WO1988000618A1 - Method of inspecting specimen for bacteria and probe therefor - Google Patents

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WO1988000618A1
WO1988000618A1 PCT/JP1987/000486 JP8700486W WO8800618A1 WO 1988000618 A1 WO1988000618 A1 WO 1988000618A1 JP 8700486 W JP8700486 W JP 8700486W WO 8800618 A1 WO8800618 A1 WO 8800618A1
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bacteria
rna
complementary
gram
probe
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PCT/JP1987/000486
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Inventor
Takafumi Uchida
Shuntaro Hosaka
Kumiko Miura
Original Assignee
Toray Industries, Inc.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for examining bacteria in a specimen derived from an organism such as a human, an animal, a plant, and a probe therefor.
  • bacterial infections are suspected when a patient develops high fever, has too many leukocytes in the blood, or has an abnormally high number of leukocytes (undifferentiated leukocytes, leukocytes with toxic granules). It is important to test for the presence of bacterial infections, because the treatment may vary depending on the etiology, as high maturity and an increase in white blood cells may occur depending on the cause of i.
  • Bacteremia and sepsis are typical diseases that require a test for bacteria in the blood Bacteremia is a group of symptoms in which bacteria are present in the blood. Sepsis is a form of foci in the body from which the pathogens constantly or periodically emerge in the bloodstream. The resulting series of clinical features.
  • Bacteria enter the bloodstream at certain times due to localized infections, such as typhoid fever, typhoid, typhoid fever, brucellosis, tularemia, anthrax, pneumonia, meningitis, cholecystitis, pyelonephritis, etc. Strewn And may transition from bacteremia to sepsis-in some cases.
  • typhoid fever typhoid, typhoid fever, brucellosis, tularemia, anthrax, pneumonia, meningitis, cholecystitis, pyelonephritis, etc.
  • Strewn And may transition from bacteremia to sepsis-in some cases.
  • bacteria are suspected to be present in the blood, patients are often severe, and detection of the bacteria is an essential test for proper diagnosis and treatment.
  • Another important sample that needs a bacterial test is urine.
  • urinary tract infections such as renal pelvic nephritis and cystitis
  • bacteria in the urine are tested.
  • Bacteria are also present in the urine of healthy subjects, but if the number of bacteria is 1 Zml or more, it is diagnosed that urinary tract infection has occurred, and if it is 1 ⁇ 3 Zml or less, it is determined to be normal . For during the intermediate region i.e. 1 0 3 ZML and 1 0 5 Zml, it determines the presence or absence of infection by performing more detailed Ken ⁇ .
  • specimens collected from living bodies such as feces, stalks, sputum, and mucous scrapes
  • foods and drinks such as milk and meat. Has been inspected.
  • the first problem is that dead bacteria in blood cannot be detected.
  • bacteria form lesions in localized areas of the body, so that viable bacteria that can be detected by the culture method do not appear in the bloodstream.
  • phagocytic cells such as neutrophils, nest cells, and macrophages accumulate in the lesion, and phagocytose and kill bacteria, so most of the bacteria present in the bloodstream are killed or phagocytic. It is a phagocytosed bacterium. This indicates that conventional culture methods cannot detect bacteria in the bloodstream or in the focus of a living body, and that a positive specimen may be judged to be negative.
  • the second problem is basically the same as the first, but cannot be tested after treatment with chemotherapeutic drugs such as antibiotics.
  • chemotherapeutic drugs such as antibiotics.
  • the administration of chemotherapeutic agents almost completely kills the bacteria present in the bloodstream, making the culture apparently undetectable.
  • the third problem is that it takes a long time to get results is there. In culture methods, it usually takes several days to obtain results. However, patients undergoing this test often have serious medical conditions and require immediate treatment. Therefore, reducing the time required to obtain test results is therapeutically important.
  • the fourth problem is that, although the suitable medium varies depending on the type of bacteria, the culture method involves culturing on two general types of media (for aerobic bacteria and for anaerobic bacteria), so all bacteria are detected.
  • the fifth problem is that the culture method cannot quantify the number of bacteria.
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned drawbacks of the conventional method and to quantitatively detect almost all kinds of dead bacteria in bloodstream and almost all kinds of bacteria poorly phagocytic by phagocytes in a short period of time.
  • the present invention provides for rapid detection or identification without cultivation, or with cultivation for enrichment or isolation.
  • the purpose of this test is to reduce the period of bacterial testing by performing the test without culturing.
  • the DNA or RNA probe having a base sequence complementary to the ribosomal RNA of Escherichia coli also hybridizes with the ribosomal RNA of bacteria other than Escherichia coli (DNA.RNA with a DNA probe, RNA.RNA with an RNA probe). Is not hybridized with human ribosomal RNA, and the structure is as follows.
  • the present invention provides a method for preparing a sample using a probe prepared by labeling a DNA or RNA containing a nucleotide sequence complementary to at least 12 continuous nucleotide sequences of ribosomal RNA of Escherichia coli with a labeling substance. This is a method of testing bacteria in the inside.
  • the Escherichia coli ribosome RNA used in the present invention is a DNA containing a nucleotide sequence complementary to at least 12 consecutive nucleotide sequences (hereinafter abbreviated as a complementary nucleotide sequence) of RNA, or RNA of Escherichia coli liposome as RNA. Any nucleotide sequence may be used as long as it is a sequence that hybridizes with RNA and does not hybridize with human ribosomal RNA.
