WO1997020049A1 - Human peptide circulating in the blood and possessing insulinotropic properties - Google Patents

Human peptide circulating in the blood and possessing insulinotropic properties Download PDF

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WO1997020049A1
WO1997020049A1 PCT/EP1996/005183 EP9605183W WO9720049A1 WO 1997020049 A1 WO1997020049 A1 WO 1997020049A1 EP 9605183 W EP9605183 W EP 9605183W WO 9720049 A1 WO9720049 A1 WO 9720049A1
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WO
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gcap
leu
peptide
cys
diseases
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PCT/EP1996/005183
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German (de)
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Inventor
Wolf-Georg Forssmann
Andreas Kist
Mogens KRUHØFFER
Markus Meyer
Andreas Pardigol
Gabriele Heine
Original Assignee
Forssmann Wolf Georg
Andreas Kist
Kruhoeffer Mogens
Markus Meyer
Andreas Pardigol
Heine Gaby
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a human peptide with insulinotropic activity and its GCAP analogs, in particular (GCAP-II- (89-112), guanylyl cyclase C activating peptide II) and GCAP-I- (99 115), its use as a pharmacological shear Active ingredient and use of its principle of action for providing new GC-C-dependent insulinotropic active ingredients.
  • peptides have become accessible which can activate guanylyl cyclase C and are able to influence insulin secretion from the ⁇ cell of the pancreas.
  • the msulmotropic peptides according to the invention open up a new class of active substances.
  • the peptide designated GCAP-II - (89-112) is preferably formed on the gastric mucosa and is found as a biologically active molecule in the plasma of healthy and sick people.
  • the hitherto unknown mechanism of action of the peptides according to the invention on the ⁇ cell has been elucidated. The therapeutic and economic use has been examined. It was z. B.
  • GCAP-11 - (89-112) surprisingly recognized as an important circulating peptide of human blood.
  • the peptides according to the invention can be used as a means to screen and further develop further ⁇ -cell activating substances.
  • the complete amino acid sequence of GCAP-I- (99-115) and the associated messenger RNA were sequenced.
  • the peptides according to the invention are obtainable by a process for obtaining proteins in pure or partially purified form from human body fluids which have the ability to regulate bodily functions related to metabolism, that is to say in the present case to control the secretion of insulin from the pancreas. These substances are characterized in that they can be obtained in particular from hemofiltrate or hemodialysate from human blood.
  • GCAPs guanylyl cyclase C activating peptides
  • the substances of the GCAP group known to date have so far been obtained from the tissue of various animal species (Currie, MG et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 967-951, 1992; Hamra, et al. Proc. Natl.
  • the GCAP-II- (89-112) (Seq. ID No. 1) formed in the gastric mucosa, which is a peptide of 24 amino acids, is preferably used for the medicament of the peptides according to the invention.
  • GCAP-II - (89-112) was previously isolated and analyzed in the method disclosed in DE 36 33 707 AI (For ⁇ smann, 1988) from blood filtrate, which was originally developed for the extraction of proteins from hamofiltrate. With these methods, molecules with a molecular weight of up to about 20 kDalton can be isolated, which are filtered out of the blood in the case of a veno-venous or arterio-venous shunt connection.
  • the GCAP-I ⁇ - (pc, 112) can now be produced by chemical synthesis or by genetic engineering and can be used for numerous other purposes, for example for analysis in human blood as a pathognomonic diagnostic feature of metabolic diseases and the treatment of these diseases, in particular diabetes mellitus.
  • GCAP-II- 89-112
  • GCAP analogues in particular GCAP-I- (99-115) (Seq. ID No. 2) and this compares to GCAP-II - (89-112) can be used.
  • a new class of active substances is therefore made available as pharmaceuticals, in particular for the treatment of diabetes mellitus.
  • the mechanism described on known cell lines is used for the screening of further analogs, especially for the screening of synthetic ones! Peptides and also non-peptide active ingredients, possibly using modifications.
  • the present invention thus relates to a new peptide class of the GCAP type, e.g. B. GCAP-II- (89-112) (Guanylyl Cyclase C Activating Peptide II), GCAP-I- (99-115) and their analogues, their preparation, use as medicaments and preparations of the GCAP analogues and their use ⁇ Lich, the principle of action described according to the invention can be used via the newly discovered signal transduction in the control of insulin secretion in order to develop, isolate and screen analogous substances for this type of action and also to make them usable for economic purposes. It also relates to the known, resulting applications, namely the biotechnological production and construction of probes for gene diagnostic purposes and the use of gene therapy for GCAP gene-dependent diseases
  • the peptides according to the invention each of which has a different structure, have one principle in common, which is presented here for the first time, in each case when the islands of the pancreas are acted upon, they cause an increased insulin secretion.
  • FIG. 1 shows partial fragments of the GCAP-I precursor which were obtained by natural endoprotease fragmentation.
  • the endoproteases Arg-C, Lys C, Asp-N, Trysm, Chemotrypsm, Endoprotease for two basic amino acids, endoprotease Glu-C and Sureo U8 were used as endoproteases.
  • Figure 1 also relates to partial fragments of GCAP-II- (89-112)
  • FIG. 2 shows the nucleic acid sequence of the guanylate cyclase C (GC-C) receptor of the rat Dit used PCR liimei to detect the GC C Tianskrjpt ⁇ m ⁇ olieiten Langerhan ⁇ 'islands and msulm-producing cells smd indicated by arrows.
  • GC-C guanylate cyclase C
  • FIG. 3 shows an electrophoresis gel for the detection of guanylyl cyclase C in the cell-producing cells (INS-I) by means of the PCR method.
  • Lane No. 1 relates to a primer, GCC 77f GCC 492r (N-terminal)
  • Lane No. 2 relates to a primer GCC 3004f-Un ⁇ p3 (C-terminal)
  • Lane No. 3 relates to a primer GCC1786f-GCC1999r (intermediate)
  • Lane No. 4 relates to a primer GCC 77f (control)
  • lane No. 5 relates to a primer GCC 492r (control)
  • lane No. 6 relates to a primer GCC 3004f (control)
  • lane No. 7 relates to a primer Un ⁇ p3 (control)
  • lane No. 8 relates to a large Prime brand
  • FIG. 4 relates to the stimulation of insulin secretion on (A) isolated pancreatic arms of the mouse in vitro.
  • the administration of the GCAP and the glucose control are each indicated by arrows.
  • the abscissa relates to the diffusion time in minutes, the coordinate gives * - the insulin stimulation in customary units
  • FIG. 5 relates to the stimulation of the cGMP generation parallel to the insulin secretion in a msulm-producing cell myia (INS-I) in vitro.
  • the strong increase in the intra-cellular cGMP under the influence of the GCAP I (99 115) addition becomes clear.
  • the cGMP generation becomes clear at the same time the insulin delivery into the medium was observed
  • FIG. 6 relates to the detection of b-cell activation in the cytosensor, which measures the metabolic activation by protein release. Addition of GCAP-I- (99-115) produces an acidification of the pericellular milieu, which shows the activation of the cell metabolism in two b-cell minias (INS-I and RIN cells).
  • FIG. 7 relates to a schematic representation of the signal transduction path of the interaction of the GCAP-type peptides according to the invention with the b-cell.
  • Figure 8 shows primers for obtaining the cDNA from GCAP-II- (81-112).
  • the primers used are shown in 5 '-> 3' orientation. Underlined areas contain recognition sequences for restriction endonucleases which ensure efficient cloning of the PCR products These primers are named as sequences Ni 28 to 34 m in the sequence list
  • FIG. 9 relates to cDNA obtained from human gastric and colon extract.
  • the translated areas are shown in capital letters, the non-translated areas in g-letters.
  • the ATG start codon, the TGA stop codon and the AATAAA polyadenylation signal smd are underlined.
  • the positions of the primers used are marked with arrows.
  • the first amino acid of the isolated GCAP-II- (99-115) is marked with a triangle, the first amino acid of the uroganylm with a diamond.
  • the nucleic acid sequence in FIG. 9 corresponds to the sequence ID no. 36, whereas the correspondingly encoded amino acid sequence of the polypeptide as Seq ID No. 35 is filed.
  • FIG. 10 relates to the schematic representation of the elements of the GCAP I - (99-115) gene.
  • the exon / intron structure of the gene and the 5 ′ - flanking one are shown Sequence area.
  • the AC-rich sequence region with potential Z-DNA conformation is highlighted.
  • FIG. 11 relates to the DNA sequence of the GCAP-I (99-115) gene and its flanking sequences with regulatory elements.
  • the corresponding sequence is stored as Seq ID No 39 in the sequence listing. Coding areas are capitalized, intron sequences are printed in small letters. Potential binding sites for transcription factors are capitalized and underlined. The potential binding of the factors on the sense or antisense strand is indicated by arrows The substance and stait codons are printed in italics. Direct and inverted repeats (direct and inverted repeats) are numbered with Roman numerals.
  • the oligo nucleotides Gua-Pl, Gua-P2 and Gua-P3 shown in the illustration were used to amplify the promoter fragments for the luciferase / reporter gene assay
  • FIG. 12 relates to promoter activities of the GCAP-I (99-115) promoter fragments.
  • the promoter / reporter gene constructs with the promoter sequences of different lengths are shown schematically.
  • the relative activities represented in the right part each represent a multiple of the definition standardized to 1 Basal activity of the promoterless clone PGL-2-Bas ⁇ c represents
  • the peptides according to the invention are surprisingly characterized in that when they act on msulm-producing cells, they react with increased insulin products. This effect was previously unknown. Only for GCAP-II- (89-112) had it been referred in the international application PCT / EP 96/03429 that this peptide can be used for the treatment of diabetes. However, it does not result for the person skilled in the art that this peptide itself is used as The present invention also contains the IT' ⁇ in the HmbLt 'au 4 96/03429 new information for the expert. Fragments claimed according to the invention are to be understood as fragments of guanylm which have the msulmotropic effect, in particular those which are mentioned here in the sequence listing.
  • the peptide GCAP-II- (89-112) according to the invention containing 24 amino acids has the following amino acid sequence
  • Seq. ID No 1 and 2 include their salts, natural and pharmacologically contractual derivatives, in particular amidated, acetylated, phosphorylated and glycosylated GCAP II (89-112) or GCAP-I (99-115) derivatives and further fragments of the peptides name, especially those according to Seq ID No. 3 - 25
  • Mass spectrometry revealed a molecular weight of 2,597.7 daltons for GCAP-II- (89-112) and 1,702 daltons for GCAP-I- (99-115) (Examples 1 and 2).
  • the amino acid sequence determined for GCAP-II - (89-112) corresponds to the amino acid sequence derived from the cDNA from position 89 to position 112 (COOH terminus)
  • the use of GCAP-II- (89-112), the peptides which are obtained from the cDNA sequence as cleavable partial fragments predominantly via natural endoproteases (FIG. 1) and its analogues as a pharmaceutical for the treatment of metabolic disorders, particularly diabetes mellitus is also the subject of the present invention.
  • a corresponding usability could be determined by functional analysis (Example 5).
  • the peptides according to the invention can be produced by various methods. These are characterized in that they are produced by prokaryotic or eme eukaryotic expression and purified chromatographically, by isolation from human blood using chromatographic methods in a manner known per se or by customary methods of solid-phase and liquid-phase synthesis from protected amino acids , which are contained in the specified sequence, couples, deblocks and cleans with common chromatography methods.
  • GCAP-II- (89-112) and GCAP-I- (99-115) were chemically synthesized (see Example 3) and prepared as a medicament.
  • Genetic engineering production using conventional vectors has also been developed:
  • the GCAP-II (89-112) peptide is produced by genetic engineering, both (1) in pro- and (2) in eukaryotic organisms.
  • Various organisms and vectors are available for eukaryotic expression, for example insect cells (Summers and Smith, Tex. Agric. Exp.
  • GCAP-I- 99-115) and GCAP-II- (89-112) are purified using methods of chromatography, preferably as indicated in Examples 1 and 2.
  • the medicament according to the invention containing the msulmotropic peptide according to the invention contains GCAP-1 - (99-115) or GCAP-II- (89-112) or their physiologically tolerable salts.
  • the form and composition of the medicinal product containing GCAP-I- (99-115) or GCAP-11 - (89-112) depends on the mode of administration.
  • Human GCAP-I - (99-115) or GCAP-II- (89-112) can be administered parenterally, intranasally, orally and by inhalation.
  • GCAP-II- (89-112) is preferably made up into an injection preparation, either as a solution or as a lyophilisate for dissolution immediately before use.
  • the pharmaceutical preparation can also contain auxiliaries which are due to filling technology, which contribute to the solubility, stability or sterility of the pharmaceutical or which increase the efficiency of absorption into the body.
  • the daily dose of the insulmotropic peptide to be administered depends on the indication and the use of certain derivatives.
  • Injection is in the range of 100 to 1,200 units ( ⁇ g) / day, with daily subcutaneous injection, preferably 300-2400 units ( ⁇ g) / day.
  • the msulmotropic peptides according to the invention are particularly distinguished by the fact that they are also suitable for long-term therapy of diabetes mellitus. They have excellent biological properties Efficacy and, on the other hand, do not trigger an immune reaction even with Dauei treatment.
  • the biological effect shows that the preparation according to the invention can also be used as an agent for therapy for diarrheal diseases, kidney diseases, heart diseases, diseases of endocrine organs (as emphasized above, in particular diabetes mellitus), in intensive care and for lung diseases (example 4 and 5).
  • the msulmotropic peptide according to the invention can also be used as a means of therapy and diagnosis for metabolic disorders of the gastrointestinal tract (in particular the small intestine and pancreas), the respiratory tract, the cardiovascular system and the urogenital system, endocrine organs and the nervous system, since it is used for Production of human-compatible antibodies can be used, which are suitable for detecting or influencing changes in the metabolic position of these organs.
  • Hamofiltrate was used as the starting material, which accumulates in large quantities in the treatment of patients with kidney deficiency and contains all plasma constituents up to a molecular size of approximately 20,000 daltons.
  • the hamofiltrate was obtained by means of a Sartorius hamofiltration system using cellulose triacetate filters with an exclusion size of 20,000 daltons (type SM 40042, Sartorius, Göttingen, FRG).
  • the filtrate came from patients with kidney insufficiency who were in a stable metabolic state due to long-term hemoflltration.
  • 3,000 1 hamofiltrate were obtained and immediately protected against proteolytic degradation by acidification and cooling to 4 ° C.
  • a crude peptide fraction (570.5 g) was then obtained by four cation exchange extractions.
  • the Rohpeptidfr press from the ultrafiltration was mascara on a column packed with RP-C18 Materral (Vydac, Hespe ⁇ a, CA, USA) Kar ⁇ equilibrated with 0.01 N hydrochloric acid, chromato ⁇ graphically by means of HPLC separated •
  • the cGMP-generating effect of the fractions was grown on T84 cells (Currie, MG et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 89, 947-951, 1992) in Fischer medium (Gibco) by measuring the Increase in intracellular cGMP was determined by means of a radioimmunoassay after 60 mm and was compared with controls in which 0.9% NaCl was added to the culture medium instead of the HF peptides.
  • Eluent B 80% acetonitrii, 20 o 0 water
  • Fractions 4-6 contained bioactivity for the cGMP generation test on T84 cells. Fraction 5 was used for the further separation. 1.2.3 Analytical cation exchange chromatography of the GCAP-II (89-112) -containing fraction from the preparative RP-Cl8 chromatography II (stage 3)
  • the bioactive GCAP-II- (89-112) -containing immunoreactive fraction (50 ml) was further purified by means of analytical cation exchange chromatography.
  • the biological activity appears in the range of a retention time of 8 and 9% of the eluent B.
  • Eluent A water with 0.1% trifluoroacetic acid
  • Eluent B 80% acetonitrii, 20% water
  • Eluent B 80% acetonitrii, 20 o water
  • the peptide activating T84 was detected in an area that eluted within one minute. The entire further material of the bioactive fractions was finally rechromatographed using the same column (see step 6)
  • Eluent B 80% acetonitrii, 20 W water
  • the sequence found is the NH 2 -terminally unknown Pepart, the C-termmus corresponds to human uroguanylms (Hamra, et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 90, 10464-10468, 1993) .
  • This surprisingly found peptide was designated as guanylyl cyclase C activating peptide II, GCAP-II- (89-112). It has structural homologies to those of human guanylm and the heat-stable enterotoxes from bacteria. The activating effect on guanylate cyclase-C is described for these peptides.
  • the analysis of the GCAP-II (89-112) sequence is confirmed by the cDNA (FIG. 7 and Example 6).
  • the derived precursor can be used to prepare the brologrsch available fiagments to the other biologically active peptides of the GCAP-II (89-112) group to win (Seq ID No 2)
  • the urine from healthy volunteers was used as the starting material - 11 l of urine were diluted with 44 l of deionized water immediately after collection and adjusted to pH 2.7 with 32% HCl after addition of 150 g Algmsaure was stirred for 2 hours at 4 ° C, sedimented for 10 minutes and stirred for a further 2 hours. The alginic acid was then sedimented over 1 hour and the supernatant checked for peptide / protein content hm. After stirring again, the suspension was transferred to a process filter and suction filtered through filter paper.
  • the alginic acid cake was sucked dry and washed twice with 5 mM HCl to remove the residual urine.
  • the alginic acid was then resuspended and washed four times with 600 ml of ethanol in order to remove lipids etc.
  • the alginic acid was suspended with 150 ml of 0.2 M HCl and sucked dry. This process was repeated four times, the filtrates were collected and immediately adjusted to pH 4.0 with 0.2 M sodium acetate.
  • the eluate was then dried by freeze-drying and the residues were taken up in 210 ml of demineralized water.
  • the dissolved peptides were desalted on a column filled with RP-C18 material.
  • the entire eluate of the preparative RP-C18 column was collected and then subjected to freeze drying.
  • the freeze-dried preparation was dissolved in 22 ml of 0.1 M acetic acid, 10% acetonitrile and separated into further constituents via cation exchangers.
  • stage IV The individual fractions of stage IV were subjected both to a direct coupling of the liquid chromatography and to a fractionation from a microbore column.
  • the mass could be determined with 1702 amu and thus corresponds to the mass of the human GCAP-I- (99-115) Example 3
  • the synthesis was carried out by m situ activation with the addition of 4.4 equivalents of TBTU [O- (1H-benzotriazol-1-yl) - N, N, N ', N' -tetramethyluronium tetrafluoroborate], 4.4 equivalents 1-Hydroxybenzotriazole (HOBt) and 8.8 equivalents of diisopropylethylamine in N, N-dimethylformamide.
  • Pre-occupied Fmoc-L-Leu-PEG-PS resin (0.20 mmol / g coverage, biosearch / per septive) was used as the carrier resin for the synthesis.
  • cysteine residues in positions 15 and 23 were used as otcotamidomethyl (Acm) -protected cysteine derivatives used while the system residues in positions 12 and 20 were used as trityl-protected derivatives.
  • Acm otcotamidomethyl
  • the resin was split off with trifluoroacetic acid / - ethanedithiol / water in a ratio of 94 3> (10 ml, v / v / v) within 90 minutes.
  • the solution is concentrated in vacuo and the product is precipitated by adding diethyl ether.
  • the crude peptide obtained was washed several times with diethyl ether, dried and then taken up in water and freeze-dried. 85 mg of crude peptide were obtained from 490 mg of peptide-resin.
  • the crude peptide was added at a concentration of 1 mg / ml m 0.1 M aqueous ammonium carbonate solution at pH 8.3. This mixture was stirred in air for 48 hours at room temperature and then lyophilized.
  • the product obtained was taken up in 80% methanol in water and 5 equivalents of solid iodine were added. This deep brown mixture was stirred vigorously for 3 hours under an atmosphere of plastic. The excess iodine is then added with the addition of 0.1 M sodium thiosulfate solution until it decolorises. The solution obtained is diluted with a volume of water. Then the peptide was purified.
  • the purification was carried out using a standard of GCAP-II- (89-112) prepared in independent synthesis, the correct sequence of which was confirmed by MS (mass spectrometry) and sequence analysis.
  • the yield was 3.6 mg.
  • the material obtained coelutes in an analytical RP-HPLC with C18 material with the independently produced standard.
  • the identity of the synthesized material with the given primary structure of GCAP-11 - (89-112) was determined by mass spectrometry (Sciex API III, Perkin-Elmer) and sequencing in a gas phase sequencer (model 470, Perkm-Elmer) confirmed.
  • the biological activity of the synthetic GCAP-II (89-112) was demonstrated in the functional test by the cGMP generation-stimulating effect on T84 colon carcinoma cells. This showed that the synthetic material has a biological activity
  • the cells were used after about 2-3 days.
  • the incubation was carried out with 0.5 ml of cell medium in the presence of 1 mM IBMX (Sigma) at 37 ° C.
  • the GCAP-II (89-112) peptide Preparations containing were taken up in the cell medium immediately before the start of the experiment.
  • FIG. 2 shows the GC-C cDNA the rat (Schulz DL, et al. Cell 63: 941-948, 1990), the 6 primers used being shown.
  • 3 shows as an example the result of the PCR for the detection of the GC-C transcript from INS-I cells.
  • the cGMP-specific protein kinases were detected in an analogous manner. The same amplifications can be found in isolated islets and on 3 other insulin-producing cells.
  • insulin-producing cell lines (INS-I, RIN, HIT) used in the studies and the isolated islets of the rat express the specific guanylin receptor
  • INS-I reads a slowly growing cell line which was established from an X-ray-induced insuloma of the rat.
  • the culture doubles time to 100 hours.
  • the Cells show the morphological characteristics of ß cells in the pancreas. They have an insulin content of about 20% of native ß cells. Glucose stimulates the insulin secretion of the INS-I cells.
  • the cells are cultivated in medium RPMI1640 + additives in an incubator at 5% CO, 37 ° C.
  • the cell chemistry is a suitable model for examining the influence of chemical substances on the insulin regulation in vitro .
  • RINm5F is also a cell measurement from an insuloma of the rat.
  • the stimulability of the cells for insulin secretion by glucose is about 1/50 that of INS-1 cells.
  • This cell myia which has comparable growth and culture restrictions, like INS-I, can also be used to study the regulatory mechanisms for the secretion of insulin.
  • the insulated-perifused pancreatic capsule reads an established tissue model for recording the effect of chemical substances on insulin secretion and the second messenger systems involved. Subject of the investigation was to demonstrate dec influence of CGAP-I] - (89 112) on the r In ul msekretrons antique natrver beta cells
  • the pancreatic tissue is removed from mice and, after digestion with collagenase, approximately 50 individual islands are transferred to a membrane and punctured with a physiological buffer. After an aquiliberation phase, the peptide to be tested is added to the buffer and the perfusionate is collected fractionally. The released insulin is then detected in the perfusate by the method already mentioned above.
  • Stimulation of the INS-I cells (FIG. 5) with GCAP-II- (89-112) resulted in an increase in the intracellular cGMP to 1016 pmol / ml at 10 M (negative control 362 pmol / ml)
  • the administration of 10 "7 M GCAP-II (89-112) stimulates INS-I cells (FIG. 5) to secrete insulin at a level of 6.08 ng / ml (negative control 1.15 ng / ml).
  • microphysiometer it is possible to record the cellular response to a chemical substance, in particular peptide factors as ligands for specific membrane receptors, via the acidification of the extracellular space.
  • concentration of released protons which is linear with the drop in the extracellular pH value, is measured using a light-addressable photometric silicon sensor (LAPS).
  • LAPS light-addressable photometric silicon sensor
  • GCAP-II- (89-112) binds to the membrane surface of the ß cell
  • cGMP-specific protein kinases eg cGK-II
  • the protein phosphorylation activates the mechanism of the Ca-dependent release of insulin via exocytosis (FIG. 7).
  • RNA was obtained from eight human tissues (duodenum, colon, stomach, liver, pancreas, kidney, adrenal gland and bladder) using standard methods.
  • MMLV reverse transcriptase and the oligo (dT) primer UNIP-5 (see FIGS. 8 and 9), which is partially complementary to the poly (A) tail of eukaryotic mRNA, a transcription was carried out in the first strand of cDNA.
  • PCR primer HUGU-5 (see FIGS. 8 and 9) was constructed, which contains the codons for the C-terminal fragment CVNVAC.
  • UNIP-6 the sequence of which is contained in UNIP-5, polymerase chain reactions (PCRs) (Saiki, RK et al ., Science, 239, 487-491, 1988).
  • PCRs polymerase chain reactions
  • the first potential translation start codon ATG appearing in the sequence is actually the beginning of an open reading frame of 336 base pairs, which codes for a 112 Ammosciui-n GCAP-11 (8 L UM Voi l.uf.i. As expected, the first 21 amino acids show the typical characteristics (high hydrophobicity) of a secretory signal peptide (Von Heij ne, G., Eur. J. Biochem., 133, 17-21, 1983). As already mentioned, the 3 'terminus of the cDNA sequence codes for the isolated peptide GCAP-II - (89 - 112)
  • luciferase reporter gene assay was used (Wood, KV, Biolummescence & Chemilumme ⁇ cence: Current Status, ed. P. Stanley and L. Kricka, John Wiley and Sons, Chicester , 1991).
  • Two differently long, potential promoter fragments were first identified by PCR (Saiki, RK et al. Science 239, 487 491, 1988) using a proofreading heat-stable combi-polymerase (InViTec, Berlin, Germany) from a lysate of phage pHGU 35 ( Hill, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the two plasmids GLuc25 and GLuc30 were cut with the residual endonucleases SstI and PstI (Life Technologies, Eggenstein, Germany) and the linear ones After electrophoresis in the agarose gel, plasmid DNA of the five plasmid constructs was religated (GLuc25, GLuc30, 25 ⁇ SstI, 25 ⁇ PstI and 30 ⁇ PstI) were prepared using TIP 100 columns (Qiagen, Hilden, Germany).
  • T84 cells were used using the calcium phosphate DNA coprecipitation method (Sambrook, J., et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York) with the promoter / reporter gene constructs for 7 hours.
  • 5 ⁇ g of promoter / report gene DNA together with 2 ⁇ g of pSVßGal DNA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) were propagated as the internal standard for later normalization of the luciferase values in the cells.
  • the relative promoter activities represented in FIG. 12 represent the mean values from two independent transformation experiments. All constructs show significant relative promoter activity. Due to a 3-fold drop in the activity of the clone GLuc25, binding motifs for potentially negative transcription factors could exist in the range between -1309 and -532.
  • MOLECULE TYPE Peptide
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • MOLECULE TYPE Peptide
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • MOLECULE TYPE Peptide
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • MOLECULE TYPE Peptide
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 6.
  • MOLECULE TYPE Peptide
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • MOLECULE TYPE Peptide
  • HYPOTHETICAL NO Uv
  • ANTI ⁇ ENSE NO
  • MOLECULE TYPE Peptide
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • MOLECULE TYPE Peptide
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • CACGATTTCC TACCCTGATG GCACGTTCAT GGATTGGGAG TTTAAGATCT CTGTCTTAAA 1800
  • GGAAAATTCC TATGGGACGA AACCCTTCCG CCCAGATCTC TTCCTGGAAA CCGCAGATGA 2160
  • GCCCCCAAGT CATGTGGGTG TTCTGGGTTG GGTTGGGTTG GGTTTGGTTG GTTGGTTTTG 3420
  • ANTISENSE NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 27: CCTCAGCTGC AGCTCGAGTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TT 42
  • ANTISENSE NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 30: CTGCAGCTCG AGTAGAATCT TTATTCAGGA GCTG 34
  • ACCATCGCTA ACGACGACTG TGAGCTGTGT GTGAACGTTG CGTGTACCGG CTGCCTCTGA 360
  • MOLECULE TYPE cDNA
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • CTGCAGAGCA CACAGTCAGT CTACATCCAG TACCAAGGCT TCCGGGTCCA GCTGGAATCC 120
  • GGTATTATTT TTGGTTCCCA CAGGGGACAC AAGGGACAAC GAGACTCAGA GAGGGGAAAG 1740
  • ACACAGCAGC ACAGGGCAGT CGTGAGTGAA TGTGCCTTGT TGGTGAATGA ATGCAGGACC 2160
  • CTCTTCGCAC TGTGCCTCCT TGGGGCCTGG GCCGCCTTGG CAGGAGGGGT CACCGTGCAG 2460
  • CTGATCTCTA TCAAAGCCAG ATTCCGGGAG GCCTTTTATT GCTTCTCAAA CCAAAACCAG 3060

Abstract

The invention relates to an insulinotropic peptide from human blood, in particular GCAP-II-(89-112) (guanylate-cyclase C-activating peptide II) whose structure has been determined with a view to diagnostic, medical and industrial applications as a drug. An analog GCAP-I-(99-115) isolated from urine is also claimed. The molecular shape of GCAP-II-(89-112) was determined by sequence analysis and mass spectrometry. Different biological activity and differences in the spatial peptide structure of GCAP-II-(89-112) compared to other GCAP-II-(89-112) fragments show that this GCAP-II-fragment is a natural peptide of the same family as the claimed peptide group whose members can be used in the treatment of many disorders associated with disturbances in glucose or electrolyte transport and insulin secretion in cells, and specifically in the treatment of endocrine disorders. The operating principle of, for example, GCAP-II-(89-112) in the context of insulin secretion by the endocrine pancreas and thus of secretion of other analog substances was thus determined and can be used to develop potent anti-diabetic drugs. In addition, GCAP-I-(99-115) and GCAP-II-(89-112) (guanylate-cyclase C-activating peptides I and II) can be used in pure form or as a natural raw extract for industrial purposes in investigating new cell functions. Knowledge obtained on the cDNA and gene structure of GCAP-II-(89-112) and GCAP-I-(99-115) can be of significance for diagnostic and therapeutic ends.

