WO1996007890A1 - Process for the photometric detection of an agglutination reaction - Google Patents

Process for the photometric detection of an agglutination reaction Download PDF

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WO1996007890A1
WO1996007890A1 PCT/DE1994/001022 DE9401022W WO9607890A1 WO 1996007890 A1 WO1996007890 A1 WO 1996007890A1 DE 9401022 W DE9401022 W DE 9401022W WO 9607890 A1 WO9607890 A1 WO 9607890A1
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light transmittance
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agglutination
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Jörg Spindler
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Deutsches Rotes Kreuz Blutspendedienst Baden-Württemberg Gemeinnützige Gmbh
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    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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    • G01N21/82—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a precipitate or turbidity
    • G01N2021/825—Agglutination

Definitions

  • the invention relates to a method for the photometric detection of particle agglutination due to an antigen-antibody reaction in a sample which is illuminated and whose light transmittance is measured.
  • Agglutination tests on erythrocytes are carried out for blood group determination and blood tolerance tests. Also used to detect the presence or absence of antibodies or antigens in body fluids, e.g. B. blood serum, urine, cerebrospinal fluid or the like, carried out according to the prior art immunochemical agglutination tests.
  • body fluids e.g. B. blood serum, urine, cerebrospinal fluid or the like
  • immunochemical agglutination tests carried out according to the prior art immunochemical agglutination tests.
  • the clinical sample is mixed in a suitable dilution with an agglutination reagent that contains fine particles to which an antigen is used for antibody detection and an antibody for antigen detection. The particles agglutinate under the immunochemical antigen-antibody reaction.
  • Immunochemical agglutination tests are usually carried out by letting the agglutination reagent and the body fluid react to a slide or in a tube and the agglutination taking place or not taking place is monitored and evaluated with the unarmed eye. This only enables qualitative evidence that is not free from subjective influences; just think of the visual acuity of the person performing the test.
  • DE-A 40 40 726 There are a number of proposals for objectively recording agglutination reactions, primarily using photometric methods. Image processing techniques should also be mentioned (cf. DE-A 40 40 726).
  • DE-A-29 18 342, DE-A-34 38 256 and DE-A-35 31 891 show nephelometric measurements in which the intensity or the intensity fluctuations of the light scattered by a sample are detected.
  • the introduction to the description of DE-A-34 38 265 deals with a spectrophotometric measurement taking place in transmission.
  • DE-A-30 33 869 is based on the prior art of US-A-38 83 308, according to which an opacity measurement in transmission is provided. The sample is centrifuged in a reaction vessel with a curved bottom and then poured on again.
  • the object of the invention is to provide a method for the photometric detection of particle agglutination based on an antigen-antibody reaction, which can be carried out simply, quickly, with a large number of samples and largely automatically, permits qualitative and quantitative antibody or antigen determinations equally and is free of subjective influences , delivers highly significant results.
  • This task is performed using a method of the type mentioned at the beginning
  • the reaction-kinetic influence of the agglutination reaction on the light transmission of the sample in transmission is measured photometrically with measurements at the beginning, during or also towards the end of the reaction time. In this way, a highly significant result is obtained with little expenditure on equipment in a short measuring time.
  • the comparison of two measurement results for the light transmittance obtained on one and the same sample makes the method according to the invention insensitive to errors caused by intrinsic coloration of the sample, variations in the x-rayed sample layer thickness, e.g. B. due to imprecise metering, small optical errors of the reaction vessel u. a. can occur.
  • the sample must be in a layer thickness and dilution which allows light to pass through and in which an agglutination reaction brings about a noticeable change in the light transmittance.
  • Two is the minimum number of measurements. It should be noted that more than two measurements can be carried out at intervals and the measurement results can be compared. Two-point kinetic determinations and multi-point kinetic determinations during the reaction time of the agglutination reaction are possible as well as end point determinations in which the light transmission is essentially measured after the reaction time has elapsed.
  • the method according to the invention can be carried out on a sample which is located in a cuvette.
  • the cuvette is preferably illuminated from the side, in particular in a horizontal line, along a Z-shaped path or the like.
  • the method according to the invention is carried out with samples which are located on a microtiter plate. It is advisable to examine the microtiter plate transversely to its main plane, ie from top to bottom or from bottom to top. A large number of samples can be processed quickly on the microtiter plate and the measurement process can be largely automated. By presenting different reagents, different infection-serological parameters can be examined on the same microtiter plate. Correspondingly prepared microtiter plates can be manufactured industrially or in the laboratory, stored in the deep-freeze for a long time and thawed quickly if required.
  • the microtiter plate is preferably loaded with a multi-channel pipette, in particular a 96-channel pipette. This enables a fast, largely automated workflow. It should be noted that the microtiter plate can also be loaded in a different manner, in particular by conventional pipetting or by means of a pipetting robot.
  • each of the light transmission measurements taking place at intervals is carried out at a plurality of measuring points offset from one another.
  • a suitable grid of measuring points is placed over the sample.
  • a measurement is preferably carried out at approx.
  • the light transmittance is measured at rows of measuring points which extend parallel to rows or columns of microtiter plate cavities and essentially diametrically over each cavity.
  • a microtiter plate can thus move quickly and at high speed in one continuous movement Measurement accuracy can be scanned. Approx.
  • Geometric effects in particular prism effects on the edge, variations in the thickness of the specimen layer, scattered light effects, small optical defects in the reaction vessel, etc. are eliminated on average.
  • a suitable measure for the light transmission of the sample is the intensity of the light passing through.
  • the method according to the invention can be carried out with erythrocytes of a test subject and an antiserum for blood group determination. It is also possible to carry out the method with blood serum from a test subject and erythrocytes with known antigenic properties. If, for example, an anti A serum which contains antibodies characteristic of blood group A is presented, erythrocytes with antigen property A, which originate from blood of blood group A, show agglutination, which is detected as described above. The result can be confirmed by a cross-test with the patient's blood serum and erythrocytes with antigenic property A. Agglutination should not occur in the serum cross-test unless the rare case of an autoimmune disease (autoaggressive disease) is present.
  • autoaggressive disease autoaggressive disease
  • the method according to the invention can also be carried out with erythrocytes from one test subject and blood serum from another test subject. Blood tolerance tests are carried out with such cross-tests. Agglutination of the erythrocytes, as described above, indicates an existing intolerance.
  • the method according to the invention is carried out with an immunochemical agglutination reagent and a body fluid, in particular blood serum.
  • a latex-based agglutination reagent is preferably used. Typical latex agglutination reagents are milky cloudy. If agglutination occurs under the antigen-antibody reaction, the sample clears and the intensity of the light passing through increases.
  • An immunochemical agglutination reagent can first be introduced into the cavity of a microtiter plate, body fluid, in particular blood serum, added, if necessary, the reagent and body fluid mixed well, and a first measurement of the light transmission and after some time a second measurement of the light transmission.
  • body fluid in particular blood serum
  • body fluid can also be taken up with a pipette, if necessary continue to take up a dilution reagent with the pipette, continue to take up an immunochemical agglutination reagent with the pipette, introduce everything together into the cavity of a microtiter plate, if necessary ensure thorough mixing and a first Measure the light transmission and after a while take a second measurement of the light transmission.
  • Blood serum and agglutination reagent can also be taken in reverse order.
  • the method according to the invention is carried out on a sample which is located in a cuvette, the latter is preferably pivoted before the measurements of the light transmittance, turned upside down in the closed state or back or the like.
  • a sample which on a microtiter plate it is advisable to shake or swivel the microtiter plate before the light transmission measurements. This ensures intimate mixing and counteracts the settling of agglutinated particles, which are then brought back into suspension, which improves the informative value of the measurement.
  • the microtiter plate can be shaken and / or swirled all the time between measurements.
  • the antigen-antibody binding is correspondingly harder to break open again and the erythrocytes sediment more easily.
  • Shaking can cause artifacts.
  • H Particle accumulations in sample zones determined by the geometry of the shaking motion, which simulate agglutination. This is counteracted effectively by shaking the microtiter plate in a linear or preferably circular motion and superimposing a rocking swinging up and down in one or two directions perpendicular to one another, thus allowing the microtiter plate to wobble.
  • the method according to the invention is preferably carried out with a device known as a "reader" for measuring the optical extinction coefficient of samples located on a microtiter plate.
  • a reader for measuring the optical extinction coefficient of samples located on a microtiter plate.
  • Spectra I, II and III or ATTC readers from SLT Lab Instrument were used for the tests described below.
  • the measurements were carried out in a light wavelength range from 340 nm to 620 nm. For the measurement on erythrocytes, light wavelengths more in blue (e.g. 405 nm) are recommended, and for measurements on latex agglutination reagents light wavelengths more in red (e.g. 620 nm) .
  • cytomegalovirus (CMV) antibodies in the blood serum of a number of volunteers.
  • the reagents used come from the CMVSCAN® range from Becton Dickinson.
  • the main reagent is a passive (indirect) latex agglutination reagent that contains microscopic latex particles coated with CMV antigen in a buffer liquid.
  • the latex agglutination reagent is conventionally used for a card test in which the latex agglutina tion reagent mixed with a serum sample on a card and the agglutination taking place or not taking place is determined with the unarmed eye.
  • the CMVSCAN ® range contains a highly reactive control serum (++ Ktr), a medium reactive control serum (+ Ktr) and a non-reactive control serum (-Ktr).
