WO1998009651A1 - ANTI-INTEGRIN α3 ANTIBODY COMPLEXES - Google Patents

ANTI-INTEGRIN α3 ANTIBODY COMPLEXES Download PDF

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WO1998009651A1
WO1998009651A1 PCT/JP1997/003085 JP9703085W WO9809651A1 WO 1998009651 A1 WO1998009651 A1 WO 1998009651A1 JP 9703085 W JP9703085 W JP 9703085W WO 9809651 A1 WO9809651 A1 WO 9809651A1
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antibody
integrin
antigen
fragment
chain
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PCT/JP1997/003085
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Yasuo Sekimori
Hiromitsu Kawata
Eri Tominaga
Toru Hayakawa
Keiji Shimizu
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM

Definitions

  • the present invention belongs to the field of medicine and diagnostics, and relates to a conjugate comprising an anti-integrin ⁇ 3 antibody.
  • Integrin ⁇ 3 is a protein belonging to the S1 integrin family and functions as an adhesion molecule between a cell and a cell and between a cell and an extracellular matrix (Takada Y. et al., J. Cel 1. Biochem. 37: 385-393, 1988
  • tumor cell line is the human medulloblastoma-derived cell line 0 NS — 76 (Tamura, K. et al., Cancer Res. 49).
  • Integrin ⁇ 3 has a molecular weight of approximately 150 kDa under non-reducing conditions (having a molecular weight of 135 kDa + 25 kDa under reducing conditions) and 110 It exists as a heterodimer (VLA 3) consisting of a ⁇ 1 chain having a molecular weight of kDa (having a molecular weight of 130 kDa under reducing conditions).
  • Anti-integrin ⁇ 3 antibody includes an antibody against human bladder carcinoma ⁇ 24 J14 (Fradet, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 224) -228, 1984), human fibroblastoma HT108, W138 Antibody to VA 13 P 1 B5 (Wayner BA et al., J. Cell Bio 1.105: 1873-1884, 1988; El ice MJ et al., J. Cell Biol. 112: 169-181, 1991 ), An antibody against human bladder cancer cell T24 S S—S1 (Takeuchi, K. et al., Exp. Cel 1. Res.
  • ONS-M21 was used as a monoclonal antibody against the human medulloblastoma-derived cell line ONS-76 (Tamura, K. et al., Cancer Res. 49: 5380-5384, 1989).
  • An antibody (Moriuchi, S. et al., Br. J. Cancer 68: 831-837, 1993) is known, and a humanized reshaped human antibody (International Patent Application Publication No. WO 9 5/1 4 0 4 1) is known.
  • WO 96/15811 discloses a method for interning DNA by a protein in which a cyclic peptide having an integrin-binding activity and DNA are linked by a polylysine, and expression of the DNA. Is described.
  • the present invention introduces an antitumor agent or the like into tumor cells using the internalization of an anti-integrin ⁇ 3 antibody and inhibits the growth of tumor cells. It seeks to provide a new means of doing so.
  • the present inventors have conducted various studies to solve the above-mentioned problems. As a result, the inventors have found that an antibody against anti-integrin ⁇ 3 (anti-integrin ⁇ 3 antibody) can be expressed on cells expressing integu, and no-a3. The present inventors have found that it is possible to introduce other substances linked to the antibody into the cells at the time of internalization, and thus completed the present invention.
  • the present invention provides a complex comprising an antibody against integrin 3 (anti-integrin ⁇ 3 antibody) or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent.
  • the present invention also provides a complex formed by linking an anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and toxin.
  • the present invention also relates to an anti-integrin 3 antibody that binds to the amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an anti-integrin antibody 3 that binds to ⁇ 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and a chemotherapeutic agent or And a complex formed by linking the components.
  • the present invention also provides a complex comprising an antibody against integrin ⁇ 3 having the following properties or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin.
  • amino terminal amino acid sequence at the amino group is Phe Asn Leu Asp Thr Arg Ph e Leu Val Val and ys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaa is not specified) (SEQ ID NO: 1) Is;
  • the present invention also provides a complex comprising an anti-integrin ⁇ 3 monoclonal antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin.
  • the present invention also provides a complex obtained by linking the 0NS-M21 antibody (IFO No. 50382) or a fragment thereof having an antigen-binding ability to a chemotherapeutic agent or toxin.
  • the present invention also provides a complex comprising a reconstituted human anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin.
  • the present invention also provides a complex comprising a reconstituted human 0NS-M21 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin.
  • the present invention also provides a complex comprising three anti-integrin antibodies or Fab, F (ab ') 2, scFv having antigen-binding activity thereof and a chemotherapeutic agent or toxin.
  • the present invention also provides a complex obtained by linking an antibody to integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability with an antitumor agent.
  • the present invention also relates to an antibody to integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and a fragment thereof that is capable of binding to antigenin, such as melphalan, cis-platinum, carboplatin, and mitomycin.
  • the present invention provides a complex formed by linking stin (Vincristine) or vindesine (V desine).
  • the present invention also provides a complex formed by linking an antibody to integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability to a cytokine.
  • the present invention also provides an antibody or antigen-binding ability to integrin 3
  • the present invention provides a complex obtained by linking a fragment thereof having interleukin-2 (IL-2), tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ), and interferon (1FN).
  • IL-2 interleukin-2
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor
  • 1FN interferon
  • the present invention also relates to an antibody against integrin ⁇ 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a diphtheria toxin ⁇ chain (Diphtheria toxin).
  • the present invention also provides a complex formed by linking an anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent with a linker.
  • the present invention also provides a complex comprising an anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a toxin linked by a linker.
  • the present invention also relates to an anti-integrin a3 antibody that binds to human integrin ⁇ 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or a fragment thereof having antigen-binding ability, and a chemotherapeutic agent or toxin. Provides a complex linked by a linker.
  • the present invention also provides a complex obtained by linking an antibody to integrin ⁇ 3 having the following properties or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin by a linker.
  • Amino acid side terminal amino acid sequence is Phe Asn Leu Asp Thr Arg Ph e Leu Val Va 1 ys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaa is not specified) (SEQ ID NO: 1) ) Is;
  • the present invention also provides a complex comprising an anti-integrin ⁇ 3 monoclonal antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin linked by a linker.
  • the present invention also provides a complex obtained by linking the 0NS-M21 antibody (IFO No. 50382) or a fragment thereof having an antigen-binding ability to a chemotherapeutic agent or toxin by a linker.
  • the present invention also provides a complex comprising a reconstituted human anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin linked by a linker.
  • the present invention also provides a complex formed by linking a reconstituted human 0NS-M21 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin with a linker.
  • the present invention also provides a complex comprising anti-integrin antibody 3 or Fab, F (ab ') 2, scFv having an antigen-binding activity thereof and a chemotherapeutic agent or toxin linked by a linker. I do.
  • the present invention also provides a complex comprising an antibody against integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability and an antitumor agent linked by a linker.
  • the present invention also relates to an antibody against integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and a compound having the ability to bind to an antigen 3, Melphalan, Cis-platinum, Carboplatin, and Mitomylum.
  • Mitomycin C Adriamycin; Doxorubicin, Daunorubicin, Bleomycin, Neocarzinostatin, Mecarininostatin Methotrexate, 5-Fluorouridine, 5-Fluoro-2'-deoxyur idin e), cytosine arabinoside (Aminopterin), Aminopterin, Vincristine, or Vindesine A complex is provided which is linked by one.
  • the present invention also provides a conjugate obtained by linking an antibody to integrin ⁇ 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability to a cytokine with a linker.
  • the present invention also relates to an antibody to integrin ⁇ 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and interleukin-2 (IL-2), tumor necrosis factor ⁇ (TNF- ⁇ ), and interferon. (IFN) is provided by a linker.
  • IL-2 interleukin-2
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • IFN interferon
  • the present invention also relates to an antibody to integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and diphtheria toxin A chain (Diphtheria toxin A), Pseudomonas endotoxin, and ricin A chain ( Ricin A chain), glycin-free ricin A chain (Deglycosylated ricin A chain), abrin A chain (Abr in A chain), gelonin (Gel on in), pork weed anti-inulinase protein (PAP-s; Poke eed an "-viral protein from seeds), bryodin (Biriodin), saporin (Sapor in), momordin (Momordin), momolcokin (Momorcochin), Jiancin 32 (Dianthin 32), Dianthin 30 (Modentin), Modeccin, Viscumin, Borgesin (Volkesin), Dodecandrin (Dodecandrin), Tritin (Tritin), Lufin or
  • the present invention also provides a conjugate comprising an anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent linked by an intermediate support. provide.
  • the present invention also provides a complex comprising an anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and toxin linked by an intermediate support.
  • the present invention also relates to an anti-integrin that binds to human integrin 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (3) an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin. And a composite formed by linking the above with an intermediate support.
  • the present invention also provides a complex comprising an antibody to integrin 3 having the following properties or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and a chemotherapeutic agent or toxin, which are linked by an intermediate support.
  • Amino group terminal amino acid sequence is Phe Asn Leu Asp Thr Arg Ph e Leu Val Val and ys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaa is not specified) (SEQ ID NO: 1) ) Is;
  • the present invention also relates to an anti-integrin 3 monoclonal antibody or antigen.
  • a complex comprising a binding fragment thereof and a chemotherapeutic agent or toxin linked by an intermediate support.
  • the present invention also provides a conjugate comprising an ONS-M21 antibody (IFO No. 50382) or a fragment thereof capable of binding to an antigen and a chemotherapeutic agent or toxin via an intermediate support.
  • a conjugate comprising an ONS-M21 antibody (IFO No. 50382) or a fragment thereof capable of binding to an antigen and a chemotherapeutic agent or toxin via an intermediate support.
  • the present invention also provides a complex comprising a reshaped human anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin, which is linked to an intermediate support.
  • the present invention also provides a complex comprising a reconstituted human ONS-M21 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin linked by an intermediate support.
  • the present invention also provides a complex comprising anti-integrin ⁇ 3 antibody or Fab, F (ab ') 2, scFv having an antigen-binding activity thereof, and a chemotherapeutic agent or toxin linked by an intermediate support. I do.
  • the present invention also provides a complex comprising an antibody against integrin ⁇ 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability and an antitumor agent linked by an intermediate support.
  • the present invention also relates to an antibody against integrin ⁇ 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and melphalan (Melphalan), cisbratin (Cis-platinum), canoleboplatin (Carboplatin), and mitomycin.
  • the present invention provides a complex obtained by linking Vindesine with an intermediate support.
  • the present invention also provides a complex obtained by linking an antibody to integrin ⁇ 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a cytokine with an intermediate support.
  • the present invention also relates to an antibody against integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and interleukin-2 (IL-2), tumor necrosis factor (TNF-H), interferon. (IFN) and an intermediate support to provide a complex.
  • IL-2 interleukin-2
  • TNF-H tumor necrosis factor
  • IFN interferon.
  • the present invention also relates to an antibody to integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a diphtheria toxin ⁇ chain (Diphtheria toxin A), a Pseudomonas endotoxin, a ricin A chain ( Ricin A chain), deglycosylated ricin A chain, abrin A chain (Abrin A chain), gelonin (Gelonin), pork weed antiviral protein (PAP-s Pokeweed anti-viral protein from seeds), fluoridin (Biriodin), saborin (Saporin), momordin (Momordin), momolcokin (Momorcochin), dianthin 32 (Dianthin 32), Dianthin 30, Modeccin, Viscumin, Volkes in, Dodeca ndrin, Tri tin , Luff in or Trico
  • the present invention provides a complex formed by linking Lin (Trichokirin) with an intermediate support.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a conjugate as described above.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition having an antitumor effect comprising the conjugate described above.
  • the present invention further provides a diagnostic composition comprising a conjugate as described above.
  • FIG. 9 is an electrophoretogram showing the results of SDS-PAGE (0.9%, silver staining) after concentration (twice).
  • the samples of each lane are as follows.
  • Figure 3 shows that the reaction product and Fraction A were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (415% gradient gel) (Pharmacia Biotech), followed by Coomassie-Prigliant-G2. Gel stained at 50. The samples of each lane are as follows from left.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of inhibiting the growth of ricin A chain on 03-76 cells, HuH-7 cells, and SW480 cells.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of immunotoxin on the growth of ONS-76 cells, 1 ⁇ 11 1-7 cells, and 348 cells.
  • FIG. 6 is an electrophoretogram showing Western 'plotting using a rabbit anti-integrin ⁇ 3 antibody.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of inhibiting the growth of imnotoxin or ricin A chain on 0NS-76 cells.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of suppressing the growth of imotoxin or ricin A chain on HuH-7 cells.
  • FIG. 9 is a graph showing the elution result of Sephacryl S200 HR 16/60 column chromatograph of DNR Immuno Conjugate.
  • FIG. 10 is a graph showing the growth inhibitory effect of imnoconjugate or DNR on 0NS-76 cells.
  • FIG. 11 is a graph showing the growth inhibitory effect of imno-conjugate or DNR on HuH-7 cells.
  • imnotoxin means a complex formed by linking an anti-integrin a3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability to toxin.
  • the chemotherapeutic agent immunoconjugate means a complex formed by linking an anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent.
  • the chemotherapeutic agent is linked by a linking group, a linker, an intermediate support, or a combination thereof, which has itself.
  • the linker means a linking molecule used for linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with a chemotherapeutic agent or a toxin.
  • a linking molecule used for linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with a chemotherapeutic agent or a toxin.
  • intermediate support means a linker or a molecule other than a linker capable of binding and carrying an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a plurality of chemotherapeutic agents or a plurality of toxins at once.
  • a linker may be used in linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with an intermediate support to a plurality of chemotherapeutic agents or a plurality of toxins.
  • the antigen against the anti-integrin 3 antibody used in the present invention is already known as described above.
  • the present inventors studied to identify the antigen of a mouse monoclonal antibody (0NS-M21 antibody) against human medulloblastoma-derived cell line ONS-76. As a result, the antigen had the following properties: Was found to have
  • the molecular weight is about 140 kDa as measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis;
  • Amino terminal amino acid sequence is Phe Asn Leu Asp Thr Arg Phe Leu Vl Val Lys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaa is not specified) (SEQ ID NO: 1);
  • the antigen for obtaining the anti-integrin ⁇ 3 antibody used in the present invention may be a cell expressing integrin 3 or a purified or semi-purified antibody from such a cell. Integrin 3 protein may be used. As such cells, for example, various cell lines described in the section of the prior art can be used. The present invention specifically describes the human medulloblastoma-derived cell strain ONS-76 and the antibody 0NS- S21 generated against it.
  • the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is particularly preferred.
  • a monoclonal antibody can be basically produced using a known technique as follows. That is, cells expressing integrin 3 or integrin ⁇ 3, such as human medulloblastoma-derived ONS-76 strain, are used as a sensitizing antigen, and are used in accordance with the usual immunization method. Immunized, the resulting immune cells are fused with known parent cells by a conventional cell fusion method, and screened for by using a conventional screening method to screen monoclonal antibody-producing cells. it can.
  • SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence and base sequence of the human integrin 3 polypeptide.
  • the signal peptide extends from the N-terminal to the 32nd Ala from the et-terminal Met, and the human integrin ⁇ 3 is the mature polypeptide. It is cut when it is produced.
  • Integrin ⁇ 3 polypeptide used as a sensitizing antigen has mutations, substitutions, deletions, insertions or additions of one or more amino acid residues as long as the purpose is achieved. Good.
  • the plurality can be selected from, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with a parent cell acting on cell fusion, and is generally used. For this, mice, rats, hamsters, egrets, etc. are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a common method is to inject a sensitizing antigen into a mammal intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, or the like, and then suspended in a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired. After emulsification, it is preferable to administer several times every 421 days to mammals.
  • a suitable carrier can be used at the time of immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells are particularly preferred.
  • the mammalian myeloid cells as the other parent cells fused with the immune cells are already known cell lines such as P 3 (P 3 x63Ag8.6653) (J. Immunol. 123: 1548, 1978), p3—U1 (Current Topics in Micro-biology and Immunology 81: 1-7, 1978), NS-1 ( Eur. J. Immunol.
  • Cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed according to a known method, for example, the method of Milstein et al. (Milstein et al., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). Can be.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be added and used to enhance the fusion efficiency. it can.
  • the ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells is, for example, preferably 1 to 10 times the number of the immune cells to the myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion include RPMI 164 culture medium, MEM culture medium, and other suitable cell cultures for growing the Mie cell line, and other cell cultures of this type.
  • the usual culture solution used can be used, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • a predetermined amount of the immunocytes and Mie cells is mixed well in the culture medium, and a PEG solution previously heated to about 37 ° C, for example, having an average molecular weight of 1
  • a fusion cell is formed by adding a PEG solution of about 0000-6000 at a concentration of 30-600% (w / V) and mixing.
  • the procedure of adding the appropriate culture medium sequentially and centrifuging to remove the supernatant is repeated.
  • the hybridoma is selected by culturing it in an ordinary selective culture medium, for example, an HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • an HAT culture medium a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the cultivation in the HAT culture solution is continued for a period of time sufficient to kill cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually several days to several weeks.
  • screening and cloning of the hybridoma producing the desired antibody are performed by the usual limiting dilution method.
  • the antigen or antigen-expressing cells may be administered to a transgenic animal having a human antibody gene liver tree to obtain a desired human antibody according to the method described above (see International Patent Application Publication). Nos. W093-12227, W092-03918, W094-02602, W094-25585, W096-34096, W096-33735, U.S. Pat.No. 5,545,806).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture medium, and can be stored for a long time in liquid nitrogen. is there.
  • a method of culturing the hybridoma according to an ordinary method and obtaining the culture supernatant, or transferring the hybridoma to a mammal compatible therewith A method of administering the substance, growing it, and obtaining it as ascites is employed.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method
  • Their method is suitable for mass production of antibodies.
  • the mouse ONS-M21 antibody-producing hybridoma has been deposited with the Fermentation Research Institute (2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Osaka) as IF050382.
  • the 0NS-M21 antibody-producing hybridoma is injected intraperitoneally into a BALB / c mouse (manufactured by Nippon Clear) to obtain ascites, a method for purifying the 0NS-M21 antibody from the ascites fluid, and a method using this hybridoma in an appropriate manner.
  • RPMI 1640 medium containing 10% ⁇ fetal serum and 5% BM-Condimed HI (Boehringer Mannheim), Hypri-Doma SFM medium (GIBCO-BRL), PFHM- ⁇ ⁇ medium (GIBC0-BRL) And purifying the mONS-M21 antibody from the culture supernatant.
  • an antibody may be obtained using an immune cell producing the desired antibody, for example, a cell obtained by immortalizing a sensitized lymphocyte or the like with an oncogene (oncogene).
  • an oncogene oncogene
  • an antibody gene is cloned from an antibody-producing cell, for example, a hybridoma, inserted into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using a genetic recombination technique.
  • Recombinant antibodies produced can be used (see, for example, Carl, A.K. ).
  • the antibody variable region (V) is derived from hybridomas that produce the target antibody and immune cells that produce the antibody, for example, cells in which sensitized lymphocytes and the like have been immortalized with oncogenes. Region)! Isolate the nRNA.
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), and AGPC method (Chmczynski, P. et al., (1987) 162, 156). -159) to prepare total RNA, and use mRNA Purification Kit (Pharmacia Prepare mRNA using Also, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • the cDNA of the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • the synthesis of the oc fraction can be performed using AMV Reverse Transcriptase Firs or strand cDNA DNA Kit.
  • AMV Reverse Transcriptase Firs or strand cDNA DNA Kit For cDNA synthesis and amplification, 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) can be used.
  • a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and a colony is selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the Doxy method.
  • DNA encoding the V region of the desired antibody is obtained, it is ligated to the DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the C region of the antibody.
  • an antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer promoter, as described later.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • Expression of the antibody gene may be determined by co-transforming the host by separately incorporating the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) into the expression vector, or by co-transforming the H chain and L chain.
  • the host may be transformed by integration (see International Patent Application Publication No. WO 94/11523).
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans such as a chimeric antibody and a humanized antibody.
  • These modified antibodies can be produced using known methods.
  • Chimeric antibodies are obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above to DNA encoding the human antibody C region, incorporating the DNA into an expression vector, and introducing it into a host. (See European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 95/14041). Using this known method, chimeric antibodies useful in the present invention can be obtained.
  • the humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, and the complementarity determining region (CDR) of a mammalian antibody other than a human, for example, a mouse antibody, is replaced with the human antibody. It has been transplanted to CDR, and its general genetic recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. W095 / 14041).
  • CDR complementarity determining region
  • a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was constructed to have an overlapping portion at the end. It is synthesized from several oligonucleotides by PCR. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the C region of the human antibody, then incorporated into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No. EP 239400). International Patent Application Publication No. W095 / 1404 1).
  • FR of human antibody linked via CDR has good antigen binding to CDR Those that form the site are selected. If necessary, use reconstituted human antibodies.
  • amino acid of FR in the V region of the antibody may be substituted so that the CDR forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856). ) o
  • Escherichia coli DH5 ⁇ Escherichia coli transformed with plasmid HEF-RV or M21P-gk containing a gene encoding the reconstituted human chain of reconstituted human ONS-M21 antibody
  • HEF-RVL-M21P-gk is designated as FERM BP-4472 and a plasmid HEF-RVH-M21 containing the gene encoding the reshaped human H chain of the reshaped human ONS-M21 antibody.
  • the human antibody C region is used for chimeric antibodies and humanized antibodies.
  • Preferred human antibody C regions include C ⁇ , and for example, C71, Cr2, Cr3 and C74 can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • Chimeric antibodies consist of a V region derived from a mammalian antibody other than human and a C region derived from a human antibody.
  • the humanized antibody comprises CDRs derived from a mammalian antibody other than human and FRs derived from a human antibody. Since it is composed of C and C regions and has reduced antigenicity in a human body, it is useful as an antibody used in the present invention.
  • a preferred specific example of the humanized antibody used in the present invention is a reshaped human 0NS-M21 antibody (see International Patent Application Publication No. W095-14041).
  • the antibody used in the present invention may be used as long as it can be suitably used in the present invention. It may be an antibody fragment or a modified antibody. For example, for an antibody fragment
  • scFv has a structure in which the Fvs of the H chain and the L chain are linked by an appropriate linker.
  • an antibody in which one or more amino acid residues of the amino acid sequence constituting the antibody have undergone mutation, substitution, deletion or insertion can also be used as the antibody in the present invention.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papine or pepsin to generate the antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and expressed. After transfection into an appropriate host cell, it is expressed in a suitable host cell (eg, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better,. & Horwitz, A.H. Methods). in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. k Skerra, A. Methods in Enzymology (1 989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Lamoy i, E.
  • an enzyme such as papine or pepsin
  • scFv can be obtained by linking the V region of the H chain and the V region of the L chain of the antibody (see International Patent Application Publication Nos. WO88-09344 and WO95-14041).
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • the H chain V region and L chain V region in the sc Fv may be derived from any of the antibodies described above.
  • the peptide linker that connects the V regions for example, any single-chain peptide consisting of amino acid residues 12 to 19 is used (see US Pat. No. 5,554,91).
  • the scFv-encoding DNA comprises the H chain or H chain V region of the antibody.
  • the type of DNA to be coded and the type of DNA coding for the L chain or the V region of the L chain are defined as type II, and the DNA portion coding for the desired amino acid sequence of the sequences is placed at both ends.
  • Amplify by PCR using the defined primer pair, and then a DNA pair that encodes a portion of the peptide linker and a primer pair that defines both ends to be linked to the H and L chains, respectively. It is obtained by combining and amplifying.
  • expression vectors containing them and hosts transformed with the expression vectors can be obtained according to a conventional method.
  • scFv can be obtained using the host according to a conventional method.
  • antibody fragments can be produced by a host by obtaining and expressing the gene as described above.
  • the “antibody” referred to in the claims of the present application also includes these antibody fragments.
  • an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • the modification made to the antibody may be a modification by introducing a chemical bond or a modification made to the amino acid sequence of the antibody.
  • the “antibody” referred to in the claims of the present application also includes these modified antibodies. Such a modified antibody can be obtained by modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed by a known method to obtain an antibody.
  • useful promoters commonly used, Z enhancers, expressed antibody genes Alternatively, it can be expressed by DNA having a polyA signal operably linked to the 3 ′ downstream thereof or a vector containing the DNA.
  • the promoter Z enhancer may be a human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer.
  • SV a promoter / enhancer derived from a mammalian cell such as a virus promoter / enhancer, such as virus promoter 1a (HEF1a), such as SV40 promoter / enhancer
  • HEF1a virus promoter 1a
  • the method of Millligan et al. (Nature (1979) 277, 108), and the method of Mizushima et al. (Nucl eic Acids Res. (1990) 18, 5322) when HEF1 promoter / enhancer is used. It can be easily implemented if you follow.
  • expression can be performed by operably linking a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoter include a lacZ promoter and an araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FA SEB J. (1992) 6, 2422-2427), and when using the araB promoter, the method of Better et al. (Science ( 1988) 240, 1041-1043).
  • a pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when E. coli is produced in the periplasm. Born in periplasm After separating the produced antibody, the antibody structure is appropriately refolded and used (for example, International Patent Application Publication No. W096-30394, Japanese Patent Application Publication No. 7-93879). See).
  • the expression vector is used as a selectable marker, such as the aminoglycoside trans- ferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphorolibosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, and the like.
  • APH aminoglycoside trans- ferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • animal cells When eukaryotic cells are used, there are production systems using animal cells, plant cells, and fungal cells.
  • animal cells include (1) mammalian cells such as CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, myeloma, BHK (ba by hamster kidney), HeLa, Vero, (2) Amphibian cells, for example, African frog frog oocytes (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), or (3) insect cells, for example, sf9 and sf2K Tn5 are known.
  • the CH0 cells include dhfr-CHO (Proc. Natl.Acad.Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) and CHO Kl (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) can be suitably used.
  • yeast As plant cells, cells derived from Nicotiana tabacum are known, which may be callus cultured.
  • Fungal cells include yeast, for example, the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces ′ Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi such as Aspergillus, such as Aspergillus niger are well known.
  • E. coli Escherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • An antibody is obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM.MEM and RPMI1640.1MDM can be used as a culture solution. At that time, a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed. In addition, antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced into the peritoneal cavity or the like of the animal.
  • FCS fetal calf serum
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. Introduce the antibody gene into these animals or plants, and produce and recover antibodies in the animals or plants.
  • mice When using animals, there are production systems using mammals and insects. Goats, pigs, sheep, mice, and mice can be used as mammals (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When using mammals, transgenic animals can be used.
  • the antibody gene is prepared as a fusion gene by inserting it into the middle of a gene encoding a protein that is uniquely produced in milk, such as goat casein.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic rat or the progeny of the goat that has received the embryo.
  • Produced from transgenic fish Hormones may be used in the transgenic fish as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibody. (Ebert, M. et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
  • silkworms can be used as insects, for example.
  • the baculovirus into which the antibody gene of interest is inserted is infected to the silkworm, and a desired antibody is obtained from a body fluid of the silkworm (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
  • tobacco When using plants, for example, tobacco can be used.
  • the antibody gene of interest is introduced into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a vector such as Agrobacterium tumefaciens. Infect this tobacco, eg, Nicotiana tabacum, to obtain the desired antibody from the leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24 , 131-138) o
  • the DNA encoding the H or L chain of the antibody is separately incorporated into an expression vector, and the host is co-transformed.
  • the host may be transformed by incorporating DMA encoding the H chain and the L chain into a single expression vector (see International Patent Application Publication No. WO094-11523).
  • Examples of a method for introducing an expression vector into a host include known methods, for example, the calcium phosphate method (Virology (1973) 52, 456-467) and the electroporation method (EMBO J. (1982) 1 , 841-845) etc. are used o
  • the antibody produced and expressed as described above can be separated from the host inside and outside the cell and from the host and purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody used in the present invention is carried out by the separation and purification methods used in ordinary protein purification.
  • the use is not limited in any way.
  • a chromatographic column such as affinity chromatography, a filter, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. can be appropriately selected and combined to separate and purify the antibody.
  • Columns used for affinity chromatography include, for example, a protein A column and a protein G column.
  • Examples of the carrier used for the Protein A column include Hyper D, P0R0S, Sepharose FF (Pharmacia) and the like.
  • Chromatography other than affinity chromatography includes, for example, ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and reversed-phase chromatography. Chromatography, adsorption chromatography, etc. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 ) These chromatographies can be performed using liquid chromatography, for example, liquid chromatography such as HPLC, FPLC, etc. It can be performed by measurement or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or the like. That is, when the absorbance is measured, the obtained antibody is appropriately diluted with PBS, and then the absorbance at 280 nm is measured. For example, in the case of a human antibody, 1 mg / ml should be calculated as 1.350D.
  • BIAcore (Pharmacia) can be used for antibody concentration measurement.
  • the antigen-binding activity of the antibody used in the present invention can be evaluated by a commonly known method, for example, ELISA, BIA (enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (radioimmunoassay) or a fluorescent antibody method ( Antibodies: A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 0
  • integrin ⁇ 3 is added to a 96-well plate on which an antibody against integrin 3 that does not inhibit the binding of the 0NS-M21 antibody to integrin ⁇ 3 is immobilized.
  • a 96-well plate in which integrin 3 is directly immobilized may be used, or cells expressing integrin 3 on the cell surface, such as 0NS-76 cells, may be used.
  • a phased 96-well plate may be used.
  • a fixed amount of a sample containing a biotinylated 0NS-M21 antibody and a target 0NS-M21 antibody for example, a culture supernatant of 0NS-M21 antibody-producing cells or a purified antibody are simultaneously added.
  • A- ⁇ After adding avidin or streptavidin labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase, incubating and washing the plate, an enzyme substrate such as P-nitrophenylyl phosphate is added. In addition, the antigen binding activity can be evaluated by measuring the absorbance.
  • an enzyme substrate such as P-nitrophenylyl phosphate
  • the humanized antibody and the mouse antibody are simultaneously added to a 96-well plate on which the antigen is directly or indirectly immobilized, and the mouse antibody or the human antibody is added. After addition of a secondary antibody that recognizes either of the antibodies and is labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase, the plate is incubated and washed, and then p-nitrophenic acid is added. Antigen binding activity can be evaluated by measuring the absorbance after adding an enzyme substrate such as phosphoric acid.
  • BIAcore (Pharmacia) can be used to evaluate the activity of the above antibody.
  • toxin means various proteins, polypeptides and the like exhibiting cytotoxicity derived from microorganisms, animals or plants.
  • toxins are known toxins.
  • Pokeweed anti-viral protein from seeds PAP-s; Pokeweed anti-viral protein from seeds
  • PAP-s Pokeweed anti-viral protein from seeds
  • Dianthin 32 (Bolognesi A., et al., Clin, exp. Immunol., 89, 341-346, 1992);
  • Dianthin 30 (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);
  • Dodecandrin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);
  • Tritin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);
  • Trichokirin (Casel las P., et al., Bur. J. Biochem. 176, 581-588, 1988; B perfumesi A., et al., Clin. Exp. Immunol., 89 341-346, 1992).
  • chemotherapeutic agent means a substance having an antitumor action other than the above-mentioned toxin, and includes an antitumor agent, a cytokine, an enzyme and the like.
  • the antitumor agent means a low molecular weight compound having an antitumor effecto
  • Cis-platinum (Hurwitz E. and Haimovich J., Method In Enzymology 178, 369-375, 1986; Schechter B., et a 1., Int. J. Cancer 48, 167-172, 1991 ); Carboplatin (Ota, Y., et al., Asia-Oceania J. Obstet. Gynaecol. 19, 449-457, 1993);
  • Adriamycin Doxorubicin
  • LB et al.
  • Cancer Res. 51 4192-4198 1991
  • Zhu Z., et al.
  • Cancer Immunol. Immumother 40 257- 267, 1995
  • Trail, PA et a 1.
  • Science 261, 212-215 1993
  • Zhu Z., et al.
  • Cancer Immunol. Immumother 40 257-267, 1995
  • Zhu Z., et al.
  • Cancer 1 mmunol. Immumother 40 257-267, 1995
  • Zhu Z., et al., Cance. r Immunol. I. mother 40, 257-267, 1995
  • Daunorubicin (DiIlman, R.0., Et al., Caner Res. 48, 6097-6102, 1988; Hudecz, F., et al., Bioconjuga te Chem. 1) 197-204, 1990; Tukada Y. et al., J. Natl. Cancer Inst. 75, 721-729, 1984);
  • Bleomycin Manabe, Y., et al., ⁇ i ochem. ⁇ i ophys. Res. Commun. 115, 1009-1014, 1983;
  • Neocarzinostatin Ki tamura, et al., Cancer Immunol. Immumother 36, 177-184, 1993; Yamaguchi T., et al., Jpn. J. Cancer Res. 85, 167-171, 1994);
  • Methotrexate (Krai ovec, J., et al., Caneer Immunol. Immumother 29, 293-302, 1989; Kulkarni, PN, et al., Cancer Res. 41, 2700-2706, 1981; Shin, LB, et al., Int. J. Cancer 41, 832-839, 1988; Gamett MC, et al., Int. J. Cancer 31, 661-670, 1983);
  • Aminopterin (Kane 11 os J., et al., Immunol. Cell. Biol. 65, 483-493, 1987);
  • Vincristine Johnson J. R., et al., Br. J. Cancer 42, 17, 1980
  • site force inn examples include a site kinase having an antitumor effect.
  • Preferred site cytokines having antitumor activity include, for example, interleukin 2 (IL-2), tumor necrosis factor alpha (TNF), and interferon (INF).
  • IL-2 interleukin 2
  • TNF tumor necrosis factor alpha
  • IFN interferon
  • Examples of the enzyme include an enzyme having an antitumor effect.
  • Enzymes having antitumor effects include, for example, carboxypeptidase (Carbox ypeptidase), anolecalif sulphase (Alkaline Phosphatase), beta-lactamase (/ S-lactamase), and cytidine dynamase. (Cytidine deaminase) is preferred.
  • Means for linking the integrin 3 antibody or a fragment thereof capable of binding to a chemotherapeutic agent or toxin are already known and commonly used.
  • the integrin ⁇ 3 antibody or a fragment having binding ability thereof and the chemotherapeutic agent or toxin may be directly linked via a linking group possessed by themselves. In addition, it has anti-integrin ⁇ 3 antibody or its binding ability.
  • the fragment and the chemotherapeutic agent or toxin may be linked by a linker or by an intermediate support.
  • the anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment having a binding ability thereof and the chemotherapeutic agent or toxin may be linked by a combination of a linking group, a linker, or an intermediate support of the antibody itself.
  • the linking group is, for example, a disulfide using an SH group.
  • the intramolecular disulfide bond of the Fc region of the antibody is reduced with a reducing agent such as dithiothreitol, and the disulfide bond of toxin or a chemotherapeutic agent is similarly reduced.
  • a reducing agent such as dithiothreitol
  • Chemotherapeutic agents directly linked by this method include, for example, neocarzinostane.
  • the linking group is, for example, a Schiff base.
  • the Schiff base can be formed, for example, by a glutaraldehyde reaction.
  • Chemotherapeutic agents directly linked by this method include, for example, daunonorevicin (Hurwitz, E. et al., Cancer Res. 35, 1175-1181, 1975), adriamycin (doxorubicin; Mohamed, G. et al., Pro. AACR 27, 317, 1986).
  • the integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a toxin or a chemotherapeutic agent are directly linked to each other via a linking group possessed by themselves.
  • the linking group in the case of being indirectly bonded is formed by, for example, a carbodiimide method.
  • a water-soluble carbodiimide ethy 1-3- (3′-dimethyl aminopropyl) carbodiimide (ECDI)
  • ECDI water-soluble carbodiimide
  • Chemotherapeutic agents linked by the carbodimid method include, for example, methotrexate (MTX) (Kulkarni, P.N. et al., Cancer Res. 41, 2700-2706, 1981).
  • MTX methotrexate
  • the linking group may be, for example, an active ester method ( It is formed by N-hydroxys ucccinimide method).
  • Chemotherapeutic agents linked by the active ester method include, for example, methotrexate (MTX) (ulkarni, P.N. et al., Cancer Res. 41, 2700-2706, 1981).
  • the linking group is formed by, for example, mixed anhydride.
  • Chemotherapeutic agents linked by mixed anhydrides include, for example, methotrexate (MTX) (Burnstein, S. et al., J. MED. Chem. 20, 950-952, 1977). Can be
  • the linking group is formed by, for example, a diazo reaction.
  • Chemotherapeutic agents linked by the diazo reaction include, for example, methotrexate (MTX) (De Carvalho, S. et al., Nature (London) 202, 255-258, 1964). .
  • a linker is defined as an antibody or a fragment thereof that has the ability to bind antigen and chemotherapy. It means a linking molecule used for linking an agent or toxin with each other.
  • linker When linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability to a chemotherapeutic agent or toxin by a linker, not only a single molecule of linker but also a plurality of same or different types of linkers are used. You may use one.
  • an amino group, a carboxyl group, a mercapto group, or the like may be used as a linking group.
  • Compounds having two or more of any one or a combination of two or more of them include antibodies or fragments thereof having an antigen-binding ability and carboxyl or amino groups of toxin or an enzyme, and linkers.
  • linkers are connected by an ester bond, an amide bond, a thioester bond, or the like formed between a carboxyl group, an amino group, a mercapto group, and the like provided by the above.
  • the linker described herein refers to a substance capable of linking one or more molecules of toxin or a chemotherapeutic agent to an antibody or a fragment thereof capable of binding to an antigen.
  • linker for linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability to toxin and a chemotherapeutic agent for example, the following substances are used.
  • N-Succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) Probionet SPDP: N-Succinimidyl 3- (2-pyridylditio) propinate
  • SPDP N-Succinimidyl 3- (2-pyridylditio) propinate
  • Succinimidyl 6-((1-methyl-2- [2-pyridyldithio] toluamide) hexanoate LC-SMPT: Succinimidyl 6- (a-met 1- (2-pyr i dy 1 ditio] toruamide) hexanoste (Hermanson GT, BI OCONJUGATE Techniques, 232-235, 1996);
  • Sulfosuccinimidyl 6- ( ⁇ -methyl- [2-pyridyldithio] toluamide) hexanoate
  • Sulfo-LC-SMPT Sulfosuccinim idy 1 ⁇ - ( ⁇ -methyl- [2-pyridyldi t ioj toruami de) hexanoate)
  • S-PB Succinimidyl-4- (p-male-midyl) p-maleimidophenyl) butyrate (Hermanson GT, BIOCONJUGATE Techniques, 242-243, 1996);
  • Sulfo-SMPB Sul fo-Succinimi dy 1-4- (p-mal eimi dopheny 1) butyrate (Hermanson GT, BIOCONJUGATE Techniques, 242-243, 1996);
  • MBS m-Malaymi dobenzoyl N—Hydroxysk Tenoré
  • MVS m-Maleimi dobenzoy 1-N-hydroxysuccinimi de ester
  • m-Maleimi dobenzoinole M-Maleimi dobenzoy 1-N-hydroxy-sulfo succinimide ester
  • SAMSA S-Acetyl mercaptosuccinic anhydride
  • DTBP Dimethyl 3,3 — dithiobisprolionimidate
  • DTBP Dimethy 13,3 -ditiobisprorionimidate
  • intermediate support means a substance capable of linking two or more molecules of toxin or a chemotherapeutic agent to an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability.
  • the intermediate support is a linker or a molecule other than a linker capable of binding and carrying an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a plurality of chemotherapeutic agents or a plurality of toxins at a time.
  • a linker may be used.
  • linker or an intermediate support for linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with toxin or a chemotherapeutic agent a peptide such as poly-L-glutamic acid (PGA), Carboxymethyl dextran, dextran, amino dextran, avidin-piotin, cis'aconitic acid, glutamate dihydrazide, human serum albumin (HSA) is used.
  • Linkage of an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with toxin or a chemotherapeutic agent by a linker or an intermediate support is performed, for example, by linking an amino group or a carboxyl group provided by the linker or the intermediate support.
  • amide bond between the antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and an amino group or a carboxyl group provided by toxin or a chemotherapeutic agent.
  • This amide bond is formed by, for example, a calposimid reaction.
  • a toxin or chemotherapeutic agent and a linker or an amino group or aldehyde provided by an intermediate support.
  • a hydrazone between an aldehyde group provided by a toxin or chemotherapeutic agent and a hydrazide group provided by a linker or an intermediate support.
  • the antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability is linked by a disulfide bond formed between an SH group provided by toxin or a chemotherapeutic agent and an SH group provided by a linker or an intermediate support. Is done.
  • This disulfide bond is formed by, for example, an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability, an SH group provided by a toxin or a chemotherapeutic agent, and an activated SH group provided by a linker or an intermediate support. It is formed by a sulfide group.
  • This disulfide bond may also have, for example, the ability to bind antibodies or antigens.
  • a carbonyl group an aldehyde group or a ketone group
  • a hydrazide group provided by a linker or an intermediate support. It is formed by joining.
  • the carbonyl group can be obtained, for example, by oxidizing an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with a toxin or a sugar chain provided by a chemotherapeutic agent.