  • the total nucleotide sequence of Escherichia coli ribosomal RNA is described, for example, in J. Brosius et al. (148.107-127 (1981) in J. M0 and Bio), and the total number of bases is about 750 °. is there.
  • the DNA containing the complementary nucleotide sequence is the chromosomal DN of E. coli. A may be cleaved with an appropriate restriction enzyme and a fragment thereof may be used, or a fragment produced by chemical synthesis may be used.
  • DNA comprising the complementary nucleotide sequence obtained as this is also possible Continued use, the plasmid (PBR 3 2 2, PUC 1 8, such as PUC 1 9> and phage (M 13)
  • the complementary base sequence may be any number as long as it is 12 or more, and may be complementary to the entire base sequence of Escherichia coli ribosome RA.
  • DNA or RNA containing the complementary base sequence may be: In order to detect bacteria with high sensitivity, it is necessary to increase the amount of labeling substance to be introduced into the probe, so the chain length is preferably at least 5 ⁇ base, usually up to 15 K bases. Is used.
  • the gram-negative bacteria and the gram-positive bacteria can be divided into groups.
  • E. coli Esscherichia coli
  • enteropa Kuta. Croca (Entero bacter cloacae). Mouth Teus' Bulgaris (Proteus vulgaris), Proteus mirabilis (Proteus mirabilis).
  • Proteus ⁇ Shigeroides Proteus shigel! Oides
  • Serratia marescens Serrati marcescen s
  • Yersinia pestis Typhoid bacteria
  • RNA probe 5 AGC UUAAC UUC U GUGUUC GGC AUGG 3 '
  • DNA or RNA having at least 12 continuous base sequences in the above base sequence and labeled with a labeling agent may be used.
  • detecting bacteria a mixture of the above-mentioned probe for gram-negative bacteria and probe for gram-positive bacteria may be used.
  • a DNA probe is more preferable because of the stability of the reagent and the potential of both DNA and RNA.
  • the labeling substance of the present invention refers to a labeling agent such as a fluorescent agent, a chemiluminescent agent, a radioisotope, an enzyme, or a labeling agent such as a biotin, a dinitrophenyl group, a sulfonyl group, or a ligand such as a hapten and avidin or an antibody. It is a substance that can bind.
  • the DNA or RNA containing the complementary base sequence of the present invention can be labeled with a labeling substance by a nick translation method, a phototopin method, or a phosphokinase. It is possible to perform the ends with 2 P in a conventional manner, such as methods of labeling.
  • the sample of the present invention is a sample derived from an organism such as a human, an animal, or a plant that requires a bacterial test.
  • an organism such as a human, an animal, or a plant that requires a bacterial test.
  • Puncture fluid refers to fluid collected by puncture, such as pleural effusion, ascites fluid, synovial fluid, and cerebrospinal fluid.
  • the feature of the method for detecting bacteria according to the present invention lies in the application of molecular biological techniques. '
  • the cells (red blood cells, white blood cells, etc.) in the sample collected from the living body are lysed.
  • Dissolution can be by any common technique, such as changing the PH ionic strength or adding a surfactant.
  • a surfactant such as sodium dodecyl sulfate because the dissolving operation is performed in a short time and the amount of the solution after the dissolution is not significantly increased.
  • a part of the liposome RNA in the bacteria is eluted.
  • the eluted ribosome RNA is a membrane or polymer such as nitrocellulose and nylon. It may be fixed to particles.
  • the fixing method may be any of physical adsorption, ionic bonding, and covalent bonding.
  • physical adsorption is performed on the membrane, it is preferable that baking is performed at a temperature of about 8 (TC) after fixation so that the membrane is not released from the membrane in a later operation.
  • RNA or RNA probe having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the bacterial liposome RNA described above is added to the free or fixed bacterial ribosomal RNA extracted from the sample as described above and hybridized. . Free probe remaining without hybridization is removed. When the ribosomal RNA is immobilized on the membrane, the free probe can be removed by washing. In the case of a reaction in a solution, separation can be performed by electrophoresis or the like.
  • the amount of labeled substance of the hybridized probe After separation, measure the amount of labeled substance of the hybridized probe.
  • the labeling substance When the labeling substance is isotope, it can be measured with a scintillation counter or Geiger counter, or it can be measured by exposing the film.
  • the labeling agent is biotin or haten, the amount of ribosome RNA can be measured by further reacting the enzyme with avidin or an antibody on which the enzyme is immobilized, and then measuring the activity of the enzyme.
  • bacteria can be detected using only one or several probes. Moreover, by quantifying the labeling agent, it is possible to quantify the number of bacteria. (2) Because it is a method for detecting ribosomal RNA, not only live bacteria but also dead bacteria can be detected. You can go out. In addition, even if the bacteria are damaged by an operation such as destruction of phagocytes, the bacteria can be detected. Therefore, according to the method of the present invention, bacteria may be detected from a sample in which no bacteria were detected by the conventional culture method. Phagocytic cells phagocytose a large number of bacteria, and the amount of specimen can be reduced if bacteria inside the phagocytes can be detected. (3) Detects large amounts of ribosomes in bacterial cells.
  • Ribosome amount is thus likely to change in the state of the cells, but usually 1 0 ⁇ ⁇ : present around L 0 4 copies / "bacteria, therefore, the method makes it possible to increase the detection ⁇ , S 'Since the time required for detection can be reduced, it is easy to use the detection results for treatment.