  • a microtiter plate has ninety-six circular cavities in a grid of eight by twelve.
  • Table 1 the rows of the microtiter plate are labeled with the letters A to H and their columns with the numbers 1 to 12. Individual cavities are labeled with their row and column coordinates.
  • the non-reactive control serum (-Ktr) is in cavities AI and B1, the medium-reactive control serum (+ Ktr) in cavities C1 and D1 and the highly reactive control serum (++ Ktr) in cavities E1 and F1. submitted. All other cavities are filled with blood serum samples from various test subjects in a suitable dilution, which corresponds to the dilution of the control sera. This is done with a pipetting robot.
  • the latex agglutination reagent is pipetted onto a second microtiter plate using a 96-channel pipette. Then, the 96-channel pipette is used to pipette ninety-six serum samples from the first microtiter plate onto the second microtiter plate.
  • the second microtiter plate is shaken vigorously for about 1 minute and then placed in a Spectra II reader from SLT Lab Instrument. With the reader, the microtiter plate is scanned line by line and the optical transmittance of the samples in the cavities is measured. Forty equidistant measuring points are provided per cavity on a grid line that extends diametrically across the cavity. The scan follows the cavity lines. The measured values for the transmittance are saved. The second microtiter plate is then removed from the reader, shaken and swirled for about 15 minutes and placed again in the reader, where the measurement of the optical transmittance is repeated. The measured values of the second measurement are also saved.
  • the measured values of the first and second measurements are compared with one another for evaluation. This can be done in various ways, for example individually for the measured values at each measuring point of a cavity, or by averaging the measured values of the first and second measurements on a cavity. A difference and quotient formation of the values is possible as well as a calculation of OD values or ⁇ E / t values (change ⁇ in the extinction coefficient E per time t).
  • the transmittance measured values at each of the twenty middle measuring points were selected, the mean value of the transmittance measured values of the first and second measurements was taken, and the mean value of the second measurement was divided by the mean value of the first measurement.
  • the ratio values obtained are summarized in Table 1. They are rated with (-) for negative, (+) for positive and (?) For questionable.
  • the transmittance measured values of the ten measuring points near the edge on both sides of the middle 20 measuring points were not included in the evaluation, since they are more likely to be falsified by geometric effects, scattered light, etc. subject to.
  • Fig. 7 provides a summary of the measurement results on all cavities.
  • the evaluation of the measurement results is secured by warning functions. If the measured transmittance of a sample is absolutely too low, the serum is marked as possibly lipemic. In this case too much reagent may have been presented, so that the sample layer thickness to be screened is too large, or there is an error in the dilution. If the measured transmittance is absolutely too high, then no serum and / or no agglutination reagent may have been incorrectly presented or the incubation time before the first measurement may have been exceeded. An absolutely too high or too low ratio value can indicate the presence of an air bubble in one of the measurements or an overreaction.
  • the measured ratio values of the transmittance are subject to changes in the composition of the latex agglutination reagent due to the batch, due to the influence of the vibrator, due to optical effects and the like. a. certain fluctuations. Your evaluation is therefore secured by the measurement on the control sera.
  • the significance assessment of the ratio values can be carried out on the basis of the measurement result on the non-reactive control serum (-Ktr), which results in artifacts, irregularities in the shaking process and the like during shaking. a. allows to recognize. Is, for example, a measurement on the non-reactive control serum (-Ktr)
  • the ratio value of the non-reactive control serums (-Ktr) a fixed amount can be added.
  • the scattering of the (-Ktr) ratio values can be taken into account when setting the threshold value according to statistical or empirical methods. With the medium reactive (+ Ktr) and strongly reactive control serum (++ Ktr) the reactivity of the agglutination reagent and the observance of proper measuring conditions are checked.
  • Non-reactive (-Ktr), medium reactive (+ Ktr) and highly reactive (++ ⁇ tr) control serum is titrated down on a microtiter plate in titer steps of 1/2 and the measurement described above is carried out with the samples.
  • Row A in Table 2 contains the samples of the non-reactive control serum (-Ktr) down-titrated from cavity 1 in cavity 2, from cavity 2 in cavity 3, etc.
  • row C the samples of the medium-reactive crown troll serum (+ Ktr)
  • row E the same down-titrated samples samples of the highly reactive control serum (++ Ktr) titrated down as well.
  • the concentration of the CMV antibodies is halved from one cavity to the next.
  • the cavities of rows B, D, F, G and H are empty.
  • the measured ratio values of the transmittance are shown in Table 2 and shown in Fig. 8.
  • the medium reactive control serum (+ Ktr) can be detected over 4 to 5 and the highly reactive control serum (++ Ktr) over 8 titer levels.
  • the highly reactive control serum (++ Ktr) shows a pronounced prozone phenomenon (Heidelberg curve) in the low titer levels.
  • the agglutination test was 1 to 2 titer levels more sensitive than the ELISA test. Apart from the proven high sensitivity of the method according to the invention, this shows the possibility of routinely working with a correspondingly diluted latex agglutination reagent, which is preferred for reasons of cost.
  • Experiment 2 demonstrates the possibility of carrying out not only qualitative, but also quantitative measurements of high accuracy using the agglutination method according to the invention.
  • the agglutination test according to the invention is quicker, easier to carry out and less expensive in terms of equipment and the reagents used.
  • the reagents are cheaper and easier to use.
  • Environmentally harmful reagents such as
  • B Chromogen solution (e.g. tetramethylbenzidine dihydrochloride) and stop solution H 2 SO 4 .
  • the agglutination test is also easier to automate.
  • the implementation of the method according to the invention using a latex agglutination reagent has an exemplary character.
  • Other reagents with particles that can bind an antigen or an antibody and agglutinate under an antigen-antibody reaction e.g. B. glass beads, polybutadiene, polystyrene, butadiene-styrene copolymers, carbon particles, erythrocytes, etc.
  • the particles should have a size and weight so that they can be kept largely in a state of suspension, ie preferably small and light.
  • agglutination reagent can be introduced and body fluid, in particular blood serum, can be added, but conversely, body fluid, in particular blood serum, can be introduced and agglutination reagent added.
  • a simultaneous task is also possible.
  • the shaking and / or swiveling of the microtiter plate are advantageous, but not always mandatory for the invention.
  • the measurement of the light transmittance can be carried out more than twice with a time interval (agglutination two-point kinetics or agglutination multipoint kinetics or agglutination end point determination).
  • agglutination tests on erythrocytes of human origin can be carried out with certain antigen-antibody properties, especially for blood group determinations and cross-tests.

Abstract

The particle agglutination is detected on the basis of an antigen-antibody reaction in a sample by transilluminating said sample and measuring its translucency at least twice at intervals of time, comparing the results of measurement and thus detecting the changes in the translucency of the sample brought about by the agglutination reaction.

Description

Verfahren zur photometrischen Erfassung einer Agglutinationsreaktion Process for the photometric detection of an agglutination reaction
Beschreibung description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur photometrischen Erfassung einer Partikelagglutination aufgrund einer Antigen-Antikörperreaktion in einer Probe, die durchleuchtet und deren Lichtdurchlässigkeit gemessen wird. The invention relates to a method for the photometric detection of particle agglutination due to an antigen-antibody reaction in a sample which is illuminated and whose light transmittance is measured.
Agglutinationsuntersuchungen an Erythrozyten werden für Blutgruppenbestimmungen und Blutverträglichkeitsproben durchgeführt. Auch werden zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern oder Antigenen in Körperflüssigkeiten, z. B. Blutserum, Urin, cerebrospinaler Flüssigkeit o. ä., nach dem Stand der Technik immunochemische Agglutinationstests durchgeführt. Nach der sog. indirekten Methode wird die klinische Probe in geeigneter Verdünnung mit einem Agglutinationsreagenz versetzt, das feinteilige Partikel enthält, an die für den Antikörpernachweis ein Antigen und für den Antigennachweis ein Antikörper gebunden ist. Unter der immunochemischen Antigen-Antikörperreaktion agglutinieren die Partikel. Agglutination tests on erythrocytes are carried out for blood group determination and blood tolerance tests. Also used to detect the presence or absence of antibodies or antigens in body fluids, e.g. B. blood serum, urine, cerebrospinal fluid or the like, carried out according to the prior art immunochemical agglutination tests. According to the so-called indirect method, the clinical sample is mixed in a suitable dilution with an agglutination reagent that contains fine particles to which an antigen is used for antibody detection and an antibody for antigen detection. The particles agglutinate under the immunochemical antigen-antibody reaction.
Immunochemische Agglutinationstests werden überlicherweise durchgeführt, indem man das Agglutinationsreagenz und die Körperflüssigkeit auf einen Objektträger oder in einem Röhrchen reagieren läßt und die stattfindende oder auch nicht stattfindende Agglutination mit dem unbewaffneten Auge verfolgt und bewertet. Das ermöglicht nur einen qualitativen Nachweis, der von subjektiven Einflüssen nicht frei ist; man denke nur an die Sehschärfe der den Test durchführenden Person. Immunochemical agglutination tests are usually carried out by letting the agglutination reagent and the body fluid react to a slide or in a tube and the agglutination taking place or not taking place is monitored and evaluated with the unarmed eye. This only enables qualitative evidence that is not free from subjective influences; just think of the visual acuity of the person performing the test.