  • the anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability can be internalized into cells expressing the integrin ⁇ 3 antigen. Therefore, various chemotherapeutic agents or toxins linked by a linking group, a linker, an intermediate support, or a combination thereof possessed by the anti-integrin antibody 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability cannot be used for anti-integrin antibody. It is efficiently introduced into cells together with the internalization of integrin a3 antibody, and exerts their pharmacological effects inside cells.
  • the complex of the present invention obtained by linking the anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with a chemotherapeutic agent or toxin introduces various chemotherapeutic agents or toxin into cells. It is useful as a pharmaceutical composition. Since integrin 3 is widely distributed in tumor cells, the pharmaceutical composition of the present invention is particularly useful as a pharmaceutical composition having an antitumor effect.
  • This effect can be achieved by, for example, a complex of the present invention comprising an anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and toxin, for example, a cell that does not express imnotoxin and integrin ⁇ 3.
  • a complex of the present invention comprising an anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and toxin, for example, a cell that does not express imnotoxin and integrin ⁇ 3.
  • the cell killing effect occurred only in the latter, and the imotoxin or free toxin of the present invention was expressed in cells expressing integrin ⁇ 3 This was proved by the higher cell killing effect in the former case.
  • this effect may be due to, for example, anti-integrin ⁇ 3 antibody or antigen binding.
  • Conjugate of the present invention comprising a fragment thereof having an ability and a chemotherapeutic agent, e.g., a cell that does not express integrin ⁇ 3 expressing the chemotherapeutic agent immunoconjugate and expresses integrin ⁇ 3
  • a chemotherapeutic agent e.g., a cell that does not express integrin ⁇ 3 expressing the chemotherapeutic agent immunoconjugate and expresses integrin ⁇ 3
  • a cell killing effect was produced only in the latter case, and when the chemotherapeutic agent immunoconjugate of the present invention or a free chemotherapeutic agent was added to cells expressing integran 3 This was proved by the high cell killing effect in the former.
  • the anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability can specifically bind to cells expressing the integrin ⁇ 3 antigen; It is also useful as a composition.
  • a complex used as a diagnostic agent or a diagnostic composition a complex obtained by linking a radioisotope with an anti-integrin antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability is used. No.
  • Radio-aisotope means a radioactive element.
  • the radioisotope linked to the anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability includes, for example, 90-YUrium.
  • the anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and yttrium are linked, for example, by a chelation reaction.
  • a chelation reaction for example, DTPA (diethylenetrnepentaacetic acid) can be used (Griffiths, G.L. et al., Cancer Theraphy with Radiolabeled Antibodies, 47-61, 1995).
  • radioisotope linked to the anti-integrin a3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability examples include technetium (99m-Technetium).
  • the anti-integrin a3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and technesium are linked, for example, by a chelation reaction. For example, use N 2 S 2 during the chelation reaction. (Clin. Pharmacokinet. 28, 126-142, 1995; Grif fiss, G. et al., Cancer Cphi la.) 73, 761-768, 1990).
  • radioisotope linked to an anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability examples include, for example, ryuneshim (186-rhenium, 188-rhenium) (Griff iths, GL et a). 1., Cancer (phila.) 73, 761-768, 1990).
  • the anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and rynenum are linked, for example, by a chelation reaction.
  • the radioisotope linked to the anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability includes, for example, indium (111-indium).
  • the anti-integrin ⁇ 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and indium are linked, for example, by a chelation reaction.
  • a chelation reaction for example, DTPA (dietylenetriaminepentaacetic acid) can be used (Griff iths, G. L. et al., Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies, 47-61, 1995).
  • the radioisotope linked to the anti-integrin a3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability includes, for example, iodine (131-Iodine, 125-Iodine).
  • the anti-integrin a3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and iodine are linked by, for example, the chloramine T method, the I0DGEN method, the lactoperoxidase oxidizing method or the Bolton-Hunter method.
  • a complex comprising the anti-integrin a3 antibody of the present invention or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin, or a pharmaceutical composition comprising the complex, a diagnostic agent, and a diagnostic agent
  • the composition can be administered orally or parenterally systemically or locally.
  • Parenteral administration includes, for example, intravenous injection, Intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection can be selected, and the administration method can be appropriately selected according to the age and symptoms of the patient.
  • the conjugate of the invention or a pharmaceutical composition comprising the conjugate is administered to a patient already suffering from a tumor in an amount sufficient to cure or at least partially arrest the condition. .
  • conjugate of the present invention or the diagnostic agent and the diagnostic composition comprising the conjugate and are administered for imaging the localization of a tumor in a patient already suffering from the tumor.
  • an effective dose is selected from the range of 0.01 mg / kg to 100 mg / kg body weight at a time.
  • a dose of 1-1000 mg, preferably 5-50 mg, can be chosen per patient.
  • the dose of the complex of the present invention or the pharmaceutical composition, the diagnostic agent, and the diagnostic composition comprising the complex is not limited to these doses.
  • the administration period can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the complex of the present invention or a pharmaceutical composition comprising the complex, a diagnostic drug, and a diagnostic composition may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive depending on the administration route. .
  • Such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, carboxymethyl cellulose nato. Lithium, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, carboxymethylstarch sodium, octyne, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, arabia gum , Casein, gelatin, agar, diglycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, vaseline, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA ), Mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • the additives to be used are appropriately or in combination selected from the above depending on the dosage form, but are not limited thereto.
  • the present invention also encompasses simultaneous or sequential concomitant administration of the conjugate of the present invention with other drugs, biological preparations, synthetic pharmaceutical preparations and the like when used as a medicament.
  • Other drugs are selected from anti-inflammatory drugs, antiallergic drugs, antiplatelet drugs, and other antitumor drugs.
  • 0 NS antigen-overexpressing medulloblastoma cell lines (0 NS- 7 6, 1. 2 X 1 0 10 cell) were solubilized with 0. 5% Tw een 2 0 ZT BS, the Centrifugal HanareueKiyoshi T The solution was diluted with TBS or replaced with a dialysis membrane so that the concentration of ween 20 became 0.1%.
  • an affinity chromatographic column was prepared by a conventional method using CNBr-activated Sepharose 4B (Pharmacia) and ONS-M21 antibody.
  • the sample (500 ⁇ 1) was concentrated about 30 times with Microcon 50 (Amicon), separated by 9% SDS-PAGE, and then PVDF membrane (Trans-Blot, Bio -Rad), stained with Ponso-S, excised a main band of about 140 kDa, and extracted with amino acid sequencer (476 A Protein Sequencer, Applied Biosystems) Was used to analyze the N-terminal amino acid sequence.
  • amino acid sequencer 476 A Protein Sequencer, Applied Biosystems
  • a homologous search was performed on the obtained sequence consisting of 20 amino acids using GENETYX (ver. 33, SWISS-PROT Rel. 32), and the terminal sequence of integrin ⁇ 3 was found. Matched. Table 1 shows the results.
  • the sample (4.5 ml) was concentrated and transferred to SDS-PAGE and PVDF membranes in the same manner as in Experiment 2) to cut out a main band of about 140 kDa.
  • the band was cut into approximately 0.5 mm squares, suspended in 70% formic acid, and dissolved by adding 2 mg of cyanogen bromide (purified by Wako Pure Chemical's usual method by sublimation method) and dissolved.
  • the reaction was carried out at room temperature for 18 hours.
  • the solution is recovered, the remaining membrane is washed twice with 70% formic acid (2001), the recovered solution and the washing solution are mixed, and a centrifugal concentrator (Concentrator CC-180, Tomi-1) is used. And dried under reduced pressure.
  • N-terminal sequence indicates the amino acid sequence of the N-terminal of the approximately 140 kDa protein derived from the ONS-76 strain of the present invention
  • P 9, P 12, and P 1 0, P13 and P12 show the amino acid sequence of a fragment of about 140 kDa protein derived from ONS-76 strain
  • ITA3 HUMAN shows the known human integrin ⁇ . 3 shows the corresponding part of the amino acid sequence.
  • ONS-76 cells Human medulloblastoma cell line with high expression of ONS antigen (ONS-76 cells were solubilized in TBS containing 0.5% Tween 20 and the centrifuged supernatant was prepared. ONS-76 solubilized
  • the ONS antigen was isolated from the fractions by immunoprecipitation using the mouse ONS-M21 antibody according to a conventional method, that is, the above-mentioned solution was used so that the mouse ONS-M21 antibody was 1 O / z gZml. , And incubated overnight at 4 ° C. Next, Protein G-Sepharose (manufactured by Pharmacia) was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 1 hour. After washing with TBS containing 20 times three times, the mixture was centrifuged to precipitate ONS antigen.
  • the immunoprecipitate prepared above was boiled for 3 minutes, applied to 12% SDS-PAGE, and the ONS antigen was separated. Next, the cells are transferred to a nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell) by a conventional method, and after blocking with TBS containing 3% skim milk, a rabbit pore that recognizes the integrin 3 light chain is obtained.
  • EXAMPLE 1 m 0 NS -. 125 1-labeled of M 2 1 antibodies of the fin evening Ichina 'Shiyo down mouse monoclonal click polyclonal antibodies (m 0 NS- ⁇ 2 1 antibody), I 0 D 0 GEN (PIERCE Company).
  • IODOGEN IODOGEN
  • 0 NS 76 cells suspended in RPMI 1640 medium (manufactured by G1BC0) (hereinafter referred to as medium) containing fetal serum (FCS)
  • FCS fetal serum
  • HBSS Hank's balanced salts solution
  • N-Succinimidyl mono-3- (2-pyridyldithiopropionate) (SPDP) (manufactured by PIECE), a bivalent crosslinking reagent, was dissolved in N, N-dimethylformamide to a volume of 2 mg. .
  • the absorbance of the released pyridin-12-thion at 343 nm was measured to quantify the molar concentration of the PDP group.
  • Ricin A chain 1.17 mg / ml (Honey Corporation) 1.7 ml is added to 0.05 M phosphoric acid bite solution (pH 7.4), 0.15 Apply force to a Sephadex G—25 column (1 cm ⁇ 10 cm) that has been bitten with sodium M chloride, 0.05 MEDTA, and add buffer of ricin A chain to 0.05.
  • M phosphate buffer (pH 7.4), 0.15 M sodium chloride, and 0.005 MEDTA were exchanged.
  • the reaction solution was equilibrated with a 0.05 M phosphate buffer (pH 7.4), 0.15 M sodium chloride, and 0.05 MEDTA, and a Sephacryl S200 HR column (1. 6 cm x 60 cm) (Pharmacia Biotech), except for the unreacted ricin A chain, and divide the antibody-eluting fraction into two parts at the elution time from the peak top (fractions A, B). The fraction eluted earlier (fraction A) was concentrated.
  • a phosphate buffer pH 7.4
  • 0.15 M sodium chloride 0.15 M sodium chloride
  • 0.05 MEDTA Sephacryl S200 HR column
  • reaction product and fraction A were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (4–15% gradient gel) (Pharmacia Biotech), followed by The cells were stained with Coomassie Priliantble G250.
  • the resulting imnotoxin was obtained as a mixture of one antibody molecule and one or more molecules of ricin A chain ( Figure 3).
  • the molecular weight of imnotoxin bound to one molecule of toxin measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was approximately 180 kDa ⁇
  • the number of ricin A chains that bind to an antibody molecule can be adjusted by the number of PDP groups introduced into the antibody.
  • the ricin A chain was removed from the 2–mercaptoethanol with a PD–10 column (Pharmacia Biotech) equilibrated with PBS, and centricon 10 (Amicon) was removed. ).
  • the quantification of imnotoxin and ricin A chain was performed by Bio-Rad Protein Assay (manufactured by BIO-RAD) using sigamma globulin as a standard.
  • tissue culture 9 6 well flat bottom plates manufactured by FALCON
  • ONS were suspended in medium - 7 6 cells per well 2.
  • m As a cell to which the ONS-M21 antibody does not bind, human liver cancer-derived HuH-7 cells (Nakabayashi, H. et al., Cancer Res., 42, 3858-3 863, 1982, Nakabayashi, H et al., Gann, 75, 151-158, 1984) and human colon cancer-derived SW480 cells (Leibovotz, A. et al., Cancer Res. 36, 4562-4569, 1976). . 1 O xi O 4 or (H u H - 7), 2. seeded at 5 X 1 0 4 pieces (SW 4 8 0), it was cultured in the same manner.
  • the collected antibody fraction is concentrated by centrifugal ultrafiltration with Centricon-50 (manufactured by Amicon), and 0.15 ml of this antibody solution is collected to give a final concentration of 2 mM.
  • dithiothreitol manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • the absorbance at 343 nm (A 343 ) of pyridin-2-thione released was measured.
  • Antibody concentration was determined using Micro BCA protein assay reagent (manufactured by PIERCE) using Sigma globulin as a standard.
  • 0.1 mg of the ricin A chain was mixed with 0.1 mg of each modified antibody. Each of these was ultracentrifuged to about 0.1 ml with Centricon-10 (manufactured by Amicon), and reacted at room temperature for 6 days. Imnotoxin was purified from the reaction solution as follows. The gel filtration column used was Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech), and a phosphate buffered saline solution was used for equilibration and elution.
  • reaction solution was applied to a gel filtration column to remove unreacted lysin ⁇ chains, and the fraction eluted earlier than the antibody elution peak was obtained. Collected as the toxin fraction.
  • the purified imnotoxin was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (Pharmacia Biotech) on a gradient gel 4-153 ⁇ 4; and stained with Coomassie brilliant blue G250.
  • the resulting immunotoxin was a complex in which one or more ricin A chains bound to one antibody molecule or more.
  • Lysine A chain was removed from 2-mercaptoethanol using a PD-10 column (Pharmacia Biotech) equilibrated with a phosphate buffered saline solution (PBS), and centricon-10 ( (Made by Amicon). Quantification of imnotoxin and ricin A chain was performed using Biorad Protein Assay (manufactured by BioRad) using sigamma globulin as a standard. The molarity was calculated assuming that the molecular weight of the ricin A chain was 30,000, the molecular weight of scFvONS-M21 imnotoxin was 60,000, and that of other imnotoxins was 180,000.
  • the medium was removed, and cells were suspended by adding 50 I per well of 0.25% trypsin-EDTA. Cells are absorbed by a glass filter (WALLAC) using a harvester (WALLAC), and the radioactivity of [methyl-3H] thymidine incorporated into the cells is counted by a beta plate counter (WALLAC). did. The growth inhibitory activity was calculated assuming that the control (cultured in the medium alone) count value was 100%. The results are shown in FIGS. 7 and 8. As a result, both hONS-M21 immunotoxin and scFvONS-M21 immunotoxin showed selective growth inhibition effect on antigen-positive cells.
  • hONS-M21 immunotoxin The activity of hONS-M21 immunotoxin is almost the same as that of mONS-M21 immunotoxin, and that of scFvONS-M21 immunotoxin is about 1/200 of that of mONS-M21 immunotoxin.
  • DNR daunorubicin
  • 0.5 ml (68.3 nmol) of 21.3 mg / ml mONS-M21 was diluted with 0.5 ml of 20 mM sodium phosphate buffer (pH 5.5). The 40 mg / ml al 0 4 was added 0.1 ml (18.7 / z mol) thereto. The reaction solution was stirred at room temperature under light shielding for 90 minutes. After completion of the reaction by adding 80 l of ethylene glycol, it was dialyzed against 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.5) to be used in the next reaction.
  • the reaction solution was dialyzed in a phosphate buffer (pH 7.5) physiological saline. After binding the antibody to a protein A column kit (Ampure PA, manufactured by Amersham) and collecting by passing through dextran _ (NHNH 2 ) that did not bind to the antibody, the antibody was eluted from the column. , Collected.
  • a protein A column kit Ampure PA, manufactured by Amersham
  • the reaction solution was concentrated by ultrafiltration (Centre Brep-10, manufactured by Amicon) and then purified by gel filtration using a Sephacryl S200 HR 16/60 column (Pharmacia Biotech).
  • a mONS-M21-dextran-DNR complex (molecular weight: 257 kDa) was obtained from the protein-bound fraction.
  • a dextran-DNR complex (60 kDa) was recovered from the fraction passed through Protein A.
  • the complex of 250-260 kDa was calculated to have 2-3 molecules of dextran- (NHNH 2 ) bound to one antibody molecule. From the measurement of the antibody and DNR concentrations, the mONS-M21-dextran-DNR complex had about 10 molecules of DNR per complex molecule, and the dextran-DNR complex had 1 molecule of dextran. On the other hand, it was calculated that about 18 molecules of DN R were bound.
  • Example 7 Specific growth-inhibitory effect of DNR immunoconjugate using dextran as an intermediate support on human medulloblastoma-derived 0NS-76 cells
  • 0NS-76 cells are suspended in RPMI1640 medium (manufactured by G1BC0) (hereinafter referred to as medium) containing 10% fetal serum (FCS) and placed in a 96-well flat bottom plate for tissue culture (Falcon) at 5.0 per well. X 10 three were sown. Similarly, 2.0 ⁇ 10 4 HuH-7 cells were seeded per well. These were cultured for 16 hours at 5! 3 ⁇ 4C0 2 under at 37 ° C. After removing the medium, 100 ml / well of DNR immi-conjugate or DNR diluted serially in the medium was added and the cells were cultured for 20 hours.
  • medium fetal serum
  • DNR Immo conjugate (abbreviated as ONS-DNR in the figure) inhibits the growth of antigen-positive 0NS-76 cells more than DNR alone and dextran-DNR complex (abbreviated as Dex-DNR in the figure) The effect was 3.3 times that of DNR alone and about 10 times that of dextran-DNR complex.
  • DNR immunoconjugate showed only the same growth inhibitory effect as dextran-DNR complex on antigen-negative HuH-7 cells.
  • DNR immunoconjugate also shows a selective growth inhibitory effect on antigen-positive cells similarly to immunonotoxin.
  • a hybrid domema producing the m0NS-M21 antibody is a human medulloblastoma-derived cell line ONS — 76
  • a spleen cell of a BALB / c mouse immunized with the above was fused with a mouse myeloma cell line P3U1 by a conventional method using polyethylene glycol.
  • the mONS-M21 antibody-producing hybridoma was transplanted into the abdominal cavity of a mouse, and the obtained ascites was applied to a protein agarose column to obtain a purified mouse monoclonal antibody.
  • a mouse monoclonal antibody isotyping kit (Amersham International Co., Ltd. pic. was used for typing.
  • the mONS-M21 antibody had a / c-type L chain and an a1-type H chain.
  • the above-mentioned Hypri-Doma was deposited with the Fermentation Research Institute (2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka) as IF500382.
  • Reconstituted human ONS-M21 antibody was obtained by the method described in International Patent Application Publication No. W095-14041.
  • RNA was prepared by a conventional method, and double-stranded cDNA was synthesized therefrom.
  • double-stranded cDNA was synthesized therefrom.
  • the DNA encoding the variable region (V region) of the light chain (L chain) and heavy chain (H chain) of the mONS-M21 antibody was determined by the polymerase chain reaction (PCR) method. Amplified. For PCR, primers described in Jones, ST. Et al., Bio / Technology (1991) 9, 88-89 were used.
  • the DNA fragment amplified by the PCR method is purified by low melting point agarose, and a DNA fragment containing the gene encoding the k-type L chain V region and a DNA fragment containing the gene encoding the H chain V region of the mONS-M21 antibody I got
  • DNA fragments were prepared with a Sal I cohesive end at the 5 'end and a 3' end. It was digested with a restriction enzyme to have an Xma 1 cohesive end at the end. Each of the obtained DNA fragments was ligated to pUC19 vector, and introduced into Escherichia coli DH5 competent cells to transform Escherichia coli cells.
  • Plasmid DNA was prepared from the transformed E. coli by the alkaline method, and the nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined by a conventional method. Furthermore, the complementarity determining region (CDR) of the DNA encoding the L chain and the V region contained in these cDNAs was determined.
  • CDR complementarity determining region
  • the PUC19 vector containing cDNAs encoding the k-type chain and the V region of the H chain of the niONS_M21 antibody was modified, respectively. These cDNAs were then inserted into separate HEF expression vectors.
  • the HEF expression vector was co-transformed into COS cells to express the Chimera ONS-M21 antibody.
  • the chimera 0NS-M21 antibody specifically bound to the human medulloblastoma cell line 0NS-76 as an antigen. Therefore, it was shown that this chimeric antibody had the correct structure of the mONS-M21 antibody.
  • Humanized ONS-M21 antibody was produced by CDR-grafting. For the L chain, 16 versions were constructed by substituting the amino acid residues in the framework region (FR). A DNA fragment containing the gene encoding the L chain and H chain of the humanized 0NS-M21 antibody was inserted into the HEF expression vector. COS cells were co-transformed with these HEF expression vectors to express humanized ONS-M21 antibody.
  • the humanized ONS-M21 antibody containing several L-chain versions showed that It bound to the medulloblastoma cell line 0NS-76 to the same extent as the Chimera 0NS-M21 antibody. Therefore, these humanized 0NS-M21 antibodies It was shown to have a functional antigen-binding site with good antigen-binding activity.
  • Escherichia coli having a plasmid containing DNA coding for the L chain and H chain of the humanized ONS-M21 antibody was Escherichia coli i DH5a (HEF-RVL-M21p-gk) and Escherichia coli i DH5a, respectively. (HEF-RVH-M21-a1) and the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-3 1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture) on November 18, 1993, respectively. Deposited internationally under BP-4472 and FERM BP-4471 under the Budapest Treaty.
  • This DNA fragment, the DNA encoding the L chain V region and the DNA encoding the H chain V region of the humanized 0NS-M21 antibody were ligated by PCR.
  • the obtained DNA fragment was cloned into a PSCFVT7 expression vector.
  • E. coli BL21 (DB3) competent cells were transformed with this expression vector.
  • scFv The antigen binding activity of the scFv obtained from this E. coli was examined by Cell ELISA using the mONS-M21 antibody's antigen binding inhibitory activity as an index. As a result, scFv showed the same level of inhibitory activity as the Fab fragment prepared from the humanized 0NS-M21 antibody. Therefore, it was shown that scFv has the same antigen-binding activity as the humanized ONS-M21 antibody. Reference to deposited microbes
  • CAC CGC TAC ACC CAG GTG CTG TGG TCA GGG TCA GAA
  • GAC CAG CGG CGC 543 His Arg Tyr Thr Gin Val Leu Trp Ser Gly Ser Glu Asp Gin Arg Arg
  • Lys Val Tyr lie Tyr His Ser Ser Ser Lys Gly Leu Leu Arg Gin Pro
  • CAG CAG GTA ATC CAT GGA GAG AAG CTG GGA CTG CCT GGG HG GCC ACC 1359 Gin Gin Gin Valerie His Gly Glu Lys Leu Gly Leu Pro Gly Leu Ala Thr

Abstract

Complexes comprising an anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding capacity and a chemotherapeutic agent or toxin, and a medicinal composition containing the same. As the chemotherapeutic agent and toxin can efficiently be incorporated into cells, particularly tumor cells by the internalization of the anti-integrin α3 antibody, the composition can exhibit cytocidal activities.

Description

明 細 書 抗イ ンテグリ ノ、 a 3抗体の複合体 技術分野  Description Anti-integrino, a3 antibody complex Technical field
本発明は医薬および診断薬の分野に属し、 抗イ ンテグリ ン α 3抗 体を含んで成る複合体に関する。 背景技術  The present invention belongs to the field of medicine and diagnostics, and relates to a conjugate comprising an anti-integrin α3 antibody. Background art
イ ンテグリ ン α 3 は、 S 1 イ ンテグリ ンフ ア ミ リ ーに属する蛋白 質であり、 細胞一細胞、 及び細胞一細胞外基質間の接着分子と して 機能し （Takada Y. et al. , J. Cel 1. Biochem. 37 ： 385-393, 1988 Integrin α3 is a protein belonging to the S1 integrin family and functions as an adhesion molecule between a cell and a cell and between a cell and an extracellular matrix (Takada Y. et al., J. Cel 1. Biochem. 37: 385-393, 1988
； El ice M. J. et al. , J. Cel 1. Biol. 112 ： 169 - 181， 1991) 、 皮 膚 （表皮細胞） 、 腎糸球体、 甲状腺、 食道、 尿路上皮、 胸腺、 線維 芽細胞、 活性化リ ンパ球、 多く の腫瘍細胞株等に分布している （Fr adet Y. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA 81 ： 224-228, 1984 ； Hemler . E. et al. , Immunology Today 9 ： 109-113, 1984) 。 El ice MJ et al., J. Cel 1. Biol. 112: 169-181, 1991), skin (epidermal cells), glomeruli, thyroid, esophagus, urothelium, thymus, fibroblasts, activity Lymphocytes, distributed in many tumor cell lines, etc. (Fradet Y. et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA 81: 224-228, 1984; Hemler. E. et al., Immunology Today 9: 109-113, 1984).
この様な腫瘍細胞株の 1 つと して、 ヒ ト髄芽腫 （Medulloblastom a)由来の細胞株 0 N S — 7 6 (Tamura, K. et al. , Cancer Res. 49 One such tumor cell line is the human medulloblastoma-derived cell line 0 NS — 76 (Tamura, K. et al., Cancer Res. 49).
： 5380-5384, 1989) が知られている。 イ ンテグリ ン《 3 は、 非還 元条件下で約 1 5 0 kDa の分子量を有し （還元条件下で 1 3 5 kDa + 2 5 kDa の分子量を示す） 、 非還元条件下で 1 1 0 kDa の分子量 を有する （還元条件下で 1 3 0 kDa の分子量を示す） β 1 鎖とから 成るヘテロ二量体 （V L A 3 ) と して存在する。 : 5380-5384, 1989). Integrin <3 has a molecular weight of approximately 150 kDa under non-reducing conditions (having a molecular weight of 135 kDa + 25 kDa under reducing conditions) and 110 It exists as a heterodimer (VLA 3) consisting of a β1 chain having a molecular weight of kDa (having a molecular weight of 130 kDa under reducing conditions).
抗イ ンテグリ ン α 3抗体と しては、 ヒ ト膀胱癌細胞腫 Τ 2 4 に対 する抗体 J 1 4 3 (Fradet, Y. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 ： 224-228, 1984) 、 ヒ 卜線維芽細胞腫 H T 1 0 8 0 , W 1 3 8 V A 1 3 に対する抗体 P 1 B 5 (Wayner B. A. et al. , J. Cell Bio 1. 105 ： 1873-1884, 1988 ； El ice M. J. et al. , J. Cell Biol. 1 12 ： 169-181， 1991) 、 ヒ ト膀胱癌細胞 T 2 4 に対する抗体 S Μ— S 1 (Takeuchi, K. et al. , Exp. Cel 1. Res. 211 ： 133-141, 1991 ) , ヒ ト肺癌細胞 A 5 4 9 に対する抗体 A 3 — 1 V A 5 (Wei tzman, J. B. et al. , J. Biol. Chem. 268 ： 8651-8657, 1993) 、 ヒ ト皮虜 細胞に対する抗体 VM— 3 (Morhenn, V. B. et al. , J. Clin. Invert . 76 ： 1978-1983, 1985) 、 抗体 M— k i d 2 (Natal i PC. et al .， Int. J. Cancer 54 ： 68-72， 1993) 、 及び F L細胞に対する抗体 a n t i - F R P - 2 (Ohta, H. et al.， BMBO J. 13 ： 2044-2055 ， 1994) 等が知られている。 Anti-integrin α3 antibody includes an antibody against human bladder carcinoma 腫 24 J14 (Fradet, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 224) -228, 1984), human fibroblastoma HT108, W138 Antibody to VA 13 P 1 B5 (Wayner BA et al., J. Cell Bio 1.105: 1873-1884, 1988; El ice MJ et al., J. Cell Biol. 112: 169-181, 1991 ), An antibody against human bladder cancer cell T24 S S—S1 (Takeuchi, K. et al., Exp. Cel 1. Res. 211: 133-141, 1991), human lung cancer cell A540 Antibody A 3 — 1 VA 5 (Weitzman, JB et al., J. Biol. Chem. 268: 8651-8657, 1993), Antibody against human skin captive cells VM-3 (Morhenn, VB et al., 76: 1978-1983, 1985), antibody M-kid 2 (Natali PC. Et al., Int. J. Cancer 54: 68-72, 1993), and antibody against FL cells. FRP-2 (Ohta, H. et al., BMBO J. 13: 2044-2055, 1994) and the like are known.
また、 前記ヒ ト髄芽腫由来細胞株 O N S— 7 6 (Tamura, K. et a 1. , Cancer Res. 49 ： 5380-5384, 1989) に対するモノ ク ローナル 抗体と して、 O N S— M 2 1 抗体（Moriuchi, S. et al. , Br. J. Can cer 68 ： 831-837, 1993) が知られており、 この抗体をヒ ト型化し た再構成ヒ ト抗体 （国際特許出願公開番号 WO 9 5 / 1 4 0 4 1 ) が知られている。  Further, ONS-M21 was used as a monoclonal antibody against the human medulloblastoma-derived cell line ONS-76 (Tamura, K. et al., Cancer Res. 49: 5380-5384, 1989). An antibody (Moriuchi, S. et al., Br. J. Cancer 68: 831-837, 1993) is known, and a humanized reshaped human antibody (International Patent Application Publication No. WO 9 5/1 4 0 4 1) is known.
WO 9 6 / 1 5 8 1 1 にはイ ンテグリ ン結合活性を有する環状べ プチ ドと D N Aとをポリ リ ジンにより連結したタ ンパク質による D N Aのィ ンターナ リゼ一シ ョ ンと該 D N Aの発現について記載され ている。  WO 96/15811 discloses a method for interning DNA by a protein in which a cyclic peptide having an integrin-binding activity and DNA are linked by a polylysine, and expression of the DNA. Is described.
しかしながら、 抗ィ ンテグリ ン ひ 3抗体がイ ンターナライズする ことは知られていない。 発明の開示  However, it is not known that the anti-integrin 3 antibody internalizes. Disclosure of the invention
本発明は、 抗イ ンテグリ ン α 3抗体のイ ンターナ リゼ一ショ ンを 利用 して抗腫瘍剤等を腫瘍細胞に導入し、 腫瘍細胞の増殖を阻害す るための新規な手段を提供しよう とするものである。 The present invention introduces an antitumor agent or the like into tumor cells using the internalization of an anti-integrin α3 antibody and inhibits the growth of tumor cells. It seeks to provide a new means of doing so.
本発明者らは、 上記の課題を解決するため、 種々研究した結果、 イ ンテグリ ン α 3 に対する抗体 （抗イ ンテグリ ン α 3抗体） がイ ン テグ、) 、ノ a 3 を発現する細胞にイ ンターナライズ（internalyze) し 、 その際に該抗体に連結した他の物質を該細胞に導入することがで きるこ とを発見し、 本発明を完成した。  The present inventors have conducted various studies to solve the above-mentioned problems. As a result, the inventors have found that an antibody against anti-integrin α3 (anti-integrin α3 antibody) can be expressed on cells expressing integu, and no-a3. The present inventors have found that it is possible to introduce other substances linked to the antibody into the cells at the time of internalization, and thus completed the present invention.
従って、 本発明は、 イ ンテグリ ンな 3 に対する抗体 （抗イ ンテグ リ ン α 3抗体） 又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤とを 連結して成る複合体を提供する。  Therefore, the present invention provides a complex comprising an antibody against integrin 3 (anti-integrin α3 antibody) or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent.
本発明はまた、 抗イ ンテグリ ン 3抗体又は抗原結合能を有する その断片と トキシ ンとを連結して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex formed by linking an anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and toxin.
本発明はまた、 配列番号 7 に記載のァ ミ ノ酸配列からなるヒ トイ ンテグ 、) ン α 3 に結合する抗ィ ンテグリ ンひ 3抗体又は抗原結合能 を有するその断片と化学療法剤または トキシ ンとを連結して成る複 合体を提供する。  The present invention also relates to an anti-integrin 3 antibody that binds to the amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, an anti-integrin antibody 3 that binds to α3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and a chemotherapeutic agent or And a complex formed by linking the components.
本発明はまた、 下記の性質を有するイ ンテグリ ン α 3 に対する抗 体又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤または トキシ ンと を連結して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising an antibody against integrin α3 having the following properties or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin.
(1) SDS-ポ リ アク リルア ミ ドゲル電気泳動により測定した分子量 が約 140kDaである ；  (1) a molecular weight of about 140 kDa measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis;
(2) ァ ミ ノ基側末端ァ ミ ノ酸配列が Phe Asn Leu Asp Thr Arg Ph e Leu Val Val し ys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaa は特定されず） （配列番号 ： 1 ) である ；  (2) The amino terminal amino acid sequence at the amino group is Phe Asn Leu Asp Thr Arg Ph e Leu Val Val and ys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaa is not specified) (SEQ ID NO: 1) Is;
(3) 内部に次のア ミ ノ酸配列を含有する ：  (3) Contains the following amino acid sequence:
① Asn lie Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His His lie lie Gl u Asp (配列番号 ： 2 )  ① Asn lie Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His His lie lie Glu Asp (SEQ ID NO: 2)
② Asp Asn Leu Arg Asp Lys Leu Arg Pro lie 11 e lie Ser ( 配列番号 ： 3 ) ② Asp Asn Leu Arg Asp Lys Leu Arg Pro lie 11 e lie Ser ( SEQ ID NO: 3)
③ Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg (配列番号 ： 4 )  ③ Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg (SEQ ID NO: 4)
④ Val Asn His Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gly Thr Val ( 配列番号 ： 5 )  ④ Val Asn His Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gly Thr Val (SEQ ID NO: 5)
⑤ Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Ph e Gin Val Gly Pro (配列番号 ： 6 ) 。  ⑤ Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Ph e Gin Val Gly Pro (SEQ ID NO: 6).
本発明はまた、 抗イ ンテグリ ン α 3 モノ ク口一ナル抗体又は抗原 結合能を有するその断片と化学療法剤または トキシンとを連結して 成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising an anti-integrin α3 monoclonal antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin.
本発明はまた、 0NS- M21 抗体 （IFO No. 50382 ) 又は抗原結合能 を有するその断片と化学療法剤または トキシ ンとを連結して成る複 合体を提供する。  The present invention also provides a complex obtained by linking the 0NS-M21 antibody (IFO No. 50382) or a fragment thereof having an antigen-binding ability to a chemotherapeutic agent or toxin.
本発明はまた、 再構成ヒ ト抗イ ンテグリ ン 3抗体又は抗原結合 能を有するその断片と化学療法剤または トキシ ンとを連結して成る 複合体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising a reconstituted human anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin.
本発明はまた、 再構成ヒ ト 0NS- M21 抗体又は抗原結合能を有する その断片と化学療法剤または トキシンとを連結して成る複合体を提 供する。  The present invention also provides a complex comprising a reconstituted human 0NS-M21 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin.
本発明はまた、 抗イ ンテグリ ン な 3抗体又はその抗原結合活性を 有する Fab 、 F(ab' )2 、 scFvと化学療法剤または トキシ ンとを連結 して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising three anti-integrin antibodies or Fab, F (ab ') 2, scFv having antigen-binding activity thereof and a chemotherapeutic agent or toxin.
本発明はまた、 イ ンテグリ ン 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片と抗腫瘍剤とを連結して成る複合体を提供する。 本発明はまた、 イ ンテグリ ン 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片と、 メ ルフ ァ ラ ン （Melphalan ) 、 シスブラチ ン （ Ci s-plat inum) 、 カルボプラチ ン （Carboplat in ) 、 マイ トマイ シ ン C (Mi tomycin C ) 、 ア ド リ アマイ シ ン ( Adr iamyc in； Doxorub i cin ) 、 ダウ ノ ノレビシン （Daunorubicin) 、 ブレオマイ シ ン （Bleo mycin ) 、 ネオ力ノレチノ スタチン (Neocarzinostatin) 、 メ 卜 ト レ キサ一 卜 （Methotrexate) 、 5-フノレオ ロ ウ リ ジ ン (5-Fluoruridine ) 、 5—フノレオ口— 2' デォキ シゥ リ ジ ン (5-Fuluoro-2' -deoxyur i d i n e ) 、 シ ト シ ンァラ ビノ シ ド （Cytosine arabinoside) 、 ア ミ ノ プ テ リ ン （Aminopterin ) 、 ビンク リ スチ ン （Vincristine ) 、 又は ビンデシ ン （V desine ) とを連結してなる複合体を提供する。 本発明はまた、 イ ンテグリ ン 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片とサイ トカイ ンとを連結して成る複合体を提供する 本発明はまた、 イ ンテグリ ンひ 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片とイ ンタ ーロイキ ン- 2 ( IL-2) 、 腫瘍壌死因子 （ TNF-α) 、 イ ンターフュ ロ ン （1FN ) とを連結して成る複合体を提 供する。 The present invention also provides a complex obtained by linking an antibody to integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability with an antitumor agent. The present invention also relates to an antibody to integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and a fragment thereof that is capable of binding to antigenin, such as melphalan, cis-platinum, carboplatin, and mitomycin. C (Mi tomycin C), Adriamycin (Adoriamyc in; Doxorub i) cin), daunorubicin, bleomycin, neocarzinostatin, methotrexate, 5-fluoruridine , 5-funoleo mouth-2 'deoxyuridine (5-Fuluoro-2'-deoxyuridine), cytosine arabinoside (Cytosine arabinoside), aminopterin (Aminopterin), vincuri The present invention provides a complex formed by linking stin (Vincristine) or vindesine (V desine). The present invention also provides a complex formed by linking an antibody to integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability to a cytokine. The present invention also provides an antibody or antigen-binding ability to integrin 3 The present invention provides a complex obtained by linking a fragment thereof having interleukin-2 (IL-2), tumor necrosis factor (TNF-α), and interferon (1FN).
本発明はまた、 イ ンテグリ ン α 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片とジフテ リ ァ トキンシ ン Α 鎖 （Diphtheria toxin The present invention also relates to an antibody against integrin α3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a diphtheria toxin 鎖 chain (Diphtheria toxin).
A) 、 シュ一 ドモナスエン ド 卜キシ ン (Pseudomonas endotoxin) 、 リ シン A 鎖 （Ricin A chain ) 、 無糖鎖リ シ ン A 鎖 （Deglycos ylated r i cin Λ chain ) 、 アブリ ン A 鎖 ( Abr in A chain ) 、 ゲロニン （Gel on in ) 、 ポー ク ウ イ 一 ド抗ウ ィ ルス蛋白 （PAP- s ； Pokeweed ant i -v i ral protein from seeds) 、 ブ リ オ ジ ン ( B i riodin) 、 サボリ ン （Sapor in ) 、 モモルジ ン （Momordin) 、 モモ ルコキ ン （Momorcochin ) 、 ジア ンシ ン 32 (Diant in 32) 、 ジァ ンシ ン 30 (Dianthin 30) 、 モデッ シ ン （Modeccin) 、 ビスカ ミ ンA), Pseudomonas endotoxin, ricin A chain (Ricin A chain), deglycosylated ricin A chain (Deglycosylated ricin Λ chain), abrin A chain (Abrin A chain) chain), gelonin (Gel on in), pork anti-virus protein (PAP-s; Pokeweed anti-viral protein from seeds), briodin (Biriodin), savorin (Sapor in), Momordin, Momorcochin, Diant in 32, Dianthin 30, Modeccin, Biscamin
(Viscumin) 、 ボノレケ シ ン ( Volkesin) 、 ドデカ ン ド リ ン ( Dodeca ndrin ) 、 ト リ チ ン （Tri tin) 、 ルフ ィ ン （Luf Πη) 又は ト リ コキ リ ン （Trichokirin ) とを連結して成る複合体を提供する。 本発明はまた、 抗イ ンテグリ ン 3抗体又は抗原結合能を有する その断片と化学療法剤とをリ ンカーにより連結して成る複合体を提 供する。 (Viscumin), bonorecin (Volkesin), dodecandrin (Dodeca ndrin), tritin (Tritin), rufin (LufΠη) or tricokirin (Trichokirin) A composite comprising: The present invention also provides a complex formed by linking an anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent with a linker.
本発明はまた、 抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有する その断片と トキシンとをリ ンカ一により連結して成る複合体を提供 する。  The present invention also provides a complex comprising an anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a toxin linked by a linker.
本発明はまた、 配列番号 7 に記載のァ ミ ノ酸配列からなる ヒ トイ ンテグリ ン α 3 に結合する抗ィ ンテグリ ン a 3抗体又は抗原結合能 を有するその断片と化学療法剤または トキシンとを リ ンカーにより 連結して成る複合体を提供する。  The present invention also relates to an anti-integrin a3 antibody that binds to human integrin α3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, or a fragment thereof having antigen-binding ability, and a chemotherapeutic agent or toxin. Provides a complex linked by a linker.
本発明はまた、 下記の性質を有するィ ンテグリ ン α 3 に対する抗 体又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤または トキシ ンと をリ ンカーにより連結して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex obtained by linking an antibody to integrin α3 having the following properties or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin by a linker.
