WO1996024844A1 - Method of diagnosing immune diseases - Google Patents

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Makoto OHGAKI
Yoshinari Takasaki
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Abstract

A method of diagnosing immune diseases which comprises the step of immunologically determining the CD80 antigen-positivity rate of the lymphocytes and/or lymphocyte subgroups contained in a body fluid sample separated from man by using, for example, an antihuman CD80 monoclonal antibody that recognizes CD80 antigens. The method is characterized in that it permits various immune diseases to be diagnosed readily and accurately and that, as compared with conventional diagnostic methods, it is simple in operation and does not much burden the patients because the object to be detected is lymphocytes contained in body fluids, such as peripheral blood, readily sampled from them. The invention also provides a medicine which contains as the active ingredient antihuman CD80 antibodies that specifically recognize human CD80 antigens and which can ameliorate or prevent immune disorder in a disease-specific way.

Description

明 細 害 免疫性疾患の診断方法 技 i r^r野  Diagnostic method for immune disease
本発明は免疫性疾患の診断方法及び診断用組成物、 並びに免疫性疾患の予防 - 治療剤に関するものである。 背景技術  The present invention relates to a method and a composition for diagnosing an immune disease, and a prophylactic / therapeutic agent for an immune disease. Background art
免疫系は、 ウィルス、 細菌、 寄生虫、 カビなどの外部からの感染から宿主であ る自己を防衛するシステムである。 しかし、 この免疫系に異常をきたし本来排除 してはならない自己を排除する方向に免疫系がはたらく場合がある。 このような 疾患は自己免疫性疾患として知られており、 臓器、 器官特異的なものから非特異 的な全身性のものまで多くの疾患が知られている。  The immune system is a system that protects its host from external infections such as viruses, bacteria, parasites, and mold. However, in some cases, the immune system works in a direction to eliminate self that should not be eliminated because of abnormalities in the immune system. Such diseases are known as autoimmune diseases, and many diseases are known from organs and organ-specific diseases to nonspecific systemic diseases.
これらの自己免疫性疾患の診断には、 各々の疾患にそれぞれの診断基準が採用 されている。 例えば、 全身性エリテマトーデス（SLE) 、 慢性関節リウマチ（RA)の診 断には、 アメリカリウマチ協会の診断基準が汎用されている [Medical Technology, 自己免疫疾患検査のすべて， 18, No. 7(1990), 医歯薬出版] 。 しかし、 その診断基 準は多岐にわたっており、 診断のための手段や操作が複雑かつ繁雑であり、 さら に、 診断基準が必ずしも免疫系の異常を反映していないという問題があった。 また、 自己免疫性疾患の発症原因についてはいまだ不明な点が多いが、 いずれ の自己免疫性疾患も主として Tリンパ球及び Bリンパ球が関与する免疫系の異常 に原因があることが示唆されている [吉木、 総合臨床、 43、 159 (1994)] 。 従って、 免疫異常是正を目的として自己免疫性疾患の治療を行う場合、 細胞レベルでの免 疫学的異常を直接的に把握できる診断方法が必要であり、 免疫異常を正確かつ簡 便に検出することにより疾患活動性や治療効果の判定をすることが望まれている。 しかしながら、 種々の免疫性疾患に対して汎用性があり、 しかも簡便な免疫性疾 患の診断方法はいまだ完成されていない。  In diagnosing these autoimmune diseases, respective diagnostic criteria are adopted for each disease. For example, for the diagnosis of systemic lupus erythematosus (SLE) and rheumatoid arthritis (RA), the diagnostic criteria of the American Rheumatology Association are widely used [Medical Technology, All Autoimmune Disease Tests, 18, No. 7 (1990). ), Medical and Dental Medicine Publishing]. However, the diagnostic criteria are diverse, the means and procedures for diagnosis are complicated and complicated, and the diagnostic criteria do not always reflect abnormalities in the immune system. Although the causes of autoimmune diseases remain largely unknown, it has been suggested that all autoimmune diseases are caused by abnormalities in the immune system involving mainly T lymphocytes and B lymphocytes. [Yoshiki, General Clinical Practice, 43, 159 (1994)]. Therefore, when treating autoimmune diseases for the purpose of correcting immune abnormalities, a diagnostic method that can directly identify immunological abnormalities at the cellular level is necessary, and accurate and simple detection of immune abnormalities is required. It is desired to determine disease activity and therapeutic effect by using the method. However, versatile and simple methods for diagnosing immune diseases have not yet been completed.
これらの自己免疫性疾患には、 各々の自己免疫性疾患毎に一応の治療法が確立 されている。 例えば、 SLE では副肾皮質ステロイ ド剤、 免疫抑制剤、 非ステロイ ド 性抗炎症剤等が、 RAでは非ステロイ ド性抗炎症剤、 副肾皮質ステロイ ド剤、 抗リウ マチ薬、 免疫抑制剤等が使用されるのが一般的である [岡田、 総合臨床、 43、 1110 (1994) ;志水、 総合臨床、 43、 1125(1994)] 。 しかしながら、 これらの薬物療法は 対症療法であり、 また、 薬物自体の使用法が難しく副作用などに問題があった [鈴 木、 Molecular Medicine, 30、 612 (1993) ；倉田、 医学のあゆみ、 161、 690 (1992)] 。 従って、 免疫系全体に作用するのではなく、 異常を発現している免疫系 の特定の部分に対して特異的に作用する薬物療法の開発が求められていた。 For these autoimmune diseases, a prima facie treatment method has been established for each autoimmune disease. Have been. For example, for SLE, corticosteroids, immunosuppressants, non-steroid anti-inflammatory drugs, etc., and for RA, non-steroidal anti-inflammatory drugs, corticosteroids, anti-rheumatic drugs, immunosuppressants Are generally used [Okada, General Clinical Studies, 43, 1110 (1994); Shimizu, General Clinical Studies, 43, 1125 (1994)]. However, these drug therapies are symptomatic, and the use of the drug itself is difficult and there are problems with side effects [Suzuki, Molecular Medicine, 30, 612 (1993); Kurata, History of Medicine, 161, 690 (1992)]. Therefore, there has been a need for the development of a drug therapy that does not act on the entire immune system but specifically acts on a specific part of the immune system in which an abnormality is occurring.
免疫性疾患の一つである臓器移植時の拒絶反応は、 免疫系本来のシステムが反 応して移植臓器を非自己臓器と判断し、 これを排除しょうとする際に起こる反応 である。 拒絶反応に重要な役割を担うのは Tリンパ球であることが知られている が、 その確実な診断方法は、 移植臓器の組織採取を行い、 病理学的に診断するこ とによらねばならない。 臓器移植同様に診断のための手段、 操作は複雑かつ繁雑 であり、 組織採取には麻酔時のショック、 組織採取時の出血など患者の生命的な 危険を伴うので、 安全かつ簡便に免疫状態を把握できる診断方法が必要とされて いる。  Rejection at the time of organ transplantation, which is one of the immune diseases, is a reaction that occurs when the original system of the immune system reacts to determine a transplanted organ as a non-self organ and tries to eliminate it. T lymphocytes are known to play an important role in rejection, but the only reliable method of diagnosis is to collect tissue from transplanted organs and make a pathological diagnosis . As with organ transplantation, the means and procedures for diagnosis are complex and complicated, and tissue collection involves a vital risk to the patient, such as shock during anesthesia and bleeding during tissue collection. A diagnostic method that can be grasped is needed.
また、 拒絶反応に対する治療方法としては主に免疫抑制剤が用いられている。 代表的な免疫抑制剤サイクロスポリン Aは、 Tリンパ球からの IL- 2産生を抑制する ことにより免疫系全体を抑制し、 移植臓器を生着させる抗原非特異的な免疫抑制 剤である [雨宮、 医学のあゆみ、 160、 163 (1992)] 。 サイクロスポリン Aの使用 により移植臓器の生着率は著しく向上したが、 サイクロスポリン Aには腎臓に対 する毒性があり [高原、 医学のあゆみ、 164、 526 (1993)：遠藤、 今日の治療指針 1994、 801、 医学害院] 、 また、 Bリ ンパ球の抗体産生に対する直接的作用が無く、 自然抗体による超急性拒絶反応や慢性拒絶反応における免疫複合体による血管内 膜の慢性刺激に対しては効果がない [長田、 現代病理学大系 6 免疫、 192 (1994)] 。 従って、 サイクロスポリ ン Aの毒性を低減し、 その作用を補助するため に、 副肾皮質ステロイ ド剤ゃァザチォプリ ン等の薬剤が併用されている。 しかし ながら、 これらの併用剤も免疫系に特異的な薬剤ではなく、 副作用の面から問題 である。 また、 他の免疫性疾患である移植片対宿主反応病は、 臓器移植時または輸血時 に移植臓器や血液中に含まれる提供者リンパ球が宿主を非自己とみなし、 排除し ようとするために引き起こされる疾患であり、 重症例では発病からの経過が早い ため早期の診断が望まれている。 また、 白血病治療の目的で行われる骨髄移植に は、 予防的にサイクロスポリン Aゃメ ト トレキセートを併用する方法が用いられ ているが、 白血病の再発を増加させるとの報告もあり、 また、 現在治療に用いら れる副肾皮質ステロイ ド剤に対して抵抗性の重症例も報告されているので [小川、 医学のあゆみ、 164、 757 (1993)] 、 この分野でも効果的薬剤が必要とされてい る。 In addition, immunosuppressants are mainly used as a treatment method for rejection. A typical immunosuppressant, cyclosporin A, is a non-antigen-specific immunosuppressant that suppresses the entire immune system by suppressing IL-2 production from T lymphocytes and engraft transplanted organs [ Amemiya, History of Medicine, 160, 163 (1992)]. Although the use of cyclosporin A significantly improved the survival rate of transplanted organs, cyclosporin A has toxicity to the kidneys [Takahara, History of Medicine, 164, 526 (1993): Endo, today. Therapeutic Guideline 1994, 801, Medical Academy] Also, there is no direct effect of B-lymphocyte on antibody production, and it can be used for hyperacute rejection by natural antibodies and chronic stimulation of intima by immune complex in chronic rejection. It has no effect [Nagata, Modern Pathology Dai 6 immunity, 192 (1994)]. Therefore, drugs such as azathioprine, a corticosteroid, are used in combination to reduce the toxicity of cyclosporin A and assist its action. However, these concomitant medications are not specific to the immune system and are problematic in terms of side effects. Graft-versus-host disease, another immune disease, is caused by donor lymphocytes contained in the transplanted organ or blood at the time of organ transplantation or blood transfusion, which considers the host as non-self and tries to exclude it. It is a disease that is caused by the disease. In severe cases, the progress from the onset of the disease is fast, so early diagnosis is desired. In addition, for bone marrow transplantation for the purpose of leukemia treatment, a prophylactic method using cyclosporin A ゃ metrexate has been used, but it has been reported that it increases the recurrence of leukemia. Because severe cases of resistance to corticosteroids currently used for treatment have been reported [Ogawa, History of Medicine, 164, 757 (1993)], there is a need for effective drugs in this field. It has been done.
アレルギー疾患としてはアトピー皮膚炎、 喘息、 花粉症などが知られており、 これらも免疫性疾患の一種である。 これらの疾患は免疫系が過剰に反応するため に引き起こされる疾患であるが、 このような免疫学的異常の原因として Tリ ンパ 球、 Bリンパ球の異常が示唆されているにもかかわらず、 これらの異常は血液中 の IgE 抗体価やアレルゲンに対する皮； t反応試験によって間接的に検出されるのみ で、 Tリンパ球や Bリンパ球自体の異常を直接検出測定する方法はなかった。 従 つて細胞レベルでの免疫学的異常を簡便に検出できればァレルギ一の診断に非常 に有用である。  As allergic diseases, atopic dermatitis, asthma, hay fever, etc. are known, and these are also a kind of immunological diseases. Although these diseases are caused by an over-responsive immune system, despite the suggestion of abnormalities in T lymphocytes and B lymphocytes as the cause of such immunological abnormalities, These abnormalities were detected only indirectly by IgE antibody titers in blood and skin; response test to allergen; there was no method to directly detect and measure abnormalities of T lymphocytes or B lymphocytes themselves. Therefore, if immunological abnormalities at the cellular level can be easily detected, it is very useful for diagnosing allergy.
I型アレルギー （アナフィラキシー型） の原因は Bリンパ球により産生される IgE 抗体であることが知られている [京極、 現代病理学大系 6 免疫、 163 (1994)] 。 現在抗アレルギー剤として用いられている薬剤は全て対症療法を目的と して用いられる薬剤であり、 IgE抗体自体の産生を抑制するものではない。 またァ トビー皮膚炎には、 副腎皮質ステロイ ド剤ゃ外用副肾皮質ステロイ ド剤が用いら れているが、 副作用の問題から使用量に制限がある。 従って、 免疫系に特異的に 作用し、 アレルギーの原因となる IgE抗体の産生を抑制する根本的な治療剤の開発 が望まれている。  It is known that the cause of type I allergy (anaphylaxis) is IgE antibody produced by B lymphocytes [Kyogoku, Modern Pathology 6 immunity, 163 (1994)]. All drugs currently used as antiallergic drugs are used for symptomatic treatment and do not suppress the production of IgE antibodies themselves. For atby dermatitis, adrenal cortical steroids, topical corticosteroids, are used, but their use is limited due to side effects. Therefore, development of a fundamental therapeutic agent that specifically acts on the immune system and suppresses the production of IgE antibodies that cause allergy is desired.
一方、 CD80抗原 (B7/BB-1, BB-1, B7, B7-1)は、 活性化 B細胞に特異的に発現 する細胞表面抗原として同定された抗原である [T. Yokochi, et al. , J. Immunol. , 128, 823 (1982)； A. S. Freedman et al.， J. Immunol. , 139, 3260 (1987)； G. J. Freeman et al. , J. Immunol. , 143, 2714(1989)] 。 その後、 CD80抗原が活 性化 B細胞、 マクロファージ、 ランゲルハンス細胞等にも発現することが報告さ れている [P. Vandenberghe et al. , Int. Immunol. , 5, 317 (1993)] 。 また、 抗 原提示細胞に発現した CD80抗原が、 Τ細胞レセプタ— /CD3抗原複合体を介する第一 シグナルに対して CD80抗原のリガンドである CD28抗原を介して第二シグナル刺激 （副 刺激シグナル： co-stimulatory signal)を与え、 T細胞に十分な活性化刺激を与え ることが報告されている [細胞工学別冊 宮坂昌之監修 接着分子ハンドブック、 128 (1994)秀潤社] 。 従って、 CD80抗原の発現異常が上記の自己免疫性疾患、 臓器 移植に伴う拒絶反応、 移植片対宿主反応病、 アレルギー等の免疫性疾患の発症に 関与していることが示唆されている。 On the other hand, CD80 antigen (B7 / BB-1, BB-1, B7, B7-1) is an antigen that has been identified as a cell surface antigen that is specifically expressed on activated B cells [T. Yokochi, et al. , J. Immunol., 128, 823 (1982); AS Freedman et al., J. Immunol., 139, 3260 (1987); GJ Freeman et al., J. Immunol., 143, 2714 (1989)]. . After that, the CD80 antigen was activated. It has been reported that it is also expressed in sexualized B cells, macrophages, Langerhans cells, etc. [P. Vandenberghe et al., Int. Immunol., 5, 317 (1993)]. In addition, the CD80 antigen expressed on antigen-presenting cells is stimulated by the second signal (co-stimulatory signal) via the CD28 antigen, which is a ligand of the CD80 antigen, in response to the first signal via the Τcell receptor / CD3 antigen complex. It has been reported that a co-stimulatory signal) is given to give sufficient activation stimulation to T cells [Cell Engineering Separate Volume, Masayuki Miyasaka, Adhesion Molecule Handbook, 128 (1994) Shujunsha]. Therefore, it has been suggested that abnormal expression of the CD80 antigen is involved in the development of the above-mentioned autoimmune diseases, rejection accompanying organ transplantation, graft-versus-host reaction disease, and allergic immune diseases.
