WO1994020859A1 - TROUSSE DE DIAGNOSTIC D'UN CANCER SECRETANT L'hCG OU DES FRAGMENTS D'hCG ET MOYENS DESTINES A L'IMMUNOTHERAPIE D'UN TEL CANCER - Google Patents

TROUSSE DE DIAGNOSTIC D'UN CANCER SECRETANT L'hCG OU DES FRAGMENTS D'hCG ET MOYENS DESTINES A L'IMMUNOTHERAPIE D'UN TEL CANCER Download PDF

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WO1994020859A1
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hcg
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polypeptide
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fragments
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Dominique Bellet
Frédéric TROALEN
Nathalie Rouas-Freiss
Jean-Michel Bidart
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors

Definitions

  • Diagnostic kit for a cancer secreting hCG or hCG fragments and means intended for the therapy of such cancer.
  • the present invention relates to a method for the treatment of cancer secreting hCG or fragments of hCG and means for implementing this method.
  • Human gonadotropic chorionic hormone Human gonadotropic chorionic hormone
  • hCG is an oligomeric glycoprotein consisting of the non-covalent association of two subunits ⁇ (hCG- ⁇ ) and ⁇ (hCG- ⁇ ). It belongs to the family of gonadothyreotropic hormones also comprising folliculotropic hormone (FSH), luteotropic hormone (LH) and thyreotropic hormone (TSH). HCG is secreted physiologically by the trophoblast from the start of pregnancy and stimulates the corpus luteum to maintain the synthesis of steroid hormones essential for implantation of the embryo.
  • FSH folliculotropic hormone
  • LH luteotropic hormone
  • TSH thyreotropic hormone
  • hCG and / or its subunits are also secreted by a majority of trophoblastic tumors and certain non-trophoblastic tumors, thus constituting biological markers which can help in the diagnosis or prognosis and in the monitoring of these tumors (Bellet and al. Rev. Prat. 40: 1677-1990).
  • hCG- ⁇ is detectable in healthy men ( ⁇ 1 ng / ml) and women over 45 years of age without menopause ( ⁇ 3 ng / ml). In contrast, hCG- ⁇ is not detectable in the normal population.
  • trophoblastic tumors In the case of trophoblastic tumors, it has been shown that benign (hydatidiform moles) and malignant (choriocarcinomas) placental tumors are characterized by an important serum hCG / hCG- ⁇ ratio: the percentage of free hCG which is 0.05 to 1% during normal pregnancies amounts to 1-5% in the case of moles and exceeds 5% in choriocarcinomas.
  • This serum hCG / hCG- ⁇ ratio is used as a control for the development of testicular tumors: a percentage of hCG- ⁇ becoming less than 5% is often characteristic of a favorable development of the tumor during treatment. This ratio will rise quickly in the event of an unfavorable development or a relapse.
  • hCG- ⁇ not detectable in healthy individuals, is found in many patients with certain non-trophoblastic tumors (tumors of the bladder, pancreas, cervix, tumors without primitive found, endometrial and lung tumors).
  • the subject of the present invention is a method of treating cancer secreting hCG or fragments of hCG which consists in
  • the polypeptides are formed by a chain of 9 to 40 amino acids corresponding to a part of the primary sequence of hCG. They may in particular be polypeptides comprising from 15 to 40 amino acids or, in the case of polypeptides capable of being recognized by cytotoxic T lymphocytes, shorter polypeptides having in particular from 9 to 11 amino acids.
  • set of polypeptides covering at least part of the primary sequence of hCG denotes a set of polypeptides as defined above which correspond to successive sequences of hCG or of its fragments or better which correspond to sequences overlapping.
  • At least one set of polypeptides will be used which covers the primary sequence of the ⁇ subunit of hCG or at least part of this sequence.
  • the synthesis of the ⁇ subunit is dependent on an ultigenic group comprising 7 genes (Talmadge et al., Nucl. Acids Res. 12, 8415, 1984). Analysis of the nucleotic sequences shows that three of these genes (1, 3, 5) have an identical structure, four others of these genes (2, 6, 7 and 8) encode a variant at codon 117 with substitution. alanine instead of an aspartic acid.
  • a study of gene expression shows that genes 1, 3 and 5 are expressed by the normal placenta.