(1) SDS -ポリ アク リ ルァ ミ ドゲル電気泳動により測定した分子量 が約 140kDaである ；  (1) a molecular weight of about 140 kDa as determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis;
(2) ァ ミ ノ基側末端ァ ミ ノ酸配列が Phe Asn Leu Asp Thr Arg Ph e Leu Val Va 1 し ys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe ( Xaa は特定されず） （配列番号 ： 1 ) である ；  (2) Amino acid side terminal amino acid sequence is Phe Asn Leu Asp Thr Arg Ph e Leu Val Va 1 ys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaa is not specified) (SEQ ID NO: 1) ) Is;
(3) 内部に次のア ミ ノ酸配列を含有する ：  (3) Contains the following amino acid sequence:
① Asn He Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His His He lie Gl u Asp (配列番号 ： 2 )  ① Asn He Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His His Helie Glu Asp (SEQ ID NO: 2)
② Asp Asn Leu Arg Asp Lys Leu Arg Pro lie lie lie Ser ( 配列番号 ： 3 )  ② Asp Asn Leu Arg Asp Lys Leu Arg Prolielielie Ser (SEQ ID NO: 3)
③ Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg (配列番号 ： 4 )  ③ Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg (SEQ ID NO: 4)
④ Val Asn His Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gly Thr Val ( 配列番号 ： 5 )  ④ Val Asn His Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gly Thr Val (SEQ ID NO: 5)
⑤ Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Ph e Gin Val Gly Pro (配列番号 ： 6 ) 。 ⑤ Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Ph e Gin Val Gly Pro (SEQ ID NO: 6).
本発明はまた、 抗イ ンテグリ ン α 3 モノ ク ローナル抗体又は抗原 結合能を有するその断片と化学療法剤または トキシ ンとをリ ンカ一 により連結して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising an anti-integrin α3 monoclonal antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin linked by a linker.
本発明はまた、 0NS-M21 抗体 （IFO No. 50382 ) 又は抗原結合能 を有するその断片と化学療法剤または トキシ ンとをリ ンカーにより 連結して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex obtained by linking the 0NS-M21 antibody (IFO No. 50382) or a fragment thereof having an antigen-binding ability to a chemotherapeutic agent or toxin by a linker.
本発明はまた、 再構成ヒ ト抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合 能を有するその断片と化学療法剤または トキシ ンとをリ ンカ一によ り連結して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising a reconstituted human anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin linked by a linker.
本発明はまた、 再構成ヒ ト 0NS-M21 抗体又は抗原結合能を有する その断片と化学療法剤または トキシンとを リ ンカーにより連結して 成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex formed by linking a reconstituted human 0NS-M21 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin with a linker.
本発明はまた、 抗イ ンテグリ ンひ 3抗体又はその抗原結合活性を 有する Fab 、 F(ab' )2 、 scFvと化学療法剤または トキシ ンとを リ ン カーにより連結して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising anti-integrin antibody 3 or Fab, F (ab ') 2, scFv having an antigen-binding activity thereof and a chemotherapeutic agent or toxin linked by a linker. I do.
本発明はまた、 イ ンテグリ ン 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片と抗腫瘍剤とをリ ンカ一により連結して成る複合体 を提供する。  The present invention also provides a complex comprising an antibody against integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability and an antitumor agent linked by a linker.
本発明はまた、 イ ンテグリ ン な 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片と、 メ ルフ ァ ラ ン （Melphalan ) 、 シスプラチ ン （ Ci s-plat inum) 、 力ノレポプラチン （Carboplatin ) 、 マイ 卜マイ シ ン C (Mi tomycin C ) 、 ア ド リ アマイ シ ン (Adriamycin; Doxorubi cin ) 、 ダウ ノ ノレビシ ン （Daunorubi cin) 、 ブレオマイ シ ン （Bleo mycin ) 、 不才力ノレチノ スタチ ン （Neocarzinostatin) 、 メ ト ト レ キサー 卜 （Methotrexate) 、 5—フノレオロ ウ リ ジ ン (5-Fluorur idine ) 、 5-フルォ口 - 2， -デォキシゥ リ ジ ン （5- Fuluoro- 2' - deoxyur idin e ) 、 シ ト シ ンァラ ビノ シ ド ( Cy tos i ne arab i nos i de) 、 ア ミ ノ プ テ リ ン （Aminopterin ) 、 ビンク リ スチ ン （Vincristine ) 、 又は ビンデシン （Vindesine ) とをリ ンカ一により連結してなる複合体 を提供する。 The present invention also relates to an antibody against integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and a compound having the ability to bind to an antigen 3, Melphalan, Cis-platinum, Carboplatin, and Mitomylum. Mitomycin C, Adriamycin; Doxorubicin, Daunorubicin, Bleomycin, Neocarzinostatin, Mecarininostatin Methotrexate, 5-Fluorouridine, 5-Fluoro-2'-deoxyur idin e), cytosine arabinoside (Aminopterin), Aminopterin, Vincristine, or Vindesine A complex is provided which is linked by one.
本発明はまた、 ィ ンテグリ ン α 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片とサイ トカイ ンとをリ ンカ一によ り連結して成る複 合体を提供する。  The present invention also provides a conjugate obtained by linking an antibody to integrin α3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability to a cytokine with a linker.
本発明はまた、 イ ンテグリ ン α 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片とイ ンターロイキン- 2 (IL-2) 、 腫瘍壌死因子 α ( TNF-α ) 、 イ ンタ一フ ヱ ロ ン （IFN ) とをリ ンカ一によ り連結して 成る複合体を提供する。  The present invention also relates to an antibody to integrin α3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and interleukin-2 (IL-2), tumor necrosis factor α (TNF-α), and interferon. (IFN) is provided by a linker.
本発明はまた、 イ ンテグリ ンひ 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片と ジフテリ ァ トキンシ ン A 鎖 （Diphtheria toxin A) 、 シユー トモナスェン ト 卜キシ ン ( Pseudomonas endotoxin) 、 リ シ ン A 鎖 （Ricin A chain ) 、 無糖鎖リ シ ン A 鎖 （Deg lycos y 1 ated ricin A chain ) 、 アブリ ン A 鎖 ( Abr i n A chain) ゲロニ ン （Gel on in ) 、 ポークウィ ー ド抗ゥ イ ノレス蛋白 （PAP- s ； Poke eed an "- viral protein from seeds) 、 ブリ オ ジ ン ( Bi riodin) 、 サポ リ ン （Sapor in ) 、 モモルジ ン （Momordin) 、 モモ ルコキ ン （Momorcochin ) 、 ジア ン シ ン 32 (Dianthin 32) 、 ジァ ン シ ン 30 (Dianthin 30) 、 モデッ シ ン （Modeccin) 、 ビスカ ミ ン ( Viscumin) 、 ボルゲシン （Volkesin) 、 ドデカ ン ド リ ン （Dodeca ndrin ) 、 ト リ チ ン （Tritin) 、 ルフ ィ ン （Luifin) 又は ト リ コキ リ ン （Trichokirin ) とをリ ンカ一により連結して成る複合体を提 供する。  The present invention also relates to an antibody to integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and diphtheria toxin A chain (Diphtheria toxin A), Pseudomonas endotoxin, and ricin A chain ( Ricin A chain), glycin-free ricin A chain (Deglycosylated ricin A chain), abrin A chain (Abr in A chain), gelonin (Gel on in), pork weed anti-inulinase protein (PAP-s; Poke eed an "-viral protein from seeds), bryodin (Biriodin), saporin (Sapor in), momordin (Momordin), momolcokin (Momorcochin), Jiancin 32 (Dianthin 32), Dianthin 30 (Modentin), Modeccin, Viscumin, Borgesin (Volkesin), Dodecandrin (Dodecandrin), Tritin (Tritin), Lufin or Trico We provide a complex consisting of a linker (Trichokirin) and a linker.
本発明はまた、 抗ィ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有する その断片と化学療法剤とを中間支持体により連結して成る複合体を 提供する。 The present invention also provides a conjugate comprising an anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent linked by an intermediate support. provide.
本発明はまた、 抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有する その断片と トキシ ンとを中間支持体により連結して成る複合体を提 供する。  The present invention also provides a complex comprising an anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and toxin linked by an intermediate support.
本発明はまた、 配列番号 7 に記載のア ミ ノ酸配列からなる ヒ 卜ィ ンテグリ ンひ 3 に結合する抗ィ ンテグリ ン《 3抗体又は抗原結合能 を有するその断片と化学療法剤または トキシ ンとを中間支持体によ り連結して成る複合体を提供する。  The present invention also relates to an anti-integrin that binds to human integrin 3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (3) an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin. And a composite formed by linking the above with an intermediate support.
本発明はまた、 下記の性質を有するイ ンテグリ ン 3 に対する抗 体又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤または トキシンと を中間支持体により連結して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising an antibody to integrin 3 having the following properties or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and a chemotherapeutic agent or toxin, which are linked by an intermediate support.
(1) SDS-ポリ アク リ ルァ ミ ドゲル電気泳動により測定した分子量 が約 140kDaである ；  (1) a molecular weight of about 140 kDa as measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis;
(2) ア ミ ノ基側末端ア ミ ノ酸配列が Phe Asn Leu Asp Thr Arg Ph e Leu Val Val し ys Glu Ala Gl y Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe ( Xaa は特定されず） （配列番号 ： 1 ) である ；  (2) Amino group terminal amino acid sequence is Phe Asn Leu Asp Thr Arg Ph e Leu Val Val and ys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaa is not specified) (SEQ ID NO: 1) ) Is;
(3) 内部に次のア ミ ノ酸配列を含有する ：  (3) Contains the following amino acid sequence:
① Asn He Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His His He lie Gl u Asp (配列番号 ： 2 )  ① Asn He Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His His Helie Glu Asp (SEQ ID NO: 2)
② Asp Asn Leu Arg Asp Lys Leu Arg Pro lie 11 e lie Ser ( 配列番号 ： 3 )  ② Asp Asn Leu Arg Asp Lys Leu Arg Prolie 11 elie Ser (SEQ ID NO: 3)
③ Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg (配列番号 ： 4 )  ③ Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg (SEQ ID NO: 4)
④ Val Asn His Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gly Thr Val ( 配列番号 ： 5 )  ④ Val Asn His Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gly Thr Val (SEQ ID NO: 5)
⑤ Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Ph e Gin Val Gly Pro (配列番号 ： 6 ) 。  ⑤ Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Ph e Gin Val Gly Pro (SEQ ID NO: 6).
本発明はまた、 抗イ ンテグリ ン 3 モノ ク ローナル抗体又は抗原 結合能を有するその断片と化学療法剤または トキシ ンとを中間支持 体により連結して成る複合体を提供する。 The present invention also relates to an anti-integrin 3 monoclonal antibody or antigen. Provided is a complex comprising a binding fragment thereof and a chemotherapeutic agent or toxin linked by an intermediate support.
本発明はまた、 ONS- M21 抗体 （ IFO No. 50382 ) 又は抗原結合能 を有するその断片と化学療法剤または トキシ ンとを中間支持体によ り連結して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a conjugate comprising an ONS-M21 antibody (IFO No. 50382) or a fragment thereof capable of binding to an antigen and a chemotherapeutic agent or toxin via an intermediate support.
本発明はまた、 再構成ヒ ト抗ィ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合 能を有するその断片と化学療法剤または トキシンとを中間支持体に より連結して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising a reshaped human anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin, which is linked to an intermediate support.
本発明はまた、 再構成ヒ ト ONS- M21 抗体又は抗原結合能を有する その断片と化学療法剤または トキシンとを中間支持体により連結し て成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising a reconstituted human ONS-M21 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin linked by an intermediate support.
本発明はまた、 抗イ ンテグリ ン α 3抗体又はその抗原結合活性を 有する Fab 、 F(ab' )2 、 scFvと化学療法剤または トキシ ンとを中間 支持体により連結して成る複合体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising anti-integrin α3 antibody or Fab, F (ab ') 2, scFv having an antigen-binding activity thereof, and a chemotherapeutic agent or toxin linked by an intermediate support. I do.
本発明はまた、 イ ンテグリ ン α 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片と抗腫瘍剤とを中間支持体により連結して成る複合 体を提供する。  The present invention also provides a complex comprising an antibody against integrin α3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability and an antitumor agent linked by an intermediate support.
本発明はまた、 イ ンテグリ ン α 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片と、 メ ルフ ァ ラ ン （Melphalan ) 、 シスブラチ ン （ C is— platinum) 、 カノレボプラチン (Carboplatin ) 、 マイ 卜マイ シ ン C (Mitomycin C 、 ア ド リ アマイ シ ン ( Adr i amy c i n； Doxorubi cin ) 、 ダウ ノ ノレビシ ン （Daunorubicin) 、 ブレオマイ シ ン （Bleo mycin ) 、 ネオ力ノレチノ スタチ ン (Neocarzinostatin) 、 メ 卜 ト レ キサー ト （Methotrexate) 、 5-フルォロウ リ ジ ン （ 5- Fl uorur i d i ne ) 、 5-フルォ口- 2' -デォキ シゥ リ ジ ン （5- Fuluoro- 2' - deoxyuridin e ) 、 シ ト シ ンァラ ヒ ノ シ ト (Cytosine arabinoside) 、 ア ミ ノ プ テ リ ン （Aminopter in ) 、 ビンク リ スチ ン （ Vincr ist ine ) 、 又は  The present invention also relates to an antibody against integrin α3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and melphalan (Melphalan), cisbratin (Cis-platinum), canoleboplatin (Carboplatin), and mitomycin. C (Mitomycin C, Adriamycin (Doxorubi cin)), Daunorubecin (Daunorubicin), Bleomycin (Neocarzinostatin), Neocarzinostatin Xate (Methotrexate), 5-fluorouridine (5-Fluoruridine), 5-Fluoro-2'-deoxyuridin (5-Fuluoro-2'-deoxyuridin e), Citosine Cytosine arabinoside, Aminopter in, Vincristine, or
1 o ビンデシン （Vindesine ) とを中間支持体により連結してなる複合 体を提供する。 1 o The present invention provides a complex obtained by linking Vindesine with an intermediate support.
本発明はまた、 イ ンテグリ ン α 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片とサイ トカイ ンとを中間支持体によ り連結して成る 複合体を提供する。  The present invention also provides a complex obtained by linking an antibody to integrin α3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a cytokine with an intermediate support.
本発明はまた、 イ ンテグリ ン 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片とイ ンタ一ロイ キ ン- 2 (IL-2) 、 腫瘍壊死因子 ( TNF-ひ ） 、 イ ンタ一フ ヱ ロ ン （IFN ) とを中間支持体により連結し て成る複合体を提供する。  The present invention also relates to an antibody against integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability, and interleukin-2 (IL-2), tumor necrosis factor (TNF-H), interferon. (IFN) and an intermediate support to provide a complex.
本発明はまた、 イ ンテグリ ン 3 に対する抗体又は抗原結合能を 有するその断片と ジフテ リ ア トキンシ ン Α 鎖 （Diphtheria toxin A) 、 シユー ドモナスエン ド 卜キシ ン ( Pseudomonas endotoxin) 、 リ シ ン A 鎖 （Ricin A chain ) 、 無糖鎖リ シ ン A 鎖 （Deglycos y lated ricin A chain ) 、 アブリ ン A 鎖 (Abr in A chain) 、 ゲロニン （Gelonin ) 、 ポークウィ ー ド抗ウ ィ ルス蛋白 （PAP-s ； Pokeweed anti -viral protein from seeds) 、 フ リ オ ジ ン ( B i r iodin) 、 サボリ ン （Saporin ) 、 モモルジ ン （Momordin) 、 モモ ルコキ ン （Momorcochin ) 、 ジア ン シ ン 32 (Dianthin 32) 、 ジァ ンシ ン 30 (Dianthin 30) 、 モデッ シ ン （Modeccin) 、 ビスカ ミ ン ( Vi scumin) 、 ボノレケシ ン (Volkes in) 、 ドデカ ン ド リ ン ( Dodeca ndrin ) 、 ト リ チ ン （Tri tin) 、 ルフ ィ ン （Luff in) 又は ト リ コキ リ ン （Trichokirin ) とを中間支持体により連結して成る複合体を 提供する。  The present invention also relates to an antibody to integrin 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a diphtheria toxin Α chain (Diphtheria toxin A), a Pseudomonas endotoxin, a ricin A chain ( Ricin A chain), deglycosylated ricin A chain, abrin A chain (Abrin A chain), gelonin (Gelonin), pork weed antiviral protein (PAP-s Pokeweed anti-viral protein from seeds), fluoridin (Biriodin), saborin (Saporin), momordin (Momordin), momolcokin (Momorcochin), dianthin 32 (Dianthin 32), Dianthin 30, Modeccin, Viscumin, Volkes in, Dodeca ndrin, Tri tin , Luff in or Trico The present invention provides a complex formed by linking Lin (Trichokirin) with an intermediate support.
本発明はまた、 上記に記載した複合体を含んで成る医薬組成物を 提供する。  The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a conjugate as described above.
本発明はまた、 上記に記載した複合体を含んで成る抗腫瘍作用を 有する医薬組成物を提供する。 本発明はさ らに、 上記に記載した複合体を含んで成る診断用組成 物を提供する。 図面の簡単な説明 The present invention also provides a pharmaceutical composition having an antitumor effect comprising the conjugate described above. The present invention further provides a diagnostic composition comprising a conjugate as described above. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1 は、 培養細胞株 0 N S - 7 6 の 0. 5 % T w e e n 2 0可溶 化画分を O N S— M 2 1 抗体ァフ ィ 二ティ ーカ ラ ム ク ロマ ト グラ フ ィ 一で濃縮 （ 2回） 後の S D S — P A G E ( 0. 9 %、 銀染色） に かけた結果を示す電気泳動図である。  Figure 1 shows the 0.5% Tween 20 solubilized fraction of the cultured cell line 0 NS-76 by the ONS-M21 antibody affinity chromatography. FIG. 9 is an electrophoretogram showing the results of SDS-PAGE (0.9%, silver staining) after concentration (twice).
各レー ンの試料は以下のとおりである。  The samples of each lane are as follows.
レーン 1 、 マーカ一  Lane 1, marker 1
レ ン 2 O N S — 7 6可溶化濃縮液 （サ ンプル）  Ren 2 ONS — 7 6 Solubilized concentrate (sample)
レ ン 3 サンプルがはいっていたチューブの洗浄液  Wash solution for the tube containing the sample
レ ン 4 マ一カー  Ren 4 Marker
レ ン 5 マ一カー  Ren 5 Marker
図 2 は、 細胞内の ' 25 1 標識 m O N S - M 2 i 抗体量を示すグラ フである。 表示は平均値土 S Dで示してある。 2, '25 1-labeled m ONS intracellular - a graph showing the M 2 i antibody amount. The display is shown as average soil SD.
図 3 は、 反応生成物および画分 Aを S D S—ポ リ アク リルア ミ ド ゲル電気泳動 （ 4 一 1 5 %グラ ジェン ト ゲル） （Pharmacia Biotech 製） 後、 クマシ一プリ リ アン トブル一 G 2 5 0 にて染色したゲルで ある。 各レー ンの試料は左から以下の通りである。  Figure 3 shows that the reaction product and Fraction A were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (415% gradient gel) (Pharmacia Biotech), followed by Coomassie-Prigliant-G2. Gel stained at 50. The samples of each lane are as follows from left.
レ - - ン 1 ， 6 ； 分子量マー力一  Rain-1,6; molecular weight
レ - - ン 2 ； ィムノ トキシンゲル濾過画分 A  Rayn-2, imnotoxin gel filtration fraction A
レ - - ン 3 ； ィ ムノ トキ シ ンゲル濾過前  --3; before imnotoxin gel filtration
レ - - ン 4 ； 0 N S - M 2 1 抗体  --4; 0 NS-M2 1 antibody
レ - - ン 5 ； リ シ ン A鎖  5-Ricin A chain
図 4 は、 0 3— 7 6細胞、 H u H— 7細胞および SW 4 8 0細 胞に対する リ シ ン A鎖の増殖抑制効果を示すグラ フである。 図 5 は、 O N S — 7 6細胞、 1^ 11 1ー 7細胞ぉょび 3 4 8 0細 胞に対するィ ムノ トキシ ンの増殖抑制効果を示すグラ フである。 FIG. 4 is a graph showing the effect of inhibiting the growth of ricin A chain on 03-76 cells, HuH-7 cells, and SW480 cells. FIG. 5 is a graph showing the effect of immunotoxin on the growth of ONS-76 cells, 1 ^ 11 1-7 cells, and 348 cells.
図 6 は、 ラ ビッ ト抗イ ンテグリ ン α 3抗体を用いたウェスタ ン ' プロ ッティ ングを示す電気泳動図である。  FIG. 6 is an electrophoretogram showing Western 'plotting using a rabbit anti-integrin α3 antibody.
レー ン 1 . 分子量マーカー （Prestained SDS- PAGE Standards, H i gh Range ； Bi o-Rad)  Lane 1. Molecular weight marker (Prestained SDS-PAGE Standards, High Range; Bio-Rad)
レー ン 2 . コ ン ト ロール （マウス O N S — M 2 1 抗体を含まない 条件下での免疫沈降物）  Lane 2. Control (Immunoprecipitate under conditions without mouse ONS-M21 antibody)
レー ン 3 . マウ ス 0 N S — M 2 1 抗体を用いた免疫沈降物 図 7 は、 0NS-76細胞に対するィムノ トキシンも しく はリ シン A 鎖 の増殖抑制効果を示すグラフである。  Immunoprecipitate using lane 3. mouse 0 NS—M 21 antibody FIG. 7 is a graph showing the effect of inhibiting the growth of imnotoxin or ricin A chain on 0NS-76 cells.
図 8 は、 HuH- 7細胞に対するィ ムノ トキシ ンも し く は リ シン A 鎖 の増殖抑制効果を示すグラ フである。  FIG. 8 is a graph showing the effect of suppressing the growth of imotoxin or ricin A chain on HuH-7 cells.
図 9 は、 DNRィ ムノ コ ンジュゲー トの Sephacryl S200 HR 16/60 カ ラム ク ロマ ト グラフ ィ ーの溶出結果を示すグラ フである。  FIG. 9 is a graph showing the elution result of Sephacryl S200 HR 16/60 column chromatograph of DNR Immuno Conjugate.
図 1 0 は、 0NS-76細胞に対するィムノ コ ン ジユゲー 卜 も しく は DN R の増殖抑制効果を示すグラ フである。  FIG. 10 is a graph showing the growth inhibitory effect of imnoconjugate or DNR on 0NS-76 cells.
図 1 1 は、 HuH- 7細胞に対するィムノ コ ン ジ ュゲー ト も しく は DN R の増殖抑制効果を示すグラフである。 発明の実施の形態  FIG. 11 is a graph showing the growth inhibitory effect of imno-conjugate or DNR on HuH-7 cells. Embodiment of the Invention
本発明において、 ィムノ トキシンとは抗ィ ンテグリ ン a 3抗体又 は抗原結合能を有するその断片と トキシ ンとを連結して成る複合体 を意味する。 また、 化学療法剤ィムノ コ ン ジュゲー ト とは抗イ ンテ グリ ン 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤とを 連結して成る複合体を意味する。 これらの複合体において、 抗イ ン テグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシン又は 化学療法剤とは、 それら自体が有する連結基、 リ ンカ一、 中間支持 体又はそれらの組み合わせにより連結される。 In the present invention, imnotoxin means a complex formed by linking an anti-integrin a3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability to toxin. The chemotherapeutic agent immunoconjugate means a complex formed by linking an anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent. In these complexes, an anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and toxin or The chemotherapeutic agent is linked by a linking group, a linker, an intermediate support, or a combination thereof, which has itself.
リ ンカ一とは、 抗体又は抗原結合能を有するその断片と化学療法 剤または トキシンとを各々相互に連結させる際に用いられる連結分 子を意味する。 リ ンカーにより抗体又は抗原結合能を有するその断 片と化学療法剤または トキシ ンとを連結させる際に、 一分子の リ ン 力一を用いるだけではなく 、 複数の同種または異種の リ ンカ一を使 用 してもよい。  The linker means a linking molecule used for linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with a chemotherapeutic agent or a toxin. When linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability to a chemotherapeutic agent or toxin using a linker, not only a single molecule of linker but also a plurality of same or different linkers can be used. May be used.
中間支持体とは、 抗体又は抗原結合能を有するその断片と複数の 化学療法剤または複数の トキシンとを一度に結合して担持しう る リ ンカ一またはリ ンカ一以外の分子を意味する。 中間支持体により抗 体又は抗原結合能を有するその断片と複数の化学療法剤または複数 の トキシンとを連結させる際に、 リ ンカ一を使用してもよい。  The term “intermediate support” means a linker or a molecule other than a linker capable of binding and carrying an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a plurality of chemotherapeutic agents or a plurality of toxins at once. A linker may be used in linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with an intermediate support to a plurality of chemotherapeutic agents or a plurality of toxins.
本発明において使用される抗イ ンテグリ ン 3抗体に対する抗原 は、 前記のごと く すでに知られている。 本発明者らは、 ヒ ト髄芽腫 由来の細胞株 O N S— 7 6 に対するマウスモノ ク ローナル抗体 （0 N S— M 2 1 抗体） の抗原を特定すべく検討した結果、 該抗原は次 の性質を有するこ とを見出した。  The antigen against the anti-integrin 3 antibody used in the present invention is already known as described above. The present inventors studied to identify the antigen of a mouse monoclonal antibody (0NS-M21 antibody) against human medulloblastoma-derived cell line ONS-76. As a result, the antigen had the following properties: Was found to have
( 1 ) S D S—ポリ アク リルア ミ ドゲル電気泳動法により測定し た分子量が約 1 4 0 kDa である ；  (1) the molecular weight is about 140 kDa as measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis;
( ) ァ ミ ノ末端ァ ミ ノ酸配列が Phe Asn Leu Asp Thr Arg Phe Leu V l Val Lys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaaは特 定されず） （配列番号 ： 1 ) である ；  () Amino terminal amino acid sequence is Phe Asn Leu Asp Thr Arg Phe Leu Vl Val Lys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaa is not specified) (SEQ ID NO: 1);
( 3 ) 内部に次のア ミ ノ酸配列を含有する ：  (3) Contains the following amino acid sequence:
① Asn lie Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His His He lie Gl u Asp (配列番号 ： 2 )  ① Asn lie Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His His Helie Glu Asp (SEQ ID NO: 2)
② Asp Asn Leu Arg Asp Lys Leu Arg Pro lie lie lie Ser ( 配列番号 ： 3 ) ② Asp Asn Leu Arg Asp Lys Leu Arg Pro lie lie lie Ser ( SEQ ID NO: 3)
③ Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg (配列番号 ： 4 )  ③ Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg (SEQ ID NO: 4)
④ Val Asn His Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gly Thr Val ( 配列番号 ： 5 )  ④ Val Asn His Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gly Thr Val (SEQ ID NO: 5)
⑤ Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Ph e Gin Val Gly Pro (配列番号 ： 6 ) ；  ⑤ Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Ph e Gin Val Gly Pro (SEQ ID NO: 6);
を有する。 Having.
実験の詳細は実験例 1 に記載する。 部分ア ミ ノ酸配列についての 情報を含めて、 上記の性質から、 O N S— M 2 1抗体の抗原がイ ン テグリ ン 3であるこ とが推定された。  Details of the experiment are described in Experimental Example 1. From the above properties, including the information on the partial amino acid sequence, it was presumed that the antigen of the ONS-M21 antibody was integrin 3.
本発明に使用される抗イ ンテグリ ン α 3抗体を得るための抗原と しては、 イ ンテグリ ン 3を発現している細胞でもよ く 、 また、 そ のような細胞から精製又は半精製イ ンテグリ ン 3蛋白質でもよい 。 この様な細胞と しては、 例えば従来技術の項に前記した種々の細 胞株を使用するこ とができる。 本発明においてはヒ ト髄芽腫由来細 胞 O N S— 7 6株、 及びこれに対して生成した抗体 0 N S— Μ 2 1 について具体的に記載する。  The antigen for obtaining the anti-integrin α3 antibody used in the present invention may be a cell expressing integrin 3 or a purified or semi-purified antibody from such a cell. Integrin 3 protein may be used. As such cells, for example, various cell lines described in the section of the prior art can be used. The present invention specifically describes the human medulloblastoma-derived cell strain ONS-76 and the antibody 0NS- S21 generated against it.
本発明に使用される抗体は、 ポ リ ク ロ一ナル抗体でも、 モノ ク ロ ーナル抗体でもよいが、 特にモノ ク ローナル抗体が好ま しい。  The antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a monoclonal antibody is particularly preferred.
モノ ク ローナル抗体は、 基本的には公知技術を使用 し、 以下のよ うにして作成できる。 すなわちイ ンテグリ ン 3 も し く はイ ンテグ リ ン α 3発現細胞、 例えばヒ ト髄芽腫由来細胞 O N S— 7 6株を感 作抗原と して使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し 、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細胞と融 合させ、 通常のスク リ ーニング法により、 モノ ク ローナルな抗体産 生細胞をスク リ ーニングするこ とによって作成できる。  A monoclonal antibody can be basically produced using a known technique as follows. That is, cells expressing integrin 3 or integrin α3, such as human medulloblastoma-derived ONS-76 strain, are used as a sensitizing antigen, and are used in accordance with the usual immunization method. Immunized, the resulting immune cells are fused with known parent cells by a conventional cell fusion method, and screened for by using a conventional screening method to screen monoclonal antibody-producing cells. it can.
また、 イ ンテグリ ン α 3 ポ リペプチ ドを感作抗原と して用いる場 合、 ヒ トイ ンテグリ ン α 3 ポ リペプチ ドが好ま しい。 ヒ トイ ンテグ リ ン 3 ポリぺプチ ドのァ ミ ノ酸配列及び塩基配列を配列番号 7 に 示す。 ヒ トイ ンテグリ ン 3 ポリペプチ ドのア ミ ノ酸配列において 、 Ν 末端の Met より N 末端から 3 2番目の Ala まではシグナルぺプ チ ドであり、 ヒ トイ ンテグリ ン α 3が成熟ポ リペプチ ドと して産生 される際に切断される。 In addition, when integrin α3 polypeptide is used as a sensitizing antigen, In this case, hytointegrin α3 polypeptide is preferred. SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence and base sequence of the human integrin 3 polypeptide. In the amino acid sequence of the human integrin 3 polypeptide, the signal peptide extends from the N-terminal to the 32nd Ala from the et-terminal Met, and the human integrin α3 is the mature polypeptide. It is cut when it is produced.
感作抗原と して使用されるイ ンテグリ ン α 3 ポ リペプチ ドは、 そ の目的を達する限り 1 または複数個のア ミ ノ酸残基の変異、 置換、 欠失、 挿入又は付加があってよい。 複数個とは、 例えば 1 、 2、 3 、 4、 5、 6、 7、 8 又は 9 の中から選ぶことができる。  Integrin α3 polypeptide used as a sensitizing antigen has mutations, substitutions, deletions, insertions or additions of one or more amino acid residues as long as the purpose is achieved. Good. The plurality can be selected from, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9.
感作抗原で免疫される哺乳動物と しては、 特に限定される もので はないが、 細胞融合に作用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ま し く 、 一般的にはマウス、 ラ ッ ト、 ハムスター、 ゥサギ 等が使用される。  The mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with a parent cell acting on cell fusion, and is generally used. For this, mice, rats, hamsters, egrets, etc. are used.
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物に腹腔内また は、 皮下に注射するこ とにより行われる。 具体的には、 感作抗原を P B S (Phosphate- Buffered Saline) や生理食塩水等で適当量に希 釈、 懸濁したものを所望により通常のア ジュバン ト、 例えば、 フロ イ ン ト完全アジュバン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4 一 2 1 日毎に数回投与するのが好ま しい。 また、 感作抗原免疫時に適当 な担体を使用することができる。  Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method. For example, a common method is to inject a sensitizing antigen into a mammal intraperitoneally or subcutaneously. Specifically, the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, or the like, and then suspended in a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired. After emulsification, it is preferable to administer several times every 421 days to mammals. In addition, a suitable carrier can be used at the time of immunization with the sensitizing antigen.
このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付さ れるが、 好ま しい免疫細胞と しては、 特に脾細胞が挙げられる。 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物の ミ エ 口一マ細胞は、 すでに、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P 3 ( P 3 x 6 3 A g 8. 6 5 3 )(J. Immunol. 123 ： 1548, 1978) , p 3 — U 1 (Current Topics in Micro-biology and Immunology 81 ： 1-7 , 1978) ， N S— 1 (Eur. J. Immunol. 6 ： 511-519, 1976) , N P C一 1 1 (Cell, 8 ： 405-415, 1976) ， S P 2 / 0 (Nature, 276 ： 269-270, 1978) , F 0 (J. Immunol. Meth. 35 ： 1-21, 1980) ， S 1 9 4 ( J. Exp. Med. 148 ： 313-323, 1978) , R 2 1 0 (Nature, 277 ： 131-133, 1979) 等が好適に使用される。 After immunization in this way and confirming that the level of the desired antibody in the serum increases, immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion. Preferred immune cells are particularly preferred. Splenocytes. The mammalian myeloid cells as the other parent cells fused with the immune cells are already known cell lines such as P 3 (P 3 x63Ag8.6653) (J. Immunol. 123: 1548, 1978), p3—U1 (Current Topics in Micro-biology and Immunology 81: 1-7, 1978), NS-1 ( Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976), NPC-11 (Cell, 8: 405-415, 1976), SP 2/0 (Nature, 276: 269-270, 1978), F0 ( J. Immunol. Meth. 35: 1-21, 1980), S194 (J. Exp. Med. 148: 313-323, 1978), R210 (Nature, 277: 131-133, 1979) Etc. are preferably used.
前記免疫細胞と ミエローマ細胞との細胞融合は基本的には公知の 方法、 たとえば、 ミ ルスティ ンらの方法 （Milsteinら、 Methods En zymol. 73 ： 3-46, 1981) 等に準じて行う こ とができる。  Cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed according to a known method, for example, the method of Milstein et al. (Milstein et al., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). Can be.
より具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤と しては例えば 、 ポリエチレングリ コール （P E G) 、 センダイウ ィ ルス （ H V J ) 等が使用され、 更に所望により融合効率を高めるためにジメ チル スルホキシ ド等の補助剤を添加使用すること もできる。  More specifically, the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture in the presence of a cell fusion promoter. As the fusion promoter, for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be added and used to enhance the fusion efficiency. it can.
免疫細胞と ミ エローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミ エローマ 細胞に対して免疫細胞を 1 〜 1 0倍とするのが好ま しい。 前記細胞 融合に用いる培養液と しては、 例えば、 前記ミ エ口一マ細胞株の增 殖に好適な R PM I 1 6 4 0培養液、 MEM培養液、 その他、 この 種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに 、 牛胎児血清 （ F C S ) 等の血清補液を併用すること もできる。 細胞融合は、 前記免疫細胞と ミ エ口一マ細胞との所定量を前記培 養液中でよ く混合し、 予め、 3 7 °C程度に加温した P E G溶液、 例 えば、 平均分子量 1 0 0 0 — 6 0 0 0程度の P E G溶液を通常、 3 0 - 6 0 % (w/ V ) の濃度で添加し、 混合するこ とによって目的 とする融合細胞 （ハイプリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な 培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すこ と によりハイプリ ドーマの生育に好ま し く ない細胞融合剤等を除去で きる。 The ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells is, for example, preferably 1 to 10 times the number of the immune cells to the myeloma cells. Examples of the culture medium used for the cell fusion include RPMI 164 culture medium, MEM culture medium, and other suitable cell cultures for growing the Mie cell line, and other cell cultures of this type. The usual culture solution used can be used, and a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination. In the cell fusion, a predetermined amount of the immunocytes and Mie cells is mixed well in the culture medium, and a PEG solution previously heated to about 37 ° C, for example, having an average molecular weight of 1 Normally, a fusion cell (hybridoma) is formed by adding a PEG solution of about 0000-6000 at a concentration of 30-600% (w / V) and mixing. . Subsequently, the procedure of adding the appropriate culture medium sequentially and centrifuging to remove the supernatant is repeated. As a result, it is possible to remove cell fusion agents and the like that are not preferred for the growth of hybridomas.
当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 H A T培養 液 （ヒポキサンチン、 ア ミ ノ プテリ ンおよびチ ミ ジ ンを含む培養液 ) で培養することにより選択される。 当該 H A T培養液での培養は 、 目的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅する のに十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界 希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのス ク リ 一ニングおよびク ローニングが行われる。  The hybridoma is selected by culturing it in an ordinary selective culture medium, for example, an HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). The cultivation in the HAT culture solution is continued for a period of time sufficient to kill cells other than the target hybridoma (non-fused cells), usually several days to several weeks. Then, screening and cloning of the hybridoma producing the desired antibody are performed by the usual limiting dilution method.
また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球を in vi troで所望の抗原蛋白質または抗原発 現細胞で感作し、 感作 B リ ンパ球をヒ ト ミ エロ一マ細胞、 例えば U2 66と融合させ、 特定の抗原または抗原発現細胞への結合活性を有す る所望のヒ ト抗体を得ること もできる （特公平卜 59878 参照） 。 さ らに、 ヒ ト抗体遺伝子のレバー ト リ一を有する ト ラ ンスジヱニッ ク 動物に抗原または抗原発現細胞を投与し、 前述の方法に従い所望の ヒ ト抗体を取得してもよい （国際特許出願公開番号 W0 93-12227 、 W0 92-03918 、 W0 94-02602 、 W0 94-25585 、 W0 96-34096 、 W0 9 6-33735 、 米国特許番号 US 5545806参照） 。  In addition to immunizing an animal other than a human with an antigen to obtain the above-mentioned hybridoma, sensitizing a human lymphocyte in vitro with a desired antigen protein or an antigen-expressing cell in vitro, It is also possible to obtain a desired human antibody having an activity of binding to a specific antigen or an antigen-expressing cell by fusing an immunoglobulin with a human myeloma cell, for example, U266 (see Japanese Patent Publication No. 59878). . Furthermore, the antigen or antigen-expressing cells may be administered to a transgenic animal having a human antibody gene liver tree to obtain a desired human antibody according to the method described above (see International Patent Application Publication). Nos. W093-12227, W092-03918, W094-02602, W094-25585, W096-34096, W096-33735, U.S. Pat.No. 5,545,806).
このようにして作製されるモノ ク ローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存するこ とが可能である。  The hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture medium, and can be stored for a long time in liquid nitrogen. is there.
当該ハイプリ ドーマからモノ ク ローナル抗体を取得するには、 当 該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。 To obtain a monoclonal antibody from the hybridoma, a method of culturing the hybridoma according to an ordinary method and obtaining the culture supernatant, or transferring the hybridoma to a mammal compatible therewith A method of administering the substance, growing it, and obtaining it as ascites is employed. The former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method Their method is suitable for mass production of antibodies.
なお、 マウス ONS- M21 抗体産生ハイプリ ドーマは、 IF0 50382と して （財） 発酵研究所 （大阪府大阪市淀川区十三本町 2- 17- 85 ) に 寄託されている。 この 0NS-M21 抗体産生ハイプリ ドーマを BALB/cマ ウス （日本ク レア製） の腹腔内に注入して腹水を得、 この腹水から 0NS-M21 抗体を精製する方法や、 本ハイプリ ドーマを適当な培地、 例えば 1 0 %ゥ シ胎児血清、 5 %BM-Condimed HI (Boehringer Man nheim 製） 含有 RPMI 1640培地、 ハイプリ ドーマ SFM 培地 （GIBCO- BR L 製） 、 PFHM-Π 培地 （GIBC0-BRL 製） 等で培養し、 その培養上清 から mONS-M21抗体を精製する方法で行う ことができる。  The mouse ONS-M21 antibody-producing hybridoma has been deposited with the Fermentation Research Institute (2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka, Osaka) as IF050382. The 0NS-M21 antibody-producing hybridoma is injected intraperitoneally into a BALB / c mouse (manufactured by Nippon Clear) to obtain ascites, a method for purifying the 0NS-M21 antibody from the ascites fluid, and a method using this hybridoma in an appropriate manner. Medium, for example, RPMI 1640 medium containing 10% ゥ fetal serum and 5% BM-Condimed HI (Boehringer Mannheim), Hypri-Doma SFM medium (GIBCO-BRL), PFHM- 培 地 medium (GIBC0-BRL) And purifying the mONS-M21 antibody from the culture supernatant.
ハイプリ ドーマを作製して抗体を産生させる他に、 所望の抗体を 産生する免疫細胞、 例えば感作リ ンパ球等を癌遺伝子 （oncogene) により不死化させた細胞を用いて抗体を得てもよい。  In addition to producing a hybridoma and producing an antibody, an antibody may be obtained using an immune cell producing the desired antibody, for example, a cell obtained by immortalizing a sensitized lymphocyte or the like with an oncogene (oncogene). .
本発明には、 モノ ク ローナル抗体と して、 抗体遺伝子を抗体産生 細胞、 例えばハイプリ ドーマからク ローニングし、 適当なベクター に組み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産 生させた組換え型抗体を用いるこ とができる （例えば、 Carl, A. K . Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTI BODIES, Published in the Uni ted Kingdom by MAC ILLAN PUBLISH ERS LTD, 1990 参照） 。  In the present invention, as a monoclonal antibody, an antibody gene is cloned from an antibody-producing cell, for example, a hybridoma, inserted into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using a genetic recombination technique. Recombinant antibodies produced can be used (see, for example, Carl, A.K. ).