Es gibt eine Reihe von Vorschlägen, Agglutinationsreaktionen objektiv zu erfassen, und zwar vorwiegend nach photometrischen Verfahren. Bildverarbeitungstechniken seien daneben erwähnt (vgl. die DE-A 40 40 726). Der DE-A-29 18 342, DE-A-34 38 256 und DE-A-35 31 891 sind nephelometrische Messungen zu entnehmen, bei denen die Intensität oder die Intensitätsschwankungen des von einer Probe gestreuten Lichts erfaßt werden. In der Beschreibungseinleitung der DE-A-34 38 265 ist eine in Transmission stattfindende spektralphotometrische Messung behandelt. Die DE-A-30 33 869 geht von dem Stand der Technik der US-A-38 83 308 aus, nach dem eine Opazitätsmessung in Transmission vorgesehen ist. Die Probe wird in einem Reaktionsgefäß mit einem gewölbten Boden zentrifugiert und anschließend wieder aufgeschüttet. An zwei Meßpunkten in der Bodenmitte und am Rand des Bodens wird Licht eingestrahlt und die Intensität des durch die Probe hindurchtretenden Lichts erfaßt. Agglutinierende Partikel sedimentieren zur Mitte des gewölbten Bodens hin. Eine Verringerung der Lichtdurchlässigkeit in der Mitte bei gleichzeitiger Vergrößerung der Lichtdurchlässigkeit am Rand kann daher als Vorliegen von Agglutination interpretiert werden. There are a number of proposals for objectively recording agglutination reactions, primarily using photometric methods. Image processing techniques should also be mentioned (cf. DE-A 40 40 726). DE-A-29 18 342, DE-A-34 38 256 and DE-A-35 31 891 show nephelometric measurements in which the intensity or the intensity fluctuations of the light scattered by a sample are detected. The introduction to the description of DE-A-34 38 265 deals with a spectrophotometric measurement taking place in transmission. DE-A-30 33 869 is based on the prior art of US-A-38 83 308, according to which an opacity measurement in transmission is provided. The sample is centrifuged in a reaction vessel with a curved bottom and then poured on again. At two measuring points in the middle of the bottom and at the edge of the bottom, light is irradiated and the intensity of the light passing through the sample is detected. Agglutinating particles sediment towards the center of the curved floor. A reduction in the light transmittance in the middle with a simultaneous increase in the light transmittance at the edge can therefore be interpreted as the presence of agglutination.
Mit dem Verfahren der US-A-38 83 308 einhergehende Referenzeichungs- und Streulichtprobleme sind in der DE-A-30 33 869 zutreffend behandelt. Überdies wird die Aussagekraft des Ergebnisses dadurch eingeschränkt, daß nicht die Agglutinationsreaktion selbst, sondern ein sekundärer Sedimentationsvorgang agglutinierter Partikel photometrisch erfaßt wird. The reference drawing and scattered light problems associated with the method of US-A-38 83 308 are correctly dealt with in DE-A-30 33 869. Furthermore, the meaningfulness of the result is limited by the fact that it is not the agglutination reaction itself, but a secondary sedimentation process of agglutinated particles that is recorded photometrically.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur photometrischen Erfassung einer Partikelagglutination aufgrund einer AntigenAntikörperreaktion zu schaffen, das sich einfach, schnell, mit einer großen Zahl von Proben und weitgehend automatisch durchführen läßt, qualitative und quantitative Antikörperoder Antigenbestimmungen gleichermaßen gestattet und ein von subjektiven Einflüssen freies, hochsignifikantes Ergebnis liefert. Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren der eingangs genanntenThe object of the invention is to provide a method for the photometric detection of particle agglutination based on an antigen-antibody reaction, which can be carried out simply, quickly, with a large number of samples and largely automatically, permits qualitative and quantitative antibody or antigen determinations equally and is free of subjective influences , delivers highly significant results. This task is performed using a method of the type mentioned at the beginning
Art dadurch gelöst, daß man die Lichtdurchlässigkeit der Probe wenigstens zweimal in zeitlichem Abstand mißt, die Meßergebnisse vergleicht und so durch die Agglutinationsreaktion bedingte Änderungen in der Lichtdurchlässigkeit der Probe erfaßt. Art solved in that the light transmittance of the sample is measured at least twice in time, the measurement results are compared and changes in the light transmittance of the sample due to the agglutination reaction are detected.
Erfindungsgemäß wird mit Messungen zu Beginn, während oder auch gegen Ende der Reaktionszeit der reaktionskinetische Einfluß der Agglutinationsreaktion auf die Lichtdurchlässigkeit der Probe in Transmission photometrisch erfaßt. Man erhält so mit geringem apparativem Aufwand in kurzer Meßzeit ein hochsignifikantes Ergebnis. Der Vergleich von zwei an ein und derselben Probe gewonnenen Meßergebnissen für die Lichtdurchlässigkeit macht das erfindungsgemäße Verfahren unempfindlich gegen Fehler, die durch Eigenfärbung der Probe, Variationen in der durchleuchteten Probenschichtdicke z. B. aufgrund ungenauer Mengendosierung, kleine optische Fehler des Reaktionsgefäßes u. a. eintreten können. According to the invention, the reaction-kinetic influence of the agglutination reaction on the light transmission of the sample in transmission is measured photometrically with measurements at the beginning, during or also towards the end of the reaction time. In this way, a highly significant result is obtained with little expenditure on equipment in a short measuring time. The comparison of two measurement results for the light transmittance obtained on one and the same sample makes the method according to the invention insensitive to errors caused by intrinsic coloration of the sample, variations in the x-rayed sample layer thickness, e.g. B. due to imprecise metering, small optical errors of the reaction vessel u. a. can occur.
Es versteht sich, daß die Probe in einer Schichtdicke und Verdünnung vorliegen muß, die ein Hindurchtreten von Licht ermöglicht und bei der eine Agglutinationsreaktion eine merkliche Änderung in der Lichtdurchlässigkeit bewirkt. It goes without saying that the sample must be in a layer thickness and dilution which allows light to pass through and in which an agglutination reaction brings about a noticeable change in the light transmittance.
Zwei ist die Mindestzahl von Messungen. Wohlgemerkt können in zeitlichem Abstand auch mehr als zwei Messungen durchgeführt und die Meßergebnisse verglichen werden. Zweipunktkinetik-Bestimmungen und Mehrpunktkinetik-Bestimmungen während der Reaktionszeit der Agglutinationsreaktion sind ebenso möglich wie Endpunktbestimmungen, bei denen man eine Messung der Lichtdurchlässigkeit im wesentlichen nach Verstreichen der Reaktionszeit vornimmt. Two is the minimum number of measurements. It should be noted that more than two measurements can be carried out at intervals and the measurement results can be compared. Two-point kinetic determinations and multi-point kinetic determinations during the reaction time of the agglutination reaction are possible as well as end point determinations in which the light transmission is essentially measured after the reaction time has elapsed.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann an einer Probe durchgeführt werden, die sich in einer Küvette befindet. Die Küvette wird vorzugsweise von der Seite durchleuchtet, insbesondere in einer horizontalen Zeile, entlang einer Z-förmigen Bahn o. ä. In einer bevorzugten Variante wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Proben durchgeführt, die sich auf einer Mikrotiterplatte befinden. Dabei empfiehlt es sich, die Mikrotiterplatte quer zu ihrer Hauptebene zu durchleuchten, d. h. von oben nach unten oder von unten nach oben. Auf der Mikrotiterplatte können schnell eine Vielzahl von Proben bearbeitet werden, und es ist eine weitgehende Automatisierung des Meßablaufs möglich. Durch Vorlegen verschiedener Reagenzien können an ein und derselben Mikrotiterplatte verschiedene infektionsserologische Parameter untersucht werden. Entsprechend präparierte Mikrotiterplatten können industriell oder im Laborbetrieb hergestellt, in tiefgefrorenem Zustand längere Zeit aufbewahrt und bei Bedarf schnell aufgetaut werden. The method according to the invention can be carried out on a sample which is located in a cuvette. The cuvette is preferably illuminated from the side, in particular in a horizontal line, along a Z-shaped path or the like. In a preferred variant, the method according to the invention is carried out with samples which are located on a microtiter plate. It is advisable to examine the microtiter plate transversely to its main plane, ie from top to bottom or from bottom to top. A large number of samples can be processed quickly on the microtiter plate and the measurement process can be largely automated. By presenting different reagents, different infection-serological parameters can be examined on the same microtiter plate. Correspondingly prepared microtiter plates can be manufactured industrially or in the laboratory, stored in the deep-freeze for a long time and thawed quickly if required.
Die Beschickung der Mikrotiterplatte wird vorzugsweise mit eine Mehrkanalpipette, insbesondere einer 96-Kanalpipette, durchgeführt. Das ermöglicht einen schnellen, weitgehend automatisierbaren Arbeitsablauf. Wohlgemerkt kann die Beschickung der Mikrotiterplatte auch in anderer Weise erfolgen, insbesondere durch herkömmliches Pipettieren oder mittels eines Pipettierroboters. The microtiter plate is preferably loaded with a multi-channel pipette, in particular a 96-channel pipette. This enables a fast, largely automated workflow. It should be noted that the microtiter plate can also be loaded in a different manner, in particular by conventional pipetting or by means of a pipetting robot.