  • Example 1 Example 1
  • Escherichia coli 16 S By 23 23 S ribosomal RA (Boehrger) was serially diluted 10-fold with TE buffer (10 mM Tris-hydrochloride, 1 EDTA-pH 8.0). This was adsorbed on a cationic nylon membrane (PaH, "Biodyne B") using a suction filtration device (Mini Holder from Sch! Ecifer S Schueli) The membrane was heated at 8 CTC for 2 hours. Liposomal RX A was immobilized on the membrane B.
  • the membrane consists of 5 XSSPE (0.9 M NaCl, 5 (pH 7.8 mM sodium phosphate buffer containing 1 M EDTA 1 ⁇ ⁇ mM), 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 4% formamide, 0.1 lg / ml BSA, 0.1 g Zml ficoll, 0.1 g Zml polyvinylpyrrolidone, 0.1 mff / ml mature sperm DNA after 4 2 ° C 3 hours Inkyube Ichito at Ipuri head forming solution, transferred to a new hybrid formed solution was ripe denatured 32 P-label the DNA probe 1 0 6 cpm / m i The membrane was incubated for 1 ⁇ at 42 ° C. The membrane was made ⁇ 2 XSSC containing 1% SDS (30 mH sodium citrate containing 0.3 M NaCl) ⁇ 42 ° C After washing twice for 2 minutes and air-drying, auto
  • the detection limit was 2.6 X 1 ⁇ " 15 mo! For 22 hours of glare.
  • JCM 1 649 Immobilization of bacterial ribosomal RNA on membrane, ⁇ ⁇ col i (JCM 1 649), Enterobacter cloacae (JCM 1 2 3 2), Klebsiel la pneum and rH ae (JCM 1662) obtained from RIKEN ), Proteus vulgaris (JCM1668), Serratia marcescens (JCM1239) .Pseudomonas ae ⁇ ug inosa (JcM9776), 6 strains of Gram-negative bacteria and Staphylococcus aureus (JCM2413), Streptococcus faecal is after the gram-positive bacteria 2 strains (J c M 2 87 5) were 1 ⁇ culture.
  • each 1 0 nine bacteria were suspended in water 1 ml, centrifuged (1 0, 00 0 rpm, 5 minutes, The same applies to the following), and the supernatant was discarded.
  • the remaining cells were suspended in about 2 ° of water, and the lysed enzyme solution (5. N-Acetylmuramidase, 0.5 mg Zrnl lysipeptidase, 1 mM Tris, hydrochloride, pH 8. ⁇ were added, and the mixture was incubated at 37 C for 15 minutes. Further, the mixture was added to 400 TE buffer, 400 mL of TEA buffer saturated phenol was added, mixed, and incubated at 65 ° C for 15 minutes.
  • Table 1 shows the results obtained in the same manner as in Example 1.
  • Streptococcus faecal is
  • Gram-negative bacteria to a complementary D Isuzu A probe I (5 GTT TC AC TTC TGAGTTC GG) and Guwomu positive bacteria to a complementary DNA probe 2 (5 AGCTTAACT TC TGTGTTC G) are each 70 HIM tris' hydrochloride ( PH 7. 6>, I 0 OlM magnesium chloride, 5 Jichio sley preparative Ichiru IM (r - 32 P) ATP in a solution comprising (Amersham Corp.) 500 teeth 7 Z ml of T 4 Polynucleotide kin -Ichino
  • reaction was carried out at 37 X: for 30 minutes using ase (Takara Shuzo), and its 5 'end was labeled with ⁇ 2 ⁇ -.
  • Pseudmonas aeruginosa '-Gram Stephylococcus aureus'-
  • Streptococcus faecal is one Example 5
  • Probes 1 and 2 did not form a hybrid with a whole blood sample treated in the same manner without adding bacteria. Table 3
  • the test method and probe according to the present invention can (1) enable detection of bacteria engulfed by dead bacteria / phagocytic cells, (2) reduce the test time from several days to less than one day, (3) (4) Use of ribosome RNA, which is abundant in quantity, as a substance of the cells, This method has the advantages that it can be increased and the sample volume can be reduced, and is extremely useful for detecting bacteria in biological samples such as blood, puncture fluid, and urine.

