WO1996006347A1 - Electrode et capteur de detection in vivo du monoxyde d'azote et de ses derives et procede de detection amperometrique in vivo du monoxyde d'azote et de ses derives - Google Patents

Electrode et capteur de detection in vivo du monoxyde d'azote et de ses derives et procede de detection amperometrique in vivo du monoxyde d'azote et de ses derives Download PDF

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WO1996006347A1
WO1996006347A1 PCT/FR1995/001112 FR9501112W WO9606347A1 WO 1996006347 A1 WO1996006347 A1 WO 1996006347A1 FR 9501112 W FR9501112 W FR 9501112W WO 9606347 A1 WO9606347 A1 WO 9606347A1
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WO
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electrode
detection
derivatives
film
nitrogen monoxide
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PCT/FR1995/001112
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Inventor
Bruno Fabre
Gérard Bidan
Raymond Cespuglio
Sophie Burlet
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue
    • A61B5/14542—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue for measuring blood gases
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61B5/1468—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue using chemical or electrochemical methods, e.g. by polarographic means
    • A61B5/1473—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue using chemical or electrochemical methods, e.g. by polarographic means invasive, e.g. introduced into the body by a catheter

Definitions

  • the present invention relates to an electrode and a sensor for the in vivo detection of nitric oxide and its derivatives, as well as a method for the amperometric detection in vivo of nitric oxide and its derivatives of the R-NO type.
  • Nitrogen monoxide NO is found in many organs in humans and animals
  • Neuro-transmitters are generally stored in synaptic vesicles, then released into the extra-cellular space by processes dependent on the electrical activity of the neuron and involving various ion channels (K + , Na + , Ca 2+ ). Once released, these neuro-transmitters exert their action on particular targets through specific receptors. It is assumed that the NO once synthesized passes by diffusion into the target cell and will activate the NO receptor.
  • NO can play an activating or inhibiting enzyme role. This property is used by the immune system in the process of destroying pathogens. Thus, the NO released by certain lymphocytes, under the action of cytokines, could rapidly diffuse into neighboring cells and asphyxiate them by binding to the active site of hemoglobin. Finally, the NO can also inhibit the synthesis of DNA (deoxyribonucleic acid) or block the transfer chain of the electrons involved in the oxidative energy of cells, at the level of the mitochondria.
  • the half-life of NO in solution in a biological medium is approximately 5 seconds, which explains the difficulty of demonstrating it by conventional methods of analysis. It is believed that its high reactivity gives it an almost immediate action which ceases with the cessation of its production.
  • nitric oxide The biological role of nitric oxide has been studied in many laboratories, but few direct and in vi vo detection methods are known.
  • the known methods for detecting nitric oxide use conductimetric or electrochemical detection methods.
  • the conductimetric detection method is based on the changes in conductivity of an n-type semiconductor (SnO 2 , WO 2 , ZnO, TiO 2 , Bi 2 O 3 , etc.) in the presence of NO.
  • an n-type semiconductor SnO 2 , WO 2 , ZnO, TiO 2 , Bi 2 O 3 , etc.
  • This technique is not very sensitive and not very selective because NO 2 and other compounds such as CO, SO 2 and O 2 interfere at the time of detection.
  • This technique has therefore mainly been developed and tested to detect NO 2 rather than NO.
  • This technique is described by J. Huusko, V. Lantto and H. Torvela in Sensors and Actua tors B, 15-16, (1993), 245; by G. Wiegleb and J. Heitbaum in Sensors and Act ua tors B, 17, (1994), 93; and by G. Williams and GSV Coles in Sensors and Act ua tors B, 15-16, (1993), 349.
  • Another detection method is also known based on the changes in conductivity of a quartz substrate on which phthalocyanine molecules are deposited.
  • the system thus obtained is sensitive to NO 2 but the sensitivity to NO has not been studied.
  • This process is described by AK Ray, MJ Cook, SC Thorpe and S. Mukhopadhyay in Phys. Stat. Ground . , 140, (1993), K85; and by R. Zhou, M. Haug, KE Geckeler and W. Göpel, in Sensors and Actuators B, 15-16, (1993), 312.
  • the most explored route is the immobilization of a catalyst on the surface of an electrode in order to produce layers sensitive to NO.
  • This immobilization can be carried out either by adsorption or by immobilization in a polymer matrix at the surface of the electrode.
  • the first technique is illustrated by the article by J. Zhang, ABP Lever and WJ Pietro, Inorg. Chem. , 33, (1994), 1392 which describes the electrocatalytic reduction of NO on an iron alizarin complexone, adsorbed on graphite electrodes.
  • T. Malinski and Z. Taha, Na ture, 358, (1992), 676 also disclose a microsensor making it possible to carry out in if tu measurements of nitrogen monoxide.
  • This microsensor is constituted by a carbon fiber electrode covered with a deposit of poly [porphyrin tetrakis (3-methoxy-4-hydroxyphenyl) of nickel (II)], protected by a layer of a perfluorous polysulfonate known under the name Nafion (Aldrich) brand.
  • This microsensor allows detection of NO up to 10 nM, by the oxidation reaction of NO to NO + , without interference from the nitrites and nitrates ions.
  • an electrode for detecting nitrogen monoxide in vi vo comprises a conductive substrate coated with a polyphorphyrine film or metallized polyphthalocyanine then a coating permeable membrane of the type Nafion ® gas.
  • these films not being intrinsically conductive, the overall sensitivity of the electrode is less good.
  • the object of the invention is to remedy the aforementioned drawbacks of the prior art and to develop an electrode for detecting nitric oxide and its derivatives in vivo and in situ, as well as a detection method.
  • this electrode comprises an electrically conductive support covered with a film of electronic conductive polymer doped with mixed heteropolyanions corresponding to one of the formulas:
  • M represents Fe, Rh, Al, Ga, In or Tl
  • X 1 represents P or As and n is equal to 4,
  • X 1 represents Si or Ge and n is equal to 5, or
  • X 1 represents B and n is equal to 6,
  • X 2 represents P or As
  • the conductive support is made of glassy carbon, carbon fiber, gold or platinum.
  • the working electrode according to the invention is prepared for example, according to the following technique.
  • a carbon fiber with a diameter of about 30 ⁇ m and a length of 20 to 40 mm is introduced into this capillary until it is blocked by the constriction formed at the end of it. .
  • the end of the capillary is cut and the carbon fiber is then pushed a few millimeters.
  • a silver wire with a diameter slightly smaller than the internal diameter of the capillary is dipped in a solution of silver powder and resin and then introduced into this capillary.
  • the electrically conductive support of the electrode is covered with the film of electronic conductive polymer comprising the mixed heteropolyanions by the method described below.
  • a solution is first prepared containing on the one hand a precursor monomer capable, by oxidation, of forming the polymer matrix and on the other hand, a salt of the mixed heteropolyanion, corresponding to one of the following formulas:
  • This preparation was described by F. Zonnevijlle, CM. Tourné and GF Tourné, in Inorg. Chem. , 21, (1982), 2742-2751.
  • the choice of synthesis solvent is dictated by the solubility of the monomer.
  • the solvent is acetonitrile
  • the solvent is water
  • this polymer is polypyrrole
  • the solvent used is water or acetonitrile.
