WO1998055647A1 - Methode de diagnostic genotypique indirect de la migraine hemiplegique familiale de type 2 - Google Patents

Methode de diagnostic genotypique indirect de la migraine hemiplegique familiale de type 2 Download PDF

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WO1998055647A1
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hemiplegic migraine
family
marker
gene
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PCT/FR1998/001162
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Anne Ducros
Elisabeth Tournier Lasserve
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Definitions

  • the present invention relates in particular to screening for predisposition as well as the diagnosis of familial hemiplegic migraine, hereinafter “MHF”, and the possibility of highlighting one or more genes involved in this condition.
  • MHF familial hemiplegic migraine
  • Hemiplegic migraine is a form of migraine with aura in which the aura has a unilateral motor deficit, usually associated with visual and sensitive symptoms, followed by migraine headaches (2, 3). In severe attacks, prolonged deficits, fever, confusion and coma, can occur but usually go away without sequelae (4).
  • a linkage analysis conducted on one of these families not linked to chromosome 19 made it possible to locate a second gene responsible for MHF on chromosome 1.
  • the susceptibility locus which will be referred to hereinafter as MHF2, (as opposed to the locus located on chromosome 19 known as MHF1), is located in the region Iq21-lq23 in an interval of 21 cM (centimorgan) (8) flanked by the two markers D1S2343 and D1 S2844.
  • the markers mentioned in the present description are known, they are the markers of Genethon and the primers making it possible to demonstrate them are also known.
  • a Lod-score greater than 3 was obtained in this first family with two markers, D1S2635 and D1S2705. Three other markers, D1S2343, D1S2707 and D1S2844 showed lod-scores greater than 2. All of these data made it possible to establish the existence of a second locus for MHF located on chromosome 1.
  • Two other families of MHF among the 6 families tested for their binding to chromosome 1 were indeed linked to chromosome 1.
  • the 4 remaining families were not linked to chromosome 1, thus demonstrating the existence of at least a third locus for MHF since these 4 families were also not linked to chromosome 19.
  • the present invention relates to a method of indirect genotypic diagnosis of familial hemiplegic migraine type 2 in an individual characterized in that:
  • This method can be applied in particular in the following two cases: • on the one hand, in front of a table of familial hemiplegic migraine, to highlight the fact that it is an MHF2, that is to say linked to chromosome 1, and which could justify specific treatments different from those applied in the case of MHF1 linked to chromosome 19,
  • markers linked to the occurrence of MHF within the family of the individual is intended to denote the presence of one or more DNA sequences which are linked with the occurrence of the disorder in the family, some of these markers located in the previous locus are identified more precisely below.
  • a marker which can be used in the method according to the present invention can be demonstrated by the binding analysis applied to DNA samples from family members, affected or not. This is a process which is known and which will therefore only be briefly recalled below.
  • the first step is to establish the link between the gene responsible for the pathology and one or more markers. This study is conducted on families whose structure lends itself to this type of analysis, that is to say families in which the presence of familial hemiplegic migraine has been clearly established by clinical analyzes as complete as possible.
  • microsatellites flanking highly polymorphic CA or GATA repeat units, these markers covering the interval in which the gene involved in the pathology is found, here the locus located between D1 S2343 and D! S2844.
  • microsatellites flanking highly polymorphic CA or GATA repeat units, these markers covering the interval in which the gene involved in the pathology is found, here the locus located between D1 S2343 and D! S2844.
  • the two markers mentioned above are the end markers but other markers could have been used, these in particular are the markers:
  • the alleles are defined by the different sizes of the fragments amplified with the oligonucleotides corresponding to a given microsatellite.
  • the most commonly used method consists, after having hybridized the primers corresponding to the microsatellite markers for example, to carry out an amplification by PCR or by any analogous method, then to separate the product from amplification, in particular by electrophoresis on acrylamide gel, then demonstrated by labeling with the polyCA or polyGATA type sequences as a probe for microsatellites.
  • lod-score The so-called "lod-score” statistical analysis is a known statistical technique and it is commonly accepted that a lod-score greater than 3 unambiguously establishes the link between the pathology gene and the marker tested.
  • a marker and a gene are very close (they are said to be linked), the portion of chromosome containing them will be transmitted as such to the descendants; on the other hand, if the marker is more distant, it may be separated from the gene during transmission (“crossing over”) and its presence is no longer necessarily associated with the presence of the defective gene.