具体的には、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマや抗体を 産生する免疫細胞、 例えば感作リ ンパ球等を癌遺伝子 （oncogene) 等により不死化させた細胞から、 抗体の可変領域 （V 領域） をコー ドする! nRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァ 二ジン超遠心法 （Chirgwin, J. M. ら、 Biochemistry (1979) 18， 5294-5299 ) 、 AGPC法 （Chmczynski, P. ら、 （1987) 162， 156-159 ) 等により全 RNA を調製し、 mRNA Purif ication Kit (Pharmacia 製） 等を使用して mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purif i cation Kit (Pharmacia 製） を用いるこ とにより mRNAを直接調製す ることができる。 Specifically, the antibody variable region (V) is derived from hybridomas that produce the target antibody and immune cells that produce the antibody, for example, cells in which sensitized lymphocytes and the like have been immortalized with oncogenes. Region)! Isolate the nRNA. mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), and AGPC method (Chmczynski, P. et al., (1987) 162, 156). -159) to prepare total RNA, and use mRNA Purification Kit (Pharmacia Prepare mRNA using Also, mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V 領域の cDNAを合成す o c画の合成は、 AMV Reverse Transcriptase Firsい strand cDN A Synthesis Kit 等を用いて行う こ とができる。 また、 cDNAの合成 および增幅を行うには 5' -Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCR を用いた 5' - RACE 法 （Frohman, M. A. ら、 Proc. Natl . Acad. Sci. USA (1988) 85， 8998 - 9002 ； Belyavsky, A. ら、 Nu cleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932 ) を使用するこ とができ る。 得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を精製し、 ベク ター DNA と連結する。 さ らに、 これより組換えべク タ一を作成し、 大腸 菌等に導入してコ ロニーを選択して所望の組換えベクターを調製す る。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、 例えば、 デォキシ法 により確認する。  The cDNA of the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. The synthesis of the oc fraction can be performed using AMV Reverse Transcriptase Firs or strand cDNA DNA Kit. For cDNA synthesis and amplification, 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and 5'-RACE method using PCR (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) can be used. Purify the target DNA fragment from the obtained PCR product and ligate it to vector DNA. Furthermore, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and a colony is selected to prepare a desired recombinant vector. The base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the Doxy method.
目的とする抗体の V 領域をコ一 ドする DNA が得られれば、 これを 所望の抗体定常領域 （C 領域） をコー ドする DNA と連結し、 これを 発現べク タ一へ組み込む。 または、 抗体の V 領域をコ一 ドする DNA を、 抗体 C 領域の DNA を含む発現べク タ一へ組み込んでもよい。 本発明で使用される抗体を製造するには、 後述のように抗体遺伝 子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー プロモーターの制御の もとで発現するよう発現ベク ターに組み込む。 次に、 この発現べク タ一により宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させることができる Once the DNA encoding the V region of the desired antibody is obtained, it is ligated to the DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector. Alternatively, DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the C region of the antibody. In order to produce the antibody used in the present invention, an antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer promoter, as described later. Next, host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
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抗体遺伝子の発現は、 抗体の重鎖 （H 鎖） または軽鎖 （L 鎖） を 別々 に発現ベク ターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよい し、 あるいは H 鎖および L 鎖をコ一 ドする DNA を単一の発現べクタ 一に組み込んで宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開番 号 W0 94 /11523 参照） 。 Expression of the antibody gene may be determined by co-transforming the host by separately incorporating the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) into the expression vector, or by co-transforming the H chain and L chain. A single expression vector The host may be transformed by integration (see International Patent Application Publication No. WO 94/11523).
本発明では、 ヒ トに対する異種抗原性を低下させるこ と等を目的 と して人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメ ラ （Ch imeric) 抗体、 ヒ ト型化 （Humanized ) 抗体を使用できる。 これら の改変抗体は、 既知の方法を用いて製造することができる。  In the present invention, a recombinant antibody artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans, such as a chimeric antibody and a humanized antibody, is used. Can be used. These modified antibodies can be produced using known methods.
キメ ラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V 領域をコー ドする DN A をヒ ト抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 これを発現べク タ —に組み込んで宿主に導入し産生させるこ とにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 95 /1404 1 参照） 。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメ ラ抗体を 得るこ とができる。  Chimeric antibodies are obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above to DNA encoding the human antibody C region, incorporating the DNA into an expression vector, and introducing it into a host. (See European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. WO 95/14041). Using this known method, chimeric antibodies useful in the present invention can be obtained.
ヒ 卜型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ 卜抗体と も称され、 ヒ 卜 以外の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; compl ementar i ty determining region ) をヒ 卜抗体の CDR へ移植したも のであり、 その一般的な遺伝子組換え手法も知られている （欧州特 許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 95 /14041 参照） 。  The humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, and the complementarity determining region (CDR) of a mammalian antibody other than a human, for example, a mouse antibody, is replaced with the human antibody. It has been transplanted to CDR, and its general genetic recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. W095 / 14041).
具体的には、 マウス抗体の CDR と ヒ ト抗体のフ レームワーク領域 (FR; framework region) を連結するように設計した DNA 配列を、 末端部にオーバーラ ップする部分を有するように作製した数個のォ リ ゴヌ ク レオチ ドから PCR 法により合成する。 得られた DNA をヒ ト 抗体 C 領域をコ一 ドする DNA と連結し、 次いで発現ベク ターに組み 込んで、 これを宿主に導入し産生させるこ とにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 95 /1404 1 参照） 。  Specifically, a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was constructed to have an overlapping portion at the end. It is synthesized from several oligonucleotides by PCR. The obtained DNA is ligated to DNA encoding the C region of the human antibody, then incorporated into an expression vector, and introduced into a host to produce it (European Patent Application Publication No. EP 239400). International Patent Application Publication No. W095 / 1404 1).
CDR を介して連結される ヒ ト抗体の FRは、 CDR が良好な抗原結合 部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒ 卜抗体のFR of human antibody linked via CDR has good antigen binding to CDR Those that form the site are selected. If necessary, use reconstituted human antibodies.
CDR が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の V 領域の FRのァ ミ ノ酸を置換してもよい （Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 5 3, 851-856) o The amino acid of FR in the V region of the antibody may be substituted so that the CDR forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856). ) o
例えば、 再構成ヒ ト ONS- M21 抗体の再構成ヒ 卜し 鎖をコ一 ドする 遺伝子を含むプラス ミ ド HEF- RVい M21P- gk により形質転換された大 腸菌 Escherichia col i DH 5 α ( HEF-RVL-M21P-gk) は FERM BP- 44 72と して、 そして再構成ヒ ト ONS- M21 抗体の再構成ヒ ト H 鎖をコ一 ドする遺伝子を含むプラス ミ ド HEF- RVH-M21- g ァ 1 により形質転換 された大腸菌 Escherichia coli DH 5 a (HBF-RVH-M21-g ) は FER BP- 4471と して、 1993年 11月 18日に工業技術院生命工学工業技 術研究所 （茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 3 号） にブダペス ト条約に 基づき国際寄託されている。  For example, Escherichia coli DH5α (Escherichia coli transformed with plasmid HEF-RV or M21P-gk containing a gene encoding the reconstituted human chain of reconstituted human ONS-M21 antibody) HEF-RVL-M21P-gk) is designated as FERM BP-4472 and a plasmid HEF-RVH-M21 containing the gene encoding the reshaped human H chain of the reshaped human ONS-M21 antibody. -Escherichia coli DH5a (HBF-RVH-M21-g) transformed with g a1 was designated as FER BP-4471 on November 18, 1993 (Tsukuba, Ibaraki, 1-3-1, Higashi-cho) has been deposited internationally under the Budapest Treaty.
キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体には、 ヒ ト抗体 C 領域が使用される。 好ま しいヒ ト抗体 C 領域と しては、 C ァが挙げられ、 例えば、 C 7 1 、 C r 2 、 C r 3 および C 74 を使用するこ とができる。 また、 抗体またはその産生の安定性を改善するために、 ヒ ト抗体 C 領域を 修飾してもよい。  The human antibody C region is used for chimeric antibodies and humanized antibodies. Preferred human antibody C regions include Cα, and for example, C71, Cr2, Cr3 and C74 can be used. In addition, the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
キメ ラ抗体はヒ ト以外の哺乳動物抗体由来の V 領域と ヒ ト抗体由 来の C 領域からなり、 ヒ ト型化抗体はヒ ト以外の哺乳動物抗体由来 の CDR と ヒ ト抗体由来の FRおよび C 領域からなり、 ヒ ト体内におけ る抗原性が低下しているため、 本発明に使用される抗体と して有用 である。  Chimeric antibodies consist of a V region derived from a mammalian antibody other than human and a C region derived from a human antibody. The humanized antibody comprises CDRs derived from a mammalian antibody other than human and FRs derived from a human antibody. Since it is composed of C and C regions and has reduced antigenicity in a human body, it is useful as an antibody used in the present invention.
本発明に使用される ヒ ト型化抗体の好ま しい具体例と しては、 再 構成ヒ ト 0NS-M21 抗体が挙げられる （国際特許出願公開番号 W0 95 - 14041 参照） 。  A preferred specific example of the humanized antibody used in the present invention is a reshaped human 0NS-M21 antibody (see International Patent Application Publication No. W095-14041).
本発明で使用される抗体は、 本発明に好適に使用され得るかぎり 、 抗体断片や抗体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断片と してはThe antibody used in the present invention may be used as long as it can be suitably used in the present invention. It may be an antibody fragment or a modified antibody. For example, for an antibody fragment
、 Fab 、 F(ab' )2 、 Fvまたはシングルチヱイ ン Fv (scFv) が挙げら れる。 scFvは H鎖と L 鎖の Fvを適当な リ ンカーで連結させた構造を 有する。 また、 抗体を構成するア ミ ノ酸配列の一つまたは複数個の ア ミ ノ酸残基が変異、 置換、 欠失または挿入を受けた抗体も本発明 において抗体と して使用されう る。 , Fab, F (ab ') 2, Fv or single chain Fv (scFv). scFv has a structure in which the Fvs of the H chain and the L chain are linked by an appropriate linker. Further, an antibody in which one or more amino acid residues of the amino acid sequence constituting the antibody have undergone mutation, substitution, deletion or insertion can also be used as the antibody in the present invention.
これらの抗体断片を得るためには、 抗体を酵素、 例えば、 パパイ ン、 ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、 または、 これら抗 体断片をコー ドする遺伝子を構築し、 これを発現べク タ一に導入し た後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co， M. S. et al.， J . Immunol. (1994) 152， 2968-2976、 Better, . & Horwi tz, A. H . Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496， Academic Press, Inc. 、 Plueckthun, A. k Skerra, A. Methods in Enzymology (1 989) 178, 476-496, Academic Press, Inc. 、 Lamoy i, E.， Method s in Enzymology (1989) 121， 652-663 、 Rousseaux, J. et al. , Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669、 Bird, R. E. et a 1. , TIBTECH (1991) 9， 132-137 参照） 。  In order to obtain these antibody fragments, the antibody is treated with an enzyme such as papine or pepsin to generate the antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and expressed. After transfection into an appropriate host cell, it is expressed in a suitable host cell (eg, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better,. & Horwitz, A.H. Methods). in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. k Skerra, A. Methods in Enzymology (1 989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Lamoy i, E. , Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669, Bird, RE et a 1., TIBTECH (1991) 9, 132- 137).
scFvは、 抗体の H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域を連結するこ とにより得 られる （国際特許出願公開番号 W0 88-09344 、 W0 95-14041 参照） 。 この scFvにおいて、 H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域はリ ンカ一、 好ま し く は、 ペプチ ドリ ンカ一を介して連結される （Huston, J. S. et a l.、 Pro Natl. Acad. Sci. U. S.A. (1988) 85, 5879-5883) 。 sc Fvにおける H 鎖 V 領域および L 鎖 V 領域は、 上記抗体と して記載さ れたもののいずれの由来であってもよい。 V 領域を連結するべプチ ドリ ンカーと しては、 例えばァ ミ ノ酸 12- 19 残基からなる任意の一 本鎖ペプチ ドが用いられる （米国特許 US 5525491参照） 。  scFv can be obtained by linking the V region of the H chain and the V region of the L chain of the antibody (see International Patent Application Publication Nos. WO88-09344 and WO95-14041). In this scFv, the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). The H chain V region and L chain V region in the sc Fv may be derived from any of the antibodies described above. As the peptide linker that connects the V regions, for example, any single-chain peptide consisting of amino acid residues 12 to 19 is used (see US Pat. No. 5,554,91).
scFvをコー ドする DNA は、 前記抗体の H 鎖または、 H 鎖 V 領域を コー ドする DNA 、 および L 鎖または、 L 鎖 V 領域をコー ドする DNA を铸型と し、 それらの配列のうちの所望のァ ミ ノ酸配列をコー ドす る DNA 部分を、 その両端を規定するプライマー対を用いて PCR 法に より増幅し、 次いで、 さ らにペプチ ドリ ンカ一部分をコー ドする DN A およびその両端を各々 H 鎖、 L 鎖と連結されるよう に規定するプ ライマー対を組み合せて増幅するこ とにより得られる。 The scFv-encoding DNA comprises the H chain or H chain V region of the antibody. The type of DNA to be coded and the type of DNA coding for the L chain or the V region of the L chain are defined as type II, and the DNA portion coding for the desired amino acid sequence of the sequences is placed at both ends. Amplify by PCR using the defined primer pair, and then a DNA pair that encodes a portion of the peptide linker and a primer pair that defines both ends to be linked to the H and L chains, respectively. It is obtained by combining and amplifying.
また、 一旦 s cFvをコー ドする DNA が作製されれば、 それらを含有 する発現べク タ一、 および該発現べク タ一により形質転換された宿 主を常法に従って得ることができる。 また、 その宿主を用いて常法 に従って、 scFvを得ることができる。  Further, once DNAs encoding scFv are prepared, expression vectors containing them and hosts transformed with the expression vectors can be obtained according to a conventional method. In addition, scFv can be obtained using the host according to a conventional method.
これら抗体断片は、 前述のようにその遺伝子を取得し発現させ、 宿主により産生させることができる。 本願特許請求の範囲でいう 「 抗体」 にはこれらの抗体断片も包含される。  These antibody fragments can be produced by a host by obtaining and expressing the gene as described above. The “antibody” referred to in the claims of the present application also includes these antibody fragments.
これらの抗体断片は、 抗体分子に比べて分子量が小さいため、 生 体において組織移行性が傻れており、 抗体を同様の機能を有する分 子と して有用である。  Since these antibody fragments have a smaller molecular weight than antibody molecules, they have good tissue transfer properties in living organisms, and are useful as molecules having the same function as antibodies.
抗体修飾物と して、 ポリエチレングリ コール （PEG ) 等の各種分 子と結合した抗体を使用するこ と もできる。 抗体になされる修飾と は、 化学的結合を導入することによる修飾であってもよいし、 抗体 のァ ミ ノ酸配列になされる修飾であつてもよい。 本願特許請求の範 囲でいう 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含される。 このよう な抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に修飾を施すことによって 得るこ とができる。 これらの方法はこの分野においてすでに確立さ れている。  As the modified antibody, an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used. The modification made to the antibody may be a modification by introducing a chemical bond or a modification made to the amino acid sequence of the antibody. The “antibody” referred to in the claims of the present application also includes these modified antibodies. Such a modified antibody can be obtained by modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ 、 抗体を取得することができる。 哺乳類細胞を使用する場合、 常用 される有用なプロモーター Zェンハンサー、 発現される抗体遣伝子 、 その 3'側下流にポ リ A シグナルを機能的に結合させた DNA あるい はそれを含むベクタ一により発現させることができる。 例えばプロ モーター Zェンハンサ一と しては、 ヒ トサイ 卜メ ガロウ ィ ルス前期 プロモータ一 Zェンノヽンサ一 ( human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer ) を挙げることができる。 また、 その他 に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモータ一 Zェンハ ンサ一と して、 レ ト ロウ イ ルス、 ポ リオ一マウ ィ ルス、 アデノ ウ ィ ルス、 シ ミ アンウィ ルス 40 (SV 40 ) 等のウ ィ ルスプロモーター/ ェンハンサーゃヒ トェロ ンゲー シ ヨ ンフ ァ ク ター 1 a (HEF1 a ) な どの哺乳類細胞由来のプロモータ一ノエンハンサ一を用いればよい 例えば、 SV 40 プロモータ一/ェンハ ンサ一を使用する場合、 Mil lliganらの方法 （Nature (1979) 277, 108) 、 また、 HEF1 プロモ 一ター/ェンハンサーを使用する場合、 Mizushima らの方法 （Nucl eic Acids Res. (1990) 18， 5322) に従えば容易に実施するこ とが できる。 The antibody gene constructed as described above can be expressed by a known method to obtain an antibody. When using mammalian cells, useful promoters commonly used, Z enhancers, expressed antibody genes Alternatively, it can be expressed by DNA having a polyA signal operably linked to the 3 ′ downstream thereof or a vector containing the DNA. For example, the promoter Z enhancer may be a human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer. Other promoters that can be used for expression of the antibodies used in the present invention include letrovirus, poliovirus, adenovirus, and simian virus 40 (SV For example, a promoter / enhancer derived from a mammalian cell such as a virus promoter / enhancer, such as virus promoter 1a (HEF1a), such as SV40 promoter / enhancer, may be used. The method of Millligan et al. (Nature (1979) 277, 108), and the method of Mizushima et al. (Nucl eic Acids Res. (1990) 18, 5322) when HEF1 promoter / enhancer is used. It can be easily implemented if you follow.
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモーター、 抗体分泌のため のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させるこ とができる。 例えばプロモーターと しては、 lacZプロモ一 ター、 araBプロモーターを挙げるこ とができる。 lacZプロモーター を使用する場合、 Wardらの方法 （Nature (1098) 341， 544-546 ； FA SEB J. (1992) 6， 2422-2427) 、 araBプロモーターを使用する場合 、 Betterらの方法 （Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従えばよ い。  In the case of Escherichia coli, expression can be performed by operably linking a useful promoter commonly used, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed. For example, examples of the promoter include a lacZ promoter and an araB promoter. When using the lacZ promoter, the method of Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FA SEB J. (1992) 6, 2422-2427), and when using the araB promoter, the method of Better et al. (Science ( 1988) 240, 1041-1043).
抗体分泌のためのシグナル配列と しては、 大腸菌のペリ ブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. et al J. Bact eriol. (1987) 169, 4379 ) を使用すればよい。 ペリ ブラズムに産 生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切にリ フ ォ ール ド （re fold) して使用する （例えば、 国際特許出願公開番号 W096-30394、 日本特許出願公告特公平 7- 93879 を参照） 。 As a signal sequence for antibody secretion, a pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when E. coli is produced in the periplasm. Born in periplasm After separating the produced antibody, the antibody structure is appropriately refolded and used (for example, International Patent Application Publication No. W096-30394, Japanese Patent Application Publication No. 7-93879). See).
複製起源と しては、 SV 40 、 ポリ オ一マウィ ルス、 アデノ ウ ィ ル ス、 ゥシパピローマウ ィ ルス （BPV ) 等の由来のものを用いること ができる。 さ らに、 宿主細胞系で遺伝子コ ピー数増幅のため、 発現 ベクタ一は選択マーカーと して、 ア ミ ノ グリ コ シ ド ト ラ ンスフ ヱ ラ ーゼ （APH ) 遺伝子、 チ ミ ジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサ ンチングァニンホスホ リ ボシル トラ ンスフ ェラ一ゼ （ Ecogpt) 遺伝 子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むこ とができる。 本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す る ことができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in v ivo の産生系がある。 in vitroの産生系と しては、 真核細胞を使用 する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。  As the origin of replication, those derived from SV40, poliovirus, adenovirus, sipapipillomavirus (BPV) and the like can be used. In addition, for the purpose of amplifying the number of gene copies in the host cell system, the expression vector is used as a selectable marker, such as the aminoglycoside trans- ferase (APH) gene, thymidine kinase ( TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphorolibosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene, and the like. For the production of the antibodies used in the present invention, any production system can be used. Production systems for producing antibodies include in vitro and in vivo production systems. Examples of the in vitro production system include a production system using eukaryotic cells and a production system using prokaryotic cells.
真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を用い る産生系がある。 動物細胞と しては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945) 、 COS 、 ミ エローマ、 BHK (ba by hamster kidney ) 、 HeLa、 Vero、 (2) 両生類細胞、 例えばァフ リ カツメ ガエル卵母細胞 （Valle, et al. , Nature (1981) 291, 35 8-340 ) 、 あるいは（3) 昆虫細胞、 例えば sf9 、 sf2K Tn5 が知ら れている。 CH0 細胞と しては、 特に DHFR遺伝子を欠損した CH0 細胞 である dhfr- CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4 220 ) や CHO K-l (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275 ) を好適に使用するこ とができる。  When eukaryotic cells are used, there are production systems using animal cells, plant cells, and fungal cells. Examples of animal cells include (1) mammalian cells such as CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, myeloma, BHK (ba by hamster kidney), HeLa, Vero, (2) Amphibian cells, for example, African frog frog oocytes (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), or (3) insect cells, for example, sf9 and sf2K Tn5 are known. The CH0 cells include dhfr-CHO (Proc. Natl.Acad.Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) and CHO Kl (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) can be suitably used.
植物細胞と しては、 Nicotiana tabacum 由来の細胞が知られてお り、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞と しては、 酵母、 例え ばサッカロ ミ セス （ Saccharomyces ) 属、 例えばサッ カロ ミ セス ' セ レビシェ ( Saccharomyces cerevi s iae) 、 糸状菌、 例えばァスぺ ルギウ ス属 （Aspergillus ) 属、 例えばァスペルギウ ス · 二ガー （ Aspergillus niger ) など力く知られている。 As plant cells, cells derived from Nicotiana tabacum are known, which may be callus cultured. Fungal cells include yeast, for example, the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces ′ Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi such as Aspergillus, such as Aspergillus niger are well known.
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌 （E. coli ) 、 枯草菌が知られている。  When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells. Escherichia coli (E. coli) and Bacillus subtilis are known as bacterial cells.
これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し 、 形質転換された細胞を in vitroで培養することにより抗体が得ら れる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液と して、 DM EM. MEM 、 RPMI1640. 1MDMを使用することができる。 その際、 牛胎 児血清 （FCS ) 等の血清補液を併用するこ と もできる し、 無血清培 養してもよい。 また、 抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ 移すことにより、 in vivo にて抗体を産生してもよい。  An antibody is obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM.MEM and RPMI1640.1MDM can be used as a culture solution. At that time, a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed. In addition, antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced into the peritoneal cavity or the like of the animal.
一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物または植物に抗体遺 伝子を導入し、 動物または植物の体内で抗体を産生させ、 回収する o  On the other hand, examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants. Introduce the antibody gene into these animals or plants, and produce and recover antibodies in the animals or plants.o
動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥ シを用い ることができる （Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Appl ica tions, 1993 ) 。 また、 哺乳類動物を用いる場合、 ト ラ ンスジヱニ ッ ク動物を用いることができる。  When using animals, there are production systems using mammals and insects. Goats, pigs, sheep, mice, and mice can be used as mammals (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When using mammals, transgenic animals can be used.
例えば、 抗体遺伝子をャギ カゼィ ンのような乳汁中に固有に産 生される蛋白質をコー ドする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子と して調製する。 抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA 断片 をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受容した ャギから生まれる トラ ンスジエニッ クャギまたはその子孫が産生す る乳汁から所望の抗体を得る。 ト ラ ンスジエニッ クャギから産生さ れる所望の抗体を含む乳汁量を增加させるために、 適宜ホルモ ンを トラ ンスジエニッ クャギに使用 してもよい。 （Ebert, M. et al. ， Bio/Technology (1994) 12， 699-702 ) 。 For example, the antibody gene is prepared as a fusion gene by inserting it into the middle of a gene encoding a protein that is uniquely produced in milk, such as goat casein. A DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat. The desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic rat or the progeny of the goat that has received the embryo. Produced from transgenic fish Hormones may be used in the transgenic fish as appropriate to increase the amount of milk containing the desired antibody. (Ebert, M. et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
また、 昆虫と しては、 例えばカイ コを用いるこ とができる。 カイ コを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を挿入したバキュ ロウィ ルスを カイ コに感染させ、 このカイ コの体液より所望の抗体を得る （Susu mu, M. et al.， Nature (1985) 315, 592-594 ) 。  In addition, silkworms can be used as insects, for example. When using a silkworm, the baculovirus into which the antibody gene of interest is inserted is infected to the silkworm, and a desired antibody is obtained from a body fluid of the silkworm (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).
さ らに植物を使用する場合、 例えばタバコを用いるこ とができる 。 タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、 例えば pMON 530に揷入し、 このベク ターを Agrobacterium tumefaci ens のような ノ 'クテリ アに導入する。 このノく クテ リ アをタバコ、 例 えば Nicotiana tabacum に感染させ、 本タバコの葉より所望の抗体 を得る （Julian, K. -C. Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138) o  When using plants, for example, tobacco can be used. When tobacco is used, the antibody gene of interest is introduced into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a vector such as Agrobacterium tumefaciens. Infect this tobacco, eg, Nicotiana tabacum, to obtain the desired antibody from the leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24 , 131-138) o
上述のように in v roまたは in vivo の産生系にて抗体を産生す る場合、 抗体の H 鎖または L 鎖をコー ドする DNA を別々 に発現べク ターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよい し、 あるいは H 鎖および L 鎖をコ一 ドする DMA を単一の発現ベク ターに組み込んで 、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開番号 W0 94-1152 3 参照） 。  As described above, when producing an antibody in an in vitro or in vivo production system, the DNA encoding the H or L chain of the antibody is separately incorporated into an expression vector, and the host is co-transformed. Alternatively, the host may be transformed by incorporating DMA encoding the H chain and the L chain into a single expression vector (see International Patent Application Publication No. WO094-11523).
宿主への発現ベクターの導入方法と しては、 公知の方法、 例えば リ ン酸カルシウム法 （Virology (1973) 52, 456-467 ) やエレク ト ロボレ一シヨ ン法 （EMBO J. (1982) 1, 841- 845 ) 等が用いられる o  Examples of a method for introducing an expression vector into a host include known methods, for example, the calcium phosphate method (Virology (1973) 52, 456-467) and the electroporation method (EMBO J. (1982) 1 , 841-845) etc. are used o
前記のように産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製するこ とができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製は、 通常の蛋白質の精製で使用されている分離、 精製方法 を使用すればよ く 、 何ら限定されるものではない。 例えば、 ァフ ィ 二ティ 一ク ロマ トグラフ ィ ー等のク ロマ ト グラフ ィ ーカラム、 フ ィ ルター、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組み合わせれば抗体 を分離、 精製することができる （Antibodies: A Laboratory anua 1. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 。 The antibody produced and expressed as described above can be separated from the host inside and outside the cell and from the host and purified to homogeneity. The separation and purification of the antibody used in the present invention is carried out by the separation and purification methods used in ordinary protein purification. The use is not limited in any way. For example, a chromatographic column such as affinity chromatography, a filter, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. can be appropriately selected and combined to separate and purify the antibody. Yes (Antibodies: A Laboratory anua 1. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
ァフィ 二ティ 一ク ロマ トグラフ ィ ーに用いるカラムと しては、 例 えばプロテイ ン A カラム、 プロテイ ン G カラムが挙げられる。 プロ ティ ン A カ ラムに用いる担体と して、 例えば Hyper D 、 P0R0S 、 Se pharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。  Columns used for affinity chromatography include, for example, a protein A column and a protein G column. Examples of the carrier used for the Protein A column include Hyper D, P0R0S, Sepharose FF (Pharmacia) and the like.
ァフ ィ 二ティ ーク ロマ ト グラフ ィ 一以外のク ロマ ト グラフ ィ 一と しては、 例えばイオン交換ク ロマ トグラフ ィ ー、 疎水性ク ロマ ト グ ラ フ ィ ー、 ゲル濾過、 逆相ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 吸着ク ロマ ト グラ フ ィ 一等が挙げられる (Strategies for Protein Purification an d Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak e t al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) これらのク ロマ ト グラフィ ーは、 液相ク ロマ トグラフ ィ ー、 例え ば HPLC、 FPLC等の液相ク ロマ トグラフ ィ ーを用いて行う ことができ 得られた抗体の濃度測定は、 吸光度の測定または酵素結合免疫吸 着検定法 ( enzyme- 1 inked immunosorbent assay； ELISA) 等により 行う こ とができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合には、 得ら れた抗体を PBS で適当に希釈した後、 280 nmの吸光度を測定する。 例えば、 ヒ ト抗体の場合、 1 mg/ml を 1.35 0D と して算出すればよ い。  Chromatography other than affinity chromatography includes, for example, ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and reversed-phase chromatography. Chromatography, adsorption chromatography, etc. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 ) These chromatographies can be performed using liquid chromatography, for example, liquid chromatography such as HPLC, FPLC, etc. It can be performed by measurement or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or the like. That is, when the absorbance is measured, the obtained antibody is appropriately diluted with PBS, and then the absorbance at 280 nm is measured. For example, in the case of a human antibody, 1 mg / ml should be calculated as 1.350D.
また、 ELISA による場合は以下のように測定するこ とができる。 すなわち、 0.1M 重炭酸緩衝液 （pH9.6 ) で 1 g/ml に希釈した ャギ抗ヒ 卜 IgG (TAG0製） 100 1 を 96穴プレー ト （Nunc製） に加 え、 4 °Cで一晩イ ンキュベー ト し、 抗体を固層化する。 ブロ ッキン グの後、 適宜希釈した本発明で使用される抗体または抗体を含むサ ンプル、 あるいは濃度標準品と して既知の濃度のヒ ト IgG (CAPPEL 製） 100 1 を添加し、 室温にて 1 時間イ ンキュベー トする。 In addition, in the case of using ELISA, it can be measured as follows. That is, goat anti-human IgG (manufactured by TAG0) 1001 diluted to 1 g / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well plate (manufactured by Nunc) and incubated at 4 ° C. Incubate overnight to solidify the antibody. After blocking, add appropriately diluted antibody used in the present invention or a sample containing the antibody, or human IgG (manufactured by CAPPEL) 1001 at a known concentration as a concentration standard, and add at room temperature. Incubate for 1 hour.
洗浄後、 5000倍希釈したアルカ リ フ ォ スフ ァ タ ーゼ標識抗ヒ ト Ig G (BIO SOURCE製） 100 μ, 1 を加え、 室温にて 1 時間ィ ンキュベー 卜する。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベー トの後、 MICR0PLATE READER Model 3550 (Bio-Rad 製） を用いて 405nm での吸光度を測 定し、 目的の抗体の濃度を算出する。  After washing, add 5,000-fold diluted alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG (BIO SOURCE) 100 μl, and incubate at room temperature for 1 hour. After washing, add the substrate solution and incubate. Measure the absorbance at 405 nm using MICR0PLATE READER Model 3550 (manufactured by Bio-Rad) to calculate the concentration of the target antibody.
また、 抗体の濃度測定には、 BlAcore (Pharmacia 製） を使用す ることができる。  BIAcore (Pharmacia) can be used for antibody concentration measurement.
本発明で使用される抗体の抗原結合活性の評価は、 通常知られた 方法、 例えば ELISA 、 BIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測 定法） あるいは蛍光抗体法を用いるこ とができる （Antibodies: A Laboratory Manual . Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Har bor Laboratory, 1988) 0 The antigen-binding activity of the antibody used in the present invention can be evaluated by a commonly known method, for example, ELISA, BIA (enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (radioimmunoassay) or a fluorescent antibody method ( Antibodies: A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 0
例えば、 ELISA を用いる場合、 0NS- M21抗体のイ ンテグリ ン α 3 への結合を阻害しないイ ンテグリ ン 3 に対する抗体を固相化した 96穴プレー トにィ ンテグリ ン α 3 を添加する。 あるいは、 直接ィ ン テグリ ン 3 を固相化した 96穴プレー トを用いてもよ く 、 また、 例 えば 0NS- 76細胞のようなイ ンテグリ ン 3 を細胞表面に発現してい る細胞を固相化した 96穴プレー トを用いてもよい。 次いで例えば一 定量のピオチン化した 0NS-M21 抗体と目的の 0NS- M21 抗体を含む試 料、 例えば 0NS-M21 抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を同時に加 For example, when using ELISA, integrin α3 is added to a 96-well plate on which an antibody against integrin 3 that does not inhibit the binding of the 0NS-M21 antibody to integrin α3 is immobilized. Alternatively, a 96-well plate in which integrin 3 is directly immobilized may be used, or cells expressing integrin 3 on the cell surface, such as 0NS-76 cells, may be used. A phased 96-well plate may be used. Then, for example, a fixed amount of a sample containing a biotinylated 0NS-M21 antibody and a target 0NS-M21 antibody, for example, a culture supernatant of 0NS-M21 antibody-producing cells or a purified antibody are simultaneously added.
A- ο アルカ リ フ ォスフ ァタ一ゼ等の酵素で標識したア ビジンまたはス ト レプ トァ ビジンを添加し、 プレー トをイ ンキュベー トおよび洗浄 した後、 P - ニ ト ロフ ニルリ ン酸等の酵素基質を加えて吸光度を 測定するこ とにより抗原結合活性を評価するこ とができる。 A- ο After adding avidin or streptavidin labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase, incubating and washing the plate, an enzyme substrate such as P-nitrophenylyl phosphate is added. In addition, the antigen binding activity can be evaluated by measuring the absorbance.
ヒ ト型化抗体の抗原結合活性を評価する場合には抗原を直接ある いは間接的に固相化した 96穴プレー トにヒ ト型化抗体とマウス抗体 を同時に加えて、 マウス抗体またはヒ 卜抗体のどち らかを認識し、 かつアルカ リ フ ォスフ ァタ一ゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加 し、 プレー トをイ ンキュベー トおよび洗浄した後、 p - ニ ト ロフ エ 二ルリ ン酸等の酵素基質を加えて吸光度を測定するこ とにより抗原 結合活性を評価するこ とができる。  When evaluating the antigen-binding activity of the humanized antibody, the humanized antibody and the mouse antibody are simultaneously added to a 96-well plate on which the antigen is directly or indirectly immobilized, and the mouse antibody or the human antibody is added. After addition of a secondary antibody that recognizes either of the antibodies and is labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase, the plate is incubated and washed, and then p-nitrophenic acid is added. Antigen binding activity can be evaluated by measuring the absorbance after adding an enzyme substrate such as phosphoric acid.
上記抗体の活性評価には、 BIAcore (Pharmacia 製） を使用する こ とができる。  BIAcore (Pharmacia) can be used to evaluate the activity of the above antibody.
本発明において、 「 トキシ ン」 とは、 微生物、 動物又は植物由来 の細胞毒性を示す種々の蛋白質やポリペプチ ド等を意味する。 例え ば既知の トキシンと して、 次のものを挙げるこ とができる。  In the present invention, the term “toxin” means various proteins, polypeptides and the like exhibiting cytotoxicity derived from microorganisms, animals or plants. For example, the following are known toxins.
ジフテ リ ア トキシ ン A鎖 （Diphtheria toxin A Chai n) (Langone J. J. , et al. , Methods in Bnzymology, 93， 307-308, 1983) 、 シユー ドモナスェン ド 卜キシ ン (Pseudomonas Bxotox i n) (Nature Medicine, 2, 350-353, 1996)、  Diphtheria toxin A chain (Langone JJ, et al., Methods in Bnzymology, 93, 307-308, 1983), Pseudomonas Bxotox in (Nature Medicine, 2, 350-353, 1996),
リ シ ン鎖 （Ricin A Chain) (Ful ton R. J.， et al. , J. Biol. Che m. , 261, 5314-5319, 1986 ； Si vam G. , et al. , Cancer Res.， 47 ， 3169-3173, 1987 ； Cumber A. J. et al. , J. Immunol. Me t ods, 1 35, 15-24, 1990 ； Wawrzynczak B. J. , et al. , Cancer Res.， 50, 7519-7562, 1990 ； Gheeite V.， et al. , J. Immunol. Methods, 142 , 223-230, 1991) ；  Ricin A Chain (Fulton RJ, et al., J. Biol. Chem., 261, 5314-5319, 1986; Si vam G., et al., Cancer Res., 47, 3169) -3173, 1987; Cumber AJ et al., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak BJ, et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Gheeite V. , Et al., J. Immunol. Methods, 142, 223-230, 1991);
無糖鎖リ シ ン A鎖 （Deglicosylated Ricin A Chain) (Thorpe P. E.， et al.， Cancer Res.， 47, 5924-5931, 1987) ； アブリ ン A鎖 （Abrin A Chain) (Wawrzynczak B. J. , et al. , Br . J. Cancer, 66， 361-366, 1992 ； Wawrzynczak E. J. , et al. , Can cer Res.， 50， 7519-7562, 1990 ； Si vam G. , et al. , Cancer Res .， 47, 3169-3173, 1987 ； Thorpe P. ， et al. , Cancer Res.， 4 7， 5924-5931, 1987) ； Deglicosylated Ricin A Chain (Thorpe P. E., et al., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987); Abrin A Chain (Wawrzynczak BJ, et al., Br. J. Cancer, 66, 361-366, 1992). Wawrzynczak EJ, et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Si vam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Thorpe P., et al., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987);
ゲロニ ン (Gelonin) (Si vam G. , et al. , Cancer Res.， 47, 316 9-3173, 1987 ； Cumber A. J. et al. , J. Immunol. Methods, 135, 1 5-24, 1990 ； Wawrzynczak B. J. , et al. , Cancer Res. , 50, 7519 -7562, 1990 ； Bolognesi A. , et al. , CI in. exp. Immunol. , 89， 3 41-346, 1992) ；  Gelonin (Si vam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber AJ et al., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak BJ, et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A., et al., CI in. Exp. Immunol., 89, 341-346, 1992);
ポークウ イ一 ド抗ウ ィ ルス蛋白 （PAP- s ； Pokeweed anti-viral protein from seeds) (Bo 1 ognes i A. , et al . , Clin. exp. Immunol. , 89， 341-346， 1992) ；  Pokeweed anti-viral protein from seeds (PAP-s; Pokeweed anti-viral protein from seeds) (Bo 1 ognesi A., et al., Clin. Exp. Immunol., 89, 341-346, 1992);
ブリ オ ジ ン (Br i od i n) (Bolognes i A. , et al. , Clin. exp. Immun oし ' 89, 341-346, 1992) ；  Briodin (Bolognes i A., et al., Clin. Exp. Immuno '89, 341-346, 1992);
サポ リ ン (Sapor i n) (Bo 1 ognes i A. , et al. , Clin. exp. Immunol 89， 341-346, 1992) ；  Saporin (Bo 1 ognes i A., et al., Clin. Exp. Immunol 89, 341-346, 1992);
モモノレジ ン (Momordin) (Cumber A. J. , et al. , J. Immunol. Meth ods, 135, 15-24, 1990 ； Wawrzynczak E. J. , et al. , Cancer Res . , 50, 7519 - 7562， 1990 ； Bolognesi A. , et al. , Clin. exp. Immu noし 89， 341-346, 1992) ；  Momordin (Cumber AJ, et al., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak EJ, et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A. , et al., Clin. exp. Immu no 89, 341-346, 1992);
モモノレコキン (Momorcochin) (Bolognes i A.， et al . , Clin. exp. Immunol. , 89， 341-346, 1992) ；  Momorcochin (Bomornesi A., et al., Clin. Exp. Immunol., 89, 341-346, 1992);
ジア ン シ ン 3 2 (Dianthin 32) (Bolognesi A., et al. , Clin, e xp. Immunol.， 89， 341-346, 1992) ；  Dianthin 32 (Bolognesi A., et al., Clin, exp. Immunol., 89, 341-346, 1992);
ジア ンシ ン 3 0 (Dianthin 30) (Stirpe F. , Barbieri L. , FEBS letter 195， 1-8, 1986) ； Dianthin 30 (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);
モデッ シ ン （Modeccin) (Stirpe F. , Barbieri L. , FEBS letter 195, 1-8， 1986) ；  Modeccin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);
ビス力 ミ ン （Viscumin) (Stirpe F. , Barbieri L. , FEBS letter 195， 1-8, 1986) ；  Viscumin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);
ボルゲシ ン （Volkesin) (Stirpe F,， Barbieri L. , FEBS letter 195, 1-8， 1986) ；  Volkesin (Stirpe F, Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);
ドデカ ン ド リ ン （Dodecandrin) (Stirpe F. , Barbieri L. , FEBS letter 195, 1-8， 1986) ；  Dodecandrin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);
ト リ チ ン （Tritin) (Stirpe F. , Barbieri L.， FEBS letter 195 ， 1-8, 1986) ；  Tritin (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);
ルフ ィ ン （Luff in) (Stirpe F.， Barbieri L. , FEBS letter 195 , 1-8， 1986) ；  Luff in (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986);
卜 リ コキ リ ン（Trichokirin) (Casel las P.， et al. , Bur. J. Bioc hem. 176, 581-588, 1988 ； Bolognesi A., et al. , Clin. exp. Imm unol. , 89, 341 -346， 1992) 。  Trichokirin (Casel las P., et al., Bur. J. Biochem. 176, 581-588, 1988; Bolognesi A., et al., Clin. Exp. Immunol., 89 341-346, 1992).