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Description

- 明 細 書 - 細菌を検査する方法およびそのためのプローブ
技 術 分 野
本発明はヒ ト、 動物、 植物等生物に由来する検体中の 細菌を検査する方法およびそのためのプロ一ブに関する， 背 景 技 術
一般に患者が高熱を発したり、 血中の白血球が增多し たり、 異常な白血球 （未分化の白血球、 中毒顆粒を有す る白血球〉 が増多したりすると、 細菌による感染が疑わ れる。 しかし別の原因によって高熟を発したり、 白血球 が増多することもあり、 当然病因によって治療法が異な るので、 細菌感染の有無を検査す,ることは重要である i 重要な検体の一つは.血液である。 血液中の細菌を検査 する必要のある疾患と して代表的なものに、 菌血症と敗 血症がある。 菌血症とは、 細菌が血液中に存在する症候 群であって、 血液中に一過性に菌が入っている状態も含 まれる。 敗血症は体内にひとつの病巣ができ、 そこから 絶えず、 あるいは周期的に血流中に病原菌が出ていき、 その結果生じた一連の臨床像をいう。 敗血症は著しい臨 床症状を伴う難治性の感染症であって、 通常、 急性の経 過をとる。 一般に、 悪性腫瘍、 血液疾患、 肝 ■ 胆道疾患 などの基礎疾患に続発する場合が多い。 菌血症は、 限局 性感染症、 例えば腸チフス、 ノ、'ラチフス、 ブルセラ症、 野兎病、 炭疽、 肺炎、 髓膜炎、 胆ク）う炎、 腎盂腎炎など で一定の時期に細菌が血流中に入り、 全身にばらまかれ る症状のことであり、 菌血症から敗血症に移行する場合 - もある。 血液中に細菌の存在が疑われる場合、 患者は重 篱であることが多く、 菌の検出は適切な診断、 治療を行 う うえで不可欠な検査である。
現在、 血液および穿刺液中の菌の検出は培養検査法 (好気および嫌気培養） によって行われている。 すなわ ち、 無菌的に採取した血液を好気または嫌気培養液と混 合して、 培養瓶中で 3 7 Cで数日培養した後に菌の有無 を判定する検査法である。 寒天培地での培養を行い菌数 を測定する方法もあるが、 現在はほとんど用いられてい ない。 最近、 細菌に対する抗体を作製して、 抗原 · 抗体 反応によって細菌を検出することも試みられている。
また細菌検査が必要な別の検体として重要なものに尿 がある。 腎孟腎炎および膀胱炎などの尿路感染症では尿 中の細菌が検査対象となる。 健常者の尿中にも細菌は存 在するが、 細菌数が 1 Zml以上の場合には、 尿路惑 染を起していると診断され、 1 ◦ 3 Zml以下ならば正常 と判定される。 中間域すなわち 1 0 3 Zmlと 1 0 5 Zml の間の場合は、 さらに詳細な検查を行って感染の有無を 判定する。 細菌数の測定は、 培養法を標準とするが、 1 0 5 Zml以上で陽性と判定される簡易スクリ一二ング 法としては、 亜硝酸塩法 （Gr i ess試験） 、 ブドウ糖酸化 酵素法、 テ卜ラゾリゥム還元法、 カタラーゼ法、 A T P 測定法、 N i t r i te- E sterase法などの化学的検査法がある。 また、 菌の同定は分離培養を行った後、 鑑別培養するこ とによって行う。
その他細菌検査が必要な検体と して主要なものには、 糞便、 臈、 喀痰、 粘膜擦過物など生体から採取した検体、 牛乳および食肉などの飲食物があるが、 いずれの場合も ほとんど培養によって検査されている。
従来の培養法により血液中の細菌を検査する方法には. 以下の 5つの問題点がある。 第一の問題点は、 血液中の 死菌を検出できないことである。 ところが、 細菌は生体 の限局された部位に病巣をつくっているので、 培養法で 検出できる生菌は血流中にあま り出てこない。 しかも、 病巣部には好中球、 巣球、 マクロファージなどの食細胞 が集積して、 細菌を貧食して殺菌するので、 血流中に存 在する菌のほとんどは死菌もしくは、 食細胞に貪食され た菌である。 このことは従来の培養による検査法では、 血流中または生体の病巣部の細菌を検出できず、 陽性の 検体も陰性と判定されることがあることを示している。 死菌が検出されるならば、 生菌の存在の可能性を予測す ることができるであろうから、 死菌の検出ができないこ とは大きな問題につながる。 第二の問題点は、 第一の問 題点と基本的に同様であるが、 抗生物質などの化学療法 剤などの治療を行なった後では検査できないことである。 化学療法剤を投与することで血流中に存在する細菌はほ ぼ死滅してしまって、 培養法では見かけ上、 細菌が検出 されなくなってしまうからである。
第三の問題点は結果を得るのに長時間を要することで ある。 培養法では通常結果を得るのに数日を要する。 し かし、 本検査受ける患者は重篤な病状であることも多く、 早急な治療が必要である。 したがって、 検査結果を得る のに必要な時間を短縮することは治療上重要である。 第 四の問題点は、 菌の種類によって適した培地は異なるの に、 培養法では一般的な 2種類の培地 （好気性菌用と嫌 気性菌用〉 で培養するので、 全ての菌を検出することは できないことである。 第五の問題点は、 培養法では菌数 の定量ができないことである。
これらの欠点を改善する目的で、 細菌に対する抗体を 作製して抗原抗体反応で菌を検出することも試みられて いる。 しかし、 多種の細菌に対する共通の抗体を作製す ることは困難で、 実用的にはなっていない。
本発明は、 以上の従来'法の欠点を解消し、 血流中の死 菌ゃ食細胞に貧食されている細菌のほとんど全種類を短 期間に定量的に検出することを目的とする。
また血液以外の検体の場合も、 培養のみに頼る従来の 細菌検查法は同様な問題点を抱えている。 食細胞による 貪食は、 血液中の場合に比較して輊度の場合もあるが、 抗生物質などの化学療法剤使用後には細菌を培養によつ て検出し難いという問題は全ての検体に共通である。 ま た菌種の同定まで培養のみによって行う場合には、 結果 を得るまでに回数がかかる。
