WO1994005787A1 - Glycopeptides, method of obtaining them and biological applications thereof - Google Patents

Glycopeptides, method of obtaining them and biological applications thereof Download PDF

Info

Publication number
WO1994005787A1
WO1994005787A1 PCT/FR1993/000853 FR9300853W WO9405787A1 WO 1994005787 A1 WO1994005787 A1 WO 1994005787A1 FR 9300853 W FR9300853 W FR 9300853W WO 9405787 A1 WO9405787 A1 WO 9405787A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glycopeptides
pro
substituted
sequence
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/FR1993/000853
Other languages
French (fr)
Inventor
Philippe Bulet
Charles Hetru
Jean-Luc Dimarcq
Jules Hoffmann
Alain Van Dorsselaer
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Publication of WO1994005787A1 publication Critical patent/WO1994005787A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention has for o jet glycopeptides, their production and their biological applications.
  • glycopeptides having in particular antibacterial properties.
  • Antibacterial peptides are known to have been isolated from insects. Certain insect species have an effective resistance against bacteria. Recent work has established that this defense is based, to a large extent, on the rapid synthesis (2 to 6 h) of several families of peptides or polypeptides. This synthesis can be induced, in particular, by a septic injury or, in general, a trauma, or by immunization, that is to say by injection of a low dose of bacteria.
  • cecropins which are cationic peptides of 4 Da forming two amphipathic ⁇ helices;
  • defensins moderately cationic, non-glycosylated peptides with a pi of 8.0 to 8.5, comprising from 38 to 43 amino acids and containing a motif characteristic of 6 cysteine residues engaged in 3 intramolecular disulfide bridges
  • antibacterial peptides mentioned above could be induced in lepidoptera, diptera, hymenoptera and beetles. Works carried out so far, however, on other species have not made it possible to detect their presence.
  • the elimination of these groups leads to a very strong reduction in antibacterial activity, or even to its complete disappearance.
  • the invention therefore aims to provide new substituted peptides having a high level of activity vis-à-vis a large number of bacteria.
  • the invention further aims to take advantage of the biological properties conferred by substitution groups for the development of antibacterial agents usable in human and veterinary therapy and, in general, for the fight against bacteria.
  • the peptides according to the invention are characterized in that they have antibacterial properties conferred by an amino acid sequence containing at least one amino acid - O - substituted by a glycosyl group containing one or more ose and / or osamine units, a polyose and / or osamine.
  • the substituted amino acid is a hydroxylated amino acid, such as threonine, serine or tyrosine. Threonine is particularly preferred.
  • glycos amino acid (s)
  • glycopeptides amino acid (s)
  • the glycosyl group is linear or cyclic, substituted or not, in ⁇ or ⁇ form. It advantageously comprises ose and / or osamine units of 5 or 6 carbon atoms.
  • Suitable dare groups include pentoses, such as ribose, lyxose, xylose, arabinose, and hexoses, such as galactose and glucose, fucose, tallose, altrose, gulose, mannose and allose.
  • Osamine groups are advantageously constituted by a galactosamine, glucosamine, tallosamine, altrosamine, gulosamine, mannosamine, or allosamine radical.
  • the poly-oses and / or -osamines comprise a series of ose and / or osamine units, in particular from 2 to 10 units, in particular from 2 to 7 units.
  • the glycosyl group is substituted.
  • the substituents of the ose and / or osamine units are then advantageously chosen from alkyl radicals of 1 to 4 carbon atoms or, in particular in the case of osamines, from acyl radicals, more especially acetyl, these radicals more particularly substituting the function amine.
  • substituents can also correspond to at least one dare unit and / or at least one osamine unit.
  • the glycosyl group can thus comprise an osamine unit bearing one or more alkyl and / or acyl groups and also be substituted by one or more ose units, in particular 2 or 3.
  • a substituted glycosyl group mention may be made of a glucosamine or galactosamine unit substituted by one or several glucose and / or galactose units, in particular an N-acyl-glucosamine or N-acylgalactosamine unit, substituted by one or more glucose and / or galactose units, in particular 2 or 3.
  • Other glycopeptides of the invention include substitutions more complex, concerning the terminal N and / or C parts, and / or radical substitutions of sialic acid.
  • glycopeptides according to the invention are further characterized in that they are of the type of glycopeptides as obtained in arthropods, and in particular in larvae or adults of insects, by a process comprising
  • the extraction is carried out on the whole animal previously frozen, then ground.
  • the extraction is carried out on the hemolymph of the animals, and this in a conventional manner, in order to separate the basic peptides.
  • the invention relates to the corresponding extracts, mixtures of glycopeptides and fractions.
  • the glycopeptides of the invention are also characterized in that they exhibit antibacterial activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria.
  • a group of glycopeptides as defined above, is further characterized in that their peptide sequence responsible for their antibacterial activity is contained in a domain comprising at least approximately 30% of proline groups.
  • This sequence more specifically comprises a consensus motif of proline-threonine / serine Xaal-Xaa2-proline 0-glycosylation in which the identical or different Xaal and Xaa2 motifs are variable amino acids.
  • the chain of amino acids of the biologically active sequence that is to say having an antibacterial activity, advantageously comprises at least one hydrophobic amino acid such as threonine, substituted by a glycosyl group.
  • the glycosyl substitution group is more particularly constituted by an N-acylhexosamine unit, more especially N-acetylgalactosamine or N-acetylglucosamine, optionally itself substituted by one or more oses, in particular pentoses and / or hexoses, such as fucose and / or galactose and / or glucose.
  • Preferred glycopeptides are as inducible in brachycera.
  • a group of these glycopeptides which is advantageous with regard to its antibacterial properties is such that it is inducible in Drosophila.
  • the chain of amino acids of the glycopeptides of this group is in particular understood or constituted by the following sequence (I) as determined according to the degradation of Edman: this sequence, and the following sequences appear in the "List of sequences" section given at the end of the description with the identifications SEQ ID n ° 1 and following. Met Lys Phe Thr Ile Val Phe Leu Leu Leu 5 10
  • sequence is understood or constituted by the following sequence (II) (SEQ ID No. 2) in amino acids.
  • This sequence corresponds to the sequence going from positions 22 to 40 in the sequence (I).
  • the threonine or serine units are substituted by a glycosyl group.
  • glycopeptides of the invention are of the type of those inducible in Diptera and, among these, in particular in Phormia terranovae.
  • glycopeptides advantageously comprise or consist of a chain of amino acids, as determined according to the degradation of Edman, corresponding to the following sequence (III) (SEQ ID No. 3): Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro thr
  • sequences include as N-terminal part, at least part of the following sequence (V) (SEQ ID N 1 5): Asp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro Ser
  • amino acid sequences of peptides endowed with antibacterial properties such as inducible in Phormia terranovae f correspond to the following sequence VIII (SEQ ID N ° 8): Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr
  • the glycosyl group is advantageously an osamine unit itself substituted by one or more ose units.
  • a glycosyl group suitable for having antibacterial glycopeptides corresponds to a (N-acylhexosamine) -hexose group, in particular N-acetylgalactosamine or N-acetyl glucosamine, this group itself being substituted by one or more ose units, in particular fucose and / or galactose and / or glucose.
  • glycopeptides are such that they are inducible in hymenoptera, in particular in bees. Still other glycopeptides are of the type of those inducible in hemiptera, for example in Pyrrho ⁇ oris apterus.
  • glycopeptides of this type include or consist of a sequence of amino acids, as determined according to the degradation of Edman, having the following sequence (IX) (SEQ ID N ⁇ 9): Val Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro
  • the threonine motif at position 11 is substituted by a glycosyl group as defined above.
  • the invention also relates to the fragments or variants of the glycopeptides defined above, as soon as these fragments or these variants are recognized by antibodies directed against said peptides and / or have charge and / or hydrophobicity or hydrophilicity giving them antibacterial activity against Gram-negative germs, as observed in native glycopeptides.
  • variants is meant glycopeptides in which one or more amino acids are deleted, substituted by a group other than a glycosyl, or replaced by another amino acid with a similar charge.
  • Antibodies formed against glycopeptides and their fragments and variants also fall within the scope of the invention.
  • the invention relates to the nucleotide sequences comprising the genetic information corresponding to the amino acids of the glycopeptides defined above.
  • the invention further relates to the nucleotide sequences complementary to those defined above, as well as the corresponding RNAs.
  • the expression and / or cloning vectors comprising at least one fragment of the nucleotide sequences defined above also form part of the invention, as well as the hosts transformed by these vectors.
  • suitable hosts for the implementation of the invention include bacteria, such as E. coli. yeasts or cells of arthropods, vertebrates or plants.
  • the invention also relates to the expression products of the above vectors.
  • glycopeptides with antibacterial activity having been characterized as indicated above, those skilled in the art will easily choose the most suitable techniques for their development. By operating synthetically, there is easy access to the structures of glycopeptides as inducible in arthroprodes and their variants.
  • one or more of the amino acids of the sequence is substituted with a glycosyl group, then the introduction of blocking groups of the functions to be protected and a determined peptide chain is formed, advantageously using of a synthesizer, the substituted amino acid (s) being introduced sequentially in order to occupy the desired position in the sequence.
  • the blocking groups are eliminated at the end of the synthesis.
  • the peptide is prepared with special protection for the amino acid to be substituted by the glycosyl group.
  • the protective group of this amino acid is then removed only, and the protected glycosyl group is introduced.
  • the protective groups of the other amino acids and those of glycosyl are then eliminated.
  • these glycopeptides can be obtained according to genetic engineering techniques by introducing into an appropriate vector the nucleotide sequences capable of expressing the peptide backbone of glycopeptide sought, and by carrying out expression in a host capable of ensuring post-translational glycosylation. Alternatively, when the host used cannot provide this functionalization, chemical synthesis routes are used.
  • these glycopeptides are obtained by immunizing arthropods containing genes capable of coding for the desired glycopeptide (s), in particular by injection of bacteria, in an amount sufficient to cause their synthesis, or by trauma , such as a septic injury. A few hours after the immunization or the trauma, the glycopeptides are extracted and then fractionated and the fraction (s) corresponding to the glycopep ide (s) sought (s) isolated. The extraction is carried out under conditions making it possible to avoid any phenomenon of degradation of the glycopeptides, such as oxidation or action of proteases.
  • supports which are not very retentive and which have a high separating power.
  • Appropriate supports are chosen from the supports used in reverse phase.
  • the antibacterial properties conferred on the peptides of the invention by the glycosyl group have been demonstrated in growth inhibition tests of Gram negative bacteria and Gram positive bacteria.
  • results are given in the examples.
  • Pathogenic bacterial cultures, such as enterobacteria taken from samples from patients were then placed in a gel-coated dish.
  • the deposition of glycopeptides according to the invention on these bacteria has shown their great bactericidal efficiency.
  • the invention therefore relates to the use, for developing antibacterial agents and compositions, of peptides containing at least one amino acid - 0 - substituted by a group containing one or more ose and / or osamine units, a polyose and / or -osamine, having an antibacterial activity conferred by the glycosyl substitution group (s).
  • These compositions are characterized in that they contain an effective amount of the glycopeptides defined above, in combination with an inert vehicle suitable for the intended application.
  • excipients such as protease inhibitors, antioxidants and bacteria multiplication inhibitors.
  • compositions or agents intended for human or veterinary therapy will advantageously be in the form of injectable solutions, or in a form for external use, such as ointments, creams, powders, or solutions.
  • compositions of the invention are also of great interest in agrochemicals as phytosanitary agents. They are advantageously used in the form of powders or spreading solutions.
  • antibacterial compositions and agents The use of antibacterial compositions and agents.
  • the invention in the food industry makes it possible to prevent contamination by Gram-negative germs, during the manufacture of products and their conservation.
  • the invention also relates to the genomes of plants as modified by the presence of genes coding for the antibacterial glycopeptides defined above. These plant cells and plants are chosen from those capable of ensuring the glycosylation of the peptide sequences so as to confer on them antibacterial activity. Plants resistant to pathogens are thus available.
  • FIGS. 1 and 2 respectively represent FIG. 1, the variation of the absorbance as a function of time of a peptide eluted according to the invention.
  • Example 1 Obtaining antibacterial glycopeptides by extraction from Drosophila.
  • Drosophila are anesthetized with carbon dioxide and immunized by puncture in the thoracic region near the wing insertion using a needle immersed before each inoculation in a bacterial suspension of icroccocus luteus (Gram positive) and Escherichia c- Qli
  • Elution 40% fraction is analyzed in the same column as the “Elution 10%” fraction. Elution is carried out in a linear gradient of acetonitrile from 2 to 52% in acidified water (TFA 0.05%) in 90 minutes (progression of 0.55% acetonitrile per minute) at a flow rate of 1 ml / min.
  • the "80% Elution" fraction is analyzed on an Aquapore RP 300 Ce reverse phase column. Elution is carried out in a linear gradient of acetonitrile from 10 to 60% in acidified water (TFA 0.05%) in 90 minutes (i.e. a progression of 0.55% acetonitrile per minute) for a flow rate 1 ml / min.
  • the fractions are collected according to the variation in absorption at 225 nm, taking account of the shoulders. Each fraction thus collected is attributable to a peak in optical density. All the fractions are evaporated to dryness under vacuum and reconstituted in Milli Q water.
  • the antibacterial activity of each fraction is detected by the technique of the growth inhibition test in liquid medium on 10 ⁇ l aliquots: a such fraction is equivalent to an extract of 300 adults of Drosophila.
  • fractions which exhibit antibacterial activity are purified on the column previously described in a linear gradient of acetonitrile from 0 to 20% in acidified water (TFA 0.05%) at 90 minutes for a flow rate of 2 ml / min.
  • the variation in the optical density DO at 225 nm as a function of time is reported in FIG. 1 during the final purification step of the glycopeptide.
  • the dotted line corresponds to the acetonitrile (in%) added for the purification.
  • the arrow in solid line (i) indicates the purified glycopeptide and that in dotted line ( ⁇ ) indicates the synthetic peptide which will be discussed below.
  • ) represents the antibacterial activity.
  • the molar mass measured is 2564.4 daltons.
  • the microsequence analysis is carried out by carrying out an automated Edman degradation of the peptide and to the detection of phenylthiohydantoin derivatives on an automatic pulsed liquid sequencer (Applied Biosystems) model 473 A or 477 A.
  • the amino acid analysis is carried out on a 420 A analyzer (Applied Biosystems) with HPLC analyzer and microcomputer.
  • the peptide is hydrolyzed at 120 ° C for 24 hours with HCl 6N in the gas phase (Pico-Tag, Millipore). Derivatives are formed with phenyl isothiocyanate, then amino acids are detected at 254 nm.
  • the isolated and purified peptide corresponds to the sequence
  • the measurement of the biological activity was carried out by the following method:
  • PB medium LB medium devoid of yeast extract
  • PB medium LB medium devoid of yeast extract
  • the sequence of the synthetic peptide was verified by carrying out a degradation of Edman and by determining the molar mass using a VG Biotech Bio Q mass spectrometer.
  • this synthetic peptide devoid of a glycosyl group, exhibits a biological activity 10,000 times less than that of the glycopeptide of Example 1.
  • the purified glycopeptide of Example 1 was subjected to the action of anhydrous HF, which specifically hydrolyzes the O-glycosyl bonds.
  • This treatment led mainly to a compound of 2199.6 daltons, therefore of the same mass as the unsubstituted synthetic peptide and to a compound of 2403.0 daltons.
  • the same treatment applied to the synthetic peptide does not alter the latter, the molar mass of which remains unchanged.
  • glycosyl group is identified as an N-acetylgalactosamine-galactose group.
  • Example 2 Sequences of nucleotides coding for antibacterial glycopeptides.
  • FIG. 11 shows variations of bases which are represented in FIG. 2.
  • the consensus signal of polyadenylation AATAAA is indicated in bold characters.
  • the first line of the nucleotide sequence corresponds to those of clones 1 to 9, the second line mentions the bases different from clone 10, the other bases being identical to those given on the first line are not indicated.
  • the deduced amino acid sequence corresponds to a precursor of the peptide sequence of the glycopeptide of Example 1 and has the sequence I given above.
  • This sequence I comprises the sequence II of 19 amino acids and in the N-terminal part a potential peptide signal (motifs 1 to 19) and a Thr-Pro dipeptide (in positions 20 and 21).
  • the C-terminal part includes a peptide of 22 amino acids (occupying positions 43 to 64 in sequence I) separated from sequence II by a dibasic Arg-Arg cleavage site (in positions 41 and 42). .
  • Preparation of the cDNA library A cDNA library of selected size is prepared by subjecting Drosophila larvae to the third larval stage to a bacterial challenge.
  • the poly (A) enriched RNA is extracted as described by Reichhart et al in EMBO J. 11, 1469-1477 (1992).
  • An A gt 22 bank is constructed using the lambda Superscript system marketed by Gibco BRL.
  • the cDNAs are subcloned into Mt3mpl9.
  • the two strands are sequenced using the Sanger dideoxy method with the sequencing kit sold under the brand Sequanase R by USB.
  • Example 3 Obtaining antibacterial glycopeptides by expression from Saccharomices cerevisae.
  • a nucleotide sequence of a cDNA clone of Example 2 is inserted into a vector and expression is carried out in Saccharomices cerevisae.
  • glycopeptide produced is recovered and analyzed to verify its sequence.
  • a threonine is reacted with an N-acetylgalactosamine.
  • the hydroxyl groups of galactosamine are blocked using protecting groups usually used for this purpose.
  • Benzoyl chloride is used, for example, to protect the hydroxyl groups with a benzoyl radical.
  • the supernatant is added with acetic acid and heated to 100 ⁇ C for 4 min.
  • the precipitated proteins are removed by centrifugation and the supernatant is applied to a cation exchange column, equilibrated with a buffer of ammonium acetate 40 to 500 mM.
  • the biological activity of the peptides obtained is checked by operating as described in Example 1, for example by studying the activity with respect to E. coli.
  • the active peptides obtained are filtered on a Sep Pack C18 WatersR cartridge and purified by liquid chromatography, reverse phase HPLC on a Baker-Bond C18 WPR column. Elution is carried out according to a linear gradient with acetonitrile.
  • One of the freshly isolated active peptides is subjected to Edman degradation and its molecular mass is determined.
  • the amino acid sequence obtained corresponds to the sequence (VIII) given above, its molecular mass is 9440.4 ( ⁇ 3).
  • the threonine residues in positions 10 and 54 are O-glycosylated. This O-glycosylation corresponds in each of these positions to an N-acetyl hexosamine-hexose group. In particular, the threonine residues are substituted by N-acetylgalactosamine-galactose-glucose groups.
  • hydrofluoric acid HFA By treatment with hydrofluoric acid HFA, a decrease in the molecular mass is observed at 8692.6 and a loss of the biological activity.
  • the peptide of Example 1 it will be noted with interest that O-glycosylation is necessary for the biological activity of the peptides.
  • substitutions can be more complex than those already indicated corresponding to an N-acetylhexamine-hexose group. Indeed, the extractions of the active peptides were carried out in an acid medium and can therefore lead to an alteration of the substitution chain.
  • active peptides comprising a glycosyl group further substituted, for example, by a radical of sialic acid and / or a fucose.
  • Example 6 Obtaining antibacterial glycopeptides from Pyrrhocnris apterus. - Immunization and obtaining the hemolymph.
  • the hemolymph (about 3 ⁇ l / insect) is collected by sectioning an antenna and gently pressing the body of the insect.
  • the hemolymphs are collected and placed in a pre-cooled plastic well in the presence of aprotinin (Sigma A-62-79, final concentration: 10 ⁇ g / ml of hemolymph) as a protease inhibitor, and of phenylthiourea (final concentration: 1 ⁇ g / ml of hemolymph) as a melanization inhibitor.
  • the hemolymph is centrifuged at 13000 g for 1 hour at 4 ⁇ C.
  • the active fractions are combined and applied to a size exclusion HPLC column, then an isocratic elution is carried out with 30% acetonitrile in acidified water (0.03% TFA).
  • the antibacterial activities of the fractions are verified by assaying aliquots and by carrying out growth inhibition tests on plates against various microorganisms.
  • An anti-E.coli activity is detected in fraction 1 corresponding to molecular weights of 10 to 30 kDa, and an antibacterial activity directed against E.coli and M.luteus, in fraction 2 with molecular weights less than 10 kDa .
  • Fraction 1 is then subjected to a reverse phase Ci8 HPLC and the active molecules are first eluted with a gradient varying from 2 to 52% of acetonitrile in acidified water (90 min, flow rate 1 ml / min) .
  • a new chromatography is carried out on the same column with a lower gradient of 15 to 35% acetonitrile in acidified water (for 90 min) with a higher flow rate (2 ml / min).
  • Fraction 2 is also subjected to reverse phase HPLC Ci8 chromatography with a gradient of 2 to 52% acetonitrile in acidified water (0.05% TFA).
  • Two zones with anti-bacterial activity are recovered: one corresponds to a peptide, called peptide B, having anti-M.luteus activity and the second to a peptide called peptide C, which is active against E.coli.
  • Peptide C appears to consist of a mixture of compounds and is subjected to an additional purification using two successive chromatography processes (HPLC, gradient from 10 to 30%, followed by a gradient from 5 to 25% acetonitrile in acidified water, 0.05% TFA, 90 min for each gradient). Peptide C is thus obtained in pure form.
  • the signals observed for the residue at position 11 are analogous to those observed for the threonine residue of the peptide according to Example 1, as induced in Drosophila.
  • the difference between the calculated mass of the peptide (2340.2 Da) and the experimental mass (2543.3 Da) is 203.1 Da, which corresponds to an N-acetylhexosamine motif (221.18 Da) with a molecule d water required for glycan bonding.
  • the threonine motif substitution group is an N-acetylgalactosamine group.
  • Example 7 Formulation usable for treating septicemia with enterobacteria.

