WO1992006118A1 - Protein aus hirudo medicinalis - Google Patents

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WO1992006118A1
WO1992006118A1 PCT/EP1991/001856 EP9101856W WO9206118A1 WO 1992006118 A1 WO1992006118 A1 WO 1992006118A1 EP 9101856 W EP9101856 W EP 9101856W WO 9206118 A1 WO9206118 A1 WO 9206118A1
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WO
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protein
new protein
new
hirudin
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PCT/EP1991/001856
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English (en)
French (fr)
Inventor
Karl-Hermann Strube
Siegfried Bialojan
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a new protein from the leech Hirudo medicinalis, its muteins and their production and use.
  • fibrinolytics that break down fibrin or fibrinogen directly, and plasinogen activators.
  • the fibrin or fibrinogen-degrading substances include hementin (from He enteria ghilianii) and destabilase (from Hirudo medicinalis; I.P. Baskova et al. Folia Haatol., Leipzig, 115, 1988, p. 166).
  • a plasminogen activator has been described in secretions from Hementeria depressa.
  • Inhibitors of blood coagulation e.g. the thrombin inhibitor hirudin (from Hirudo medicinalis), a factor Xa inhibitor (from Hirudo medicinalis), trypsin and plasmin or chymotrypsin and elastase inhibitors such as e.g. the Bdellin or Egline (from Hirudo medicinalis) (Leech Biology and Behavior, Vol. II, Oxford, Science Publication / R.T. Sawyer, 1986).
  • hirudin from Hirudo medicinalis
  • factor Xa inhibitor from Hirudo medicinalis
  • trypsin and plasmin or chymotrypsin and elastase inhibitors such as e.g. the Bdellin or Egline (from Hirudo medicinalis) (Leech Biology and Behavior, Vol. II, Oxford, Science Publication / R.T. Sawyer, 1986).
  • the invention relates to a new protein from Hirudo medi ⁇ cinalis, which extends the clotting time of the blood, is relatively heat-stable and has a molecular weight of 25 to 34 KDa, and its muteins.
  • the new protein significantly increases the intrinsic clotting time (APTT) and the extrinsic clotting time (PT) of the blood. It differs in its anticoagulant properties from hirudin and the factor Xa inhibitor. In fractions in which the APTT prolonging activity is present, neither appropriate amounts of hirudin (by ELISA) nor factor
  • Muteins of the new protein are to be understood as those proteins which are derived from the new protein by exchange, deletion and / or addition of amino acids or peptides without their properties being very different from the new protein.
  • the new protein can be obtained from leeches (Hirudo medicinalis). For this, the leeches are placed in water. After stimulation with arginine, the leeches release the factor into the aqueous solution, from which the new protein is isolated in a known manner by ion exchange, affinity, chelate and gel permeation chromatography or by hydrophobic chromatography.
  • the expression systems include prokaryotes such as E. coli or Bacillus subtilis on the one hand, but also eukaryotes such as yeasts and mammalian cells (e.g. Cl27 mouse fibroblasts, hamster and insect cells).
  • the new protein and its muteins are suitable for the treatment of diseases, in particular for the treatment and prophylaxis of thrombotic conditions.
  • diseases in particular for the treatment and prophylaxis of thrombotic conditions.
  • Extracts from Hirudo medicinalis were obtained using the following methods:
  • the liquids obtained according to a) were heated individually or together for 10 minutes at 90 ° C. and then immediately cooled on ice. After centrifugation (20 min, 10,000 rpm, Sorvall® SA 600 rotor), the supernatant was first diluted 1: 2 to 1: 5 with PBS. The pH was adjusted to 7.4. The solution was then equilibrated to PBS
  • Fractions containing activity were pooled, diluted 1: 2 with 20 mM phosphate buffer, 250 mM NaCl pH 7.0 and applied to a Cu chelate column (1 ml). After rinsing with 10 to 15 column volumes of equilibration buffer (20 mM Na phosphate, 250 mM NaCl pH 7.0), the elution was carried out by applying a linear gradient from 0 to 100% buffer B (20 mM succinic acid, 1 M NaCl pH 4.0). . The column was then post-eluted either with 20 mM phosphate, 2 M NaCl, 10 mM EDTA, pH 7 or with 20 mM succinic acid 2 M NaCl, 100 M histidine pH 4.
