UA97484C2 - Isolated antibody that binds the extracellular domain of prlr - Google Patents

Isolated antibody that binds the extracellular domain of prlr Download PDF

Info

Publication number
UA97484C2
UA97484C2 UAA200902394A UAA200902394A UA97484C2 UA 97484 C2 UA97484 C2 UA 97484C2 UA A200902394 A UAA200902394 A UA A200902394A UA A200902394 A UAA200902394 A UA A200902394A UA 97484 C2 UA97484 C2 UA 97484C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
хра
antibodies
human
sequence
Prior art date
Application number
UAA200902394A
Other languages
Russian (ru)
Ukrainian (uk)
Inventor
Дениэл Бединджер
Джейсон Дамиано
Мохаммад Лукман
Линда Масат
Амер Мирза
Женевьев Ноне
Original Assignee
Новартис Аг
Ксома Текнолоджи Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Новартис Аг, Ксома Текнолоджи Лтд. filed Critical Новартис Аг
Priority claimed from PCT/US2007/076160 external-priority patent/WO2008022295A2/en
Publication of UA97484C2 publication Critical patent/UA97484C2/en

Links

Abstract

The invention relates to an isolated antibody that binds the extracellular domain of PRLR, a pharmaceutical composition comprising thereof, and to a kit comprising a therapeutically effective amount of an antibody of the invention.

Description

Перехресне посилання на споріднені заявкиCross reference to related applications

За даною заявкою заявляється про пріоритет Попередньої заявки на патент США Мо 60/946360, поданої 26 червня 2007 року, і Попередньої заявки на патент США Мо 60/838648, поданої 18 серпня 2006 року.This application claims priority to US Provisional Patent Application Mo 60/946360, filed June 26, 2007, and US Provisional Patent Application Mo 60/838648, filed August 18, 2006.

Галузь техніки, якої стосується винахідThe field of technology to which the invention relates

Даний винахід стосується способів профілактики і лікування раку введенням РКІК-специфічних антитіл.The present invention relates to methods of cancer prevention and treatment by introducing RKIK-specific antibodies.

Рівень технікиTechnical level

Рак є другою основною причиною смерті у Сполучених Штатах. Хоча «раком» називають багато різних типів раку, тобто рак молочної залози, передміхурової залози, легені, ободової кишки, підшлункової залози, кожний тип раку відрізняється як на фенотипічному рівні, так і на генетичному рівні. Нерегульований ріст, характерний для раку, відбувається, коли експресія одного або декількох генів стає експресією з порушеною регуляцією внаслідок мутацій, і ріст клітин не може більше контролюватися.Cancer is the second leading cause of death in the United States. Although many different types of cancer are called "cancer", i.e. breast cancer, prostate cancer, lung cancer, colon cancer, pancreatic cancer, each cancer type is different at both the phenotypic and genetic level. The dysregulated growth characteristic of cancer occurs when the expression of one or more genes becomes dysregulated due to mutations, and cell growth can no longer be controlled.

Гени часто класифікують на два класи, онкогени і супресорні гени пухлин. Онкогени є генами, нормальною функцією яких є стимуляція росту клітин, але тільки за конкретних умов. З появою мутації в онкогені і при втраті потім цього контролю, онкоген стимулює ріст за всіх умов. Однак, було виявлено, що, для того щоб рак був дійсно успішним, цей рак повинен мати також мутації у супресорних генах пухлин.Genes are often classified into two classes, oncogenes and tumor suppressor genes. Oncogenes are genes whose normal function is to stimulate cell growth, but only under specific conditions. With the appearance of a mutation in an oncogene and subsequent loss of this control, the oncogene stimulates growth under all conditions. However, it was discovered that for a cancer to be truly successful, that cancer must also have mutations in tumor suppressor genes.

Нормальною функцією супресорних генів пухлин є зупинка клітинного росту. Приклади супресорів пухлин включають роі3, р1б, р21 і АРС, всі з яких, при нормальній дії, зупиняють неконтрольований поділ і ріст клітин. Коли супресор пухлини мутований або втрачений, це гальмування росту клітин також втрачається, дозволяючи клітинам рости тепер без обмежень.The normal function of tumor suppressor genes is to stop cell growth. Examples of tumor suppressors include roi3, p1b, p21, and ARS, all of which, when acting normally, stop uncontrolled cell division and growth. When a tumor suppressor is mutated or lost, this inhibition of cell growth is also lost, allowing cells to grow now without restriction.

Рецептор пролактину (РЕК) є рецептором цитокінів класу 1, що однократно пронизує мембрану, який є гомологічним рецепторам для членів суперсімейства цитокінів, таким як рецептори для І 2, І! 3, І 4, ІІ. 6,The prolactin receptor (REK) is a single membrane-spanning class 1 cytokine receptor that is homologous to receptors for members of the cytokine superfamily, such as receptors for I 2, I! 3, I 4, II. 6,

І-7, еритропоетину і ЗМ-С5БЕ. РЕГІ Е бере участь у множинних біологічних функціях, що включають ріст клітин, диференціювання, розвиток, лактацію і репродукцію. Він не має внутрішньої тирозинкіназної активності; зв'язування ліганду приводить до димеризації рецептора, перехресного фосфорилування ак?г і подальшої передачі сигналу. КДНК рецептора пролактину людини була спочатку виділена з бібліотек гепатоми і раку молочної залози. (Вошіп, У.-М. еї аї., МоІес. Епдосг. 3:1455-1461, 1989). Ця нуклеотидна послідовність передбачила зрілий білок з 598 амінокислот з набагато більш довгим цитоплазматичним доменом, ніж домен рецептора РКІ печінки щура. Ген рецептора пролактину знаходиться у тій самій хромосомній області, що і ген рецептора гормону росту, який був картований в 5;13-р12 (Агаеєп, К. С. еї аї.I-7, erythropoietin and ZM-S5BE. REGI E is involved in multiple biological functions, including cell growth, differentiation, development, lactation, and reproduction. It has no intrinsic tyrosine kinase activity; Ligand binding leads to dimerization of the receptor, cross-phosphorylation of Ak?g and subsequent signal transmission. Human prolactin receptor cDNA was originally isolated from hepatoma and breast cancer libraries. (Voship, U.-M. ei ai., MoIes. Epdosg. 3:1455-1461, 1989). This nucleotide sequence predicted a mature protein of 598 amino acids with a much longer cytoplasmic domain than the rat liver RKI receptor domain. The prolactin receptor gene is located in the same chromosomal region as the growth hormone receptor gene, which was mapped in 5;13-p12 (Agayep, K. S. ei ai.

Суюдепеї. Се Сепе 53:161-165, 1990; Агаєп, К.С. еї а!., (Абзігас) АМ. 9. Нит. Сепеї. 45 (в5иррі.): А129 тільки, 1989). Гормон росту також зв'язується з рецептором пролактину і активує цей рецептор.Suyudepei Se Sepe 53:161-165, 1990; Agayep, K.S. ei a!., (Abzigas) AM. 9. Thread. Sepoys 45 (v5yrri.): A129 only, 1989). Growth hormone also binds to the prolactin receptor and activates this receptor.

Була визначена геномна організація гена РКК людини (Ни, 2.-2. еї аї., у. Сіїп. Епдосг. Меїабр. 84:1153- 1156, 1999). 5'і-нетрансльована область гена РЕ Е містить 2 альтернативних перших екзони: Е13, людська копія щурячого і мишачого Е13, і новий тип альтернативного першого екзону людини, названий ЕТМ. 5'- нетрансльована область також містить звичайний некодуючий екзон 2 і частину екзону 3, що містить кодон ініціації трансляції. Екзони Е13 і ЕТМ знаходяться на відстані 800 пар основ один від одного. Ці 2 екзони експресуються у тканині молочної залози людини, клітинах раку молочної залози, гонадах і печінці. Загалом і в цілому, транскрипт, що містить Е13, є переважним у більшості тканин. Продукт гена РЕК кодується екзонами 3-10, з яких екзон 10 кодує більшу частину внутрішньоклітинного домену. Екзони Е1З3 і Е1ТМ транскрибуються від альтернативних промоторів РІЇ! ії РМ, відповідно. Промотор РІЇ! містить елементи 5рі іThe genomic organization of the human RKK gene was determined (Ni, 2.-2. ei ai., y. Siip. Epdosg. Meiiabr. 84:1153-1156, 1999). The 5' untranslated region of the PE E gene contains 2 alternative first exons: E13, the human copy of rat and mouse E13, and a new type of human alternative first exon called ETM. The 5' untranslated region also contains the usual non-coding exon 2 and part of exon 3 containing the translation initiation codon. Exons E13 and ETM are 800 base pairs apart. These 2 exons are expressed in human breast tissue, breast cancer cells, gonads, and liver. Overall and overall, the E13-containing transcript is predominant in most tissues. The REK gene product is encoded by exons 3-10, of which exon 10 encodes most of the intracellular domain. Exons E1Z3 and E1TM are transcribed from alternative promoters of RIA! of the Republic of Moldova, respectively. Promoter of RIA! contains elements 5ri and

С/ЕВР, які ідентичні цим елементам у промоторі гризунів, і є на 8195 подібним до області -480/-106 у щура і миші. Промотор РМ містить можливі сайти зв'язування для білків сімейства ЕТ5 і півсайту для ядерних рецепторів.C/EUR, which is identical to these elements in the rodent promoter, and is 8195 similar to the -480/-106 region in rat and mouse. The PM promoter contains possible binding sites for proteins of the ET5 family and a half-site for nuclear receptors.

РКГК існує у ряді різних ізоформ, які відрізняються за довжиною їх цитоплазматичних доменів. Чотири ізоформи мРНК РЕ Е (І, І, 5т1а і 515) були продемонстровані у підшкірній черевній жировій тканині і жировій тканині молочної залози людини (Гіпо, С. еї аї., У. Сіп. Епдосг. Мебар. 88:1804-1808, 2003). Крім того, вони детектували експресію білка ІГ-РКІ ЕК і І-РЕЇ КЕ у підшкірній черевній жировій тканині і жировій тканині молочної залози людини за допомогою імуноблот-аналізу. РК! зменшував активність ліпопротеїнліпази у жировій тканині людини у порівнянні з контролем. Гіпд еї аі. припускають, що ці результати продемонстрували пряму дію РК, через функціональні РЕК, у зменшенні активності І РІ. у жировій тканині людини і що ці результати дозволяють припустити, що І Рі може також регулюватися подібним чином під час лактації. Була з'ясована функція цих ізоформ РКІЕ у щура (Ретої-Арріапаї, М. еї аІ., МоІеєс. Епдосг. 11:1020-1032, 1997). Подібно до відомої довгої форми (591 амінокислота), форма МБ2, що позбавлена 198 амінокислот цитоплазматичного домену, здатна передавати лактогенний сигнал. На противагу цьому, коротка форма, що позбавлена 291 амінокислоти цитоплазматичного домену, є неактивною. Функцію короткої форми досліджували після котрансфекції як довгої, так і короткої форм. Ці результати показують, що коротка форма діє як домінантно-негативний інгібітор при утворенні неактивних гетеродимерів, приводячи до інгібування активації кінази 2 Януса. Регтої-Арріапаї еї аІ. припускають, що гетеродимеризація РЕ Е може позитивно або негативно активувати транскрипцію РЕ...RKGC exists in a number of different isoforms that differ in the length of their cytoplasmic domains. Four isoforms of RE E mRNA (I, I, 5t1a and 515) were demonstrated in subcutaneous abdominal adipose tissue and adipose tissue of the human mammary gland (Hypo, S. ei ai., U. Sip. Epdosg. Mebar. 88:1804-1808, 2003). In addition, they detected the expression of IH-RKI EC and I-REI KE protein in subcutaneous abdominal adipose tissue and human mammary gland adipose tissue using immunoblot analysis. RK! reduced the activity of lipoprotein lipase in human adipose tissue compared to the control. Hypd ei ai. suggest that these results demonstrated a direct effect of RK, through functional RECs, in reducing the activity of IRI. in human adipose tissue and that these results suggest that I Ri may also be similarly regulated during lactation. The function of these RKIE isoforms in the rat was elucidated (Retoi-Arriapai, M. ei aI., MoIeyes. Epdosg. 11:1020-1032, 1997). Similar to the known long form (591 amino acids), the MB2 form lacking 198 amino acids of the cytoplasmic domain is able to transmit the lactogenic signal. In contrast, the short form, lacking 291 amino acids of the cytoplasmic domain, is inactive. The function of the short form was examined after cotransfection of both the long and short forms. These results indicate that the short form acts as a dominant-negative inhibitor in the formation of inactive heterodimers, leading to inhibition of Janus kinase 2 activation. Regtoi-Arriapai ei aI. suggest that the heterodimerization of PE E can positively or negatively activate the transcription of PE...

У нещодавніх повідомленнях припускається, що РКК надекспресується у тканинах раку молочної залози і раку передміхурової залози людини (і еї аІ., Сапсег Ке5, 64:4774-4782, 2004; С еї аї., 9 СіїпRecent reports suggest that RKK is overexpressed in human breast cancer and prostate cancer tissues (Sapseg Ke5, 64:4774-4782, 2004; Siip S., 9

Раїпої, 54:956-960, 2001; Тоигаїпе еї аї., У Сіїп Епдосіїпо! Меїйаб., 83:667-674, 1998). Гі еї а. повідомляли, що активація 5іїаї5 і експресія РЕК асоціюється з високим гістологічним ступенем у 5495 проб раку передміхурової залози (Гі еї аІ., вище). В інших повідомленнях також припускається, що проби первинного раку молочної залози чутливі до РКІ в аналізах утворення колоній, і що концентрації РК у плазмі корелюють з ризиком раку молочної залози (Тмогодег еї аіІ., Сапсег Ке5, 64:6814-6819, 2004; Тмогоде" еї аї.,Raipoi, 54:956-960, 2001; Toigaipe ei ai., U Siip Epdosiipo! Meiyab., 83:667-674, 1998). Hey hey a. reported that the activation of 5iii5 and the expression of REK is associated with a high histological grade in 5495 samples of prostate cancer (Gi ei aI., above). Other reports also suggest that primary breast cancer samples are sensitive to RCI in colony formation assays, and that plasma RC concentrations correlate with breast cancer risk (Tmogodeg et al., Sapseg Ke5, 64:6814-6819, 2004; Tmogodeg " hey ay.,

Сапсег Вез, 66:2476-2482, 2006). Інше повідомлення вказувало на те, що РЕГ-трансгенні миші розвивають злоякісні карциноми молочної залози або гіперплазію передміхурової залози (М/еппро еї аї.,.У Сіїп Іпмеві., 100:2744-2751, 1997; Меппбо еї а!., Епаосгіпоіоду, 138:4410-4415, 1997).Sapseg Vez, 66:2476-2482, 2006). Another report indicated that REG transgenic mice develop malignant carcinomas of the mammary gland or prostatic hyperplasia (M/eppro ei ai.,.U Siip Ipmevi., 100:2744-2751, 1997; Meppbo ei a!., Epaosgipoiodu, 138:4410-4415, 1997).

Моноклональне антитіло РЕК знижувало зустрічаність пухлин молочної залози у мишей (5і55от еї аї.,Monoclonal antibody REK reduced the incidence of mammary gland tumors in mice (5i55ot ei ai.,

Ат. у. Раїпої. 133:589-595, 1988). Крім того, антагоніст РЕГ. (5179 О-мутантий РЕ) інгібував проліферацію клітинної лінії карциноми передміхурової залози людини, 0О-145 іп міго ії 00-145-індуковані пухлини іп мімоAt. in. Raipoi 133:589-595, 1988). In addition, the antagonist REG. (5179 O-mutant RE) inhibited the proliferation of a human prostate carcinoma cell line, 0O-145 ip migo and 00-145-induced ip mimo tumors

(Хи егаї., Сапсег Нез., 61:6098-6104, 2001).(Khy egai., Sapseg Nez., 61:6098-6104, 2001).

Таким чином, існує потреба в ідентифікації композицій і способів, які модулюють РЕ ЕК, і його роль у таких раках. Даний винахід націлений на ці, а також інші важливі потреби.Thus, there is a need to identify compounds and methods that modulate RE EC and its role in such cancers. The present invention addresses these and other important needs.

Суть винаходуThe essence of the invention

Нуклеотидна послідовність РКК представлена у 5ЕБО ІЮО МО: 1, а амінокислотна послідовність представлена у ЗЕО ІЮО МО: 2. Позаклітинний домен (ЕСО), що складається з амінокислот 25-234 5ЕО ІЮThe nucleotide sequence of RKK is presented in 5EBO IUO MO: 1, and the amino acid sequence is represented in ZEO IUO MO: 2. Extracellular domain (ECD), consisting of amino acids 25-234 5EO IU

МО: 2, може бути розділений на два основних домени, 51 (амінокислоти 25-122) і 52 (амінокислоти 123- 234). Був ідентифікований ряд різних ізоформ РЕ. ЕК: довгі (І) і проміжні (І), А51, неактивна розчинна форма (РЕ ВР) і неактивні короткі форми 51а і 510. Екзони і нуклеотидні області, що містяться у кожній ізоформі, зображені на Фігурі 1. В ілюстративних варіантах здійснення даний винахід розглядає антитіла, які зв'язуються з 51-доменом і/або з 52-доменом. Ті антитіла, які зв'язуються з 52-доменом, можуть націлюватися на всі активні ізоформи. Даний винахід обговорює також антитіла, які зв'язуються специфічно з однією ізоформою, але не з іншою (наприклад, з проміжною, але не з 51а або 515), або з активними ізоформами (довгими, проміжними і А51), але не з неактивними ізоформами (51а і 516).MO: 2, can be divided into two main domains, 51 (amino acids 25-122) and 52 (amino acids 123-234). A number of different isoforms of RE have been identified. EC: long (I) and intermediate (I), A51, inactive soluble form (PE BP), and inactive short forms 51a and 510. The exons and nucleotide regions contained in each isoform are depicted in Figure 1. In illustrative embodiments, this the invention contemplates antibodies that bind to the 51-domain and/or to the 52-domain. Those antibodies that bind to the 52-domain can target all active isoforms. The present invention also contemplates antibodies that bind specifically to one isoform but not to another (eg, to intermediate but not to 51a or 515), or to active isoforms (long, intermediate, and A51) but not to inactive isoforms (51a and 516).

Матеріали і способи даного винаходу задовольняють згаданим вище та іншим вимогам у даній галузі.The materials and methods of this invention satisfy the above-mentioned and other requirements in this field.

В одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РКІК з рівноважною константою дисоціації (Ко) 109 М або більш низькою і конкурує з будь-яким з антитілIn one embodiment, an antibody is provided that binds the extracellular domain of RKIK with an equilibrium dissociation constant (K0) of 109 M or lower and competes with any of the antibodies

СИХНА.06.642, СИХНА.Об6.275, пе.06.642-1, пе.06.642-2, пе.06.275-1, Не.06.275-2, пе.06.275-3, пе.06.275-4,SYHNA.06.642, SYHNA.Ob6.275, pe.06.642-1, pe.06.642-2, pe.06.275-1, Ne.06.275-2, pe.06.275-3, pe.06.275-4,

ХРА.0О6.128, ХРА.0О6.129, ХРА.0О6.130, ХРА.Об.131, ХРА.0О6.141, ХРА.0О6.147, ХРА.06.148, ХРА.0О6.158,ХРА.0О6.128, ХРА.0О6.129, ХРА.0О6.130, ХРА.Об.131, ХРА.0О6.141, ХРА.0О6.147, ХРА.06.148, ХРА.0О6.158,

ХРА.0О6.159, ХРА.0О6б.163, ХРА.0О6.167, ХРА.0Об.171, ХРА.0О6.178, ХРА.0Об.181, ХРА.0О6.192, ХРА.0О6.202,ХРА.0О6.159, ХРА.0О6б.163, ХРА.0О6.167, ХРА.0Об.171, ХРА.0О6.178, ХРА.0Об.181, ХРА.0О6.192, ХРА.0О6.202,

ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.06.207, ХРА.0О6.210, ХРА.06.212, ХРА.0О6.217, ХРА.0О6.219, ХРА.06.229,ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.06.207, ХРА.0О6.210, ХРА.06.212, ХРА.0О6.217, ХРА.0О6.219, ХРА.06.229,

ХРА.0О6.233, ХРА.0О6б.235, ХРА.0О6.239, ХРА.0О6.145, ХНА.0О6.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983, ХНА.О06.275,ХРА.0О6.233, ХРА.0О6б.235, ХРА.0О6.239, ХРА.0О6.145, ХНА.0О6.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983, ХНА.О06.275,

ХНА.06.189 або ХНА.06.907 за зв'язування з РЕ Е більш ніж на 7595. Під терміном «рівноважна константа дисоціації (Ко) 105 М або більш низька» мають на увазі рівноважну константу дисоціації, наприклад, 107 М, 1077 М, 108 М, 109 М, 1079 М, 10-71 М або 1072 М (тобто величину, більш низьку, ніж 105 М). В іншому варіанті здійснення антитіло зв'язується з тим самим епітопом РЕК, що і будь-яке з антитіл СИХНА.06.642,ХНА.06.189 or ХНА.06.907 for binding to РЭ E by more than 7595. The term "equilibrium dissociation constant (Ko) 105 M or lower" means the equilibrium dissociation constant, for example, 107 M, 1077 M, 108 M, 109 M, 1079 M, 10-71 M or 1072 M (that is, a value lower than 105 M). In another embodiment, the antibody binds to the same REC epitope as any of the SIKHNA.06.642 antibodies,

СИХНА.06.275, Не.06.642-1, пе.06.642-2, пе.06.275-1, Не.06.275-2, пе.06.275-3, Нпе.06.275-4, ХРА.06.128,SIKHNA.06.275, Ne.06.642-1, pe.06.642-2, pe.06.275-1, Ne.06.275-2, pe.06.275-3, Npe.06.275-4, KhRA.06.128,

ХРА.0О6.129, ХРА.0Об.130, ХРА.0О6.131, ХРА.0Об.141, ХРА.06.147, ХРА.0О6б.148, ХРА.0О6.158, ХРА.Об6.159,ХРА.0О6.129, ХРА.0Об.130, ХРА.0О6.131, ХРА.0Об.141, ХРА.06.147, ХРА.0О6б.148, ХРА.0О6.158, ХРА.Об6.159,

ХРА.0О6.163, ХРА.0Об.167, ХРА.0О6.171, ХРА.0О6б.178, ХРА.0О6.181, ХРА.0О6.192, ХРА.06.202, ХРА.0О6.203,ХРА.0О6.163, ХРА.0Об.167, ХРА.0О6.171, ХРА.0О6б.178, ХРА.0О6.181, ХРА.0О6.192, ХРА.06.202, ХРА.0О6.203,

ХРА.0О6.206, ХРА.0О6.207, ХРА.0О6.210, ХРА.0О6.212, ХРА.0О6.217, ХРА.0О6.219, ХРА.06.229, ХРА.0О6.233,ХРА.0О6.206, ХРА.0О6.207, ХРА.0О6.210, ХРА.0О6.212, ХРА.0О6.217, ХРА.0О6.219, ХРА.06.229, ХРА.0О6.233,

ХРА.0О6.235, ХРА.0О6.239, ХРА.0О6.145, ХНА.О6.567, ХНА.06.642, ХНА.0О6.983, ХНА.0О6.275, ХНА.06.189 абоХРА.0О6.235, ХРА.0О6.239, ХРА.0О6.145, ХНА.О6.567, ХНА.06.642, ХНА.0О6.983, ХНА.0О6.275, ХНА.06.189 or

ХНА.06.907.HNA.06.907.

В іншому варіанті здійснення згадане вище антитіло містить 1, 2, 3, 4, 5 або 6 областей СОР будь-якого з антитіл СПИХНА.0О6.642, спХНА.06.275, пе.06.642-1, Не.06.642-2, пе.06.275-1, Не.06.275-2, Не.06.275-3, пе.06.275-4, ХРА.О0О6.128, ХРА.О0О6.129, ХРА.О0О6.130, ХРА.О6.131, ХРА.О0О6.141, ХРА.О0О6.147, ХРА.06.148,In another embodiment, the above-mentioned antibody contains 1, 2, 3, 4, 5 or 6 regions of the COP of any of the antibodies SPIKHNA.0O6.642, spKHNA.06.275, pe.06.642-1, Ne.06.642-2, pe. 06.275-1, No.06.275-2, No.06.275-3, pe.06.275-4, ХРА.О0О6.128, ХРА.О0О6.129, ХРА.О0О6.130, ХРА.О6.131, ХРА.О0О6. 141, ХРА.О0О6.147, ХРА.06.148,

ХРА.0О6.158, ХРА.0О6б.159, ХРА.0О6.163, ХРА.0Об.167, ХРА.0О6.171, ХРА.0О6б.178, ХРА.0О6.181, ХРА.О06.192,ХРА.0О6.158, ХРА.0О6б.159, ХРА.0О6.163, ХРА.0Об.167, ХРА.0О6.171, ХРА.0О6б.178, ХРА.0О6.181, ХРА.О06.192,

ХРА.0О6.202, ХРА.0О6.203, ХРА.06.206, ХРА.0О6.207, ХРА.06.210, ХРА.06.212, ХРА.О0О6.217, ХРА.06.219,ХРА.0О6.202, ХРА.0О6.203, ХРА.06.206, ХРА.0О6.207, ХРА.06.210, ХРА.06.212, ХРА.О0О6.217, ХРА.06.219,

ХРА.06.229, ХРА.0О6.233, ХРА.0О6.235, ХРА.06.239, ХРА.Об.145, ХНА.06б.567, ХНА.О0О6.642, ХНА.06.983,ХРА.06.229, ХРА.0О6.233, ХРА.0О6.235, ХРА.06.239, ХРА.Об.145, ХРА.06б.567, ХРА.О0О6.642, ХРА.06.983,

ХНА.06.275, ХНА.0О6.189 або ХНА.06.907. В іншому варіанті здійснення згадане вище антитіло є химерним антитілом, гуманізованим антитілом, сконструйованим для людини антитілом, антитілом людини, одноланцюжковим антитілом або фрагментом антитіла. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому щонайменше одна амінокислота у СОК замінена відповідним залишком відповідної СОК іншого анти-РАЇ В-антитіла. В ілюстративному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому щонайменше одна амінокислота у СОК з антитіла, вибраного з групи, що складається з СИХНА.0О6.642, СПХНА.0О6.275, пе.06.642-1, пе.06.642-2, пе.06.275-1, Не.06.275-2, Не.06.275-3, пе.06.275-4, ХРА.О0О6.128, ХРА.О0О6.129, ХРА.О0О6.130, ХРА.О6.131, ХРА.О0О6.141, ХРА.О0О6.147, ХРА.06.148,ХНА.06.275, ХНА.0О6.189 or ХНА.06.907. In another embodiment, the aforementioned antibody is a chimeric antibody, a humanized antibody, an engineered human antibody, a human antibody, a single-chain antibody, or an antibody fragment. In yet another embodiment, the above-mentioned antibody is provided, in which at least one amino acid in the SOC is replaced by a corresponding residue of the corresponding SOC of another anti-RAI B-antibody. In an illustrative embodiment, the above-mentioned antibody is provided, in which at least one amino acid in the SOC from an antibody selected from the group consisting of SIKHNA.0O6.642, SPKHNA.0O6.275, pe.06.642-1, pe.06.642-2, пе.06.275-1, Не.06.275-2, Не.06.275-3, пе.06.275-4, ХРА.О0О6.128, ХРА.О0О6.129, ХРА.О0О6.130, ХРА.О6.131, ХРА. О0О6.141, ХРА.О0О6.147, ХРА.06.148,

ХРА.0О6.158, ХРА.0О6б.159, ХРА.0О6.163, ХРА.0Об.167, ХРА.0О6.171, ХРА.0О6б.178, ХРА.0О6.181, ХРА.О06.192,ХРА.0О6.158, ХРА.0О6б.159, ХРА.0О6.163, ХРА.0Об.167, ХРА.0О6.171, ХРА.0О6б.178, ХРА.0О6.181, ХРА.О06.192,

ХРА.06.202, ХРА.0О6.203, ХРА.06.206, ХРА.06.207, ХРА.06.210, ХРА.0О6.212, ХРА.06.217, ХРА.06.219,ХРА.06.202, ХРА.0О6.203, ХРА.06.206, ХРА.06.207, ХРА.06.210, ХРА.0О6.212, ХРА.06.217, ХРА.06.219,

ХРА.06.229, ХРА.0О6.233, ХРА.0О6.235, ХРА.06.239, ХРА.Об.145, ХНА.06б.567, ХНА.О0О6.642, ХНА.06.983,ХРА.06.229, ХРА.0О6.233, ХРА.0О6.235, ХРА.06.239, ХРА.Об.145, ХРА.06б.567, ХРА.О0О6.642, ХРА.06.983,

ХНА.06.275, ХНА.06.189 або ХНА.06.907, замінена відповідним залишком відповідної області СОВ. іншого анти-РВЇІ В-антитіла. В іншому ілюстративному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому щонайменше одна амінокислота у СОК з антитіла, вибраного з групи, що складається зХНА.06.275, ХНА.06.189 or ХНА.06.907, replaced by the corresponding remainder of the corresponding region of the SOV. of another anti-RBII B-antibody. In another illustrative embodiment, the above-mentioned antibody is provided, in which at least one amino acid in the SOC of an antibody selected from the group consisting of

СИХНА.06.642, СИХНА.Об6.275, пе.06.642-1, пе.06.642-2, пе.06.275-1, Не.06.275-2, пе.06.275-3, пе.06.275-4,SYHNA.06.642, SYHNA.Ob6.275, pe.06.642-1, pe.06.642-2, pe.06.275-1, Ne.06.275-2, pe.06.275-3, pe.06.275-4,

ХРА.0О6.128, ХРА.0О6.129, ХРА.0О6.130, ХРА.Об.131, ХРА.0О6.141, ХРА.0О6.147, ХРА.06.148, ХРА.0О6.158,ХРА.0О6.128, ХРА.0О6.129, ХРА.0О6.130, ХРА.Об.131, ХРА.0О6.141, ХРА.0О6.147, ХРА.06.148, ХРА.0О6.158,

ХРА.0О6.159, ХРА.0Об.163, ХРА.0О6.167, ХРА.0Об.171, ХРА.0О6.178, ХРА.0Об.181, ХРА.0О6.192, ХРА.О0О6.202,ХРА.0О6.159, ХРА.0Об.163, ХРА.0О6.167, ХРА.0Об.171, ХРА.0О6.178, ХРА.0Об.181, ХРА.0О6.192, ХРА.О0О6.202,

ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.0О6.207, ХРА.0О6.210, ХРА.06.212, ХРА.0О6.217, ХРА.06.219, ХРА.06.229,ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.0О6.207, ХРА.0О6.210, ХРА.06.212, ХРА.0О6.217, ХРА.06.219, ХРА.06.229,

ХРА.0О6.233, ХРА.0О6б.235, ХРА.0О6.239, ХРА.0О6.145, ХНА.0О6.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983, ХНА.О06.275,ХРА.0О6.233, ХРА.0О6б.235, ХРА.0О6.239, ХРА.0О6.145, ХНА.0О6.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983, ХНА.О06.275,

ХНА.06.189 або ХНА.06.907, замінена відповідним залишком відповідної СОЕЄ іншого антитіла, вибраного з групи, що складається з СсПИХНА.06.642, сСПХНА.06.275, пе.06.642-1, Не.06.642-2, пе.06.275-1, Не.06.275-2, пе.06.275-3, пе.06.275-4, ХРА.0О6.128, ХРА.06.129, ХРА.0О6.130, ХРА.О6.131, ХРА.О0О6.141, ХРА.06.147,ХНА.06.189 or ХНА.06.907, replaced by the corresponding residue of the corresponding SOEE of another antibody selected from the group consisting of СсПХНА.06.642, сСПХНА.06.275, пе.06.642-1, Не.06.642-2, пе.06.275-1, Не ,

ХРА.0О6.148, ХРА.0О6б.158, ХРА.0О6.159, ХРА.0О6б.163, ХРА.0О6.167, ХРА.0Об.171, ХРА.0О6.178, ХРА.06.181,ХРА.0О6.148, ХРА.0О6б.158, ХРА.0О6.159, ХРА.0О6b.163, ХРА.0О6.167, ХРА.0Об.171, ХРА.0О6.178, ХРА.06.181,

ХРА.0О6.192, ХРА.0О6.202, ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.0О6.207, ХРА.0О6б.210, ХРА.06.212, ХРА.06.217,ХРА.0О6.192, ХРА.0О6.202, ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.0О6.207, ХРА.0О6б.210, ХРА.06.212, ХРА.06.217,

ХРА.0О6.219, ХРА.0О6.229, ХРА.0О6.233, ХРА.06.235, ХРА.0О6.239, ХРА.0О6.145, ХНА.06.567, ХНА.06.642,ХРА.0О6.219, ХРА.0О6.229, ХРА.0О6.233, ХРА.06.235, ХРА.0О6.239, ХРА.0О6.145, ХНА.06.567, ХНА.06.642,

ХНА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 або ХНА.06.907. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому одна або дві амінокислоти у СОЕК модифіковані.ХНА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 or ХНА.06.907. In yet another embodiment, the above-mentioned antibody is provided, in which one or two amino acids in SOEK are modified.

В іншому варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, яке зберігає щонайменше 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 9995 ідентичність протягом або варіабельної легкої, або варіабельної важкої області стосовно антитіл СПХНА.06.642, спХНА.06.275, Ппе.06.642-1, Не.06.642-2, пе.06.275-1, Не.06.275-2, Ппе.06.275-3, Не.06.275-4, ХРА.0О6.128, ХРА.06.129, ХРА.0О6.130, ХРА.06.13ІIn another embodiment, the above-mentioned antibody is provided that retains at least 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, or 9995 identity during either variable lung or of the variable heavy region in relation to antibodies SPKHNA.06.642, spKHNA.06.275, Ппе.06.642-1, Не.06.642-2, пе.06.275-1, Не.06.275-2, Ппе.06.275-3, Не.06.275-4, ХРА .0О6.128, ХРА.06.129, ХРА.0О6.130, ХРА.06.13И

ХРА.0О6.141, ХРА.0О6.147, ХРА.0О6.148, ХРА.0О6б.158, ХРА.0О6.159, ХРА.0О6б.163, ХРА.06.167, ХРА.О06.171,ХРА.0О6.141, ХРА.0О6.147, ХРА.0О6.148, ХРА.0О6б.158, ХРА.0О6.159, ХРА.0О6б.163, ХРА.06.167, ХРА.О06.171,

ХРА.0О6.178, ХРА.Об.181, ХРА.0О6.192, ХРА.0О6б.202, ХРА.0О6.203, ХРА.0О6б.206, ХРА.0О6.207, ХРА.Об6.210,ХРА.0О6.178, ХРА.Об.181, ХРА.0О6.192, ХРА.0О6б.202, ХРА.0О6.203, ХРА.0О6б.206, ХРА.0О6.207, ХРА.Об6.210,

ХРА.0О6.212, ХРА.0О6б.217, ХРА.06.219, ХРА.0О6б.229, ХРА.0О6.233, ХРА.0Об.235, ХРА.06.239, ХРА.Об6.145,ХРА.0О6.212, ХРА.0О6б.217, ХРА.06.219, ХРА.0О6б.229, ХРА.0О6.233, ХРА.0Об.235, ХРА.06.239, ХРА.Об6.145,

ХНА.06.567, ХНА.0О6.642, ХБІА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 або ХНА.06.907.ХНА.06.567, ХНА.0О6.642, ХБИА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 or ХНА.06.907.

В іншому варіанті здійснення згадане вище антитіло містить константну область послідовності антитіла людини і одну або декілька варіабельних каркасних областей важкого і легкого ланцюгів послідовності антитіла людини. Ще в одному варіанті здійснення винаходу забезпечене згадане вище антитіло, в якому послідовність антитіла людини є індивідуальною послідовністю людини, консенсусною послідовністю людини, індивідуальною послідовністю зародкової лінії людини або консенсусною послідовністю зародкової лінії людини.In another embodiment, the aforementioned antibody contains a constant region of the human antibody sequence and one or more variable framework regions of the heavy and light chains of the human antibody sequence. In yet another embodiment of the invention, the above-mentioned antibody is provided, in which the human antibody sequence is an individual human sequence, a human consensus sequence, an individual human germline sequence, or a human germline consensus sequence.

Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому константна область важкого ланцюга є модифікованим або немодифікованим Ідс, І9М, ІдА, дО, ІДЕ, їх фрагментом або їх комбінаціями. В іншому варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому константна область важкого ланцюга є модифікованим або немодифікованим Ідс1, Іде2, ІдДОЗ або Ідс4. В іншому варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що має рівноважну константу дисоціації 1072, 107, 1038 або 109 М або більш низьку стосовно РЕ. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що містить консервативну заміну в областях СОК. В іншому варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що містить консервативну або неконсервативну зміну у залишках низького або помірного ризику. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому константна область легкого ланцюга є модифікованою або немодифікованою константною областю легкого ланцюга лямбда, константною областю легкого ланцюга каппа, їх фрагментом або їх комбінаціями.In yet another embodiment, the above-mentioned antibody is provided, in which the constant region of the heavy chain is a modified or unmodified Ids, I9M, IdA, dO, IDE, their fragment or their combinations. In another embodiment, the above-mentioned antibody is provided, in which the constant region of the heavy chain is a modified or unmodified Ids1, Ids2, IdDOZ or Ids4. In another embodiment, the aforementioned antibody having an equilibrium dissociation constant of 1072, 107, 1038 or 109 M or lower relative to PE is provided. In yet another embodiment, the above-mentioned antibody containing a conservative substitution in the SOC regions is provided. In another embodiment, the aforementioned antibody containing a conservative or non-conservative change in low or moderate risk residues is provided. In yet another embodiment, the aforementioned antibody is provided, in which the light chain constant region is a modified or unmodified lambda light chain constant region, a kappa light chain constant region, a fragment thereof, or combinations thereof.

Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що інгібує димеризацію РЕ Є, інгібує внутрішньоклітинне фосфорилування РР ЕК, інгібує індукцію фосфорилування МАРК, інгібує індукцію фосфорилування 5зіаї5, інгібує індукцію фосфорилування АКТ і/або інгібує зв'язування РЕ. з РЕ К.In yet another embodiment, the above-mentioned antibody is provided, which inhibits PE E dimerization, inhibits intracellular PP EC phosphorylation, inhibits the induction of MAPK phosphorylation, inhibits the induction of 5zia and 5 phosphorylation, inhibits the induction of AKT phosphorylation and/or inhibits PE binding. with RE K.

В інших варіантах здійснення згадане вище антитіло додатково інгібує продукування МЕСЕ і/або ангіогенез.In other embodiments, the aforementioned antibody additionally inhibits the production of MESE and/or angiogenesis.

Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що інгібує проліферацію ракової клітини. Ще в одному варіанті здійснення це антитіло інгібує проліферацію клітин раку молочної залози, передміхурової залози і легені.In yet another embodiment, the above-mentioned antibody that inhibits cancer cell proliferation is provided. In another embodiment, this antibody inhibits the proliferation of breast, prostate and lung cancer cells.