Description

Humanes, im Blut zirkulierendes Human, circulating in the blood
Peptid mit insulinotroper WirkungPeptide with an insulinotropic effect
Die vorliegende Erfindung betrifft ein humanes Peptid mit insulinotroper Wirkung und seine GCAP-Analoga, insbesondere (GCAP-II- (89-112) , Guanylyl Cyclase C Aktivierendes Peptid II) und GCAP-I- (99 115) , seine Anwendung als pharmakologi scher Wirkstoff und Verwendung seines Wirkungsprinzipes zur Bereitstellung neuer GC-C-abhangiger insulinotroper Wirk¬ stoffe .The present invention relates to a human peptide with insulinotropic activity and its GCAP analogs, in particular (GCAP-II- (89-112), guanylyl cyclase C activating peptide II) and GCAP-I- (99 115), its use as a pharmacological shear Active ingredient and use of its principle of action for providing new GC-C-dependent insulinotropic active ingredients.
Neuere Arbeiten (W. G. Forssmann, Acta Nova Leopoldina, NF, 294, 1995 m Druck) haben ergeben, daß zahlreiche kleine Peptide aus Blutflüssigkeiten gewonnen werden können, die für die Regulation der Funktion des Stoffwechsels wichtig sind. Sie sind auch diagnostisch und therapeutisch von großem Interesse. Dazu nehmen solche Faktoren eine Sonderstellung ein, die sowohl bei der Behandlung von Stoffwechseler krankungen als auch bei der Hormonsubstitution bei vielen Erkrankungen durch regelmäßige Gabe über einen langen Zeit räum, gegebenenfalls lebenslang, verabreicht werden können Somit ist vorstcllbai , daß Krankheitsvoigangc ubej diesen neuartigen Zugang zu Pharmaka behandelbai werden Auch dio Aufklärung der zu den erfindungsgemäßen Peptiden gehörigen Gene kann neue Wege für eine spezifische Genanalyse und Gentherapie eröffnen.Recent work (WG Forssmann, Acta Nova Leopoldina, NF, 294, 1995 m pressure) has shown that numerous small peptides can be obtained from blood fluids, which are important for the regulation of the function of the metabolism. They are also of great diagnostic and therapeutic interest. For this purpose, such factors have a special position that can be administered in the treatment of metabolic diseases as well as in hormone substitution in many diseases by regular administration over a long period of time, possibly lifelong.Therefore, it is first of all clear that the disease pathway has this new approach Pharmaceuticals are also treated dio Clarification of the genes belonging to the peptides according to the invention can open up new paths for specific gene analysis and gene therapy.
Überraschenderweise wurden Peptide zugänglich, die Guanylyl Cyclase C aktivieren können und in der Lage sind, die In¬ sulinsekretion aus der ß-Zelle der Bauchspeicheldruse zu beeinflussen. Die erfindungsgemäßen, msulmotropen Peptide eröffnen eine neue Wirkstoffklasse. So wird z B. das als GCAP- II - (89-112) bezeichnete Peptid vorzugsweise an der Magenschleimhaut gebildet und als biologisch aktives Molekül im Plasma gesunder und kranker Menschen gefunden. Der bisner unbekannte Wirkungsmechanismus der erfindungsgemaßen Peptide an der ß-Zelle wurde aufgeklärt. Die therapeutische und wirtschaftliche Verwendung wurde geprüft. Dabei wurde z. B. das GCAP- 11 - (89-112) überraschenderweise als wichtiges zirkulierendes Peptid des menschlichen Blutes erkannt. Die erfindungsgemäßen Peptide können als Mittel eingesetzt werden, um weitere ß-zellaktivierende Stoffe zu screenen und gezielt zu entwickeln. Erstmals wurde die komplette Aminosau¬ resequenz des GCAP-I- (99-115) und die dazugehörige Messenger RNA sequenziert .Surprisingly, peptides have become accessible which can activate guanylyl cyclase C and are able to influence insulin secretion from the β cell of the pancreas. The msulmotropic peptides according to the invention open up a new class of active substances. For example, the peptide designated GCAP-II - (89-112) is preferably formed on the gastric mucosa and is found as a biologically active molecule in the plasma of healthy and sick people. The hitherto unknown mechanism of action of the peptides according to the invention on the β cell has been elucidated. The therapeutic and economic use has been examined. It was z. B. GCAP-11 - (89-112) surprisingly recognized as an important circulating peptide of human blood. The peptides according to the invention can be used as a means to screen and further develop further β-cell activating substances. For the first time, the complete amino acid sequence of GCAP-I- (99-115) and the associated messenger RNA were sequenced.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind erhältlich durch ein Verfahren zur Gewinnung von Eiweißstoffen m reiner oder partiell aufgereinigter Form aus menschlichen Körperflüssig¬ keiten, die die Fähigkeit besitzen, stoffwechselbedingte Korperfunktionen zu regeln, also im vorliegenden Fall die Sekretion von Insulin aus der Bauchspeicheldrüse zu steuern. Diese Stoffe sind dadurch gekennzeichnet, daß sie insbe¬ sondere aus Hämofiltrat oder Hämodialysat von menschlichem Blut gewonnen werden können. Die gefundenen msulmotropen Stoffe gehören zur Gruppe der GCAPs (Guanylyl Cyclase C Activating Peptides) , und sie sind vorzugsweise zum Zwecke (1) dei Analyse von Erkrankungen, (2) zui medizinischen und gewerblichen Verwendung als Medikamente geeignet, di^ mit dem Zuckerstoffwechsel (Diabetes mellitus; zusammenhanαeπ Die bis jetzt bekannten Stoffe der Gruppe GCAP wurden bisher aus dem Gewebe verschiedener Tierarten (Currie, M.G. et al , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 967 - 951, 1992; Hamra, et al . Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 90, 10464 - 10468, 1993) und dem Hamofiltrat Nierenkranker nach Ultrafiltration am Hamo- dialyseapparat (Kuhn, M. , et al . , FEBS letters 318, 205 - 209, 1993, Hess, R. , et al . FEBS letters, 374, 34 - 38, 1995) gewonnen. Nachdem erfindungsgemäß ihre überraschende Wirkung auf ß-Zellen der Inseln der Bauchspeicheldrüse entdeckt war, wurden sie an isolierten Pankreas-Inseln der Ratte sowie an insulinproduzierenden Zellinien, die analog der ß Zelle aufgebaut smd, funktionell charakterisiert.The peptides according to the invention are obtainable by a process for obtaining proteins in pure or partially purified form from human body fluids which have the ability to regulate bodily functions related to metabolism, that is to say in the present case to control the secretion of insulin from the pancreas. These substances are characterized in that they can be obtained in particular from hemofiltrate or hemodialysate from human blood. The msulmotropic substances found belong to the group of GCAPs (guanylyl cyclase C activating peptides), and they are preferably suitable for the purpose of (1) the analysis of diseases, (2) medical and commercial use as medicaments, ie with the sugar metabolism (diabetes mellitus; togetherness The substances of the GCAP group known to date have so far been obtained from the tissue of various animal species (Currie, MG et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 967-951, 1992; Hamra, et al. Proc. Natl. Acad Sei, USA, 90, 10464-10468, 1993) and the hamofiltrate of kidney patients after ultrafiltration on the hemodialysis machine (Kuhn, M., et al., FEBS letters 318, 205-209, 1993, Hess, R., et al FEBS letters, 374, 34-38, 1995). After their surprising effect on ß-cells of the pancreatic islets was discovered according to the invention, they were functionally characterized on isolated pancreatic islets of the rat and on insulin-producing cell lines which had a structure similar to that of the ß-cell.
Vorzugsweise wird für die Verwendung als Medikament der erfindungsgemäßen Peptide das m der Magenschleimhaut ge¬ bildete GCAP-II- (89-112) (Seq. ID No . 1) benutzt, das em Peptid von 24 Aminosäuren darstellt. GCAP-II - (89-112) wurde zuvor m dem in der DE 36 33 707 AI offenbarte Verfahren (Forεsmann, 1988) aus Blutfiltrat isoliert und analysiert, welches ursprünglich für Gewinnung von Einweißstoffen aus Hamofiltrat entwickelt wurde. Mit diesen Verfahren können Moleküle von einem Molekulargewicht bis etwa 20 kDalton isoliert werden, die bei veno-venoser oder arterio-venoser Shuntverbmdung aus dem Blut abfiltπert werden. GCAP-II- (89- 112) enthaltende Fraktionen zeigten überraschenderweise m einem Biotest der stimulierten Insulinsekretion diese Wirkung. Das an sich bekannte Verfahren wurde benutzt, um die Rohpeptidextrakte zu gewinnen, welche bei der Anwendung an Inselzellen m Zellkultur überraschenderweise eme starke Wirkung unter gesteigerter Ausschüttung von Insulin ent falten. Nach Synthese der GCAP-II - (89-112 ) wurde dieser Stoff, ebenso wie andere Peptide der Gruppe der GCAPs, überraschenderweise als insulinotroper Faktor erkannt . Die vorliegende Erfindung ermöglicht m vorteilhafter Weise, diesen Stoff aus dem bisher als wertlos betrachteten Hamo¬ filtrat zu reinigen, um als wirtschaftlich verwertbaie Substanz benutzt zu werden. Das erfindungsgemaße GCAP-Iτ-(pc, 112) ist nun durch chemische Synthese oder durch gentechno¬ logische Produktion herstellbar und für zahlreiche weitere Belange nutzbar, so zum Beispiel für die Analyse im mensch¬ lichen Blut als pathognomonisches Diagnosemerkmal von Stoff¬ wechselerkrankungen und die Behandlung dieser Erkrankungen, insbesondere des Diabetes mellitus.The GCAP-II- (89-112) (Seq. ID No. 1) formed in the gastric mucosa, which is a peptide of 24 amino acids, is preferably used for the medicament of the peptides according to the invention. GCAP-II - (89-112) was previously isolated and analyzed in the method disclosed in DE 36 33 707 AI (Forεsmann, 1988) from blood filtrate, which was originally developed for the extraction of proteins from hamofiltrate. With these methods, molecules with a molecular weight of up to about 20 kDalton can be isolated, which are filtered out of the blood in the case of a veno-venous or arterio-venous shunt connection. Fractions containing GCAP-II (89-112) surprisingly showed this effect in a bioassay of the stimulated insulin secretion. The process, which is known per se, was used to obtain the crude peptide extracts which, when used on islet cells in cell culture, surprisingly develop a strong effect with increased release of insulin. After synthesis of GCAP-II - (89-112) this substance, like other peptides from the group of GCAPs, was surprisingly recognized as an insulinotropic factor. The present invention advantageously makes it possible to purify this substance from the hamofiltrate previously considered worthless in order to be used as an economically usable substance. The GCAP-Iτ- (pc, 112) can now be produced by chemical synthesis or by genetic engineering and can be used for numerous other purposes, for example for analysis in human blood as a pathognomonic diagnostic feature of metabolic diseases and the treatment of these diseases, in particular diabetes mellitus.
Bei der Untersuchung der Wirkung von Hamofiltratpeptiden konnte überraschenderweise festgestellt werden, daß bisher nach chromatographischen Eigenschaften unbekannte Stoffe zu einer Erhohunq der Insulinsekretion fuhren. Nach Identifi zierung des GCAP- II- (89-112) als insulinotroper Faktor wurde weitei festgestellt, daß die Wirkung über membranstandige GC-C (Guanylyl Cyclase C) als Rezeptor m die ß-Zelle über¬ tragen wird, nachdem das Peptid an der Membranoberflache gebunden wird. Durch parallelen Anstieg des cyclischen cGMP und des mtracellularen Calziums in der ß-Zelle wahrend der Aktivierung dieser Zelle konnte der vermutlichen Stoff¬ wechselweg aufgeklart werden, der durch den molekularbio logischen Nachweis der cGMP-abhängigen Proteinkmasen (Schmidt H H. H. W. et al , Biochim. Biophyε . Acta 1178: 153 - 175, 1993) m ß-Zellmien und Ratteninseln gesichert wurde. Es wurde somit em völlig neuer Wirkmechanismus beschrieben, der für die Insulinsekretion bislang nicht bekannt war und damit überraschenderweise neue Wege für die Diabetestherapie eröffnet.When examining the effect of hemofiltrate peptides, it was surprisingly found that substances previously unknown according to chromatographic properties lead to an increase in insulin secretion. After identifying the GCAP-II- (89-112) as an insulinotropic factor, it was furthermore found that the action via membrane-standing GC-C (guanylyl cyclase C) as receptor m is transmitted to the .beta. Cell after the peptide on the Membrane surface is bound. A parallel increase in the cyclic cGMP and the mtracellular calcium in the β cell during the activation of this cell made it possible to elucidate the presumed metabolic pathway, which is based on the molecular biological detection of the cGMP-dependent protein masses (Schmidt HHW et al., Biochim. Biophyε Acta 1178: 153-175, 1993) mß cell lines and rat islands. A completely new mechanism of action has thus been described which was not previously known for insulin secretion and thus surprisingly opens up new paths for diabetes therapy.
Weitere Versuche zeigten, daß der Stoffwechselweg für GCAP- II- (89-112) auch mit GCAP-Analoga funktioniert, insbesondere das GCAP-I- (99-115) (Seq. ID No. 2) und diese vergleichsweise zum GCAP-II- (89-112) eingesetzt werden können. Erfindungs¬ gemaß wird mithin eme neue Klasse von Wirkstoffen als Pharmaka, insbesondere für die Behandlung des Diabetes mellitus zur Verfugung gestellt. Der beschriebene Mechanismus an bekannten Zellmien wird zum Screening weiterer Analoσa benutzt, insbesondere zum Screening synthetische! Peptide und auch nicht peptiderger Wirkstoffe ggf. unter Einsatz von Modifizierungen.Further experiments showed that the metabolic pathway for GCAP-II- (89-112) also works with GCAP analogues, in particular GCAP-I- (99-115) (Seq. ID No. 2) and this compares to GCAP-II - (89-112) can be used. According to the invention, a new class of active substances is therefore made available as pharmaceuticals, in particular for the treatment of diabetes mellitus. The mechanism described on known cell lines is used for the screening of further analogs, especially for the screening of synthetic ones! Peptides and also non-peptide active ingredients, possibly using modifications.
Die vorliegende Erfindung betrifft also eme neue Peptid- klasse vom GCAP-Typ, z. B. das GCAP-II- (89-112) (Guanylyl Cyclase C Activating Peptide II) , GCAP-I- (99-115) und ihre Analoga, ihre Herstellung, Verwendung als Arzneimittel sowie Aufbereitungen der GCAP-Analoga und ihre Verwendung Schlie߬ lich wird das erfindungsgemäß beschriebene Wirkungsprinzip über die neu entdeckte Signaltransduktion bei der Steuerung der Insulinsekretion verwendbar, um analoge Substanzen zu diesem Wirkungstyp zu entwickeln, zu isolieren und zu screenen und sie ebenfalls für wirtschaftliche Zwecke ver¬ wertbar zu machen. Sie betrifft weiterhin αie bekannten, sich daraus ergebenden Anwendungen, namlich die biotechnologische Herstellung und die Konstruktion von Sonden für gen diagnostische Zwecke und die Anwendung dei Gentherapie für GCAP-Gen-abhangige ErkrankungenThe present invention thus relates to a new peptide class of the GCAP type, e.g. B. GCAP-II- (89-112) (Guanylyl Cyclase C Activating Peptide II), GCAP-I- (99-115) and their analogues, their preparation, use as medicaments and preparations of the GCAP analogues and their use ¬ Lich, the principle of action described according to the invention can be used via the newly discovered signal transduction in the control of insulin secretion in order to develop, isolate and screen analogous substances for this type of action and also to make them usable for economic purposes. It also relates to the known, resulting applications, namely the biotechnological production and construction of probes for gene diagnostic purposes and the use of gene therapy for GCAP gene-dependent diseases
Den erfindungsgemaßen Peptiden, die jeweils eine unterschied¬ liche Struktur aufweisen, ist ein hier erstmals vorgestelltes Prinzip gemeinsam, jeweils bei Einwirkung auf die Inseln der Bauchspeicheldrüse eme erhöhte Insulmausschuttunq zu bewirken.The peptides according to the invention, each of which has a different structure, have one principle in common, which is presented here for the first time, in each case when the islands of the pancreas are acted upon, they cause an increased insulin secretion.
Die Figur 1 zeigt Teilfragmente des GCAP-I-Precusors, die durch naturliche Endoproteasenfragmentierung erhalten wurden. Dabei smd als Endoproteasen die Endoprotease Arg-C, Lys C, Asp-N, desweiteren Trysm, Chemotrypsm, Endoprotease für zwei basische Aminosäuren, Endoprotease Glu-C bzw S aureus U8 eingesetzt worden.FIG. 1 shows partial fragments of the GCAP-I precursor which were obtained by natural endoprotease fragmentation. The endoproteases Arg-C, Lys C, Asp-N, Trysm, Chemotrypsm, Endoprotease for two basic amino acids, endoprotease Glu-C and Sureo U8 were used as endoproteases.
Die Figur 1 betrifft auch Teilfragmente des GCAP-II- (89-112)Figure 1 also relates to partial fragments of GCAP-II- (89-112)
Die Figur 2 zeigt die Nuclemsauresequenz des Guanylat¬ cyclase C (GC-C) Rezeptors der Ratte Dit benutzten PCR liimei zum Nachweis des GC C Tianskrjpt πς m ι olieiten Langerhanε' Inseln sowie msulmproduzierenden Zellen smd mit Pfeilen angegeben.FIG. 2 shows the nucleic acid sequence of the guanylate cyclase C (GC-C) receptor of the rat Dit used PCR liimei to detect the GC C Tianskrjpt πς m ι olieiten Langerhanε 'islands and msulm-producing cells smd indicated by arrows.
Die Figur 3 zeigt em Elektrophoresegel zum Nachweis der Guanylyl-Cyclase C m msulmproduzierenden Zellen (INS-I) durch PCR-Verfahren. Die Spur Nr. 1 betrifft emen Primer, GCC 77f GCC 492r (N-terminal) , Spur Nr. 2 betrifft einen Primer GCC 3004f-Unιp3 (C-terminal) , Spur Nr 3 betrifft einen Primer GCC1786f-GCC1999r (Intermediär) , Spur Nr 4 betrifft einen Primer GCC 77f (Kontrolle) , Spur Nr 5 be¬ trifft einen Primer GCC 492r (Kontrolle) , Spur Nr 6 betrifft einen Primer GCC 3004f (Kontrolle) , Spur Nr 7 betrifft einen Pπmei Unιp3 (Kontrolle) und Spur Nr 8 betrifft einen Primei GroßcnmarkeiFIG. 3 shows an electrophoresis gel for the detection of guanylyl cyclase C in the cell-producing cells (INS-I) by means of the PCR method. Lane No. 1 relates to a primer, GCC 77f GCC 492r (N-terminal), Lane No. 2 relates to a primer GCC 3004f-Unιp3 (C-terminal), Lane No. 3 relates to a primer GCC1786f-GCC1999r (intermediate), Lane No. 4 relates to a primer GCC 77f (control), lane No. 5 relates to a primer GCC 492r (control), lane No. 6 relates to a primer GCC 3004f (control), lane No. 7 relates to a primer Unιp3 (control) and lane No. 8 relates to a large Prime brand
Verschiedene Primersortiments ergaben die spezifischen Banden für GC-C. In analoger Weise wurden die cGMP-spezifischen Protemkmasen nachgewiesen Gleiche Amplifikationen smd in isolierten Inseln und an weiteren ß-Zellimen durchgeführt worden, die die m Figur 6 genannte Signaltransduktion belegen.Different ranges of primers gave the specific bands for GC-C. The cGMP-specific protein masks were detected in an analogous manner. The same amplifications smd were carried out in isolated islands and on further β-cell lines, which confirm the signal transduction referred to in FIG. 6.
Figur 4 betrifft die Stimulation der Insulinsekretion an (A) isolierten Pankreasmseln der Maus in vitro. Die deutlich verstärkte Abgabe von Insulin ms Kulturmedium, induziert durch GCAP, ist dargestellt Die Gabe des GCAP sowie der Glukosekontrolle ist jeweils mit Pfeilen gekennzeichnet Die Abszisse betrifft die Perifusionszeit in Minuten, die Ko Ordinate ergib*- die Insulmstimulation in gebräuchlichen Einheiten anFIG. 4 relates to the stimulation of insulin secretion on (A) isolated pancreatic arms of the mouse in vitro. The markedly increased delivery of insulin ms culture medium, induced by GCAP, is shown. The administration of the GCAP and the glucose control are each indicated by arrows. The abscissa relates to the diffusion time in minutes, the coordinate gives * - the insulin stimulation in customary units
Die Figur 5 betrifft die Stimulation der cGMP-Generation parallel zur Insulinsekretion an einer msulmproduzierenden Zellmie (INS-I) in vitro Die starke Zunahme des intra¬ zellularen cGMP unter dem Einfluß der GCAP I (99 115) Zugabe wird deutlich Die cGMP-Generation wird zeitgleich dei Insulinfleisetzung in das Medium beobachtet Die Figur 6 betrifft den Nachweis der b-Zellaktivierung im Cytosensor, der die Stoffwechselaktivierung durch Protein¬ freigabe mißt Zugabe von GCAP-I- (99-115) erzeugt eine Ansauerung des perizellularen Milieus, was die Aktivierung des Zellstoffwechsels in zwei b-Zellmien zeigt (INS-I- und RIN-Zellen) .FIG. 5 relates to the stimulation of the cGMP generation parallel to the insulin secretion in a msulm-producing cell myia (INS-I) in vitro. The strong increase in the intra-cellular cGMP under the influence of the GCAP I (99 115) addition becomes clear. The cGMP generation becomes clear at the same time the insulin delivery into the medium was observed FIG. 6 relates to the detection of b-cell activation in the cytosensor, which measures the metabolic activation by protein release. Addition of GCAP-I- (99-115) produces an acidification of the pericellular milieu, which shows the activation of the cell metabolism in two b-cell minias (INS-I and RIN cells).
Figur 7 betrifft eme schematische Darstellung des Signal- transduktionswegs der Interaktion der erfindungsgemaßen Peptide vom GCAP-Typ mit der b-Zelle.FIG. 7 relates to a schematic representation of the signal transduction path of the interaction of the GCAP-type peptides according to the invention with the b-cell.
Die Fiαur 8 zeigt Primer zur Gewinnung der cDNA von GCAP- II- (81-112) Die verwendeten Primer sind m 5'->3' Orientierung gezeigt Unterstrichene Bereiche enthalten Erkennungs¬ sequenzen für Restriktionsendonucleasen, die eine effiziente Klonierung der PCR-Produkte gewährleisten Diese Primer sind als Sequenzen Ni 28 bis 34 m der Sequenzliste genanntFigure 8 shows primers for obtaining the cDNA from GCAP-II- (81-112). The primers used are shown in 5 '-> 3' orientation. Underlined areas contain recognition sequences for restriction endonucleases which ensure efficient cloning of the PCR products These primers are named as sequences Ni 28 to 34 m in the sequence list
Die Figur 9 betrifft erhaltene cDNA aus Magen- und Colon- Extrakt des Menschen. cDNA-Sequenz des GCAP- II/Uroguanylm- Vorlaufers und die davon abgeleitete Aminosauresequenz. Die translatierten Bereiche sind in Großbuchstaben, die nicht- translatierten Bereiche m Kiembuchstaben dargestellt Das ATG-Startcodon, das TGA-Stopcodon sowie das AATAAA-Poly- adenylierungssignal smd unterstrichen. Die Positionen der verwendeten Primer sind mit Pfeilen gekennzeichnet Die erste Aminosäure des isolierten GCAP-II- (99-115) ist mit einem Dreieck, die erste Aminosäure des Uroguanylms mit einer Raute gekennzeichnet. Die Nuclemsauresequenz in Figur 9 entspricht der Sequenz ID No. 36, wohingegen die entsprecnend kodierte Amionsauresequenz des Polypeptids als Seq ID No . 35 abgelegt ist.FIG. 9 relates to cDNA obtained from human gastric and colon extract. cDNA sequence of the GCAP-II / Uroguanylm precursor and the amino acid sequence derived therefrom. The translated areas are shown in capital letters, the non-translated areas in g-letters. The ATG start codon, the TGA stop codon and the AATAAA polyadenylation signal smd are underlined. The positions of the primers used are marked with arrows. The first amino acid of the isolated GCAP-II- (99-115) is marked with a triangle, the first amino acid of the uroganylm with a diamond. The nucleic acid sequence in FIG. 9 corresponds to the sequence ID no. 36, whereas the correspondingly encoded amino acid sequence of the polypeptide as Seq ID No. 35 is filed.
Die Figur 10 betrifft die schematische Darstellung der Ele¬ mente des GCAP I - ( 99- 115) -Gens Dargestellt ist die Exon/Intron-Struktui des Gens sowie der 5 ' - flankierende Sequenzbereich. Hervorgehoben ist der AC-reiche Sequenz¬ bereich mit potentieller Z-DNA-Konformation.FIG. 10 relates to the schematic representation of the elements of the GCAP I - (99-115) gene. The exon / intron structure of the gene and the 5 ′ - flanking one are shown Sequence area. The AC-rich sequence region with potential Z-DNA conformation is highlighted.
Die Figur 11 betrifft die DNA-Sequenz des GCAP-I- (99-115) - Gens und ihre flankierenden Sequenzen mit regulatorischen Elementen. Die entsprechende Sequenz ist als Seq ID No 39 im Sequenzprotokoll abgelegt Kodierende Bereiche sind mit Großbuchstaben gekennzeichnet, Intronsequenzen sind kleinge¬ druckt Potentielle Bindungsstellen für Transkriptions¬ faktoren smd großgeschrieben und unterstrichen Die potentielle Bindung der Faktoren auf dem Sense bzw. Anti sensestrang ist durch Pfeile gekennzeichnet Stoff- und Staitcodon sind kursiv gedruckt Direkte und invertierte Sequenzwiederholungen (Direct und mverted repeats) sind mit romischen Ziffern durchnumeriert Die eingezeichneten Oligo nucleotide Gua-Pl, Gua-P2 und Gua-P3 wurden zur Amplifikation der Promotorfragmente für den Luciferase/Reportergen Assay benutztFIG. 11 relates to the DNA sequence of the GCAP-I (99-115) gene and its flanking sequences with regulatory elements. The corresponding sequence is stored as Seq ID No 39 in the sequence listing. Coding areas are capitalized, intron sequences are printed in small letters. Potential binding sites for transcription factors are capitalized and underlined. The potential binding of the factors on the sense or antisense strand is indicated by arrows The substance and stait codons are printed in italics. Direct and inverted repeats (direct and inverted repeats) are numbered with Roman numerals. The oligo nucleotides Gua-Pl, Gua-P2 and Gua-P3 shown in the illustration were used to amplify the promoter fragments for the luciferase / reporter gene assay
Die Figur 12 betrifft Promoter-Aktivitäten der GCAP-I (99- 115) Promoterfragmente Im linken Teil der Figur smd schematisch die Promotor/Reportergenkonstrukte mit den unterschiedlich langen Promotorsequenzen dargestellt Die im rechten Teil repräsentierten relativen Aktivitäten stellen jeweils em Vielfaches der defmitionsgemaß auf 1 normierten Basalaktivitat des promotorlosen Klons PGL-2-Basιc darFIG. 12 relates to promoter activities of the GCAP-I (99-115) promoter fragments. In the left part of the figure, the promoter / reporter gene constructs with the promoter sequences of different lengths are shown schematically. The relative activities represented in the right part each represent a multiple of the definition standardized to 1 Basal activity of the promoterless clone PGL-2-Basιc represents
Die erfindungsgemaßen Peptide zeichnen sich überraschender¬ weise dadurch aus, daß bei Einwirkung auf msulmpro- duzrerende Zellen diese mit erhöhter Insulmproduktlon reagieren. Dieser Effekt war bis dahin unbekannt. Lediglich für GCAP-II- (89-112) war m der internationalen Anmeldung PCT/EP 96/03429 darauf verwiesen worden, daß dieses Peptid zur Behandlung von Diabetes eingesetzt werden kann Daraus ergibt sich für den Fachmann jedoch nicht, daß dieses Peptid solbst als msulmotrop einzuordnen ist Mithin enthalt die vorliegende Ei findung auch im HmbLt ' au4 die IT'ΓΓ 96/03429 eme neue Information für den Fachmann. Als er¬ findungsgemaß beanspruchte Fragmente sind Fragmente des Guanylm zu verstehen, welche die msulmotrope Wirkung besitzen, insbesondere solche, die vorliegend im Sequenz¬ protokoll genannt sind.The peptides according to the invention are surprisingly characterized in that when they act on msulm-producing cells, they react with increased insulin products. This effect was previously unknown. Only for GCAP-II- (89-112) had it been referred in the international application PCT / EP 96/03429 that this peptide can be used for the treatment of diabetes. However, it does not result for the person skilled in the art that this peptide itself is used as The present invention also contains the IT'ΓΓ in the HmbLt 'au 4 96/03429 new information for the expert. Fragments claimed according to the invention are to be understood as fragments of guanylm which have the msulmotropic effect, in particular those which are mentioned here in the sequence listing.