  • the concentrates were diluted to 20 mM succinic acid pH 2.5 (final concentration) and applied to an S-Sepharose® column equilibrated with 20 mM succinic acid pH 2.5. Any hirudin present was separated off by elution with 30 mM succinic acid pH 4.5. Elution of the new factor? was carried out by applying a buffer gradient according to PE pH 7.5. A pH value of 5.5-7 was measured in the value fractions of S-Sepharose. Fractions containing the activity (thrombin inhibition) were further tested in a hirudin Elisa (see Example 6a).
  • the fractions of S-Sepharose® chromatography exhibiting thrombin inhibition were further purified by reversed phase HPLC on a Bio-RAD rp304® column with a 20 M ammonium acetate, pH 6, 20 M ammonium acetate, 50% acetonitrile 1 system .
  • the value fractions were concentrated to a volume of 200 to 500 ⁇ l and eluted from the rHPLC by applying an acetonitrile gradient.
  • the new factor elutes at an acetonitrile concentration of 7.5% + _ 3%.
  • the activity of the new thrombin inhibitor is retained and can be demonstrated by tricin-SDS-polyacrylamide gel electrophoresis or APTT determination.
  • the new protein could be concentrated by Centricon® 10, but not by Centricon® 30. This means that the new protein must have a molecular weight between 10 and 30 kDA.
  • the gel electrophoresis was carried out in accordance with the instructions (Schägger, H. and von Jagow, G .; Analytical Biochemistry, 166, 368-379 (1987) at 20 A and 1400 V, 30 W, with a power supplier from LKB and a running chamber of the " mighty s all system ". After completion of the electrophoresis, the gel was first incubated for 30 min in a 2.5% solution of Triton X100 and then on an agarose plate containing thrombin and fibrinogen twice
  • the thrombin concentration in the agarose was adjusted so that the fibrinogen was polymerized under the action of the thrombin within 2 to 4 hours.
  • the presence of the new thrombin inhibitor was confirmed by unpolymerized sites in the
  • the molecular weight marker (calibration proteins: intact myoglobin 17.2 kDA, cyanogen bromide cyanide myoglobin I + Uli 14.6 kDa, cyanogen bromide cyanogen myoglobin I 8.2 kDa, bromocyanopeptide myoglobin II 6.4 kDa, bromocyanopeptide myoglobin III 2.6 kDa, myoglobin 1-14), the molecular weight of the new thrombin inhibitor was determined to be 14.6 + _ 3 kDa.
  • the new factor was tested in various assay systems to determine how and which factors in the coagulation as ( ade it inhibits.
  • APTT *** activated partial thromboplastin time
  • Samples to be tested were diluted in 50 ⁇ l human plasma (eg Preciclot®, Boehringer / Ma, No. 654 370).
  • 50 ⁇ l of PTT a reagent (Boehringer / Ma, No. 886 050) were pipetted in and incubated at 37 ° C. for 5 min.
  • the coagulation cascade was started by adding 50 ⁇ l of 25 mM CaCl. The time until the occurrence of plasma clots was measured.
  • the samples showed a significant increase in the plasma clotting time (intrinsically).
  • PT prothrombin time, quick test
  • ⁇ OD C ⁇ D 60m in-OD5 min ] + FXa - [OD 6 0min- OD 5minJ'-FXa
  • a sample of the new protein was diluted in 100 ⁇ l plasma.
  • the coagulation was started by adding 50 ⁇ l of thrombin reagent (Boehringer / Ma, No. 126 594). The time until the occurrence of plasma clots was determined turbid etrically.