  • the method according to the invention can be implemented both in adults, in children and in the fetus as a prenatal diagnosis.
  • PCR complementary metal-oxide-semiconductor
  • the principle is to carry out several PCR reactions simultaneously from the same genomic DNA sample.
  • the advantage is to save the reagents as well as the DNA to be typed, and reduce the risk of error by reducing the number of manipulations.
  • the disclosure methods are known and will not be described in detail.
  • a diagnostic protocol is given below on the basis of the polymo ⁇ hisms which have been described previously. Of course, any method of indirect genotypic diagnosis can be used.
  • DNA is obtained from the various family members, each of whom has been studied clinically in order to demonstrate the existence or not of the disease in the individual in question.
  • Nuclear DNA can, for example, be isolated from peripheral blood leukocytes, lymphoblastoid cells, cells from amniotic fluid, cultured or otherwise, treated appropriately.
  • the confirmation of the link or the absence of link between the analyzed fragments and the MHF were the subject of a statistical analysis for which a link score higher than 3 establishes in an unambiguous way the link between the gene responsible for pathology and the marker tested.
  • a positive lod-score but less than 3 can be obtained when linked to the MHF2 locus, due to the small size of the family explored.
  • a calculation of the probability that the family is related can then be performed using the HOMOG method (12). This then makes it possible to determine the most informative microsatellites for the family in question.
  • the diagnostic protocol for an individual at risk of a disease implements the information previously obtained: • we select the most informative markers for the family in question,
  • the present invention also relates to the DNA sequence and the genes involved in MHF2.
  • the localization of the MHF2 gene in fact makes it possible, through a functional cloning strategy, to identify this gene. It is possible to isolate the gene, in particular by:
  • the present invention also relates to the DNA sequence located on the locus located between the markers D1 S2343 and
  • D1S2844 and linked to the occurrence of familial hemiplegic migraine as well as the gene involved in the occurrence of hemiplegic migraine type 2 and located on a DNA according to the invention.
  • the only figure shows schematically the pedigree of the 3 MHF families linked to chromosome Iq21-q23. Affected individuals are represented by blackened symbols, unaffected individuals are represented by empty symbols, when the status of the individual is unknown, the symbol is hatched, individuals with no information are crossed out.
  • the position of the various markers in the region has also been shown.
  • the alleles for the markers are represented for each individual, the blackened parts indicate regions which co-aggregate with the disease.
  • the P family is a large Caucasian family of 3 generations from the north of France. Families C, D and V are from southern France, families H and N from central France and family W from northern Spain. A total of 102 subjects including 20 spouses were examined as part of this study.
  • family P 12 members suffer from characteristic hemiplegic migraine attacks (2). In addition to the typical attacks, 5 of them suffered severe episodes in which hemiplegia was associated with fever, confusion and coma. In the other 6 pedigrees, 35 patients were identified fulfilling the criteria of the International Headache Society. The 47 subjects suffering from MHF had a normal neurological examination outside the attacks. These 47 members have been classified as affected.
  • DNA is extracted from the blood of different individuals by known methods. 5 markers were chosen from the Genethon link map.
  • the DNA was amplified by the PCR method using the PHC3 Techne device.
  • the reactions are carried out in a final volume of 50 ⁇ l containing 200 ng of genomic DNA, 125 mM 4dNTP mixture, 1 x PCR buffer Cetus Taq polymerase, 1 U BRL Taq polymerase, 1 mM of each primer.
  • the samples are treated for 30 temperature cycles (1 cycle, 94 ° C for 5 min; 28 cycles including a denaturation step at 92 ° C for 1 min and a fixing step at 55 ° C for 1 min and extension to 72 ° C for 1 min; the last cycle allows an extension to 72 ° C for 10 min).
  • the samples are denatured for 5 minutes at 94 ° C.
  • allelic frequency for each locus is obtained from the Genome Data Base. Analysis of the results 30 members of the P family were genotypes with 260 microsatellite markers covering all the chromosomes.
  • the region where the MHF2 gene has been located contains two candidate genes for this condition, GLRK3 (15, 16, 17) which codes for a potassium channel, and CACNL1A6 (13, 14) which codes for a calcium channel.