Das 24 Aminosäuren enthaltende erfindungsgemaße Peptid GCAP- II- (89-112) weist die folgende Aminosauresequenz aufThe peptide GCAP-II- (89-112) according to the invention containing 24 amino acids has the following amino acid sequence
Phe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - - Ala - - Asn - - AspPhe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - - Ala - - Asn - - Asp
Asp Cys - Glu Leu - Cys - Val - Asn - Val Ala - CysAsp Cys - Glu Leu - Cys - Val - Asn - Val Ala - Cys
Thi - Gly Cys - - LeuThi - Gly Cys - - Leu
(Seq ID No. 1)(Seq ID No. 1)
Das 17 Aminosäuren enthaltende erfindungsgemaße Peptid, GCAP- T (91-115) , mit der AminosauresequenzThe peptide according to the invention containing 17 amino acids, GCAP-T (91-115), with the amino acid sequence
Glu - Asp - Pro - Gly - Thr - Cys - Glu - Ile - Cys - Ala - Tyr - Ala - Ala - Cys - Thr - Gly - Cys (Seq ID No . 2)Glu - Asp - Pro - Gly - Thr - Cys - Glu - Ile - Cys - Ala - Tyr - Ala - Ala - Cys - Thr - Gly - Cys (Seq ID No. 2)
wird erfindungsgemaß beansprucht.is claimed according to the invention.
Als Derivate der erfindungsgemaßen Peptide Seq. ID No 1 und 2 smd ihre Salze, natürlichen und pharmakologisch vertrag¬ lichen Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphorylierte und glycosylierte GCAP II- (89-112) oder GCAP- I- (99-115) Derivate und weitere Fragmente der Peptide zu nennen, insbesondere diejenigen gemäß Seq ID No. 3 - 25As derivatives of the peptides according to the invention Seq. ID No 1 and 2 include their salts, natural and pharmacologically contractual derivatives, in particular amidated, acetylated, phosphorylated and glycosylated GCAP II (89-112) or GCAP-I (99-115) derivatives and further fragments of the peptides name, especially those according to Seq ID No. 3 - 25
Durch Massenspektrometrie konnte em Molekulargewicht von 2.597,7 Dalton für GCAP-II- (89-112) und von 1.702 Dalton für GCAP-I- (99-115) festgestellt werden (Beispiele 1 und 2) . Die ermittelte Aminosauresequenz für GCAP-II - (89-112) entspricht der von der cDNA abgeleiteten Aminosauresequenz von Position 89 bis Position 112 (COOH Terminus) Die Anwendung des GCAP-II- (89-112) , der Peptide, die aus der cDNA-Sequenz als abspaltbare Teilfragmente vorwiegend über natürliche Endoproteasen erhalten werden (Fig. 1) sowie seiner Analoga als Pharmakon für die Behandlung von Stoff- Wechselerkrankungen, besonderε des Diabetes mellitus ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Durch funktionelle Analyse konnte eine entsprechende Verwendbarkeit festgestellt werden (Beispiel 5) .Mass spectrometry revealed a molecular weight of 2,597.7 daltons for GCAP-II- (89-112) and 1,702 daltons for GCAP-I- (99-115) (Examples 1 and 2). The amino acid sequence determined for GCAP-II - (89-112) corresponds to the amino acid sequence derived from the cDNA from position 89 to position 112 (COOH terminus) The use of GCAP-II- (89-112), the peptides which are obtained from the cDNA sequence as cleavable partial fragments predominantly via natural endoproteases (FIG. 1) and its analogues as a pharmaceutical for the treatment of metabolic disorders, particularly diabetes mellitus is also the subject of the present invention. A corresponding usability could be determined by functional analysis (Example 5).
Unter anderem ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Peptide und ihre funktionell verwandten Stoffe bereit¬ zustellen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie alε gut zugängliche Arzneimittel mit biologisch und therapeutischer Aktivität des natürlichen Analogons, insbesondere des im Blut oder Urin vorkommenden Stoffes verwandt werden können.Among other things, it is the object of the present invention to provide new peptides and their functionally related substances, which are characterized in that they are used as readily accessible pharmaceuticals with biological and therapeutic activity of the natural analogue, in particular of the substance occurring in the blood or urine can be.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind mittels verschiedener Verfahren herstellbar. Diese sind dadurch gekennzeichnet, daß sie über eine prokaryontische oder eme eukaryontiεche Expression hergestellt und chromatographisch gereinigt werden, durch Isolation aus menschlichem Blut über Chromato¬ graphie-Verfahren in an sich bekannter Weise oder durch übliche Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese aus geschützten Aminosäuren, die m der angegebenen Sequenz enthalten sind, koppelt, deblockiert und mit gängigen Chroma¬ tographie-Verfahren reinigt.The peptides according to the invention can be produced by various methods. These are characterized in that they are produced by prokaryotic or eme eukaryotic expression and purified chromatographically, by isolation from human blood using chromatographic methods in a manner known per se or by customary methods of solid-phase and liquid-phase synthesis from protected amino acids , which are contained in the specified sequence, couples, deblocks and cleans with common chromatography methods.
GCAP-II- (89-112) und GCAP-I- ( 99- 115 ) wurden chemisch synthetisiert (vgl. Beispiel 3) und als Arzneimittel zube¬ reitet. Auch die gentechnologische Herstellung über übliche Vektoren ist erarbeitet: auf gentechnologischem Wege wird das GCAP-II- (89-112) -Peptid sowohl (1) in pro- als auch (2) in eukaryontischen Organismen hergestellt . Hierfür stehen u.a. Expressionsvektoren zur sekretorischen Expression (z.B. pSP6 , pRit -Derivate , Pharmacia) , zur direkten cyto- plasmatischcn Expression (z.B. pKK-Derivate, Pharmacia) oder zur Expression als Fusionsprotein (pMC187J ( Pharmaciαj zur Verfügung. Für die eukaryontische Expression stehen ver¬ schiedene Organismen und Vektoren zur Verfügung, z.B. In¬ sektenzellen (Summers and Smith, Tex. Agric . Exp. Stn. (bull) 1555, 1987) , Hefen (Hitzeman et al . , Nature, 293, 717-722, 1981) , filamentöse Pilze (Yelton et al . , Proc .Natl .Acad.Sei . - USA, 81, 1470-1474, 1984) ) und Säugerzellen (Zettlmeissl et al . , Biotechnology, 5, 720-725, 1987) , von denen vorzugsweise Insektenzellen benutzt werden. Die exprimierten Peptide der GCAP-I- (99-115) und GCAP-II-(89-112) werden mit Methoden der Chromatographie gereinigt, vorzugsweise wie in Beispielen 1 und 2 angegeben.GCAP-II- (89-112) and GCAP-I- (99-115) were chemically synthesized (see Example 3) and prepared as a medicament. Genetic engineering production using conventional vectors has also been developed: The GCAP-II (89-112) peptide is produced by genetic engineering, both (1) in pro- and (2) in eukaryotic organisms. This includes expression vectors for secretory expression (eg pSP6, pRit derivatives, Pharmacia), for direct cytoplasmic expression (eg pKK derivatives, Pharmacia) or for expression as a fusion protein (pMC187 J ( Pharmaciαj Available. Various organisms and vectors are available for eukaryotic expression, for example insect cells (Summers and Smith, Tex. Agric. Exp. Stn. (Bull) 1555, 1987), yeasts (Hitzeman et al., Nature, 293, 717-722, 1981), filamentous fungi (Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Se. - USA, 81, 1470-1474, 1984)) and mammalian cells (Zettlmeissl et al., Biotechnology, 5, 720-725 , 1987), of which insect cells are preferably used. The expressed peptides of GCAP-I- (99-115) and GCAP-II- (89-112) are purified using methods of chromatography, preferably as indicated in Examples 1 and 2.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel enthaltend das erfindungs¬ gemäße msulmotrope Peptid enthält GCAP-1 - ( 99-115) oder GCAP-II- (89-112) oder ihre physiologisch verträglichen Salze. Die Form und Zusammensetzung des Arzneimittels, welches das GCAP-I- (99-115) oder GCAP-11 -(89-112) enthält, richtet sich nach der Art der Verabreichung. Das humane GCAP- I -(99-115) oder GCAP-II- (89-112) kann parenteral, intranasal, oral und mittels Inhalation verabreicht werden. Vorzugsweise wird GCAP- II- (89-112) zu einem Injektionspräparat, entweder alε Lösung oder als Lyophilisat zur Auflösung unmittelbar vor Gebrauch, konfektioniert. Die Arzneimittelzubereitung kann außerdem Hilfsstoffe enthalten, die abfülltechnisch bedingt sind, emen Beitrag zur Löslichkeit, Stabilität oder Sterilität des Arzneimittelε leisten oder den Wirkungsgrad der Aufnahme in den Körper erhöhen.The medicament according to the invention containing the msulmotropic peptide according to the invention contains GCAP-1 - (99-115) or GCAP-II- (89-112) or their physiologically tolerable salts. The form and composition of the medicinal product containing GCAP-I- (99-115) or GCAP-11 - (89-112) depends on the mode of administration. Human GCAP-I - (99-115) or GCAP-II- (89-112) can be administered parenterally, intranasally, orally and by inhalation. GCAP-II- (89-112) is preferably made up into an injection preparation, either as a solution or as a lyophilisate for dissolution immediately before use. The pharmaceutical preparation can also contain auxiliaries which are due to filling technology, which contribute to the solubility, stability or sterility of the pharmaceutical or which increase the efficiency of absorption into the body.
Die zu verabreichende Tagesdosis des insulmotropen Peptides, wie GCAP-I- (99-115) bzw. GCAP- 11- (89-112 ) hängt von der Indikation und der Anwendung bestimmter Derivate ab. Bei i.v./i.m. Injektion liegt sie im Bereich von 100 bis 1.200 Einheiten (μg)/Tag, bei täglicher subeutaner Injektion, vorzugsweise bei 300 - 2400 Einheiten (μg)/Tag.The daily dose of the insulmotropic peptide to be administered, such as GCAP-I- (99-115) or GCAP-11- (89-112), depends on the indication and the use of certain derivatives. At i.v./i.m. Injection is in the range of 100 to 1,200 units (μg) / day, with daily subcutaneous injection, preferably 300-2400 units (μg) / day.
Die Bestimmung αer biologischen Aktivität des msulmotropenThe determination of the biological activity of the msulmotropic
Peptids, wie GCAP- I- (99-115) oder GCAP 11 - ( 8i- 112 ) , basiert auf Messungen gegen Referenzpraparationen für humanes GCAP oder seine Analoga m einem gebräuchlichen biologischen Testverfahren für dieselben. Dazu wird vorzugsweise em standardisierter cGMP Generationstest mit T84-Zellen benutzt (Beispiel 4) .Peptides such as GCAP-I- (99-115) or GCAP 11- (8i- 112) measurements against reference preparations for human GCAP or its analogs in a common biological test procedure for the same. For this purpose, a standardized cGMP generation test with T84 cells is preferably used (example 4).
Die erfindungsgemaßen msulmotropen Peptide, wie GCAP-II- (89 112) und GCAP-I- (99-115) , zeichnen sich besonders dadurch aus, daß sie auch für eine Langzeit-Therapie des Diabetes mellitus geeignet smd Sie verfugen über eine ausgezeichnete biologische Wirksamkeit und losen andererseits auch bei Daueibehandlung keine Immunreaktion aus.The msulmotropic peptides according to the invention, such as GCAP-II- (89 112) and GCAP-I- (99-115), are particularly distinguished by the fact that they are also suitable for long-term therapy of diabetes mellitus. They have excellent biological properties Efficacy and, on the other hand, do not trigger an immune reaction even with Dauei treatment.
Die biologische Wirkung zeigt, daß das erfindungsgemaße Präparat weiterhin als Mittel auch zur Therapie bei Durch¬ fallerkrankungen, Nierenerkrankungen, Herzerkrankungen, Erkrankungen endokrmei Organe (wie oben betont, insbesondere dem Diabetes mellitus) , in der Intensivpflege und bei Lungen¬ erkrankungen anwendbar ist (Beispiel 4 und 5) .The biological effect shows that the preparation according to the invention can also be used as an agent for therapy for diarrheal diseases, kidney diseases, heart diseases, diseases of endocrine organs (as emphasized above, in particular diabetes mellitus), in intensive care and for lung diseases (example 4 and 5).
Das erfindungsgemaße msulmotrope Peptid ist weiter als Mittel zur Therapie und Diagnose bei StoffWechselerkrankungen des Magen-Darm-Trakteε (insbesondere Dünndarm und Bauch¬ speicheldrüse) , der Atemwege, des Herz-Kreislaufsystems und Urogenitalapparates, endokriner Organe sowie des Nerven Systems einzusetzen, da es zur Herstellung von human ver¬ traglichen Antikörpern verwandt werden kann, die geeignet sind, Änderungen der Stoffwechsellage dieser Organe festzu¬ stellen oder zu beeinflussen.The msulmotropic peptide according to the invention can also be used as a means of therapy and diagnosis for metabolic disorders of the gastrointestinal tract (in particular the small intestine and pancreas), the respiratory tract, the cardiovascular system and the urogenital system, endocrine organs and the nervous system, since it is used for Production of human-compatible antibodies can be used, which are suitable for detecting or influencing changes in the metabolic position of these organs.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen er¬ läutert : Beispiel 1The invention is explained below using examples: example 1
Direkter Nachweis der Aminosäure-Sequenz des zirkulierenden, biologisch aktiven GCAP-II- (89-112) nach Isolierung aus Hamofiltrat .Direct detection of the amino acid sequence of the circulating, biologically active GCAP-II- (89-112) after isolation from hamofiltrate.
Als Ausgangsmaterial wurde Hamofiltrat verwendet, das m großen Mengen bei der Behandlung nierenmsuffizienter Patienten anfällt und alle Plasmabeεtandteile biε zu einer Molekülgröße von ca. 20.000 Dalton enthält.Hamofiltrate was used as the starting material, which accumulates in large quantities in the treatment of patients with kidney deficiency and contains all plasma constituents up to a molecular size of approximately 20,000 daltons.
1.1 Gewinnung des Rohpeptidmaterials1.1 Obtaining the raw peptide material
Das Hamofiltrat wurde mittels einer Hamofiltrationsanlage der Firma Sartorius unter Verwendung von Cellulosetriacetat- Filtern mit einer Ausschlußgröße von 20.000 Dalton (Typ SM 40042, Sartorius, Göttingen, BRD) gewonnen. Das Filtrat stammte von niereninsuffizienten Patienten, die sich durch Langzeit-Hämoflltration in einer stabilen Stoffwechsellage befanden. 3.000 1 Hamofiltrat wurden gewonnen und unmittelbar nach der Gewinnung mittels Ansäuern und Abkühlung auf 4°C gegen proteolytischen Abbau geschützt. Anschließend wurde durch vier Kationenaustauscherextraktionen eine Rohpeptid- fraktion (570,5 g) gewonnen. Durch die folgende Ultrafil¬ tration mittels einer Ultrafiltrationsanlage der Firma Sartorius unter Verwendung eines Cellulosetriacetat-Filters mit einer Ausschlußgröße von 20.000 Dalton (Typ SM 3031454901E, Sartorius) wurde em von Plasmabestandteilen größer 20.000 Dalton weitestgehend befreites Filtrat ge¬ wonnen. 1.2 Isolierung einer Fraktion mit cGMP-generierender Wirkung auf T84-ZellenThe hamofiltrate was obtained by means of a Sartorius hamofiltration system using cellulose triacetate filters with an exclusion size of 20,000 daltons (type SM 40042, Sartorius, Göttingen, FRG). The filtrate came from patients with kidney insufficiency who were in a stable metabolic state due to long-term hemoflltration. 3,000 1 hamofiltrate were obtained and immediately protected against proteolytic degradation by acidification and cooling to 4 ° C. A crude peptide fraction (570.5 g) was then obtained by four cation exchange extractions. The following ultrafiltration using an ultrafiltration system from Sartorius using a cellulose triacetate filter with an exclusion size of 20,000 daltons (type SM 3031454901E, Sartorius) resulted in a filtrate largely freed from plasma components greater than 20,000 daltons. 1.2 Isolation of a fraction with cGMP-generating activity on T84 cells
1.2.1 Entsalzen und Fraktionierung des Rohpeptidmaterials über RP-C18-Festphase (Stufe 1)1.2.1 Desalting and fractionation of the raw peptide material via RP-C18 solid phase (stage 1)
Die Rohpeptidfraktion aus der Ultrafiltration wurde über eine mit RP-C18 Materral (Vydac, Hespeπa, CA, USA) gefüllte Kar¬ tusche, die mit 0,01 N Salzsaure equilibriert war, chromato¬ graphisch mittels HPLC aufgetrennt • The Rohpeptidfraktion from the ultrafiltration was mascara on a column packed with RP-C18 Materral (Vydac, Hespeπa, CA, USA) Kar¬ equilibrated with 0.01 N hydrochloric acid, chromato¬ graphically by means of HPLC separated •
Säule : Kartusche 47 x 300 mm Mater lal RP-C18, 300 Ä, 15 20 μm Eluent A Wasser mit 0,01 N HCI Eluent B 80 o Acetonitrii, 20 1 Wasse r (V : V) mit 0, 01 N HCIColumn: Cartridge 47 x 300 mm material RP-C18, 300 Ä, 15 20 μm eluent A water with 0.01 N HCI eluent B 80 o acetonitrii, 20 1 water (V: V) with 0.01 N HCI
Gradient 0 0 Eluent B 2 , 5 mmGradient 0 0 eluent B 2.5 mm
0 - 10 Eluent B 3 , 75 mm0 - 10 eluent B 3, 75 mm
10 - 60 Eluent B 3 0 mm10 - 60 eluent B 3 0 mm
60 - 95 % Eluent B 5 mm60 - 95% eluent B 5 mm
95 - 95 % Eluent B 5 mm95 - 95% eluent B 5 mm
95 - 0 % Eluent B 5 mm95 - 0% eluent B 5 mm
0 - 0 % Eluent B 15 mm0 - 0% eluent B 15 mm
Flußrate: 40 ml / mmFlow rate: 40 ml / mm
Fraktionen: 50 ml / 1,25 mm ab mm 12 . 5Fractions: 50 ml / 1.25 mm from mm 12. 5
Absorption. 280 nmAbsorption. 280 nm
Die cGMP generierende Wirkung der Fraktionen wurde an T84- Zellen (Currie, M. G. et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. , 89, 947 - 951, 1992, gezüchtet m Fischer-Medium (Gibco) ge¬ messen, indem die Zunahme von intrazellularem cGMP mittels eines Radioimmunoassays nach 60 mm festgestellt und mit Kontrollen verglichen wurde, bei denen zum Kulturmedium statt der HF-Peptide 0,9 % NaCl gegeben wurde Die im cGMP-Gene rations-Test meßbar bioaktiven Fraktionen aus 11 Laufen dieser Reinigungsstufe wurden im Pool VI zusammengefaßt Der betreffende Pool VI wurde für die weitere Isolierung ein¬ gesetzt .The cGMP-generating effect of the fractions was grown on T84 cells (Currie, MG et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 89, 947-951, 1992) in Fischer medium (Gibco) by measuring the Increase in intracellular cGMP was determined by means of a radioimmunoassay after 60 mm and was compared with controls in which 0.9% NaCl was added to the culture medium instead of the HF peptides. The bioactive fractions from 11 runs of this purification stage, which were measurable in the cGMP generation test, became summarized in pool VI The relevant pool VI was used for further isolation.
1.2.2 Praparative Large-Scale-RP-Chromatographie II von Pool VI {Stufe 2)1.2.2 Preparative Large-Scale RP Chromatography II of Pool VI (Level 2)
Eine weitere praparative Aufreinigung der GCAP-II- (89-112) - haltrgen Peptidfraktionen erfolgte über eine mit RP-C18- Mateπal (Vydac, Hesperia, CA, USA) gefüllte Kartusche mittels einer HPLC-Anlage (BioCAD, PerSeptive Biosystemε, Preiburg, BRD) , wobei die cGMP-geneπerende wirksame Peptrd fraktion wieder abgetrennt werden konnte Das Material des Pools VI wurde dabei nach Vakuumevaporation des enthaltenden Lösungsmittels in einem Lauf aufgetragenA further preparative purification of the GCAP-II- (89-112) -along peptide fractions was carried out using a cartridge filled with RP-C18 material (Vydac, Hesperia, CA, USA) using an HPLC system (BioCAD, PerSeptive Biosystem, Preiburg, FRG), the cGMP-generating effective peptrd fraction being able to be separated off again. The material of pool VI was applied in one run after vacuum evaporation of the solvent contained
Bedingungen:Conditions:
Säule : Kartusche 47 x 300 mmColumn: cartridge 47 x 300 mm
Material : RP- C18, 300 Ä, 15 - 20 μmMaterial: RP-C18, 300 Ä, 15 - 20 μm
Eluent A: Wasser mit 0, 01 N HCIEluent A: water with 0.01 N HCl
Eluent B: 80 % Acetonitrii, 20 o 0 Wasser
Figure imgf000017_0001
Eluent B: 80% acetonitrii, 20 o 0 water
Figure imgf000017_0001
Gradient : 0 0 % Eluent B 2, 5 mmGradient: 0 0% eluent B 2.5 mm
0 - 32 o.0 - 32 o.
D Eluent B 2,5 mmD eluent B 2.5 mm
32 - 48 O,32 - 48 O,
0 Eluent B 42, 5 mm0 Eluent B 42.5 mm
48 - 95 o Eluent B 2,5 mm48 - 95 o Eluent B 2.5 mm
95 - 95 o,95 - 95 o,
"0 Eluent B 5 mm"0 eluent B 5 mm
95 0 % Eluent B 5 mm95 0% eluent B 5 mm
0 0 o Eluent B 15 mm0 0 o Eluent B 15 mm
Flußrate: 40 ml / mm Fraktionen: 50 ml / 1,25 mm ab mm 11 , 25 Absorption: 280 nmFlow rate: 40 ml / mm fractions: 50 ml / 1.25 mm from mm 11, 25 absorption: 280 nm
Die Fraktionen 4 - 6 enthielten Bioaktivitat bezüglich des cGMP-Generationstests an T84-Zellen. Die Fraktion 5 wurde für die weitere Auftrennung verwendet . 1.2.3 Analytische Kationenaustauscher-Chromatographie der GCAP-II- (89-112) -haltigen Fraktion aus der präparativen RP-Cl8-Chromatographie II (Stufe 3)Fractions 4-6 contained bioactivity for the cGMP generation test on T84 cells. Fraction 5 was used for the further separation. 1.2.3 Analytical cation exchange chromatography of the GCAP-II (89-112) -containing fraction from the preparative RP-Cl8 chromatography II (stage 3)
Die bioaktive GCAP-II- (89-112) -haltige immunreaktive Fraktion (50 ml) wurde über eme analytische Kationenaustauscher- Chromatographie weiter gereinigt. Die biologische Aktivität erscheint dabei im Bereich einer Retentionszeit von 8 und 9 % des Eluenten B Diese Fraktionen aus 17 identischen Laufen wurden gepoolt BedingungenThe bioactive GCAP-II- (89-112) -containing immunoreactive fraction (50 ml) was further purified by means of analytical cation exchange chromatography. The biological activity appears in the range of a retention time of 8 and 9% of the eluent B. These fractions from 17 identical runs were pooled under conditions
Säule Stahlmantel 10 x 50 mmColumn steel jacket 10 x 50 mm
Material Kationenaustauscher Parcosil, Pepkat , 300 Ä, b μmMaterial cation exchanger Parcosil, Pepkat, 300 Ä, b μm
(Biotek, Ostrmgen, Germany) Eluent A Wasεer mit 25 mM NA,HP04 , pH 3 , 0 Eluent B Wasser mit 1,5 M NaCl, 25 mM NA HPO, , pH 3 , 0(Biotek, Ostrmgen, Germany) Eluent A water with 25 mM NA, HP0 4 , pH 3.0, eluent B water with 1.5 M NaCl, 25 mM NA HPO,, pH 3.0
Gradient 0 0 % Eluent B 1 mmGradient 0 0% eluent B 1 mm
0 40 % Eluent B 60 mm0 40% eluent B 60 mm
40 100 % Eluent B 3 mm40 100% eluent B 3 mm
100 - 100 % Eluent B 5 mm100 - 100% eluent B 5 mm
100 0 % Eluent B 5 mm100 0% eluent B 5 mm
0 0 % Eluent B 5 mm0 0% eluent B 5 mm
Flußiate 3 ml / mmFlussiate 3 ml / mm
Fraktionen. 1,5 ml / , 5 mm ab mm 4Fractions. 1.5 ml / .5 mm from mm 4
Absorption 214 nmAbsorption 214 nm
1.2.4 Analytische HPLC-RP-C4-Chromatographie des GCAP-II- (89-112) -haltigen Pools aus der analytischen Kationenaus¬ tauscher-Chromatographie (Stufe 4)1.2.4 Analytical HPLC-RP-C4 chromatography of the GCAP-II- (89-112) -containing pool from analytical cation exchange chromatography (stage 4)
Die Aufarbeitung des Pools, der die cGMP-generierende, bioaktive Wirkung zeigte, wurde durch eme RP-C4 -Chromato¬ graphie m weitere Unterbestandteile aufgetrennt, wobei sich deutlich eine GCAP II- (89 112) -Aktivität nach einer Chromato¬ graphiezeit von 34 - 36 mm nach Programmstart feststellen ließ (2 Fraktionen) Bedingungen :The pool, which showed the cGMP-generating, bioactive effect, was worked up by means of RP-C4 chromatography to separate further sub-components, with GCAP II (89 112) activity being clearly evident after a chromatography time of 34 - determined 36 mm after the start of the program (2 fractions) Conditions:
Säule: Stahlmantel 4 x 250 mm Material: Parcosil Pro-RP-C4, 300 Ä, 5 μmColumn: steel jacket 4 x 250 mm Material: Parcosil Pro-RP-C4, 300 Ä, 5 μm
(Biotek, Öεtringen, Germany) Eluent A: Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure Eluent B: 80 % Acetonitrii, 20 % Wasser(Biotek, Öεtringen, Germany) Eluent A: water with 0.1% trifluoroacetic acid Eluent B: 80% acetonitrii, 20% water
(V .- V) mit 0,1 % Trifluoresεigsäure(V .- V) with 0.1% trifluoroacetic acid
Gradient: 0 - 0 % Eluent B 1 mmGradient: 0 - 0% eluent B 1 mm
0 - 25 % Eluent B 5 mm0 - 25% eluent B 5 mm
25 - 45 % Eluent B 60 mm25 - 45% eluent B 60 mm
45 - 100 % Eluent B 3 mm45 - 100% eluent B 3 mm
100 100 % Eluent B 5 mm100 100% eluent B 5 mm
100 - 0 % Eluent B 5 mm100 - 0% eluent B 5 mm
0 - 0 % Eluent B 10 mm0 - 0% eluent B 10 mm
Flußrate: 0 , 7 ml / mmFlow rate: 0.7 ml / mm
Fraktionen: 0,7 ml / l mm ab min 5 Absorption: 214 nmFractions: 0.7 ml / l mm from min 5 absorption: 214 nm
Diese je zwei hochaktiven Fraktionen von fünf gleichartigen Chromatographielaufen wurden wieder gepoolt und direkt weiter verarbeitet .These two highly active fractions from five identical chromatography runs were pooled again and processed directly.
