WO1998023954A1 - Methode de detection in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial - Google Patents

Methode de detection in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial Download PDF

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WO1998023954A1
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Guido Kroemer
Antonio Macho
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Centre National De La Recherche Scientifique
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    • G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis

Definitions

  • the subject of the invention is a new method for the detection and / or in vitro measurement of the mitochondrial transmembrane potential, and its application to the evaluation and / or monitoring of the process of apoptosis in an individual, as well as to the diagnosis in in vitro pathologies linked to a modification of this apoptosis process.
  • Apoptosis is usually detected by measurement of nuclear events occurring in the final stage of the apoptotic cascade: DNA fragmentation or loss of chromatin (7,10-12,17,21).
  • PTM mitochondrial transmembrane potential
  • PTM is the result of an uneven distribution of protons in the inner mitochondrial membrane, resulting in the formation of negative charges on the inner side of the inner mitochondrial membrane.
  • the cytofluorometric quantification of PTM is based on the use of lipophilic cationic markers which, according to Nernst's equation, are sequestered inside the mitochondrial matrix.
  • the use of most of the potential-sensitive markers (2) namely the 3.3 'iodide dihexyloxacarbocyanine (DiOC6 (3)), rhodamine 123, tetramethylrosamine, or the iodide of 5.5 ', 6,6'-tetrachloro-l, l', 3,3'- tetraethylbenzimidazolcarbocyanine (JC-1) is not compatible with the chemical fixation of cells, which gives them at least three major drawbacks.
  • the cytofluorometric quantification of the incorporation of the marker must be carried out ad hoc, immediately after the labeling of the cells.
  • infectious material such as blood samples
  • cytofluorometric analysis the integrity of cell membranes must be maintained throughout the experiment, thereby preventing simultaneous detection of PTM and other parameters such as the level of expression of intracellular antigens or the degree of DNA fragmentation.
  • One of the aims of the present invention is to provide a new method for the detection and / or measurement in vitro of PTM having the following advantages
  • PTM in particular of markers of intracellular antigens.
  • Another object of the present invention is to provide a new method for in vitro evaluation of the process of apoptosis in populations of human or animal cells, and having, in addition to the aforementioned advantages, that of allowing the detection of the presence of cells at a pre-apoptotic stage, insofar as this method makes it possible to detect and / or measure an early event in the process of apoptosis, namely that of the fall of the PTM in these cells at the pre-apoptotic stage, compared to the PTM of cells which have not started an apoptosis process.
  • Detection of cells at the pre-apoptotic stage constitutes a definite advantage over the methods currently used above for detecting apoptosis, since all the cells at the pre-apoptotic or apoptotic stage of a determined cell population can be detected. , while only cells at the apoptotic stage can be detected by said current methods which lead to an underestimation of the actual process of apoptosis in a determined cell population, which has the effect of distorting the results of these latter methods.
  • the invention more particularly aims to provide a new reliable method of in vitro screening for a modification of the apoptosis process in a patient compared to a healthy individual, this modification going either in the direction of 'an increase, either in the direction of a decrease in this process of apoptosis.
  • the present invention also aims to provide new methods of in vitro diagnosis and / or monitoring the evolution of pathologies linked to a modification of the apoptosis process in a patient compared to a healthy individual.
  • Another object of the present invention is to provide new methods for screening for therapeutic products capable of modifying the process of apoptosis in the cells of a patient.
  • Another object of the present invention is to provide new methods for toxicological evaluation of products, in particular of therapeutic interest.
  • the subject of the present invention is the use of lipophilic, cationic compounds comprising at least one haloalkyl group in which the linear or branched alkyl group comprises from 1 to 10 carbon atoms, in particular a chloromethyl group, these compounds being labeled, in particular using a fluorescent marker, or being by themselves markers capable of being able to be detected, in particular being by themselves fluorescent markers, for the implementation of a detection method, and / or in vitro measurement of mitochondrial transmembrane potential.
  • the abovementioned compounds used in the context of the present invention comprise a group of at least three cycles of 4 to 8 members, preferably of 6 members, each of these rings comprising a common link with at least one of the two other cycles, these cycles being heterocyclic or not, aromatic or not, in particular a group of the following formula:
  • - X represents a halogen atom, in particular a chlorine atom
  • - n represents an integer varying from 1 to 5
  • R 'i, R * 2 »R'3 and R'4> represent a hydrogen atom, or R' i in association with R ⁇ and N ⁇ form a heterocycle, and / or R'2 in association with R2 and N ⁇ form a heterocycle, and / or R'3 in combination with R3 and N ⁇ form a heterocycle, and / or R'4 in combination with R4 and N ⁇ form a heterocycle, said heterocycles being aromatic or not and comprising from 3 to 7 carbon atoms in the ring, - R ⁇ , R2, R3 and R4, when they are not associated respectively with R ' ⁇ , R'2, R'3 and R'4 to form a heterocycle with N ⁇ or Np, represent independently of each other a hydrogen atom, or an alkyl group (linear or branched) of 1 to 10 carbon atoms, in particular a methyl group.
  • the invention more particularly relates to the aforementioned use as a fluorescent marker of chloromethyl-X-rosamine (CMXRos) having the formula
  • the invention also relates to the use of compounds as defined above for the implementation of a method for in vitro evaluation of the process of apoptosis in a patient compared to the normal process of apoptosis in a healthy individual. .
  • This in vitro evaluation is carried out by measuring the quantity of cells which, within a determined cell population in a biological sample of an individual, are at the pre-apoptotic or apoptotic stage, and comparison with the quantity of cells at the stage. pre-apoptotic or apoptotic measured within the same cell population in a biological sample from a healthy individual.
  • the present invention also relates to the use of the compounds defined above, for the implementation of a method of in vitro diagnosis of a possible modification of the process of apoptosis in a patient compared to the normal apoptosis process in a healthy individual.
  • the aforementioned diagnosis of a modification either in the direction of an increase or in the direction of a decrease in the process of apoptosis can advantageously be correlated with the diagnosis of pathologies linked to such modifications, or even to confirm the diagnosis of these pathologies and, if necessary, makes it possible to monitor over time the evolution of such pathologies, in particular during the therapeutic treatment of the latter (in particular, monitoring of oncological treatment lymphomas and leukemias).
  • pathologies capable of being detected within the framework of the present invention, mention may be made more particularly of diseases affecting lymphocytes or leukocytes in the blood circulation, in particular AIDS or other infectious diseases (viral, bacterial, fungal, parasites), tumors and more particularly those of blood cells (lymphomas, leukemias), aplasia, cancers, hematological pathologies, intoxications, myocardial infarction, neurodegenerative or neuromuscular diseases.
  • infectious diseases viral, bacterial, fungal, parasites
  • tumors and more particularly those of blood cells (lymphomas, leukemias), aplasia, cancers, hematological pathologies, intoxications, myocardial infarction, neurodegenerative or neuromuscular diseases.
  • a more particular subject of the invention is the use of compounds defined above for the implementation of an in vitro diagnostic method and / or the monitoring of pathologies in which an increase in the apoptosis process occurs, in particular the intoxication, myocardial infarction, neurodegenerative or neuromuscular diseases, degenerative lymphocytic processes, in particular AIDS.
  • the invention also relates to the use of the compounds defined above for the implementation of an in vitro diagnostic method and / or the monitoring of pathologies in which a reduction in the process of apoptosis occurs, in particular tumors, aplasia, cancers.
  • An increase in the process of apoptosis results in the measurement of an amount of cells at the pre-apoptotic or apoptotic stage which, within a determined cell population, is greater than the amount of cells at the pre-apoptotic stage or apoptotic capable of being measured from an identical cell population originating from a healthy individual.
  • a reduction in the apoptosis process corresponds to the measurement of an amount of cells at the pre-apoptotic or apoptotic stage which, within a determined cell population, is less than the amount of cells at the pre-apoptotic stage.
  • the invention also relates to the use of compounds defined above for the implementation of a method of screening for products of therapeutic interest capable of increasing or decreasing apoptosis.
  • the invention also relates to the use of the compounds defined above, for the implementation of a method for toxicological evaluation of products of therapeutic interest.
  • the invention relates to the use of CMXRos for the implementation of one of the methods defined above.
  • the invention also relates to any method of detection and / or in vitro measurement of the mitochondrial transmembrane potential of human or animal cells, characterized in that it comprises:
  • the aforementioned method is carried out from blood cells, in particular leukocytes, separated from most of the other constituents of blood according to methods conventional for those skilled in the art in this field.
  • the population of cells on which the abovementioned method is carried out is advantageously such that it contains approximately
  • the amount of the compound chosen from those defined above, which is used in the incubation step of the aforementioned method is from about 1 nM to about 300 nM, when said method does not include a step fixing, and is in particular from approximately 20 nM to approximately 30 nM.
  • the quantity of said compound which is used in the incubation step is preferably from approximately 10 nM to approximately 300 nM, in particular approximately 150 nM.
  • said step of incubating the cells with said compound in the above-mentioned method is carried out at a temperature between about 30 ° C and about 40 ° C and for a time of about 5 min to about 60 go.
  • the above-mentioned method comprises a step of fixing the above-mentioned cells, this fixing being advantageously carried out by incubation of the said cells with 4% paraformaldehyde in a phosphate buffer (PBS) for about 15 min at room temperature.
  • PBS phosphate buffer
  • the measurement of the quantity of said compound integrated into the cells in the aforementioned method is advantageously carried out using a spectrofluorimeter (in particular that sold by the company Kontron, Zurich, Switzerland) at an excitation wavelength of 488 nM.