Крім раку, інший варіант здійснення винаходу забезпечує згадане вище антитіло для профілактики і/або лікування аутоїмунних і запальних захворювань або порушень. Ці антитіла особливо придатні у профілактиці, ослабленні або лікуванні захворювань, що включають аутоїмунний і/або запальний компонент. Ці захворювання включають, але не обмежуються ними, аутоімунні і запальні захворювання, такі як системний червоний вовчак (ЗЕ), дискоїдний (хронічний) червоний вовчак, люпус-нефрит (вовчаковий нефрит), саркоїдоз, запальний артрит, у тому числі, але не тільки, ювенільний артрит, ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит, Синдром Рейтера, анкілозуючий спондиліт і подагричний артрит, відторгнення трансплантата органу або тканини, гіпергостре, гостре або хронічне відторгнення і/або хворобу трансплантат проти хазяїна, розсіяний склероз, гіпер-Ід-синдром, нодозний поліартеріїт, первинний біліарний цироз печінки, запальне захворювання кишечнику, хворобу Крона, глютенову хворобу (глютен- чутливу ентеропатію), аутоїмунний гепатит, перніціозну (злоякісну) анемію, аутоїмунну гемолітичну анемію, псоріаз, склеродермію, тяжку псевдопаралітичну міастенію, аутоїмунну тромбоцитопенічну пурпуру, аутоїмунний тиреоїдит, хворобу Грейвса, тиреоїдит Хашимото, хворобу імунних комплексів, синдром хронічної втоми - імунної дисфункції (СРІО5), поліміозит і дерматоміозит, кріоглобулінемію, тромболізис, кардіоміопатію, звичайну пухирчатку, інтерстиціальний легеневий фіброз, цукровий діабет Типу | і Типу Ії, гіперчутливість уповільненого типу 1, 2, З і 4, алергію або алергійні порушення, небажані/ненавмисні імунні реакції на терапевтичні білки, астму, синдром Черджа-Строса (алергійний гранулематоз), атопічний дерматит, алергійний і подразнюючий контактний дерматит, кропивницю, ІДЕ-опосередковану алергію, атеросклероз, васкуліт, ідіопатичні запальні міопатії, гемолітичне захворювання, хворобу Альцгеймера, хронічну запальну демієлінізуючу поліневропатію і т.п.In addition to cancer, another embodiment of the invention provides the above-mentioned antibody for the prevention and/or treatment of autoimmune and inflammatory diseases or disorders. These antibodies are particularly useful in the prevention, attenuation or treatment of diseases involving an autoimmune and/or inflammatory component. These diseases include, but are not limited to, autoimmune and inflammatory diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE), discoid (chronic) lupus erythematosus, lupus nephritis (lupus nephritis), sarcoidosis, inflammatory arthritis, including but not limited to , juvenile arthritis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, Reiter's syndrome, ankylosing spondylitis and gouty arthritis, organ or tissue transplant rejection, hyperacute, acute or chronic rejection and/or graft-versus-host disease, multiple sclerosis, hyper-Id syndrome, polyarteritis nodosa , primary biliary cirrhosis of the liver, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, gluten disease (gluten-sensitive enteropathy), autoimmune hepatitis, pernicious (malignant) anemia, autoimmune hemolytic anemia, psoriasis, scleroderma, pseudoparalytic myasthenia gravis, autoimmune thrombocytopenic purpura, autoimmune thyroiditis, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, immune complex disease, chronic fatigue syndrome and - immune dysfunction (СРИО5), polymyositis and dermatomyositis, cryoglobulinemia, thrombolysis, cardiomyopathy, usual pemphigus, interstitial pulmonary fibrosis, diabetes Type | and Type Ii, delayed hypersensitivity type 1, 2, C and 4, allergy or allergic disorders, unwanted/unintended immune reactions to therapeutic proteins, asthma, Cherg-Strauss syndrome (allergic granulomatosis), atopic dermatitis, allergic and irritant contact dermatitis, urticaria , IDE-mediated allergy, atherosclerosis, vasculitis, idiopathic inflammatory myopathies, hemolytic disease, Alzheimer's disease, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, etc.

В іншому варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що кон'юговане з іншим діагностичним або терапевтичним агентом.In another embodiment, the above-mentioned antibody conjugated with another diagnostic or therapeutic agent is provided.

Ще в одному варіанті здійснення забезпечений спосіб скринінгу на антитіло проти позаклітинного домену білка РКІК, придатне для лікування раку, що передбачає стадії: контактування поліпептиду, що містить ЕСО РЕ Е, з кандидатним антитілом, що містить щонайменше 1, 2, 3, 4, 5 або б областей СОК антитіл. СПХНА.06.642, спХНА.06б.275, пе.06.642-1, Ппе.06.642-2, Ппе.06.275-1, Не.06.275-2, Не.06.275-3, пе.06.275-4, ХРА.06.128, ХРА.06.129, ХРА.0О6.130, ХРА.0О6.131, ХРА.0О6.141, ХРА.0О6.147, ХРА.06.148,In yet another embodiment, a method of screening for an antibody against the extracellular domain of the RKIK protein, suitable for the treatment of cancer, is provided, which involves the following steps: contacting a polypeptide containing ESO PE E with a candidate antibody containing at least 1, 2, 3, 4, 5 or areas of SOC antibodies. SPKHNA.06.642, spKHNA.06b.275, pe.06.642-1, Ппе.06.642-2, Ппе.06.275-1, Не.06.275-2, Не.06.275-3, пе.06.275-4, ХРА.06.128, ХРА.06.129, ХРА.0О6.130, ХРА.0О6.131, ХРА.0О6.141, ХРА.0О6.147, ХРА.06.148,

ХРА.Об.158, ХРА.0О6б.159, ХРА.0О6.163, ХРА.О0О6.167, ХРА.О0Об.171, ХРА.О0О6.178, ХРА.О0О6.181, ХРА.06.192,ХРА.Об.158, ХРА.0О6б.159, ХРА.0О6.163, ХРА.О0О6.167, ХРА.О0Об.171, ХРА.О0О6.178, ХРА.О0О6.181, ХРА.06.192,

ХРА.0О6б.202, ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.0О6.207, ХРА.О06.210, ХРА.О0О6.212, ХРА.О0О6.217, ХРА.06.219,ХРА.0О6б.202, ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.0О6.207, ХРА.О06.210, ХРА.О0О6.212, ХРА.О0О6.217, ХРА.06.219,

ХРА.0Об.229, ХРА.0О6.233, ХРА.0О6.235, ХРА.0О6б.239, ХРА.06.145, ХНА.06.567, ХНА.06.642, ХНА.О06.983,ХРА.0Об.229, ХРА.0О6.233, ХРА.0О6.235, ХРА.0О6б.239, ХРА.06.145, ХНА.06.567, ХНА.06.642, ХНА.О06.983,

ХНА.06.275, ХНА.06.189 і ХНА.06.907; детектування афінності зв'язування кандидатного антитіла з даним поліпептидом та ідентифікації зазначеного кандидатного антитіла як антитіла, придатного для лікування раку, якщо детектована рівноважна константа дисоціації 105 М або більш низька.ХНА.06.275, ХНА.06.189 and ХНА.06.907; detecting the binding affinity of the candidate antibody to the given polypeptide and identifying said candidate antibody as an antibody suitable for the treatment of cancer if the detected equilibrium dissociation constant is 105 M or lower.

В іншому варіанті здійснення забезпечений спосіб системної зміни антитіл і скринінгу на антитіло проти позаклітинного домену білка РЕК, придатне для лікування раку, що передбачає стадії одержання кандидатного антитіла, що містить модифікації однієї або двох амінокислот в областях СО антитілIn another embodiment, a method of system modification of antibodies and screening for an antibody against the extracellular domain of the REK protein, suitable for the treatment of cancer, is provided, which involves the stage of obtaining a candidate antibody containing modifications of one or two amino acids in the CO regions of antibodies

СИХНА.06.642, СИХНА.О6.275, пе.06.642-1, пе.06.642-2, пе.06.275-1, пе.06.275-2, пе.06.275-3, пе.06.275-4,SYHNA.06.642, SYHNA.О6.275, pe.06.642-1, pe.06.642-2, pe.06.275-1, pe.06.275-2, pe.06.275-3, pe.06.275-4,

ХРА.Об6.128, ХРА.0О6.129, ХРА.0О6.130, ХРА.0О6.131, ХРА.0О6б.141, ХРА.О0Об6б.147, ХРА.О0О6.148, ХРА.О06.158,ХРА.Об6.128, ХРА.0О6.129, ХРА.0О6.130, ХРА.0О6.131, ХРА.0О6б.141, ХРА.О0Об6б.147, ХРА.О0О6.148, ХРА.О06.158,

ХРА.Об.159, ХРА.0Об6.163, ХРА.0О6.167, ХРА.О0О6б.171, ХРА.О0О6.178, ХРА.О6.181, ХРА.О6.192, ХРА.06.202,ХРА.Об.159, ХРА.0Об6.163, ХРА.0О6.167, ХРА.О0О6б.171, ХРА.О0О6.178, ХРА.О6.181, ХРА.О6.192, ХРА.06.202,

ХРА.0О6б.203, ХРА.0О6.206, ХРА.0О6б.207, ХРА.0О6.210, ХРА.О06.212, ХРА.О0О6.217, ХРА.0О6.219, ХРА.06.229,ХРА.0О6б.203, ХРА.0О6.206, ХРА.0О6б.207, ХРА.0О6.210, ХРА.О06.212, ХРА.О0О6.217, ХРА.0О6.219, ХРА.06.229,

ХРА.0Об.233, ХРА.0О6.235, ХРА.0О6б.239, ХРА.06.145, ХНА.О06.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983, ХНА.О06.275,ХРА.0Об.233, ХРА.0О6.235, ХРА.0О6б.239, ХРА.06.145, ХНА.О06.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983, ХНА.О06.275,

ХНА.06.189 і ХНА.0О6.907; контактування поліпептиду, що містить ЕСО РК. ЕК, із зазначеним кандидатним антитілом; детектування афінності зв'язування кандидатного антитіла з цим поліпептидом та ідентифікації зазначеного кандидатного антитіла як антитіла, придатного для лікування раку, якщо детектована рівноважна константа дисоціації 105 М або більш низька.ХНА.06.189 and ХНА.0О6.907; contacting the polypeptide containing ESO RK. EC, with the indicated candidate antibody; detecting the binding affinity of the candidate antibody to this polypeptide and identifying said candidate antibody as an antibody suitable for the treatment of cancer if the detected equilibrium dissociation constant is 105 M or lower.

Ще в одному варіанті здійснення забезпечений спосіб скринінгу на антитіло проти позаклітинного домену білка РКІК, придатне для лікування раку, що передбачає стадії контактування клітини молочної залози, легені або передміхурової залози з кандидатним антитілом, що містить щонайменше 1, 2, 3, 4, 5 або 6 областей СОЕ антитіл СИХНА.0О6.642, сиХхНА.06.275, пе.06.642-1, пе.06.642-2, пе.06.275-1, пе.06.275- 2, пе.06.275-3, пе.06.275-4, ХРА.0О6.128, ХРА.06.129, ХРА.О0О6.130, ХРА.О6.131, ХРА.О6.141, ХРА.06.147,In yet another embodiment, there is provided a method of screening for an antibody against the extracellular domain of the RKIK protein, suitable for the treatment of cancer, which involves the step of contacting a breast, lung or prostate cell with a candidate antibody containing at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 areas of ESR of antibodies SYHNA.0О6.642, syХхНА.06.275, пе.06.642-1, пе.06.642-2, пе.06.275-1, пе.06.275- 2, пе.06.275-3, пе.06.275-4, ХРА.0О6.128, ХРА.06.129, ХРА.О0О6.130, ХРА.О6.131, ХРА.О6.141, ХРА.06.147,

ХРА.Об.148, ХРА.0Об.158, ХРА.0О6.159, ХРА.О0О6.163, ХРА.0О6.167, ХРА.0О6.171, ХРА.0О6.178, ХРА.О0О6.181,ХРА.Об.148, ХРА.0Об.158, ХРА.0О6.159, ХРА.О0О6.163, ХРА.0О6.167, ХРА.0О6.171, ХРА.0О6.178, ХРА.О0О6.181,

ХРА.0О6.192, ХРА.0О6.202, ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.О06.207, ХРА.О0О6.210, ХРА.О0О6.212, ХРА.06.217,ХРА.0О6.192, ХРА.0О6.202, ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.О06.207, ХРА.О0О6.210, ХРА.О0О6.212, ХРА.06.217,

ХРА.0О6б.219, ХРА.0О6.229, ХРА.06.233, ХРА.0О6.235, ХРА.0О6.239, ХРА.0О6.145, ХНА.06.567, ХНА.О06.642,ХРА.0О6б.219, ХРА.0О6.229, ХРА.06.233, ХРА.0О6.235, ХРА.0О6.239, ХРА.0О6.145, ХНА.06.567, ХНА.О06.642,

ХНА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.0О6.189 і ХНА.О0О6.907, або антитілом, що містить модифікацію однієї або двох амінокислот в одній або декількох областях СОЕ; детектування проліферації або виживаності зазначеної клітини та ідентифікації зазначеного кандидатного антитіла як антитіла, придатного для лікування раку, якщо детектовано зменшення клітинної проліферації або виживаності.ХНА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.0О6.189 and ХНА.О0О6.907, or an antibody containing a modification of one or two amino acids in one or more regions of the SOE; detecting proliferation or survival of said cell and identifying said candidate antibody as an antibody suitable for treating cancer if a decrease in cell proliferation or survival is detected.

Ще в одному варіанті здійснення забезпечений спосіб лікування суб'єкта, який страждає від раку стадійIn yet another embodiment, a method of treating a subject suffering from stage cancer is provided

О, І, І, ПІ, М або У, що передбачає стадію введення згаданого вище антитіла у терапевтично ефективній кількості. У спорідненому варіанті здійснення цим раком є рак молочної залози, легені або передміхурової залози. В іншому варіанті здійснення вводять другий терапевтичний агент. В ілюстративному варіанті здійснення другим терапевтичним агентом є доксорубіцин, даунорубіцин або інший антрацикліновий або топоіїзомеразний інгібітор. У наступних варіантах здійснення будь-який з попередніх топоізомеразних інгібіторів вводять з спПХнНА.06.642, спХНА.06.275, пе.06.642-1, пе.06.642-2, Ппе.06.275-1, Ппе.06.275-2,O, I, I, PI, M or Y, which involves the stage of administration of the above-mentioned antibody in a therapeutically effective amount. In a related embodiment, the cancer is breast, lung, or prostate cancer. In another embodiment, a second therapeutic agent is administered. In an illustrative embodiment, the second therapeutic agent is doxorubicin, daunorubicin, or another anthracycline or topoisomerase inhibitor. In the following embodiments, any of the previous topoisomerase inhibitors is administered with spPChNA.06.642, spPChNA.06.275, pe.06.642-1, pe.06.642-2, Ppe.06.275-1, Ppe.06.275-2,

Не.06.275-3, пе.06.275-4. Ще в одному варіанті здійснення суб'єкта додатково піддають променевій терапії або хірургічному втручанню. В інших варіантах здійснення винаходу цей суб'єкт є позитивним стосовно експресії РКК і експресії НЕН2-пеи, і зазначеним другим терапевтичним агентом є анти-Нег2-пеш-антитіло.No. 06.275-3, no. 06.275-4. In yet another embodiment, the subject is additionally subjected to radiation therapy or surgery. In other embodiments of the invention, this subject is positive for the expression of RCC and the expression of HEN2-pey, and the specified second therapeutic agent is an anti-Neg2-peh-antibody.

У спорідненому варіанті здійснення цей суб'єкт є позитивним стосовно експресії РЕ КЕ і експресії ЕР, і зазначеним другим терапевтичним агентом є анти-ЕВ-антитіло. У наступному варіанті здійснення винахід забезпечує антитіло за винаходом для застосування у медицині, у тому числі для застосування у лікуванні раку. В інших варіантах здійснення винахід забезпечує застосування антитіла за винаходом у приготуванні лікарського засобу для лікування раку. Цей лікарський засіб може бути введений пацієнту у комбінації з другим терапевтичним агентом і/або з променевою терапією.In a related embodiment, the subject is positive for RE KE expression and ER expression, and said second therapeutic agent is an anti-EB antibody. In a further embodiment, the invention provides an antibody according to the invention for use in medicine, including for use in the treatment of cancer. In other embodiments, the invention provides the use of an antibody according to the invention in the preparation of a medicinal product for the treatment of cancer. This drug may be administered to the patient in combination with a second therapeutic agent and/or with radiation therapy.

В іншому варіанті здійснення винаходу забезпечений спосіб направленого впливу на пухлинну клітину, що експресує РКІК, який передбачає стадію введення згаданого вище антитіла, кон'югованого з радіонуклідом або іншим токсином. В іншому варіанті здійснення цим суб'єктом є ссавець. Ще в одному варіанті здійснення цим суб'єктом є людина.In another embodiment of the invention, a method of directed influence on a tumor cell expressing RKIK is provided, which involves the stage of introduction of the above-mentioned antibody conjugated with a radionuclide or other toxin. In another embodiment, the subject is a mammal. In yet another embodiment, this subject is a person.

Ще в одному варіанті здійснення забезпечена виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує важкий ланцюг або легкий ланцюг згаданого вище антитіла. Ще в одному варіанті здійснення забезпечений експресуючий вектор, що містить згадану вище молекулу нуклеїнової кислоти, функціонально зв'язану з регуляторною контрольною послідовністю. Ще в одному варіанті здійснення забезпечена клітина-хазяїн, що містить згаданий вище вектор або згадану вище молекулу нуклеїнової кислоти.In yet another embodiment, an isolated nucleic acid molecule containing a nucleotide sequence encoding a heavy chain or a light chain of the above-mentioned antibody is provided. In yet another embodiment, an expression vector containing the above-mentioned nucleic acid molecule functionally linked to a regulatory control sequence is provided. In yet another embodiment, a host cell containing the above-mentioned vector or the above-mentioned nucleic acid molecule is provided.

Ще в одному варіанті здійснення забезпечений спосіб застосування згаданої вище клітини-хазяїна для одержання антитіла, що передбачає культивування цієї клітини-хазяїна при придатних умовах і витягування зазначеного антитіла. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, одержане згаданим вище способом.In yet another embodiment, a method of using the host cell mentioned above to obtain an antibody is provided, which involves culturing this host cell under suitable conditions and extracting the specified antibody. In yet another embodiment, an antibody obtained by the method mentioned above is provided.

Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, яке очищене щонайменше до 9595 гомогенності розраховуючи на масу. В іншому варіанті здійснення забезпечена фармацевтична композиція, що містить згадане вище антитіло і фармацевтично прийнятний носій.In another embodiment, the above-mentioned antibody is provided, which is purified to at least 9595 homogeneity by mass. In another embodiment, a pharmaceutical composition containing the above-mentioned antibody and a pharmaceutically acceptable carrier is provided.

Ще в одному варіанті здійснення забезпечений набір, що містить згадане вище антитіло, що містить терапевтично ефективну кількість антитіла за винаходом, упаковане у контейнер, причому цей набір необов'язково містить другий терапевтичний агент і додатково містить етикетку, приєднану до контейнера або упаковану з контейнером, причому етикетка описує вміст контейнера і забезпечує вказівки і/або інструкції, що стосуються застосування вмісту контейнера для лікування раку. В іншому варіанті здійснення забезпечений набір, в якому контейнером є флакон або склянка, або попередньо заповнений шприц.In yet another embodiment, there is provided a kit containing the above-mentioned antibody containing a therapeutically effective amount of the antibody of the invention packaged in a container, the kit optionally containing a second therapeutic agent and further comprising a label attached to or packaged with the container, wherein the label describes the contents of the container and provides directions and/or instructions regarding the use of the contents of the container to treat cancer. In another embodiment, a kit is provided in which the container is a vial or glass, or a pre-filled syringe.

В іншому варіанті здійснення винаходу забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕ ЕК, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається зIn another embodiment of the invention, an antibody is provided that binds the extracellular domain of PE EC, containing an amino acid sequence of a variable light chain selected from the group consisting of

ЗЕО ІЮ МО: 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 82, 84, 86, 88, 91, 95 і 96. В іншому варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕЇ' ЕК, що містить амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІО МО: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 83, 85, 87, 89, 90, 93, 94, 97 і 98. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РКІК, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 88, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 89. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕЇЕК, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 88, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 90.ZEO IU MO: 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 82, 84, 86, 88, 91, 95 and 96. In another embodiment, an antibody is provided that binds the extracellular domain of REI' EC, comprising a variable heavy chain amino acid sequence selected from from the group consisting of ZEO IO MO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 83, 85, 87, 89, 90, 93, 94, 97 and 98. In yet another embodiment, an antibody is provided that binds the extracellular domain of RKIK, containing the amino acid sequence of the variable light chain of 5EO IO MO: 88, and the amino acid sequence of the variable heavy chain of ZEO IU MO: 89. In yet another embodiment, an antibody that binds the extracellular domain of REIEC is provided, comprising the amino acid sequence of the variable light chain of 5EO IO MO: 88, and the amino acid sequence of the variable heavy chain ZEO IO MO: 90.

Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕ ЕЕ, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 91, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 93. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕЇЕ, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 91, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 94. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕК, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга 5ЗЕО ІО МО: 92, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 93. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕЇЕ, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга 5ЗЕО ІО МО: 92, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 94.In yet another embodiment, an antibody is provided that binds the extracellular domain of PE EE, comprising the amino acid sequence of the variable light chain of ZEO IO MO: 91, and the amino acid sequence of the variable heavy chain of ZEO IO MO: 93. In yet another embodiment, the antibody is provided, that binds the extracellular domain of REI containing the amino acid sequence of the antibody variable light chain ZEO IO MO: 91 and the amino acid sequence of the variable heavy chain ZEO IU MO: 94. In yet another embodiment, an extracellular domain binding REK is provided, which contains the amino acid sequence of the variable light chain of 5ZEO IO MO: 92, and the amino acid sequence of the variable heavy chain of ZEO IO MO: 93. In yet another embodiment, an antibody that binds the extracellular domain of REIE is provided, comprising the amino acid sequence of the variable light chain of 5ZEO IO MO : 92, and the amino acid sequence of the variable heavy chain ZEO IU MO: 94 .

Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕ ЕЕ, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 95, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 97. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕЇЕ, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 95, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 98. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕК, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 96, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 97. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕЇЕ, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга ЗЕО ІО МО: 96, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 98.In yet another embodiment, an antibody is provided that binds the extracellular domain of PE EE, comprising the amino acid sequence of the variable light chain of ZEO IO MO: 95, and the amino acid sequence of the variable heavy chain of ZEO IO MO: 97. In yet another embodiment, the antibody is provided, that binds the extracellular domain of REK containing the amino acid sequence of the variable light chain ZEO IO MO: 95 and the amino acid sequence of the variable heavy chain 5EO IU MO: 98. In yet another embodiment, an antibody is provided that binds the extracellular domain of REK, which contains the amino acid sequence of the variable light chain 5EO IO MO: 96, and the amino acid sequence of the variable heavy chain ZEO IO MO: 97. In yet another embodiment, an antibody that binds the extracellular domain of REIE is provided, comprising the amino acid sequence of the variable light chain ZEO IO MO: : 96, and the amino acid sequence of the variable heavy chain 5EO IU MO: 98.

В іншому варіанті здійснення винаходу забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РЕК людини з Ко щонайменше у 10-25000 разів, 100-20000 разів, 1000-18000 разів, 5000-17000 разів, 8000- 16000 разів, 10000-15000 разів, 12000-15000 разів або 13000-14000 разів більш низькою, ніж позаклітинний домен мишачого РК. К. У спорідненому варіанті здійснення згадане вище антитіло зв'язує той самий епітоп, що і пе.06.275-4. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний доменIn another embodiment of the invention, an antibody is provided that binds the extracellular domain of human REK to Ko at least 10-25000 times, 100-20000 times, 1000-18000 times, 5000-17000 times, 8000-16000 times, 10000-15000 times, 12000-15000 times or 13000-14000 times lower than the extracellular domain of mouse RK. K. In a related embodiment, the above-mentioned antibody binds the same epitope as pe.06.275-4. In yet another embodiment, an antibody that binds the extracellular domain is provided

РКК людини, позаклітинний домен РКК миші і позаклітинний домен РКК щура. В іншому варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен РКК людини, миші і щура з рівноважною константою дисоціації (Ко) 109 М або менше. У спорідненому варіанті здійснення згадане вище антитіло зв'язує той самий епітоп, що і пе.06.642-2.Human RCC, extracellular domain of mouse RCC and extracellular domain of rat RCC. In another embodiment, an antibody is provided that binds the extracellular domain of human, mouse and rat RCC with an equilibrium dissociation constant (Ko) of 109 M or less. In a related embodiment, the aforementioned antibody binds the same epitope as pe.06.642-2.

Ще в одному варіанті здійснення зазначені вище способи можуть бути використані для ідентифікації суб'єкта, який потребує лікування анти-РВЇ В-антитілом, за допомогою, наприклад, (а) одержання проби з цього суб'єкта; і (р) аналізу цієї проби на рівень фосфорилування РЕ Є, дак2, Марк, 5іаї5, Егк1/2 і/або АК; де рівень фосфорилування РЕК, дак2, Марк, 5їаї5, Егк1/2 і/або АКІ є показником необхідності лікування анти-РВІ В-антитілом. В іншому варіанті здійснення забезпечений спосіб моніторингу ракової терапії у суб'єкта, який страждає від раку, що передбачає стадії: (а) аналізу першої проби з цього суб'єкта на рівень фосфорилування РКІК перед початком лікування протираковим терапевтичним засобом; і (р) аналізу другої проби після початку лікування протираковим терапевтичним засобом, де зменшення рівня фосфорилування РК Е після початку лікування протираковим терапевтичним засобом свідчить про те, що цей пацієнт одержує терапевтично ефективну дозу протиракового терапевтичного засобу. У спорідненому варіанті здійснення протираковим терапевтичним засобом є антитіло за будь-яким з описаних вище варіантів здійснення.In yet another embodiment, the above methods can be used to identify a subject in need of treatment with an anti-RBV B-antibody by, for example, (a) obtaining a sample from this subject; and (p) analysis of this sample for the level of phosphorylation of PE E, dak2, Mark, 5iai5, Egk1/2 and/or AK; where the level of phosphorylation of REK, dak2, Mark, 5iai5, Egk1/2 and/or AKI is an indicator of the need for anti-RVI B-antibody treatment. In another embodiment, a method of monitoring cancer therapy in a subject suffering from cancer is provided, which involves the stages of: (a) analysis of the first sample from this subject for the level of phosphorylation of RKIK before the start of treatment with an anticancer therapeutic agent; and (p) analyzing a second sample after initiation of treatment with the anticancer therapeutic agent, wherein a decrease in the level of phosphorylation of RK E after initiation of treatment with the anticancer therapeutic agent indicates that the patient is receiving a therapeutically effective dose of the anticancer therapeutic agent. In a related embodiment, the anticancer therapeutic agent is an antibody according to any of the embodiments described above.

Короткий опис фігурA brief description of the figures

Фігура 1 показує розташування генів і екзонів у різних ізоформах РК. В.Figure 1 shows the location of genes and exons in different isoforms of RK. IN.

Фігури 2, З і 4 показують дію вибраних РЕ К-специфічних антитіл на фосфорилування рЕККТ/2. |ТАБ 1167 є контрольним мишачим моноклональним анти-РНАЇ В-ангитілом; КО Зувіетв, саїаіюд Ж МАВ 11671.Figures 2, C and 4 show the effect of selected PE K-specific antibodies on the phosphorylation of rEKKT/2. |TAB 1167 is a control murine monoclonal anti-RNAi B-antibody; KO Zuvietv, saiaiyud Zh MAV 11671.

Фігура 5 показує дію РЕК К-специфічного антитіла на проліферацію РЕГ--чутливої лінії пухлинних клітин.Figure 5 shows the effect of the REK K-specific antibody on the proliferation of the REG-sensitive tumor cell line.

Фігура 6 показує дію РЕК К-специфічного антитіла на внутрішньоклітинне фосфорилування РЕК.Figure 6 shows the effect of the REK K-specific antibody on the intracellular phosphorylation of REK.

Фігура 7А-7С показує амінокислотні послідовності МН і Мі, а також місце розташування СОК (підкреслені), антитіл ХРА.06.128, ХРА.06.129, ХРА.06.130, ХРА.06.131, ХРА.06.141, ХРА.06.147,Figure 7A-7C shows the amino acid sequences of MH and Mi, as well as the location of SOC (underlined), antibodies ХРА.06.128, ХРА.06.129, ХРА.06.130, ХРА.06.131, ХРА.06.141, ХРА.06.147,

ХРА.06.148, ХРА.0О6.158, ХРА.О0О6.159, ХРА.06.163, ХРА.06.167, ХРА.06.171, ХРА.06.178, ХРА.06.181,ХРА.06.148, ХРА.0О6.158, ХРА.О0О6.159, ХРА.06.163, ХРА.06.167, ХРА.06.171, ХРА.06.178, ХРА.06.181,

ХРА.06.192, ХРА.06.202, ХРА.06.203, ХРА.06.206, ХРА.06.207, ХРА.06.210, ХРА.06.212, ХРА.06.217,ХРА.06.192, ХРА.06.202, ХРА.06.203, ХРА.06.206, ХРА.06.207, ХРА.06.210, ХРА.06.212, ХРА.06.217,

ХРА.06.219, ХРА.06.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235, ХРА.06.239, які виявляли більш ніж 8095 інгібування в аналізі РЕКК.ХРА.06.219, ХРА.06.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235, ХРА.06.239, which showed more than 8095 inhibitions in the RECK assay.

Фігура 8 показує амінокислотну послідовність УН і Мі. антитіла ХРА.0О6.145.Figure 8 shows the amino acid sequence of UN and Mi. antibodies ХРА.0О6.145.

Фігура 9 показує нуклеотидні лідерні послідовності і МН, і МІ антитіл ХНА.06.983, ХНА.06.275 іFigure 9 shows the nucleotide leader sequences of both MH and MI antibodies ХНА.06.983, ХНА.06.275 and

ХНА.06.642.HNA.06.642.

Фігура 10 показує амінокислотні послідовності МН і МІ. антитіл ХНА.06.983, ХНА.0О6.275 і ХНА.0О6.642 (СОК підкреслені).Figure 10 shows the amino acid sequences of MH and MI. antibodies ХНА.06.983, ХНА.0О6.275 and ХНА.0О6.642 (SOCs are underlined).

Фігура 11 показує, що химерні анти-РАІ А-тАБ сСпХНА.06.642, спХНА.0О6.275 і сСпХНА.06.983 сильно інгібують проліферацію і виживаність клітин Ваг/РкІ тк. КІ Н-51 є неспецифічним ізотипічно подібним контрольним антитілом. Панель праворуч показує величини ІСзо відповідних мишачих тА.Figure 11 shows that chimeric anti-RAI A-tAB cSpHNA.06.642, spHNA.0O6.275 and cSpHNA.06.983 strongly inhibit the proliferation and survival of Vag/PkI tk cells. KI H-51 is a non-specific isotypically similar control antibody. The panel on the right shows the values of ISzo of the corresponding mouse taA.

Фігура 12 показує, що химерні анти-РАЇ А-тАбБ інгібують передачу сигналу 5ТАТ5 у клітинах Т470.Figure 12 shows that chimeric anti-RAI A-tAbB inhibits 5TAT5 signaling in T470 cells.

Клітини попередньо обробляли 1 мкг/мл тАБ перед 30-хвилинною стимуляцією 50 нг/мл РЕ. Лізати аналізували на присутність фосфо-РКІК з використанням антитіл, специфічних стосовно залишків фосфотирозину 546 і 611 РЕК.Cells were pretreated with 1 μg/ml tAB before a 30-min stimulation with 50 ng/ml PE. Lysates were analyzed for the presence of phospho-RKIK using antibodies specific for phosphotyrosine residues 546 and 611 of REK.

Фігура 13 показує дію сконструйованих антитіл для людини (Нитап Епдіпеегед'мМ) на фосфорилуванняFigure 13 shows the effect of engineered antibodies for humans (Nitap Epdipeeged'MM) on phosphorylation

РЕВАКТ/2.REVACT/2.

Фігура 14 показує АОСС, опосередковану химерними анти-РАЇ В-тАБ. Клітини Т470-Т2 мітили Саїсеїп-Figure 14 shows AOSS mediated by chimeric anti-RAI B-tAB. T470-T2 cells were labeled with Saiseip-

АМ перед нанесенням тАб (1 мкг/мл) і очищених НК-клітин людини при співвідношенні ефектор-мішень 10:11. Після 4-годинної інкубації вимірювали вивільнення СаїЇсеіп-АМ у супернатант. Анти-КІ Н-антитіло і герцептин використовували як негативний і позитивний контролі, відповідно. Специфічний лізис у 95 розраховували як (експериментальне вивільнення -мимовільне вивільнення)/(максимальне вивільнення - мимовільне вивільнення)х100.AM before application of tAb (1 μg/ml) and purified human NK cells at an effector-target ratio of 10:11. After a 4-hour incubation, the release of SaiYseip-AM into the supernatant was measured. Anti-KI H-antibody and Herceptin were used as negative and positive controls, respectively. Specific lysis at 95 was calculated as (experimental release - spontaneous release)/(maximal release - spontaneous release) x 100.

Фігура 15 показує, що анти-РАІ А-тАр діють синергічно з цитотоксичними лікарськими засобами у комбінованих дослідженнях. Доксорубіцин (верхня панель) і цисплатин (нижня панель) вводили разом з контрольним анти-КІН-АБ, анти-РВІ А-тАр спХНА.06.642 або анти-РАЇ А-тАр спХНА.06.275 (всі при 1 мкг/мл). Виживаність клітин визначали аналізом СеїїТцег Сіо і виражали у вигляді КІ Ш (у-вісь).Figure 15 shows that anti-RAI A-tArs act synergistically with cytotoxic drugs in combination studies. Doxorubicin (upper panel) and cisplatin (lower panel) were co-injected with control anti-KIN-AB, anti-RVI A-tAr spHNA.06.642, or anti-RAI A-tAr spHNA.06.275 (all at 1 μg/ml). Cell survival was determined by the SeyiTzegSio assay and expressed as CI Ш (y-axis).

Фігура 16 показує, що сконструйовані тАБб для людини (Нитап Епдіпеегей' м) зберігають функціональні характеристики анти-РКІ Е в аналізах фосфорилування 5ТАТ5. Клітини Т470 інкубували з 1 або 10 мкг/мл таАб, потім обробляли з РЕ. (50 нг/мл) або без нього протягом додаткових 30 хвилин.Figure 16 shows that the designed tABb for humans (Nitap Epdipeege'm) retain the functional characteristics of anti-RKI E in 5TAT5 phosphorylation assays. T470 cells were incubated with 1 or 10 μg/ml taAb, then treated with PE. (50 ng/ml) or without it for an additional 30 minutes.

Фігури 17А і В показують, що кандидати гуманізованого анти-РНАЇ В-антитіла сильно інгібують ріст РЕ - залежних клітин Ваг3/РКІ Кк. Клітини Вагз3/РкКІ Кк вирощували у присутності РК. (50 нг/мл) протягом 48 годин з контрольним анти-Кі Н-антитілом (верхня лінія), химерним оантитілом або з версіями сконструйованого для людини антитіла (Нитап Епдіпеегед'м), Величини ЕС5зо розраховували з використанням нелінійного регресійного аналізу з підгонками кривих.Figures 17A and B show that candidate humanized anti-RNAi B-antibodies strongly inhibit the growth of RE-dependent Vag3/RKI Kk cells. Vagz3/RkKI Kk cells were grown in the presence of RK. (50 ng/ml) for 48 hours with a control anti-Ki H antibody (upper line), a chimeric oantibody, or with versions of a human-engineered antibody (Nitap Epdipeged'm), EC50 values were calculated using non-linear regression analysis with curve fitting.

Фігури 18А і В показують інгібування р-ЗТАТ5 у пухлинах Мр2-С11 оброблених сПхХНА.06.642 тварин.Figures 18A and B show the inhibition of p-ZTAT5 in Mr2-C11 tumors of treated cPxHNA.06.642 animals.

Безтимусних мишей з підшкірними пухлинами Мр2-с11 ін'єктували внутрішньочеревинно СПХНА.06.642 або контрольними анти-КІ Н-Ідса1-тАБ. Через два дні вводили болюс 20 мкг внутрішньочеревинною ін'єкцієюThymusless mice with subcutaneous Mr2-c11 tumors were injected intraperitoneally with SPKHNA.06.642 or control anti-KI H-Idsa1-tAB. Two days later, a bolus of 20 μg was administered by intraperitoneal injection

ОРЕ. Контрольних тварин ін'єктували сольовим розчином. Через два дні вводили 20 мкг болюсної ін'єкціїORE. Control animals were injected with a saline solution. Two days later, a 20 mcg bolus injection was administered

ОРЕ, і через 40 хвилин пухлини збирали і оцінювали на р-5ТАТ5 імуноблотингом або ІНС (імуногістохімічним аналізом). Фіг. 18А, Вестерн-Блот 80 мкг Тугб694 р-зТАТ5; Фіг. 188, ІНС Тугб94 р-5ТАТ5.ORE, and after 40 minutes the tumors were collected and evaluated for p-5TAT5 by immunoblotting or INS (immunohistochemical analysis). Fig. 18A, Western Blot 80 μg Tugb694 r-zTAT5; Fig. 188, INS Tugb94 r-5TAT5.

Фігури 19А і В показують, що спхНА.06.642 є ефективним у моделі лімфоми щура Мра2-сіІ 1 у мишахFigures 19A and B show that sphNA.06.642 is effective in the Mra2-siI 1 rat lymphoma model in mice

ЗСІЮО у двох різних дослідженнях.ZSIUO in two different studies.

Фігури 20А і В показують, що спХНА.06.642 викликає регресію встановлених пухлин лімфоми щурівFigures 20A and B show that SPHNA.06.642 induces regression of established rat lymphoma tumors

МЬ2-С11 у мишах ЗСІО. фіг. 20А зображує об'єм пухлини; Фіг. 208 зображує умовну виживаність.МБ2-С11 in ЗСИО mice. fig. 20A depicts the volume of the tumor; Fig. 208 depicts conditional survival.

Фігури 21А і В показують, що внутрішньочеревинна болюсна ін'єкція ОРЕ. індукує р--ТАТ»5, і обробка спАбаА.1 інгібує індукцію р--ТАТ5 у ксенотрансплантатах Т470 молочної залози людини. СИХНА.06.642 або контрольний анти-КІ Н-ІдДО1 ін'єктували внутрішньочеревинно в імунодефіцитних мишей, які несуть пухлинуFigures 21A and B show that an intra-abdominal bolus injection of OPE. induces p-TAT5, and spAbaA.1 treatment inhibits the induction of p-TAT5 in T470 human mammary xenografts. SIKHNA.06.642 or the control anti-KI H-IdDO1 was injected intraperitoneally into immunodeficient mice bearing a tumor

Т470О, імплантованих гранулами естрадіолу 0,18 мг/день (Ег) для підтримки росту. Через два дні внутрішньочеревинно вводили болюсну ін'єкцію ОРЕ. (20 мкг), і через 40 хвилин пухлини Т47О збирали і оцінювали на р-5ТАТ5 імуноблотингом або ІНС. Рівні р-ЕКЕК або р-АКТ також оцінювали з використанням імуноблоту. фіг. 21А, Вестерн-Блот 80 мкг Тугб94 р-5ТАТ5; фіг. 218, ІНС Тугб94 р-5ТАТ5.T470O implanted with estradiol granules 0.18 mg/day (Eg) to support growth. Two days later, a bolus injection of ORE was administered intraperitoneally. (20 μg), and after 40 minutes, T47O tumors were collected and evaluated for p-5TAT5 by immunoblotting or HNS. p-EKEK or p-ACT levels were also assessed using immunoblot. fig. 21A, Western Blot 80 μg Tugb94 p-5TAT5; fig. 218, INS Tugb94 r-5TAT5.

Докладний описDetailed description

Даний винахід забезпечує РЕЇ В-специфічні антитіла, фармацевтичні композиції, що містять такі антитіла, способи одержання цих антитіл і фармацевтичних композицій і способи лікування пацієнтів цими фармацевтичними композиціями і сполуками. Антитіла за даним винаходом можуть мати бажану біологічну активність зв'язування з РЕЇРЖК і/або інгібування димеризації РЕЇЕ, і/або внутрішньоклітинного фосфорилування РЕ КЕ, і/або інгібування передачі сигналу РКК далі по ходу процесу, наприклад, за допомогою фосфорилування ЧУак2, Марк, 5їаї5, Егк1/2 і/або АКі, та інгібування клітинної проліферації, асоційованої з раком або пухлинами. Таким чином, припускається прямий аналіз активації РЕК детектуванням його фосфорилування або оцінкою статусу фосфорилування інших розташованих далі по ходу процесу партнерів передачі сигналу, таких як Уак2, віаї5, ЕгК1/2 і/або АКІ. Таким чином, аналіз шляхів передачі сигналу далі по ходу процесу може бути використаний для ідентифікації пацієнтів, які потребують анти-РВЇІ В-антитіл, або використаний для моніторингу пацієнтів, яких лікували анти-РАЇ В-антитілами.The present invention provides REI B-specific antibodies, pharmaceutical compositions containing such antibodies, methods of obtaining these antibodies and pharmaceutical compositions, and methods of treating patients with these pharmaceutical compositions and compounds. Antibodies according to the present invention may have the desired biological activity of binding to РЕЙРХК and/or inhibition of РЕЙЕ dimerization, and/or intracellular phosphorylation of РЭ КЕ, and/or inhibition of RKK signal transmission further along the process, for example, by means of phosphorylation of Chuak2, Mark, 5iai5, Egk1/2 and/or AKi, and inhibition of cell proliferation associated with cancer or tumors. Thus, a direct analysis of REC activation by detecting its phosphorylation or assessing the phosphorylation status of other downstream signaling partners, such as Uak2, Viai5, EgK1/2 and/or AKI, is suggested. Thus, analysis of signaling pathways further down the process can be used to identify patients who require anti-RVII B antibodies, or used to monitor patients treated with anti-RAVI B antibodies.