  • the invention also relates to the use of the hGLRK3 and CACNL1A6 genes for the detection of familial hemiplegic migraine.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de diagnostic génotypique indirect de la migraine hémiplégique familiale de type 2 chez un individu, caractérisée en ce que: on met en évidence dans l'ADN dudit individu la présence d'un marqueur situé sur le chromosome 1q21-q23 dans le locus limité par les marqueurs D1S2343 et D1S2844, ledit marqueur étant lié à la survenue de la migraine hémiplégique familiale au sein de sa famille.

Description

METHODE DE DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE INDIRECT DE LA MIGRAINE HEMIPLEGIQUE FAMILIALE DE TYPE 2
La présente invention concerne notamment le dépistage de la prédisposition ainsi que le diagnostic de la migraine hémiplégique familiale, ci-après « MHF », et la possibilité de mettre en évidence un ou plusieurs gènes impliqués dans cette affection.
La migraine hémiplégique familiale est une affection héréditaire. La migraine hémiplégique est une forme de migraine avec aura dans laquelle l'aura comporte un déficit moteur unilatéral, en général associé à des symptômes visuels et sensitifs, suivie par des maux de tête migraineux (2, 3). Dans les attaques sévères, des déficits prolongés, une fièvre, une confusion et un coma, peuvent survenir mais disparaissent généralement sans séquelle (4).
Les recherches récentes ont montré que le gène responsable de la survenue d'une MHF dans certaines familles était localisé sur le chromosome 19 (1 1). Ce gène, CACNL1A4, code pour une sous-unité αl d'un canal calcique spécifique du cerveau (1). Toutefois, les inventeurs ont démontré que la MHF était génétiquement hétérogène : en particulier 9 des 21 familles testées jusqu'à maintenant n'étaient pas liées au chromosome 19 (5, 6, 7).
Une analyse de liaison conduite sur une de ces familles non liées au chromosome 19 a permis de localiser un deuxième gène responsable de la MHF sur le chromosome 1.
Plus particulièrement, le locus de susceptibilité, qui sera dénommé ci-après MHF2, (par opposition au locus situé sur le chromosome 19 dénommé MHF1), est situé dans la région Iq21-lq23 dans un intervalle de 21 cM (centimorgan) (8) flanqué par les deux marqueurs D1S2343 et D1 S2844.
Les marqueurs mentionnés dans la présente description sont connus, il s'agit des marqueurs du Généthon et les amorces permettant de ies mettre en évidence sont également connues. Un Lod-score supérieur à 3 a été obtenu dans cette première famille avec deux marqueurs, D1S2635 et D1S2705. Trois autres marqueurs, D1S2343, D1S2707 et D1S2844 montraient des lod-scores supérieurs à 2. L'ensemble de ces données a permis d'établir l'existence d'un deuxième locus pour la MHF situé sur le chromosome 1. Deux autres familles de MHF parmi les 6 familles testées pour leur liaison au chromosome 1 étaient bien liées au chromosome 1. Les 4 familles restantes n'étaient pas liées au chromosome 1, démontrant ainsi l'existence d'au moins un troisième locus pour la MHF puisque ces 4 familles n'étaient pas non plus liées au chromosome 19. Parmi les 3 familles liées au chromosome 1, deux des familles comptaient plusieurs membres chez lesquels le diagnostic de migraine hémiplégique avait été très tardif et difficile en raison de la nature des symptômes qu'ils présentaient. Le diagnostic clinique chez certains de ces patients avait hésité entre migraine hémiplégique et crise d'épilepsie. Par ailleurs, la pénétrance clinique (pourcentage des individus porteurs du gène malade qui expriment le phénotype malade) des formes de MHF liées au chromosome 1 est incomplète et plus faible que dans les formes liées au chromosome 19. Ainsi, un sujet atteint peut se présenter comme un cas sporadique. Ces deux observations, l'intrication avec des crises d'épilepsie et le caractère incomplet de la pénétrance, soulignent l'intérêt d'un test diagnostique génotypique de cette forme de MHF.
En outre, ces formes de MHF liées au chromosome 1 pourraient justifier de traitements différents des autres formes de MHF. La connaissance du locus selon la présente invention permet d'envisager le diagnostic de la maladie, notamment au sein des familles à risque, et permet d'orienter le diagnostic lors de la survenue d'un épisode paroxystique.