1.2.5 Analytische RP-C18-Chromatographie des GCAP-II- (89-112) -bioaktiven Pools aus der analytischen HPLC-RP-C4- Chromatographie (Stufe 5)1.2.5 Analytical RP-C18 chromatography of the GCAP-II (89-112) bioactive pool from analytical HPLC-RP-C4 chromatography (stage 5)
Die gesamte Substanz der fünf Läufe aus Reinigungsstufe 4 wurde in Lösung gelassen, mit Eluent A verdünnt und auf einer Vydac RP-C18-Säule und HPLC-Anlage (Kontron, Hamburg, Germany) in drei gleichartigen Läufen chromatographiert. Bedingungen :The entire substance of the five runs from purification stage 4 was left in solution, diluted with eluent A and chromatographed on a Vydac RP-C18 column and HPLC system (Kontron, Hamburg, Germany) in three identical runs. Conditions:
Säule: Stahlmantel 4,6 x 250 mm Material: Vydac RP - C18, 300 Ä, 5 μm Säulentemperatur- 25°CColumn: steel jacket 4.6 x 250 mm Material: Vydac RP - C18, 300 Ä, 5 μm column temperature - 25 ° C
Eluent A: Wasser mit 0 , 01 N HCIEluent A: water with 0.01 N HCl
Eluent B: 80 % Acetonitrii, 20 o Wasser
Figure imgf000020_0001
Eluent B: 80% acetonitrii, 20 o water
Figure imgf000020_0001
Gradient : 0 0 o Eluent B 1 mmGradient: 0 0 o Eluent B 1 mm
0 - 25 σ Eluent B 5 mm0 - 25 σ eluent B 5 mm
25 50 o Eluent B 75 mm25 50 o Eluent B 75 mm
50 100 Eluent B 3 mm50 100 eluent B 3 mm
100 - 100 o Eluent B 2 mm100 - 100 o eluent B 2 mm
100 0 % Eluent B 3 mm100 0% eluent B 3 mm
0 0 Eluent B 10 mm0 0 Eluent B 10 mm
Flußrate : 0, 7 ml / mmFlow rate: 0.7 ml / mm
Fraktionen: 0, 35 ml / 0,5 mm ab mm 4Fractions: 0.35 ml / 0.5 mm from mm 4
Absorption: 214 nmAbsorption: 214 nm
Das T84-Zellen aktivierende Peptid war in einem Bereich nachzuweisen, der innerhalb von einer Minute eluierte. Das gesamte weitere Material der bioaktiven Fraktionen wurde schließlich mit der gleichen Säule rechromatographiert (s. Stufe 6)The peptide activating T84 was detected in an area that eluted within one minute. The entire further material of the bioactive fractions was finally rechromatographed using the same column (see step 6)
1.2.6 Analytische RP-Chromatographie III der GCAP-II- (89-112) -bioaktiven Fraktionen Pools aus der analytischen RP-Chromatographie II (Stufe 6, Endreinigung)1.2.6 Analytical RP-Chromatographie III of the GCAP-II- (89-112) -bioactive fractions pools from the analytical RP-Chromatographie II (stage 6, final cleaning)
Die gesamte Substanz der drei Läufe aus Reinigungsstufe 5 wurde m Losung gelassen, mit Eluent A verdünnt und dann auf einer Vydac RP-C18-Säule und HPLC-Anlage (Kontron, Hamburg, Germany) m zwei Laufen rechromatographiert . Das gesuchte cGMP-aktivierende Peptid (GCAP-II) war nun m einem Peak nachzuweisen, der m drei Teilfraktionen per Hand gesammelt wurde Jede Fraktion wurde im Bioassay getestet isiehe Beispiel 4) , ansequenziert und im Massenspektrometer mittels LC-MS-Kopplung analysiert.The entire substance of the three runs from purification stage 5 was left in solution, diluted with eluent A and then re-chromatographed on two runs on a Vydac RP-C18 column and HPLC system (Kontron, Hamburg, Germany). The sought-after cGMP-activating peptide (GCAP-II) could now be detected in a peak which was manually collected in three sub-fractions. Each fraction was tested in the bioassay Example 4), sequenced and analyzed in the mass spectrometer by means of LC-MS coupling.
Bedingungen :Conditions:
Säule: Stahlmantel 4,6 x 250 mm Material Vydac RP-C18, 300 Ä, 5 μm Saulentemperatur.- 20°CColumn: steel jacket 4.6 x 250 mm material Vydac RP-C18, 300 Ä, 5 μm column temperature. - 20 ° C
Eluent A- Wasser mit : 00,, 0011 N N H HCCIIEluent A- water with: 00 ,, 0011 N N H HCCII
Eluent B: 80 % Acetonitrii , 20 Wwasser
Figure imgf000021_0001
Eluent B: 80% acetonitrii, 20 W water
Figure imgf000021_0001
Giadient 0 0 o Eluent B 1 mmGiadient 0 0 or eluent B 1 mm
0 25 o Eluent B 5 mm0 25 o Eluent B 5 mm
25 - 42 o o Eluent B 68 mm25 - 42 o eluent B 68 mm
42 100 o, Eluent B 4 mm42 100 o, eluent B 4 mm
100 - 100 o o Eluent B 3 mm100 - 100 o eluent B 3 mm
100 0 o Eluent B 5 mm100 0 o eluent B 5 mm
0 0 o, o Eluent B 10 mm0 0 o, o eluent B 10 mm
Flußrate- 0,7 ml / mmFlow rate - 0.7 ml / mm
Fraktionen: 0,28 ml / 0,4 mm ab mm 4Fractions: 0.28 ml / 0.4 mm from mm 4
Absorption: 214 nmAbsorption: 214 nm
1.2.7 Sequenzanalytische Bestimmung der Primärstruktur des GCAP-II- (89-112)1.2.7 Sequence analytical determination of the primary structure of GCAP-II- (89-112)
Aus Fraktion 8 des 1. Laufes von Reinigungsstufe 5 wurden je 14 μl aus der Gesamtmenge von je 280 μl zur Aminosäuren- Sequenz-Analyse benutzt. Nach Isolierung aus Hamofiltrat wie oben beschrieben, wurden mit Hilfe des Gasphasensequenatorε Typ ABI 473 A (Applied Biosystems) sequenziert. Der EDMAN- Abbau (Edman P. und Begg G., Eur. J. Biochem. 1, 80-91, 1967) erfolgte mit dem Standardprogramm PTHRUN. Die Analyse der derivatisierten Aminosäuren wurde im on-lme-Verfahren über HPLC-Trennung unter Verwendung des Standardprotokolls ABI durchgeführt Für diese Fraktionen konnte eine Sequenz von 24 Aminosäuren bestimmt werden (Seq. ID No. 1) . Bei der gefundenen Sequenz handelt es sich um die NH2-terminal unbekannte Pepart, der C-Termmus entεpricht dem humanen Uroguanylms (Hamra, et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. , USA, 90, 10464 - 10468, 1993) . Dieses überraschend gefundene Peptid wurde als Guanylyl- Cyclase C aktivierendes Peptid II, GCAP-II- (89-112) bezeich¬ net Es besitzt strukturelle Homologien zu denen des humanen Guanylms und der hitzestabilen Enterotoxme aus Bakterien. Für diese Peptide ist die aktivierende Wirkung auf die Guanylatcyclase-C beschrieben.From fraction 8 of the first run of purification stage 5, 14 μl of the total amount of 280 μl each were used for the amino acid sequence analysis. After isolation from hamofiltrate as described above, the ABI 473 A type (Applied Biosystems) was used for sequencing. EDMAN degradation (Edman P. and Begg G., Eur. J. Biochem. 1, 80-91, 1967) was carried out using the standard program PTHRUN. The analysis of the derivatized amino acids was carried out in the on-lme method via HPLC separation using the standard protocol ABI A sequence of 24 amino acids could be determined for these fractions (Seq. ID No. 1). The sequence found is the NH 2 -terminally unknown Pepart, the C-termmus corresponds to human uroguanylms (Hamra, et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 90, 10464-10468, 1993) . This surprisingly found peptide was designated as guanylyl cyclase C activating peptide II, GCAP-II- (89-112). It has structural homologies to those of human guanylm and the heat-stable enterotoxes from bacteria. The activating effect on guanylate cyclase-C is described for these peptides.
Desweiteren wurde nun aus dem Endprodukt der Aufremigung nach Stufe 6 alle bioaktiven Unterfraktionen des per Hand gesammelten Peaks einer Microbore-HPLC-MS-Kopplung unter¬ worfen, um über dre Masse 2.597,7 Dalton die Identität des GCAP II (89-112) in diesen Unterfraktionen zu bestätigen. Nach dieser Bestimmung war abzuleiten, daß GCAP II (89-112) für die Bioaktivitat in den Unterfraktionen verantwortlich ist .Furthermore, all bioactive sub-fractions of the manually collected peak were subjected to a microbore-HPLC-MS coupling from the end product of the purification according to stage 6 in order to determine the identity of GCAP II (89-112) in over three masses of 2,597.7 daltons to confirm these sub-fractions. After this determination it had to be deduced that GCAP II (89-112) is responsible for the bioactivity in the sub-fractions.
Der äußerst geringe Kontaminierungsgrad des nativen GCAP-II- (89-112) konnte auch m den Unterfraktionen festgestellt werden, woraus hervorging, daß das Peptid m hochreiner Form vorlag und die biologische Wirkung nach dem derzeitigen Stand dei Kenntnis nicht auf eme Verunreinigung zu beziehen istThe extremely low degree of contamination of the native GCAP-II- (89-112) could also be found in the sub-fractions, from which it emerged that the peptide was present in a highly pure form and, based on the current state of knowledge, the biological effect cannot be related to any contamination
1.2.8 Nachweis des Molekulargewichtes des nativen GCAP-II- (89-112) durch Microbore-HPLC-Massenspektrometrie-Kopplung1.2.8 Detection of the molecular weight of the native GCAP-II- (89-112) by microbore-HPLC mass spectrometry coupling
Aus dem Endprodukt der Aufremigung nach Stufe 6 wurden weiter alle Unterfraktionen des per Hand gesammelten Peaks massenspektrometnsch unterεucht . Die Analysen wurden unter Verwendung deε Dual Syringe Solvent Delivery System ABI 140AFrom the final product of the purification according to stage 6, all sub-fractions of the peak collected by hand were examined by mass spectrometry. The analyzes were carried out using the Dual Syringe Solvent Delivery System ABI 140A
(Applied Biosystems, Weiterstadt, BRD) , einer RP-C18-Saule AQS 1,0 x 250 mm (YMC, Schernbeck, BRD) und einem mit einem zuticulateα Ion Spray inlet ausgestatteten AI > iτj Bic molecular Mass Analyser (Sciex, Perkm Eimer, Langen, BRD) durchgeführt. Die molekularen Massen wurden im Positiv-Ion- Mode gemessen. Mittels dieser Bestimmung wurde festgestellt, daß alle Unterfraktionen GCAP-II- (89-112) mit einem MG von 2 597,7 Dalton enthielten Bei diesen Messungen waren m allen Fraktionen nur geringe Signale anderer Molekularge¬ wichte lesbar Die Substanz des Molekulargewichts von GCAP- II- (89-112) war alε hochreines Material zu bezeichnen(Applied Biosystems, Weiterstadt, FRG), an RP-C18 column AQS 1.0 x 250 mm (YMC, Schernbeck, FRG) and an AI> iτj Bic equipped with a Zuticulateα Ion Spray inlet molecular mass analyzer (Sciex, Perkm Eimer, Langen, FRG). The molecular masses were measured in positive ion mode. By means of this determination it was found that all sub-fractions contained GCAP-II- (89-112) with a MW of 2 597.7 daltons. In these measurements, only small signals of other molecular weights were readable in all fractions. The substance of the molecular weight of GCAP- II- (89-112) was to be described as a highly pure material
Die Analyse der GCAP-II- (89-112) -Sequenz wird durch die cDNA bestätigt (Fig 7 und Beispiel 6) Der abgeleitete Precursor kann zum Herstellen der brologrsch erhaltlichen Fiagmente benutzt werden, um die weiteren biologisch aktiven Peptide der GCAP-II- (89-112) -Gruppe zu gewinnen (Seq ID No 2)The analysis of the GCAP-II (89-112) sequence is confirmed by the cDNA (FIG. 7 and Example 6). The derived precursor can be used to prepare the brologrsch available fiagments to the other biologically active peptides of the GCAP-II (89-112) group to win (Seq ID No 2)
Beispiel 2Example 2
Isolierung und Charakterisierung der nativen Molekulform von GCAP-I- (99-115) aus menschlichem UrinIsolation and characterization of the native molecular form of GCAP-I- (99-115) from human urine
Zur Extraktion der Peptide aus menschlichem Urin wurde als Ausgangsmaterial der Urin von gesunden Probanden verwendet - 11 1 Urin wurden direkt nach dem Sammeln mit 44 1 deioni - εiertem Waεser verdünnt und mit 32%-ιger HCI auf pH 2,7 eingestellt Nach Zugabe von 150 g Algmsaure wurde für 2 Stunden bei 4°C gerührt, 10 Minuten absedimentiert und für weitere 2 Stunden gerührt. Anschließend wurde die Algmsaure über 1 Std absedimentiert und der Überstand auf Peptid/- Protem-Gehalt hm überprüft Die Suspension wurde nach erneutem Aufruhren m em Prozellanfllter überfuhrt und über Filterpapier abgesaugt.To extract the peptides from human urine, the urine from healthy volunteers was used as the starting material - 11 l of urine were diluted with 44 l of deionized water immediately after collection and adjusted to pH 2.7 with 32% HCl after addition of 150 g Algmsaure was stirred for 2 hours at 4 ° C, sedimented for 10 minutes and stirred for a further 2 hours. The alginic acid was then sedimented over 1 hour and the supernatant checked for peptide / protein content hm. After stirring again, the suspension was transferred to a process filter and suction filtered through filter paper.
Der Algmsaurekuchen wurde trocken gesaugt und zweimal mit 5 mM HCI zum Entfernen des Resturins gewaschen Anschließend wurde die Algmsaure erneut aufgeschlemmt und viermal mit jeweils 600 ml Ethanol gewaschen um Lipide etc zu entfernen Zum Eluieren der Peptide wurde die Alginsäure mit 150 ml 0 , 2 M HCI aufgeschlemmt und trockengesaugt . Dieser Vorgang wurde viermal wiederholt, die Filtrate gesammelt und sofort mit 0,2 M Natriumacetat auf pH 4 , 0 eingestellt.The alginic acid cake was sucked dry and washed twice with 5 mM HCl to remove the residual urine. The alginic acid was then resuspended and washed four times with 600 ml of ethanol in order to remove lipids etc. To elute the peptides, the alginic acid was suspended with 150 ml of 0.2 M HCl and sucked dry. This process was repeated four times, the filtrates were collected and immediately adjusted to pH 4.0 with 0.2 M sodium acetate.
Das Eluat wurde anschließend durch Gefriertrocknung ge¬ trocknet und dle Rückstände in 210 ml VE-Wasser aufgenommen.The eluate was then dried by freeze-drying and the residues were taken up in 210 ml of demineralized water.
2.1. Entsalzung des Alginsäureeluates .2.1. Desalination of the alginic acid eluate.
Die gelösten Peptide wurden über eine mit RP-C18 Material gefüllte Säule entsalzt.The dissolved peptides were desalted on a column filled with RP-C18 material.
Säule : Glassäule 50 x 200 mm Material Amicon RP-C18, 30μm, 300 Ä Eluent A Wasser mit 0,06% TFA Eluent B 50 % Iso-Propanol 30 % Methanol 20 % Eluent AColumn: Glass column 50 x 200 mm Material Amicon RP-C18, 30μm, 300 Ä Eluent A water with 0.06% TFA Eluent B 50% Iso-Propanol 30% Methanol 20% Eluent A
Gradient 0 - 0 % Eluent B 10 min 0 - 80 % Eluent B 30 mm 80 - 0 % Eluent B 20 min Flußrate: 9 ml/min Fraktionen: 1 Fraktion DurchbruchGradient 0-0% eluent B 10 min 0-80% eluent B 30 mm 80-0% eluent B 20 min Flow rate: 9 ml / min Fractions: 1 fraction breakthrough
Nach 10 Minuten 1 FraktionAfter 10 minutes 1 fraction
Das gesamte Eluat der präparativen RP-C18-Säule wurde ge¬ sammelt und anschließend einer Gefriertrocknung unterworfen.The entire eluate of the preparative RP-C18 column was collected and then subjected to freeze drying.
2.2 Kationenaustauscherchromatographie des entsalzten Algin¬ säureeluates2.2 Cation exchange chromatography of the desalted alginic acid eluate
Das gefriergetrocknete Präparat wurde in 22 ml 0,1 M Essig¬ säure, 10 % Acetonitrii gelöst und über Kationenaustauεcher m weitere Bestandteile aufgetrennt. Säule: Stahlmantel 10 x 50 mm Material Parcosil PepKat , 300 Ä, 5 μm Eluent A 0,1 M Essigsäure, 10 % Acetonitrii Eluent B 0,5 M Essigsaure, 10 % Acetonitrii Gradient 0 - 0 % Eluent B 5,0 mmThe freeze-dried preparation was dissolved in 22 ml of 0.1 M acetic acid, 10% acetonitrile and separated into further constituents via cation exchangers. Column: steel jacket 10 x 50 mm material Parcosil PepKat, 300 Ä, 5 μm eluent A 0.1 M acetic acid, 10% acetonitrii eluent B 0.5 M acetic acid, 10% acetonitrii gradient 0 - 0% eluent B 5.0 mm
0 - 80 % Eluent B 55,0 mm0 - 80% eluent B 55.0 mm
80 - 100 % Eluent B 10,0 mm80 - 100% eluent B 10.0 mm
100 - 100 % Eluent B 5,0 mm100 - 100% eluent B 5.0 mm
100 - 0 % Eluent B 5,0 mm100 - 0% eluent B 5.0 mm
Flußrate- 1,0 ml/mmFlow rate - 1.0 ml / mm
Fraktionen: 1,0 ml ab Start des Gradienten Durchbruch gesondert gesammelt Absorption 280 nmFractions: 1.0 ml collected separately from the start of the gradient breakthrough absorption 280 nm
2.3 Kationenaustauschchromatographie des Durchbruches der ersten Katlonenaustauschchromatographie2.3 Cation exchange chromatography of the breakthrough of the first catalytic exchange chromatography
Das gesamte Eluat des Durchbruches wurde erneut auf die Kationenaustauschersäule (siehe III.) aufgetragen.The entire eluate from the breakthrough was reapplied to the cation exchange column (see III.).
Säule: Stahlmantel 10 x 50 mm Material: Parcosil PepKat, 300 Ä, 5 μm Eluent A- 0,1 M Essigsaure, 10 % Acetonitrii Eluent B: 0,5 M Essigsäure, 10 % AcetonitriiColumn: steel jacket 10 x 50 mm Material: Parcosil PepKat, 300 Ä, 5 μm eluent A- 0.1 M acetic acid, 10% acetonitrii Eluent B: 0.5 M acetic acid, 10% acetonitrii
Gradient : 0 - 0 Eluent B 5,0 mmGradient: 0 - 0 eluent B 5.0 mm
0 - 80 Eluent B 55,0 mm0 - 80 eluent B 55.0 mm
80 - - 100 Eluent B 10,0 mm80 - - 100 eluent B 10.0 mm
100 - - 100 Eluent B 5,0 mm100 - - 100 eluent B 5.0 mm
100 0 Eluent B 5,0 mm Flußrate- 1,0 ml/mm100 0 eluent B 5.0 mm flow rate - 1.0 ml / mm
Fraktionen: 1,0 ml ab Start des Gradienten Absorption: 280 nmFractions: 1.0 ml from the start of the gradient Absorption: 280 nm
Die Fraktionen wurden anschließend gefriergetrocknet 2.4 Mikropraparative Trennung der Fraktionen der Stufe IIIThe fractions were then freeze-dried 2.4 Micropraparative separation of the stage III fractions
Die einzelnen Fraktionen der Stufe IV wurden sowohl einer direkten Kopplung der Flüssigchromatographie, als auch einer Abfraktionierung von einer Microbore-Säule unterworfen.The individual fractions of stage IV were subjected both to a direct coupling of the liquid chromatography and to a fractionation from a microbore column.
Säule : Stahlmantel 1 x 250 mm Material YMC ODS-AQ, 120 Ä, 3 μm Eluent A Wasser mit 0,06 \ Trifluoressigsäure Eluent B 80 - Acetonrtrrl mit 0,05 TFA Gradient 10 10 % Eluent B 5,0 mmColumn: steel jacket 1 x 250 mm material YMC ODS-AQ, 120 Ä, 3 μm eluent A water with 0.06 \ trifluoroacetic acid eluent B 80 - Acetonrtrrl with 0.05 TFA gradient 10 10% eluent B 5.0 mm
10 70 % Eluent B 60,0 mm10 70% eluent B 60.0 mm
70 100 % Eluent B 10, 0 mm70 100% eluent B 10.0 mm
100 100 % Eluent B 5,0 mm100 100% eluent B 5.0 mm
100 0 % Eluent B 5,0 mm100 0% eluent B 5.0 mm
Flußrate: 0,02 ml/min Fraktionen: manuell abgesammelt Absorption: 210 nmFlow rate: 0.02 ml / min Fractions: manually collected Absorption: 210 nm
Die manuell abgesammelten Fraktionen wurden direkt einer chemischen Sequenzierung mit Hilfe des Edman-Abbaues unter¬ worfen .The manually collected fractions were subjected directly to chemical sequencing using Edman degradation.
In einer Probe ergab sich überraschenderweise die folgende SequenzThe following sequence surprisingly resulted in one sample
Bestimmte SequenzCertain sequence
Glu - Asp - Pro - Gly - Thr - Xxx - Glu - Ile - Xxx -Glu - Asp - Pro - Gly - Thr - Xxx - Glu - Ile - Xxx -
Ala - Tyr - Ala - Ala - Xxx - Thr - Gly - GlyAla - Tyr - Ala - Ala - Xxx - Thr - Gly - Gly
Die Sequenz zeigt unter Berücksichtigung der Xxx als Cys 100 % Homologie mit humanem GCAP-I - ( 99-115) .Taking the Xxx as Cys into account, the sequence shows 100% homology with human GCAP-I - (99-115).
Die Masse konnte mit 1702 amu bestimmt werden und entspricht somit der Masse des humanen GCAP- I- ( 99-115 ) Beispiel 3The mass could be determined with 1702 amu and thus corresponds to the mass of the human GCAP-I- (99-115) Example 3
Chemische Synthese des humanen Guanylatcyclase-C-aktivieren- den Peptides II, GCAP-II- (89-112) .Chemical synthesis of the human guanylate cyclase-C activating peptide II, GCAP-II- (89-112).
3.1 Strategie der Synthese des humanen GCAP-II- (89-112)3.1 Strategy of Synthesis of Human GCAP-II- (89-112)
Für die Synthese des Peptids mit der Formel:For the synthesis of the peptide with the formula:
Phe - - Lys - - Thr - - Leu - - Arg - - Thr - - Ile - - Ala • - Asn ■ - AspPhe - - Lys - - Thr - - Leu - - Arg - - Thr - - Ile - - Ala • - Asn ■ - Asp
Asp - - Cys - - Glu - - Leu - ■ Cys - - Val - - Asn - - Val ■ - Ala - - CysAsp - - Cys - - Glu - - Leu - ■ Cys - - Val - - Asn - - Val ■ - Ala - - Cys
Thr - Gly - Cys LeuThr - Gly - Cys Leu
wurde die Durchflußmethode (Atherton E. und Sheppard R. C , Solid phase peptide synthesis, IRL Press, Oxford, 1989) angewendet. Die genannte Peptidsequenz wurde mit Hilfe einer automatischen Peptidsyntheεe -Apparatur (Model 9050, Bioεearch/PerSeptive) unter Verwendung von Fmoc-Aminosäuren synthetisiert . Folgende Fmoc-Aminosäuren wurden im Überεchuß (4 Äquivalente) eingesetzt (verwendet wurden jeweils die Derivate der L-Ammosäuren) :the flow method (Atherton E. and Sheppard R. C, Solid phase peptide synthesis, IRL Press, Oxford, 1989) was used. The peptide sequence mentioned was synthesized using an automatic peptide synthesis apparatus (Model 9050, Bioεearch / PerSeptive) using Fmoc amino acids. The following Fmoc amino acids were used in excess (4 equivalents) (the derivatives of the L-amino acids were used in each case):
Fmoc-Ala, Fmoc-Arg (Pbf) , Fmoc-Asn (Trt ) , Fmoc-Asp (OBu' ) , Fmoc-Cys (Acm) , Fmoc-Cyε (Trt) , Fmoc-Gln- (OPfp) , Fmoc-Gln (Trt) , Fmoc-Glu (OBu*1) , Fmoc-Gly, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Lys (Boc) , Fmoc-Phe, Fmoc-Thr (Bu1) , Fmoc-Val-OPfp, Fmoc-Val.Fmoc-Ala, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Asn (Trt), Fmoc-Asp (OBu '), Fmoc-Cys (Acm), Fmoc-Cyε (Trt), Fmoc-Gln- (OPfp), Fmoc- Gln (Trt), Fmoc-Glu (OBu * 1 ), Fmoc-Gly, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Phe, Fmoc-Thr (Bu 1 ), Fmoc-Val-OPfp , Fmoc-Val.
Die Synthese wurde durch m situ-Aktivierung unter Zugabe von 4,4 Äquivalenten TBTU [O- ( lH-Benzotriazol - 1 -yl ) - N, N, N' , N' -tetramethyluronium-tetrafluoroborat] , 4,4 Äqui¬ valenten 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 8,8 Äquivalenten Diisopropylethylamin in N, N-Dimethylformamid durchgeführt. Alε Träger-Harz für die Synthese wurde vorbelegtes Fmoc-L- Leu-PEG-PS-Harz (0,20 mmol/g Belegungεgrad, Biosearch/Per¬ Septive) eingesetzt. Zur regioselektrven Einführung der beiden Disulfldbrücken wurden die Cysteinreste m Position 15 und 23 als Λcotamidomethyl (Acm) -geschützte Cysteindeπvate eingesetzt wahrend die Cystemreste m den Positionen 12 und 20 alε Trityl-geschützte Derivate eingesetzt wurden Nach Abspaltung und Entblockierung des Peptides vom Trager bleiben die Acm-Gruppen erhalten, so daß die erste Disulfidbrucke durch Luftoxidation eingeführt werden kann. Anschließend wird die zweite Disulfidbrucke durch Oxidation mit Iod gebildet, so daß keine falsch verbruckten Guanylm- Isomere entstehen können .The synthesis was carried out by m situ activation with the addition of 4.4 equivalents of TBTU [O- (1H-benzotriazol-1-yl) - N, N, N ', N' -tetramethyluronium tetrafluoroborate], 4.4 equivalents 1-Hydroxybenzotriazole (HOBt) and 8.8 equivalents of diisopropylethylamine in N, N-dimethylformamide. Pre-occupied Fmoc-L-Leu-PEG-PS resin (0.20 mmol / g coverage, biosearch / per septive) was used as the carrier resin for the synthesis. For the regioselectrical introduction of the two disulfide bridges, the cysteine residues in positions 15 and 23 were used as otcotamidomethyl (Acm) -protected cysteine derivatives used while the system residues in positions 12 and 20 were used as trityl-protected derivatives. After the peptide had been split off and unblocked from the carrier, the Acm groups were retained, so that the first disulfide bridge could be introduced by air oxidation. The second disulfide bridge is then formed by oxidation with iodine, so that incorrectly bridged guanylm isomers cannot form.
3.2 Praktische Durchführung der Synthese des humanen GCAP-II- (89-112)3.2 Practical implementation of the synthesis of human GCAP-II- (89-112)
Die Synthese von Phe - Lys - Thr - Leu Arg Thr ■ - Ile - - Ala Asn Asp Asp Cys - Glu Leu Cys Val - Asn • - Val ■ - Ala Cys Thr Gly - Cys - LeuThe synthesis of Phe - Lys - Thr - Leu Arg Thr ■ - Ile - - Ala Asn Asp Asp Cys - Glu Leu Cys Val - Asn • - Val ■ - Ala Cys Thr Gly - Cys - Leu
wurde mit dem automatischen 9050 PepSynthesizer (Programm Version 1.3, Biosearch/PerSeptive) nach der continuous flow- Methode durchgeführt. Fmoc-Aminosäuren waren L-konflguriert und m 0,8 mmol-Portionen verwendet Alle zur Synthese notwendigen Reagenzien wurden von Biosearch/PerSeptive bezogen N, N-Dimethylformamid, 20% Piperidin m N,N-Dimethyl- formamid und 1-Hydroxybenzotrιazol Die L-Ammosaurederivate wurden in vierfachem Überschuß, bezogen auf das harzgebundene Fmoc L-Leucm, eingesetzt. Folgender Synthesecyclus wurde verwendet: Fmoc-Abspaltung mit 20 % Piperidin m DMF (10 mm) , waschen mit DMF (12 mm) , Acylierung (30 mm) und waschen mit DMF (8 mm) . Die fortschreitende Synthese wurde durch kontinuierliche UV-Detektion verfolgt Die Synthese wurde mit dei Abspaltung des N-termmalen Fmoc-Restes abge¬ schlossen. Das harzgebundene Peptid wurde dreimal mit je 50 ml Isopropanol und tert-Butylmethylether gewaschen und bis zur Gewichtskonεtanz getrocknetwas carried out with the automatic 9050 PepSynthesizer (program version 1.3, Biosearch / PerSeptive) according to the continuous flow method. Fmoc amino acids were L-confgured and m 0.8 mmol portions were used. All the reagents required for the synthesis were obtained from Biosearch / PerSeptive N, N-dimethylformamide, 20% piperidine m N, N-dimethylformamide and 1-hydroxybenzotrιazole Die L -Ammosaur derivatives were used in a fourfold excess, based on the resin-bound Fmoc L-Leucm. The following synthesis cycle was used: Fmoc cleavage with 20% piperidine with DMF (10 mm), washing with DMF (12 mm), acylation (30 mm) and washing with DMF (8 mm). The progressing synthesis was followed by continuous UV detection. The synthesis was concluded with the elimination of the N-terminal Fmoc residue. The resin-bound peptide was washed three times with 50 ml of isopropanol and tert-butyl methyl ether and dried to constant weight
Die Abspaltung vom Harz erfolgte mrt Trifluoressigsaure/ - Ethandithiol/Wasser im Verhältnis 94 3 > (10 ml, v/v/v) innerhalb von 90 Minuten. Die Lösung wird in vacuo eingeengt und das Produkt durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das erhaltene Rohpeptid wurde mehrere Male mit Diethylether gewaschen, getrocknet und anschließend in Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Aus 490 mg Peptid-Harz wurden 85 mg Rohpeptid erhalten.The resin was split off with trifluoroacetic acid / - ethanedithiol / water in a ratio of 94 3> (10 ml, v / v / v) within 90 minutes. The solution is concentrated in vacuo and the product is precipitated by adding diethyl ether. The crude peptide obtained was washed several times with diethyl ether, dried and then taken up in water and freeze-dried. 85 mg of crude peptide were obtained from 490 mg of peptide-resin.