  • tumourogenesis processes involving non-trophoblastic cells the expression of several genes leads to both the secretion of the normal protein and of a protein mutated to 117.
  • ⁇ subunit denotes both the normal protein and the protein mutated at 117.
  • polypeptide corresponding to the antigen responsible for the state of immunization means a polypeptide which has the same sequence as one of the polypep ⁇ tides responsible for the state of immunization or a sequence resulting from the combination of sequences at least partial of the polypeptides responsible for the state of immunization.
  • the state of immunization with respect to one of the polypeptides can be identified by a test for stimulating the proliferation of T lymphocytes by the polypeptides, or also by a test for cytotoxicity of T lymphocytes against vis the polypeptides.
  • the recognized polypeptides are formed by a sequence of at least 9 amino acids corresponding to a part of the primary sequence of 1'hCG.
  • the polypeptides interact with the class I molecules of the major histocompatibility complex of the patient. Each class I molecule interacts with peptides with specific motifs.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit for a cancer secreting hCG or hCG fragments comprising a set of polypeptides covering at least part of the primary sequence of 1'hCG.
  • the subject of the present invention is also a composition intended for the immunotherapy of cancers secreting hCG or hCG fragments comprising an effective dose of a polypeptide corresponding to at least part of the primary sequence of hCG and in particular a polypeptide corresponding to at least part of the primary sequence of the hCG ⁇ subunit and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the present invention also relates to the use of a polypeptide corresponding to at least a part of the primary sequence of 1'hCG and in particular of a polypeptide corresponding to at least a part of the primary sequence of the ⁇ subunit hCG for the manufacture of a composition for the immunotherapy of cancers secreting hCG or fragments of hCG.
  • poly ⁇ peptides can be used in free form or in a more immunogenic form, in particular a form in which the peptide is coupled to a polylysine matrix according to the MAP technique (Posnett et al. J. Biol. Chem. 263, 17, 1988).
  • the polypeptide is advantageously administered with an adjuvanting immunity.
  • adjuvants of immunity we may cite muramyldipeptide and SAF-1 (Allison et al., J. Immunol. Methods 45, 157, 1986).
  • polypeptide can be protected at its NH 2 and COOH terminal ends in order to reduce the risks of degradation.
  • the BCG vaccine (Bacillus Calmette Guérin) constituted by living attenuated strains of tuberculous bacillus (see in particular D. Lamm et al, New England Journal of Medicine 325, 17, 1205, 1991).
  • the present invention therefore further relates to a composition intended for the immunotherapy of cancers secreting hCG or hCG fragments comprising an effective dose of a polypeptide corresponding to at least part of the primary sequence of hCG and an effective dose of BCG in a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • immunotherapy can be carried out with doses of polypeptides from 1 to 100 mg administered in particular at the level of the tumor.
  • the polypeptides can be administered in the case of bladder cancer, as is already practiced in the case of immunotherapy with BCG, that is to say by intravesical instillation one week after resection. tumor, then this administration is repeated every week for 6 weeks and additional intravesical administration is performed 3, 6, 12, 18 and 24 months later.
  • Percutaneous or general administrations are also possible. Description of the figures.
  • Fig. 1 shows the proliferation of lymphocytes from a patient with bladder cancer in the presence of hCG, free ⁇ and ⁇ subunits and various polypeptides.
  • Fig. 2 shows the proliferation of lymphocytes from another patient with bladder cancer in the presence of free ⁇ and ⁇ subunits and different polypeptides.
  • Fig. 3A shows the proliferation of lymphocytes from a patient with bladder cancer in the presence of different polypeptides.
  • Fig. 3B shows the proliferation of lymphocytes from a patient with testicular cancer in the presence of different polypeptides.
  • PBMC mononuclear cells
  • the PBMCs are cultured (2 ⁇ 10 5 cells per well) in RPMI 1640 supplemented with 10% human AB serum, 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml of penicillin and 100 ⁇ g / ml of streptomycin, in the presence of polypeptide at different concentrations.
  • the cells are then incubated at 37 ° C with 5% C0 2 for 5 days.
  • a ⁇ Ci of tritiated thymidine is then added to each well.
  • the cells are collected 18 hours later and The incorporation of the radioactivity is analyzed by spectrometry in a scintillation liquid using a ⁇ counter.