  • the mixed heteropolyanion salt is used as the electrolyte.
  • the electrochemical oxidation is carried out by applying a potential difference between the working electrode previously treated by electrochemically and a reference electrode Ag / AgCl, immersed in the synthesis solution.
  • a potential difference between the working electrode previously treated by electrochemically and a reference electrode Ag / AgCl, immersed in the synthesis solution.
  • This makes it possible to form directly on the working electrode, a deposit of electronic conductive polymer doped with a mixed heteropolyanion, the thickness of which depends on the duration of application of the potential difference.
  • This electrosynthesis can be carried out in two different ways:
  • electrosynthesis is followed either by chronoamperometry if a potential is imposed, or by chronopotentiometry if a current is imposed.
  • the deposit increases regularly on the electrode as a function of time.
  • a conductive polymer comprising between 0.04 and 0.12 mixed heteropolyanion per monomer unit of the polymer.
  • the electrode modified by the deposit of electronic conductive polymer doped with one mixed heteropolyanion is soaked in a synthesis solvent and then in water (if the synthesis has not been carried out in water ), before being transferred to a buffered aqueous solution at a pH of 4.6 (0.1 M CH 3 COOH and 0.1 M CH 3 COONa).
  • the mixed heteropolyanion is:
  • the anionic polymer film deposited on the electronically conductive polymer film is perfluorinated polysulfonate known under the brand name Nafion.
  • Nafion is not porous and prevents the diffusion of nitrite ions (and other anions which may interfere during in vivo measurements, such as anions derived from peptides), towards the surface of the doped electronic conductive polymer film in mixed heteropolyanion. However, Nafion does not prevent the electrode from remaining permeable to NO.
  • the Nafion is deposited on the electrode covered with the polymer in a potentiostatic manner. More specifically, a drop of Nafion solution is deposited in the center of a tungsten ring and the working electrode covered with the doped polymer film is placed in the center of this ring, thus dipping into the drop. A large potential difference of 3.5 Volts is applied between the modified working electrode and the ring, for 5 times 2 seconds. This step is followed by drying in an oven at a temperature between 30 and 50 ° C for about 5 to 10 minutes. A layer of Nafion with a thickness of 0.1 ⁇ m to 5 ⁇ m is thus obtained.
  • the invention also relates to a sensor for the detection of nitric oxide and its derivatives, in vi vo comprising:
  • the reference electrode is an Ag / AgCl electrode and the auxiliary electrode is a platinum or tungsten electrode.
  • the amperometric detection of nitrogen monoxide NO is based on the measurement of the catalytic current accompanying the oxidation of NO to NO + ion, when using as catalyst, the mixed heteropolyanion immobilized in the electronic conductive polymer.
  • the measurement is carried out by differential normal pulsed voltammetry (VPND), by scanning between two potential terminals (0.4 to 1.3 V relative to an Ag / AgCl electrode), at a relatively low scanning speed (10 mV / s).
  • VPND differential normal pulsed voltammetry
  • the response of the electrode in vi vo reveals an anodic peak at about 0.65 V and the amplitude of which varies as a function of the amount of NO present.
  • NO reacts with the reduced forms of the mixed heteropolyanion immobilized in the conductive polymer, to form a complex of the nitrosyl type:
  • the potential scan is continued for 2 to 3 hours, at the rate of one cycle every 2 minutes. It should be noted that the value of the peak potential (0.65 V) remains unchanged during this time.
  • the thickness of the deposit of conductive polymer doped with mixed heteropolyanions is directly related to the charge accumulated during the synthesis of the polymer which is easily measurable by means of a coulometer.
  • electrodes are used in which the film of electronic conductive polymer doped with mixed heteropolyanions has a thickness of 0.2 ⁇ m to 2 ⁇ m, which corresponds to an accumulated charge of 10 to 100 mc / cm 2 of electrode .
  • the sensor according to the present invention is efficient and allows a real-time measurement of the NO concentration. It has good sensitivity since it allows detection of up to 10 -8 M NO, good selectivity since the electrochemical response is not disturbed by interferers and a stability of several hours capable of being used for the detection of NO in chronic conditions, that is to say in an animal not immobilized and not anesthetized.
  • the invention also relates to an amperometric detection method of nitric oxide and its derivatives in vivo consisting in measuring the catalytic current accompanying the oxidation of NO by implanting in vivo the three electrodes of the sensor and by measuring by pulsed voltammetry normal differential, the intensity of the peak obtained at approximately 0.65 V, this intensity being proportional to the amount of NO present in vivo.
  • the measurement is carried out by differential normal pulsed voltammetry (VPND).
  • VPND differential normal pulsed voltammetry
  • VPD differential pulsed voltammetry
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a detection electrode according to the invention
  • FIG. 2 is a curve representing the electrochemical cycling of the electrode according to the invention, implanted in the cerebral cortex,
  • FIG. 3 is a curve representing the evolution of the intensity Ipa measured at 0.65 V as a function of the cycling time during the detection of NO in vi vo for examples 1 and 6,
  • FIG. 4 is a curve representing the electrochemical cycling of the electrode immediately after the total disappearance of the peak at 0.65 V, induced by the inhibitor of NO synthase, and
  • FIG. 5 is a schematic view of the cell used for the detection of NO in vitro.
  • the working electrode 1 made of carbon fiber (prepared as described above) is illustrated in FIG. 1. It comprises an electrically conductive support 3 placed in a glass pipette 5. Its measuring end 7 protrudes out of the pipette 5.
  • Example 1 Detection of NO in the cerebral cortex of a rat from a carbon fiber modified by a deposition of poly (N-methyl pyrrole) / [Fe III PW 11 O 39 (H 2 O)] 4- / Nafion (registered trademark)
  • Electrochemical treatment of the microelectrode This treatment considerably increases the selectivity and the sensitivity of the working electrodes. The redox processes involved are faster.
  • Tacussel There is applied between the working electrode and the reference electrode a potential difference of 2.90 V for 20 s, then of 1.30 V for 4 s (the variation of the applied potential as a function of time is of form triangular and the value of its frequency is 70 Hz). After this treatment, the electrodes are rinsed with distilled water.
  • the modified electrode is cycled between 0.4 and 1.3 V (against an Ag / AgCl reference electrode) at 10 mV / s.
  • the anode current obtained by VPND first decreases and then increases from 0.9 V, which means that the working electrode is waterproof.
  • the response stabilizes after 6 to 7 cycles with 1 cycle / 2 min. At this time, cycling is stopped and the three electrodes are left in the buffer. These electrodes are thus stabilized.
  • the cycling having been carried out at a pH close to 7, these electrodes are ready to operate in a biological medium.
  • a 320 g male rat was used as an experimental animal.
  • the surgical phase begins after anesthesia (Chloral Hydrate Cl 3 CCH (OH) 2 , 400 mg / kg) and immobilization of the head of the animal in stereotaxic position.
  • the craniectomy is then performed.
  • a median sagittal incision of the cranial dorsal cutaneous plane is made. This incision is followed by resection of the underlying muscle planes.
  • the cranial box, thus made accessible, is then very meticulously cleaned with a solution containing antibiotics and sulfonamides.