Abstract

Glycopeptides are disclosed having antibacterial properties due to an aminoacid sequence containing at least one aminoacid substituted by a glycosyl group selected from monosaccharides, amino sugars, polysaccharides and/or polyamino sugars. These glycopeptides can be used against bacteria.

Description

GLYCOPEPTIDES, LEUR PROCEDE D'OBTENTION, ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUESGLYCOPEPTIDES, THEIR PROCESS FOR OBTAINING IT, AND THEIR BIOLOGICAL APPLICATIONS
L'invention a pour o jet des glycopeptides, leur obtention, ainsi que leurs applications biologiques.The invention has for o jet glycopeptides, their production and their biological applications.
Elle vise plus particulièrement des glycopeptides présentant notamment des propriétés antibactériennes.It relates more particularly to glycopeptides having in particular antibacterial properties.
On sait que des peptides antibactériens ont été isolés à partir d'insectes. Certaines espèces d'insectes présentent en effet une résistance efficace contre des bactéries. Des travaux récents ont établi que cette défense est basée, pour une large part, sur la synthèse rapide (2 à 6 h) de plusieurs familles de peptides ou de polypeptides. Cette synthèse peut être induite, notamment, par une blessure septique ou, d'une manière générale, un traumatisme, ou par immunisation, c'est-à-dire par injection d'une faible dose de bactéries.Antibacterial peptides are known to have been isolated from insects. Certain insect species have an effective resistance against bacteria. Recent work has established that this defense is based, to a large extent, on the rapid synthesis (2 to 6 h) of several families of peptides or polypeptides. This synthesis can be induced, in particular, by a septic injury or, in general, a trauma, or by immunization, that is to say by injection of a low dose of bacteria.
Parmi les peptides ou polypeptides produits, on peut distinguer les quatre groupes suivants : i) les cécropines qui sont des peptides cationiques de 4 Da formant deux hélices α amphipathiques ; (ii) des peptides cationiques riches en proline, de petite taille (2 à 4 kDa), partiellement caractérisés, comme les apidaecines et les abaecines ; (iii) plusieurs polypeptides distincts, ayant un poids moléculaire (P ) de 8 à 27 kDa, pour la plupart cationiques et fréquemment riches en résidus glycine comme les attacines, les sarcotoxines II, les diptéricines et les coléoptéricines, et (iv) les défensines, peptides non glycosylés, modérément cationiques avec un pi de 8,0 à 8,5, comprenant de 38 à 43 acides aminés et contenant un motif caractéristique de 6 résidus cystéine engagés dans 3 ponts disulfure intramoléculaires.Among the peptides or polypeptides produced, the following four groups can be distinguished: i) cecropins which are cationic peptides of 4 Da forming two amphipathic α helices; (ii) cationic peptides rich in proline, of small size (2 to 4 kDa), partially characterized, such as apidaecins and abaecins; (iii) several distinct polypeptides, having a molecular weight (P) of 8 to 27 kDa, for the most part cationic and frequently rich in glycine residues such as attacins, sarcotoxins II, diptericins and coleoptericins, and (iv) defensins , moderately cationic, non-glycosylated peptides with a pi of 8.0 to 8.5, comprising from 38 to 43 amino acids and containing a motif characteristic of 6 cysteine residues engaged in 3 intramolecular disulfide bridges.
Les peptides antibactériens évoqués ci-dessus ont pu être induits chez des lépidoptères, des diptères, des hyménoptères et des coléoptères. Des travaux réalisés jusqu'à présent sur d'autres espèces n'ont pas permis en revanche de détecter leur présence.The antibacterial peptides mentioned above could be induced in lepidoptera, diptera, hymenoptera and beetles. Works carried out so far, however, on other species have not made it possible to detect their presence.
On remarquera qu'à ce jour la structure chimique attribuée à ces peptides correspondait à un simple enchaînement d'acides aminés.Note that to date the chemical structure attributed to these peptides corresponded to a simple chain of amino acids.
Sur la base de cet enseignement, l'homme de l'art, cherchant à élaborer par voie de synthèse des peptides présentant de telles propriétés, n'était donc amené qu'à construire une séquence peptidique par enchaînement d'acides aminés déterminés selon les techniques classiques.On the basis of this teaching, a person skilled in the art, seeking to synthesize peptides exhibiting such properties, was therefore only led to construct a peptide sequence by linking amino acids determined according to the classic techniques.
Or, dans le cadre de leurs travaux sur l'étude des bases moléculaires de la réponse immunitaire des insectes, les inventeurs ont constaté que l'activité antibactérienne de certains peptides inductibles chez des espèces particulières d'insectes était liée à la présence de groupes de substitution déterminés sur des acides aminés.However, in the context of their work on the study of the molecular bases of the immune response of insects, the inventors have found that the antibacterial activity of certain inducible peptides in particular species of insects was linked to the presence of groups of substitution determined on amino acids.
L'élimination de ces groupes conduit à une très forte réduction de l'activité antibactérienne, voire à sa disparition complète. L'invention a donc pour but de fournir de nouveaux peptides substitués ayant un haut niveau d'activité vis-à- vis d'un grand nombre de bactéries.The elimination of these groups leads to a very strong reduction in antibacterial activity, or even to its complete disappearance. The invention therefore aims to provide new substituted peptides having a high level of activity vis-à-vis a large number of bacteria.
Elle a de plus pour but de fournir des procédés d'obtention de tels peptides permettant de les obtenir en grande quantité.It further aims to provide methods for obtaining such peptides making it possible to obtain them in large quantities.
L'invention vise en outre la mise à profit des propriétés biologiques conférées par les groupes de substitutions pour l'élaboration d'agents antibactériens utilisables en thérapeutique humaine et vétérinaire et, d'une manière générale, pour la lutte contre les bactéries. Les peptides selon 1'invention sont caractérisés en ce qu'ils possèdent des propriétés antibactériennes conférées par une séquence en acides aminés renfermant au moins un acide aminé - O - substitué par un groupe glycosyle contenant un ou plusieurs motifs ose et/ou osamine, un poly-ose et/ou-osamine. L'acide aminé substitué est un acide aminé hydroxylé, tel que la thréonine, la serine ou la tyrosine. La thréonine est particulièrement préférée.The invention further aims to take advantage of the biological properties conferred by substitution groups for the development of antibacterial agents usable in human and veterinary therapy and, in general, for the fight against bacteria. The peptides according to the invention are characterized in that they have antibacterial properties conferred by an amino acid sequence containing at least one amino acid - O - substituted by a glycosyl group containing one or more ose and / or osamine units, a polyose and / or osamine. The substituted amino acid is a hydroxylated amino acid, such as threonine, serine or tyrosine. Threonine is particularly preferred.
Le groupe de substitution du ou des acides aminés sera désigné dans la description qui suit et les revendications par le terme "glycosyle", les peptides de l'invention étant également appelés glycopeptides.The substitution group of the amino acid (s) will be designated in the following description and the claims by the term "glycosyl", the peptides of the invention also being called glycopeptides.
Le groupe glycosyle est linéaire ou cyclique, substitué ou non, sous forme α ou β. Il comporte avantageusement des motifs ose et/ou osamine de 5 ou 6 atomes de carbone.The glycosyl group is linear or cyclic, substituted or not, in α or β form. It advantageously comprises ose and / or osamine units of 5 or 6 carbon atoms.
Comme groupes ose appropriés, on citera les pentoses, tels que le ribose, le lyxose, le xylose, l'arabinose, et les hexoses, tels que le galactose et le glucose, le fucose, le tallose, l'altrose, le gulose, le mannose et l'allose.Suitable dare groups include pentoses, such as ribose, lyxose, xylose, arabinose, and hexoses, such as galactose and glucose, fucose, tallose, altrose, gulose, mannose and allose.
Des groupes osamine sont avantageusement constitués par un radical galactosamine, glucosamine, tallosamine, altrosamine, gulosamine, mannosamine, ou allosamine. Les poly-oses et/ou -osamines comprennent un enchaînement des motifs oses et/ou osamines, notamment de 2 à 10 motifs, en particulier de 2 à 7 motifs.Osamine groups are advantageously constituted by a galactosamine, glucosamine, tallosamine, altrosamine, gulosamine, mannosamine, or allosamine radical. The poly-oses and / or -osamines comprise a series of ose and / or osamine units, in particular from 2 to 10 units, in particular from 2 to 7 units.
Selon une variante de l'invention, le groupe glycosyle est substitué. Les substituants des motifs ose et/ou osamine sont alors avantageusement choisis parmi des radicaux alkyle de 1 à 4 atomes de carbone ou, en particulier dans le cas des osamines, parmi les radicaux acyle, plus spécialement acétyle, ces radicaux substituant plus spécialement la fonction aminé.According to a variant of the invention, the glycosyl group is substituted. The substituents of the ose and / or osamine units are then advantageously chosen from alkyl radicals of 1 to 4 carbon atoms or, in particular in the case of osamines, from acyl radicals, more especially acetyl, these radicals more particularly substituting the function amine.
Ces substituants peuvent également correspondre à au moins un motif ose et/ou au moins un motif osamine. Le groupe glycosyle peut ainsi comprendre un motif osamine portant un ou plusieurs groupes alkyle et/ou acyle et également être substitué par un ou plusieurs motifs ose, notamment 2 ou 3.These substituents can also correspond to at least one dare unit and / or at least one osamine unit. The glycosyl group can thus comprise an osamine unit bearing one or more alkyl and / or acyl groups and also be substituted by one or more ose units, in particular 2 or 3.
Comme exemple de groupe glycosyle substitué, on citera un motif glucosamine ou galactosamine substitué par un ou plusieurs motifs glucose et/ou galactose, en particulier un motif N-acyl-glucosamine ou N-acylgalactosamine, substitué par un ou plusieurs motifs glucose et/ou galactose, notamment 2 ou 3. D'autres glycopeptides de 1'invention comportent des substitutions plus complexes, concernant les parties N et/ou C terminales, et/ou des substitutions par des radicaux de l'acide sialique.As an example of a substituted glycosyl group, mention may be made of a glucosamine or galactosamine unit substituted by one or several glucose and / or galactose units, in particular an N-acyl-glucosamine or N-acylgalactosamine unit, substituted by one or more glucose and / or galactose units, in particular 2 or 3. Other glycopeptides of the invention include substitutions more complex, concerning the terminal N and / or C parts, and / or radical substitutions of sialic acid.
Comme le montrent les travaux des inventeurs rapportés dans les exemples, les groupes glycosyle évoqués, d'une manière surprenante, apparaissent indispensables pour disposer d'un niveau appréciable d'activité anti¬ bactérienne.As the work of the inventors reported in the examples shows, the glycosyl groups mentioned, surprisingly, appear to be essential for having an appreciable level of anti-bacterial activity.
Les glycopeptides selon 1'invention sont en outre caractérisés en ce qu'ils sont du type des glycopeptides tels qu'obtenus chez les arthropodes, et en particulier chez les larves ou les adultes d'insectes, par un procédé comprenantThe glycopeptides according to the invention are further characterized in that they are of the type of glycopeptides as obtained in arthropods, and in particular in larvae or adults of insects, by a process comprising
- l'induction de leur synthèse notamment par injection aux insectes de bactéries en doses suffisantes, ou par blessure septique ou autre traumatisme,- induction of their synthesis, in particular by injection into insects of bacteria in sufficient doses, or by septic injury or other trauma,
- 1'extraction de manière à recueillir les peptides ayant subi une glycosylation post-traductionnelle et, le cas échéant, - le fractionnement de l'extrait isolé afin de séparer sélectivement les glycopeptides selon le niveau de leur activité antibactérienne.- the extraction in order to collect the peptides having undergone post-translational glycosylation and, if necessary, - the fractionation of the isolated extract in order to selectively separate the glycopeptides according to the level of their antibacterial activity.
Selon une variante, l'extraction est réalisée sur l'animal entier préalablement congelé, puis broyé. Selon une autre variante, l'extraction est réalisée sur l'hémolymphe des animaux, et ce de manière classique, afin de séparer les peptides basiques.According to a variant, the extraction is carried out on the whole animal previously frozen, then ground. According to another variant, the extraction is carried out on the hemolymph of the animals, and this in a conventional manner, in order to separate the basic peptides.
L'invention vise les extraits correspondants, les mélanges de glycopeptides et les fractions. Les glycopeptides de l'invention sont également caractérisés en ce qu'ils présentent une activité antibactérienne contre les germes à Gram négatif et à Gram positif. Un groupe de glycopeptides tels que définis ci-dessus, est encore caractérisé en ce que leur séquence peptidique responsable de leur activité antibactérienne est contenue dans un domaine comportant au moins 30 % environ de groupes proline.The invention relates to the corresponding extracts, mixtures of glycopeptides and fractions. The glycopeptides of the invention are also characterized in that they exhibit antibacterial activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria. A group of glycopeptides as defined above, is further characterized in that their peptide sequence responsible for their antibacterial activity is contained in a domain comprising at least approximately 30% of proline groups.
Cet enchaînement comporte plus spécialement un motif consensus de 0-glycosylation proline-thréonine/sérine Xaal-Xaa2-proline dans lequel les motifs Xaal et Xaa2, identiques ou différents, sont des acides aminés variables. L'enchaînement d'acides aminés de la séquence biologiquement active, c'est-à-dire présentant une activité antibactérienne, comporte, avantageusement, au moins un acide aminé hydrophobe tel que la thréonine, substitué par un groupe glycosyle. Le groupe de substitution glycosyle est plus particulièrement constitué par un motif N-acylhexosamine, plus spécialement N-acétylgalactosamine ou N- acétylglucosamine, le cas échéant lui-même substitué par un ou plusieurs oses, notamment des pentoses et/ou des hexoses, comme le fucose et/ou le galactose et/ou le glucose.This sequence more specifically comprises a consensus motif of proline-threonine / serine Xaal-Xaa2-proline 0-glycosylation in which the identical or different Xaal and Xaa2 motifs are variable amino acids. The chain of amino acids of the biologically active sequence, that is to say having an antibacterial activity, advantageously comprises at least one hydrophobic amino acid such as threonine, substituted by a glycosyl group. The glycosyl substitution group is more particularly constituted by an N-acylhexosamine unit, more especially N-acetylgalactosamine or N-acetylglucosamine, optionally itself substituted by one or more oses, in particular pentoses and / or hexoses, such as fucose and / or galactose and / or glucose.