例えば、 CD80抗原は、 ヒ 卜の生体内では活性化 B細胞、 マクロファージ、 ラン ゲルハンス細胞等の抗原提示機能を有する細胞に発現することが知られており、 また、 休止期 Tリ ンパ球には発現されないが、 RA患者の関節中の T細胞 [J. Verwilghen et al. , J. Immunol. , 153, 1378(1994)] や肝炎患者の肝臓内浸潤 T 細胞 [V. Bamaba et al. , Eur. J. Immunol. , 24, 71 (1994)] 等の病変部に浸潤 した T細胞に発現することが知られている。 また HIV などのウィルス感染、 SLE 、 サルコィ ドーシス等の慢性炎症性疾患においても、 CD80抗原が Tリ ンパ球に発現す ることが知られている [細胞工学別冊 宮坂昌之監修 接着分子ハンドブック、 128 (1994)秀潤社] 。  For example, the CD80 antigen is known to be expressed on cells having an antigen-presenting function, such as activated B cells, macrophages, and Langerhans cells, in vivo in humans. Although not expressed, T cells in joints of RA patients [J. Verwilghen et al., J. Immunol., 153, 1378 (1994)] and infiltrating T cells in liver of patients with hepatitis [V. Bamaba et al., Eur J. Immunol., 24, 71 (1994)] is known to be expressed in T cells infiltrating a lesion. It is also known that the CD80 antigen is expressed on T lymphocytes in viral infections such as HIV, chronic inflammatory diseases such as SLE and sarcoidosis [Adhesion Molecule Handbook, edited by Masayuki Miyasaka, Cell Engineering Separate Volume, 128 ( 1994) Shujunsha].
上記の RA患者や肝炎患者における報告では、.病巣組織より浸潤リ ンパ球を採取 して CD80抗原の発現が検討されている。 しかしながら、 この方法は患者に対する負 担が大きいという問題があり、 また、 上記刊行物には末梢血液中リ ンパ球におけ る CD80抗原陽性リンノ、。球の発現や CD80抗原陽性率等についての詳細な記述がないの で、 完成された免疫性疾患の診断法が開示されているとはいえない。 他の免疫性 疾患における報告も、 CD80抗原の発現や CD80抗原陽性率について詳細に開示してお らず、 また CD80抗原が発現する Tリンパ球の Tリンパ球亜群、 活性化マーカーの発 現に関しても言及がないので [T. fyss-Coray et al. , Eur. J. 】画 unol. , 23, 2175(1993) ； J. Verwilghen et al. , J. Immunol. , 153. 1378(1994)] 、 免疫性疾 患の診断法として完成されているものではない。  In the above report on RA patients and hepatitis patients, the expression of CD80 antigen was examined by collecting infiltrating lymphocytes from focal tissue. However, this method has a problem that the burden on a patient is large. In addition, the above publication discloses CD80 antigen-positive Rinno in peripheral blood lymphocytes. Since there is no detailed description of sphere expression, CD80 antigen positive rate, etc., it cannot be said that a method for diagnosing a completed immune disease has been disclosed. Reports on other immune diseases also do not disclose in detail the expression of CD80 antigen or the positive rate of CD80 antigen, and the expression of T lymphocyte subgroups of T lymphocytes expressing CD80 antigen and activation markers No reference is made to [T. fyss-Coray et al., Eur. J.] Paintings unol., 23, 2175 (1993); J. Verwilghen et al., J. Immunol., 153. 1378 (1994) ] However, it has not been completed as a diagnostic method for immune diseases.
免疫性疾患における免疫異常を是正し、 免疫系に特異的に作用する治療剤とし ては、 リンパ球に発現する抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体が開発さ れている。 この治療剤の作用機序は、 リ ンパ球に発現する抗原にモノクローナル 抗体が特異的に結合して発現抗原分子の機能を阻害したり、 その抗原を発現して いるリンパ球を傷害排除することにより、 免疫性疾患を治療するものである。 代 表的なリンパ球の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体として、 ヒ ト CD3 抗原 に対するモノクローナル抗体が移植における急性拒絶反応の抑制剤として臨床で 用いられいる。 急性拒絶反応では CD3 抗原陽性 Tリンパ球の移植臓器細胞障害作用 が原因であり、 抗ヒ ト CD3 モノクローナル抗体は Tリンパ球を排除する作用を有し ている。 しかしながら、 抗ヒ ト CD3 モノクローナル抗体は、 ほぼ全ての T細胞と反 応するマウス型のモノクローナル抗体であるためにその適応範囲が急性拒絶反応 の抑制に限定されており、 免疫性疾患全般には用いることはできない。 A therapeutic agent that corrects immune abnormalities in immune diseases and acts specifically on the immune system Thus, monoclonal antibodies that specifically react with antigens expressed on lymphocytes have been developed. The mechanism of action of this therapeutic agent is that a monoclonal antibody specifically binds to an antigen expressed on lymphocytes to inhibit the function of the expressed antigen molecule, or to eliminate lymphocytes that express the antigen. To treat immune diseases. As a typical monoclonal antibody against the lymphocyte cell surface antigen, a monoclonal antibody against human CD3 antigen is used clinically as an inhibitor of acute rejection in transplantation. Acute rejection is caused by the cytotoxicity of transplanted organs of CD3 antigen-positive T lymphocytes, and anti-human CD3 monoclonal antibodies have the effect of eliminating T lymphocytes. However, the anti-human CD3 monoclonal antibody is a mouse-type monoclonal antibody that reacts with almost all T cells, so its application range is limited to suppression of acute rejection, and it is used for all immune diseases. It is not possible.
また、 抗 CD4 モノクローナル抗体は自己免疫性疾患モデルで有用性が示されてお り [D. fosfy et al. , J. Immunol. , 183, 3247 (1987)] 、 臨床的な検討もなされ ている [G. Horneff et al. , Arthritis Rheum. , 34, 129 (1991) ; G. Horneff et al. , J. Rheumatol. , 19, 1845(1992) ; P. A. Van Der Lubble et al. , Arthritis Rheum. , 36, 1375(1993)]。 抗 CD4 モノクローナル抗体については、 排除性抗体 が非排除性抗体に対してマウス実験系の移植モデルで有効性が高いとの報告があ るが [C. R. Darby et al. , Transplantation, 57, 1419 (1994)] 、 排除性抗体は CD4抗原陽性リンパ球全てに結合して CD4抗原陽性リンパ球を排除してしまうので、 CD4 抗原陽性リ ンパの減少による免疫不全症の危険性が指摘されている。  In addition, anti-CD4 monoclonal antibodies have been shown to be useful in autoimmune disease models [D. fosfy et al., J. Immunol., 183, 3247 (1987)], and are being studied clinically. [G. Horneff et al., Arthritis Rheum., 34, 129 (1991); G. Horneff et al., J. Rheumatol., 19, 1845 (1992); PA Van Der Lubble et al., Arthritis Rheum., 36, 1375 (1993)]. Regarding anti-CD4 monoclonal antibodies, it has been reported that excluding antibodies are more effective than non-excluded antibodies in a mouse experimental transplantation model [CR Darby et al., Transplantation, 57, 1419 (1994). )] However, since the elimination antibody binds to all CD4 antigen-positive lymphocytes and eliminates the CD4 antigen-positive lymphocytes, the risk of immunodeficiency due to a decrease in CD4 antigen-positive lymphocytes has been pointed out.
CD80 抗原の機能は、 上述のように CD28抗原を介した第二シグナル刺激を与え ることによって T細胞に十分な活性化刺激を与えることにある。 従って、 第二シ グナルを妨害することにより、 抗原特異的なリンパ球活性化を抑制する方法も考 えられる。 しかしながら、 マウスリ ンパ球を用いたァロ MLR(Mixed Lymphocyes Reaction)における Tリンパ球増殖及び IL-2の産生は、 CD80抗原の機能を阻害する ラッ ト抗マウス CD80モノクローナル抗体を用いた系で完全には抑制されず、 ヒ トリ ンパ球を用いたァロ MLR の場合にもマウス抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体を用いた 系で完全には抑制されない [斎藤、 最新医学、 42、 2386(1994)；伊藤、 日本免疫学 会総会 ·学術総会記録、 24、 464 (1994)] 。 その理由として、 CD28抗原に対する第二リガンドである CD86抗原 （B 7- 2、 B 70) の関与が示唆されている [M. Azuma et al. , Nature, 366, 76 (1993) ； G. Freeman et al. , Science, 262, 909 (1993)； G. Freeman et al. , Science, 262, 905 (1993) ； Engel P et al. , Blood, 84, 1402(1994)] 。 上記 MLR 系に各々抗 マウス CD86モノクローナル抗体、 または抗ヒ ト CD86モノクローナル抗体を加えるこ とによって、 MLR における細胞増殖及び 1レ2産生をほぼ完全に抑制できることが知 られている。 これは、 CD80抗原と CD86抗原の発現誘導の速度や発現増強、 また恒常 的発現レベルなど発現性の違いによるものであると考えられている [斎藤、 最新 医学、 42、 2386(1994)] 。 The function of the CD80 antigen is to provide a sufficient activation stimulus to T cells by providing a second signal stimulation via the CD28 antigen as described above. Therefore, a method of inhibiting antigen-specific lymphocyte activation by interfering with the second signal may be considered. However, the proliferation of T lymphocytes and the production of IL-2 in the mixed lymphocyte reaction (MLR) using mouse lymphocytes were completely inhibited by a system using a rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody that inhibits the function of the CD80 antigen. Is not suppressed, and it is not completely suppressed even in the case of aro-MLR using human trypanocytes in a system using mouse anti-human CD80 monoclonal antibody [Saito, Saishin Igaku, 42, 2386 (1994); Ito] The General Meeting of the Japanese Society of Immunology · Record of the General Assembly, 24, 464 (1994)]. For this reason, the involvement of the second ligand for the CD28 antigen, the CD86 antigen (B7-2, B70), has been suggested [M. Azuma et al., Nature, 366, 76 (1993); G. Freeman]. et al., Science, 262, 909 (1993); G. Freeman et al., Science, 262, 905 (1993); Engel P et al., Blood, 84, 1402 (1994)]. It has been known that by adding an anti-mouse CD86 monoclonal antibody or an anti-human CD86 monoclonal antibody to the above MLR system, cell growth and production of MLR can be almost completely suppressed. This is thought to be due to differences in expression, such as the speed of induction of expression of CD80 antigen and CD86 antigen, enhancement of expression, and constitutive expression level [Saito, Saishin Igaku, 42, 2386 (1994)].
マウス心臓移植のモデルにおいて、 CD80抗原に対するモノクローナル抗体の投 与により CD80抗原の機能を抑制し心臓移植における拒絶反応を予防するための動物 モデル実験が報告されている。 このモデル系では、 ラッ ト抗マウス CD80モノクロ一 ナル抗体の投与によっても移植拒絶に対して効果が認められなかったが、 ラッ ト 抗マウス CD86モノクローナル抗体の投与では、 ある程度の移植心生着延長が認めら れ、 さらにラッ ト抗マウス CD80モノクロ一ナル抗体とラッ ト抗マウス CD86モノクロー ナル抗体の併用により移植心の生着が認められたことが報告されている [佐藤、 日本免疫学会総会 ·学術総会記録、 24、 390 (1994)] 。  In a mouse heart transplantation model, an animal model experiment has been reported to suppress the function of the CD80 antigen by administering a monoclonal antibody against the CD80 antigen and prevent rejection in heart transplantation. In this model system, administration of the rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody had no effect on transplant rejection, but administration of the rat anti-mouse CD86 monoclonal antibody did prolong some of the graft heart survival. In addition, it has been reported that transplantation of transplanted hearts was observed by the combined use of rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody and rat anti-mouse CD86 monoclonal antibody [Sato, General Meeting of the Immunological Society of Japan General Assembly Record, 24, 390 (1994)].
また、 CD80抗原及び CD86抗原の機能を阻害することにより免疫性疾患を治療す るための試みがなされている。 この試みでは、 CD28抗原と相同性を有し CD80及び CD86 抗原の両者に結合できる CTLA- 4に対して免疫グロプリンを融合して得られる CTLA -4-lg を用い、 多くの免疫性疾患動物モデルでの治療効果が検討されている [細胞 工学別冊 宮坂昌之監修 接着分子ハン ドブック、 128 (1994)秀潤社] 。 CTLA - 4 -I は、 CD80抗原と CD86抗原の両リガンドに結合してその機能を阻害することでは 免疫性疾患を改善する能力を有するが、 この抗体がイン ' ビボで作用している間 は他の抗原 （外来性の病因抗原など） に対しても免疫抑制または無反応状態にな ると考えられる。 また、 CTLA- 4- Ig は人工的に合成された蛋白であるため、 生体内 に投与する際の安全性が問題である。  Attempts have also been made to treat immune disorders by inhibiting the function of the CD80 and CD86 antigens. In this trial, CTLA-4-lg obtained by fusing immunoglobulin to CTLA-4, which has homology to CD28 antigen and can bind to both CD80 and CD86 antigens, Therapeutic effects are being studied [Cell Engineering Separate Volume Masayuki Miyasaka, Adhesion Molecule Handbook, 128 (1994) Shujunsha]. CTLA-4-I has the ability to ameliorate immune disease by binding to and inhibiting the function of both CD80 and CD86 antigens, but while this antibody is acting in vivo It may also be immunosuppressive or unresponsive to other antigens (such as exogenous etiological antigens). Also, since CTLA-4-Ig is an artificially synthesized protein, its safety when administered in vivo is a problem.
従って、 本発明の目的は、 免疫性疾患を簡便かつ正確に診断できる診断方法を 提供することにある。 具体的には、 本発明の目的は、 ヒ 卜から分離 '採取された 末梢血液などの体液を試料として用い、 種々の免疫性疾患を簡便かつ正確に診断 する方法を提供することにある。 また、 本発明の別の目的は、 種々の免疫性疾患 に対して汎用性のある簡便な免疫性疾患の診断方法を提供することにある。 免疫 性疾患の治療剤を提供することも本発明のさらに別の目的であり、 より具体的に は、 種々の免疫性疾患に対して有効性を示し、 免疫系のなかで異常を発現してい る部分に対して特異的に作用する免疫性疾患の治療剤を提供することが本発明の 目的である。 発明の開示 Therefore, an object of the present invention is to provide a diagnostic method capable of simply and accurately diagnosing an immune disease. Specifically, an object of the present invention was to separate and collect humans. An object of the present invention is to provide a method for simply and accurately diagnosing various immune diseases using a body fluid such as peripheral blood as a sample. Another object of the present invention is to provide a simple and versatile method for diagnosing immune diseases with respect to various immune diseases. It is still another object of the present invention to provide a therapeutic agent for an immune disease, and more specifically, it shows efficacy against various immune diseases and expresses abnormalities in the immune system. It is an object of the present invention to provide a therapeutic agent for an immunological disease that specifically acts on a certain portion. Disclosure of the invention
本発明者は上記の課題を解決すベく鋭意努力した結果、 CD80抗原の生物学的意義 を研究する過程において、 免疫性疾患の患者末梢リ ンパ球では CD80抗原陽性率が健 康正常成人に比較して高いこと、 並びに、 CD80抗原陽性率が疾患における免疫異常 を強く反映しており、 免疫性疾患の診断に有力であることを発見した。 また本発 明者は、 免疫性疾患において CD80抗原陽性率が高いという上記の知見に基づき、 免 疫性疾患の治療に排除性抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体が有効であることを見い出 した。 本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。  The present inventors have made intensive efforts to solve the above problems, and as a result, in the process of studying the biological significance of CD80 antigen, the positive rate of CD80 antigen in peripheral lymphocytes from patients with immunological diseases was normal in healthy adults. It was found that the ratio was relatively high, and that the positive rate of CD80 antigen strongly reflected immune abnormalities in the disease, and was effective in diagnosing immune diseases. In addition, the present inventors have found that an exclusionary anti-human CD80 monoclonal antibody is effective in treating an immunological disease based on the above finding that the CD80 antigen-positive rate is high. The present invention has been completed based on the above findings.