Антитіла відповідно до даного винаходу можуть альтернативно (або додатково) мати бажану біологічну активність зв'язування з РКК, що експресується на ракових клітинах, служачи, таким чином, для направленого впливу цитотоксичних терапевтичних засобів на ракові клітини.Antibodies according to this invention may alternatively (or additionally) have the desired biological activity of binding to RCC expressed on cancer cells, thus serving to target cytotoxic therapeutic agents on cancer cells.

Далі, даний винахід стосується аналізів скринінгу для ідентифікації антагоністів або агоністів гена або продукту гена РЕ Е і їх варіантів. Таким чином, даний винахід стосується способів ідентифікації агоністів або антагоністів гена або продукту гена РКК і їх варіантів і застосування зазначеного агоніста або антагоніста для лікування або профілактики раку, як описано тут. Крім того, даний винахід розглядає застосування молекул нуклеїнових кислот, поліпептидів і/або антагоністів або агоністів продуктів гена, що кодуються геном РЕК, для скринінгу, діагностики, профілактики і/або лікування порушень, які характеризуються аберантною експресією або активністю РЕГІ, що включають ракові захворювання, такі як, але не тільки, рак легені, рак молочної залози і рак передміхурової залози.Further, the present invention relates to screening assays for the identification of antagonists or agonists of the PE E gene or gene product and variants thereof. Thus, the present invention relates to methods of identifying agonists or antagonists of the RCC gene or gene product and variants thereof and the use of said agonist or antagonist for the treatment or prevention of cancer as described herein. In addition, the present invention contemplates the use of nucleic acid molecules, polypeptides and/or antagonists or agonists of gene products encoded by the REK gene for the screening, diagnosis, prevention and/or treatment of disorders characterized by aberrant expression or activity of REGI, including cancers , such as, but not limited to, lung cancer, breast cancer, and prostate cancer.

Декілька переважних мишачих або химерних антитіл з високою афінністю і ефективністю, виміряними аналізами іп міго, модифіковані для зменшення їх імуногенності у людей на основі способу конструювання для людини Нитап Епдіпеегіпд'м 5щапіска еї а. Коротко, представлені на поверхні амінокислотні залишки варіабельних областей важкого ланцюга і легкого ланцюга модифікують введенням амінокислотних залишків людини у положеннях, які, як було визначено, мають малу ймовірність шкідливої дії на зв'язування антигену або укладання білка, з одночасним зменшенням імуногенності стосовно оточення (середовища) людини. Конструюють синтетичні гени, що містять модифіковані варіабельні області важкого ланцюга і/або легкого ланцюга і зв'язують з константними областями важкого ланцюга у і/або легкого ланцюга каппа.Several preferred murine or chimeric antibodies with high affinity and potency, as measured by immunoassays, have been modified to reduce their immunogenicity in humans based on a human engineering method. Briefly, the surface-presented amino acid residues of the heavy chain and light chain variable regions are modified by introducing human amino acid residues in positions that have been determined to have a low probability of detrimental effects on antigen binding or protein folding, while simultaneously reducing immunogenicity relative to the environment (environment ) of a person. Construct synthetic genes containing modified variable regions of the heavy chain and/or light chain and link to the constant regions of the heavy chain y and/or light chain kappa.

Будь-які константні області важкого ланцюга і легкого ланцюга можуть бути використані у комбінації з варіабельними областями сконструйованого для людини антитіла (Нитап Епдіпеегейд'м), Гени важкого і легкого ланцюгів вводять у клітини ссавців, і утворені рекомбінантні імуноглобулінові продукти одержують і характеризують.Any constant regions of the heavy chain and the light chain can be used in combination with the variable regions of an antibody designed for humans (Nytap Epdipeegeid'm), the genes of the heavy and light chains are introduced into mammalian cells, and the resulting recombinant immunoglobulin products are obtained and characterized.

Зразкові антитіла відповідно до даного винаходу включають спХнНА.06.642, СПХНА.06.275, ПпПе.06.642-1,Exemplary antibodies according to the present invention include SPKhNA.06.642, SPKHNA.06.275, PPPE.06.642-1,

Нпе.06.642-2, Нпе.06.275-1, Не.06.275-2, Ппе.06.275-3, Нпе.06.275-4, ХРА.06.128, ХРА.0О6.129, ХРА.О0О6.130,Нпе.06.642-2, Нпе.06.275-1, Не.06.275-2, Ппе.06.275-3, Нпе.06.275-4, ХРА.06.128, ХРА.0О6.129, ХРА.О0О6.130,

ХРА.Об.131, ХРА.0Об.141, ХРА.0О6б.147, ХРА.0О6.148, ХРА.О0О6.158, ХРА.О0О6.159, ХРА.О0О6.163, ХРА.06.167,ХРА.Об.131, ХРА.0Об.141, ХРА.0О6б.147, ХРА.0О6.148, ХРА.О0О6.158, ХРА.О0О6.159, ХРА.О0О6.163, ХРА.06.167,

ХРА.Об.171, ХРА.0Об6.178, ХРА.0Об6.181, ХРА.О0О6.192, ХРА.06.202, ХРА.0О6.203, ХРА.06.206, ХРА.О06.207,ХРА.Об.171, ХРА.0Об6.178, ХРА.0Об6.181, ХРА.О0О6.192, ХРА.06.202, ХРА.0О6.203, ХРА.06.206, ХРА.О06.207,

ХРА.0Об.210, ХРА.0О6.212, ХРА.0О6б.217, ХРА.О06.219, ХРА.06.229, ХРА.0О6.233, ХРА.О0О6.235, ХРА.06.239,ХРА.0Об.210, ХРА.0О6.212, ХРА.0О6б.217, ХРА.О06.219, ХРА.06.229, ХРА.0О6.233, ХРА.О0О6.235, ХРА.06.239,

ХРА.0О6.145, ХНА.0О6.567, ХНА.0О6.642, ХНА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 і ХНА.О0О6.907. Наведені нижче гібридоми, що секретують антитіла, були депоновані Американською Колекцією Типових Культур (АТСС) 10801 Опімегейу Віма., Мапавхзаз, МА 20110-2209 (О5А), відповідно до положень Будапештського Договору, 17 серпня 2006 року:ХРА.0О6.145, ХНА.0О6.567, ХНА.0О6.642, ХНА.06.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 and ХНА.О0О6.907. The following antibody-secreting hybridomas were deposited by the American Type Culture Collection (ATSC) 10801 Opimegeiu Vima., Mapavkhzaz, MA 20110-2209 (O5A), pursuant to the provisions of the Budapest Treaty, on August 17, 2006:

Наведені нижче визначення забезпечені як допомога у більш повному розумінні даного винаходу.The following definitions are provided to aid in a more complete understanding of the present invention.

Загальні визначенняGeneral definitions

Антиген-мішень людини "РКК" означає у даному контексті поліпептид людини, що має по суті амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 2, і його природні алельні і/або сплайсингові варіанти. "ЕСО РЕК" означає у даному контексті позаклітинну частину РЕГЕ, представлену амінокислотами 25-234 5ЕО ІЮ МО: 2. "Пухлиною" називають у даному контексті ріст і проліферацію всіх неопластичних клітин, незалежно від того, є вони злоякісними або доброякісними, і всі передракові і ракові клітини і тканини.Human target antigen "RKC" means in this context a human polypeptide having essentially the amino acid sequence ZEO IJOO MO: 2, and its natural allelic and/or splicing variants. "ESO REC" means in this context the extracellular part of REGE, represented by amino acids 25-234 5EO IU MO: 2. "Tumor" is called in this context the growth and proliferation of all neoplastic cells, regardless of whether they are malignant or benign, and all precancerous and cancer cells and tissues.

Терміни "рак" і "ракове" стосуються фізіологічного стану або описують фізіологічний стан у ссавців, що звичайно характеризується нерегульованим ростом клітин. Приклади раку включають, але не обмежуються ними, рак молочної залози, рак ободової кишки, рак нирки, рак печінки, рак легені, лімфоїдний рак, рак яєчника, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак матки, рак шийки матки або рак шкіри. "Лікування" є втручанням, виконуваним з наміром запобігання розвитку або зміни патології порушення.The terms "cancer" and "cancerous" refer to or describe a physiological state in mammals, usually characterized by unregulated cell growth. Examples of cancers include, but are not limited to, breast cancer, colon cancer, kidney cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoid cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, or skin cancer. "Treatment" is an intervention performed with the intention of preventing the development or modification of the pathology of the disorder.

Таким чином, «лікування» стосується як терапевтичного лікування, так і профілактичних або превентивних заходів. Особи, які потребують лікування, включають осіб, які вже мають це порушення, а також осіб, у яких цьому порушенню потрібно запобігти. У лікуванні пухлини (наприклад, раку) терапевтичний агент може безпосередньо зменшувати патологію пухлинних клітин або робити пухлинні клітини більш чутливими до лікування іншими терапевтичними агентами, наприклад, опромінення і/або хіміотерапії. Лікування пацієнтів, які страждають від клінічних, біохімічних, радіологічних або суб'єккивних симптомів може включати ослаблення деяких або всіх симптомів або зменшення схильності до цього захворювання. Термін "патологія" раку включає всі явища, які погіршують хороше самопочуття пацієнта. Він включає, без обмеження, аномальний або неконтрольований ріст клітин, метастазування, перешкоджання нормальному функціонуванню сусідніх клітин, вивільнення цитокінів або інших секреторних продуктів при рівнях, що відхиляються від норми, супресію або загострення запальної або імунологічної реакції і т.д. Таким чином, поліпшення після лікування може проявлятися у вигляді зменшеного розміру пухлини, зниження швидкості росту пухлини, деструкції існуючих пухлинних клітин або метастатичних клітин і/або зменшення розміру або кількості метастазів. "Ссавець" для цілей лікування стосується будь-якої тварини, що класифікується як ссавець, у тому числі людей, домашніх і сільськогосподарських тварин і тварин зоопарків, спортивних тварин і домашніх улюбленців, таких як собаки, коні, коти, корови і т.д. Переважно цим ссавцем є людина.Thus, "treatment" refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures. Persons in need of treatment include persons who already have the disorder, as well as persons in whom the disorder needs to be prevented. In the treatment of a tumor (eg, cancer), a therapeutic agent can directly reduce the pathology of tumor cells or make tumor cells more sensitive to treatment with other therapeutic agents, such as radiation and/or chemotherapy. Treatment of patients suffering from clinical, biochemical, radiological or subjective symptoms may include alleviating some or all of the symptoms or reducing the susceptibility to the disease. The term "pathology" of cancer includes all phenomena that impair the patient's well-being. It includes, without limitation, abnormal or uncontrolled cell growth, metastasis, interference with the normal functioning of neighboring cells, release of cytokines or other secretory products at abnormal levels, suppression or exacerbation of an inflammatory or immunological response, etc. Thus, improvement after treatment can be manifested in the form of reduced tumor size, reduced tumor growth rate, destruction of existing tumor cells or metastatic cells, and/or reduced size or number of metastases. "Mammal" for treatment purposes refers to any animal classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals and zoo animals, sport animals and pets such as dogs, horses, cats, cows, etc. Mostly this mammal is a person.

У даному контексті фраза «терапевтично ефективна кількість» означає кількість терапевтичного або профілактичного антитіла, яке було б придатним для варіанту здійснення даного винаходу, що буде індукувати бажані терапевтичні або профілактичні дію або реакцію, у тому числі ослаблення декількох або всіх таких симптомів захворювання або зменшення схильності до цього захворювання при введенні відповідно до бажаної схеми лікування.As used herein, the phrase "therapeutically effective amount" means an amount of a therapeutic or prophylactic antibody that would be suitable for an embodiment of the present invention that would induce a desired therapeutic or prophylactic effect or response, including the attenuation of some or all of such disease symptoms or a reduction in susceptibility to this disease when administered according to the desired treatment regimen.

Антитіла "Афінність" або "афінність зв'язування" часто вимірюють рівноважною константою асоціації (Ка) або рівноважною константною дисоціації (Ко). Термін "імуноспецифічне" або "специфічно зв'язуюче" означає, що це антитіло зв'язується з РЕ ЕК або його ЕСО з рівноважною константою асоціації (Ка), більшою ніж або рівною приблизно 109 М", більшою ніж або рівною приблизно 107 М", більшою ніж або рівною приблизно 108 М", або більшою ніж або рівною приблизно 109 М", 1019 МИ, 1011 М" або 1012 М, Це антитіло може мати істотно більш високу афінність стосовно антигену-мішені у порівнянні з іншими неспорідненими молекулами. Це антитіло може мати також істотно більш високу афінність стосовно антигену-мішені у порівнянні з ортологами або гомологами, наприклад, щонайменше 1,5-кратну, 2-кратну, 5-кратну, 10-кратну, 100-кратну, 10З-кратну, 107-кратну, 102-кратну, 1069-кратну або більш високу відносну афінність стосовно антигену-мішені. Альтернативно, воно може бути застосовне як антитіло для перехресної реакції з відомим гомологом або ортологом.Antibody "affinity" or "binding affinity" is often measured by the equilibrium constant of association (Ka) or the equilibrium constant of dissociation (Ko). The term "immunospecific" or "specific binding" means that this antibody binds to PE EC or its ESO with an equilibrium association constant (Ka) greater than or equal to about 109 M", greater than or equal to about 107 M" , greater than or equal to about 108 M", or greater than or equal to about 109 M", 1019 MU, 1011 M" or 1012 M. This antibody can have a substantially higher affinity for the target antigen compared to other unrelated molecules. This the antibody may also have a significantly higher affinity for the target antigen compared to orthologs or homologues, for example, at least 1.5-fold, 2-fold, 5-fold, 10-fold, 100-fold, 103-fold, 107- fold, 102-fold, 1069-fold, or higher relative affinity for the target antigen Alternatively, it may be applicable as an antibody to cross-react with a known homolog or ortholog.

Антитіла за винаходом можуть бути також охарактеризовані за рівноважною константою дисоціації (Ко)Antibodies according to the invention can also be characterized by the equilibrium dissociation constant (Ko)

М, 105 М, 107 М або 103 М, 10719 М, 10-11 М або 1072 М, або більш низькою. Такі афінності можуть бути легко визначені з використанням загальноприйнятих способів, наприклад, рівноважним діалізом; з використанням приладу ВіАсоге 2000, з використанням загальних процедур, описаних виробником; радіоїмуноаналізом з використанням радіоактивно міченого антигену-мішені або іншим способом, відомим кваліфікованому у даній галузі фахівцеві. Дані з афінності можуть аналізуватися, наприклад, за способом зсаїспага еї аї., Апп М. У. Асай. сі, 51:660 (1949).M, 105 M, 107 M or 103 M, 10719 M, 10-11 M or 1072 M, or lower. Such affinities can be easily determined using conventional methods, for example, equilibrium dialysis; using the ViAsoge 2000 device, using the general procedures described by the manufacturer; radioimmunoassay using radiolabeled target antigen or another method known to a person skilled in the art. Affinity data can be analyzed, for example, by the method of zsaispaga ei ai., App M. U. Asai. si, 51:660 (1949).

Під "нейтралізуючим антитілом" мають на увазі молекулу антитіла, що здатна елімінувати або істотно зменшувати ефекторну функцію антигену-мішені, з яким вона зв'язується. Таким чином, «нейтралізуюче» анти-мішень-антитіло здатне елімінувати або істотно зменшувати ефекторну функцію, наприклад, активність ферменту, зв'язування ліганду або внутрішньоклітинну передачу сигналів."Neutralizing antibody" means an antibody molecule capable of eliminating or significantly reducing the effector function of the target antigen to which it binds. Thus, a "neutralizing" anti-target antibody is capable of eliminating or substantially reducing effector function, such as enzyme activity, ligand binding, or intracellular signaling.

Термін "антитіло" використовується в його найширшому змісті і включає повністю зібрані антитіла, моноклональні антитіла, поліклональні антитіл, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), фрагменти антитіл, які можуть містити антиген (наприклад, Рар', Е(аб)», Ем, одноланцюжкові антитіла, димерні антитіла), антитіла з частинами антитіл сімейства верблюдячих і рекомбінантні пептиди, що містять всі попередні антитіла, доки вони проявляють бажану біологічну активність. Фрагменти антитіл можуть бути одержані способами рекомбінантних ДНК або ферментативним або хімічним розщепленням інтактних антитіл і описані додатково нижче. Необмежувальні приклади моноклональних антитіл включають мишачі, химерні, гуманізовані антитіла, антитіла людини та імуноглобуліни, сконструйованого для людини антитіла Нитап Епдіпеегей м, химерні злиті білки, що мають послідовності, вироблені з імуноглобулінів, або їх мутеїни або похідні, кожні з яких описані додатково нижче. Розглядаються мультимери або агрегати інтактних молекул і/або фрагментів, у тому числі хімічно дериватизовані антитіла. Антитіла будь-якого класу або підкласу ізотипу розглядаються відповідно до даного винаходу.The term "antibody" is used in its broadest sense and includes fully assembled antibodies, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies), antibody fragments that may contain antigen (eg, Rar', E(ab)", Em , single-chain antibodies, dimeric antibodies), antibodies with parts of camel family antibodies and recombinant peptides containing all previous antibodies, as long as they exhibit the desired biological activity. Antibody fragments can be obtained by recombinant DNA methods or by enzymatic or chemical cleavage of intact antibodies and are further described below. Non-limiting examples of monoclonal antibodies include murine, chimeric, humanized antibodies, human antibodies and immunoglobulins, engineered human antibodies Nytap Epdipeegei m, chimeric fusion proteins having sequences derived from immunoglobulins, or muteins or derivatives thereof, each of which is further described below. Multimers or aggregates of intact molecules and/or fragments, including chemically derivatized antibodies, are considered. Antibodies of any isotype class or subclass are contemplated in accordance with the present invention.

Термін «моноклональне антитіло» стосується у даному контексті антитіла, одержаного з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, що містять цю популяцію, є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутніми у мінорних кількостях. Моноклональні антитіла є високо специфічними, направленими проти єдиного антигенного сайту. Крім того, на противагу загальноприйнятим (поліклональним) антитілам, які звичайно включають різні антитіла, направлені проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло направлене проти єдиної детермінанти на цьому антигені. Крім їх специфічності, моноклональні антитіла є переважними у тому розумінні, що вони синтезуються о гомогенною культурою, не забрудненою іншими імуноглобулінами з відмінними специфічностями і характеристиками.The term "monoclonal antibody" refers in this context to an antibody derived from a population of essentially homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies comprising this population are identical except for possible natural mutations that may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, directed against a single antigenic site. In addition, unlike conventional (polyclonal) antibodies, which usually include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on this antigen. In addition to their specificity, monoclonal antibodies are superior in the sense that they are synthesized by a homogeneous culture, uncontaminated by other immunoglobulins with different specificities and characteristics.

Визначення «моноклональне» вказує на характер цього антитіла, як одержаного по суті з гомогенної популяції антитіл, і не повинне розглядатися як таке, що потребує одержання цього антитіла яким-небудь конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, які повинні використовуватися відповідно до даного винаходу, можуть бути одержані гібридомним способом, вперше описаним Копіег еї аї., Майиге, 256:495 (1975), або способами рекомбінантних ДНК (див., наприклад, патент США Мо 4816567). «Моноклональні антитіла» можуть бути рекомбінантними, химерними, гуманізованими, антитілами людини, сконструйованими для людини (Нитап Епдіпеегей м) або, наприклад, фрагментами антитіл. "Виділене" антитіло є антитілом, яке було ідентифіковане і відділене, і витягнуте з компонента його природного оточення. Компонентами забруднення його природного оточення є речовини, які могли б заважати діагностичним і терапевтичним застосуванням для цього антитіла, і можуть включати ферменти, гормони та інші, білкові і небілкові розчинені речовини. У переважних варіантах здійснення це антитіло буде очищене (1) до більш ніж 9595 розраховуючи на масу антитіла, як визначено за допомогою способу Лоурі, і найбільш переважно більш ніж 9995 розраховуючи на масу, (2) до ступеня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків М-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності з використанням секвенатора з обертовою чашею, або (3) до гомогенності відповідно до електрофорезу у ДСН-ПААГ при відновлювальних або невідновлювальних умовах з використанням Кумасі синього або барвника, що переважно містить срібло. Виділене антитіло включає антитіло іп 5йи у рекомбінантних клітинах, як тільки не буде присутній щонайменше один компонент природного оточення антитіла. Однак, звичайно, виділене антитіло повинно виділятися з використанням щонайменше однієї стадії очищення. "Імуноглобулін" або "нативне антитіло" є тетрамерним глікопротеїном. У природному імуноглобуліні кожний тетрамер складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, причому кожна пара має один «легкий» (приблизно 25 кДа) і один «важкий» ланцюг (приблизно 50-70 кДа). Амінокінцева частина кожного ланцюга включає «варіабельну» область приблизно 100-110 або більше амінокислот, первинно відповідальних за пізнавання антигену. Карбоксикінцева частина кожного ланцюга визначає константну область, первинно відповідальну за ефекторну функцію. Імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних класів в залежності від амінокислотної послідовності константної області їх важких ланцюгів. Важкі ланцюги класифікуються як мю (р), дельта (А), гамма (у), альфа (о) і епсилон (є), і визначають ізотип антитіла, такий як ОМ, дО, дос, ІдА і І94Е, відповідно. Декілька з них можуть бути додатково розділені на підкласи або ізотипи, наприклад, Ддс1, Ідс2, ІдсСЗ, ІдсЯ4, ДАТ і ІдА2. Різні ізотипи мають різні ефекторні функції; наприклад, ізотипи ДС1 і (до3 мають АЮСс-активність. Легкі ланцюги людини класифікуються як легкі ланцюги каппа (к) і лямбда (Х). У легкому і важкому ланцюгах варіабельні і константні області з'єднані "9"- областю з приблизно 12 або більше амінокислот, причому важкий ланцюг також включає в себе "0О"-область з приблизно 10 або більше амінокислот. Див. у загальному вигляді Рипдатепаї! Іттипо!оду, Сп. 7 (Раш, МУ/., ед., 279 вед. Вамеп Ргевв, М.У. (1989)).The definition "monoclonal" indicates the nature of this antibody as derived from an essentially homogeneous population of antibodies, and should not be construed as requiring that this antibody be produced by any particular method. For example, the monoclonal antibodies to be used in accordance with the present invention can be obtained by the hybridoma method first described in Kopieg et al., Mayige, 256:495 (1975), or by recombinant DNA methods (see, for example, US Pat. No. 4,816,567). . "Monoclonal antibodies" can be recombinant, chimeric, humanized, human antibodies designed for humans (Nitap Epdipeegei m) or, for example, antibody fragments. An "isolated" antibody is an antibody that has been identified and separated and extracted from a component of its natural environment. Contamination components of its natural environment are substances that could interfere with the diagnostic and therapeutic use of this antibody, and may include enzymes, hormones, and other protein and non-protein dissolved substances. In preferred embodiments, this antibody will be purified (1) to greater than 9595 by weight of the antibody as determined by the Lowry method, and most preferably greater than 9995 by weight, (2) to a degree sufficient to yield at least 15 M residues -terminal or internal amino acid sequence using a rotating bowl sequencer, or (3) to homogeneity according to electrophoresis in SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions using Coomassie blue or a dye preferably containing silver. The isolated antibody includes the antibody ip 5yi in recombinant cells, as soon as at least one component of the natural environment of the antibody is not present. However, of course, the isolated antibody must be isolated using at least one purification step. "Immunoglobulin" or "native antibody" is a tetrameric glycoprotein. In natural immunoglobulin, each tetramer consists of two identical pairs of polypeptide chains, with each pair having one "light" (approximately 25 kDa) and one "heavy" chain (approximately 50-70 kDa). The amino-terminal part of each chain includes a "variable" region of approximately 100-110 or more amino acids, primarily responsible for antigen recognition. The carboxy-terminal part of each chain defines a constant region primarily responsible for the effector function. Immunoglobulins can be assigned to different classes depending on the amino acid sequence of the constant region of their heavy chains. Heavy chains are classified as mu (p), delta (A), gamma (y), alpha (o), and epsilon (e), and determine the isotype of the antibody, such as OM, dO, dos, IdA, and I94E, respectively. Several of them can be further divided into subclasses or isotypes, for example, Dds1, Ids2, IdsSZ, IdsYA4, DAT and IdA2. Different isotypes have different effector functions; for example, DS1 and (do3) isotypes have AUCs activity. Human light chains are classified as kappa (k) and lambda (X) light chains. In the light and heavy chains, the variable and constant regions are connected by a "9" region with approximately 12 or more amino acids, and the heavy chain also includes an "O" region of about 10 or more amino acids. See generally Ripdatepai!Ittipo!odu, Sp. 7 (Rash, MU/., ed., 279 ved. Wamep Rgevv, M.U. (1989)).

Стосовно докладного опису структури і генерування антитіл див. роботу Коїй, О.В., апа Сгаїд, М.Г., сеї, 94:411-414 (1998), включену сюди повністю як посилання. Коротко, спосіб генерування ДНК, що кодує гени важкого і легкого ланцюга імуноглобуліну, має місце спочатку у В-клітинах, що розвиваються. Перед реаранжуванням і з'єднанням різних генних сегментів імуноглобуліну, сегменти генів М, 0, У і константні (С) генні сегменти виявляються у відносно тісній близькості на єдиній хромосомі. Під час диференціювання В- клітин один з кожного з придатних членів сімейства генних сегментів М, О, У (або тільки М і У у випадку генів легкого ланцюга) рекомбінується з утворенням функціонально реаранжованих генів важкого і легкого ланцюга імуноглобуліну. Цей процес реаранжування генних сегментів є, очевидно, безперервним. Спочатку утворюються зчленування важкий ланцюг 0-, потім зчленування важкий ланцюг У-0.) і зчленування легкий ланцюг У-У. Поряд з реаранжуванням сегментів М, О і у), додаткове різноманіття генерується у первинному репертуарі важкого і легкого ланцюга імуноглобуліну за допомогою варіабельної рекомбінації у місцях розташування, де сегменти М і у з'єднуються у легкому ланцюзі, і де сегменти О і у) з'єднуються у важкому ланцюзі. Така варіація у легкому ланцюзі звичайно відбувається в останньому кодоні генного сегментам і першому кодоні сегмента У. Подібна неточність приєднання відбувається на хромосомі важкого ланцюга між сегментами 0 і Ун і може простягатися на 10 нуклеотидів. Крім того, декілька нуклеотидів можуть бути інсертовані між генними сегментами О і Он і між Мн і 0, які не кодуються геномною ДНК. Додавання цих нуклеотидів відомо як різноманіття М-області. Сумарним ефектом таких реаранжувань у генних сегментах варіабельної області і варіабельної рекомбінації що може відбуватися під час такого приєднання, є одержання репертуару первинних антитіл. "Фрагменти антитіл" містять частину інтактного повнорозмірного антитіла (у тому числі антитіл людини), переважно антигензв'язувальної області або варіабельної області інтактного антитіла і включають мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Необмежувальні приклади фрагментів антитіл включають Раб, Раб", Е(ар)», Ем, домен-антитіло (дАбБ), фрагменти області, що визначає комплементарність (СОК), одноланцюжкові антитіла (зсЕм), фрагменти одноланцюжкових антитіл, димерні антитіла, тримерні антитіла, тетрамерні антитіла, міні-антитіла, лінійні антитіла (7араїа еї аї., Ргоївіп Епо., 8(10): 1057-1062 (1995)); хелатоутворюючі рекомбінантні антитіла, тримерні антитіла або бі-антитіла, інтра-антитіла, нано- антитіла, малі модульні імунофармацевтичні речовини (ЗМІР), злитий білок антигензв'язувальний домен- імуноглобулін, «верблюдизоване» антитіло, МНН-вмісне антитіло, або їх мутеїни або похідні, і поліпептиди, які містять щонайменше частину імуноглобуліну, яка є достатньою для надання зв'язування специфічного антигену до цього поліпептиду, таку як СОК-послідовність, доки це антитіло зберігає бажану біологічну активність.For a detailed description of the structure and generation of antibodies, see Koii, O.V., apa Sgaid, M.G., sei, 94:411-414 (1998), incorporated herein by reference in its entirety. Briefly, the DNA encoding genes for immunoglobulin heavy and light chains are generated first in developing B cells. Before the rearrangement and connection of different immunoglobulin gene segments, gene segments M, 0, Y and constant (C) gene segments are found in relatively close proximity on a single chromosome. During B-cell differentiation, one of each of the suitable members of the M, O, U gene segment family (or only M and U in the case of light chain genes) recombines to form functionally rearranged immunoglobulin heavy and light chain genes. This process of rearrangement of gene segments is apparently continuous. First, the articulations of the heavy chain 0-, then the articulations of the heavy chain U-0.) and the articulations of the light chain U-U are formed. Along with the rearrangement of the M, O, and y) segments, additional diversity is generated in the primary immunoglobulin heavy and light chain repertoire by variable recombination at the locations where the M and y segments join in the light chain, and where the O and y) segments with are connected in a heavy chain. Such a variation in the light chain usually occurs in the last codon of the gene segments and the first codon of the U segment. A similar inaccuracy of joining occurs on the chromosome of the heavy chain between segments 0 and Un and can extend for 10 nucleotides. In addition, several nucleotides can be inserted between gene segments O and On and between Mn and O, which are not encoded by genomic DNA. The addition of these nucleotides is known as M-region diversity. The total effect of such rearrangements in the gene segments of the variable region and variable recombination that can occur during such joining is the acquisition of a repertoire of primary antibodies. "Antibody fragments" contain part of an intact full-length antibody (including human antibodies), preferably an antigen-binding region or a variable region of an intact antibody, and include multispecific antibodies formed from antibody fragments. Non-limiting examples of antibody fragments include Rab, Rab", E(ar)", Em, domain-antibody (dAbB), complementarity-determining region (CDO) fragments, single-chain antibodies (csEm), single-chain antibody fragments, dimeric antibodies, trimeric antibodies , tetrameric antibodies, mini-antibodies, linear antibodies (7araia ei ai., Rgoivip Epo., 8(10): 1057-1062 (1995)); chelating recombinant antibodies, trimeric antibodies or bi-antibodies, intra-antibodies, nano- antibodies, small modular immunopharmaceuticals (SMIs), antigen-binding domain-immunoglobulin fusion protein, "camelized" antibody, INN-containing antibody, or muteins or derivatives thereof, and polypeptides that contain at least a portion of an immunoglobulin sufficient to confer binding ligation of a specific antigen to this polypeptide, such as a SOC sequence, while this antibody retains the desired biological activity.

Розщеплення антитіл папаїном дає два ідентичних антигензв'язувальних фрагменти, називаних «Еар»- фрагментами, кожний з яких має єдиний сайт зв'язування антигену, і залишковий «Рс»-фрагмент, назва якого відбиває його здатність легко кристалізуватися (35). Обробка пепсином дає фрагмент Е(ар)»2, що дає два «Ем»-фрагменти. «Ем»-фрагмент є мінімальним фрагментом антитіла, що містить повний сайт пізнавання і зв'язування антигену. Ця область складається з димеру одного варіабельного домену важкого ланцюга і одного варіабельного домену легкого ланцюга у щільній, нековалентній асоціації. У цій конфігурації три області СОК кожного варіабельного домену взаємодіють для визначення (створення) антигензв'язувального сайту на поверхні димеру МН Мі. Разом ці шість областей СОК надають цьому антитілу антигензв'язувальну специфічність. Однак, навіть єдиний варіабельний домен (або половина Ем, що містить тільки три області СОЕК, специфічні стосовно антигену) має здатність пізнаватися і зв'язувати антиген. "Одноланцюжкові Ру" або "5Ру", або "5сЕу" фрагменти антитіл містять домени МН і Мі. антитіла, де ці домени присутні в єдиному поліпептидному ланцюзі. Переважно цей Ему-поліпептид додатково містить поліпептидний лінкер між доменами МН і МІ, що дозволяє цьому Ем утворювати бажану структуру для зв'язування антигену. Стосовно огляду 5ЕРм див. Ріпскіпип іп Тпе Рпаптасоїоду ої Мопосіопа! Апіродієв, мої. 1 13, Возепригу апа Мооге єавз., Зрііпдег-Мепад, Мем Хогк, рр. 269-315(1994).Cleavage of antibodies with papain yields two identical antigen-binding fragments, called "Ear" fragments, each of which has a single antigen-binding site, and a residual "Pc" fragment, the name of which reflects its ability to easily crystallize (35). Treatment with pepsin gives the E(ar)"2 fragment, which gives two "Em"-fragments. "Em"-fragment is a minimal antibody fragment containing a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain in a tight, noncovalent association. In this configuration, three regions of the SOC of each variable domain interact to determine (create) an antigen-binding site on the surface of the MN Mi dimer. Together, these six SOC regions confer antigen-binding specificity to this antibody. However, even a single variable domain (or half of an EM containing only three regions of the SOEK specific for an antigen) has the ability to recognize and bind an antigen. "Single-chain Ru" or "5Ru" or "5cEu" antibody fragments contain MN and Mi domains. antibodies where these domains are present in a single polypeptide chain. Preferably, this Emu polypeptide additionally contains a polypeptide linker between the MN and MI domains, which allows this Emu to form the desired structure for antigen binding. Regarding the 5ERm review, see Ripskipip ip Tpe Rpaptasoiodu oi Moposiopa! Apirodiyev, my. 1 13, Vozeprygu apa Mooge eavz., Zriipdeg-Mepad, Mem Hogk, pp. 269-315 (1994).

Рар-фрагмент також містить константний домен легкого ланцюга і перший константний домен (СНІ) важкого ланцюга. Рар-фрагменти відрізняються від Рар'-ррагментів додаванням декількох залишків на карбокси-кінці СНІ-домену важкого ланцюга, у тому числі одного або декількох цистеїнів з шарнірної області антитіла. Гар'-ЗН є тут позначенням для Раб, в якому залишок (залишки) цистеїну константних доменів несе одну вільну тіолову групу. Е(ар)2-фрагменти антитіл спочатку були одержані у вигляді парThe rar fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CDN) of the heavy chain. Rar-fragments differ from Rar'-rragments by the addition of several residues at the carboxy-end of the SNI-domain of the heavy chain, including one or more cysteines from the hinge region of the antibody. Har'-ZN is here the designation for Rab in which the cysteine residue(s) of the constant domains carries one free thiol group. E(ar)2-fragments of antibodies were initially obtained in the form of pairs

Рар'-фрагментів, які мали цистеїни шарніру між ними.Rar' fragments that had hinge cysteines between them.

Термін «гіперваріабельна» область стосується амінокислотних залишків антитіла, які відповідальні за зв'язування антигену. Гіперваріабельна область містить амінокислотні залишки з «області, що визначає комплементарність», або СОР (тобто залишки 24-34 (11), 50-56 (12) і 89-97 (13) у варіабельному домені легкого ланцюга і 31-35 (НІ), 50-65 (Н2) і 95-102 (НЗ) у варіабельному домені важкого ланцюга, як описаноThe term "hypervariable" region refers to the amino acid residues of the antibody that are responsible for antigen binding. The hypervariable region contains amino acid residues from the "complementarity determining region" or CRP (ie, residues 24-34 (11), 50-56 (12), and 89-97 (13) in the light chain variable domain and 31-35 (NO ), 50-65 (H2) and 95-102 (NH) in the variable domain of the heavy chain as described

Каваї єї а!., Зедиепсев ої Ргоїєїп5 ої Іттипо!одіса! Іпіегеві, 5" Ед. Рибіїс Неайй Зегмісе, Майопаї! Іпвійшев оїKawai eyi a!., Zedyepsev oi Rgoiyeip5 oi Ittypo!odisa! Ipiegevi, 5" Ed. Rybiis Neay Zegmise, Maiopai! Ipviyshev oi

Неаш, Веїпезаа, Ма. (1991)) і/або ці залишки з гіперваріабельної петлі (тобто залишки 26-32 (11), 50-52 (І 2) і 91-96 (І3) у варіабельному домені легкого ланцюга і 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) і 96-101 (НЗ) у варіабельному домені важкого ланцюга, як описано (Споїніа еї аї., У. Мої. Віо!. 196:901-917 (1987)|. "Каркасні" або ЕкК-залишки є залишками варіабельних доменів, іншими, ніж залишки гіперваріабельної області.Neash, Veipezaa, Ma. (1991)) and/or those residues from the hypervariable loop (ie, residues 26-32 (11), 50-52 (I 2), and 91-96 (I3) in the variable domain of the light chain and 26-32 (NO), 53 -55 (H2) and 96-101 (NH) in the variable domain of the heavy chain as described (Spoinia et al., U. Moi. Bio!. 196:901-917 (1987)|. "Framework" or EKK residues are the residues of the variable domains, other than the residues of the hypervariable region.

Фраза «константна область» стосується частини молекули антитіла, що надає ефекторну функцію.The phrase "constant region" refers to the part of the antibody molecule that provides the effector function.

Фраза «химерне антитіло» стосується у даному контексті антитіла, що містить послідовність, вироблену з двох різних антитіл (див., наприклад, патент США Мо 4816567), що звичайно походить з різних видів.The phrase "chimeric antibody" refers in this context to an antibody containing a sequence produced from two different antibodies (see, for example, US Pat. No. 4,816,567), usually originating from different species.

Найбільш часто химерні антитіла містять фрагменти антитіл людини і миші, звичайно константну область людини і варіабельну область миші.Most often, chimeric antibodies contain fragments of human and mouse antibodies, usually the human constant region and the mouse variable region.

Термін «мутеїн» або «варіант» може використовуватися взаємозамінно і стосується поліпептидної послідовності антитіла, яка містить щонайменше одну амінокислотну заміну, делецію або інсерцію у варіабельній області або частині, еквівалентній варіабельній області, за умови, що цей мутеїн або варіант зберігає бажану афінність зв'язування або біологічну активність. Мутеїни можуть бути по суті гомологічні або по суті ідентичні вихідному антитілу.The term "mutein" or "variant" may be used interchangeably and refers to a polypeptide sequence of an antibody that contains at least one amino acid substitution, deletion, or insertion in the variable region or a portion equivalent to the variable region, provided that the mutein or variant retains the desired affinity for growth or biological activity. Muteins can be substantially homologous or substantially identical to the parent antibody.

Термін «похідне» стосується, у контексті антитіл даного винаходу, антитіл, ковалентно модифікованих такими способами як убіквітинілювання, кон'югація з терапевтичними або діагностичними агентами, мічення (наприклад, радіонуклідами або різними ферментами), ковалентне приєднання полімеру, таке як пегілюваня (дериватизація поліетиленгліколем), та інсерція або заміна хімічним синтезом неприродних амінокислот. Похідні даного винаходу будуть зберігати зв'язувальні властивості недериватизованих молекул даного винаходу.The term "derivative" refers, in the context of the antibodies of the present invention, to antibodies covalently modified by methods such as ubiquitinylation, conjugation with therapeutic or diagnostic agents, labeling (eg, with radionuclides or various enzymes), covalent attachment of a polymer such as pegylation (derivatization with polyethylene glycol ), and insertion or replacement by chemical synthesis of unnatural amino acids. The derivatives of this invention will retain the binding properties of non-derivatized molecules of this invention.