C'est pourquoi, la présente invention concerne une méthode de diagnostic génotypique indirect de la migraine hémiplégique familiale de type 2 chez un individu caractérisée en ce que :
• on met en évidence dans l'ADN provenant dudit individu la présence d'un marqueur situé sur le chromosome Iq21-q23 dans le locus limité par les marqueurs D1S2343 et D1S2844, ledit marqueur étant lié à la survenue de la migraine hémiplégique familiale au sein de sa famille.
Cette méthode peut être appliquée notamment dans les deux cas suivants : • d'une part, devant un tableau de migraine hémiplégique familiale, pour mettre en évidence le fait qu'il s'agit d'une MHF2, c'est-à-dire liée au chromosome 1, et qui pourraient justifier de traitements particuliers différents de ceux appliqués dans le cas de MHF1 liée au chromosome 19,
• d'autre part, pour déceler chez un individu appartenant à une famille à risque le risque qu'il souffre d'une MHF et éviter ainsi des diagnostics erronés.
Par « marqueur lié à la survenue de la MHF au sein de la famille de l'individu » on entend désigner la présence d'une ou plusieurs séquences d'ADN qui sont liées avec la survenue de l'affection dans la famille, certains de ces marqueurs situés dans le locus précédent sont identifiés plus précisément ci-après.
Un marqueur utilisable dans la méthode selon la présente invention peut être mis en évidence par l'analyse de liaison appliquée à des échantillons d'ADN provenant des membres de la famille, affectés ou non. Il s'agit d'un processus qui est connu et qui ne sera donc rappelé que succinctement ci-après.
La première étape consiste à établir le lien entre le gène responsable de la pathologie et un ou plusieurs marqueurs. Cette étude est conduite sur des familles dont la structure se prête à ce type d'analyse, c'est- à-dire des familles dans lesquelles la présence de la migraine hémiplégique familiale a été clairement établie par des analyses cliniques aussi complètes que possible.
Ensuite, on réalise une analyse de liaison génétique entre les différents marqueurs testés, c'est-à-dire des fragments d'ADN, et la pathologie ; on utilise pour ce faire, de préférence, des marqueurs hautement polymorphes : des microsatellites flanquant des unités répétées hautement polymorphes CA ou GATA, ces marqueurs recouvrant l'intervalle dans lequel se trouve le gène mis en cause dans la pathologie, ici le locus situé entre D1 S2343 et D!S2844. L'intérêt d'utiliser des marqueurs microsatellites est qu'il s'agit de séquences qui sont très polymoφhes, c'est-à-dire qu'elles ont des compositions différentes selon les individus, bien qu'étant situées au même endroit sur le chromosome, ces zones sont dénommées « microsatellites » et font l'objet de nombreuses publications (Weissenbach J. et al., Nature 359, 794-801, 1992 ; Gyapay et al. 1996, A comprehensive genetic map of the human génome based on 5,264 microsatellites, Nature, vol 380; Hudson et al., 1992, Genomics 13 : 622-629 et Weber et May, 1989 et Weber J. et al., Am. J. Hum. Gen., 1993, 53, 1079-1095). Ces marqueurs sont sélectionnés pour donner les meilleures informations pour une famille déterminée. Plus ces marqueurs sont proches du gène, plus le risque de recombinaison entre le gène et ces marqueurs sera faible et donc le diagnostic sera d'autant plus fiable.
Dans le cas de la migraine hémiplégique familiale, les deux marqueurs mentionnés précédemment sont les marqueurs d'extrémité mais d'autres marqueurs ont pu être utilisés, il s'agit notamment des marqueurs :
D1S2343
D1S2635
D1S2707 D1S2705
D1S2844
Ces marqueurs microsatellites, de même que les amorces qui permettent de les mettre en évidence, sont connus, ils ont fait l'objet de nombreuses publications et en particulier figurent dans la carte dite « Carte du Généthon ».
Les allèles sont définis par les différentes tailles des fragments amplifiés avec les oligonucléotides correspondant à un microsatellite donné.
L'analyse de plusieurs membres de statut défini au sein d'une famille permet d'identifier pour chaque marqueur l'allèle qui est lié à la maladie dans la famille considérée.