  • FIG. 1 We have given in FIG. 1 the results of proliferation of lymphocytes from a patient with bladder cancer in the presence
  • results demonstrate a significant proliferation with the polypeptide corresponding to the sequence 95-115 of the ⁇ subunit of hCG as well as with the polypeptide corresponding to the sequence 25-59 of the ⁇ subunit of the hCG.
  • the 95-115 hCG- ⁇ and 25-59 hCG- ⁇ polypeptides can be used for immunotherapy in the patient tested.
  • FIG. 2 results of the same type on lymphocytes from another patient with bladder cancer.
  • the results demonstrate a significant proliferation with the polypeptide corresponding to the sequence 31 - 50 of the ⁇ subunit of hCG as well as with the polypeptide corresponding to the sequence 41 - 61 of the ⁇ subunit of the hCG.
  • hCG- ⁇ and 41-61 hCG- ⁇ polypeptides 31 - 50 can be used for immunotherapy.
  • FIG. 3A We have given in FIG. 3A the results of PBMC proliferation tests of another patient with bladder cancer secreting the ⁇ subunit of hCG in the presence of different polypeptides covering the entire ⁇ subunit of hCG (50 ⁇ m).
  • T cells from a patient with testicular cancer secreting hCG- ⁇ , proliferated in the presence of the peptide hCG- ⁇ (20-47) (Fig. 3B).
  • PBMCs isolated by Ficoll gradient are tested for their cytotoxic action against autologous targets (patient B lymphocytes immortalized by Epstein-Barr virus) labeled with chromium 51 and serving as cells presenting the hCG polypeptides. . Cytotoxicity is evaluated by counting the radioactivity due to the release of 51 Cr from the lysed target.

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Abstract

L'invention a pour objet une trousse de diagnostic d'un cancer secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG comprenant un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG pour la fabrication d'une composition destinée à l'immunothérapie de cancers secrétant l'hCG ou des fragments d'hCG.

Description

Trousse de diagnostic d'un cancer sécrétant l'hCG ou des fragments d'hCG et moyens destinés à l'iππiunothérapie d'un tel cancer.
La présente invention concerne une méthode de traitement d'un cancer sécrétant l'hCG ou des fragments d'hCG et des moyens pour la mise en oeuvre de cette méthode. L'hormone chorionique gonadotrope humaine
(hCG) est une glycoprotéine oligomérique constituée de l'association non covalente de deux sous-unités α(hCG-α) et β(hCG-β). Elle appartient à la famille des hormones gonadothyréotropes comprenant également l'hormone folliculotrope (FSH), l'hormone lutéotrope (LH) et 1'hormone thyréotrope (TSH) . L'hCG est sécrétée physiolo- giquement par le trophoblaste dès le début de la gros¬ sesse et stimule le corps jaune pour maintenir la synthèse d'hormones stéroïdiennes essentielle à l'implan- tation de l'embryon. Par ailleurs, l'hCG et/ou ses sous- unités sont également sécrétées par une majorité de tumeurs trophoblastiques et certaines tumeurs non trophoblastiques, constituant ainsi des marqueurs biologiques pouvant aider au diagnostic ou au pronostic et à la surveillance de ces tumeurs (Bellet et al. Rev. Prat. 40:1677-1990).
La séquence des acides aminés de 1'hCG a été décrite par Morgan F. J. et al. The amino acid séquence of Human chorionic gonadotropin, J. Biol. Chem. 250, 5247, 1975.
Au sein de la population normale, des taux sériques très faibles d'hCG dimérique sont retrouvés chez l'homme (<0,05 ng/ml correspondant à la limite de détection de la méthode utilisée) et chez la femme non ménopausée (<0,1 ng/ml). L'hCG est principalement détectable chez 30% des femmes de plus de 45 ans (de 0,1 à 1 ng/ml) . Plusieurs études suggèrent que 1'hCG présente dans le sérum des sujets sains serait produite par des cellules hypophysaires. 'hCG-α est détectable chez l'homme sain (<1 ng/ml) et la femme de plus de 45 ans non ménopausée (<3 ng/ml). En revanche, l'hCG-β n'est pas détectable dans la population normale. Dans le cas de tumeurs trophoblastiques on a montré que les tumeurs placentaires bénignes (môles hydatiformes) et malignes (choriocarcinomes) sont caractérisées par un rapport hCG/hCG-β sérique important: le pourcentage d'hCG-libre qui est de 0,05 à 1% lors de grossesses normales s'élève à 1-5% en cas de môle et dépasse 5% dans les choriocarcinomes. Ce rapport hCG/hCG- β sérique est utilisé comme un témoin d'évolution des tumeurs testiculaires : un pourcentage d'hCG-β devenant inférieur à 5% est souvent caractéristique d'une évolu- tion favorable de la tumeur au cours du traitement. Ce rapport s'élèvera rapidement en cas d'évolution défavora¬ ble ou de rechute.