У даному контексті термін «антитіло» специфічно включає в себе будь-який з наведених нижче компонентів, які зберігають здатність зв'язування позаклітинної частини РЕ ЕК: 1) амінокислотний мутеїн вихідного антитіла, що має амінокислотну послідовність, представлену наIn this context, the term "antibody" specifically includes any of the following components that retain the ability to bind the extracellular portion of PE EC: 1) an amino acid mutein of the parent antibody having the amino acid sequence represented by

Фігурі 7А-7С або Фігурі 8, у тому числі мутеїн, що містить амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга, що є щонайменше на 60, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 9995. гомологічною вихідній амінокислотній послідовності, і/або містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга, що є щонайменше на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 9995 гомологічною вихідній амінокислотній послідовності, з врахуванням подібних амінокислот для визначення гомології; 2) РВАЇА-зв'язувальні поліпептиди, що містять одну або декілька областей, що визначають комплементарність, (СОК) вихідного антитіла, що мають амінокислотну послідовність, представлену наFigures 7A-7C or Figure 8, including a mutein comprising a variable heavy chain amino acid sequence of at least 60, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 , 96, 97, 98 or 9995. homologous to the original amino acid sequence, and/or contains an amino acid sequence of a variable light chain that is at least 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or 9995 homologous original amino acid sequence, taking into account similar amino acids to determine homology; 2) PVAIA-binding polypeptides containing one or more complementarity-determining regions (CROs) of the original antibody having the amino acid sequence represented by

Фігурі 7А-7С або фігурі 8, що переважно містять щонайменше СОКЗ важкого ланцюга і переважно містять дві або більше, або три або більше, або чотири або більше, або п'ять або більше, або всі шість областейFigures 7A-7C or Figure 8, preferably comprising at least one heavy chain SOCZ and preferably comprising two or more, or three or more, or four or more, or five or more, or all six regions

Сов; 3) антитіла, сконструйовані для людини (Нитап Епдіпеегеа м), генеровані зміною вихідної послідовності відповідно до способів, описаних у біцапіска еї аІ,, патент США Мо 5766886 і у прикладі 5 тут, з використанням нумерації Кабата для ідентифікації залишків низького, помірного і високого ризику; такі антитіла містять щонайменше один з наведених нижче важких ланцюгів і щонайменше один з наведених нижче легких ланцюгів: (а) важкий ланцюг, в якому всі з залишків гризуна низького ризику, які відрізняються від відповідних залишків у посилальній послідовності імуноглобуліну людини, модифікували, щоб вони були тими самими, що і залишки людини у посилальній послідовності імуноглобуліну людини, або (р) важкий ланцюг, в якому всі з залишків гризуна низького і помірного ризику модифікували, якщо необхідно, щоб вони були тими самими залишками, що і залишки у посилальній послідовності імуноглобуліну людини, (с) легкий ланцюг, в якому всі з залишків низького ризику модифікували, якщо необхідно, щоб вони були тими самими, що і залишки у посилальній послідовності імуноглобуліну людини, або (4) легкий ланцюг, в якому всі з залишків низького і помірного ризику модифікували, якщо необхідно, щоб вони були тими самими, що і залишки у посилальній послідовності імуноглобуліну людини. 4) мутеїни згаданих вище антитіл попереднього параграфу (3), що містять важкий ланцюг або легкий ланцюг, або варіабельні області важкого або легкого ланцюга, що мають щонайменше 6095 ідентичність амінокислотній послідовності з вихідним легким ланцюгом гризуна, більш переважно щонайменше 8095, більш переважно щонайменше 8595, більш переважно щонайменше 9095 і найбільш переважно щонайменше 9595, у тому числі, наприклад, 6595, 70905, 7595, 80905, 8195, 8295, 8395, 8495, 8595, 869о, 8790, 88905, 89905, 90905, 9195, 9295, 93905, 94905, 95905, 96905, 9795, 9895, 9995 і 10095 ідентичність; 5) РАЇ В-зв'язувальні поліпептиди, що містять залишки високого ризику однієї або декількох областейOwls; 3) human-engineered antibodies (Nytap Epdipegea m) generated by altering the starting sequence according to the methods described in Bisapiska et al., US Pat. risk; such antibodies contain at least one of the following heavy chains and at least one of the following light chains: (a) a heavy chain in which all of the low-risk rodent residues that differ from the corresponding residues in the human immunoglobulin linker sequence have been modified to be the same as human residues in the human immunoglobulin reference sequence, or (p) a heavy chain in which all of the low- and moderate-risk rodent residues have been modified, if necessary, to be the same residues as residues in the human immunoglobulin reference sequence , (c) a light chain in which all of the low-risk residues are modified, if necessary, to be the same as residues in the human immunoglobulin reference sequence, or (4) a light chain in which all of the low- and moderate-risk residues modified, if necessary, to be the same as the residues in the human immunoglobulin reference sequence. 4) muteins of the antibodies of the previous paragraph (3) mentioned above, containing a heavy chain or a light chain, or variable regions of a heavy or light chain, having at least 6095 amino acid sequence identity with the original rodent light chain, more preferably at least 8095, more preferably at least 8595 , more preferably at least 9095 and most preferably at least 9595, including, for example, 6595, 70905, 7595, 80905, 8195, 8295, 8395, 8495, 8595, 869o, 8790, 88905, 89905, 90905, 9195, 93905 , 94905, 95905, 96905, 9795, 9895, 9995 and 10095 identity; 5) RAI B-binding polypeptides containing high-risk residues of one or more regions

СОБК антитіла гризуна і переважно містять залишки високого ризику двох або більше, або трьох або більше, або чотирьох або більше, або п'яти або більше, або всіх шести областей СОБЕ і необов'язково містять одну або декілька змін у залишках низького або помірного ризику; наприклад, що містять одну або декілька змін у залишку низького ризику і консервативні заміни у залишку помірного ризику, або наприклад, що зберігають амінокислотні залишки помірного і високого ризику і містять одну або декілька змін у залишку низького ризику, де зміни включають інсерції, делеції або заміни і можуть бути консервативними замінами або можуть змушувати сконструйоване антитіло бути більш близьким у послідовності до послідовності легкого ланцюга або важкого ланцюга людини, послідовності легкого ланцюга або важкого ланцюга зародкової лінії людини, консенсусної послідовності легкого ланцюга або важкого ланцюга людини або консенсусної послідовності легкого ланцюга або важкого ланцюга зародкової лінії людини. Такі розглянуті зміни можуть бути також зображені у форматі послідовності наступним чином. У гіпотетичній послідовності АККІ МНТРУЗЕКЕОРЕ, де відповідний ризик, розподілений відносно кожного залишку відповідно до 5ішапіска еї аї.,, патент США Ме 5766886, є наступним: НМЕНМНМЕНМЕНМІ. (Невисокий, М-середній, І низький), зразкові зміни відносно залишків низького ризику цієї гіпотетичної послідовності можуть бути зображені як: АКХІ МХТРХ5ЕХЕОХ, деSOBC antibodies of a rodent and preferably contain high-risk residues of two or more, or three or more, or four or more, or five or more, or all six regions of SOBE and optionally contain one or more changes in low- or moderate-risk residues ; e.g., containing one or more changes in a low-risk residue and conservative substitutions in a moderate-risk residue, or e.g., conserving moderate- and high-risk amino acid residues and containing one or more changes in a low-risk residue, where the changes include insertions, deletions, or substitutions and may be conservative substitutions or may cause the engineered antibody to be closer in sequence to a human light chain or heavy chain sequence, a human germline light chain or heavy chain sequence, a human light chain or heavy chain consensus sequence, or a human light chain or heavy chain consensus sequence human germ line. Such considered changes can also be depicted in sequence format as follows. In the hypothetical sequence AKKI MNTRUZEKEORE, where the corresponding risk, distributed with respect to each residue in accordance with the 5ischapiska ei ai.,, US patent Me 5766886, is as follows: NMENMNMENMENMENMI. (Low, M-Medium, I Low), sample changes relative to the low-risk residues of this hypothetical sequence can be represented as:

Х означає будь-яку амінокислоту, або, альтернативно, де Х означає консервативну заміну вихідного залишку у цьому положенні, а зразкові зміни відносно залишків низького і помірного ризику можуть бути зображені аналогічним чином, наприклад, АУХІ УХТУХЗУХЕУХ, де Х означає будь-яку амінокислоту, а М є консервативною заміною вихідного залишку у цьому положенні.X represents any amino acid, or, alternatively, where X represents a conservative replacement of the parent residue at that position, and exemplary changes relative to low- and moderate-risk residues may be depicted similarly, for example, AUHI UHTUHZUHEUH, where X represents any amino acid, and M is a conservative replacement of the parent residue at that position.

Термін "конкуруюче антитіло" включає 1) не мишаче моноклональне антитіло або моноклональне антитіло не гризуна, що зв'язується з тим самим епітопом РКК, що і антитіло СИХНА.0О6.642, СИХНА.06.275, пе.06.642-1, пе.06.642-2, пе.06.275-1,The term "competing antibody" includes 1) a non-mouse monoclonal antibody or a non-rodent monoclonal antibody that binds to the same RKK epitope as the antibody SYHNA.0О6.642, SYHNA.06.275, pe.06.642-1, pe.06.642 -2, pe.06.275-1,

Нпе.06.275-2, Нпе.06.275-3, Нпе.06.275-4. ХРА.06.128, ХРА.0О6.129, ХРА.0О6.130, ХРА.0Об6.131, ХРА.О0О6.141,Npe.06.275-2, Npe.06.275-3, Npe.06.275-4. ХРА.06.128, ХРА.0О6.129, ХРА.0О6.130, ХРА.0Об6.131, ХРА.О0О6.141,

ХРА.Об.147, ХРА.0О6.148, ХРА.0О6.158, ХРА.О0О6.159, ХРА.О0О6.163, ХРА.О0О6.167, ХРА.О0О6.171, ХРА.06.178,ХРА.Об.147, ХРА.0О6.148, ХРА.0О6.158, ХРА.О0О6.159, ХРА.О0О6.163, ХРА.О0О6.167, ХРА.О0О6.171, ХРА.06.178,

ХРА.Об.181, ХРА.0Об6.192, ХРА.0О6.202, ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.О0О6.207, ХРА.О0О6.210, ХРА.06.212,ХРА.Об.181, ХРА.0Об6.192, ХРА.0О6.202, ХРА.0О6.203, ХРА.0О6.206, ХРА.О0О6.207, ХРА.О0О6.210, ХРА.06.212,

ХРА.0Об.217, ХРА.0О6.219, ХРА.06б.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235, ХРА.0О6.239, ХРА.06.145, ХНА.О06.567,ХРА.0Об.217, ХРА.0О6.219, ХРА.06б.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235, ХРА.0О6.239, ХРА.06.145, ХНА.О06.567,

ХНА.06.642, ХНА.О6.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 або ХНА.06.907, наприклад, як визначено за допомогою рентгенівської кристалографії; або 2) не мишаче моноклональне антитіло або моноклональне антитіло не гризуна, що конкурує з антитіломХНА.06.642, ХНА.О6.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 or ХНА.06.907, for example, as determined by X-ray crystallography; or 2) non-mouse monoclonal antibody or non-rodent monoclonal antibody that competes with the antibody

СИХНА.06.642, СИХНА.О6.275, пе.06.642-1, пе.06.642-2, пе.06.275-1, пе.06.275-2, пе.06.275-3, пе.06.275-4,SYHNA.06.642, SYHNA.О6.275, pe.06.642-1, pe.06.642-2, pe.06.275-1, pe.06.275-2, pe.06.275-3, pe.06.275-4,

ХРА.Об6.128, ХРА.0Об6.129, ХРА.0О6.130, ХРА.О0Об6.131, ХРА.0О6б.141, ХРА.О0О6.147, ХРА.О0О6.148, ХРА.06.158,ХРА.Об6.128, ХРА.0Об6.129, ХРА.0О6.130, ХРА.О0Об6.131, ХРА.0О6б.141, ХРА.О0О6.147, ХРА.О0О6.148, ХРА.06.158,

ХРА.О6.159, ХРА.0О6б.163, ХРА.0О6.167, ХРА.0О6.171, ХРА.О0О6.178, ХРА.0О6.181, ХРА.О0О6.192, ХРА.06.202,ХРА.О6.159, ХРА.0О6б.163, ХРА.0О6.167, ХРА.0О6.171, ХРА.О0О6.178, ХРА.0О6.181, ХРА.О0О6.192, ХРА.06.202,

ХРА.0Об.203, ХРА.0О6б.206, ХРА.0О6.207, ХРА.0О6.210, ХРА.О06.212, ХРА.О0О6.217, ХРА.О0О6.219, ХРА.06.229,ХРА.0Об.203, ХРА.0О6б.206, ХРА.0О6.207, ХРА.0О6.210, ХРА.О06.212, ХРА.О0О6.217, ХРА.О0О6.219, ХРА.06.229,

ХРА.0Об.233, ХРА.0О6.235, ХРА.0Об.239, ХРА.0О6.145, ХНА.06б.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983, ХНА.О06.275,ХРА.0Об.233, ХРА.0О6.235, ХРА.0Об.239, ХРА.0О6.145, ХНА.06б.567, ХНА.06.642, ХНА.06.983, ХНА.О06.275,

ХНА.06.189 або ХНА.О06.907 на більш ніж 7595, більш ніж 8095 або більш ніж 8195, 8295, 8395, 8495, 8595, 8695, 8795, 8895, 89905, 9095, 9195, 9290, 9390, 9495 або 9595; альтернативно, не мишаче моноклональне антитіло або моноклональне антитіло не гризуна, що зменшує зв'язування СПХНА.06.642, СПИХНА.06.275, пе.06.642-1,ХНА.06.189 or ХНА.О06.907 by more than 7595, more than 8095 or more than 8195, 8295, 8395, 8495, 8595, 8695, 8795, 8895, 89905, 9095, 9195, 9290, 9390, 9495, or 95 alternatively, a non-mouse monoclonal antibody or a non-rodent monoclonal antibody that reduces the binding of SPKHNA.06.642, SPKHNA.06.275, pe.06.642-1,

Нпе.06.642-2, Нпе.06.275-1, Не.06.275-2, Ппе.06.275-3, Нпе.06.275-4, ХРА.06.128, ХРА.0О6.129, ХРА.О0О6.130,Нпе.06.642-2, Нпе.06.275-1, Не.06.275-2, Ппе.06.275-3, Нпе.06.275-4, ХРА.06.128, ХРА.0О6.129, ХРА.О0О6.130,

ХРА.Об.131, ХРА.0Об.141, ХРА.О0Об.147, ХРА.0О6.148, ХРА.О0О6.158, ХРА.О0О6.159, ХРА.О0О6.163, ХРА.06.167,ХРА.Об.131, ХРА.0Об.141, ХРА.О0Об.147, ХРА.0О6.148, ХРА.О0О6.158, ХРА.О0О6.159, ХРА.О0О6.163, ХРА.06.167,

ХРА.Об.171, ХРА.0Об6.178, ХРА.0О6.181, ХРА.О0О6.192, ХРА.06.202, ХРА.0О6.203, ХРА.О0О6.206, ХРА.06.207,ХРА.Об.171, ХРА.0Об6.178, ХРА.0О6.181, ХРА.О0О6.192, ХРА.06.202, ХРА.0О6.203, ХРА.О0О6.206, ХРА.06.207,

ХРА.0Об.210, ХРА.0О6.212, ХРА.0О6б.217, ХРА.О06.219, ХРА.06.229, ХРА.0О6.233, ХРА.О0О6.235, ХРА.06.239,ХРА.0Об.210, ХРА.0О6.212, ХРА.0О6б.217, ХРА.О06.219, ХРА.06.229, ХРА.0О6.233, ХРА.О0О6.235, ХРА.06.239,

ХРА.06.145, ХНА.0О6.567, ХНА.0О6.642, ХНА.0О6.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 або ХНА.06.907 щонайменше у 2,3,4,5, 6, 10, 20, 50, 100 разів або більше. В одному варіанті здійснення це не мишаче моноклональне антитіло або моноклональне антитіло не гризуна знаходиться у 50-кратному молярному надлишку.ХРА.06.145, ХНА.0О6.567, ХНА.0О6.642, ХНА.0О6.983, ХНА.06.275, ХНА.06.189 or ХНА.06.907 at least in 2,3,4,5, 6, 10, 20, 50 , 100 times or more. In one embodiment, the non-mouse monoclonal antibody or non-rodent monoclonal antibody is present in a 50-fold molar excess.

Антитіла за винаходом переважно зв'язуються з ЕСО РВІЕ з рівноважною константою дисоціації 105 М, 1107 М, 108 М, 109 М, 1079 М, 10-11 М, 1072 М або більш низькою і переважно інгібують внутрішньоклітинне фосфорилування РК. К і активацію передачі сигналу РКІ К далі по ходу процесу, наприклад, за допомогою активації ЗТАТ5, МАРК або АКТ.Antibodies according to the invention preferably bind to ESO RVIE with an equilibrium dissociation constant of 105 M, 1107 M, 108 M, 109 M, 1079 M, 10-11 M, 1072 M or lower and preferably inhibit intracellular phosphorylation of RK. K and activation of RKI K signal transmission further along the process, for example, by activating ZTAT5, MARK or AKT.

Необов'язково будь-яке химерне антитіло, антитіло людини або гуманізоване антитіло, публічно розкрите до дати подачі цієї заявки або розкрите у заявці, поданій до дати подачі цієї заявки, виключене з обсягу даного винаходу.Optionally, any chimeric antibody, human antibody, or humanized antibody publicly disclosed prior to the filing date of this application or disclosed in an application filed prior to the filing date of this application is excluded from the scope of this invention.

Моноклональним антитілом "не гризуна" є будь-яке антитіло, визначене у широкому змісті тут, що не є повним інтактним моноклональним антитілом гризуна, генерованим гібридомою гризуна. Таким чином, антитіла не гризуна конкретно включають, але не обмежуються ними, мутеїни антитіл гризуна, фрагменти антитіл гризуна, лінійні антитіла, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, сконструйовані для людини антитіла Нитап Епдіпеегеа'м і антитіла людини, у тому числі антитіла людини, одержані з трансгенних тварин або технологією фагового дисплею. Подібним чином, не мишачі антитіла включають, але не обмежуються ними, мутеїни мишачих антитіл, фрагменти мишачих антитіл, лінійні антитіла, химерні, гуманізовані, сконструйовані для людини (Нитап Епадіпеегей" м) і антитіла людини.A "non-rodent" monoclonal antibody is any antibody, broadly defined herein, that is not a complete intact rodent monoclonal antibody generated by a rodent hybridoma. Thus, non-rodent antibodies specifically include, but are not limited to, rodent antibody muteins, rodent antibody fragments, linear antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, engineered human antibodies, and human antibodies, including human derived antibodies. from transgenic animals or phage display technology. Similarly, non-mouse antibodies include, but are not limited to, murine antibody muteins, murine antibody fragments, linear antibodies, chimeric, humanized, engineered for humans (Nytap Epadipeegei) and human antibodies.

Антиген-мішеньTarget antigen

Антигеном-мішенню для застосування для одержання антитіл може бути, наприклад, позаклітинна частина РЕК або фрагмент, що зберігає бажаний епітоп, необов'язково злиті з іншим поліпептидом, що дозволяє цьому епітопу бути представленим в його нативній конформації. Альтернативно, для генерування антитіл може бути використаний інтактний РЕК, що експресується на поверхні клітин. Такі клітини можуть бути трансформовані для експресії РЕ Е або можуть бути іншими природними клітинами, які експресуютьThe target antigen for use in the production of antibodies can be, for example, the extracellular part of REK or a fragment that retains the desired epitope, optionally fused with another polypeptide, which allows this epitope to be presented in its native conformation. Alternatively, intact REC expressed on the surface of cells can be used to generate antibodies. Such cells can be transformed to express PE E or can be other natural cells that express

РЕК. Інші форми поліпептидів РЕ. ЕК, застосовні для генерування антитіл, будуть очевидні кваліфікованим у даній галузі фахівцям.REC. Other forms of PE polypeptides. ECs applicable to the generation of antibodies will be apparent to those skilled in the art.

Поліклональні антитілаPolyclonal antibodies

Поліклональні антитіла переважно індукуються у тварин множинними підшкірними (5с) або внутрішньочеревинними (ір) ін'єкціями відповідного антигену і ад'юванту. Поліпшена реакція у вигляді антитіл може бути одержана кон'югуванням відповідного антигену з білком, що є імуногенним у вигляді, що повинен бути імунізований, наприклад, гемоціаніном морського блюдця, сироватковим альбуміном, бичачим тироглобуліном або інгібітором трипсину сої, з використанням біфункціонального або дериватизуючого агента, наприклад, ефіру малеімідобензоїлсульфосукциніміду (кон'югацією через залишки цистеїну), М-гідроксисукциніміду (через залишки лізину), глутарового альдегіду, бурштинового ангідриду або інших агентів, відомих у даній галузі.Polyclonal antibodies are mainly induced in animals by multiple subcutaneous (5c) or intraperitoneal (ip) injections of the appropriate antigen and adjuvant. An improved antibody response can be obtained by conjugating the appropriate antigen to a protein that is immunogenic in the form to be immunized, for example, sea bass hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, or soybean trypsin inhibitor, using a bifunctional or derivatizing agent. for example, maleimidobenzoylsulfosuccinimide ester (via conjugation via cysteine residues), M-hydroxysuccinimide (via lysine residues), glutaraldehyde, succinic anhydride, or other agents known in the art.

Тварин імунізують проти цього антигену, імуногенних кон'югатів або похідних об'єднанням, наприклад, 100 мкг або 5 мкг білка або кон'югату (для кроликів або мишей, відповідно) з З об'ємами повного ад'ювантуAnimals are immunized against this antigen, immunogenic conjugates or derivatives by combining, for example, 100 μg or 5 μg of protein or conjugate (for rabbits or mice, respectively) with C volumes of complete adjuvant

Фрейнда та ін'єкцією цього розчину інтрадермально у множинних сайтах. Через один місяць цих тварин вдруге імунізують 1/5 - «часток (1/10)) вихідної кількості пептиду або кон'югату у повному ад'юванті Фрейнда підшкірною ін'єкцією у множинних сайтах. На 7-14 дні після бустер-ін'єкції у тварин беруть кров і одержану сироватку аналізують на титр антитіл. Бустер-ін'єкції тварин повторюють, доки титр не вийде на плато.Freund and injection of this solution intradermally in multiple sites. One month later, these animals are immunized a second time with 1/5 - "part (1/10)) of the original amount of peptide or conjugate in Freund's complete adjuvant by subcutaneous injection at multiple sites. On 7-14 days after the booster injection, blood is taken from the animals and the serum obtained is analyzed for the antibody titer. Booster injections of animals are repeated until the titer reaches a plateau.

Переважно тварину реімунізують тим самим антигеном, але кон'югованим з відмінним білком, і/або з використанням відмінного зшивального реагенту. Кон'югати можуть бути також одержані у культурі рекомбінантних клітин у вигляді злитих білків. Для посилення імунної реакції зручно використовувати також агрегуючі агенти, такі як квасці.Preferably, the animal is reimmunized with the same antigen, but conjugated with a different protein, and/or using a different cross-linking reagent. Conjugates can also be obtained in the culture of recombinant cells in the form of fusion proteins. It is also convenient to use aggregating agents, such as alum, to enhance the immune response.

Моноклональні антитілаMonoclonal antibodies

Моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням гібридомного способу, вперше описаного Копіег еї аї!., Майшге, 256:495 (1975), або можуть бути одержані способами рекомбінантних ДНК.Monoclonal antibodies can be obtained using the hybridoma method, first described in Kopieg ei ai!., Maishge, 256:495 (1975), or can be obtained by recombinant DNA methods.

У гібридомному способі мишу або іншу придатну тварину-хазяїна, таку як хом'ячок або мавпа (макака), імунізують, як описано тут, для індукції лімфоцитів, які продукують або здатні продукувати антитіла, які будуть специфічно зв'язуватися з білком, використовуваним для імунізації. Альтернативно, лімфоцити можуть бути імунізовані іп міго. Потім лімфоцити зливають з мієломними клітинами з використанням придатного агента злиття, такого як поліетиленгліколь, для утворення гібридомної клітини (содіпод,In the hybridoma method, a mouse or other suitable animal host, such as a hamster or monkey (macaque), is immunized as described herein to induce lymphocytes that produce or are capable of producing antibodies that will specifically bind to the protein used to immunization Alternatively, lymphocytes can be immunized ip migo. The lymphocytes are then fused with myeloma cells using a suitable fusion agent such as polyethylene glycol to form a hybridoma cell (sodipod,

Мопосіопаї Апіїбодієв: Ргіпсірієз апа Ргасіїсє, рр. 59-103 (Асадетіс Ргезз, 1986)), або вони можуть бути злиті з використанням злиття із застосуванням електроелементу.Moposiopai Apiibodiev: Rgipsiriez apa Rgasiise, pp. 59-103 (Asadetis Rgezz, 1986)), or they can be fused using electrofusion.

Гібридомні клітини, одержані таким чином, висівають і вирощують у придатному культуральному середовищі, що переважно містить одну або декілька речовин, які інгібують ріст або виживаність незлитих, вихідних мієломних клітин. Наприклад, якщо вихідні мієломні клітини позбавлені ферменту гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (НОРКЕТ або НРЕТ), це культуральне середовище для гібридом буде звичайно включати гіпоксантин, аміноптерин і тимідин (НАТ-середовище), які запобігають росту НОРКТ-недостатніх клітин.Hybridoma cells obtained in this way are seeded and grown in a suitable culture medium, which preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused, original myeloma cells. For example, if the original myeloma cells lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (NORKET or HRET), this hybridoma culture medium will usually include hypoxanthine, aminopterin, and thymidine (HAT medium), which prevent the growth of NORKT-deficient cells.

Переважними мієломними клітинами є клітини, які ефективно зливаються, підтримують стабільне продукування високого рівня антитіла відібраними антитіло-продукуючими клітинами і є чутливими до середовища. Лінії клітин мієломи людини і гетеромієломи миша-людина також були описані для одержання моноклональних антитіл людини (Когброг, .). Іттипої!., 133:3001 (1984); Вгодеиг еї аї!., Мопосіопа! АпіїродуPreferred myeloma cells are cells that fuse efficiently, support stable high-level antibody production by selected antibody-producing cells, and are sensitive to the environment. Human myeloma and murine-human heteromyeloma cell lines have also been described for the production of human monoclonal antibodies (Kogbrog, .). Ittipoi!., 133:3001 (1984); Wgodeig ei ai!., Moposiopa! Apiirodu

Ргодисіоп Тесппідоез апа Арріїсайоп5, рр. 51-63 (Магсе! ОеккКег, Іпс., Мему Могк, 1987)). Зразкові лінії мишачої мієломи включають в себе лінії одержані з пухлин мишей МОР-21 і М.С.-11, доступні з заїкRhodisiop Thesppidoes apa Arriisaiop5, pp. 51-63 (Magse! OekkKeg, Ips., Memu Mogk, 1987)). Exemplary mouse myeloma lines include mouse tumor-derived lines MOR-21 and M.S.-11, available from rabbits

Іпеійше Сеї! Оівііршіоп Сепіег, Зап Оіедо, Саїй. ОБА, і клітини 5Р-2 або Хб63-Ад8-653, доступні зGreat Seiya! Oivirshiop Sepieg, Zap Oiedo, Saiy. BOTH and 5P-2 or Xb63-Ad8-653 cells are available from

Американської Колекції Типових Культур (Атегісап Туре Сийшге СоїПесіп, Коскміе, Ма. ОА).of the American Collection of Typical Cultures (Ategisap Toure Siyshge SoiPesip, Koskmieh, MA. OA).

Культуральне середовище, в якому вирощують гібридомні клітини, аналізують на продукування моноклональних антитіл, направлених проти цього антигену. Переважно, специфічність зв'язування моноклональних антитіл, продукованих гібридомними клітинами, визначають імунопреципітацією або за допомогою аналізу зв'язування іп мйго, такого як радіоїмуноаналіз (КІА) або твердофазовий імуноферментний аналіз (ЕГІ5А). Афінність зв'язування моноклонального антитіла може бути визначена, наприклад, аналізом Скетчарда (Мипзоп еї аї., Апаї. Віоспет., 107:220 (1980)).The culture medium in which the hybridoma cells are grown is analyzed for the production of monoclonal antibodies directed against this antigen. Preferably, the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by means of an Ip binding assay, such as radioimmunoassay (RIA) or solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay (SIA). The binding affinity of a monoclonal antibody can be determined, for example, by the Sketchard assay (Mipzop et al., Apai. Viospet., 107:220 (1980)).

Після ідентифікації гібридомних клітин, які продукують антитіла бажаної специфічності, афінності і/або активності, ці клони можуть бути субклоновані процедурами лімітуючого розведення і вирощені стандартними способами (Содіпд, Мопосіопа! Апііродіев: Ргіпсірієз апа Ргасіїсе, рр.59-103 (Асадетіс Ргевв5, 1986)). Придатні культуральні середовища для цієї мети включають в себе, наприклад, середовище О-МЕМ або середовище ЕРМІ-1640. Крім того, гібридомні клітини можуть бути вирощені іп мімо у вигляді асцитних пухлин у тварині. Моноклональні антитіла, що секретуються цими субклонами, переважно відділяють від культурального середовища, асцитної рідини або сироватки загальноприйнятими процедурами очищення імуноглобулінів, такими як, наприклад, білок А-сефарозна, гідроксіапатитна хроматографія, гель- електрофорез, діаліз або афінна хроматографія.After the identification of hybridoma cells that produce antibodies of the desired specificity, affinity and/or activity, these clones can be subcloned by limiting dilution procedures and grown by standard methods (Sodipd, Moposiopa! Apiirodiev: Rgipsiriez apa Rgasiise, pp. 59-103 (Asadetis Rgevv5, 1986 )). Suitable culture media for this purpose include, for example, O-MEM medium or ERMI-1640 medium. In addition, hybridoma cells can be grown i.p. mimo in the form of ascites tumors in an animal. Monoclonal antibodies secreted by these subclones are preferably separated from the culture medium, ascitic fluid, or serum by conventional immunoglobulin purification procedures, such as, for example, protein A-sepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, or affinity chromatography.

ДНК, що кодує моноклональні антитіла, може бути виділена і секвенована з гібридомних клітин з використанням загальноприйнятих процедур (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, які здатні зв'язуватися специфічно з генами, що кодують важкий і легкий ланцюги цих моноклональних антитіл). Визначення послідовності буде звичайно потребувати виділення щонайменше частини гена, що представляє інтерес, або кКДНК, що представляє інтерес. Звичайно це потребує клонування ДНК або, переважно, мРНК (тобто кДНК), що кодує ці моноклональні антитіла. Клонування проводять з використанням стандартних способів (див., наприклад, керівництво Затьгоок еї а!. (1989) Моїіесшаг Сіопіпо:DNA encoding monoclonal antibodies can be isolated and sequenced from hybridoma cells using conventional procedures (for example, using oligonucleotide probes capable of binding specifically to the genes encoding the heavy and light chains of these monoclonal antibodies). Determining the sequence will usually require isolation of at least a portion of the gene of interest or the cDNA of interest. This usually requires cloning of the DNA or, preferably, the mRNA (i.e. cDNA) encoding these monoclonal antibodies. Cloning is carried out using standard methods (see, for example, the guide Zatgook ei a!. (1989) Moiiesshag Siopipo:

А Іарогаюгу Стшіде, Мої 1-3, Сої4 БЗргіпд Нагрог Ргез5, що включене сюди як посилання). Наприклад, бібліотека кДНК може бути сконструйована зворотною транскрипцією поліА- мРНК, переважно мембраноасоційованою мРНК, і ця бібліотека може бути піддана скринінгу з використанням зондів,And Iarogayugu Stshide, Moi 1-3, Soi4 BZrgipd Nagrog Rgez5, which is incorporated herein by reference). For example, a cDNA library can be constructed by reverse transcription of polyA mRNA, preferably a membrane-associated mRNA, and this library can be screened using probes that

специфічних для послідовностей генів поліпептидів імуноглобуліну людини. Однак, у переважному варіанті здійснення використовують полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) для ампліфікації КкДНК (або частин повнорозмірних КДНК), що кодує генний сегмент імуноглобуліну, що представляє інтерес (наприклад, варіабельний сегмент легкого ланцюга). Ці ампліфіковані послідовності можуть бути легко клоновані у придатний вектор, наприклад, в експресуючі вектори, мінігенні вектори або вектори фагового дисплею.specific for human immunoglobulin polypeptide gene sequences. However, in a preferred embodiment, polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify cDNA (or portions of full-length cDNA) encoding the immunoglobulin gene segment of interest (eg, the light chain variable segment). These amplified sequences can be easily cloned into a suitable vector, for example, into expression vectors, minigene vectors or phage display vectors.

Буде зрозуміло, що конкретний спосіб клонування не є вирішальним, доки можна визначати послідовність деякої частини поліпептиду імуноглобуліну, що представляє інтерес. У даному контексті «виділена» молекула нуклеїнової кислоти або «виділена» послідовність нуклеїнової кислоти є молекулою нуклеїнової кислоти, яка або (1) ідентифікована і відділена щонайменше від однієї забруднюючої молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона звичайно асоційована у природному джерелі цієї нуклеїнової кислоти, або (2) клонована, ампліфікована, мічена або іншим чином відрізнена від нуклеїнових кислот фону, так що ця послідовність нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, може бути визначена, і вважається виділеною.It will be understood that the particular method of cloning is not critical as long as the sequence of some portion of the immunoglobulin polypeptide of interest can be determined. As used herein, an "isolated" nucleic acid molecule or "isolated" nucleic acid sequence is a nucleic acid molecule that is either (1) identified and separated from at least one contaminating nucleic acid molecule with which it is normally associated in the natural source of that nucleic acid, or (2) cloned, amplified, labeled, or otherwise distinguished from background nucleic acids so that the nucleic acid sequence of interest can be determined, and is considered isolated.

Виділена молекула нуклеїнової кислоти є іншою, ніж ця молекула у формі або оточенні, в яких вона виявляється у природі. Таким чином, виділені молекули нуклеїнових кислот відрізняються від молекули нуклеїнової кислоти у тому вигляді, в якому вона існує у природних клітинах. Однак, виділена молекула нуклеїнової кислоти включає в себе молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься у клітинах, які звичайно експресують це антитіло, де, наприклад, ця молекула нуклеїнової кислоти знаходиться у місці розташування хромосоми, яке відрізняється від місця розташування природних клітин.An isolated nucleic acid molecule is different from the form or environment in which it occurs in nature. Thus, isolated nucleic acid molecules differ from the nucleic acid molecule in the form in which it exists in natural cells. However, an isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule found in cells that normally express that antibody, where, for example, that nucleic acid molecule is in a location on the chromosome that is different from the location of native cells.

Одним джерелом РНК, використовуваним для клонування і секвенування, є гібридома, вироблена одержанням В-клітини з трансгенної миші і злиттям цієї В-клітини з іморталізованою клітиною. Перевага використання гібридом полягає у тому, що вони можуть бути легко піддані скринінгу, і відбирають гібридому, що продукує моноклональне антитіло людини, що представляє інтерес. Альтернативно, РНК може бути виділена з В-клітин (або цілої селезінки) імунізованої тварини. При використанні джерел, інших, ніж гібридоми, може бути бажаним скринінг на послідовності, що кодують імуноглобуліни або поліпептиди імуноглобулінів зі специфічними характеристиками зв'язування. Одним способом для такого скринінгу є застосування технології фагового дисплею. Фаговий дисплей описаний, наприклад, у роботах Ооуег еї аї.,One source of RNA used for cloning and sequencing is a hybridoma produced by obtaining a B cell from a transgenic mouse and fusing this B cell with an immortalized cell. The advantage of using hybridomas is that they can be easily screened and select hybridomas that produce the human monoclonal antibody of interest. Alternatively, RNA can be isolated from B cells (or the whole spleen) of an immunized animal. When using sources other than hybridomas, it may be desirable to screen for sequences encoding immunoglobulins or immunoglobulin polypeptides with specific binding characteristics. One method for such screening is the use of phage display technology. Phage display is described, for example, in the works of Ooueg ei ai.,

МО 91/17271, МеСапнепу еї аї., МО 92/01047 і Саюп апа Коргомув5кі, Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 87:6450-6454 (1990), кожна з яких включена сюди як посилання. В одному варіанті здійснення з використанням технології фагового дисплею, кКДНК з імунізованої трансгенної миші (наприклад, загальну кДНК селезінки) виділяють, використовують полімеразну ланцюгову реакцію для ампліфікації послідовностей кДНК, які кодують частину поліпептиду імуноглобуліну, наприклад, області СОЕК, і ампліфіковані послідовності інсертують у фаговий вектор. КДНК, що кодують пептиди, що представляють інтерес, наприклад, пептиди варіабельних областей, з бажаними характеристиками зв'язування, ідентифікують стандартними способами, такими як пенінг.MO 91/17271, MeSapnepu eyi ai., MO 92/01047 and Sayup apa Korgomuv5ki, Rhos. Mai). Asad 5 BOTH, 87:6450-6454 (1990), each of which is incorporated herein by reference. In one embodiment using phage display technology, cDNA from an immunized transgenic mouse (e.g., total spleen cDNA) is isolated, polymerase chain reaction is used to amplify cDNA sequences that encode a portion of an immunoglobulin polypeptide, e.g., the SOEC region, and the amplified sequences are inserted into a phage vector. cDNAs encoding peptides of interest, such as variable region peptides, with desired binding characteristics are identified by standard methods such as panning.

Потім визначають послідовність цієї ампліфікованої або клонованої нуклеїнової кислоти. Звичайно визначають послідовність, що кодує повну варіабельну область поліпептиду імуноглобуліну, однак, іноді буде достатнім секвенування тільки частини варіабельної області, наприклад, СОВ-кодуючої частини.The sequence of this amplified or cloned nucleic acid is then determined. Usually, the sequence encoding the complete variable region of the immunoglobulin polypeptide is determined, however, sometimes it will be sufficient to sequence only part of the variable region, for example, the SOV-coding part.

Звичайно частина, що секвенується, буде мати довжину 30 основ, більш часто будуть секвенуватися основи, які кюдують щонайменше приблизно одну третину або щонайменше приблизно половину довжини варіабельної області.Typically, the sequenced portion will be 30 bases long, more often bases that span at least about one-third or at least about half the length of the variable region will be sequenced.

Секвенування може проводитися на клонах, виділених з бібліотеки кКДНК або, при використанні ПЛР, після субклонування ампліфікованої послідовності або прямим ПЛР-секвенуванням ампліфікованого сегменту. Секвенування проводять з використанням стандартних способів (див., наприклад, керівництво затьгоок еї а!. (1989) МоіІесшаг Сіопіпо: А І арогаюгу Сшпціде, Моїв 1-3, Соїай Зргіпд Нагрог Ргезз і Запдег, Р. еї а. (1977) Ргос. Май. Асай. сі. БА 74:5463-5467, які включені сюди як посилання). За допомогою порівняння послідовності клонованої нуклеїнової кислоти з опублікованими послідовностями генів і кКДНК імуноглобулінів людини, кваліфікований у даній галузі фахівець буде здатний легко визначити, в залежності від секвенованої області, (і) використання сегмента зародкової лінії гібридомного поліпептиду імуноглобуліну (у тому числі ізотипу важкого ланцюга) і (її) послідовність варіабельних областей важкого і легкого ланцюга, у тому числі послідовностей, що походять з додавання М-області і процесу соматичної мутації. Одним джерелом інформації послідовностей генів імуноглобулінів є Майопа! Сепіег ТогSequencing can be performed on clones selected from a cDNA library or, when using PCR, after subcloning of the amplified sequence or direct PCR sequencing of the amplified segment. Sequencing is carried out using standard methods (see, for example, the manual of zatgook ei a!. (1989) MoiIesshag Siopipo: A I arogayugu Sshptside, Moiv 1-3, Soiai Zrgipd Nagrog Rgezz and Zapdeg, R. ei a. (1977) Rgos May Asai Si BA 74:5463-5467, which are incorporated herein by reference). By comparing the cloned nucleic acid sequence with published human immunoglobulin gene and cDNA sequences, one skilled in the art will be able to readily determine, depending on the region sequenced, (i) the use of the germline segment of the immunoglobulin hybridoma polypeptide (including the heavy chain isotype) and (its) sequence of the variable regions of the heavy and light chain, including sequences derived from the addition of the M-region and the process of somatic mutation. One source of information on immunoglobulin gene sequences is Myopa! Sepieg Tog

Віотесппоіоду Іпіогтайоп, Майбопаї І Іргагу ої Медісіпе, Мабіопаї! Іпеійшез ої Неаїт, Веїпезаа, ма.Viotesppoiodu Ipiogtaiop, Maibopai And Irgagu oi Medisipe, Mabiopai! Ipeijshez oi Neait, Veipezaa, ma.