すなわち本発明は、 ヒ トから分雜採取した体液試料中に含まれるリ ンパ球の CD80 抗原陽性率を免疫学的に測定する工程を含む免疫性疾患の診断方法を提供するも のである。 本発明の好ましい態様によれば、 リンパ球がリ ンパ球亜群である上記 診断方法；体液が末梢血液である上記診断方法；免疫学的測定に CD80抗原を認識す る抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体を用いる上記診断方法；免疫学的測定に CD80抗原 を認識する抗ヒト CD80モノクローナル抗体とリンパ球亜群を認識するモノクローナ ル抗体とを組み合わせて用いる上記診断方法； リ ンパ球亜群を認識するモノクロ一 ナル抗体が、 抗ヒト CD3 モノクローナル抗体、 抗ヒ ト CD4 モノクローナル抗体、 抗 ヒ ト CD8 モノクローナル抗体、 抗ヒ ト CD19モノクローナル抗体、 抗ヒ ト CD20モノク ローナル抗体、 抗ヒ ト CD45RAモノクローナル抗体、 抗ヒ ト CD45ROモノクローナル抗 体、 抗ヒ ト CD25モノクローナル抗体、 及び抗ヒ ト HLA-DRモノクローナル抗体からな る群から選ばれる上記診断方法が提供される。  That is, the present invention provides a method for diagnosing an immune disease, comprising the step of immunologically measuring the CD80 antigen-positive rate of lymphocytes contained in a body fluid sample collected from humans. According to a preferred embodiment of the present invention, the above-mentioned diagnostic method, wherein the lymphocytes are a lymphocyte subgroup; the above-mentioned diagnostic method, wherein the body fluid is peripheral blood; an anti-human CD80 monoclonal antibody which recognizes the CD80 antigen for immunological measurement The above diagnostic method using a combination of an anti-human CD80 monoclonal antibody recognizing the CD80 antigen and a monoclonal antibody recognizing a lymphocyte subgroup for immunological measurement; Recognizing a lymphocyte subgroup Monoclonal antibodies are anti-human CD3 monoclonal antibody, anti-human CD4 monoclonal antibody, anti-human CD8 monoclonal antibody, anti-human CD19 monoclonal antibody, anti-human CD20 monoclonal antibody, anti-human CD45RA monoclonal antibody, anti-human A CD45RO monoclonal antibody, an anti-human CD25 monoclonal antibody, and an anti-human HLA-DR monoclonal antibody The diagnostic method selected from is provided.
上記発明の別の好ましい態様として、 免疫性疾患が自己免疫疾患、 全身性エリ テマトーデス、 慢性関節リウマチ、 混合性結合組織病、 特発性血小板減少性紫斑 病、 重症筋無力症、 多発性硬化症、 臓器移植に伴う拒絶反応症、 臓器移植もしく は輸血に伴う移植片対宿主反応病、 及びアレルギー疾患からなる群から選ばれる 上記診断方法；免疫学的測定がフローサイ トメ トリー、 蛍光抗体法、 または酵素 抗体法である上記診断方法；並びに、 さらに上記の CD80抗原陽性率を健常者から分 雜採取した体液試料中に含まれるリンパ球及び Z又はリンパ球亜群の CD80抗原陽性 率と比較する工程を含む上記診断方法が提供される。 In another preferred embodiment of the above invention, the immune disease is an autoimmune disease, Tematodes, rheumatoid arthritis, mixed connective tissue disease, idiopathic thrombocytopenic purpura, myasthenia gravis, multiple sclerosis, rejection associated with organ transplantation, graft transplantation with organ transplantation or blood transfusion The above diagnostic method selected from the group consisting of reactive diseases and allergic diseases; the above diagnostic method in which the immunological measurement is a flow cytometry, a fluorescent antibody method, or an enzyme antibody method; and the above CD80 antigen positive rate is normal. The present invention provides the above diagnostic method, comprising a step of comparing the lymphocyte and Z or lymphocyte subgroup CD80 antigen positive rate contained in a body fluid sample collected and collected from an individual.
また、 本発明により、 CD80抗原を認識する抗ヒ 卜 CD80モノクローナル抗体を有効 成分として含む免疫性疾患の診断用組成物が提供される。 この発明の好ましい態 様によれば、 ヒ 卜から分離採取した体液試料中に含まれるリ ンパ球及び/又はリ ンパ球亜群の CD80抗原陽性率を免疫学的に測定するために使用する上記診断用組成 物が提供される。  The present invention also provides a composition for diagnosing an immune disease, which comprises an anti-human CD80 monoclonal antibody that recognizes the CD80 antigen as an active ingredient. According to a preferred embodiment of the present invention, the above-mentioned method used for immunologically measuring the CD80 antigen positive rate of lymphocyte and / or lymphocyte subgroup contained in a body fluid sample separated and collected from a human. A diagnostic composition is provided.
さらに、 本発明によれば、 ヒ ト CD80抗原を特異的に認識する抗ヒ ト CD80抗体か らなる医薬、 及びヒ ト CD80抗原を特異的に認識する抗ヒ ト CD80抗体を有効成分とし て含む免疫性疾患の治療及び Z又は予防剤が提供される。 この発明の好ましい態 様によれば、 該抗体が抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体である上記治療及び Z又は予 防剤；該抗体がヒ ト体内においてヒ ト CD80陽性リンパ球排除能を有するモノ クロー ナル抗体である上記治療及びノ又は予防剤：該抗体がマウス抗ヒ ト CD80モノ クロー ナル抗体、 ラッ ト抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体、 ヒ ト抗ヒ ト CD80モノクローナル 抗体、 マウスーヒ トキメラ抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体、 ラッ ト一ヒ トキメラ抗 ヒ ト CD80モノクローナル抗体、 霊長類—ヒ トキメ,ラ抗ヒ ト CD80抗体モノクローナル 抗体から選ばれる上記治療及び 又は予防剤が提供される。  Further, according to the present invention, a drug comprising an anti-human CD80 antibody that specifically recognizes human CD80 antigen, and an anti-human CD80 antibody that specifically recognizes human CD80 antigen are contained as active ingredients. A therapeutic and / or prophylactic agent for an immune disease is provided. According to a preferred embodiment of the present invention, the above-mentioned therapeutic and / or Z-prophylactic agent, wherein the antibody is an anti-human CD80 monoclonal antibody; a monoclonal antibody having the ability to eliminate human CD80-positive lymphocytes in a human body The above therapeutic and / or prophylactic agent which is an antibody: the antibody is a mouse anti-human CD80 monoclonal antibody, a rat anti-human CD80 monoclonal antibody, a human anti-human CD80 monoclonal antibody, a mouse-human chimeric anti-human CD80 monoclonal antibody And a therapeutic and / or prophylactic agent selected from the group consisting of a rat chimeric anti-human CD80 monoclonal antibody, a primate human and an anti-human CD80 monoclonal antibody.
以上に加えて、 免疫性疾患の治療及び/又は予防方法であって、 免疫性疾患の 患者に対してヒ ト CD80抗原を特異的に認識する抗ヒ ト CD80抗体の有効量を投与する 工程を含む方法；該抗体が抗ヒト CD80モノクローナル抗体である上記方法；及び、 該抗体がヒ ト生体内で CD80陽性リンパ球排除能を有する抗ヒ 卜 CD80モノクローナル 抗体である上記方法；並びに、 免疫性疾患の治療及び/又は予防剤の製造のため のヒ ト CD80抗原を特異的に認識する抗ヒ ト CD80抗体の使用；該抗体が抗ヒ ト CD80 モノクローナル抗体である上記の使用；及び、 該抗体がヒ 卜生体内で CD80陽性リ ン ノ、。 ^^除能を有する抗ヒト CD80モノクローナル抗体である上記の使用が提供される。 図面の簡単な説明 In addition to the above, there is provided a method for treating and / or preventing an immune disease, comprising the step of administering an effective amount of an anti-human CD80 antibody that specifically recognizes a human CD80 antigen to a patient having the immune disease. The above method, wherein the antibody is an anti-human CD80 monoclonal antibody; and the above method, wherein the antibody is an anti-human CD80 monoclonal antibody capable of eliminating CD80-positive lymphocytes in a human body; Use of an anti-human CD80 antibody that specifically recognizes a human CD80 antigen for the manufacture of a therapeutic and / or prophylactic agent for the present invention; the above-mentioned use, wherein the antibody is an anti-human CD80 monoclonal antibody; and CD80 positive in vivo in humans No ,. ^^ Provided is a use as described above, which is an anti-human CD80 monoclonal antibody with capacity to kill. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
第 1図は、 健常成人 Aのリンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD3 モノクローナル抗体 （横 軸） とピオチン標識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体及びス トレプトァビジン -PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。  Figure 1 shows the results of analysis of the lymphocytes of healthy adult A stained with FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE (vertical axis). FIG.
第 2図は、 健常成人 Aのリ ンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD4 モノクローナル抗体 （横 軸） とビォチン標識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体及びス トレプトアビジン - PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。  Fig. 2 shows the analysis of lymphocytes from healthy adult A stained with FITC-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE (vertical axis). It is a figure showing a result.
第 3図は、 健常成人 Aのリンパ球を FITC標識抗ヒ 卜 CD19モノクローナル抗体 （横 軸） とピオチン標識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体及びス トレブトァビジン - PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。  Fig. 3 shows the results of analysis of lymphocytes of healthy adult A stained with FITC-labeled anti-human CD19 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE (vertical axis). FIG.
第 4図は、 SLE 患者 Bのリンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD3 モノクローナル抗体 （横 軸） とピオチン標識抗ヒ ト CD80モノ クローナル抗体及びス ト レプトァビジン -PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。  Fig. 4 shows the results of analysis of lymphocytes from SLE patient B stained with FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE (vertical axis). FIG.
第 5図は、 SLE患者 Bのリンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD4 モノクローナル抗体 （横 軸） とピオチン標識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体及びス トレプトァビジン - PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。  Fig. 5 shows the results of analysis of lymphocytes of SLE patient B stained with FITC-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody (horizontal axis), with biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). FIG.
第 6図は、 SLE 患者 Bのリンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD19モノクローナル抗体 （横 軸） とビォチン標識抗ヒ ト CD80モノク口一ナル抗体及びス トレプトァビジン -PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。  Fig. 6 shows the analysis of lymphocytes from SLE patient B stained with FITC-labeled anti-human CD19 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE (vertical axis). It is a figure showing a result.
第 7図は、 RA患者 Cのリンパ球を FITC標識抗ヒト CD3 モノクローナル抗体 （横軸） とピオチン標識抗ヒト CD80モノクローナル抗体及びストレプトアビジン- PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。  Fig. 7 shows the results of analysis of lymphocytes from RA patient C stained with FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal antibody (horizontal axis), and with biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). is there.
第 8図は、 RA患者 Cのリンパ球を FITC標識抗ヒト CD4 モノクローナル抗体 （横軸） とピオチン標識抗ヒト CD80モノクローナル抗体及びストレブトアビジン - PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。  Figure 8 shows the results of analysis of lymphocytes of RA patient C stained with FITC-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody (horizontal axis), and with biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). It is.
第 9図は、 RA患者 Cのリンパ球を FITC標識抗ヒト CD19モノクローナル抗体 （横軸） とピオチン標識抗ヒト CD80モノクローナル抗体及びストレプトァビジン -PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。 Fig. 9 shows lymphocytes of RA patient C with FITC-labeled anti-human CD19 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). It is a figure which shows the analysis result dye | stained with and.
第 10図は、 MCTD患者 Dのリンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD3 モノクローナル抗体 （横 軸） とビォチン標識抗ヒ ト CD80モノ クローナル抗体及びス ト レブトァビジン- PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。  Figure 10 shows the results of analysis of lymphocytes from MCTD patient D stained with FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE (vertical axis). FIG.
第 11図は、 MCTD患者 Dのリンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD4 モノクローナル抗体 （横 軸） とビォチン標識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体及びス ト レブトァビジン - PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。  Figure 11 shows the results of analysis of lymphocytes of MCTD patient D stained with FITC-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). FIG.
第 12図は、 MCTD患者 Dのリ ンパ球を FITC標識抗ヒ 卜 CD19モノクローナル抗体 （横 軸） とビォチン標識抗ヒ ト CD80モノ ク口一ナル抗体及びス ト レプトァビジン- PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図である。  Fig. 12 shows that lymphocytes of MCTD patient D were compared with FITC-labeled anti-human CD19 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). It is a figure which shows the analysis result dyed.
第 13図は、 各免疫性疾患と健康正常成人における全リンパ球、 CD3 抗原陽性リ ンパ球、 CD4 抗原陽性リ ンパ球、 CD8 抗原陽性リ ンパ球、 CD19抗原陽性リンパ球各 リ ンパ球亜群について CD80抗原陽性率を算出し、 陽性率の分布と平均値 （* ) をプ ロッ トした結果を示す図である。 縦軸はリンパ球、 またはリンパ球亜群における CD80抗原陽性率を示し、 図中、 SLE は全身性エリテマトーデスを、 RAは慢性関節リ ゥマチを、 MCTDは混合性結合組織病を示す。  Fig. 13 shows lymphocyte subgroups of all lymphocytes, CD3 antigen-positive lymphocytes, CD4 antigen-positive lymphocytes, CD8 antigen-positive lymphocytes, and CD19 antigen-positive lymphocytes in each immune disease and healthy healthy adult. FIG. 4 is a diagram showing the results obtained by calculating the CD80 antigen positive rate for, and plotting the distribution and average value (*) of the positive rate. The vertical axis indicates CD80 antigen positive rate in lymphocytes or lymphocyte subgroups. In the figure, SLE indicates systemic lupus erythematosus, RA indicates chronic rheumatoid arthritis, and MCTD indicates mixed connective tissue disease.
第 14図は、 SLE 患者 Eのリンパ球において CD4 抗原陽性及び CD80抗原陽性リ ン パ球分画における CD25抗原の発現の解析結果を示す図である。 縦軸は CD4 抗原の発 現、 横軸は CD25抗原の発現を示す。  FIG. 14 is a view showing the results of analyzing the expression of CD25 antigen in the CD4 antigen-positive and CD80 antigen-positive lymphocyte fractions in lymphocytes of SLE patient E. The vertical axis indicates the expression of CD4 antigen, and the horizontal axis indicates the expression of CD25 antigen.
第 15図は、 SLE 患者 Eのリ ンパ球において CD4 抗原陽性及び CD80抗原陽性リン パ球分画における CD45RA抗原の発現の解析結果を示す図である。 縦軸は CD4 抗原の 発現を、 横軸は CD45RA抗原の発現を示す。  FIG. 15 shows the results of analysis of CD45RA antigen expression in CD4 antigen-positive and CD80 antigen-positive lymphocyte fractions in lymphocytes of SLE patient E. The vertical axis shows the expression of CD4 antigen, and the horizontal axis shows the expression of CD45RA antigen.
第 16図は、 SLE 患者 Eのリンパ球において CD4 抗原陽性及び CD80抗原陽性リン パ球分画における CD45RO抗原の発現の解析結果を示す図である。 縦軸は CD4 抗原の 発現を、 横軸は CD45RO抗原の発現を示す。  FIG. 16 shows the results of analysis of the expression of CD45RO antigen in CD4 antigen-positive and CD80 antigen-positive lymphocyte fractions in lymphocytes of SLE patient E. The vertical axis shows the expression of CD4 antigen, and the horizontal axis shows the expression of CD45RO antigen.
第 17図は、 SLE 患者 Eのリンパ球において CD4 抗原陽性及び CD80抗原陽性リン パ球分画における HLA-DR抗原の発現の解析結果を示す図である。 縦軸は CD4 抗原の 発現を、 横軸は HLA-DR抗原の発現を示す。  FIG. 17 shows the results of analysis of the expression of HLA-DR antigen in CD4 antigen-positive and CD80 antigen-positive lymphocyte fractions in lymphocytes of SLE patient E. The vertical axis shows the expression of the CD4 antigen, and the horizontal axis shows the expression of the HLA-DR antigen.
第 18図は、 Ml- 18 の PFC assay における抗体産生排除効果を示す図である。 縦 軸は対照群での PFC数に対する抗体産生細胞傷害効果を PFC形成抑制率で示し、 横 軸は MI-18 の投与 iを示す。 FIG. 18 shows the effect of Ml-18 on eliminating antibody production in the PFC assay. Vertical The axis shows the PFC formation inhibitory effect on the number of PFCs in the control group by the PFC formation inhibitory rate, and the horizontal axis shows the administration i of MI-18.