Dans le cas de tumeurs non trophoblastiques, Marcillac et al. Cancer Res. 52:3901, 1992 ont montré que l'hCG-β, non détectable chez les individus sains, est retrouvée chez de nombreux patients atteints de certaines tumeurs non trophoblastiques (tumeurs de la vessie, du pancréas, du col de l'utérus, les tumeurs sans primitif retrouvé, les tumeurs de l'endomètre et du poumon). La présente invention a pour objet une méthode de traitement d'un cancer sécrétant 1'hCG ou des fragments d'hCG qui consiste à
- identifier dans le sérum d'un patient à 1'aide d'un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG, un état d'immunisation vis-à-vis d'un de ces polypeptides.
- administrer au patient au moins un polypep¬ tide correspondant à 1'antigène responsable de 1'état d'immunisation. Dans le cadre de la présente invention les polypeptides sont formés par un enchaînement de 9 à 40 aminoacides correspondant à une partie de la séquence primaire de l'hCG. Il peut s'agir en particulier de polypeptides comportant de 15 à 40 aminoacides ou, dans le cas de polypeptides susceptibles d'être reconnus par des lymphocytes T cytotoxiques, de polypeptides plus courts ayant notamment de 9 à 11 aminoacides.
On désigne par ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG un ensemble de polypeptides tels que définis ci- dessus qui correspondent à des séquences successives de 1'hCG ou de ses fragments ou mieux qui correspondent à des séquences qui se chevauchent. On peut par exemple utiliser un ensemble de polypeptides correspondant aux séquences suivantes : hCG-α 1-20
15-35
30-50 45-65
60-80
75-92 hCG-β 1-20
15-35 30-50
45-65 60-80 75-95 90-110 105-125
120-145 De préférence on utilisera au moins un ensemble de polypeptides qui recouvre la séquence primaire de la sous-unité β de l'hCG ou au moins une partie de cette séquence. Il est à noter que la synthèse de la sous- unité β est sous la dépendance d'un groupe ultigénique comportant 7 gènes (Talmadge et al., Nucl. Acids Res. 12, 8415, 1984). L'analyse des séquences nucléotiques montre que trois de ces gènes (1, 3, 5) ont une structure identique, quatre autres de ces gènes (2, 6, 7 et 8) codent un variant au niveau du codon 117 avec substitu¬ tion de l'alanine à la place d'un acide aspartique. Une étude de l'expression des gènes (Bo et al., J. Biol. Chem., 267, 3179, 1992) montre que les gènes 1, 3 et 5 sont exprimés par le placenta normal.
On pense que dans les processus de tumorogé- nèse intéressant les cellules non trophoblastiques l'expression de plusieurs gènes conduit à la fois à la sécrétion de la protéine normale et d'une protéine mutée en 117.
Dans la présente invention on désigne donc par sous-unité β à la fois la protéine normale et la protéine mutée en 117.
Par "polypeptide correspondant à l'antigène responsable de 1'état d'immunisation on désigne un polypeptide qui a la même séquence que 1'un des polypep¬ tides responsable de l'état d'immunisation ou une séquence résultant de la combinaison de séquences au moins partielles des polypeptides responsables de l'état d'immunisation.
L'état d'immunisation vis-à-vis d'un des polypeptides peut être identifié par un test de stimula- tion de la prolifération des lymphocytes T par les polypeptides, ou encore par un test de cytotoxicité des lymphocytes T vis-à-vis des polypeptides.