Gemäß einer bevorzugten Variante der Erfindung wird eine jede der in zeitlichem Abstand stattfindenden Lichtdurchlässigkeitsmessungen an mehreren voneinander versetzten Meßstellen durchgeführt. Dazu wird ein geeignetes Raster von Meßstellen über die Probe gelegt. Vorzugsweise erfolgt eine Messung an ca. According to a preferred variant of the invention, each of the light transmission measurements taking place at intervals is carried out at a plurality of measuring points offset from one another. For this purpose, a suitable grid of measuring points is placed over the sample. A measurement is preferably carried out at approx.
10 bis ca. 50, insbesondere ca. 20 Meßstellen, die zweidimensional, z. B. in einem quadratischen Raster, mäanderförmig oder längs der Kanten eines Dreiecks über die Probenfläche verteilt, aber auch im wesentlichen äquidistant auf einer über die Probe sich erstreckenden linearen Zeile liegen können. 10 to about 50, especially about 20 measuring points, the two-dimensional, z. B. distributed in a square grid, meandering or along the edges of a triangle over the sample surface, but may also be substantially equidistant on a linear line extending over the sample.
In einer bevorzugten Variante wird die Lichtdurchlässigkeit an Zeilen von Meßstellen gemessen, die sich parallel zu Reihen oder Spalten von Mikrotiterplattenkavitäten und im wesentlichen diametral über eine jede Kavität erstrecken. Eine Mikrotiterplatte kann so in durchgehender Bewegung schnell und mit hoher Meßgenauigkeit durchgescant werden. Pro Kavität sollen ca. In a preferred variant, the light transmittance is measured at rows of measuring points which extend parallel to rows or columns of microtiter plate cavities and essentially diametrically over each cavity. A microtiter plate can thus move quickly and at high speed in one continuous movement Measurement accuracy can be scanned. Approx.
10 bis ca. 50, vorzugsweise ca. 20 Meßstellen in die Auswertung einbezogen werden. Es wird so jeweils ein großer Teil der Probe erfaßt, was der Aussagekraft des Ergebnisses zugute kommt. 10 to approx. 50, preferably approx. 20 measuring points are included in the evaluation. In this way, a large part of the sample is recorded, which enhances the informative value of the result.
Geometrische Effekte, insbesondere Prismeneffekte am Rand, Variationen in der durchleuchteten Probenschichtdicke, Streulichteffekte, kleine optische Fehler des Reaktionsgefäßes u.s.w. werden im Mittel eliminiert. Geometric effects, in particular prism effects on the edge, variations in the thickness of the specimen layer, scattered light effects, small optical defects in the reaction vessel, etc. are eliminated on average.
Ein geeignetes Maß für die Lichtdurchlässigkeit der Probe ist die Intensität des hindurchtretenden Lichts. A suitable measure for the light transmission of the sample is the intensity of the light passing through.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit Erythrozyten eines Probanden und einem Antiserum zur Blutgruppenbestimmung durchgeführt werden. Ebenso besteht die Möglichkeit, das Verfahren mit Blutserum eines Probanden und Erythrozyten bekannter Anti- geneigenschaft durchzuführen. Legt man beispielsweise ein Serum Anti A vor, das für die Blutgruppe A charakteristische Antikörper enthält, so zeigen Erythrozyten mit der Antigeneigenschaft A, die aus Blut der Blutgruppe A stammen, eine Agglutination, die wie vorstehend beschrieben nachgewiesen wird. Das Ergebnis kann durch eine Gegenprobe mit Blutserum des Probanden und Erythrozyten der Antigeneigenschaft A abgesichert werden. Bei der Serumgegenprobe darf keine Agglutination auftreten, es sei denn, es liegt der seltene Fall einer Autoimmunkrankheit (Autoaggressionskrankheit) vor. The method according to the invention can be carried out with erythrocytes of a test subject and an antiserum for blood group determination. It is also possible to carry out the method with blood serum from a test subject and erythrocytes with known antigenic properties. If, for example, an anti A serum which contains antibodies characteristic of blood group A is presented, erythrocytes with antigen property A, which originate from blood of blood group A, show agglutination, which is detected as described above. The result can be confirmed by a cross-test with the patient's blood serum and erythrocytes with antigenic property A. Agglutination should not occur in the serum cross-test unless the rare case of an autoimmune disease (autoaggressive disease) is present.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit Erythrozyten eines Probanden und Blutserum eines anderen Probanden durchgeführt werden. Mit solchen Kreuzproben werden Blutverträglichkeitsuntersuchungen durchgeführt. Eine wie vorstehend beschrieben nachgewiesene Agglutination der Erythrozyten zeigt eine bestehende Unverträglichkeit an. In einer weiteren Variante wird das erfindungsgemäße Verfahren mit einem immunochemischen Agglutinationsreagenz und einer Körperflüssigkeit, insbesonder Blutserum, durchgeführt. Vorzugsweise wird ein Agglutinationsreagenz auf Latexbasis verwendet. Typische Latex-Agglutinationsreagenzien sind milchig trüb. Kommt es unter der Antigen-Antikörperreaktion zu einer Agglutination, so klart die Probe auf, und die Intensität des hindurchtretenden Lichts steigt an. Wird während der potentiellen Reaktionszeit der Agglutinationsreaktion anfangs ein niedriger und später ein signifikant höherer Intensitätswert des durch die Probe hindurchtretenden Lichts festgestellt, so ist das ein Zeichen dafür, daß eine Agglutinationsreaktion stattgefunden hat. Tritt hingegen keine Agglutination ein, weil der nachzuweisende Antikörper bzw. das nachzuweisende Antigen in der Probe nicht vorhanden ist, so bleibt die Intensität des durch die Probe hindurchtretenden Lichts im wesentlichen konstant. The method according to the invention can also be carried out with erythrocytes from one test subject and blood serum from another test subject. Blood tolerance tests are carried out with such cross-tests. Agglutination of the erythrocytes, as described above, indicates an existing intolerance. In a further variant, the method according to the invention is carried out with an immunochemical agglutination reagent and a body fluid, in particular blood serum. A latex-based agglutination reagent is preferably used. Typical latex agglutination reagents are milky cloudy. If agglutination occurs under the antigen-antibody reaction, the sample clears and the intensity of the light passing through increases. If during the potential reaction time of the agglutination reaction a lower and later a significantly higher intensity value of the light passing through the sample is found, this is a sign that an agglutination reaction has taken place. If, on the other hand, no agglutination occurs because the antibody to be detected or the antigen to be detected is not present in the sample, the intensity of the light passing through the sample remains essentially constant.
Man kann zunächst ein immunochemisches Agglutinationsreagenz in die Kavität einer Mikrotiterplatte einbringen, Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, dazugeben, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung von Reagenz und Körperflüssigkeit sorgen und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durchführen. An immunochemical agglutination reagent can first be introduced into the cavity of a microtiter plate, body fluid, in particular blood serum, added, if necessary, the reagent and body fluid mixed well, and a first measurement of the light transmission and after some time a second measurement of the light transmission.
Es besteht aber auch die Möglichkeit, zunächst Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, in die Kavität einer Mikrotiterplatte einzubringen, immunochemisches Agglutinationsreagenz dazuzugeben, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung von Körperflüssigkeit und Reagenz zu sorgen und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durchzuführen. Schließlich kann man auch Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, mit einer Pipette aufnehmen, gegebenenfalls weiter ein Verdünnungsreagenz mit der Pipette aufnehmen, weiter ein immunochemisches Agglutinationsreagenz mit der Pipette aufnehmen, alles zusammen in die Kavität einer Mikrotiterplatte einbringen, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung sorgen und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durchführen. Blutserum und Agglutinationsreagenz können auch in umgekehrter Reihenfolge aufgenommen werden. However, there is also the possibility of first introducing body fluid, in particular blood serum, into the cavity of a microtiter plate, adding immunochemical agglutination reagent, if necessary ensuring that the body fluid and reagent are thoroughly mixed, and a first measurement of the light transmittance and after some time a second measurement of the light transmittance perform. Finally, body fluid, in particular blood serum, can also be taken up with a pipette, if necessary continue to take up a dilution reagent with the pipette, continue to take up an immunochemical agglutination reagent with the pipette, introduce everything together into the cavity of a microtiter plate, if necessary ensure thorough mixing and a first Measure the light transmission and after a while take a second measurement of the light transmission. Blood serum and agglutination reagent can also be taken in reverse order.