  • the subject of the invention is also any method of in vitro evaluation of the process of apoptosis, as defined above, and where appropriate of in vitro diagnosis of a possible modification of the process of apoptosis in a patient compared to the normal apoptosis process in a healthy individual, said method being carried out by implementing a method of in vitro measurement of the mitochondrial transmembrane potential as described above in which:
  • the incubation step is carried out between on the one hand a population of cells coming from a biological sample taken from said patient, in particular from blood, or preparations derived from blood such as preparations of leukocytes and, on the other hand share, at least one compound as defined above,
  • the possible modification of the apoptosis process is detected and / or measured by comparison with a normal control corresponding to the measurement of the amount of the same compound as that used during the previous incubation step and integrated into a cell population identical to the previous one and coming from a biological sample taken from a healthy individual.
  • the invention also relates to any method of in vitro diagnosis and / or monitoring of pathologies linked to an increase in the process of apoptosis, said pathologies being as defined above, said method being carried out by implementing a method for evaluating the process of apoptosis as defined above, in which the measurement of an amount of said compound, in the population of cells of the patient's biological sample, which is less than the amount of this same compound in the population of cells of a healthy individual, can be correlated with the measurement of an amount of cells in the pre-apoptotic or apoptotic stage which is greater than the quantity of these same cells in the pre-apoptotic stage or apoptotic in the cell population of a healthy individual, and then indicates an increase in the process of apoptosis in this patient.
  • the subject of the invention is also any method of in vitro diagnosis and / or monitoring of pathologies linked to a reduction in the apoptosis process, said pathologies being as defined above, said method being carried out by implementing a method for evaluating the process of apoptosis as defined above, in which the measurement of an amount of said compound, in the population of cells of the patient's biological sample, which is greater than the amount of this same compound in the population of cells of a healthy individual, can be correlated with the measurement of an amount of cells in the pre-apoptotic or apoptotic stage which is less than the quantity of these same cells in the pre-apoptotic or apoptotic stage in the cell population of a healthy individual, and then indicates a decrease in the process of apoptosis in this patient.
  • the above-mentioned methods of the invention are carried out using leukocytes, as the cell population studied, and from CMXRos as the compound used in the incubation step with said cell population.
  • the invention also relates to any method of in vitro diagnosis and / or monitoring of pathologies linked to an increase or a decrease in the process of apoptosis as described above, characterized in that the stage of incubation of the population of cells with said compound is preceded by, and / or followed by, and / or carried out with an incubation step of this same population of cells with cellular markers other than the compounds as defined above, these other markers being specific for said pathologies, in particular labeled antibodies specific for heterologous antigens or autoantigens of the patient present in said cells, these antigens or autoantigens being specific for said pathologies.
  • markers specific for the following antigens of the CD system and viral antigens and therefore specific for the following pathologies: leukemias, lymphomas, other neoplasias, AIDS and other viral infections.
  • the invention also relates to any method of in vitro screening of products of therapeutic interest capable of increasing or decreasing apoptosis, said method being carried out by implementing a method of in vitro measurement of the mitochondrial transmembrane potential as described above, in which the step of incubating a population of human or animal cells with at least one compound as defined above, is preceded by a step of incubation of this same population of cells with said products of therapeutic interest.
  • the invention more particularly relates to any method of screening for products capable of increasing apoptosis, said method being carried out by implementing a screening method as defined above, in which the measurement of an amount of compound as defined above, in the population of cells previously incubated with said products, which is less than the amount of this same compound in a population of cells identical to the preceding but not having been incubated with said products, can be correlated to the fact that said products are capable of increasing the process of apoptosis in said cells.
  • the products selected for their property of increasing apoptosis in cells in vitro according to the screening method described above are therefore capable of being used as products capable of accelerating the process of apoptosis in the context of treatment.
  • the subject of the invention is more particularly still, any method of screening for products capable of reducing apoptosis, said method being carried out by implementing a screening method as defined above, in which the measurement of an amount of compound as defined above, in the population of cells previously incubated with said products, which is greater than the amount of this same compound in a population of cells identical to the preceding but not having been incubated with said products , can be correlated to the fact that said products are capable of decreasing the process of apoptosis in said cells.
  • the products selected for their property of reducing apoptosis in cells in vitro according to the screening method described above, are therefore capable of being used as products capable of delaying the process of apoptosis in the context of the treatment of pathologies linked to an increase in the process of apoptosis, as defined above.
  • the screening methods described above are carried out from blood cells, in particular leukocytes, originating either from a healthy individual, or from a patient suffering from the pathology capable of being treated with said products, and the labeled compound is CMXRos.
  • the screening methods mentioned above, and more particularly those of screening for products capable of reducing the process of apoptosis with a view to restoring the latter include a step of inducing apoptosis of the cells used in said methods. This apoptosis induction step is carried out prior to the step of incubating said cells with the compound as defined above. Then the possible capacity of said products is measured to restore a normal apoptosis process in the manner indicated above.
  • this step of incubating apoptosis is carried out by incubating said cells with a corticosteroid such as dexamethasone.
  • the subject of the invention is also any method of in vitro toxicological evaluation of products, in particular of therapeutic interest, said method being carried out by implementing a method of in vitro measurement of the mitochondrial transmembrane potential as described above. , in which the step of incubating a population of human or animal cells with at least one compound as defined above, is preceded by a step of incubating this same population of cells with said products.
  • the measurement of an amount of said compound in the population of cells previously incubated with said products which, within the framework of the abovementioned biological evaluation method, is greater or less than the measurement of the amount of this same compound in a population of cells identical to the preceding ones but not having been incubated with said products, can be correlated with the fact that said products are likely to be toxic for the organism, insofar as an effect of modifying the process of apoptosis does not is not wanted for these products.
  • the above-mentioned toxicological evaluation methods of the invention are carried out using human or animal cells, in particular leukocytes originating from healthy individuals, and the compound used is CMXRos.
  • kits for the implementation of one of the methods described above, containing at least one compound as defined above, advantageously at the concentrations indicated above.
  • the kits of the invention also comprise a cellular fixative, such as paraformaldehyde at the concentration indicated above, as well as a protocol of use containing in particular the standard values of apoptosis in a healthy individual.
  • a cellular fixative such as paraformaldehyde at the concentration indicated above
  • the thymocytes of female BALB / c mice (6-10 weeks) were cultured in RPM1640 medium supplemented with L-glutamine and 10% fetal calf serum (1 ⁇ 10 6 cells / ml).
  • the cells were cultured in the presence of DEX (dexamethasone 10 ⁇ M; Sigma,
  • CMXRos (Molecular Probes, Eu confusing; OR; 20nM in PBS, 15 min 37 ° C) (26) and / or with CMXRos (Molecular Probes; standard doses: 30 nM for experiments without fixation and 150 nM before fixation).
  • CMXRos (ImM) was prepared as a solution in dimethylsulfoxide (DMSO) and stored at -20 ° C. Intermediate solutions were prepared in DMSO at a concentration of 200 times the final concentration, followed by a 1: 200 dilution with the medium containing the cells.
  • the DiOCô (3) solution (40 ⁇ M in DMSO) was diluted to a working solution of 400 nM (10 ⁇ l solution + 1 ml PBS), followed by a 1:20 dilution with the medium containing the cells. .
  • a working solution 400 nM (10 ⁇ l solution + 1 ml PBS)
  • cells were treated simultaneously with the non-coupling agent cyanide carbonyl of m-chlorophenylhydrazone (mCICCP, 50 ⁇ M, Sigma).
  • mCICCP m-chlorophenylhydrazone
  • the aldehyde fixation was carried out by incubation of cell pellets with 4% paraformaldehyde in PBS for 15 minutes at room temperature. During this 15 minute period, the cells were kept in a horizontal mixer (150 rpm). The cells were then stored for 1 to 10 days at 4 ° C in the dark. 4) Spectrofluorometric measurements
  • the fluorescence spectra of FITC (1 ⁇ M in ethanol), PE (2.5 ⁇ M in water) and CMXRos (1 ⁇ M in ethanol) were obtained using a Kontron SFM25 spectrofluorimeter (Kontron, Zurich, Switzerland ) at an excitation wavelength of 488 nM.
  • CMXRos CMXRos
  • mAB monoclonal antibody
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • this monoclonal antibody being specific for mouse CD4 (RM4-5; 240 ng / 10 ⁇ cells in 100 ⁇ l; Pharmagen, San Diego, CA) and with an mAB conjugated to R-phycoerythrin (PE ) this mAB being specific for the ⁇ chain of mouse CD8 (53-6.7; 240 ng / 10 ⁇ cells in 10 ⁇ l; Pharmagen).
  • PE R-phycoerythrin
  • the analyzes were carried out using an EPICS Profile II analyzer (Couker, Hialeh, FL) equipped with an air-cooled argon laser (488 nM, 15 mW).
  • the instrument was installed to measure the front (FS) and lateral (SS) light beams, FITC / DiOCôQ fluorescence (FL1, 525 min), PE fluorescence (FL-2,575 nm) and CMXRos fluorescence (FL3, 630 nm).
  • the FS and SS parameters were transferred to the adult population of normal size.
  • the voltage photomultiplier was calibrated daily with standardized fluorescent beads (Standard Immunobrite, Coulter).
  • CMXRos is a fluorochrome sensitive to PTM, and fixable to formaldehyde.
  • Thymocytes induced to follow apoptosis show an early fall in PTM (1,19). This early fall in PTM affects the thymocytes susceptible to the induction of apoptosis by the glucocorticoid dexamethasone
  • CMXRos and DiOC6 (3) are incorporated into the cells according to a strict linear correlation.