Dans le cas de lymphocytes T cytotoxiques, les polypeptides reconnus sont formés par un enchaînement d'au moins 9 aminoacides correspondant à une partie de la séquence primaire de 1'hCG. Pour être reconnus par les lymphocytes T cytotoxiques, les polypeptides interagis¬ sent avec les molécules de classe I du complexe majeur d'histocompatibilité du patient. Chaque molécule de classe I interagit avec des peptides comportant des motifs précis. On peut par exemple utiliser les polypeptides correspondant aux séquences suivantes de 1'hCG-β :
3 - 12 4 - 12
8 - 16
10 - 18
11 - 20
17 - 25
23 - 33
24 - 33
28 - 37
32 - 41
40 - 48
40 - 49
44 - 52
47 - 55
48 - 56
51 - 59
55 - 62
61 - 69
68 - 76
71 - 80
72 - 80
75 - 84
77 - 86
78 - 86
83 - 92
100 - - 108
119 - - 128 125 - 134 134 - 143.
On peut également mettre en évidence la présence éventuelle d'anticorps sériques spécifiques de 1'hCG ou de ses fragments. Ces anticorps peuvent être mis en évidence notamment par une méthode immuno-enzymatique telle qu'une méthode ELISA.
La présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic d'un cancer sécrétant l'hCG ou des fragments d'hCG comprenant un ensemble de polypepti¬ des recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de 1'hCG.
La présente invention a également pour objet une composition destinée à 1'immunothérapie de cancers sécrétant l'hCG ou des fragments d'hCG comprenant une dose efficace d'un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG et notamment un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de la sous-unité β de l'hCG et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de 1'hCG et notamment d'un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de la sous-unité β de l'hCG pour la fabrication d'une composition destinée à 1'immunothérapie de cancers sécrétant l'hCG ou des fragments d'hCG.
Pour la thérapie on peut utiliser les poly¬ peptides sous forme libre ou sous une forme plus immuno- gène, notamment une forme dans laquelle le peptide est couplé à une matrice de polylysine selon la technique du MAP (Posnett et al. J. Biol. Chem. 263, 17, 1988).
En outre, pour la thérapie on administre le polypeptide avantageusement avec un agent adjuvant de l'immunité. Comme exemples d'adjuvants de l'immunité on peut citer le muramyldipeptide et le SAF-1 (Allison et al., J. Immunol. Methods 45, 157, 1986).
On peut également administrer le polypeptide couplé à des nanosphères ou à des nanoparticules telles que celles décrites dans EP 02 40 424.
Enfin, le polypeptide peut être protégé à ses extrémités NH2 et COOH terminales afin de réduire les risques de dégradation.
Dans le cas du traitement de certains cancers et notamment dans le cas du cancer de la vessie, on peut également administrer en plus de façon concomitante ou en mélange du vaccin BCG (Bacille de Calmette Guérin) constitué par des souches vivantes atténuées de bacille tuberculeux (voir notamment D. Lamm et al, New England Journal of Medicine 325, 17, 1205, 1991).
La présente invention a donc en outre pour objet une composition destinée à l'immunothérapie de cancers sécrétant 1'hCG ou des fragments d'hCG comprenant une dose efficace d'un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de 1'hCG et une dose efficace de BCG dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
En pratique 1'immunothérapie peut être réalisée avec des doses de polypeptides de 1 à 100 mg administrés notamment au niveau de la tumeur. Par exemple, les polypeptides peuvent être administrés dans le cas d'un cancer de la vessie, comme cela est pratiqué déjà dans le cas d'une immunothérapie par le BCG, c'est- à-dire par instillation intravésicale une semaine après la résection de la tumeur, puis cette administration est répétée chaque semaine pendant 6 semaines et des admi¬ nistrations intravésicales supplémentaires sont effec¬ tuées 3, 6, 12, 18 et 24 mois après. Des administrations percutanées ou par voie générale sont également possi- blés. Description des figures.
La Fig. 1 représente la prolifération des lymphocytes provenant d'un patient ayant un cancer de la vessie en présence d'hCG, des sous-unités α et β libres et de différents polypeptides.
La Fig. 2 représente la prolifération des lymphocytes provenant d'un autre patient ayant un cancer de la vessie en présence des sous-unités α et β libres et de différents polypeptides. La Fig. 3A représente la prolifération des lymphocytes provenant d'un patient ayant un cancer de la vessie en présence de différents polypeptides.
La Fig. 3B représente la prolifération des lymphocytes provenant d'un patient ayant un cancer du testicule en présence de différents polypeptides.