Zur Einführung der ersten Diεulfidbrucke wurde daε Rohpeptid mit einer Konzentration von 1 mg/ml m 0,1 M wässrige Ammornumcarbonat-Lösung bei pH 8,3 gegeben. Bei Raum¬ temperatur wurde diese Mischung 48 Stunden an der Luft gerührt und anschließend lyophilisrert . Zur Einführung der zweiten Diεulfidbrucke wurde das erhaltene Produkt in 80% Methanol in Wasser aufgenommen und mit 5 Äquivalenten festem Iod versetzt. Diese tiefbraune Mischung wurde unter Strck- stoffatmosphäre 3 Stunden heftig gerührt. Das überschüssige Iod wird anschließend unter Zugabe von 0,1 M Natriumthio- sulfat-Lösung bis zur Entfärbung versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit einem Volumenteil Wasser verdünnt. Dann wurde das Peptid gereinigt.To introduce the first disulfide bridges, the crude peptide was added at a concentration of 1 mg / ml m 0.1 M aqueous ammonium carbonate solution at pH 8.3. This mixture was stirred in air for 48 hours at room temperature and then lyophilized. To introduce the second disulfide bridge, the product obtained was taken up in 80% methanol in water and 5 equivalents of solid iodine were added. This deep brown mixture was stirred vigorously for 3 hours under an atmosphere of plastic. The excess iodine is then added with the addition of 0.1 M sodium thiosulfate solution until it decolorises. The solution obtained is diluted with a volume of water. Then the peptide was purified.
Die Reinigung erfolgte unter Benutzung eines m unabhängiger Synthese hergestellten Standards von GCAP-II- (89-112) , dessen korrekte Sequenz durch MS (Massenspektrometrie) und Sequenz- analyse bestätigt war. Hierzu wurde eine Reversed-phase-HPLC (Vydac C18, 22 x 250 mm, 10 μm, 300 Ä, Flußrate 8 ml/mm, Detektion bei 230 nm, Elutionsmittel A= 0,06 % Trifluoressig¬ säure in Wasser, B= 0,055 % Trifluoressigsäure in Aceto- nitril/Wasser 4:1 (v/v) , Gradient: 0 - 100% B in 70 min) . Die Ausbeute betrug 3,6 mg.The purification was carried out using a standard of GCAP-II- (89-112) prepared in independent synthesis, the correct sequence of which was confirmed by MS (mass spectrometry) and sequence analysis. Reversed-phase HPLC (Vydac C18, 22 x 250 mm, 10 μm, 300 Å, flow rate 8 ml / mm, detection at 230 nm, eluent A = 0.06% trifluoroacetic acid in water, B = 0.055 % Trifluoroacetic acid in acetonitrile / water 4: 1 (v / v), gradient: 0 - 100% B in 70 min). The yield was 3.6 mg.
Das erhaltene Material coeluiert in einer analytischen RP- HPLC mit C18-Material mit dem unabhängig hergestellten Standard. Die Identität des synthetisierten Materials mit der vorgegebenen Primärstruktur von GCAP- 11 - (89- 112) wurde durch Massenspektrometrie (Sciex API III, Perkin-Elmer) und Sequenzrerung rn einem Gasphasensequenator (Modell 470, Perkm-Elmer) bestätigt. Die biologische Aktivität deε εynthetiεchen GCAP-II- (89-112) wurde im Funktionstest durch die cGMP-Generations-εtimulierende Wirkung an T84-Kolon- carcmom-Zellen nachgewiesen Dieser zeigte, daß das synthetische Material eine biologische Aktivität aufweistThe material obtained coelutes in an analytical RP-HPLC with C18 material with the independently produced standard. The identity of the synthesized material with the given primary structure of GCAP-11 - (89-112) was determined by mass spectrometry (Sciex API III, Perkin-Elmer) and sequencing in a gas phase sequencer (model 470, Perkm-Elmer) confirmed. The biological activity of the synthetic GCAP-II (89-112) was demonstrated in the functional test by the cGMP generation-stimulating effect on T84 colon carcinoma cells. This showed that the synthetic material has a biological activity
Beispiel 4Example 4
Allgemeine biologische Wirkung und Anwendung des GCAP II (89- 112)General biological effects and application of GCAP II (89-112)
Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde Hamofiltrat chromatogra phisch aufgearbeitet, wobei GCAP-II (89- 112) -enthaltende Traktionen m allen Reinigungstufen gefunden wurden Das gemäß Beispiel 2 synthetisierte GCAP-II (89 112) wurden für den folgenden Test als Substanz eingesetzt Auf gleiche Weise konnten aus dem Hamofiltrat m allen Reinigungsstufen Fraktionen nachgewiesen werden, die die biologische, cGMP- geneπerende Wirkung wie GCAP- II- (89-112 ) zeigteAs described in Example 1, hamofiltrate was worked up chromatographically, traces containing GCAP-II (89-112) being found in all purification stages. GCAP-II (89 112) synthesized according to Example 2 was used as substance for the following test In the same way, fractions could be detected from the hamofiltrate in all purification stages, which showed the biological, cGMP-generating effect as GCAP-II- (89-112)
Die Zellen wurden nach Ausεaat in 24 Well Platten nach ca. 2 - 3 Tagen verwendet Die Inkubation erfolgte mit 0,5 ml Zellmedium m Gegenwart von 1 mM IBMX (Sigma) bei 37°C Die GCAP-II (89-112) -Peptid enthaltenden Präparate wurden un mittelbar vor Versuchsbeginn im Zeilmedium aufgenommen. Im Versuchsansatz wurden 1,5 x IO5 Zellen mit 0,1 mM GCAP I (99-115) bzw. wahrend der Aufarbeitung mit Aliquotε GCAP-II- (89-112) -Peptid enthaltender Fraktionen für 60 mm mkubiert und die cGMP-generierende Wirkung gegenüber Kontrollen gemessen Zur Kontrolle wurden Zellen mrt Fiεcher-Medium (1 ) ohne jeglichen Zusatz, und (2.) mit verschiedenen Konzen¬ trationen an GCAP-II- (89-112) pro Well (0,5 ml) mkubiert. Die erhaltenen Werte der cGMP-Generation sind als Mittelwerte von Vierfachansatzen ± S.D. angegebenAfter sowing in 24-well plates, the cells were used after about 2-3 days. The incubation was carried out with 0.5 ml of cell medium in the presence of 1 mM IBMX (Sigma) at 37 ° C. The GCAP-II (89-112) peptide Preparations containing were taken up in the cell medium immediately before the start of the experiment. In the test batch, 1.5 × IO 5 cells were incubated for 60 mm with 0.1 mM GCAP I (99-115) or during the work-up with fractions containing aliquots of GCAP-II (89-112) peptide and the cGMP- Generating effect measured against controls As a control, cells were incubated with Fiεcher medium (1) without any addition, and (2.) with different concentrations of GCAP-II- (89-112) per well (0.5 ml). The cGMP generation values obtained are given as mean values of quadruple approaches ± SD
Der Zusatz von GCAP II (89-112) ebenso wie m gleichen Versuchen auch von GCAP-I (99 115) bzw von Fraktionen zum Medium wurde zu Beginn der Inkubation vorgenommen und wahrend der Versuchszeit blieben die Proben im Inkubator bei 37°C.The addition of GCAP II (89-112) as well as m same experiments also of GCAP-I (99 115) or fractions to Medium was added at the beginning of the incubation and the samples remained in the incubator at 37 ° C during the test period.
Die Ergebnisse zeigten, daß signifikante Unterschiede m der Wirksamkeit des GCAP-II- (89-112) im Vergleich zu den Kontrollen mit den untersuchten Zellsystem bestehen. Außerdem besteht eme dosisabhangige Wirkung. Dieses Ergebnis laßt auf die Wirkungsweise dieses Peptides schließen, namlich den Aktivierungsmechanismus des GCAP-II- (89 112) . Damit ist gezeigt, daß GCAP-II- (89-112 ) die cGMP Generation m T84- Zellen über einen bereits früher identifizierten Receptor für hitzestabile Enterotoxme beeinflussen mußThe results showed that there are significant differences in the effectiveness of the GCAP-II- (89-112) compared to the controls with the cell system examined. There is also a dose-dependent effect. This result suggests the mode of action of this peptide, namely the activation mechanism of GCAP-II- (89 112). This shows that GCAP-II (89-112) must influence the cGMP generation m T84 cells via a previously identified receptor for heat-stable enterotoxes
In ähnlicher Weise wurde festgestellt daß auch weitere Zellarten auf GCAP II- (89-112) ansprechen, u . ^ Belegzellen des Magens, Kryptenzellen deε Dünndarms, Schaltzellen der Pankreaεgange und Leber, die unter Verwendung des GCAP-II- (89-112) auch die mtracellulare Ca+* Konzentration andern.Similarly, it was found that other cell types respond to GCAP II- (89-112), u. ^ Gastric parietal cells, crypt cells of the small intestine, switching cells of the pancreatic ducts and liver, which also change the mtracellular Ca + * concentration using the GCAP-II- (89-112).
Beispiel 5Example 5
Biologische Bedeutung deε GCAP-II- (89-112) bzw. GCAP-I- (99- 115) für die Inselzellfunktion und Wirkung auf die Insulin¬ sekretionBiological significance of the GCAP-II- (89-112) or GCAP-I- (99-115) for the islet cell function and effect on insulin secretion
5.1 Molekularbiologische Untersuchungen5.1 Molecular biological studies
Der molekularbiologische Nachweis für die Proteine, die an der cGMP-Signaltransduktion beteiligt smd, wurde wie folgt durchgeführt. Hierzu wurde RNA auε isolierten Ratten Langerhans' Inseln sowie aus msulmproduzierenden Zellen INS- I, RINm5F und HIT mit Hilfe der Thiocyanate-Phenol-Chloro form-Methode extrahiert (Chromczynski P. and Sacchi , N., Analytical Biochemistry 162 156 - 159, 1987) Einzelstrang cDNA wurde durch reverse Transkription der Poly(A)' RNA hergestellt und basierend auf veröffentlichten cDNA-Sequenzen wurden PCR-Primcr konstrurert Fig 2 zeigt die GC-C-cDNA der Ratte (Schulz D.L., et al . Cell 63: 941 - 948, 1990) , wobei die 6 benutzten Primer eingezeichnet sind. Fig. 3 zeigt als Beispiel das Ergebnis der PCR zum Nachweis des GC-C Transkriptε aus INS-I-Zellen.The molecular biological detection for the proteins involved in the cGMP signal transduction was carried out as follows. For this, RNA was extracted from isolated rats from Langerhans' islands and from msm-producing cells INS-I, RINm5F and HIT using the thiocyanate-phenol-chloroform method (Chromczynski P. and Sacchi, N., Analytical Biochemistry 162 156-159, 1987 ) Single-strand cDNA was produced by reverse transcription of the poly (A) 'RNA and PCR primers were designed based on published cDNA sequences. FIG. 2 shows the GC-C cDNA the rat (Schulz DL, et al. Cell 63: 941-948, 1990), the 6 primers used being shown. 3 shows as an example the result of the PCR for the detection of the GC-C transcript from INS-I cells.
Die 3 Banden im Gel entsprechen den erwarteten Produktgrößen von 439, 889, 238 Basenpaaren. Die Sequenzierung der er¬ haltenen Produkte bestätigte die GC-C Spezifität der Amplifikation .The 3 bands in the gel correspond to the expected product sizes of 439, 889, 238 base pairs. The sequencing of the products obtained confirmed the GC-C specificity of the amplification.
In analoger Weise wurden die cGMP-spezifischen Protemkinasen nachgewiesen. Gleiche Amplifikationen sind in isolierten Inseln und an 3 weiteren insulinproduzierenden Zellmien nachzuweisen .The cGMP-specific protein kinases were detected in an analogous manner. The same amplifications can be found in isolated islets and on 3 other insulin-producing cells.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, daßIn summary, the results show that
1. die in den Untersuchungen benutzen insulinpro¬ duzierenden Zellmien (INS-I, RIN, HIT) sowie die iso¬ lierten Inseln der Ratte den spezifischen Guanylin- Rezeptor exprimieren,1. the insulin-producing cell lines (INS-I, RIN, HIT) used in the studies and the isolated islets of the rat express the specific guanylin receptor,
2. sie weiterhin die cGK II-Protemkinase und teilweise auch die cGK-lα- oder cGK-lß-Protemkmase enthalten. Somit ist hier durch den molekularbiologischen Nachweis der Kolokalisation des spezifischen Guanylm-Rezeptors mit der cGMP-abhängigen Proteinkinase die Voraussetzung für einen Signaltransdutionsweg in insulinpro¬ duzierenden Zellen aufgezeigt .2. they also contain the cGK II protein kinase and in some cases also the cGK-lα or cGK-lß proteinase. Thus, the molecular biological detection of the colocalization of the specific guanylm receptor with the cGMP-dependent protein kinase shows the prerequisite for a signal transduction pathway in insulin-producing cells.
5.2 Funktionelle Untersuchungen5.2 Functional examinations
5.2.1 Charakteristik der benutzten Zellinien5.2.1 Characteristics of the cell lines used
INS-I lεt eine langεam wachsende Zellinie, die aus einem Röntgenstrahlen-induzierten Insulmom der Ratte etabliert wurde. Die Verdopplungszeit der Kultur beträgt 100 h. Die Zellen zeigen die morphologischen Charakteπstika von ß- Zellen des Pankreas. Sie weisen einen Insulingehalt von etwa 20% nativer ß-Zellen auf. Glucose stimuliert die Insulin¬ sekretion der INS-I-Zellen Die Kultivierung der Zellen erfolgt in Medium RPMI1640 + Zusätze m einem Inkubator bei 5% CO , 37°C Die Zellmie ist em geeignetes Modell zur Untersuchung des Einflusses chemischer Subεtanzen auf die Insulinregulation in vitro.INS-I reads a slowly growing cell line which was established from an X-ray-induced insuloma of the rat. The culture doubles time to 100 hours. The Cells show the morphological characteristics of ß cells in the pancreas. They have an insulin content of about 20% of native ß cells. Glucose stimulates the insulin secretion of the INS-I cells. The cells are cultivated in medium RPMI1640 + additives in an incubator at 5% CO, 37 ° C. The cell chemistry is a suitable model for examining the influence of chemical substances on the insulin regulation in vitro .
RINm5F ist ebenfallε eine Zellmie auε einem Insulmom der Ratte Die Stimulierbarkeit der Zellen zur Inεulmsekrektlon durch Glucose betragt etwa 1/50 jener von INS-1-Zellen . Auch diese Zellmie, die vergleichbare Wachstums und Kulturbe- dmgungen aufweist, wie INS-I, kann zum Studium der re gulatorischen Mechanismen für die Sekretion des Insulins herangezogen werden.RINm5F is also a cell measurement from an insuloma of the rat. The stimulability of the cells for insulin secretion by glucose is about 1/50 that of INS-1 cells. This cell myia, which has comparable growth and culture restrictions, like INS-I, can also be used to study the regulatory mechanisms for the secretion of insulin.
Beide Zellmien wurden zur Charakterisierung des Einflusses von GCAP- II- (89-112 ) auf intrazellulare εecond messenger Systeme (cGMP) , Insulinsekretion sowie den zellularen Meta¬ bolismus eingesetzt. Hintergrund der Untersuchungen ist es, den modulierenden Einfluß des im Magen gebildeten Hormons GCAP-II (89-112) auf die Insulinsekretion im Pankreas zu beschreibenBoth cell lines were used to characterize the influence of GCAP-II- (89-112) on intracellular εecond messenger systems (cGMP), insulin secretion and the cellular metabolism. The background to the investigations is to describe the modulating influence of the hormone GCAP-II (89-112) formed in the stomach on the insulin secretion in the pancreas
5.2.2 Durchgeführte Experimente5.2.2 Experiments carried out
5.2.2.1 Einfluß von GCAPs auf die Insulinsekretion von isoliert-perifundierten Pankreasinseln der Maus5.2.2.1 Influence of GCAPs on the insulin secretion of isolated-perifused pancreatic islets of the mouse
Die isolier-perifundierte Pankreasmsel lεt em etabliertes Gewebemodell zur Erfassung der Wirkung chemischer Substanzen auf die Insulinsekretion und den daran beteiligten Second- Messenger-Systemen . Gegenstand der Untersuchung war die Darstellung dec Einflusses von CGAP-I]- (89 112) auf die Inr ul msekretronsleistung natrver ß-Zellen Mausen wird das Pankreas-Gewebe entnommen und nach Verdauung mit Collagenase werden ca. 50 einzelne Inseln auf eme Membran übertragen und mit einem physiologischen Puffer peπfunidert . Nach einer Aquilibπerungsphase wird das zu testende Peptid dem Puffer beigefugt und das Peπfusat wird fraktionell gesammelt. In dem Peπfusat wird dann das frei¬ gesetzte Insulin nach der bereits oben genannten Methode detektiert .The insulated-perifused pancreatic capsule reads an established tissue model for recording the effect of chemical substances on insulin secretion and the second messenger systems involved. Subject of the investigation was to demonstrate dec influence of CGAP-I] - (89 112) on the r In ul msekretronsleistung natrver beta cells The pancreatic tissue is removed from mice and, after digestion with collagenase, approximately 50 individual islands are transferred to a membrane and punctured with a physiological buffer. After an aquiliberation phase, the peptide to be tested is added to the buffer and the perfusionate is collected fractionally. The released insulin is then detected in the perfusate by the method already mentioned above.
Die Gabe von 10 M GCAP-II- (89-112) (Fig. 4) provoziert eme Insulinsekretion von ca. 6,5 ng/50 Inseln/mm gegenüber einer eindeutig geringeren Insulinsekretion bei einer Applikation von 30 mM Glucose von ca. 3 ng/50 Inseln/mm (BasalsekretionThe administration of 10 M GCAP-II- (89-112) (FIG. 4) provokes an insulin secretion of approx. 6.5 ng / 50 islets / mm compared to a clearly lower insulin secretion with an application of 30 mM glucose of approx. 3 ng / 50 islands / mm (basal secretion
0 - 1,5 ng/50 Inseln/mm) .0 - 1.5 ng / 50 islands / mm).
5.2.2.2 Einfluß von GCAPs auf die cGMP-Generation und In¬ sulinsekretion an INS-I-Zellen5.2.2.2 Influence of GCAPs on the cGMP Generation and Insulin Secretion on INS-I Cells
1 x 10' Zellen/Loch werden m eme 24-Loch-Flachboden-Zell kulturplatte m 1 ml Kulturmedium ausgesät und über Nacht mkubiert. Es erfolgt eine 15-mmütιge Vorstimulation mit 0,1 M IBMX, gefolgt von einer 5-mmütιgen Hauptstimulation mit GCAP-II- (89-112) in einer Konzentration von 10 M.1 x 10 'cells / hole are sown in a 24-hole flat-bottom cell culture plate in 1 ml culture medium and incubated overnight. There is a 15 mm pre-stimulation with 0.1 M IBMX, followed by a 5 mm main stimulation with GCAP-II- (89-112) in a concentration of 10 M.
Die Inkubation erfolgt bei 37°C und 5% CO Nach Stimulation wird der Zellkulturuberstand abpipettiert und bei -20°C für den Insulm-Radioimmunoassay (RIA) aufbewahrt, die Zellen mit eiskaltem 70% Ethanol gefroren und über Nacht bei -20°C gelagert . Am folgenden Tag wird der Alkohol abgedampft und die Zellen werden m Assay-Puffer für den cGMP-ELISA aufge nommen.Incubation takes place at 37 ° C and 5% CO. After stimulation, the cell culture supernatant is pipetted off and stored at -20 ° C for the insulm radioimmunoassay (RIA), the cells are frozen with ice-cold 70% ethanol and stored overnight at -20 ° C . The following day the alcohol is evaporated off and the cells are taken up in assay buffer for the cGMP ELISA.
Die Stimulation der INS-I-Zellen (Fig 5) mit GCAP-II- (89- 112) ergab einen Anstieg des intrazellularen cGMP auf 1016 pmol/ml bei 10 M (Negativkontrolle 362 pmol/ml) Die Gabe von 10"7 M GCAP-II- (89-112) stimuliert INS-I-Zellen (Fig. 5) zur Sekretion von Insulin m Hohe von 6,08 ng/ml (Negativkontrolle 1,15 ng/ml) .Stimulation of the INS-I cells (FIG. 5) with GCAP-II- (89-112) resulted in an increase in the intracellular cGMP to 1016 pmol / ml at 10 M (negative control 362 pmol / ml) The administration of 10 "7 M GCAP-II (89-112) stimulates INS-I cells (FIG. 5) to secrete insulin at a level of 6.08 ng / ml (negative control 1.15 ng / ml).
5.2.2.3 Erfassung des zellulären Metabolismus von RINm5F- und INS-I-Zellen unter der Gabe von GCAP-II- (89-112) mittels Mikrophysiometer5.2.2.3 Detection of the cellular metabolism of RINm5F and INS-I cells with the administration of GCAP-II- (89-112) using a microphysiometer
Mittels deε Mikrophysiometerε beεteht die Möglichkeit, die zellulare Antwort auf eine chemische Substanz, insbesondere Peptldfaktoren als Liganden für spezifische Membran¬ rezeptoren, über die Azidifizierung des Extrazellularraumes zu erfassen. Gemessen wird die Konzentration freigesetzter Protonen, die sich linear zum Abfall des extrazellularen pH- Wertes verhält, über einen lichtadressierbaren photo- metriεchen Siliciumsensor (LAPS) . Aus dem Verhältnis der Azidifizierung vor und während Gabe der chemischen Substanz laßt sich die Veränderung der metabolischen Rate erfassen.Using the microphysiometer, it is possible to record the cellular response to a chemical substance, in particular peptide factors as ligands for specific membrane receptors, via the acidification of the extracellular space. The concentration of released protons, which is linear with the drop in the extracellular pH value, is measured using a light-addressable photometric silicon sensor (LAPS). The change in the metabolic rate can be determined from the ratio of the acidification before and during administration of the chemical substance.
Dre Applikation von IO"6 M Guanylm provoziert eme Steige¬ rung der metabolischen Rate um ca. 10% bei RINmSF- und INS-I- Zellen (Fig. 6) .Three applications of IO "6 M guanylm provoked an increase in the metabolic rate by approximately 10% in RINmSF and INS-I cells (FIG. 6).
Aus den genannten Analysen läßt sich der Wirkungsmechanismus der GCAP-Peptide und Analoga über folgende Schema der Signal¬ transduktion erklären:The mechanism of action of the GCAP peptides and analogs can be explained from the above-mentioned analyzes using the following scheme of signal transduction:
1. GCAP-II- (89-112) bindet an der Membranoberfläche der ß-Zelle,1. GCAP-II- (89-112) binds to the membrane surface of the ß cell,
2. die Bindung findet spezifisch an den GC-C-Rezeptoren statt,2. the binding takes place specifically at the GC-C receptors,
3. an dieser partikulären Guanylyl-Cyclase wird auf der cytoplasmatischen Seite des Rezeptors die Domäne der Gunaylyl-Cyclaεe aktiviert,3. the domain of the Gunaylyl cycle is activated on this particulate guanylyl cyclase on the cytoplasmic side of the receptor,
4. es erfolgt eme intrazellulare cGMP-Erhöhung in der ß- Zelle, 5. die cGMP spezifischen Proteinkinasen (z. B. cGK-II) werden aktiviert,4. there is an intracellular cGMP increase in the β cell, 5. the cGMP-specific protein kinases (eg cGK-II) are activated,
6. die Protein-Phosphorylierung aktiviert den Mechanismus der Ca-abhängigen Freisetzung von Insulin über Exocy- tose (Fig . 7) .6. The protein phosphorylation activates the mechanism of the Ca-dependent release of insulin via exocytosis (FIG. 7).
Beispiel 6Example 6
Darstellung der cDNA für das Vorlauferprotem von humanem GCAP-II- (89-112)Illustration of the cDNA for the precursor protein of human GCAP-II- (89-112)
Aus acht humanen Geweben (Duodenum, Colon, Magen, Leber, Pankreas, Niere, Nebenniere und Harnblase) wurde mit Staπ- dardmethoden die Gesamt-RNA gewonnen. Mit Hilfe MMLV-Reverser Transkriptase und des Oligo (dT) -Primers UNIP-5 (siehe Figuren 8 und 9) , der teilweise komplementär zum Poly (A) -Schwanz eukaryontischer mRNA ist, erfolgte eine Umschrerbung in cDNA- Erststrang .The total RNA was obtained from eight human tissues (duodenum, colon, stomach, liver, pancreas, kidney, adrenal gland and bladder) using standard methods. With the help of MMLV reverse transcriptase and the oligo (dT) primer UNIP-5 (see FIGS. 8 and 9), which is partially complementary to the poly (A) tail of eukaryotic mRNA, a transcription was carried out in the first strand of cDNA.
Ausgehend von der GCAP II-Aminosauresequenz (FKTLRTIANDDCELCVNVACTGCL) wurde der degenerierte PCR-Primer HUGU-5 (siehe Figuren 8 und 9) konstruiert, der die Codons für das C-terminale Fragment CVNVAC beinhaltet. Mit Hilfe dreses Primers und des Primers UNIP-6 (siehe Figuren 8 und 9) , dessen Sequenz m UNIP-5 enthalten ist, wurden an¬ εchließend unter Verwendung der verschiedenen cDNAs Polyme- rase-Kettenreaktionen (PCRs) (Saiki, R.K. et al . , Science, 239, 487 - 491, 1988) durchgeführt. Nur im Falle der Colon- cDNA erhielten wir em 280 bp großes Amplifikationsprodukt . Dieses DNA-Fragment wurde kloniert und sequenziert. Die Analyse der Nucleotidsequenz ergab, daß in 3 '-Richtung hinter der Region, welche dem Primer HUGU-5 entspricht, ein Bereich folgt, der im korrekten Leseraster für die Aminosäuren codiert, die aus der Peptidsequenz zu erwarten ist. Dies bestätigte die Klonierung eines GCAP-II- (89-112) -spezifischen cDNA-Fragmentes . Auf das Codon für Leucm m Position 24 von GCAP- 11 folgt dann ein TGΛ-Translati onsstopccdon , wa< > u. Beweis dafür darstellt, daß das isolierte Peptid den C- Termmus eines Vorlauferprotems repräsentiert.Starting from the GCAP II amino acid sequence (FKTLRTIANDDCELCVNVACTGCL), the degenerate PCR primer HUGU-5 (see FIGS. 8 and 9) was constructed, which contains the codons for the C-terminal fragment CVNVAC. With the help of this primer and the primer UNIP-6 (see FIGS. 8 and 9), the sequence of which is contained in UNIP-5, polymerase chain reactions (PCRs) (Saiki, RK et al ., Science, 239, 487-491, 1988). We only received a 280 bp amplification product in the case of the colon cDNA. This DNA fragment was cloned and sequenced. Analysis of the nucleotide sequence showed that in the 3 'direction, behind the region which corresponds to the primer HUGU-5, there follows an area which codes in the correct reading frame for the amino acids which can be expected from the peptide sequence. This confirmed the cloning of a GCAP-II (89-112) specific cDNA fragment. The codon for Leucm m position 24 of GCAP-11 is then followed by a TGΛ-Translati onsstopccdon, wa <> u. Evidence shows that the isolated peptide represents the C-termmus of a precursor protein.