本発明は培養なしで迅速に検出または同定するか、 あ るいは増菌または分離には培養を併用するにしても、 同 定は培養せずに行うことにより、 細菌検査期間を短縮す ることを目的とする。
発 明 の 開 示
本発明は、 大腸菌のリボゾーム RN Aと相補な塩基配 列を有する D N Aまたは RN Aプロ一ブが大腸菌以外の 細菌のリボゾーム R N Aともハイプリダイズする （ D N Aプローブでは D N A . RNA、 RNAプローブでは R N A . RNAの 2本鎖を形成する〉 がヒ トのリボゾーム RN Aとはハイブリダィズしないことを見い出したこと に基づく ものであって、 その構成は以下のとおりである。
すなわち本発明は、 大腸菌のリボゾーム RN Aの少な く とも 1 2の連続した塩基配列と相補な塩基配列を含む D NAまたは RNAを標識物質で標識して作製したプ口 ーブを用いて、 検体中の細菌を検査する方法である。
発明を実施するための最良の形態
本発明で使用する大腸菌のリボゾーム RN Aの少なく とも 1 2の連続した塩基配列と相補な塩基配列 （以下、 相補塩基配列と略す〉 を含む D NA、 または RNAと し ては大腸菌のリポゾ一ム R N Aとハイブリダィズしてヒ トのリボゾーム R N Aとハイブリダイズしない配列であ れば、 いかなる塩基配列であってもよい。
大腸菌のリボゾーム RN Aの全塩基配列は、 例えば、 J. Brosius ら （ J. M0し Bioに 148^ 107〜127 (1981) ) に 記載されており、 その全塩基数は約 7 5 0 ◦である。 相 補塩基配列を含む D NAと しては、 大腸菌の染色体 D N Aを適当な制限酵素で切断し、 その断片を用いても良い し、 化学合成によって製造したものを用いても良い。 こ のようにして得られた相補塩基配列を含む D N Aは、 そ のまま使用することもできるが、 プラスミ ド （ P B R 3 2 2、 P U C 1 8、 P U C 1 9など〉 やファージ （ M13) に組み込んで使用しても良い。 相補塩基配列としては、 1 2以上であればいくつでも良く、 大腸菌リボゾーム R Aの全塩基配列に相補なものでも良い。 相補塩基配列 を含む D N Aまたは RN Aとしては、 高感度で細菌を検 出するためには、 プローブに導入する標識物質量を多く する必要があるので、 その鎖長は 5◦塩基以上である方 が好ましく、 通常 1 5 K塩基位までのものが使用される。
また本発明では、 グラム陰性菌とグラム陽性菌のグル —プ分けも行うことができる。 すなわち、 大腸菌 （ Esch eri chi a coi i ) 、 ェンテロパ、クタ一 . クロァカ （ Entero bacter cloacae) 、 フ。口テウス ' ブルガリス ( Proteus vulgaris) 、 プロテウス · ミラビリス （ Proteus mi rabi l is). プロテウス ■ シゲロイデス （ Proteus shigel !oid es) 、 セラチア - マ/レセッセンス ( Serrat i marcescen s 〉 、 ペスト菌 ( Yersinia pestis ) 、 チフス菌 ( Salm one! la typhimurium) 、 綠膽菌 ( Pseudomonas aerug i no sa) 、 シユードモナス ■ フルォレツセンス （ Pseudomona s f I uorescens) ァチネノくクタ一 ■ カ レコアセチカス ( Ac i netobacter calcoaceticus ) 、 エロモナス - ノヽィ ドロフイラ （ Aero瞧 as ydrophi la) 、 肺炎桿菌 ( leb s i e 11 a pneumoniae ) などのグラム陰性菌のリボゾーム RN Aとのみ相補的な D N Aプローブの塩基配列5' GT TTC AC TTC TGAGTTC GG3'または RNAフ。 ローブの塩基配列5' G U U UC AC U UC UGAGUU C GG3 、 黄色ブドウ球菌 ( Staphylococcus aureus ) 、 表皮ブド'ゥ球菌 （ Staphylococcus epidermid i s) 、 腸球 菌 （ Enterococcus faecal is)、 糞便連鎖球菌 （ Streptoc occus faecal is) などのグラム陽性菌のリボゾーム R N Aとのみ相補的な D N Aプローブの塩基配列5' AGC T
TAAC TTC TGTGTTC GGC ATGG または RN Aプローブの塩基配列5 AGC U UAAC UUC U GUGUUC GGC AUGG3'を使いわけることで、 菌 のグループ分けも可能となる。 プローブと しては上記塩 基配列中の少なく とも 1 2の連続した塩基配列を有し、 標識剤で標識された D N Aまたは RN Aを使用すればよ い。 細菌の検出をする場合は、 上記のグラム陰性菌のプ ローブとグラム陽性菌のプローブを混合して使用すれば 良い。
プロ一ブには、 D N A、 R N Aのどちらもなり うる力 試薬の安定性から D N Aプローブの方が好ましい。
本発明の標識物質とは、 蛍光剤、 化学発光剤、 ラジオ アイソ トーァ、 酵素などの標識剤そのもの、 またはピオ チン、 ジニトロフエニル基、 スルホニル基等のリガンド またはハプテンなど標識剤とァビジンや抗体を介して結 合しうる性質を持つ物質である。 本発明の相補塩基配列を含む D N Aまたは R N Aを標 識物質で標識するには、 ニック トランスレーション法、 フォ トピオチン法、 ホスフォキナーゼにより。2 Pで末端 を標識する方法などの通常の方法で行うことができる。