  • DiOC6 (3) which is chemically relatively inert
  • CMXRos has a chloromethyl group which reacts covalently with intramitochondrial thiols to form a thioester bond.
  • DiOCg (3) escapes from the cells while the CMXRos remains in situ.
  • CMXRos emits at a maximum of 605 nm. Therefore, the CMXRos is compatible with the simultaneous use of both FITC (emission: 515 nm) and TE (emission: 580 nm), the two classic fluorochromes used in immunofluorescence. Based on this information, three-color staining of DEX-treated thymocytes was performed to determine the level of expression of two surface markers (CD4 and CD8) using FITC and PE, as well as PTM using an optimal dose of CMXRos (150 nM), after fixation with paraformaldehyde.
  • CD4 + CD8 + (“double positive")
  • CD4 ⁇ CD8 " (“double negative ")
  • CD4 + CD8 " or CD4 " CD8 + (“ single positive ")
  • the determination of PTM in fixed cells opens the possibility of detecting at the same time the level of expression of intracellular antigens.
  • the proto-oncogene Bcl-2 is well known for its role as an endogenous inhibitor of apoptosis which is present in the nuclei and mitochondria but not in the plasma membranes (4).
  • the level of expression of Bcl-2 was measured simultaneously with the determination of the PTM.
  • the cells were labeled with CMXRos, fixed with paraformaldehyde, then waterproofed with acetone and labeled with a monoclonal antibody specific for the Bcl-2 protein.
  • DEX treatment has two effects on thymocytes:
  • the CMXRos-based method for the determination of PTM allows routine detection of the interruption of PTM associated with AIDS (14) among lymphocytes from seropositive donors.
  • this method eliminates the need to determine ad hoc PTM. This is important for large-scale experiments as well as for the inter-experimental standardization of results.
  • this CMXRos-based approach is compatible with simultaneous detections of PTM and other parameters, the determination of which requires permeabilization of cell membranes.
  • the labeling with CMXRos can be combined with the labeling by immunofluorescence of intracellular antigens as well as with the Tunel technique for the determination of DNA fragmentation.
  • thymocytes which are small cells and which contain relatively few mitochondria in comparison with other cell types (19).
  • this multi-parameter approach is suitable for measuring apoptosis in many different cell types, including normal peripheral lymphocytes, CEM-7 human lymphoma cells, hybridoma cells, and WEHI-231 pre-leukemia cells.
  • Mitochondrial disturbances define undergoing apoptotic depletion lymphocytes in vivo. Eur. J. Immunol. 25: 3277-3284, 1995.
  • Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA Identification of programmed cell death in situ via specifies labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119: 493-501, 1992. 1 1. Gold R, Schmied M, Rothe G, Zischler H, Breitschopf H, Wekerle H, Lassmann H: Detection of DNA fragmentation in apoptosis: application of in situ nick translation to cell culture Systems and tissue sections. J. Histochem. Cytochem. 41: 1023-1030, 1993.
  • Vayssière J-L, Petit PX, Risler Y, Mignotte B Commitment to apoptosis is associated with changes in mitochondrial biogenesis and activity in cell lines conditionally immortalized with simian virus 40. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1 1752-11756, 1994.
  • Willie AH Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature 284: 555-556, 1980.

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation de composés lipophiles, cationiques et comportant au moins un groupe halogénoalkyle, notamment un groupe chlorométhyle, ces composés étant marqués ou étant par eux-mêmes des marqueurs susceptibles de pouvoir être détectés, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection, et/ou de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial. L'invention a également pour objet l'utilisation de ces composés pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de modifications du processus d'apoptose, ainsi que des pathologies associées à de telles modifications.

Description

METHODE DE DETECTION IN VITRO DU POTENTIEL TRANSMEMBRANAIRE MITOCHONDRIAL
L'invention a pour objet une nouvelle méthode de détection et/ou de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial, et son application à l'évaluation et/ou au suivi du processus d' apoptose chez un individu, ainsi qu'au diagnostic in vitro de pathologies liées à une modification de ce processus d' apoptose. L' apoptose est habituellement détectée par mesure d'événements nucléaires intervenant en stade final de la cascade apoptotique : fragmentation de l'ADN ou perte de chromatine (7,10-12,17,21). La plupart des techniques cytofluorométriques ou histochimiques utilisées pour la détection de la fragmentation apoptotique de l'ADN conduisent à une sous estimation de la fréquence de cellules apoptotiques in vivo, dans la mesure ou les événements susmentionnés sont accompagnés ou précédés par des changements dans la physico-chimie de la membrane plasmique permettant la reconnaissance phagocytaire et l'élimination des cellules apoptotiques (16,20). Par conséquent, et tout particulièrement dans le cas ou les cellules sont analysées ex vivo ou in vivo, la détection de changements nucléaires pré-apoptotiques est susceptible de constituer un avantage majeur.
Il a récemment été démontré que des signes nucléaires d' apoptose dans de nombreux systèmes différents, sont précédés par une chute du potentiel transmembranaire mitochondrial (PTM) (1,5,8,15,19,23,25-27). Cette dissipation du PTM n'est pas accompagnée d'altérations ultrastructurales majeures des mitochondries et remplit les critères suivants :
(i) elle est précoce en ce sens qu'elle précède toute autre manifestation d' apoptose dont les altérations de membranes plasmatiques, la condensation de chromatine, et la fragmentation d'ADN ; ce stade précoce des cellules en apoptose est encore désigné dans ce qui suit par stade pré-apoptotique ;
(ii) elle est spécifique en ce sens qu'elle est uniquement observée dans les cellules au stade pré-apoptotique ;
(iii) elle est universelle en ce sens qu'on la retrouve dans tous les types cellulaires en apoptose, ainsi qu'en réponse à tous les inducteurs d'apoptose étudiés ;
(iv) elle est irréversible en ce sens qu'elle constitue un point de non retour et que les cellules ayant perdu leur PTM vont suivre une apoptose complète même si le stimulus inducteur d'apoptose est supprimé (1 ,5,8,15,19,23,25-27). Combinées ensemble, toutes ces caractéristiques soulignent le caractère utile de la mesure du PTM pour la caractérisation de l' apoptose précoce.
Le PTM est le résultat d'une distribution inégale de protons dans la membrane mitochondriale interne, donnant lieu à la formation de charges négatives du côté interne de la membrane mitochondriale interne. La quantification cytofluorométrique du PTM est basée sur l'utilisation de marqueurs cationiques lipophiles qui, selon l'équation de Nernst, sont séquestrés à l'intérieur de la matrice mitochondriale. Malheureusement, l'utilisation de la plupart des marqueurs sensibles au potentiel (2), à savoir l'iodure de 3,3' dihexyloxacarbocyanine (DiOC6(3)), la rhodamine 123, la tétraméthylrosamine, ou l'iodure de 5,5' ,6,6'-tétrachloro-l ,l ',3,3'- tétraéthylbenzimidazolcarbocyanine (JC-1) n'est pas compatible avec la fixation chimique des cellules, ce qui leur confère au moins trois inconvénients majeurs. Premièrement, la quantification cytofluorométrique de l'incorporation du marqueur doit être effectuée ad hoc, immédiatement après le marquage des cellules. Deuxièmement, le matériel infectieux (tels que les échantillons de sang), doit être manipulé suivant des procédures spéciales de protection des manipulateurs durant l'analyse cytofluorométrique. Troisièmement, l'intégrité des membranes cellulaires doit être maintenue pendant toute l'expérience, empêchant par conséquent la détection simultanée du PTM et d'autres paramètres tels que le niveau d'expression d'antigènes intracellulaires ou le degré de fragmentation d'ADN.
Un des buts de la présente invention est de fournir une nouvelle méthode de détection et/ou de mesure in vitro du PTM présentant les avantages suivants
- elle est simple de mise en oeuvre et peut être utilisée en routine, notamment dans des laboratoires d'analyses biologiques ou biochimiques, par exemple en milieu hospitalier ; - elle ne nécessite pas de mesures spéciales de protection du manipulateur qui peut analyser les échantillons biologiques en toute sécurité dans la mesure où cette méthode autorise la fixation des cellules étudiées après leur marquage ;
- elle peut être associée à la détection et/ou à la mesure, simultanée ou non, de marqueurs cellulaires différents de ceux utilisés pour la mesure du
PTM, notamment de marqueurs d'antigènes intracellulaires.
Un autre but de la présente invention est de fournir une nouvelle méthode d'évaluation in vitro du processus d'apoptose dans des populations de cellules humaines ou animales, et présentant outre les avantages susmentionnés, celui de permettre la détection de la présence de cellules à un stade pré-apoptotique, dans la mesure où cette méthode permet de détecter et/ou de mesurer un événement précoce du processus d'apoptose, à savoir celui de la chute du PTM dans ces cellules au stade pré-apoptotique, par rapport au PTM de cellules n'ayant pas enclenché un processus d'apoptose.
La détection de cellules à un stade pré-apoptotique constitue un avantage certain par rapport aux méthodes actuellement utilisées susmentionnées pour détecter l' apoptose, dans la mesure où toutes les cellules au stade pré- apoptotique ou apoptotique d'une population cellulaire déterminée pourront être détectées, tandis que seules les cellules au stade apoptotique peuvent être détectées par lesdites méthodes actuelles qui conduisent à une sous estimation du processus d'apoptose réel dans une population cellulaire déterminée, ce qui a pour effet de fausser les résultats de ces dernières méthodes. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour but celui de fournir une nouvelle méthode fiable de dépistage in vitro d'une modification du processus d'apoptose chez un patient par rapport à un individu sain, cette modification allant soit dans le sens d'une augmentation, soit dans le sens d'une diminution de ce processus d'apoptose. La présente invention a également pour but de fournir de nouvelles méthodes de diagnostic in vitro et/ou de suivi de l'évolution de pathologies liées à une modification de processus d'apoptose chez un patient par rapport à un individu sain.