  • the evaluation was carried out using a calibration curve with known thrombin inhibitors (eg hirudin). The results obtained show that the new protein is a thrombin inhibitor. 6. Attempts to differentiate the new protein from hirudin
  • Microtiter plates (Flow 77-173-05) - streptavidin-peroxidase complex (Boehringer / Ma 1089153) Tetramethylbenzidin (Serva 35926)
  • Peroxidase substrate 0.1 ml TBM solution (42 mM TBM in DMSO) and 10 ml substrate buffer (0, Mix 1 M Na acetate pH 4.9) slowly; then add 14.7 ⁇ l 3% H2O2
  • Standard dilutions were applied and gave a linear dependence in the range of approx. 60 to 2 ng / ml.
  • Samples with unknown hirudin concentrations were used in parallel to the calibration sample in different dilutions in the test. An amount of hirudin corresponding to an activity of at most 5 ATU / ml could be detected in the measured samples.
  • the measurement of the TZ showed an antithrombin activity of 200 ATU / ml. This value was a factor> 40 above the value determined for hirudin by ELISA. This proves that the new protein is not hirudin.

Abstract

Es wird ein neues Protein aus Hirudo medicinalis, das die Gerinnungszeit des Blutes verlängert, relativ hitzestabil ist und ein Molekulargewicht von 25 bis 34 KDa besitzt, sowie dessen Muteine beschrieben, welches sich zur Behandlung von Krankenheiten eignet.

Description

Protein aus Hirudo medicinalis
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein aus dem Blutegel Hirudo medicinalis, dessen Muteine sowie deren Her¬ stellung und Verwendung.
Aus den Sekreten verschiedener Egel sind bereits eine Reihe medi- zinisch interessanter Faktoren beschrieben worden, die unter anderem bei der Koagulation des Blutes und der Fibrinolyse eine Rolle spielen. Zu diesen Faktoren gehören Fibrinolytika, die Fibrin oder Fibrinogen direkt abbauen, sowie Plas inogen- aktivatoren. Zu den Fibrin bzw. Fibrinogen abbauenden Substanzen gehören das Hementin (aus He enteria ghilianii) und die De- stabilase (aus Hirudo medicinalis; I.P. Baskova et al. Folia Hä atol., Leipzig, 115, 1988, S. 166). Ein Plasminogenaktivator wurde in Sekreten von Hementeria depressa beschrieben.
Weiter sind auch Inhibitoren der Blutgerinnung, z.B. der Throm- bininhibitor Hirudin (aus Hirudo medicinalis), ein Faktor Xa-In- hibitor (aus Hirudo medicinalis), Trypsin- und Plasmin- bzw. Chymotrypsin- und Elastaseinhibitoren wie z.B. das Bdellin bzw. Egline (aus Hirudo medicinalis) beschrieben (Leech Biology and Behavior, Vol. II, Oxford, Science Publication/R.T. Sawyer, 1986).
Es wurde nun ein neuer Faktor aus Hirudo medicinalis isoliert.
Gegenstand der Erfindung ist ein neues Protein aus Hirudo medi¬ cinalis, das die Gerinnungszeit des Blutes verlängert, relativ hitzestabil ist und ein Molekulargewicht von 25 bis 34 KDa be¬ sitzt, sowie dessen Muteine.
Das neue Protein verlängert die intrinsiche Gerinnungszeit (APTT) und die extrinsische Gerinnungszeit (PT) des Blutes deutlich. Es unterscheidet sich in seinen blutgerinnungshemmenden Eigen¬ schaften von Hirudin und dem Faktor Xa-Inhibitor. In Fraktionen, in denen die APTT verlängernde Aktivität vorhanden ist, können weder entsprechende Mengen Hirudin (durch ELISA) noch Faktor
Xa-Inhibitor-Aktivität (durch Farbsubstrat) nachgewiesen werden. Als Muteine des neuen Proteins sollen solche Proteine verstanden werden, die sich von dem neuen Protein durch Austausch, Deletion und/oder Addition von Aminosäuren oder Peptiden ableiten, ohne daß sich deren Eigenschaften stark vom neuen Protein unter- scheiden.