Фрагменти антитілFragments of antibodies

Як зазначалося вище, фрагменти антитіл містять частину інтактного повнорозмірного антитіла, переважно антигензв'язувальну або варіабельну область інтактного антитіла, і включають лінійні антитіла і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Необмежувальні приклади фрагментів антитіл включають в себе Раб, Рар Е(ар)», Ем, га, домен-антитіло (АБ), фрагменти області, що визначає комплементарність (СОК), одноланцюжкові антитіла (5СЕм), фрагменти одноланцюжкових антитіл, димерні антитіла, тримерні антитіла, тетрамерні антитіла, міні-антитіла, лінійні антитіла, хелатоутворюючі рекомбінантні антитіла, тримерні антитіла або бі-антитіла, інтра-антитіла, нано-антитіла, малі модульні імунофармацевтичні речовини (ЗМІР), злитий білок антигензв'язувальний домен-імуноглобулін, верблюдизоване антитіло, МНН-вмісне антитіло, або їх мутеїни або похідні, і поліпептиди, які містять щонайменше частину імуноглобуліну, яка є достатньою для надання зв'язування специфічного антигену цьому поліпептиду, таку як СОБК-послідовність, доки це антитіло зберігає бажану біологічну активність. Такі фрагменти антитіл можуть бути одержані модифікацією цілих антитіл або синтезовані де помо з використанням технологій рекомбінантних ДНК або пептидного синтезу.As noted above, antibody fragments contain part of an intact full-length antibody, preferably an antigen-binding or variable region of an intact antibody, and include linear antibodies and multispecific antibodies formed from antibody fragments. Non-limiting examples of antibody fragments include Rab, Rar, E(ar), Em, Ha, antibody domain (AB), complementarity-determining region (CDO) fragments, single-chain antibodies (5Cem), single-chain antibody fragments, dimeric antibodies, trimeric antibodies, tetrameric antibodies, mini-antibodies, linear antibodies, chelating recombinant antibodies, trimeric antibodies or bi-antibodies, intra-antibodies, nano-antibodies, small modular immunopharmaceuticals (SMIs), antigen-binding domain-immunoglobulin fusion protein, camelized an antibody, an INN-containing antibody, or muteins or derivatives thereof, and polypeptides that contain at least a portion of an immunoglobulin that is sufficient to confer binding of a specific antigen to that polypeptide, such as a SOBK sequence, as long as the antibody retains the desired biological activity. Such fragments of antibodies can be obtained by modification of whole antibodies or synthesized de pomo using technologies of recombinant DNA or peptide synthesis.

Термін "димерні антитіла" стосується малих фрагментів антитіл з сайтами, що зв'язують два антигени, причому ці фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (МН), з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (М) в одному і тому ж поліпептидному ланцюгу (МН М). За допомогою застосування лінкера, що є занадто коротким, щоб дозволити спарювання між цими двома доменами на одному і тому ж ланцюгу, домени змушують спарюватися з комплементарними доменами іншого ланцюга і створювати сайти, що зв'язують два антигени. Димерні антитіла описані більш повно, наприклад, в ЕР 404097; УМО 93/11161 і 30 Ноїподег еї а!., Ргос. Маї). Асай. сі. ОБА, 90:6444-6448 (1993). "Одноланцюжкові Ем" або "зсЕу" фрагменти антитіл містять домени Мн і Мі антитіла, де ці домени присутні в єдиному поліпептидному ланцюгу і необов'язково містять поліпептидний лінкер між доменами Мн і Му, що дозволяє Ем утворювати бажану структуру для зв'язування антигену (Віга еї а!., Зсіепсе 242:423- 426, 1988, і Низюп еї а!., Ргос. Май). Асай. 5сі ОА 85:5879-5883, 1988). Еа-фрагмент складається з доменівThe term "dimeric antibodies" refers to small antibody fragments with binding sites for two antigens, and these fragments contain a heavy chain variable domain (MH) linked to a light chain variable domain (M) in the same polypeptide chain ( MN M). By using a linker that is too short to allow pairing between these two domains on the same chain, the domains are forced to pair with complementary domains on the other chain and create binding sites for the two antigens. Dimeric antibodies are described more fully, for example, in EP 404097; UMO 93/11161 and 30 Noipodeg ei a!., Rhos. Mai). Asai. si. BOTH, 90:6444-6448 (1993). "Single-chain Em" or "csEu" fragments of antibodies contain the Mn and Mi domains of the antibody, where these domains are present in a single polypeptide chain and optionally contain a polypeptide linker between the Mn and Mu domains, which allows the Em to form the desired structure for antigen binding ( Viga ei a!., Zsiepse 242:423-426, 1988, and Nyzyup ei a!., Rgos. May). Asai. 5si OA 85:5879-5883, 1988). The Ea fragment consists of domains

Мн і Сн1.Mn and Sn1.

Додатковий фрагмент антитіла включає фрагмент домену антитіла (аАбБ) (М/ага еї аї., Маиге 341:544- 546, 1989), що складається з домену Мн. "Лінійні антитіла" містять пару тандемних Ра-сегментів (Мн-Сні-Мн-Сн!), які утворюють пару антигензв'язувальних областей. Лінійні антитіла можуть бути біспецифічними або моноспецифічними (7араа єї а. Ргоївїп Епад. 8:1057-62 (1995)). "Міні-антитіло", що складається з 5сЕм, злитого з СНЗ через пептидний лінкер (без шарніра) або через шарнір Ідс, було описане в Оіаїзеп, еї аі!., Ргоївіп Епд Оез Зеї. 2004 Арг; 17(4):315-23.An additional fragment of the antibody includes a fragment of the antibody domain (aAbB) (M/aga ei ai., Maige 341:544-546, 1989), consisting of the Mn domain. "Linear antibodies" contain a pair of tandem Ra-segments (Mn-Sni-Mn-Sn!), which form a pair of antigen-binding regions. Linear antibodies can be bispecific or monospecific (7araa eyi a. Rgoivip Epad. 8:1057-62 (1995)). A "mini-antibody" consisting of 5cEm fused to SNPs via a peptide linker (no hinge) or via an Ids hinge was described in Oiaizep, ei ai!., Rgoivip Epd Oez Zei. 2004 Arg; 17(4):315-23.

Функціональні антитіла важкого ланцюга, позбавлені легких ланцюгів, зустрічаються у природі у вусатих акулах-няньках (Сгеепрбего еї аї., Маїшге 374:168-73, 1995), килимових акулах (воббегонгах) (мМипйаї еї аї., МоїFunctional heavy chain antibodies devoid of light chains are found in nature in whiskered nurse sharks (Sgeeprbego ei ai., Maishge 374:168-73, 1995), carpet sharks (wobbegongs) (mMypyai ei ai., Moi

Іттипої. 38:313-26, 2001), Сатеїїдає (Натегв5-Сазіептап сеї аї., Майте 363:446-8, 1993; Модиуеп еї аї., 9У. Мо).And so on. 38:313-26, 2001), Sateyidaye (Nategv5-Sazieptap sei ai., Mayte 363:446-8, 1993; Modiuep ei ai., 9U. Mo).

Віої. 275:413, 1998), таких як верблюди, дромедари, альпаки і лами. Антигензв'язувальний сайт у цих тваринах зменшений до єдиного домену, домену МНн. Ці антитіла утворюють антигензв'язувальні області з використанням тільки варіабельної області важкого ланцюга, тобто ці функціональні антитіла є гомодимерами тільки важких ланцюгів, що мають структуру Н»і 2 (називаними "антитілами важких ланцюгів" або "НСАБ"). Повідомлялося, що верблюдизований Мнн рекомбінується з константними областями Ідсае іVioi 275:413, 1998), such as camels, dromedaries, alpacas and llamas. The antigen-binding site in these animals is reduced to a single domain, the MNn domain. These antibodies form antigen-binding regions using only the variable region of the heavy chain, that is, these functional antibodies are homodimers of only the heavy chains having the H»i 2 structure (called "heavy chain antibodies" or "NSAB"). It has been reported that camelized Mnn recombines with the constant regions of Idsae and

ІдО3, які містять шарнірну область, домени СНІ і СНЗ і позбавлені домену СНІ (Натег5-Савієеттап еї аї., вище). Наприклад, о1 лами є загальноприйнятим ізотипом антитіла (Нгі2), в якому Мн рекомбінується з константною областю, що містить шарнірну область, домени СНІ, СНІ і СНУ, тоді як ІдС2 і |до3 лами є ізотипами тільки важкого ланцюга, які позбавлені доменів СНІ і які не містять легких ланцюгів. Класичні тільки-Мн-фрагменти важко одержати у розчинній формі, але поліпшення розчинності і специфічного зв'язування можуть бути одержані при зміні залишків каркасу таким чином, що вони є більш МНн-подібними. (Див., наприклад, Кеісптанп, еї аї., У Іттипої Меїподз 1999, 231:25-38). Було виявлено, що верблюдизовані домени Мнн зв'язуються з антигеном з високою афінністю (Оезтугег еї аї., у. Віої. Спет. 276:26285-90, 2001) і мають високу стабільність у розчині (Еуегі еї а!., Віоспетівігу 41:3628-36, 2002). Способи генерування антитіл, що мають верблюдизовані важкі ланцюги, описані, наприклад, у Публікаціях патентів США з номерами 20050136049 і 20050037421.IdO3, which contain the hinge region, SNI and SNZ domains and lack the SNI domain (Nateg5-Savieettap ei ai., above). For example, o1 llama is a commonly accepted isotype of an antibody (Hhi2) in which Mn recombines with a constant region containing the hinge region, SNI, SNI and SNU domains, while IdC2 and |do3 lam are heavy chain only isotypes that lack the SNI domains and which do not contain light chains. Classical Mn-only fragments are difficult to obtain in soluble form, but improved solubility and specific binding can be obtained by changing the framework residues so that they are more Mn-like. (See, for example, Keisptanp, ei ai., In Ittipoi Meipodz 1999, 231:25-38). It was found that the camelized domains of Mnn bind to the antigen with high affinity (Oeztugeg ei ai., y. Vioi. Spet. 276:26285-90, 2001) and have high stability in solution (Euegi ei a!., Viospetivigu 41 :3628-36, 2002). Methods for generating antibodies having camelized heavy chains are described, for example, in US Patent Publications 20050136049 and 20050037421.

Оскільки варіабельний домен антитіл важких ланцюгів є найменшим повністю функціональним антигензв'язувальним фрагментом з молекулярною масою тільки 15 кДа, цю молекулу називають нано- антитілом (Согег-Неїатог2о еї аї!., Сапсег Везеагсп 64:2853-57, 2004). Бібліотека нано-антитіл може бути генерована з імунізованого дромедара, як описано у Сопгайй еї аї., Апііїтісгор Адепі5 Спетоїйег 45:2807-12, 2001, або з використанням рекомбінантних способів.Since the variable domain of antibodies of heavy chains is the smallest fully functional antigen-binding fragment with a molecular weight of only 15 kDa, this molecule is called a nano-antibody (Sogeg-Neiatog2o ei ai!., Sapseg Vezeagsp 64:2853-57, 2004). A library of nano-antibodies can be generated from an immunized dromedary, as described in Sopgaii et al., Apiiitisgor Adepi5 Spetoiieg 45:2807-12, 2001, or using recombinant methods.

Інтра-антитіла є одноланцюжковими антитілами, які демонструють внутрішньоклітинну експресію і можуть впливати на внутрішньоклітинну функцію білків (Віосса, еї аі., ЕМВО 4. 9:101-108, 1990; Соібу еї аї.,Intra-antibodies are single-chain antibodies that show intracellular expression and can affect the intracellular function of proteins (Viossa, et al., EMVO 4. 9:101-108, 1990; Soibu et al.,

Ргос Маї! Асай 5сі ОБА, 101:17616-21, 2004). Інтра-антитіла, які містять сигнальні послідовності клітини, що зберігають конструкцію антитіла у внутрішньоклітинних областях, можуть бути одержані, як описано уHail Mary! Asai 5si OBA, 101:17616-21, 2004). Intra-antibodies that contain cell signal sequences that preserve the antibody construct in intracellular regions can be prepared as described in

МпазвнпіїкКаг еї аї!., (ЕМВО 3. 14:1542-51, 1995) і УМпееїег еї аї!., (ГАЗЕВ 9. 17:1733-5, 2003). Транс-антитіла є антитілами, що проникають у клітину, в яких домени трансдукції білка (РТО) злиті з одноланцюжковим варіабельним фрагментом (5сЕУ) (Непо еї аІ., Меа Нуроїйезевз, 64:1105-8, 2005).MpazvnpiikKag ei ai!., (EMVO 3. 14:1542-51, 1995) and UMpeeieg ei ai!., (GAZEV 9. 17:1733-5, 2003). Trans-antibodies are cell-penetrating antibodies in which protein transduction domains (PTOs) are fused to a single-chain variable fragment (5cEU) (Nepo ei aI., Mea Nuroiyezevs, 64:1105-8, 2005).

Далі розглядаються антитіла, які є 5МІР або злитими білками домену зв'язування імуноглобуліну, специфічними стосовно білка-мішені. Ці конструкції є одноланцюжковими поліпептидами, що містять антигензв'язувальні домени, злиті з доменами імуноглобуліну, необхідними для здійснення ефекторних функцій антитіл. Див., наприклад, УМО 03/041600, публікації патентів США 20030133939 і 20030118592.Next, antibodies that are 5MIRs or immunoglobulin binding domain fusion proteins specific for the target protein are considered. These structures are single-chain polypeptides containing antigen-binding domains fused to immunoglobulin domains necessary for the effector functions of antibodies. See, e.g., UMO 03/041600, US Patent Publications 20030133939 and 20030118592.

Мультивалентні антитілаMultivalent antibodies

У деяких варіантах здійснення може бути бажаним генерування мультивалентного або навіть мультиспецифічного (наприклад, біспецифічного, триспецифічного і т.д.) моноклонального антитіла. Таке антитіло може мати специфічності зв'язування стосовно щонайменше двох різних епітопів антигену-мішені, або воно може зв'язуватися з двома різними молекулами, наприклад, з антигеном-мішенню і з білком або рецептором поверхні клітини. Наприклад, біспецифічне антитіло може включати в себе плече, що зв'язується з мішенню, та інше плече, що зв'язується з молекулою, що запускає, на лейкоциті, наприклад, молекулою Т-клітинного рецептора (наприклад, СО2 або СО3), або ЕРс-рецепторами для ІдсС (Есугр), наприклад, ЕсуВІ (СО64), ЕсукИ (СО32) і ЕсувІ (СО 16), таким чином, щоб сфокусувати механізми клітинного захисту на клітині, що експресу є мішень. Як інший приклад, біспецифічні антитіла можуть бути використані для локалізації цитотоксичних агентів у клітини, які експресують антиген-мішень. Ці антитіла мають плече зв'язування мішені і плече, що зв'язує цитотоксичний агент (наприклад, сапорин, анти- інтерферон-60, алкалоїд Міпса, ланцюг А рицину, метотрексат або гаптен з радіоактивним ізотопом).In some embodiments, it may be desirable to generate a multivalent or even multispecific (eg, bispecific, trispecific, etc.) monoclonal antibody. Such an antibody can have binding specificities for at least two different epitopes of the target antigen, or it can bind to two different molecules, for example, to the target antigen and to a protein or cell surface receptor. For example, a bispecific antibody may include an arm that binds to a target and another arm that binds to a trigger molecule on a leukocyte, such as a T-cell receptor molecule (eg, CO2 or CO3), or EPs-receptors for IdsS (Esugr), for example, EsuVI (CO64), EsukI (CO32) and EsuvI (CO 16), in such a way as to focus cellular defense mechanisms on the cell that express is the target. As another example, bispecific antibodies can be used to localize cytotoxic agents to cells expressing a target antigen. These antibodies have a target-binding arm and a cytotoxic agent-binding arm (eg, saporin, anti-interferon-60, Mips alkaloid, ricin A chain, methotrexate, or radioactive isotope hapten).

Мультиспецифічні антитіла можуть бути одержані у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл.Multispecific antibodies can be obtained in the form of full-length antibodies or antibody fragments.

Біспецифічні антитіла включають зшиті або "гетерокон'югатні" антитіла. Наприклад, одне з антитіл у цьому гетер окон'югаті може бути зв'язане з авідином, а інше - з біотином. Гетер окон'югатні антитіла можуть бути одержані з використанням будь-яких способів зшивання. Придатні зшивальні агенти добре відомі у даній галузі і описані у патенті США Мо 4676980, разом з рядом способів зшивання.Bispecific antibodies include crosslinked or "heteroconjugate" antibodies. For example, one of the antibodies in this heteroconjugate may be linked to avidin and the other to biotin. Heter-conjugate antibodies can be obtained using any methods of cross-linking. Suitable crosslinking agents are well known in the art and are described in US Pat. No. 4,676,980, along with a number of crosslinking methods.

Відповідно до іншого підходу для одержання біспецифічних антитіл, межа поділу між парою молекул антитіл може бути сконструйована для максимізації відсотка гетеродимерів, які витягуються з культури рекомбінантних клітин. Переважна межа поділу містить щонайменше частину домену Сн3 константного домену антитіла. У цьому способі малі бічні ланцюги однієї або декількох амінокислот з межі поділу молекули першого антитіла замінені більшими бічними ланцюгами (наприклад, тирозину або триптофану).According to another approach for obtaining bispecific antibodies, the separation boundary between a pair of antibody molecules can be designed to maximize the percentage of heterodimers that are recovered from recombinant cell culture. A preferred separation boundary contains at least part of the Sn3 domain of the antibody's constant domain. In this method, small side chains of one or more amino acids from the separation boundary of the first antibody molecule are replaced by larger side chains (for example, tyrosine or tryptophan).

Компенсуючі «западини» ідентичного або подібного розміру стосовно більшого бічного ланцюга (більших бічних ланцюгів) створюються на поверхні поділу молекули другого антитіла заміною більших бічних ланцюгів амінокислот меншими бічними ланцюгами (наприклад, аланіну або треоніну). Це забезпечує механізм для збільшення виходу цього гетеродимеру у порівнянні з іншими небажаними кінцевими продуктами, такими як гомодимери. Див. МО 96/27011, опублікований 6 вересня 1996 року.Compensatory "pits" of identical or similar size with respect to the larger side chain(s) are created on the cleavage surface of the second antibody molecule by replacing the larger amino acid side chains with smaller side chains (eg, alanine or threonine). This provides a mechanism to increase the yield of this heterodimer compared to other undesired end products such as homodimers. See MO 96/27011, published on September 6, 1996.

Способи генерування біспецифічних антитіл з фрагментів антитіл також були описані у літературі.Methods of generating bispecific antibodies from antibody fragments have also been described in the literature.

Наприклад, біспецифічні антитіла можуть бути одержані з використанням хімічного зв'язку. Вгеппап еї аї.,For example, bispecific antibodies can be obtained using a chemical bond. Vgeppap ei ai.,

Зсіепсе 229:81 (1985) описують процедуру, в якій інтактні антитіла протеолітично розщеплюють для генерування фрагментів Е(ар)г. Ці фрагменти відновлюють у присутності дитіол-комплексуючого агента арсеніту натрію для стабілізації віцинальних дитіолів і запобігання утворенню міжмолекулярних дисульфідних зв'язків. Потім генеровані фрагменти Рар' перетворюють у похідні тіонітробензоату (ТМВ).Zsiepse 229:81 (1985) describe a procedure in which intact antibodies are proteolytically cleaved to generate E(ar)g fragments. These fragments are reduced in the presence of the dithiol-complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent the formation of intermolecular disulfide bonds. Then the generated fragments of Rar' are converted into thionitrobenzoate derivatives (TMV).

Потім одне з похідних БГар'-ТМВ перетворюють назад у Рар'-тіол відновленням меркаптоетиламіном і змішують з еквімолярною кількістю іншого похідного Рар-ТМВ з утворенням біспецифічного антитіла.Then one of the BGar'-TMV derivatives is converted back into Par'-thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equimolar amount of another Par-TMV derivative to form a bispecific antibody.

Одержані біспецифічні антитіла можуть бути використані як агенти для селективної іммобілізації ферментів.The obtained bispecific antibodies can be used as agents for selective immobilization of enzymes.

Вецег евї а!., Зсіеєпсе 240:1041-1043 (1988) описують секрецію функціональних фрагментів антитіл з бактерій (див., наприклад, Вецег еї аї!., 5Кеїта еї аІ. Зсіепсе 240:1038-1041 (1988)). Наприклад, Рар'-5Н-фрагменти можуть бути безпосередньо одержані з Е. сої і хімічно зв'язані з утворенням біспецифічних антитіл (Сагпег еї аІ., Віо/ГТесппоіоду 10:163-167 (1992); Зпаїару еї а)ї., У. Ехр. Мед. 175:217-225 (1992).Vetseg evi a!., Zsieepse 240:1041-1043 (1988) describe the secretion of functional fragments of antibodies from bacteria (see, for example, Vetseg ei ai!., 5Keita ei aI. Zsiepse 240:1038-1041 (1988)). For example, Rar'-5H-fragments can be directly obtained from E. soya and chemically linked to the formation of bispecific antibodies (Sagpeg et al., Vio/GTespoiodu 10:163-167 (1992); Zpaiaru et al)i., U. Ehr. Honey. 175:217-225 (1992).

Зпаїару еї аї., У. Ехр. Мей. 175:217-225 (1992) описують одержання молекули повністю гуманізованого біспецифічного антитіла Е(ар)». Кожний фрагмент Рар' секретувався окремо з Е. соїї і піддавався направленому хімічному зв'язуванню іп міо для утворення біспецифічного антитіла. Утворене таким чином біспецифічне антитіло було здатне зв'язуватися з клітинами, які надекспресують рецептор НЕК, і нормальними Т-клітинами людини, а також запускати літичну активність цитотоксичних лімфоцитів людини проти пухлин-мішеней молочної залози людини.Zpaiaru ei ai., U. Ehr. May 175:217-225 (1992) describe the production of a fully humanized bispecific E(ar) antibody molecule. Each fragment of Rar' was secreted separately from E. soii and subjected to directed chemical binding of ip myo to form a bispecific antibody. The bispecific antibody generated in this way was able to bind to cells overexpressing the NEK receptor and normal human T-cells, as well as trigger the lytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human mammary tumor targets.

Були також описані різні способи одержання і виділення фрагментів біспецифічних антитіл безпосередньо з культури рекомбінантних клітин. Наприклад, біспецифічні антитіла одержували з використанням лейцинових блискавок, наприклад, СМ. (Див. у цілому КовіеїІпу еї аї., У. Іттипої. 148(5): 1547-1553 (1992)). Пептиди лейцинової блискавки з білків Роз і діт зв'язували з Рар'-частинами двох різних антитіл злиттям генів. Ці гомодимери антитіл відновлювали у шарнірній області для утворення мономерів і потім повторно окиснювали для утворення гетеродимерів антитіл. Цей спосіб може бути також використаний для одержання гомодимерів антитіл.Various methods of obtaining and isolating fragments of bispecific antibodies directly from the culture of recombinant cells were also described. For example, bispecific antibodies were obtained using leucine zippers, for example, CM. (See in general KovieiIpu ei ai., U. Ittipoi. 148(5): 1547-1553 (1992)). Leucine zipper peptides from Roz and Dit proteins were linked to the Rar'-parts of two different antibodies by gene fusion. These antibody homodimers were reduced in the hinge region to form monomers and then re-oxidized to form antibody heterodimers. This method can also be used to obtain antibody homodimers.

Термін "димерні антитіла" стосується малих фрагментів антитіл з двома антигензв'язувальними сайтами, причому ці фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (МН), з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (МІ) в одному і тому ж поліпептидному ланцюгу (МН М). З використанням лінкера, що є занадто коротким, щоб було можливим спарювання між цими двома доменами на одному і тому ж ланцюгу, змушують ці домени спарюватися з комплементарними доменами іншого ланцюга і утворювати два антигензв'язувальних сайти. Див. наприклад, Ноїпдег еї аї!., Ргос. Майї).The term "dimeric antibodies" refers to small fragments of antibodies with two antigen-binding sites, and these fragments contain a heavy chain variable domain (HL) linked to a light chain variable domain (MI) in the same polypeptide chain (MH M). . Using a linker that is too short to allow pairing between these two domains on the same chain causes these domains to pair with complementary domains on the other chain to form two antigen-binding sites. See for example, Noipdeg ei ai!., Rgos. Maya).

Асад. Осі. ОБА 90:6444-6448, (1993).Asad Axes BOTH 90:6444-6448, (1993).

Повідомлялася також інша стратегія одержання фрагментів біспецифічних антитіл з використанням одноланцюжкових димерів Ем (5Ем). Див. сгибрег еї аї., у. Іттипої. 152:5368 (1994).Another strategy for obtaining fragments of bispecific antibodies using single-chain Em dimers (5Em) was also reported. See shybreg ei ai., u. And so on. 152:5368 (1994).

Альтернативно, біспецифічне антитіло може бути «лінійним антитілом», одержуваним, як описано у 7арага еї а). Ргоївїп Епо. 8(10): 1057-1062 (1995). Коротко, ці антитіла містять пари тандемних сегментів га (Мн-Сні-Мн-Сн!), які утворюють пари антигензв'язувальних областей. Лінійні антитіла можуть бути біспецифічними або моноспецифічними.Alternatively, the bispecific antibody may be a "linear antibody" prepared as described in paragraph (a). Rgoivip Epo. 8(10): 1057-1062 (1995). Briefly, these antibodies contain pairs of tandem ha segments (Mn-Sni-Mn-Sn!) that form pairs of antigen-binding regions. Linear antibodies can be bispecific or monospecific.

Антитіла з більш ніж двома валентностями також обговорюються. Наприклад, можуть бути одержані триспецифічні антитіла (Тий еї аї., 9. Іттипої. 147:60 (1991)). «Хелатоутворююче рекомбінантне антитіло» є біспецифічним антитілом, що пізнає сусідні і такі, що не перекриваються, епітопи антигену-мішені і є досить гнучким для зв'язування обох епітопів одночасно (Мегі еїа)ї., У Мої Віої. 246:367-73, 1995).Antibodies with more than two valencies are also discussed. For example, trispecific antibodies can be obtained (Tiy ei ai., 9. Ittipoi. 147:60 (1991)). A "chelating recombinant antibody" is a bispecific antibody that recognizes adjacent and non-overlapping epitopes of a target antigen and is flexible enough to bind both epitopes at the same time. 246:367-73, 1995).

Одержання біспецифічного Рар-5сЕм ("бі-антитіла") і триспецифічного Рар-(зсЕм)(2). ("три-антитіла") описане у Зспоопіапз5 еї аї. (9 Іттипої. 165:7050-57, 2000) і ММІетв» еї аї. (9. Спготаїодг В Апаїуї ТесппоїPreparation of bispecific Par-5cEm ("bi-antibodies") and trispecific Par-(csEm)(2). ("tri-antibodies") described in Zspoopiapz5 ei ai. (9 Ittipoi. 165:7050-57, 2000) and MMIetv» ei ai. (9. Spgotaiodg In Apaiui Tesppoi

Віотеа (Ме сі. 786:161-76, 2003). Для бі-антитіл або три-антитіл молекулу 5зсЕмМ зливають з одним або обома ланцюгами МІ-СІ. () ї МН-СН; (Ра); наприклад, для одержання три-антитіла два 5сЕм зливають з С- кінцем Раб, тоді як у бі-антитілі один 5сЕм зливають з С-кінцем Раб.Viotea (Me si. 786:161-76, 2003). For bi-antibodies or tri-antibodies, the 5zsEmM molecule is fused to one or both MI-SI chains. () th MH-CH; (Ra); for example, to obtain a tri-antibody, two 5sEms are fused to the C-terminus of Rab, while in a bi-antibody, one 5sEm is fused to the C-terminus of Rab.

Рекомбінантне одержання антитілRecombinant production of antibodies

Антитіла можуть бути одержані методологією рекомбінантних ДНК з використанням однієї з систем експресії антитіл, добре відомих у даній галузі (див., наприклад, Нагіомж/ апа Гапе, Апііродіеєв5: А І арогайфогуAntibodies can be produced by recombinant DNA methodology using one of the antibody expression systems well known in the art (see, for example, Nagyomzh/ apa Gape, Apiirodieev5: A I arogaiphogu

Мапиаї, Соїа ріпу Нагбог І арогаюгу (1988)).Mapiai, Soya turnip Nagbog I arogayugu (1988)).

ДНК, що кодує антитіла за винаходом, може бути вміщена в експресуючі вектори, які потім трансфікують у клітини-хазяїни, такі як клітини Е. соїї, клітини СО5 мавпи, клітини 293 ембріональної нирки людини (наприклад, клітини 293Е), клітини Китайського хом'ячка (СНО) або мієломні клітини, які в іншому випадку не продукують білок імуноглобуліну, для одержання синтезу моноклональних антитіл у рекомбінантних клітинах-хазяїнах. Рекомбінантне одержання антитіл добре відоме у даній галузі.The DNA encoding the antibodies of the invention can be inserted into expression vectors, which are then transfected into host cells, such as E. soya cells, monkey CO5 cells, human embryonic kidney 293 cells (eg, 293E cells), Chinese hamster cells cell (CHO) or myeloma cells, which otherwise do not produce immunoglobulin protein, to obtain the synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells. Recombinant production of antibodies is well known in the art.

Фрагменти антитіл виробляють протеолітичним розщепленням інтактних антитіл (див., наприклад, Могітоїо еї аї., дУоштпаї ої Віоспетіса! апа Віорпузіса! Меїподе5 24:107-117 (1992) і Вгеппап еї аї., зсіеєпсе 229:81 (1985)). Однак, ці фрагменти можуть тепер продукуватися безпосередньо рекомбінантними клітинами- хазяїнами. Інші способи одержання фрагментів антитіл, у тому числі пептидний синтез і ковалентне зв'язування, будуть очевидними кваліфікованому практику.Antibody fragments are produced by proteolytic cleavage of intact antibodies (see, e.g., Mogitoio et al., dWashtpai oi Viospetisa! apa Viorpusisa! Meipode5 24:107-117 (1992) and Vgeppap ei ai., zsieepse 229:81 (1985)). However, these fragments can now be produced directly by recombinant host cells. Other methods of obtaining antibody fragments, including peptide synthesis and covalent binding, will be apparent to the skilled practitioner.

Регуляторними послідовностями експресії називають послідовності ДНК, необхідні для експресії функціонально зв'язаної кодуючої послідовності у конкретному організмі-хазяїні. Наприклад, регуляторні послідовності, які Є придатними для прокаріотів, включають в себе промотор, необов'язково операторну послідовність і сайт зв'язування рибосом. Відомо, що еукаріотичні клітини використовують промотори, сигнали поліаденілювання і енхансери.Expression regulatory sequences are DNA sequences necessary for the expression of a functionally related coding sequence in a specific host organism. For example, regulatory sequences that are suitable for prokaryotes include a promoter, optionally an operator sequence and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to use promoters, polyadenylation signals, and enhancers.

Нуклеїнова кислота є функціонально зв'язаною, коли вона вміщена у функціональний взаємозв'язок з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК для передпослідовності або секреторного лідера функціонально зв'язана з ДНК для поліпептиду, якщо він експресується у вигляді пребілка, що бере участь у секреції цього поліпептиду; промотор або енхансер є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію цієї послідовності; або сайт зв'язування рибосом є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він розташований таким чином, що транскрипція посилюється.A nucleic acid is functionally linked when it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, the DNA for the presequence or secretory leader is functionally linked to the DNA for the polypeptide if it is expressed as a preprotein involved in the secretion of this polypeptide; a promoter or enhancer is functionally linked to a coding sequence if it affects the transcription of this sequence; or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it is located in such a way that transcription is enhanced.

Звичайно термін «функціонально зв'язані» означає, що ДНК-послідовності являючись зв'язаними, є суміжними і, у випадку секреторного лідера, суміжними і такими, що знаходяться у рамці зчитування. Однак, енхансери не повинні бути обов'язково суміжними. Зв'язування виконується лігуванням у зручних сайтах рестрикції. Якщо таких сайтів не існує, використовують синтетичні олігонуклеотидні адаптори або лінкери відповідно до загальноприйнятої практики.Generally, the term "operably linked" means that the DNA sequences being linked are contiguous and, in the case of a secretory leader, contiguous and in-frame. However, enhancers do not necessarily have to be contiguous. Binding is performed by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to standard practice.

Терміни клітина, клітинна лінія і культура клітин часто використовуються взаємозамінно, і всі такі назви тут включають в себе і потомство. Трансформанти і трансформовані клітини включають в себе первинну розглянуту клітину і культури, вироблені з неї, без врахування кількості переносів. Повинно бути також зрозуміло, що все потомство може не бути точно ідентичним за змістом ДНК внаслідок навмисних або ненавмисних мутацій. У винахід включене мутантне потомство, що має ту ж саму функцію або біологічну активність, на яку проводиться скринінг у спочатку трансформованій клітині. Якщо маються на увазі особливі значення, це буде зрозуміло з контексту.The terms cell, cell line, and cell culture are often used interchangeably, and all such names here include progeny. Transformants and transformed cells include the primary cell in question and cultures produced from it, regardless of the number of transfers. It should also be understood that all offspring may not be exactly identical in DNA content due to intentional or unintentional mutations. The invention includes mutant progeny having the same function or biological activity that is screened for in the originally transformed cell. If special meanings are intended, it will be clear from the context.

В альтернативному варіанті здійснення амінокислотна послідовність імуноглобуліну, що представляє інтерес, може бути визначена прямим секвенуванням білка. Придатні нуклеотидні послідовності можуть бути сконструйовані відповідно до таблиці універсальних кодонів.In an alternative embodiment, the amino acid sequence of the immunoglobulin of interest can be determined by direct protein sequencing. Suitable nucleotide sequences can be constructed according to the table of universal codons.

Мутеїни амінокислотної послідовності бажаного антитіла можуть бути одержані введенням придатних нуклеотидних змін у кодуючу ДНК або пептидним синтезом. Такі мутеїни включають в себе, наприклад, делеції і/або інсерції, і/або заміни залишків в амінокислотних послідовностях цих антитіл. Будь-яка комбінація делеції, інсерції або заміни здійснюється для одержання кінцевої конструкції, за умови, що ця кінцева конструкція має бажані характеристики. Амінокислотні зміни можуть також змінювати посттрансляційні процеси моноклонального антитіла, антитіла людини, гуманізованого антитіла, сконструйованого для людини антитіла Нитап Епдіпеегед!м або антитіла-мутеїну, наприклад, зміною кількості або положення сайтів глікозилювання.Muteins of the amino acid sequence of the desired antibody can be obtained by introducing suitable nucleotide changes into the coding DNA or by peptide synthesis. Such muteins include, for example, deletions and/or insertions, and/or substitutions of residues in the amino acid sequences of these antibodies. Any combination of deletion, insertion, or substitution is performed to produce a final construct, provided that the final construct has the desired characteristics. Amino acid changes can also alter the post-translational processes of a monoclonal antibody, a human antibody, a humanized antibody, a human-engineered Nitap Epdipeeged!m antibody, or a mutein antibody, for example, by changing the number or position of glycosylation sites.

Молекули нуклеїнових кислот, що кодують мутеїни амінокислотної послідовності антитіла, одержують різними способами, відомими у даній галузі. Ці способи включають, але не обмежуються ними, виділення з природного джерела (у випадку природних мутеїнів амінокислотної послідовності) або одержання олігонуклеотид-опосередкованим (або сайт-направленим) мутагенезом, ПЛР-мутагенезом і касетним мутагенезом одержаного раніше мутеїну або версії цього антитіла, що не є мутеїном.Nucleic acid molecules encoding muteins of the amino acid sequence of antibodies are obtained by various methods known in the art. These methods include, but are not limited to, isolation from a natural source (in the case of naturally occurring amino acid sequence muteins) or preparation by oligonucleotide-mediated (or site-directed) mutagenesis, PCR mutagenesis, and cassette mutagenesis of a previously obtained mutein or antibody version that does not is a mutein.

Даний винахід забезпечує також виділену нуклеїнову кислоту, що кодує антитіла за винаходом, необов'язково функціонально зв'язану з регуляторними послідовностями, пізнаваними клітиною-хазяїном, вектори і клітини-хазяїни, що містять ці нуклеїнові кислоти, і рекомбінантні способи для одержання цих антитіл, які можуть передбачати культивування клітини-хазяїна таким чином, що ця нуклеїнова кислота експресується і, необов'язково, витягування цього антитіла з культури клітини-хазяїна або культурального середовища.The present invention also provides isolated nucleic acid encoding the antibodies of the invention, optionally functionally linked to host cell-recognized regulatory sequences, vectors and host cells containing these nucleic acids, and recombinant methods for producing these antibodies. which may involve culturing the host cell so that this nucleic acid is expressed and, optionally, extracting this antibody from the host cell culture or culture medium.

Для рекомбінантного одержання антитіла нуклеїнову кислоту, що кодує його, виділяють та інсертують у вектор, що реплікується, для додаткового клонування (ампліфікації цієї ДНК) або для експресії. ДНК, що кодує моноклональне антитіло, легко виділяють і секвенують з використанням загальноприйнятих процедур (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, які здатні зв'язуватися специфічно з генами, що кодують важкий і легкий ланцюги цього антитіла). Доступно багато векторів. Компоненти векторів звичайно включають в себе, але не обмежуються ними, один або декілька з наступних компонентів: сигнальну послідовність, сайт ініціації реплікації, один або декілька маркерних генів, енхансерний елемент, промотор і послідовність термінації транскрипції. (1) Компонент сигнальної послідовностіFor recombinant production of an antibody, the nucleic acid encoding it is isolated and inserted into a replicating vector for further cloning (amplification of this DNA) or for expression. DNA encoding a monoclonal antibody is easily isolated and sequenced using conventional procedures (for example, using oligonucleotide probes capable of binding specifically to the genes encoding the heavy and light chains of this antibody). Many vectors are available. Vector components typically include, but are not limited to, one or more of the following components: a signal sequence, a replication initiation site, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. (1) Signal sequence component

Антитіло за винаходом може бути одержане рекомбінантно не тільки безпосередньо, але також у вигляді злитого поліпептиду з гетерологічним поліпептидом, який переважно є сигнальною послідовністю або іншим поліпептидом, що має сайт специфічного розщеплення, на М-кінці зрілого білка або поліпептиду.The antibody according to the invention can be produced recombinantly not only directly, but also in the form of a fused polypeptide with a heterologous polypeptide, which is preferably a signal sequence or another polypeptide having a specific cleavage site at the M-end of a mature protein or polypeptide.

Вибрана сигнальна послідовність переважно є послідовністю, що упізнається і процесується (тобто відщеплюється сигнальною пептидазою) клітиною-хазяїном. Якщо прокаріотична клітина-хазяїн не упізнає і не процесує сигнальну послідовність нативного антитіла, ця сигнальна послідовність може бути замінена сигнальною послідовністю, вибраною, наприклад, з групи, що складається з лідерів пектатліази (наприклад, ре!Ів), лужної фосфатази, пеніцилінази, Ірр, або лідерами термостабільного ентеротоксину ІІ. Для секреції дріжджів нативна сигнальна послідовність може бути замінена, наприклад, лідером дріжджової інвертази, лідером о-фактора (у тому числі лідерами о-фактора Засспаготусез і Кісумеготусев) або лідером кислої фосфатази, лідером глюкоамілази С. аІрісап5 або сигналом, описаним у УУО90/13646. В експресії клітин ссавців доступними є сигнальні послідовності ссавців, а також лідери вірусної секреції, наприклад, сигнал 90 вірусу простого герпесу.The selected signal sequence is preferably a sequence that is recognized and processed (that is, cleaved by signal peptidase) by the host cell. If the prokaryotic host cell does not recognize and process the native antibody signal sequence, this signal sequence can be replaced by a signal sequence selected, for example, from the group consisting of pectate lyase leaders (eg, re!Iv), alkaline phosphatase, penicillinase, Irr , or leaders of thermostable enterotoxin II. For yeast secretion, the native signal sequence can be replaced by, for example, the yeast invertase leader, the o-factor leader (including the Zasspagotusez and Kisumegotusev o-factor leaders), or the acid phosphatase leader, the S. aIrisap5 glucoamylase leader, or the signal described in UUO90/13646 . In the expression of mammalian cells, mammalian signal sequences are available, as well as viral secretion leaders, for example, herpes simplex virus signal 90.