On donnera ci-après le compte-rendu d'essais de diagnostic.
1) Isolement des cellules mononuclées (PBMC) par gradient de ficoll : Le sang total héparine prélevé sur des patients présentant un cancer est déposé sur une solution de ficoll-hypaque (1,077 g/1) dans un tube conique. Le tube est centrifugé 30 mn à 900 g, 18-20PC. La couche correspondant aux cellules mononuclées est récupérée à l'aide d'une pipette. Les cellules sont lavées dans du tampon de HANKs.
2) Test de prolifération lymphocvtaire
Les PBMC sont cultivés (2xl05 cellules par puits) dans du RPMI 1640 additionné de 10% de sérum humain AB, 2mM de L-glutamine, 100 Ul/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine, en présence de polypeptide à différentes concentrations. Les cellules sont alors mises à incuber à 37°C avec 5% de C02 pendant 5 jours. Un μCi de thymidine tritiée est ensuite ajouté dans chaque puits. Les cellules sont collectées 18 heures après et 1'incorporation de la radioactivité est analysée par spectrométrie dans un liquide de scintillation utilisant un compteur β.
On a donné sur la Fig. 1 les résultats de prolifération des lymphocytes provenant d'un patient ayant un cancer de la vessie en présence
- du milieu de culture (M)
- de l'hCG et de ses sous-unités α et β
- de différents polypeptides appartenant aux sous-unités α et β.
Les résultats mettent en évidence une prolifération significative avec le polypeptide corres¬ pondant à la séquence 95-115 de la sous unité β de l'hCG ainsi qu'avec le polypeptide correspondant à la séquence 25-59 de la sous unité α de l'hCG.
Les polypeptides 95-115 hCG-β et 25-59 hCG-α peuvent être utilisés pour une immunothérapie chez le patient testé.
On a donné sur la Fig. 2 des résultats du même type sur des lymphocytes d'un autre patient ayant un cancer de la vessie. Les résultats mettent en évidence une prolifération significative avec le polypeptide correspondant à la séquence 31 - 50 de la sous-unité β de l'hCG ainsi qu'avec le polypeptide correspondant à la séquence 41 - 61 de la sous-unité α de l'hCG. Chez ce patient les polypeptides 31 - 50 de l'hCG-β et 41-61 de l'hCG-α peuvent être utilisés pour une immunothérapie.
On a donné sur la Fig. 3A les résultats de tests de prolifération de PBMC d'un autre patient ayant un cancer de la vessie sécrétant la sous-unité β de l'hCG en présence de différents polypeptides recouvrant la totalité de la sous-unité β de l'hCG (50 μm).
Les résultats montrent que pour ce patient le polypeptide correspondant à la région β (20-47) de 1'hCG est le plus efficace pour induire une prolifération des cellules T.
Par ailleurs, d'autres tumeurs (pancréatiques et testiculaires) ont été étudiées. Les cellules T d'un patient, présentant un cancer du testicule, sécrétant de l'hCG-β, ont proliféré en présence du peptide hCG-β (20- 47) (Fig. 3B).
Ces résultats montrent que des peptides correspondant à une partie de la séquence de l'hCG-β sont immunogéniques chez des malades ayant une tumeur produc¬ trice d'hCG-β et peuvent ainsi être utilisés pour développer une immunothérapie antitumorale.
A l'inverse, aucune réponse contre l'hCG, ses sous-unités ou des peptides de structure analogue n'a été observée chez 21 femmes enceintes.
On donnera ci-après les résultats ainsi obtenus.
Réponse immune cellulaire contre l'hCG ou ses sous-unités.
Populations testées Total Réponses
Tumeurs vésicales 21 5 Tumeurs hCGβ+ 14 5 Tumeurs hCGβ- 7 0
Femmes enceintes 21 0
Sujets sains 13 0
3) Test de cvtotoxicité
Les PBMC isolés par gradient de Ficoll sont testés pour leur action cytotoxique vis-à-vis de cibles autologues (lymphocytes B du patient immortalisés par 1'Epstein-Barr virus) marquées du chrome 51 et servant de cellules présentatrices des polypeptides de l'hCG. La cytotoxicité est évaluée par le comptage de la radioacti¬ vité due au relargage du 51Cr de la cible lysée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Trousse de diagnostic d'un cancer sécré¬ tant l'hCG ou des fragments d'hCG comprenant un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de 1'hCG.