Das neue Protein läßt sich aus Blutegeln (Hirudo medicinalis) gewinnen. Hierzu werden die Egel in Wasser gegeben. Nach Stimulation mit Arginin geben die Blutegel den Faktor in die wäß- rige Lösung ab, aus der das neue Protein in bekannter Weise durch Ionenaustausch-, Affinitäts-, Chelat- und Gelpermeationschromato- graphie oder durch hydrophobe Chromatographie isoliert wird.
Man kann die Egel auch nach Argininstimulation punktieren und das neue Protein wie oben beschrieben aus dem Punktat isolieren.
Ebenso ist es möglich, das neue Protein aus dem Homogenat von Köpfen dekapitierter Egel in analoger Weise aufzureinigen.
Um das Protein für therapeutische Zwecke in größeren Mengen ver¬ fügbar zu machen, kann man bekannte gentechnische Methoden (vgl. Maniatis, T. et al ; Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989) anwenden. Hierzu wird das Protein zunächst in reiner Form hergestellt. Anschließend wird das Protein gespalten und die so erhaltenen Peptide über reversed phase HPLC (rHPLC) aufgetrennt. Von einigen dieser Peptide wird die Aminosäuresequenz bestimmt. Mit Oligonukleotiden, die aus den ermittelten Sequenzen abgeleitet werden, wird dann in einer c-DNA-Bank durch sequenzspezifische Filterhybridisierung das für das neue Protein kodierende Gen identifiziert. Die so erhaltene genetische Information kann man dann in verschiedenen Wirtzellen nach bekannten Methoden zur Expression bringen. Zu den Ex¬ pressionssystemen gehören einerseits Prokaryonten wie E. coli oder Bacillus subtilis, aber auch Eukaryonten wie Hefen und Säugerzellen (z.B. Cl27-Mausfibroblasten, Hamster-, Insekten¬ zellen) .
Das neue Protein und dessen Muteine eignen sich zur Behandlung von Krankheiten, insbesondere zur Behandlung und Prophylaxe thrombotischer Zustände. Be i sp i el
a) Gewinnung von Egelextrakt
Extrakte aus Hirudo medicinalis wurden nach folgenden Ver¬ fahren erhalten:
1. Egel wurden 75 min mit einer 10 mM Arginin-Lösung behandelt. In dieser Zeit nahm die Lösung durch die Sekretionstätigkeit der Egel eine gelbliche Farbe an.
Nach Austausch der Flüssigkeit gegen Wasser sezernierten die Egel weiter.
2. Egel, die gemäß 1. mit Arginin behandelt worden waren, wurden punktiert und der Mageninhalt gewonnen.
b) Reinigung des neuen Proteins.
Die gemäß a) erhaltenen Flüssigkeiten wurden einzeln oder zusammen 10 min auf 90°C erhitzt und anschließend sofort auf Eis abgekühlt. Nach der Zentrifugation (20 min, 10.000 rpm, Sorvall® SA 600-Rotor) wurde der überstand zunächst 1:2 bis 1:5 mit PBS verdünnt. Der pH-Wert wurde auf 7,4 eingestellt. Danach wurde die Lösung auf eine mit PBS äquilibrierte
Q-Sepharose®-Säule (10 ml, Pharmacia, Schweden) aufgetragen. Nach dem Wegwaschen nicht-gebundenen Materials wurde die Säule mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % Puffer A (PBS + 1 M NaCl) eluiert. Aliquots der Fraktionen wurden auf APTT-Verlängerung getestet. Der neue Faktor eluierte unter diesen Bedingungen zwischen 0,3 M und 0,5 M NaCl.