  • the holes used to set up the reference electrodes occipital cortex: (CxO), auxiliary
  • NO-synthase here L-arginine p-nitroanilide; 200 mg / kg
  • L-arginine p-nitroanilide 200 mg / kg
  • Example 1 The protocol described in Example 1 is also used for the implantation of four carbon fibers modified by a deposit of poly (N-methyl pyrrole) /
  • Example 1 The main results are collated in Table 1. a Peak intensity at 0.65 V corresponding to the catalytic oxidation of NO (after 2 h of cycling with 1 cycle every 2 minutes).
  • Example 1 After the action of the NO synthase inhibitor, the three electrodes of Example 1 are removed from the cerebral cortex of the rat in order to be reimplanted into that of another rat whose mass is 270 g.
  • the response of the modified electrode has a shape similar to that tested in Example 1 (1 cycle / 2 min).
  • the peak corresponding to the catalytic oxidation of NO is always observed at 0.65 V but its intensity is clearly lower (2.5 nA).
  • L-arginine p-nitroanilide is administered intraperitoneally (200 mg / kg).
  • microsensor according to the invention can be used to carry out measurements on several successive individuals and that the use of the inhibitor does not alter the performance of the electrode.
  • the response of the modified electrode is stable and has an anodic peak located at 0.65 V
  • the three electrodes are removed from the rat cortex and placed in the glass cell represented in FIG. 5 where the reference and auxiliary electrodes bear the references 15 and 17 respectively.
  • the electrochemical response of the modified electrode is recorded between 0.4 and 1.3 V, first in a degassed PBS buffer, then in distilled water containing NO at 10 -6 M. In this latter medium, a peak corresponding to the catalytic oxidation of NO appears at 0.70 V. Its intensity is not constant depending on the temperature. Indeed, a study carried out on a modified carbon fiber and having not used for in vivo detection, showed that the intensity of the anode peak in the presence of NO at 10 -5 M varied from 25 nA (at 27 ° C) to 37 nA (at 37 ° C).
  • the electrochemical response will be recorded at 37 ° C (temperature in the cerebral cortex of the rat).
  • the intensity of the anode peak in the presence of NO at 10 -6 M is close to 1 nA.
  • the intensity this time is 5.2 nA.
  • the latter in the cortex of the rat can be estimated at 2.5 ⁇ 10 -6 M.

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Abstract

L'invention concerne une électrode de détection in vivo du monoxyde d'azote et de ses dérivés, un capteur de détection comprenant une telle électrode et un procédé de détection. Le but de l'invention est de pouvoir détecter de très faibles quantités de NO sans subir les interférences d'autres ions présents dans le milieu. Ce but est atteint à l'aide d'une électrode comprenant un support électriquement conducteur (3) recouvert d'un film de polymère conducteur électronique (9) dopé par des hétéropolyanions mixtes répondant à l'une des formules: [MIIIX1W11O39(H2O)]?n- ou [MIIIX2W¿17O61(H2O)]7-, dans lesquelles M représente Fe, Rh, Al, Ga, In ou T1, X1 représente P ou As et n est égal à 4, X1 représente Si ou Ge et n est égal à 5, ou X1 représente B et n est égal à 6, X2 représente P ou As, ce film (9) étant recouvert d'un polymère anionique (11) choisi parmi la polyamide sulfonée, le polystyrène sulfonate ou le polysulfonate perfluoré.

Description

ELECTRODE ET CAPTEUR DE DETECTION IN VIVO DU MONOXYDE
D'AZOTE ET DE SES DERIVES ET PROCEDE DE DETECTION
AMPEROMETRIQUE IN VIVO DU MONOXYDE D'AZOTE ET
DE SES DERIVES
La présente invention concerne une électrode et un capteur de détection in vivo du monoxyde d'azote et de ses dérivés, ainsi qu'un procédé de détection ampérométrique in vivo du monoxyde d'azote et de ses dérivés du type R-NO.
Chez les êtres humains et les animaux, le monoxyde d'azote NO est présent dans de nombreux organes
(cerveau, pancréas), dans le système circulatoire et dans le système respiratoire. Il joue aussi bien un rôle de messager (neuro-transmetteur) que d'agent inducteur des défenses immunitaires en participant à la destruction des éléments pathogènes.
Les neuro-transmetteurs sont généralement stockés dans des vésicules synaptiques, puis libérés dans l'espace extra-cellulaire par des processus dépendants de l'activité électrique du neurone et impliquant divers canaux ioniques (K+, Na+, Ca2+). Une fois libérés, ces neuro-transmetteurs exercent leur action sur des cibles particulières à travers des récepteurs spécifiques. On suppose que le NO une fois synthétisé passe par diffusion dans la cellule cible et va activer le récepteur du NO.
Par ailleurs, le NO peut jouer un rôle d'activateur ou d'inhibiteur enzymatique. Cette propriété est utilisée par le système immunitaire dans les processus de destruction des éléments pathogènes. Ainsi, le NO libéré par certains lymphocytes, sous l'action des cytokines, pourrait diffuser rapidement dans les cellules voisines et les asphyxier en se liant au site actif de l'hémoglobine. Enfin, le NO peut également inhiber la synthèse de l'ADN (acide désoxyribonucléique) ou bloquer la chaîne de transfert des électrons impliqués dans l'énergie oxydative des cellules, au niveau des mitochondries.
Dans certaines situations, lorsque les mécanismes de production du NO sont altérés, ce dernier peut être toxique et détruire certains éléments cellulaires. Ainsi, l'étude de malades atteints de maladies neurodégénératives comme par exemple la chorée de Huntington et la maladie d'Alzheimer a permis de mettre en évidence la neuro-toxicité du NO.
Au niveau cellulaire, la demi-vie du NO en solution dans un milieu biologique est d'environ 5 secondes, ce qui explique la difficulté à le mettre en évidence par les méthodes d'analyse classiques. On pense que sa forte réactivité lui confère une action quasi-immédiate qui cesse avec l'arrêt de sa production.
Le rôle biologique du monoxyde d'azote a été étudié dans de nombreux laboratoires, mais l'on connaît toutefois peu de procédés de détection directs et in vi vo . Les procédés connus de détection du monoxyde d'azote font appel à des procédés de détection conductimétriques ou électrochimiques.
Le procédé de détection conductimétrique est basé sur les changements de conductivité d'un semiconducteur de type n (SnO2, WO2, ZnO, TiO2, Bi2O3, etc...) en présence de NO. Cette technique est toutefois peu sensible et peu sélective car le NO2 et d\autres composés tels que CO, SO2 et O2 viennent interférer au moment de la détection. Cette technique a donc surtout été développée et testée pour détecter le NO2 plutôt que le NO. Cette technique est décrite par J. Huusko, V. Lantto et H. Torvela dans Sensors and Actua tors B, 15-16, (1993), 245 ; par G. Wiegleb et J. Heitbaum dans Sensors and Act ua tors B, 17, (1994), 93 ; et par G. Williams et G.S.V. Coles dans Sensors and Act ua tors B, 15-16, (1993), 349.
On connaît également un autre procédé de détection basé sur les changements de conductivité d'un substrat en quartz sur lequel sont déposées des molécules de phthalocyanines. Le système ainsi obtenu est sensible à NO2 mais la sensibilité à NO n'a pas été étudiée. Ce procédé est décrit par A.K. Ray, M.J. Cook, S.C. Thorpe et S. Mukhopadhyay dans Phys . Stat . Sol . , 140, (1993), K85 ; et par R. Zhou, M. Haug, K.E. Geckeler et W. Göpel, dans Sensors and Actuators B, 15-16, (1993), 312.