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens an einer Probe, die sich in einer Küvette befindet, wird letztere vor den Messungen der Lichtdurchlässigkeit vorzugsweise geschwenkt, in verschlossenem Zustand auf den Kopf und wieder zurück gestellt o. ä. Bei Durchführung des Verfahrens an einer Probe, die sich auf einer Mikrotiterplatte befindet, empfiehlt es sich, die Mikrotiterplatte vor den Messungen der Lichtdurchlässigkeit zu rütteln oder zu schwenken. Dadurch wird eine innige Durchmischung erreicht und einem Absetzen agglutinierter Partikel entgegengewirkt, die wieder in den Schwebezustand überführt werden, was die Aussagekraft der Messung verbessert. Die Mikrotiterplatte kann die ganze Zeit zwischen den Messungen gerüttelt und/oder geschwenkt werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, die Mikrotiterplatte in Intervallen zu rütteln und/ oder zu schwenken, insbesondere zwischen aufeinanderfolgenden Messungen eine Zeitlang stehen zu lassen und unmittelbar vor der späteren Messung wieder zu rütteln und/oder zu schwenken. Das optimale Vorgehen hängt von den Reagenzien ab, mit denen die Agglutinationsmessung durchgeführt wird. Bei Messungen an Agglutinationsreagenzien mit kleinen und/oder leichten Partikeln, die mit schwacher Bindungskapazität agglutinieren, empfiehlt sich ein ständiges Rütteln und/oder Schwenken, da die Partikel so besser in einem reaktionssensiblen Schwebezustand gehalten werden können. Bei einem starken Aufschütteln sedimentierter Partikel besteht hier eher die Gefahr, die Antigen-Antikörperbindung aufzubrechen. Bei Messungen an Erythrozy ten empfiehlt sich eher ein intervallweises Rütteln und/oderWhen the method according to the invention is carried out on a sample which is located in a cuvette, the latter is preferably pivoted before the measurements of the light transmittance, turned upside down in the closed state or back or the like. When carrying out the method on a sample which on a microtiter plate, it is advisable to shake or swivel the microtiter plate before the light transmission measurements. This ensures intimate mixing and counteracts the settling of agglutinated particles, which are then brought back into suspension, which improves the informative value of the measurement. The microtiter plate can be shaken and / or swirled all the time between measurements. However, there is also the possibility of shaking and / or pivoting the microtiter plate at intervals, in particular allowing it to stand for a while between successive measurements and shaking and / or pivoting again immediately before the later measurement. The optimal procedure depends on the reagents with which the agglutination measurement is carried out. When measuring agglutination reagents with small and / or light particles that agglutinate with weak binding capacity, it is advisable to constantly shake and / or swivel them, as the particles can be better kept in a reaction-sensitive state of suspension. If sedimented particles are shaken vigorously, there is a greater risk of breaking the antigen-antibody bond. When measuring on erythrozy Intermittent shaking and / or is recommended
Schwenken, da die Erythrozyten mit starker Bindungskapazität agglutinieren, die Antigen-Antikörperbindung entsprechend schwerer wieder aufzubrechen ist und die Erythrozyten leichter sedimentieren. Panning, since the erythrocytes with a strong binding capacity agglutinate, the antigen-antibody binding is correspondingly harder to break open again and the erythrocytes sediment more easily.
Durch das Rütteln können Artefakte entstehen, d. h. Partikelansammlungen in durch die Geometrie der Rüttelbewegung bestimmten Probezonen, die eine Agglutination vortäuschen. Man begegnet dem wirkungsvoll dadurch, daß man die Mikrotiterplatte in linearer oder vorzugsweise kreisender Bewegung rüttelt und diesem Rütteln ein wippendes Auf- und Niederschwenken in einer oder zwei zueinander senkrechten Richtungen überlagert, die Mikrotiterplatte also eine Taumelbewegung durchführen läßt. Shaking can cause artifacts. H. Particle accumulations in sample zones determined by the geometry of the shaking motion, which simulate agglutination. This is counteracted effectively by shaking the microtiter plate in a linear or preferably circular motion and superimposing a rocking swinging up and down in one or two directions perpendicular to one another, thus allowing the microtiter plate to wobble.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren mit einer als "Reader" bekannten Vorrichtung zur Messung des optischen Extinktionskoeffizienten von auf einer Mikrotiterplatte befindlichen Proben durchgeführt. Für die nachstehend beschriebenen Versuche kamen Reader von Typ Spectra I, II und III oder ATTC der Firma SLT Lab Instrument zum Einsatz. Die Messungen erfolgten in einem Lichtwellenlängenbereich von 340 nm bis 620 nm. Für die Messung an Erythrozyten empfehlen sich Lichtwellenlängen mehr im Blauen (z. B. 405 nm), und für Messungen an LatexAgglutinationsreagenzien Lichtwellenlängen mehr im Roten (z. B. 620 nm). The method according to the invention is preferably carried out with a device known as a "reader" for measuring the optical extinction coefficient of samples located on a microtiter plate. Spectra I, II and III or ATTC readers from SLT Lab Instrument were used for the tests described below. The measurements were carried out in a light wavelength range from 340 nm to 620 nm. For the measurement on erythrocytes, light wavelengths more in blue (e.g. 405 nm) are recommended, and for measurements on latex agglutination reagents light wavelengths more in red (e.g. 620 nm) .
1. Versuch 1st attempt
Es wird ein Versuch zum Nachweis von Cytomegalievirus (CMV)Antikörpern im Blutserum einer Anzahl Probanden durchgeführt. Die verwendeten Reagenzen entstammen dem Sortiment CMVSCAN® der Firma Becton Dickinson. Hauptreagenz ist ein passives (indirektes) Latexagglutinationsreagenz, das mit CMV-Antigen belegte mikroskopische Latexpartikel in einer Puftertlüssigkeit enthält. Das Latexagglutinationsreagenz wird herkömmlicherweise für einen Kartentest verwendet, bei dem das Latexagglutina tionsreagenz mit einer Serumprobe auf einer Karte vermischt und die stattfindende bzw. nicht stattfindende Agglutination mit dem unbewaffneten Auge festgestellt wird. Als Referenz enthält das Sortiment CMVSCAN ® ein stark reaktives Kontrollserum (++Ktr), ein mittel reaktives Kontrollserum (+Ktr) und ein nicht reaktives Kontrollserum (-Ktr). An attempt is being made to detect cytomegalovirus (CMV) antibodies in the blood serum of a number of volunteers. The reagents used come from the CMVSCAN® range from Becton Dickinson. The main reagent is a passive (indirect) latex agglutination reagent that contains microscopic latex particles coated with CMV antigen in a buffer liquid. The latex agglutination reagent is conventionally used for a card test in which the latex agglutina tion reagent mixed with a serum sample on a card and the agglutination taking place or not taking place is determined with the unarmed eye. As a reference, the CMVSCAN ® range contains a highly reactive control serum (++ Ktr), a medium reactive control serum (+ Ktr) and a non-reactive control serum (-Ktr).
Eine Mikrotiterplatte hat sechsundneunzig kreisrunde Kavitäten im Raster acht mal zwölf. In Tabelle 1 sind die Zeilen der Mikrotiterplatte mit den Buchstaben A bis H und ihre Spalten mit den Ziffern 1 bis 12 bezeichnet. Einzelne Kavitäten werden mit ihren Zeilen- und Spaltenkoordinaten bezeichnet. A microtiter plate has ninety-six circular cavities in a grid of eight by twelve. In Table 1, the rows of the microtiter plate are labeled with the letters A to H and their columns with the numbers 1 to 12. Individual cavities are labeled with their row and column coordinates.
Auf einer ersten Mikrotiterplatte wird in den Kavitäten AI und B1 das nicht reaktive Kontrollserum (-Ktr), in den Kavitäten C1 und D1 das mittel reaktive Kontrollserum (+Ktr) und in den Kavitäten E1 und F1 das stark reaktive Kontrollserum (++Ktr) vorgelegt. Alle anderen Kavitäten werden in geeigneter Verdünnung, die der Verdünnung der Kontrollseren entspricht, mit Blutserumproben verschiedener Probanden beschickt. Das geschieht mit einem Pipettierroboter. On a first microtiter plate, the non-reactive control serum (-Ktr) is in cavities AI and B1, the medium-reactive control serum (+ Ktr) in cavities C1 and D1 and the highly reactive control serum (++ Ktr) in cavities E1 and F1. submitted. All other cavities are filled with blood serum samples from various test subjects in a suitable dilution, which corresponds to the dilution of the control sera. This is done with a pipetting robot.
Auf eine zweite Mikrotiterplatte wird mit einer 96-Kanalpipette das Latexagglutinationsreagenz aufpipettiert. Sodann werden mit der 96-Kanalpipette sechsundneunzig Serumproben von der ersten Mikrotiterplatte auf die zweite Mikrotiterplatte pipettiert. The latex agglutination reagent is pipetted onto a second microtiter plate using a 96-channel pipette. Then, the 96-channel pipette is used to pipette ninety-six serum samples from the first microtiter plate onto the second microtiter plate.
Die zweite Mikrotiterplatte wird ca. 1 min stark gerüttelt und dann in einen Reader vom Typ Spectra II der Firma SLT Lab Instrument gestellt. Mit dem Reader wird die Mikrotiterplatte zeilenweise gescant und der optische Transmissionsgrad der Proben in den Kavitäten gemessen. Pro Kavität sind auf einer Rasterzeile, die sich diametral über die Kavität erstreckt, vierzig äquidistante Meßstellen vorgesehen. Der Scan folgt den Kavitätenzeilen. Die Meßwerte für den Transmissionsgrad werden gespeichert. Sodann wird die zweite Mikrotiterplatte aus dem Reader genommen, ca. 15 min gerüttelt und geschwenkt und erneut in den Reader gestellt, wo die Messung des optischen Transmissionsgrads wiederholt wird. Auch die Meßwerte der zweiten Messung werden gespeichert. The second microtiter plate is shaken vigorously for about 1 minute and then placed in a Spectra II reader from SLT Lab Instrument. With the reader, the microtiter plate is scanned line by line and the optical transmittance of the samples in the cavities is measured. Forty equidistant measuring points are provided per cavity on a grid line that extends diametrically across the cavity. The scan follows the cavity lines. The measured values for the transmittance are saved. The second microtiter plate is then removed from the reader, shaken and swirled for about 15 minutes and placed again in the reader, where the measurement of the optical transmittance is repeated. The measured values of the second measurement are also saved.