Aktivität enthaltende Fraktionen wurden vereinigt, 1:2 mit 20 mM Phosphatpuffer, 250 mM NaCl pH 7,0 verdünnt und auf eine Cu-Chelat-Säule (1 ml) aufgetragen. Nach dem Spülen mit 10 bis 15 Säulenvolumen Äquilibrierungspuffer (20 mM NaPhosphat, 250 mM NaCl pH 7,0) erfolgte die Elution durch Anlegen eines linearen Gradienten von 0 bis 100 % Puffer B (20 mM Bernsteinsäure, 1 M NaCl pH 4,0). Die Säule wurde anschließend entweder mit 20 mM Phosphat, 2 M NaCl, 10 mM EDTA, pH 7 oder mit 20 mM Bernsteinsäure 2 M NaCl, 100 M Histidin pH 4 nacheluiert. Aliquots einzelner Fraktionen wurden auf APTT-Verlängerung getestet, Aktivität enthaltende Fraktionen vereinigt und über Centricon® 10 (A icon, Best. Nr. 4206) aufkonzentriert, auf PBS umgepuffert und auf einer FPLC-Gelfilrationssäule (Superose® 12, Pharmacia) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min weiter aufgereinigt.
Die Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und auf eine mit PBS äquilibrierte Mono Sepharose® (Pharmacia, Schweden) aufgetragen. Von der Mono Q-Säule erfolgte die Elution entweder mit einem pH-Gradienten (0 bis 100 % B, Puffer B = 20 M Bernsteinsäure 1 M NaCl pH 4) oder mit einem Salzgradienten (0 bis 100 % Puffer A).
S-Sepharose®-Chromatographie
Zur weiteren Reinigung des neuen Faktors wurde eine Chromatographie an S-Sepharose® (LKB, Pharmacia) durchgeführt. Dazu werden die Wertfraktionen der Q-Sepharose bzw. Cu-Chelat-Chromatographie zunächst mit Hilfe einer Konzentrierungskammer (Amicon, YM 10 Membran) bei pH 4 bzw. 7 auf onzentriert und durch wiederholtes Auffüllen und Konzentrieren entsalzt.
Nach dem letzten Schritt wurden die Konzentrate auf 20 mM Bernsteinsäure pH 2,5 (Endkonzentration) verdünnt und auf eine mit 20 mM Bernsteinsäure pH 2,5 äquilibrierte S-Sepha- rose-Säule® aufgetragen. Durch Elution mit 30 mM Bernstein¬ säure pH 4,5 wurde evtl. vorhandenes Hirudin abgetrennt. Die Elution des neuen Faktor? erfolgte durch Anlegen eines Puffergradienten nach PE pH 7,5. In den Wertfraktionen der S-Sepharose wurde ein pH-Wert von 5,5 - 7 gemessen. Die Aktivität (Thrombin-Inhibition) enthaltenden Fraktionen wurden weiterhin in einem Hirudin-Elisa (s. Beispiel 6a) getestet. Fraktionen, die die APTT verlängern und im Hirudin-Elisa negativ waren, wurden vereinigt, aufkonzen¬ triert, zur Trockne eingedampft, in Ammoniumacetat pH 6 aufgenommen und durch rHPLC an einer C-4 Phase (rp 304® Bio-Rad) weiter aufgereinigt. Reversed Phase HPLC (rHPLC)
Die Thrombin-Inhibition aufweisenden Fraktionen der S-Sepharose®-Chromatographie wurden über reversed phase HPLC an einer Bio-RAD rp304®-Säule mit einem 20 M Ammonium- acetat, pH 6, 20 M Ammoniumacetat, 50 % Acetonitri 1-System weiter aufgereinigt. Dazu wurden die Wertfraktionen auf ein Volumen von 200 bis 500 μl konzentriert und durch Anlegen eines Acetonitrilgradienten von der rHPLC eluiert. Der neue Faktor elusiert bei einer Acetonitri Ikonzentration von 7,5 % +_ 3 %. Die Aktivität des neuen Thrombininbibitors bleibt erhalten und kann durch Tricin-SDS-Polyacrylamid Gel-Elektrophorese oder APTT-Bestimmung nachgewiesen werden.
c) Charakterisierung des neuen Proteins
1. Temperaturstabilität
Ein Aliquot des neuen Faktors wurde 10 min auf 95°C erhitzt und danach sofort auf Eis abgekühlt. Die Aktivität wurde durch Messung der Hemmung der APTT bestimmt. Durch die Hitzebehandlung nahm die Aktivität um etwa 10 % ab.