Parmi les méthodes de détection électrochimique, la détection du NO en solution est basée sur la conversion électrocatalytique du NO par des complexes métalliques de transition. Récemment, par M.M. Iravani, Z.L. Kruk et J. Millar dans un article paru dans J. Physi ol ogy, 467, (1993), 48P, ont montré qu'il était possible de détecter le NO à partir d'une simple électrode en fibre de carbone, en l'absence d'un catalyseur et en utilisant la voltampérométrie cyclique à grande vitesse de balayage. Néanmoins, ce système de détection n'est pas du tout sélectif puisque de nombreux composés électroactifs et notamment les ions nitrites peuvent interférer avec la mesure du NO. En conséquence, un tel système de détection n'est pas susceptible d'être utilisé in vi vo, où de nombreux éléments susceptibles d'interférer avec la mesure sont présents.
La voie la plus explorée est l'immobilisation d'un catalyseur à la surface d'une électrode afin de réaliser des couches sensibles au NO. Cette immobilisation peut être réalisée soit par adsorption, soit par immobilisation dans une matrice polymère à la surface de l'électrode. La première technique est illustrée par l'article de J. Zhang, A.B.P. Lever et W.J. Pietro, Inorg. Chem . , 33, (1994), 1392 qui décrit la réduction électrocatalyque du NO sur une complexone d'alizarine de fer, adsorbée sur des électrodes en graphite.
La deuxième technique est illustrée par l'article de A. P. Doherty et J.G. Vos, J. Chem . Soc , Faraday Trans . , 88, (1992), 2903 qui décrit une électrode au carbone vitreux recouverte d ' un polymère rédox
[Os (2,2 '-bipyridyl) 2 (poly (4-vinylpyridine)) 10Cl]Cl. Ce polymère constitue un catalyseur potentiel de la réduction du NO mais malheureusement il gonfle lorsqu'il est immergé dans l'électrolyte, ce qui peut conduire à son détachement de l'électrode de carbone.
Afin d'éviter la dégradation des ligands organiques qui entourent les sites actifs des catalyseurs, il est possible d'utiliser des catalyseurs avec des ligands inertes (face aux produits intermédiaires formés durant l'électrocatalyse) ou des catalyseurs capables de transférer de nombreux électrons au substrat en évitant ainsi la formation de produits intermédiaires. J.E. Toth et F.C. Anson, J. Am. Chem . Soc., 111, (1989), 2444, ont montré que les hétéropolyanions mixtes du type [FeIIIXW11O39 (H2O) ]n- (avec X=P ou As et n=4 ; X=Ge ou Si et n=5) possèdent les deux caractéristiques précitées, ce qui permet de les impliquer dans la catalyse de la réduction du NO2- ou du NO, en phase homogène et de les utiliser dans des méthodes de détection en solution.
La détection du NO in si tu, c'est-à-dire dans les milieux biologiques n'a été étudiée que très récemment.
L'article de K. Shibuki, Neuroscience Research , 9,
(1990), 69 divulgue un microcapteur électrochimique dont le principe de fonctionnement repose sur l'oxydation du NO sur une électrode de platine. Ce microcapteur a été utilisé pour la détermination de la concentration en NO sur des tranches de tissu cérébral. Néanmoins, ce microcapteur n'est pas sélectif et pour certains potentiels, le courant observé est attribuable non seulement à l'oxydation du NO mais également à l'oxydation du NO2-. Un tel microcapteur ne peut donc pas être utilisé pour des mesures in vi vo .
T. Malinski et Z. Taha, Na ture, 358, (1992), 676 divulguent également un microcapteur permettant d'effectuer des mesures in si tu du monoxyde d'azote. Ce microcapteur est constitué par une électrode en fibre de carbone recouverte d'un dépôt de poly[porphyrine tétrakis (3-méthoxy-4-hydroxyphényl) de nickel (II)], protégé par une couche d'un polysulfonate perfluore connu sous le nom de marque Nafion (Aldrich). Ce microcapteur permet une détection du NO jusqu'à 10 nM, par la réaction d'oxydation du NO en NO+, sans interférence des ions nitrites et nitrates. Les auteurs de l'article précité ont utilisé leur microcapteur pour la détection du NO sanguin ou dans un milieu de culture contenant des cellules endothéliales provenant de l'artère pulmonaire du porc, voir l'article de T. Malinski, Z. Taha, S. Grunfeld, A. Burewicz, P. Tomboulian et F. Kiechle, Anal . Chim . Acta, 279, (1993), 135. Toutefois, un tel capteur est difficilement utilisable in vivo, car il est fragile et manque de reproductibilité.
Un essai de détection du NO in vi vo et in si tu a été réalisé et décrit dans l'article de A. Meulemans, Neuroscience Letters, 157, (1993), 7. Selon cet article, une microélectrode en fibre de carbone a été implantée dans le cortex cérébral d'un rat. Aucun signal dû à l'oxydation ou à la réduction du NO n'a toutefois été observé alors que la détection en solution, d'une concentration de NO comprise entre 10-5 et 5x10-2 M, dans un tampon phosphate à pH 7,4, était possible avec la même électrode. L'auteur en a conclu que la concentration en NO dans le cortex devait se situer en dessous de la limite de détection de la microélectrode.
Enfin, on connaît également d'après le document WO-A-94 02845 une électrode de détection du monoxyde d'azote in vi vo . Cette électrode comprend un substrat conducteur, recouvert d'un film de polyphorphyrine ou de polyphtalocyanine métallisée puis d'une membrane de revêtement perméable au gaz du type Nafion®. Toutefois, ces films n'étant pas intrinsèquement conducteurs, la sensibilité globale de l'électrode est moins bonne.
L'invention a pour but de remédier aux inconvénients précités de l'art antérieur et de mettre au point une électrode de détection du monoxyde d'azote et de ses dérivés in vivo et in si tu, ainsi qu'un procédé de détection.
Selon les caractéristiques de l'invention, cette électrode comprend un support électriquement conducteur recouvert d'un film de polymère conducteur électronique dopé par des hétéropolyanions mixtes répondant à l'une des formules :
[MIIIX1W11O39(H2O)]n- ou
[MIIIX2W17O61 (H2O)]7- dans lesquelles :
M représente Fe, Rh, Al, Ga, In ou Tl,
X1 représente P ou As et n est égal à 4,
X1 représente Si ou Ge et n est égal à 5, ou
X1 représente B et n est égal à 6,
X2 représente P ou As,
ce film étant recouvert d'un polymère anionique choisi parmi la polyamide sulfonée, le polystyrène sulfonate ou le polysulfonate perfluore. De préférence, le support conducteur est en carbone vitreux, en fibre de carbone, en or ou en platine.