本発明において、 「化学療法剤」 とは、 上記の トキシ ン以外の、 抗腫瘍作用を有する物質を意味し、 抗腫瘍剤、 サイ トカイ ン、 酵素 等が含まれる。  In the present invention, “chemotherapeutic agent” means a substance having an antitumor action other than the above-mentioned toxin, and includes an antitumor agent, a cytokine, an enzyme and the like.
こ こで抗腫瘍剤は、 抗腫瘍作用を有する低分子化合物を意味する o  Here, the antitumor agent means a low molecular weight compound having an antitumor effecto
抗腫瘍剤と しては、 As an antitumor agent,
メ ルフ ァ ラ ン （Melphalan) (Rowland G. F.， et al. ( Nature 255 ， 487-488, 1975) ； Melphalan (Rowland GF, et al. ( Nature 255, 487-488, 1975);
シスプラチ ン (Ci s-plat inum (Hurwi tz E. and Haimovich J.， Method In Enzymology 178， 369-375, 1986 ； Schechter B. , et a 1. , Int. J. Cancer 48, 167-172， 1991) ； 力ノレ 'ボブラチ ン (Carboplat in) (Ota, Y. , et al. , Asia-Oceani a J. Obstet. Gynaecol. 19， 449-457, 1993) ； Cis-platinum (Hurwitz E. and Haimovich J., Method In Enzymology 178, 369-375, 1986; Schechter B., et a 1., Int. J. Cancer 48, 167-172, 1991 ); Carboplatin (Ota, Y., et al., Asia-Oceania J. Obstet. Gynaecol. 19, 449-457, 1993);
マイ トマイ シ ン C (Mi tomycin C) (Noguchi, A., et al. , B i oco njugate Chem. 3, 132-137, 1992) ；  Mitomicin C (Noguchi, A., et al., Bioconjugate Chem. 3, 132-137, 1992);
ア ド リ アマイ シ ン (Adr iamycin (Doxorubicin)) (Shih, L. B. , e t al. , Cancer Res. 51 4192 - 4198， 1991 ； Zhu, Z. , et al. , Can cer Immunol. Immumother 40, 257-267, 1995 ； Trail, P. A. , et a 1. , Science 261, 212-215, 1993 ； Zhu, Z.， et al. , Cancer I mm unol. Immumother 40， 257-267, 1995 ； Kondo, Y. , et al. , Jpn. J. Cancer Res. 86 1072-1079, 1995 ； Zhu, Z. , et al. , Cancer 1 mmunol. Immumother 40, 257-267, 1995 ； Zhu, Z. , et al. , Cance r Immunol. I画 mother 40, 257-267, 1995) ；  Adriamycin (Doxorubicin) (Shih, LB, et al., Cancer Res. 51 4192-4198, 1991; Zhu, Z., et al., Cancer Immunol. Immumother 40, 257- 267, 1995; Trail, PA, et a 1., Science 261, 212-215, 1993; Zhu, Z., et al., Cancer Immunol. Immumother 40, 257-267, 1995; Kondo, Y., et al., Jpn. J. Cancer Res. 86 1072-1079, 1995; Zhu, Z., et al., Cancer 1 mmunol. Immumother 40, 257-267, 1995; Zhu, Z., et al., Cance. r Immunol. I. mother 40, 257-267, 1995);
ダウ ノ ノレビシ ン (Daunorub i cin) (D i I lman, R.0. , et al. , Cane er Res. 48, 6097-6102, 1988 ； Hudecz, F. , et al. , Bioconjuga te Chem. 1, 197-204, 1990 ； Tukada Y. et al. , J. Natl. Cancer Inst. 75, 721-729, 1984) ；  Daunorubicin (DiIlman, R.0., Et al., Caner Res. 48, 6097-6102, 1988; Hudecz, F., et al., Bioconjuga te Chem. 1) 197-204, 1990; Tukada Y. et al., J. Natl. Cancer Inst. 75, 721-729, 1984);
ブレオマイ シ ン (Bleomycin) (Manabe, Y. , et al. , Β i ochem. Β i ophys. Res. Commun. 115， 1009-1014, 1983) ；  Bleomycin (Manabe, Y., et al., Βi ochem. Βi ophys. Res. Commun. 115, 1009-1014, 1983);
ネオ力ノレチノ スタチ ン (Neocarzinostatin) (Ki tamura ， et a 1. , Cancer Immunol. Immumother 36, 177-184, 1993 ； Yamaguchi T. , et al. , Jpn. J. Cancer Res. 85, 167-171, 1994) ；  Neocarzinostatin (Ki tamura, et al., Cancer Immunol. Immumother 36, 177-184, 1993; Yamaguchi T., et al., Jpn. J. Cancer Res. 85, 167-171, 1994);
メ ト ト レキセ一 ト (Methotrexate) (Krai ovec, J. , et al. , Cane er Immunol. Immumother 29, 293-302, 1989 ； Kulkarni, P. N. , et al. , Cancer Res. 41, 2700-2706, 1981 ； Shin, L. B. , et al. , Int. J. Cancer 41, 832-839, 1988 ； Gamett M. C. , et al. , Int. J. Cancer 31， 661-670, 1983) ；  Methotrexate (Krai ovec, J., et al., Caneer Immunol. Immumother 29, 293-302, 1989; Kulkarni, PN, et al., Cancer Res. 41, 2700-2706, 1981; Shin, LB, et al., Int. J. Cancer 41, 832-839, 1988; Gamett MC, et al., Int. J. Cancer 31, 661-670, 1983);
5 — フルォロ ウ リ ジ ン （5- Fluorouridine) (Shin, L. B. , Int. J. Cancer 46, 1101-1106, 1990) ； 5 — 5-Fluorouridine (Shin, LB, Int. J. Cancer 46, 1101-1106, 1990);
5 — フルオロ ー 2 ' —デォキシゥ リ ジ ン （5- Fluoro- 2' - deoxyuri dine) (Goer lach A. , et al.， Bioconjugate Chem. 2, 96-101, 19 91) ；  5 — Fluoro-2'-deoxyuridine (Goer lach A., et al., Bioconjugate Chem. 2, 96-101, 1991);
シ ト シ ンァラ ビノ シ ド (Cytosine arabinoside) (Hurwi tz E. , e t aし， J. Med. Chem. 28， 137-140, 1985) ；  Cytosine arabinoside (Hurwitz E., et al., J. Med. Chem. 28, 137-140, 1985);
ア ミ ノ プテ リ ン (Aminopterin) (Kane 11 os J.， et al . , Immunol. Cell. Biol. 65, 483-493, 1987) ；  Aminopterin (Kane 11 os J., et al., Immunol. Cell. Biol. 65, 483-493, 1987);
ビンク リ スチ ン （Vincristine) (Johnson J. R. , et al. , Br. J. C ancer 42, 17, 1980) ；  Vincristine (Johnson J. R., et al., Br. J. Cancer 42, 17, 1980);
ビンデシ ン (Vindes ine) (Johnson J. R.， et al. , Br. J. Cancer 44， 472-475, 1981) ；  Vindesine (Johnson J. R., et al., Br. J. Cancer 44, 472-475, 1981);
などが挙げられる。 And the like.
サイ ト力イ ンと しては、 抗腫瘍作用を有するサイ トカイ ンが挙げ られる。 抗腫瘍作用を有するサイ トカイ ンと しては、 例えばイ ンタ —ロイ キ ン 2 ( I L— 2 ) 、 腫瘍壌死因子アルフ ァ （T N F ） 、 イ ンターフ ヱ ロ ン （ I N F ) などが好ま しい。  Examples of the site force inn include a site kinase having an antitumor effect. Preferred site cytokines having antitumor activity include, for example, interleukin 2 (IL-2), tumor necrosis factor alpha (TNF), and interferon (INF).
酵素と しては、 抗腫瘍作用を有する酵素が挙げられる。 抗腫瘍作 用を有する酵素と しては、 例えばカルボキシぺプチダーゼ （Carbox ypept i dase) 、 ァノレカ リ フ 才 スフ ァ ターゼ (Alkaline Phosphatase ) 、 ベータ ラ ク タマーゼ （ /S -lactamase) 、 シチジ ンデァ ミ ナーゼ (Cytidine deaminase) など力 好ま しい。  Examples of the enzyme include an enzyme having an antitumor effect. Enzymes having antitumor effects include, for example, carboxypeptidase (Carbox ypeptidase), anolecalif sulphase (Alkaline Phosphatase), beta-lactamase (/ S-lactamase), and cytidine dynamase. (Cytidine deaminase) is preferred.
ィ ンテグリ ン ひ 3抗体又はその結合能を有する断片と化学療法剤 又は トキシ ンを連結する手段はすでに公知であり、 常用されている 。 イ ンテグリ ン α 3抗体又はその結合能を有する断片と化学療法剤 又は トキシ ンは、 それら自身が有する連結基を介して直接連結され てもよい。 また、 抗イ ンテグリ ン α 3抗体又はその結合能を有する 断片と化学療法剤または トキシンは、 リ ンカ一により連結されても よ く 、 中間支持体により連結されてもよい。 または、 抗イ ンテグリ ン α 3抗体又はその結合能を有する断片と化学療法剤または トキシ ンは、 それら自体が有する連結基、 リ ンカ一又は中間支持体の組み 合わせにより連結されてもよい。 Means for linking the integrin 3 antibody or a fragment thereof capable of binding to a chemotherapeutic agent or toxin are already known and commonly used. The integrin α3 antibody or a fragment having binding ability thereof and the chemotherapeutic agent or toxin may be directly linked via a linking group possessed by themselves. In addition, it has anti-integrin α3 antibody or its binding ability. The fragment and the chemotherapeutic agent or toxin may be linked by a linker or by an intermediate support. Alternatively, the anti-integrin α3 antibody or a fragment having a binding ability thereof and the chemotherapeutic agent or toxin may be linked by a combination of a linking group, a linker, or an intermediate support of the antibody itself.
イ ンテグリ ンな 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン又は化学療法剤が、 それら自身が有する連結基を介して直接結合 される場合の連結基は、 例えば SH基を用いたジスルフ ィ ド結合が挙 げられる。 具体的には抗体の Fc領域の分子内ジスルフ ィ ド結合を還 元剤、 例えばジチオ ト レイ トール等にて還元し、 トキシ ン又は化学 療法剤のジスルフ ィ ド結合を同様に還元して、 両者をジスルフ ィ ド 結合にて連結する。 連結前に活性化促進剤、 例えばエルマ ン試薬（E llman' s reagent)にて抗体か トキシ ン又は化学療法剤のいずれか一 方を活性化させ両者のジスルフ ィ ド結合形成を促進してもよい。 こ の方法により直接連結される化学療法剤と しては、 例えばネオカル チノ スタ ンが挙げられる。  When the integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and toxin or a chemotherapeutic agent are directly linked via a linking group possessed by themselves, the linking group is, for example, a disulfide using an SH group. Network connection. Specifically, the intramolecular disulfide bond of the Fc region of the antibody is reduced with a reducing agent such as dithiothreitol, and the disulfide bond of toxin or a chemotherapeutic agent is similarly reduced. Are linked by a disulfide bond. Before ligation, activation of an antibody, toxic agent or chemotherapeutic agent with an activation promoter such as Ellman's reagent to promote the formation of a disulfide bond between the two is also possible. Good. Chemotherapeutic agents directly linked by this method include, for example, neocarzinostane.
また、 イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン又は化学療法剤が、 それら自身が有する連結基を介して直 接結合される場合の連結基は、 例えばシ ッ フ塩基を用いるこ とがで きる。 シ ッ フ塩基は、 例えばグルタールアルデヒ ド反応により形成 させるこ とができる。 この方法により直接連結される化学療法剤と しては、 例えばダウ ノ ノレビシン （Hurwitz, E. et al. , Cancer Res . 35, 1175-1181, 1975) 、 ア ド リ アマイ シ ン （ ドキソルビシ ン ； M ohamed, G. et al. , Pro. A. A. C. R. 27, 317, 1986 ) が挙げら れる。  In addition, when the integrin α3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and toxin or a chemotherapeutic agent are directly bonded via a linking group of the antibody itself, the linking group is, for example, a Schiff base. Can be used. The Schiff base can be formed, for example, by a glutaraldehyde reaction. Chemotherapeutic agents directly linked by this method include, for example, daunonorevicin (Hurwitz, E. et al., Cancer Res. 35, 1175-1181, 1975), adriamycin (doxorubicin; Mohamed, G. et al., Pro. AACR 27, 317, 1986).
また、 イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシン又は化学療法剤が、 それら自身が有する連結基を介して直 接結合される場合の連結基は、 例えばカルボジィ ミ ド法により形成 される。 カルボジィ ミ ド法には、 例えば水溶性カルボジィ ミ ド （卜 ethy 1-3-(3' - dimethyl am inopropyl) carbodiimide(ECDI))を使用す るこ とができる。 Further, the integrin α3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a toxin or a chemotherapeutic agent are directly linked to each other via a linking group possessed by themselves. The linking group in the case of being indirectly bonded is formed by, for example, a carbodiimide method. In the carbodiimide method, for example, a water-soluble carbodiimide (ethy 1-3- (3′-dimethyl aminopropyl) carbodiimide (ECDI)) can be used.
カルボジィ ミ ド法により連結される化学療法剤と しては、 例えば メ ト ト レキサ一 ト （MTX ) ( Kulkarni, P. N. et al. , Cancer Re s. 41, 2700-2706, 1981) が挙げられる。  Chemotherapeutic agents linked by the carbodimid method include, for example, methotrexate (MTX) (Kulkarni, P.N. et al., Cancer Res. 41, 2700-2706, 1981).
また、 イ ンテグリ ン な 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン又は化学療法剤が、 それら自身が有する連結基を介して直 接結合される場合の連結基は、 例えば活性エステル法 （N- hydroxys ucccinimide 法） により形成される。 活性エステル法により連結さ れる化学療法剤と しては、 例えばメ ト ト レキサ一ト （MTX ) ( ul karni, P. N. et al. , Cancer Res. 41, 2700-2706, 1981) が挙げ られる。  In addition, when the integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and toxin or a chemotherapeutic agent are directly bonded via a linking group possessed by themselves, the linking group may be, for example, an active ester method ( It is formed by N-hydroxys ucccinimide method). Chemotherapeutic agents linked by the active ester method include, for example, methotrexate (MTX) (ulkarni, P.N. et al., Cancer Res. 41, 2700-2706, 1981).
また、 イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン又は化学療法剤が、 それら自身が有する連結基を介して直 接結合される場合の連結基は、 例えば Mixed anhydride により形成 される。 Mixed anhydrideにより連結される化学療法剤と しては、 例えばメ 卜 ト レキサ一 卜 （MTX ) ( Burnstein, S. et al. , J. ME D. Chem. 20, 950-952, 1977) が挙げられる。  In addition, when the integrin α3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and toxin or a chemotherapeutic agent are directly bonded to each other via a linking group possessed by themselves, the linking group is formed by, for example, mixed anhydride. Is done. Chemotherapeutic agents linked by mixed anhydrides include, for example, methotrexate (MTX) (Burnstein, S. et al., J. MED. Chem. 20, 950-952, 1977). Can be
また、 イ ンテグリ ン な 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシン又は化学療法剤が、 それら自身が有する連結基を介して直 接結合される場合の連結基は、 例えばジァゾ反応により形成される 。 ジァゾ反応により連結される化学療法剤と しては、 例えばメ 卜 ト レキサ一 卜 （MTX ) (De Carvalho, S. et al. , Nature(London) 2 02， 255-258, 1964 ) が挙げられる。  In addition, when the integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a toxin or a chemotherapeutic agent are directly linked via a linking group possessed by themselves, the linking group is formed by, for example, a diazo reaction. . Chemotherapeutic agents linked by the diazo reaction include, for example, methotrexate (MTX) (De Carvalho, S. et al., Nature (London) 202, 255-258, 1964). .
リ ンカーとは、 抗体又は抗原結合能を有するその断片と化学療法 剤または トキシンとを各々相互に連結させる際に用いられる連結分 子を意味する。 リ ンカ一によ り抗体又は抗原結合能を有するその断 片と化学療法剤または トキシ ンとを連結させる際に、 一分子のリ ン カーを用いるだけではなく 、 複数の同種または異種のリ ンカ一を使 用 してもよい。 A linker is defined as an antibody or a fragment thereof that has the ability to bind antigen and chemotherapy. It means a linking molecule used for linking an agent or toxin with each other. When linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability to a chemotherapeutic agent or toxin by a linker, not only a single molecule of linker but also a plurality of same or different types of linkers are used. You may use one.
また、 抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン又は化学 療法剤とを連結するための リ ンカ一と しては、 連結基と してア ミ ノ 基、 カルボキシル基、 メルカプ ト基等をいずれか 1 種類または 2種 類以上の組み合わせで 2個以上有する化合物が挙げられ、 抗体又は 抗原結合能を有するその断片及び トキシ ン又は酵素が有するカルボ キシル基又はア ミ ノ 基と、 リ ンカ一が提供するカルボキシル基、 ァ ミ ノ基、 メルカプ ト基等との間に形成されるエステル結合、 ア ミ ド 結合、 チォエステル結合等により連結される。 こ こで述べる リ ンカ 一は、 抗体又は抗原結合能を有するその断片に対し、 1 分子または それ以上の トキシ ン又は化学療法剤を連結させ得る物質を意味する o  As a linker for linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with toxin or a chemotherapeutic agent, an amino group, a carboxyl group, a mercapto group, or the like may be used as a linking group. Compounds having two or more of any one or a combination of two or more of them include antibodies or fragments thereof having an antigen-binding ability and carboxyl or amino groups of toxin or an enzyme, and linkers. Are connected by an ester bond, an amide bond, a thioester bond, or the like formed between a carboxyl group, an amino group, a mercapto group, and the like provided by the above. The linker described herein refers to a substance capable of linking one or more molecules of toxin or a chemotherapeutic agent to an antibody or a fragment thereof capable of binding to an antigen.o
抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン及び化学療法剤 とを連結するための リ ンカ一と しては、 例えば次の物質が使用され As a linker for linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability to toxin and a chemotherapeutic agent, for example, the following substances are used.
Ό。 Ό.
N—ス ク シ二 ミ ジル 3 — ( 2 — ピ リ ジルジチォ） プロ ビオネ一 卜 （SPDP ： N- Succinimidyl 3-(2-pyr idyldi t io) propinate) (Wawr zynczak E. J. , et al. , Cancer Res.， 50, 7519-7562, 1990 ； Tho rpe P. E. , et al. , Cancer Res. , 47， 5924-5931, 1987) ；  N-Succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) Probionet (SPDP: N-Succinimidyl 3- (2-pyridylditio) propinate) (Wawr zynczak EJ, et al., Cancer Res. ., 50, 7519-7562, 1990; Thorpe PE, et al., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987);
スク シ二 ミ ジル 6 — 3 — 〔 2 — ピ リ ジルジチォ〕 プロ ピオ ンァ ミ ド） へキサノ エ— 卜 （LC- SPDP ： Succinimidyl 6-3- (2- pyridyld itio) propinamide)hexanoate) (Hermanson G. T. , BIOCONJUGATE T echniques, 230 - 232， 1996) ； スルホスク シ二 ミ ジル 6 — 3 — 〔 2 — ピ リ ジルジチォ〕 プロ ピ オ ンア ミ ド） へキサノ エ一 ト （Sulfo- LC-SPDP ： Sulfosuccinimidy 1 6-3- [ 2 -pyridyldi tio 〕 pro i nami de hexanoate) (Hermanson G . T. , BIOCONJUGATE Techniques, 230-232, 1996) ； Succinimidyl 6—3— [2—pyridyldithio] propionamide) hexanoate (LC-SPDP: Succinimidyl 6-3- (2-pyridyld itio) propinamide) hexanoate) (Hermanson GT , BIOCONJUGATE T echniques, 230-232, 1996); Sulfosuccinimidyl 6 — 3 — [2 — pyridyldithio] propionamide Hexanoate (Sulfo-LC-SPDP: Sulfosuccinimidy 1 6-3- [2-pyridylditio] proi nami de hexanoate) (Hermanson G. T., BIOCONJUGATE Techniques, 230-232, 1996);
N—スク シ二 ミ ジル 3 — （ 2 — ピ リ ジルジチォ） ブチ レー ト （ SPDB ： N-Succinimi dy 1 3- (2-py r i dy 1 d i t i oリ butyrate) (Wawrzyncz ak E. J.， et al. , Br. J. Cancer, 66, 361-366, 1992) ；  N-Succinimidyl 3 — (2 — pyridyldithio) butyrate (SPDB: N-Succinimi dy1 3- (2-pyridydy1 ditioli butyrate) (Wawrzynczak EJ, et al., Br J. Cancer, 66, 361-366, 1992);
スク シニ ミ ジロキシカルボ二ルー α— （ 2 — ピ リ ジルジチォ） ト ノレェ ン (SMPT： Succinimidyloxycarbonyl-a - (2-pyridyldi tio) to ruene) (Thorpe P. E. , et al. , Cancer Res. , 47, 5924-5931, 198 7) ；  Succinimidyloxycarbonyl-a- (2-pyridylditio) to ruene (SMPT) (Thorpe PE, et al., Cancer Res., 47, 5924-) 5931, 198 7);
ス ク シ二 ミ ジル 6 — (ひ 一メ チル一 〔 2 — ピ リ ジルジチォ〕 ト ルア ミ ド） へキサノ エ一 ト （LC - SMPT ： Succinimidyl 6- ( a - met 1 - (2-pyr i dy 1 d i t i o] toruamide)hexanosteリ (Hermanson G. T. , B I OCONJUGATE Techniques, 232-235, 1996) ；  Succinimidyl 6-((1-methyl-2- [2-pyridyldithio] toluamide) hexanoate (LC-SMPT: Succinimidyl 6- (a-met 1- (2-pyr i dy 1 ditio] toruamide) hexanoste (Hermanson GT, BI OCONJUGATE Techniques, 232-235, 1996);
スルホスク シ二 ミ ジル 6 — （ α —メ チルー 〔 2 — ピ リ ジルジチ ォ〕 トルア ミ ド） へキサノ エー ト （Sulfo- LC- SMPT ： Sulfosuccinim i dy 1 α - ( α - methyl - [2-pyridyldi t ioj toruami de)hexanoate) (Hermanson G. T. , BIOCONJUGATE Techniques, 232-235, 1996) ； スク シ二 ミ ジル一 4 一 （ p—マ レイ ミ ドフ ヱニル） ブチ レー 卜 （ S PB： Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl) butyrateリ (Hermanso n G. T. , BIOCONJUGATE Techniques, 242-243, 1996) ；  Sulfosuccinimidyl 6- (α-methyl- [2-pyridyldithio] toluamide) hexanoate (Sulfo-LC-SMPT: Sulfosuccinim idy 1 α- (α-methyl- [2-pyridyldi t ioj toruami de) hexanoate) (Hermanson GT, BIOCONJUGATE Techniques, 232-235, 1996); S-PB: Succinimidyl-4- (p-male-midyl) p-maleimidophenyl) butyrate (Hermanson GT, BIOCONJUGATE Techniques, 242-243, 1996);
スルホー スク シ二 ミ ジル 4 一 （ p —マ レイ ミ ドフ エニル） ブチ レ一 ト (Sulfo - SMPB ： Sul fo-Succinimi dy 1-4- (p-mal eimi dopheny 1 ) butyrate) (Hermanson G. T. , BIOCONJUGATE Techniques, 242-24 3， 1996) ；  Sulfo-SMPB: Sul fo-Succinimi dy 1-4- (p-mal eimi dopheny 1) butyrate (Hermanson GT, BIOCONJUGATE Techniques, 242-243, 1996);
m—マ レイ ミ ドベンゾィル一 N—ハイ ドロキシスク シニ ミ ドエス テノレ (MBS ： m-Maleimi dobenzoy 1 -N-hydroxysuccinimi de ester) ( Hermanson G. T. , BIOCONJUGATE Techniques, 237-238, 1996) ； m—マ レイ ミ ドベンゾイノレー N—ノヽィ ドロキシー スノレホスク シ二 ミ ドエステノレ (Sulfo— MBS ： m-Maleimi dobenzoy 1-N-hydroxy-sulfo succinimide ester) (Hermanson G. T.， BIOCONJUGATE Techniques, 237-238, 1996) ； m—Malaymi dobenzoyl N—Hydroxysk Tenoré (MBS: m-Maleimi dobenzoy 1-N-hydroxysuccinimi de ester) (Hermanson GT, BIOCONJUGATE Techniques, 237-238, 1996); m-Maleimi dobenzoinole : M-Maleimi dobenzoy 1-N-hydroxy-sulfo succinimide ester) (Hermanson GT, BIOCONJUGATE Techniques, 237-238, 1996);
S —ァセチルメ ルカプ ト スク シニ ッ ク ア ン ヒ ドラ イ ド （SAMSA ： S - Acetyl mercaptosuccini c anhydride) (Casel las P. , e t al. , E ur. J. Biochem, 176， 581-588， 1988) ；  S—Acetyl mercaptosuccinic anhydride (SAMSA: S-Acetyl mercaptosuccinic anhydride) (Casel las P., et al., Euro. J. Biochem, 176, 581-588, 1988) ;
ジメ チル 3， 3 — ジチォ ビスプロ リ オニ ミ デー ト （DTBP ： Dime thy 1 3， 3 -ditiobisprorionimidate (Casel las P. , e t al. , Bur . J. Biochem, 176, 581-588, 1988) ；  Dimethyl 3,3 — dithiobisprolionimidate (DTBP: Dimethy 13,3 -ditiobisprorionimidate (Casel las P., et al., Bur. J. Biochem, 176, 581-588, 1988);
2 —ィ ミ ノ チォ レー ン （2- Iminotiolane) (Thorpe P. E.， et al. ， Cancer Res. , 47, 5924-5931， 1987) 。  2 — 2-Iminotiolane (Thorpe P. E., et al., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987).
中間支持体とは、 抗体又は抗原結合能を有するその断片に対し、 2分子以上の トキシ ン又は化学療法剤を連結させ得る物質を意味す る。 中間支持体は、 抗体又は抗原結合能を有するその断片と複数の 化学療法剤または複数の トキシ ンとを一度に結合して担持しう る リ ンカ一またはリ ンカ一以外の分子である。 中間支持体により抗体又 は抗原結合能を有するその断片と複数の化学療法剤または複数の ト キシンとを連結させる際に、 リ ンカ一を使用 してもよい。  The term "intermediate support" means a substance capable of linking two or more molecules of toxin or a chemotherapeutic agent to an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability. The intermediate support is a linker or a molecule other than a linker capable of binding and carrying an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a plurality of chemotherapeutic agents or a plurality of toxins at a time. In linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with a plurality of chemotherapeutic agents or a plurality of toxins by an intermediate support, a linker may be used.
抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン又は化学療法剤 とを連結するためのリ ンカ一又は中間支持体と しては、 ペプチ ド、 例えばポ リ L— グルタ ミ ン酸 （ P G A ) 、 カルボキ シメ チルデキス ト ラ ン、 デキス ト ラ ン、 ア ミ ノ デキス ト ラ ン、 ア ビジ ン · ピオチ ン 、 シス ' ア コニ ッ ト酸、 グルタ ミ ン酸ジ ヒ ドラ ジ ド、 ヒ ト血清アル ブミ ン （H S A) 等が用いられる。 抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン又は化学療法剤 とのリ ンカー又は中間支持体による連結は、 例えばリ ンカ一又は中 間支持体により提供されるァ ミ ノ基またはカルボキ シル基と、 抗体 又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン又は化学療法剤により 提供されるァ ミ ノ基又はカルボキシル基との間のァ ミ ド結合により 連結される。 このア ミ ド結合は、 例えばカルポジイ ミ ド反応により 形成される。 As a linker or an intermediate support for linking an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with toxin or a chemotherapeutic agent, a peptide such as poly-L-glutamic acid (PGA), Carboxymethyl dextran, dextran, amino dextran, avidin-piotin, cis'aconitic acid, glutamate dihydrazide, human serum albumin (HSA) is used. Linkage of an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with toxin or a chemotherapeutic agent by a linker or an intermediate support is performed, for example, by linking an amino group or a carboxyl group provided by the linker or the intermediate support. It is linked by an amide bond between the antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and an amino group or a carboxyl group provided by toxin or a chemotherapeutic agent. This amide bond is formed by, for example, a calposimid reaction.
また、 例えば抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン又 は化学療法剤により提供されるァ ミ ノ基又はァルデヒ ド基と リ ンカ —又は中間支持体により提供されるア ミ ノ基又はアルデヒ ド基との 間のシ ッ フ塩基の形成によ り連結される。  Also, for example, an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and an amino group or aldehyde group provided by a toxin or chemotherapeutic agent and a linker, or an amino group or aldehyde provided by an intermediate support. Linked by the formation of a Schiff base between the thiol group.
また、 例えば トキシ ン又は化学療法剤により提供されるアルデヒ ド基と リ ンカ一又は中間支持体により提供される ヒ ドラ ジ ド基との 間のヒ ドラゾンの形成により連結される。  Also linked, for example, by the formation of a hydrazone between an aldehyde group provided by a toxin or chemotherapeutic agent and a hydrazide group provided by a linker or an intermediate support.
また、 抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン又は化学 療法剤により提供されるヒ ドロキシル基又はカルボキシル基と リ ン 力一又は中間支持体により提供される ヒ ドロキシル基又はカルボキ シル基との間に形成されるエステル結合により連結される。 このェ ステル結合は、 例えば活性エステル化法により形成される。  In addition, an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability, a hydroxyl group or a carboxyl group provided by a toxin or a chemotherapeutic agent, and a hydroxyl group or a carboxyl group provided by a phosphor or an intermediate support. They are linked by an ester bond formed between them. This ester bond is formed, for example, by an active esterification method.
また、 抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ン又は化学 療法剤により提供される SH基と リ ンカー又は中間支持体により提供 される SH基との間に形成されるジスルフ ィ ド結合により連結される 。 このジスルフ ィ ド結合は、 例えば抗体又は抗原結合能を有するそ の断片と トキシン又は化学療法剤により提供される SH基と リ ンカ一 又は中間支持体により提供される活性化 SH基、 例えばピリ ジルジス ルフ ィ ド基によ り形成される。  Further, the antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability is linked by a disulfide bond formed between an SH group provided by toxin or a chemotherapeutic agent and an SH group provided by a linker or an intermediate support. Is done. This disulfide bond is formed by, for example, an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability, an SH group provided by a toxin or a chemotherapeutic agent, and an activated SH group provided by a linker or an intermediate support. It is formed by a sulfide group.
このジスルフ ィ ド結合はまた、 例えば抗体又は抗原結合能を有す るその断片と トキシン又は化学療法剤により提供されるカルボニル 基（ アルデヒ ド基またはケ ト ン基） と リ ンカ一又は中間支持体によ り提供される ヒ ドラ ジ ド基より形成される ヒ ドラゾン結合により形 成される。 カルボニル基は、 例えば、 抗体又は抗原結合能を有する その断片と トキシン又は化学療法剤により提供される糖鎖を酸化す るこ とにより得られる。 This disulfide bond may also have, for example, the ability to bind antibodies or antigens. Formed from a fragment thereof, a carbonyl group (an aldehyde group or a ketone group) provided by a toxin or a chemotherapeutic agent, and a hydrazide group provided by a linker or an intermediate support. It is formed by joining. The carbonyl group can be obtained, for example, by oxidizing an antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with a toxin or a sugar chain provided by a chemotherapeutic agent.
抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有するその断片は、 ィ ンテグリ ン α 3抗原を発現している細胞にィ ンターナライズするこ とができる。 従って、 抗イ ンテグリ ンひ 3抗体又は抗原結合能を有 するその断片が有する連結基、 リ ンカ一、 中間支持体又はそれらの 組み合わせにより連結された種々の化学療法剤や トキシ ンは、 抗ィ ンテグリ ン a 3抗体のィ ンターナリゼーシ ョ ンと共に細胞に効率よ く導入され、 細胞内でそれらの薬理効果を発揮する。  The anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability can be internalized into cells expressing the integrin α3 antigen. Therefore, various chemotherapeutic agents or toxins linked by a linking group, a linker, an intermediate support, or a combination thereof possessed by the anti-integrin antibody 3 or a fragment thereof having an antigen-binding ability cannot be used for anti-integrin antibody. It is efficiently introduced into cells together with the internalization of integrin a3 antibody, and exerts their pharmacological effects inside cells.
従って、 本発明の抗イ ンテグリ ン 3抗体又は抗原結合能を有す るその断片と化学療法剤または トキシンを連結して成る複合体は、 種々 の化学療法剤又は 卜キシ ンを細胞に導入するための医薬組成物 と して有用である。 イ ンテグリ ン な 3 は腫瘍細胞に広く 分布してい るから、 本発明の医薬組成物は特に抗腫瘍作用のある医薬組成物と して有用である。  Therefore, the complex of the present invention obtained by linking the anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability with a chemotherapeutic agent or toxin introduces various chemotherapeutic agents or toxin into cells. It is useful as a pharmaceutical composition. Since integrin 3 is widely distributed in tumor cells, the pharmaceutical composition of the present invention is particularly useful as a pharmaceutical composition having an antitumor effect.
この効果は、 例えば抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有 するその断片と トキシ ンを含んで成る本発明の複合体、 例えばィム ノ トキシ ンをイ ンテグリ ン α 3 を発現しない細胞とイ ンテグリ ン α 3 を発現している細胞に添加した場合、 後者においてのみ殺細胞効 果が生じたこと、 本発明のィムノ トキシン又は遊離の トキシンをィ ンテグリ ン α 3 を発現している細胞に添加した場合、 前者において 殺細胞効果が高かったこ と によ り証明された。  This effect can be achieved by, for example, a complex of the present invention comprising an anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and toxin, for example, a cell that does not express imnotoxin and integrin α3. When added to cells expressing integrin α3, the cell killing effect occurred only in the latter, and the imotoxin or free toxin of the present invention was expressed in cells expressing integrin α3 This was proved by the higher cell killing effect in the former case.
さ らに、 この効果は例えば抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合 能を有するその断片と化学療法剤を含んで成る本発明の複合体、 例 えば化学療法剤ィムノ コ ンジユゲー トをィ ンテグリ ン α 3 を発現し ない細胞とイ ンテグリ ン α 3 を発現している細胞に添加した場合、 後者においてのみ殺細胞効果が生じたこと、 本発明の化学療法剤ィ ムノ コ ンジユゲー ト又は遊離の化学療法剤をイ ンテグリ ンひ 3 を発 現している細胞に添加した場合、 前者において殺細胞効果が高かつ たことにより証明された。 In addition, this effect may be due to, for example, anti-integrin α3 antibody or antigen binding. Conjugate of the present invention comprising a fragment thereof having an ability and a chemotherapeutic agent, e.g., a cell that does not express integrin α3 expressing the chemotherapeutic agent immunoconjugate and expresses integrin α3 When added to cells, a cell killing effect was produced only in the latter case, and when the chemotherapeutic agent immunoconjugate of the present invention or a free chemotherapeutic agent was added to cells expressing integran 3 This was proved by the high cell killing effect in the former.
また、 抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有するその断片 は、 イ ンテグリ ン α 3抗原を発現している細胞に特異的に結合する こ とができるため、 腫瘍の診断薬、 診断用組成物と しても有用であ る。 診断薬、 診断用組成物と して使用される複合体と して、 抗イ ン テグ 、) ン 3抗体又は抗原結合能を有するその断片とラ ジオァイ ソ トープとを連結してなる複合体が挙げられる。  In addition, the anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability can specifically bind to cells expressing the integrin α3 antigen; It is also useful as a composition. As a complex used as a diagnostic agent or a diagnostic composition, a complex obtained by linking a radioisotope with an anti-integrin antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability is used. No.
「ラ ジオアイ ソ トープ」 とは、 放射活性を有する元素を意味する 。 抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と連結 されるラ ジオアイ ソ トープと しては、 例えばイ ツ ト リ ウム （ 90- YU rium) が挙げられる。 抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有 するその断片とイ ツ ト リ ウムとは、 例えばキレー ト化反応により連 結される。 キレー ト化反応の際に、 例えば DTPA (diethylenetr mi nepentaacetic acid) を使用することができる （ Griffiths, G. L . et al. , Cancer Theraphy with Radiolabeled Antibodies, 47-6 1， 1995 ) o  “Radio-aisotope” means a radioactive element. The radioisotope linked to the anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability includes, for example, 90-YUrium. The anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and yttrium are linked, for example, by a chelation reaction. For the chelation reaction, for example, DTPA (diethylenetrnepentaacetic acid) can be used (Griffiths, G.L. et al., Cancer Theraphy with Radiolabeled Antibodies, 47-61, 1995).
抗イ ンテグリ ン a 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と連結 されるラ ジオァイ ソ トープと しては、 例えばテクネシゥム （ 99m-Te chnetium ) が挙げられる。 抗イ ンテグリ ン a 3抗体又は抗原結合 能を有するその断片とテクネシゥムとは、 例えばキレー ト化反応に より連結される。 キレー ト化反応の際に、 例えば N2S2を使用するこ とができる （Clin. Pharmacokinet. 28, 126-142, 1995 ； Grif f i th s, G. に et al. , CancerCphi la. ) 73， 761-768， 1990 ) 。 Examples of the radioisotope linked to the anti-integrin a3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability include technetium (99m-Technetium). The anti-integrin a3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and technesium are linked, for example, by a chelation reaction. For example, use N 2 S 2 during the chelation reaction. (Clin. Pharmacokinet. 28, 126-142, 1995; Grif fiss, G. et al., Cancer Cphi la.) 73, 761-768, 1990).
抗イ ンテグリ ン 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と連結 されるラ ジオアイ ソ トープと しては、 例えばリ ューネシゥム （ 186 - rhenium 、 188-rhenium ) 力く挙げられる ( Griff iths, G. L. et a 1. , Cancer(phila. ) 73, 761-768, 1990) 。 抗イ ンテグリ ン α 3抗 体又は抗原結合能を有するその断片と リ ューネンゥムとは、 例えば キレー 卜化反応により連結される。  Examples of radioisotope linked to an anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability include, for example, ryuneshim (186-rhenium, 188-rhenium) (Griff iths, GL et a). 1., Cancer (phila.) 73, 761-768, 1990). The anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and rynenum are linked, for example, by a chelation reaction.
抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と連結 されるラ ジオアイ ソ トープと しては、 例えばイ ンジウム （111- Indi um) が挙げられる。 抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有す るその断片とイ ンジウムとは、 例えばキレー ト化反応により連結さ れる。 キレー ト化反応の際に、 例えば DTPA ( diet ylenetr iaminep entaacetic acid ) を使用することができる （Griff iths, G. L. e t al. , Cancer Therap y with Radiolabeled Antibodies, 47-61, 1995) 。  The radioisotope linked to the anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability includes, for example, indium (111-indium). The anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and indium are linked, for example, by a chelation reaction. In the chelation reaction, for example, DTPA (dietylenetriaminepentaacetic acid) can be used (Griff iths, G. L. et al., Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies, 47-61, 1995).
抗イ ンテグリ ン a 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と連結 されるラ ジオアイ ソ トープと しては、 例えば沃素 （131-Iodine、 12 5 - Iodine) が挙げられる。 抗イ ンテグリ ン a 3抗体又は抗原結合能 を有するその断片と沃素とは、 例えばク ロラ ミ ン T 法、 I0D0GEN 法 、 ラ ク トペルォキシダ一ゼ酸化法又は Bolton- Hunter 法により連結 される。  The radioisotope linked to the anti-integrin a3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability includes, for example, iodine (131-Iodine, 125-Iodine). The anti-integrin a3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and iodine are linked by, for example, the chloramine T method, the I0DGEN method, the lactoperoxidase oxidizing method or the Bolton-Hunter method.
本発明の抗イ ンテグリ ン a 3抗体又は抗原結合能を有するその断 片と化学療法剤または トキシンとを連結して成る複合体または該複 合体を含んで成る医薬組成物および診断薬、 診断用組成物は、 経口 的あるいは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる 。 非経口的投与投与と しては、 例えば、 点滴などの静脈内注射、 筋 肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射を選択するこ とができ、 患者の年 齢、 症状により適宜投与方法を選択するこ とができる。 A complex comprising the anti-integrin a3 antibody of the present invention or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent or toxin, or a pharmaceutical composition comprising the complex, a diagnostic agent, and a diagnostic agent The composition can be administered orally or parenterally systemically or locally. Parenteral administration includes, for example, intravenous injection, Intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection can be selected, and the administration method can be appropriately selected according to the age and symptoms of the patient.
本発明の複合体または該複合体を含んで成る医薬組成物は、 腫瘍 に既に悩まされる患者に、 症状を治癒するか、 あるいは少なく と も 部分的に阻止するために十分な量で投与される。  The conjugate of the invention or a pharmaceutical composition comprising the conjugate is administered to a patient already suffering from a tumor in an amount sufficient to cure or at least partially arrest the condition. .