本発明の検体は、 細菌検査が必要なヒ ト、 動物、 植物 等生物に由来する検体であり、 具体的には血液、 穽剌液、 尿、 糞便、 膿、 喀痰、 粘膜擦過物、 牛乳および食肉など の飲食物等である。 穿刺液とは、 胸水、 腹水、 関節液お よび髄液などの穿刺して採取する液をいう。
本発明のプローブを用いて細菌を検査するには、 例え ば次の様に行う。 本発明による細菌の検出方法の特徴は、 分子生物学的技術を応用した点にある。 '
まず、 生体より採取した検体中の細胞 （赤血球、 白血 球など） を溶解させる。 溶解は P H イオン強度を変え たり、 界面活性剤を加えたりするなど、 一般的などのよ うな技術を用いてもよい。 しかし、 溶解操作を短時間に すること、 溶解後の液量があまり増加しないことなどか ら、 ドデシル硫酸ナ卜リウムなどの界面活性剤を用いる ことが好ましい。 この操作で細菌内のリポゾ一ム R N A の一部は溶出される。 しかし、 ほとんどのリボゾーム R ' N Aを溶岀させるには、 さらに、 熟フエノールでリボゾ ーム Aを抽出することが好ましい。 さらに、 グラム 陽性菌の場合は熟フエノール抽出に先立って溶菌酵素で 処理することが好ましい。 溶出してきたリボゾーム R N Aは、 ニトロセルロース、 ナイロンなどの膜やポリマー 粒子に固定してもよい。 固定の方法は物理吸着、 イオン 結合、 共有結合のどの方法でもかまわない。 膜に物理吸 着させた場合は、 固定後 8 (TCぐらいの温度でべィキン グを行なって、 後の操作で膜から遊離しないようにして おいたほうが好ましい。
以上のようにして検体からと り出した遊離または固定 された細菌のリボゾーム R N Aに前述した細菌のリポゾ —ム R N Aの塩基配列と相補な塩基配列の D N Aまたは R N Aプローブを過剰量加えてハイプリダイズさせる。 ハイプリダイズしないで残った遊離のプロ一ブは除去す る。 リボゾーム R N Aが膜に固定されている時には、 遊 離のプローブは洗浄によって除去できる。 溶液中での反 応の場合は、 電気泳動などで分離できる。
分離後、 ハイプリダイズしたプローブの標識物質の量 を測定する。 標識物質がアイソ トープの場合には、 シン チレ一シヨンカウンタ一やガイガーカウンタ一などで測 定できるし、 フ ィルムを感光させても測定できる。 標識 剤がビォチンまたはハァテンの場合は、 酵素を固定化し たアビジンまたは抗体とさらに反応させた後、 酵素の话 性を測定することでリボゾーム R N A量を測定できる。
本発明の特徴は下記のとおりである。
①プロ一ブを 1種または数種類用いるだけで、 あらゆ ' る種類の菌を検出することができる。 しかも標識剤を定 量することで、 菌数の定量も可能になる。 ②リボゾーム R N Aを検出する方法なので、 生菌だけでなく死菌の検 出ふ可能になる。 また、 食細胞を破壊する操作などで菌 が慯害を受けても菌の検出ができる。 したがって、 従来 の培養法では、 細菌が検出されなかった検体からも本発 明の方法によれば、 菌が検出されることもあり うる。 食 細胞は細菌を多数貪食しており、 食細胞内部の細菌を検 出できれば検体量を少量にできる。 ③菌体中で量が多い リボゾームを検出する。 リボゾーム量は、 菌体の状態に よって変化しやすいが、 通常 1 0 ύ 〜： L 04 コピー/"菌 ぐらい存在する， したがって、 本方法は検出惑度を高く することが可能となる， S'検出に要する時間を短縮でき るので、 検查結果を治療に利用することも容易となる。
以下、 実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。 実施例 1
大腸菌の 1 6 Sおよび 2 3 Sリボゾーム RN Αの検出 A . 大腸菌、 リボゾーム R N Aのメンブレンへの固定
大腸菌の 1 6 S卞 2 3 Sリボゾーム R A ( Boehri rg er社〉 を TEノくッファー （ 1 0 mMト リス · 塩酸塩、 1 E D T A · p H 8. 0 〉 で 1 0倍ずつ段階希积した。 こ れを吸引ろ過装置 （ Sch!eicf er S Schuel i社のミニホ一 ルド） を用いてカチオン性ナイロンメンブレン （ PaH社、 "Biodyne B " ) に吸着させた。 メンブレンは 8 CTCで 2時間加熱しリポゾ一ム RX Aをメンブレンに固定した。 B . リボゾーム RN Aに相補的な D X Aプローブの作製 5 S、 1 6 S、 2 3 S リボゾーム R Aをコードす る遺伝子を含むプラスミ ド （以下 P K Kと称す） は、 J. Efrosius ら （ J.MoLBiol, 107〜127 (1981) ) の 方法に従って作製した。 このプラスミ ド P K Kの塩基数 は約 1 1 . 9 Κであった。 ρ Κ Κを 5 0 Mトリス · 塩酸 塩 （ P H 7 . 2 〉 、 1 0 IllM塩化マグネシウム、 ◦ . 1 ジチオスレイ ト一ル、 5 0〃 g /miの牛血清アルブミン ( B S A ) 、 2 0 M d AT P、 d GT P、 d TT Pと、 2 Mの [ α—32 P ] d C T P ( Amersham社〉 を含む溶 液中で、 2 . 5 n g Zmlの DNase I ( Pharmac ia 社〉 お よび 2 0 ◦ U Zm!の D N A polymerase I (宝酒造） を 用いて 1 5。Cで 6 0分間二ック · トランスレーショ ン 反応をおこない、 P K Kを32 Pでラベルした。 比活性は 1 07 z / εであった。 '
C . ハイプリ ッ ド形成によるリボゾーム RN Αの検出