Lorsqu'il s'agit d'une fibre de carbone, l'électrode de travail selon l'invention est préparée par exemple, selon la technique suivante. On procède à l'étirement d'un tube capillaire en verre d'un diamètre externe de 1,5 mm et d'un diamètre interne de 1,05 mm jusqu'à obtenir une extrémité de quelques micromètres de diamètre. Une fibre de carbone d'un diamètre d'environ 30 μm et d'une longueur de 20 à 40 mm est introduite dans ce capillaire jusqu'à ce qu'elle soit bloquée par l'étranglement formé à l'extrémité de celui-ci. L'extrémité du capillaire est coupée et la fibre de carbone est alors poussée de quelques millimètres. Ensuite, un fil d'argent d'un diamètre légèrement inférieur au diamètre interne du capillaire est trempé dans une solution de poudre d'argent et de résine puis introduit dans ce capillaire. Pendant son introduction, il est soumis à une rotation constante qui provoque l'enroulement sur lui-même de la fibre de carbone en assurant ainsi un contact électrique optimum. L'ensemble est laissé à sécher pendant environ 4 heures puis le fil d'argent est rendu solidaire du tube de verre par du ciment dentaire tandis que l'extrémité fine du capillaire d'où émerge la fibre de carbone est recouverte du film de polymère conducteur électronique dopé par les hétéropolyanions mixtes.
De façon avantageuse, le support électriquement conducteur de l'électrode est recouvert du film de polymère conducteur électronique comprenant les hétéropolyanions mixtes par le procédé décrit ci-après.
De préférence, on prépare tout d'abord une solution contenant d'une part un monomère précurseur capable par oxydation de former la matrice polymère et d'autre part un sel de 1 'hétéropolyanion mixte, répondant à l'une des formules suivantes :
[MIIIX1W11O39(H2O)]n- ou
A7[MIIIX2W17O61 (H2O)]7- dans lesquelles A représente Na+, H+, K+ si la synthèse est réalisée dans l'eau ou A représente l'ion tétrabutylammonium [(C4H9)4N]+si la synthèse est réalisée dans l'acétonitrile, X et M étant tels que définis précédemment. Cette préparation a été décrite par F. Zonnevijlle, CM. Tourné et G. F. Tourné, dans Inorg. Chem . , 21, (1982), 2742-2751.
Le choix du solvant de synthèse est dicté par la solubilité du monomère. Lorsque le polymère conducteur électronique est le poly (N-alkylpyrrole), le solvant est l'acétonitrile, lorsqu'il s'agit d ' une polyaniline, le solvant est l'eau et lorsque ce polymère est le polypyrrole, le solvant utilisé est de l'eau ou de l'acétonitrile. Le sel d'hétéropolyanion mixte est utilisé comme électrolyte.
L'oxydation électrochimique est réalisée par application d'une différence de potentiel entre l'électrode de travail préalablement traitée par électrochimiquement et une électrode de référence Ag/AgCl, immergée dans la solution de synthèse. Ceci permet de former directement sur l'électrode de travail, un dépôt de polymère conducteur électronique dopé par un hétéropolyanion mixte, dont l'épaisseur dépend de la durée d'application de la différence de potentiel. Cette électrosynthèse peut être réalisée de deux manières différentes :
a) par un balayage linéaire de potentiel entre deux bornes dont l'une est voisine du potentiel du début d'oxydation du monomère ; ou b) par une électrolyse à un potentiel ou à courant imposé.
Dans les deux cas, 1' électrosynthèse est suivie soit par chronoampérométrie si on impose un potentiel, soit par chronopotentiométrie si on impose un courant. Le dépôt croît de façon régulière sur l'électrode en fonction du temps.
Dans les deux cas, on obtient un polymère conducteur comprenant généralement entre 0,04 et 0,12 hétéropolyanion mixte par motif monomère du polymère.
Après l'électrosynthèse, l'électrode modifiée par le dépôt de polymère conducteur électronique dopé par 1 'hétéropolyanion mixte est trempé dans un solvant de synthèse puis dans de l'eau (si la synthèse n'a pas été réalisée dans de l'eau), avant d'être transférée dans une solution aqueuse tamponnée à un pH de 4,6 (CH3COOH 0,1 M et CH3COONa 0,1 M).
De préférence, l'hétéropolyanion mixte est :
[FeIIIPW11O39(H2O)]4- et le polymère conducteur électronique est le poly[N-méthylpyrrole].
De façon avantageuse, le film de polymère anionique déposé sur le film de polymère conducteur électronique est du polysulfonate perfluore connu sous le nom de marque Nafion.
Le Nafion n'est pas poreux et empêche la dif fusion des ions nitrites (et d'autres anions susceptibles d'interférer lors des mesures in vivo, tels que les anions dérivés des peptides), vers la surface du film de polymère conducteur électronique dopé en hétéropolyanion mixte. Toutefois, le Nafion n'empêche pas l'électrode de rester perméable au NO.
Le Nafion est déposé sur l'électrode recouverte du polymère de manière potentiostatique. Plus précisément, une goutte de solution de Nafion est déposée au centre d'un anneau en tungstène et l'électrode de travail recouverte du film de polymère dopé est placée au centre de cet anneau, plongeant ainsi dans la goutte. Une forte différence de potentiel de 3,5 Volts est appliquée entre l'électrode de travail modifiée et l'anneau, pendant 5 fois 2 secondes. Cette étape est suivie d'un séchage à l'étuve à une température comprise entre 30 et 50°C pendant 5 à 10 minutes environ. On obtient ainsi une couche de Nafion d'une épaisseur de 0,1 μm à 5 μm.
L'invention concerne également un capteur pour la détection du monoxyde d'azote et de ses dérivés, in vi vo comprenant :
- une électrode de détection (ou électrode de travail) conforme à celle qui vient d'être décrite,
- une électrode auxiliaire,
- une électrode de référence,
- des moyens pour appliquer une différence de potentiel entre l'électrode de détection et l'électrode de référence, et
- des moyens pour mesurer l'intensité du courant électrique circulant entre l'électrode de détection et l'électrode auxiliaire.
De préférence, l'électrode de référence est une électrode Ag/AgCl et l'électrode auxiliaire est une électrode de platine ou de tungstène.
Dans ce capteur, la détection ampérométrique du monoxyde d'azote NO est basée sur la mesure du courant catalytique accompagnant l ' oxydation du NO en ion NO+, lorsqu'on utilise comme catalyseur, l'hétéropolyanion mixte immobilisé dans le polymère conducteur électronique.
Plus précisément, la mesure est effectuée par voltampérométrie puisée normale différentielle (VPND), par balayage entre deux bornes de potentiel (0,4 à 1,3 V par rapport à une électrode Ag/AgCl), à une vitesse de balayage relativement faible (10 mV/s). La réponse de l'électrode in vi vo laisse apparaître un pic anodique à 0,65 V environ et dont l'amplitude varie en fonction de la quantité de NO présent.
Lors de l'oxydation du NO en NO+ en présence de l'hétéropolyanion mixte, deux mécanismes réactionnels peuvent être proposés, basés sur les hypothèses suivantes :
a) lors de l'oxydation électrocatalytique, le NO réagit avec les formes réduites de l'hétéropolyanion mixte immobilisé dans le polymère conducteur, pour former un complexe du type nitrosyl :
[FeII(NO) XW11O39] (n+1)-. Le processus réactionnel est le suivant :
Figure imgf000013_0001
avec
X=P, As et n=4 ;
X=Si, Ge et n=5 ;
X=B et n=6
b) L' électrocatalyse ne passe pas par la formation du complexe nitrosyl car à pH voisin de 7, sa constante de vitesse de formation est trop faible. Le processus réactionnel est alors le suivant :
Figure imgf000013_0002
In vi vo, le balayage de potentiel est poursuivi pendant 2 à 3 heures, à raison d'un cycle toutes les 2 minutes. Il faut noter que la valeur du potentiel du pic (0,65 V) reste inchangée pendant ce temps.