2. Lösungsmittelstabilität
Ein Aliquot der Aktivität enthaltenden Proben wurde bei Raumtemperatur mit 50 % Acetonitril in 20 M Ammoniumacetat pH 6,0 versetzt und 30 min inkubiert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde der Einfluß der Proben auf die APTT analysiert. Es zeigte sich, daß der neue Faktor in seiner Aktivität durch Acetonitril nicht beeinflußt wird.
3. Proteinnatur
Ein Aliquot des neuen Faktors wurde mit 10 μg Trypsin 16 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch 5 min Kochen und sofortiges Abkühlen mit Eis gestoppt und danach der Einfluß der Probe auf die Hemmung der APTT bestimmt. Ebenso wurde mit einer Kontrollprobe verfahren, die nicht mit Trypsin aber sonst gleich behandelt worden war. Die Ergeb¬ nisse zeigen, daß nach Inkubation mit Trypsin die Aktivität des Faktors verschwindet, was seine Proteinnatur beweist. 4. Molekulargewicht
a) Das Molekulargewicht des neuen Proteins wurde mit Hilfe von Membranen definierter Porengröße eingegrenzt. Dazu wurden Fraktionen, die das neue Protein enthielten, mit Puffer (PBS pH 7,2 bzw. 20 mM Bernsteinsäure pH 4) verdünnt, in einen Centricon® Mikrokonzentrator (10 bzw. 30 kDa Ausschlu߬ grenze) gegeben und 60 min bei 5000 x g zentrifugiert. Die Durchläufe der Membranen wurden in einem Speed Vac Konzen- trator zur Trockne eingeengt, in PBS resuspendiert und eben¬ so wie die Retentate der Membranen in der APTT vermessen.
Bei beiden pH-Werten ließ sich das neue Protein durch Centricon® 10, nicht aber durch Centricon® 30 konzentrieren. Das bedeutet, daß das neue Protein ein Molekulargewicht zwischen 10 und 30 kDA besitzen muß.
b) Das Molekulargewicht wurde weiter auf einer kalibrierten Gelfiltrationssäule (Superose® 12) bestimmt. Als Laufmittel diente dabei PBS bei einem Fluß von 0,3 ml/min. Es wurden
Fraktionen von 150 μl fraktioniert und auf APTT-Verlängerung getestet. Das Aktivitätsmaximum wurde unter diesen Bedin¬ gungen in einem Bereich von 25 kDa bis 34 kDa bestimmt.
c) Bestimmung des Molekulargewichtes durch Tricin-SDS-Poly- acrylamid Gel Elektrophorese
Die Gelelektrophorese wurde entsprechend der Vorschrift (Schägger, H. and von Jagow, G.; Analytical Biochemistry, 166, 368-379 (1987) bei 20 A und 1400 V, 30 W, mit einem Stromversorger der Firma LKB und einer Laufkammer des "mighty s all System" durchgeführt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel zunächst für 30 min in einer 2,5 %igen Lösung aus Triton X100 inkubiert und dann auf eine Thrombin und Fibrinogen haltige Agarose-Platte 2 mal
20 Minuten aufgelegt. Die Thrombinkonzentration in der Agarose war dabei so eingestellt, daß binnen 2 bis 4 Stunden eine Polymerisation des Fibrinogens unter der Wirkung des Thrombins stattfand. Die Anwesenheit des neuen Thrombin- inhibitors wurde durch unpolymerisierte Stellen in der
Agarose angezeigt. Durch Färben des Molekulargewichtsmarkers (Eichproteine: Intaktes Myoglobin 17,2 kDA, Bromcyanpeptid Myoglobin I + Uli 14,6 kDa, Bromcyanpeptid Myoglobin I 8,2 kDa, Bromcyanpeptid Myoglobin II 6,4 kDa, Bromcyanpeptid Myoglobin III 2,6 kDa, Myoglobin 1-14) wurde das Molekular¬ gewicht des neuen Thrombininhibitors mit 14, 6 +_ 3 kDa bestimmt.