Um mögliche Syntheseorte des GCAP-II (89-112) -Vorlaufer¬ protems zu identifizieren, wurde eine Northern-Hybπ- disierung (Thomas, P., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 7_7, 5201 - 5205, 1980) mit Gesamt-RNA aus einer Reihe humaner GewebeIn order to identify possible synthesis sites of the GCAP-II (89-112) precursor protem, a Northern hybridization (Thomas, P., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 7_7, 5201 - 5205, 1980) was used Total RNA from a range of human tissues
(Tonsillen, Parotrs, Herzaurikel, Magen, Pankreas, Leber, Colon, Niere und Nebenniere) durchgeführt Als Hybridi- sierungsprobe wurde em inneres, mit den Primern HUGU-8 und HUGU-9 (siehe Figuren 8 und 9) erhaltenes PCR-Fragment verwendet, welches nicht mehr die Oligo (dT) -Sequenz des Primers HUGU-5 enthalt und dahei nicht zu einem un- εpezifiεchen Hintergrund durch Kreuzhybridiεierung mit den Poly (A) -Schwänzen eukaryontiεcher mRNAs fuhrt Von den untersuchten Geweben zeigte nur Colon em relativ starkes Signal, was für eine hohe Expressionsrate des GCAP- II-(Tonsils, parotrs, cardiac auricle, stomach, pancreas, liver, colon, kidney and adrenal gland) carried out. An inner PCR fragment obtained with the primers HUGU-8 and HUGU-9 (see FIGS. 8 and 9) was used as the hybridization sample , which no longer contains the oligo (dT) sequence of the primer HUGU-5 and therefore does not lead to an unspecific background by cross-hybridization with the poly (A) tails of eukaryotic mRNAs. Of the tissues examined, only colon showed a relatively strong signal what a high expression rate of the GCAP-II
(89-112) -Gens in diesem Gewebe spricht.(89-112) gene speaks in this tissue.
Die Kenntnis deε Syntheseortes erlaubte nun die Durchfuhrung einer sogenannten 5'-RACE-PCR (Frohmann, M.A., et al . , Proc Natl. Acad. Sei USA, 85, 8998 - 9002, 1988) zur Ampli¬ fikation deε 5' -termmalen Restes der GCAP-II- (89-112) cDNA Hierzu wurden die selbstkonstruierten Primer HUGU-7, HUGU-9 und HUGU-10, humane Colon-Gesamt-RNA und das 5'-RACE System von Gibco BRL (Eggenstein, Germany) verwendet Tatsachlrch wurde em 500 bp großes homogenes Fragment im letzten Am pll fikatlonsschπtt erhalten. Durch Klonierung und Sequenzierung konnte die Spezifität für GCAP-II- ( 89-112) bestätigt und zusammen mit der zuerst erhaltenen Sequenz eme komplette, 583 Basenpaare große cDNA-Sequenz des GCAP II- (89-112) -Vorlaufers zusammengesetzt werden (siehe Figur 9)Knowing the synthesis site now allowed a so-called 5'-RACE-PCR to be carried out (Frohmann, MA, et al., Proc Natl. Acad. Sei USA, 85, 8998-9002, 1988) for the amplification of the 5 'term Rest of the GCAP-II (89-112) cDNA For this purpose, the self-designed primers HUGU-7, HUGU-9 and HUGU-10, human colon total RNA and the 5'-RACE system from Gibco BRL (Eggenstein, Germany) In fact, a 500 bp homogeneous fragment was obtained in the last part of the fikatlonsschπtt. The specificity for GCAP-II (89-112) could be confirmed by cloning and sequencing and, together with the sequence obtained first, a complete 583 base pair cDNA sequence of the GCAP II (89-112) precursor was assembled (see FIG 9)
Das erste in der Sequenz erscheinende potentielle Translationεstartcodon ATG ist tatsachlich der Beqinn eines offenen Leserasters von 336 Basenpaaren, das für einen 112 Ammosciui-n großen GCAP- 11 (8L U M Voi l.uf.i codier t Die N- termmal ersten 21 Aminosäuren zeigen erwartungsgemäß die typischen Charakterist ika ( hohe Hydrophobi zitat ) e ines sekretorischen Signalpeptides (Von Heij ne , G . , Eur . J . Biochem . , 133 , 17 - 21 , 1983 ) . Der 3 ' -Terminus der cDNA- Sequenz codiert wie bereits erwähnt , für das isolierte Peptid GCAP- I I - ( 89 - 112 )The first potential translation start codon ATG appearing in the sequence is actually the beginning of an open reading frame of 336 base pairs, which codes for a 112 Ammosciui-n GCAP-11 (8 L UM Voi l.uf.i. As expected, the first 21 amino acids show the typical characteristics (high hydrophobicity) of a secretory signal peptide (Von Heij ne, G., Eur. J. Biochem., 133, 17-21, 1983). As already mentioned, the 3 'terminus of the cDNA sequence codes for the isolated peptide GCAP-II - (89 - 112)
Beispiel 7Example 7
Darstellung des GCAP-I-Gens und Nachweis regulatorischer ElementeRepresentation of the GCAP-I gene and detection of regulatory elements
Zur iunktionellen Charakterisierung des GCAP-I-Promotors und zum Nachweis regulatorischer Elemente wurde αer Luciferase- Reportergen-Assay verwendet (Wood, K V , Biolummescence & Chemilummeεcence : Current Status, ed. P. Stanley and L. Kricka, John Wiley and Sons, Chicester, 1991) . Zwei ver¬ schieden lange, potentielle Promotorfragmente wurden zunächst mittels PCR (Saiki, R.K. et al . Science 239, 487 491, 1988) unter Verwendung einer korrekturlesenden hitzestabilen Combi- Polymerase (InViTec, Berlin, Germany) aus einem Lysat des Phagen pHGU 35 (Hill, O., et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 2046 - 2050, 1995) amplifiziert Hierzu wurden drei Oligonucleotide mit eingebauten Schnittstellen synthetisiert (Gua-Pl, Gua-P2 und Gua-P3, Positionen siehe Figur 10) . Die gerichtete Klonierung (5' ->3 ' -Orientierung) der PCR-Fragmente m den Luciferase-Reportergen-Vektor pGL2-Basιc (Sigma- Aldπch, Deisenhofen, Germany) erfolgte über die Schnitt¬ stellen SstI und Hindlll Zur Verifizierung der beiden Plasmid-Konstrukte GLuc25 und GLuc30 wurden die Plasmide ansequenziert. Zur Konstruktion dreier weiterer Promotor/- Reportergen-Konεtrukte wurden die beiden Plasmide GLuc25 und GLuc30 mit den Restπktionsendonucleasen SstI bzw PstI (Life Technologies, Eggenstein, Germany) geschnitten und die linearen
Figure imgf000038_0001
nach elektrophoretischei Tiennung im Agarosegel religiert Plasmid-DNA der fünf Plasmid Konstrukte (GLuc25, GLuc30, 25ΔSstI, 25ΔPstI und 30ΔPstI) wurden über TIP 100-Säulen (Qiagen, Hilden, Germany) präpariert.For the functional characterization of the GCAP-I promoter and for the detection of regulatory elements, the luciferase reporter gene assay was used (Wood, KV, Biolummescence & Chemilummeεcence: Current Status, ed. P. Stanley and L. Kricka, John Wiley and Sons, Chicester , 1991). Two differently long, potential promoter fragments were first identified by PCR (Saiki, RK et al. Science 239, 487 491, 1988) using a proofreading heat-stable combi-polymerase (InViTec, Berlin, Germany) from a lysate of phage pHGU 35 ( Hill, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2046 - 2050, 1995) For this purpose, three oligonucleotides with built-in interfaces were synthesized (Gua-Pl, Gua-P2 and Gua-P3, positions see Figure 10). Directional cloning (5 '->3' orientation) of the PCR fragments in the luciferase reporter gene vector pGL2-Basιc (Sigma-Aldπch, Deisenhofen, Germany) was carried out via the interfaces SstI and Hindlll to verify the two plasmids -Constructs GLuc25 and GLuc30, the plasmids were sequenced. To construct three further promoter / reporter gene constructs, the two plasmids GLuc25 and GLuc30 were cut with the residual endonucleases SstI and PstI (Life Technologies, Eggenstein, Germany) and the linear ones
Figure imgf000038_0001
After electrophoresis in the agarose gel, plasmid DNA of the five plasmid constructs was religated (GLuc25, GLuc30, 25ΔSstI, 25ΔPstI and 30ΔPstI) were prepared using TIP 100 columns (Qiagen, Hilden, Germany).
Zur Beεtimmung der relativen Promotoraktivitäten der klonierten GCAP- I-Promotor-Fragmente wurden T84-Zellen unter Anwendung der Kalzium-Phospat-DNA-Copräzipitations-Methode (Sambrook, J., et al . 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York) mit den Promotor/Reportergen-Konstrukten für 7 Stunden tranεfiziert . Für die in Tripletanεätzen durchgeführten Transfektionen wurden je 5 μg Promotor/Reportgen-DNA zusammen mit je 2 μg pSVßGal -DNA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) als innerer Standard zur späteren Normierung der Luciferase- werte m die Zellen propagiert. Nach 40 Stunden Inkubation wurden die Zellen lysiert und die Luciferaseaktivität im Chemilumineszensmeßgerät (Berthold, Wildbach, Germany) gemessen. Die in Fig. 12 repräsentierten relativen Promotor- aktiviäten stellen die gemittelten Werte aus zwei unabhängigen Transformationsexperimenten dar. Alle Konstrukte zeigen signifikante relative Promotoraktivität. Aufgrund eines 3-fachen Abfalls der Aktivität des Klons GLuc25 könnten im Bereich zwischen -1309 und -532 Bindungsmotive für potentiell negative Transkriptionsfaktoren vorliegen. To determine the relative promoter activities of the cloned GCAP-I promoter fragments, T84 cells were used using the calcium phosphate DNA coprecipitation method (Sambrook, J., et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York) with the promoter / reporter gene constructs for 7 hours. For the transfections carried out in triplet approaches, 5 μg of promoter / report gene DNA together with 2 μg of pSVßGal DNA (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) were propagated as the internal standard for later normalization of the luciferase values in the cells. After 40 hours of incubation, the cells were lysed and the luciferase activity was measured in a chemiluminescence measuring device (Berthold, Wildbach, Germany). The relative promoter activities represented in FIG. 12 represent the mean values from two independent transformation experiments. All constructs show significant relative promoter activity. Due to a 3-fold drop in the activity of the clone GLuc25, binding motifs for potentially negative transcription factors could exist in the range between -1309 and -532.
SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LOG
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:(1. GENERAL INFORMATION:
(i) ANMELDER:(i) APPLICANT:
(A) NAME: Prof. Dr. Wolf-Georg Forssmann(A) NAME: Prof. Dr. Wolf-Georg Forssmann
(B) STRASSE: c/o IPF, Feodor-Lynen-Str. 31(B) STRASSE: c / o IPF, Feodor-Lynen-Str. 31
(C) ORT: Hannover(C) LOCATION: Hanover
(E) LAND: Germany(E) COUNTRY: Germany
(F) POSTLEITZAHL: 30625(F) POSTAL NUMBER: 30625
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Humanes, im Blut zirkulierendes Peptid mit insulinotroper Wirkung(ii) DESCRIPTION OF THE INVENTION: Human circulating peptide with insulinotropic activity
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 38(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 38
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:(iv) COMPUTER READABLE VERSION:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk(A) DISK: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)(D) SOFTWARE: Patentin Release # 1.0, Version # 1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren(A) LENGTH: 17 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN(ii) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:
Glu Asp Pro Gly Thr Cys Glu Ile Cys Ala Tyr Ala Ala Cys Thr Gly 1 5 10 15Glu Asp Pro Gly Thr Cys Glu Ile Cys Ala Tyr Ala Ala Cys Thr Gly 1 5 10 15
CysCys
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 108 Aminosäuren(A) LENGTH: 108 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:(ii) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:
Ala Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Val Ala Val Val Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15Ala Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Val Ala Val Val Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15
Leu Gin Ser Thr Gin Ser Val Tyr Ile Gin Tyr Gin Gly Phe Arg Val 20 25 30Leu Gin Ser Thr Gin Ser Val Tyr Ile Gin Tyr Gin Gly Phe Arg Val 20 25 30
Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala 35 40 45Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala 35 40 45
Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His 50 55 60Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His 50 55 60
His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu 65 70 75 80His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu 65 70 75 80
Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys 85 90 95Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys 85 90 95
Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 100 105Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 100 105
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 3:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 77 Aminosäuren(A) LENGTH: 77 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN(ii) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
Val Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin TrpVal Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp
1 5 10 151 5 10 15
Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys 20 25 30Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys 20 25 30
His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin 35 40 45His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin 35 40 45
Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp 50 55 60Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp 50 55 60
Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 65 70 75Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 65 70 75
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 4:
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 56 Aminosäuren(A) LENGTH: 56 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN(D) TOPOLOGY: not known (ii) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala LeuLeu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu
1 5 10 151 5 10 15
Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile 20 25 30Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile 20 25 30
Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val 35 40 45Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val 35 40 45
Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 50 55Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 50 55
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 19 Aminosäuren(A) LENGTH: 19 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN(ii) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:
Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr 1 5 10 15Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr 1 5 10 15
Gly Cys LeuGly Cys Leu
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 70 Aminosäuren(A) LENGTH: 70 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6.(ii) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6.
Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu GinLys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin
1 5 10 151 5 10 15
Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin 20 25 30Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin 20 25 30
Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys 35 40 45Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys 35 40 45
Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val 50 55 60Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val 50 55 60
Ala Cys Thr Gly Cys Leu 65 70Ala Cys Thr Gly Cys Leu 65 70
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO. 7-(2) INFORMATION ON SEQ ID NO. 7-
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE. 69 Aminosäuren(A) LONG. 69 amino acids
(B) ART Aminosäure(B) ART amino acid
(C) STRANGFORM Einzelstrang(C) STRANDFORM single strand
(D) TOPOLOGIE nicht bekannt(D) TOPOLOGY not known
(n) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (lll) HYPOTHETISCH- NEIN (iv) ANTISENSE NEIN(n) TYPE OF MOLECULE: Peptide (III) HYPOTHETIC NO (iv) ANTISENSE NO
(Xl) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO. 7(Xl) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO. 7
Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala 1 5 10 15Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala 1 5 10 15
Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp 20 25 30Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp 20 25 30
Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr 35 40 45Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr 35 40 45
Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala 50 55 60Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala 50 55 60
Cys Thr Gly Cys Leu 65Cys Thr Gly Cys Leu 65
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8-(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 8-
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 22 Aminosäuren(A) LENGTH: 22 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM- Einzelstrang(C) STRANDFORM single strand
(D) TOPOLOGIE nicht bekannt(D) TOPOLOGY not known
(il) ART DES MOLEKÜLS Peptid (in) HYPOTHETISCH NEIN (iv) ANTISENSE NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO: 8(il) TYPE OF MOLECULE Peptide (in) HYPOTHETIC NO (iv) ANTISENSE NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO: 8
Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val 1 5 10 15Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val 1 5 10 15
Ala Cys Thr Gly Cys Leu 20Ala Cys Thr Gly Cys Leu 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 9
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE. 67 Aminosäuren(A) LONG. 67 amino acids
(B) ART Aminosäure(B) ART amino acid
(C) STRANGFORM. Einzelstrang(C) STRAND FORM. Single strand
(D) TOPOLOGIE. nicht bekannt(D) TOPOLOGY. not known
(n) ART DES MOLEKÜLS Peptid Uli) HYPOTHETISCH NEIN (iv) ANTISENSE NEIN(n) TYPE OF MOLECULE Peptide Uli) HYPOTHETIC NO (iv) ANTISENSE NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG. SEQ ID NO: 9(xi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEQ ID NO: 9
Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser 1 5 10 15Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser 1 5 10 15
Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin 20 25 30Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin 20 25 30
Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg 35 40 45Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg 35 40 45
Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr 50 55 60Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr 50 55 60
Gly Cys LeuGly Cys Leu
6565
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 10(2) INFORMATION ON SEQ ID NO 10
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE. 38 Aminosäuren(A) LONG. 38 amino acids
(B) ART Aminosäure(B) ART amino acid
(C) STRANGFORM. Einzelstrang(C) STRAND FORM. Single strand
(D) TOPOLOGIE. nicht bekannt(D) TOPOLOGY. not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS- Peptid (in) HYPOTHETISCH. NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG. SEQ ID NO 10-(ii) TYPE OF MOLECULAR peptide (in) HYPOTHETICAL. NO (iv) ANTISENSE: NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION. SEQ ID NO 10-
Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys 1 5 10 15Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys 1 5 10 15
Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val 20 25 30Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val 20 25 30
Ala Cys Thr Gly Cys Leu 35Ala Cys Thr Gly Cys Leu 35
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 11(2) INFORMATION ON SEQ ID NO 11
(l) SEQUENZKENNZEICHEN.(l) SEQUENCE LABEL.
(A) LANGE 15 Aminosäuren(A) LONG 15 amino acids
(B) ART Aminosäure(B) ART amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE nicht bekannt(D) TOPOLOGY not known
(n) ART DES MOLEKÜLS Peptid (in) HYPOTHETISCH NEIN (iv) ANTISENSE NEIN(n) TYPE OF MOLECULE Peptide (in) HYPOTHETIC NO (iv) ANTISENSE NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG- SEQ ID NO: 11:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION- SEQ ID NO: 11:
Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 1 5 10 15Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 1 5 10 15
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 12(2) INFORMATION ON SEQ ID NO 12
(l) SEQUENZKENNZEICHEN:(l) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE: 14 Aminosäuren(A) LONG: 14 amino acids
(B) ART Aminosäure(B) ART amino acid
(C) STRANGFORM EinzelStrang(C) STRANDFORM single strand
(D) TOPOLOGIE- nicht bekannt(D) TOPOLOGY- not known
Ul) ART DES MOLEKÜLS- Peptid (in) HYPOTHETISCH: NEIN Uv) ANTISENSE. NEINUl) TYPE OF MOLECULE peptide (in) HYPOTHETICAL: NO Uv) ANTISENSE. NO
(Xl) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO- 12:(Xl) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO-12:
Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 1 5 10Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 13:
U) SEQUENZKENNZEICHEN:U) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 84 Aminosäuren(A) LENGTH: 84 amino acids
(B) ART. Aminosäure(B) ART. amino acid
(C) STRANGFORM Einzelstrang(C) STRANDFORM single strand
(D) TOPOLOGIE nicht bekannt(D) TOPOLOGY not known
Ui) ART DES MOLEKÜLS Peptid Un) HYPOTHETISCH NEIN Uv) ANTISENSE: NEINUi) TYPE OF MOLECULE Peptide Un) HYPOTHETIC NO Uv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13:
Ile Gin Tyr Gin Gly Phe Arg Val Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu 1 5 10 15Ile Gin Tyr Gin Gly Phe Arg Val Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu 1 5 10 15
Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin 20 25 30Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin 20 25 30
Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu 35 40 45Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu 35 40 45
Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu 50 55 60Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu 50 55 60
Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys 65 70 75 80Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys 65 70 75 80
Thr Gly Cys LeuThr Gly Cys Leu
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 81 Aminosäuren(A) LENGTH: 81 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN(ii) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14:
Gin Gly Phe Arg Val Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu 1 5 10 15Gin Gly Phe Arg Val Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu 1 5 10 15
Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu 20 25 30Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu 20 25 30
Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val 35 40 45Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val 35 40 45
Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile 50 55 60Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile 50 55 60
Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys 65 70 75 80Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys 65 70 75 80
Leu (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:Leu (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 15:
U) SEQUENZKENNZEICHEN:U) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 78 Aminosäuren(A) LENGTH: 78 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
Ui) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEINUi) TYPE OF MOLECULE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15:
Arg Val Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin 1 5 10 15Arg Val Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin 1 5 10 15
Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val 20 25 30Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val 20 25 30
Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser 35 40 45Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser 35 40 45
Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp 50 55 60Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp 50 55 60
Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 65 70 75Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 65 70 75
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 23 Aminosäuren(A) LENGTH: 23 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN Uv) ANTIΞENSE: NEIN(ii) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO Uv) ANTIΞENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 16:
Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn 1 5 10 15Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn 1 5 10 15
Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 20Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 20
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 43 Aminosäuren(A) LENGTH: 43 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN(D) TOPOLOGY: not known (ii) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 17:
Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala 1 5 10 15Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala 1 5 10 15
Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu 20 25 30Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu 20 25 30
Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 35 40Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 35 40
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 73 Aminosäuren(A) LENGTH: 73 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN(ii) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18:
Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro 1 5 10 15Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro 1 5 10 15
Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala 20 25 30Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala 20 25 30
Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser 35 40 45Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser 35 40 45
Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys 50 55 60Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys 50 55 60
Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 65 70Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 65 70
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 66 Aminosäuren(A) LENGTH: 66 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN Uv) ANTISENSE: NEIN (Xl) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO 19(ii) MOLECULE TYPE: peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO uv) ANTISENSE: NO (Xl) SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO 19
Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser LeuLeu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu
1 5 10 151 5 10 15
Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro 20 25 30Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro 20 25 30
Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr 35 40 45Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr 35 40 45
Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly 50 55 60Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly 50 55 60
Cys Leu 65Cys Leu 65
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 20(2) INFORMATION ON SEQ ID NO 20
U) SEQUENZKENNZEICHENU) SEQUENCE LABEL
(A) LANGE 64 Aminosäuren(A) LONG 64 amino acids
(B) ART Aminosäure(B) ART amino acid
(C) STRANGFORM Einzelstrang(C) STRANDFORM single strand
(D) TOPOLOGIE nicht bekannt(D) TOPOLOGY not known
(n) ART DES MOLEKÜLS Peptid Un) HYPOTHETISCH NEIN (iv) ANTISENSE NEIN(n) MOLECULE TYPE Peptide Un) HYPOTHETIC NO (iv) ANTISENSE NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG SEQ ID NO 20(xi) SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO 20
Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu ProAla Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro
1 5 10 151 5 10 15
Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val CysAla Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys
20 25 3020 25 30
Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile AlaAla Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala
35 40 4535 40 45
Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys LeuAsn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu
50 55 6050 55 60
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 21(2) INFORMATION ON SEQ ID NO 21
U) SEQUENZKENNZEICHENU) SEQUENCE LABEL
(A) LANGE 37 Aminosäuren(A) LONG 37 amino acids
(B) ART. Aminosäure(B) ART. amino acid
(C) STRANGFORM Einzelstrang(C) STRANDFORM single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
Ui) ART DES MOLEKÜLS Peptid Uli) HYPOTHETISCH NEIN Uv) ANTISENSE NEIN (Xl) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:Ui) TYPE OF MOLECULE Peptide Uli) HYPOTHETICAL NO Uv) ANTISENSE NO (Xl) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 21:
Leu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys ThrLeu Gin Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr
1 5 10 151 5 10 15
Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala 20 25 30Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala 20 25 30
Cys Thr Gly Cys Leu 35Cys Thr Gly Cys Leu 35
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren(A) LENGTH: 28 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid Uli) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN(ii) MOLECULE TYPE: Uli peptide) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 22:
Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys 1 5 10 15Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys 1 5 10 15
Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 20 25Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 20 25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren(A) LENGTH: 14 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN(ii) MOLECULE TYPE: Peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 23:
Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys LeuAsp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu
1 5 101 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 24:
U) SEQUENZKENNZEICHEN:U) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren(A) LENGTH: 13 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
Ul) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (in) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEINUl) TYPE OF MOLECULE: peptide (in) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24.(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 24.
Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 1 5 10Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO. 25:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO. 25:
U) SEQUENZKENNZEICHEN:U) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE: 11 Aminosäuren(A) LONG: 11 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM Einzelstrang(C) STRANDFORM single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
Ui) ART DES MOLEKÜLS: Peptid Uli) HYPOTHETISCH- NEIN Uv) ANTISENSE: NEINUi) TYPE OF MOLECULE: Peptide Uli) HYPOTHETICAL- NO Uv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 25:
Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 1 5 10Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 1 5 10
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:(2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 26:
U) SEQUENZKENNZEICHEN:U) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 3784 Basenpaare(A) LENGTH: 3784 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(il) ART DES MOLEKÜLS: cDNA Uli) HYPOTHETISCH: NEIN Uv) ANTISENSE: NEIN(il) TYPE OF MOLECULE: cDNA Uli) HYPOTHETICAL: NO Uv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 26:
GAGCGAGGTC ATGACGTCAC TCCTGGGCTT GGCTGTGCGG TTACTGCTCT TCCAACCCAC 60GAGCGAGGTC ATGACGTCAC TCCTGGGCTT GGCTGTGCGG TTACTGCTCT TCCAACCCAC 60
GCTGATGTTC TGGGCCTCCC AGGTGAGGCA GAAGTGCCAC AATGGCACCT ACGAGATCAG 120GCTGATGTTC TGGGCCTCCC AGGTGAGGCA GAAGTGCCAC AATGGCACCT ACGAGATCAG 120
TGTCCTGATG ATGGATAACT CAGCCTACAA AGAACCTTTG CAAAACTTGA GGGATGCTGT 180TGTCCTGATG ATGGATAACT CAGCCTACAA AGAACCTTTG CAAAACTTGA GGGATGCTGT 180
GGAGGAAGGA CTGGACATCG TGCGAAAGGC CCTGCGCGAA GCCGAACTAA ATGTGACTGT 240GGAGGAAGGA CTGGACATCG TGCGAAAGGC CCTGCGCGAA GCCGAACTAA ATGTGACTGT 240
GAACGCAACC TTCATCTACT CCGATGGTCT GATCCATAAG TCAGGTGACT GCCGGAGCAG 300GAACGCAACC TTCATCTACT CCGATGGTCT GATCCATAAG TCAGGTGACT GCCGGAGCAG 300
TACCTGTGAA GGCCTTGACC TCCTCAGGGA AATTACAAGA GATCGTAAGA TGGGCTGTGT 360TACCTGTGAA GGCCTTGACC TCCTCAGGGA AATTACAAGA GATCGTAAGA TGGGCTGTGT 360
CCTCATGGGG CCCTCGTGCA CGTATTCCAC CTTCCAGATG TACCTTGACA CAGAGTTGAA 420 CTATCCCATG ATTTCCGCTG GAAGTTTTGG ATTGTCCTGT GACTATAAGG AAACCCTAAC 480CCTCATGGGG CCCTCGTGCA CGTATTCCAC CTTCCAGATG TACCTTGACA CAGAGTTGAA 420 CTATCCCATG ATTTCCGCTG GAAGTTTTGG ATTGTCCTGT GACTATAAGG AAACCCTAAC 480
CAGGATCCTG CCTCCAGCCA GGAAGCTGAT GTACTTCTTG GTCGATTTCT GGAAAGTCAA 540CAGGATCCTG CCTCCAGCCA GGAAGCTGAT GTACTTCTTG GTCGATTTCT GGAAAGTCAA 540
CAATGCACCT TTCAAAACCT TTTCCTGGAA CTCTTCATAT GTTTACAAGA ACGGATCGGA 600CAATGCACCT TTCAAAACCT TTTCCTGGAA CTCTTCATAT GTTTACAAGA ACGGATCGGA 600
GCCTGAAGAT TGTTTCTGGT ACCTCAACGC TCTAGAGGCT GGGGTGTCCT ATTTTTCTGA 660GCCTGAAGAT TGTTTCTGGT ACCTCAACGC TCTAGAGGCT GGGGTGTCCT ATTTTTCTGA 660
GGTGCTCAGC TTCAAGGATG TATTGAGACG CAGTGAACAG TTCCAGGAAA TCCTAATGGG 720GGTGCTCAGC TTCAAGGATG TATTGAGACG CAGTGAACAG TTCCAGGAAA TCCTAATGGG 720
CCGTAACAGG AAGAGCAATG TGATTGTTAT GTGTGGCACG CCAGAAACCT TCTACAATGT 780CCGTAACAGG AAGAGCAATG TGATTGTTAT GTGTGGCACG CCAGAAACCT TCTACAATGT 780
GAAAGGTGAC CTCAAAGTGG CTGACGACAC TGTTGTCATC CTGGTAGATC TGTTCAGTAA 840GAAAGGTGAC CTCAAAGTGG CTGACGACAC TGTTGTCATC CTGGTAGATC TGTTCAGTAA 840
CCATTACTTT GAGGATGACA CCAGAGCTCC TGAGTATATG GACAATGTCC TCGTCCTGAC 900CCATTACTTT GAGGATGACA CCAGAGCTCC TGAGTATATG GACAATGTCC TCGTCCTGAC 900
ACTGCCTCCT GAAAAGTTCA TCGCGAACGC CTCTGTCTCT GGGAGGTTTC CATCGGAAAG 960ACTGCCTCCT GAAAAGTTCA TCGCGAACGC CTCTGTCTCT GGGAGGTTTC CATCGGAAAG 960
AAGCGACTTT TCTCTCGCTT ACTTGGAGGG GACCTTGCTG TTTGGACACA TGCTGCAGAC 1020AAGCGACTTT TCTCTCGCTT ACTTGGAGGG GACCTTGCTG TTTGGACACA TGCTGCAGAC 1020
GTTTCTTGAA AATGGAGAAT CTGTCACCAC GCCCAAGTTC GCTCGTGCGT TCAGGAATCT 1080GTTTCTTGAA AATGGAGAAT CTGTCACCAC GCCCAAGTTC GCTCGTGCGT TCAGGAATCT 1080
CACTTTTCAA GGCTTAGAGG GGCCCGTGAC TCTGGATGAC AGTGGGGACA TTGACAACAT 1140CACTTTTCAA GGCTTAGAGG GGCCCGTGAC TCTGGATGAC AGTGGGGACA TTGACAACAT 1140
TATGTGTCTT CTGTATGTGT CTCTGGATAC CAGGAAATAC AAGGTTCTTA TGGCGTATGA 1200TATGTGTCTT CTGTATGTGT CTCTGGATAC CAGGAAATAC AAGGTTCTTA TGGCGTATGA 1200
CACCCATAAA AACCAAACGA TCCCTGTGGC TACGAGCCCC AACTTCATCT GGAAGAACCA 1260CACCCATAAA AACCAAACGA TCCCTGTGGC TACGAGCCCC AACTTCATCT GGAAGAACCA 1260
CAGACTCCCT AATGACGTTC CTGGGCTGGG CCCTCAAATC CTGATGATTG CCGTCTTCAC 1320CAGACTCCCT AATGACGTTC CTGGGCTGGG CCCTCAAATC CTGATGATTG CCGTCTTCAC 1320
GCTCACGGGG ATTGTGGTCG TTCTGCTGCT GATTGCCCTC CTTGTGCTCA GAAAATACAG 1380GCTCACGGGG ATTGTGGTCG TTCTGCTGCT GATTGCCCTC CTTGTGCTCA GAAAATACAG 1380
AAGAGATCAT GAACTTCGAC AGAAGAAATG GTCCCACATC CCTTCTGAAA ATATCTTTCC 1440AAGAGATCAT GAACTTCGAC AGAAGAAATG GTCCCACATC CCTTCTGAAA ATATCTTTCC 1440
TCTGGAGACC AACGAGACCA ACGAGACCAA CCATGTCAGC CTGAAGATTG ACGATGACAG 1500TCTGGAGACC AACGAGACCA ACGAGACCAA CCATGTCAGC CTGAAGATTG ACGATGACAG 1500
GAGGCGGGAT ACAATCCAGA GAGTGCGACA GTGCAAATAC GACAAGAAGA AAGTGATCCT 1560GAGGCGGGAT ACAATCCAGA GAGTGCGACA GTGCAAATAC GACAAGAAGA AAGTGATCCT 1560
GAAAGACCTC AAGCACTGTG ATGGTAACTT CAGTGAGAAG CAGAAGATAG AACTGAACAA 1620GAAAGACCTC AAGCACTGTG ATGGTAACTT CAGTGAGAAG CAGAAGATAG AACTGAACAA 1620
GCTACTGCAG TCAGACTACT ACAACCTGAC CAAGTTCTAC GGCACCGTGA AGCTAGACAC 1680GCTACTGCAG TCAGACTACT ACAACCTGAC CAAGTTCTAC GGCACCGTGA AGCTAGACAC 1680
CAGGATCTTT GGGGTGGTCG AGTACTGCGA GAGGGGGTCC CTCCGGGAAG TGTTAAATGA 1740CAGGATCTTT GGGGTGGTCG AGTACTGCGA GAGGGGGTCC CTCCGGGAAG TGTTAAATGA 1740
CACGATTTCC TACCCTGATG GCACGTTCAT GGATTGGGAG TTTAAGATCT CTGTCTTAAA 1800CACGATTTCC TACCCTGATG GCACGTTCAT GGATTGGGAG TTTAAGATCT CTGTCTTAAA 1800
TGACATTGCT AAGGGGATGT CCTATCTGCA CTCCAGTAAG ATTGAAGTCC ACGGGCGTCT 1860TGACATTGCT AAGGGGATGT CCTATCTGCA CTCCAGTAAG ATTGAAGTCC ACGGGCGTCT 1860
GAAGTCCACC AACTGCGTGG TGGACAGTCG CATGGTGGTG AAGATCACTG ATTTTGGGTG 1920GAAGTCCACC AACTGCGTGG TGGACAGTCG CATGGTGGTG AAGATCACTG ATTTTGGGTG 1920
CAATTCCATC CTGCCTCCAA AGAAAGACCT GTGGACTGCC CCCGAGCACC TGCGCCAAGC 1980CAATTCCATC CTGCCTCCAA AGAAAGACCT GTGGACTGCC CCCGAGCACC TGCGCCAAGC 1980
TACTATCTCT CAGAAAGGAG AGCTGTACAG CTTCAGCATC ATTGCCCAGG AGATCATCCT 2040TACTATCTCT CAGAAAGGAG AGCTGTACAG CTTCAGCATC ATTGCCCAGG AGATCATCCT 2040
CCGCAAGGAA ACTTTCTACA CGCTGAGCTG CCGGGATCAG AATGAGAAGA TTTTCAGAGT 2100CCGCAAGGAA ACTTTCTACA CGCTGAGCTG CCGGGATCAG AATGAGAAGA TTTTCAGAGT 2100
GGAAAATTCC TATGGGACGA AACCCTTCCG CCCAGATCTC TTCCTGGAAA CCGCAGATGA 2160GGAAAATTCC TATGGGACGA AACCCTTCCG CCCAGATCTC TTCCTGGAAA CCGCAGATGA 2160
GAAGGAGCTG GAGGTCTATC TATTGGTCAA AAGCTGTTGG GAGGAGGATC CAGAAAAGAG 2220GAAGGAGCTG GAGGTCTATC TATTGGTCAA AAGCTGTTGG GAGGAGGATC CAGAAAAGAG 2220
ACCAGATTTC AAGAAAATCG AGAGCACACT AGCCAAGATA TTTGGCCTTT TTCATGACCA 2280ACCAGATTTC AAGAAAATCG AGAGCACACT AGCCAAGATA TTTGGCCTTT TTCATGACCA 2280
AAAAAATGAA TCTTACATGG ACACCTTGAT CCGACGTCTA CAGCTGTATT CTCGGAACCT 2340AAAAAATGAA TCTTACATGG ACACCTTGAT CCGACGTCTA CAGCTGTATT CTCGGAACCT 2340
GGAGCACCTG GTGGAGGAAA GGACTCAGCT GTACAAGGCC GAGAGGGACA GGGCTGACCA 2400 CCTTAACTTT ATGCTGCTCC CACGGCTGGT GGTAAAGTCC CTGAAGGAGA AAGGCATCGT 2460GGAGCACCTG GTGGAGGAAA GGACTCAGCT GTACAAGGCC GAGAGGGACA GGGCTGACCA 2400 CCTTAACTTT ATGCTGCTCC CACGGCTGGT GGTAAAGTCC CTGAAGGAGA AAGGCATCGT 2460
GGAGCCAGAG CTGTACGAAG AAGTCACAAT CTATTTCAGT GACATTGTCG GTTTCACGAC 2520GGAGCCAGAG CTGTACGAAG AAGTCACAAT CTATTTCAGT GACATTGTCG GTTTCACGAC 2520
CATCTGCAAG TACAGCACGC CCATGGAGGT GGTGGACATG CTGAATGACA TCTACAAGAG 2580CATCTGCAAG TACAGCACGC CCATGGAGGT GGTGGACATG CTGAATGACA TCTACAAGAG 2580
TTTTGACCAG ATTGTGGATC ACCACGACGT CTACAAGGTA GAAACCATCG GCGATGCCTA 2640TTTTGACCAG ATTGTGGATC ACCACGACGT CTACAAGGTA GAAACCATCG GCGATGCCTA 2640
CGTGGTGGCC AGCGGCCTGC CTATGAGAAA CGGCAACCGG CATGCAGTGG ACATTTCCAA 2700CGTGGTGGCC AGCGGCCTGC CTATGAGAAA CGGCAACCGG CATGCAGTGG ACATTTCCAA 2700
GATGGCCTTG GACATCCTCA GCTTCATGGG GACCTTTGAG CTGGAGCATC TCCCCGGCCT 2760GATGGCCTTG GACATCCTCA GCTTCATGGG GACCTTTGAG CTGGAGCATC TCCCCGGCCT 2760
CCCCGTGTGG ATTCGCATTG GGGTTCATTC TGGCCCCTGT GCTGCTGGTG TGGTGGGGAT 2820CCCCGTGTGG ATTCGCATTG GGGTTCATTC TGGCCCCTGT GCTGCTGGTG TGGTGGGGAT 2820
CAAGATGCCT CGTTATTGCC TGTTTGGAGA CACTGTCAAC ACTGCCTCCA GGATGGAGTC 2880CAAGATGCCT CGTTATTGCC TGTTTGGAGA CACTGTCAAC ACTGCCTCCA GGATGGAGTC 2880
CACCGGCCTT CCCTTAAGGA TTCACATGAG CAGCTCCACC ATTGCCATCC TGAGGAGAAC 2940CACCGGCCTT CCCTTAAGGA TTCACATGAG CAGCTCCACC ATTGCCATCC TGAGGAGAAC 2940
GGATTGCCAG TTCCTGTACG AAGTGAGGGG AGAAACGTAC TTAAAGGGAA GAGGGACCGA 3000GGATTGCCAG TTCCTGTACG AAGTGAGGGG AGAAACGTAC TTAAAGGGAA GAGGGACCGA 3000
GACCACATAC TGGCTGACTG GGATGAAGGA CCAAGAGTAC AACCTGCCAA CCCCACCAAC 3060GACCACATAC TGGCTGACTG GGATGAAGGA CCAAGAGTAC AACCTGCCAA CCCCACCAAC 3060
AGTGGAGAAC CAACAGCGTC TGCAAACTGA GTTCTCAGAC ATGATCGTTA GTGCCTTACA 3120AGTGGAGAAC CAACAGCGTC TGCAAACTGA GTTCTCAGAC ATGATCGTTA GTGCCTTACA 3120
GAAAAGACAG GCCTCGGGCG TGAAGAGCCG GAGGCCCACT CGGGTGGCCA GCTACAAGAA 3180GAAAAGACAG GCCTCGGGCG TGAAGAGCCG GAGGCCCACT CGGGTGGCCA GCTACAAGAA 3180
AGGCTTTTTG GAATACATGC AGCTGAACAA CTCAGACCAC GATAGCACCT ATTTTTAGAC 3240AGGCTTTTTG GAATACATGC AGCTGAACAA CTCAGACCAC GATAGCACCT ATTTTTAGAC 3240
CACGTGCGGT CTAAGAACTG ACAGTAGCAA CCTCTGATAT CCTGAATCTG CATTTTCCCA 3300CACGTGCGGT CTAAGAACTG ACAGTAGCAA CCTCTGATAT CCTGAATCTG CATTTTCCCA 3300
GAAACCTCAA CAACACAGAC AAGTGCTTAG CCCCAGTGCC CTGTCTGGAA TGTAGAACCA 3360GAAACCTCAA CAACACAGAC AAGTGCTTAG CCCCAGTGCC CTGTCTGGAA TGTAGAACCA 3360
GCCCCCAAGT CATGTGGGTG TTCTGGGTTG GGTTGGGTTG GGTTTGGTTG GTTGGTTTTG 3420GCCCCCAAGT CATGTGGGTG TTCTGGGTTG GGTTGGGTTG GGTTTGGTTG GTTGGTTTTG 3420
TTTCTATTGA GACAGAGTCT CATGTATCCC AAACTGGCCT CAAACTCGCT GAGGAGCTAT 3480TTTCTATTGA GACAGAGTCT CATGTATCCC AAACTGGCCT CAAACTCGCT GAGGAGCTAT 3480
GGATGACCTT GGACTTCTAA GACCATCCAT GTGTGTTCCT GGCTGTGTGA TGCCCTGTCC 3540GGATGACCTT GGACTTCTAA GACCATCCAT GTGTGTTCCT GGCTGTGTGA TGCCCTGTCC 3540
AGAGTCGTGT CCCACAGTTC TCCACGGAGC ATCAACGTCA GCCTGAAGGG AGGAAGGAGG 3600AGAGTCGTGT CCCACAGTTC TCCACGGAGC ATCAACGTCA GCCTGAAGGG AGGAAGGAGG 3600
AACGTACTAT ACAGAACTTG GGGTTTCATT CTAATTTCAT TTCTGCTTTT TTTCATTTTG 3660AACGTACTAT ACAGAACTTG GGGTTTCATT CTAATTTCAT TTCTGCTTTT TTTCATTTTG 3660
TTTACTGGAT CCTTCCTTAT GTACACATGA ATTTTTTTAA TTGTCTGGAT TAAGTAGCTT 3720TTTACTGGAT CCTTCCTTAT GTACACATGA ATTTTTTTAA TTGTCTGGAT TAAGTAGCTT 3720
ATCTCCAAGA AAGTGTGTTT AACTAGTGAT TTTTGCAGAA ACCATGCTGG ATATTAGGTA 3780ATCTCCAAGA AAGTGTGTTT AACTAGTGAT TTTTGCAGAA ACCATGCTGG ATATTAGGTA 3780
AAAA 3784 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:AAAA 3784 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare(A) LENGTH: 42 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"(ii) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "primer"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27: CCTCAGCTGC AGCTCGAGTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TT 42(iv) ANTISENSE: NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 27: CCTCAGCTGC AGCTCGAGTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TT 42
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
( i i ) ART DES MOLEKÜLS : Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG : /desc = " Primer "(i i) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "Primer"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: NEIN(iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28: CCTCAGCTGC AGCTCGAG (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 28: CCTCAGCTGC AGCTCGAG (2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"(ii) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "primer"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: NEIN(iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29: TCTGAGCTCT GGTAAGTGCT G 21(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 29: TCTGAGCTCT GGTAAGTGCT G 21
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 34 Basenpaare(A) LENGTH: 34 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"(ii) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "primer"
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30: CTGCAGCTCG AGTAGAATCT TTATTCAGGA GCTG 34(iv) ANTISENSE: NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 30: CTGCAGCTCG AGTAGAATCT TTATTCAGGA GCTG 34
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
Ui) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"Ui) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "Primer"
Uli) HYPOTHETISCH: NEINUli) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: NEIN(iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31: TCTGAGCTCA CCGGCTGCCT CTGAGATAGC 30(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 31: TCTGAGCTCA CCGGCTGCCT CTGAGATAGC 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare(A) LENGTH: 31 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"(ii) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "primer"
Uli) HYPOTHETISCH: NEINUli) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTISENSE: NEIN(iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32: CTGCAGCTCG AGGGTGGTGA TGACCATGGT G 31(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 32: CTGCAGCTCG AGGGTGGTGA TGACCATGGT G 31
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:(i) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare(A) LENGTH: 31 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
Ui) ART DES MOLEKÜLS: Sonstige Nucleinsäure (A) BESCHREIBUNG: /desc = "Primer"Ui) TYPE OF MOLECULE: Other nucleic acid (A) DESCRIPTION: / desc = "Primer"
Uii) HYPOTHETISCH: NEIN Uv) ANTISENSE: NEINUii) HYPOTHETICAL: NO Uv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33: CTGCAGCTCG AGCCAGGGAC CCATCTTGAG C 3l (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 33: CTGCAGCTCG AGCCAGGGAC CCATCTTGAG C 3l
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 34:
U) SEQUENZKENNZEICHEN:U) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 112 Aminosäuren(A) LENGTH: 112 amino acids
(B) ART: Aminosäure(B) TYPE: amino acid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(n) ART DES MOLEKÜLS. Peptid (in) HYPOTHETISCH NEIN (iv) ANTISENSE- NEIN(n) TYPE OF MOLECULE. Peptide (in) HYPOTHETIC NO (iv) ANTISENSE NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 34:
Met Gly Cys Arg Ala Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Val Ala Val Val 1 5 10 15Met Gly Cys Arg Ala Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Val Ala Val Val 1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gin Ser Thr Gin Ser Val Tyr Ile Gin Tyr Gin 20 25 30Leu Leu Leu Leu Leu Gin Ser Thr Gin Ser Val Tyr Ile Gin Tyr Gin 20 25 30
Gly Phe Arg Val Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu 35 40 45Gly Phe Arg Val Gin Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu 35 40 45
Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro 50 55 60Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gin Ala Gin Ser Leu Leu Pro 50 55 60
Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys 65 70 75 80Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gin Asp Leu Gin Pro Val Cys 65 70 75 80
Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala 85 90 95Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala 85 90 95
Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 100 105 110Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 100 105 110
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 35:
U) SEQUENZKENNZEICHEN:U) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 583 Basenpaare(A) LENGTH: 583 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ll) ART DES MOLEKÜLS: cDNA Uli) HYPOTHETISCH: NEIN Uv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:(ll) MOLECULE TYPE: cDNA Uli) HYPOTHETICAL: NO Uv) ANTISENSE: NO (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 35:
AGGGGGAACC CAGGGAGCGC GATGGGCTGC AGGGCTGCAT CAGGGCTCCT GCCAGGAGTG 60AGGGGGAACC CAGGGAGCGC GATGGGCTGC AGGGCTGCAT CAGGGCTCCT GCCAGGAGTG 60
GCCGTGGTCC TCCTGCTGCT GCTGCAGAGC ACACAGTCAG TCTACATCCA GTACCAAGGC 120GCCGTGGTCC TCCTGCTGCT GCTGCAGAGC ACACAGTCAG TCTACATCCA GTACCAAGGC 120
TTCCGGGTCC AGCTGGAATC CATGAAGAAG CTGAGTGACC TGGAGGCACA GTGGGCACCC 180TTCCGGGTCC AGCTGGAATC CATGAAGAAG CTGAGTGACC TGGAGGCACA GTGGGCACCC 180
AGCCCCCGCC TGCAGGCCCA GAGCCTCCTG CCCGCCGTGT GCCACCACCC TGCTCTGCCT 240AGCCCCCGCC TGCAGGCCCA GAGCCTCCTG CCCGCCGTGT GCCACCACCC TGCTCTGCCT 240
CAGGACCTTC AGCCTGTCTG CGCCTCGCAG GAGGCTTCCA GCATCTTCAA GACCCTGAGG 300CAGGACCTTC AGCCTGTCTG CGCCTCGCAG GAGGCTTCCA GCATCTTCAA GACCCTGAGG 300
ACCATCGCTA ACGACGACTG TGAGCTGTGT GTGAACGTTG CGTGTACCGG CTGCCTCTGA 360ACCATCGCTA ACGACGACTG TGAGCTGTGT GTGAACGTTG CGTGTACCGG CTGCCTCTGA 360
GATAGCCCTG GGTACCCTGA GCCCACCAGG GACACCTCGC CCTTCAGCCC ACCACCCTGG 420GATAGCCCTG GGTACCCTGA GCCCACCAGG GACACCTCGC CCTTCAGCCC ACCACCCTGG 420
CAGGCTTCCA TCCCCGTCCA TGCTCAAGAT GGGTCCCTGG CCACCATGGT CATCACCACC 480CAGGCTTCCA TCCCCGTCCA TGCTCAAGAT GGGTCCCTGG CCACCATGGT CATCACCACC 480
CTTCCAGGGC CTGAGCAGCT GGATCTGGTA CAAAGCAATC GGACATAGAG TTGGAGGGGG 540CTTCCAGGGC CTGAGCAGCT GGATCTGGTA CAAAGCAATC GGACATAGAG TTGGAGGGGG 540
AGGCCCCTGA GGCAGCCCAG CTCCTGAATA AAGATTCTAC AAC 583 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:AGGCCCCTGA GGCAGCCCAG CTCCTGAATA AAGATTCTAC AAC 583 (2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 36:
U) SEQUENZKENNZEICHEN:U) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 336 Basenpaare(A) LENGTH: 336 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iv) ANTISENSE: NEIN(ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 36:
ATGGGCTGCA GGGCTGCATC AGGGCTCCTG CCAGGAGTGG CCGTGGTCCT CCTGCTGCTG 60ATGGGCTGCA GGGCTGCATC AGGGCTCCTG CCAGGAGTGG CCGTGGTCCT CCTGCTGCTG 60
CTGCAGAGCA CACAGTCAGT CTACATCCAG TACCAAGGCT TCCGGGTCCA GCTGGAATCC 120CTGCAGAGCA CACAGTCAGT CTACATCCAG TACCAAGGCT TCCGGGTCCA GCTGGAATCC 120
ATGAAGAAGC TGAGTGACCT GGAGGCACAG TGGGCACCCA GCCCCCGCCT GCAGGCCCAG 180ATGAAGAAGC TGAGTGACCT GGAGGCACAG TGGGCACCCA GCCCCCGCCT GCAGGCCCAG 180
AGCCTCCTGC CCGCCGTGTG CCACCACCCT GCTCTGCCTC AGGACCTTCA GCCTGTCTGC 240AGCCTCCTGC CCGCCGTGTG CCACCACCCT GCTCTGCCTC AGGACCTTCA GCCTGTCTGC 240
GCCTCGCAGG AGGCTTCCAG CATCTTCAAG ACCCTGAGGA CCATCGCTAA CGACGACTGT 300GCCTCGCAGG AGGCTTCCAG CATCTTCAAG ACCCTGAGGA CCATCGCTAA CGACGACTGT 300
GAGCTGTGTG TGAACGTTGC GTGTACCGGC TGCCTC 336 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:GAGCTGTGTG TGAACGTTGC GTGTACCGGC TGCCTC 336 (2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 37:
U) SEQUENZKENNZEICHEN:U) SEQUENCE LABEL:
(A) LÄNGE: 72 Basenpaare(A) LENGTH: 72 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: Einzelstrang(C) STRAND FORM: Single strand
(D) TOPOLOGIE: linear(D) TOPOLOGY: linear
(il) ART DES MOLEKÜLS: cDNA Uli) HYPOTHETISCH: NEIN Uv) ANTISENSE: NEIN (Xl) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37: TTCAAGACCC TGAGGACCAT CGCTAACGAC GACTGTGAGC TGTGTGTGAA CGTTGCGTGT 60 ACCGGCTGCC TC 72(il) TYPE OF MOLECULE: cDNA Uli) HYPOTHETICAL: NO Uv) ANTISENSE: NO (Xl) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 37: TTCAAGACCC TGAGGACCAT CGCTAACGAC GACTGTGAGC TGTGTGTGAA CGTTGCGTGT 60 ACCGGCTGCC TC 72
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 38:
U) SEQUENZKENNZEICHEN:U) SEQUENCE LABEL:
(A) LANGE: 4595 Basenpaare(A) LONG: 4595 base pairs
(B) ART: Nucleotid(B) TYPE: nucleotide
(C) STRANGFORM: nicht bekannt(C) STRANDFORM: not known
(D) TOPOLOGIE: nicht bekannt(D) TOPOLOGY: not known
Ui) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA Uli) HYPOTHETISCH. NEIN (iv) ANTISENSE: NEINUi) TYPE OF MOLECULE: Genomic DNA Uli) HYPOTHETICAL. NO (iv) ANTISENSE: NO
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 38:
GTGTATACAC ACGTCAGGAC ACACACCTCA GTGTATACAC ACACGTCAGG GGACACACAC 60GTGTATACAC ACGTCAGGAC ACACACCTCA GTGTATACAC ACACGTCAGG GGACACACAC 60
CTCAGTGTAT ACACACACGT CAGGACTTAC ACACCTCAGG ACATACACGC ACCTCAGTGT 120CTCAGTGTAT ACACACACGT CAGGACTTAC ACACCTCAGG ACATACACGC ACCTCAGTGT 120
ATACACACAT GTCAGGACAC ACACACCTCA GCACACACAC GCACCTCAGT GTATACACAC 180ATACACACAT GTCAGGACAC ACACACCTCA GCACACACAC GCACCTCAGT GTATACACAC 180
ACATCAGCGC ACACATACCT CAGCACACAC ACGCTCCTCA GTGTATACAC ACACGTCAGC 240ACATCAGCGC ACACATACCT CAGCACACAC ACGCTCCTCA GTGTATACAC ACACGTCAGC 240
ACTCACACAC ACCTCAGTGT ATACACACAC ATCAGCACAC ACACAGCTCA GCACACACAC 300ACTCACACAC ACCTCAGTGT ATACACACAC ATCAGCACAC ACACAGCTCA GCACACACAC 300
ACACCTCAGC ACACACACAC ACACCTCAGT GTATACACAC ACGTCAGCAC ACACACACCT 360ACACCTCAGC ACACACACAC ACACCTCAGT GTATACACAC ACGTCAGCAC ACACACACCT 360
CAGCACACAT ACGCACCTCA GCACACATAC GCACCTCAGT GTATACACAC ACGTCAGCAC 420CAGCACACAT ACGCACCTCA GCACACATAC GCACCTCAGT GTATACACAC ACGTCAGCAC 420
TCACACACGT CAGCACACAC ACACCTCAGC GCACACATGC ACCTCAGTGT ATACACACAC 480TCACACACGT CAGCACACAC ACACCTCAGC GCACACATGC ACCTCAGTGT ATACACACAC 480
CTCGGCACAC ACACGCACAA CACAGCAGAT GCACTCAGCT CAGCATACAC ACACACACCT 540CTCGGCACAC ACACGCACAA CACAGCAGAT GCACTCAGCT CAGCATACAC ACACACACCT 540
CAGTGCACAT ACACACACAT ATCTCAGTGC ATATACACAC ATGAGCATAC ACACACCCCA 600CAGTGCACAT ACACACACAT ATCTCAGTGC ATATACACAC ATGAGCATAC ACACACCCCA 600
GCAGACACCC CAGCAGACAC ACATCCCAGC AAACACACAC ACCTCGGTGT ACACACACGC 660GCAGACACCC CAGCAGACAC ACATCCCAGC AAACACACAC ACCTCGGTGT ACACACACGC 660
GCCTGTGTAT ATACACACTG ACACACACAC CTCGATGTAT ATATGCACAC CTCCTTGCAC 720GCCTGTGTAT ATACACACTG ACACACACAC CTCGATGTAT ATATGCACAC CTCCTTGCAC 720
AGACACAGAT ACCTTGGTGT ACACGGACAC ACATATACCC CTCAGCATAC ACACACATAC 780AGACACAGAT ACCTTGGTGT ACACGGACAC ACATATACCC CTCAGCATAC ACACACATAC 780
ACCTCAGCAT ATATACACAT ACACTCCTCA GTGTACACAC ATGCCTCAGC ACACACACAC 840ACCTCAGCAT ATATACACAT ACACTCCTCA GTGTACACAC ATGCCTCAGC ACACACACAC 840
CTTCAGCACA AGCACACATA CAAACACACC TTGGCTACAC ACACCCATCA GGGTATATAC 900CTTCAGCACA AGCACACATA CAAACACACC TTGGCTACAC ACACCCATCA GGGTATATAC 900
AGACACCTTG GCATACACAG ACATACACAT CTCCGCAGAC ACACCCCCCC TTAACACACA 960AGACACCTTG GCATACACAG ACATACACAT CTCCGCAGAC ACACCCCCCC TTAACACACA 960
CACACACACA CACACACACA CTCACCAGAA AGGGGTGGGA AATCCAGTGC AGCTGTGAGG 1020CACACACACA CACACACACA CTCACCAGAA AGGGGTGGGA AATCCAGTGC AGCTGTGAGG 1020
ACTGCCCTGG GAGCTGGGCC AGGAGCTACC TGCCCCTCCC TGAGGGCCTT GTCCCTGCAG 1080ACTGCCCTGG GAGCTGGGCC AGGAGCTACC TGCCCCTCCC TGAGGGCCTT GTCCCTGCAG 1080
TTCCCTCCTG GTCAGGCCCT GCTCTCTCCA ATTCCCTCTT CAGTGTTGAC TCTCCCCACC 1140TTCCCTCCTG GTCAGGCCCT GCTCTCTCCA ATTCCCTCTT CAGTGTTGAC TCTCCCCACC 1140
CAGGAATTCC TGCCCAACCT CCCGCCCCAG GGCTGTCCTG GCATCGGGCC AGGTTGGCTG 1200CAGGAATTCC TGCCCAACCT CCCGCCCCAG GGCTGTCCTG GCATCGGGCC AGGTTGGCTG 1200
AGTAGAAAGA TGACAATCCC AGGGCTACCC TTTCTCCTGT GTCCTGGGGA TTCCTGCTCA 1260 CAACAGCACA CAGTGAATGC ACGCTGCCCT GAGGGCGCAG TCTGAATGGG GTCAGAGTCT 1320AGTAGAAAGA TGACAATCCC AGGGCTACCC TTTCTCCTGT GTCCTGGGGA TTCCTGCTCA 1260 CAACAGCACA CAGTGAATGC ACGCTGCCCT GAGGGCGCAG TCTGAATGGG GTCAGAGTCT 1320
ATAGGGGCGC GGGCACACCC AAGCAATTCC CCAGTGAGAT CCGCGGAAAG GGGACTGTAT 1380ATAGGGGCGC GGGCACACCC AAGCAATTCC CCAGTGAGAT CCGCGGAAAG GGGACTGTAT 1380