ДНК для такої області-попередника лігують у рамці зчитування з ДНК, що кодує це антитіло. (2) Компонент сайту ініціації реплікаціїThe DNA for such a precursor region is ligated in frame with the DNA encoding that antibody. (2) A component of the replication initiation site

Як експресуючі, так і клонуючі вектори містять послідовність нуклеїнової кислоти, яка дозволяє вектору реплікуватися в одній або декількох клітинах-хазяїнах. Звичайно у клонуючих векторах цією послідовністю є послідовність, що дозволяє вектору реплікуватися незалежно від хромосомної ДНК хазяїна і включає в себе сайти ініціації реплікації або послідовності, що автономно реплікуються. Такі послідовності добре відомі для різних бактерій, дріжджів і вірусів. Сайт ініціації реплікації з плазміди рВЕ322 є придатним для більшості грамнегативних бактерій, сайт ініціації реплікації плазміди 2 у є придатним для дріжджів, і різні вірусні сайти ініціації реплікації застосовні для клонуючих векторів у клітинах ссавців. Звичайно компонент сайту ініціації реплікації не потрібен для експресуючих векторів ссавців (звичайно може використовуватися сайт ініціації реплікації 5М40, тільки тому, що він містить ранній промотор). (3) Компонент селективного маркераBoth expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that allows the vector to replicate in one or more host cells. Typically, in cloning vectors, this sequence is a sequence that allows the vector to replicate independently of the host's chromosomal DNA and includes replication initiation sites or autonomously replicating sequences. Such sequences are well known for various bacteria, yeasts and viruses. The replication initiation site from plasmid pBE322 is suitable for most Gram-negative bacteria, the replication initiation site from plasmid 2 is suitable for yeast, and various viral replication initiation sites are suitable for cloning vectors in mammalian cells. Usually, the replication initiation site component is not required for mammalian expression vectors (the 5M40 replication initiation site can of course be used, only because it contains an early promoter). (3) Selective marker component

Експресуючі і клонуючі вектори можуть містити селективний ген, також називаний маркером, що селектується. Типові селективні гени кодують білки, які (а) надають стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, ампіциліну, неоміцину, метотрексату, тетрацикліну, 5418, генетицину, гістидинолу або мікофенолової кислоти, (р) заповнюють ауксотрофні недостатності або (с) доставляють критичні нутриєнти, недоступні з комплексного середовища, наприклад, ген, що кодує О-аланінрацемазу, для бацил.Expressing and cloning vectors may contain a selectable gene, also called a selectable marker. Typical selective genes encode proteins that (a) confer resistance to antibiotics or other toxins, such as ampicillin, neomycin, methotrexate, tetracycline, 5418, geneticin, histidinol, or mycophenolic acid, (p) fill auxotrophic deficiencies, or (c) deliver critical nutrients , unavailable from a complex environment, for example, the gene encoding O-alanine racemase, for bacilli.

Один приклад схеми відбору використовує лікарський засіб для зупинки росту клітини-хазяїна. Клітини, які успішно трансформуються гетерологічним геном, продукують білок, що надає стійкість до лікарського засобу, і, отже, виживають у схемі відбору. Приклади такого домінантного відбору використовують лікарські засоби метотрексат, неоміцин, гістидинол, пуроміцин, мікофенолову кислоту і гігроміцин.One example of a selection scheme uses a drug to stop the growth of a host cell. Cells that are successfully transformed with the heterologous gene produce a protein that confers resistance to the drug and therefore survive the selection scheme. Examples of such dominant selection use drugs methotrexate, neomycin, histidinol, puromycin, mycophenolic acid and hygromycin.

Іншим прикладом придатних маркерів, що селектуються, для клітин ссавців є маркери, які роблять можливою ідентифікацію клітин, компетентних стосовно поглинання нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло, такі як ОНЕК, тимідинкіназа, металотіонеїн-І і -І, переважно гени металотіонеїну приматів, аденозиндеамінази, орнітиндекарбоксилази і т.д.Another example of suitable selectable markers for mammalian cells are markers that enable the identification of cells competent to take up the nucleic acid encoding the antibody, such as ONEK, thymidine kinase, metallothionein-I and -I, preferably primate metallothionein genes, adenosine deaminase, ornithine decarboxylase, etc.

Наприклад, клітини, трансформовані геном відбору ОНЕРЕ, спочатку ідентифікують культивуванням всіх цих трансформантів у культуральному середовищі, що містить метотрексат (МЕХ), конкурентний антагоністFor example, cells transformed with the ONERE selection gene are first identified by culturing all these transformants in culture medium containing methotrexate (MEH), a competitive antagonist

ОНЕН. Придатною клітиною-хазяїном, при використанні ОНЕК дикого типу, є лінія клітин яєчникаONEN. A suitable host cell when using wild-type ONEK is an ovarian cell line

Китайського хом'ячка (СНО), дефектна за активністю ОНЕК.Chinese hamster (CHO), defective in ONEK activity.

Альтернативно, клітини-хазяїни (зокрема, хазяїни дикого типу, які містять ендогенну ОНЕБК), трансформовані або котрансформовані ДНК-послідовностями, що кодують антитіло за винаходом, білокAlternatively, host cells (in particular, wild-type hosts that contain endogenous ONEBC) transformed or co-transformed with DNA sequences encoding an antibody of the invention, a protein

ОНЕК дикого типу та інший маркер, що селектується, такий як аміноглікозид-3'--фосфотрансфераза (АРН), можуть бути відібрані за ростом клітин у середовищі, що містить агент селекції для відбору, що селектується, такий як аміноглікозидний антибіотик, наприклад, канаміцин, неоміцин або 5418. Див. патентWild-type ONEK and another selectable marker such as aminoglycoside 3'-phosphotransferase (ARN) can be selected for cell growth in a medium containing a selectable selection agent such as an aminoglycoside antibiotic such as kanamycin , neomycin or 5418. See patent

США Ме 4965199.USA Me 4965199.

Придатним селективним геном для застосування у дріжджах є ген їгр1, присутній у дріжджовій плазмідіA suitable selective gene for use in yeast is the ygr1 gene present in a yeast plasmid

УАр7 (БЗіпспсотр еї аїЇ., Маїшге, 282:39 (1979)). Ген ігр! забезпечує маркер, що селектується, для мутантного штаму дріжджів, позбавленого здатності рости у триптофані, наприклад, АТОС Мо. 44076 абоUAr7 (BZipspsotre ei aiYi., Maishge, 282:39 (1979)). Game Gen! provides a selectable marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow in tryptophan, such as ATOS Mo. 44076 or

РЕРА-1. Уопе5, Сепеїіс5, 85:12 (1977). Присутність ушкодження ігр! у геномі дріжджової клітини-хазяїна забезпечує потім ефективне середовище для детектування трансформації за ростом за відсутності триптофану. Подібним чином ІГеи2-дефіцитні штами дріжджів (АТОС 20622 або 38626) доповнюють відомими плазмідами, що несуть ген Гец2. ОгаЗ-недостатні штами дріжджів доповнюють плазмідами, що несуть ген Огаз.RERA-1. Uope5, Sepeis5, 85:12 (1977). The presence of game damage! in the genome of the host yeast cell then provides an efficient medium for detecting transformation by growth in the absence of tryptophan. Similarly, IGe2-deficient yeast strains (ATOS 20622 or 38626) are supplemented with known plasmids carrying the Hec2 gene. OgaZ-deficient yeast strains are supplemented with plasmids carrying the Ogaz gene.

Крім того, вектори, вироблені з кільцевої плазміди 1,6 мкм рКОї, можуть бути використані для трансформації дріжджів Кіпумеготусе5. Альтернативно, для К. Іасії5 повідомлялася експресійна система для великомасштабного одержання рекомбінантного хімозину теляти. Мап деп Вего, Віо/Тесппоіоду, 8:135 (1990). Описані також стабільні мультикопійні експресуючі вектори для секреції зрілого рекомбінантного сироваткового альбуміну людини промисловими штамами Кіцсумеготусезвз. Ріеег еї а!., Віо/Тесппоіоду, 9:968- 975 (1991). (4) Компонент промоторуIn addition, vectors produced from the circular plasmid 1.6 μm pKOi can be used to transform the yeast Kipumegotuse5. Alternatively, an expression system for large-scale production of recombinant calf chymosin was reported for K. Iasia5. Map dep Vego, Vio/Tesppoiodu, 8:135 (1990). Stable multicopy expressing vectors for the secretion of mature recombinant human serum albumin by commercial strains of Kitsumegotuszvz are also described. Rieeg ei a!., Vio/Thesppoiodu, 9:968-975 (1991). (4) Promoter component

Експресуючі і клонуючі вектори звичайно містять промотор, що упізнається організмом-хазяїном і функціонально зв'язаний з нуклеїновою кислотою, що кодує антитіло. Промотори, придатні для використання з прокаріотичними хазяїнами, включають промотор арабінози (наприклад, агав), промотор рпоА, промоторні системи р-лактамази і лактози, лужної фосфатази, промоторну систему триптофану (р) і гібридні промотори, такі як промотор їас. Однак, придатними є й інші відомі бактеріальні промотори.Expressing and cloning vectors usually contain a promoter recognized by the host organism and functionally linked to the nucleic acid encoding the antibody. Promoters suitable for use with prokaryotic hosts include the arabinose promoter (eg, agave), the rpoA promoter, the p-lactamase and lactose, alkaline phosphatase promoter systems, the tryptophan (p) promoter system, and hybrid promoters such as the ias promoter. However, other known bacterial promoters are also suitable.

Промотори для використання у бактеріальних системах будуть також містити послідовність Шайна-Promoters for use in bacterial systems will also contain the sequence of Shine-

Далгарно (5.0.), функціонально зв'язану з ДНК, що кодує антитіло за даним винаходом.Dalgarno (5.0.), functionally linked to the DNA encoding the antibody of the present invention.

Промоторні послідовності відомі і для еукаріот. Фактично всі еукаріотичні гени мають АТ-багату область, розташовану на 25-30 основ ліворуч від сайту, в якому ініціюється транскрипція. Іншою послідовністю, виявленою на 70-80 основ ліворуч від початку транскрипції, є область СМСААТ, де М може бути будь-яким нуклеотидом. На 3'-кінці більшості еукаріотичних генів знаходиться послідовність ААТААА, яка може бути сигналом для додавання полі-А хвоста до 3'-кінця кодуючої послідовності. Всі ці послідовності придатним чином інсертують в еукаріотичні експресуючі вектори.Promoter sequences are also known for eukaryotes. Virtually all eukaryotic genes have an AT-rich region located 25-30 bases to the left of the transcription initiation site. Another sequence found 70-80 bases to the left of the transcription start is the SMSAAT region, where M can be any nucleotide. At the 3'-end of most eukaryotic genes is the sequence AATAAA, which can be a signal for adding a poly-A tail to the 3'-end of the coding sequence. All these sequences are conveniently inserted into eukaryotic expression vectors.

Приклади придатних промотуючих послідовностей для використання з хазяїнами-дріжджами включають в себе промотори для 3-фосфогліцераткінази або інших гліколітичних ферментів, таких як енолаза, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа, гексокіназа, піруватдекарбоксилаза, фосфофруктокіназа, глюкозо- б-фосфатізомераза, З-фосфогліцератмутаза, піруваткіназа, триозофосфатізомераза, фосфоглюкозоізомераза і глюкокіназа.Examples of suitable promoter sequences for use with yeast hosts include promoters for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-b-phosphatisomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase , triose phosphate isomerase, phosphoglucose isomerase and glucokinase.

Іншими дріжджовими промоторами, які є промоторами, що індукуються, що мають додаткову перевагу транскрипції, регульованої умовами вирощування, є промоторні області для алкогольдегідрогенази 2, ізоцитохрому С, кислої фосфатази, деградуючих ферментів, асоційованих з метаболізмом азоту, металотіонеїну, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази і ферментів, відповідальних за утилізацію мальтози і галактози. Придатні вектори і промотори для використання в експресії дріжджів описані додатково в ЕР 73657. Енхансери дріжджів також переважно використовуються з промоторами дріжджів.Other yeast promoters that are inducible promoters with the added advantage of transcription regulated by growth conditions are the promoter regions for alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degradative enzymes associated with nitrogen metabolism, metallothionein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and enzymes responsible for the utilization of maltose and galactose. Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are further described in EP 73657. Yeast enhancers are also preferably used with yeast promoters.

Транскрипція антитіл з векторів у клітинах-хазяїнах ссавців регулюється, наприклад, промоторами, одержаними з геномів вірусів, таких як вірус лейкозу Абельсона, поліомавірус, вірус віспи (дифтериту) птахів, аденовірус (такий як аденовірус 2), бичачий папіломавірус, вірус пташиної саркоми, найбільш переважно цитомегаловірус, ретровірус, вірус гепатиту В, вірус мавп 40 (5М40), з гетерологічних промоторів ссавців, наприклад, промотор актину або промотор імуноглобуліну, з промоторів теплового шоку, за умови, що такі промотори сумісні з системами клітин-хазяїнів.Transcription of antibodies from vectors in mammalian host cells is regulated, for example, by promoters derived from the genomes of viruses such as Abelson's leukemia virus, polyomavirus, fowlpox (diphtheria) virus, adenovirus (such as adenovirus 2), bovine papillomavirus, avian sarcoma virus, most preferably cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus, simian virus 40 (5M40), from heterologous mammalian promoters, for example, an actin promoter or an immunoglobulin promoter, from heat shock promoters, provided that such promoters are compatible with host cell systems.

Ранній і пізній промотори вірусу 5М40 придатним чином одержують у вигляді рестрикційного фрагментаThe early and late promoters of the 5M40 virus are conveniently obtained as a restriction fragment

ЗМ40, що містить також вірусний сайт ініціації реплікації. Негайно ранній промотор цитомегаловірусу людини придатним чином одержують у вигляді рестрикційного фрагмента Ніпаїйї. Система для експресіїZM40, which also contains a viral replication initiation site. The human cytomegalovirus immediate early promoter is conveniently prepared as a Nipaiella restriction fragment. A system for expression

ДНК у хазяїнах-ссавцях з використанням бичачого папіломавірусу як вектора описана у патенті США Мо 4419446. Одна модифікація цієї системи описана у патенті США Ме 4601978. Див. також Кеуєз еї аї., МаїшгеDNA in mammalian hosts using bovine papillomavirus as a vector is described in US Pat. No. 4,419,446. One modification of this system is described in US Pat. No. 4,601,978. See also Keuez ei ai., Maishge

297:598-601 (1982) стосовно експресії КДНК р-інтерферону людини у мишачих клітинах під контролем промотору тимідинкінази з вірусу простого герпесу. Альтернативно, як промотор може бути використаний довгий кінцевий повтор вірусу саркоми Рауса. (5) Компонент енхансерного елемента297:598-601 (1982) regarding the expression of human β-interferon cDNA in mouse cells under the control of the thymidine kinase promoter from herpes simplex virus. Alternatively, the Rous sarcoma virus long terminal repeat can be used as a promoter. (5) Enhancer element component

Транскрипція ДНК, що кодує антитіло за винаходом, вищими еукаріотами часто збільшується інсертуванням енхансерної послідовності у вектор. Багато енхансерних послідовностей у наш час відомі з генів ссавців (глобіну, еластази, альбуміну, альфа-фетопротеїну та інсуліну). Однак, звичайно використовують енхансер з вірусу еукаріотичної клітини. Приклади включають в себе енхансер 5М40 на пізній стороні сайту ініціації реплікації (пари нуклеотидів 100-270), енхансер раннього промотору цитомегаловірусу на пізній стороні сайту ініціації реплікації, енхансер поліомавірусу на пізній стороні сайту ініціації реплікації і енхансери аденовірусу. Див. також Мапім, Майшге 297:17-18 (1982) стосовно енхансерних елементів для активації еукаріотичних промоторів. Енхансер може бути сплайсований у вектор у положенні або 3" стосовно послідовності, що кодує антитіло, але переважно він знаходиться у сайті 5' (ліворуч) від промотору. (6) Компонент термінації транскрипціїTranscription of the DNA encoding the antibody of the invention by higher eukaryotes is often increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Many enhancer sequences are now known from mammalian genes (globin, elastase, albumin, alpha-fetoprotein, and insulin). However, an enhancer from a virus of a eukaryotic cell is usually used. Examples include the 5M40 enhancer on the late side of the replication initiation site (nucleotide pairs 100-270), the cytomegalovirus early promoter enhancer on the late side of the replication initiation site, the polyomavirus enhancer on the late side of the replication initiation site, and adenovirus enhancers. See also Mapim, Maishge 297:17-18 (1982) regarding enhancer elements for activation of eukaryotic promoters. The enhancer can be spliced into the vector at or 3" to the antibody coding sequence, but preferably it is located at a site 5' (to the left) of the promoter. (6) Transcription Termination Component

Експресуючі вектори, використовувані в еукаріотичних клітинах-хазяїнах (дріжджах, грибах, комахах, рослині, тварині або клітинах, що містять ядро, з інших багатоклітинних організмів), будуть також містити послідовності, необхідні для термінації транскрипції і для стабілізації мРНК. Такі послідовності звичайно доступні з 5"- та іноді 3'-нетрансльованих областей еукаріотичних або вірусних ДНК або кДНК. Ці області містять нуклеотидні сегменти, що транскрибуються у вигляді поліаденільованих фрагментів у нетрансльованій частині мРНК, що кодує антитіло. Одним застосовним компонентом термінації транскрипції є область поліаденілювання бичачого гормону росту. Див. УМО94/11026 і описаний у ньому експресуючий вектор. Іншим є термінатор транскрипції легкого ланцюга імуноглобуліну миші. (7) Відбір і трансформація клітин-хазяїнівExpression vectors used in eukaryotic host cells (yeast, fungi, insect, plant, animal, or nucleated cells from other multicellular organisms) will also contain sequences necessary for transcription termination and for mRNA stabilization. Such sequences are usually accessible from the 5"- and sometimes the 3'-untranslated regions of eukaryotic or viral DNAs or cDNAs. These regions contain nucleotide segments that are transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the antibody-encoding mRNA. One applicable transcription termination component is the polyadenylation of bovine growth hormone. See UMO94/11026 and the expression vector described therein. Another is a mouse immunoglobulin light chain transcription terminator. (7) Selection and transformation of host cells

Придатними клітинами-хазяїнами для клонування або експресії ДНК в описаних тут векторах є клітини прокаріотів, дріжджів або вищих еукаріотів. Придатні прокаріоти для цієї мети включають в себе еубактерії, такі як грамнегативні або грампозитивні організми, наприклад, Епіегорасіегіасеае, такі як Е5спегіспіа, наприклад, Е. соїї, Епіегорасіег, Егуміпіа, КіерзіеІІа, Ргоїеи5, ЗаІтопеїПа, наприклад, ЗаІтопеїїа їурпітигішт,Suitable host cells for cloning or expressing DNA in the vectors described herein are prokaryotic, yeast, or higher eukaryotic cells. Suitable prokaryotes for this purpose include eubacteria, such as gram-negative or gram-positive organisms, such as E. spp., e.g.

Беїтайа, наприклад, Зеггайа тагсезсап5, і Зпідейа, а також бацили, такі як В. 5!бБій5 і В. Іспепітгтів (наприклад, В. Іспепітогтів 41 Р, описана у 0О 266710, опублікованому 12 квітня 1989 року), Реендотопав, такий як Р. аегидіпоза, і зігеріотусе5з. Одним переважним клонуючим хазяїном БЕ. соїї є Е. соїї 294 (АТОС 31446), хоча придатними є й інші штами, такі якЕ. соїї В, Е. соїї Х1776 (АТСС 31537) і Е. соїї МУ3110 (АТоС 27325). Ці приклади є ілюстративними, а не обмежувальними.Beitaia, such as Zeggaya tagsezsap5 and Zpidea, as well as bacilli such as B. 5!bBii5 and V. Ispepitogtiv (eg, V. ispepitogtiv 41 P, described in 0O 266710, published on April 12, 1989), Reendotopav, such as R. aegidipoza, and zigeriotuse5z. One preferred cloning host BE. soybean is E. soybean 294 (ATOS 31446), although other strains such as E. soybean B, E. soybean X1776 (ATSS 31537) and E. soybean MU3110 (АТоС 27325). These examples are illustrative and not limiting.

Крім прокаріотів, еукаріотичні мікроби, такі як нитчасті гриби або дріжджі, є придатними клонуючими або експресуючими хазяїнами для векторів, що кодують антитіло. Засспаготусез5 сегемізіае, або звичайні пекарні дріжджі, є найбільш часто використовуваним серед нижчих еукаріотичних мікроорганізмів -хазяїнів.In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for antibody-encoding vectors. Zasspagotuses5 segemisiae, or common baker's yeast, is the most commonly used among the lower eukaryotic host microorganisms.

Однак, ряди інших родів, видів і штамів звичайно є доступними і застосовними тут, такі якHowever, a number of other genera, species and strains are usually available and applicable here, such as

Зепігозасспаготусез ротре; Кіпухеготусез-хазяїни, такі як, наприклад, К. Іасіїв, К. їадіїв (АТОС 12424), К. риїдагісиз (АТСС 16045), К. міскегатії (АТСС 24178), К. мані (АТСС 56500), К. агозорпіагит (АТСС 36906),Zepigozasspagotusez rotre; Kipuhegotusez-hosts, such as, for example, K. Iasiiv, K. iadiiv (ATOS 12424), K. ryidagisiz (ATSS 16045), K. miskegatii (ATSS 24178), K. mani (ATSS 56500), K. agozorpiagit (ATSS 36906),

К. (Тептою!егап5 і К. тагхіапи5; Магоміа (ЕР 402226); Ріспіа равіогіз (ЕР 183070); Сапаїда; Тгісподегта геезіа (ЕР 244234); Меигозрога сгазза; Зспумаппіотусев5, наприклад, Зспуаппіотусев оссідепа|і5; і нитчасті гриби, такі як, наприклад, Меигозрога, Репісіййшт, ТоїІуросіадіит і АзрегодіПи5-хазяїни, такі як А. підшапз і А. підег.K. (Teptoyu!egap5 and K. taghiapi5; Magomia (ER 402226); Rispia raviogyz (ER 183070); Sapaida; Tgispodegta geezia (ER 244234); Meigozroga sgazza; Zspumappiotusev5, for example, Zspuappiotusev ossidepa|i5; and filamentous fungi, such such as, for example, Meygozroga, Repisiysht, ToiIurosiadiyt and AzregodiPi5-hosts, such as A. podshapz and A. podeg.

Придатні клітини-хазяїни для експресії глікозилованого антитіла одержують з багатоклітинних організмів. Приклади клітин безхребетних включають в себе клітини рослин і комах. Були ідентифіковані численні бакуловірусні штами і варіанти і відповідні пермісивні клітини-хазяїни комах з таких хазяїнів, як зродоріега їгидірегаа (гусениця), Аедезх аедурії (комар), Аедез аІрорісіи5 (комар), Огозорпйа теїІаподавіег (плодова мушка, дрозофіла) і Вотрух тогі. Різні вірусні штами для трансфекції є публічно доступними, наприклад, варіант Ї-1 МРМ Ашодгарпа саїїогпіса і штам Вт-5 МРМ Вотрух тотгі, і такі віруси можуть бути використані як віруси тут відповідно до даного винаходу, зокрема, для трансфекції клітин Зродоріега тидірегаа.Suitable host cells for expression of glycosylated antibodies are obtained from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculovirus strains and variants and corresponding permissive insect host cells have been identified from such hosts as Zrodoriega yhydiregaa (caterpillar), Aedezx aedurii (mosquito), Aedez airorisii5 (mosquito), Ogozorpya teiIapodavieg (fruit fly, Drosophila), and Votruh togi. Various viral strains for transfection are publicly available, for example Ashodgarpa saigiopis MRM variant Y-1 and Votruh totgi MRM V-5 strain, and such viruses can be used as viruses herein according to the present invention, in particular for transfection of Zrodoriega tidiregaa cells.

Культури клітин рослин бавовнику, кукурудзи, картоплі, сої, петунії, томату, тютюну, ряски і клітин інших рослин можуть також використовуватися як хазяїни.Cell cultures of cotton, corn, potato, soybean, petunia, tomato, tobacco, duckweed, and other plant cells can also be used as hosts.

Однак, найбільший інтерес представляли клітини хребетних, і розмноження клітин хребетних у культурі (культурі тканини) стало рутинною процедурою. Прикладами застосовних ліній клітин-хазяїнів ссавців є клітини яєчника Китайського хом'ячка, у тому числі клітини СНОК! (АТСС СС 61), ОХВ-11, 00-44 і клітини/-However, vertebrate cells have been of greatest interest, and propagation of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a routine procedure. Examples of applicable mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary cells, including SNOC cells! (ATSS SS 61), OKHV-11, 00-44 and cells/-

ОНЕР яєчника Китайського хом'ячка (СНО, ШОпацб еї аї., Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 77:4216 (1980)); лінія клітин СМІ мавпи, трансформована 5М40 (СбО5-7, АТСС СІ 1651); лінія клітин ембріональної нирки людини (клітини 293 або клітини 293, субклоновані для росту у суспензійній культурі (Сгапат еї аї., у. сепONER of the ovary of the Chinese hamster (SNO, Shopatsb ei ai., Rgos. Mai. Asai. si. OBA 77:4216 (1980)); monkey SMI cell line, transformed 5M40 (СбО5-7, ATSS SI 1651); human embryonic kidney cell line (293 cells or 293 cells subcloned for growth in suspension culture (Sgapat ei ai., u. sep

Міго!. 36:59 (1977)); клітини нирки дитинчати хом'яка (ВНК, АТС СС 10); клітини Сертолі миші (ТМА4,Migo!. 36:59 (1977)); baby hamster kidney cells (VNK, ATS SS 10); mouse Sertoli cells (TMA4,

Майшег, ВіоІ. Нергоа. 23:243-251 (1980)); клітини нирки мавпи (СМ! АТСС СС 70); клітини ниркиMaysheg, VioI. Nergoa. 23:243-251 (1980)); monkey kidney cells (SM! ATSS SS 70); kidney cells

Африканської зеленої мавпи (МЕКО-76, АТСС СКІ -1587); клітини раку шийки матки людини (НЕГА, АТОСAfrican green monkey (MEKO-76, ATSS SKI -1587); human cervical cancer cells (NEGA, ATOS

СС 2); клітини нирки собачих (МОСК, АТСС СС. 34); клітини печінки буйволового щура (ВЕК. ЗА, АТОСSS 2); canine kidney cells (MoSC, ATSS SS. 34); buffalo rat liver cells (VEK. ZA, ATOS

СК. 1442); клітини легені людини (М/138, АТСС СС 75); клітини печінки людини (Нер 52, НВ 8065); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562, АТОС ССІ 51); ТКІ-клітини (Маїпег еї а!., Аппа!5 М.М Асаай. збі. 383:44-68 (1982)); клітини МКО 5; клітини Е5а4 і клітини гепатомної лінії людини (Нер 2).SK. 1442); human lung cells (M/138, ATCC SS 75); human liver cells (Ner 52, HB 8065); mouse mammary gland tumor cells (MMT 060562, ATOS SSI 51); TKI-cells (Maipeg ei a!., Appa!5 MM Asaai. zbi. 383:44-68 (1982)); MKO 5 cells; E5a4 cells and cells of the human hepatoma line (Ner 2).

Клітини-хазяїни трансформували або трансфікували описаними вище експресуючими або клонуючими векторами для одержання антитіл і культивували у придатних поживних середовищах, модифікованих відповідним чином для індукції промоторів, відбору трансформантів або ампліфікації генів, що кодують бажані послідовності. Крім того, нові вектори і трансфіковані клітинні лінії з множинними копіями транскрипційних одиниць, відділені з використанням селективного маркера, є особливо застосовними і переважними для експресії антитіл. (8) Культивування клітин-хазяїнівHost cells were transformed or transfected with the above-described expressing or cloning vectors to obtain antibodies and cultured in suitable nutrient media modified accordingly for the induction of promoters, selection of transformants, or amplification of genes encoding the desired sequences. In addition, new vectors and transfected cell lines with multiple copies of transcription units separated using a selective marker are particularly applicable and preferred for antibody expression. (8) Cultivation of host cells

Клітини-хазяїни, використовувані для одержання антитіла за даним винаходом, можуть культивуватися у різних середовищах. Для культивування клітин-хазяїнів придатні комерційно доступні середовища, такі якThe host cells used to produce the antibodies of the present invention can be cultured in various media. Commercially available media such as

Нат Е10 (Зідта), мінімальне есенціальне середовище (МЕМ), (Зідта)), КРМІ-1640 (Зідта) і модифіковане за способом Дульбеко середовище Ігла (ОМЕМ), Зідта). Крім того, будь-які з середовищ, описаних у Нат еї аї,, Мей. Епл. 58:44 (1979), Вагпез еї аї., АпаІ. Віоспет. 102:255 (1980), патентах США з номерами 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 або 5122469; М/О90103430; УМО 87/00195 або патенті США Ке. Ме 30985, можуть бути використані як культуральні середовища для цих клітин-хазяїнів. Будь-які з цих середовищ можуть бути доповнені, якщо необхідно, гормонами і/або іншими факторами росту (такими як інсулін, трансферин або епідермальний фактор росту), солями (такими як хлорид натрію, кальцію, магнію і фосфат), буферами (такими як НЕРЕ5), нуклеотидами (такими як аденозин і тимідин), антибіотиками (такими як Гентаміцин"м), мікроелементами (що визначаються як неорганічні сполуки, звичайно присутні у кінцевій концентрації у діапазоні мікромолярних концентрацій) і глюкозою або еквівалентним джерелом енергії. Будь-які інші необхідні домішки, які відомі кваліфікованим у даній галузі фахівцям, можуть бути також включені у придатних концентраціях. Умови культивування, такі як температура, рнН і т.п., є умовами, використовуваними раніше з клітиною-хазяїном, вибраною для експресії, і будуть очевидними для фахівця зі звичайною кваліфікацією у даній галузі. (9) Очищення антитілаNat E10 (Zidta), minimal essential medium (MEM), (Zidta)), KRMI-1640 (Zidta) and Dulbecco's modified Eagle's medium (OMEM), Zidta). In addition, any of the environments described in Nat. Apple 58:44 (1979), Vagpez ei ai., ApaI. Viospet. 102:255 (1980), US Patent Nos. 4,767,704; 4657866; 4927762; 4560655 or 5122469; M/O90103430; UMO 87/00195 or US patent Ke. Me 30985, can be used as culture media for these host cells. Any of these media may be supplemented, if necessary, with hormones and/or other growth factors (such as insulin, transferrin, or epidermal growth factor), salts (such as sodium chloride, calcium, magnesium, and phosphate), buffers (such as HERE5), nucleotides (such as adenosine and thymidine), antibiotics (such as Gentamicin), trace elements (defined as inorganic compounds, usually present at a final concentration in the micromolar concentration range) and glucose or an equivalent energy source. Any other necessary additives known to those skilled in the art may also be included at suitable concentrations.Culturing conditions such as temperature, pH, etc. are those previously used with the host cell selected for expression and will be apparent for one of ordinary skill in the art.(9) Purification of antibody

При використанні рекомбінантних технологій антитіло може бути одержане внутрішньоклітинно, у периплазматичному просторі і безпосередньо секретоване у середовище, у тому числі з мікробних культур.When using recombinant technologies, the antibody can be obtained intracellularly, in the periplasmic space and directly secreted into the environment, including from microbial cultures.

Якщо це антитіло продукується внутрішньоклітинно, як перша стадія, залишки у вигляді частинок або фрагменти клітин-хазяїнів, або лізовані фрагменти видаляють, наприклад, центрифугуванням або ультрафільтрацією. Вейцег єї а). 5сієпсе 240:1041-1043 (1988); ІСБО Зпогпі Керогів 10:105 (1990); і Ргос. Маї!.If this antibody is produced intracellularly, as a first step, particulate residues or host cell fragments or lysed fragments are removed, for example, by centrifugation or ultrafiltration. Weitzeg her a). 5siepse 240:1041-1043 (1988); ISBO Zpogpi Kerogov 10:105 (1990); and Rgos. Mai!

Асад. сі ШБА 90:457-461 (1993) описують процедуру виділення антитіл, які секретуються у периплазматичний простір Е. сої. (див. також Сагіег еї а!., Віо/Гесппоїоду 10:163-167 (1992)).Asad si ShBA 90:457-461 (1993) describe the procedure for isolating antibodies that are secreted into the periplasmic space of E. soya. (see also Sagieg et al., Vio/Hesppoiodu 10:163-167 (1992)).

Композиція антитіл, приготована з мікробних клітин і клітин ссавців, може бути очищена з використанням, наприклад, гідроксіапатитної хроматографії, катіоно- або аніонообмінної хроматографії і афінної хроматографії, причому переважним способом очищення є афінна хроматографія. Придатність білка А як афінного ліганду залежить від виду та ізотипу будь-якого Ес-домену імуноглобуліну, що є присутнім у цьому антитілі. Білок А може бути використаний для очищення антитіл, які базуються на важких ланцюгах у, у2 або у4 людини (І іпатагк еї аї., У. Іттипої. Меїй. 62:1-13 (1983)). Білок 5 рекомендується для всіх ізотипів миші і для уЗ людини (би55 еї аі.,, ЕМВО 3. 5:1567-1575 (1986)). Матриксом, до якого приєднують цей афінний ліганд, є найчастіше агароза, але доступні й інші матрикси. Механічно стабільні матрикси, такі як скло з контрольованими порами або полі(стирендивініл)бензол, роблять можливими більш швидкі швидкості потоку і більш короткі періоди часу обробки, ніж швидкості і періоди, одержувані з агарозою. Коли антитіло містить домен Сн3, для очищення застосовна смола ВаКегропа АВХ м (у. Т. Вакег,An antibody composition prepared from microbial and mammalian cells can be purified using, for example, hydroxyapatite chromatography, cation or anion exchange chromatography, and affinity chromatography, with affinity chromatography being the preferred method of purification. The suitability of protein A as an affinity ligand depends on the species and isotype of any immunoglobulin E domain present in that antibody. Protein A can be used to purify antibodies that are based on human y, y2 or y4 heavy chains (I ipatagk ei ai., U. Ittipoi. Meii. 62:1-13 (1983)). Protein 5 is recommended for all mouse isotypes and for human uZ (by55 ei ai.,, EMVO 3. 5:1567-1575 (1986)). The matrix to which this affinity ligand is attached is most often agarose, but other matrices are also available. Mechanically stable matrices, such as controlled pore glass or poly(styrenedivinyl)benzene, enable faster flow rates and shorter processing times than those obtained with agarose. When the antibody contains the Сn3 domain, VaKegroup ABH m resin is applicable for purification (U. T. Wakeg,

РПйірзриго, МУ). Доступні також інші способи очищення білка, такі як фракціонування на іонообмінній колонці, осадження етанолом, оберненофазова ВЕРХ, хроматографія на силікагелі, хроматографія на гепарині, хроматографія на Сефарозітм, хроматографія на аніоно- або катіонообмінній смолі (такій як колонка з поліаспарагіновою кислотою), хроматофокусування, електрофорез у ДСН-ПААГ і осадження сульфатом амонію.RPyirzrygo, MU). Other methods of protein purification are also available, such as ion-exchange column fractionation, ethanol precipitation, reverse-phase HPLC, silica gel chromatography, heparin chromatography, Sepharozitm chromatography, chromatography on an anion or cation exchange resin (such as a polyaspartic acid column), chromatographic focusing, electrophoresis in SDS-PAGE and precipitation with ammonium sulfate.

Химерні антитілаChimeric antibodies

Антитіло гризуна після повторюваного введення іп мімо людині, або окремо, або у вигляді кон'югату, буде викликати імунну реакцію у реципієнті проти антитіла гризуна; так звану реакцію НАМА (людське анти- мишаче антитіло) Реакція НАМА може обмежувати ефективність фармацевтичного засобу при повторюваному введенні доз. Імуногенність антитіла може бути зменшена хімічною модифікацією цього антитіла гідрофільним полімером, таким як поліетиленгліколь, або з використанням способів генної інженерії, щоб зробити структуру антитіла більш подібною до структури антитіла людини, наприклад, у вигляді химерного, гуманізованого антитіла, антитіла людини або сконструйованих для людини антитілA rodent antibody, after repeated ip injection into a human, either alone or as a conjugate, will elicit an immune response in the recipient against the rodent antibody; the so-called NAMA reaction (human anti-mouse antibody) The NAMA reaction can limit the effectiveness of the pharmaceutical agent with repeated administration of doses. The immunogenicity of an antibody can be reduced by chemically modifying that antibody with a hydrophilic polymer, such as polyethylene glycol, or by using genetic engineering techniques to make the structure of the antibody more similar to that of a human antibody, for example, as a chimeric, humanized antibody, human antibody, or engineered antibody.

Нитап Епдіпеегед!м, Оскільки такі сконструйовані антитіла є менш імуногенними у людях, ніж вихідні мишачі моноклональні антитіла, вони можуть бути використані для лікування людей з набагато меншим ризиком анафілаксії. Таким чином, ці антитіла можуть бути переважними у терапевтичних застосуваннях, які включають в себе введення іп ммо людині.Because these engineered antibodies are less immunogenic in humans than the original murine monoclonal antibodies, they can be used to treat people with a much lower risk of anaphylaxis. Thus, these antibodies may be advantageous in therapeutic applications that include administration of human immunodeficiency virus.

Химерні моноклональні антитіла, в яких варіабельні домени Ід мишачого моноклонального антитіла злиті з константними доменами Ід людини, можуть бути генеровані з використанням стандартних процедур, відомих у даній галузі (див. Могтізоп, 5. І., еї аі. (1984) Спітепс Нитап Апіїроду МоіІесцев; Моизе АпіїдепChimeric monoclonal antibodies, in which the variable Id domains of a murine monoclonal antibody are fused to the constant domains of human Id, can be generated using standard procedures known in the art (see Mogtizop, 5. I., et al. (1984) Spiteps Nytap Apiirodu MoiIestsev; Moise Apiidep

Віпаіпд Оотаїп5 м/йй Нитап Сопвіапі Недіоп Оотаїпв, Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 81, 6841-6855; і Вошіаппе,Vipaipd Ootaipv m/y Nytap Sopviapi Nediop Ootaipv, Rgos. Mai). Asad si. BOTH 81, 6841-6855; and Voshiappe,

С.Ї.., ег аІ., Мате 312, 643-646. (1984)). Наприклад, послідовності генів для варіабельних областей антитіла гризуна, які зв'язують СЕА, можуть бути введені для заміни варіабельних доменів білка мієломи людини з одержанням, таким чином, рекомбінантного химерного антитіла. Ці процедури докладно описані в ЕР 194276, ЕР 0120694, ЕР 0125023, ЕР 0171496, ЕР 0173494 і УУО 86/01533. Хоча деякі химерні моноклональні антитіла виявилися менш імуногенними у людях, варіабельні домени Ід миші можуть усе ще приводити до значної реакції людини проти мишачих антитіл.S.Yi., eg aI., Mate 312, 643-646. (1984)). For example, the gene sequences for the variable regions of the rodent antibody that bind CEA can be introduced to replace the variable domains of the human myeloma protein, thereby producing a recombinant chimeric antibody. These procedures are described in detail in EP 194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 and UUO 86/01533. Although some chimeric monoclonal antibodies have been shown to be less immunogenic in humans, the mouse Id variable domains can still elicit a significant human anti-mouse antibody response.

Гуманізовані антитілаHumanized antibodies

Гуманізовані антитіла можуть бути одержані різними способами, що включають, наприклад, (1) трансплантацію областей, що визначають комплементарність, (СОК) не людини на каркасну і константну область людини (спосіб, називаний у даній галузі гуманізацією через «трансплантацію СОК»), або альтернативно (2) трансплантацію повних варіабельних доменів не людини, але «покриванням» їх людиноподібною поверхнею заміною поверхневих залишків (спосіб, називаний у даній галузі «облицюванням»). У даному винаході гуманізовані антитіла будуть включати в себе як «гуманізовані», так і «облицьовані» антитіла. Ці способи описані, наприклад, у статтях допез еї аї!., Маїшге 321:522-525 (1986);Humanized antibodies can be produced in a variety of ways, including, for example, (1) transplanting a non-human complementarity-determining region (CDR) onto a human framework and constant region (a method referred to in the art as humanization via “CDR transplantation”), or alternatively (2) transplanting the complete non-human variable domains, but "coating" them with a human-like surface by replacing surface residues (a method referred to in the art as "cladding"). In the present invention, humanized antibodies will include both "humanized" and "coated" antibodies. These methods are described, for example, in the articles of Dopez ei!., Maishge 321:522-525 (1986);

Моттізоп еї аї., Ргос. Май). Асад. Зсі., О.5.А., 81:6851-6855 (1984); Моїтізоп апа ОЇ, Аду. Іттипої., 44:65-92 (1988); Метовеєуеєг еї аї., Зсівєпсе 239:1534-1536 (1988); Радіап, Моїес. Іттип. 28:489-498 (1991); Радіап,Mottizop eyi ai., Rhos. May). Asad Zsi., O.5.A., 81:6851-6855 (1984); Moitisop apa ОЙ, Adu. Ittipoi., 44:65-92 (1988); Metovyeueeg ei ai., Zsivepse 239:1534-1536 (1988); Radiap, Moyes. Etc. 28:489-498 (1991); Radiap,

Моїес. Іттипої. 31(3): 169-217 (1994); і Кешерогоцдн, СА. еї аї., Ргоївіп Епад. 4(7):773-83 (1991), кожна з яких включена сюди як посилання.Moyes. And so on. 31(3): 169-217 (1994); and Kesherogotsdn, SA. ei ai., Rgoivip Epad. 4(7):773-83 (1991), each of which is incorporated herein by reference.

