auf diese Weise erhaltenen Wert S gilt: wherein the averaging is carried out over all NxM pixels of an image section which is preferably the same size or smaller than the interference pattern at the bottom of a microtiter potty. Averaging is preferably carried out over a square area. S is referred to as the "mean square difference of the normalized intensities" of two interference patterns (I v , I j j) before and after the adsorption. The following applies to the value S obtained in this way:
wobei λ die verwendete Lichtwellenlänge bezeichnet und n-j_ die jeweiligen Brechungsindizes, wie oben definiert. Gleichung (3) wird in vielen praktischen Fällen, in de-
nen die Adsorbatschicht klein gegenüber λ/4 ist genügen, um die optische Schichtdickenzunahme Δδ aus dem gemessenen Wert für S direkt zu bestimmen. Die jeweilige Genauigkeit der Gleichung (3) läßt sich durch Vergleich mit den numerischen Werten für gegebene Brechungsindizes und Schichtdicken δ bestimmen. Somit ist für kleine Schichtdickenänderungen S proportional zur Schichtdik- kenänderung Δδ. Die exakte Beziehung kann numerisch bestimmt und tabellarisch abgelegt werden. Für den Grenzfall, daß die Adsorbatschicht vor der Adsorption exakt Null ist, läßt sich obige Beziehung (3) unter Vernachlässigung von Vielfachreflexion herleiten. Fig. lc zeigt die Größe S einer simulierten Probe, welche nach Gleichung (1) und (2) berechnet wurde als Funktion derwhere λ denotes the light wavelength used and n- j _ the respective refractive indices as defined above. Equation (3) is used in many practical cases where NEN the adsorbate layer is small compared to λ / 4 is sufficient to directly determine the optical layer thickness increase Δδ from the measured value for S. The respective accuracy of equation (3) can be determined by comparison with the numerical values for given refractive indices and layer thicknesses δ. Thus, for small changes in layer thickness, S is proportional to the change in layer thickness Δδ. The exact relationship can be determined numerically and stored in a table. For the borderline case that the adsorbate layer is exactly zero before adsorption, the above relationship (3) can be derived by neglecting multiple reflection. Fig. Lc shows the size S of a simulated sample, which was calculated according to equations (1) and (2) as a function of
Schichtdickenänderung Δδ. Dabei wurde angenommen, daß die Adsorbatschicht δ homogen, also nicht vom Ort abhängig ist.Change in layer thickness Δδ. It was assumed that the adsorbate layer δ is homogeneous, that is, it is not dependent on the location.
Herstellung interferometrischer MikrotiterplattenManufacture of interferometric microtiter plates
Optisch hochwertige, lateral strukturierte Interferenzschichten können durch standardmäßiges Aufdampfen dielektrischer Schichten auf Glas hergestellt werden. Die Strukturierung würde in diesem Fall durch Masken, welche zwischen den einzelnen Aufdampfzyklen entweder verschoben oder ausgetauscht werden, erfolgen.Optically high-quality, laterally structured interference layers can be produced by standard vapor deposition of dielectric layers on glass. In this case, the structuring would take the form of masks which are either shifted or exchanged between the individual vapor deposition cycles.