Un autre but de la présente invention est celui de fournir de nouvelles méthodes de criblage de produits thérapeutiques susceptibles de modifier le processus d'apoptose dans les cellules d'un patient.
Un autre but de la présente invention est celui de fournir de nouvelles méthodes d'évaluation toxicologique de produits, notamment d'intérêt thérapeutique. La présente invention a pour objet l'utilisation de composés lipophiles, cationiques et comportant au moins un groupe halogénoalkyle dans lequel le groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprend de 1 à 10 atomes de carbone, notamment un groupe chlorométhyle, ces composés étant marqués, notamment à l'aide d'un marqueur fluorescent, ou étant par eux-mêmes des marqueurs susceptibles de pouvoir être détectés, notamment étant par eux-mêmes des marqueurs fluorescents, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection, et/ou de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial. De préférence, les composés susmentionnés utilisés dans le cadre de la présente invention, comprennent un groupe d'au moins trois cycles de 4 à 8 chaînons, de préférence de 6 chaînons, chacun de ces cycles comportant un chaînon commun avec au moins un des deux autres cycles, ces cycles étant hétérocycliques ou non, aromatiques ou non, notamment un groupe de formule suivante :
Figure imgf000006_0001
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de composés tels que définis ci-dessus et répondant à la formule. générale (I) suivante :
Figure imgf000006_0002
dans laquelle : (- C M2 ) ~~ ^
- X représente un atome d'halogène, notamment un atome de chlore,
- n représente un nombre entier variant de 1 à 5 ,
- R' i, R*2» R'3 et R'4> représentent un atome d'hydrogène, ou R' i en association avec R\ et Nα forment un hétérocycle, et/ou R'2 en association avec R2 et Nα forment un hétérocycle, et/ou R'3 en association avec R3 et Nβ forment un hétérocycle, et/ou R'4 en association avec R4 et Nβ forment un hétérocycle, lesdits hétérocycles étant aromatique ou non et comportant de 3 à 7 atomes de carbone dans le cycle, - R\ , R2, R3 et R4, lorsqu'ils ne sont pas associés respectivement avec R' χ, R'2, R'3 et R'4 pour former un hétérocycle avec Nα ou Np, représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle (linéaire ou ramifié) de 1 à 10 atomes de carbone, notamment un groupe méthyle.
L'invention à plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée en tant que marqueur fluorescent de la chlorométhyl-X-rosamine (CMXRos) ayant la formule
Figure imgf000007_0001
L'invention concerne également l'utilisation de composés tels que définis ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation in vitro du processus d'apoptose chez un patient par rapport au processus normal d'apoptose chez un individu sain.
Cette évaluation in vitro est effectuée par mesure de la quantité de cellules qui, au sein d'une population cellulaire déterminée dans un échantillon biologique d'un individu, sont au stade pré-apoptotique ou apoptotique, et comparaison avec la quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique mesurée au sein d'une même population cellulaire dans un échantillon biologique d'un individu sain.
Cette évaluation in vitro permet ainsi de détecter des éventuelles modifications du processus d'apoptose chez un individu par rapport au processus d'apoptose normal chez un individu sain.
A ce titre, la présente invention a également pour objet l'utilisation des composés définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro d'une éventuelle modification du processus d'apoptose chez un patient par rapport au processus d'apoptose normal chez un individu sain.
Le diagnostic susmentionné d'une modification soit dans le sens d'une augmentation, soit dans le sens d'une diminution du processus d'apoptose, peut avantageusement être corrélé au diagnostic de pathologies liées à de telles modifications, voire de confirmer le diagnostic de ces pathologies et, le cas échéant, permet d'effectuer un suivi dans le temps de l'évolution de telles pathologies, notamment au cours du traitement thérapeutique de ces dernières (en particulier, suivi du traitement oncologique des lymphomes et leucémies). Parmi les pathologies susmentionnées susceptibles d'être détectées dans le cadre de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les maladies affectant les lymphocytes ou leucocytes dans la circulation sanguine, notamment le SIDA ou d'autres maladies infectieuses (virales, bactériennes, fongiques, parasitaires), les tumeurs et plus particulièrement celles des cellules sanguines (lymphomes, leucémies), aplasies, cancers, les pathologies hématologiques, les intoxications, l'infarctus du myocarde, les maladies neurodégénératives ou neuromusculaires.
Parmi les différents traitements thérapeutiques susceptibles d'être suivis par mise en oeuvre d'une méthode selon l'invention, on peut citer le traitement du SIDA, le traitement des infections (virales, bactériennes, fongiques, parasitaires), la chimiothérapie, la radiothérapie.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de composés définis ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies dans lesquelles intervient une augmentation du processus d'apoptose, notamment les intoxications, l'infarctus du myocarde, les maladies neurodégénératives ou neuromusculaires, les processus dégénératifs lymphocytaires, notamment le SIDA.
L'invention concerne également l'utilisation des composés définis ci- dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies dans lesquelles intervient une diminution du processus d'apoptose, notamment tumeurs, aplasies, cancers.
Une augmentation du processus d'apoptose, se traduit par la mesure d'une quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique qui, au sein d'une population cellulaire déterminée, est supérieure à la quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique susceptible d'être mesurée à partir d'une population cellulaire identique provenant d'un individu sain. A l'inverse, une diminution du processus d'apoptose correspond à la mesure d'une quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique qui, au sein d'une population cellulaire déterminée, est inférieure à la quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique susceptible d'être mesurée à partir d'une population cellulaire identique provenant d'un individu sain. L'invention a également pour objet l'utilisation de composés définis ci- dessus pour la mise en oeuvre d'une méthode de criblage de produits d'intérêt thérapeutique susceptibles d'augmenter ou de diminuer l' apoptose.
L'invention concerne également l'utilisation des composés définis ci- dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation toxicologique de produits d'intérêt thérapeutique.
De préférence, l'invention a pour objet l'utilisation de la CMXRos pour la mise en oeuvre d'une des méthodes définies ci-dessus.
L'invention concerne également toute méthode de détection et/ou de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial de cellules humaines ou animales, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- une étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales, notamment de cellules sanguines, avec au moins un composé tel que défini ci-dessus, - le cas échéant, la fixation des cellules susmentionnées, après l'étape d'incubation précédente, ladite fixation étant avantageusement effectuée à l'aide de formaldéhyde,
- la mesure, notamment par analyse cytofluorométrique, de la quantité dudit composé intégrée, lors de l'étape d'incubation précédente, dans lesdites cellules.
De préférence la méthode susmentionnée est réalisée à partir de cellules sanguines, notamment de leucocytes, séparées de la plupart des autres constituants du sang selon des procédés classiques pour l'homme du métier dans ce domaine. La population de cellules sur laquelle est effectuée la méthode susmentionnée, est avantageusement telle qu'elle contient environ
5.104 à environ 5.10^ cellules par ml, et est notamment d'environ 5.10^ cellules/ml.
De préférence également la quantité du composé choisi parmi ceux définis ci-dessus, qui est utilisée dans l'étape d'incubation de la méthode susmentionnée, est d'environ 1 nM à environ 300 nM, lorsque ladite méthode ne comprend pas d'étape de fixation, et est notamment d'environ 20 nM à environ 30 nM. Lorsque ladite méthode comprend une étape de fixation, la quantité dudit composé qui est utilisée dans l'étape d'incubation est de préférence d'environ 10 nM à environ 300 nM, notamment d'environ 150 nM.
Avantageusement, ladite étape d'incubation des cellules avec ledit composé dans la méthode susmentionnée, est effectuée à une température comprise entre environ 30 °C et environ 40 °C et pendant un temps d'environ 5 mn à environ 60 irai.
De préférence la méthode susmentionnée comprend une étape de fixation des cellules susmentionnées, cette fixation étant avantageusement effectuée par incubation desdites cellules avec du paraformaldéhyde à 4% dans un tampon phosphate (PBS) pendant environ 15 mn à température ambiante.
La mesure de la quantité dudit composé intégrée dans les cellules dans la méthode susmentionnée est avantageusement effectuée à l'aide d'un spectrofluorimètre (notamment celui commercialisé par la société Kontron, Zurich, Suisse) à une longueur d'onde d'excitation de 488 nM.
L'invention a également pour objet toute méthode d'évaluation in vitro du processus d'apoptose, telle que définie ci-dessus, et le cas échéant de diagnostic in vitro d'une éventuelle modification du processus d'apoptose chez un patient par rapport au processus d'apoptose normal chez un individu sain, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial telle que décrite ci-dessus dans laquelle :
- l'étape d'incubation est effectuée entre d'une part une population de cellules provenant d'un échantillon biologique prélevé sur ledit patient, notamment du sang, ou des préparations dérivées du sang telles que des préparations de leucocytes et, d'autre part, au moins un composé tel que défini ci-dessus,
- l'éventuelle modification du processus d'apoptose est détectée et/ou mesurée par comparaison à un témoin normal correspondant à la mesure de la quantité du même composé que celui utilisé lors de l'étape d'incubation précédente et intégrée dans une population cellulaire identique à la précédente et provenant d'un échantillon biologique prélevé chez un individu sain.