第 19図は、 DTH を指標とする排除性抗マウス CD80抗体の細胞性免疫反応に対す る抑制効果を示す図である。 図中、 * は Pく 0. 05 ;林は pく 0. 01であることを示す。 発明を実施するための最良の形態  FIG. 19 is a graph showing the inhibitory effect of an exclusion anti-mouse CD80 antibody on cell-mediated immune response using DTH as an index. In the figure, * indicates P <0.05; Hayashi indicates p <0.01. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明の診断方法は、 ヒ 卜から分離採取した体液、 例えば血液、 好ましくは末 梢血液などを試料として用い、 該試料中に含まれるリンパ球及びノ又はリンパ球 亜群における CD80抗原陽性率を免疫学的に測定する工程を含んでいる。 本発明の診 断方法の対象となる免疫性疾患は免疫系に異常のある疾患であれば特に限定され ないが、 例えば、 自己免疫疾患、 全身性エリテマトーデス、 慢性関節リウマチ、 混合性結合組織病、 特発性血小板減少性紫斑病、 重症筋無力症、 多発性硬化症、 臓器移植に伴う拒絶反応症、 臓器移植もしくは輸血に伴う移植片対宿主反応病、 及びァレルギ一疾患などの免疫性疾患を本発明の方法により診断することが可能 である。 免疫学的測定法は特に限定されないが、 例えば、 フローサイ トメ トリー、 蛍光抗体法、 または酵素抗体法など当業者に利用可能な測定方法を用いることが できる。  The diagnostic method of the present invention uses a body fluid separated and collected from a human, such as blood, preferably peripheral blood, as a sample, and determines the CD80 antigen positive rate in lymphocytes and lymphocytes or lymphocyte subgroups contained in the sample. It includes a step of measuring immunologically. The immune disease targeted by the diagnostic method of the present invention is not particularly limited as long as it is a disease having an abnormal immune system.Examples include an autoimmune disease, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, mixed connective tissue disease, Immune diseases such as idiopathic thrombocytopenic purpura, myasthenia gravis, multiple sclerosis, rejection associated with organ transplantation, graft-versus-host reaction associated with organ transplantation or blood transfusion, and allergic disease Diagnosis is possible by the method of the invention. The immunological measurement method is not particularly limited, and for example, a measurement method available to those skilled in the art such as flow cytometry, fluorescent antibody method, or enzyme antibody method can be used.
免疫学的測定法には、 特異的に CD80抗原を認識するモノクローナル抗体を単独 で用いてもよいが、 CD80抗原を認識するモノクローナル抗体を他のリンパ球亜群を 認識するモノクローナル抗体と組み合わせて用いてもよい。 このような組み合わ せにより、 本発明の診断方法をより効率的かつ正確に行うことができるので、 上 記の組み合わせを用いる態様は本発明の好ましい態様である。 抗リ ンパ球亜群モ ノクローナル抗体としては、 例えば、 T細胞を同定するために特異的に CD3 抗原を 認識するモノクローナル抗体、 T細胞の亜群を同定するために特異的に CD4 抗原を 認識するモノクローナル抗体、 T細胞の亜群を同定するために特異的に CD8 抗原を 認識するモノクローナル抗体、 B細胞を同定するために特異的に CD19抗原を認識す るモノクローナル抗体、 及び B細胞を同定するために特異的に CD20を認識するモノ クローナル抗体などの 1種または 2種以上を用いることができ、 好ましくは、 抗 ヒ ト CD3 モノクローナル抗体、 抗ヒ ト CD4 モノクローナル抗体、 抗ヒ ト CD8 モノク ローナル抗体、 抗ヒ ト CD19モノクローナル抗体、 抗ヒ ト CD20モノクローナル抗体、 抗ヒ ト CD45RAモノクローナル抗体、 抗ヒ ト CD45ROモノクローナル抗体、 抗ヒ ト CD25 モノクローナル抗体、 及び抗ヒ ト HLA— DRモノクローナル抗体などを用いることが できる。 これらの抗リ ンパ球亜群モノクローナル抗体を用いて、 2カラーまたは 3カラーフローサイ トメ トリー、 蛍光 2重染色、 酵素 2重染色等により測定を行 うことができる。 また、 これらの抗リンパ球亜群モノクローナル抗体は公知であ り、 それ自体既知の方法により製造、 または市販のものを入手することができる。 上記の免疫測定法に用いられる標識蛍光色素としては、 フルォレツセンスイソ チアネート（FITC)、 ファイコエリスリ ン（PE)、 FITC及び PEと蛍光波長を異にするフ ローサイ トメ トリー用蛍光色素、 例えば QuamtuDi Red (Sigma) ^ Cy-Chrome(ParMingen) 等を用いることができ、 標識酵素としては、 アルカリフォスファターゼ（ALP) また は西洋ヮサビペルォキシダーゼ（HRP) またはベータガラク トシダーゼ（GLA) などを 用いることができる。 CD80抗原陽性リ ンパ球の検出には、 抗 CD80モノクローナル抗 体に上記の標識蛍光色素を直接結合するか、 または抗 CD80モノクローナル抗体をビ ォチンで標識し、 アビジンまたはストレプトアビジン標識 PEと複合体を形成させる ピオチンーストレプトアビジン法を用いることにより、 CD80抗原陽性リンパ球を感 度よく測定し、 再現性よく CD80抗原陽性リンパ球の末梢血液中リンパ球における比 率を求めることができる。 このような工程を含む方法は本発明の好ましい態様で ある。 なお、 下記に示す実施例中に示されたモノ クローナル抗体は、 本発明の方 法に特に好ましいモノクローナル抗体である。 For immunoassays, a monoclonal antibody that specifically recognizes the CD80 antigen may be used alone, but a monoclonal antibody that recognizes the CD80 antigen is used in combination with a monoclonal antibody that recognizes another lymphocyte subgroup. You may. With such a combination, the diagnostic method of the present invention can be performed more efficiently and accurately. Therefore, an embodiment using the above combination is a preferable embodiment of the present invention. Anti-lymphocyte subgroup monoclonal antibodies include, for example, a monoclonal antibody that specifically recognizes the CD3 antigen to identify T cells, and a CD4 antigen that specifically recognizes a subgroup of T cells Monoclonal antibodies, monoclonal antibodies that specifically recognize the CD8 antigen to identify subgroups of T cells, monoclonal antibodies that specifically recognize the CD19 antigen to identify B cells, and B cells One or two or more monoclonal antibodies that specifically recognize CD20 can be used, and preferably, an anti-human CD3 monoclonal antibody, an anti-human CD4 monoclonal antibody, or an anti-human CD8 monoclonal antibody. Use monoclonal antibody, anti-human CD19 monoclonal antibody, anti-human CD20 monoclonal antibody, anti-human CD45RA monoclonal antibody, anti-human CD45RO monoclonal antibody, anti-human CD25 monoclonal antibody, anti-human HLA-DR monoclonal antibody, etc. be able to. Using these anti-lymphocyte subgroup monoclonal antibodies, measurement can be performed by two-color or three-color flow cytometry, fluorescent double staining, enzyme double staining, or the like. In addition, these anti-lymphocyte subgroup monoclonal antibodies are known, and can be produced by a method known per se or commercially available. Labeled fluorescent dyes used in the above immunoassay include fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), FITC and fluorescent dyes for flow cytometry having a different fluorescence wavelength from PE, For example, QuamtuDi Red (Sigma) ^ Cy-Chrome (ParMingen) or the like can be used. As a labeling enzyme, alkaline phosphatase (ALP) or horseradish peroxidase (HRP) or beta-galactosidase (GLA) is used. be able to. For detection of CD80 antigen-positive lymphocytes, the labeled fluorescent dye is directly bound to the anti-CD80 monoclonal antibody, or the anti-CD80 monoclonal antibody is labeled with biotin, and a complex with avidin or streptavidin-labeled PE is used. By using the biotin streptavidin method to be formed, CD80 antigen-positive lymphocytes can be measured with good sensitivity, and the ratio of CD80 antigen-positive lymphocytes to peripheral blood lymphocytes can be determined with good reproducibility. A method including such a step is a preferred embodiment of the present invention. The monoclonal antibodies shown in the examples below are particularly preferred monoclonal antibodies for the method of the present invention.
本発明の診断方法には、 本発明の一態様である抗ヒ ト CD80モノ クローナル抗体 を有効成分として含む診断用組成物を用いることが好ましい。 また、 本発明の診 断方法では、 上記の免疫学的測定法により CD80抗原陽性率を測定することを特徴と しているので、 例えば、 あらかじめ健常者から分離 ·採取した末梢血液中のリ ン パ球またはリンパ球亜群における標準的な CD80抗原陽性率を求めておき、 この陽性 率と被検試料における陽性率を比較することにより、 免疫性疾患の特定を効率的 かつ正確に行うことができる。 また、 本発明の診断方法により免疫性疾患を正確 に診断するためには、 各種の典型的な免疫性疾患について疾患別の CD80抗原陽性率 を調べた結果を蓄積しておくことが望ましい。 自己免疫疾患の患者末梢血液中のリ ンパ球における CD80抗原陽性率をフローサ ィ トメ トリーで検討した結果を一例として説明すると、 全リ ンパ球における CD80 抗原陽性率が健常成人で 4. 8¾であるのに対し、 SLE で 11. 7%、 RAで 6. 2%、 MCTDで 6. である。 また、 リ ンパ球亜群を認識するモノクローナル抗体を用いた 2カラーフ ローサイ トメ トリーにより測定すると、 CD3 抗原陽性リ ンパ球における CD80抗原陽 性率は健常成人で 1. 4¾、 SLE で 4. 2¾i、 RAで 2. 6!¾、 MCTDで 2. 9¾； CD4 抗原陽性リンパ 球における CD80抗原陽性率は、 健康正常成人で 3. 2%、 SLE で 8. 1¾、 RAで 4. 、 CTD で 5. 0¾； CD8 抗原陽性リ ンパ球における CD80抗原陽性率は健康正常成人で 0. 5¾、 SLE で 1. 7¾、 RAで 1. 1¾S、 MCTDで 0. 7¾； CD19抗原陽性リンパ球における CD80抗原陽性率 は健康正常成人で 35. 4!¾、 SLE で 67. 8¾、 RAで 48. 8¾、 MCTDで 55· 3!¾ である。 In the diagnostic method of the present invention, it is preferable to use a diagnostic composition containing the anti-human CD80 monoclonal antibody of one embodiment of the present invention as an active ingredient. In addition, the diagnostic method of the present invention is characterized in that the CD80 antigen positive rate is measured by the above-described immunological assay, and thus, for example, phosphorus in peripheral blood previously separated and collected from healthy subjects By determining the standard CD80 antigen positive rate in papillocytes or lymphocyte subgroups and comparing this positive rate to the positive rate in the test sample, it is possible to identify immune diseases efficiently and accurately. it can. In addition, in order to accurately diagnose an immune disease by the diagnostic method of the present invention, it is desirable to accumulate the results of examining the CD80 antigen positive rate of various typical immune diseases by disease. An example of flow cytometry analysis of the positive rate of CD80 antigen on lymphocytes in the peripheral blood of patients with autoimmune diseases is as follows.The positive rate of CD80 antigen on all lymphocytes is 4.8% in healthy adults. On the other hand, SLE is 11.7%, RA is 6.2%, and MCTD is 6. When measured by two-color flow cytometry using a monoclonal antibody that recognizes lymphocyte subgroups, the CD80 antigen positive rate in CD3 antigen-positive lymphocytes was 1.4¾ in healthy adults and 4.2¾i in SLE. 2.6! ¾ in RA, 2.9¾ in MCTD; CD80 antigen-positive rate in CD4 antigen-positive lymphocytes was 3.2% in healthy healthy adults, 8.1¾ in SLE, 4.¾ in RA, 4. and 5 in CTD. 0¾; CD80 antigen-positive rate in CD8 antigen-positive lymphocytes is 0.5¾ in healthy normal adults, 1.7¾ in SLE, 1.1¾S in RA, 0.7¾ in MCTD; CD80 antigen-positive rate in CD19 antigen-positive lymphocytes Is 35.4! ¾ for normal healthy adults, 67.8¾ for SLE, 48.8¾ for RA, and 55.3! MC for MCTD.
また、 3カラ—フローサイ トメ トリ一解析によれば、 CD3 抗原または CD4 抗原 陽性リンパ球における CD80抗原陽性リンパ球は、 CD45RA抗原陰性、 CD45RO抗原陽性、 CD25抗原陽性、 HLA- DR抗原一部陽性の活性化 CD4 抗原陽性リンパ球であることが判 明している。 従って、 自己免疫性疾患の患者では、 B リ ンパ球における CD80抗原陽 性率が正常人に比較して高く、 Tリ ンパ球では特に CD4 抗原陽性 Tリ ンパ球に CD80 抗原陽性リンパ球が認められ、 CD4 抗原陽性リンパ球における CD80抗原陽性率が高 く、 さらに CD4 抗原陽性リンパ球における CD80抗原陽性リンパ球は活性化 CD4 抗原 陽性リ ンパ球であるという特徴がある。 なお、 本発明の方法の適用対象は自己免 疫性疾患に限定されることはなく、 上記のような免疫系の異常を本発明の方法に よつて把握することにより、 種々の免疫性疾患の診断が可能である。  In addition, according to 3-color flow cytometry analysis, CD80 antigen-positive lymphocytes among CD3 antigen or CD4 antigen-positive lymphocytes showed CD45RA antigen negative, CD45RO antigen positive, CD25 antigen positive, and HLA-DR antigen partially positive. Activated CD4 antigen-positive lymphocytes have been identified. Therefore, patients with autoimmune disease have higher CD80 antigen positivity in B lymphocytes than in normal subjects, and T lymphocytes have CD80 antigen-positive lymphocytes, especially CD4 antigen-positive T lymphocytes. The CD4 antigen-positive lymphocytes have a high CD80 antigen-positive rate, and the CD4 antigen-positive lymphocytes have the characteristic that they are activated CD4 antigen-positive lymphocytes. The subject to which the method of the present invention is applied is not limited to self-immune diseases, but by grasping the abnormalities of the immune system as described above by the method of the present invention, various immune diseases can be treated. Diagnosis is possible.
いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、 上記に一例として説明した自 己免疫疾患の患者の Bリンパ球における高 CD80抗原陽性率は、 自己抗体を含む高免 疫グロプリン血症を反映しており、 CD4 抗原陽性 Tリンパ球における CD80抗原陽性 率は、 活性化 CD4 抗原陽性 Tリンパ球の增加による免疫系の活性化を反映しててい ることから、 CD80抗原陽性リンパ球が免疫疾患の発症に関与していることが強く示 唆される。 本発明により提供される医薬、 例えば免疫性疾患の治療及びノ又は予 防剤の有効成分であるヒ ト CD80抗原を特異的に認識する抗ヒ ト CD80抗体、 好ましく は抗ヒト CD80モノクローナル抗体は、 CD80抗原陽性リンパ球を生体内において殺傷 · 排除することができ、 疾患特異的な免疫異常を改善し、 あるいはそのような異常 を予防することができる。 Without being bound by any particular theory, the high prevalence of CD80 antigen on B lymphocytes in patients with autoimmune diseases described above as an example reflects hyperimmune globulinemia, including autoantibodies. The CD80 antigen-positive rate of CD4 antigen-positive T lymphocytes reflects the activation of the immune system due to the addition of activated CD4 antigen-positive T lymphocytes. It is strongly suggested that they are involved in The medicament provided by the present invention, for example, an anti-human CD80 antibody, preferably an anti-human CD80 monoclonal antibody, which specifically recognizes a human CD80 antigen which is an active ingredient of a therapeutic and / or prophylactic agent for an immune disease, CD80 antigen-positive lymphocytes can be killed and eliminated in vivo, improving disease-specific immune abnormalities, or such abnormalities Can be prevented.