Наприклад, послідовності генів областей СОЕ антитіла гризуна можуть бути виділені або синтезовані і введені для заміни відповідних областей послідовності гомологічного гена антитіла людини, з одержанням антитіла людини зі специфічністю вихідного антитіла гризуна. Ці процедури описані в ЕР 023940, УМО 90/07861 і УМО 91/09967.For example, the gene sequences of the SOE regions of the rodent antibody can be selected or synthesized and introduced to replace the corresponding regions of the sequence of the homologous gene of the human antibody, resulting in a human antibody with the specificity of the original rodent antibody. These procedures are described in EP 023940, UMO 90/07861 and UMO 91/09967.

Трансплантація області СОК включає введення однієї або декількох з шести областей СО з варіабельних доменів Ід важкого і легкого ланцюга миші у відповідні чотири каркасних області варіабельних доменів Ід людини, також називане трансплантацією СОВ. Цей спосіб (Кіесптапп, Г.., еї а!., Магиге 332, 323 (1988)) використовує консервативні каркасні області (ЕК1-ЕК4) як каркас для підтримки петель СОБК, які є первинними контактами з антигеном. Однак, недоліком трансплантації СОК є те, що вона може приводити до гуманізованого антитіла, що має істотно більш низьку афінність зв'язування, ніж вихідне антитіло миші, оскільки амінокислоти каркасних областей можуть сприяти зв'язуванню антигену, і оскільки амінокислоти петель СОК можуть впливати на асоціацію двох варіабельних доменів Ід. Для збереження афінності гуманізованого моноклонального антитіла цей спосіб трансплантації СОЕ може бути поліпшений вибором каркасних областей людини, які найбільш близько подібні до каркасних областей вихідного антитіла миші, і сайт-направленим мутагенезом окремих амінокислот у каркасі або СОК за допомогою комп'ютерного моделювання сайту зв'язування антигену (наприклад, Со, М. 5., еї аї. (1994), 9. Іттипої. 152, 2968-2976).Transplantation of the SOC region involves the introduction of one or more of the six CO regions from the variable Id domains of the mouse heavy and light chains into the corresponding four framework regions of the human Id variable domains, also called SOV transplantation. This method (Kiesptapp, H.., ei a!., Magige 332, 323 (1988)) uses the conserved framework regions (EK1-EK4) as a framework to support the SOBK loops, which are the primary contacts with the antigen. However, a disadvantage of SOC grafting is that it can result in a humanized antibody with substantially lower binding affinity than the parent mouse antibody, because the amino acids of the framework regions can facilitate antigen binding, and because the amino acids of the SOC loops can affect association of two variable domains Id. To preserve the affinity of the humanized monoclonal antibody, this method of ESR transplantation can be improved by selecting human framework regions that most closely resemble the framework regions of the original mouse antibody and by site-directed mutagenesis of individual amino acids in the framework or SOC using computer modeling of the binding site antigen (for example, So, M. 5., ei ai. (1994), 9. Ittipoi. 152, 2968-2976).

Один спосіб гуманізації антитіл передбачає порівняння послідовностей важкого і легкого ланцюгів не людини з послідовностями важкого і легкого ланцюгів людини, відбір і заміну каркаса не людини каркасом людини на основі такого порівняння, молекулярне моделювання для передбачення конформації цієї гуманізованої послідовності і порівняння з конформацією вихідного антитіла. За цим процесом йшла зворотна мутація залишків в області СОК, що порушує структуру областей СОК, доки передбачена конформація моделі гуманізованої послідовності не наблизиться близько до конформації областей СОВ не людини вихідного антитіла не людини. Такі гуманізовані антитіла можуть бути додатково дериватизовані для полегшення поглинання і кліренсу, наприклад, за допомогою АзпуеїІ-рецепторів (див., наприклад, патенти США з номерами 5530101 і 5585089, які включені сюди як посилання).One way to humanize antibodies involves comparing the sequences of the non-human heavy and light chains with the sequences of the human heavy and light chains, selecting and replacing the non-human framework with a human framework based on such comparison, molecular modeling to predict the conformation of this humanized sequence, and comparison with the conformation of the original antibody. This process was followed by reverse mutation of residues in the SOC region, which disrupts the structure of the SOC regions, until the predicted conformation of the humanized sequence model approaches the conformation of the non-human SOB regions of the original non-human antibody. Such humanized antibodies may be further derivatized to facilitate uptake and clearance, for example, with AzpoI receptors (see, for example, US Patent Nos. 5,530,101 and 5,585,089, which are incorporated herein by reference).

Повідомлявся ряд гуманізацій мишачих моноклональних антитіл за допомогою раціонального конструювання (див., наприклад, 20020091240, опублікований 11 липня 2002 року, МО 92/11018 і патентA number of humanizations of murine monoclonal antibodies using rational design have been reported (see, e.g., 20020091240, published July 11, 2002, MO 92/11018 and patent

США Ме 5693762, патент США Ме5766866).USA Me 5693762, US patent Me 5766866).

Сконструйовані для людини (Нитап Епдіпеегей м) антитілаAntibodies designed for humans (Nitap Epdipeegei m).

Фраза "сконструйоване для людини (Нитап Епдіпеегеа"м) антитіло" стосується антитіла, виробленого з антитіла не людини, звичайно з мишачого моноклонального антитіла. Альтернативно, сконструйоване для людини антитіло Нитап Епдіпеегед"м може бути вироблене з химерного антитіла, що зберігає або по суті зберігає властивості зв'язування антитіла вихідного антитіла не людини, але яке проявляє зменшену імуногенність у порівнянні з вихідним антитілом при введенні людям.The phrase "engineered humanized (Nitap Epdipegea"m) antibody" refers to an antibody produced from a non-human antibody, usually a mouse monoclonal antibody. Alternatively, a humanized Nytap Epdipegea'm antibody may be produced from a chimeric antibody that retains or essentially retains the antibody binding properties of the original non-human antibody, but which exhibits reduced immunogenicity compared to the original antibody when administered to humans.

Конструювання для людини (Нитап Епдіпеегіпд'м) варіабельних доменів антитіла було описане зішапіска (Див., наприклад, зіцапіска еї аі., патент США Ме5766886; 5іцапіска еї аї. Ргоївіп Епдіпеегіпд 7:805-814 (1994)| як спосіб для зменшення імуногенності при збереженні активності зв'язування молекул антитіла. Відповідно до цього способу, кожній амінокислоті варіабельної області приписували ризик заміни.The construction of human (Nytap Epipeechpd'm) antibody variable domains has been described previously (See, e.g., Zitsapiska et al., US Patent No. 5766886; 5itsapiska et al. Rgoivip Epipeechpd 7:805-814 (1994)) as a way to reduce immunogenicity while retaining the binding activity of the antibody molecules.According to this method, each amino acid of the variable region was assigned a risk of substitution.

Амінокислотні заміни відрізняються однією з трьох категорій ризику: (1) змінами низького ризику є зміни, які мають найвищий потенціал для зменшення імуногенності з найменшим шансом порушення зв'язування антигену; (2) змінами помірного (середнього) ризику є зміни, які можуть додатково зменшувати імуногенність, але мають більший шанс впливу на зв'язування антигену або укладання (фолдинг) білка; (3) змінами високого ризику є зміни, які Є важливими для зв'язування або для збереження структури антитіла і несуть найвищий ризик того, що вони будуть впливати на зв'язування антигену або укладання білка.Amino acid substitutions fall into one of three risk categories: (1) low-risk changes are changes that have the highest potential to reduce immunogenicity with the least chance of disrupting antigen binding; (2) moderate (medium) risk changes are changes that may further reduce immunogenicity, but have a greater chance of affecting antigen binding or protein folding; (3) high-risk changes are changes that ARE important for binding or for maintaining the structure of the antibody and carry the highest risk that they will affect antigen binding or protein folding.

Внаслідок тривимірної структурної ролі пролінів, модифікації у пролінах звичайно вважаються щонайменше змінами помірного (середнього) ризику, навіть якщо дане положення звичайно є положенням низького ризику.Because of the three-dimensional structural role of prolines, modifications in prolines are usually considered at least moderate (intermediate) risk changes, even if a given position is usually a low risk position.

Варіабельні області легкого і важкого ланцюгів антитіла гризуна конструюються для людини (НитапThe variable regions of the light and heavy chains of the rodent antibody are designed for humans (Ex

Епдіпеегеа"м) наступним чином для заміни амінокислот людини у положеннях, визначених як такі, що не мають ймовірності шкідливої дії ні на зв'язування антигену, ні на укладання білка, але мають ймовірність зменшення імуногенності при введенні людині. Амінокислотні залишки, які знаходяться у положеннях «низького ризику» і які є кандидатами для модифікації відповідно до даного способу, ідентифікують порівнянням амінокислотних послідовностей варіабельних областей гризуна з послідовністю варіабельної області людини. Може бути використана будь-яка варіабельна область людини, у тому числі окрема послідовність МН або Мі, або консенсусна послідовність МН або Мі людини, або окрема або консенсусна послідовність зародкової лінії людини. Амінокислотні залишки у будь-якій кількості положень низького ризику або у всіх положеннях низького ризику можуть бути змінені. Наприклад, у кожному положенні низького ризику, де порівняні амінокислотні залишки миші і людини відрізняються, вводять модифікацію амінокислоти, що заміняє амінокислотний залишок гризуна амінокислотним залишком людини.Epdipeegea"m) as follows to replace human amino acids in positions defined as those that are not likely to have a harmful effect on either antigen binding or protein folding, but are likely to reduce immunogenicity when administered to humans. Amino acid residues that are in "low risk" positions and which are candidates for modification according to this method are identified by comparing the amino acid sequences of the rodent variable regions with the sequence of the human variable region. Any human variable region can be used, including a single MH or Mi sequence, or a consensus a human MH or Mi sequence, or a single or consensus human germline sequence. Amino acid residues at any number of low-risk positions or at all low-risk positions may be altered. For example, at each low-risk position where mouse and human amino acid residues are compared differ, amino modification is introduced acid that replaces the rodent amino acid residue with a human amino acid residue.

Альтернативно, можуть бути змінені амінокислотні залишки у всіх положеннях низького ризику і у будь- якому положенні помірного ризику. В ідеалі, для досягнення найменшої імуногенності всі з положень низького і помірного ризику змінюють у послідовності гризуна з одержанням послідовності людини.Alternatively, amino acid residues at all low-risk positions and at any moderate-risk position may be changed. Ideally, to achieve the least immunogenicity, all of the positions of low and moderate risk are changed in the rodent sequence to obtain the human sequence.

Синтетичні гени, що містять модифіковані варіабельні області важкого і/або легкого ланцюга, конструюють і зв'язують з константними областями важкого ланцюга у і/або легкого ланцюга каппа людини.Synthetic genes containing modified variable regions of the heavy and/or light chain are constructed and linked to the constant regions of the heavy chain in and/or the light chain of human kappa.

Будь-які константні області важкого ланцюга і легкого ланцюга людини можуть бути використані у комбінації з варіабельними областями сконструйованого для людини (Нитап Епдіпеегеа м) антитіла, у тому числі ІДА (будь-якого підкласу, такого як ІЇІДАТ або ІдА2), дО, ЧЕ, Іде (будь-якого підкласу, наприклад, Ідс1, Ідса2,Any of the human heavy chain and light chain constant regions can be used in combination with the variable regions of a humanized antibody, including IDA (of any subclass such as IIDAT or Ida2), dO, CHE, Goes (of any subclass, for example, Ids1, Idsa2,

ІДОЗ або ІдС4) або ІдМ. Гени важкого і легкого ланцюга вводять у клітини-хазяїни, такі як клітини ссавців, і утворені рекомбінантні імуноглобулінові продукти одержують і характеризують.IDOZ or IdS4) or IdM. The heavy and light chain genes are introduced into host cells, such as mammalian cells, and the resulting recombinant immunoglobulin products are obtained and characterized.

Антитіла людини з трансгенних тваринHuman antibodies from transgenic animals

Антитіла людини для націлювання на антиген можуть бути також одержані з використанням трансгенних тварин, які не мають ендогенного продукування імуноглобуліну, і сконструйовані для вміщення локусів імуноглобуліну людини. Наприклад, У/О 98/24893 описує трансгенних тварин, які мають локус Ід людини, причому ці тварини не продукують функціональні ендогенні імуноглобуліни внаслідок інактивації ендогенних локусів важкого і легкого ланцюга. МО 91/10741 також описує трансгенних хазяїнів-ссавців не приматів, здатних утворювати імунну реакцію на імуноген, причому ці антитіла мають константні і варіабельні області приматів, а ендогенні локуси, що кодують імуноглобулін, замінені або інактивовані. УМО 96/30498 описує застосування системи Сге/Л ох для модифікації локусу імуноглобуліну у ссавці, наприклад, заміни всіх або частини константної або варіабельної області, для утворення модифікованої молекули антитіла. УМО 94/02602 описує ссавців-хазяїнів не людини, що мають інактивовані ендогенні локуси Ід і функціональні локуси Ід людини. Патент США Мо 5939598 описує способи одержання трансгенних мишей, в яких ці миші позбавлені ендогенних важких ланцюгів і експресують екзогенний локус імуноглобуліну, що містить одну або декілька ксеногенних константних областей.Human antibodies for antigen targeting can also be obtained using transgenic animals that do not have endogenous production of immunoglobulin, and engineered to include human immunoglobulin loci. For example, U/O 98/24893 describes transgenic animals having the human Id locus, and these animals do not produce functional endogenous immunoglobulins due to inactivation of the endogenous heavy and light chain loci. MO 91/10741 also describes transgenic non-primate mammalian hosts capable of generating an immune response to an immunogen, wherein these antibodies have primate constant and variable regions, and the endogenous immunoglobulin coding loci are replaced or inactivated. UMO 96/30498 describes the use of the Sge/Lok system to modify an immunoglobulin locus in a mammal, for example, replacing all or part of a constant or variable region, to form a modified antibody molecule. UMO 94/02602 describes non-human mammalian hosts having inactivated endogenous Id loci and functional human Id loci. US patent Mo 5939598 describes methods of obtaining transgenic mice in which these mice are devoid of endogenous heavy chains and express an exogenous immunoglobulin locus containing one or more xenogeneic constant regions.

З використанням описаної вище трансгенної тварини може бути одержана імунна реакція на вибрану антигенну молекулу, і клітини, що продукують антитіло, можуть бути видалені з тварини і використані для одержання гібридом, які секретують моноклональні антитіла людини. Протоколи імунізації, ад'юванти і т.п. відомі у даній галузі і використовувалися в імунізації, наприклад, трансгенної миші, як описано у МО 96/33735. Ця публікація описує моноклональні антитіла проти різних антигенних молекул, у тому числі 1І--6,Using the transgenic animal described above, an immune response to the selected antigenic molecule can be elicited, and antibody-producing cells can be removed from the animal and used to produce hybridomas that secrete human monoclonal antibodies. Immunization protocols, adjuvants, etc. are known in the art and have been used in the immunization of, for example, a transgenic mouse as described in MO 96/33735. This publication describes monoclonal antibodies against various antigenic molecules, including 1I--6,

І/-8, ТМРа, СО4 людини, І -селектину, др39 і правцевого токсину. Ці моноклональні антитіла можуть бути випробувані на здатність інгібувати або нейтралізувати біологічну активність або фізіологічну дію відповідного білка. М/О 96/33735 описує, що моноклональні антитіпя проти ІІ-8, одержані з імунних клітин трансгенних мишей, імунізованих 1-8, блокували функції нейтрофілів, що індукуються 1І/-8. Моноклональні антитіла людини зі специфічністю стосовно антигену, використаного для імунізації трансгенних тварин, також описані у МУМО 96/34096 і заявці на патент США Мо 20030194404; і заявці на патент США Мо 20030031667. Див. також Чакороміїв вї а!., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 90:2551 (1993); дакобоміїв евї а!., Майиге, 362:255-258 (1993); Вгиддептапп еї аї., Меаг іп Іттипої, 7:33 (1993); і патент США Ме 5591669, патент СШАI/-8, TMRa, human CO4, I-selectin, dr39 and tetanus toxin. These monoclonal antibodies can be tested for their ability to inhibit or neutralize the biological activity or physiological effect of the respective protein. M/O 96/33735 describes that monoclonal antibodies against II-8, obtained from immune cells of transgenic mice immunized with 1-8, blocked the functions of neutrophils induced by 1I/-8. Monoclonal human antibodies with specificity for the antigen used to immunize transgenic animals are also described in MUMO 96/34096 and US patent application Mo 20030194404; and US Patent Application Mo. 20030031667. See also Chakoromyiv vii a!., Rgos. Mai). Asad 5 OBA, 90:2551 (1993); dakobomyiv evy a!., Mayige, 362:255-258 (1993); Vgyddeptapp ei ai., Meag ip Ittipoi, 7:33 (1993); and US Pat. No. 5,591,669, US Pat

Мо 5589369, патент США Мо 5545807 і заявку на патент США Ме 20020199213, УМО 96/34096 і заявку на патент США Ме 20030194404 і заявку на патент США Ме 20030031667.MO 5589369, US patent MO 5545807 and US patent application ME 20020199213, UMO 96/34096 and US patent application ME 20030194404 and US patent application ME 20030031667.

Додаткові трансгенні тварини, застосовні для одержання моноклональних антитіл, включають в себеAdditional transgenic animals applicable to the production of monoclonal antibodies include

Медагех НИМАБ-МОШЗЕФ, описану у патенті США Ме5770429 і Різпм/йй, еї а. (Маї. Віоїесппої. 14:845-851, 1996), що містить генні послідовності з неаранжованих генів антитіла людини, які кодують важкий і легкий ланцюги антитіл людини. Імунізація з використанням НимМАбБ-МОБЕФ робить можливим продукування моноклональних антитіл до білка-мішені.Medagekh NIMAB-MOSZEF, described in the US patent Me5770429 and Rizpm/yy, ei a. (May. Violations. 14:845-851, 1996), containing gene sequences from unarranged human antibody genes that encode the heavy and light chains of human antibodies. Immunization using NimMAbB-MOBEF makes it possible to produce monoclonal antibodies to the target protein.

Івпіда еї аї. (Сіопіпд біт Сеїв. 4:91-102, 2002) описують також мишу ТгапеСпгото Моизе (ТСМОШИ5Е М), яка містить сегменти з розмірами порядку мега (1042) нуклеотидів ДНК людини і яка включає локуси повного імуноглобуліну людини (під). ТОМОШ5БЕ має повний різноманітний репертуар бід, що включає в себе всі підкласи до (Ід01-54). Імунізація ТО-миші різними антигенами продукує реакції у вигляді антитіл, що містять антитіла людини.Ivpida her ai. (Siopipd bit Seiv. 4:91-102, 2002) also describe the TgapeSpgoto Moise mouse (TSMOSHY5E M), which contains segments of the order of mega (1042) nucleotides of human DNA and which includes loci of complete human immunoglobulin (sub). TOMOSH5BE has a full diverse repertoire of problems, which includes all subclasses up to (Id01-54). Immunization of TO mice with various antigens produces reactions in the form of antibodies containing human antibodies.

Заявка на патент США Мо 20030092125 описує способи зсуву імунної реакції тварини на бажаний епітоп. Антитіла людини можуть бути також генеровані активованими іп міго В-клітинами (див. патенти США з номерами 5567610 і 5229275).US patent application Mo 20030092125 describes methods of shifting the animal's immune response to the desired epitope. Human antibodies can also be generated by activated ip migo B cells (see US Patent Nos. 5,567,610 and 5,229,275).

Антитіла з технології фагового дисплеюAntibodies from phage display technology

Розвиток технологій для одержання репертуарів рекомбінантних генів антитіл людини і дисплею фрагментів антитіл, що кодуються, на поверхні нитчастого бактеріофагу забезпечило рекомбінантні способи для прямого одержання і відбору антитіл людини, які можуть бути також застосовані до гуманізованих, химерних, мишачих або мутеїнових антитіл. Антитіла, одержувані фаговою технологією, продукуються у вигляді антигензв'язувальних фрагментів, звичайно Еу- або Рар-фрагментів, у бактеріях і, отже, позбавлені ефекторних функцій. Ефекторні функції можуть бути введені однією з двох стратегій: ці фрагменти можуть бути сконструйовані або у повні антитіла для експресії у клітинах ссавців, або у фрагменти біспецифічного антитіла з другим сайтом зв'язування, здатним запускати ефекторну функцію.The development of technologies for obtaining repertoires of recombinant human antibody genes and the display of encoded antibody fragments on the surface of filamentous bacteriophage has provided recombinant methods for the direct production and selection of human antibodies, which can also be applied to humanized, chimeric, murine or mutein antibodies. Antibodies obtained by phage technology are produced in the form of antigen-binding fragments, usually Eu- or Rar-fragments, in bacteria and, therefore, are devoid of effector functions. Effector functions can be introduced by one of two strategies: these fragments can be engineered either into complete antibodies for expression in mammalian cells, or into bispecific antibody fragments with a second binding site capable of triggering effector function.

Звичайно Ба-фрагмент (Мн-Сні1) і легкий ланцюг (Мі-Сі) антитіл клонують окремо за допомогою ПЛР і рекомбінують випадковим чином у комбінаторних бібліотеках фагового дисплею, які можуть бути потім відібрані на зв'язування з конкретним антигеном. Гар-фрагменти експресуються на поверхні фагу, тобто фізично зв'язані з генами, які їх кодують. Таким чином, відбір Гар за зв'язуванням антигену одночасно відбирає послідовності, що кодують Рар, які можуть бути потім ампліфіковані. За допомогою декількох циклів зв'язування антигену і повторюваної ампліфікації, процедури, називаної пенінгом, Раб, специфічний для цього антигену, збагачують і, нарешті, виділяють.Usually, the Ba-fragment (Mn-Cni1) and light chain (Mi-Ci) of antibodies are cloned separately using PCR and recombined randomly in combinatorial phage display libraries, which can then be selected for binding to a specific antigen. Har-fragments are expressed on the phage surface, that is, they are physically linked to the genes that encode them. Thus, the selection of Har by antigen binding simultaneously selects sequences encoding Rar, which can then be amplified. Through several cycles of antigen binding and repeated amplification, a procedure called panning, the Rab specific for that antigen is enriched and finally isolated.

У 1994 році був описаний підхід для гуманізації антитіл, називаний «відбором, що направляється».In 1994, an approach to humanize antibodies called "directed selection" was described.

Відбір, що направляється, використовує ефективність способу фагового дисплею стосовно гуманізації моноклонального антитіла миші (див. ЧУезрегв5, |. 5., еї а!І., Віо/Тесппоіоду 12, 899-903 (1994)). Для цього Ба- фрагмент моноклонального антитіла миші може бути виставлений у дисплеї у комбінації з бібліотекою легких ланцюгів людини, і потім одержаний гібрид може бути відібраний з антигеном. За допомогою цього мишачий Рга-фрагмент забезпечує матрицю для направлення відбору. Потім відібрані легкі ланцюги людини об'єднують з бібліотекою Ра-фрагментів людини. Відбір з одержаних виходів бібліотеки дає повністю «людський» Гарбр.Guided selection utilizes the efficiency of the phage display method for humanizing a mouse monoclonal antibody (see ChUezregv5, |. 5., ei a!I., Vio/Thespoiodu 12, 899-903 (1994)). For this, the Ba fragment of a mouse monoclonal antibody can be displayed in combination with a library of human light chains, and then the resulting hybrid can be selected with the antigen. With this, the murine PgA fragment provides a matrix for directing selection. Then the selected human light chains are combined with the human Ra-fragment library. The selection from the obtained library outputs gives a completely "human" Garbr.

Були описані різні процедури для створення антитіл людини з бібліотек фагового дисплею (див., наприклад, Ноодепроот еї аї., У. Мої. Віої., 227:381 (1991); Магкз5 еї аї., У. Мої. Віої, 222:581-597 (1991); патенти США з номерами 5565332 і 5573905; Сіаск5оп, Т., і Умеїї5, У. А., ТІВТЕСН 12, 173-184 (1994).Various procedures have been described for the generation of human antibodies from phage display libraries (see, for example, Noodeprot et al., U. Moi. Viol., 227:381 (1991); Magkz5 ei ai., U. Moi. Viol., 222: 581-597 (1991); US Patent Nos. 5,565,332 and 5,573,905; Siask5op, T., and Umey, U. A., TIVTESN 12, 173-184 (1994).

Зокрема, відбір іп міго і еволюція антитіл, вироблених з бібліотек фагового дисплею, стали потужним інструментом (див. Випоп, О. Е., апа Ваграз І, С. ЕР, Аду. Іттипої. 57, 191-280 (1994); М/іпієг, С, єї аі., Аппи.In particular, the selection of migo and the evolution of antibodies produced from phage display libraries have become a powerful tool (see Vypop, O. E., apa Vagraz I, S. ER, Adu. Ittipoi. 57, 191-280 (1994); M /ipieg, S, eyi ai., Appy.

Вем. Іттипої. 12, 433-455 (1994); заявку на патент США Мо 20020004215 і М/0О92/01047; заявку на патент Мо 20030190317, опубліковану 9 жовтня 2003 року, і патент США Мо 6054287; патент США Ме 5877293).Vem. And so on. 12, 433-455 (1994); US patent application Nos. 20020004215 and М/0О92/01047; patent application Mo. 20030190317, published Oct. 9, 2003, and US patent Mo. 6,054,287; US patent Me 5877293).

Маїкіп5, Зсгеепіпд ої Рнаде-Ехргеззей Апіїроду І іргапйез бу Саршгте Гій, Меї йод» іп МоІесшаг Віоіоду,Maikip5, Zsgeepipd oi Rnade-Ehrgezzei Apiirodu And irgapyez bu Sarshgte Gii, Mei yod» ip MoIesshag Viiodu,

Апіїроду Рпаде Оігріау: Меїйоаз апа Ргоїосоїв 178:187-193, і заявка на патент США Ме 200120030044772, опублікована 6 березня 2003 року, описують способи скринінгу бібліотек антитіл, що експресуються фагом, або інших зв'язувальних молекул за допомогою захоплюючого підйому (ліфтингу), причому один спосіб включає в себе іммобілізацію кандидатних зв'язувальних молекул на твердому носії.Apiirodou Rpade Oigriau: Meiyoaz apa Rgoiosoiev 178:187-193, and US patent application Me 200120030044772, published Mar. 6, 2003, describe methods for screening libraries of phage-expressed antibodies or other binding molecules using capture lifting (lifting) , and one method involves the immobilization of candidate binding molecules on a solid support.

Продукти антитіл можуть бути піддані скринінгу на активність і на застосовність у способах даного винаходу з використанням аналізів, описаних у розділі із заголовком «Способи скринінгу» тут, або з використанням будь-яких інших придатних аналізів, відомих у даній галузі.Antibody products can be screened for activity and applicability in the methods of the present invention using the assays described in the section entitled "Screening Methods" herein, or using any other suitable assays known in the art.

Мутеїни амінокислотних послідовностейMuteins of amino acid sequences

Антитіла за винаходом включають мутеїни або варіанти вихідного антитіла, в яких поліпептидна послідовність вихідного антитіла була змінена щонайменше однією амінокислотною заміною, делецією або інсерцією у варіабельній області або частині, еквівалентній варіабельній області, у тому числі в областіAntibodies of the invention include muteins or variants of the parent antibody in which the polypeptide sequence of the parent antibody has been altered by at least one amino acid substitution, deletion, or insertion in the variable region or a portion equivalent to the variable region, including in the region

СОР, за умови, що цей мутеїн або варіант зберігає бажану афінність зв'язування або біологічну активність.CPO, provided that the mutein or variant retains the desired binding affinity or biological activity.

Мутеїни можуть бути по суті гомологічними або по суті ідентичними вихідному антитілу, наприклад, щонайменше на 6595, 7095, 7595, 8095, 8195, 8295, 8395, 8495, 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 91905, 9295, 9395, 9495, 95905, 96905, 97 905, 9895, 9995 або 10095 ідентичними або гомологічними. Ідентичність або гомологія стосовно цієї послідовності визначається тут як відсоток амінокислотних залишків у кандидатній послідовності, які є ідентичними з вихідною послідовністю, після порівняння цих послідовностей і введення гепів, якщо необхідно, для одержання максимальної процентної ідентичності послідовності і без врахування будь-яких консервативних замін як частини ідентичності послідовності. Жодна з М-кінцевих, С-кінцевих або внутрішніх подовжень, делецій або інсерцій у це антитіло не повинна розглядатися як така, що впливає на ідентичність або гомологію послідовностей. Таким чином, ідентичності послідовності можуть бути визначені стандартними способами, які звичайно використовують для порівняння подібності у положенні амінокислот двох поліпептидів. З використанням комп'ютерної програми, такої як В А5Т або ЕА5ТА, два поліпептиди порівнюють для оптимальної відповідності їх відповідних амінокислот (або по всій довжині однієї або обох послідовностей, або по заданій частині однієї або обох послідовностей). Ці програми забезпечують штраф за відкриття гепу за умовчанням і штраф за подовження гепу за умовчанням, і може бути забезпечена матриця оцінок, така як РАМ 250 (стандартна матриця оцінок; див. Оаупотї еї аї., іп АНаз ої Ргоївіп Зедоепсе апа Зігисіиге, мої. 5, 5ирр. З (1978))Ї), разом з цією комп'ютерною програмою. Наприклад, процентна ідентичність може бути потім розрахована як загальна кількість ідентичних збігів, помножена на 100 і потім поділена на суму довжини більш довгої послідовності у співпадаючій відстані і кількості гепів, введених у більш довгі послідовності для порівняння цих двох послідовностей.Muteins can be substantially homologous or substantially identical to the parent antibody, e.g., at least 6595, 7095, 7595, 8095, 8195, 8295, 8395, 8495, 8595, 8695, 8795, 8895, 8995, 9095, 91905, 92955, 9395 , 9495, 95905, 96905, 97905, 9895, 9995 or 10095 identical or homologous. Identity or homology with respect to this sequence is defined here as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the parent sequence, after comparing these sequences and introducing gaps, if necessary, to obtain the maximum percent sequence identity and excluding any conservative substitutions as part sequence identity. None of the M-terminal, C-terminal or internal extensions, deletions or insertions in this antibody should be considered to affect sequence identity or homology. Thus, sequence identities can be determined by standard methods commonly used to compare the similarity in amino acid position of two polypeptides. Using a computer program, such as B A5T or EA5TA, two polypeptides are compared for optimal matching of their respective amino acids (either along the entire length of one or both sequences, or over a given part of one or both sequences). These programs provide a default gap opening penalty and a default gap extension penalty, and may provide a scoring matrix such as RAM 250 (standard scoring matrix; see Oaupoti ei ai., ip ANaz oi Rgoivip Zedoepse apa Zigysiige, my. 5, 5th edition of Z (1978)), together with this computer program. For example, percent identity can then be calculated as the total number of identical matches, multiplied by 100 and then divided by the sum of the length of the longer sequence in the matching distance and the number of gaps introduced into the longer sequences to compare the two sequences.

Антитіла за винаходом можуть також включати зміни у поліпептидній послідовності константної області, які не будуть впливати на афінність зв'язування, але будуть змінювати ефекторну функцію, таку як антитілозалежна клітинна токсичність (АОСС), комплементзалежна цитотоксичність (СОС) або кліренс і поглинання (і одержана дія на напівперіод існування в організмі).Antibodies of the invention may also include changes in the polypeptide sequence of the constant region that will not affect binding affinity, but will alter effector function, such as antibody-dependent cellular toxicity (AOSS), complement-dependent cytotoxicity (SOC), or clearance and uptake (and resulting effect on the half-life of existence in the body).

ІнсерціїAdvertisements

Інсерції амінокислотної послідовності включають аміно- і/або карбоксикінцеві злиття з довжиною у діапазоні від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше залишків, а також інсерції всередині послідовності єдиних або множинних амінокислотних залишків, наприклад, 2, З або більше.Amino acid sequence insertions include amino- and/or carboxy-terminal fusions ranging in length from one residue to polypeptides containing a hundred or more residues, as well as intra-sequence insertions of single or multiple amino acid residues, for example, 2, C or more.

Приклади кінцевих інсерцій включають в себе антитіло з М-кінцевим метіонільним залишком або антитіло (у тому числі фрагмент антитіла), злите з епітопною міткою або епітопом рецептора реутилізації. Інші інсерційні мутеїни молекули антитіла включають в себе додавання сайтів глікозилювання, додавання цистеїнів для внутрішньомолекулярного або міжмолекулярного зв'язування, або злиття з поліпептидом, що збільшує напівперіод існування у сироватці цього антитіла, наприклад, на М-кінці або С-кінці. Наприклад, цистеїновий зв'язок (цистеїнові зв'язки) може бути доданий до антитіла для поліпшення його стабільності (особливо, коли це антитіло є фрагментом антитіла, таким як Ем-фрагмент).Examples of terminal insertions include an antibody with an M-terminal methionyl residue or an antibody (including an antibody fragment) fused to an epitope tag or epitope of a reutilization receptor. Other insertional muteins of the antibody molecule include addition of glycosylation sites, addition of cysteines for intramolecular or intermolecular binding, or fusion with a polypeptide that increases the serum half-life of this antibody, for example, at the M-terminus or C-terminus. For example, a cysteine bond(s) can be added to an antibody to improve its stability (especially when this antibody is a fragment of an antibody, such as an Em fragment).

Глікозилювання антитіл звичайно є М-зв'язаним або О-зв'язаним. М-зв'язаним називають приєднання вуглеводної частини молекули до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де Х означає будь-яку амінокислоту, крім проліну, є послідовностями пізнавання для ферментативного приєднання вуглеводної частини молекули до бічного ланцюга аспарагіну. Присутність будь-якої з цих трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. Таким чином, М-зв'язані сайти глікозилювання можуть бути додані до антитіла зміною амінокислотної послідовності таким чином, що вона містить одну або декілька цих трипептидних послідовностей. О-зв'язаними сайтами глікозилювання називають приєднання одного з цукрівGlycosylation of antibodies is usually M-linked or O-linked. M-linked is the attachment of the carbohydrate part of the molecule to the side chain of the asparagine residue. The tripeptide sequences asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, where X is any amino acid except proline, are recognition sequences for the enzymatic attachment of the carbohydrate part of the molecule to the side chain of asparagine. The presence of any of these tripeptide sequences in a polypeptide creates a potential glycosylation site. Thus, M-linked glycosylation sites can be added to the antibody by changing the amino acid sequence so that it contains one or more of these tripeptide sequences. O-linked sites of glycosylation are called attachment of one of the sugars

М-ацетилгалактозаміну, галактози або ксилози до гідроксиламінокислоти, найбільш часто серину або треоніну, хоча може бути також використаний 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. О-зв'язані сайти глікозилювання можуть бути додані до антитіла інсертуванням або заміною одного або декількох залишків серину або треоніну стосовно послідовності вихідного антитіла.of M-acetylgalactosamine, galactose or xylose to a hydroxylamino acid, most often serine or threonine, although 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine may also be used. O-linked glycosylation sites can be added to the antibody by inserting or replacing one or more serine or threonine residues relative to the original antibody sequence.

Термін "мічений епітопом" стосується антитіла, злитого з епітопною міткою. Поліпептид епітопної мітки має досить залишків для забезпечення епітопу, проти якого може бути вироблене антитіло, але все ще досить коротким, так що воно не перешкоджає активності цього антитіла. Епітопна мітка переважно є досить унікальною, так що це антитіло по суті не реагує перехресно з іншими епітопами. Придатні поліпептиди-мітки звичайно мають щонайменше 6 амінокислотних залишків і звичайно мають приблизно 8- амінокислотних залишків (переважно між приблизно 9-30 залишками). Приклади включають в себе поліпептид-мітку Ям НА і його антитіло 12СА5 (Ріеа еї а!., Мої. СеїІ. ВіоІ. 8:2159-2165 (1988)|; мітку с-тус і антитіла 89, 3С7, 6Е10, 54, В7 і 9Е10 до неї (Емап еї аїЇ., Мої. СеїІ. Віої. 5(12):3610-3616 (1985)|; і глікопротеїн О (90)-мітку вірусу простого герпесу і його антитіло (РарогзКу еї аї., Ргоївеіп Епдіпеегіпд 3(6):547- 553 (1990)|. Іншою зразковою міткою є полігістидинова послідовність, звичайно близько шести залишків гістидину, що робить можливим виділення міченої таким чином сполуки з використанням утворення хелату нікелю. Інші мітки і «ярлики», такі як мітка ЕГАСФ (Еазітап Кодак, Коспезіег, МУ), добре відомі і рутинно використовувані у даній галузі, включені у даний винахід.The term "epitope-tagged" refers to an antibody fused to an epitope tag. The epitope tag polypeptide has enough residues to provide an epitope against which an antibody can be raised, but is still short enough so that it does not interfere with the activity of that antibody. The epitope tag is preferably sufficiently unique so that the antibody essentially does not cross-react with other epitopes. Suitable tag polypeptides usually have at least 6 amino acid residues and usually have about 8 amino acid residues (preferably between about 9-30 residues). Examples include the Yam HA-tagged polypeptide and its antibody 12CA5 (Rea et al., Moi. Sci. Biol. 8:2159-2165 (1988)|; c-tus tag and antibodies 89, 3C7, 6E10, 54, B7 and 9E10 to it (Emap ei aiY., Moi. SeiI. Vioi. 5(12):3610-3616 (1985)|; and glycoprotein O (90)-label of the herpes simplex virus and its antibody (RarogzKu ei ai., Pharmacology Epidemiol. 3(6):547-553 (1990). Another exemplary label is a polyhistidine sequence, usually about six histidine residues, which enables isolation of the labeled compound using nickel chelation. Other labels and "labels" such as such as the EGASF label (Eazitap Kodak, Kospezieg, MU), well known and routinely used in the field, are included in the present invention.

У даному контексті термін «епітоп зв'язування рецептора порятунку» стосується епітопу Ес-області молекули дО (наприклад, Ідсі, ІдС2, ІдсСз або ІдбСал), що є відповідальним за збільшення напівперіоду існування у сироватці іп мімо молекули до.In this context, the term "rescue receptor binding epitope" refers to an epitope of the Es region of the dO molecule (eg, Idsi, IdC2, IdsC3, or IdbSal), which is responsible for increasing the serum half-life of the iP past the do molecule.

ДелеціїDeletions

Делеції амінокислотної послідовності включають аміно- і/або карбоксил-кінцеві делеції з довжиною у діапазоні від одного до ста або більше залишків, що приводять до фрагментів, які зберігають афінність зв'язування стосовно антигену-мішені, а також делеції всередині послідовності єдиного або множинних амінокислотних залишків, наприклад, 2, З або більше. Наприклад, сайти глікозилювання можуть бути делетовані або переміщені в інше положення делецією частини або всіх трипептидів, або інших послідовностей пізнавання для глікозилювання.Amino acid sequence deletions include amino- and/or carboxyl-terminal deletions ranging in length from one to a hundred or more residues, resulting in fragments that retain binding affinity for the target antigen, as well as deletions within the sequence of a single or multiple amino acids residues, for example, 2, C or more. For example, glycosylation sites can be deleted or moved to another position by deleting part or all of the tripeptides or other recognition sequences for glycosylation.

ЗаміниReplacements

Іншим типом мутеїну є мутеїн з амінокислотними замінами. Ці мутеїни мають щонайменше один видалений амінокислотний залишок у молекулі антитіла і вставлений на його місце інший залишок.Another type of mutein is mutein with amino acid substitutions. These muteins have at least one amino acid residue removed from the antibody molecule and another residue inserted in its place.