Zur Auswertung werden die Meßwerte der ersten und zweiten Messung miteinander verglichen. Das kann auf verschiedene Weise geschehen, beispielsweise einzeln für die Meßwerte an einer jeden Meßstelle einer Kavität, oder unter Bildung von Mittelwerten der Meßwerte der ersten und zweiten Messung an einer Kavität. Eine Differenz- und Quotientenbildung der Werte ist ebenso möglich wie eine Berechnung von OD-Werten oder ΔE/tWerten (Änderung Δ des Extinktionskoeffizienten E pro Zeit t). The measured values of the first and second measurements are compared with one another for evaluation. This can be done in various ways, for example individually for the measured values at each measuring point of a cavity, or by averaging the measured values of the first and second measurements on a cavity. A difference and quotient formation of the values is possible as well as a calculation of OD values or ΔE / t values (change Δ in the extinction coefficient E per time t).
Bei einer exemplarischen Auswertung wurden für eine jede Kavität die Transmissionsgrad-Meßwerte an den zwanzig mittleren Meßstellen herausgegriffen, der Mittelwert der Transmissionsgrad-Meßwerte der ersten und zweiten Messung gebildet und der Mittelwert der zweiten Messung durch den Mittelwert der ersten Messung dividiert. Die erhaltenen Ratio-Werte sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Sie sind mit (-) für negativ, (+) für positiv und (?) für fraglich bewertet. Die Transmissionsgrad-Meßwerte der randnahen zehn Meßstellen beidseits der mittleren 20 Meßstellen wurden nicht in die Auswertung einbezogen, da sie eher einer Verfälschung durch geometrische Effekte, Streulicht u.s.w. unterliegen. In the case of an exemplary evaluation, the transmittance measured values at each of the twenty middle measuring points were selected, the mean value of the transmittance measured values of the first and second measurements was taken, and the mean value of the second measurement was divided by the mean value of the first measurement. The ratio values obtained are summarized in Table 1. They are rated with (-) for negative, (+) for positive and (?) For questionable. The transmittance measured values of the ten measuring points near the edge on both sides of the middle 20 measuring points were not included in the evaluation, since they are more likely to be falsified by geometric effects, scattered light, etc. subject to.
Stattgefundene Agglutination zeigt sich in einer signifikanten Erhöhung des optischen Transmissionsgrads von der ersten zur zweiten Messung. Ratio-Werte von 1,07 bzw. 1,04, wie sie das nicht reaktive Kontrollserum (-Ktr) in Kavität A1 und A2 zeigt, sind nicht signifikant. Ein Ratio-Wert von 1,11 in Kavität H2 ist im Ergebnis als fraglich zu betrachen. Ratio-Werte von 1,2 und mehr sind signifikant für einen positiven Nachweis von CMV-Antikörpern. Die einzelnen gemessenen Transmissionsgrade sind für die Kavitäten A1 (nicht reaktives Kontrollserum -Ktr), A12 (Serumprobe negativ), B3 (Serumprobe schwach positiv), D1 (mittel reaktives Kontrollserum +Ktr), D8 (Serumprobe stark positiv) und H2 (Serumprobe fraglich) in Fig. 1 bis Fig. 6 dargestellt. Eine zusammenfassende Darstellung der Meßergebnisse an allen Kavitäten gibt Fig. 7. Agglutination that has taken place is shown by a significant increase in the optical transmittance from the first to the second measurement. Ratio values of 1.07 and 1.04, as shown by the non-reactive control serum (-Ktr) in cavity A1 and A2, are not significant. A ratio value of 1.11 in cavity H2 can be regarded as questionable in the result. Ratio values of 1.2 and more are significant for a positive detection of CMV antibodies. The individual measured degrees of transmission are for the cavities A1 (non-reactive control serum -Ktr), A12 (serum sample negative), B3 (serum sample weakly positive), D1 (medium reactive control serum + Ktr), D8 (serum sample strongly positive) and H2 (serum sample questionable ) shown in Fig. 1 to Fig. 6. Fig. 7 provides a summary of the measurement results on all cavities.
Die Auswertung der Meßergebnisse ist durch Warnfunktionen gesichert. Ist der gemessene Transmissionsgrad einer Probe absolut zu gering, so wird das Serum als möglicherweise lipämisch gekennzeichnet. Auch kann in diesem Fall zuviel Reagenz vorgelegt worden sein, so daß die zu durchleuchtende Probenschichtdicke zu groß ist, oder ein Fehler in der Verdünnung vorliegen. Ist der gemessene Transmissionsgrad absolut zu hoch, so mag fehlerhafterweise kein Serum und/oder kein Agglutinationsreagenz vorgelegt worden oder die Inkubationszeit vor der ersten Messung überschritten sein. Ein absolut zu hoher oder zu niedriger Ratio-Wert kann das Vorhandensein einer Luftblase bei einer der Messungen oder eine Überreaktion anzeigen. The evaluation of the measurement results is secured by warning functions. If the measured transmittance of a sample is absolutely too low, the serum is marked as possibly lipemic. In this case too much reagent may have been presented, so that the sample layer thickness to be screened is too large, or there is an error in the dilution. If the measured transmittance is absolutely too high, then no serum and / or no agglutination reagent may have been incorrectly presented or the incubation time before the first measurement may have been exceeded. An absolutely too high or too low ratio value can indicate the presence of an air bubble in one of the measurements or an overreaction.
Die gemessenen Ratio-Werte des Transmissionsgrads unterliegen aufgrund chargenbedingter Änderungen in der Zusammensetzung des Latexagglutinationsreagenz, aufgrund des Einflusses des Rütteins, aufgrund optischer Effekte u. a. gewissen Schwankungen. Ihre Bewertung wird daher durch die Messung an den Kontrollseren abgesichert. Insbesondere kann die Signifikanzbewertung der Ratio-Werte anhand des Meßergebnisses an dem nicht reaktiven Kontrollserum (-Ktr) vorgenommen werden, was beim Rütteln entstehende Artefakte, Unregelmäßigkeiten im Rüttelvorgang u. a. zu erkennen ermöglicht. Wird beispielsweise bei einer Messung an dem nicht reaktiven Kontrollserum (-Ktr) einThe measured ratio values of the transmittance are subject to changes in the composition of the latex agglutination reagent due to the batch, due to the influence of the vibrator, due to optical effects and the like. a. certain fluctuations. Your evaluation is therefore secured by the measurement on the control sera. In particular, the significance assessment of the ratio values can be carried out on the basis of the measurement result on the non-reactive control serum (-Ktr), which results in artifacts, irregularities in the shaking process and the like during shaking. a. allows to recognize. Is, for example, a measurement on the non-reactive control serum (-Ktr)
Ratio-Wert von 1,15 festgestellt, so werden erst Ratio-Werte ab z. B. 1,2 als fraglich und ab z. B. 1,25 als positiv bewertet. Zur Schwellwertsetzung der Fraglichkeit und positiven Bewertung kann auf den Ratio-Wert des nichtreaktiven Kontroll- serums (-Ktr) ein fester Betrag aufaddiert werden. Alternativ kann bei der Schwellwertsetzung die Streuung der (-Ktr) -Ratio- Werte nach statistischen oder empirischen Methoden berücksichtigt werden. Mit dem mittel reaktiven (+Ktr) und stark reaktiven Kontrollserum (++Ktr) wird die Reaktivität des Agglutinationsreagenz und das Einhalten ordnungsgemäßer Meßbedingungen kontrolliert. Ratio value of 1.15 determined, so ratio values from z. B. 1.2 as questionable and from z. B. 1.25 rated as positive. To set the threshold value for the questionability and positive evaluation, the ratio value of the non-reactive control serums (-Ktr) a fixed amount can be added. Alternatively, the scattering of the (-Ktr) ratio values can be taken into account when setting the threshold value according to statistical or empirical methods. With the medium reactive (+ Ktr) and strongly reactive control serum (++ Ktr) the reactivity of the agglutination reagent and the observance of proper measuring conditions are checked.
Zur Überprüfung des Versuchsergebnisses wurde mit den auf der ersten Mikrotiterplatte vorgelegten Proben ein ELISA-Test (En- zyme-Linked Immuno Sorbent Assay) durchgeführt, der als klassischer Nachweis von CMV-Antikörpern gelten kann. Das Ergebnis des ELISA-Tests stimmte für 94 der 96 Kavitäten mit dem desTo check the test result, an ELISA test (enzyme-linked immunosorbent assay) was carried out on the samples presented on the first microtiter plate, which can be regarded as classic detection of CMV antibodies. The result of the ELISA test was in agreement with that of 94 of the 96 wells
Agglutinationstests überein. In den beiden abweichenden Fällen war das Ergenis des ELISA-Tests negativ und das des Agglutinationstests schwach positiv. Zu erklären ist das durch die etwas höhere Empfindlichkeit des Agglutinationstests; vgl. Versuch 2. Agglutination tests. In the two different cases, the result of the ELISA test was negative and that of the agglutination test was weakly positive. This can be explained by the somewhat higher sensitivity of the agglutination test; see. Trial 2.