5. Angriffspunkt des neuen Proteins in der Koagulationskaskade
Der neue Faktor wurde in verschiedenen Assaysystemen ge- testet um festzustellen, wie und welche Faktoren in der Koagulations as(ade er inhibiert.
a) APTT (*** aktivierte partielle Thromboplastinzeit) zum Nach¬ weis einer antikoagulatorischen Aktivität in der intrinsi- sehen Gerinnungskaskade.
Zu testende Proben wurden in 50 μl humanem Plasma (z.B. Preciclot®, Boehringer/Ma, Nr. 654 370) verdünnt. Dazu wurden 50 μl PTTa-Reagenz (Boehringer/Ma, Nr. 886 050) pipettiert und 5 min bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 50 μl 25 mM CaCl wurde die Gerinnungskaskade gestartet. Gemessen wurde die Zeit bis zum Auftreten von Plasma¬ gerinnseln.
Die Proben zeigten eine signifikante Verlängerung der Plasmagerinnungszeit (intrinsisch) .
b) PT (= Prothrombinzeit, Quick-Test) zum Nachweis einer antikoagulatorischen Wirkung auf die extrinsische Gerinnungskaskade.
Proben wurden in 100 μl humanem Plasma (z.B. Preciclot®, Boehringer/Ma, Nr. 654 370) verdünnt. Dazu wurden 100 μl Thromboplastin (1:1 mit NaCl 0, 9 % verdünnt) pipettiert. Mit 50 μl 25 mM CaCl2 wurde die Gerinnungskaskade gestartet. Gemessen wurde die Zeit bis zum Auftreten von Plasma¬ gerinnseln. Die Proben zeigten eine signifikante Ver¬ längerung der Plasmagerinnungszeit (extrinsisch) . c) FXa-Inhibitionstest zur Differenzierung von FXa-lnhibitor
Proben (verdünnt in PBS) wurden mit Faktor Xa (FXa) und einem spezifischen chromogenen Substrat für FXa 60 min bei Raumtemperatur inkubiert:
25 μl Probe
50 μl FXa (Boehringer/Ma, Nr. 602 388, 0,025 U/ml) 100 μl S-2222-Farbsubstrat (Kabi-Vitrum, 16,9 ml H20/vial) Nach 5 min wurde die optische Dichte bei 405 nm erstmals gemessen. Nach 60 min wurde die Reaktion mit 50 μl Eisessig gestoppt und die optische Dichte bei 405 nm erneut gemessen.
Als Kontrollen dienen Ansätze ohne FXa sowie Proben ohne Inhibitor. Für die Auswertung wurde ein Δ OD405 40' nach folgender Formel errechnet:
Δ OD = CθD60min-OD5min]+FXa - [OD60min-OD5minJ'-FXa
(Differenz der Extinktionsänderung mit und ohne FXa).
Aus entsprechenden Ansätzen mit und ohne Inhibitor ergibt sich der Grad der Inhibition von FXa (in %) durch
Δ 0D+Inhibitor
% Inhibition = x 100
Δ 0D-lnhibitor
d) Thrombin-Zeit
Eine Probe des neuen Proteins wurde in 100 μl Plasma ver¬ dünnt. Durch Zugabe von 50 μl Thrombin-Reagenz (Boehringer/Ma, Nr. 126 594) wurde die Gerinnung gestartet. Die Zeit bis zum Auftreten von Plasmagerinnseln wurde turbi- do etrisch bestimmt.