メンブレンは 5 X S S P E ( 0 . 9 Mの N a C l 、 5 (llMの E D T Aを含む p H 7 · 8のリン酸ナトリウム緩衝 液 1 ◦ ◦ mM) 、 0 . 1 %ドデシル硫酸ナトリウム （ S D S ) 、 4 〇％ホルムアミ ド、 0. l g/mlの B SA、 0. I g Zmlのフイコール、 0 . 1 g Zmlポリビニルピロリ ドン、 0 . I mff/mlの熟変性した鲑精子 D NAを舍むハ ィプリ ッ ド形成溶液中で 4 2°C 3時間ィンキュベ一トし た後に、 新しいハイブリ ッ ド形成溶液中に移し、 32Pラ ベルした D N Aプローブを熟変性して 1 06 cpm/miにな るように加え、 4 2。Cで 1晚インキュべ一トした。 メン プレンを◦ . 1 % S D Sを含む 2 X S S C ( 0 . 3 Mの N a C l を含む 3 0 mHのクェン酸ナトリウム〉 で 4 2 °C で 2 ◦分間、 計 3回洗浄し、 風乾後一 7 CTCでォートラ' ジオグラフィーを行った。
その結果、 検出限界は 22時間惑光の場合、 2. 6 X 1 〇 "15 mo! であつた。
実施例 2
細菌リボゾームの検出
A . 細菌リボゾーム RNAのメンブレンへの固定 ， 理化学研究所より入手した Ε· col i ( J C M 1 649 ) 、 Enterobacter c loacae ( J C M 1 2 3 2 ) 、 Klebsiel la pneumひ rH ae ( J C M 1 6 6 2 ) 、 Proteus vulgaris ( J C M 1 6 68 ) 、 Serratia marcescens ( J C M 1 239 ) . Pseudomonas ae「ug inosa ( J c M 9776 ) の 6株のグラム陰性菌及び Staphylococcus aureus ( J C M 24 1 3 ) 、 Streptococcus faecal i s ( J c M 2 87 5 ) の 2株のグラム陽性菌を 1晚培養した。 各々 1 09 個の菌を水 1 mlに懸濁した後、 遠心 （ 1 0， 00 0 rpm 、 5分、 以下同じ〉 し、 上清を捨てた。 残る菌体 を約 2 ◦ の水に懸溻し、 5 の溶菌酵素液 （ 0.
Figure imgf000014_0001
N—ァセチルムラミダ一ゼ、 0 . 5 mgZrnlリゾ ぺプチグーゼ、 1 ◦ mMトリス、 塩酸塩、 p H 8. ◦ 〉 を 加え、 3 7 Cで 1 5分インキュベートした。 さらに 40 0 の T Eバッファ一に戀溻し、 40 0 ϋ の TEA ッファー飽和フ ノールを加え、 混和し、 6 5°Cで 1 5 分ィンキュペートした。 遠心後、 水層 （上層） を分取し、 残るフ： ϋノールはジェテルエ一テルで除いた。 これを水 で L 0倍ずつ段階希釈したものを実施例 1 と同様にナイ ロンメンブレンに吸着、 固定した。
B . リポゾ一ム R N Aに相補的な D Aプローブの作製 実施例 1 と同様に行った。 比活性は 1 00 cpm / g であった。
C . ノ、ィ プリ ッ ド形成による リボゾーム R N Aの検出 実施例 1 と同様に行った， 結果を表 1 に示す。
表 1
検 出 感 度
2時間 光' 1 晚惑光
E.coli " 10 ^ cell I 03 cell Enterobacter cloacae
グラム陰' ft lebsiel la pneumoniae ff 菌（0株〉 Proteus vulgaris ！)
Serratia inarcescens
Psoudmonas aeruginosa
グラム^ ft Staphylococcus aureus ' 105 ccl ! ' 10 ce! ί 2 I ) Streptococcus faecal is 実 施 冽 3
血液中の大腸菌の検出
A . サンプルのメンブレンへの固定
ヒ 卜の全血 1 mし又は H? 〇 1 mlに E. COi iを 1 f 個又
？ 1 〇 ϋを添加した > これに 1 mlの 0 . 1 °o T r i ton X- : 1 00を加え溶血後遠心し、 上凊を除いた後、 う 一度この操作を繰り返した後、 実施例 2の Aと同様に溶 菌、 酵素処理、 フヱノ一ル処理、 エーテル処理を行った。 このサンプルをナイロンメンブレンに吸着固定した。
実施例 2の B、 Cと同様にハイプリ ッ ド形成を行った 後、 2時間感光させて検出した。
そク)結果、 E. col iは全血に添加した場合でも、 H? 〇 中と同程度検出された
一" tr
ノ E,col iを添加しない全血サンプルについても同 様の処理を行ったが、 ハイブリ ッ ドは形成されなかった, 実施 例 4
D X Aオリゴマ一によるグラム陰性菌およびダラ.ム陽 性菌の同定
A . 細菌リボゾーム R X Aの調製
実施 2と同様に行ったリボゾーム RN Α水溶液のう ち約 4 ( I 0 f 個の菌に相当〉 を Cに用いた
B . D X Aプロ一ブの作製
グラム陰性菌に相補的な D：ヾ Aプローブ I (5 GTT TC AC TTC TGAGTTC GG ) およびグヲム陽性 菌に相補的な D N Aプローブ 2 ( 5 A G C T T A A C T TC TGTGTTC G ) は、 各々 70 HIMトリス ' 塩酸塩 ( P H 7. 6〉 、 I 0 OlM塩化マグネシウム、 5 ジチォ スレイ ト一ル I M ( r -32P ) ATP ( Amersham社） を含む溶液中で 500し7 Z mlの T 4 polynucleotide kin ー一ノ
ase (宝酒造〉 を用いて 3 7 X：、 3 0分反応を行い、 そ の 5'末端を ύ2Ρでラベルした --.