Erfindungsgemäß werden gemäß der ersten Ausführungsform Plastikplatter- bzw. die Trägersubstanz strukturiert. Dies ist einfach und kostengünstig. Ein optisch niedrig oder nicht-dcppelbrechendes Polymer (Polycarbonat, zyklische Olefir-e) kann beispielsweise im Spritzgußverfahren auf eine Mikrotiterplattenform gebracht werden (Fig. 2a) . Diese besteht aus einer Anordnung kleiner Plastiktöpfchen mit flachem Boden. In einem zweiten
Schritt wird mit Hilfe eines Stempels in jedem Töpfchen eine Vertiefung 5 von einigen wenigen Mikrometern Tiefe gepreßt (Fig. 2b) . Beispielsweise ist die Vertiefung zwischen 5 und 2000 Nanometer tief. Für die exakte Form der Vertiefung 5 sind mehrere Möglichkeiten denkbar. Beispielsweise monoton ansteigende, vorzugsweise stetige Formen, wie konkave, konvexe, konische oder dachförmige Vertiefungen stellen einfache Lösungen dar. Im letzten Schritt wird ein zweites Polymer (Schicht 2) mit unterschiedlichem Brechungsindex im Gießverfahren aus der Lösung auf die Vertiefung 5 aufgetragen, kann aber - wie in Fig. la gezeigt - über die Vertiefung 5 hinaus verlaufen. Da der Durchmesser des Stempels konstant ist, läßt sieh durch Auftragen einer definierten Menge Lösungsmittel die Schichtdicke D sehr reproduzierbar herstellen. Der zweite Kunststoff 2 soll in einem Lösungsmittel lösbar sein, welches den Kunststoff 1 nicht angreift. Durch Eintrocknen der Schicht 2 kann sich an der Oberfläche ein Meniskus ausbilden.According to the first embodiment, plastic plate or the carrier substance is structured. This is easy and inexpensive. An optically low or non-birefringent polymer (polycarbonate, cyclic olefir-e) can, for example, be injection molded onto a microtiter plate mold (FIG. 2a). This consists of an arrangement of small plastic pots with a flat bottom. In a second Step, a depression 5 of a few micrometers depth is pressed in each potty with the aid of a stamp (FIG. 2b). For example, the recess is between 5 and 2000 nanometers deep. Several possibilities are conceivable for the exact shape of the recess 5. For example, monotonously increasing, preferably continuous shapes, such as concave, convex, conical or roof-shaped depressions, represent simple solutions. In the last step, a second polymer (layer 2) with a different refractive index is applied from the solution to the depression 5 in the casting process, but can - as shown in Fig. La - extend beyond the recess 5. Since the diameter of the stamp is constant, the layer thickness D can be produced very reproducibly by applying a defined amount of solvent. The second plastic 2 should be soluble in a solvent that does not attack the plastic 1. By drying the layer 2, a meniscus can form on the surface.
Auslesen des Reflexions-Interferenz-SignalsReading out the reflection interference signal
Die Reflektivität der Mikrotiterplatte kann mit Hilfe von Reflexions-Mikroskopie unter Auflichtbeleuchtung abgebildet werden (siehe Fig. 3) . Wird mit Hilfe eines schmalbandigen Interferenzfilters monochromatisches Licht erzeugt, werden die Interferenzen in den oben beschriebenen lateral strukturierten Vertiefungen 5 sichtbar. In der Praxis läßt sich weiterhin das Verhältnis von Interferenzsignal zu Hintergrundhelligkeit verbes¬ sern, indem die Antiflex-Technik nach Pluta (Pluta, M; Advanced Light Microscopy, Elsevier, Amsterdam 1989) be¬ nutzt wird. Fig. 3 zeigt den Strahlengang eines solchen Reflexions-Interferenz-Kontrast-Mikroskops nach Pluta. Wird die Probenkammer durch Immersionsöl direkt auf die
λ/4-Platte 7 aufgebracht, so ist die erste reflektierende Grenzfläche die Glas-Magnesiumfluorid 2 Grenzschicht (Fig. la) .The reflectivity of the microtiter plate can be imaged with the aid of reflection microscopy under reflected light (see FIG. 3). If monochromatic light is generated with the aid of a narrow-band interference filter, the interference becomes visible in the laterally structured depressions 5 described above. In practice, further the ratio of interference signal to background brightness verbes ¬ lets fibers by the anti-Flex technology for Pluta (Pluta, M; Advanced Light Microscopy, Elsevier, Amsterdam 1989) uses be ¬. 3 shows the beam path of such a reflection-interference-contrast microscope according to Pluta. If the sample chamber is placed directly on the immersion oil λ / 4 plate 7 applied, so the first reflective interface is the glass-magnesium fluoride 2 interface (Fig. La).