L'épaisseur du dépôt de polymère conducteur dopé par les hétéropolyanions mixtes est directement liée à la charge accumulée pendant la synthèse du polymère qui est facilement mesurable au moyen d'un coulomètre.
De préférence, on utilise des électrodes dans lesquelles le film de polymère conducteur électronique dopé par les hétéropolyanions mixtes a une épaisseur de 0,2 μm à 2 μm, ce qui correspond à une charge accumulée de 10 à 100 mc/cm2 d'électrode.
Le capteur selon la présente invention est performant et permet une mesure en temps réel de la concentration en NO. Il présente une bonne sensibilité puisqu'il permet de détecter jusqu'à 10-8M de NO, une bonne sélectivité puisque la réponse électrochimique n'est pas perturbée par des interférents et une stabilité de plusieurs heures susceptible d'être mise à profit pour la détection du NO dans des conditions chroniques, c'est-à-dire chez un animal non immobilisé et non anesthésié.
Enfin, l'invention concerne également un procédé de détection ampérométrique du monoxyde d'azote et de ses dérivés in vivo consistant à mesurer le courant catalytique accompagnant l'oxydation du NO en implantant in vivo les trois électrodes du capteur et en mesurant par voltampérométrie puisée normale différentielle, l'intensité du pic obtenu à 0,65 V environ, cette intensité étant proportionnelle à la quantité de NO présent in vivo.
De préférence, la mesure est effectuée par voltampérométrie puisée normale différentielle (VPND). Cette technique est une modification intéressante de la voltampérométrie puisée différentielle (VPD). Les sauts de potentiels délivrés sont d'amplitude croissante et à la fin de chaque saut, le potentiel retourne à sa valeur initiale. Ce retour à l'état initial constitue tout l'intérêt de la technique, car il permet à certains systèmes électrochimiques, sensibles à des potentiels trop oxydants, de ne pas être dégradés.
Ce procédé est utilisable dans des domaines très divers :
- dans le domaine des neurosciences pour la mesure directe du NO dans le cerveau, associée à divers aspects comportementaux tels que le sommeil, l'apprentissage ou une situation de stress par exemple,
- dans le domaine cardiovasculaire pour la détermination du rôle du NO dans les mécanismes de régulation de la pression artérielle ou de la migraine, - dans le domaine de l'immunologie pour la détermination du rôle du NO dans la stimulation des défenses immunitaires,
- dans le domaine de la pneumologie pour la détermination du rôle du NO dans la régulation de la respiration et dans le cancer du poumon et tous les états asthmatiques, et
- dans le domaine de la mise au point de substances pharmacologiques, afin de pouvoir doser directement et in vivo les effets induits par le NO dans un organe cible.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront mieux à la lecture de la description suivante, donnée bien entendu à titre illustratif et non limitatif, cette description étant faite en faisant référence aux dessins joints, dans lesquels :
- la figure 1 est un schéma illustrant une électrode de détection selon l'invention, - la figure 2 est une courbe représentant le cyclage électrochimique de l'électrode selon l'invention, implantée dans le cortex cérébral,
- la figure 3 est une courbe représentant l'évolution de l'intensité Ipa mesurée à 0, 65 V en fonction du temps de cyclage lors de la détection du NO in vi vo pour les exemples 1 et 6,
- la figure 4 est une courbe représentant le cyclage électrochimique de l'électrode immédiatement après la disparition totale du pic à 0,65 V, induite par l'inhibiteur de la NO-synthase, et
- la figure 5 est une vue schématique de la cellule utilisée pour la détection du NO in vitro.
L'électrode de travail 1 en fibre de carbone (préparée comme décrit précédemment) est illustrée en figure 1. Elle comprend un support électriquement conducteur 3 placé dans une pipette de verre 5. Son extrémité de mesure 7 dépasse hors de la pipette 5.
Cette extrémité est recouverte du film polymère conducteur 9 dopé par des hétéropolyanions et d'une couche de polymère anionique 11. Son autre extrémité est reliée à un conducteur 13.
On donne ci-après un exemple de réalisation de l'électrode de détection selon l'invention et de son application à la détection du NO.
Exemple 1 : Détection du NO dans le cortex cérébral d'un rat à partir d'une fibre de carbone modifiée par un dépôt de poly (N-méthyl pyrrole)/ [FeIIIP W11O39(H2O)]4- /Nafion (marque déposée)
a) Traitement électrochimique de la microélectrode Ce traitement augmente considérablement la sélectivité et la sensibilité des électrodes de travail. Les processus rédox mis en jeu sont plus rapides. L'électrode de travail 1 nue ainsi que les électrodes de référence (Ag/AgCl) et auxiliaire
(tungstène) sont immergées dans un tampon phosphate PBS
(pH = 7,4 ; vol. = 2,5 ml) et connectées à un potentiostat ("Biopulse" marque déposée de Soléa,
Tacussel). Il est appliqué entre l'électrode de travail et l'électrode de référence une différence de potentiel de 2,90 V pendant 20 s, puis de 1,30 V pendant 4 s (la variation du potentiel appliqué en fonction du temps est de forme triangulaire et la valeur de sa fréquence est de 70 Hz). Après ce traitement, les électrodes sont rincées à l'eau distillée.
b) Synthèse du film poly (N-méthyl pyrrole)/
[FeIIIP W11O39(H2O)]4- à la surface de la microélectrode On prépare tout d'abord le sel de l'hétéropolyanion (HPA) mixte
[(C4H9)4N]4[FeIIIPW11O39(H2O)], ≈7H2O (selon la méthode décrite par Zonnevijlle et al.) qui va servir d'électrolyte support lors de la synthèse. (F. Zonnevijlle, CM. Tourné et CF. Tourné, Inorg. Chem., 21, (1982), 2751).
Dans 100 ml d'eau, on ajoute 65,97 g de Na2WO4, 2H2O (2x10-1 mole) et 6,91 g de Na3PO4, 12 H2O (1,82x10-2 mole). La solution est portée à 80°C L'addition lente de 27,4 ml de HCl 37% à cette solution permet d'obtenir le sel Na7PW11O39. Durant cette étape, il faut veiller à ce que le pH soit toujours supérieur à 3 afin d'éviter la dégradation de [PW11O39]7 - en
[PW12O40]3- . La solution est ensuite portée jusqu'à 95°C Pour obtenir le sel de sodium de
FeIIIP W11O39(H2O)]4-, il est nécessaire de lui ajouter par petites portions, 7,49 g de Fe(NO3)3, 9H2O
(1,85x10-2 mole), soit un excès de 2% par rapport à la quantité stoéchiométrique. La solution devient jaune, orange puis marron et trouble. Elle est maintenue à 95°C pendant 15 minutes après la fin de l'addition. Ensuite, elle est filtrée à chaud pour récupérer l'excès de fer qui a précipité sous la forme Fe(OH)3. On laisse refroidir le filtrat à l'air, jusqu'à la température ambiante. Pour former le sel de tétrabutylammonium de FeIIIP W11O39(H2O)]4- , on lui ajoute 23,6 g de [(C4H9)4N]Br 99% (7,27x10-2 mole) par petites portions et l'on constate qu'un précipité jaune apparaît. Celui-ci est recristallisé dans de l'eau chaude et le sel ainsi purifié est séché dans une étude à 90°C pendant 2 jours.