L'invention a également pour objet toute méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies liées à une augmentation du processus d'apoptose, lesdites pathologies étant telles que définies ci-dessus, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation du processus d'apoptose telle que définie ci-dessus, dans laquelle la mesure d'une quantité dudit composé, dans la population de cellules de l'échantillon biologique du patient, qui est inférieure à la quantité de ce même composé dans la population de cellules d'un individu sain, peut être corrélée à la mesure d'une quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique qui est supérieure à la quantité de ces mêmes cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique dans la population de cellules d'un individu sain, et témoigne alors d'une augmentation du processus d'apoptose chez ce patient.
L'invention a également pour objet toute méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies liées à une diminution du processus d'apoptose, lesdites pathologies étant telles que définies ci-dessus, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation du processus d'apoptose telle que définie ci-dessus, dans laquelle la mesure d'une quantité dudit composé, dans la population de cellules de l'échantillon biologique du patient, qui est supérieure à la quantité de ce même composé dans la population de cellules d'un individu sain, peut être corrélée à la mesure d'une quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique qui est inférieure à la quantité de ces mêmes cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique dans la population de cellules d'un individu sain, et témoigne alors d'une diminution du processus d'apoptose chez ce patient. Avantageusement les méthodes susmentionnées de l'invention sont effectuées à partir de leucocytes, en tant que population cellulaire étudiée, et de CMXRos en tant que composé utilisé dans l'étape d'incubation avec ladite population cellulaire.
L'invention concerne également toute méthode de diagnostic in vitro et/ou de suivi de pathologies liées à une augmentation ou à une diminution du processus d'apoptose telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce que l'étape d'incubation de la population de cellules avec ledit composé est précédé par, et/ou suivie par, et/ou effectuée avec une étape d'incubation de cette même population de cellules avec des marqueurs cellulaires autres que les composés tels que définis ci-dessus, ces autres marqueurs étant spécifiques desdites pathologies, notamment des anticorps marqués spécifiques d'antigènes hétérologues ou d' autoantigènes du patient présents dans lesdites cellules, ces antigènes ou autoantigènes étant spécifiques desdites pathologies.
L'utilisation de ces autres marqueurs dans cette dernière méthode de diagnostic in vitro permet notamment de confirmer le diagnostic par évaluation du processus apoptotique selon l'invention des pathologies en question.
Parmi ces autres marqueurs, on peut citer notamment les marqueurs spécifiques des antigènes suivants du système CD et des antigènes viraux, et donc spécifiques des pathologies suivantes : leucémies, lymphomes, autres néoplasies, SIDA et autres infections virales.
L'invention concerne également toute méthode de criblage in vitro de produits d'intérêt thérapeutique susceptibles d'augmenter ou de diminuer l' apoptose, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial telle que décrite ci-dessus, dans laquelle l'étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales avec au moins un composé tel que défini ci-dessus, est précédée par une étape d'incubation de cette même population de cellules avec lesdits produits d'intérêt thérapeutique.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet toute méthode de criblage de produits capables d'augmenter l' apoptose, ladite méthode étant effectuée par mise en oeuvre d'une méthode de criblage telle que définie ci- dessus, dans laquelle la mesure d'une quantité de composé tel que défini ci- dessus, dans la population de cellules préalablement incubées avec lesdits produits, qui est inférieure à la quantité de ce même composé dans une population de cellules identiques aux précédentes mais n'ayant pas été incubées avec lesdits produits, peut être corrélée au fait que lesdits produits sont capables d'augmenter le processus d'apoptose dans lesdites cellules. Les produits sélectionnés pour leur propriété d'augmenter l' apoptose dans des cellules in vitro selon la méthode de criblage précédemment décrite, sont donc susceptibles d'être utilisés en tant que produits capables d'accélérer le processus d'apoptose dans le cadre du traitement des pathologies liées à une diminution du processus d'apoptose, telles que définies ci-dessus. L'invention a plus particulièrement pour objet encore, toute méthode de criblage de produits capables de diminuer l' apoptose, ladite méthode étant effectuée par mise en oeuvre d'une méthode de criblage telle que définie ci- dessus, dans laquelle la mesure d'une quantité de composé tel que défini ci- dessus, dans la population de cellules préalablement incubées avec lesdits produits, qui est supérieure à la quantité de ce même composé dans une population de cellules identiques aux précédentes mais n'ayant pas été incubées avec lesdits produits, peut être corrélée au fait que lesdits produits sont capables de diminuer le processus d'apoptose dans lesdites cellules.
Les produits sélectionnés pour leur propriété de diminuer l' apoptose dans des cellules in vitro selon la méthode de criblage précédemment décrite, sont donc susceptibles d'être utilisés en tant que produits capables de retarder le processus d'apoptose dans le cadre du traitement de pathologies liées à une augmentation du processus d'apoptose, telle que définies ci-dessus.
Avantageusement, les méthodes de criblage décrites ci-dessus sont effectuées à partir de cellules sanguines, notamment de leucocytes, provenant soit d'un individu sain, soit d'un patient atteint de la pathologie susceptible d'être traitée par lesdits produits, et le composé marqué est la CMXRos. En variante, les méthodes de criblage susmentionnées, et plus particulièrement celles de criblage de produits capables de diminuer le processus d'apoptose en vue de restaurer ce dernier, comprennent une étape d'induction de l' apoptose des cellules utilisées dans lesdites méthodes. Cette étape d'induction d'apoptose est effectuée préalablement à l'étape d'incubation desdites cellules avec le composé tel que défini ci-dessus. Puis l'on mesure la capacité éventuelle desdits produits à restaurer un processus d'apoptose normal de la manière indiquée ci-dessus. Avantageusement, cette étape d'incubation de l' apoptose est effectuée par incubation desdites cellules avec un corticoïde telle que la dexaméthasone.
L'invention a également pour objet toute méthode d'évaluation toxicologique in vitro de produits, notamment d'intérêt thérapeutique, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial telle que décrite ci-dessus, dans laquelle l'étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales avec au moins un composé tel que défini ci-dessus, est précédée par une étape d'incubation de cette même population de cellules avec lesdits produits.
La mesure d'une quantité dudit composé dans la population de cellules préalablement incubées avec lesdits produits qui, dans le cadre de la méthode d'évaluation biologique susmentionnée, est supérieure ou inférieure, à la mesure de la quantité de ce même composé dans une population de cellules identiques aux précédentes mais n'ayant pas été incubées avec lesdits produits, peut être corrélée au fait que lesdits produits sont susceptibles d'être toxiques pour l'organisme, dans la mesure où un effet de modification du processus d'apoptose n'est pas recherché pour ces produits.
Avantageusement les méthodes d'évaluation toxicologiques susmentionnées de l'invention sont effectuées à l'aide de cellules humaines ou animales notamment de leucocytes provenant d'individus sains, et le composé utilisé est la CMXRos.
L'invention a également pour objet des trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre d'une des méthodes décrites ci-dessus, contenant au moins un composé tel que défini ci-dessus, avantageusement aux concentrations indiquées ci- dessus. Le cas échéant, les kits de l'invention comprennent également un fixant cellulaire, tel que du paraformaldéhyde à la concentration indiquée ci- dessus, ainsi qu'un protocole d'utilisation contenant notamment les valeurs standard d'apoptose chez un individu sain. L'invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples qui suivent de mesure du PTM avec la CMXRos.
I MATERIELS ET METHODES
1) Cellules et induction de l' apoptose
Les thymocytes de souris BALB/c femelles (6-10 semaines) ont été cultivés dans un milieu RPM1640 complété avec de la L-glutamine et 10 % de sérum foetal de veau (1 x 106 cellules/ml). Pour l'induction de l' apoptose, les cellules ont été cultivées en présence de DEX (dexaméthasone 10 μM ; Sigma,
St Louis, MO). Après incubation pendant l'intervalle de temps indiqué, les paramètres mitochondriaux ou nucléaires d'apoptose ont été mesurés.
2) Détermination du PTM Afin d'évaluer le PTM, les cellules (5 x 105 /ml) ont été incubées avec
DiOCô(3) (Molecular Probes, Eugène ; OR ; 20nM dans PBS, 15 mn 37°C) (26) et/ou avec de la CMXRos (Molecular Probes ; doses standard : 30 nM pour les expériences sans fixation et 150 nM avant la fixation). La CMXRos (ImM) a été préparée sous forme d'une solution dans du diméthylsulfoxide (DMSO) et stockée à -20 °C. Des solutions intermédiaires ont été préparées dans du DMSO à une concentration de 200 fois la concentration finale, suivi par une dilution par 1 : 200 avec le milieu contenant les cellules. La solution de DiOCô(3) (40 μM dans DMSO) a été diluée jusqu'à une solution de travail de 400 nM (10 μl solution + 1 ml PBS), suivi par une dilution de 1 : 20 avec le milieu contenant les cellules. Pour contrôle négatif, des cellules ont été traitées simultanément avec l'agent non couplant cyanure carbonyle de m- chlorophénylhydrazone (mCICCP, 50 μM, Sigma). Dans une expérience de contrôle, les cellules ont été gardées pendant 5 minutes à 37° C en présence de 137 mM KC1 dans du PBS isotonique (pH=7,2) ou uniquement du PBS, suivi par le marquage avec CMXRos.
3) Fixation
La fixation par l'aldéhyde a été réalisée par incubation de culots cellulaires avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Durant cette période de 15 minutes, les cellules ont été gardées dans un mélangeur horizontal (150 rpm). Puis les cellules ont été stockées pendant 1 à 10 jours à 4°C à l'obscurité. 4) Mesures spectrofluorométriques
Les spectres de fluorescence de FITC (1 μM dans l'éthanol), PE (2.5 μM dans de l'eau) et CMXRos (1 μM dans l'éthanol) ont été obtenus en utilisant un spectrofluorimètre Kontron SFM25 (Kontron, Zurich, Suisse) à une longueur d'onde d'excitation de 488 nM.