Des glycopeptides préférés sont tels qu'inductibles chez les brachycères.Preferred glycopeptides are as inducible in brachycera.
Un groupe de ces glycopeptides avantageux au regard de ses propriétés antibactériennes est tel qu'inductible chez la drosophile.A group of these glycopeptides which is advantageous with regard to its antibacterial properties is such that it is inducible in Drosophila.
L'enchaînement des acides aminés des glycopeptides de ce groupe est notamment compris ou constitué par la séquence (I) suivante telle que déterminée selon la dégradation d'Edman : cette séquence, et les séquences suivantes figurent dans la partie "Liste des séquences" donnée en fin de description avec les identifications SEQ ID n° 1 et suivantes. Met Lys Phe Thr Ile Val Phe Leu Leu Leu 5 10The chain of amino acids of the glycopeptides of this group is in particular understood or constituted by the following sequence (I) as determined according to the degradation of Edman: this sequence, and the following sequences appear in the "List of sequences" section given at the end of the description with the identifications SEQ ID n ° 1 and following. Met Lys Phe Thr Ile Val Phe Leu Leu Leu 5 10
Ala Cys Val Phe Ala Met Ala Val Ala Thr Pro Gly Lys Pro Arg ProAla Cys Val Phe Ala Met Ala Val Ala Thr Pro Gly Lys Pro Arg Pro
25 Pro Thr Ser His Pro Arg25 Pro Thr Ser His Pro Arg
35 Arg Arg Glu Ala Leu Ala35 Arg Arg Glu Ala Leu Ala
45 Leu Ala Gin Ala Ala Ile45 Leu Ala Gin Ala Ala Ile
55
Figure imgf000008_0001
55
Figure imgf000008_0001
Ile Leu Pro Ala 64Ile Leu Pro Ala 64
Plus particulièrement, ledit enchaînement est compris ou constitué par la séquence (II) suivante (SEQ ID N° 2) en acides aminés.More particularly, said sequence is understood or constituted by the following sequence (II) (SEQ ID No. 2) in amino acids.
Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro 5 10Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro 5 10
Thr Ser His Pro Arg Pro Ile Arg ValThr Ser His Pro Arg Pro Ile Arg Val
15 1915 19
Cette séquence correspond à l'enchaînement allant des positions 22 à 40 dans la séquence (I). Dans ces glycopeptides préférés correspondant à ces séquences, les motifs thréonine ou serine sont substitués, par un groupe glycosyle. On citera en particulier les glycopeptides dans lesquels le motif thréonine est substitué par un groupe N-acylhexosamine, tel que N- acétylglucosamine ou N-acétylgalactosamine, ce groupe comportant lui-même un ou plusieurs oses comme le fucose, le glucose ou le galactose.This sequence corresponds to the sequence going from positions 22 to 40 in the sequence (I). In these preferred glycopeptides corresponding to these sequences, the threonine or serine units are substituted by a glycosyl group. Mention will in particular be made of the glycopeptides in which the threonine motif is substituted by an N-acylhexosamine group, such as N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine, this group itself comprising one or more oses such as fucose, glucose or galactose.
D'autres glycopeptides préférés de l'invention, sont du type de ceux inductibles chez les diptères et, parmi ceux-ci, notamment chez Phormia terranovae.Other preferred glycopeptides of the invention are of the type of those inducible in Diptera and, among these, in particular in Phormia terranovae.
De tels glycopeptides comprennent avantageusement ou sont constitués par un enchaînement d'acides aminés, tel que déterminé selon la dégradation d'Edman, répondant à la séquence (III) suivante (SEQ ID N° 3) : Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro ThrSuch glycopeptides advantageously comprise or consist of a chain of amino acids, as determined according to the degradation of Edman, corresponding to the following sequence (III) (SEQ ID No. 3): Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro thr
5 105 10
Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu ValPro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val
15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys Asp Gly15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Gn Asn Arg Lys Asp Gly
25 3025 30
Phe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin LysPhe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin Lys
35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Gly His Ser35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Gly His Ser
45 5045 50
Ile Gly Val Ser Pro Gly Tyr Ser Gin HisIle Gly Val Ser Pro Gly Tyr Ser Gin His
55 6055 60
Leu Pro Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70Leu Pro Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70
Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser TyrAsp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr
75 80 Asn Glu 82 en particulier à la séquence (IV) suivante (SEQ ID N° 4) :75 80 Asn Glu 82 in particular to the following sequence (IV) (SEQ ID No. 4):
Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro ThrAsp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr
5 105 10
Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20
Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys Asp GlyGly Gly Gly Gly Gly Gn Asn Arg Lys Asp Gly
25 3025 30
Phe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin LysPhe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin Lys
35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg His Ser35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg His Ser
45 5045 50
Ile Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser Gin HisIle Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser Gin His
55 6055 60
Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70
Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser TyrAsp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr
75 80 Asn Phe 82 D'autres enchaînements comportent comme partie N- terminale, au moins une partie de la séquence (V) suivante (SEQ ID N1 5) : Asp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro Ser75 80 Asn Phe 82 Other sequences include as N-terminal part, at least part of the following sequence (V) (SEQ ID N 1 5): Asp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro Ser
5 105 10
Xaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu ValXaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val
15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa Gly15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa Gly
25 3025 30
Xaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala Ala Gin LysXaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala Ala Gin Lys
35 40 Val 41 en particulier de la séquence (VI) suivante (SEQ ID N° 6) :35 40 Val 41 in particular of the following sequence (VI) (SEQ ID N ° 6):
Asp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro SerAsp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro Ser
5 105 10
Xaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20Xaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20
Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa GlyGly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa Gly
25 3025 30
Xaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala His Gin LysXaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala His Gin Lys
35 40 Val 41 ou de la séquence (VII) suivante (SEQ ID N" 7) :35 40 Val 41 or of the following sequence (VII) (SEQ ID N "7):
Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Xaa Pro XaaAsp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Xaa Pro Xaa
5 10 Xaa Ala Pro Xaa Asn Leu Xaa Gin Leu Val5 10 Xaa Ala Pro Xaa Asn Leu Xaa Gin Leu Val
15 2015 20
Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Lys XaaGly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Lys Xaa
25 3025 30
Xaa Gly Val Xaa Val Xaa Xaa Ala Gin 35 39Xaa Gly Val Xaa Val Xaa Xaa Ala Gin 35 39
D'autres séquences en acides aminés de peptides dotés de propriétés antibactériennes tels qu'inductibles chez Phormia terranovaef répondent à la séquence VIII suivante (SEQ ID N° 8) : Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro ThrOther amino acid sequences of peptides endowed with antibacterial properties such as inducible in Phormia terranovae f correspond to the following sequence VIII (SEQ ID N ° 8): Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr
5 105 10
Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu ValPro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val
15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys
25 r Phe Gly Val Ser Val -Asp Ala His25 r Phe Gly Val Ser Val -Asp Ala His
35 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg35 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg
45 Ile Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser45 Ile Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser
55 Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser 65
Figure imgf000011_0001
55 Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser 65
Figure imgf000011_0001
Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser TyrAsp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr
75 8075 80
Asn Phe 82 Dans les séquences (III) à (VIII), la thréonine ou la serine en position 10 et/ou celle en position 54 est (sont) substituée(s) par un groupe glycosyle comme défini ci- dessus.Asn Phe 82 In sequences (III) to (VIII), threonine or serine in position 10 and / or that in position 54 is (are) substituted with a glycosyl group as defined above.
Le groupe glycosyle est avantageusement un motif osamine lui-même substitué par un ou plusieurs motifs ose. Un groupe glycosyle approprié pour disposer de glycopeptides antibactériens correspond à un groupe (N- acylhexosamine)-hexose, en particulier N-acétyl- galactosamine ou N-acétyl glucosamine, ce groupe étant lui- même substitué par un ou plusieurs motifs ose, en particulier fucose et/ou galactose et/ou glucose.The glycosyl group is advantageously an osamine unit itself substituted by one or more ose units. A glycosyl group suitable for having antibacterial glycopeptides corresponds to a (N-acylhexosamine) -hexose group, in particular N-acetylgalactosamine or N-acetyl glucosamine, this group itself being substituted by one or more ose units, in particular fucose and / or galactose and / or glucose.
D'autres glycopeptides préférés sont tels qu'inductibles chez les hyménoptères, notamment chez les abeilles. D'autres glycopeptides encore sont du type de ceux inductibles chez les hémiptères, par exemple chez Pyrrhoπoris apterus.Other preferred glycopeptides are such that they are inducible in hymenoptera, in particular in bees. Still other glycopeptides are of the type of those inducible in hemiptera, for example in Pyrrhoπoris apterus.
Des glycopeptides particulièrement préférés de ce type comprennent ou sont constitués par un enchaînement d'acides aminés, tel que déterminé selon la dégradation d'Edman, présentant la séquence (IX) suivante (SEQ ID Nβ 9) : Val Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg ProParticularly preferred glycopeptides of this type include or consist of a sequence of amino acids, as determined according to the degradation of Edman, having the following sequence (IX) (SEQ ID N β 9): Val Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro
5 10 Thr Pro Pro Arg Pro Ile Tyr Asn Arg Asn5 10 Thr Pro Pro Arg Pro Ile Tyr Asn Arg Asn
15 2015 20
Dans cette séquence, le motif thréonine en position 11 est substitué par un groupe glycosyle tel que défini ci- dessus.In this sequence, the threonine motif at position 11 is substituted by a glycosyl group as defined above.
L'invention vise également les fragments ou variantes des glycopeptides définis ci-dessus, dès lors que ces fragments ou ces variantes sont reconnus par des anticorps dirigés contre lesdits peptides et/ou possèdent des caractéristiques de charge et/ou d'hydrophobicité ou d'hydrophilie leur conférant une activité antibactérienne contre des germes à Gram négatif, telle qu'observée chez les glycopeptides natifs. Par variantes, on entend des glycopeptides dans lesquels un ou plusieurs acides aminés sont délétés, substitués par un groupe autre qu'un glycosyle, ou remplacés par un autre acide aminé de charge voisine.The invention also relates to the fragments or variants of the glycopeptides defined above, as soon as these fragments or these variants are recognized by antibodies directed against said peptides and / or have charge and / or hydrophobicity or hydrophilicity giving them antibacterial activity against Gram-negative germs, as observed in native glycopeptides. By variants is meant glycopeptides in which one or more amino acids are deleted, substituted by a group other than a glycosyl, or replaced by another amino acid with a similar charge.
Les caractéristiques d1hydrophilie et d'hydrophobicité des acides aminés sont données par Kyte et al dans J. Mol. Biol., 157, 105-132, 1982.The characteristics of one hydrophilicity and hydrophobicity of the amino acids are given by Kyte et al in J. Mol. Biol., 157, 105-132, 1982.
Les anticorps formés contre les glycopeptides et leurs fragments et variantes entrent également dans le champ de l'invention.Antibodies formed against glycopeptides and their fragments and variants also fall within the scope of the invention.
Selon un autre aspect, l'invention vise les séquences de nucléotides comportant l'information génétique correspondant aux acides aminés des glycopeptides définis ci-dessus.According to another aspect, the invention relates to the nucleotide sequences comprising the genetic information corresponding to the amino acids of the glycopeptides defined above.
Elle vise également les séquences de nucléotides capables de s'hybrider dans des conditions stringentes avec les séquences ci-dessus.It also targets the nucleotide sequences capable of hybridizing under stringent conditions with the above sequences.
Par conditions stringentes, on entend les conditions définies dans l'ouvrage "Molecular Cloning" de Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. L'invention vise en outre les séquences de nucléotides complémentaires de celles définies plus haut, ainsi que les ARN correspondants. Les vecteurs d'expression et/ou de clonage comportant au moins un fragment des séquences de nucléotides définies ci-dessus font également partie de l'invention, ainsi que les hôtes transformés par ces vecteurs. A titre d'exemples, des hôtes appropriés pour la mise en oeuvre de l'invention comprennent des bactéries, telles que E.coli. des levures ou encore des cellules d'arthropodes, de vertébrés ou de plantes.By stringent conditions is meant the conditions defined in the work "Molecular Cloning" by Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. The invention further relates to the nucleotide sequences complementary to those defined above, as well as the corresponding RNAs. The expression and / or cloning vectors comprising at least one fragment of the nucleotide sequences defined above also form part of the invention, as well as the hosts transformed by these vectors. As examples, suitable hosts for the implementation of the invention include bacteria, such as E. coli. yeasts or cells of arthropods, vertebrates or plants.
L'invention concerne également les produits d'expression des vecteurs ci-dessus.The invention also relates to the expression products of the above vectors.
La structure chimique des glycopeptides à activité antibactérienne ayant été caractérisée comme indiqué ci- dessus, l'homme de l'art choisira aisément les techniques les plus appropriées pour leur élaboration. En opérant par voie de synthèse, on a aisément accès aux structures des glycopeptides tels qu'inductibles chez les arthroprodes et à leurs variantes.The chemical structure of glycopeptides with antibacterial activity having been characterized as indicated above, those skilled in the art will easily choose the most suitable techniques for their development. By operating synthetically, there is easy access to the structures of glycopeptides as inducible in arthroprodes and their variants.