すなわち、 本発明の治療及び 又は予防剤は、 CD80抗原陽性 Bリンパ球を排除 することにより、 自己抗体を含む高免疫グロプリン血症を改善し自己抗体の産生 を抑制する作用を有している。 このような作用を有する本発明の治療及びノ又は 予防剤は、 特に自己抗体が主たる原因である器官特異的自己免疫性疾患、 自己抗 体の関与が強く疑われるループス肾炎、 あるいは IgE 抗体が原因のアレルギー性疾 患の治療及び Z又は予防に有用である。 また、 本発明の治療及び 又は予防剤は、 CD80抗原陽性 CD4 抗原陽性 Tリンパ球、 すなわち活性化 CD4 抗原陽性 Tリンパ球を 排除する作用を有しているので、 臓器移植の拒絶反応、 移植片対宿主反応病、 RA、 SLE の治療及び Z又は予防に有用である。 さらに、 CD80抗原を発現する B細胞は抗 原提示細胞として機能していることから、 本発明の治療及び/又は予防剤は、 自 己免疫性疾患における自己反応性 T細胞の活性化抑制、 臓器移植における移植抗 原反応性 T細胞の活性化抑制、 移植片対宿主反応病における宿主抗原反応性 T細 胞の活性化抑制、 アレルギー性疾患におけるアレルゲン反応性 T細胞の活性化抑 制にも有効である。  That is, the therapeutic and / or prophylactic agent of the present invention has an effect of improving hyperimmune globulinemia including autoantibodies and suppressing the production of autoantibodies by eliminating CD80 antigen-positive B lymphocytes. The therapeutic and / or prophylactic agent of the present invention having such an effect is particularly caused by an organ-specific autoimmune disease in which autoantibodies are the main cause, lupus inflammation in which the involvement of autoantibodies is strongly suspected, or IgE antibodies. It is useful for treating and preventing or preventing allergic diseases. In addition, the therapeutic and / or prophylactic agent of the present invention has an action of eliminating CD80 antigen-positive CD4 antigen-positive T lymphocytes, that is, activated CD4 antigen-positive T lymphocytes. It is useful for treating and / or preventing Z-prevention disease, RA and SLE. Furthermore, since the B cells expressing the CD80 antigen function as antigen-presenting cells, the therapeutic and / or prophylactic agent of the present invention can suppress the activation of autoreactive T cells in autoimmune diseases, Inhibits transplant antigen-reactive T cell activation in transplantation, suppresses host antigen-reactive T cell activation in graft-versus-host reaction disease, and is also effective in suppressing allergen-reactive T cell activation in allergic disease It is.
従って、 本発明の治療及びノ又は予防剤は、 自己免疫疾患、 全身性エリテマト— デス、 慢性関節リウマチ、 混合性結合組織病、 特発性血小板減少性紫斑病、 重症 筋無力症、 多発性硬化症、 臓器移植に伴う拒絶反応症、 臓器移植もしくは輸血に 伴う移植片対宿主反応病、 及びアレルギー疾患などの免疫性疾患の治療及びノ又 は予防に有用である。 なお、 本発明の医薬の作用機序を説明したが、 本発明の医 薬の適当対象はこれらの作用機序によって限定されることはない。 なお、 有効成 分である上記モノクローナル抗体の投与量は、 治療や予防の目的、 治療または予 防すべき疾患の種類、 患者の症状、 体重、 年齢や性別等を考慮して適宜決定すれ ばよいが、 通常の場合、 成人 1日あたり静脈內投与により 10 mg〜500 rag程度を投 与することができる。 このような投与量を 1 日あたり 1〜数回に分けて投与する のが望ましい。  Therefore, the therapeutic and / or prophylactic agent of the present invention may be used for autoimmune disease, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, mixed connective tissue disease, idiopathic thrombocytopenic purpura, myasthenia gravis, multiple sclerosis It is useful for treating and / or preventing immune diseases such as rejection diseases associated with organ transplantation, graft-versus-host reaction disease associated with organ transplantation or blood transfusion, and allergic diseases. Although the mechanism of action of the medicament of the present invention has been described, an appropriate target of the medicament of the present invention is not limited by these mechanisms of action. The dosage of the above-mentioned monoclonal antibody, which is an active ingredient, may be appropriately determined in consideration of the purpose of treatment or prevention, the type of disease to be treated or prevented, the patient's symptoms, weight, age, sex, etc. However, usually, an adult can receive about 10 mg to 500 rag per day by intravenous administration. It is desirable to administer such a dosage in one or several divided doses per day.
本発明の医薬の有効成分である抗ヒ ト CD80抗体のうち、 例えば、 抗ヒ ト CD80モ ノクローナル抗体は公知であり、 例えば市販のものを入手することもできる。 本 発明の医薬の有効成分としては、 生体内においてヒ ト CD80陽性リンパ球排除能を有 する抗ヒ ト CD80抗体モノクローナル抗体を用いることが好ましい。 モノクローナル 抗体としては、 マウス、 ラッ ト、 ヒ トなどの哺乳類由来のものや、 マウスーヒ 卜 キメラ抗体、 ラッ トーヒ トキメラ抗体、 霊長類一ヒ トキメラ抗体などを用いるこ とができる。 このようなモノクローナル抗体は、 治療の目的などに応じて適宜選 択すればよく、 またモノクローナル抗体自体の製造方法は当業者に周知の技術で あ O 0 Among the anti-human CD80 antibodies which are the active ingredients of the medicament of the present invention, for example, an anti-human CD80 monoclonal antibody is known, and for example, a commercially available one can be obtained. The active ingredient of the medicament of the present invention has the ability to exclude human CD80-positive lymphocytes in vivo. Preferably, an anti-human CD80 antibody monoclonal antibody is used. As the monoclonal antibody, those derived from mammals such as mouse, rat, and human, chimeric mouse-human antibody, rat chimeric antibody, primate human chimeric antibody, and the like can be used. Such monoclonal antibodies may be appropriately selection depending on the purpose of the treatment, also production method Oh O 0 in techniques well known to those skilled in the art of monoclonal antibody per se
本発明の医薬を投与する場合、 抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体の 1種又は 2種 以上を有効成分とする医薬組成物を用いることが好ましい。 このような医薬組成 物としては、 注射剤などの非経口投与用の製剤を用いることが好ましい。 非経口 投与用の製剤は、 一般には、 有効成分である上記モノクローナル抗体と滅菌媒体 とを含有する液体単位投与量製剤として提供され、 通常、 上記モノクローナル抗 体を媒体に溶解させて滅菌濾過し、 次に適当なバイアル又はアンプルに充填して 密封することにより製造される。 安定性を高めるために、 組成物を凍結させた後 にバイアル中に充填し、 水を真空下で除去してもよい。 非経口懸濁液は、 実質的 に非経口溶液の場合と同じ方法で製造されるが、 有効成分を媒体に懸濁させてェ チレンォキシドなどにより滅菌することにより好適に製造できる。 また、 有効成 分が均一分布となるように、 必要に応じて界面活性剤、 湿潤剤等を添加してもよ く、 また、 他の医薬の有効成分を配合することも可能である。  When administering the medicament of the present invention, it is preferable to use a pharmaceutical composition containing one or more anti-human CD80 monoclonal antibodies as an active ingredient. As such a pharmaceutical composition, it is preferable to use a preparation for parenteral administration such as an injection. A preparation for parenteral administration is generally provided as a liquid unit dose preparation containing the above-mentioned monoclonal antibody as an active ingredient and a sterile medium. Usually, the above-mentioned monoclonal antibody is dissolved in a medium, and sterilized and filtered. It is then made by filling into suitable vials or ampoules and sealing. To enhance stability, the composition may be filled into vials after freezing and the water removed under vacuum. Parenteral suspensions are prepared substantially in the same manner as for parenteral solutions, but can be suitably prepared by suspending the active ingredient in a vehicle and sterilizing the suspension with ethylenoxide or the like. Further, a surfactant, a wetting agent and the like may be added as necessary so that the active ingredient has a uniform distribution, and it is also possible to mix an active ingredient of another medicine.
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれ らの実施例により限定されることはない。 実施例  Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples. Example
各実施例において用いた材料及び方法は以下のとおりである。  The materials and methods used in each example are as follows.
(A) リ ンパ球の分離  (A) Separation of lymph spheres
自己免疫性疾患の患者より採取したへパリン （ノボ） 加静脈血 10 mlより Ficoll -Paque (フアルマシア） による比重遠心法により単核球を分離し、 0. 1% BSA (Sigma) -PBSで 2回洗浄後下記モノクローナル抗体で染色した。  Mononuclear cells were separated from 10 ml of heparin (Novo) venous blood collected from patients with autoimmune diseases by specific gravity centrifugation using Ficoll-Paque (Pharmacia) and 0.1% BSA (Sigma) -PBS. After washing twice, the cells were stained with the following monoclonal antibody.
(B) リンパ球の染色に用いた標識抗体  (B) Labeled antibody used for staining lymphocytes
モノクローナル抗体は全てマウスハイプリ ドーマ由来のものを用いた。 (C) CD80抗原の染色に用いた標識抗体 All monoclonal antibodies were derived from mouse hybridomas. (C) Labeled antibody used for staining of CD80 antigen
ピオチン化キッ ト （アメ リカンコーレックス） を用いピオチン標識したビォチ ン標識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体 （L304. 7； Becton Dickinson) とピオチン標 識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体と組み合わせて使用するストレブ卜アビジン- PE (Becton Dickinson)を用いた 0 Streptavidin used in combination with a biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody (L304.7; Becton Dickinson) and a biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody using a biotinylated kit (American Corex). - 0 with PE (Becton Dickinson)
(D) CD80抗原の陰性コントロールによる染色に用いた標識抗体  (D) Labeled antibody used for staining with CD80 antigen negative control
ピオチン化キッ ト （アメ リカンコーレックス） を用いピオチン標識したビォチ ン標識抗 KLH モノクローナル抗体 （X40 ； Becton Dickinson) とピオチン標識抗 KLH モノクローナル抗体と組み合わせて使用するス トレプトァビジン- PE (Becton Dickinsoru ¾r用いた o  A biotin-labeled anti-KLH monoclonal antibody (X40; Becton Dickinson) labeled with a biotin-labeled kit (American Corex) and streptavidin-PE (Becton Dickinsoru®) used in combination with a biotin-labeled anti-KLH monoclonal antibody were used. o
(E) リ ンパ球亜群の染色に用いた蛍光標識抗体  (E) Fluorescently labeled antibody used to stain lymphocyte subgroups
リンパ球亜群の染色は下記 FITC または Quantum Red 標識モノクローナル抗体を 用いた。  For staining of lymphocyte subgroups, the following FITC or Quantum Red-labeled monoclonal antibodies were used.
FITC標識抗ヒ ト CD3 モノクローナル抗体 （UCHT- 1； Sigma )  FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal antibody (UCHT-1; Sigma)
FITC標識抗ヒ ト CD4 モノク口一ナル抗体 （Q4120 ； Sigma )  FITC-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody (Q4120; Sigma)
FITC標識抗ヒ ト CD8 モノクローナル抗体 （UCHT- 4 ； Sigma )  FITC-labeled anti-human CD8 monoclonal antibody (UCHT-4; Sigma)
FITC標識抗ヒ ト CD19モノ ク ローナル抗体 （SJ25- C1 ； Sigma )  FITC-labeled anti-human CD19 monoclonal antibody (SJ25-C1; Sigma)
FITC標識抗ヒ ト CD25モノクローナル抗体 （M- A251 ； Phar Mingen )  FITC-labeled anti-human CD25 monoclonal antibody (M-A251; Phar Mingen)
FITC標識抗ヒ ト CD45ROモノ クローナル抗体 （UCHL - 1 ； Sigma )  FITC-labeled anti-human CD45RO monoclonal antibody (UCHL-1; Sigma)
FITC標識抗ヒ ト HLA- DRモノクローナル抗体 （L243 ； Becton Dickinson) FITC-labeled anti-human HLA-DR monoclonal antibody (L243; Becton Dickinson)
Quantum Red 標識抗ヒ ト CD3 モノクローナル抗体 （UCHT- 1 ； Sigma ) Quantum Red labeled anti-human CD3 monoclonal antibody (UCHT-1; Sigma)
Quantum Red 標識抗ヒ ト CD4 モノク口一ナル抗体 （Q4120 ； Sigma )  Quantum Red-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody (Q4120; Sigma)
(F) リンパ球亜群の陰性コントロールによる染色に用いた蛍光標識抗体  (F) Fluorescently labeled antibody used for staining of lymphocyte subgroups by negative control
リンパ球亜群の陰性コントロールとして下記 FITCまたは Quantum Red 標識モノク ローナル抗体を用いた。  The following FITC or Quantum Red-labeled monoclonal antibody was used as a negative control for lymphocyte subgroups.
FITC標識マウス IgGlモノ ク ローナル抗体 （M0PC21 ； Sigma )  FITC-labeled mouse IgG1 monoclonal antibody (M0PC21; Sigma)
FITC標識マウス IgG2aモノ クローナル抗体 （UPC- 10 ； Sigma )  FITC-labeled mouse IgG2a monoclonal antibody (UPC-10; Sigma)
Quantum Red 標識マウス IgGlモノ クローナル抗体 （M0PC21 ； Sigma )  Quantum Red-labeled mouse IgGl monoclonal antibody (M0PC21; Sigma)
(G) 細胞の染色方法 2カラーフローサイ トメ トリ一解析のためのリンパ球の染色は、 以下の方法で 行った。 リ ンパ球の分離の項の方法で調整された単核球 l x lO6〜5 x l06 個を至 適澳度に調整したビォチン標識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体またはピオチン標識 抗 KLH抗体と 4 で 30分間反応させ、 0. 1¾ BSA-PBSで一回洗浄後、 ス トレプトアビ ジン- PE を 4 °Cで 30分間遮光下で反応させた。 0. 1¾ BSA-PBSで一回洗浄後、 FITC 標識抗ヒト CD3 モノクローナル抗体、 FITC標識抗ヒト CD4 モノクローナル抗体、 FITC 標識抗ヒ ト CD8 モノクローナル抗体、 FITC標識抗ヒト CD19モノクローナル抗体、 FITC 標識抗ヒ ト HLA-DRモノクローナル抗体、 FITC標識陰性コントロール抗体を 4 °Cで 30 分間遮光下で反応させ、 さらに 0. 1¾ BSA- PBSで一回洗浄後、 2¾パラホルムアルデヒ ド- PBSで固定した。 フローサイ トメ トリー解析まで 4 で遮光保存した。 (G) Cell staining method (2) Staining of lymphocytes for color flow cytometry analysis was performed by the following method. In Biochin labeled anti human CD80 monoclonal antibody or Piochin labeled anti-KLH antibody and 4 was adjusted l0 6 cells mononuclear lx lO 6 to 5 x adjusted by the method of claim separation of lymphocytes optimally澳度After reacting for 30 minutes and washing once with 0.1¾ BSA-PBS, streptavidin-PE was reacted at 4 ° C. for 30 minutes under light shielding. 0.1¾ After washing once with BSA-PBS, FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal antibody, FITC-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody, FITC-labeled anti-human CD8 monoclonal antibody, FITC-labeled anti-human CD19 monoclonal antibody, FITC-labeled anti-human An HLA-DR monoclonal antibody and a FITC-labeled negative control antibody were reacted at 4 ° C for 30 minutes under light shielding, washed once with 0.1¾ BSA-PBS, and fixed with 2¾ paraformaldehyde-PBS. Stored in 4 light shielded until flow cytometry analysis.