2. Trousse de diagnostic selon la revendica¬ tion 1, comprenant un ensemble de polypeptides qui recouvre la séquence primaire de la sous-unité β de l'hCG.
3. Trousse de diagnostic selon la revendica¬ tion 1, comprenant un ensemble de polypeptides qui recouvre au moins une partie de la séquence primaire de la sous-unité β de l'hCG.
4. Trousse de diagnostic selon 1'une quelcon- que des revendications 1 à 3, comprenant des polypeptides ayant de 9 à 40 aminoacides.
5. Trousse de diagnostic selon 1'une quelcon¬ que des revendications 1 à 4, comprenant des polypeptides dont les séquences se chevauchent.
6. Utilisation d'un polypeptide correspondant à au moins une partie de la séquence primaire de 1'hCG pour la fabrication d'une composition destinée à 1'immu¬ nothérapie de cancers sécrétant 1'hCG ou des fragments d'hCG.
7. Utilisation selon la revendication 6, dans laquelle le polypeptide correspond à au moins une partie de la séquence primaire de la sous unité β de l'hCG.
8. Utilisation selon la revendication 6 ou la revendication 7, dans laquelle le ou les polypeptides ont de 9 à 40 aminoacides.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, dans laquelle le polypeptide est couplé à une matrice de polylysine.
10. Utilisation selon 1'une quelconque des revendications 6 à 9, comprenant en outre un agent adjuvant de l'immunité.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 6 à 10, dans laquelle le polypeptide est protégé aux extrémités NH2 et COOH terminales.
12. Composition destinée à l'immunothérapie de cancers sécrétant 1'hCG ou des fragments d'hCG comprenant une dose efficace d'un polypeptide correspon¬ dant à au moins une partie de la séquence primaire de 1'hCG et une dose efficace de BCG dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
13. Méthode de diagnostic in vitro en vue du traitement d'un cancer sécrétant l'hCG ou des fragments d'hCG qui consiste à identifier dans le sang circulant d'un patient à 1'aide d'un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG, un état d'immunisation vis-à-vis d'un de ces polypeptides.
14. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle l'état d'immunisation vis-à-vis d'un des polypeptides est identifié par un test de stimulation des lymphocytes T par les polypeptides.
15. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle on met en évidence la présence éventuelle d'anticorps sériques spécifiques de l'hCG ou de ses fragments.
16. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle 1'état d'immunisation vis-à-vis d'un des polypeptides est identifié par un test de cytotoxicité des lymphocytes T vis-à-vis des polypeptides.
17. Méthode de traitement d'un cancer sécré¬ tant l'hCG ou des fragments d'hCG qui consiste à
- identifier dans le sérum d'un patient à 1'aide d'un ensemble de polypeptides recouvrant au moins une partie de la séquence primaire de l'hCG, un état d'immunisation vis-à-vis d'un de ces polypeptides. - administrer au patient au moins un polypep¬ tide correspondant à 1'antigène responsable de 1'état d'immunisation.
18. Méthode selon la revendication 17, dans laquelle l'ensemble des polypeptides recouvre au moins une partie de la séquence primaire de la sous unité β de l'hCG.
19. Méthode selon la revendication 17 ou la revendication 18, dans laquelle les polypeptides ont de 9 à 40 aminoacides.
20. Méthode selon la revendication 19, dans laquelle les séquences des différents polypeptides se chevauchent.
21. Méthode selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, dans laquelle l'état d'immunisa¬ tion vis-à-vis d'un des polypeptides est identifié par un test de stimulation des lymphocytes T par les polypep¬ tides.
22. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, dans laquelle on met en évidence la présence éventuelle d'anticorps sériques spécifiques de l'hCG ou de ses fragments.
23. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle l'état d'immunisation vis-à-vis d'un des polypeptides est identifié par un test de cytotoxicité des lymphocytes T vis-à-vis des polypeptides.
24. Méthode selon l'une quelconque des revendications 17 à 23, dans laquelle on administre avec le polypeptide un agent adjuvant de l'immunité.
25. Méthode selon l'une quelconque des revendications 17 à 24, dans laquelle on administre de façon concomitante à l'administration du polypeptide ou en mélange avec le polypeptide, du BCG.
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