On procède avantageusement à la substitution d'un ou de plusieurs des acides aminés de la séquence, avec un groupe glycosyle, puis à l'introduction de groupes de blocage des fonctions à protéger et on forme une chaîne peptidique déterminée, avantageusement à l'aide d'un synthétiseur, le ou les acides aminés substitués étant introduits séquentiellement afin d'occuper la position souhaitée dans la séquence. Les groupes de blocage sont éliminés en fin de synthèse.Advantageously, one or more of the amino acids of the sequence is substituted with a glycosyl group, then the introduction of blocking groups of the functions to be protected and a determined peptide chain is formed, advantageously using of a synthesizer, the substituted amino acid (s) being introduced sequentially in order to occupy the desired position in the sequence. The blocking groups are eliminated at the end of the synthesis.
En variante, on prépare le peptide avec une protection particulière pour l'acide aminé à substituer par le groupe glycosyle. On procède ensuite à l'élimination du groupe protecteur de cet acide aminé uniquement, puis on introduit le groupe glycosyle protégé. Les groupes protecteurs des autres acides aminés et ceux du glycosyle sont alors éliminés. Selon une variante, ces glycopeptides peuvent être obtenus selon les techniques du génie génétique en introduisant dans un vecteur approprié les séquences de nucléotides capables d'exprimer le squelette peptidique du glycopeptide recherché, et en réalisant l'expression dans un hôte capable d'assurer une glycosylation post- traductionnelle. En variante, lorsque l'hôte utilisé ne peut assurer cette fonctionnalisation, on a recours aux voies de synthèse chimiques.Alternatively, the peptide is prepared with special protection for the amino acid to be substituted by the glycosyl group. The protective group of this amino acid is then removed only, and the protected glycosyl group is introduced. The protective groups of the other amino acids and those of glycosyl are then eliminated. According to a variant, these glycopeptides can be obtained according to genetic engineering techniques by introducing into an appropriate vector the nucleotide sequences capable of expressing the peptide backbone of glycopeptide sought, and by carrying out expression in a host capable of ensuring post-translational glycosylation. Alternatively, when the host used cannot provide this functionalization, chemical synthesis routes are used.
Selon encore une autre variante, ces glycopeptides sont obtenus en immunisant des arthropodes renfermant des gènes capables de coder pour le ou les glycopeptide(s) recherché(s), notamment par injection de bactéries, en quantité suffisante pour provoquer leur synthèse, ou par traumatisme, tel qu'une blessure septique. Quelques heures après l'immunisation, ou le traumatisme, les glycopeptides sont extraits puis fractionnés et la ou les fractions correspondant au(x) glycopep ide(s) recherché(s) isolée(s). L'extraction est réalisée dans des conditions permettant d'éviter tout phénomène de dégradation des glycopeptides, tel qu'oxydation ou action de protéases.According to yet another variant, these glycopeptides are obtained by immunizing arthropods containing genes capable of coding for the desired glycopeptide (s), in particular by injection of bacteria, in an amount sufficient to cause their synthesis, or by trauma , such as a septic injury. A few hours after the immunization or the trauma, the glycopeptides are extracted and then fractionated and the fraction (s) corresponding to the glycopep ide (s) sought (s) isolated. The extraction is carried out under conditions making it possible to avoid any phenomenon of degradation of the glycopeptides, such as oxidation or action of proteases.
Pour la purification des produits, on utilise avec avantage des supports très peu rétensifs et possédant un pouvoir séparateur élevé. Des supports appropriés sont choisis parmi les supports utilisés en phase inverse.For the purification of the products, it is advantageous to use supports which are not very retentive and which have a high separating power. Appropriate supports are chosen from the supports used in reverse phase.
La mise en oeuvre de ces dispositions permet d'isoler des glycopeptides, sous forme pure, à partir d'animaux aussi petits que des adultes de drosophile. On notera de plus que cette technique d'extraction, telle que décrite dans les exemples, permet d'isoler des glycopeptides dont la fragilité est bien connue.The implementation of these provisions makes it possible to isolate glycopeptides, in pure form, from animals as small as adults of Drosophila. It will also be noted that this extraction technique, as described in the examples, makes it possible to isolate glycopeptides whose fragility is well known.
Les propriétés antibactériennes conférées aux peptides de l'invention par le groupe glycosyle ont été mises en évidence dans des tests d*inhibition de croissance de bactéries à Gram négatif et de bactéries à Gram positif. A titre illustratif, des résultats sont donnés dans les exemples. Des cultures bactériennes pathogènes, comme les entérobactéries, effectuées à partir de prélèvements sur des patients ont été mises ensuite en boîte gélosée. Le dépôt de glycopeptides selon 1'invention sur ces bactéries a montré leur grande efficacité bactéricide. Ces propriétés sont mises à profit pour l'élaboration d'agents antibactériens utilisables en thérapeutique humaine ou animale, ou pour traiter un environnement donné.The antibacterial properties conferred on the peptides of the invention by the glycosyl group have been demonstrated in growth inhibition tests of Gram negative bacteria and Gram positive bacteria. By way of illustration, results are given in the examples. Pathogenic bacterial cultures, such as enterobacteria, taken from samples from patients were then placed in a gel-coated dish. The deposition of glycopeptides according to the invention on these bacteria has shown their great bactericidal efficiency. These properties are used for the development of agents antibacterials usable in human or animal therapy, or to treat a given environment.
L'invention vise donc l'utilisation, pour élaborer des agents et compositions antibactériens, de peptides renfermant au moins un-cacide aminé - 0 - substitué par un groupe contenant un ou plusieurs motifs oses et/ou osamine, un poly-ose et/ou -osamine, possédant une activité antibactérienne conférée par le ou les groupes de substitution glycosyle. Ces compositions sont caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace des glycopeptides définis ci-dessus, en association avec un véhicule inerte approprié pour l'application envisagée.The invention therefore relates to the use, for developing antibacterial agents and compositions, of peptides containing at least one amino acid - 0 - substituted by a group containing one or more ose and / or osamine units, a polyose and / or -osamine, having an antibacterial activity conferred by the glycosyl substitution group (s). These compositions are characterized in that they contain an effective amount of the glycopeptides defined above, in combination with an inert vehicle suitable for the intended application.
Il est avantageux d'incorporer des excipients tels qu'inhibiteurs de protéases, antioxydants et inhibiteurs de multiplication des bactéries.It is advantageous to incorporate excipients such as protease inhibitors, antioxidants and bacteria multiplication inhibitors.
Les compositions ou agents destinés à la thérapeutique humaine ou vétérinaire se présenteront avantageusement sous forme de solutions injectables, ou sous une forme pour usage externe, telle que pommades, crèmes, poudres, ou solutions.The compositions or agents intended for human or veterinary therapy will advantageously be in the form of injectable solutions, or in a form for external use, such as ointments, creams, powders, or solutions.
Ils sont particulièrement indiqués dans le cas de septicémies, ou encore pour le traitement des yeux, des oreilles, des soins buccaux et dentaires et en gynécologie. On a recours avantageusement aux posologies habituelles dans ces domaines.They are particularly indicated in the case of septicemia, or also for the treatment of the eyes, ears, oral and dental care and in gynecology. It is advantageous to use the usual dosages in these areas.
Les compositions de 1'invention présentent également un grand intérêt en agrochimie comme agents phytosanitaires. Elles sont avantageusement utilisées sous forme de poudres ou de solutions d'épandage.The compositions of the invention are also of great interest in agrochemicals as phytosanitary agents. They are advantageously used in the form of powders or spreading solutions.
L'utilisation des compositions et agents antibactériens de . 1'invention dans 1'industrie agro¬ alimentaire permet d'empêcher la contamination par des germes à Gram négatif, pendant la fabrication de produits et leur conservation.The use of antibacterial compositions and agents. The invention in the food industry makes it possible to prevent contamination by Gram-negative germs, during the manufacture of products and their conservation.
L'invention vise également les génomes de plantes tels que modifiés par la présence de gènes codant pour les glycopeptides antibactériens définis ci-dessus. Ces cellules végétales et plantes sont choisies parmi celles capables d'assurer la glycosylation des séquences peptidiques de manière à leur conférer une activité antibactérienne. On dispose ainsi de plantes résistant à des agents pathogènes.The invention also relates to the genomes of plants as modified by the presence of genes coding for the antibacterial glycopeptides defined above. These plant cells and plants are chosen from those capable of ensuring the glycosylation of the peptide sequences so as to confer on them antibacterial activity. Plants resistant to pathogens are thus available.
A titre illustratif, on rapporte dans les exemples qui suivent d'autres caractéristiques et avantages de l'invention.By way of illustration, other examples and advantages of the invention are reported in the examples which follow.
Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 et 2 qui représentent respectivement la figure 1, la variation de 1'absorbance en fonction du temps d'un peptide élue selon l'invention, etIn these examples, reference is made to FIGS. 1 and 2 which respectively represent FIG. 1, the variation of the absorbance as a function of time of a peptide eluted according to the invention, and
- la figure 2, des séquences de nucléotides capables de coder pour un peptide de 1'invention. Exemple 1 : Obtention de glycopeptides antibactériens par extraction à partir de la drosophile.- Figure 2, nucleotide sequences capable of coding for a peptide of the invention. Example 1: Obtaining antibacterial glycopeptides by extraction from Drosophila.
- Méthode d'induction de la synthèse biologique.- Method of induction of biological synthesis.
Les drosophiles sont anesthésiées au gaz carbonique et immunisées par piqûre au niveau thoracique à proximité de l'insertion alaire à l'aide d'une aiguille plongée avant chaque inoculation dans une suspension bactérienne de icroccocus luteus (Gram positif) et d'Escherichia c-QliDrosophila are anesthetized with carbon dioxide and immunized by puncture in the thoracic region near the wing insertion using a needle immersed before each inoculation in a bacterial suspension of icroccocus luteus (Gram positive) and Escherichia c- Qli
1106 (Gram négatif). Les insectes sont conservés à 25°C durant 24 heures et tués par congélation dans 1'azote liquide.1106 (Gram negative). The insects are stored at 25 ° C for 24 hours and killed by freezing in liquid nitrogen.
Extraction, fractionnement et purification des glycopeptides synthétisés : * extraction Les pattes, les ailes et les têtes d'adultes de drosophiles sont éliminées par tamisage, les thorax et les abdomens sont broyés en présence d'azote liquide durant 30 minutes dans un mortier maintenu au froid. A la poudre ainsi obtenue sont ajoutés 10 volumes d'eau acidifiée [0,1 % d'acide trifluoroacétique (TFA 0,1 %)] contenant de 1'aprotinine (total de 2 mg). Après 30 minutes d'extraction sous agitation, l'extrait est centrifugé à 10.000 rpm pendant 30 minutes à 4°C. Le surnageant ainsi obtenu est immédiatement soumis aux différentes étapes de la purification.Extraction, fractionation and purification of the synthesized glycopeptides: * extraction The legs, wings and heads of adults of Drosophila are removed by sieving, the thorax and the abdomens are ground in the presence of liquid nitrogen for 30 minutes in a mortar kept at cold. To the powder thus obtained are added 10 volumes of acidified water [0.1% trifluoroacetic acid (TFA 0.1%)] containing aprotinin (total of 2 mg). After 30 minutes of extraction with stirring, the extract is centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. The supernatant thus obtained is immediately subjected to the various stages of purification.
*Fractionnement de l'extrait sur cartouches Sep-Pak* Fractionation of the extract on Sep-Pak cartridges
C18 Après dépôt de 1'extrait sur un support de phase inverse, tel que commercialisé sous forme de cartouches sous la marque Sep-Pak Ci8B, par Waters Millipore, les molécules à caractère hydrophile sont éliminées par un simple lavage par 5 ml d'eau acidifiée (TFA 0,05 %). L'élution des molécules hydrophobes est réalisée avec des solutions de 10,40 et 80 % d'acetonitrile en eau acidifiée (TFA 0,05 %).C18 After depositing the extract on a reverse phase support, as marketed in the form of cartridges under the brand Sep-Pak Ci8 B , by Waters Millipore, the molecules of hydrophilic nature are eliminated by a simple washing with 5 ml of acidified water (TFA 0.05%). The hydrophobic molecules are eluted with solutions of 10.40 and 80% acetonitrile in acidified water (TFA 0.05%).
Les fractions recueillies sont dénommées "Elution 10 %", "Elution 40 %" et "Elution 80 %" et concentrées sous vide. Les fractions sont ensuite reconstituées avec de l'eau Milli Q avant l'analyse en HPLC.The fractions collected are called "Elution 10%", "Elution 40%" and "Elution 80%" and concentrated in vacuo. The fractions are then reconstituted with Milli Q water before analysis by HPLC.
*Purifica ion par HPLC des molécules à activité antibactérienne. a- Première étape de purification La fraction "Elution 10 %" est analysée sur une colonne de phase inverse Aquapore OD 300 Ci8 R avec un gradient linéaire d'acetonitrile de 0 à 40 % dans 1'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (soit une augmentation de 0,44 % d'acetonitrile par minute) pour un débit de 1 ml/min.* Purifica ion by HPLC of molecules with antibacterial activity. a- First purification step The fraction "Elution 10%" is analyzed on an Aquapore OD 300 Ci8 R reverse phase column with a linear gradient of acetonitrile from 0 to 40% in acidified water (TFA 0.05%) in 90 minutes (an increase of 0.44% acetonitrile per minute) for a flow rate of 1 ml / min.
La fraction "Elution 40 %" est analysée sur la même colonne que la fraction "Elution 10 %". L'élution est réalisée dans un gradient linéaire d'acetonitrile de 2 à 52 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (progression de 0,55 % d'acetonitrile par minute) à un débit de 1 ml/min.The "Elution 40%" fraction is analyzed in the same column as the "Elution 10%" fraction. Elution is carried out in a linear gradient of acetonitrile from 2 to 52% in acidified water (TFA 0.05%) in 90 minutes (progression of 0.55% acetonitrile per minute) at a flow rate of 1 ml / min.