Bien entendu, il est possible de mettre en évidence d'autres marqueurs dans le même locus qui pourraient être liés à la survenue de la maladie dans la famille en cause. Afin de détecter la présence d'un allèle microsatellite, la méthode la plus couramment utilisée consiste, après avoir hybride les amorces correspondant aux marqueurs microsatellites par exemple, à procéder à une amplification par PCR ou par toute méthode analogue, puis à séparer le produit d'amplification, notamment par électrophorèse sur gel d'acrylamide, puis mise en évidence par marquage à l'aide des séquences de type polyCA ou polyGATA à titre de sonde pour les microsatellites.
Une analyse statistique, méthode des « lod-scores », permet d'estimer, à partir de la distribution observée des allèles au sein de la famille, s'il existe ou non une liaison génétique entre la pathologie en cause et le marqueur testé.
L'analyse statistique dite de « lod-score » est une technique statistique connue et on admet couramment qu'un lod-score supérieur à 3 établit de façon non ambiguë le lien entre le gène de la pathologie et le marqueur testé.
Si un marqueur et un gène sont très proches (on dit qu'ils sont liés), la portion de chromosome les contenant sera transmise telle quelle à la descendance ; par contre, si le marqueur est plus éloigné, il peut se trouver séparé du gène lors de la transmission (« crossing over ») et sa présence n'est plus nécessairement associée à la présence du gène défectueux.
Bien entendu, lorsque cette analyse a été réalisée, comme c'est le cas dans le cadre de la présente invention, il est possible d'utiliser directement des informations ainsi collectées pour réaliser le dépistage d'une prédisposition à la migraine hémiplégique familiale de type 2 chez un membre de cette famille, il n'est pas nécessaire de refaire l'ensemble de l'analyse.
La méthode selon l'invention peut être mise en oeuvre aussi bien chez l'adulte, chez l'enfant, que chez le foetus à titre de diagnostic prénatal.
Afin de simplifier la détection, lorsque l'on utilise différents marqueurs, il est possible d'utiliser la PCR « multiplex ». Le principe est de réaliser plusieurs réactions de PCR simultanément à partir d'un même échantillon d'ADN génomique. L'intérêt est d'économiser les réactifs ainsi que l'ADN à typer, et de réduire le risque d'erreur en diminuant le nombre de manipulations. Bien entendu, il est possible d'utiliser d'autres méthodes d'amplification que la PCR, qui sont parfois appelées « PCR-like », ou autres. De même, les méthodes de révélation sont connues et ne seront pas décrites en détail. A titre indicatif, on donne ci-après un protocole de diagnostic sur la base des polymoφhismes qui ont été décrits précédemment. Bien entendu, toute méthode de diagnostic génotypique indirect peut être utilisée.
Afin de sélectionner les marqueurs les plus informatifs en fonction de ce qui est connu sur la famille ou bien du fait qu'on cherche à établir un diagnostic sur la famille, on réalisera les opérations suivantes :
• On obtient de l'ADN des différents membres de la famille, chacun d'entre eux ayant été étudié sur le plan clinique afin de mettre en évidence l'existence ou non de la maladie chez l'individu en question.
• L'ADN nucléaire peut, par exemple, être isolé à partir des leucocytes du sang périphérique, des cellules lymphoblastoïdes, des cellules du liquide amniotique, mis en culture ou autre, traité de façon appropriée.
• Ensuite on amplifie les allèles polymoφhiques des microsatellites par la méthode PCR en utilisant un appareil thermocycleur,
• puis on analyse la taille des produits d'amplification par électrophorèse sur gel, fixation sur membrane et hybridation avec des sondes appropriées tel que cela a été mentionné précédemment.
• Il est également possible de pratiquer une analyse par RFLP, c'est-à-dire analyse des fragments de restriction polymoφhes sur un gel d'agarose après Southern blotting. • Les informations obtenues des autoradiographies sont analysées par le programme statistique.
La confirmation du lien ou de l'absence de lien entre les fragments analysés et la MHF ont fait l'objet d'une analyse statistique pour laquelle un score de liaison supérieur à 3 établit de façon non ambiguë la liaison entre le gène responsable de la pathologie et le marqueur testé. Un lod-score positif mais inférieur à 3 peut être obtenu en cas de liaison au locus MHF2, en raison de la petite taille de la famille explorée. Un calcul de probabilité que la famille soit liée peut alors être réalisé en utilisant la méthode HOMOG (12). Ceci permet ensuite de déterminer les microsatellites les plus informatifs pour la famille en cause.