Versuch 2 Trial 2
Nicht reaktives (-Ktr), mittel reaktives (+Ktr) und stark reaktives (++κtr) Kontrollserum wird auf einer Mikrotiterplatte in Titerstufen von 1/2 heruntertitriert und mit den Proben die zuvor beschriebene Messung durchgeführt. Zeile A in Tabelle 2 enthält die von Kavität 1 in Kavität 2, von Kavität 2 in Kavität 3 u.s.w. heruntertitrierten Proben des nicht reaktiven Kontrollserums (-Ktr), Zeile C die genauso heruntertitrierten Proben des mittel reaktiven Krontrollserums (+Ktr) und Zeile E die genauso heruntertitrierten Proben des stark reaktiven Kontrollserums (++Ktr). In den Zeilen C und E halbiert sich also die Konzentration der CMV-Antikörper von Kavität zu Nachbarkavität. Die Kavitäten der Zeilen B, D, F, G und H sind leer. Die gemessenen Ratio-Werte des Transmissionsgrads sind in Tabelle 2 angeführt und in Fig. 8 dargestellt. Das mittel reaktive Kontrollserum (+Ktr) läßt sich über 4 bis 5 und das stark reaktive Kontrollserum (++Ktr) über 8 Titerstufen nachweisen. Das stark reaktive Kontrollserum (++Ktr) zeigt dabei in den niedrigen Titerstufen ein ausgeprägtes Prozonen-Phänomen (Heidelberger Kurve). Non-reactive (-Ktr), medium reactive (+ Ktr) and highly reactive (++ κtr) control serum is titrated down on a microtiter plate in titer steps of 1/2 and the measurement described above is carried out with the samples. Row A in Table 2 contains the samples of the non-reactive control serum (-Ktr) down-titrated from cavity 1 in cavity 2, from cavity 2 in cavity 3, etc., row C the samples of the medium-reactive crown troll serum (+ Ktr) and row E the same down-titrated samples samples of the highly reactive control serum (++ Ktr) titrated down as well. In rows C and E, the concentration of the CMV antibodies is halved from one cavity to the next. The cavities of rows B, D, F, G and H are empty. The measured ratio values of the transmittance are shown in Table 2 and shown in Fig. 8. The medium reactive control serum (+ Ktr) can be detected over 4 to 5 and the highly reactive control serum (++ Ktr) over 8 titer levels. The highly reactive control serum (++ Ktr) shows a pronounced prozone phenomenon (Heidelberg curve) in the low titer levels.
Zur Überprüfung wurde mit den Proben ein ELISA-Test durchgeführt. Der Agglutinationstest erwies sich gegenüber dem ELISA- Test als 1 bis 2 Titerstufen empfindlicher. Abgesehen von der so nachgewiesenen hohen Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ist damit die Möglichkeit aufgezeigt, routinemäßig mit einem entsprecr d verdünnten Latexagglutinationsreagenz zu arbeiten, was at Kostengründen bevorzugt ist. An ELISA test was carried out on the samples for verification. The agglutination test was 1 to 2 titer levels more sensitive than the ELISA test. Apart from the proven high sensitivity of the method according to the invention, this shows the possibility of routinely working with a correspondingly diluted latex agglutination reagent, which is preferred for reasons of cost.
Versuch 2 belegt die Möglichkeit, nicht nur qualitative, sondern auch quantitative Messungen hoher Genauigkeit mit dem erfindungsgemäßen Agglutinationsverfahren durchzuführen, d. Experiment 2 demonstrates the possibility of carrying out not only qualitative, but also quantitative measurements of high accuracy using the agglutination method according to the invention.
h. Konzentrationen von Antikörpern oder Antigenen zu bestimmen, was für die Beurteilung von Stärke und Verlauf einer Infektion, die Erkennung einer Serumnarbe u. a. von Bedeutung ist. Hierzu wird mit einem Standardserum bekannter Konzentration eine Fig. 8 entsprechende Eichkurve oder ein Umrechnungsfaktor gewonnen, die eine Umrechnung in Konzentrationswerte ermöglichen. H. Determine concentrations of antibodies or antigens, what for the assessment of the strength and course of an infection, the detection of a serum scar u. a. is important. For this purpose, a calibration curve corresponding to FIG. 8 or a conversion factor is obtained with a standard serum of known concentration, which enable conversion into concentration values.
Verglichen mit ELISA-Tests ist der erfindungsgemäße Agglutinationstest schneller, in der Duchführung einfacher und vom apparativen Aufwand und den eingesetzten Reagenzien her unaufwendiger. Die Reagenzien sind billiger und lassen sich einfacher handhaben. Es entfallen umweltbelastende Reagenzien wie z. Compared to ELISA tests, the agglutination test according to the invention is quicker, easier to carry out and less expensive in terms of equipment and the reagents used. The reagents are cheaper and easier to use. Environmentally harmful reagents such as
B. Chromogenlösung (z. B. Tetramethylbenzidin-Dihydrochlorid) und Stopplösung H2SO4. Auch läßt sich der Agglutinationstest leichter automatisieren. Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren unter Einsatz eines Latexagglutinationsreagenz hat exemplarischen Charakter. Es können auch andere Reagenzien mit Partikeln verwendet werden, die ein Antigen oder einen Antikörper zu binden vermögen und unter einer Antigen-Antikörperreaktion agglutinieren, z. B. Glasperlen, Polybutadien, Polystyrol, Butadien-Styrol-Copolymerisate, Kohlepartikel, Erythrozyten u. a. Die Partikel sollten eine Größe und ein Gewicht haben, so daß sie weitgehend in einem Schwebezustand gehalten werden können, d. h. vorzugsweise klein und leicht sein. Es kann, wie beschrieben, Agglutinationsreagenz vorgelegt und Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, dazugegeben werden, aber auch umgekehrt Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, vorgelegt und Agglutinationsreagenz dazugegeben werden. Eine gleichzeitige Aufgabe ist ebenfalls möglich. Das Rütteln und/oder Schwenken der Mikrotiterplatte sind vorteilhaft, für die Erfindung aber nicht immer zwingend. Die Messung der Lichtdurchlässigkeit kann mehr als zweimal in zeitlichem Abstand durchgeführt werden (Agglutionationszweipunktkinetik oder Agglutinationsmehrpunktkinetik oder Agglutinationsendpunktbestimmung). Hinzuweisen ist schließlich auch noch einmal auf die Möglichkeit, Agglutinationsuntersuchungen an Erythrozyten menschlichen Ursprung^ mit bestimmten Antigen-Antikörpereigenschaften durchzuführen, insbesondere für BlutgruppenbeStimmungen und Kreuzproben. B. Chromogen solution (e.g. tetramethylbenzidine dihydrochloride) and stop solution H 2 SO 4 . The agglutination test is also easier to automate. The implementation of the method according to the invention using a latex agglutination reagent has an exemplary character. Other reagents with particles that can bind an antigen or an antibody and agglutinate under an antigen-antibody reaction, e.g. B. glass beads, polybutadiene, polystyrene, butadiene-styrene copolymers, carbon particles, erythrocytes, etc. The particles should have a size and weight so that they can be kept largely in a state of suspension, ie preferably small and light. As described, agglutination reagent can be introduced and body fluid, in particular blood serum, can be added, but conversely, body fluid, in particular blood serum, can be introduced and agglutination reagent added. A simultaneous task is also possible. The shaking and / or swiveling of the microtiter plate are advantageous, but not always mandatory for the invention. The measurement of the light transmittance can be carried out more than twice with a time interval (agglutination two-point kinetics or agglutination multipoint kinetics or agglutination end point determination). Finally, it should also be pointed out again that agglutination tests on erythrocytes of human origin can be carried out with certain antigen-antibody properties, especially for blood group determinations and cross-tests.