La fraction "Elution 80 %" est analysée sur une colonne de phase inverse Aquapore RP 300 Ce. L'élution est réalisée dans un gradient linéaire d'acetonitrile de 10 à 60 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (soit une progression de 0,55 % d'acetonitrile par minute) pour un débit de 1 ml/min. La collecte des fractions est réalisée suivant la variation de l'absorption à 225 nm, en tenant compte des épaulements. Chaque fraction ainsi récoltée est attribuable à un pic de densité optique. Toutes les fractions sont évaporées à sec sous vide et reconstituées dans de l'eau Milli Q. L'activité antibactérienne de chaque fraction est détectée par la technique du test d'inhibition de croissance en milieu liquide sur des fractions aliquotes de 10 μl : une telle fraction équivaut à un extrait de 300 adultes de drosophiles. b- Purification finaleThe "80% Elution" fraction is analyzed on an Aquapore RP 300 Ce reverse phase column. Elution is carried out in a linear gradient of acetonitrile from 10 to 60% in acidified water (TFA 0.05%) in 90 minutes (i.e. a progression of 0.55% acetonitrile per minute) for a flow rate 1 ml / min. The fractions are collected according to the variation in absorption at 225 nm, taking account of the shoulders. Each fraction thus collected is attributable to a peak in optical density. All the fractions are evaporated to dryness under vacuum and reconstituted in Milli Q water. The antibacterial activity of each fraction is detected by the technique of the growth inhibition test in liquid medium on 10 μl aliquots: a such fraction is equivalent to an extract of 300 adults of Drosophila. b- Final purification
Deux étapes supplémentaires sont nécessaires à la purification finale des molécules à activité antibactérienne. Les fractions "Elution 10 %" présentant 1'activité biologique sont analysées sur une colonne de phase inverse Aquapore OD 300 Ci8 R- L'élution est réalisée dans un gradient linéaire d'acetonitrile de 0 à 20 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes (soit une progression de 0,22 % d'acetonitrile par minute) pour un débit de 0,8 ml/min.Two additional steps are necessary for the final purification of the molecules with antibacterial activity. The "Elution 10%" fractions exhibiting biological activity are analyzed on an Aquapore OD 300 Ci8 R reverse phase column - Elution is carried out in a linear gradient of acetonitrile from 0 to 20% in acidified water (TFA) 0.05%) in 90 minutes (an increase of 0.22% acetonitrile per minute) for a flow rate of 0.8 ml / min.
Les fractions qui présentent une activité antibactérienne, mesurée selon la méthode indiquée ci- après, sont purifiées sur la colonne précédemment décrite dans un gradient linéaire d'acetonitrile de 0 à 20 % dans l'eau acidifiée (TFA 0,05 %) en 90 minutes pour un débit de 2 ml/min.The fractions which exhibit antibacterial activity, measured according to the method indicated below, are purified on the column previously described in a linear gradient of acetonitrile from 0 to 20% in acidified water (TFA 0.05%) at 90 minutes for a flow rate of 2 ml / min.
On rapporte sur la figure 1, la variation de la densité optique DO à 225 nm en fonction du temps lors de l'étape de purification finale du glycopeptide. La ligne en pointillés correspond à 1'acetonitrile (en %) ajouté pour la purification. La flèche en trait plein { i ) désigne le glycopeptide purifié et celle en pointillés (^) désigne le peptide de synthèse dont il sera question ci-après. La colonne (|) représente l'activité antibactérienne.The variation in the optical density DO at 225 nm as a function of time is reported in FIG. 1 during the final purification step of the glycopeptide. The dotted line corresponds to the acetonitrile (in%) added for the purification. The arrow in solid line (i) indicates the purified glycopeptide and that in dotted line (^) indicates the synthetic peptide which will be discussed below. Column (|) represents the antibacterial activity.
La masse molaire mesurée est de 2564,4 daltons. L'analyse de la microséquence est réalisée en procédant à une dégradation d'Edman automatisée du peptide et à la détection des dérivés de phénylthiohydantoïne sur un séquenceur automatique à liquide puisé (Applied Biosystems) modèle 473 A ou 477 A.The molar mass measured is 2564.4 daltons. The microsequence analysis is carried out by carrying out an automated Edman degradation of the peptide and to the detection of phenylthiohydantoin derivatives on an automatic pulsed liquid sequencer (Applied Biosystems) model 473 A or 477 A.
L'analyse des acides aminés est effectuée sur un analyseur 420 A (Applied Biosystems) avec analyseur HPLC et microordinateur.The amino acid analysis is carried out on a 420 A analyzer (Applied Biosystems) with HPLC analyzer and microcomputer.
Le peptide est hydrolyse à 120°C durant 24 heures avec HC1 6N en phase gazeuse (Pico-Tag, Millipore). On forme des dérivés avec le phényl isothiocyanate, puis on détecte les acides aminés à 254 nm.The peptide is hydrolyzed at 120 ° C for 24 hours with HCl 6N in the gas phase (Pico-Tag, Millipore). Derivatives are formed with phenyl isothiocyanate, then amino acids are detected at 254 nm.
Le peptide isolé et purifié correspond à la séquenceThe isolated and purified peptide corresponds to the sequence
(II) en acides aminés donnée plus haut et comporte un groupe de substitution N-acétylgalactosamine-galactose sur le motif thréonine, comme démontré par HPLC et spectrométrie de masse.(II) in amino acids given above and includes an N-acetylgalactosamine-galactose substitution group on the threonine motif, as demonstrated by HPLC and mass spectrometry.
La mesure de l'activité biologique a été réalisée par la méthode suivante :The measurement of the biological activity was carried out by the following method:
*Préparation des souches pour le test antibactérien* Preparation of strains for the antibacterial test
Pour chaque souche, une colonie isolée est prélevée et mise en suspension dans 30 ml de milieu PB (milieu LB dépourvu d'extrait de levure) et incubée à 30°C pendant une nuit sous agitation lente. Les bactéries en phase exponentielle de croissance sont ramenées par dilution dans du milieu PB frais à une concentration de 400.000 UFC(unités formant des colonies)/ml pour E.coli et 40.000 UFC/ml pour M.luteus (soit une D0600=0,001).For each strain, an isolated colony is removed and suspended in 30 ml of PB medium (LB medium devoid of yeast extract) and incubated at 30 ° C overnight with slow shaking. The bacteria in the exponential growth phase are brought back by dilution in fresh PB medium to a concentration of 400,000 CFU (colony-forming units) / ml for E. coli and 40,000 CFU / ml for M.luteus (i.e. an OD 600 = 0.001) .
*Réalisation du test antibactérien* Antibacterial test
L'échantillon à tester (10 μl) est déposé dans des puits de plaques de microtitration dans lesquels sont ajoutés 100 μl d'une culture bactérienne en phase exponentielle de croissance ramenée à D0600 = 0,002. Après 24 heures d'incubation à 25βC, la croissance bactérienne est mesurée à 600 nm. L'inhibition de croissance des bactéries, qui reflète l'activité antibactérienne, est mise en évidence par la différence de D0600 existant entre les fractions testées et une culture témoin dans laquelle les 10 μl d'échantillon sont remplacés par 10 μl d'eau stérile. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau ci-après et sont exprimés en UFC/ml x 103.The test sample (10 μl) is placed in wells of microtitration plates to which are added 100 μl of a bacterial culture in exponential growth phase reduced to OD 600 = 0.002. After 24 hours of incubation at 25 β C, the bacterial growth is measured at 600 nm. The growth inhibition of the bacteria, which reflects the antibacterial activity, is highlighted by the difference in OD 600 existing between the tested fractions and a control culture in which the 10 μl of sample is replaced by 10 μl of sterile water. . The results obtained are reported in the table below and are expressed in CFU / ml x 103.
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0001
Ces résultats mettent bien en évidence l'activité bactéricide des produits de l'invention.These results clearly demonstrate the bactericidal activity of the products of the invention.
A titre de comparaison, on a préparé par voie de synthèse en utilisant un synthétiseur de peptides tel que celui indiqué ci-dessus, un peptide présentant le squelette en acides aminés de l'enchaînement I, mais dans lequel la thréonine en position 11, contrairement au glycopeptide de l'invention, n'est pas glycosyle.For comparison, synthetically prepared using a peptide synthesizer such as that indicated above, a peptide having the backbone of amino acids of sequence I, but in which the threonine in position 11, unlike to the glycopeptide of the invention, is not glycosyl.
La séquence du peptide synthétique a été vérifiée en effectuant une dégradation d'Edman et en déterminant la masse molaire à l'aide d'un spectromètre de masse VG Biotech Bio Q.The sequence of the synthetic peptide was verified by carrying out a degradation of Edman and by determining the molar mass using a VG Biotech Bio Q mass spectrometer.
On constate une elution différente du peptide en HPLC, comme le montre la figure 1.There is a different elution of the peptide in HPLC, as shown in FIG.
La détermination de la masse molaire donne une valeur de 2199,6 daltons qui diffère de 364,8 daltons de celle du glypeptide de l'exemple 1.The determination of the molar mass gives a value of 2199.6 daltons which differs by 364.8 daltons from that of the glypeptide of Example 1.
De plus, ce peptide synthétique, dépourvu de groupement glycosyle, présente une activité biologique 10000 fois inférieure à celle du glycopeptide de 1'exemple 1. Afin de prouver que la différence entre le glycopeptide et ce peptide synthétique provient de la 0- glycosylation sur la thréonine en position 11, le glycopeptide purifié de l'exemple 1 a été soumis à l'action de HF anhydre, qui hydrolyse spécifiquement les liaisons 0- glycosyle. Ce traitement a conduit principalement à un composé de 2199,6 daltons, donc de même masse que le peptide synthétique non substitué et à un composé de 2403,0 daltons. En revanche, le même traitement appliqué au peptide synthétique n'altère pas ce dernier dont la masse molaire reste inchangée.In addition, this synthetic peptide, devoid of a glycosyl group, exhibits a biological activity 10,000 times less than that of the glycopeptide of Example 1. In order to prove that the difference between the glycopeptide and this synthetic peptide comes from 0-glycosylation on the threonine in position 11, the purified glycopeptide of Example 1 was subjected to the action of anhydrous HF, which specifically hydrolyzes the O-glycosyl bonds. This treatment led mainly to a compound of 2199.6 daltons, therefore of the same mass as the unsubstituted synthetic peptide and to a compound of 2403.0 daltons. On the other hand, the same treatment applied to the synthetic peptide does not alter the latter, the molar mass of which remains unchanged.
Le groupe glycosyle est identifié comme étant un groupe N-acétylgalactosamine-galactose.The glycosyl group is identified as an N-acetylgalactosamine-galactose group.
Exemple 2 : Séquences de nucléotides codant pour des glycopeptides antibactériens.Example 2: Sequences of nucleotides coding for antibacterial glycopeptides.
. Isolement de clones d'ADNc : à l'aide d'une sonde dégénérée 5' TAG GGN CGN GGC TTG. Isolation of cDNA clones: using a degenerate 5 'probe TAG GGN CGN GGC TTG
CC 3' et à partir de 30 000 phages contenant l'insert correspondant, on procède au criblage d'une banque d'ADNc de drosophile (l'élaboration de cette banque est rapportée ci-après).CC 3 ′ and from 30,000 phages containing the corresponding insert, a screening of a Drosophila cDNA library is carried out (the development of this library is reported below).
On obtient 30 clones d'hybridation positifs. . Séquençage30 positive hybridization clones are obtained. . Sequencing
Dix de ces clones sont séquences. On constate que les inserts contiennent tous un cadre ouvert de lecture de 65 codons commençant avec une méthionine. Les inserts 1 à 9 ne montrent pas de variation de séquence. Le plus long est représenté sur la figure 2 (SEQ ID N° 10). L'insert 10 (SEQTen of these clones are sequenced. It can be seen that the inserts all contain an open reading frame of 65 codons starting with a methionine. Inserts 1 to 9 do not show any variation in sequence. The longest is shown in Figure 2 (SEQ ID No. 10). Insert 10 (SEQ
ID N° 11) montre des variations de bases qui sont représentées sur la figure 2. Le signal consensus de polyadénylation AATAAA est indiqué en caractères gras. La première ligne de la séquence de nucléotides correspond à celles des clones 1 à 9, la deuxième ligne mentionne les bases différentes du clone 10, les autres bases étant identiques à celles données sur la première ligne ne sont pas indiquées.ID No. 11) shows variations of bases which are represented in FIG. 2. The consensus signal of polyadenylation AATAAA is indicated in bold characters. The first line of the nucleotide sequence corresponds to those of clones 1 to 9, the second line mentions the bases different from clone 10, the other bases being identical to those given on the first line are not indicated.
La séquence en acides aminés déduite correspond à un précurseur de la séquence peptidique du glycopeptide de l'exemple 1 et présente l'enchaînement I donné ci-dessus. Cet enchaînement I comporte la séquence II de 19 acides aminés et dans la partie N-terminale un signal peptidique potentiel (motifs 1 à 19) et un dipeptide Thr-Pro (en positions 20 et 21). La partie C-terminale comprend un peptide de 22 acides aminés (occupant les positions 43 à 64 dans l'enchaînement I) séparé de l'enchaînement II par un site de clivage dibasique Arg-Arg (en positions 41 et 42). . Préparation de la banque d'ADNc On prépare une banque d'ADNc de taille sélectionnée en soumettant à un challenge bactérien des larves de drosophile au troisième stade larvaire. L'ARN enrichi en poly (A) est extrait comme décrit par Reichhart et al dans EMBO J. 11, 1469-1477 (1992). Une banque A gt 22 est construite en utilisant le système Superscript lambda commercialisé par Gibco BRL. Les ADNc sont sous-clonés dans Mt3mpl9. Les deux brins sont séquences en utilisant la méthode au didéoxy de Sanger avec le kit de séquençage commercialisé sous la marque Séquanase R par USB. Exemple 3 : Obtention de glycopeptides antibactériens par expression chez Saccharomices cerevisae.The deduced amino acid sequence corresponds to a precursor of the peptide sequence of the glycopeptide of Example 1 and has the sequence I given above. This sequence I comprises the sequence II of 19 amino acids and in the N-terminal part a potential peptide signal (motifs 1 to 19) and a Thr-Pro dipeptide (in positions 20 and 21). The C-terminal part includes a peptide of 22 amino acids (occupying positions 43 to 64 in sequence I) separated from sequence II by a dibasic Arg-Arg cleavage site (in positions 41 and 42). . Preparation of the cDNA library A cDNA library of selected size is prepared by subjecting Drosophila larvae to the third larval stage to a bacterial challenge. The poly (A) enriched RNA is extracted as described by Reichhart et al in EMBO J. 11, 1469-1477 (1992). An A gt 22 bank is constructed using the lambda Superscript system marketed by Gibco BRL. The cDNAs are subcloned into Mt3mpl9. The two strands are sequenced using the Sanger dideoxy method with the sequencing kit sold under the brand Sequanase R by USB. Example 3: Obtaining antibacterial glycopeptides by expression from Saccharomices cerevisae.
En opérant selon les techniques classiques du génie génétique, on insère dans un vecteur une séquence de nucléotides d'un clone d'ADNc de l'exemple 2 et on réalise l'expression chez Saccharomices cerevisae.By operating according to conventional techniques of genetic engineering, a nucleotide sequence of a cDNA clone of Example 2 is inserted into a vector and expression is carried out in Saccharomices cerevisae.