Le rendement de la synthèse est voisin de 65% et la formule du produit, déduite de l'analyse élémentaire, est : [ (C4H9) 4N]4[FeIIIPW11O39 (H2O) ], ≈7H2O.
Ensuite, la synthèse électrochimique du poly(N- méthyl pyrrole) /[FeIIIPW11O39 (H2O) ]4- peut être réalisée.
On prépare dans un pilulier en verre (5 ml) une solution d'acétonitrile contenant 5x10-2 M de [(C4H9)4N] 4[FeIIIPW11O39(H2O)], ≈7H2O et 10-2 M de N-méthyl pyrrole. L'électrode de travail (fibre de carbone traitée), et les électrodes auxiliaire et de référence sont plongées dans cette solution puis connectées au potentiostat. Les films de poly (N-méthyl pyrrole)/
[FeIIIP W11O39(H2O)]4- peuvent être synthétisés, soit par un balayage linéaire de potentiel, soit par électrolyse à potentiel imposé. Ces deux méthodes électrochimiques donnent des films d' électroactivité et de stabilité comparables.
Pour former sur la fibre de carbone traitée un dépôt de poly (N-méthyl pyrrole) /[FeIIIP W11O39(H2O)]4-, on la porte au potentiel de 0,86 V (contre Ag/AgCl) pendant 2 fois 60 s. Après une courte période transitoire, le courant de synthèse alors enregistré (lors de la chronoampérométrie) est constant, traduisant ainsi une croissance régulière du film sur l'électrode de travail. Celui-ci contient approximativement 0,06 à 0,08 [FeIIIP W11O39(H2O)]4- par motif (N-méthyl pyrrole) (valeur déduite de l'analyse élémentaire).
Après l'électrosynthèse, les trois électrodes sont rincées dans l'acétonitrile, puis dans l'eau avant de les transférer dans une solution aqueuse tamponnée à pH=4,6 avec 0, 1 M CH3COOH et 0,1 M CH3COONa.
c) Dépôt de Nafion (marque déposée) sur le film de poly (N-méthyl pyrrole) /[FeIIIP W11O39(H2O)]4-
Ce dépôt est effectué comme indiqué précédemment. d) Cyclage de l'électrode modifiée dans un tampon phosphate (pH=7,4)
L'électrode de travail (fibre de carbone modifiée) ainsi que les électrodes de référence et auxiliaire sont plongées dans un tampon PBS (pH=7,4 ; vol. =2, 5 ml), dégazé auparavant à l'argon pendant 30 minutes.
Dans ce milieu, le cyclage de l'électrode modifiée est réalisé entre 0,4 et 1,3 V (contre une électrode de référence Ag/AgCl) à 10 mV/s. Le courant anodique obtenu par VPND diminue tout d'abord puis augmente à partir de 0, 9 V ce qui signifie que l'électrode de travail est étanche. La réponse se stabilise au bout de 6 à 7 cycles avec 1 cycle/2 min. A ce moment, le cyclage est stoppé et les trois électrodes sont laissées dans le tampon. Ces électrodes sont ainsi stabilisées. Le cyclage ayant été effectué à un pH voisin de 7, ces électrodes sont prêtes à fonctionner en milieu biologique.
e) Préparation de l'animal en vue de l'implantation des électrodes
Un rat mâle de 320 g a été utilisé comme animal d'expérience. La phase chirurgicale débute après l'anesthésie (Chloral Hydrate Cl3CCH(OH)2, 400 mg/kg) et l'immobilisation de la tête de l'animal en position stéréotaxique. La craniectomie est alors réalisée. Pour cela une incision sagittale médiane du plan cutané crânien dorsal est pratiquée. Cette incision est suivie de la résection des plans musculaires sous-jacents. La boîte crânienne, ainsi rendue accessible, est alors très méticuleusement nettoyée avec une solution contenant des antibiotiques et des sulfamides. Les orifices permettant de mettre en place les électrodes de référence (cortex occipital : (CxO), auxiliaire
(CxO) et de travail (électrode à NO : Cx frontal droit, premiers 500 μm) ) sont réalisés grâce à un tour de dentiste. Enfin, pour éviter une compression cérébrale lors de l'introduction de l'électrode de travail, la dure-mère, interposée entre la paroi osseuse externe et le tissu cérébral, est au préalable incisée.
Dès que les électrodes sont mises en place, les enregistrements peuvent débuter. Une mesure est réalisée toutes les deux minutes. Le niveau de l'anesthésie est maintenu par des injections répétées de chloral hydrate (concentration : 100 mg/ml ; 0,2 ml/20 min).
f) Détection du NO in vivo
Après la mise en place des trois électrodes, les enregistrements in vivo débutent. La réponse de l'électrode modifiée obtenue par VPND (balayage entre 0,4 et 1,3 V ; électrode de référence Ag/AgCl ; 1 cycle/2 min ; vitesse de balayage =10 mV/s) laisse apparaître un pic anodique très fin 0,65 V (intensité ≈ 6,5 nA), correspondant à l'oxydation du NO catalysée par l'HPA mixte immobilisé. Sur la figure 2, on peut constater que la hauteur du pic est d'environ 6,5 nA, après stabilisation au bout de 2 heures. La variation de l'intensité du pic en fonction du temps de cyclage est montrée sur la figure 3. En 3 heures de cyclage, une diminution de 20% de l'intensité de ce pic est observée, probablement lié au trauma- d'introduction de l'électrode.
g) Action d'un inhibiteur de la NO-synthase
Au bout de 3 heures de cyclage (après la fin d'un cycle et avant le début du suivant), l'inhibiteur de la
NO-synthase (ici la L-arginine p-nitroanilide ; 200 mg/kg) est administré à l'animal par voie intrapéritonéale.
Après cette injection, une diminution progressive du pic anodique de 6 nA à 0,65 V est observée. Sa disparition est totale au bout de 22 minutes. La poursuite du cyclage sur 16 minutes supplémentaires montre qu'il ne réapparaît pas (voir figure 4). On notera que in vivo et dans une solution de NO cette même électrode détecte toujours un signal. Exemples 2 à 5 : Comparaison des caractéristiques (sensibilité, stabilité et action d'un inhibiteur de la NO-synthase) de plusieurs microcapteurs implantés dans le cortex cérébral de plusieurs animaux.
Le protocole décrit dans l'exemple 1, est aussi utilisé pour l'implantation de quatre fibres de carbone modifiées par un dépôt de poly (N-méthyl pyrrole)/
[FeIIIP W11O39(H2O)]4-/Nafion chez six rats différents. Les réponses électrochimiques enregistrées (dans le tampon PBS, dans le cortex cérébral : avant et après l'action d'un inhibiteur de la NO-synthase) présentent une allure similaire à celles enregistrées dans
l'exemple 1. Les principaux résultats sont réunis dans le tableau 1.