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Claims

Ansprüche Expectations
1. Verfahren zur photometrischen Erfassung einer Partikelagglutination aufgrund einer Antigen-Antikörperreaktion in einer Probe, die durchleuchtet und deren Lichtdurchlässigkeit gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lichtdurchlässigkeit der Probe wenigstens zweimal in zeitlichem Abstand mißt, die Meßergebnisse vergleicht und so durch die Agglutinationsraktion bedingte Änderungen in der Lichtdurchlässigkeit der Probe erfaßt. 1. A method for the photometric detection of a particle agglutination due to an antigen-antibody reaction in a sample which is transilluminated and whose light transmittance is measured, characterized in that the light transmittance of the sample is measured at least twice at intervals, the measurement results are compared and thus caused by the agglutination reaction Changes in the light transmittance of the sample are detected.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es an einer Probe durchführt, die sich in einer Küvette befindet, und vorzugsweise die Küvette von der Seite durchleuchtet, insbesondere in einer horizontalen Zeile, entlang einer Z-förmigen Bahn o. ä. 2. The method according to claim 1, characterized in that it is carried out on a sample which is located in a cuvette, and preferably the cuvette is illuminated from the side, in particular in a horizontal line, along a Z-shaped path or the like.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es an einer Probe durchführt, die sich auf einer Mikrotiterplatte befindet, und vorzugsweise die Mikrotiterplatte quer zu ihrer Hauptebene durchleuchtet. 3. The method according to claim 1, characterized in that it is carried out on a sample which is located on a microtiter plate, and preferably X-rayed the microtiter plate transverse to its main plane.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Beschickung der Mikrotiterplatte mit einer Mehrkanalpipette, vorzugsweise 96-Kanalpipette, durchführt. 4. The method according to claim 3, characterized in that one loads the microtiter plate with a multi-channel pipette, preferably a 96-channel pipette.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge 5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized ge
kennzeichnet, daß man die Lichtdurchlässigkeit der Probe an mehreren voneinander versetzten Meßstellen mißt, insbesondere an ca. 10 bis ca. 50 Meßstellen, vorzugsweise an ca. 20 Meßstellen.  indicates that the light transmittance of the sample is measured at several measuring points offset from one another, in particular at approximately 10 to approximately 50 measuring points, preferably at approximately 20 measuring points.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lichtdurchlässigkeit der Probe an zweidimensional, z. B. in einem quadratischen Raster, mäanderförmig oder längs der Kanten eines Dreiecks über die Probenfläche verteilten Meßstellen mißt. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the light transmittance of the sample to two-dimensional, for. B. in a square grid, meandering or along the edges of a triangle over the sample area measuring points.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lichtdurchlässigkeit der Probe an Meßstellen mißt, die vorzugsweise im wesentlichen äquidistant auf einer über die Probe sich erstreckenden linearen Zeile liegen. 7. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the light transmittance of the sample is measured at measuring points which are preferably substantially equidistant on a linear line extending over the sample.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß 8. The method according to claim 7, characterized in that
man die Lichtdurchlässigkeit an Zeilen von Meßstellen mißt, die sich parallel zu Reihen oder Spalten von Mikrotiterplattenkavitäten im wesentlichen diametral über eine jede Kavität erstrecken.  the light transmittance is measured at rows of measuring points which extend parallel to rows or columns of microtiter plate cavities essentially diametrically over each cavity.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Intensität des durch die Probe hindurchtretenden Lichts mißt. 9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the intensity of the light passing through the sample is measured.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man es mit Erythrozyten eines Probanden und einem Antiserum zur Blutgruppenbestimmung durchführt. 10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that it is carried out with erythrocytes of a subject and an antiserum for blood group determination.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man es mit Blutserum eines Probanden und Erythrozyten bekannter Antigeneigenschaft durchführt. 11. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that it is carried out with blood serum of a subject and erythrocytes of known antigenic property.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man es mit Erythrozyten eines Probanden und Blutserum eines anderen Probanden durchführt. 12. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that it is carried out with erythrocytes of a subject and blood serum of another subject.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man es mit einem immunochemischen Agglutinationsreagenz und einer Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, durchführt. 13. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that it is carried out with an immunochemical agglutination reagent and a body fluid, in particular blood serum.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Agglutinationsreagenz auf Latexbasis verwendet. 14. The method according to claim 13, characterized in that one uses an agglutination reagent based on latex.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man das Aufklaren der Probe erfaßt. 15. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the clarification of the sample is detected.
16. Verehren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch ge- ken eichnet, daß man ein immunochemisches Agglutinationsreagenz in die Kavität einer Mikrotiterplatte einbringt, Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, dazugibt, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung von Reagenz und Körperflüssigkeit sorgt und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durchführt. 16. Worship according to one of claims 1 to 15, characterized by the fact that an immunochemical agglutination reagent is introduced into the cavity of a microtiter plate, body fluid, in particular blood serum, is added, if necessary, the reagent and body fluid are mixed thoroughly and a first measurement is carried out the light transmittance and after a while takes a second measurement of the light transmittance.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, in die Kavität einer Mikrotiterplatte einbringt, ein immunochemisches Agglutinationsreagenz dazugibt, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung von Körperflüssigkeit und Reagenz sorgt und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durchführt. 17. The method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that introducing body fluid, in particular blood serum, into the cavity of a microtiter plate, adding an immunochemical agglutination reagent, if necessary, ensuring a good mixing of body fluid and reagent and a first measurement of the light transmission and after a while takes a second measurement of light transmission.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, mit einer Pipette aufnimmt, gegebenenfalls weiter ein Verdünnungsreagenz mit der Pipette aufnimmt, weiter ein immunochemisches Agglutinationsreagenz mit der Pipette aufnimmt, alles zusammen in die Kavität einer Mikrotiterplatte einbringt, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung sorgt und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durchführt. 18. The method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that body fluid, in particular blood serum, is taken up with a pipette, if appropriate further a dilution reagent is taken up with the pipette, further an immunochemical agglutination reagent is taken up with the pipette, all together in the cavity of one Introduces a microtiter plate, if necessary ensures good mixing and carries out a first measurement of the light transmission and after some time a second measurement of the light transmission.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man ein immunochemisches Agglutinationsreagenz mit einer Pipette aufnimmt, gegebenenfalls weiter ein Verdünnungsreagenz mit der Pipette aufnimmt, weiter Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum, mit der Pipette aufnimmt, alles zusammen in die Kavität einer Mikroteterplatte einbringt, erforderlichenfalls für eine gute Durchmischung sorgt und eine erste Messung der Lichtdurchlässigkeit und nach einiger Zeit eine zweite Messung der Lichtdurchlässigkeit durchführt. 19. The method according to any one of claims 1 to 15, characterized in that an immunochemical agglutination reagent is taken up with a pipette, if appropriate further a dilution reagent is taken up with the pipette, further body fluid, in particular blood serum, is taken up with the pipette, all together in the cavity of one Introduces a microteter plate, if necessary ensures good mixing and carries out a first measurement of the light transmittance and after some time a second measurement of the light transmittance.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 , dadurch gekennzeichnet , daß man die Küvette vor den Messungen der Lichtdurchlässigkeit schwenkt, die verschlossene Küvette auf den Kopf und wieder zurück stellt o. ä. 20. The method according to any one of claims 1 to 19, characterized in that one swivels the cuvette before the measurements of the light transmission, the closed cuvette upside down and back or the like.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikrotiterplatte ständig oder in Intervallen insbesondere vor den Messungen der Lichtdurchlässigkeit rüttelt und/oder schwenkt. 21. The method according to any one of claims 1 to 19, characterized in that the microtiter plate is shaken and / or swiveled continuously or at intervals, in particular before the measurements of the light transmittance.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikrotiterplatte in linearer oder vorzugsweise kreisender Bewegung rüttelt und diesem Rütteln ein wippendes Auf- und Niederschwenken in einer oder zwei zueinander senkrechten Richtungen überlagert. 22. The method according to any one of claims 1 to 21, characterized in that the microtiter plate is shaken in a linear or preferably circular motion and this shaking a rocking up and down swiveling in one or two mutually perpendicular directions superimposed.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Messung der Lichtdurchlässigkeit mit einem Reader durchführt. 23. The method according to any one of claims 1 to 22, characterized in that one carries out the measurement of the light transmittance with a reader.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4306586A1 (en) * 1993-03-03 1994-09-08 Deutsches Rotes Kreuz Blutspen Method for the photometric detection of an agglutination reaction
DE102012105241A1 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 Hitec Zang Gmbh Robot with tool changer

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0005978A1 (en) * 1978-05-26 1979-12-12 Warner-Lambert Company Process for detecting and quantifying an antigen or antibody
US4213764A (en) * 1978-08-09 1980-07-22 Akzona Incorporated Method for determining immunochemical substances
EP0107580A2 (en) * 1982-10-21 1984-05-02 LE MATERIEL BIOMEDICAL Société à Responsabilité Limitée dite: Device for the detection and quantification of agglutinates
US4563430A (en) * 1982-11-29 1986-01-07 Olympus Optical Company Limited Method of judging a particle agglutination pattern
EP0433629A1 (en) * 1989-12-22 1991-06-26 DIESSE DIAGNOSTICA SENESE s.r.l. A method for the qualitative and quantitative determination of antibodies against bacterial antigens by means of the photometric measurement of agglutination
US5325295A (en) * 1989-05-04 1994-06-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Adaptation of microtiter plate technology to measurement of platelet aggregation
DE4306586A1 (en) * 1993-03-03 1994-09-08 Deutsches Rotes Kreuz Blutspen Method for the photometric detection of an agglutination reaction

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0005978A1 (en) * 1978-05-26 1979-12-12 Warner-Lambert Company Process for detecting and quantifying an antigen or antibody
US4213764A (en) * 1978-08-09 1980-07-22 Akzona Incorporated Method for determining immunochemical substances
EP0107580A2 (en) * 1982-10-21 1984-05-02 LE MATERIEL BIOMEDICAL Société à Responsabilité Limitée dite: Device for the detection and quantification of agglutinates
US4563430A (en) * 1982-11-29 1986-01-07 Olympus Optical Company Limited Method of judging a particle agglutination pattern
US5325295A (en) * 1989-05-04 1994-06-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Adaptation of microtiter plate technology to measurement of platelet aggregation
EP0433629A1 (en) * 1989-12-22 1991-06-26 DIESSE DIAGNOSTICA SENESE s.r.l. A method for the qualitative and quantitative determination of antibodies against bacterial antigens by means of the photometric measurement of agglutination
DE4306586A1 (en) * 1993-03-03 1994-09-08 Deutsches Rotes Kreuz Blutspen Method for the photometric detection of an agglutination reaction

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