また、 本発明の複合体または該複合体を含んで成るおよび診断薬 、 診断用組成物は、 腫瘍に既に悩まされる患者の体内の腫瘍の局在 をイメ ージングするために投与される。  Also, the conjugate of the present invention or the diagnostic agent and the diagnostic composition comprising the conjugate and are administered for imaging the localization of a tumor in a patient already suffering from the tumor.
例えば、 有効投与量は、 一回につき体重 1 kgあたり 0. 0 1 mg から 1 00 mgの範囲で選ばれる。 あるいは、 患者あたり 1 - 1 000 mg 、 好ま し く は 5 - 50 mg の投与量を選ぶこ とができる。 しかしながら、 本発 明の複合体または該複合体を含んで成る医薬組成物および診断薬、 診断用組成物はこれらの投与量に制限される ものではない。  For example, an effective dose is selected from the range of 0.01 mg / kg to 100 mg / kg body weight at a time. Alternatively, a dose of 1-1000 mg, preferably 5-50 mg, can be chosen per patient. However, the dose of the complex of the present invention or the pharmaceutical composition, the diagnostic agent, and the diagnostic composition comprising the complex is not limited to these doses.
また、 投与期間は、 患者の年齢、 症状により適宜選択するこ とが できる。  The administration period can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
本発明の複合体または該複合体を含んで成る医薬組成物および診 断薬、 診断用組成物は、 投与経路次第で医薬的に許容される担体や 添加物を共に含むものであってもよい。  The complex of the present invention or a pharmaceutical composition comprising the complex, a diagnostic drug, and a diagnostic composition may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive depending on the administration route. .
このような担体および添加物の例と して、 水、 医薬的に許容され る有機溶媒、 コラーゲン、 ポ リ ビニルアルコール、 ポ リ ビニルピロ リ ドン、 カルボキシビ二ルポ リ マー、 カルボキシメ チルセルロース ナ ト リ ウム、 ポ リ アク リ ル酸ナ ト リ ウム、 アルギン酸ナ ト リ ウム、 水溶性デキス トラ ン、 カルボキシメ チルスターチナ ト リ ゥム、 ぺク チン、 メチルセルロース、 ェチルセルロース、 キサンタ ンガム、 ァ ラ ビアゴム、 カゼイ ン、 ゼラチン、 寒天、 ジグリセリ ン、 プロ ピレ ングリ コール、 ポ リエチレングリ コール、 ワセリ ン、 パラフ ィ ン、 ステア リルアルコール、 ステア リ ン酸、 ヒ ト血清アルブミ ン （HSA ) 、 マンニ トール、 ソルビ トール、 ラ ク トース、 医薬添加物と して 許容される界面活性剤などが挙げられる。 使用される添加物は、 剤 型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、 これ らに限定されるものではない。 Examples of such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, carboxymethyl cellulose nato. Lithium, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, carboxymethylstarch sodium, octyne, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, arabia gum , Casein, gelatin, agar, diglycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, vaseline, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA ), Mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives. The additives to be used are appropriately or in combination selected from the above depending on the dosage form, but are not limited thereto.
本発明はまた、 医薬と して使用される際に本発明の複合体と他の 薬剤、 生物学的製剤や合成医薬製剤などとの、 同時も しく は逐次的 併用投与をも包含する。 他の薬剤と しては、 抗炎症薬ゃ抗アレルギ 一薬、 抗血小板薬、 他の抗腫瘍薬の中から選ばれる。 実施例  The present invention also encompasses simultaneous or sequential concomitant administration of the conjugate of the present invention with other drugs, biological preparations, synthetic pharmaceutical preparations and the like when used as a medicament. Other drugs are selected from anti-inflammatory drugs, antiallergic drugs, antiplatelet drugs, and other antitumor drugs. Example
次に、 実験例及び実施例により本発明をさ らに具体的に説明する 実験例 1. 0 N S抗原の同定  Next, the present invention will be described more specifically with reference to Experimental Examples and Examples. Experimental Example 1.0 Identification of NS antigen
1 ) 抗体ァフ ィ二ティ 一カラムク ロマ トグラフ ィ ー  1) Antibody affinity single column chromatography
0 N S抗原高発現髄芽腫細胞株 （ 0 N S— 7 6、 1 . 2 X 1 0 10 cell) を 0. 5 % Tw e e n 2 0 ZT B Sで可溶化し、 その遠心分 離上清を T w e e n 2 0の濃度が 0. 1 %になるように、 T B Sで 希釈あるいは、 透析膜で交換した。 一方、 C N B r活性化 Sepharo se 4 B (フアルマシア） と O N S— M 2 1抗体により常法でァフ ィ 二ティ一ク ロマ トカラムを調整した。 0 NS antigen-overexpressing medulloblastoma cell lines (0 NS- 7 6, 1. 2 X 1 0 10 cell) were solubilized with 0. 5% Tw een 2 0 ZT BS, the Centrifugal HanareueKiyoshi T The solution was diluted with TBS or replaced with a dialysis membrane so that the concentration of ween 20 became 0.1%. On the other hand, an affinity chromatographic column was prepared by a conventional method using CNBr-activated Sepharose 4B (Pharmacia) and ONS-M21 antibody.
前述の溶液をァフ ィ 二ティ 一カラムにアプライ し、 0. l % Tw e e n 2 0 / T B Sで洗浄し、 グリ シンバッ フ ァ一 （ pH 2. 5、 0 . l %Tw e e n 2 0 ) で溶出した。 溶出液は、 1 M T r i s — H C 1 (pH 8. 5 ) で中和した。 目的の抗原を含む分画を 0 N S— M 2 1 抗体を用いた ドッ トブロ ッ 卜で検索し、 陽性の画分を集めて 同様のァフ ィ 二ティ ーカラムクロマ トグラフ ィ 一を再度行い、 分析 用サンプルを調整した。 サンプル （ 7 ml) のうち 7 0 n 1 を 9 % S D S— P A G Eにより分離後、 銀染色法により分析した （図 1 ) 。 1 4 0 kDa 付近にメ イ ンバン ドを認め、 3 8 kDa 付近にサプノくン ド を観察した。 図 1 において、 レーン 1 ， 4 および 5 はマーカー、 レ ー ン 2 は O N S— 7 6可溶化濃縮液 （サ ンプル） 、 レー ン 3 はサ ン プルが入っていたチューブの洗浄液を泳動したものである。 The above solution is applied to an affinity column, washed with 0.1% Tween 20 / TBS, and glycine buffer (pH 2.5, 0.1% Tween 20). Eluted. The eluate was neutralized with 1 MT ris-HC 1 (pH 8.5). The fraction containing the target antigen was searched for by a dot blot using the 0 NS-M21 antibody, and the positive fractions were collected and subjected to the same affinity column chromatography again for analysis. Samples were prepared. 70 n1 of the sample (7 ml) in 9% S After separation by DS-PAGE, analysis was performed by silver staining (Fig. 1). Main band was observed around 140 kDa, and Sapno band was observed around 38 kDa. In Fig. 1, lanes 1, 4 and 5 show markers, lane 2 shows ONS-76 solubilized concentrate (sample), and lane 3 shows the washing solution of the tube containing the sample. is there.
2 ) N末ァ ミ ノ酸配列の解析  2) Analysis of N-terminal amino acid sequence
サンプル （ 5 0 0 〃 1 ) をマイ ク ロ コ ン 5 0 (ア ミ コ ン） によ り 約 3 0倍に濃縮し 9 % S D S — P A G Eで分離後、 P V D F膜（Tra ns-Blot, Bio-Rad) に常法により転写し、 ポ ンソ一 Sで染色後、 約 1 4 0 kDa のメ イ ンバン ドを切り出し、 ア ミ ノ酸シーケ ンサー （ 4 7 6 A Protein Sequencer, アプライ ドバイオシステムズ） により N末ァ ミ ノ酸配列を分析した。 得られた 2 0 ア ミ ノ酸からなる配列 を G E N E T Y X (ver. 3 3， SWISS- PROT Rel. 3 2 ) によ りホモ ロ ジ一検索を行ったところ、 イ ンテグリ ン α 3の Ν末配列と一致し た。 この結果を表 1 に示す。  The sample (500〃1) was concentrated about 30 times with Microcon 50 (Amicon), separated by 9% SDS-PAGE, and then PVDF membrane (Trans-Blot, Bio -Rad), stained with Ponso-S, excised a main band of about 140 kDa, and extracted with amino acid sequencer (476 A Protein Sequencer, Applied Biosystems) Was used to analyze the N-terminal amino acid sequence. A homologous search was performed on the obtained sequence consisting of 20 amino acids using GENETYX (ver. 33, SWISS-PROT Rel. 32), and the terminal sequence of integrin α3 was found. Matched. Table 1 shows the results.
3 ) 内部ア ミ ノ酸配列の解析  3) Analysis of internal amino acid sequence
サンプル （ 4. 5 ml) を上記実験 2 ) と同様に、 濃縮、 S D S — P A G E , P V D F膜への転写を行い、 約 1 4 0 kDa のメ イ ンバン ドを切り出 した。 バン ドを約 0. 5 mm角に切断し、 7 0 %ギ酸にサ スベン ドし、 2 mgの臭化シア ン （和光純薬のものを常法により昇華 法により精製） を加え溶解し、 室温で 1 8時間反応させた。 溶液を 回収し、 残った膜を 7 0 %ギ酸 （ 2 0 0 1 ) で 2 回洗浄し、 回収 液と洗浄液を混合し遠心濃縮器 （コ ンセン ト レーター C C一 1 8 0 、 ト ミ 一） で減圧乾燥した。  The sample (4.5 ml) was concentrated and transferred to SDS-PAGE and PVDF membranes in the same manner as in Experiment 2) to cut out a main band of about 140 kDa. The band was cut into approximately 0.5 mm squares, suspended in 70% formic acid, and dissolved by adding 2 mg of cyanogen bromide (purified by Wako Pure Chemical's usual method by sublimation method) and dissolved. The reaction was carried out at room temperature for 18 hours. The solution is recovered, the remaining membrane is washed twice with 70% formic acid (2001), the recovered solution and the washing solution are mixed, and a centrifugal concentrator (Concentrator CC-180, Tomi-1) is used. And dried under reduced pressure.
0. 1 % T F A/H 2 0を加え、 よ く撹拌し、 その上清をマイ ク 口ポア一 H P L C (Model 5 S C、 ギルソ ン、 カ ラム ： Vydac C 1 8 / 5 ^ m. 2. 1 X 2 5 0 πιπκ 0. 1 % T F A , A c C Nグラ ジ ェン ト ： 0. 9 %/min 、 0. 2 ml/min ) で分離し、 各ピークを 分取した。 得られた各ピークについてァ ミ ノ酸シーケンサ一により N末配列分析を行った。 5つのピークについてア ミ ノ酸配列を読む こ とができ、 それらの配列はイ ンテグリ 、ノ a 3のメ チォニン切断フ ラグメ ン トの配列と一致した。 この結果を表 1 に示す。 0. 1% TFA / H 2 0 is added, good rather than stirred, the supernatant microphone opening pores one HPLC (Model 5 SC, Giruso down, column:. Vydac C 1 8/5 ^ m 2. 1 X 250 πιπκ 0.1% TFA, Ac CN (0.9% / min, 0.2 ml / min), and each peak was collected. Each of the obtained peaks was subjected to N-terminal sequence analysis using an amino acid sequencer. Amino acid sequences could be read for the five peaks, which were consistent with the sequences of the methionine-cleaved fragments of integer and no3. Table 1 shows the results.
L  L
N -末端配列 FNLDTRFLVVKEAGNPXXLF  N-terminal sequence FNLDTRFLVVKEAGNPXXLF
ITA3 HUMAN FNLDTRFLVVKEAGNPGSLFGYSVALHR  ITA3 HUMAN FNLDTRFLVVKEAGNPGSLFGYSVALHR
1 10 1 10
P9 NITVKNDPGH HI IBD  P9 NITVKNDPGH HI IBD
ITA3 HUMAN NITVKNDPGH HI IED  ITA3 HUMAN NITVKNDPGH HI IED
75 80 89  75 80 89
1 10 1 10
P12 DNLRDKLRPI IIS  P12 DNLRDKLRPI IIS
1TA3 HUMAN DNLRDKLRP1 IIS  1TA3 HUMAN DNLRDKLRP1 IIS
527 535 539  527 535 539
1 7 1 7
P10 NYSLPLR  P10 NYSLPLR
ITA3 HUMAN NYSLPLR  ITA3 HUMAN NYSLPLR
541 547  541 547
1 10 1 10
P13 VNHRLQSFFG GTV  P13 VNHRLQSFFG GTV
ITA3 HUMAN VNHRLQSFFG GTV  ITA3 HUMAN VNHRLQSFFG GTV
735 740 747  735 740 747
1 10 1 10
P12 KTVEDVGSPL KYEFQVGP  P12 KTVEDVGSPL KYEFQVGP
ITA3 HUMAN KTVEDVGSPL KYEFQVGP  ITA3 HUMAN KTVEDVGSPL KYEFQVGP
764 770 781 表 1 中で、 「 N—末端配列」 は本発明の O N S — 7 6株由来の約 1 4 0 kDa 蛋白質の N—末端のア ミ ノ酸配列を示し、 P 9 , P 1 2 ， P 1 0 , P 1 3及び P 1 2 は、 ぃずれも O N S — 7 6株由来の約 1 4 0 kDa 蛋白質の断片のア ミ ノ酸配列を示し、 I T A 3 H U M A Nは、 既知のヒ トイ ンテグリ ン α 3のァ ミ ノ酸配列の対応部分を 示す。 764 770 781 In Table 1, “N-terminal sequence” indicates the amino acid sequence of the N-terminal of the approximately 140 kDa protein derived from the ONS-76 strain of the present invention, and P 9, P 12, and P 1 0, P13 and P12 show the amino acid sequence of a fragment of about 140 kDa protein derived from ONS-76 strain, and ITA3 HUMAN shows the known human integrin α. 3 shows the corresponding part of the amino acid sequence.
実験例 2. 0 N S抗原の異同の確認  Experimental example 2.0 Confirmation of differences in NS antigen
1 . 免疫沈降  1. Immunoprecipitation
O N S抗原高発現ヒ ト髄芽腫細胞株 （O N S — 7 6細胞を 0. 5 % T w e e n 2 0 を含む T B Sで可溶化し、 その遠心分離上清を調 製した。 O N S— 7 6可溶化画分より常法に従いマウス O N S— M 2 1 抗体を用いて免疫沈降を行い O N S抗原を単離した。 すなわち 、 マウス O N S— M 2 1 抗体を 1 O /z gZmlとなるよう に前述の溶 液に添加し、 4 °Cにて一夜イ ンキュベー ト した。 次に、 Protein G - Sepharose (フ アルマシア製） を加え、 4 °Cにて 1 時間イ ンキュべ — 卜 した。 0. 5 %Tw e e n 2 0 を含む T B Sで 3 回洗浄した後 、 遠心し O N S抗原を沈降させた。  Human medulloblastoma cell line with high expression of ONS antigen (ONS-76 cells were solubilized in TBS containing 0.5% Tween 20 and the centrifuged supernatant was prepared. ONS-76 solubilized The ONS antigen was isolated from the fractions by immunoprecipitation using the mouse ONS-M21 antibody according to a conventional method, that is, the above-mentioned solution was used so that the mouse ONS-M21 antibody was 1 O / z gZml. , And incubated overnight at 4 ° C. Next, Protein G-Sepharose (manufactured by Pharmacia) was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 1 hour. After washing with TBS containing 20 times three times, the mixture was centrifuged to precipitate ONS antigen.
2. ウェスタ ン · ブロ ッテイ ング  2. Western Blotting
上記により調製した免疫沈降物を 3分間煮沸したものを、 1 2 % S D S— P A G Eにアプライ し、 O N S抗原を分離した。 次に、 常 法によりニ トロセルロース膜 （Schleicher & Schuell製） に転写し 、 3 %スキム ミ ルクを含む T B Sによるブロ ッキングの後、 イ ンテ グリ ン 3軽鎖を認識するラ ビッ トポ リ ク 口一ナル抗体 （CHEM1C0N The immunoprecipitate prepared above was boiled for 3 minutes, applied to 12% SDS-PAGE, and the ONS antigen was separated. Next, the cells are transferred to a nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell) by a conventional method, and after blocking with TBS containing 3% skim milk, a rabbit pore that recognizes the integrin 3 light chain is obtained. One null antibody (CHEM1C0N
INTERNATIONAL INC製） を含む溶液中 （ 1 g /ml) で室温にて 2 時間ィ ンキュベー ト した。 INTERNATIONAL INC) (1 g / ml) for 2 hours at room temperature.
0. 0 5 %Tw e e n 2 0 を含む T B Sにて 2 回洗浄後、 アル力 リ フォスファ タ一ゼ標識ャギ抗ラ ビッ トイムノ グロブリ ン抗体 （TA GO製） を加え、 室温で 1 時間イ ンキュべ一 卜 した。 0. 0 5 % Tw e e n 2 0を含む T B Sで 3回、 T B Sで 2回洗浄後、 アルカ リ フ ォスフ ァ タ一ゼ基質 N B TZ B C I P (GIBCO BRL社製） を加え発色 させた。 After washing twice with TBS containing 0.05% Tween 20, the antibody was labeled with anti-rabbit immunoglobulin antibody (TA GO) and incubated for 1 hour at room temperature. After washing three times with TBS containing 0.05% Tween 20 and twice with TBS, an alkaline phosphatase substrate NB TZ BCIP (GIBCO BRL) was added to develop color.
その結果、 マウス O N S— M 2 1抗体を用いて免疫沈降を行った 場合のみ、 非還元化で約 1 4 0 kDa (イ ンテグリ ン ひ 3 ) のバン ド が検出された （図 6 ) 。  As a result, only when immunoprecipitation was performed using the mouse ONS-M21 antibody, a band of about 140 kDa (integrin 3) was detected by non-reduction (FIG. 6).
実施例 1 . m 0 N S - M 2 1抗体のィ ン夕一ナ ' ーシヨ ン マウスモノ ク ローナル抗体 （m 0 N S— Μ 2 1抗体） の 1251標 識は、 I 0 D 0 G E N (PIERCE社） で行った。 I O D O G E N 5 gをコー ト したバイアルに、 0. 1 Mリ ン酸緩衝液 pH7. 0 に溶 解した 2 mg/mlの m 0 N S - M 2 1抗体 1 0 0 1 および N a I 0. 5 mC Amersham製） を加え、 3 0秒ごとに 1 0秒間撹拌しな がら室温で 5分間反応した。 反応液を 5 0 0 / 1 の 3 mM N a l を 含む P B Sに加え、 反応を停止させた。 125 I標識 m 0 N S — M 2 1抗体の精製は、 P B Sで平衡化した P D— 1 0 (Pharmacia製） 力 ラムで行った。 125 I標識 m 0 N S— M 2 1抗体の比活性は 3. 2 7 X 1 0 6 cpm/ gであった。 ィ ンターナ リゼーシ ョ ンの測定に際 しては、 非標識 m 0 N S— M 2 1抗体で 5 x 1 0 5 cpm/〃 gとなる よう希釈して使用 した。 EXAMPLE 1 m 0 NS -. 125 1-labeled of M 2 1 antibodies of the fin evening Ichina 'Shiyo down mouse monoclonal click polyclonal antibodies (m 0 NS- Μ 2 1 antibody), I 0 D 0 GEN (PIERCE Company). In a vial coated with 5 g of IODOGEN, add 2 mg / ml m0NS-M21 antibody 1001 and NaI0.5 dissolved in 0.1 M phosphate buffer pH 7.0. mC Amersham) and reacted at room temperature for 5 minutes while stirring for 10 seconds every 30 seconds. The reaction solution was added to 500/1 PBS containing 3 mM NaI to stop the reaction. Purification of the 125 I-labeled m0NS-M21 antibody was performed using a PD-10 (Pharmacia) column equilibrated with PBS. The specific activity of the 125 I-labeled m 0 NS—M 21 antibody was 3.27 × 10 6 cpm / g. Is in when the measurement of I Ntana Rizeshi ® down, was used diluted to a non-labeled m 0 NS- M 2 1 antibody becomes 5 x 1 0 5 cpm / 〃 g.
組織培養用 1 2穴平底プレー ト（CORNING製） に 1 0 %ゥ シ胎児血 清 （F C S ) 含有 R P M I 1 6 4 0培地（G1BC0製） （以下培地） に 懸濁した 0 N S— 7 6細胞を 1穴当たり 2. 0 X 1 0 5 個播種して 、 5 % C 02 イ ンキュベータ一 （ 3 7 °C) で 1 6時間培養した。 氷 上で冷却しながら培地を除去し、 1 0 g/mlの ' 251標識 mO N S - M 2 1 抗体を含む氷冷した培地を加えて 9 0分間反応させた。 氷冷 Hank' s balanced salts solution (以下 H B S S , G1BC0製） で 3回洗浄した後、 培地を 1 ml加えて 5 % C 02 イ ンキュベーター ( 3 7 °C ) も しく は氷上で 6 0分間培養した。 10% in a 12-well flat bottom plate (manufactured by CORNING) for tissue culture. 0 NS—76 cells suspended in RPMI 1640 medium (manufactured by G1BC0) (hereinafter referred to as medium) containing fetal serum (FCS) Were seeded at 2.0 × 10 5 per well, and cultured in a 5% C02 incubator (37 ° C.) for 16 hours. The medium was removed while cooling on an ice, 1 0 g / ml of '25 1-labeled mO NS - was reacted by adding medium iced containing M 2 1 antibody 9 0 min. Ice-cooled Hank's balanced salts solution (HBSS, G1BC0) After washing three times with, 1 ml of the medium was added, and the cells were cultured on a 5% C02 incubator (37 ° C) or on ice for 60 minutes.
細胞を氷上に移し、 冷却しながら氷冷 H B S Sで 1 回洗浄し、 1 mlの氷冷 0. 1 M酢酸、 0. 1 5 M N a C 1 (pH2. 8 ) で 1 0 分間の処理を 2回行う ことにより細胞表面に結合した ' 25 I標識 m 0 N S - M 2 1抗体を除去した。 氷冷した H B S Sで 3回洗浄した 後、 0. 1 % Triton X— 1 0 0、 0. I N N a O Hで細胞を可 溶化し、 細胞の放射能をガンマカウンターで測定した。 Transfer cells to ice, wash once with ice-cold HBSS while cooling, and treat with 1 ml ice-cold 0.1 M acetic acid, 0.15 M NaC1 (pH 2.8) for 10 min. bound '25 I-labeled m 0 NS on the cell surface by performing times - to remove M 2 1 antibody. After washing three times with ice-cold HBSS, the cells were solubilized with 0.1% Triton X—100, and INNAOH, and the radioactivity of the cells was measured with a gamma counter.
細胞内の放射能は、 6 0分間培養後において、 氷上での培養では 増加が見られなかったのに対して、 3 7 °Cでは増加が認められた。 これは、 mO N S— M 2 1抗体が受動的に細胞内に浸透するのでは なく 、 能動的にィ ンターナ リゼーシヨ ンするこ とを示す （図 2 ) 。 実施例 2. m 0 N S - M 2 1抗体と リ シン A鎖からなるィムノ ト キシンの作製  Intracellular radioactivity did not increase after culturing for 60 minutes on ice, but increased at 37 ° C. This indicates that the mONS-M21 antibody does not penetrate into cells passively, but actively engages in internalization (FIG. 2). Example 2. Preparation of imnotoxin consisting of m0NS-M21 antibody and ricin A chain
2価性架橋試薬である N—スク シンィ ミ ジル一 3 — ( 2 — ピリ ジ ルジチォプロ ピオネー ト） （ S P D P) (PIECE製） を N, N—ジメ チルホルムア ミ ドに溶解し 2 mgノ mlと した。  N-Succinimidyl mono-3- (2-pyridyldithiopropionate) (SPDP) (manufactured by PIECE), a bivalent crosslinking reagent, was dissolved in N, N-dimethylformamide to a volume of 2 mg. .
m 0 N S— M 2 1抗体 6 mgを 0. 0 5 Mリ ン酸緩衝液 （ pH 7. 4 ) , 0. 1 5 M塩化ナ ト リ ウム、 0. 0 0 5 M E D T Aにて希釈 し、 抗体溶液 1 mlあたり 1 0 n 1 の S P D P溶液を撹拌しながら添 加した。 溶液液中の抗体の終濃度は 2 mgZmlと した。 抗体濃度は 1 %抗体溶液の 2 8 0 nmの吸光度を 1 3. 5 と して算定した。  Dilute 6 mg of m0NS-M21 antibody with 0.05 M phosphate buffer (pH 7.4), 0.15 M sodium chloride, 0.05 MEDTA, 10 n 1 of SPDP solution was added per 1 ml of the antibody solution while stirring. The final concentration of the antibody in the solution was 2 mgZml. The antibody concentration was calculated based on the absorbance at 280 nm of the 1% antibody solution as 13.5.
これを室温 （ 2 3 °C) で 1 時間反応させ、 抗体をピリ ジルジチォ プロ ピオニル化 （P D P化） した。 反応液を 0. 0 5 Mリ ン酸緩衝 液 （pH7. 4 ) 、 0. 1 5 M塩化ナ ト リ ウム、 0. 0 0 5 M E D T Aで平衡化した Sephadex G— 2 5 カラム （ 1 cmx 1 0 cm) (Pha rmacia Biotech製） にかけ、 未反応の S P D Pを除いた。 抗体の P D P基導入率を調べるため、 P D P化抗体溶液 2 0 0 // 1 に終濃度 2 mMとなるように粉末ジチオ ト レイ トール （和光純薬製 ) を加え、 室温で 3 0分間反応させた。 反応後、 遊離したピリ ジ ン 一 2 —チオ ンの 3 4 3 nmの吸光度を測定し、 P D P基のモル濃度を 定量した。 粉末ジチオ ト レイ トール添加前の抗体溶液の 2 8 0 の 吸光度より吸光係数 1 3 . 5 と して抗体濃度を算定し、 ピリ ジ ン一 2 —チォンのモル吸光係数 £ 3 4 3 nm= 8. 0 8 x 1 0 3 から抗体 1 分子あたりの P D P基を算出した。 その結果、 抗体 1 分子あたり 1 . 6分子の P D P基が導入された。 This was reacted at room temperature (23 ° C) for 1 hour, and the antibody was subjected to pyridyldithiopropionylation (PDP conversion). The reaction solution was applied to a Sephadex G-25 column (1 cm x 1) equilibrated with 0.05 M phosphate buffer (pH 7.4), 0.15 M sodium chloride, and 0.05 MEDTA. 0 cm) (Pharmacia Biotech) to remove unreacted SPDP. To examine the PDP group introduction rate of the antibody, add powdered dithiothreitol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to the PDP-conjugated antibody solution 200 // 1 to a final concentration of 2 mM, and react at room temperature for 30 minutes. Was. After the reaction, the absorbance of the released pyridin-12-thion at 343 nm was measured to quantify the molar concentration of the PDP group. The antibody concentration was calculated as the extinction coefficient of 13.5 from the 280 absorbance of the antibody solution before the addition of powdered dithiothreitol, and the molar extinction coefficient of pyridin-12-thion was £ 34 3 nm = 8 . was calculated 0 8 x 1 0 3 PDP group per antibody molecule from. As a result, 1.6 PDP groups were introduced per antibody molecule.
リ シ ン A鎖 1 . 1 7 mg/ml (ホ一ネ ンコーポレー シ ョ ン製） 1 . 7 mlを 0. 0 5 Mリ ン酸緩銜液 （pH 7 . 4 ) 、 0. 1 5 M塩化ナ ト リ ウム、 0 . 0 0 5 M E D T Aで平銜化した Sephadex G— 2 5 カラム （ 1 cm X 1 0 cm) に力、け、 リ シ ン A鎖の緩衝液を 0. 0 5 M リ ン酸緩衝液 （pH7. 4 ) 、 0. 1 5 M塩化ナ ト リ ウム、 0. 0 0 5 M E D T Aに交換した。 Sephadex G— 2 5 カラムから溶出し たリ シ ン A鎖 0 . 5 mgZml溶液 4 mlに 3 mg/mlに濃縮した P D P化 抗体溶液 l mlを加え、 穏やかに撹拌した後に 1 mlに濃縮し、 室温で 5 6 時間反応させた。 リ シン A鎖濃度は 1 %溶液の 2 8 0 nmの吸光 度を 7 と して算定した。  Ricin A chain 1.17 mg / ml (Honey Corporation) 1.7 ml is added to 0.05 M phosphoric acid bite solution (pH 7.4), 0.15 Apply force to a Sephadex G—25 column (1 cm × 10 cm) that has been bitten with sodium M chloride, 0.05 MEDTA, and add buffer of ricin A chain to 0.05. M phosphate buffer (pH 7.4), 0.15 M sodium chloride, and 0.005 MEDTA were exchanged. Sephadex G-25 Eluted A chain eluted from the column 0.5 A 0.5 mg Zml solution 4 ml of PDP-conjugated antibody solution concentrated to 3 mg / ml 1 ml, gently stirred and concentrated to 1 ml The reaction was carried out at room temperature for 56 hours. Lysine A chain concentration was calculated as the absorbance at 280 nm of a 1% solution as 7.
反応液を 0. 0 5 Mリ ン酸緩衝液 （pH7. 4 ) 、 0. 1 5 M塩化 ナ ト リ ウム、 0. 0 0 5 M E D T Aで平衡化した Sephacryl S 2 0 0 H Rカラム （ 1 . 6 cmx 6 0 cm) (Pharmacia Biotech製） にか け、 未反応のリ シ ン A鎖を除き抗体溶出画分をピーク ト ップを境に 溶出時間にて 2分割 （画分 A， B ) し、 先に溶出した画分 （画分 A ) を濃縮した。  The reaction solution was equilibrated with a 0.05 M phosphate buffer (pH 7.4), 0.15 M sodium chloride, and 0.05 MEDTA, and a Sephacryl S200 HR column (1. 6 cm x 60 cm) (Pharmacia Biotech), except for the unreacted ricin A chain, and divide the antibody-eluting fraction into two parts at the elution time from the peak top (fractions A, B). The fraction eluted earlier (fraction A) was concentrated.
反応生成物および画分 Aを S D S —ポリ アク リ ルア ミ ドゲル電気 泳動 （ 4 — 1 5 %グラ ジェン トゲル） （Pharmacia Biotech製） 後、 クマシ一プリ リ アン トブル一 G 2 5 0 にて染色した。 The reaction product and fraction A were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (4–15% gradient gel) (Pharmacia Biotech), followed by The cells were stained with Coomassie Priliantble G250.
生成したィムノ トキシ ンは抗体 1 分子に対してリ シ ン A鎖が 1 分 子またはそれ以上結合した混合物と して得られた （図 3 ) 。 S D S 一ポリアク リルア ミ ドゲル電気泳動により測定した トキシ ン 1 分子 が結合したィムノ トキシンの分子量はおよそ 1 8 0 k D aであった ο  The resulting imnotoxin was obtained as a mixture of one antibody molecule and one or more molecules of ricin A chain (Figure 3). The molecular weight of imnotoxin bound to one molecule of toxin measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was approximately 180 kDa ο
なお、 一般に抗体分子に対して結合する リ シ ン A鎖数は抗体に導 入する P D P基数により調節可能である。  In general, the number of ricin A chains that bind to an antibody molecule can be adjusted by the number of PDP groups introduced into the antibody.
実施例 3. ィ ムノ トキシ ンのヒ ト髄芽腫由来 O N S— 7 6細胞に 対する特異的増殖抑制効果  Example 3. Specific growth inhibitory effect of immunotoxin on human medulloblastoma-derived ONS-76 cells
リ シ ン A鎖は、 P B Sで平衡化した P D— 1 0 カラム（Pharmacia Biotech製） で 2 — メ ルカプ トエタ ノ ールを除去し、 セ ン ト リ コ ン 一 1 0 ( ア ミ コ ン製） で濃縮して使用 した。 ィムノ トキシンおよび リ シン A鎖の定量は、 ゥ シガンマグロプリ ンをスタ ンダー ドと して Bio-Rad Protein Assay (BIO-RAD製） で行った。  The ricin A chain was removed from the 2–mercaptoethanol with a PD–10 column (Pharmacia Biotech) equilibrated with PBS, and centricon 10 (Amicon) was removed. ). The quantification of imnotoxin and ricin A chain was performed by Bio-Rad Protein Assay (manufactured by BIO-RAD) using sigamma globulin as a standard.
組織培養用 9 6穴平底プレー ト （FALCON製） に、 培地に懸濁した O N S — 7 6細胞を 1 穴当たり 2. 5 X 1 0 3 個播種して、 5 % C 02 イ ンキュベータ一 （ 3 7 °C) で 1 6時間培養した。 In tissue culture 9 6 well flat bottom plates (manufactured by FALCON), ONS were suspended in medium - 7 6 cells per well 2. 5 X 1 0 3 or seeding, 5% C 02 Lee Nkyubeta one (3 The cells were cultured at 7 ° C) for 16 hours.
m O N S— M 2 1 抗体が結合しない細胞と して、 ヒ ト肝癌由来 H u H— 7細胞（Nakabayashi, H. et al. , Cancer Res.， 42, 3858-3 863， 1982， Nakabayashi, H. et al. , Gann, 75， 151-158, 1984) と ヒ ト大腸癌由来 S W 4 8 0細胞（Leibovotz, A. et al. , Cancer Res. 36, 4562-4569, 1976) を 1 穴当たり 1 . O x i O 4 個 （H u H - 7 ) 、 2. 5 X 1 0 4 個 （ S W 4 8 0 ) で播種し、 同様に培養 した。 培地を除去した後、 l / g/ml〜 3 3. 3 pgZmlのィ ムノ ト キシンも しく は 1 0 0 〃 g Ζιη1〜 3. 3 ngZmlのリ シ ン A鎖を含む 培地を 1 穴当たり 1 0 0 1 加えてさ らに 4 4時間培養した。 5 0 i CiZmlの 〔methyl— 3H〕 T H YM I D I N E (Amersham 製） を含む培地を 1 穴当たり 1 0 〃 1 加え、 5 % C 02 イ ンキュべ —夕一 （ 3 7 °C) で 4時間培養した。 培地を除去し、 0. 2 5 % T rypsin- E D T Aを 1 穴当たり 1 0 0 1 加えて細胞を浮遊させた 後に、 ハーべスター （WALLAC製） でガラ スフ ィ ルター （WALLAC製） に吸収させ、 ベータプレー トカウ ンタ一 （WALLAC製） で計数した。 コ ン トロール （培地のみで培養） の計数値を 1 0 0 %と して、 ィム ノ トキシ ンまたは リ シ ン A鎖の増殖抑制活性を算出 した。 その結果 を図 4 および図 5 に示した。 m As a cell to which the ONS-M21 antibody does not bind, human liver cancer-derived HuH-7 cells (Nakabayashi, H. et al., Cancer Res., 42, 3858-3 863, 1982, Nakabayashi, H et al., Gann, 75, 151-158, 1984) and human colon cancer-derived SW480 cells (Leibovotz, A. et al., Cancer Res. 36, 4562-4569, 1976). . 1 O xi O 4 or (H u H - 7), 2. seeded at 5 X 1 0 4 pieces (SW 4 8 0), it was cultured in the same manner. After removing the medium, add 1 / g / ml to 33.3 pgZml of iminotoxin or 100 μg / ml of medium containing ricin A chain of 1 to 3.3 ngZml per well. Further, the cells were further cultured for 44 hours. 5 0 i CiZml of [methyl- 3 H] TH YM IDINE (manufactured by Amersham) Medium 1 0 〃 1 added per well containing, 5% C 0 2 Lee Nkyu base - evening 4 in one (3 7 ° C) Cultured for hours. After removing the medium, add 0.25% Tripsin-EDTA to each well, and add cells to the glass filter (WALLAC) using a harvester (WALLAC). And a beta plate counter (WALLAC). The growth inhibitory activity of imnotoxin or ricin A chain was calculated by setting the count value of the control (cultured in the medium alone) to 100%. The results are shown in Figs.
この結果、 ィムノ トキシ ンは標的細胞のみに特異的な増殖抑制効 果を示すこ とが明らかとなった （表 2 ) 。  As a result, it was clarified that imnotoxin exhibited a growth inhibitory effect specific to only target cells (Table 2).
表 2  Table 2
リ シ ン A鎖およびィ ムノ トキン ンの細胞増殖抑制活性  Cytostatic activity of ricin A chain and imnotokine
( I C 5。 ； ng/ml) リ シ ン A鎖 ィ ムノ ト キシン (IC 5;. Ng / ml ) Re Thin A chain I Takeno preparative Xing
0 N S - 7 6 2 6 2 0. 1 9. 7 0 N S-7 6 2 6 2 0.1 0.1
H u H - 7 7 5 3 8. 7 > 1 0 0 0 S W 4 8 0 8 2 6 2. 2 > 1 0 0 0 実施例 4. 抗体と リ シ ン A 鎖からなるィ ムノ トキシ ンの作製 抗体と リ シ ン A 鎖を 2価性架橋試薬を介して結合させたィムノ 卜 キシ ンを以下の方法で作製した。  H u H-7 7 5 3 8.7> 1 000 SW 480 8 2 6 2.2> 1 000 Example 4 Preparation of imotoxin consisting of antibody and ricin A chain Immunoxin in which the antibody and ricin A chain were bound via a bivalent crosslinking reagent was produced by the following method.
抗体は、 マウスモノ ク ローナル抗体 mONS-M21、 そのヒ ト型化抗体 hONS-M2K その一本鎖 Fv抗体 scFvONS- M21 および mONS- M21の抗原に 反応しない陰性コ ン ト ロール抗体（M0PC31C) を用いた。  For the antibody, use the mouse monoclonal antibody mONS-M21, its humanized antibody hONS-M2K, its single-chain Fv antibody scFvONS-M21, and a negative control antibody (M0PC31C) that does not react with the antigen of mONS-M21. Was.
まず、 抗体に活性化 SH基を導入するため、 それぞれの抗体 0.4mg に対して 5 倍モル量の 2価性架橋試薬 Sulfo- LC- SMPT (スルホスク シニ ミ ジル- 6 _[(a- メ チル -a- (2-ピ リ ジルジチォ） トルア ミ ド] へキサノエ一ト（PIERCE 製） を添加し、 0.2ml の 0.05M リ ン酸緩衝 液（pH 7.4)， 0.15M 塩化ナ ト リ ウム溶液中、 室温にて 1 時間反応さ せた。 First, to introduce activated SH groups into antibodies, a 5-fold molar amount of the divalent crosslinking reagent Sulfo-LC-SMPT (0.4%) was added to 0.4 mg of each antibody. Add cinimidyl-6 _ [(a-methyl-a- (2-pyridyldithio) toluamide] hexanoate (manufactured by PIERCE), and add 0.2 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 7.4), Reaction was performed for 1 hour at room temperature in 0.15M sodium chloride solution.
あらかじめ 0.05M リ ン酸緩衝液（pH 7.4), 0.15M 塩化ナ ト リ ウム にて平衡化したゲル濾過カラム Sephadex G-25 (lcm x 10 cm ) ( フアルマシア バイオテク製） にて、 この反応液から未反応の Sulf o-LC-SMPT を除去した。  A gel filtration column Sephadex G-25 (lcm x 10 cm) (Pharmacia Biotech) previously equilibrated with 0.05M phosphate buffer (pH 7.4) and 0.15M sodium chloride Unreacted Sulfo-LC-SMPT was removed.
回収した抗体画分をセ ン ト リ コ ン- 50(ア ミ コ ン製） にて遠心限外 濾過濃縮した後、 この抗体溶液 0.15mlを分取して、 これに終濃度 2m M となるよ うにジチオ ト レイ トール （和光純薬製） を添加した。 室 温で 1 時間反応後に遊離したピリ ジン- 2- チォンの 343nm の吸光度 (A343)を測定した。 抗体濃度はゥ シガンマグロブリ ンをスタ ンダ一 ドと してマイ ク ロ BCA プロテイ ンア ツセィ試薬（PIERCE 製） にて定 量した。 ピ リ ジ ン -2- チォンの 343nm のモル吸光係数 e = 8.08 x 103 M 一 lcm — 1 から、 [A343 x e (M)/抗体濃度（M)] を計算して 、 抗体 1 分子あたりの活性化 SH基の導入率を求めた。 その結果、 各 抗体の活性化 SH基の導入率は 1.0 〜1, 8 であった。 The collected antibody fraction is concentrated by centrifugal ultrafiltration with Centricon-50 (manufactured by Amicon), and 0.15 ml of this antibody solution is collected to give a final concentration of 2 mM. As described above, dithiothreitol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) was added. After reacting at room temperature for 1 hour, the absorbance at 343 nm (A 343 ) of pyridin-2-thione released was measured. Antibody concentration was determined using Micro BCA protein assay reagent (manufactured by PIERCE) using Sigma globulin as a standard. Calculate [A 343 xe (M) / antibody concentration (M)] from the molar extinction coefficient of pyridin-2-thione at 343 nm e = 8.08 x 10 3 M-1 cm-1 and calculate the value per antibody molecule. Activation rate of SH group was determined. As a result, the introduction rate of the activated SH group of each antibody was 1.0 to 1.8.