3カラ—フローサイ トメ トリー解析のためのリンパ球の染色は、 以下の方法で 行った。 リンパ球の分離の項の方法で調製された単核球 l x lO6〜5 x l0。 個を 至適濃度に調整したピオチン標識抗ヒト CD80モノクローナル抗体またはピオチン標 識抗 KLH抗体と 4 で 30分間反応させ、 0. 1¾ BSA-PBSで一回洗浄後、 ス トレブトァ ビジン- PE を 4てで 30分間遮光下で反応させた。 0. 1¾ BSA-PBSで一回洗浄後、 FITC 標識抗ヒ ト CD25モノクローナル抗体、 FITC標識抗ヒ ト CD45RAモノクローナル抗体、 FITC標識抗ヒ ト CD45R0モノクローナル抗体、 FITC標識抗ヒ ト HLA-DRモノクローナル 抗体、 FITC標識陰性コントロール抗体を 4 で 30分間遮光下で反応させ、 0. 1¾ BSA - PBSで一回洗浄後、 Quantum Red 標識抗ヒ ト CD3 モノクローナル抗体、 Quantum Red 標識抗ヒ ト CD4 モノクローナル抗体、 Quantum Red 標識陰性コントロール抗体 を 4 で 30分間遮光下で反応させ、 0. 1% BSA-PBSで一回洗浄後、 2¾パラホルムアル デヒ ド -PBSで固定した。 フローサイ トメ トリー解析まで 4 で遮光保存した。 The staining of lymphocytes for 3-color flow cytometry analysis was performed by the following method. Mononuclear prepared in terms of the method of separation of lymphocytes lx lO 6 ~5 x l0. After reacting the cells with the anti-human CD80 monoclonal antibody or the anti-KLH antibody labeled with biotin adjusted to the optimal concentration for 30 minutes with 0.1, wash once with 0.1¾ BSA-PBS, and then add streptavidin-PE. For 30 minutes under light protection. After washing once with BSA-PBS, FITC-labeled anti-human CD25 monoclonal antibody, FITC-labeled anti-human CD45RA monoclonal antibody, FITC-labeled anti-human CD45R0 monoclonal antibody, FITC-labeled anti-human HLA-DR monoclonal antibody, Incubate with FITC-labeled negative control antibody at 4 for 30 minutes in the dark, wash with 0.1 0 BSA-PBS once, and then use Quantum Red-labeled anti-human CD3 monoclonal antibody, Quantum Red-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody, and Quantum Red The labeled negative control antibody was reacted with 4 for 30 minutes in the dark, washed once with 0.1% BSA-PBS, and fixed with 2¾ paraformaldehyde-PBS. Stored in 4 light shielded until flow cytometry analysis.
(H) フローサイ トメ ト リー (H) Flow cytometry
フローサイ トメ トリーは FACScan (Becton Dickinson) を用いて行い、 解析用ソ フトウエアとして LYSYS I I (Becton Dickinson)を用いた。 解析は、 染色された単 核球を 15, 000〜30, 000個カウント後、 FSC (前方散乱） と SSC (側方散乱） によりリン パ球分画にゲイティングすることにより行った。 各リンパ球亜群における CD80抗原 陽性率は、 陰性コントロールを用いて算出された陽性率を差し引いて算出した。  Flow cytometry was performed using FACScan (Becton Dickinson), and LYSYS II (Becton Dickinson) was used as analysis software. The analysis was performed by counting 15,000 to 30,000 stained mononuclear cells, and then gating to the lymphocyte fraction by FSC (forward scatter) and SSC (side scatter). The CD80 antigen positive rate in each lymphocyte subgroup was calculated by subtracting the positive rate calculated using the negative control.
3カラーフローサイ トメ トリー解析では、 染色された単核球を ， 000〜30，000個力 ゥント後、 FSC と SSC によりリンパ球分画にゲイティングし、 CD80抗原陽性かつ CD4 抗原陽性、 または CD3 抗原陽性の分画にさらにゲイティ ングをかけ CD45RA抗原、 CD45R0抗原、 CD25抗原、 HLA- DR抗原の発現を検討した。 3 In the color flow cytometry analysis, 20,000 to 30,000 stained mononuclear cells were analyzed. After counting, the lymphocyte fraction is gated by FSC and SSC, and the CD80 antigen-positive and CD4 antigen-positive or CD3 antigen-positive fractions are further gated, and CD45RA antigen, CD45R0 antigen, CD25 antigen, and HLA-DR antigen Was examined.
例 1 ：健常成人 Example 1: Healthy adult
健康診断等で特に異常を指摘されなかった健康正常成人 22名 （女性 名、 男性 8 名） を対象にした。 そのうち 1例につき結果を第 1図〜第 3図に示す。 図はいず れも 2カラ一フローサイ トメ トリーによる結果を示している。  The subjects were 22 healthy healthy adults (female and 8 male) who did not find any particular abnormalities during medical examinations. Figures 1 to 3 show the results for one case. All figures show the results of two-color, one-flow cytometry.
第 1図は、 健常成人 Aのリ ンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD3 モノクローナル抗体 （横 軸） とビォチン標識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体及びス トレブ卜アビジン- PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図であり、 この結果は、 CD3 抗原陽性リ ンパ 球には CD80抗原陽性リンパ球がほとんど認められないことを示している。 第 2図は 健常成人 Aのリ ンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD4 モノクローナル抗体 （横軸） とビォチ ン標識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体及びストレプトアビジン- PE (縱軸） とで染 色した解析結果を示す図であり、 この結果は、 CD4抗原陽性リ ンパ球には CD80抗原 陽性リ ンパ球がほとんど認められないことを示している。 また、 第 3図は、 健常 成人 Aのリ ンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD19モノクローナル抗体 （横軸） とビォチン標 識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体及びストレプトアビジン- PE (縱軸） とで染色し た解析結果を示す図であり、 この結果は、 CD19抗原陽性リ ンパ球の一部にに CD80 抗原陽性リ ンパ球が認められることを示している。  Fig. 1 shows the analysis of lymphocytes from healthy adult A stained with FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE (vertical axis). It is a figure which shows a result and shows that a CD80 antigen positive lymphocyte is hardly recognized in a CD3 antigen positive lymphocyte. Fig. 2 shows the results of analysis of lymphocytes from healthy adults A stained with FITC-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE (vertical axis). This result indicates that almost no CD80 antigen-positive lymphocytes were observed in CD4 antigen-positive lymphocytes. Figure 3 shows that the lymphocytes of healthy adult A were stained with FITC-labeled anti-human CD19 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE (vertical axis). FIG. 9 is a graph showing the results of analysis, showing that CD80 antigen-positive lymphocytes are observed in some of the CD19 antigen-positive lymphocytes.
例 2 ：全身エリテマ トーデス患者例 Example 2: A patient with systemic lupus erythematosus
アメ リカリウマチ協会の診断基準により全身ェリテマトーデス（SLE) と診断され た患者 26名 （女性 25名、 男性 1名） を対象にした。 そのうち 1例につき結果を第 4 図〜第 6図に示す。 図はいずれも 2カラ一フローサイ トメ ト リーによる結果を示 している。  Twenty-six patients (25 female and 1 male) diagnosed with systemic erythematosus (SLE) according to the American College of Rheumatology diagnostic criteria. Figures 4 to 6 show the results for one case. All figures show the results obtained by two-color flow cytometry.
第 4図は SLE患者 Bのリンパ球を FITC標識抗ヒト CD3 モノクローナル抗体 （横軸） とビォチン標識抗ヒト CD80モノクローナル抗体及びストレプトアビジン- PE (縱軸） とで染色した解析結果を示す図であり、 この結果は、 CD3 抗原陽性リンパ球の一部 に CD80抗原陽性リンパ球が認められることを示している。 第 5図は SLE 患者 Bのリ ンパ球を FITC標識抗ヒト CD4 モノクローナル抗体 （横軸） とピオチン標識抗ヒ ト CD80 モノクローナル抗体及びストレプトアビジン- PE (縦軸） とで染色した解析結果を 示す図であり、 この結果は、 CD4 抗原陽性リンパ球の一部に CD80抗原陽性リンパ球 が認められることを示している。 また、 第 6図は SLE 患者 Bのリ ンパ球を FITC標識 抗ヒ ト CD19モノクローナル抗体 （横軸） とピオチン標識抗ヒ ト CD80モノクローナル 抗体及びストレプトアビジン- PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図であり、 この結果は、 CD19抗原陽性リンパ球の多くは CD80抗原陽性リンパ球であることを示 している。 Fig. 4 shows the analysis results of staining of lymphocytes of SLE patient B with FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). This result indicates that CD80 antigen-positive lymphocytes are found in some of the CD3 antigen-positive lymphocytes. Fig. 5 shows that lymphocytes from SLE patient B were labeled with FITC-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody (horizontal axis) and biotin-labeled anti-human CD80. FIG. 4 is a view showing the results of analysis performed by staining with a monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). The results show that CD80 antigen-positive lymphocytes are observed in some of the CD4 antigen-positive lymphocytes. Figure 6 shows the results of analysis of the lymphocytes of SLE patient B stained with FITC-labeled anti-human CD19 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). This result indicates that many of the CD19 antigen-positive lymphocytes are CD80 antigen-positive lymphocytes.
例 3 ：惓性関節リウマチ患者例 Example 3: Patients with rheumatoid arthritis
アメ リカリウマチ協会の診断基準により慢性関節リウマチ（RA)と診断された患者 18名 （女性 14名、 男性 4名） を対象にした。 そのうち 1例につき結果を第 7図〜第 9図に示す。 図はいずれも 2カラーフローサイ トメ トリ一による結果を示してい る。  Eighteen patients (14 women and 4 men) diagnosed with rheumatoid arthritis (RA) according to the American College of Rheumatology diagnostic criteria. Figures 7 to 9 show the results for one case. Each figure shows the results of two-color flow cytometry.
第 7図は、 RA患者 Cのリンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD3 モノクローナル抗体 （横軸） とピオチン標識抗ヒト CD80モノクローナル抗体及びストレプトアビジン- PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図であり、 この結果は、 CD3 抗原陽性リンパ球の一部 に CD80抗原陽性リ ンパ球が認められることを示している。 第 8図は、 RA患者 Cのリ ンパ球を FITC標識抗ヒト CD4 モノクローナル抗体 （横軸） とピオチン標識抗ヒ ト CD80 モノクローナル抗体及びストレプトアビジン- PE (縦軸） とで染色した解析結果を 示す図であり、 この結果は、 CD4 抗原! ¾性リンパ球の一部に CD80抗原陽性リ ンパ球 が認められることを示している。 第 9図は、 RA患者 Cのリンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD19モノクローナル抗体 （横軸） とピオチン標識.抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体及 びストレプトアビジン- PE (縦軸） とで染色した解析結果を示す図であり、 この結 果は、 CD19抗原陽性リンパ球の多くは CD80抗原陽性リンパ球であることを示す。 例 4 ：港合拌結合組織病患者例  Figure 7 shows the results of analysis of lymphocytes from RA patient C stained with FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal antibody (horizontal axis), and with biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). This result indicates that CD80 antigen-positive lymphocytes are found in some of the CD3 antigen-positive lymphocytes. Fig. 8 shows the results of analysis of the lymphocytes of RA patient C stained with FITC-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE (vertical axis). The figure shows that the results show that CD80 antigen-positive lymphocytes are observed in some of the CD4 antigen-positive lymphocytes. Fig. 9 shows the results of staining lymphocytes from RA patient C with FITC-labeled anti-human CD19 monoclonal antibody (horizontal axis) and biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). The results show that most of the CD19 antigen-positive lymphocytes are CD80 antigen-positive lymphocytes. Example 4: A case of patients with connective tissue disease in Minato
厚生省の診断基準により混合性結合組織病 (MCTD)と診断された患者 8名 （女性 7 名、 男性 1名） を対象にした。 そのうち 1例につき結果を第 10図〜第 12図に示す。 図はいずれも 2カラ一フローサイ トメ トリ一による結果を示している。  Eight patients (seven females and one male) diagnosed with mixed connective tissue disease (MCTD) according to the Ministry of Health and Welfare's diagnostic criteria were included. Figures 10 to 12 show the results for one case. Each figure shows the results from two-color flow cytometry.
第 10図は、 MCTD患者 Dのリンパ球を FITC標識抗ヒ ト CD3 モノクローナル抗体 （横 軸） とピオチン標識抗ヒ ト CD80モノ クローナル抗体及びス ト レプトァビジン- PE (縱軸） とで染色した解析結果を示す図であり、 この結果は、 CD3 抗原陽性リ ンパ 球の一部に CD80抗原陽性リンパ球が認められることを示している。 第 11図は、 MCTD 患者 Dのリ ンパ球を FITC標識抗ヒト CD4 モノクローナル抗体 （横軸） とビォチン標 識抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体及びストレプトアビジン- PE (縦軸） とで染色し た解析結果を示す図であり、 この結果は、 CD4 抗原陽性リンパ球の一部に CD80抗原 陽性リ ンパ球が認められることを示している。 また、 第 12図は、 MCTD患者 Dのリ ン パ球を FITC標識抗ヒ ト CD19モノクローナル抗体 （横軸） とピオチン標識抗ヒ 卜 CD80 モノクローナル抗体及びストレプトアビジン- PE (縦軸） とで染色した解析結果を 示す図であり、 この結果は、 CD19抗原陽性リンパ球の多くは CD80抗原陽性リンパ球 であることを示している。 Figure 10 shows that lymphocytes of MCTD patient D were labeled with FITC-labeled anti-human CD3 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE. (Longitudinal axis) shows the results of analysis, which shows that CD80 antigen-positive lymphocytes are observed in some of the CD3 antigen-positive lymphocytes. Figure 11 shows the results of analysis of the lymphocytes of MCTD patient D stained with FITC-labeled anti-human CD4 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody, and streptavidin-PE (vertical axis). This result indicates that CD80 antigen-positive lymphocytes are observed in some of the CD4 antigen-positive lymphocytes. Fig. 12 shows the lymphocytes of MCTD patient D stained with FITC-labeled anti-human CD19 monoclonal antibody (horizontal axis), biotin-labeled anti-human CD80 monoclonal antibody and streptavidin-PE (vertical axis). FIG. 3 is a view showing the results of analysis, and shows that most of CD19 antigen-positive lymphocytes are CD80 antigen-positive lymphocytes.
第 13図は、 以上の方法に従って、 各免疫性疾患と健康正常成人における全リ ン パ球、 CD3抗原陽性リンパ球、 CD4抗原陽性リンパ球、 CD8 抗原陽性リンパ球、 CD19 抗原陽性リンパ球各リンパ球亜群について CD80抗原陽性率を算出し、 陽性率の分布 と平均値 （* ) をプロッ 卜した結果を示す図である。 縦軸はリ ンパ球、 またはリ ン パ球亜群における CD80抗原陽性率を示す。 SLE は全身性エリテマ トーデスを、 RA は慢性関節リウマチを、 MCTDは混合性結合組織病を示す。  Figure 13 shows the total lymphocytes, CD3-antigen-positive lymphocytes, CD4-antigen-positive lymphocytes, CD8-antigen-positive lymphocytes, and CD19-antigen-positive lymphocytes of each immune disease and healthy normal adult. FIG. 9 is a diagram showing the results of calculating the CD80 antigen positive rate for the subpopulation of spheres and plotting the distribution of positive rates and the average value (*). The vertical axis shows the CD80 antigen positive rate in lymphocyte or lymphocyte subgroup. SLE indicates systemic lupus erythematosus, RA indicates rheumatoid arthritis, and MCTD indicates mixed connective tissue disease.
例 5 ：全身性エリテマ トーデス患者例 Example 5: Patient with systemic lupus erythematosus
第 14図は、 SLE 患者 Eのリンパ球において CD4 抗原陽性及び CD80抗原陽性リンパ 球分画における CD25抗原の発現の解析結果を示す図であり、 この結果は、 CD4 抗原 陽性及び CD80抗原陽性リンパ球は CD25陽性細胞であることを示している （縦軸は CD4 抗原の発現、 横軸は CD25抗原の発現を示す） 。 第 15図は、 SLE 患者 Eのリンパ球 において CD4 抗原陽性及び CD80抗原陽性リンパ球分画における CD45RA抗原の発現の 解析結果を示す図であり、 この結果は、 CD4 抗原陽性及び CD80抗原陽性リンパ球は CD45RA抗原陰性であることを示している （縱軸は CD4 抗原の発現を、 横軸は CD45RA 抗原の発現を示す） 。 また、 第 16図は、 SLE 患者 Eのリンパ球において CD4 抗原陽 性及び CD80抗原陽性リン '、'球分画における CD45RO抗原の発現の解析結果を示す図で あり、 この結果は、 CD4 抗原陽性及び CD80抗原陽性リンパ球は CD45RO抗原陽性であ ることを示している （縦軸は CD4 抗原の発現を、 横軸は CD45RO抗原の発現を示す） 。 さらに、 第 17図は、 SLE 患者 Eのリ ンパ球において CD4 抗原陽性及び CD80抗原陽性 リンパ球分画における HLA-DR抗原の発現の解析結果を示す図であり、 この結果は、 CD4 抗原陽性及び CD80抗原 ¾性リンパ球は HLA-DRがー部陽性であることを示してい る （縦軸は CD4 抗原の発現を、 横軸は HLA- DR抗原の発現を示す） 。 FIG. 14 is a diagram showing the results of analyzing the expression of CD25 antigen in the CD4 antigen-positive and CD80 antigen-positive lymphocyte fractions in lymphocytes of SLE patient E. The results show that CD4 antigen-positive and CD80 antigen-positive lymphocytes. Indicates that the cells are CD25-positive cells (vertical axis indicates CD4 antigen expression, horizontal axis indicates CD25 antigen expression). FIG. 15 shows the results of analysis of the expression of CD45RA antigen in the CD4 antigen-positive and CD80 antigen-positive lymphocyte fractions in lymphocytes of SLE patient E. The results show that CD4 antigen-positive and CD80 antigen-positive lymphocytes. Indicates CD45RA antigen negative (the vertical axis indicates CD4 antigen expression, and the horizontal axis indicates CD45RA antigen expression). FIG. 16 shows the results of analyzing the expression of CD45RO antigen in the CD4 antigen-positive and CD80 antigen-positive phosphorus 'and' sphere fractions in lymphocytes of SLE patient E. In addition, CD80 antigen-positive lymphocytes indicate CD45RO antigen-positive (vertical axis indicates CD4 antigen expression, horizontal axis indicates CD45RO antigen expression). Fig. 17 shows that the lymphocytes of SLE patient E were positive for CD4 antigen and CD80 antigen. FIG. 7 is a view showing the results of analysis of the expression of HLA-DR antigen in the lymphocyte fraction, which shows that the CD4 antigen-positive and CD80 antigen-positive lymphocytes are positive for HLA-DR (-). The vertical axis indicates the expression of the CD4 antigen, and the horizontal axis indicates the expression of the HLA-DR antigen.)