Figure imgf000022_0001
a Intensité du pic à 0, 65 V correspondant à l'oxydation catalytique de NO (au bout de 2 h de cyclage avec 1 cycle toutes les 2 minutes).
b Disparition induite par l'inhibiteur de la NO- synthase (L-arginine p-nitroanilide).
Exemple 6 : Réimplantation d'un microcapteur à NO d'un rat de l'exemple 1 à un autre rat
Après l'action de l'inhibiteur de la NO-synthase, les trois électrodes de l'exemple 1 sont otées du cortex cérébral du rat pour être réimplantées dans celui d'un autre rat dont la masse est de 270 g.
Entre 0,4 et 1,3 V (électrode de référence
Ag/AgCl), la réponse de l'électrode modifiée présente une allure similaire à celle testée dans l'exemple 1 (1 cycle/2 min). Le pic correspondant à l'oxydation catalytique du NO est toujours observé à 0,65 V mais son intensité est nettement plus faible (2,5 nA) .
Néanmoins, cette grandeur ne diminue pratiquement pas sur 2 h de cyclage (voir figure 3) . Au bout de ce temps
(après la fin d'un cycle et avant le début du suivant), la L-arginine p-nitroanilide est administrée par voie intrapéritonéale (200 mg/kg).
La disparition totale du pic à 0, 65 V intervient au bout de 24 min. La poursuite du cyclage sur 16 min montre qu'il ne réapparaît pas.
Ceci montre que le microcapteur selon l'invention peut être utilisé pour effectuer des mesures sur plusieurs individus successifs et que l'usage de l'inhibiteur n'altère pas les performances de l'électrode.
Exemple 7 : Estimation de la concentration en NO au niveau du cortex cérébral d'un rat à partir de mesures in vitro
Le protocole décrit dans l'exemple 1 est toujours utilisé pour l'implantation des trois électrodes (travail, référence et auxiliaire) dans le cortex cérébral d'un rat (masse=320 g).
Après 2 heures de cyclage (entre 0,4 et 1,3 V ; 1 cycle/2 min), la réponse de l'électrode modifiée est stable et présente un pic anodique localisé à 0, 65 V
(électrode de référence Ag/AgCl) et d'intensité 2,5 nA.
Afin d'estimer la concentration en NO in vi vo, les trois électrodes sont otées du cortex du rat et placées dans la cellule en verre représentée en figure 5 où les électrodes de référence et auxiliaire portent respectivement les références 15 et 17.
La réponse électrochimique de l'électrode modifiée, est enregistrée entre 0,4 et 1,3 V, d'abord dans un tampon PBS dégazé, puis dans de l'eau distillée contenant NO à 10-6 M. Dans ce dernier milieu, il apparaît à 0,70 V un pic correspondant à l'oxydation catalytique du NO. Son intensité n'est pas constante en fonction de la température. En effet, une étude réalisée sur une fibre de carbone modifiée et n'ayant pas été utilisée à la détection in vivo, a montré que l'intensité du pic anodique en présence de NO à 10-5 M variait de 25 nA (à 27°C) à 37 nA (à 37°C).
Par conséquent, pour avoir une bonne estimation de la concentration en NO in vi vo, la réponse électrochimique sera enregistrée à 37°C (température au niveau du cortex cérébral du rat).
A cette température, l'intensité du pic anodique en présence de NO à 10-6 M est voisine de 1 nA. En remplaçant cette solution par de l'eau distillée contenant NO à 5x10-6 M, l'intensité est cette fois-ci de 5,2 nA.
S'il existe en solution une relation linéaire entre l'intensité et la concentration en NO, cette dernière au niveau du cortex du rat peut être estimée à 2, 5x10-6 M.
Pour ne pas fausser les mesures réalisées in vitro, toutes les manipulations se font sous atmosphère inerte (dégazage des solutions à l'argon, cellule et seringues étanches).

Claims

REVENDICATIONS
1. Electrode (1) de détection in vi vo du monoxyde d'azote et de ses dérivés, caractérisé en ce qu'elle comprend un support électriquement conducteur (3) recouvert d'un film de polymère conducteur électronique (9) dopé par des hétéropolyanions mixtes répondant à l'une des formules :
[MIIIX1W11O39(H2O)]n- ou
[MIIIX2W17O61 (H2O)]7- dans lesquelles :
M représente Fe, Rh, Al, Ga, In ou Tl,
X1 représente P ou As et n est égal à 4,
X1 représente Si ou Ge et n est égal à 5, ou
X1 représente B et n est égal à 6,
X2 représente P ou As,
ce film (9) étant recouvert d'un polymère anionique (11) choisi parmi la polyamide sulfonée, le polystyrène sulfonate ou le polysulfonate perfluore.
2. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le film (9) contient 0,04 à 0,12 hétéropolyanion mixte par motif monomère du polymère conducteur électronique.
3. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polymère conducteur électronique (9) est le poly (N-alkylpyrrole), le polypyrrole ou la polyaniline.
4. Electrode selon la revendication 3, caractérisée en ce que le polymère conducteur électronique est le poly (N-méthylpyrrole).
5. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le film (9) de polymère conducteur électronique a une épaisseur de 0,2 à 2 μm.
6. Electrode selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'hétéropolyanion mixte est : [FeIIIP W11O39(H2O)]4-.
7. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le support conducteur (3) est en carbone vitreux, en fibre de carbone, en or ou en platine.
8. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polymère anionique (11) est le polysulfonate perfluore.
9. Electrode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la couche de polymère anionique
(11) a une épaisseur de 0,1 à 5 μm.
10. Capteur pour la détection de monoxyde d'azote et de ses dérivés, in vi vo, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une électrode de détection (1) du NO selon l'une quelconque des revendications 1 à 9,
- une électrode auxiliaire (17),
- une électrode de référence (15),
- des moyens pour appliquer une différence de potentiel entre l'électrode de détection (1) et l'électrode de référence (15), et
- des moyens pour mesurer l'intensité du courant électrique circulant entre l'électrode de détection (1) et l'électrode auxiliaire (17).
11. Capteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'électrode de référence (15) est une électrode Ag/AgCl.
12. Capteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'électrode auxiliaire (17) est une électrode de platine ou de tungstène.
13. Capteur selon la revendication 11, caractérisé en ce que les moyens pour appliquer une différence de potentiel entre l'électrode de détection (1) et l'électrode de référence (15) et les moyens pour mesurer l'intensité du courant électrique circulant entre l'électrode de détection (1) et l'électrode auxiliaire (17) forment une unité de mesure par voltampérométrie puisée normale différentielle.
14. Procédé de détection ampérométrique du monoxyde d'azote et de ses dérivés, in vi vo, caractérisé en ce que l'on mesure le courant catalytique accompagnant l'oxydation du NO en implantant in vi vo les trois électrodes (1, 15, 17) du capteur selon l'une quelconques des revendications 10 à 12 et en mesurant par voltampérométrie puisée normale différentielle, l'intensité du pic obtenu à 0,65 V environ, cette intensité étant proportionnelle à la quantité de NO présent in vi vo .
15. Procédé de détection selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'on réalise une courbe d'étalonnage in vi tro avant d'effectuer les mesures in vi vo .
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