リ シ ン A 鎖溶液 （ホーネ ンコーポ レー シ ョ ン製） から 2-メ ルカプ トエタ ノ ールを除去するため、 あらかじめ 0.05M リ ン酸緩衝液 （pH 7.4 ) ， 0.15M 塩化ナ ト リ ウム， 0.005M EDTA で平衡化した Sephad ex G-25 カ ラ ム （lcm x 10 cm ) (フアルマシア バイオテク製） にてゲル濾過してリ シ ン A 鎖を回収した。  In order to remove 2-mercaptoethanol from the ricin A chain solution (produced by Horne Corporation), a 0.05M phosphate buffer (pH 7.4), 0.15M sodium chloride, The ricin A chain was recovered by gel filtration using a Sephad ex G-25 column (1 cm × 10 cm) (manufactured by Pharmacia Biotech) equilibrated with 0.005 M EDTA.
修飾抗体に リ シン A 鎖を結合させるため、 リ シン A 鎖 0. lmg ずつ を各修飾抗体 0. lmg に混合した。 これらをそれぞれセ ン ト リ コ ン -1 0(ア ミ コ ン製） にて約 0.1ml に遠心限外濃縮した後、 室温で 6 日間 反応させた。 反応液からィムノ トキシ ンを以下の通りに精製した。 ゲル濾過カラムは Superdex 200 HR 10/30 (フアルマシア バイオ テク製） を用い、 平衡化と溶出には リ ン酸緩衝液生理食塩水溶液を 用いた。 m0NS-M21、 hONS- M21および M0PC31C では、 反応液をゲル濾 過カラムにかけて、 未反応のリ シ ン Λ 鎖を除去し、 抗体の溶出ピ一 ク ト ップより先に溶出 した画分をィムノ トキシ ン画分と して回収し た。 To bind the ricin A chain to the modified antibodies, 0.1 mg of the ricin A chain was mixed with 0.1 mg of each modified antibody. Each of these was ultracentrifuged to about 0.1 ml with Centricon-10 (manufactured by Amicon), and reacted at room temperature for 6 days. Imnotoxin was purified from the reaction solution as follows. The gel filtration column used was Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech), and a phosphate buffered saline solution was used for equilibration and elution. In the case of m0NS-M21, hONS-M21 and M0PC31C, the reaction solution was applied to a gel filtration column to remove unreacted lysin 、 chains, and the fraction eluted earlier than the antibody elution peak was obtained. Collected as the toxin fraction.
一方、 scFvONS- M21 では、 反応液を同様にゲル濾過カラムにかけ て、 未反応のリ シ ン A 鎖と未反応の scFv抗体を除き、 分子量およそ 60， 000のィ ムノ トキシ ン溶出画分を回収した。 回収した画分をそれ ぞれマイ ク ロ コ ン- 50(ア ミ コ ン製） にておよそ 100 倍に遠心限外濾 過濃縮した。  On the other hand, for scFvONS-M21, the reaction solution was applied to a gel filtration column in the same manner to remove unreacted ricin A chain and unreacted scFv antibody, and to recover an immutoxin eluted fraction with a molecular weight of approximately 60,000. did. Each of the collected fractions was centrifugally ultrafiltered with Microcon-50 (manufactured by Amicon) to about 100 times.
精製したィムノ トキシンについて、 4-15¾；グラ ジェン トゲルの SDS- ポ リ アク リルア ミ ドゲル電気泳動 （フアルマシア バイオテク製） を行い、 クマシ一ブリ リ ア ン トブル一 G250にて染色した。 得られた ィ ムノ トキシンは抗体 1 分子に対してリ シ ン A 鎖が 1 分子結合また はそれ以上結合した複合体であった。  The purified imnotoxin was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (Pharmacia Biotech) on a gradient gel 4-15¾; and stained with Coomassie brilliant blue G250. The resulting immunotoxin was a complex in which one or more ricin A chains bound to one antibody molecule or more.
実施—例 . ヒ 卜型化抗体 hONS - M21ィムノ トキシンおよび scFv 0NS  Implementation—Examples. Humanized antibodies hONS-M21 immunotoxin and scFv 0NS
- M21ィ ムノ トキシ ンのヒ ト髄芽腫由来 0NS-76細 対 する特異的増殖抑制効果  -Specific inhibitory effect of M21 immunotoxin on human medulloblastoma-derived 0NS-76 cells
リ シン A 鎖は、 リ ン酸緩衝液生理食塩水溶液（PBS) で平衡化した PD-10 カラム （フアルマシア バイオテク製） で 2-メルカプ トエタ ノ ールを除去し、 セン 卜 リ コ ン- 10(ア ミ コ ン製） で濃縮して使用 し た。 ィムノ トキシンおよびリ シン A 鎖の定量は、 ゥ シガンマグロブ リ ンをスタ ンダ一 ドと してバイオラ ドプロティ ンア ツセィ （バイオ ラ ド製） で行った。 リ シ ン A 鎖は分子量 30， 000、 scFvONS-M21 ィム ノ トキシンは分子量 60, 000、 その他のィムノ トキシンは分子量 180， 000 と してモル濃度を算出 した。 ONS- 76細胞を 105ί ゥ シ胎児血清 （FCS ) 含有 RPMI 1640培地 （GIBC 0 製） （ 以下培地） に懸濁して、 組織培養用 96穴平底プレー 卜 （フ アルコ ン製） に 1 穴当たり 2.5 X 103 個播種した。 同様に、 HuH- 7 細胞を培地に懸濁して、 96 穴平底プレー ト 1 穴当たり 5.0 103 個 播種した。 これらを 37°Cにて 5¾!C02 下で 16時間培養した。 培地を除 去した後、 培地にて階段希釈したィムノ トキシ ンも し く はリ シ ン A 鎖を 1 穴当たり 100 1 加えた。 44時間培養した後、 50 /z Ci/ml の [ メ チル -3H]チ ミ ヂン （アマシ ャム製） を含む培地を 1 穴当たり 10 fi 1 加え、 さ らに 4 時間培養した。 Lysine A chain was removed from 2-mercaptoethanol using a PD-10 column (Pharmacia Biotech) equilibrated with a phosphate buffered saline solution (PBS), and centricon-10 ( (Made by Amicon). Quantification of imnotoxin and ricin A chain was performed using Biorad Protein Assay (manufactured by BioRad) using sigamma globulin as a standard. The molarity was calculated assuming that the molecular weight of the ricin A chain was 30,000, the molecular weight of scFvONS-M21 imnotoxin was 60,000, and that of other imnotoxins was 180,000. Suspend ONS-76 cells in RPMI 1640 medium (manufactured by GIBCO) (hereinafter referred to as medium) containing 105FC ゥ fetal serum (FCS), and place them in a 96-well flat bottom plate for tissue culture (manufactured by Falcon) for 2.5 per well. X 10 three were sown. Similarly, HuH- 7 cells suspended in medium were plated 5.0 10 3 96 well flat bottom plates per well. These were cultured at 37 ° C under 5¾! C02 for 16 hours. After removing the medium, 100 1 of imnotoxin or ricin A chain serially diluted in the medium was added per well. After culturing for 44 hours, 50 / z Ci / ml of [methylmercury - 3 H] medium 10 fi 1 added per well containing Ji Mi Ding (manufactured by Cane catcher arm), were cultured for 4 hours to further.
培地を除去し、 0.25% ト リプシン- EDTA を 1 穴当たり 50 I 加え て細胞を浮遊させた。 細胞をハーべスター （WALLAC製） でガラスフ ィ ルター （WALLAC製） に吸収させ、 ベータプレー トカウ ンタ一 （WA LLAC製） で細胞に取り込まれた [ メチル -3H]チ ミ ヂンの放射活性を 計数した。 コ ン トロール （培地のみで培養） の計数値を 100%と して 増殖抑制活性を算出した。 その結果を図 7 および図 8 に示した。 そ の結果、 hONS- M21ィ ムノ ト キシ ン、 scFvONS- M21 ィ ム ノ トキシ ンは いずれも抗原陽性細胞選択的な増殖抑制効果を示した。 その活性は hONS- M21ィ ムノ トキシ ンでは mONS- M21ィ ムノ ト キシ ンと ほぼ同程度 であ り、 scFvONS - M21 ィ ムノ トキ シ ンでは mONS-M21ィ ムノ トキシ ン の約 1/200 であった。  The medium was removed, and cells were suspended by adding 50 I per well of 0.25% trypsin-EDTA. Cells are absorbed by a glass filter (WALLAC) using a harvester (WALLAC), and the radioactivity of [methyl-3H] thymidine incorporated into the cells is counted by a beta plate counter (WALLAC). did. The growth inhibitory activity was calculated assuming that the control (cultured in the medium alone) count value was 100%. The results are shown in FIGS. 7 and 8. As a result, both hONS-M21 immunotoxin and scFvONS-M21 immunotoxin showed selective growth inhibition effect on antigen-positive cells. The activity of hONS-M21 immunotoxin is almost the same as that of mONS-M21 immunotoxin, and that of scFvONS-M21 immunotoxin is about 1/200 of that of mONS-M21 immunotoxin. Was.
なお、 表 3 に、 0NS- 76細胞および HuH- 7 細胞に対するィ ムノ トキ シ ン、 リ シ ン A 鎖の IC5。値を示した。 Incidentally, in Table 3, 0NS- 76 cells and HuH- 7 I Takeno butoxy down to cells, Li Thin A IC strand 5. The value was shown.
¾ 3_  ¾ 3_
ヒ ト型化および scFvONS- M21 ィ ムノ トキシ ンの細胞増殖抑制活性 Humanized and cytostatic activity of scFvONS-M21 imotoxin
( 1C50 ； nM) ィ ムノ トキシ ン 0NS- 76 HuH - 7 リ シ ン A鎖 21 59 MOPC- 31Cィ ムノ トキシ ン > 5.6 > 5.6 mONS- M21ィ ム ノ ト キシ ン 0.027 > 5.6 hONS- M21ィ ムノ トキシ ン 0.037 > 5.6 scFvONS - M21ィ ムノ ト キシ ン 6.4 > 17 実施例 6. 化学療法剤ィム ノ コ ン ジユゲー 卜の作製 (1C 5 0; nM) I Takeno butoxy down 0NS- 76 HuH - 7 Li Thin A chain 21 59 MOPC-31C immunotoxin>5.6> 5.6 mONS-M21 immunotoxin 0.027> 5.6 hONS-M21 immunotoxin 0.037> 5.6 scFvONS-M21 immunotoxin 6.4> 17 Example 6. Chemotherapy Preparation of Immobilized Conjugate
化学療法剤ィムノ コ ンジュゲー トの 1 例と してデキス ト ラ ンを中 間支持体と したダウ ノルビシ ン（ 以下 DNR)ィムノ コ ンジュゲー トを 作製した。 作製法は、 Zhenping Zhuら（ lmmuno 1 Immunother, 40， 2 57-267, 1995) が報告した抗体- ア ドリ アマイ シ ン複合体の方法に 従い、 部分的に改変して下述のよ う に行った。  As an example of the chemotherapeutic agent imno conjugate, daunorubicin (DNR) imno conjugate using dextran as an intermediate support was prepared. The preparation method is based on the method of the antibody-adriamycin complex reported by Zhenping Zhu et al. (Lmmmuno 1 Immunother, 40, 257-267, 1995), and partially modified as described below. went.
1) デキス ト ラ ンの酸化  1) Oxidation of dextran
平均分子量 40， 000のデキス トラ ン 2 mg (0.05 mmol, 単糖に換算 して 11.1 mmol)と NaI04 0.94 g (4.4 mmol) を精製水 400 mlに溶 解し、 25°Cで 2 時間撹拌した。 反応終了後、 限外濾過 （ セ ン ト リ プレップ- 10， ア ミ コ ン製） により反応液を約 20 ml に濃縮した。 これを精製水中で透析後、 凍結乾燥した。 Average molecular weight 40, 000 dextrin tiger down 2 mg of construed soluble in (0.05 mmol, converted to 11.1 mmol monosaccharide) and NaI0 4 0.94 g (4.4 mmol) of purified water 400 ml and stirred for 2 hours = 25 ° C in did. After completion of the reaction, the reaction solution was concentrated to about 20 ml by ultrafiltration (Centreprep-10, manufactured by Amicon). This was dialyzed in purified water and freeze-dried.
2) デキス ト ラ ン-（NHNH2)の合成 2) Synthesis of dextran- (NHNH 2 )
16 g の adipic dihydrazide (91.84 mmol) を 150 ml の 100 mM 酢酸緩衝液 （PH 4.5) に溶解した。 一方、 200 m の酸化デキス トラ ン （4.76 / mol)を 10 mlの 100 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （pH 4 .5) に溶解した。 adipic dihydrazide溶液を室温で撹拌しながら酸 化デキス ト ラ ン溶液を滴下して加え、 さ らに 2 時間撹拌した。 この 反応液に、 NaBH3CN 30 mg を溶解した 100 mM酢酸ナ ト リ ゥム緩衝液16 g of adipic dihydrazide (91.84 mmol) was dissolved in 150 ml of 100 mM acetate buffer (PH 4.5). On the other hand, 200 m of dextran oxide (4.76 / mol) was dissolved in 10 ml of 100 mM sodium phosphate buffer (pH 4.5). While stirring the adipic dihydrazide solution at room temperature, the oxidized dextran solution was added dropwise, and the mixture was further stirred for 2 hours. To this reaction solution, NaBH 3 CN 30 100 mM acetate Na bets were dissolved mg Li © beam buffer
(pH 4.5) 10 ml を添加して室温で一晩撹拌した。 不溶物を濾過除 去した後、 限外濾過 （セ ン ト リ ブレ ッ プ- 10， ア ミ コ ン製） で約 10 ml に濃縮した。 反応溶液は 100 mM酢酸ナ ト リ ウム緩衝液 （pH 4.5) に対して透析 後、 Sephacryl S200 HR 16/60 カラ ム （フアルマシア バイ オテ ク 製） を用いたゲル濾過法により精製した。 (pH 4.5) 10 ml was added and the mixture was stirred at room temperature overnight. After removing insoluble matter by filtration, the mixture was concentrated to about 10 ml by ultrafiltration (Centrebrep-10, manufactured by Amicon). The reaction solution was dialyzed against a 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.5), and purified by a gel filtration method using Sephacryl S200 HR 16/60 column (Pharmacia Biotech).
3) ra0NS- 21 の糖鎖の酸化  3) Oxidation of sugar chain of ra0NS-21
21.3 mg/mlの mONS-M21 0.5 ml (68.3 nmol) を 20 mM リ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 （pH 5.5) 0.5 mlにて希釈した。 これに 40 mg/ml al 04を 0.1 ml (18.7/z mol)添加した。 反応溶液を室温で 90 分遮光下 にて撹拌した。 80 l の ethylene glycol を添加して反応を完結さ せた後、 次の反応に用いる 100 mM酢酸ナ ト リ ウム緩衝液 （pH 4.5) に対して透析した。 0.5 ml (68.3 nmol) of 21.3 mg / ml mONS-M21 was diluted with 0.5 ml of 20 mM sodium phosphate buffer (pH 5.5). The 40 mg / ml al 0 4 was added 0.1 ml (18.7 / z mol) thereto. The reaction solution was stirred at room temperature under light shielding for 90 minutes. After completion of the reaction by adding 80 l of ethylene glycol, it was dialyzed against 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.5) to be used in the next reaction.
4) mONS- M2卜デキス トラ ン-（NHNH2)合成 4) mONS-M2 dextran- (NHNH 2 ) synthesis
2.5 mg/ml の酸ィ匕 mONS— M21 0.5 ml (8.31 nmol) と 9.4 mg/ml の デキス トラ ン-（NHNH2) 1.2 ml (208 nmol)を、 7.3 ml の 100 mM酢酸 ナ ト リ ウム緩衝液 （PH 4.5) に希釈した（mONS- M21:デキス 卜ラ ン- ( NHNH2)-1 :25, mol :mol) 。 これを 4 °Cでー晚撹拌した。 次に、 結合 を安定化させるため、 200 mg/ml の NaBH3CN 0.5 ml (1.59 mmol)を 添加して、 4 °Cで 3 時間撹拌した。 反応溶液はリ ン酸緩衝液（pH 7. 5)生理食塩水中で透析した。 プロテイ ン A カラム キッ ト （Ampure PA, アマシ ャ ム製） に抗体を結合させて、 抗体に結合しなかった デキス トラ ン _(NHNH2)を素通り させて回収した後、 カラムから抗体 を溶出させ、 回収した。 2.5 mg / ml of acido mONS—M21 0.5 ml (8.31 nmol) and 9.4 mg / ml dextran- (NHNH 2 ) 1.2 ml (208 nmol), 7.3 ml of 100 mM sodium acetate buffer The solution was diluted with a liquid (PH 4.5) (mONS-M21: dextran- (NHNH 2 ) -1: 25, mol: mol). This was stirred at 4 ° C. Next, in order to stabilize the binding, 0.5 ml (1.59 mmol) of 200 mg / ml NaBH 3 CN was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 3 hours. The reaction solution was dialyzed in a phosphate buffer (pH 7.5) physiological saline. After binding the antibody to a protein A column kit (Ampure PA, manufactured by Amersham) and collecting by passing through dextran _ (NHNH 2 ) that did not bind to the antibody, the antibody was eluted from the column. , Collected.
5) DNRィ ム ノ コ ンジュゲー トの合成  5) Synthesis of DNR immunoconjugate
mONS- 21- デキス トラ ン-（NHNH2)と DNR 塩酸塩を- NHNH2： DNR = 1： 1 0 のモル比で 0.1 M PBS (pH 7.8)中で混合し、 4 てで 3 日間穏やか に撹拌した。 反応溶液を限外濾過 （セン ト リ ブレップ- 10， ア ミ コ ン製） で濃縮後、 Sephacryl S200 HR 16/60 カラム （フアルマシア バイオテク製） を用いたゲル濾過法にて精製した。 DNR ィムノ コ ンジユゲー トの Sephacryl S200 HR 16/60 カラム ク ロマ トグラ フ ィ —の溶出結果 （移動層緩衝液 ： 10mMリ ン酸緩衝液、 150mM NaCl (pH 7.5) ； 流速 ： 0.8ml/min ； 分画 ： 0.8ml/分画 ； 検出 ： Ahs 280ηπι)を 図 9 に示した。 mONS-21-dextran- (NHNH 2 ) and DNR hydrochloride were mixed in a molar ratio of -NHNH 2 : DNR = 1: 10 in 0.1 M PBS (pH 7.8), and gently mixed at 4 for 3 days. Stirred. The reaction solution was concentrated by ultrafiltration (Centre Brep-10, manufactured by Amicon) and then purified by gel filtration using a Sephacryl S200 HR 16/60 column (Pharmacia Biotech). DNR Immunoko Elution results of Sephacryl S200 HR 16/60 column chromatography on unzygate (mobile phase buffer: 10 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl (pH 7.5); flow rate: 0.8 ml / min; fractionation: 0.8 ml / fraction; detection: Ahs 280ηπι) is shown in FIG.
その結果、 プロテイ ン Α 結合画分から mONS- M21- デキス トラ ン- D NR 複合体（ 分子量 257 kDa ) が得られた。 一方、 プロティ ン A 通 過画分からデキス トラ ン- DNR複合体（60 kDa) を回収した。  As a result, a mONS-M21-dextran-DNR complex (molecular weight: 257 kDa) was obtained from the protein-bound fraction. On the other hand, a dextran-DNR complex (60 kDa) was recovered from the fraction passed through Protein A.
mONS-M21- デキス トラ ン- DNR複合体の分子量から 250- 260 kDa の 複合体は、 抗体 1 分子に 2- 3 分子のデキス トラ ン -(NHNH2)が結合し ていると計算された。 抗体と DNR の濃度測定から mONS- M21- デキス トラ ン- DNR複合体は、 複合体 1 分子に対して約 10分子の DNR が、 デ キス トラ ン -DNR複合体はデキス 卜ラ ン 1 分子に対して約 18分子の DN R が結合していると計算された。 From the molecular weight of the mONS-M21-dextran-DNR complex, the complex of 250-260 kDa was calculated to have 2-3 molecules of dextran- (NHNH 2 ) bound to one antibody molecule. From the measurement of the antibody and DNR concentrations, the mONS-M21-dextran-DNR complex had about 10 molecules of DNR per complex molecule, and the dextran-DNR complex had 1 molecule of dextran. On the other hand, it was calculated that about 18 molecules of DN R were bound.
実施例 7. デキス トラ ンを中間支持体と した DNR ィムノ コ ン ジュ ゲー トのヒ ト髄芽腫由来 0NS-76細胞に対する特異的増 殖抑制効果  Example 7. Specific growth-inhibitory effect of DNR immunoconjugate using dextran as an intermediate support on human medulloblastoma-derived 0NS-76 cells
0NS- 76細胞を 10% ゥ シ胎児血清 （FCS ) 含有 RPMI1640培地 （G1BC 0 製） （ 以下培地） に懸濁して、 組織培養用 96穴平底プレー ト （フ アルコ ン製） に 1 穴当たり 5.0 X 103 個播種した。 同様に HuH-7 細 胞を 1 穴当たり 2.0 X 104 個播種した。 これらを 37°Cにて 5!¾C02 下 で 16時間培養した。 培地を除去した後、 培地にて階段希釈した DNR ィムノ コ ンジュゲー ト も し く は DNR を 1 穴当たり 100 1 加えて 20 時間培養した。 50 z Ci/ml の [ メ チル -3H]チ ミ ジ ン （アマ シ ャ ム製 ) を含む培地を 1 穴当たり 10 1 加え、 さ らに 4時間培養した。 培地を除去した後、 0.25¾ ト リプシ ン - EDTA を 1 穴当たり 50 1 で加えて細胞を浮遊させた。 細胞をハーべスター （WALLAC製） でガ ラスフ ィ ルタ一 （WALLAC製） に吸収させた。 ベータプレー トカウ ン ター （WALLAC製） で細胞に取り込まれた [メ チル- 3H]チ ミ ヂンの放 射活性を計数した。 コ ン ト ロ ール （培地のみで培養） の計数値を 10 0 と して増殖率を算出した。 その結果を図 1 0 および図 1 1 に示し た。 DNR ィムノ コ ンジュゲー ト（ 図中では ONS- DNR と略称） は抗原 陽性 0NS- 76細胞に対して DNR 単独およびデキス 卜ラ ン- DNR複合体（ 図中では Dex- DNR と略称） より強い増殖抑制効果を示し、 その強さ は DNR 単独の 3.3 倍、 デキス トラ ン -DNR複合体の約 10倍に相当した 。 一方抗原陰性の HuH-7 細胞に対して、 DNRィムノ コ ンジュゲー ト はデキス トラ ン -DNR複合体と同程度の増殖抑制効果しか示さなかつ た。 なお、 表 4 に 0NS-76細胞および HuH-7 細胞に対するィムノ コ ン ジュゲー ト、 DNR の 1 C 5。値を示した。 0NS-76 cells are suspended in RPMI1640 medium (manufactured by G1BC0) (hereinafter referred to as medium) containing 10% fetal serum (FCS) and placed in a 96-well flat bottom plate for tissue culture (Falcon) at 5.0 per well. X 10 three were sown. Similarly, 2.0 × 10 4 HuH-7 cells were seeded per well. These were cultured for 16 hours at 5! ¾C0 2 under at 37 ° C. After removing the medium, 100 ml / well of DNR immi-conjugate or DNR diluted serially in the medium was added and the cells were cultured for 20 hours. 50 z Ci / ml of [methylmercury - 3 H] medium 10 1 added per well containing Chi Mi di emissions (flax sheet catcher manufactured arm), were cultured for 4 hours to further. After removing the medium, cells were suspended by adding 0.25¾ trypsin-EDTA at 50 1 per well. The cells were absorbed into a glass filter (WALLAC) using a harvester (WALLAC). Beta plate count Incorporated into cells coater (manufactured by WALLAC) [methylation - 3 H] were counted release morphism activity Ji Mi Ding. The proliferation rate was calculated by setting the count value of the control (cultured in the medium alone) to 100. The results are shown in FIGS. 10 and 11. DNR Immo conjugate (abbreviated as ONS-DNR in the figure) inhibits the growth of antigen-positive 0NS-76 cells more than DNR alone and dextran-DNR complex (abbreviated as Dex-DNR in the figure) The effect was 3.3 times that of DNR alone and about 10 times that of dextran-DNR complex. On the other hand, DNR immunoconjugate showed only the same growth inhibitory effect as dextran-DNR complex on antigen-negative HuH-7 cells. Incidentally, Imuno co down Juge DOO, 1 C 5 of DNR against 0NS-76 cells and HuH-7 cells in Table 4. The value was shown.
以上のこ とから、 DNRィムノ コ ンジュゲー ト もィムノ トキシンと 同様に抗原陽性細胞に対して選択的な増殖抑制効果を示すこ とが明 らかとなつた。  From the above, it has been clarified that DNR immunoconjugate also shows a selective growth inhibitory effect on antigen-positive cells similarly to immunonotoxin.
g 1  g 1
DNRィ ムノ コ ンジユゲー 卜の細胞増殖抑制活性  Cell proliferation inhibitory activity of DNR immunoconjugate
( IC5 o ； nM) ィムノ コ ンジュゲー ト ONS-76 HuH-7 (IC 5 o; nM) Imno conjugate ONS-76 HuH-7
DNR 19 46  DNR 19 46
Dex - DNR 61 130  Dex-DNR 61 130
ONS- DNR 6.9 > 270 参考例 1 . m 0 N S - M 2 1 抗体産生ハイプリ ドーマの作成 m 0 N S - M 2 1 抗体を産生するハイプリ ドーマは、 ヒ ト髄芽腫 由来細胞株 O N S — 7 6 で免疫した B A L B / cマウスの脾臓細胞 とマウス骨髄腫細胞株 P 3 U 1 をポ リ エチ レ ングリ コールを用いた 常法により融合して作成した。 ヒ ト髄芽腫由来細胞株 0 N S - 7 6 と結合する活性を指標と したスク リ ーニ ングを行い、 m 0 N S — M 2 1 抗体産生ハイプリ ドーマを樹立した（S. Mori uchi et al. , Br. J . Cancer (1993) 68， 831-837) 。 ONS-DNR 6.9> 270 Reference Example 1. Preparation of m0NS-M21 Antibody-producing Hypri-Doma A hybrid domema producing the m0NS-M21 antibody is a human medulloblastoma-derived cell line ONS — 76 A spleen cell of a BALB / c mouse immunized with the above was fused with a mouse myeloma cell line P3U1 by a conventional method using polyethylene glycol. Human medulloblastoma-derived cell line 0 NS-7 6 Screening was carried out using the activity of binding to mN NS —M 21 antibody-producing hybridomas (S. Mori uchi et al., Br. J. Cancer (1993) 68, 831). -837).
m O N S — M 2 1 抗体産生ハイプリ ドーマをマウス腹腔に移植し 、 得られた腹水をプロテイ ンァガロースカラムにかけ、 精製マウス モノ ク ローナル抗体を得た。 得られたマウ スモノ ク ローナル抗体 m 0 N S - M 2 1 の L鎖および H鎖のタイプを調べるために、 マウス モノ ク ローナル抗体ァイ ソ タイ ピングキ ッ 卜 （アマシ ャ ムイ ンタ一 ナシ ョ ナル pic製） を用いてタイ ピングを行った。 その結果、 m O N S - M 2 1 抗体は / c型 L鎖およびァ 1 型 H鎖を有するこ とが明ら かになつた。 なお、 上記のハイプリ ドーマは、 （財） 発酵研究所 （ 大阪府大阪市淀川区十三本町 2- 17-85 ) に I F 0 5 0 3 8 2 と し て寄託された。  The mONS-M21 antibody-producing hybridoma was transplanted into the abdominal cavity of a mouse, and the obtained ascites was applied to a protein agarose column to obtain a purified mouse monoclonal antibody. In order to examine the type of the L chain and H chain of the obtained mouse monoclonal antibody m0NS-M21, a mouse monoclonal antibody isotyping kit (Amersham International Co., Ltd. pic. Was used for typing. As a result, it was clarified that the mONS-M21 antibody had a / c-type L chain and an a1-type H chain. The above-mentioned Hypri-Doma was deposited with the Fermentation Research Institute (2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Osaka) as IF500382.
参考例 2. 再構成ヒ ト 0NS-M21 抗体の作製  Reference Example 2. Preparation of reconstituted human 0NS-M21 antibody
再構成ヒ ト ONS- M21 抗体を国際特許出願公開番号 W0 95-14041 に 記載の方法により得た。  Reconstituted human ONS-M21 antibody was obtained by the method described in International Patent Application Publication No. W095-14041.
参考例 1 で作製されたマウ ス 0NS-M21 抗体 （mONS- M21抗体） 抗体 産生ハイプリ ドーマから常法により全 RNA を調製し、 これより二本 鎖 cDNAを合成した。 この二本鎖 cDNAを用いてポ リ メ ラーゼ連鎖反応 (PCR ) 法により mONS- M21抗体の軽鎖 （L 鎖） および重鎖 （H 鎖） の可変領域 （V 領域） をコー ドする DNA を増幅した。 PCR 法には、 Jones, S. T. et al. , Bio/Technology (1991) 9， 88-89 に記載さ れたプライマ一を使用 した。 PCR 法により増幅した DNA 断片を低融 点ァガロースにより精製し、 mONS- M21抗体の k型 L 鎖 V 領域をコー ドする遺伝子を含む DNA 断片および H 鎖 V 領域をコー ドする遺伝子 を含む DNA 断片を得た。  From the mouse 0NS-M21 antibody (mONS-M21 antibody) antibody-producing hybridoma prepared in Reference Example 1, total RNA was prepared by a conventional method, and double-stranded cDNA was synthesized therefrom. Using this double-stranded cDNA, the DNA encoding the variable region (V region) of the light chain (L chain) and heavy chain (H chain) of the mONS-M21 antibody was determined by the polymerase chain reaction (PCR) method. Amplified. For PCR, primers described in Jones, ST. Et al., Bio / Technology (1991) 9, 88-89 were used. The DNA fragment amplified by the PCR method is purified by low melting point agarose, and a DNA fragment containing the gene encoding the k-type L chain V region and a DNA fragment containing the gene encoding the H chain V region of the mONS-M21 antibody I got
これらの DNA 断片を、 5'側末端に Sal I 接着末端を有し、 3'側末 端に Xma 1 接着末端を有するよう制限酵素で消化した。 得られた各 々 の DNA 断片を pUC19 ベク タ一に連結し、 大腸菌 DH5 のコ ン ビテ ン ト細胞に導入して、 大腸菌細胞を形質転換した。 These DNA fragments were prepared with a Sal I cohesive end at the 5 'end and a 3' end. It was digested with a restriction enzyme to have an Xma 1 cohesive end at the end. Each of the obtained DNA fragments was ligated to pUC19 vector, and introduced into Escherichia coli DH5 competent cells to transform Escherichia coli cells.
形質転換した大腸菌よりアルカ リ法によりプラス ミ ド DNA を調製 し、 プラス ミ ド中の cDNAコ一 ド領域の塩基配列を常法により決定し た。 さ らに、 これらの cDNAに含まれる L 鎖及びの V 領域をコ一 ドす る DNA の相補性決定領域 （complementarity determining region; CDR ) を決定した。  Plasmid DNA was prepared from the transformed E. coli by the alkaline method, and the nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined by a conventional method. Furthermore, the complementarity determining region (CDR) of the DNA encoding the L chain and the V region contained in these cDNAs was determined.
キメ ラ ONS- M21 抗体を発現するベク ターを作製するために、 各々 niONS_M21抗体の k 型し 鎖及び H 鎖の V 領域をコー ドする cDNAを含む PUC19 ベク タ一を修飾した。 次いで、 これらの cDNAを別々の HEF 発 現べクタ一に挿入した。 HEF 発現ベク ターを COS 細胞に同時形質転 換し、 キメ ラ ONS- M21 抗体を発現させた。 発現させたキメ ラ 0NS-M2 1 抗体の抗原結合活性を Cell- ELISAにより調べた結果、 キメ ラ 0NS - M21 抗体は抗原である ヒ ト髄芽腫細胞株 0NS-76と特異的に結合した 。 したがって、 このキメ ラ抗体が mONS-M21抗体の正しい構造を有す ることが示された。  In order to prepare vectors expressing the chimeric ONS-M21 antibody, the PUC19 vector containing cDNAs encoding the k-type chain and the V region of the H chain of the niONS_M21 antibody was modified, respectively. These cDNAs were then inserted into separate HEF expression vectors. The HEF expression vector was co-transformed into COS cells to express the Chimera ONS-M21 antibody. As a result of examining the antigen-binding activity of the expressed chimera 0NS-M21 antibody by Cell-ELISA, the chimera 0NS-M21 antibody specifically bound to the human medulloblastoma cell line 0NS-76 as an antigen. Therefore, it was shown that this chimeric antibody had the correct structure of the mONS-M21 antibody.
ヒ ト型化 ONS- M21 抗体を CDR- grafting法により作製した。 L 鎖に ついてはフ レームワーク領域 （framework region ； FR) のァ ミ ノ 酸残基を置換することにより、 16バー ジ ョ ンを構築した。 ヒ ト型化 0NS-M21 抗体の L 鎖及び H 鎖をコ— ドする遺伝子を含む DNA 断片を HEF 発現ベクターに挿入した。 これらの HEF 発現べク タ一により CO S 細胞を同時形質転換し、 ヒ ト型化 ONS- M21 抗体を発現させた。 得 られたヒ ト型化 0NS-M21 抗体の抗原結合活性を CeH- ELISAにより調 ベた結果、 いく つかの L 鎖バー ジ ョ ンを含むヒ ト型化 ONS- M21 抗体 は、 抗原である ヒ ト髄芽腫細胞株 0NS- 76にキメ ラ 0NS-M21 抗体と同 程度に結合した。 したがって、 これらのヒ ト型化 0NS-M21 抗体は、 良好な抗原結合活性を持つ機能的抗原結合部位を有するこ とが示さ れた。 Humanized ONS-M21 antibody was produced by CDR-grafting. For the L chain, 16 versions were constructed by substituting the amino acid residues in the framework region (FR). A DNA fragment containing the gene encoding the L chain and H chain of the humanized 0NS-M21 antibody was inserted into the HEF expression vector. COS cells were co-transformed with these HEF expression vectors to express humanized ONS-M21 antibody. As a result of examining the antigen-binding activity of the obtained humanized 0NS-M21 antibody by CeH-ELISA, the humanized ONS-M21 antibody containing several L-chain versions showed that It bound to the medulloblastoma cell line 0NS-76 to the same extent as the Chimera 0NS-M21 antibody. Therefore, these humanized 0NS-M21 antibodies It was shown to have a functional antigen-binding site with good antigen-binding activity.
なお、 ヒ ト型化 ONS- M21 抗体の L 鎖及び H 鎖をコー ドする DNA を 含むプラス ミ ドを有する大腸菌は、 各々 Escherichia col i DH5a ( HEF-RVL-M21p-gk ) 、 Escherichia col i DH5a ( HEF-RVH-M21 - ァ 1 ) と して、 工業技術院生命工学工業技術研究所 （茨城県つく ば市 東 1 丁目 1 番 3 号） に、 平成 5 年 11月 18日に、 各々 FERM BP- 4472及 び FERM BP- 4471と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託された。  Escherichia coli having a plasmid containing DNA coding for the L chain and H chain of the humanized ONS-M21 antibody was Escherichia coli i DH5a (HEF-RVL-M21p-gk) and Escherichia coli i DH5a, respectively. (HEF-RVH-M21-a1) and the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-3 1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture) on November 18, 1993, respectively. Deposited internationally under BP-4472 and FERM BP-4471 under the Budapest Treaty.
参考例 3. 再構成ヒ 卜 0NS-M21 抗体一本鎖 Fv (scFv) の作製 参考例 2で得られたヒ ト型化 ONS- M21 抗体の L 鎖および H 鎖の V 領域を用いた一本鎖 Fv (single chain Fv ) を国際特許出願公開番 号 W0 95-14041 に記載の方法により得たア ミ ノ酸配列 Gly- Gly- Gly Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (配列番号 ： 8 ) から成る、 ヒ ト型化 ONS- M21 抗体のし 鎖および II 鎖の V 領域を 連結する scFvのためのリ ンカ一をコー ドする DNA を、 Huston, J. S . et aし， Pro atl. Acad. Sci. USA (1998) 85, 5879-5883 に 記載の方法により作製した。 この scFvのためのリ ンカ一をヒ ト型化 0NS-M21 抗体の L 鎖及び H 鎖の V 領域と連結するために、 scFvのた めのリ ンカ一をコ一 ドする DNA の 5'側末端にヒ ト型化 ONS- M21 抗体 の H 鎖の V 領域カルボキシ基側末端の数ァ ミ ノ酸残基をコー ドする DNA を付加した。  Reference Example 3. Preparation of single-chain Fv (scFv) of reconstituted human 0NS-M21 antibody A single fragment using the V regions of the L and H chains of the humanized ONS-M21 antibody obtained in Reference Example 2. Amino acid sequence obtained by obtaining a single chain Fv (single chain Fv) by the method described in International Patent Application Publication No.W0 95-14041 Gly-Gly-Gly Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly -Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 8), a linker-coding DNA for scFv that links the V region of the humanized ONS-M21 antibody and the II chain. Acad. Sci. USA (1998) 85, 5879-5883, Huston, J. S. et a. To link this scFv linker to the humanized 0NS-M21 antibody 5 'end of the DNA coding for the scFv linker to link it to the L and H chain V regions. DNA encoding several amino acid residues at the carboxy group end of the V region of the H chain of the humanized ONS-M21 antibody was added to the end.
次いで、 scFv のためのリ ンカ一をコー ドする DNA の 3'側末端に ヒ ト型化 ONS- M21 抗体の L 鎖の V 領域ァ ミ ノ基側末端の数ァ ミ ノ酸 残基をコー ドする DNA を付加した。 さ らに、 pUC19 ベクターに揷人 できるように 5'側末端に Hind III認識部位を、 3'側末端に Eco RI認 識部位を付加した。  Next, several amino acids at the 3 'end of the DNA encoding the linker for scFv were added with several amino acid residues at the V region amino group end of the L chain of the humanized ONS-M21 antibody. DNA to be added was added. Furthermore, a HindIII recognition site was added to the 5 'end and an EcoRI recognition site was added to the 3' end so that the pUC19 vector could be used.
こ う して設計した DNA 断片を元にセンス方向及びアンチセンス方 向の 2 個のオリ ゴヌ ク レオチ ドを合成し、 これらをァ二一 リ ングし た。 ァニ一 リ ングした DNA を制限酵素 Hind 111及び Eco RIで消化し た。 得られた DNA 断片を pUC19 ベク ターと連結した。 Based on the DNA fragment designed in this way, the sense direction and antisense method Two oligonucleotides were synthesized, and they were aligned. The cleaned DNA was digested with restriction enzymes Hind 111 and Eco RI. The obtained DNA fragment was ligated with pUC19 vector.
この DNA 断片、 ヒ ト型化 0NS- M21 抗体の L 鎖 V 領域をコ一 ドする DNA 及び H 鎖 V 領域をコー ドする DNA を PCR 法により連結した。 得 られた DNA 断片を、 PSCFVT7 発現べク ターにク ローニングした。 こ の発現べク ターで大腸菌 BL21 (DB3 ) のコンビテン ト細胞を形質転 換した。  This DNA fragment, the DNA encoding the L chain V region and the DNA encoding the H chain V region of the humanized 0NS-M21 antibody were ligated by PCR. The obtained DNA fragment was cloned into a PSCFVT7 expression vector. E. coli BL21 (DB3) competent cells were transformed with this expression vector.