例 6 ：本発明の医薬の作用 Example 6: Action of the medicament of the present invention
抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体は、 通常の薬理試験に用いられるラッ トもしくは マウスの CD80抗原と交差反応性を示さないので、 抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体を 実験動物に投与してもその薬効を証明することは不可能である。 そこで、 排除性 ラッ ト抗マウス CD80モノクローナル抗体を用いたマウスモデル試験系での試験結果 をヒ トに外揷することにより本発明の医薬の作用を確認した。  The anti-human CD80 monoclonal antibody does not show any cross-reactivity with rat or mouse CD80 antigen used in usual pharmacological tests. It is impossible. Therefore, the effect of the drug of the present invention was confirmed by extrapolating the results of a mouse model test system using an exclusionary rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody to humans.
マウスモデル試験系の結果をヒ 卜に外挿し、 ヒ 卜における薬効を予測すること が可能であることは、 抗 CD4 モノクローナル抗体を用いた実験によりすでに証明さ れている。 抗ヒ ト CD4 モノクローナル抗体は、 抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体と同 様に、 実験動物 CD4 抗原との間で交差反応性を示さないことが示されている。 すな わち、 Wofsy らは、 イン · ビボにおいて CD4 抗原陽性細胞を殺傷排除可能なラッ ト 抗マウス CD4 モノクローナル抗体を正常マウスに投与し、 CD4 抗原陽性細胞を殺傷 排除されたマウスにおいては抗原特異的な免疫応答反応が観察されないことを報 告している [D. Wofsy, et al. , J. Immunol. , 1698(1985)]。 また、 Ranges らは関節に向かう異常な免疫反応の亢進によって発症すると考えられるヒ ト RAの動 物モデルであるマウスコラーゲン誘導関節炎の発症が、 ラッ ト抗マウス CD4 モノク ローナル抗体を投与することで強く抑制されることを報告している [G. E. Ranges, et al. , J. Exp. Med. , 162^. 1105 (1985)] 。 これに対応して、 ヒ 卜における RA の病態は、 抗ヒ ト CD4 モノクローナル抗体を投与することによって強く抑制される ことが Herzogらあるいは Reiterらによって報告されている [C. Herzog, et al. , The ability to extrapolate the results of mouse model test systems to humans and predict drug efficacy in humans has already been demonstrated by experiments using anti-CD4 monoclonal antibodies. The anti-human CD4 monoclonal antibody, like the anti-human CD80 monoclonal antibody, has been shown to show no cross-reactivity with the experimental animal CD4 antigen. In other words, Wofsy et al. Administered a rat anti-mouse CD4 monoclonal antibody capable of killing and eliminating CD4 antigen-positive cells to normal mice in vivo, and antigen-specific in mice where CD4 antigen-positive cells were killed and eliminated. No specific immune response was observed [D. Wofsy, et al., J. Immunol., 1698 (1985)]. In addition, Ranges et al. Strongly suggested that the development of mouse collagen-induced arthritis, an animal model of human RA, which is thought to be caused by an abnormally enhanced immune response toward the joints, was induced by the administration of rat anti-mouse CD4 monoclonal antibody. Have been reported [GE Ranges, et al., J. Exp. Med., 162 ^. 1105 (1985)]. Correspondingly, it has been reported by Herzog et al. Or Reiter et al. That the pathogenesis of RA in humans is strongly suppressed by administration of an anti-human CD4 monoclonal antibody [C. Herzog, et al.,
J . Autoimmuni ty, 12, 627 ( 1989)； C. Reiter, et al. , Arthrit is and Rheumatism, 34. 129 (1991)]。 これらの事実は、 抗マウス CD4 モノクローナル抗 体を用いたマウスにおける RA治療成綾から、 ヒ トにおける RAの治療成績を外捜予測 する手法が妥当性を得たものであることが示されたと考えられる。 J. Autoimmunity, 12, 627 (1989); C. Reiter, et al., Arthrit is and Rheumatism, 34. 129 (1991)]. These facts suggest that the results of RA treatment in mice using anti-mouse CD4 monoclonal antibody showed that the method of externally predicting RA treatment results in humans was appropriate. Can be
免疫性疾患は異常な免疫反応によって引き起こされると考えられている。 免疫 反応は抗体産生を基本とする液性免疫反応と細胞傷害性機能を有するェフ クタ一 細胞の活性化を基本とする細胞性免疫とに大別される。 したがって、 イ ン · ビボ において CD80陽性細胞を殺傷排除する能力のあるラッ ト抗マウス CD80モノクローナ ル抗体を投与したときにこれらの基本免疫反応がともに抑制されれば、 ヒ ト生体 内で CD80陽性リンパ球排除能を有する抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体が免疫疾患に 対して有効であることを外挿予測することができる。 Immune diseases are thought to be caused by abnormal immune responses. The immune response is a humoral immune response based on antibody production and an effector with a cytotoxic function. It is roughly classified into cell-mediated immunity based on cell activation. Therefore, if these basal immune responses are suppressed when a rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody capable of killing and eliminating CD80-positive cells is administered in vivo, both CD80-positive cells are obtained in vivo in humans. It can be extrapolated and predicted that an anti-human CD80 monoclonal antibody having the ability to eliminate lymphocytes will be effective against immune diseases.
(1) ラッ ト抗マウス CD80モノクローナル抗体の調製とイン ' ビボにおいて CD80陽性 細胞を殺傷排除する能力の測定  (1) Preparation of rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody and measurement of its ability to kill and eliminate CD80-positive cells in vivo
(a) ラッ ト抗マウス CD80モノクローナル抗体の調製  (a) Preparation of rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody
ラッ ト抗マウス CD80モノクローナル抗体を作成するにあたり、 抗原となるマウス CD80抗原を大腸菌にマウス CD80抗原遣伝子を導入して発現させ、 通常の方法で精製 して用いた。 精製したマウス CD80抗原を抗原として Wistar系ラッ ト （雄性、 4週齢） を免疫した後、 8週齢まで追加免疫を行ない、 この免疫ラッ ト脾細胞とマウス形 質細胞腫 P3U1との細胞融合法によりハイプリ ドーマを作成した。  In preparing a rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody, mouse CD80 antigen as an antigen was expressed by introducing a mouse CD80 antigen gene into Escherichia coli, and purified and used in a usual manner. After immunizing a Wistar rat (male, 4 weeks of age) with purified mouse CD80 antigen as an antigen, booster immunization was performed until the age of 8 weeks, and cell fusion between the immunized rat spleen cells and mouse morphocytoma P3U1 Hypri-doma was prepared by the method.
ラッ ト抗マウス CD80抗体産生ハイブリ ドーマのスク リーニングは、 上記マウス CD80抗原を抗原とした EL】SA 法により行い、 ラッ ト抗マウス CD80抗体を産生するク ローンを選択した。 クローニングは限界希釈法により行なった。 本クローンを SCID マウスの腹腔内に移植し、 産生された腹水を採取し、 抗体を精製して実験に供し た。 本モノクローナルラッ ト抗マウス CD80抗体の免疫グロブリ ンクラスは IgG2b クラス抗体であることがラッ ト免疫グロプリンタイピングキッ ト （ァメ リカン ' コーレックス） で確認され、 本抗体を Ml- 18 と命名した。 MI-18 がマウス CD80抗原 に反応することをウェスタンプロッティング、 およびマウス CD80抗原を感作させた CH0 細胞への結合性試験で確認した。  Screening of the rat anti-mouse CD80 antibody-producing hybridoma was performed by the EL] SA method using the mouse CD80 antigen as an antigen, and clones producing rat anti-mouse CD80 antibody were selected. Cloning was performed by the limiting dilution method. This clone was transplanted intraperitoneally into SCID mice, the ascites produced was collected, the antibody was purified, and used for the experiment. The immunoglobulin class of this monoclonal rat anti-mouse CD80 antibody was confirmed to be an IgG2b class antibody using a rat immunoglobulin typing kit (American 'Corex), and this antibody was named Ml-18. The reactivity of MI-18 to mouse CD80 antigen was confirmed by Western blotting and binding test to mouse CD80 antigen-sensitized CH0 cells.
(b) MI- 18のイン · ビボにおける CD80陽性細胞の殺傷排除能力  (b) Ability of MI-18 to eliminate CD80-positive cells in vivo
ラッ ト抗マウス CD80モノクローナル抗体である Ml- 18 がイン ' ビボにおいて CD80 抗原陽性細胞を殺傷排除する能力があるかどうかを検討した。 Ml- 18 を腹腔内投与 されたマウスでは、 B220陽性細胞サブフラクション （主として B細胞を含む分画） においても、 B220陰性細胞サブフラクション （主として T細胞を含む分画） におい ても、 CD80陽性細胞の割合が低下しているという結果が得られた。 この結果は、 Ml -18 によって CD80陽性細胞がイン ' ビボにおいて殺傷排除されたことを示している と解釈することが可能である。 We examined whether Ml-18, a rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody, was able to kill and eliminate CD80 antigen-positive cells in vivo. In mice to which Ml-18 was administered intraperitoneally, CD80-positive cells were observed in both B220-positive cell subfractions (primarily containing B cells) and B220-negative cell subfractions (fractions mainly containing T cells). Was reduced. This result indicates that Ml-18 killed CD80-positive cells in vivo It can be interpreted as
(C) 殺傷排除能力の測定のための材料と方法  (C) Materials and methods for measuring kill exclusion capacity
マウス ： Balb/c、 5 週齢、 雄 （日本 SLC)を使用した。  Mice: Balb / c, 5 weeks old, male (Japan SLC) was used.
フローサイ トメ トリー ： ヒ ト末梢血リンパ球の解析で記述した方法と同様の手法 でマウス脾臓細胞をビォチン標識ラッ ト抗マウス CD80抗体（1G10; PharMingen社製） とラッ ト抗マウス CD45RA 抗体 (Sigma社製） で 2カラーフローサイ トメ トリ一解析 した。  Flow cytometry: Mouse spleen cells were treated with biotin-labeled rat anti-mouse CD80 antibody (1G10; PharMingen) and rat anti-mouse CD45RA antibody (Sigma) in the same manner as described in the analysis of human peripheral blood lymphocytes. Two-color flow cytometry analysis.
ラッ ト抗マウス CD80モノクローナル抗体の投与：上記殺傷排除能力試験においてフ ローサイ トメ トリー解析の前日に、 MI-18 を 250 jt/ g/マウスの用量で腹腔内投与し た。 対照として、 マウスに同容量の PBS を投与した。  Administration of rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody: MI-18 was intraperitoneally administered at a dose of 250 jt / g / mouse the day before the flow cytometric analysis in the killing elimination ability test described above. As a control, mice received the same volume of PBS.
(d) 結果  (d) Result
以上の方法により確認された MI -18のイン · ビボにおける CD80陽性細胞の殺傷 排除能力の測定結果を表 1に示す。 表 1  Table 1 shows the measurement results of the ability of MI-18 to kill and eliminate CD80-positive cells in vivo confirmed by the above method. table 1
CD80 陽性細胞率 (¾) CD80 positive cell rate (¾)
試 験 群 CD45RA陽性分面 CD45RA陰性分画 対 照 群 33. 3 ± 3, 7 11. 3 ± 0. 2 Test group CD45RA positive fraction CD45RA negative fraction Control group 33.3 ± 3, 7 11.3 ± 0.2
Ml- 18 投与群 26, 1 土 0. 2 2. 3 土 0. 6 Ml-18 administration group 26, 1 Sat 0.2 2.2.3 Sat 0.6
(2) 液性免疫反応に対する Ml - 18 の抑制作用 (2) Inhibitory effect of Ml-18 on humoral immune response
(a) あらかじめヒッジ赤血球 (SRBC)で感作したマウスに、 イン ' ビボにおいて CD80 抗原陽性細胞を殺傷排除する能力のあるラッ ト抗マウス CD80モノクローナル抗体を 投与し、抗原感作で誘導される SRBCに対する特異抗体を産生する細胞数を比較した。 その結果、 ラッ ト抗 CD80モノクローナル抗体を投与されたマウスでは、 脾臓あたり に誘導される抗 SRBC抗体産生細胞数が抗体非投与対照群に対して有意に少ないと t、 う結果が得られた。 特定の理論に拘泥するわけではないが、 この結果は、 以下の ように解釈することが可能である。 (a) Rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody capable of killing and eliminating CD80 antigen-positive cells in vivo is administered to mice previously sensitized with hedge red blood cells (SRBC), and SRBC induced by antigen sensitization The number of cells producing a specific antibody against was compared. As a result, in mice administered with rat anti-CD80 monoclonal antibody, When the number of anti-SRBC antibody-producing cells induced by the antibody was significantly smaller than that of the control group to which no antibody was administered, the following results were obtained. Without being bound by a particular theory, this result can be interpreted as follows.
すなわち、 SRBCで感作されたマウスでは、 SRBCに発現する抗原に対応する CD4 抗原陽性ヘルパー Tリンパ球が抗原提示を受けて活性化しており、 CD4 抗原陽性へ ルパー Tリンパ球は、 抗 SRBC抗体産生能力を有する休止期 B細胞に分化増殖シグナ ルを放出し、 最終的にマウス体内に抗 SRBC抗体産生細胞が誘導されると考えられて いる。 このカスケー ドに関与する免疫担当細胞のうち、 活性化 CD4 陽性ヘルパー T 細胞及び活性化抗体産生 B細胞は細胞表面上に CD80抗原を発現しており、 SRBC感作 マウスに CD80抗原陽性細胞を殺傷排除する能力のあるラッ ト抗マウス CD80モノクロー ナル抗体を投与すると、 CD80抗原陽性である SRBC特異的活性化 CD4 抗原陽性ヘルパー T細胞及び抗 SRBC抗体を産生する活性化 B細胞が選択的に排除されるため、 抗体を 投与したマウスでは、 脾臓に検出される抗 SRBC抗体産生細胞数が減少する。  That is, in mice sensitized with SRBC, CD4 antigen-positive helper T lymphocytes corresponding to the antigen expressed on SRBC are activated by receiving antigen presentation, and CD4 antigen-positive helper T lymphocytes are expressed by anti-SRBC antibody. It is thought that they release differentiation / proliferation signals into resting B cells that have the ability to produce, and eventually induce anti-SRBC antibody-producing cells in the mouse body. Among the immunocompetent cells involved in this cascade, activated CD4-positive helper T cells and activated antibody-producing B cells express CD80 antigen on the cell surface and kill CD80 antigen-positive cells in SRBC-sensitized mice When a rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody capable of eliminating is administered, CD80 antigen-positive SRBC-specific activated CD4 antigen-positive helper T cells and activated B cells producing anti-SRBC antibodies are selectively eliminated. Therefore, the number of anti-SRBC antibody-producing cells detected in the spleen decreases in mice to which the antibody has been administered.