Die Auswertung erfolgte anhand einer Eichkurve mit bekannten Thrombin-Inhibitoren (z.B. Hirudin). Die erhaltenen Ergeb- nisse zeigen, daß das neue Protein ein Thrombin-Inhibitor ist. 6. Versuche zur Abgrenzung des neuen Proteins gegen Hirudin
a) Fraktionen des neuen Proteins, die eine APTT-Verlängerung entsprechend 2500 ATU zeigten, wurden in einen Hirudin-ELISA eingeschleust:
Material:
Microtiterplatten (Flow 77-173-05) - Streptavidin-Peroxidase-Ko plex (Boehringer/Ma 1089153) Tetramethylbenzidin (Serva 35926) Peroxidasesubstrat: 0,1 ml TBM-Lösung (42 mM TBM in DMSO) und 10 ml Substratpuffer (0,1 M Na-acetat pH 4,9) langsam mischen; dann Zusatz von 14,7 μl 3 % H2O2
Vorgehen:
Microtiterplatten beschichten mit 0,2 ml/well Hirudin
(1 μg/ml, in 0,1 M NaHC03, pH 8,3) - Absättigen mit 1% BSA/PBS; 0,3 ml/well
3 x Waschen mit 0,05 % Tween 20/PBS
12 Standardverdünnungen von Hirudin, angefangen mit
500 ng/ l 0, 1 % BSA/PBS in 2er Schritten, davon je
0,1 ml/well; dann Zusatz von 0,1 ml/well poly-anti-Hirudin (1 μg/ml 0,1 % BSA/PBS) und
Inkubation über Nacht/4°C
Waschen wie oben
0,2 ml/well biotinylierter anti-Kaninchen-IgG-Anti- körper (1:5000) 2 h bei Raumtemperatur - Waschen wie oben
0,2 ml/well Streptavidin-Peroxidase-Komplex (1:10000);
30 min bei Raumtemperatur
Waschen wie oben
0,1 ml/well Peroxidasesubstrat - Reaktion stoppen mit 0,1 ml/well 2 M H2Sθ
Messung der Absorption bei 450 nm
Auswertung:
Die erhaltenen OD-Werte wurden gegen den Logarithmus der
Standardverdünnungen aufgetragen und ergaben im Bereich von ca. 60 bis 2 ng/ml eine lineare Abhängigkeit. Proben mit unbekannter Hirudinkonzentration setzte man parallel zur Eichprobe in unterschiedlichen Verdünnungen im Test ein. In den gemessenen Proben konnte eine Hirudinmenge nachgewiesen werden, die einer Aktivität von maximal 5 ATU/ml entspricht.
b) Thrombin-Zeit (= TZ)
Bei der Analyse des neuen Proteins ergab die Messung der TZ eine Antithrombin-Aktivität von 200 ATU/ml. Dieser Wert lag um den Faktor > 40 über dem nach ELISA für Hirudin er¬ mittelten Wert. Das beweist, daß das neue Protein nicht Hirudin ist.
c) Aufkonzentrierung
Es wurde versucht, Hirudin mit Hilfe von Centricon® Membranen bei p und 7 zu konzentrieren. Hirudin wurde durch die Centricon® 10-Memb nicht zurückgehalten. Das neue Protein wird unter diesen Bedingunge von der Membran zurückgehalten (vgl. 4a).

Claims

Patentanspruch
Protein aus Hirudo medicinalis, das die Gerinnungszeit des Blutes verlängert, relativ hitzestabil ist und ein Molekulargewicht von 25 bis 34 KDa besitzt, sowie dessen Muteine.
PCT/EP1991/001856 1990-10-06 1991-09-27 Protein aus hirudo medicinalis WO1992006118A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

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DEP4031731.5 1990-10-06
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0209061A2 (de) * 1985-07-17 1987-01-21 Hoechst Aktiengesellschaft Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel

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EP0209061A2 (de) * 1985-07-17 1987-01-21 Hoechst Aktiengesellschaft Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel

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