5) Marquages des antigènes de surface cellulaire
Après marquage par la CMXRos, les cellules ont été lavées dans du PBS refroidi dans de la glace avec 2 % de sérum de veau foetal (FCS), incubées pendant 30 minutes à 4°C avec un anticorps monoclonal (mAB) couplé avec de l' isothiocyanate de fluorescéine (FITC) cet anticorps monoclonal étant spécifique du CD4 de souris (RM4-5 ; 240 ng/10^ cellules dans 100 μl ; Pharmagen, San Diego, CA) et avec un mAB conjugué à la R-phycoérythrine (PE) ce mAB étant spécifique de la chaîne α du CD8 de souris (53-6.7 ; 240 ng/lO^ cellules dans 10μl ; Pharmagen). Puis les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS + 2 % de FCS et fixées avec du paraformaldéhyde comme décrit ci-dessus.
6) Détermination de l'expression de Bcl-2 intracellulaire Après marquage par la CMXRos et la fixation, les cellules ont été lavées dans du PBS, perméabilisées avec de l'acétone refroidie dans la glace pendant 10 minutes, lavées 2 fois dans du PBS + 2 % de FCS, et incubées pendant une nuit avec un anticorps monoclonal spécifique de Bcl-2 (4C11 , 400 ng/10^ cellules dans 100 μl ; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Après deux lavages dans du PBS + 2 % de FCS, les cellules ont été incubées pendant 30 minutes à 4°C en présence d'IgG anti souris de F(ab)2-FITC (1 : 100 ; Silenus, Dandenong, Victoria, Australia), lavées deux fois et resuspendues dans du PBS auquel a été rajouté 2 % de paraformaldéhyde en tant que conservateur.
7) Détermination de la fragmentation apoptotique d'ADN
Après marquage par la CMXRos et fixation, les cellules (1 x 10") ont été lavées dans du PBS et perméabilisées 2 minutes dans du citrate de sodium à 0, 1 % contenant du triton X100 à 0, 1 % , lavées deux fois dans du PBS isotonique (pH=7,2), resuspendues dans un volume final de 50 μl contenant 0,3 nmoles de FITC-12-déoxy-2-uridine triphosphate (FITC-dUTP), 3 nmoles de dATP, 50 nmoles de CoC12, et 5 U de déoxynucléotidetransférase terminale (Boehringer Mannheim, Mannheim, Allemagne) dans un tampon de réaction contenant 200 mM de cocadylate de potassium, 250 μg/ml de BSA, 25 mM de Tris-HCl (pH=6,6). Après incubation (1 heure à 37°C), les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS et resuspendues dans du PBS contenant 2 % de paraformaldéhyde.
8) Mesures cytofluorométriques
Les analyses ont été réalisées en utilisant un analyseur EPICS Profile II (Couker, Hialeh, FL) équipé avec un laser argon refroidi par l'air (488 nM, 15 mW). L'instrument a été installé afin de mesurer les faisceaux de lumière frontaux (FS) et latéraux (SS), fluorescence FITC/DiOCôQ) (FL1, 525 mn), fluorescence PE (FL-2,575 nm) et fluorescence CMXRos (FL3, 630 nm). Dans toutes les expériences les paramètres FS et SS ont été reportés sur la population majeure de taille normale. Pour les mesures de fluorescence de CMXRos, le photomultiplicateur de voltage a été calibré chaque jour avec des billes fluorescentes standardisées (Standard Immunobrite, Coulter).
II RESULTATS
1) La CMXRos est un fluorochrome sensible au PTM, et fixable au formaldéhyde.
Les thymocytes induits pour suivre une apoptose manifestent une chute précoce du PTM (1,19). Cette chute précoce du PTM affecte les thymocytes susceptibles à l'induction de l' apoptose par le glucocorticoïde dexaméthasone
(DEX) et peut être détecté par des marqueurs cationiques lipophiles tels que DiOCβQ) et CMXRos, 2 fluorochromes qui marquent essentiellement la même population de cellules. L'incorporation de tous les marqueurs lipophiles cationiques, dont ceux utilisés en routine pour la détermination du PTM (rhodamine 123, JC-1, DioC6(3) est dirigé à la fois par le potentiel de membrane plasmique et le PTM (2,9). Ceci s'applique également à la CMXRos en ce sens qu'à la fois l'interruption du potentiel de membrane plasmique (qui est principalement un gradient de potassium) et la disparition du PTM (qui est principalement un gradient de proton) consommant un excès extracellulaire de potassium ou le protonophore mCICCP, respectivement, réduisent tous les deux l'incorporation. Toutefois, il semble que la contribution du PTM à la fluorescence de CMXRos est plus importante que celle du potentiel de membrane plasmique. Comme on pouvait s'y attendre, le protonophore mCICCP supprime le PTM de toutes les cellules, à la fois les cellules sensibles ou résistantes au DEX, éliminant ainsi les différences entre cellules avec un PTM élevé et les cellules avec un faible PTM. Conformément à des études antérieures (19,26), ceci indique que les différences dans l'incorporation du marqueur entre les cellules normales (avec PTM élevé) et les cellules pré-apoptotiques (avec PTM faible) est dicté par un gradient de protons mitochondrial plutôt que par d'autres potentiels de membranes.
CMXRos et DiOC6(3) sont incorporés dans les cellules suivant une corrélation linéaire stricte. Par opposition au DiOC6(3), qui est chimiquement relativement inerte, CMXRos possède un groupe chlorométhyle qui réagit de façon covalente avec les thiols intramitochondriaux pour former une liaison thioester. Ainsi, lorsque les cellules sont fixées à l'aide de paraformaldéhyde, un procédé qui interrompt ipso facto la compartimentalisation ionique intracellulaire, DiOCg(3) s'échappe des cellules tandis que la CMXRos demeure in situ.
2) Détermination des paramètres optimum pour le marquage par CMXRos
Des essais dose/réponse et de cinétique montrent qu'à une dose optimale de 3 à 30 nM, le marquage par CMXRos est limité par le PTM plutôt que par le contenu en thiol cellulaire. Même après la fixation par le formaldéhyde, une différence significative persiste entre les cellules non traitées (PTM élevé) et les cellules traitées au mCICCP (faible PTM). Pour obtenir cet effet, la concentration de CMXRos doit être augmentée (concentration optimale 30-200 nM). Le lavage du marqueur avant la fixation par le paraformaldéhyde n'améliore pas le rapport signal/bruit du marquage au CMXRos. Une substitution similaire par d'autres aldéhydes (formaldéhyde, glutaraldéhyde) ou des changements dans la concentration de paraformaldéhyde utilisée lors de la fixation n'améliore pas les résultats. Bien qu'après la fixation le rapport PTM élevé/PTM faible de la fluorescence de CMXRos chute 0,5 plus ou moins 0,1 logs, il est toujours possible de distinguer les cellules à PTM élevé des cellules à faible PTM. Après la fixation au paraformaldéhyde, le marquage obtenu avec 150 nM de CMXRos demeure inchangé durant au moins dix jours.
3) Détermination simultanée de deux antigènes de surface et de la suppression apoptotique du PTM
A une longueur d'onde d'excitation de 488 nm, CMXRos émet à un maximum de 605 nm. Par conséquent, la CMXRos est compatible avec l'utilisation simultanée à la fois de FITC (émission : 515 nm) et TE (émission : 580 nm), les deux fluorochromes classiques utilisés en immuno fluorescence. Sur la base de cette information, une coloration à trois couleurs de thymocytes traités au DEX a été réalisée afin de déterminer le niveau d'expression de deux marqueurs de surface (CD4 et CD8) en utilisant FITC et PE, ainsi que le PTM en utilisant une dose optimale de CMXRos (150 nM), après fixation au paraformaldéhyde. Cette méthode permet de détecter le PTM parmi les quatre populations de thymocytes principaux : CD4+CD8+ ("double positif"), CD4~ CD8" ("double négatif") et CD4+CD8" ou CD4"CD8 + ("simple positif"). Conformément à des études antérieures (3,18,24), les cellules CD4+CD8 +
("double positif") sont particulièrement sensibles à l'induction de l'interruption pré-apoptotique du PTM par les glucocorticoïdes. Ainsi, après traitement au DEX, environ la moitié des cellules CD4+CD8+ ont incorporé des quantités sub-optimales de CMXRos, alors que ce pourcentage est plus faible (10-30 %) parmi les cellules "simple positif". Comme cela a été décrit précédemment
(3,22), les thymocytes pré-apoptotiques (PTM faible) présentent une régulation partiellement négative de l'expression de CD4 et CD8. Ces résultats confirment l'utilité de CMXRos pour la détermination du PTM en association avec les deux fluorochromes les plus fréquemment utilisés pour le marquage immunologique, à savoir FITC et PE.
4) Détermination simultanée de la réduction du PTM apoptotique et de l'expression intracellulaire de Bcl-2
La détermination du PTM dans les cellules fixées ouvre la possibilité de détecter en même temps le niveau d'expression d'antigènes intracellulaires. Le proto-oncogène Bcl-2 est bien connu pour son rôle d'inhibiteur endogène de l' apoptose qui est présent dans les noyaux et les mitochondries mais pas dans les membranes plasmiques (4). Le niveau d'expression de Bcl-2 a été mesuré simultanément avec la détermination du PTM. Les cellules ont été marquées avec CMXRos, fixées avec le paraformaldéhyde, puis imperméabilisées avec l'acétone et marquées avec un anticorps monoclonal spécifique de la protéine Bcl-2. Le traitement avec DEX a deux effets sur les thymocytes :
(i) comme décrit ci-dessus, cela cause une interruption du PTM ; et
(ii) provoque la réduction de Bcl-2. Ces changements affectent la même population de cellules, ce qui indique un lien intime entre les niveaux d'expression de Bcl-2 et le maintien du PTM. Ces données sont en conformité avec des études précédentes, indiquant que le DEX cause une régulation négative de l'expression de Bcl-2 (13) et que Bcl-2 stabilise le PTM (27). En conclusion, l'utilisation de CMXRos est compatible avec le marquage immunofluorescent des antigènes intracellulaires.