この大腸菌から得られた scFvの抗原結合活性を、 mONS- M21抗体の 抗原結合に対する阻害活性を指標に Cell EL ISAによ り調べた。 その 結果、 scFvはヒ ト型化 0NS-M21 抗体より調製した Fab 断片と同程度 の阻害活性を示した。 したがって、 scFvはヒ ト型化 ONS- M21 抗体と 同程度の抗原結合活性を有することが示された。 寄託された微生への言及  The antigen binding activity of the scFv obtained from this E. coli was examined by Cell ELISA using the mONS-M21 antibody's antigen binding inhibitory activity as an index. As a result, scFv showed the same level of inhibitory activity as the Fab fragment prepared from the humanized 0NS-M21 antibody. Therefore, it was shown that scFv has the same antigen-binding activity as the humanized ONS-M21 antibody. Reference to deposited microbes
委託機関  Contracting organization
名称 ： 工業技術院生命工学工業技術研究所  Name: Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute
あて名 ： 茨城県つく ば巿東 1丁目 1 番 3号  Address: 1-3-3 Tsukuba East, Ibaraki Prefecture
(a) 寄託微生物の名称 ： Escherichia col i DH5 (HEF-RVL-M21p  (a) Name of deposited microorganism: Escherichia col i DH5 (HEF-RVL-M21p
-gk)  -gk)
寄託番号 ： FERM BP- 4472  Deposit number: FERM BP-4472
寄託曰 ： 1993年 11月 18日  Deposit: November 18, 1993
(b) 寄託微生物の名称 ： Escherichia col i DH5な (HEF-RVH-M21- g r l)  (b) Name of deposited microorganism: Escherichia col i DH5 (HEF-RVH-M21-grl)
寄託番号 ： FERM BP- 4471  Deposit number: FERM BP-4471
寄託日 ： 1993年 11月 18日 配 列 表 配列番号 ： 1 Deposit date: November 18, 1993 Sequence list SEQ ID NO: 1
配列の長さ ： 2 0 Array length: 20
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
トポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列 Array
Phe Asn Leu Asp Thr Arg Phe Leu Val Val Lys Glu Ala Gly Asn Pro 1 5 10 15  Phe Asn Leu Asp Thr Arg Phe Leu Val Val Lys Glu Ala Gly Asn Pro 1 5 10 15
Xaa Xaa leu Phe Xaa Xaa leu Phe
20  20
配列番号 ： 2 SEQ ID NO: 2
配列の長さ ： 1 5 Array length: 1 5
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
トポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ペプチ ド  Sequence type: Peptide
配列  Array
Asn l ie Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His Hi s l ie l ie Glu Asp 1 5 10 15 配列番号 ： 3  Asn lie Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His His lie lie Glu Asp 1 5 10 15 SEQ ID NO: 3
配列の長さ ： 1 3  Array length: 1 3
配列の型 ： ア ミ ノ酸  Sequence type: amino acid
トポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド  Sequence type: peptide
配列  Array
Asp Asn Leu Arg Asp Lys し eu Arg Pro Ue Ue Ue Ser  Asp Asn Leu Arg Asp Lys then eu Arg Pro Ue Ue Ue Ser
1 5 10 配列番号 ： 4 1 5 10 SEQ ID NO: 4
配列の長さ ： 7 Array length: 7
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
トポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ペプチ ド Sequence type: Peptide
配列 Array
Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg  Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg
1 5  1 5
配列番号 ： 5 SEQ ID NO: 5
配列の長さ ： 1 3 Array length: 1 3
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
トポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列 Array
Val Asn Hi s Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gl y Thr Val  Val Asn His Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gly Thr Thr Val
1 5 10  1 5 10
配列番号 ： 6 SEQ ID NO: 6
配列の長さ ： 1 8 Array length: 1 8
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
トポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列 Array
Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Phe Gin Val Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Phe Gin Val
1 5 10 151 5 10 15
Gly Pro Gly Pro
配列番号 ： 7 SEQ ID NO: 7
配列の長さ ： 4 6 3 6 8 9 Array length: 4 6 3 6 8 9
SOT ΟΟΐ 96 j on usv 13W 3J nio s dsy dsy s S !H ¾1V JL "31 OJd s 66ε VOV OiV OW OXV 900 0V9 lOL OVO IV9 DW OVO 339 13V 0X3 VDO 301 SOT ΟΟΐ 96 j on usv 13W 3J nio s dsy dsy s S! H ¾1V JL "31 OJd s 66ε VOV OiV OW OXV 900 0V9 lOL OVO IV9 DW OVO 339 13V 0X3 VDO 301
06 98 08 nai JA
Figure imgf000070_0001
06 98 08 nai JA
Figure imgf000070_0001
TS8 010 3V1 OIO 100 100 13V 000 OW 33V 3VI 309 iVO 333 010 139 DID  TS8 010 3V1 OIO 100 100 13V 000 OW 33V 3VI 309 iVO 333 010 139 DID
92. 01 S9  92.01 S9
ni9 3JV OJd ^IO ¾IV "31 naq ngq JA丄 UIO "10 3JV niO J¾ εοε ova ooo w DOO ICQ xoo oio oio oio ovi 30D ovo ovo ooo ovo vov ni9 3J V OJd ^ IO ¾IV "31 naq ngq JA 丄 UIO" 10 3JV niO J¾ εοε ova ooo w DOO ICQ xoo oio oio oio ovi 30D ovo ovo ooo ovo vov
09 gg 09  09 gg 09
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S2 02 91 S2 02 91
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Οΐ g i  Οΐ g i
3JV OJd BfV 3JV OJd BIV 3JV J3S OJj A 19 OJd iio WW  3JV OJd BfV 3JV OJd BIV 3JV J3S OJj A 19 OJd iio WW
Πΐ 300 V33 330 390 033 030 000 OOV 333 300 030 000 9IV 30 0V30013000 09 IL000303VO 0903901013 0000V31000 3D9D3100V0 3090V0100X 00V0W0190 v N α コ ： m n o M f - - ^ a ^ ^ 蘭 ： a> Πΐ 300 V33 330 390 033 030 000 OOV 333 300 030 000 9IV 30 0V30013000 09 IL000303VO 0903901013 0000V31000 3D9D3100V0 3090V0100X 00V0W0190 v N α Co: mno M f--^ a ^ ^ Orchid: a>
^WK0lL6d£IIDd IS960/8 OAV GTG AAA AAT GAC CCT GGC CAT CAC Α ΑΠ GAG GAC ATG TGG CTT GGA 447 Val Lys Asn Asp Pro Gly Hi s His l ie He Glu Asp Met Trp Leu Gly 110 115 120 125^ WK0lL6d £ IIDd IS960 / 8 OAV GTG AAA AAT GAC CCT GGC CAT CAC Α ΑΠ GAG GAC ATG TGG CTT GGA 447 Val Lys Asn Asp Pro Gly His His Lie He Glu Asp Met Trp Leu Gly 110 115 120 125
GTG ACT GTG GCC AGC CAG GGC CCT GCA GGC AGA GTT CTG GTC TGT GCC 495 Val Thr Val Ala Ser Gin Gly Pro Ala Gly Arg Val Leu Val Cys Ala GTG ACT GTG GCC AGC CAG GGC CCT GCA GGC AGA GTT CTG GTC TGT GCC 495 Val Thr Val Ala Ser Gin Gly Pro Ala Gly Arg Val Leu Val Cys Ala
130 135 140  130 135 140
CAC CGC TAC ACC CAG GTG CTG TGG TCA GGG TCA GAA GAC CAG CGG CGC 543 His Arg Tyr Thr Gin Val Leu Trp Ser Gly Ser Glu Asp Gin Arg Arg  CAC CGC TAC ACC CAG GTG CTG TGG TCA GGG TCA GAA GAC CAG CGG CGC 543 His Arg Tyr Thr Gin Val Leu Trp Ser Gly Ser Glu Asp Gin Arg Arg
145 150 155  145 150 155
ATG GTG GGC AAG TGC TAC GTG CGA GGC AAT GAC CTA GAG CTG GAC TCC 591 Met Val Gly Lys Cys Tyr Val Arg Gly Asn Asp Leu Glu Leu Asp Ser  ATG GTG GGC AAG TGC TAC GTG CGA GGC AAT GAC CTA GAG CTG GAC TCC 591 Met Val Gly Lys Cys Tyr Val Arg Gly Asn Asp Leu Glu Leu Asp Ser
160 165 170  160 165 170
AGT GAT GAC TGG CAG ACC TAC CAC AAC GAG ATG TGC AAT AGC AAC ACA 639 Ser Asp Asp Trp Gin Thr Tyr His Asn Glu Met Cys Asn Ser Asn Thr  AGT GAT GAC TGG CAG ACC TAC CAC AAC GAG ATG TGC AAT AGC AAC ACA 639 Ser Asp Asp Trp Gin Thr Tyr His Asn Glu Met Cys Asn Ser Asn Thr
175 180 185  175 180 185
GAC TAC CTG GAG ACG GGC ATG TGC CAG CTG GGC ACC AGC GGT GGC TTC 687 Asp Tyr Leu Glu Thr Gly Met Cys Gin Leu Gly Thr Ser Gly Gly Phe 190 195 200 205GAC TAC CTG GAG ACG GGC ATG TGC CAG CTG GGC ACC AGC GGT GGC TTC 687 Asp Tyr Leu Glu Thr Gly Met Cys Gin Leu Gly Thr Ser Gly Gly Phe 190 195 200 205
ACC CAG AAC ACT GTG TAC TTC GGC GCC CCC GGT GCC TAC AAC TGG AAA 735 Thr Gin Asn Thr Val Tyr Phe Gly Ala Pro Gly Ala Tyr Asn Trp Lys ACC CAG AAC ACT GTG TAC TTC GGC GCC CCC GGT GCC TAC AAC TGG AAA 735 Thr Gin Asn Thr Val Tyr Phe Gly Ala Pro Gly Ala Tyr Asn Trp Lys
210 215 220  210 215 220
GGA AAC AGC TAC ATG ΑΠ CAG CGC AAG GAG TGG GAC ΠΑ TCT GAG TAT 783 Gly Asn Ser Tyr Met l ie Gin Arg Lys Glu Trp Asp Leu Ser Glu Tyr  GGA AAC AGC TAC ATG ΑΠ CAG CGC AAG GAG TGG GAC ΠΑ TCT GAG TAT 783 Gly Asn Ser Tyr Met lie Gin Arg Lys Glu Trp Asp Leu Ser Glu Tyr
225 230 235  225 230 235
AGT TAC AAG GAC CCA GAG GAC CM GGA AAC CTC TAT ΑΠ GGG TAC ACG 831 Ser Tyr Lys Asp Pro Glu Asp Gin Gly Asn Leu Tyr l ie Gly Tyr Thr  AGT TAC AAG GAC CCA GAG GAC CM GGA AAC CTC TAT ΑΠ GGG TAC ACG 831 Ser Tyr Lys Asp Pro Glu Asp Gin Gly Asn Leu Tyr lie Gly Tyr Thr
240 245 250 0 I 240 245 250 0 I
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sic οιε SOS  sic οιε SOS
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Lys Val Tyr l ie Tyr His Ser Ser Ser Lys Gly Leu Leu Arg Gin Pro Lys Val Tyr lie Tyr His Ser Ser Ser Lys Gly Leu Leu Arg Gin Pro
400 405 410  400 405 410
CAG CAG GTA ATC CAT GGA GAG AAG CTG GGA CTG CCT GGG HG GCC ACC 1359 Gin Gin Val l ie His Gly Glu Lys Leu Gly Leu Pro Gly Leu Ala Thr  CAG CAG GTA ATC CAT GGA GAG AAG CTG GGA CTG CCT GGG HG GCC ACC 1359 Gin Gin Valerie His Gly Glu Lys Leu Gly Leu Pro Gly Leu Ala Thr
415 420 425  415 420 425
TTC GGC TAT TCC CTC AGT GGG CAG ATG GAT GTG GAT GAG AAC TTC TAC 1407 Phe Gly Tyr Ser Leu Ser Gly Gin Met Asp Val Asp Glu Asn Phe Tyr 430 435 440 445TTC GGC TAT TCC CTC AGT GGG CAG ATG GAT GTG GAT GAG AAC TTC TAC 1407 Phe Gly Tyr Ser Leu Ser Gly Gin Met Asp Val Asp Glu Asn Phe Tyr 430 435 440 445
CCA GAC CH CTA GTG GGA AGC CTG TCA GAC CAC ΑΠ GTG CTG CTG CGG 1455 Pro Asp Leu Leu Val Gly Ser Leu Ser Asp His He Val Leu Leu Arg CCA GAC CH CTA GTG GGA AGC CTG TCA GAC CAC ΑΠ GTG CTG CTG CGG 1455 Pro Asp Leu Leu Val Gly Ser Leu Ser Asp His He Val Leu Leu Arg
450 455 460  450 455 460
GCC CGG CCA GTC ATC AAC ATC GTC CAC AAG ACC m GTG CCC AGG CCA 1503 Ala Arg Pro Val He Asn l ie Val His Lys Thr Leu Val Pro Arg Pro  GCC CGG CCA GTC ATC AAC ATC GTC CAC AAG ACC m GTG CCC AGG CCA 1503 Ala Arg Pro Val He Asn lie Val His Lys Thr Leu Val Pro Arg Pro
465 470 475  465 470 475
GCT GTG CTG GAC CCT GCA CH TGC ACG GCC ACC TCT TGT GTG C GTG 1551 Ala Val Leu Asp Pro Ala Leu Cys Thr Ala Thr Ser Cys Val Gin Val  GCT GTG CTG GAC CCT GCA CH TGC ACG GCC ACC TCT TGT GTG C GTG 1551 Ala Val Leu Asp Pro Ala Leu Cys Thr Ala Thr Ser Cys Val Gin Val
480 485 490  480 485 490
GAG CTC TGC ΤΓΓ GCT TAC AAC CAG AGT GCC GGG AAC CCC AAC TAC AGG 1599 Glu Leu Cys Phe Ala Tyr Asn Gin Ser Ala Gly Asn Pro Asn Tyr Arg  GAG CTC TGC ΤΓΓ GCT TAC AAC CAG AGT GCC GGG AAC CCC AAC TAC AGG 1599 Glu Leu Cys Phe Ala Tyr Asn Gin Ser Ala Gly Asn Pro Asn Tyr Arg
495 500 505  495 500 505
CGA AAC ATC ACC CTG GCC TAC ACT CTG GAG GCT GAC AGG GAC CGC CGG 1647 Arg Asn He Thr Leu Ala Tyr Thr Leu Glu Ala Asp Arg Asp Arg Arg 510 515 520 525CGA AAC ATC ACC CTG GCC TAC ACT CTG GAG GCT GAC AGG GAC CGC CGG 1647 Arg Asn He Thr Leu Ala Tyr Thr Leu Glu Ala Asp Arg Asp Arg Arg 510 515 520 525
CCG CCC CGG CTC CGC TTT GCC GGC AGT GAG TCC GCT GTC TTC CAC GGC 1695 Pro Pro Arg Leu Arg Phe Ala Gly Ser Glu Ser Ala Val Phe His Gly CCG CCC CGG CTC CGC TTT GCC GGC AGT GAG TCC GCT GTC TTC CAC GGC 1695 Pro Pro Arg Leu Arg Phe Ala Gly Ser Glu Ser Ala Val Phe His Gly
530 535 540 Z L 530 535 540 ZL
S89 089 Si9 02,9 aq ngq ¾iv OJd OJd naq n3q Έΐν niD S j H ¾1VS89 089 Si9 02,9 aq ngq ¾iv OJd OJd naq n3q Έΐν niD S j H ¾1V
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S 0 SSI S 0 SSI
OJd dj丄 Π9ΐ usv dsv uio J9S J3S -∑m naq "ID \ 6ΐδΖ 300 001 010 3W OVO DV3 OVO 10V 001 90V 031 013 OVO 010 OVO 010 OJd dj 丄 Π9ΐ usv dsv uio J9S J3S -∑m naq "ID \ 6ΐδΖ 300 001 010 3W OVO DV3 OVO 10V 001 90V 031 013 OVO 010 OVO 010
0£L S2 ZL  0 £ L S2 ZL
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S O  S O
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OOA 969 069  OOA 969 069
9Md an Jil丄 nio usv ¾IV "10 s ¾iv A[Q OJd OJd 3JV 〖 J9S z ILL OIV OOV OVO IW 100 m OOl OOO OOO OOO 333 000 DXO VOX 031 9Md an Jil 丄 nio usv ¾IV "10 s ¾iv A (Q OJd OJd 3JV 〖J9S z ILL OIV OOV OVO IW 100 m OOl OOO OOO OOO 333 000 DXO VOX 031
S80£0/ 6dT/X d IS960/86 OAV t L S80 £ 0 / 6dT / X d IS960 / 86 OAV t L
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S96 0S6 S 6  S96 0S6 S 6
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068 S88 088  068 S88 088
Ι¾Λ OJd OJd 3 uio AlO OJd dsy IS丄 2 330 130 130 013 1DV 3X0 133 VOO 030 300 0V3 000 VOO 000 V33 XVO  Ι¾Λ OJd OJd 3 uio AlO OJd dsy IS 丄 2 330 130 130 013 1DV 3X0 133 VOO 030 300 0V3 000 VOO 000 V33 XVO
0 8 S98  0 8 S98
3JV ui9 OJj J9S J3S OJd 3JV dsv OJd dsv 3JV ui9 OJj J9S J3S OJd 3JV dsv OJd dsv
OVO voo 303 OOV 300 OVO VOO 331 VOX VOO OOV OVO 000 130 3V0OVO voo 303 OOV 300 OVO VOO 331 VOX VOO OOV OVO 000 130 3V0
098 0S8 098 0S8
na usv Π31 OJJ usv d\ [ na dsv OJJ 3JV SA3 na usv Π31 OJJ usv d \ [na dsv OJJ 3JV SA3
SS92 丄 OL LL3 I3V 910 OW 313 100 31V 1L3 OVO VOO iOO VOO VOO 301 SS92 丄 OL LL3 I3V 910 OW 313 100 31V 1L3 OVO VOO iOO VOO VOO 301
8 0 8 0C8 OJd 丄 J3S ^19 usv S I H Ι¾Λ J¾ an niO J¾ OJd JAI naq naq ム 092 33D 901 331 030丄 W 300 IVD 310 33V 01V OVO OOV 393 IVX 013 013 8 0 8 0C8 OJd 丄 J3S ^ 19 usv S I H Ι¾Λ J¾ an niO J¾ OJd JAI naq naq 092 33D 901 331 030 丄 W 300 IVD 310 33V 01V OVO OOV 393 IVX 013 013
S80eO/ .6dT/XDd TS960/86 ΟΛ TTC TCT GTG GAC ΑΠ GAC TCG GAG CTG GTG GAG GAG CTG CCG GCC GAA 3039 Phe Ser Val Asp l ie Asp Ser Glu Leu Val Glu Glu Leu Pro Ala Glu S80eO / .6dT / XDd TS960 / 86 ΟΛ TTC TCT GTG GAC ΑΠ GAC TCG GAG CTG GTG GAG GAG CTG CCG GCC GAA 3039 Phe Ser Val Asp lie Asp Ser Glu Leu Val Glu Glu Leu Pro Ala Glu
975 980 985  975 980 985
ATC GAG CTG TGG CTG GTG CTG GTG GCC GTG GGT GCA GGG CTG CTG CTG 3087 He Giu Leu Trp Leu Val Leu Val Ala Val Gly Ala Glyし eu Leu Leu 990 995 1000 1005ATC GAG CTG TGG CTG GTG CTG GTG GCC GTG GGT GCA GGG CTG CTG CTG 3087 He Giu Leu Trp Leu Val Leu Val Ala Val Gly Ala Gly then eu Leu Leu 990 995 1000 1005
CTG GGG CTG ATC ATC CTC CTG CTG TGG AAG TGC GGC TTC TTC AAG CGA 3135 Leu Gly Leu He l ie Leu Leu Leu Trp Lys Cys Gly Phe Phe Lys Arg CTG GGG CTG ATC ATC CTC CTG CTG TGG AAG TGC GGC TTC TTC AAG CGA 3135 Leu Gly Leu Helie Leu Leu Leu Trp Lys Cys Gly Phe Phe Lys Arg
1010 1015 1020  1010 1015 1020
GCC CGC ACT CGC GCC CTG TAT GAA GCT AAG AGG CAG AAG GCG GAG ATG 3183 Ala Arg Thr Arg Ala Leu Tyr Glu Ala Lys Arg Gin Lys Ala Glu Met GCC CGC ACT CGC GCC CTG TAT GAA GCT AAG AGG CAG AAG GCG GAG ATG 3183 Ala Arg Thr Arg Ala Leu Tyr Glu Ala Lys Arg Gin Lys Ala Glu Met
1025 1030 1035  1025 1030 1035
AAG AGC CAG CCG TCA GAG ACA GAG AGG CTG ACC GAC GAC TAC 3225 Lys Ser Gin Pro Ser Glu Thr Glu Arg Leu Thr Asp Asp Tyr AAG AGC CAG CCG TCA GAG ACA GAG AGG CTG ACC GAC GAC TAC 3225 Lys Ser Gin Pro Ser Glu Thr Glu Arg Leu Thr Asp Asp Tyr
1040 1045 1050  1040 1045 1050
TGAGGGGGCA GCCCCCCGCC CCCGGCCCAC CTGGTGTGAC TTCTTTMGC GGACCCGCTA 3285 HATCAGATC ATGCCCAAGT ACCACGCAGT GCGGATCCGG GAGGAGGAGC GCTACCCACC 3345 TCCAGGGAGC ACCCTGCCCA CCAAGAAGCA CTGGGTGACC AGCTGGCAGA CTCGGGACCA 3405 ATACTACTGA CGTCCTCCCT GATCCCACCC CCTCCTCCCC CAGTGTCCCC TTTCTTCCTA 3465 TTTATCATAA GHATGCCTC TGACAGTCCA CAGGGGCCAC CACCITTGGC TGGTAGCAGC 3525 AGGCTCAGGC ACATACACCT CGTCAAGAGC ATGCACATGC TGTCTGGCCC TGGGGATCH 3585 CCCACAGGAG GGCCAGCGCT GTGGACCHA CAACGCCGAG TGCACTGCAT TCCTGTGCCC 3645 TAGATGCACG TGGGGCCCAC TGCTCGTGGA CTGTGCTGGT GCATCACGGA TGGTGCATGG 3705 GCTCGCCGTG TCTCAGCCTC TGCCAGCGCC AGCGCCAAAA CAAGCCAAAG AGCCTCCCAC 3765 CAGAGCCGGG AGGAAAAGGC CCCTGCAATG TGGTGACACC TCCCCITTCA CACCTGGATC 3825 CATCHGAGA GCCACAGTCA CTGGAHGAC TTTGCTGTCA AAACTACTGA CAGGGAGCAG 3885 CCCCCGGGCC GCTGGCTGGT GGGCCCCCAA HGACACCCA TGCCAGAGAG GTGGGGATCC 3945 TGCCTAAGGT TGTCTACGGG GGCACTTGGA GGACCTGGCG TGCTCAGACC CAACAGCAAA 4005 GGAACTAGAA AGAAGGACCC AGAAGGCTTG CTTTCCTGCA TCTCTGTGAA GCCTCTCTCC 4065 TTGGCCACAG ACTGAACTCG CAGGGAGTGC AGCAGGAAGG AACAAAGACA GGCAAACGGC 4125 AACGTAGCCT GGGCTCACTG TGCTGGGGCA TGGCGGGATC CTCCACAGAG AGGAGGGGAC 4185 CAAHCTGGA CAGACAGATG TTGGGAGGAT ACAGAGGAGA TGCCACTTCT CACTCACCAC 4245 TACCAGCCAG CCTCCAGAAG GCCCCAGAGA GACCCTGCAA GACCACGGAG GGAGCCGACA 4305 CTTGAATGTA GTAATAGGCA GGGGGCCCTG CCACCCCATC CAGCCAGACC CCAGCTGAAC 4365 CATGCGTCAG GGGCCTAGAG GTGGAGTTCT TAGCTATCCT TGGCITTCTG TGCCAGCCTG 4425 GCTCTGCCCC TCCCCCATGG GCTGTGTCCT AAGGCCCAH TGAGAAGCTG AGGCTAGTTC 4485 CAAAAACCTC TCCTGACCCC TGCCTGHGG CAGCCCACTC CCCAGCCCCA GCCCCTTCCA 4545 TGGTACTGTA GCAGGGGAAT TCCCTCCCCC TCCHGTCCC TTCTTTGTAT ATAGGCTTCT 4605 CACCGCGACC AATAMCAGC TCCCAGITTG T 4636 配列番号 ： 8 TGAGGGGGCA GCCCCCCGCC CCCGGCCCAC CTGGTGTGAC TTCTTTMGC GGACCCGCTA 3285 HATCAGATC ATGCCCAAGT ACCACGCAGT GCGGATCCGG GAGGAGGAGC GCTACCCACC 3345 TCCAGGGAGC ACCCTGCCCA CCAAGAAGCA CTGGGTGACC AGCTGGCAGA CTCGGGACCA 3405 ATACTACTGA CGTCCTCCCT GATCCCACCC CCTCCTCCCC CAGTGTCCCC TTTCTTCCTA 3465 TTTATCATAA GHATGCCTC TGACAGTCCA CAGGGGCCAC CACCITTGGC TGGTAGCAGC 3525 AGGCTCAGGC ACATACACCT CGTCAAGAGC ATGCACATGC TGTCTGGCCC TGGGGATCH 3585 CCCACAGGAG GGCCAGCGCT GTGGACCHA CAACGCCGAG TGCACTGCAT TCCTGTGCCC 3645 TAGATGCACG TGGGGCCCAC TGCTCGTGGA CTGTGCTGGT GCATCACGGA TGGTGCATGG 3705 GCTCGCCGTG TCTCAGCCTC TGCCAGCGCC AGCGCCAAAA CAAGCCAAAG AGCCTCCCAC 3765 CAGAGCCGGG AGGAAAAGGC CCCTGCAATG TGGTGACACC TCCCCITTCA CACCTGGATC 3825 CATCHGAGA GCCACAGTCA CTGGAHGAC TTTGCTGTCA AAACTACTGA CAGGGAGCAG 3885 CCCCCGGGCC GCTGGCTGGT GGGCCCCCAA HGACACCCA TGCCAGAGAG GTGGGGATCC 3945 TGCCTAAGGT TGTCTACGGG GGCACTTGGA GGACCTGGCG TGCTCAGACC CAACAGCAAA 4005 GGAACTAGAA AGAAGGACCC AGAAGGCTTG CTTTCCTGCA TCTCTGTGAA GCCTCTCTCC 4065 TTGGCCACAG ACTGAACTCG CAGGGAGTGC AGCAGGAAGG AACAAAGACA GGCAAACGGC 4125 AACGTAGCCT GGGCTCACTG TGCTGGGGCA TGGCGGGATC CTCCACAGAG AGGAGGGGAC 4185 CAAHCTGGA CAGACAGATG TTGGGAGGAT ACAGAGGAGA TGCCACTTCT CACTCACCAC 4245 TACCAGCCAG CCTCCAGAAG GCCCCAGAGA GACCCTGCAA GACCACGGAG GGAGCCGACA 4305 CTTGAATGTA GTAATAGGCA GGGGGCCCTG CCACCCCATC CAGCCAGACC CCAGCTGAAC 4365 CATGCGTCAG GGGCCTAGAG GTGGAGTTCT TAGCTATCCT TGGCITTCTG TGCCAGCCTG 4425 GCTCTGCCCC TCCCCCATGG GCTGTGTCCT AAGGCCCAH TGAGAAGCTG AGGCTAGTTC 4485 CAAAAACCTC TCCTGACCCC TGCCTGHGG CAGCCCACTC CCCAGCCCCA GCCCCTTCCA 4545 TGGTACTGTA GCAGGGGAAT TCCCTCCCCC TCCHGTCCC TTCTTTGTAT ATAGGCTTCT 4605 CACCGCGACC AATAMCAGC TCCCAGITTG T 4636 SEQ ID NO: 8
配列の長さ ： 1 5 Array length: 1 5
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
トポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列 Array
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser  Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
5 10 15  5 10 15

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims
1 . イ ンテグリ ン ひ 3 に対する抗体 （抗イ ンテグリ ン 3抗体） 又は抗原結合能を有するその断片と化学療法剤とを連結して成る複 合体。 1. A complex formed by linking an antibody against integrin 3 (anti-integrin 3 antibody) or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent.
2. イ ンテグリ ン 3 に対する抗体 （抗イ ンテグリ ン α 3抗体） 又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ンとを リ ンカ一により連 結して成る複合体。  2. A complex formed by linking an antibody against integrin 3 (anti-integrin α3 antibody) or a fragment thereof having antigen-binding ability and toxin by a linker.
3. 前記イ ンテグリ ン α 3が下記の性質 ：  3. The integrin α3 has the following properties:
( 1 ) S D S—ポリ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳動法により測定し た分子量が約 1 4 0 kDa である ；  (1) SDS—polyacrylamide gel electrophoresis has a molecular weight of about 140 kDa;
( 2 ) ァ ミ ノ末端ァ ミ ノ酸配列が Phe Asn Leu Asp Thr Arg Phe Leu Val Val Lys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaaは特 定されず） （配列番号 ： 1 ) である ；  (2) The amino terminal amino acid sequence is Phe Asn Leu Asp Thr Arg Phe Leu Val Val Lys Glu Ala Gly Asn Pro Xaa Xaa Leu Phe (Xaa is not specified) (SEQ ID NO: 1);
( 3 ) 内部に次のア ミ ノ酸配列を含有する ：  (3) Contains the following amino acid sequence:
① Asn lie Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His His He lie Gl u Asp (配列番号 ： 2 )  ① Asn lie Thr Val Lys Asn Asp Pro Gly His His Helie Glu Asp (SEQ ID NO: 2)
② Asp Asn Leu Arg Asp Lys Leu Arg Pro lie lie lie Ser ( 配列番号 ： 3 )  ② Asp Asn Leu Arg Asp Lys Leu Arg Prolielielie Ser (SEQ ID NO: 3)
③ Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg (配列番号 ： 4 )  ③ Asn Tyr Ser Leu Pro Leu Arg (SEQ ID NO: 4)
④ Val Asn His Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gly Thr Val ( 配列番号 ： 5 )  ④ Val Asn His Arg Leu Gin Ser Phe Phe Gly Gly Thr Val (SEQ ID NO: 5)
⑤ Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Ph e Gin Val Gly Pro (配列番号 ： 6 ) ；  ⑤ Lys Thr Val Glu Asp Val Gly Ser Pro Leu Lys Tyr Glu Ph e Gin Val Gly Pro (SEQ ID NO: 6);
を有する請求項 1 又は 2 に記載の複合体。 The composite according to claim 1, comprising:
4 . 前記抗ィ ンテグリ ン 3抗体がモ ノ ク 口一ナル抗体である請 求項 1 〜 3 のいずれか 1 項に記載の複合体。 4. The conjugate according to any one of claims 1 to 3, wherein the anti-integrin 3 antibody is a monoclonal antibody.
5. 前記抗ィンテグリ ン α 3抗体が 0 N S - Μ 2 1抗体 （ I F 0 N o. 5 0 3 8 2由来） である、 請求項 4に記載の複合体。 5. The complex according to claim 4, wherein the anti-integrin α3 antibody is a 0 NS-Μ21 antibody (derived from IF No. 50382).
6. 前記抗イ ンテグリ ン α 3抗体が再構成ヒ ト抗体である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の複合体。  6. The complex according to any one of claims 1 to 3, wherein the anti-integrin α3 antibody is a reshaped human antibody.
7. 前記再構成ヒ ト抗体が再構成ヒ ト ON S— Μ 2 1抗体である 、 請求項 6に記載の複合体。  7. The complex according to claim 6, wherein the reshaped human antibody is a reshaped human ONS-—21 antibody.
8. 前記抗イ ンテグリ ン α 3抗体の抗原結合能を有する断片が、 F a b, F ( a b ' ) 2、 又は s c F vである、 請求項 1〜 7のい ずれか 1項に記載の複合体。  8. The fragment according to any one of claims 1 to 7, wherein the fragment having an antigen-binding ability of the anti-integrin α3 antibody is Fab, F (ab ') 2, or scFv. Complex.
9. 前記化学療法剤が、 抗腫瘍剤である、 請求項 1〜 8のいずれ か 1項に記載の複合体。  9. The complex according to any one of claims 1 to 8, wherein the chemotherapeutic agent is an antitumor agent.
10. 前記抗腫瘍剤がメ ルフ ァ ラ ン（Melphalan) 、 シスブラチ ン （ Ci s-plat inum) 、 カルボプラ チン （Carboplat in)、 マイ ト マイ シ ン C (Mi tomy c i n C) 、 ア ト リ アマイ シ ン (Adriamycin ； Doxorubicin ) 、 ダウ ノ ノレビシ ン (Daunorubicin) 、 ブレオマイ シ ン（Bleomycin ) 、 ネオカルチノ スタチ ン （Neocarzinostatin) 、 メ ト ト レキセ一 ト （Methotrexate) 、 5—フルォロ ウ リ ジ ン（5- Fl uorour i d i ne) 、 5 — フルオロー 2 ' —デォキシゥ リ ジン （5- Fluoro-2' - deoxyuridi ne) 、 シ ト シ ンァラ ビノ シ ド （Cy tosine arabinoside) 、 ア ミ ノ プ テ リ ン（Ami nop ter in) 、 ビンク リ スチ ン（Vincr i st ine) 又は ビンデ シ ン（Vindesine) である、 請求項 9に記載の複合体。  10. The antitumor agent is Melphalan, Cis-platinum, Carboplatin, Mitomycin C, Atriamycin. Adriamycin; Doxorubicin; Daunorubicin; Bleomycin; Neocarzinostatin; Methotrexate; 5-Fluorodium Fluorour idi ne), 5 — Fluoro-2'-deoxyuridin (5-Fluoro-2'-deoxyuridi ne), Cy tosine arabinoside, Aminopter 10. The complex according to claim 9, which is terin), vincristine, or vindesine.
11. 前記化学療法剤がサイ トカイ ンである請求項 1〜 8のいずれ か 1項に記載の複合体。  11. The conjugate according to any one of claims 1 to 8, wherein the chemotherapeutic agent is sitekine.
12. 前記サイ ト 力イ ンがイ ンターロイキ ン一 2、 腫瘍壊死因子ァ ルフ ァ （TN F a) 、 イ ンタ 一フ ヱ ロ ン （ I F N) である、 請求項 1 1 に記載の複合体。  12. The conjugate according to claim 11, wherein said site force protein is interleukin-12, tumor necrosis factor alpha (TN Fa), or interferon (IFN).
13. 前記 トキ シ ンが、 ジフテ リ ア トキシ ン A鎖 （Diphtheria tox in A chain) 、 シュ一 ドモナスエン ド 卜キシ ン (Pseudomonas en do toxin), リ シ ン A鎖 （Ricin A chain)、 無糖鎖リ シ ン A鎖（Degl yco sy lated ricin A chain)、 アブリ ン A鎖 (Abrin A chain) 、 ゲロ 二ン（Gelonin) 、 ポークウィー ド抗ウイ ルス蛋白 （PAP- s ； Pokewe ed an t i -v i ral protein from seedsリ 、 ブリ オジ ン (Br i odin) 、 サ ポ リ ン（Saporin) 、 モモルジ ン （Momordin) 、 モモルコキン（Momor cochin) 、 ジア ンシ ン 3 2 (Di an thin 32) 、 ジア ンシン 3 0 (D i an t hin 30) 、 モデッ シ ン （Modeccin) 、 ビスカ ミ ン （Viscumin) 、 ボ ルケシ ン （Volkesin) 、 ドデカ ン ド リ ン（Dodecandr i π) 、 ト リ チン (Tri tin) 、 ルフ ィ ン （Luff in) 又は 卜 リ コキ リ ン（Tr i chok i r i n) である、 請求項 1〜 8のいずれか 1 項に記載の複合体。 13. The toxin is a diphtheria toxin A chain (Diphtheria toxin). in A chain), Pseudomonas end doxin, ricin A chain, sugar-free ricin A chain (Deglycosylated ricin A chain), abrin A chain (Abrin A chain), gelonin (Gelonin), porkweed anti-virus protein (PAP-s; Pokeweed anti-viral protein from seeds), briodin (Briodin), sapoin Lin (Saporin), Momordin (Momordin), Momorcochin (Momor cochin), Dian thin 32 (Di an thin 32), Dian thin 30 (Dianthin 30), Modeccin (Modeccin), Viscumin, Volkesin, Dodecandrin (π), Tritin, Luffin, or Trichoklin The conjugate according to any one of claims 1 to 8, wherein the conjugate is irin).
14. 抗イ ンテグリ ン 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と 化学療法剤とをリ ンカ一により連結して成る請求項 1 及び 3〜 1 2 のいずれか 1 項に記載の複合体。  14. The complex according to any one of claims 1 and 3 to 12, wherein the anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent are linked by a linker.
15. 抗イ ンテグリ ン 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシ ンとをリ ンカ一により連結して成る請求項 2〜 8及び 1 3 の いずれか 1 項に記載の複合体。  15. The complex according to any one of claims 2 to 8 and 13, wherein the anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and toxin are linked by a linker.
16. 前記 リ ンカ一が、 N—スク シ二 ミ ジル 3 — （ 2 — ピ リ ジル ジチォ） プロ ピオネー ト、 スク シ二 ミ ジル 6 — 3 — 〔 2 — ピ リ ジ ルジチォ〕 プロ ピオ ンア ミ ド） へキサノ エー ト、 スルホスク シニ ミ ジル 6 — 3 — 〔 2 — ピ リ ジルジチォ〕 プロ ピオンア ミ ド） へキサ ノ エ一 ト、 N—スク シ二 ミ ジル 3 — （ 2 — ピ リ ジルジチォ） ブチ レー ト、 スク シ二 ミ ジルォキシカルボニル一 α— （ 2 — ピ リ ジルジ チォ） トルエン、 ス ク シ二 ミ ジル 6 — （ な 一メ チル一 〔 2 — ピ リ ジ ルジチォ〕 トルア ミ ド） へキサノ エー ト、 スルホスク シ二 ミ ジル 6 - ( ひ ー メ チル一 〔 2 — ピ リ ジルジチォ〕 トルア ミ ド） へキサノ エ ー ト、 スク シ二 ミ ジル一 4 — ( ρ—マレイ ミ ドフ エニル） ブチ レー ト、 スノレホ一スク シ二 ミ ジル 4 一 （ p —マ レイ ミ ドフ ヱニル） ブ チ レ一 ト、 m —マ レイ ミ ドベンゾイノレー N — イ ドロキシス ク シ二 ミ ドエステル、 m —マ レイ ミ ドベンゾィノレ 一 N — ヽィ ドロキシスル ホスク シニ ミ ドエステル、 S —ァセチルメ ルカプ ト スク シニ ッ ク ァ ン ヒ ドライ ド、 ジメ チル 3 , 3 — ジチォ ビスプロ リ オニ ミ デー ト 又は 2 —ィ ミ ノチォレー ンである、 請求項 1 4及び 1 5 のいずれか 1項に記載の複合体。 16. The linker is N-succinimidyl 3— (2—pyridyl dithio) propionate, succinimidyl 6—3— [2—pyridyl dithio) propionamid Hexanoate, sulfosuccinimidyl 6—3— [2—pyridyldithio] propionamide) hexanoate, N—succinimidyl 3— (2—pyridyldithio) Butyrate, succinimidyloxycarbonyl-1-α- (2—pyridyldithio) toluene, succinimidyl 6— (na-methyl-1- [2—pyridyldithio] toluamide ) Hexanoate, sulfosuccinimidyl 6- (H-methyl [2-pyridyldithio] toluamide) Hexanoate, succinimidyl 1 4 — (ρ-Mley Enil) Buty Le (P—male middoxy) butyrate, m—male dibenzoinole N—idroxixin midyl ester, m—male mid benzoinole N — D-droxysul phosuccinimide ester, S — acetylmethylcapsuccinic anhydride, dimethyl 3,3 — dithiobisproionimidate or 2 — iminotholane. And the complex according to any one of 15 to 15.
17. 前記 リ ンカ一がペプチ ド、 カルボキシメ チルデキス ト ラ ン、 ア ビジ ン · ピオチン、 デキス ト ラ ン、 ア ミ ノ デキス ト ラ ン、 シス · ア コニ ッ ト酸、 グルタ ミ ン酸ジ ヒ ドラ ジ ド、 又はヒ ト血清アルブ ミ ン （ H S A ) である、 請求項 1 4及び 1 5のいずれか 1 項に記載の 複合体。  17. The linker is a peptide, carboxymethyl dextran, avidin-biotin, dextran, aminodextran, cis-aconitic acid, glutamate dihydrochloride. The conjugate according to any one of claims 14 and 15, which is a razide or human serum albumin (HSA).
18. 抗イ ンテグリ ン 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と 化学療法剤とを中間支持体により連結して成る請求項 1 3 1 2 1 4 1 6及び 1 7のいずれか 1 項に記載の複合体。  18. The anti-integrin 3 antibody or a fragment thereof having an antigen-binding ability and a chemotherapeutic agent linked by an intermediate support, according to any one of claims 1312, 1416 and 17 Complex.
19. 抗イ ンテグリ ン α 3抗体又は抗原結合能を有するその断片と トキシンとを中間支持体により連結して成る請求項 2 8 1 3及 び 1 5 1 7 のいずれか 1 項に記載の複合体。  19. The complex according to any one of claims 2813 and 1517, wherein an anti-integrin α3 antibody or a fragment thereof having antigen-binding ability and a toxin are linked by an intermediate support. body.
20. 前記中間支持体がペプチ ド、 カルボキ シメチルデキス ト ラ ン 、 ア ビジ ン · ビォチ ン、 デキス ト ラ ン、 ア ミ ノ デキス ト ラ ン、 又は ヒ ト血清アルブミ ン （HSA ) である、 請求項 1 8及び 1 9 のいずれ か 1項に記載の複合体。  20. The intermediate support is a peptide, carboxymethyl dextran, avidin biotin, dextran, aminodextran, or human serum albumin (HSA). 18. The complex according to any one of items 18 and 19.
21. 請求項 1 2 0のいずれか 1 項に記載の複合体を含んで成る 医薬組成物。  21. A pharmaceutical composition comprising the conjugate of any one of claims 120.
22. 抗腫瘍作用を有する請求項 2 1 に記載の医薬組成物。  22. The pharmaceutical composition according to claim 21, which has an antitumor effect.
23. 請求項 1 2 0のいずれか 1項に記載の複合体を含んで成る 診断用組成物。  23. A diagnostic composition comprising the conjugate of any one of claims 120.
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