(b) IgM PFCの材料と方法 (b) Materials and methods of IgM PFC
マウス ： Balb/c、 5週齢、 雄 （日本 SLC ) を使用した。 Mice: Balb / c, 5 weeks old, male (Japan SLC) was used.
PFC assay ： Balb/c に 2 x lO8 のヒッジ赤血球 （SRBC) を腹腔内投与して免疫し、 4日後に脾臓中の抗 SRBC Ig PFCを Cunningham and Szenbergらの方法により測定 した。 すなわち、 摘出した脾臓を 5. 0 ml の Eagles ' s Minimum Medium (MEM, 日水 製薬） 中でステンレスワイヤーメ ッシュ（200mesh )を通して単細胞浮遊液とした。 単細胞浮遊液 50 / 1 を 4 x liT/mlの SRBC浮遊液 50 μ \ 、 及び補体としてモルモッ 卜血清 50 / 1 と混和し、 Cunninghamの溶血斑形成チャンバ一 （高橋技研） 中に封入 し、 37°C、 45分間インキュベーショ ンした後、 出現した溶血斑数を測定した。 ラッ ト抗マウス CD80モノクローナル抗体の投与：上記 PFC assay において SRBC免疫 3日後に Ml- 18 を 100 fi g、 または 200 ^ g /マウス、 腹腔内投与した。 対照として 同容量の PBS を投与した。 PFC assay: Balb / c was immunized by intraperitoneal administration of 2 × 10 8 shed erythrocytes (SRBC). Four days later, anti-SRBC Ig PFC in the spleen was measured by the method of Cunningham and Szenberg et al. That is, the removed spleen was made into a single cell suspension through a stainless wire mesh (200 mesh) in 5.0 ml of Eagles's Minimum Medium (MEM, Nissui Pharmaceutical). 50/1 of the single cell suspension was mixed with 50 μl of 4 × liT / ml SRBC suspension and 50/1 of guinea pig serum as complement, and sealed in Cunningham's hemolytic spot formation chamber 1 (Takahashi Giken). After incubation at 37 ° C for 45 minutes, the number of hemolytic spots that appeared was counted. Administration of rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody: Three days after SRBC immunization in the above PFC assay, Ml-18 was intraperitoneally administered at 100 fig or 200 ^ g / mouse. As a control, the same volume of PBS was administered.
CO 結果 CO result
以上の方法により確認された、 PFC assay における排除性抗マウス CD80抗体の 抗体産生細胞排除効果を第 18図に示す。 縦軸は対照群での PFC数に対する抗体産生 細胞傷害効果を PFC 形成抑制率で示し、 横軸は MI-18 の投与量を示す。 (3) 細胞性免疫反応に対する MI-18 の抑制作用 FIG. 18 shows the elimination effect of the exclusion anti-mouse CD80 antibody in antibody-producing cells in the PFC assay confirmed by the above method. The vertical axis shows the PFC formation inhibitory effect on the number of PFCs in the control group by the PFC formation inhibitory rate, and the horizontal axis shows the dose of MI-18. (3) Inhibitory effect of MI-18 on cellular immune response
(a) イン · ビボにおいて CD80陽性細胞を殺傷排除する能力のあるラッ ト抗マウス CD80 抗体を投与したマウスをメチル化ヒ ト血清アルブミ ン（MeHSA) で感作し、 MeHSA チャレンジで惹起される足浮腫 （遅延型ァレルギ一反応； DTH)を対照群と比較した。 その結果、 抗 CD80抗体投与を受けたマウスにおける浮腫の形成は、 抗体非投与対照 群に比較して有意に軽度であるという試験結果が得られた。 この結果は以下のよ うに解釈することが可能である。  (a) Rats treated with rat anti-mouse CD80 antibody capable of killing and eliminating CD80-positive cells in vivo. Sensitized with methylated human serum albumin (MeHSA), and feet elicited by MeHSA challenge. Edema (delayed allergic reaction; DTH) was compared with the control group. As a result, the test results showed that the formation of edema in the mice receiving the anti-CD80 antibody was significantly milder than that in the control group not receiving the antibody. This result can be interpreted as follows.
すなわち、 MeHSA で慼作されたマウスにおいては、 MeHSA に対応する CD4 陽性 ヘルパー Tリンパ球が抗原提示を受けて活性化し、 CD4 陽性ヘルパー Tリンパ球は 遅延型アレルギー反応のエフ Xクタ一細胞であるマクロファージに活性化シグナ ルを伝達し、 抗原チャレンジ部位であるマウス足踱に浮腫が形成されると考えら れている。 このカスケードに関与する免疫担当細胞のうち、 活性化 CD4 陽性ヘルパー T細胞及びマクロファージが細胞表面上に CD80抗原を発現している。 CD80陽性細胞 を殺傷排除する能力のあるラッ ト抗マウス CD80抗体を投与されたマウスに MeHSA を投与すると、 CD80抗原陽性である MeHSA 特異的活性化 CD4 陽性ヘルパー T細胞及 びエフヱクタ一細胞であるマクロファージが選択的に排除されるため、 抗体を投 与したマウスにおいては、 抗原チヤレンジによって誘導される足踱の浮腫形成が 減弱する。  That is, in mice developed with MeHSA, CD4-positive helper T lymphocytes corresponding to MeHSA are activated by receiving antigen presentation, and CD4-positive helper T lymphocytes are FX cells of delayed allergic reaction. It is believed that the activation signal is transmitted to macrophages and edema is formed in the mouse foot, which is the site of antigen challenge. Among the immunocompetent cells involved in this cascade, activated CD4-positive helper T cells and macrophages express the CD80 antigen on the cell surface. Rat anti-mouse capable of killing and eliminating CD80-positive cells When MeHSA is administered to mice to which CD80 antibody has been administered, MeHSA-specific activated CD80 antigen-positive CD4-positive helper T cells and effector-specific macrophages Is selectively eliminated, so that in mice to which the antibody has been administered, the formation of foot edema induced by antigen challenge is reduced.
(WDTHの材料と方法  (WDTH Materials and Methods
マウス ： ICR、 6週齢、 雄 （日本 SLC ) を使用した。 Mice: ICR, 6 weeks old, male (Japanese SLC) was used.
DTH ：注射用蒸留水に溶解したメチル化ヒ ト血清アルブミ ン（MeHSA ; 2. 5 mg ml) を ICR マウスの背部皮下に 250 ^ 1 投与して感作し、 4日後に MeHSA (1 mg/ml) を足踱皮下に 25 \ 投与して DTH を惹起した。 MeHSA 投与 24 時間後の足躕の厚 さをマイクロシックネスゲージで測定し、 DTH の指標とした。  DTH: Methylated human serum albumin (MeHSA; 2.5 mg ml) dissolved in distilled water for injection was sensitized by subcutaneously administering 250 ^ 1 to the back of ICR mice 250 days later, and MeHSA (1 mg / ml) was subcutaneously administered 25 \ to induce DTH. The thickness of the foot 24 hours after the administration of MeHSA was measured with a micro thickness gauge and used as an index of DTH.
ラッ ト抗マウス CD80モノクローナル抗体の投与：上記 DTH において、 MeHSA 感作前 日より 3日目まで、 Ml- 18 を 50 i g， 100 /i g又は 200 / g/マウスの用量でマウス腹 腔内に投与した。 対照としてマウスに同容量の PBS を投与した。 Rat anti-mouse CD80 monoclonal antibody administration: In the above DTH, Ml-18 was administered intraperitoneally to mice at a dose of 50 ig, 100 / ig or 200 / g / mouse from the day before MeHSA sensitization to day 3 did. As a control, mice received the same volume of PBS.
(c) 結果 (c) Result
DTH を指標とする細胞性免疫反応に対する排除性抗マウス CD80抗体の抑制効果 を第 19図に示す。 図中、 縦軸は足踱における浮腫形成を示し、 横軸は Ml- 18 の投与 量を示す。 また、 は pく 0. 05 ; **は pく 0. 01であることを示す。 Inhibitory effect of exclusion anti-mouse CD80 antibody on DTH-mediated cellular immune response Is shown in FIG. In the figure, the vertical axis indicates edema formation in the foot, and the horizontal axis indicates the dose of Ml-18. Indicates that p is 0.05; ** indicates that p is 0.01.
上記の結果と正常マウスの脾臓には CD80陽性細胞が極めて少数しか検出されな い事実とを考え併せると、 排除性抗 CD80抗体を投与することにより、 抗原特異的に 活性化する免疫反応を選択的に抑制することができることが明らかである。 すな わち、 異常に活性化したリンパ球によって引き起こされる種々の免疫性疾患を、 予備的な免疫能を残したまま治療することが可能であることが示された。 産業上の利用可能性  Considering the above results and the fact that only a very small number of CD80-positive cells are detected in the spleen of normal mice, an immunoreaction that activates antigen-specifically by administering an anti-CD80 antibody is selected. It is clear that it can be suppressed. In other words, it has been shown that it is possible to treat various immune diseases caused by abnormally activated lymphocytes while retaining preliminary immune ability. Industrial applicability
本発明の診断方法は、 各種の免疫性疾患を簡便かつ正確に診断することができ るうえ、 患者から容易に分離 ·採取できる末梢血などの体液中に含まれるリンパ 球を検出の対象とするので、 従来の診断法に比較して操作が簡便で患者への負担 が少ないという特徴を有している。 また、 本発明の方法は種々の免疫性疾患に対 して汎用性を有するという特徴もある。  INDUSTRIAL APPLICABILITY The diagnostic method of the present invention can easily and accurately diagnose various immune diseases, and detects lymphocytes contained in body fluids such as peripheral blood which can be easily separated and collected from patients. Therefore, it has the feature that the operation is simple and the burden on the patient is small compared to conventional diagnostic methods. Further, the method of the present invention is characterized in that it has versatility for various immune diseases.
また本発明の医薬は、 各種の免疫性疾患の治療及びノ又は予防に有用であり、 予備的な免疫能に対して影響を与えず、 免疫系中の特定の異常部分に特異的に作 用するので、 免疫不全症などを惹起する可能性が少ないという特徴がある。  The medicament of the present invention is useful for treating and preventing or preventing various immunological diseases, has no effect on preliminary immunity, and acts specifically on specific abnormal parts in the immune system. Therefore, there is a low possibility of causing immunodeficiency and the like.

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims
1 . ヒ 卜から分離'採取した体液試料中に含まれるリンパ球の CD80抗原陽性率を免 疫学的に測定する工程を含む免疫性疾患の診断方法。 1. A method for diagnosing an immune disease, comprising the step of immunologically measuring the CD80 antigen positive rate of lymphocytes contained in a body fluid sample isolated and collected from a human.
2 . リンパ球がリンパ球亜群である請求項 1に記載の方法。  2. The method of claim 1, wherein the lymphocytes are a lymphocyte subgroup.
3 . 体液が末梢血液である請求項 1または 2に記載の診断方法。  3. The diagnostic method according to claim 1, wherein the body fluid is peripheral blood.
4 . 免疫学的測定に CD80抗原を認識する抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体を用いる請 求項 1、 2または 3に記載の診断方法。  4. The diagnostic method according to claim 1, 2, or 3, wherein an anti-human CD80 monoclonal antibody that recognizes the CD80 antigen is used for immunological measurement.
5 . 免疫学的測定に CD80抗原を認識する抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体とリンパ球 亜群を認識するモノクローナル抗体とを組み合わせて用いる請求項 1、 2または 3に記載の診断方法。  5. The diagnostic method according to claim 1, 2 or 3, wherein an anti-human CD80 monoclonal antibody recognizing the CD80 antigen and a monoclonal antibody recognizing a lymphocyte subgroup are used in combination for immunological measurement.
6 . さらに上記の CD80抗原陽性率を健常者から分離採取した体液試料中に含まれる リンパ球及び 又はリンパ球亜群の CD80抗原陽性率と比較する工程を含む請求項 1 ないし 5のいずれか 1項に記載の診断方法。  6. The method according to any one of claims 1 to 5, further comprising the step of comparing the CD80 antigen positive rate with the CD80 antigen positive rate of lymphocytes and / or lymphocyte subgroups contained in a body fluid sample separated and collected from a healthy subject. The diagnostic method described in the section.
7 . CD80抗原を認識する抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体を有効成分として含む免疫 性疾患の診断用組成物。  7. A composition for diagnosing an immune disease, which comprises an anti-human CD80 monoclonal antibody that recognizes the CD80 antigen as an active ingredient.
8 . 請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の診断方法に用いるための請求項 7 に記載の診断用組成物。  8. The diagnostic composition according to claim 7, which is used for the diagnostic method according to any one of claims 1 to 6.
9 . 請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の診断方法に用いる診断用組成物の 製造のための抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体の使用。  9. Use of an anti-human CD80 monoclonal antibody for the manufacture of a diagnostic composition for use in the diagnostic method according to any one of claims 1 to 5.
10. ヒ 卜 CD80抗原を特異的に認識する抗ヒ ト CD80抗体からなる医薬。  10. A drug comprising an anti-human CD80 antibody that specifically recognizes human CD80 antigen.
11. ヒ ト CD80抗原を特異的に認識する抗ヒ ト CD80抗体を有効成分として含む免疫性 疾患の治療及び Z又は予防剤。  11. A therapeutic and / or prophylactic agent for immunological diseases comprising an anti-human CD80 antibody that specifically recognizes human CD80 antigen as an active ingredient.
12. 該抗体が抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体である請求項 11に記載の治療及び/又 は予防剤。  12. The therapeutic and / or prophylactic agent according to claim 11, wherein the antibody is an anti-human CD80 monoclonal antibody.
13. 該抗体がヒ ト生体内で CD80陽性リンパ球排除能を有する抗ヒ ト CD80モノクロ一 ナル抗体である請求項 11または 12に記載の治療及び Z又は予防剤。  13. The therapeutic, Z or prophylactic agent according to claim 11 or 12, wherein the antibody is an anti-human CD80 monoclonal antibody having CD80-positive lymphocyte elimination ability in a human body.
14. 免疫性疾患の治療及び 又は予防方法であって、 免疫性疾患の患者に対してヒ ト CD80抗原を特異的に認識する抗ヒ 卜 CD80抗体の有効量を投与する工程を含む方法。 14. A method for treating and / or preventing an immune disease, which comprises the step of administering to a patient with an immune disease an effective amount of an anti-human CD80 antibody that specifically recognizes human CD80 antigen.
15. 該抗体が抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体である請求項 14に記載の方法。 15. The method according to claim 14, wherein said antibody is an anti-human CD80 monoclonal antibody.
16. 該抗体がヒ ト生体内で CD80陽性リンパ球排除能を有する抗ヒ ト CD80モノクロー ナル抗体である請求項 14又は 15に記載の方法。  16. The method according to claim 14 or 15, wherein the antibody is an anti-human CD80 monoclonal antibody capable of eliminating CD80-positive lymphocytes in a human body.
17. 免疫性疾患の治療及び 又は予防剤の製造のためのヒ ト CD80抗原を特異的に認 識する抗ヒ ト CD80抗体の使用。  17. Use of an anti-human CD80 antibody that specifically recognizes a human CD80 antigen for the manufacture of a therapeutic and / or prophylactic agent for an immune disease.
18. 該抗体が抗ヒ ト CD80モノクローナル抗体である請求項 17に記載の使用。  18. Use according to claim 17, wherein said antibody is an anti-human CD80 monoclonal antibody.
19. 該抗体がヒト生体内で CD80陽性リンパ球排除能を有する抗ヒ ト CD80モノクロ一 ナル抗体である請求項 17又は 18に記載の使用。  19. The use according to claim 17 or 18, wherein the antibody is an anti-human CD80 monoclonal antibody having CD80-positive lymphocyte elimination ability in a human body.
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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IMMUNITY, Vol. 1, No. 4, (1994), LESYA M. PINCHUK et al., "The Role of CD40 and CD80 Accessory Cell Molecules in Dendritic Cell-Dependent HIV-1 Infection", p. 317-325. *
THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, Vol. 153, (1994), JO VERWILGHEN et al., "Expression of Functional B7 and CTLA4 on Rheumatoid Synovial T Cells", p. 1378-1385. *

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