5) Quantification simultanée du PTM et fragmentation de l'ADN nucléaire
Les techniques classiques pour la détection des cellules apoptotiques sont basées sur la détermination de cassures de l'ADN qui crée des sites accepteurs potentiels pour l'ADN polymérase ou la désoxyribonucléotidyltransferase terminale (Tdt) (7, 10-12,21). Malheureusement, l'utilisation de marqueurs sensibles du PTM tel que DiOCg(3) ou JC1 n'est pas compatible avec la détermination simultanée de la fragmentation d'ADN, en raison du fait qu'une perméabilisation est nécessaire pour l'action des enzymes modifiant l'ADN. Encore une fois, ce problème peut être résolu à l'aide de la CMXRos. Après marquage par la CMXRos, fixation, des cassures d'ADN ont été révélées avec
Tdt en utilisant la méthode Tunel. La population entière de cellules apoptotiques (Tunel +) présente une faible incorporation de CMXRos. Ce résultat est en accord avec le fait que les deux paramètres, à savoir l'interruption du PTM et la fragmentation de l'ADN, sont des événements irréversibles. Conformément à des résultats fonctionnels et cinétiques antérieurs (19,25), une population mineure mais significative de cellules à faible PTM ne permet pas de détecter de fragmentation d'ADN, ce qui indique que l'interruption pré-apoptotique du PTM doit précéder la fragmentation nucléaire de l'ADN. Ces résultats apportent une réponse à la controverse concernant la séquence des caractéristiques mitochondriales et nucléaires de l' apoptose dans les thymocytes qui selon une étude (6) sont des éléments simultanés alors que d'autres études (19,26,27) indiquent que la suppression du PTM précède l' apoptose nucléaire. En conclusion, cette méthode permet d'identifier une population de cellules pré-apoptotiques ayant un PTM en dessous de la normale mais ne présentant pas encore de fragmentation d'ADN.
III CONCLUSION
Le travail présenté ci-dessus est une méthodologie simple pour la quantification du PTM. L'incubation des cellules avec le marqueur CMXRos réagissant avec les fonctions thiol et sensible au PTM, suivi par la fixation au paraformaldéhyde, constitue une méthode pratique pour la détermination des variations pré-apoptotiques du PTM. Bien que cette procédure cause une réduction du rapport signal/bruit entre les populations de cellules à PTM élevé et à faible PTM, en comparaison aux méthodes n'utilisant pas de fixation avec un aldéhyde, cette procédure a de nombreux avantages majeurs. Premièrement la fixation au paraformaldéhyde inactive les agents infectieux dont le virus de l'immunodéficience humaine (HIV). Ainsi, la méthode basée sur la CMXRos pour la détermination du PTM autorise la détection en routine de l'interruption de PTM associée au SIDA (14) parmi les lymphocytes de donneurs séropositifs. Deuxièmement cette méthode supprime la nécessité de détermination de PTM ad hoc. Ceci est important pour les expériences à grande échelle ainsi que pour la standardisation inter-expérimentale des résultats. Troisièmement cette approche basée sur la CMXRos est compatible avec les détections simultanées du PTM et d'autres paramètres dont la détermination requière la perméabilisation des membranes cellulaires. Le marquage au CMXRos peut être combiné avec le marquage par immunofluorescence d'antigènes intracellulaires ainsi qu'avec la technique Tunel pour la détermination de la fragmentation d'ADN. L'approche est également valable avec les thymocytes, qui sont de petites cellules et qui contiennent relativement peu de mitochondries en comparaison avec d'autres types cellulaires (19). Ainsi, cette approche multiparamétrique est appropriée pour mesurer l' apoptose dans de nombreux types cellulaires différents, dont les lymphocytes périphériques normaux, les cellules CEM-7 de lymphome humain, les cellules hybrido- murins, et les cellules WEHI-231 de leucémie pré-B.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
1. Castedo M, Macho A, Zamzami N, Hirsch T, Marchetti P, Uriel J, Kroemer G:
Mitochondrial perturbations define lymphocytes undergoing apoptotic depletion in vivo. Eur. J. Immunol. 25:3277-3284, 1995.
2. Chen LB: Mitochondrial membrane potential in living cells. Ann. Rev. Cell Biol. 4: 155-
181, 1988.
3. Cohen GM, Sun X-M, Snowden RT, Ormerod MG, Dinsdale D: Identification of a transitional preapoptotic population of thymocytes. J. Immunol. 151:566-574, 1993.
4. Cory S: Régulation of lymphocyte survival by the Bcl-2 gène family. Ann. Rev. Immunol.
13:513-543, 1995.
5. Cossarizza A, Franceschi C, Monti D, Salvioli S, Bellesia E, Rivabene R, Biondo L,
Rainaldi G, Tinari A, Malorni W: Protective effect of N-acetylcysteine in tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis in U937 cells: the rôle of mitochondria. Exp. Cell Res. 220:232-240, 1995.
6. Cossarizza A, Kalashnikova G, Grassilli E, Chiapelli F, Salvioli S, Capri M, Barbieri D,
Troiano L, Monti D, Franceschi C: Mitochondrial modifications during rat thymocyte apoptosis: a study at the single cell level. Exp. Cell Res. 214:323-330, 1994.
7. Darzynkiewicz-Z., Bruno S, Del-Bino G, Gorczyca W, Hotz MA, Lassota P, Traganos F:
Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry 13:795-808, 1992.
8. Deckwerth TL, Johnson EM: Temporal analysis of events associated with programmed cell death (apoptosis) of svmpathetic neurons deprived of nerve growth factor. J. Cell Biol. 123:1207-1222, 1993.
9. Ehrenberg B, Montana V, Wei MD, Wukell JP, Loew LM: Membrane potentials can be determined in individual cells from the Nernstian distribution of cationic dyes. Biophys. J. 53:785-794, 1988.
10. Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA: Identification of programmed cell death in situ via spécifie labelling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119:493-501, 1992. 1 1. Gold R, Schmied M, Rothe G, Zischler H, Breitschopf H, Wekerle H, Lassmann H: Détection of DNA fragmentation in apoptosis: application of in situ nick translation to cell culture Systems and tissue sections. J. Histochem. Cytochem. 41: 1023- 1030, 1993.
12. Li X, Melamed MR, Darzynkiewicz Z: Détection of apoptosis and DNA replication by differential labeling of DNA strand breaks with fluorochromes of différent color. Exp. Cell Res. 222:28-37, 1996.
13. Lotem J, Sachs L: Régulation of bcl-2, bel-XL and bax in the control of apoptosis by hematopoietic cytokines and dexaméthasone. Cell Growth Diff. 6:647-653, 1995.
14. Macho A, Castedo M, Marchetti P, Aguilar JJ, Decaudin D, Zamzami N, Girard PM, Uriel J, Kroemer G: Mitochondrial dysfunctions in circulating T lymphocytes from human immunodeficiency virus-1 carriers. Blood 86:2481-2487, 1995.
15. Marchetti P, Susin SA, Decaudin D, Gamen S, Castedo M, Hirsch T, Zamzami N, Naval J, Senik A, Kroemer G: Apoptosis-associated dérangement of mitochondrial fonction in cells lacking mitochondrial DNA. Cancer Res. 56:2033-2038, 1996.
16. Martin SJ, Reutelingsperger CPM, McGahon AJ, Rader JA, van Schie RCAA, LaFace DM, Green DR: Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a gênerai feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. J. Exp. Med. 182:1545-1556, 1995.
17. Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, Riccardi C: A rapid simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J. Immunol. Meth. 139:271-280, 1991.
18. Nordeen SK, Young DA: Glucocorticoid action on rat thymic lymphocytes. J. Biol. Chem. 251:7295-7303, 1976.
19. Petit PX, LeCoeur H, Zorn E, Dauguet C, Mignotte B, Gougeon ML: Altérations of mitochondrial structure and fonction are early events of dexamethasone-induced thymocyte apoptosis. J. Cell. Biol. 130:157-167, 1995.
20. Savill J, Fadok V, Henson P, Haslett C: Phagocyte récognition of cells undergoing apoptosis. Immunol. Today 14:131-136, 1993. 21. Surh CD, Sprent J: T-cell apoptosis detected in situ during positive and négative sélection in the thymus. Nature 372: 100-103, 1994.
22. Swat W, Ignatowicz L, von Boehmer H, Kisielow P: Clonal dcletion of immature CD4+8+ thymocytes in suspension culture by extrathymic antigen-presenting cells. Nature 351: 150-153, 1991.
23. Vayssière J-L, Petit PX, Risler Y, Mignotte B: Commitment to apoptosis is associated with changes in mitochondrial biogenesis and activity in cell lines conditionally immortalized with simian virus 40. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 1 1752-11756, 1994.
24. Willie AH: Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature 284:555-556, 1980.
25. Zamzami N, Marchetti P, Castedo M, Decaudin D, Macho A, Hirsch T, Susin SA, Petit PX, Mignotte B, Kroemer G: Sequential réduction of mitochondrial transmembrane potential and génération of reactive oxygen species in early programmed cell death. J. Exp. Med. 182:367-377, 1995.