Le protocole de diagnostic pour un individu à risque d'une maladie met en oeuvre les informations obtenues précédemment : • on sélectionne les marqueurs les plus informatifs pour la famille en cause,
• on sépare l'ADN de l'individu par des procédés appropriés,
• on amplifie les séquences situées dans le locus de survenue de la maladie, comme cela a été décrit précédemment,
• on analyse les produits d'amplification, • on utilise ensuite les marqueurs polymorphes et les résultats trouvés précédemment de façon à pouvoir calculer le risque de survenue de la pathologie chez l'individu en cause.
La présente invention concerne également la séquence d'ADN et les gènes impliqués dans MHF2. La localisation du gène MHF2 permet, en effet, par une stratégie de clonage fonctionnel d'identifier ce gène. Il est possible d'isoler le gène, notamment par :
• recherche simultanée de nouveaux marqueurs polymoφhes et de nouveaux haplotypes recombinants qui permettront de rétrécir encore la région contenant le gène ; • recherche directe de gènes par plusieurs méthodes :
• sélection de transcrits par hybridation
• piègeage d'exons
• séquences phylogénétiquement conservées
• îlots CpG • expansion de triplets
C'est pourquoi la présente invention concerne également la séquence d'ADN située sur le locus situé entre les marqueurs D1 S2343 et
D1S2844 et liée à la survenue de la migraine hémiplégique familiale ainsi que le gène impliqué dans la survenue de la migraine hémiplégique de type 2 et situé sur un ADN selon l'invention.
D'autres caractéristiques et modalités de mise en oeuvre du procédé pourront être déduits de la lecture de l'exemple qui suit.
L'unique figure schématise le pedigree des 3 familles MHF liée au chromosome Iq21-q23. Les individus affectés sont représentés par des symboles noircis, les individus non affectés sont représentés par des symboles vides, lorsque le statut de l'individu est inconnu, le symbole est hachuré, les individus n'ayant pas d'information sont rayés.
On a également représenté la position des différents marqueurs de la région. Les allèles pour les marqueurs sont représentés pour chaque individu, les parties noircies indiquent des régions qui coségrègent avec la maladie.
EXEMPLE Méthode de génotypage de l'ADN génomique humain avec des marqueurs microsatellites de la région Iq21-lq23
La famille P est une grande famille caucasienne de 3 générations provenant du nord de la France. Les familles C, D et V sont originaires du sud de la France, les familles H et N du centre de la France et la famille W du nord de l'Espagne. Un total de 102 sujets comprenant 20 époux a été examiné dans le cadre de la présente étude. Dans la famille P, 12 membres souffrent de crises de migraine hémiplégique caractéristiques (2). En plus des attaques typiques, 5 d'entre eux ont subi des épisodes sévères dans lesquels l'hémiplégie a été associé à de la fièvre, de la confusion et un coma. Dans les 6 autres pedigrees, 35 patients ont été identifiés remplissant les critères de l'International Headache Society. Les 47 sujets souffrant de MHF avaient un examen neurologique normal en dehors des crises. Ces 47 membres ont été classés comme affectés. 25 sujets âgés de plus de 15 ans n'ont pas d'histoire de migraine hémiplégique, aucune migraine avec aura non hémiplégique ou autre épisode non déterminé comme méningite aseptique ou confusion épisodique. Ces 25 ont été classés comme sains. 9 sujets souffrant de migraine avec aura sensitive et visuelle, ou ayant des enfants chez lesquels existait un doute diagnostique, ont été classés de statut inconnu. Du sang a été collecté de tous les membres consentants et l'ADN a été préparé comme cela est décrit. Du fait de la présence de 1 ou 2 sujets asymptomatiques porteurs obligatoires du gène muté dans chaque famille, la pénétrance pour l'analyse de liaison a été fixée à 80%.
Le résultat de cette analyse est représenté dans la figure 1 annexée selon les représentations habituelles. L'analyse des marqueurs figurant sur cette figure a été effectuée de la façon suivante :
L'ADN est extrait du sang des différents individus par des méthodes connues. 5 marqueurs ont été choisis dans la carte de liaison du Généthon.