C . ノヽィブリ ッ ドの検出
Αで調製した 1 0 f 個の菌ぉよび 1 04 cpm のプロ一 ブ、 X a C 1 (プ口一ブ 1 では 0 . 5 M、 プローブ 2で は〇 . 0 5 M ) を含む 1 0 の溶液を 1 0 0て:で 1 0 分間イ ン キュベ一 ト後、 さらに 6 0 で 2 0分間ィ ンキ ュべ一 卜 し、 氷冷し、 ハイ ブリ ッ ドを形成させた後、 1 5 0ァク リルアミ ドゲルで電気泳動を行い、 ノ、ィ プリ マ
10 ドと遊 のプロ一ブを分離した > ゲ /レはー 7 CTCで ΐ 晚 感光させた
結果を表 ニ
2に示
表 2
15
, ハイプリッドの形成
； ；プローブ 1 ,ァローブ 2
； E. col i -
Enterobacter cloacae 一
グラム - Klebsiel la pneumoniae - 陰性菌 ！ Proteus vulgaris ： -- Serratia marcescens ―
Pseudmonas aeruginosa ' - グラム ： Stephylococcus aureus ' ―
. Streptococcus faecal is 一 実 施 例 5
血液中の細菌の検出
サンフ。ゾレま、 ヒ 卜の全血 1 mlに E. col.i、 Pseudomonas aerug i nosa¾るいは Staphy I ococcus aureus 各 1 0 ° 個 を添加したものを実施例 3と同様に処理した。 その 4 ϋ を用いて実施例 4の Cと同様にハイプリ ッ ト形成を行 つたところ、 表 3に示すようにバッファ一系と同様の結 果が得られた。
細菌を添加せず同様の処理をした全血サンプルとは、 プローブ 1 、 2ともハイブリ ッ ドを形成しなかった。 表 3
Figure imgf000018_0001
産業上の利用可能性
本発明による検査方法およびプローブは、 （1) 死菌ゃ 食細胞に貪食された菌の検出が可能となること、 （2) 検 査時間を数日から 1日以内に短縮できること、 （3) 多種 の細菌を一挙に検出できること、 （4) 菌体の物質として 量的に多いリボゾーム RN Aを用いるので、 測定惑度を 高くすることができ検体量を少量にできること、 等の利 点があり、 血液、 穿刺液、 尿等の生物由来の検体中の細 菌を検出するうえで、 極めて有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 大腸菌のリボゾーム RNAの少なくとも 1 2の連続 した塩基配列と相補な塩基配列を含む D Aまたは R N Aを標識物質で標識して作製したプローブを用いて、 検 体中の細菌を検査する方法。
2 . D NAまたはRNAが、 グラム陰性菌のリボゾーム RNAとのみ相補なもの、 あるいはグラム陽性菌のリボ ゾーム RN Aとのみ相補なものである請求の範囲第 1項 記載の細菌を検査する方法。
3 - グラム陰性菌のリボゾーム RNAとのみ相補な D N ' Aまたは RNAが、 GTTTC AC TTC TGAGTT C GGまたは GUUUCAC UUC UGAGUUC GG なる塩基配列中の少なくとも 1 2の連続した塩基配列を 有するものである請求の範囲第 2項記載の細菌を検査す る方法。 '
4. グラム陽性菌のリボゾーム RNAとのみ相補な D N Aまたは RNAが、 AGC TTAAC TTCTGTGT 丁00(3"〇八丁0&または八（1( 11； 〇 ；11( 1；0" U G U U C G GC AU GGなる塩基配列中の少なくとも 1 2の連続した塩基配列を有するものである請求の範囲 第 2項記載の細菌を検查する方法。
5. 大腸菌のリボゾーム RN Aの少なくとも 1 2の連続 した塩基配列と相補な塩基配列を含む D N Aまたは R N Aを標識物質で標識して作製したプロ一ブ。
6 . D NAまたはRNAが、 グラム陰性菌のリボゾーム R N Aとのみ相補なもの、 あるいはグラム陽性菌のリボ ゾーム R N Aとのみ相補なものである請求の範囲第 5項 記載のプローブ.，
7 . グラム陰性菌のリボゾーム R N Aとのみ相補な D λ: Αまたは R Aが、 G T丁丁 C A C T T C T G A G T T C G Gまたは Gじ U U C A C U U C U G A G U U C G G なる塩基配列中の少なく と も 1 2の連続した塩基配列を 有する のである請求の範 SI第 6項記載のプローブ S . グラム陽性菌のリボゾーム R Aとのみ相補な D Aまたは R X Aが、 A G C T T A A C T T C T G丁 G T T C G G C A T G Gまたは A G C Uし7 A A C U U Cし G U G U U C G G C A ϋ G Gなる塩基配列中の少なく と
1 2の連続した塩基配列を有するものである請求の範 a 第 6項記载のプロ一ブ。
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