Le glycopeptide produit est récupéré et analysé pour vérifier sa séquence.The glycopeptide produced is recovered and analyzed to verify its sequence.
Exemple 4 : Obtention par voie de synthèse de glycopeptides antibactériens du type de ceux induits chez Phormia terranovae.Example 4 Obtaining Antibacterial Glycopeptides of the Type Induced in Phormia Terranova by Synthesis
On fait réagir une thréonine avec une N- acétylgalactosamine. On procède au blocage des groupes hydroxyle de la galactosamine à 1'aide de groupes protecteurs utilisés habituellement à cet effet. On utilise par exemple du chlorure de benzoyle pour protéger les groupes hydroxyle avec un radical benzoyle.A threonine is reacted with an N-acetylgalactosamine. The hydroxyl groups of galactosamine are blocked using protecting groups usually used for this purpose. Benzoyl chloride is used, for example, to protect the hydroxyl groups with a benzoyl radical.
L'enchaînement . d'acides aminés de la séquence VI donnée plus haut est réalisé à l'aide d'un synthétiseur de peptides, tel qu'utilisé dans l'exemple 1. L'analyse par spectro étrie de masse du produit obtenu et la dégradation d'Edman permettent de vérifier que le glycopeptide recherché a bien été synthétisé. Exemple 5 : Obtention de glycopeptides antibactériens par extraction à partir de Phormia terranovae.The sequence. of amino acids of the sequence VI given above is carried out using a peptide synthesizer, as used in Example 1. Analysis by mass spectro etry of the product obtained and the degradation of Edman allow to verify that the glycopeptide sought has been synthesized. Example 5: Obtaining antibacterial glycopeptides by extraction from Phormia terranovae.
- Induction de la synthèse biologique. Des larves de troisième stade de Phormia terranovae sont blessées par piqûre à 1'aide d'une aiguille plongée préalablement dans une suspension bactérienne, par exemple d'Enterobacter-cloacae.- Induction of biological synthesis. Third-stage larvae of Phormia terranovae are injured by a bite using a needle previously immersed in a bacterial suspension, for example Enterobacter-cloacae.
Extraction, fractionnement et purification des glycopeptides synthétisés. Après 24 heures, le sang est prélevé par incision de la cuticule et soumis à centrifugation à 36000 g, pendant 20 min, à 4°C.Extraction, fractionation and purification of synthesized glycopeptides. After 24 hours, the blood is taken by incision from the cuticle and subjected to centrifugation at 36,000 g, for 20 min, at 4 ° C.
Le surnageant est additionné d'acide acétique et chauffé à 100βC, pendant 4 min. Les protéines précipitées sont éliminées par centrifugation et le surnageant est appliqué sur une colonne échangeuse de cations, équilibrée avec un tampon d'acétate d'ammonium 40 à 500 mM.The supernatant is added with acetic acid and heated to 100 β C for 4 min. The precipitated proteins are removed by centrifugation and the supernatant is applied to a cation exchange column, equilibrated with a buffer of ammonium acetate 40 to 500 mM.
On vérifie 1'activité biologique des peptides obtenus en opérant comme décrit dans l'exemple 1, par exemple en étudiant l'activité vis-à-vis de E.coli. Les peptides actifs obtenus sont filtrés sur cartouche Sep Pack C18 WatersR et purifiés en chromatographie liquide, HPLC phase inverse sur une colonne Baker-Bond C18 WPR. L'élution est effectuée selon un gradient linéaire avec de 1'acetonitrile.The biological activity of the peptides obtained is checked by operating as described in Example 1, for example by studying the activity with respect to E. coli. The active peptides obtained are filtered on a Sep Pack C18 WatersR cartridge and purified by liquid chromatography, reverse phase HPLC on a Baker-Bond C18 WPR column. Elution is carried out according to a linear gradient with acetonitrile.
On soumet l'un des peptides actifs fraîchement isolé à la dégradation d'Edman et on détermine sa masse moléculaire.One of the freshly isolated active peptides is subjected to Edman degradation and its molecular mass is determined.
La séquence en acides aminés obtenue répond à la séquence (VIII) donnée plus haut, sa masse moléculaire est de 9440,4 (± 3). Les résidus thréonine en positions 10 et 54 sont O-glycosylés. Cette O-glycosylation correspond sur chacune de ces positions à un groupe N-acétyl hexosamine- hexose. En particulier, les résidus thréonine sont substitués par des groupes N-acétylgalactosamine-galactose- glucose. Par traitement avec de l'acide fluorhydrique HFA, on observe une diminution de la masse moléculaire à 8692,6 et une perte de l'activité biologique. Comme pour le peptide de 1'exemple 1, on notera avec intérêt que la O-glycosylation est nécessaire pour l'activité biologique des peptides.The amino acid sequence obtained corresponds to the sequence (VIII) given above, its molecular mass is 9440.4 (± 3). The threonine residues in positions 10 and 54 are O-glycosylated. This O-glycosylation corresponds in each of these positions to an N-acetyl hexosamine-hexose group. In particular, the threonine residues are substituted by N-acetylgalactosamine-galactose-glucose groups. By treatment with hydrofluoric acid HFA, a decrease in the molecular mass is observed at 8692.6 and a loss of the biological activity. As for the peptide of Example 1, it will be noted with interest that O-glycosylation is necessary for the biological activity of the peptides.
Ces substitutions peuvent être plus complexes que celles déjà indiquées correspondant à un groupe N-acétyl- hexamine-hexose. En effet, les extractions des peptides actifs ont été réalisées en milieu acide et peuvent donc conduire à une altération de la chaîne de substitution.These substitutions can be more complex than those already indicated corresponding to an N-acetylhexamine-hexose group. Indeed, the extractions of the active peptides were carried out in an acid medium and can therefore lead to an alteration of the substitution chain.
En opérant dans des conditions plus douces, il est alors possible d'obtenir des peptides actifs comportant un groupe glycosyle substitué en outre par exemple par un radical de 1'acide sialique et/ou un fucose.By operating under milder conditions, it is then possible to obtain active peptides comprising a glycosyl group further substituted, for example, by a radical of sialic acid and / or a fucose.
Exemple 6 : Obtention de glycopeptides antibaσtériens à partir de Pyrrhocnris apterus. - Immunisation et obtention de 1'hémolymphe.Example 6: Obtaining antibacterial glycopeptides from Pyrrhocnris apterus. - Immunization and obtaining the hemolymph.
On recueille les adultes de P.apterus durant 1'été sur des feuilles d'hibiscus. On injecte à 1000 insectes une suspension de 2 μl contenant 2500 cellules de M.luteus (bactéries à Gram positif) et 2500 cellules de E.coli (bactéries à Gram négatif).Adults of P.apterus are collected during summer on hibiscus leaves. A 1000 μl suspension containing 2500 cells of M.luteus (Gram positive bacteria) and 2500 cells of E. coli (Gram negative bacteria) is injected into 1000 insects.
A différents intervalles de temps, on recueille 1'hémolymphe (environ 3 μl/insecte) en sectionnant une antenne et en pressant doucement le corps de l'insecte. Les hémolymphes sont rassemblées et placées dans un puits en plastique pré-refroidi en présence d'aprotinine (Sigma A- 62-79, concentration finale : 10 μg/ml d'hémolymphe) comme inhibiteur de protéases, et de phénylthiourée (concentration finale : 1 μg/ml d'hémolymphe) comme inhibiteur de melanisation. L'hémolymphe est centrifugée à 13000 g pendant 1 heure à 4βC.At different time intervals, the hemolymph (about 3 μl / insect) is collected by sectioning an antenna and gently pressing the body of the insect. The hemolymphs are collected and placed in a pre-cooled plastic well in the presence of aprotinin (Sigma A-62-79, final concentration: 10 μg / ml of hemolymph) as a protease inhibitor, and of phenylthiourea (final concentration: 1 μg / ml of hemolymph) as a melanization inhibitor. The hemolymph is centrifuged at 13000 g for 1 hour at 4 β C.
On observe une forte activité anti-bactérienne dans les 24 heures suivant l'injection. Cette activité est maintenue jusqu'à 72 heures. Le volume total d'hémolymphe collectée est de 2,2 ml. Après l'élimination des cellules sanguines par centrifugation, on applique les surnageants, comme indiqué dans les exemples ci-dessus, sur une cartouche Sep-Pak Cl8R. L'activité antibactérienne est récupérée par elution avec 50 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée (0,05 % TFA).There is strong anti-bacterial activity within 24 hours of the injection. This activity is maintained for up to 72 hours. The total volume of hemolymph collected is 2.2 ml. After the elimination of blood cells by centrifugation, the supernatants are applied, as indicated in the examples above, on a Sep-Pak Cl8 R cartridge. The antibacterial activity is recovered by elution with 50% acetonitrile in acidified water (0.05% TFA).
Les fractions actives sont rassemblées et appliquées sur une colonne HPLC d'exclusion de taille, puis on effectue une elution isocratique avec 30 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée (0,03 % de TFA).The active fractions are combined and applied to a size exclusion HPLC column, then an isocratic elution is carried out with 30% acetonitrile in acidified water (0.03% TFA).
Les activités antibactériennes des fractions sont vérifiées en dosant des quantités aliquotes et en effectuant des tests d'inhibition de croissance sur plaques vis-à-vis de différents micro-organismes. Une activité anti-E.coli est détectée dans la fraction 1 correspondant à des masses moléculaires de 10 à 30 kDa, et une activité antibactérienne dirigée contre E.coli et M.luteus, dans la fraction 2 avec des masses moléculaires inférieures à 10 kDa.The antibacterial activities of the fractions are verified by assaying aliquots and by carrying out growth inhibition tests on plates against various microorganisms. An anti-E.coli activity is detected in fraction 1 corresponding to molecular weights of 10 to 30 kDa, and an antibacterial activity directed against E.coli and M.luteus, in fraction 2 with molecular weights less than 10 kDa .
La fraction 1 est ensuite soumise à une HPLC Ci8 en phase inverse et les molécules actives sont d'abord éluées avec un gradient variant de 2 à 52 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée (90 min, débit 1 ml/min). On effectue une nouvelle chromatographie sur la même colonne avec un gradient plus faible de 15 à 35 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée (pendant 90 min) avec un débit plus fort (2 ml/min). On récupère un produit apparaissant pur, appelé peptide A.Fraction 1 is then subjected to a reverse phase Ci8 HPLC and the active molecules are first eluted with a gradient varying from 2 to 52% of acetonitrile in acidified water (90 min, flow rate 1 ml / min) . A new chromatography is carried out on the same column with a lower gradient of 15 to 35% acetonitrile in acidified water (for 90 min) with a higher flow rate (2 ml / min). We recover a product appearing pure, called peptide A.
La fraction 2 est soumise également à une chromatographie HPLC Ci8 en phase inverse avec un gradient de 2 à 52 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée (0,05 % de TFA). Deux zones présentant une activité anti-bactérienne sont récupérées : 1'une correspond à un peptide, appelé peptide B, présentant une activité anti-M.luteus et la deuxième à un peptide appelé peptide C, qui est actif vis- à-vis de E.coli. Le peptide C apparaît constitué par un mélange de composés et est soumis à une purification supplémentaire à l'aide de deux processus successifs de chromatographie (HPLC, gradient de 10 à 30 %, suivi d'un gradient de 5 à 25 % d'acetonitrile dans de l'eau acidifiée, 0,05 % de TFA, 90 min pour chaque gradient). On obtient ainsi le peptide C sous forme pureFraction 2 is also subjected to reverse phase HPLC Ci8 chromatography with a gradient of 2 to 52% acetonitrile in acidified water (0.05% TFA). Two zones with anti-bacterial activity are recovered: one corresponds to a peptide, called peptide B, having anti-M.luteus activity and the second to a peptide called peptide C, which is active against E.coli. Peptide C appears to consist of a mixture of compounds and is subjected to an additional purification using two successive chromatography processes (HPLC, gradient from 10 to 30%, followed by a gradient from 5 to 25% acetonitrile in acidified water, 0.05% TFA, 90 min for each gradient). Peptide C is thus obtained in pure form.
- Détermination de la structure primaire du peptide C. On soumet le peptide C à la réaction de dégradation d'Edman.- Determination of the primary structure of peptide C. The peptide C is subjected to the Edman degradation reaction.
La détermination de la séquence en acides aminés montre que le peptide C comporte 20 résidus et correspond à l'enchaînement IX donné ci-dessus. La mesure par spectrométrie de masse de la masse moléculaire conduit à une valeur de m/z = 2543,3.Determination of the amino acid sequence shows that peptide C has 20 residues and corresponds to the sequence IX given above. The mass spectrometry measurement of the molecular mass leads to a value of m / z = 2543.3.
Les signaux observés pour le résidu en position 11 sont analogues à ceux observés pour le résidu thréonine du peptide selon 1'exemple 1, tel qu'induit chez la drosophile.The signals observed for the residue at position 11 are analogous to those observed for the threonine residue of the peptide according to Example 1, as induced in Drosophila.
La différence entre la masse calculée du peptide (2340,2 Da) et la masse expérimentale (2543,3 Da) est de 203,1 Da, ce qui correspond à un motif N-acétylhexosamine (221,18 Da) avec une molécule d'eau nécessaire pour la liaison glycane. Le groupe de substitution du motif thréonine est un groupe N-acétylgalactosamine.The difference between the calculated mass of the peptide (2340.2 Da) and the experimental mass (2543.3 Da) is 203.1 Da, which corresponds to an N-acetylhexosamine motif (221.18 Da) with a molecule d water required for glycan bonding. The threonine motif substitution group is an N-acetylgalactosamine group.
Exemple 7 : Formulation utilisable pour traiter des septicémies à entérobactéries.Example 7: Formulation usable for treating septicemia with enterobacteria.
1) Peptide de 1'exemple 1 : 10 à 100 mg Excipient : eau physiologique.1) Peptide of Example 1: 10 to 100 mg Excipient: physiological water.
2) Peptide de l'exemple 6 : 10 à 100 mg Excipient : eau physiologique.2) Peptide of Example 6: 10 to 100 mg Excipient: physiological water.
La formulation est administrée par voie injectable 4 fois par jour, pendant une semaine. Dans ces essais, aussi bien que dans les nombreuses autres expériences réalisées selon l'invention, on constate l'effet bactéricide puissant et rapide des peptides de l'invention qui permet un traitement efficace des septicémies. LISTE DES SEQUENCESThe formulation is administered by injection 4 times a day, for a week. In these tests, as well as in the numerous other experiments carried out according to the invention, the powerful and rapid bactericidal effect of the peptides of the invention is observed, which allows an effective treatment of septicemia. LIST OF SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE: (i) DEPOSANT:(1) GENERAL INFORMATION: (i) DEPOSITOR:
(A) NOM: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE(A) NAME: NATIONAL RESEARCH CENTER
SCIENTIFIQUE (C N R S)SCIENTIFIC (C N R S)
(B) RUE: 3 rue Michel Ange(B) STREET: 3 rue Michel Ange
(C) VILLE: PARIS (E) PAYS: FRANCE(C) CITY: PARIS (E) COUNTRY: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75794 CEDEX 16(F) POSTAL CODE: 75794 CEDEX 16
(ii) TITRE DE L' INVENTION :(ii) TITLE OF THE INVENTION:
GLYCOPEPTIDES, LEUR PROCEDE D'OBTENTION, ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUESGLYCOPEPTIDES, THEIR PROCESS FOR OBTAINING IT, AND THEIR BIOLOGICAL APPLICATIONS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 11 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 11 (iv) COMPUTER-READABLE FORM:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk(A) TYPE OF SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)(D) SOFTWARE: Patentln Release # 1.0, Version # 1.25 (EPO)
(V) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE:(V) CURRENT DEMAND DATA:
NUMERO DE DEPOT: PCT/FR (en attente)DEPOSIT NUMBER: PCT / FR (pending)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N°: 1:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 64 acides aminés (B) TYPE: acide aminé(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE: (A) LENGTH: 64 amino acids (B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:(ii) TYPE OF MOLECULE: Peptide (ix) ADDITIONAL CHARACTERISTIC:
(A) NOM/CLE: Peptide(A) NAME / KEY: Peptide
(B) EMPLACEMENT: 1..64(B) LOCATION: 1..64
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N": 1:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N ": 1:
Met Lys Phe Thr Ile Val Phe Leu Leu LeuMet Lys Phe Thr Ile Val Phe Leu Leu Leu
5 105 10
Ala Cys Val Phe Ala Met Ala Val Ala ThrAla Cys Val Phe Ala Met Ala Val Ala Thr
15 2015 20
Pro Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro ArgPro Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg
25 30 Pro Thr Ser His Pro Arg Pro Ile Arg Val25 30 Pro Thr Ser His Pro Arg Pro Ile Arg Val
35 4035 40
Arg Arg Glu Ala Leu Ala Ile Glu Asp HisArg Arg Glu Ala Leu Ala Ile Glu Asp His
45 50 Leu Ala Gin Ala Ala Ile Arg Pro Pro Pro45 50 Leu Ala Gin Ala Ala Ile Arg Pro Pro Pro
55 6055 60
Ile Leu Pro Ala 64 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 2 :Ile Leu Pro Ala 64 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 acides aminés(A) LENGTH: 19 amino acids
(B) TYPE: acide aminé(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: Peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:(ix) ADDITIONAL FEATURE:
(A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..19(A) NAME / KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..19
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 2: Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N ° 2: Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro
5 10 Thr Ser His Pro Arg Pro Ile Arg Val5 10 Thr Ser His Pro Arg Pro Ile Arg Val
15 1915 19
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 3 :(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 82 acides aminés(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE: (A) LENGTH: 82 amino acids
(B) TYPE: acide aminé(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: Peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:(ix) ADDITIONAL FEATURE:
(A) NOM/CLE: Peptide(A) NAME / KEY: Peptide
(B) EMPLACEMENT: 1..82(B) LOCATION: 1..82
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 3(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N ° 3
Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro ThrAsp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr
5 105 10
Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20
Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys Asp GlyGly Gly Gly Gly Gly Gn Asn Arg Lys Asp Gly
25 30 Phe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin Lys25 30 Phe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin Lys
35 4035 40
Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Gly His SerVal Trp Thr Ser Asp Asn Gly Gly His Ser
45 50 Ile Gly Val Ser Pro Gly Tyr Ser Gin His45 50 Ile Gly Val Ser Pro Gly Tyr Ser Gin His
55 6055 60
Leu Pro Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg ProLeu Pro Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro
65 7065 70
Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr 75 80Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr 75 80
Asn Glu 82Asn Glu 82
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 4 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: (i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 82 acides aminés(A) LENGTH: 82 amino acids
(B) TYPE: acide aminé(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide(D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:(ix) ADDITIONAL FEATURE:
(A) NOM/CLE: Peptide(A) NAME / KEY: Peptide
(B) EMPLACEMENT: 1..82(B) LOCATION: 1..82
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 4:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N ° 4:
Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro ThrAsp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr
5 105 10
Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20
Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys Asp GlyGly Gly Gly Gly Gly Gn Asn Arg Lys Asp Gly
25 3025 30
Phe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin LysPhe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin Lys
35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg His Ser35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg His Ser
45 5045 50
Ile Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser Gin HisIle Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser Gin His
55 6055 60
Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70
Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser TyrAsp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr
75 80 Asn Phe75 80 Asn phe
82 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 5 :82 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 41 acides aminés(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE: (A) LENGTH: 41 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: Peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:(ix) ADDITIONAL FEATURE:
(A) NOM/CLE: Peptide(A) NAME / KEY: Peptide
(B) EMPLACEMENT: 1..41(B) LOCATION: 1..41
(C) AUTRES INFORMATIONS : Xaa signifie acide aminé variable(C) OTHER INFORMATION: Xaa means variable amino acid
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N" 5 :(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N "5:
Asp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro SerAsp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro Ser
5 10 Xaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val .5 10 Xaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val.
15 2015 20
Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa GlyGly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa Gly
25 3025 30
Xaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala Ala Gin Lys 35 40Xaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala Ala Gin Lys 35 40
Val 41Val 41
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N°: 6 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6: (i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 41 acides aminés(A) LENGTH: 41 amino acids
(B) TYPE: acide aminé(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide(D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: Peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:(ix) ADDITIONAL FEATURE:
(A) NOM/CLE: Peptide(A) NAME / KEY: Peptide
(B) EMPLACEMENT: 1..41(B) LOCATION: 1..41
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N" 6 :(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N "6:
Asp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro SerAsp Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Pro Ser
5 105 10
Xaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20Xaa Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val 15 20
Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa GlyGly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Xaa Gly
25 30 Xaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala His Gin Lys25 30 Xaa Xaa Val Ser Ile Asn Ala His Gin Lys
35 4035 40
ValVal
4141
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N°: 7 :(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 acides aminés(A) LENGTH: 39 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: Peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE: (A) NOM/CLE: Peptide(ix) ADDITIONAL FEATURE: (A) NAME / KEY: Peptide
(B) EMPLACEMENT: 1..39(B) LOCATION: 1..39
(C) AUTRES INFORMATIONS : Xaa signifie acide aminé variable (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 7 :(C) OTHER INFORMATION: Xaa means variable amino acid (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N ° 7:
Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Xaa Pro XaaAsp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Xaa Pro Xaa
5 105 10
Xaa Ala Pro Xaa Asn Leu Xaa Gin Leu ValXaa Ala Pro Xaa Asn Leu Xaa Gin Leu Val
15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Lys Xaa15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Asn Asn Lys Lys Xaa
25 3025 30
Xaa Gly Val Xaa Val Xaa Xaa Ala GinXaa Gly Val Xaa Val Xaa Xaa Ala Gin
35 3935 39
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N°: 8 :(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 82 acides aminés(A) LENGTH: 82 amino acids
(B) TYPE: acide aminé(B) TYPE: amino acid
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: Peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE: (A) NOM/CLE: Peptide (B) EMPLACEMENT: 1..82(ix) ADDITIONAL FEATURE: (A) NAME / KEY: Peptide (B) LOCATION: 1..82
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N1 8 Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N 1 8 Asp Glu Lys Pro Lys Leu Ile Leu Pro Thr
5 10 Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val5 10 Pro Ala Pro Pro Asn Leu Pro Gin Leu Val
15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Asn Arg Lys Asp Gly15 20 Gly Gly Gly Gly Gly Gn Asn Arg Lys Asp Gly
25 3025 30
Phe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin LysPhe Gly Val Ser Val Asp Ala His Gin Lys
35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg His Ser35 40 Val Trp Thr Ser Asp Asn Gly Arg His Ser
45 5045 50
Ile Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser Gin HisIle Gly Val Thr Pro Gly Tyr Ser Gin His
55 6055 60
Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70Leu Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Ser Arg Pro 65 70
Asp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser TyrAsp Tyr Arg Ile Gly Ala Gly Tyr Ser Tyr
75 8075 80
Asn PheAsn phe
8282
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 9 :(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 acides aminés(A) LENGTH: 20 amino acids
(B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire(B) TYPE: amino acid (D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: Peptide(ii) TYPE OF MOLECULE: Peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:(ix) ADDITIONAL FEATURE:
(A) NOM/CLE: Peptide(A) NAME / KEY: Peptide
(B) EMPLACEMENT: 1..20(B) LOCATION: 1..20
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 9 :(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N ° 9:
Val Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg ProVal Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro
5 105 10
Thr Pro Pro Arg Pro Ile Tyr Asn Arg AsnThr Pro Pro Arg Pro Ile Tyr Asn Arg Asn
15 2015 20
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 10(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 353 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique(A) LENGTH: 353 base pairs (B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS : double brin(C) NUMBER OF STRANDS: double strand
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARN génomique (iϋ) HYPOTHETIQUE : oui (iv) ANTI-SENS : non (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:(ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA for genomic RNA (iϋ) HYPOTHETIC: yes (iv) ANTI-SENSE: no (ix) ADDITIONAL FEATURE:
(A) NOM/CLE:(A) NAME / KEY:
(B) EMPLACEMENT: 1..353(B) LOCATION: 1..353
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 10(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N ° 10
TCCACCACTC CAAGCACA ATG AAG TTC ACC ATC GTT TTC CTG 42TCCACCACTC CAAGCACA ATG AAG TTC ACC ATC GTT TTC CTG 42
Met Lys Phe Thr Ile Val Phe Leu -20 -15 CTG CTT GCC TGC GTT TTT GCC ATG GCT GTG GCC ACT CCC 81 Leu Leu Ala Cys Val Phe Ala Met Ala Val Ala Thr ProMet Lys Phe Thr Ile Val Phe Leu -20 -15 CTG CTT GCC TGC GTT TTT GCC ATG GCT GTG GCC ACT CCC 81 Leu Leu Ala Cys Val Phe Ala Met Ala Val Ala Thr Pro
-10 -5-10 -5
GGC AAG CCA CGC CCC TAC AGC CCA CGC CCC ACC TCC CAT 120 Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Thr Ser His 1 5 10GGC AAG CCA CGC CCC TAC AGC CCA CGC CCC ACC TCC CAT 120 Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Thr Ser His 1 5 10
CCT CGC CCC ATT CGA GTG AGG CGC GAG GCA CTG GCC ATC 159 Pro Arg Pro Ile Arg Val Arg Arg Glu Ala Leu Ala IleCCT CGC CCC ATT CGA GTG AGG CGC GAG GCA CTG GCC ATC 159 Pro Arg Pro Ile Arg Val Arg Arg Glu Ala Leu Ala Ile
15 20 2515 20 25
GAG GAT CAC CTG GCT CAA GCT GCC ATC AGG CCA CCA CCC 198 Glu Asp His Leu Ala Gin Ala Ala Ile Arg Pro Pro ProGAG GAT CAC CTG GCT CAA GCT GCC ATC AGG CCA CCA CCC 198 Glu Asp His Leu Ala Gin Ala Ala Ile Arg Pro Pro Pro
30 3530 35
ATT CTG CCC GCC TAA AGA TGTGTGCATA CCGCGGAGAA 236ATT CTG CCC GCC TAA AGA TGTGTGCATA CCGCGGAGAA 236
Ile Leu Pro Ala 40 GTCATCCGAT CAAATTTGTT TTGAAAAATC TTTATAAAAA 276Ile Leu Pro Ala 40 GTCATCCGAT CAAATTTGTT TTGAAAAATC TTTATAAAAA 276
TTGTGAATTT TTTACTTTCT GCAAACAGTA AACAATAAAC 316TTGTGAATTT TTTACTTTCT GCAAACAGTA AACAATAAAC 316
ACACGAAAGA CAGCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 353ACACGAAAGA CAGCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 353
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N° : 11 :(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 363 paires de bases(A) LENGTH: 363 base pairs
(B) TYPE: acide nucléique(B) TYPE: nucleic acid
(C) NOMBRE DE BRINS : double brin (D) CONFIGURATION: linéaire(C) NUMBER OF STRANDS: double strand (D) CONFIGURATION: linear
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc pour ARN génomique (iii) HYPOTHETIQUE : oui (iv) ANTI-SENS : non(ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA for genomic RNA (iii) HYPOTHETIC: yes (iv) ANTI-SENSE: no
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONNELLE:(ix) ADDITIONAL FEATURE:
(A) NOM/CLE:(A) NAME / KEY:
(B) EMPLACEMENT: 1..363 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N° 11 ATTTG TCCACCACTC CAAGCACA ATG AAG TTC ACC ATC GTT 41(B) LOCATION: 1..363 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID N ° 11 ATTTG TCCACCACTC CAAGCACA ATG AAG TTC ACC ATC GTT 41
Met Lys Phe Thr Ile Val -20Met Lys Phe Thr Ile Val -20
TTC CTG CTG CTT GCT TGC GTT TTT GCC ATG GGT GTG GCC 80 Phe Leu Leu Leu Ala Cys Val Phe Ala Met Gly Val Ala -15 -10 -5TTC CTG CTG CTT GCT TGC GTT TTT GCC ATG GGT GTG GCC 80 Phe Leu Leu Leu Ala Cys Val Phe Ala Met Gly Val Ala -15 -10 -5
ACT CCC GGC AAG CCA CGC CCC TAC AGC CCA CGC CCC ACC 119 Thr Pro Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro ThrACT CCC GGC AAG CCA CGC CCC TAC AGC CCA CGC CCC ACC 119 Thr Pro Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Thr
1 5 101 5 10
TCC CAT CCC CGC CCC ATT CGA GTG AGG CGC GAG GCA CTG 158 Ser His Pro Arg Pro Ile Arg Val Arg Arg Glu Ala Leu 15 20 GCC ATC GAG GAT CAC CTG ACT CAA GCT GCC ATC AGG CCA 197 Ala Ile Glu Asp His Leu Thr Gin Ala Ala Ile Arg Pro 25 30 35TCC CAT CCC CGC CCC ATT CGA GTG AGG CGC GAG GCA CTG 158 Ser His Pro Arg Pro Ile Arg Val Arg Arg Glu Ala Leu 15 20 GCC ATC GAG GAT CAC CTG ACT CAA GCT GCC ATC AGG CCA 197 Ala Ile Glu Asp His Leu Thr Gin Ala Ala Ile Arg Pro 25 30 35
CCA CCC ATT CTG CCC GCC TAA AGA TGTGTGCATA 231CCA CCC ATT CTG CCC GCC TAA AGA TGTGTGCATA 231
Pro Pro Ile Leu Pro Ala 40Pro Pro Ile Leu Pro Ala 40
CCGCGGAGAA GTCATCCGAT CAAATTTGTT TTGAAAAATC 271CCGCGGAGAA GTCATCCGAT CAAATTTGTT TTGAAAAATC 271
TTTATAAAAA TTGTGAATTT TTTACTTTCT GCAAACAGTA 311TTTATAAAAA TTGTGAATTT TTTACTTTCT GCAAACAGTA 311
AGCAATAAAC ACACGAAAGA CAGCAAAAAA AAAAAAAAAA 351AGCAATAAAC ACACGAAAGA CAGCAAAAAA AAAAAAAAAA 351
AAAAAAAAAA AA 363 AAAAAAAAAA AA 363