L'ADN a été amplifié par la méthode PCR en utilisant l'appareil PHC3 Techne. Les réactions sont effectuées dans un volume final de 50 μl contenant 200 ng d'ADN génomique, 125 mM mélange 4dNTP, 1 x tampon PCR Cetus Taq polymérase, 1 U BRL Taq polymérase, 1 mM de chaque amorce. Les échantillons sont traités pendant 30 cycles de température (1 cycle, 94°C pour 5 min ; 28 cycles incluant une étape de dénaturation à 92°C pour 1 min et une étape de fixation à 55°C pendant 1 min et une extension à 72°C pendant 1 min ; le dernier cycle autorise une extension à 72°C pendant 10 min). Après addition de 75 μl de tampon de charge, les échantillons sont dénaturés pendant 5 minutes à 94°C puis placés sur un gel d'acrylamide à 6%. Après transfert sur membranes de nylon, celles-ci sont fixées dans 0,4 M d'hydroxyde de sodium et hybridées avec une sonde marquée au P32 (CA)π pendant 14 heures. Les produits amplifiés sont alors visualisés grâce à un film sensible aux rayons X après 4 à 6 heures d'exposition. L'analyse de liaison bipoint est effectuée en utilisant le programme Linkage (9).
Les paramètres de l'analyse de liaison étaient les suivants :
• mode de transmission autosomique dominant,
• pénétrance estimée à 80%, • fréquence du gène muté fixée à 0,0001,
• fréquences de recombinaison supposées identiques dans les deux sexes.
La fréquence allélique pour chaque locus est obtenue à partir de la Génome Data Base. Analyse des résultats 30 membres de la famille P ont été génotypes avec 260 marqueurs microsatellites couvrant tous les chromosomes.
Un score de liaison significatif de 3,64 a été obtenu à θ = 0,05 pour D1S2705. 4 marqueurs supplémentaires à proximité de D1S2705 ont alors été testés dans la famille P (tableau 1). Le marqueur Dl S2635 a montré une liaison significative avec un Zmax de 3,33 à θ = 0,05. Afin de confirmer qu'un gène de la FMH se trouvait sur le bras long du chromosome 1, on a effectué une analyse de liaison dans 6 autres familles. 2 ont montré des scores de liaison positifs avec différents marqueurs (tableau 1). Avec D1S2635 le score de liaison combiné maximum pour les 3 familles montrant des lod-scores positifs a été de 4,21. Ce score de liaison maximum a été identifié à une fraction de recombinaison de 0,07 indiquant que certains individus étaient recombinants.
4 familles, C, N, H et W, montrent des scores de liaison négatifs avec tous les marqueurs testés de l'intervalle D1S2343-D1S2844. Ces informations démontrent l'existence d'au moins un 3ème locus pour la MHF.
La région où a été localisé le gène MHF2 contient deux gènes candidats pour cette affection, GLRK3 (15, 16, 17) qui code pour un canal potassique, et CACNL1A6 (13, 14) qui code pour un canal calcique. L'invention concerne également l'utilisation des gènes hGLRK3 et CACNL1A6 pour la mise en évidence de la migraine hémiplégique familiale.
TABLEAU 1
Score de liaison pour la FMH et les marqueurs du chromosome 1
(pénétrance 80%)
Locus Famille 0,00 0,01 0,05 0,10 0,20 0,30 0,40 Zmax à θ
D1S2343 D -3,19 -0,81 -0,18 0,02 0,12 0,09 0,03 0,12 0,20
P -0,98 1,67 2,72 2,86 2,47 1,72 0,80 2,87 0,09
N -2,63 -0,46 0, 13 0,30 0,32 0,22 0,09 0,34 0, 16
Total -6,81 0,40 2,67 3, 18 2,92 2,04 0,92 3,22 0,12
D1 S2635 D -2,89 0,51 0,09 0,27 0,33 0,24 o,n 0,33 0,17
P -1,26 2,98 3,33 3,18 2,'9 1,60 0,69 3,33 0,05
V 0,84 0,82 0,75 0,67 0,49 0,32 0,16 0,84 0,00
Total -3,31 3,29 4,18 4,12 3,31 2,16 0,95 4,21 0,07
D1 S2707 D 0,60 0,59 0,53 0,46 0,32 0,17 0,05 0,60 0,00
P -6,06 1,26 2,34 2,51 2,19 1,52 0,66 2,51 0,10
V 1,40 1,37 1,25 1,09 0,77 0,46 0, 19 1,39 0,00
Total -4,06 3,22 4, 1 1 4,07 3,28 2,15 0,90 4, 15 0,07
D1S2705 D -4,01 -1,60 -0,88 -0,57 -0,26 -0,10 -0,02 _ .