CTGCAGGGGC AAGGGGGGCG GGCGGATTGG GGAGGAGCTC ATTCGAGGAC ACCCTGAGGC 1440CTGCAGGGGC AAGGGGGGCG GGCGGATTGG GGAGGAGCTC ATTCGAGGAC ACCCTGAGGC 1440
TGCAGGGCAG GCAGGACAGG ATGGGGACCA GCACAGGATG GGGACAGCCT GTGACTCAGA 1500TGCAGGGCAG GCAGGACAGG ATGGGGACCA GCACAGGATG GGGACAGCCT GTGACTCAGA 1500
CAGGCAGGAG GTCACCAGAG GGGCCAGGGA GGACCAGGAG CTGCTGTGGC TGCTAAAAAT 1560CAGGCAGGAG GTCACCAGAG GGGCCAGGGA GGACCAGGAG CTGCTGTGGC TGCTAAAAAT 1560
AATATGGGAA TGGACCTCTG CTGAGCACCT TCTGTGTGCC AGGCATTGAG CTAAATGTTT 1620AATATGGGAA TGGACCTCTG CTGAGCACCT TCTGTGTGCC AGGCATTGAG CTAAATGTTT 1620
TTAAAACCTC ACTTGATTCT CCAAACAGTA ATGCCTACCA CACACCTACC CCATGAGGTA 1680TTAAAACCTC ACTTGATTCT CCAAACAGTA ATGCCTACCA CACACCTACC CCATGAGGTA 1680
GGTATTATTT TTGGTTCCCA CAGGGGACAC AAGGGACAAC GAGACTCAGA GAGGGGAAAG 1740GGTATTATTT TTGGTTCCCA CAGGGGACAC AAGGGACAAC GAGACTCAGA GAGGGGAAAG 1740
CATTGGCCCA AGTTCACACG CCTCACAACT GGGCAGTAGG TGGAACGGAA CCCAGGCTGT 1800CATTGGCCCA AGTTCACACG CCTCACAACT GGGCAGTAGG TGGAACGGAA CCCAGGCTGT 1800
GCGGAGGGCT TCCTTGAGGT CGCGGCAATC AAACCCAGAC CCTGACTTGC CCTGCAGCCT 1860GCGGAGGGCT TCCTTGAGGT CGCGGCAATC AAACCCAGAC CCTGACTTGC CCTGCAGCCT 1860
CCCCCGTGGA ATTTCTCACA TTTCCCTGAA TATTCCAGGC CCGTCTCACC TCCTGGCTGT 1920CCCCCGTGGA ATTTCTCACA TTTCCCTGAA TATTCCAGGC CCGTCTCACC TCCTGGCTGT 1920
CCCTTTGGCA TGAAATGGCC TTCTGTCCTC AGTCCCTTCT CTGGGAAAAC TTCCACCCAT 1980CCCTTTGGCA TGAAATGGCC TTCTGTCCTC AGTCCCTTCT CTGGGAAAAC TTCCACCCAT 1980
TCTCCAGAGC TCAGCCCCCA GTGCAGCCCC GTCACCTCAT CCTAATCACC CCACCCTAAT 2040TCTCCAGAGC TCAGCCCCCA GTGCAGCCCC GTCACCTCAT CCTAATCACC CCACCCTAAT 2040
CGCCTTGCGT TTCACTGTCG GGCTGGGCCC CCCTCCTCAA GGGCAGGGTC TGCCGGCCCC 2100CGCCTTGCGT TTCACTGTCG GGCTGGGCCC CCCTCCTCAA GGGCAGGGTC TGCCGGCCCC 2100
ACACAGCAGC ACAGGGCAGT CGTGAGTGAA TGTGCCTTGT TGGTGAATGA ATGCAGGACC 2160ACACAGCAGC ACAGGGCAGT CGTGAGTGAA TGTGCCTTGT TGGTGAATGA ATGCAGGACC 2160
CAGCCCGGCT GTGGGTCAAA GTAGGTGCTC AGGGAGGGGC CGGGGCCCCC CCTGCCTGGC 2220CAGCCCGGCT GTGGGTCAAA GTAGGTGCTC AGGGAGGGGC CGGGGCCCCC CCTGCCTGGC 2220
TCTTATCTCC TAGGGCTGTC TCGAGCCTTA TCTGATAAGG CCTGACAGGT GAGCAGATGA 2280TCTTATCTCC TAGGGCTGTC TCGAGCCTTA TCTGATAAGG CCTGACAGGT GAGCAGATGA 2280
GACTGACAGA GGCTTCCAGG TTACTCAGTA ACCTGCCCTC TTTAAAAGTC CCGCCGCTTC 2340GACTGACAGA GGCTTCCAGG TTACTCAGTA ACCTGCCCTC TTTAAAAGTC CCGCCGCTTC 2340
CCCCTGGCAT CCAGAACAGC CACCCCTCTC TCGGGCACTG CTGCCATGAA TGCCTTCCTG 2400CCCCTGGCAT CCAGAACAGC CACCCCTCTC TCGGGCACTG CTGCCATGAA TGCCTTCCTG 2400
CTCTTCGCAC TGTGCCTCCT TGGGGCCTGG GCCGCCTTGG CAGGAGGGGT CACCGTGCAG 2460CTCTTCGCAC TGTGCCTCCT TGGGGCCTGG GCCGCCTTGG CAGGAGGGGT CACCGTGCAG 2460
GTGAGTCCTG TGTCCCTACC CCGGCCCAGC TGGCTCCCTG CCCCTAGTGC CCAGGTCTGG 2520GTGAGTCCTG TGTCCCTACC CCGGCCCAGC TGGCTCCCTG CCCCTAGTGC CCAGGTCTGG 2520
TCCCCTGAGA GAGTACCTCC TCTTTGGGGC TGGATTGAGG GTGTGTGTCC CAGGCTTGGC 2580TCCCCTGAGA GAGTACCTCC TCTTTGGGGC TGGATTGAGG GTGTGTGTCC CAGGCTTGGC 2580
CTTCTTCGAG GAGCTCCTGC TCAGTCCAGC CACACACACA CCTTTCCCTT CAACTTTGGA 2640CTTCTTCGAG GAGCTCCTGC TCAGTCCAGC CACACACACA CCTTTCCCTT CAACTTTGGA 2640
GGAGAAAGAA ACCCAGTGGA GGGAAGAGGA ATAACCATAT GGGGAAGGCG GGGAGTTGGC 2700GGAGAAAGAA ACCCAGTGGA GGGAAGAGGA ATAACCATAT GGGGAAGGCG GGGAGTTGGC 2700
CAATTTACTG AGTGTCCTAT GTGCCGGCTC CTTCCCCAGC CCCTCACTGT GGCTCCACTA 2760CAATTTACTG AGTGTCCTAT GTGCCGGCTC CTTCCCCAGC CCCTCACTGT GGCTCCACTA 2760
TCAACCTGGA AGAAAGGGAT CATTAGTCCC ATTTTACAGA GGGGAAAACT GAGCCTCACA 2820TCAACCTGGA AGAAAGGGAT CATTAGTCCC ATTTTACAGA GGGGAAAACT GAGCCTCACA 2820
AAGGTTCTGT AACAGGCCAT GGGCACATGG CTGTGGGAAG TGCAGGAGCT GGATTTAAAT 2880AAGGTTCTGT AACAGGCCAT GGGCACATGG CTGTGGGAAG TGCAGGAGCT GGATTTAAAT 2880
CCAGACCTTA CTCCTCAGTG GGTCCCAGGA ACCACATGGA CACCCTGGAG GTCCTGACAG 2940CCAGACCTTA CTCCTCAGTG GGTCCCAGGA ACCACATGGA CACCCTGGAG GTCCTGACAG 2940
ATGGGTATGC CTACCAGTGC CAATGCTGGC GACAGGCCAA GCTGGCACCT AGCGGGGGCC 3000ATGGGTATGC CTACCAGTGC CAATGCTGGC GACAGGCCAA GCTGGCACCT AGCGGGGGCC 3000
CTGATCTCTA TCAAAGCCAG ATTCCGGGAG GCCTTTTATT GCTTCTCAAA CCAAAACCAG 3060CTGATCTCTA TCAAAGCCAG ATTCCGGGAG GCCTTTTATT GCTTCTCAAA CCAAAACCAG 3060
GCTGCAGGCT GGAGCTGGGG GCCCAGTAAT CAGCCGCACC GCTCTCAGGC AGGGGAAAGA 3120GCTGCAGGCT GGAGCTGGGG GCCCAGTAAT CAGCCGCACC GCTCTCAGGC AGGGGAAAGA 3120
CAGCCTGGGC TTGGCCACGT GGAACTACGA TGCCTGGGTG CTGGTCCTTT GCCTCTCCCT 3180CAGCCTGGGC TTGGCCACGT GGAACTACGA TGCCTGGGTG CTGGTCCTTT GCCTCTCCCT 3180
AAAAATCAGC ACACTGGCTC CTACTCATTA GGCACCTATG GTGTTCCTGG AGCTTCACAC 3240AAAAATCAGC ACACTGGCTC CTACTCATTA GGCACCTATG GTGTTCCTGG AGCTTCACAC 3240
CCATTTTCTC CATTCCCCAT ACAACATGCA GAATTTGCGG GTTCCAGAGT GTCCAGCATC 3300 ACGGAGCCAA GCCAGGACGT GGGGCCTGAA CTCTGCCCCT CACAGTGCCC CACTGTGGAT 3360CCATTTTCTC CATTCCCCAT ACAACATGCA GAATTTGCGG GTTCCAGAGT GTCCAGCATC 3300 ACGGAGCCAA GCCAGGACGT GGGGCCTGAA CTCTGCCCCT CACAGTGCCC CACTGTGGAT 3360
CGCCTGGCTC CCATATGCCA CGAACACTGC CTGTGAGCAC CACTGGGCTG GACCGGGGCC 3420CGCCTGGCTC CCATATGCCA CGAACACTGC CTGTGAGCAC CACTGGGCTG GACCGGGGCC 3420
AGCACGGGGG GCACAGCCAG GAAGCAGGCT GCAGCCTGGC CTCATGCTCT GGGCTTCTCT 3480AGCACGGGGG GCACAGCCAG GAAGCAGGCT GCAGCCTGGC CTCATGCTCT GGGCTTCTCT 3480
CTTCCAGGAT GGAAATTTCT CCTTTTCTCT GGAGTCAGTG AAGAAGCTCA AAGACCTCCA 3540CTTCCAGGAT GGAAATTTCT CCTTTTCTCT GGAGTCAGTG AAGAAGCTCA AAGACCTCCA 3540
GGAGCCCCAG GAGCCCAGGG TTGGGAAACT CAGGAACTTT GCACCCATCC CTGGTGAACC 3600GGAGCCCCAG GAGCCCAGGG TTGGGAAACT CAGGAACTTT GCACCCATCC CTGGTGAACC 3600
TGTGGTTCCC ATCCTCTGTA GCAACCCGAA CTTTCCAGAA GAACTCAAGC CTCTCTGCAA 3660TGTGGTTCCC ATCCTCTGTA GCAACCCGAA CTTTCCAGAA GAACTCAAGC CTCTCTGCAA 3660
GGAGCCCAAT GCCCAGGAGA TACTTCAGAG GCTGGGTGAG CAGCCTCCTT CCTCTCTGAT 3720GGAGCCCAAT GCCCAGGAGA TACTTCAGAG GCTGGGTGAG CAGCCTCCTT CCTCTCTGAT 3720
TGGTGGGGCT CGGGAATACT GTGGTGGCAC TTGAGGAAGA GATGTGCTCT GATTGGTGGG 3780TGGTGGGGCT CGGGAATACT GTGGTGGCAC TTGAGGAAGA GATGTGCTCT GATTGGTGGG 3780
ATTTGGAGGA AGGGCTCAGC TCTGACTGGT GGAACTAGGG AGCTTGGCTC TGATTGGTGG 3840ATTTGGAGGA AGGGCTCAGC TCTGACTGGT GGAACTAGGG AGCTTGGCTC TGATTGGTGG 3840
GTCTGTTCCA TGCCCACTTC AATTCCAAGT TGTAACTGCT GAGGTTTGGG AACTAAGACC 3900GTCTGTTCCA TGCCCACTTC AATTCCAAGT TGTAACTGCT GAGGTTTGGG AACTAAGACC 3900
ATTCATCTGG TCTTAGTTTC CTCTCTTTCT GGTGGAATCT CTGCTTTGAT TGGTTGGTTT 3960ATTCATCTGG TCTTAGTTTC CTCTCTTTCT GGTGGAATCT CTGCTTTGAT TGGTTGGTTT 3960
GAGTGGTCTG TGTGCCCTGG TTTGGGGCGA AAAGCCCAGT AGGTCAGAGT ACGGGCCTGC 4020GAGTGGTCTG TGTGCCCTGG TTTGGGGCGA AAAGCCCAGT AGGTCAGAGT ACGGGCCTGC 4020
TGAGATTCTC CTGGGGCTGG GTGGTGACGT ACAAGCTCTG GGCCAAGGGC GGCAGGGGCC 4080TGAGATTCTC CTGGGGCTGG GTGGTGACGT ACAAGCTCTG GGCCAAGGGC GGCAGGGGCC 4080
TCGCGAGGAA ATGCTGGTTC TCACGAGGCT CCATCTCTGT TGTGCAGAGG AAATCGCTGA 4140TCGCGAGGAA ATGCTGGTTC TCACGAGGCT CCATCTCTGT TGTGCAGAGG AAATCGCTGA 4140
GGACCCGGGC ACATGTGAAA TCTGTGCCTA CGCTGCCTGT ACCGGATGCT AGGGGGGCTT 4200GGACCCGGGC ACATGTGAAA TCTGTGCCTA CGCTGCCTGT ACCGGATGCT AGGGGGGCTT 4200
GCCCACTGCC TGCCTCCCCT CCGCAGCAGG GAAGCTCTTT TCTCCTGCAG AAAGGGCCAC 4260GCCCACTGCC TGCCTCCCCT CCGCAGCAGG GAAGCTCTTT TCTCCTGCAG AAAGGGCCAC 4260
CCATGATACT CCACTCCCAG CAGCTCAACC TACCCTGGTC CAGTCGGGAG GAGCAGCCCG 4320CCATGATACT CCACTCCCAG CAGCTCAACC TACCCTGGTC CAGTCGGGAG GAGCAGCCCG 4320
GGGAGGAACT GGGTGACTGG AGGCCTCGCC CCAACACTGT CCTTCCCTGC CACTTCAACC 4380GGGAGGAACT GGGTGACTGG AGGCCTCGCC CCAACACTGT CCTTCCCTGC CACTTCAACC 4380
CCCAGCTAAT AAACCAGATT CCAGAGTACT CTGGGTGTTG CCTTCCTTCC TTCCTTCATC 4440CCCAGCTAAT AAACCAGATT CCAGAGTACT CTGGGTGTTG CCTTCCTTCC TTCCTTCATC 4440
CCCTAGTCTA TCCTGCCCTG GAAGCTCGGG ATGTAATGTA CTAAGCGAAG GACCCCACTC 4500CCCTAGTCTA TCCTGCCCTG GAAGCTCGGG ATGTAATGTA CTAAGCGAAG GACCCCACTC 4500
TCCCTGCTAA GCTGCTCACT GTCCCTGGGG CTGCCACAAC ACAGAGGCGT GGAGAGGATC 4560TCCCTGCTAA GCTGCTCACT GTCCCTGGGG CTGCCACAAC ACAGAGGCGT GGAGAGGATC 4560
TGGATCTCCA AACCACCAAG GCAGCGGGTG GTGGG 4595 TGGATCTCCA AACCACCAAG GCAGCGGGTG GTGGG 4595

Claims

A n s p r ü c h eExpectations
1. Insulinotropes Peptid vom GCAP-Typ ausgenommen GCAP-II- (89- 112) , erhältlich durch1. GCAP-type insulinotropic peptide except GCAP-II- (89-112) available from
Behandlung von Hamofiltrat mit Säure und Abkühlung auf 4°C zum Schutz gegen proteolytischen Abbau, chromatographische Reinigung durch mehrere KatIonenaus¬ tauscher-Chromatographie-Schritte,Treatment of hamofiltrate with acid and cooling to 4 ° C. to protect against proteolytic degradation, chromatographic purification by means of several cat ion exchanger chromatography steps,
Ultrafiltration mit Ausschlußgröße 20.000 Dalton, gefolgt von Entsalzungsschritten,Ultrafiltration with a cut-off size of 20,000 daltons, followed by desalination steps,
Rechromatographie an Umkehrphasenmaterial (RP-Chromato- graphie) und Prüfung der aktiven Fraktion auf spezifische Aktivität durch Messung der insulinotropen Wirkung sowie natürliche und pharmakologisch verträgliche Derivate des insulinotropen Peptids, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphorylierte und glycosylierte Derviate und natürliche und künstliche Fragmente mit biologischer Wirkung, die auε der Aminosäurensequenz abgeleitet werden, erhältlich durch enzymatisch proteolytische und/oder chemische Spaltung.Rechromatography on reverse phase material (RP chromatography) and testing of the active fraction for specific activity by measuring the insulinotropic effect and natural and pharmacologically acceptable derivatives of the insulinotropic peptide, in particular amidated, acetylated, phosphorylated and glycosylated derivatives and natural and artificial fragments with biological effects which are derived from the amino acid sequence, obtainable by enzymatic proteolytic and / or chemical cleavage.
2. Peptid nach Anspruch 1 mit der Aminosäurensequenz2. Peptide according to claim 1 with the amino acid sequence
Glu - Asp - Pro - Gly - Thr - Cys - Glu - Ile - Cys - Ala - Tyr - Ala - Ala - Cys - Thr - Gly - CysGlu - Asp - Pro - Gly - Thr - Cys - Glu - Ile - Cys - Ala - Tyr - Ala - Ala - Cys - Thr - Gly - Cys
als GCAP-I- (99-115) (Seq. ID No. 2.)as GCAP-I- (99-115) (Seq. ID No. 2.)
sowie Fragmente des GCAP-I- (99-115) ,as well as fragments of GCAP-I- (99-115),
3. Insulinotropes Peptid, erhältlich durch Spaltung des GCAP-II- (89-112) mit den Seq. ID No. 3 bis 26. Gen oder Genabschnitt mit der folgenden Struktur3. Insulinotropic peptide, obtainable by cleaving the GCAP-II- (89-112) with the Seq. ID No. 3 to 26. Gene or gene segment with the following structure
Figure imgf000062_0001
Figure imgf000062_0001
kodierend für ein insulinotropes Peptid nach Anspruch 1.coding for an insulinotropic peptide according to claim 1.
5. Nucleinsäure mit der in Seq. ID No. 37 bis 39 wiedergegebenen Sequenz .5. Nucleic acid with that in Seq. ID No. 37 to 39 reproduced sequence.
6. Verfahren zur Herstellung der Peptide GCAP-II- (89-112) und GCAP-1- (99-115) oder ihrer Derivate und ihrer Fragmente nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß diese über eine prokaryontische oder eine eurkaryontische Expression hergestellt und chromatographisch gereinigt werden.6. A process for the preparation of the peptides GCAP-II- (89-112) and GCAP-1- (99-115) or their derivatives and their fragments according to Claims 1 to 3, characterized in that these have a prokaryotic or a eurkaryotic expression be prepared and cleaned chromatographically.
7. Verfahren zur Herstellung und Entwicklung des GCAP-II- (89- 112) und GCAP-I- (99-115) oder ihrer Derivate und ihrer Fragmente nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man es aus menschlichem Blut über übliche Chromatographie- Verfahren in bekannter Weise isoliert.7. A process for the preparation and development of GCAP-II- (89-112) and GCAP-I- (99-115) or their derivatives and their fragments according to claims 1 to 3, characterized in that it is obtained from human blood using conventional methods Chromatography method isolated in a known manner.
8. Verfahren zur Herstellung des GCAP-II- (89-112) und GCAP-I-8. Process for the preparation of GCAP-II- (89-112) and GCAP-I-
(99-115) oder ihrer Derivate und ihrer Fragmente nach An¬ sprüchen 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet , daß man diese GCAPs oder ihre Derivate durch die üblichen Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der angegebenen Sequenz enthalten sind, herstellt, deblockiert und es mit den gängigen Chromato¬ graphie-Verfahren reinigt.(99-115) or their derivatives and their fragments according to claims 1 to 3, characterized in that these GCAPs or their derivatives by the usual methods of Solid-phase and liquid-phase synthesis from the protected amino acids contained in the specified sequence is produced, deblocked and purified using the usual chromatography methods.
9. Arzneimittel, enthaltend ein insulinotropes Peptid vom GCAP- Typ, insbesondere das humane, zirkulierende GCAP-II- (89-112) oder GCAP- 1- (99-115) oder ihre Fragmente nach Ansprüchen 1 bis 3 als aktiven Wirkstoff neben üblichen Hilfs- und Zusatz¬ stoffen .9. Medicament containing an insulinotropic peptide of the GCAP type, in particular the human, circulating GCAP-II- (89-112) or GCAP-1- (99-115) or their fragments according to Claims 1 to 3 as an active ingredient in addition to conventional ones Auxiliaries and additives.
10. Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, die bei Funktions¬ störungen des endokrinen Pankreas, insbesondere der mangelnden Insulinproduktion (vorwiegend Diabetes mellitus Typ II) , auftreten, durch Verabreichung des Arzneimittels nach Anspruch 9.10. A method for the treatment of diseases which occur in the case of functional disorders of the endocrine pancreas, in particular the lack of insulin production (predominantly diabetes mellitus type II), by administration of the medicament according to claim 9.
11. Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, die bei Funktions¬ störungen des Elektrolyt-Wasser-Haushaltes (Nieren- und Darmerkrankungen) sowie weiteren Störungen im menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Magen-Darm- Traktes, der Atemwege und des Urogenitalapparates auftreten, durch Verabreichung des Arzneimittels nach Anspruch 9.11. Process for the treatment of diseases which occur in the case of functional disorders of the electrolyte-water balance (kidney and intestinal disorders) and other disorders in the human organism, in particular with the involvement of the gastrointestinal tract, the respiratory tract and the urogenital apparatus Administration of the medicament according to claim 9.
12. Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Herzkreislauf¬ und Nervensystems durch Verabreichung des Arzneimittels nach Anspruch 9.12. A method for the treatment of diseases of the human organism, in particular with involvement of the cardiovascular and nervous system by administration of the medicament according to claim 9.
33. Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen des menschlichen Organismus, insbesondere mit Beteiligung des Intugementes und der Sinnesorgane durch Verabreichung des Arzneimittels nach Anspruch 9.33. A method for the treatment of diseases of the human organism, in particular involving the intugement and the sensory organs by administration of the medicament according to claim 9.
14. Verfahren zur Behandlung von Systemerkrankungen bei Über¬ produktion oder Mangel von GCAP- II - (89- 112) , insbesondere bei z.B. durch Anwendung gegen dieses gebildete Λntikorpci oder zur Verwendung von GCAP-II- (89-112 ) zur Substitutions¬ therapie durch Verarbreichung des Arzneimittels nach Anspruch 9.14. Process for the treatment of systemic diseases in the case of overproduction or deficiency of GCAP-II - (89-112), in particular in the case of ikntikorpci formed by use against it or for the use of GCAP-II- (89-112) for substitution therapy by administration of the medicament according to claim 9.
15. Verfahren zur Behandlung von chronischen Erkrankungen, teils vergesellschaftet mit Erkrankungen gemäß Ansprüchen 10 bis 14, indem es in geeigneter Form für die Behandlung für die Elektrolytwirkung bei Erkrankungen auf den Knochenumbau15. A method for the treatment of chronic diseases, partly associated with diseases according to claims 10 to 14, by being in a suitable form for the treatment for the electrolyte effect in diseases on the bone remodeling
(Osteoporose) oder am Zahnapparat benutzt wird durch Ver¬ abreichung deε Arzneimittels nach Anspruch 9.(Osteoporosis) or on the dental apparatus by administering the medicament according to claim 9.
16. Verfahren zur Behandlung von endokrinen Erkrankungen, die durch Stimulation des cGMP-Spiegelε in endokrinen Zellen einhergehen wie z.B. die Erkrankungen verwandt mit denen des Diabetes mellitus, der Hypophyse und des endokrinen Magen- Darmtraktes durch Verabreichung des Arzneimittels nach Anspruch 9.16. A method of treating endocrine diseases associated with stimulation of the cGMP level in endocrine cells, e.g. the diseases related to those of diabetes mellitus, the pituitary gland and the endocrine gastrointestinal tract by administration of the medicament according to claim 9.
17. Verfahren zur Behandlung von akuten Erkrankungen, gemäß Ansprüchen 10 bis 16, indem es m geeigneter Form für die Behandlung m der Intensivpflege dieser Erkrankungen benutzt wird durch Verabreichung des Arzneimittels nach Anspruch 8.17. A method for the treatment of acute diseases, according to claims 10 to 16, in that it is used in a suitable form for the treatment m of the intensive care of these diseases by administration of the medicament according to claim 8.
18. Diagnostikmittel enthaltend Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Diagnose von Erkrankungen, insbesondere nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 17, indem Antikörper gegen das synthetische Peptid, seine Derivate und/oder seine Fragmente hergestellt werden und die Blutkonzentration GCAPs über Immuntests gemessen wird.18. Diagnostic agent containing peptides according to one of claims 1 to 3 for the diagnosis of diseases, in particular according to any one of claims 10 to 17, by producing antibodies against the synthetic peptide, its derivatives and / or its fragments and the blood concentration of GCAPs is measured by immunoassays .
19. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 9 in geeigneten verschiedenen galenischen Applikationsformen, insbesondere der lyophilisierten, mit Mannit aufgenommenen Form in sterilen Ampullen zur Auflösung in physiologischer Kochsalz¬ lösung und/oder Infusionslösungen zur wiederholten Einzel - miektion und/oder Dauerinfusion in Mengen von 300 Mikrogramm bis 30 Milligramm reines GCAP pro Therapie Einheit 20. Verwendung der humanen cDNA von GCAP-II- (89-112 ) und GCAP-I- (99-115) für die Erkennung und Behandlung der m Ansprüchen 9 bis 16 genannten Erkrankungen, indem Gensonden aus dem sequenzierten Bereich abgeleitet, synthetisch oder biotechno¬ logisch hergestellt und zur Diagnose über Hybπdisierungs- techmken (z.B Southern- und Northern-Blots) sowie mit spezifischer PCR-Reaktion benutzt werden.19. Use of the medicament according to claim 9 in suitable various galenical application forms, in particular the lyophilized form, taken up with mannitol, in sterile ampoules for dissolution in physiological saline solution and / or infusion solutions for repeated single miection and / or continuous infusion in amounts of 300 micrograms up to 30 milligrams of pure GCAP per therapy unit 20. Use of the human cDNA of GCAP-II- (89-112) and GCAP-I- (99-115) for the detection and treatment of the diseases mentioned in claims 9 to 16 by gene probes derived from the sequenced area, synthetically or biotechnologically produced and used for diagnosis via hybridization technologies (eg Southern and Northern blots) and with a specific PCR reaction.
21 01igonucleotide als Hybridisiersonden , geeignet zur Klonierung des humanen GCAP-II- (89-112) -Gens und GCAP-I- (99-115) Gens21 01igonucleotides as hybridization probes, suitable for cloning the human GCAP-II (89-112) gene and GCAP-I (99-115) gene
2, Verwendung der Gene von GCAP-I- (99-115) und/oder GCAP-II- (89- 112) zur Konstruktion von Vektoren, die speziell in der Gen¬ therapie für GCAP-abhängige Erkrankungen, wie Diabetes mellitus, eingesetzt werden können.2, Use of the genes of GCAP-I- (99-115) and / or GCAP-II- (89-112) for the construction of vectors which are used specifically in gene therapy for GCAP-dependent diseases, such as diabetes mellitus can be.
23. Verwendung der cDNA oder des Gens nach Ansprüchen 20 und 22 mit Nucleotidsequenzen zur Konstruktion von Expressions¬ systemen, bestehend aus den m diesen Sequenzen enthaltenen Nucleotidfragmenten zur Produktion von msulmotropen Peptiden vom GCAP-Typ nach Anspruch 1, wie GCAP-II (89-112) und/oder GCAP-I- (99-115) , insbesondere zur Behandlung der m Ansprüchen 10 bis 16 genannten Erkrankungen.23. Use of the cDNA or the gene according to claims 20 and 22 with nucleotide sequences for the construction of expression systems, consisting of the nucleotide fragments contained in these sequences for the production of msulmotropic peptides of the GCAP type according to claim 1, such as GCAP-II (89- 112) and / or GCAP-I- (99-115), in particular for the treatment of the diseases mentioned in claims 10 to 16.
24. Verwendung von Promotoren der Gene insulinotroper Peptide vom GCAP-Typ nach Anspruch 1, wie GCAP II- (89-112) und/oder GCAP-I- (99-115) zur Intervention m der Genregulation mittels Benutzung von Vektorkonstruktion, die speziell m der Gen therapie für abhängige Erkrankungen, wie Diabetes mellitus eingesetzt werden können.24. Use of promoters of the genes insulinotropic peptides of the GCAP type according to claim 1, such as GCAP II- (89-112) and / or GCAP-I- (99-115) for the intervention m of gene regulation by using vector construction, which specifically m gene therapy for dependent diseases such as diabetes mellitus can be used.
25 Verwendung der humanen insulinotroper Peptide vom GCAP-Typ nach Anspruch 1, wie GCAP-I- und/oder GCAP- II -Gene , m Form ihrer Nucleotidsequenz zur Veränderung des Genoms bei Tieren, / a . ii. Form von tiansgenen Spezies oder modifizierten Tierarten, die resistent gegen die in Ansprüchen 10 bis 1! genannten Erkrankungen sind.25 Use of the human insulinotropic peptides of the GCAP type according to claim 1, such as GCAP-I and / or GCAP-II genes, m form their nucleotide sequence for changing the genome in animals, / a. ii. Form of tiansgenic species or modified Animal species that are resistant to claims 10 to 1! diseases mentioned are.
26. Transgene Säuger erhältlich nach Anspruch 25. 26. Transgenic mammals obtainable according to claim 25.
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