Claims

REVENDICATIONS
1/ Glycopeptides, caractérisés en ce qu'ils possèdent des propriétés antibactériennes conférées par une séquence en acides aminés renfermant au moins un acide aminé 0 - substitué par un groupe glycosyle contenant un ou plusieurs motifs, ose et/ou osamine, un poly-ose et/ou -osamine.1 / Glycopeptides, characterized in that they have antibacterial properties conferred by an amino acid sequence containing at least one amino acid 0 - substituted by a glycosyl group containing one or more motifs, ose and / or osamine, a polyose and / or -osamine.
2/ Glycopeptides selon la revendication 1, caractérisés en ce que l'acide aminé substitué est un acide aminé hydroxyle tel que la thréonine, la serine ou la tyrosine.2 / Glycopeptides according to claim 1, characterized in that the substituted amino acid is a hydroxylated amino acid such as threonine, serine or tyrosine.
3/ Glycopeptides selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que le groupe glycosyle est linéaire ou cyclique, substitué ou non, sous forme α ou β, comportant avantageusement 5 ou 6 atomes de carbone, les substituants éventuellement présents étant choisis notamment parmi les radicaux alkyle de 1 à 4 atomes de carbone ou, en particulier, pour les osamines, parmi les radicaux acyle, plus spécialement acétyle.3 / Glycopeptides according to claim 1 or 2, characterized in that the glycosyl group is linear or cyclic, substituted or not, in α or β form, advantageously comprising 5 or 6 carbon atoms, the substituents optionally present being chosen in particular from alkyl radicals of 1 to 4 carbon atoms or, in particular, for osamines, among the acyl radicals, more especially acetyl.
4/ Glycopeptides selon la revendication 3, caractérisés en ce que le groupe glycosyle est choisi parmi les hexoses tels que le galactose, le glucose, le tallose, l'altrose, le gulose, le mannose et l'allose, les hexosamines telles que la galactosamine, la glucosamine, la tallosamine, l'altrosamine, le gulosamine, la mannosamine ou 1'allosamine, ou les hexosamines substituées par un ou plusieurs motifs hexoses comme la (N-acétylhexosamine)- hexose(s). 5/ Glycopeptides selon la revendication 4, caractérisés en ce que le groupe glycosyle est une N-acétylglucosamine ou une N-acétylgalactosamine, substituée par un galactose ou un motif galactose-glucose.4 / Glycopeptides according to claim 3, characterized in that the glycosyl group is chosen from hexoses such as galactose, glucose, tallose, altrose, gulose, mannose and allose, hexosamines such as galactosamine, glucosamine, tallosamine, altrosamine, gulosamine, mannosamine or allosamine, or hexosamines substituted by one or more hexose units such as (N-acetylhexosamine) - hexose (s). 5 / Glycopeptides according to claim 4, characterized in that the glycosyl group is an N-acetylglucosamine or an N-acetylgalactosamine, substituted by a galactose or a galactose-glucose unit.
6/ Glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce qu'ils sont du type des peptides tels qu'obtenus chez les arthropodes, et notamment chez les larves ou les adultes d'insectes par un procédé comprenant - l'induction de leur synthèse notamment par injection de bactéries en doses suffisantes ou par blessure septique ou autre traumatisme,6 / Glycopeptides according to one of claims 1 to 5, characterized in that they are of the type of peptides as obtained in arthropods, and in particular in larvae or adults of insects by a process comprising - the induction of their synthesis in particular by injection of bacteria in sufficient doses or by septic injury or other trauma,
- l'extraction de manière à recueillir les peptides ayant subi une glycosylation post-traductionnelle et, le cas échéant,- the extraction in order to collect the peptides having undergone post-translational glycosylation and, if necessary,
- le fractionnement de l'extrait isolé afin de séparer sélectivement les glycopeptides selon le niveau de leur activité antibactérienne. 7/ Glycopeptides, selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisés en ce qu'ils présentent une activité contre les germes à Gram négatif et à Gram positif.- fractionation of the isolated extract in order to selectively separate the glycopeptides according to the level of their antibacterial activity. 7 / Glycopeptides, according to one of claims 1 to 6, characterized in that they exhibit activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria.
8/ Glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisés en ce que leur séquence peptidique responsable de leur activité antibactérienne, qui comprend au moins un acide aminé substitué comme défini dans la revendication 1, est contenue dans un domaine comportant au moins 30 % environ de groupes proline.8 / Glycopeptides according to one of claims 1 to 7, characterized in that their peptide sequence responsible for their antibacterial activity, which comprises at least one substituted amino acid as defined in claim 1, is contained in a domain comprising at least 30 about% of proline groups.
9/ Glycopeptides selon la revendication 8, caractérisés en ce que ladite séquence comporte au moins un motif de 0-glycosylation proline-thréonine/sérine-Xaal-9 / Glycopeptides according to claim 8, characterized in that said sequence comprises at least one motif of proline-threonine / serine-Xaal- 0-glycosylation
Xaa2-proline dans lequel les motifs Xaal et Xaa2, identiques ou différents, sont des acides aminés variables.Xaa2-proline in which the Xaal and Xaa2 motifs, identical or different, are variable amino acids.
10/ Glycopeptides selon la revendication 8 ou 9, caractérisés en ce que ladite séquence comporte au moins un acide aminé hydrophobe tel que la thréonine, substitué par un groupe glycosyle, en particulier par un groupe N-acétyl hexosamine ou (N-acétylhexosamine)-hexose.10 / Glycopeptides according to claim 8 or 9, characterized in that said sequence comprises at least one hydrophobic amino acid such as threonine, substituted by a glycosyl group, in particular by an N-acetyl hexosamine group or (N-acetylhexosamine) - hexose.
11/ Glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 10, tels qu'inductibles chez la drosophile.11 / Glycopeptides according to one of claims 1 to 10, as inducible in Drosophila.
12/ Glycopeptides selon la revendication 11, caractérisés en ce qu'ils comportent ou qu'ils sont constitués par les séquences (I) ou (II), dans lesquelles au moins un motif thréonine ou serine est-O - substitué comme défini dans l'une des revendications 3 à 5.12 / Glycopeptides according to claim 11, characterized in that they comprise or that they consist of the sequences (I) or (II), in which at least one threonine or serine unit is O-substituted as defined in l 'one of claims 3 to 5.
13/ Glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 10, tels qu'inductibles chez les diptères, notamment chez Phormia terranovae. 14/ Glycopeptides selon la revendication 13 caractérisés en ce qu'ils comportent ou qu'ils sont constitués par une séquence en acides aminés, telle que déterminée selon la dégradation d'Edman, répondant à l'une des séquences (III) à (VIII), dans lesquelles la thréonine ou la serine en position 10 et/ou celle en position 54, sont substituée(s) par un groupe glycosyle comme défini dans 1'une des revendications 3 à 5.13 / Glycopeptides according to one of claims 1 to 10, as inducible in dipterans, in particular in Phormia terranovae. 14 / Glycopeptides according to claim 13 characterized in that they comprise or that they consist of an amino acid sequence, as determined according to the degradation of Edman, corresponding to one of the sequences (III) to (VIII ), in which the threonine or serine in position 10 and / or that in position 54 are substituted by a glycosyl group as defined in one of claims 3 to 5.
15/ Glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 10, tels qu'inductibles chez les hyménoptères, notamment chez les abeilles.15 / Glycopeptides according to one of claims 1 to 10, as inducible in hymenoptera, in particular in bees.
16/ Glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisés en ce qu'ils sont tels qu'inductibles chez les hémiptères, par exemple chez Pyrrhocoris apterus. 17/ Glycopeptides selon la revendication 16, caractérisés en ce qu'ils comportent ou qu'ils sont constitués par la séquence (IX).16 / Glycopeptides according to one of claims 1 to 10, characterized in that they are such that they are inducible in hemiptera, for example in Pyrrhocoris apterus. 17 / Glycopeptides according to claim 16, characterized in that they comprise or are constituted by the sequence (IX).
18/ Les fragments, mutants et dérivés fonctionnels des glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 17. 19/ Séquences de nucléotides comportant l'information génétique correspondant aux acides aminés des glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 18, les séquences capables de s'hybrider avec celles-ci dans des conditions stringentes, les séquences complémentaires et les ARN correspondants.18 / The fragments, mutants and functional derivatives of the glycopeptides according to one of claims 1 to 17. 19 / Nucleotide sequences comprising the genetic information corresponding to the amino acids of the glycopeptides according to one of claims 1 to 18, the sequences capable to hybridize with these under stringent conditions, the complementary sequences and the corresponding RNAs.
20/ Vecteurs d'expression et/ou de clonage comportant au moins un fragment des séquences de nucléotides selon la revendication 19 et hôtes transformés par ces vecteurs.20 / Expression and / or cloning vectors comprising at least one fragment of the nucleotide sequences according to claim 19 and hosts transformed by these vectors.
21/ Les produits d'expression des vecteurs selon la revendication 20.21 / The expression products of the vectors according to claim 20.
22/ Procédé d'obtention de glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'on procède à l'enchaînement des acides aminés par voie de synthèse, l'un au moins des acides aminés utilisés étant 0 substitué comme défini dans la revendication 1 et étant introduit de manière à occuper la position souhaitée dans la séquence. 23/ Agents antibactériens caractérisés en ce qu'ils renferment au moins un glycopeptide selon 1'une des revendications 1 à 18.22 / A method for obtaining glycopeptides according to one of claims 1 to 18, characterized in that one proceeds to the chain of amino acids by synthesis, at least one of the amino acids used being 0 substituted as defined in claim 1 and being introduced so as to occupy the desired position in the sequence. 23 / Antibacterial agents characterized in that they contain at least one glycopeptide according to one of claims 1 to 18.
24/ Compositions antibactériennes, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace de glycopeptides selon l'une des revendications 1 à 18, en association avec un véhicule inerte.24 / Antibacterial compositions, characterized in that they contain an effective amount of glycopeptides according to one of claims 1 to 18, in association with an inert vehicle.
25/ Compositions selon la revendication 24, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées en thérapeutique humaine ou vétérinaire, le véhicule inerte étant approprié pour cette utilisation.25 / Compositions according to claim 24, characterized in that they are used in human or veterinary therapy, the inert vehicle being suitable for this use.
26/ Compositions selon la revendication 24, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées en agrochimie, le véhicule inerte étant approprié pour cette utilisation. 27/ Compositions selon la revendication 24, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées dans 1'industrie agro-alimentaire.26 / Compositions according to claim 24, characterized in that they are used in agrochemistry, the inert vehicle being suitable for this use. 27 / Compositions according to claim 24, characterized in that they are used in the food industry.
28/ Cellules végétales et plantes dont le génome est modifié par la présence de gènes capables de coder pour les séquences peptidiques des glycopeptides selon 1'une des revendications 1 à 18, ces cellules végétales et plantes étant capables d'assurer la glycosylation des séquences peptidiques de manière à leur conférer une activité antibactérienne. 28 / Plant cells and plants whose genome is modified by the presence of genes capable of coding for the peptide sequences of the glycopeptides according to one of claims 1 to 18, these plant cells and plants being capable of ensuring the glycosylation of the peptide sequences so as to give them antibacterial activity.
PCT/FR1993/000853 1992-09-04 1993-09-06 Glycopeptides, method of obtaining them and biological applications thereof WO1994005787A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9210608A FR2695391B1 (en) 1992-09-04 1992-09-04 Glycopeptides, their process of obtaining, and their biological applications.
FR92/10608 1992-09-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1994005787A1 true WO1994005787A1 (en) 1994-03-17

Family

ID=9433234

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1993/000853 WO1994005787A1 (en) 1992-09-04 1993-09-06 Glycopeptides, method of obtaining them and biological applications thereof

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2695391B1 (en)
WO (1) WO1994005787A1 (en)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000078956A1 (en) * 1999-06-23 2000-12-28 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Novel pyrrhocoricin-derived peptides, and methods of use thereof
US6891085B2 (en) 2001-04-20 2005-05-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleic acid encoding the FUS6 antimicrobial polypeptide of Agrotis ipsilon and its use to enhance disease resistance in a plant
US7015309B1 (en) 1999-06-23 2006-03-21 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Pyrrhocoricin-derived peptides, and methods of use thereof
EP1657249A1 (en) * 2004-11-10 2006-05-17 Nederlandse Organisatie voor toegepast-natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO Antibiotic drosocin derivatives
CN112941133A (en) * 2021-02-19 2021-06-11 中国农业大学 Fish protein glycopeptide capable of promoting growth of probiotics and resisting oxidation and preparation method and application thereof

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2732345B1 (en) * 1995-04-03 1997-05-30 Rhone Poulenc Agrochimie ANTIBACTERIAL PEPTIDE
FR2733237B1 (en) * 1995-04-24 1997-05-16 Rhone Poulenc Agrochimie ANTIBACTERIAL AND ANTIFUNGAL PEPTIDE

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57188525A (en) * 1981-05-15 1982-11-19 Otsuka Pharmaceut Co Ltd Glycopeptide having antibacterial activity
WO1989009786A1 (en) * 1988-04-08 1989-10-19 Sandoz Ag Peptide derivatives
EP0348892A2 (en) * 1988-06-28 1990-01-03 Mect Corporation Sialic acid-bonded octapeptide and preparation thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57188525A (en) * 1981-05-15 1982-11-19 Otsuka Pharmaceut Co Ltd Glycopeptide having antibacterial activity
WO1989009786A1 (en) * 1988-04-08 1989-10-19 Sandoz Ag Peptide derivatives
EP0348892A2 (en) * 1988-06-28 1990-01-03 Mect Corporation Sialic acid-bonded octapeptide and preparation thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NORIHIKO NAKAKURA ET AL.: "Isolation and structural determination of three peptides from the insect locusta migratoria", EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 204, no. 1, February 1992 (1992-02-01), pages 147 - 153 *
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 7, no. 34 (C - 150)<1179> 10 February 1983 (1983-02-10) *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000078956A1 (en) * 1999-06-23 2000-12-28 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Novel pyrrhocoricin-derived peptides, and methods of use thereof
US7015309B1 (en) 1999-06-23 2006-03-21 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Pyrrhocoricin-derived peptides, and methods of use thereof
US6891085B2 (en) 2001-04-20 2005-05-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleic acid encoding the FUS6 antimicrobial polypeptide of Agrotis ipsilon and its use to enhance disease resistance in a plant
US7064183B2 (en) 2001-04-20 2006-06-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fus6 family antimicrobial polypeptides and their uses
US7064184B2 (en) 2001-04-20 2006-06-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mag1 antimicrobial polypeptides and their uses
US7202214B2 (en) 2001-04-20 2007-04-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rhizoc3 antimicrobial polypeptides and their uses
US7262342B2 (en) 2001-04-20 2007-08-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. FUS6 nucleic acid molecules and methods of their use in enhancing disease resistance in plants
US7323623B2 (en) 2001-04-20 2008-01-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. RHIZOC3 nucleic acid molecules
EP1657249A1 (en) * 2004-11-10 2006-05-17 Nederlandse Organisatie voor toegepast-natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO Antibiotic drosocin derivatives
WO2006052129A2 (en) * 2004-11-10 2006-05-18 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Antibiotic drosocin derivatives
WO2006052129A3 (en) * 2004-11-10 2006-07-13 Tno Antibiotic drosocin derivatives
CN112941133A (en) * 2021-02-19 2021-06-11 中国农业大学 Fish protein glycopeptide capable of promoting growth of probiotics and resisting oxidation and preparation method and application thereof

Also Published As

Publication number Publication date
FR2695391A1 (en) 1994-03-11
FR2695391B1 (en) 1994-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Casteels‐Josson et al. Apidaecin multipeptide precursor structure: a putative mechanism for amplification of the insect antibacterial response.
CN101265296B (en) Reptile cathelicidin antibiotic peptide and derivatives, and application thereof
Cociancich et al. Novel inducible antibacterial peptides from a hemipteran insect, the sap-sucking bug Pyrrhocoris apterus
Bulet et al. A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosylated substitution
DE69432231T2 (en) PEPTIDES WITH ANTITHROMBOTIC ACTIVITY AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
CN102203127B (en) Leucoagglutinin and its application
JPH10509415A (en) Conotoxin peptide
JPH10502925A (en) Immunological activity of rhamnolipids
FR2766191A1 (en) ANTI-MICROBIAL PEPTIDES OF CRUSTACEANS
DK2563806T3 (en) Human leukolectiner and uses thereof
WO1994005787A1 (en) Glycopeptides, method of obtaining them and biological applications thereof
DE60118359T2 (en) HUMAN PELLINO POLYPEPTIDE
Amiche et al. Molecular cloning of a cDNA encoding the precursor of adenoregulin from frog skin: Relationships with the vertebrate defensive peptides, dermaseptins
DE69831084T2 (en) Beta-defensins
FR2695392A1 (en) New antibacterial peptide(s) from dragonfly - for medical, veterinary, agricultural and food preservation use
EP2408806A1 (en) Analogs of temporin-sha, and uses thereof
Jiménez-Vega et al. A secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI)-like protein from Litopenaeus vannamei haemocytes
EP1517916B1 (en) Spheniscins and analogue peptides having antimicrobial properties for use in preserving foods
AU770076B2 (en) Alpha-conotoxin peptides
CA2391421A1 (en) Compositions and methods for modifying an immune response against tropomyosin
CN106478811B (en) Giant knotweed frog protease inhibitory peptide, gene thereof and application thereof in pharmacy
Jimenez-Vega et al. Isoforms of Litopenaeus vannamei anti-lipopolysaccharide and its expression by bacterial challenge
JP3810821B2 (en) Peptide derivatives and their uses
AU768091B2 (en) Tau-conotoxin peptides
RU2116311C1 (en) Peptides showing organoprotective activity, pharmacologically active composition

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: CA

122 Ep: pct application non-entry in european phase