P -1,63 3,28 3,64 3,49 2,81 1,90 0,85 3,64 0,05
V 1,34 1,31 1,19 1,05 0,76 0,46 0,19 1,34 0,00
Total -4,31 2,99 3,95 3,98 3,32 2,26 1,02 4,02 0,08
D1 S2844 D -6,55 -2,21 -0,88 -0,38 0,02 0, 14 0, 12 0,02 0,20
P -3,08 1 ,00 2,13 2,36 2,12 1,50 0,69 2,36 0,1 1
V 0,78 0,77 0,68 0,58 0,37 0, 18 0,05 0,76 0,00
Total -8,87 -0,46 1,90 2,53 2,49 1,81 0,85 2,64 0, 14 D1S2635 C -3,79 -3,23 -1,93 -1,28 -0,61 -0,25 -0,06
H -8,16 -5,23 -2,80 -1,17 0,67 -0,22 -0,03
N -6,35 -3,73 -1,99 -1,19 -0,49 -0,18 -0,03
W -4,43 -2,66 -1,81 -1,34 -0,78 -0,43 -0,17
D1S2707 C -4,41 -1,88 -1,11 -0,73 -0,34 -0,14 -0,03
H -12,04 -5,96 -3,27 -2,09 -0,99 -0,45 -0,15
N -3,06 -1,40 -0,73 -0,46 -0,21 -0,08 -0,02
W -4,09 -1,80 -1,07 -0,75 -0,44 -0,28 -0,14
D1S2705 C -3,63 -1,12 -0,45 -0,19 -0,01 0,02 0,01
H -8,44 -4,49 -2,38 -1,47 -0,62 -0,23 -0,05
N -2,79 -2,50 -1,42 -0,88 -0,38 -0,15 -0,03
W -4,13 -3,34 -2,01 -1,40 -0,78 -0,43 -0,18
D1S2844 C -4,51 -2,39 -1,28 -0,76 0,28 0,01 0,01
H -11,87 -6,82 -3,96 -2,52 -1,18 -0,52 -0,16
N -3,10 -2,50 -1,28 -0,75 -0,30 -0,10 -0,02
W -4,13 -3,35 -2,01 -1,40 -0,79 -0,43 -0,18
Références
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Claims

REVENDICATIONS
1) Méthode de diagnostic génotypique indirect de la migraine hémiplégique familiale de type 2 chez un individu, caractérisée en ce que : • on met en évidence dans l'ADN dudit individu la présence d'un marqueur situé sur le chromosome Iq21-q23 dans le locus limité par les marqueurs D1S2343 et D1S2844, ledit marqueur étant lié à la survenue de la migraine hémiplégique familiale au sein de sa famille.
2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le marqueur est choisi parmi les marqueurs microsatellites du locus défini.
3) Méthode selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le marqueur est mis en évidence après amplification du locus dudit marqueur.
4) Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que l'amplification est effectuée par PCR.
5) Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les marqueurs microsatellites sont choisis parmi :
D1S2343 D1S2635 D1S2707
D1 S2705 D1 S2844
6) Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le prélèvement biologique est un prélèvement de sang. 7) Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'on prélève l'ADN d'un individu, on amplifie les marqueurs microsatellites liés à la survenue de la migraine hémiplégique familiale au sein de sa famille, on met en évidence la présence ou l'absence des allèles microsatellites liés à la survenue de la MHF dans sa famille pour évaluer les risques de survenue de la pathologie.
8) Séquence d'ADN située sur le locus situé entre les marqueurs D1S2343 et D1S2844 et liée à la survenue de la migraine hémiplégique familiale de type 2. 9) Gène impliqué dans la survenue de la migraine hémiplégique de type 2 et situé sur un ADN selon la revendication 8.
10) Gène impliqué dans la survenue de la migraine hémiplégique de type 2 selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les gènes hGIRK3 et CACNL1A6.
11) Utilisation du gène hGIRK3 ou du gène codant pour le canal calcique CACNL1A6 selon la revendication 9 pour la mise en évidence de la migraine hémiplégique familiale.
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