26. Zamzami N, Marchetti P, Castedo M, Zanin C, Vayssière J-L, Petit PX, Kroemer G: Réduction in mitochondrial potential constitutes an early irréversible step of programmed lymphocyte death in vivo. J. Exp. Med. 181:1661-1672, 1995.
27. Zamzami N, Susin SA, Marchetti P, Hirsch T, Gόmez-Monterrey I, Castedo M, Kroemer G: Mitochondrial control of nuclear apoptosis. J. Exp. Med. 183:1533-1544, 1996.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de composés lipophiles, cationiques et comportant au moins un groupe halogenoalkyle dans lequel le groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comprend de 1 à 10 atomes de carbone, notamment un groupe chlorométhyle, ces composés étant marqués, notamment à l'aide d'un marqueur fluorescent, ou étant par eux-mêmes des marqueurs susceptibles de pouvoir être détectés, notamment étant par eux-mêmes des marqueurs fluorescents, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection, et/ou de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial.
2. Utilisation selon la revendication 1 , de composés comprenant un groupe d'au moins trois cycles de 4 à 8 chaînons, de préférence de 6 chaînons, chacun de ces cycles comportant un chaînon commun avec au moins un des deux autres cycles, ces cycles étant hétérocycliques ou non, aromatiques ou non, notamment un groupe de formule suivante :
Figure imgf000024_0001
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, de composés répondant à la formule générale (I) suivante :
Figure imgf000024_0002
dans laquelle :
- X représente un atome d'halogène, notamment un atome de chlore,
- n représente un nombre entier variant de 1 à 5 ,
- R' i , R'2> R'3 et R'4, représentent un atome d'hydrogène, ou R' en association avec R et Nα forment un hétérocycle, et/ou R'2 en association avec R2 et Nα forment un hétérocycle, et/ou R'3 en association avec R3 et Np forment un hétérocycle, et/ou R'4 en association avec R4 et Nβ forment un hétérocycle, lesdits heterocycles étant aromatique ou non et comportant de 3 à 7 atomes de carbone dans le cycle,
- R\ , R2, R3 et R4, lorsqu'ils ne sont pas associés respectivement avec R' i , R'2, R'3 et R'4 pour former un hétérocycle avec Nα ou Np, représentent indépendamment les uns des autres un atome d'hydrogène, ou un groupe alkyle (linéaire ou ramifié) de 1 à 10 atomes de carbone, notamment un groupe méthyle.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, de la chlorométhyl-X- rosamine (CMXRos), de formule suivante :
Figure imgf000025_0001
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro d'une éventuelle modification du processus d'apoptose chez un patient par rapport au processus d'apoptose normal chez un individu sain.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de pathologies dans lesquelles intervient une modification, dans le sens d'une diminution ou d'une augmentation, du processus d'apoptose, et/ou pour la mise en oeuvre d'une méthode de suivi dans le temps de l'évolution de telles pathologies, notamment au cours du traitement thérapeutique de ces dernières.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies dans lesquelles intervient une augmentation du processus d'apoptose, notamment les intoxications, l'infarctus du myocarde, les maladies neurodégénératives ou neuromusculaires, les processus dégénératifs lymphocytaires, notamment le SIDA.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro et/ ou du suivi de pathologies dans lesquelles intervient une diminution du processus d'apoptose, notamment tumeurs, aplasies, cancers.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, pour la mise en oeuvre d'une méthode de criblage de produits d'intérêt thérapeutique susceptibles d'augmenter ou de diminuer l' apoptose.
10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, pour la mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation toxicologique de produits, notamment d ' intérêt thérapeutique .
11. Méthode de détection et/ou de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- une étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales, notamment de cellules sanguines, avec au moins un composé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4,
- le cas échéant, la fixation des cellules susmentionnées, après l'étape d'incubation précédente, ladite fixation étant avantageusement effectuée à l'aide de formaldéhyde,
- la mesure, notamment par analyse cytofluorométrique, de la quantité dudit composé intégrée, lors de l'étape d'incubation précédente, dans lesdites cellules.
12. Méthode de diagnostic in vitro d'une éventuelle modification du processus d'apoptose chez un patient par rapport au processus d'apoptose normal chez un individu sain, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial selon la revendication 11 , dans laquelle :
- l'étape d'incubation est effectuée entre d'une part une population de cellules provenant d'un échantillon biologique prélevé sur ledit patient, notamment du sang, ou des préparations dérivées de sang telles que des préparations de leucocytes, et, d'autre part au moins un composé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4,
- l'éventuelle modification du processus d'apoptose est détectée et/ou mesurée par comparaison à un témoin normal correspondant à la mesure de la quantité du même composé que celui utilisé lors de l'étape d'incubation précédente et intégrée dans une population identique à la précédente et provenant d'un échantillon biologique prélevé chez un individu sain.
13. Méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies liées à une augmentation du processus d'apoptose, telles que définies dans la revendication 7, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode selon la revendication 12, dans laquelle la mesure d'une quantité dudit composé, dans la population de cellules de l'échantillon biologique du patient, qui est inférieure à la quantité de ce même composé dans la population de cellules d'un individu sain, peut être corrélée à la mesure d'une quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique qui est supérieure à la quantité de ces mêmes cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique dans la population de cellules d'un individu sain, et témoigne alors d'une augmentation du processus d'apoptose chez ce patient.
14. Méthode de diagnostic in vitro et/ou du suivi de pathologies liées à une diminution du processus d'apoptose, telles que définies dans la revendication 8, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode selon la revendication 12, dans laquelle la mesure d'une quantité dudit composé, dans la population de cellules de l'échantillon biologique du patient, qui est supérieure à la quantité de ce même composé dans la population de cellules d'un individu sain, peut être corrélée à la mesure d'une quantité de cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique qui est inférieure à la quantité de ces mêmes cellules au stade pré-apoptotique ou apoptotique dans la population de cellules d'un individu sain, et témoigne alors d'une diminution du processus d'apoptose chez ce patient.
15. Méthode de diagnostic in vitro et/ou de suivi de pathologies liées à une augmentation ou à une diminution du processus d'apoptose selon la revendication 13 ou la revendication 14 respectivement, caractérisée en ce que l'étape d'incubation de la population de cellules avec ledit composé selon l'une des revendications 1 à 3, est précédée par, et/ou suivie par, et/ou effectuée avec une étape d'incubation de cette même population de cellules avec des marqueurs cellulaires autres que ledit composé, ces autres marqueurs étant spécifiques desdites pathologies, notamment des anticorps marqués spécifiques d'antigènes hétérologues ou d' autoantigènes du patient présents dans lesdites cellules, ces antigènes ou autoantigènes étant spécifiques desdites pathologies.
16. Méthode de criblage de produits d'intérêt thérapeutique susceptibles d'augmenter ou de diminuer l' apoptose, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial selon la revendication 11, dans laquelle l'étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales avec au moins un composé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, est précédée par une étape d'incubation de cette même population de cellules avec lesdits produits d'intérêt thérapeutique.
17. Méthode d'évaluation toxicologique de produits, notamment d'intérêt thérapeutique, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'une méthode de mesure in vitro du potentiel transmembranaire mitochondrial selon la revendication 11, dans laquelle l'étape d'incubation d'une population de cellules humaines ou animales avec au moins un composé tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4, est précédée par une étape d'incubation de cette même population de cellules avec lesdits produits.
18. Trousses pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'une des revendications 1 à 17, contenant au moins un composé selon l'une des revendications 1 à 4, et, le cas échéant, un fixant cellulaire, tel que du paraformaldéhyde, ainsi qu'un protocole d'utilisation contenant notamment les valeurs standard d'apoptose chez un individu sain.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2331520A1 (fr) * 2008-09-19 2011-06-15 Cancer Research Initiative Foundation Dérivés de rosamine comme agents pour le traitement d'un cancer

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7432298B2 (en) 2003-05-09 2008-10-07 Applied Biosystems Inc. Fluorescent polymeric materials containing lipid soluble rhodamine dyes
WO2004101709A1 (fr) 2003-05-09 2004-11-25 Applera Corporation Colorants de phenyle xanthene

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2283744A (en) * 1993-10-25 1995-05-17 Molecular Probes Inc Diaminoxanthenes
WO1996041166A2 (fr) * 1995-06-07 1996-12-19 The Regents Of The University Of California Detection par procedes optiques des potentiels transmembranaires

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2283744A (en) * 1993-10-25 1995-05-17 Molecular Probes Inc Diaminoxanthenes
WO1996041166A2 (fr) * 1995-06-07 1996-12-19 The Regents Of The University Of California Detection par procedes optiques des potentiels transmembranaires

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. MACHO ET AL: "Chloromethyl-X-rosamine is an aldehyde-fixable potential-sensitive fluorochrome for the detection of early apoptosis.", CYTOMETRY, vol. 25, no. 4, 1996, NEW YORK US, pages 333 - 340, XP002039971 *
RINK T J ET AL: "LYMPHOCYTE MEMBRANE POTENTIAL ASSESSED WITH FLUORESCENT PROBES", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. BIOMEMBRANES, vol. 595, 1980, pages 15 - 30, XP000609450 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2331520A1 (fr) * 2008-09-19 2011-06-15 Cancer Research Initiative Foundation Dérivés de rosamine comme agents pour le traitement d'un cancer
EP2331520A4 (fr) * 2008-09-19 2012-06-06 Cancer Res Initiative Foundation Dérivés de rosamine comme agents pour le traitement d'un cancer

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Szejda et al. Flow cytometric quantitation of oxidative product formation by polymorphonuclear leukocytes during phagocytosis.
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