Fig. 3 zeigt einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflektivität der Mikrotiterplatte mittels Reflexions- Interferenz-Kontrast-Mikroskopie. Der Träger 1 mit der eingebrachten Interferenzschicht 2 wird über einer λ/4- Platte 7 (optional) angeordnet. Dazwischen befindet sich ein Medium 6 mit gleichem Brechungsindex wie der Träger3 shows a structure for the optical imaging of the reflectivity of the microtiter plate by means of reflection-interference-contrast microscopy. The carrier 1 with the introduced interference layer 2 is arranged over a λ / 4 plate 7 (optional). In between is a medium 6 with the same refractive index as the support
1 und die λ/4-Platte 7 zur reflexionsfreien Ankopplung. Dieses Medium ist vorzugsweise ein Immersionsöl oder Silikon. Das von einer Quecksilberdampflampe 14 ausgestrahlte Licht wird über ein Bandpass-Filter 13, das monochromatisches Licht erzeugt, über einen Polarisator 12 (optional) , einen halbdurchlässigen Spiegel 9 und ein Objektiv 8 auf die zu messende Schicht gerichtet. Das reflektierte Licht durchdringt den halbdurchlässigen Spiegel 9 und gelangt über einen Analysator 10 (optional) zu einer Kamera 11. Diese kann eine CCD-Kamera sein.1 and the λ / 4 plate 7 for reflection-free coupling. This medium is preferably an immersion oil or silicone. The light emitted by a mercury vapor lamp 14 is directed onto the layer to be measured via a bandpass filter 13, which generates monochromatic light, a polarizer 12 (optional), a semi-transparent mirror 9 and an objective 8. The reflected light penetrates the semitransparent mirror 9 and reaches an camera 11 via an analyzer 10 (optional). This can be a CCD camera.
Ein zweites mögliches Ausleseverfahren (Auslesevorrichtung) besteht in der Abtastung der Mikrotiterplatte mit einem Laser bzw. einer Laserdiode. Das reflektierte Licht wird mit einem eindimensionalen Detektor aufgenommen. Wird die Platte abgerastert, entsteht wiederum ein Interferenzsignal, wie in Fig. lb dargestellt, und die Auswertung erfolgt analog zur abbildenden Reflexions- Interferenz.A second possible readout method (readout device) consists of scanning the microtiter plate with a laser or a laser diode. The reflected light is recorded with a one-dimensional detector. If the plate is scanned, an interference signal again arises, as shown in FIG. 1b, and the evaluation is carried out analogously to the imaging reflection interference.
Fig. 4 zeigt eine Ausführungsform mit Laserabtastung. Eine Abtastung der Mikrotiterplatte mit einem Laser 19 ist vorteilhaft in Anwendungen, bei denen die Geschwindigkeit des A sleseprozeßes kritisch ist. In dieser Aus-
führungsform wird auf abbildende Optik verzichtet und die Mikrotiterplatte von einem Laserstrahl abgetastet, wobei die Intensität des reflektierten Strahls gemessen wird. In Fig. 4 wird der Laserstrahl durch einen drehbaren Spiegel 20 so umgelenkt, daß er die Probe überstreicht und auf einen eindimensionalen Detektor 21 (vorzugsweise CCD) reflektiert wird. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte in dieser Ausführung der Abtastung sind vorzugsweise dach- oder keilförmige Vertiefungen, also lediglich in einer, der Abtastrichtung entsprechenden, Richtung variiert. Die Mittelungen nach Formel (1) und (2) entsprechen in diesem Fall der Mittelung entlang einer Linie. Bezugszeichen 18 bezeichnet einen Glasblock mit Antireflexbeschichtung.
Fig. 4 shows an embodiment with laser scanning. Scanning the microtiter plate with a laser 19 is advantageous in applications in which the speed of the reading process is critical. In this In the embodiment, imaging optics are dispensed with and the microtiter plate is scanned by a laser beam, the intensity of the reflected beam being measured. In Fig. 4, the laser beam is deflected by a rotatable mirror 20 so that it sweeps over the sample and is reflected on a one-dimensional detector 21 (preferably CCD). The depressions of the microtiter plate in this embodiment of the scanning are preferably roof-shaped or wedge-shaped depressions, that is to say only varied in a direction corresponding to the scanning direction. In this case, the averages according to formulas (1) and (2) correspond to the averaging along a line. Reference numeral 18 denotes a glass block with an anti-reflective coating.