Обговорюється замінний мутагенез у будь-якій з гіперваріабельних або СОК-областей, або каркасних областей. Консервативні заміни показані у таблиці 1. Найбільш консервативна заміна показана під заголовком «переважні заміни». Якщо такі заміни не приводять до зміни біологічної активності, то можуть бути введені більш істотні зміни, названі «зразковими замінами» у таблиці 1, або описані нижче у посиланні на класи амінокислот, і продукти можуть бути піддані скринінгу.Replacement mutagenesis in any of the hypervariable or SOC regions or framework regions is discussed. Conservative substitutions are shown in Table 1. The most conservative substitution is shown under the heading "preferred substitutions". If such substitutions do not result in a change in biological activity, then more significant changes, called "exemplary substitutions" in Table 1, or described below in reference to amino acid classes, can be introduced and the products can be screened.

Таблиця 1 залишків сус) аа 777 ЇїTable 1 of the remains of sus) aa 777 Her

Нів(Н) (аєп;діпиув;аю. | 77777771Niv(N) (ayep; dipyuv; ayu. | 77777771

Пе() Пемш;маї; тесаа;рпе; Іем норлейцин норлейцин; Іе; маї; пен вкаPemsh; Mai; tesaa;rpe; Iem norleucine norleucine; Yes; may Pen vka

Рпе(є) МПешмасйератує | 777777Rpe(is) MPeshmasieratue | 777777

Ро(Р)Їаа 7 ЇЇRo(R)Yiaa 7 ЯИ

Зе(8в) іш 17111111Ze(8c) ish 17111111

Ме; Ієи; тес; рпе; аїа;Me; Yea; tess; rpe; aya

Істотні модифікації у біологічних властивостях антитіла виконують відбором замін, які істотно відрізняються в їх дії на збереження (а) структури скелету поліпептиду у зоні заміни, наприклад, у вигляді складчастої або спіральної конформації, (5) заряду або гідрофобності молекули у сайті-мішені або (с) об'єму бічного ланцюга. Природні залишки розділені на групи на основі загальних властивостей бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, теї, аїа, маї, Іец, Пе; (2) нейтральні гідрофільні: су, зег, Їйг; (3) кислі: азр, дічц; (4) основні: азп, діп, піз, Іу5, аго; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: ау, рго; і (6) ароматичні: ігр, їуг, рпе.Substantial modifications in the biological properties of antibodies are performed by selecting substitutions that differ significantly in their effect on preserving (a) the structure of the polypeptide skeleton in the substitution zone, for example, in the form of a folded or helical conformation, (5) the charge or hydrophobicity of the molecule in the target site or ( c) side chain volume. Natural residues are divided into groups based on the general properties of the side chains: (1) hydrophobic: norleucine, thei, aia, mai, Iec, Pe; (2) neutral hydrophilic: su, zeg, Yiig; (3) acidic: azr, dichs; (4) the main ones: azp, dip, piz, Iu5, ago; (5) residues that affect the orientation of the chain: au, rgo; and (6) aromatic: igr, iug, rpe.

Консервативні заміни включають заміну амінокислоти іншою амінокислотою її класу. Неконсервативні заміни включають заміну члена одного з цих класів членом іншого класу.Conservative substitutions involve replacing an amino acid with another amino acid of its class. Non-conservative substitutions involve replacing a member of one of these classes with a member of another class.

Будь-який залишок цистеїну, не включений у збереження правильної конформації антитіла, також може бути замінений, звичайно серином, для поліпшення окисної стабільності молекули і запобігання аберантному зшиванню.Any cysteine residue not involved in maintaining the correct conformation of the antibody can also be replaced, usually by serine, to improve the oxidative stability of the molecule and prevent aberrant cross-linking.

Дозрівання афінності звичайно включає одержання і скринінт варіантів антитіл, які мають заміни в областях СОР. вихідного антитіла, і відбору варіантів, які мають поліпшені біологічні властивості, такі як афінність зв'язування, стосовно вихідного антитіла. Зручним шляхом для генерування таких варіантів з замінами є дозрівання афінності з використанням фагового дисплею. Коротко, декілька сайтів гіперваріабельних областей (наприклад, 6-7 сайтівр мутують для генерування всіх можливих амінокислотних замін у кожному сайті. Генеровані таким чином варіанти антитіл представляють у вигляді дисплею одновалентним чином з частинок нитчастого фагу у вигляді злиттів з продуктом гена І М113, упакованим у кожній частинці. Потім ці представлені фагом варіанти піддають скринінгу на їх біологічну активність (наприклад, афінність зв'язування). Див., наприклад, УМО 92/01047, УМО 93/112366, УМО 95/15388 іAffinity maturation typically involves obtaining and screening antibody variants that have substitutions in the CRP regions. of the original antibody, and selecting variants that have improved biological properties, such as binding affinity, relative to the original antibody. A convenient way to generate such substitution variants is through affinity maturation using phage display. Briefly, several hypervariable region sites (e.g., 6-7 sites) are mutated to generate all possible amino acid substitutions at each site. The antibody variants thus generated are displayed in a monovalent manner from filamentous phage particles as fusions with the M113 gene I product packaged in to each particle. These phage-presented variants are then screened for their biological activity (eg, binding affinity). See, e.g., UMO 92/01047, UMO 93/112366, UMO 95/15388 and

МО 93/19172.MO 93/19172.

Існуючі способи дозрівання афінності антитіл стосуються двох категорій мутагенезу: стохастичноїExisting methods of antibody affinity maturation relate to two categories of mutagenesis: stochastic

(випадкової) і нестохастичної. Схильна до помилок ПЛР, мутаторні бактеріальні штами (І ому еї аї., У. Мої.(random) and non-stochastic. Prone to PCR errors, mutator bacterial strains (I omu ei ai., U. Moi.

Віої. 260, 359-68, 1996) і мутагенез, що насичує, (Мізпітіуа еї аї., 9. Віої. Спет. 275:12813-20, 2000;Vioi 260, 359-68, 1996) and saturating mutagenesis (Mizpitiua ei ai., 9. Vioi. Spet. 275:12813-20, 2000;

Спожапигу, Р. 5. Меїйпод5 Мої. ВіоЇ. 178, 269-85, 2002) є типовими прикладами способів стохастичного мутагенезу (Каїраї еї аїЇ., Ргос Май Асай сі ОСОБА. 102:8466-71, 2005). Нестохастичні способи часто використовують аланін-сканування або сайт-направлений мутагенез для генерування обмежених колекцій специфічних варіантів. Деякі способи описані більш докладно нижче.Spozhapigu, R. 5. Meiypod5 Moi. Vio 178, 269-85, 2002) are typical examples of methods of stochastic mutagenesis (Kairai ei aiYi., Rgos Mai Asai si OSOBA. 102:8466-71, 2005). Non-stochastic methods often use alanine scanning or site-directed mutagenesis to generate limited collections of specific variants. Some methods are described in more detail below.

Дозрівання афінності через способи пенінгу - Дозрівання афінності рекомбінантних антитіл звичайно виконують за допомогою декількох циклів пенінгу кандидатних антитіл у присутності зменшуваних кількостей антигену. Зменшення кількості антигену на цикл відбирає антитіла з найвищою афінністю до антигену, видаючи тим самим антитіла високої афінності з великого пулу вихідного матеріалу. Дозрівання афінності за допомогою пенінгу добре відоме у даній галузі і описане, наприклад, у Ниїв5 еї аї. (СапсегAffinity maturation through penning methods - Affinity maturation of recombinant antibodies is usually performed using several cycles of penning candidate antibodies in the presence of decreasing amounts of antigen. Reducing the amount of antigen per cycle selects antibodies with the highest affinity for the antigen, thereby producing high-affinity antibodies from a large pool of starting material. Affinity ripening by means of penning is well known in this field and is described, for example, in Nyiv5 ei ai. (Sapseg

Іттипої! Іттипоїйпег. 50:163-71, 2001). Способи дозрівання афінності з використанням технологій фагового дисплею описані тут в іншому місці і відомі у даній галузі (див., наприклад, Оацшдпепу еї аї., Ргос Маї! АсайEat like that! Ittipoiipeg. 50:163-71, 2001). Affinity maturation methods using phage display technologies are described elsewhere herein and are known in the art (see, e.g.

Зсі ОБА. 97:2029-34, 2000).Both of them. 97:2029-34, 2000).

Переглядовий (Гоок-(пгоцдії) мутагенез - Переглядовий мутагенез (ТМ) (Каї)раї еї аї., Ргос Маї! Асайа зсіViewing (Hook-(pgocsdiy) mutagenesis - Viewing mutagenesis (TM) (Kai)rai ei ai., Rgos Mai! Asaya zsi

БА. 102:8466-71, 2005) забезпечує спосіб швидкого картування антигензв'язувально сайту. Для ГТМ відбирають дев'ять амінокислот, реперезентативних для хімії основних бічних ланцюгів, забезпечуваних 20 природними амінокислотами, для аналізу функціональних внесків бічних ланцюгів у зв'язування у кожному положенні у всіх шести областях СОК антитіла. ГТМ генерує позиційний ряд моносайтових мутацій в області СОК, де кожний залишок «дикого типу» систематично заміняють однією з дев'яти вибраних амінокислот. Мутування області СОМ об'єднують для генерування комбінаторних бібліотек одноланцюжкових варіабельних фрагментів (зсЕм) складності, що збільшується, і розміру, що збільшується, які не стають забороняючими стосовно кількісного дисплею всіх варіантів. Після позитивного відбору клони з поліпшеним зв'язуванням секвенують і сприятливі мутації картують.BA 102:8466-71, 2005) provides a method for rapid antigen-binding site mapping. For HTM, nine amino acids representative of the basic side chain chemistry provided by the 20 naturally occurring amino acids are selected to analyze the functional contributions of the side chains to binding at each position in all six regions of the antibody SOC. HTM generates a positional series of single-site mutations in the SOC region, where each "wild-type" residue is systematically replaced by one of nine selected amino acids. Mutations of the COM region are combined to generate combinatorial single-stranded variable fragment (SVF) libraries of increasing complexity and increasing size that do not become prohibitive for quantitative display of all variants. After positive selection, clones with improved binding are sequenced and favorable mutations are mapped.

Схильна до помилок ПЛР - Схильна до помилок ПЛР включає рандомізацію нуклеїнових кислот між різними циклами відбору. Ця рандомізація відбувається при низькій швидкості за допомогою швидкості помилок, властивої використовуваній полімеразі, але може бути посилена схильною до помилок ПЛР (7ассою еї аї., У. Мої. Віої. 285:775-783, 1999) з використанням полімерази, що має високу внутрішню швидкість помилок під час транскрипції (Нажукіп5 еї аї., У Мої. Віої. 226:889-96, 1992). Після циклів мутації клони з поліпшеною афінністю стосовно антигену відбирають за допомогою рутинних способів у даній галузі.Error-prone PCR - Error-prone PCR involves the randomization of nucleic acids between different rounds of selection. This randomization occurs at a low rate through the error rate inherent in the polymerase used, but can be enhanced by error-prone PCR (7assay et al., U. Moi. Viol. 285:775-783, 1999) using a polymerase that has a high the internal speed of errors during transcription (Nazhukip5 ei ai., In Moi. Vioi. 226:889-96, 1992). After cycles of mutation, clones with improved affinity for the antigen are selected using routine methods in this field.

Перетасування ДНК - Перетасування нуклеїнової кислоти є способом гомологічної рекомбінації іп міго або іп мімо пулів коротших або менших полінуклеотидів для одержання варіантних полінуклеотидів.DNA shuffling - Nucleic acid shuffling is a method of homologous recombination of ip migo or ip mimo pools of shorter or smaller polynucleotides to produce variant polynucleotides.

Перетасування ДНК було описане у патенті США Мо 6605449, патенті США Мо 6489145, УМО 02/092780 іDNA shuffling has been described in US Pat. No. 6,605,449, US Pat. No. 6,489,145, UMO 02/092780, and

Зіетте"!, Ргос. Май. Асай. сі ОБА, 91:10747-51 (1994). Звичайно перетасування ДНК містить З стадії: фрагментацію генів, що підлягають перетасуванню, ДНКазою І, випадкову гібридизацію фрагментів і повторне складання або наповнення у цей фрагментований ген за допомогою ПЛР у присутності ДНК- полімерази (статева ПЛР) і ампліфікацію знову зібраного продукту з використанням звичайної ПЛР.Ziette"!, Rhos. Mai. Asai. si OBA, 91:10747-51 (1994). Typically, DNA shuffling includes the C stage: fragmentation of the genes to be shuffled by DNase I, random hybridization of the fragments, and reassembly or filling into this fragmented gene using PCR in the presence of DNA polymerase (sex PCR) and amplification of the newly assembled product using conventional PCR.

Перетасування ДНК відрізняється від схильної до помилок ПЛР тим, що воно є інвертованою ланцюговою реакцією. У схильній до помилок ПЛР кількість сайтів старту полімерази і кількість молекул росте експоненціально. На противагу цьому, у повторному складанні нуклеїнових кислот або перетасуванні випадкових полінуклеотидів кількість сайтів старту і кількість (але не розмір) випадкових полінуклеотидів зменшується протягом часу.DNA shuffling differs from error-prone PCR in that it is an inverted chain reaction. In error-prone PCR, the number of polymerase start sites and the number of molecules grows exponentially. In contrast, in nucleic acid reassembly or random polynucleotide shuffling, the number of start sites and the number (but not the size) of random polynucleotides decrease over time.

У випадку антитіла перетасування ДНК робить можливою асоціацію, наприклад, усіх з СОКІ1 з усіма зIn the case of an antibody, DNA shuffling makes possible the association of, for example, all with SOKI1 with all with

СО, з усіма з СОКЗ. Припускається, що численні сімейства послідовностей можуть бути перетасовані в одній і тій же реакції. Крім того, перетасування звичайно зберігає відносний порядок, так що, наприклад,CO, with everyone from SOCZ. It is suggested that multiple families of sequences can be shuffled in the same reaction. Also, shuffling usually preserves relative order, so, for example,

СОМ не буде виявлений у положенні СОК2. Рідкі перетасовані продукти будуть містити велику кількість найкращих (наприклад, найвищої афінності) областей СОК, і ці рідкі перетасовані продукти можуть бути відібрані на основі їх переважаючої афінності.COM will not be detected in the SOC2 position. The liquid shuffled products will contain a large number of the best (eg, highest affinity) SOC regions, and these liquid shuffled products can be selected based on their predominant affinity.

Матричним полінуклеотидом, що може бути використаний у перетасуванні ДНК, може бути ДНК абоThe template polynucleotide that can be used in DNA shuffling can be DNA or

РНК. Вона може бути різної довжини в залежності від розміру гена або більш короткого або меншого полінуклеотиду, що підлягає рекомбінації або повторному складанню. Переважно цей матричний полінуклеотид має розмір 50 плн. - 50 т.п.н. Матричний полінуклеотид часто повинен бути двохланцюжковим.RNA. It can be of different lengths depending on the size of the gene or a shorter or smaller polynucleotide subject to recombination or reassembly. Preferably, this matrix polynucleotide has a size of 50 pln. - 50 t.p.n. The template polynucleotide must often be double-stranded.

Припускається, що полінуклеотиди одноланцюжкових або двохланцюжкових нуклеїнових кислот, що мають області ідентичності з матричним полінуклеотидом і області гетерології з матричним полінуклеотидом, можуть бути додані до цього матричного полінуклеотиду під час початкової стадії відбору генів. Припускається також, що під час цієї початкової стадії можуть бути змішані дві різні, але споріднені полінуклеотидні матриці.It is suggested that single-stranded or double-stranded nucleic acid polynucleotides having regions of identity with the template polynucleotide and regions of heterology with the template polynucleotide may be added to this template polynucleotide during the initial stage of gene selection. It is also suggested that two different but related polynucleotide matrices may be mixed during this initial stage.

Аланін-сканування - Аланін-скануючий мутагенез може виконуватися для ідентифікації залишків гіперваріабельних областей, які істотно сприяють зв'язуванню антигену. Сиппіпдпат апа Умеїї5 (Зсіепсе 244:1081-1085, 1989). Ідентифікують залишок або групу залишків (наприклад, заряджені залишки, такі як агд, азр, піб, уз і дію) і заміняють їх нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (найбільш переважно аланіном або поліаланіном) для впливу на взаємодію цих амінокислот з антигеном. Потім місця розташування амінокислот, що демонструють функціональну чутливість до цих замін, поліпшують введенням додаткових або інших варіантів у сайтах замість сайтів заміни. Таким чином, хоча сайт для введення варіації амінокислотної послідовності є попередньо визначеним, характер самої мутації (рег зе) не повинен бути попередньо визначеним. Наприклад, для аналізу виконання мутації у конкретному сайті проводять аій-скануючий або випадковий мутагенез у кодоні-мішені, і експресовані мутеїни антитіл піддають скринінгу на бажану активність.Alanine-scanning - Alanine-scanning mutagenesis can be performed to identify residues of hypervariable regions that significantly contribute to antigen binding. Sippipdpat apa Umeyi5 (Zsiepse 244:1081-1085, 1989). A residue or group of residues (for example, charged residues such as agd, azr, pib, uz, and sane) is identified and replaced with a neutral or negatively charged amino acid (most preferably alanine or polyalanine) to affect the interaction of these amino acids with the antigen. Then, the locations of amino acids that show functional sensitivity to these substitutions are improved by introducing additional or other variants in the sites instead of the substitution sites. Thus, although the site for introducing the amino acid sequence variation is predetermined, the nature of the mutation itself (reg ze) need not be predetermined. For example, to analyze the execution of a mutation in a specific site, AI-scanning or random mutagenesis is carried out in the target codon, and the expressed antibody muteins are screened for the desired activity.

Конструювання за допомогою комп'ютера - Альтернативно або на додаток може бути корисним аналіз кристалічної структури комплексу антиген-антитіло для ідентифікації точок контакту між антитілом і антигеном або для використання комп'ютерного програмного забезпечення для моделювання точок контакту. Залишки контакту і сусідні залишки є кандидатами на заміну відповідно до розроблених тут способів. Після генерування таких варіантів панель варіантів піддають скринінгу, як описано тут, і антитіла з переважаючими властивостями в одному або декількох релевантних аналізах можуть бути відібрані для додаткового розвитку.Computer Aided Design - Alternatively or additionally, it may be useful to analyze the crystal structure of the antigen-antibody complex to identify points of contact between antibody and antigen or to use computer software to model the points of contact. Contact residues and neighboring residues are candidates for replacement according to the methods developed here. After generating such variants, the panel of variants is screened as described herein, and antibodies with predominant properties in one or more relevant assays may be selected for further development.

Дозрівання афінності включає одержання і скринінг мутеїнів антитіл, які мають заміни в областях СОМ вихідного антитіла, і відбір мутеїнів, які мають поліпшені біологічні властивості, такі як афінність зв'язування, стосовно вихідного антитіла. Зручним способом генерування таких мутеїнів із замінами є дозрівання афінності з використанням фагового дисплею. Коротко, декілька сайтів гіперваріабельних областей (наприклад, 6-7 сайтів) мутують для генерування всіх можливих амінокислотних замін у кожному сайті. Генеровані таким чином мутеїни антитіл представляють у вигляді дисплею одновалентним чином з часток нитчастого фагу у вигляді злиттів з продуктом гена І М13, упакованим у кожній частинці. Потім ці представлені фагом мутеїни піддають скринінгу на їх біологічну активність (наприклад, афінність зв'язування).Affinity maturation includes obtaining and screening antibody muteins that have substitutions in the COM regions of the original antibody, and selecting muteins that have improved biological properties, such as binding affinity, relative to the original antibody. A convenient way to generate such muteins with substitutions is through affinity maturation using phage display. Briefly, multiple sites of hypervariable regions (eg, 6-7 sites) are mutated to generate all possible amino acid substitutions at each site. Antibody muteins generated in this way are presented in the form of a monovalent display from filamentous phage particles in the form of fusions with the product of the I M13 gene packaged in each particle. These phage-presented muteins are then screened for their biological activity (eg, binding affinity).

Аланін-скануючий о мутагенез може виконуватися для ідентифікації залишків гіперваріабельних областей, які істотно сприяють зв'язуванню антигену. Альтернативно або на додаток може бути корисним аналіз кристалічної структури комплексу антиген-антитіло для ідентифікації точок контакту між антитілом і антигеном. Залишки такого контакту і сусідні залишки є кандидатами на заміну відповідно до розроблених тут способів. Після генерування таких мутеїнів панель мутеїнів піддають скринінгу, як описано тут, і антитіла з переважаючими властивостями в одному або декількох релевантньїх аналізах можуть бути відібрані для додаткового розвитку.Alanine-scanning mutagenesis can be performed to identify residues of hypervariable regions that significantly contribute to antigen binding. Alternatively or additionally, analysis of the crystal structure of the antigen-antibody complex may be useful to identify points of contact between antibody and antigen. Residues of such a contact and adjacent residues are candidates for replacement according to the methods developed here. After generating such muteins, the mutein panel is screened as described herein, and antibodies with predominant properties in one or more relevant assays can be selected for further development.

Змінена ефекторна функціяChanged effector function

Розглядаються й інші модифікації антитіла. Наприклад, може бути бажаною модифікація антитіла за даним винаходом стосовно ефекторної функції, наприклад, для посилення ефективності антитіла у лікуванні раку. Наприклад, в Ес-область можуть бути введені залишок(ки) цистеїну, що дозволяють утворення міжланцюжкових дисульфідних зв'язків у цій області. Генероване таким чином гомодимерне антитіло може мати поліпшену здатність інтерналізації і/або збільшені комплемент-опосередковане убивання клітин і антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС). Див. Сагоп еї аї., У. Ехр Мей. 176:1191- 1195 (1992) і Зпорев, В. 9. Іттипої. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерні антитіла з підвищеною активністю можуть бути також одержані з використанням гетеробіфункціональних зшивальних агентів, як описано уOther modifications of the antibody are under consideration. For example, it may be desirable to modify an antibody of the present invention with respect to effector function, for example, to enhance the effectiveness of the antibody in the treatment of cancer. For example, cysteine residue(s) can be introduced into the Es region, allowing the formation of interchain disulfide bonds in this region. Homodimeric antibody generated in this way may have improved internalization capacity and/or increased complement-mediated cell killing and antibody-dependent cellular cytotoxicity (AOSS). See Sagop ei ai., U. Ehr May. 176:1191-1195 (1992) and Zporev, V. 9. Ittipoi. 148:2918-2922 (1992). Homodimeric antibodies with increased activity can also be produced using heterobifunctional crosslinking agents as described in

МОЇЙ еї аІ., Сапсег Незеагсп 53:2560-2565 (1993). Альтернативно, може бути сконструйоване антитіло, що має подвійні Ес-області і може за допомогою цього мати посилені здатності лізису комплементу і АОСС.MY EI AI., Sapseg Nezeagsp 53:2560-2565 (1993). Alternatively, an antibody can be designed that has double E-regions and can thereby have enhanced complement and AOSS lysis capabilities.

Див. 5іемепзоп еї а!., Апіїі-Сапсег Огид Оевідп 3:219-230 (1989). Крім того, було показано, що послідовності в області СОК можуть змусити антитіло зв'язуватися з МНС Класу ІІ і запускати небажану хелперну Т- клітинну реакцію. Консервативна заміна може дозволити антитілу зберігати активність зв'язування, але все ще втрачати його здатність запуску небажаної Т-клітинної реакції. Див. також статтю 5іеріемувкі еї а!., РгосSee 5iemepzop ei a!., Apiii-Sapseg Ogyd Oevidp 3:219-230 (1989). In addition, it has been shown that sequences in the SOC region can cause an antibody to bind to MHC Class II and trigger an unwanted helper T-cell response. A conservative substitution can allow an antibody to retain binding activity but still lose its ability to trigger an unwanted T-cell response. See also the article 5ieriemuvki ei a!., Rgos

Маї! Асад сі ОА 1988; 85(13):4852-6, включену сюди як посилання в її повному вигляді, що описує химерні антитіла, в яких варіабельна область імуноглобуліну миші з'єднана з константними областями гамма 1, гамма 2, гамма З і гамма 4 імуноглобуліну людини.Mai! Asad si OA 1988; 85(13):4852-6, incorporated herein by reference in its entirety, which describes chimeric antibodies in which the variable region of mouse immunoglobulin is fused to the constant regions of human immunoglobulin gamma 1, gamma 2, gamma C and gamma 4.

У деяких варіантах здійснення винаходу може бути бажаним застосування фрагмента антитіла, а не інтактного антитіла, наприклад, для збільшення проникнення у пухлину. У цьому випадку може бути бажана модифікація фрагмента антитіла, наприклад, для збільшення його напівперіоду існування у сироватці, додавання молекул, таких як ПЕГ або інші водорозчинні полімери, у тому числі полісахаридні полімери, до фрагментів антитіл для збільшення напівперіоду існування. Це може бути також досягнуто, наприклад, включенням епітопу зв'язування рецептора порятунку у фрагмент антитіла (наприклад, мутацією придатної області у фрагменті антитіла або включенням цього епітопу у пептидну мітку, яку потім зливають з фрагментом антитіла на іншому кінці або у середині, наприклад, за допомогою ДНК або пептидного синтезу) (див., наприклад, МО 96/32478).In some embodiments of the invention, it may be desirable to use an antibody fragment rather than an intact antibody, for example, to increase tumor penetration. In this case, it may be desirable to modify the antibody fragment, for example, to increase its half-life in serum, add molecules such as PEG or other water-soluble polymers, including polysaccharide polymers, to the antibody fragments to increase the half-life. This can also be achieved, for example, by incorporating a rescue receptor binding epitope into an antibody fragment (e.g., by mutating a suitable region in the antibody fragment or by incorporating this epitope into a peptide tag which is then fused to the antibody fragment at the other end or in the middle, e.g. by means of DNA or peptide synthesis) (see, for example, MO 96/32478).

Цей епітоп зв'язування рецептора порятунку переважно утворює область, в якій один або декілька залишків амінокислоти з однієї або декількох петель домену Ес перенесені у відповідне положення фрагменту антитіла. Ще більш переважно переносять три або більше залишків епітопу з однієї або двох петель Рс-домену. Ще більш переважно епітоп береться з СН2-домену Ес-області (наприклад, дв) і переноситься в область СНІ, СНЗ або УН, або більш ніж в одну таку область, антитіла. Альтернативно, цей епітоп береться з СН2-домену Ес-області і переноситься в С. 5цЦБ. І -область або У. з!б. І -область, або в обидві, цього фрагменту антитіла. Див. також міжнародні заявки УМО 97/34631 і МО 96/32478, які описуютьThis rescue receptor binding epitope preferably forms a region in which one or more amino acid residues from one or more loops of the Es domain are transferred to the corresponding position of the antibody fragment. Even more preferably, three or more epitope residues from one or two loops of the Pc domain are transferred. Even more preferably, the epitope is taken from the CH2-domain of the E-region (for example, dv) and transferred to the SNI, SNZ or UN region, or to more than one such region, of the antibody. Alternatively, this epitope is taken from the CH2-domain of the E-region and transferred to S. 5cCB. I - region or U. z!b. I -region, or in both, of this antibody fragment. See also international applications UMO 97/34631 and MO 96/32478, which describe

Ес-варіанти і їх взаємодії з рецептором порятунку.E-variants and their interaction with the rescue receptor.

Таким чином, антитіла за винаходом можуть містити Ес-область людини, консенсусну частину Ес або його мутеїн, що зберігає здатність взаємодіяти з рецептором реутилізації Ес, у тому числі мутеїни, в яких цистеїни, що беруть участь в утворенні дисульфідних зв'язків, модифіковані або видалені, і/або в які доданий теї на М-кінці і/або видалені одна або декілька з М-кінцевих 20 амінокислот, і/або видалені області, які взаємодіють з комплементом, такі як сайт зв'язування С149, і/або видалений сайт АОСС (Ідив., наприклад,Thus, the antibodies of the invention may contain a human Es region, a consensus part of Es or its mutein, which retains the ability to interact with the Es reutilization receptor, including muteins in which the cysteines involved in the formation of disulfide bonds are modified or deleted, and/or in which an M-terminal tei is added and/or one or more of the M-terminal 20 amino acids are deleted, and/or complement-interacting regions such as the C149 binding site are deleted, and/or deleted AOSS website (See, for example,

Моїес. Іттипої. 29 (5):633-9 (1992)). Антитіла класу (До можуть також включати в себе відмінну константну область, наприклад, антитіло (9052 може бути модифіковане для надання константної області (Дс1 абоMoyes. And so on. 29 (5):633-9 (1992)). Antibodies of the (K) class may also include a distinct constant region, e.g., antibody (9052 may be modified to provide a constant region (Ds1 or

Ідс4.Ids4.

У випадку О1 модифікації константної області, зокрема, шарнірної області або СН2-області, можуть збільшувати або зменшувати ефекторну функцію, у тому числі активність АОСС і/або СОС. В інших варіантах здійснення константну область ІЇ34052 модифікують для зменшення утворення агрегатів антитіло- антиген. У випадку Ід4 модифікації константної області, зокрема шарнірної області, можуть зменшувати утворення напів-антитіл. У конкретних зразкових варіантах здійснення забезпечене мутування шарнірної послідовності Ід54 Суз-Рго-5ег-Суз у шарнірну послідовність І(Д01 Суз-Рго-Рго-Сув.In the case of O1, modifications of the constant region, in particular, the hinge region or the CH2 region, can increase or decrease effector function, including AOSS and/or SOC activity. In other embodiments, the constant region of II34052 is modified to reduce the formation of antibody-antigen aggregates. In the case of Id4, modifications of the constant region, in particular the hinge region, can reduce the formation of half-antibodies. In specific exemplary embodiments, the mutation of the hinge sequence Id54 Suz-Pgo-5eg-Suz into the hinge sequence I(D01 Suz-Pgo-Pgo-Suv.

Попередні дослідження картували сайт зв'язування на (дО людини і миші для ЕСК первинно у нижній шарнірній області, що складається з залишків Ї(ДО 233-239. Інші дослідження припускали додаткові широкі сегменти, наприклад, сСіІуЗ316- уз338 для Рс-рецептора І людини, Гуз274-Аг9301 і Туг407-Агд416 для Гс- рецептора І людини, або виявляли декілька специфічних залишків поза нижнім шарніром, наприклад,Previous studies have mapped the binding site on the human and mouse δO for ESK primarily in the lower hinge region consisting of residues Я(ДО 233-239. Other studies have suggested additional broad segments, for example, cSiIuZ316-uz338 for the human Pc receptor I , Huz274-Ag9301 and Tug407-Agd416 for human Gs-receptor I, or revealed several specific residues outside the lower hinge, for example,

Азп297 і Сі318 для мишачого ІД020, що взаємодіє з мишачим Ес-рецептором ІІ. Повідомлялася 3,2-А кристалічна структура Ес-фрагменту (901 людини зі зміненими у напрямку диференціювання залишкамиAzp297 and Si318 for mouse ID020 interacting with mouse Es-receptor II. The 3.2-Å crystal structure of the Es-fragment was reported (901 individuals with residues changed in the direction of differentiation

ЗО І ен2г34-5ег239, Авр265-С10269, Авзп297-ТПпг299 і АІа327-Пе332 Рс-рецептора ША людини як така, що бере участь у зв'язуванні з Ес-рецептором ША. На підставі кристалічної структури було зроблене припущення, що поряд із залишками нижнього шарніру (Геи234-С1у237) залишки у петлях Ео СН2-домену дО (залишки 326-330) і ВС (залишки 265-271) можуть відігравати роль у зв'язуванні з Ес-рецептором ПА.ZO I en2g34-5eg239, Avr265-C10269, Avzp297-TPpg299 and AIa327-Pe332 of the Ps-receptor SHA of a person as being involved in binding with the ES-receptor of SHA. On the basis of the crystal structure, it was assumed that along with the residues of the lower hinge (Hei234-C1u237), the residues in the Eo loops of the CH2 domain dO (residues 326-330) and VS (residues 265-271) may play a role in binding to Es -PA receptor.

Див. роботу Зпіеїд5 еї аї., у. Віої. Спет., 276(9):6591-6604 (2001), включену сюди як посилання у повному вигляді. Мутація залишків у сайтах зв'язування Ес-рецептора може приводити до зміненої ефекторної функції, наприклад, до зміненої активності АЮОСС або СОС, або до зміненого напівперіоду життя. Як описано вище, потенційні мутації включають інсерцію, делецію або заміну в одному або декількох залишках, у тому числі заміну аланіном, консервативну заміну, неконсервативну заміну або заміну відповідного амінокислотного залишку у тому самому положенні залишком відмінного підкласу до (наприклад, заміну залишку ІдДО1 відповідним залишком Ідса2 у цьому положенні).See work Zpieid5 ei ai., u. Vioi Spet., 276(9):6591-6604 (2001), incorporated herein by reference in its entirety. Mutation of residues in the binding sites of the E-receptor can lead to a changed effector function, for example, to a changed activity of АХОСС or СОС, or to a changed half-life. As described above, potential mutations include an insertion, deletion, or substitution at one or more residues, including an alanine substitution, a conservative substitution, a non-conservative substitution, or a substitution of the corresponding amino acid residue at the same position with a residue of a different subclass to (eg, a substitution of an IDO1 residue with a corresponding residue Idsa2 in this position).

Зпіед5 еї аІ. повідомляли, що залишки ІдДС1, що беруть участь у зв'язуванні всіх Ес-рецепторів людини, розташовані у домені СН2, проксимальному стосовно шарніра, і попадають у дві категорії наступним чином: 1) положення, які можуть взаємодіяти з усіма ЕСЕ, включають в себе І е0234-Рго238, Аіа327 і Рго329 (Її, можливо, Азр265); 2) положення, які впливають на характер або положення вуглеводу, включають Авра265 іЗпиед5 ей аи. reported that IDS1 residues involved in the binding of all human Es receptors are located in the CH2 domain proximal to the hinge and fall into two categories as follows: 1) positions that can interact with all Es include And e0234-Rgo238, Aia327 and Rgo329 (Her, possibly Azr265); 2) provisions that affect the character or position of the carbohydrate include Avra265 and

А5п297. Додаткові залишки ІдС1, які впливають на зв'язування з Ес-Рецептором ІІ, є наступними: (найбільша дія) Агд255, Тпг256, СіІц258, бег267, Азр270, біц272, Азр280, Агд292, 5ег298 і (менша дія)A5p297. Additional IdC1 residues that affect binding to ES-Receptor II are as follows: (highest effect) Agd255, Tpg256, SiIc258, beg267, Azr270, bis272, Azr280, Agd292, 5eg298 and (less effect)

Ніз268, Авзп276, Ніз285, Азп286, І уз290, СіІп2г95, Аг9301, Тиг307, Геиз309, Авп315, І уз322, ІГуз326, Рго331,Niz268, Avzp276, Niz285, Azp286, I uz290, SiIp2g95, Ag9301, Tyg307, Geiz309, Avp315, I uz322, IGuz326, Rgo331,

Бег337, Аіа339, АіаЗ378 і Гуз414. АЗ270, АЗ275, РЗ29А, 0265А і 0270А зменшували зв'язування. Крім залишків, ідентифікованих вище для всіх ЕсК, додатковими залишками Ідс1, які зменшували зв'язування зBeg337, Aia339, AiaZ378 and Guz414. AZ270, AZ275, RZ29A, 0265A and 0270A reduced binding. In addition to the residues identified above for all ESCs, additional Ids1 residues that reduced binding to

Ес-рецептором ША на 4095 або більше, є наступні: Зег239, бег267 (тільки Су), Ніз268, Сі0293, СіІп295,The ES receptor of 4095 or more is the following: Zeg239, beg267 (only Su), Niz268, Si0293, SiIp295,

Туг296, Агда301, МаІ303, І уз338 і Азр376. Мутеїни, які поліпшували зв'язування з ЕСЕПА, включають в себеTug296, Agda301, MaI303, I uz338 and Azr376. Muteins that improved binding to ESEPA include

Т256А, К290А, 5298А, ЕЗЗЗА, КЗ34А і АЗ39Т. І уз414 показував 4095 зменшення зв'язування для ЕсСКІІА іT256A, K290A, 5298A, EZZZA, KZ34A and AZ39T. And uz414 showed 4095 reduction of binding for ESKIIA and

ЕСВІІВ, Ага416 - 3095 зменшення для РСКІІА і РСКША, біІп419 - 3095 зменшення стосовно РСКІА і 40905 зменшення стосовно ЕСКІЇІВ, і Гуз360 - 2395 поліпшення стосовно ГСКПА. Див. також Ргевзіа еї а!., Віоспет. ос. Тгапв. (2001) 30, 487-490.ESVIIV, Aga416 - 3095 decrease for RSKIIA and RSKSHA, biIp419 - 3095 decrease regarding RSKIA and 40905 decrease regarding ESCIIIV, and Guz360 - 2395 improvement regarding GSKPA. See also Rgevzia ei a!., Viospet. wasps Thapv (2001) 30, 487-490.

Наприклад, патент США Ме 6194551, включений сюди як посилання у повному вигляді, описує мутеїни зі зміненою ефекторною функцією, що містять мутації в Ес-області (до людини, у положенні амінокислот 329, 331 або 322 (з використанням нумерації Кабата), деякі з яких проявляли зменшене зв'язування С14 або зменшену активність СОС. Як інший приклад, патент США Ме 6737056, включений сюди як посилання в його повному вигляді, описує мутеїни з ефекторною функцією або зв'язуванням Ес-гамма-рецептора, що містять мутації в Ес-області (до людини, у положенні амінокислот 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 або 439 (з використанням нумерації Кабата), деякі з яких проявляють профілі зв'язування рецептора, асоційовані зі зменшеною активністю АОСС або СОС.For example, US Patent No. 6,194,551, incorporated herein by reference in its entirety, describes muteins with altered effector function containing mutations in the Es region (pre-human, at amino acid positions 329, 331, or 322 (using Kabat numbering), some of which exhibited reduced C14 binding or reduced SOC activity.As another example, US Patent No. 6,737,056, incorporated herein by reference in its entirety, describes muteins with effector function or Es-gamma receptor binding containing mutations in Es - region (to humans, at amino acid positions 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286 . , 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 or 439 (using Kabat numbering), some of which exhibit receptor binding profiles associated with reduced activity of AOSS or SOC.

Стверджується, що з них мутація у положенні амінокислоти 238, 265, 269, 270, 327 або 329 зменшує зв'язування з ЕРСКІ, мутація у положенні амінокислоти 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 або 439 зменшує зв'язування з ЕсКІЇ, а мутація у положенні амінокислоти 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 або 437 зменшує зв'язування з ЕСКІЇЇ.Of these, mutation at amino acid positions 238, 265, 269, 270, 327, or 329 is said to reduce binding to ERSKI, mutation at amino acid positions 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324 . 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 or 437 reduces binding to ESCIIA.

Патент Сполучених Штатів Мо 5624821, включений сюди як посилання в його повному вигляді, повідомляє, що активність зв'язування С1д мишачого антитіла може бути змінена мутацією амінокислотного залишку 318, 320 або 322 важкого ланцюга і заміна залишку 297 (Азп) приводить до видалення літичної активності.United States Patent No. 5,624,821, incorporated herein by reference in its entirety, reports that the C1d binding activity of a murine antibody can be altered by mutation of amino acid residue 318, 320, or 322 of the heavy chain and substitution of residue 297 (Azp) results in elimination of lytic activity. .

Публікація заявки на патент Сполучених Штатів Ме 20040132101, включена сюди як посилання в її повному вигляді, описує мутеїни з мутаціями в амінокислотних положеннях 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328 або 332 (з використанням нумерації Кабата) або положеннях 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 або 332 (з використанням нумерації Кабата), з яких мутації у положеннях 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 або 332 можуть зменшувати активність АОСС або зменшувати зв'язування з Ес-гамма-рецептором.United States Patent Application Publication No. 20040132101, incorporated herein by reference in its entirety, describes muteins with mutations at amino acid positions 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328, or 332 (from using Kabat numbering) or provisions 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 or 332 (using Kabat numbering), of which mutations at positions 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267 , 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 or 332 may reduce the activity of AOSS or reduce binding to the Es-gamma receptor.

Стаття Спарреї еї аІ., Ргос Майї! Асай Зсі ОБА 1991; 88(20):9036-40, включена сюди як посилання в її повному вигляді, повідомляє, що цитофільна активність (901 є властивістю, властивою домену СН2 його важкого ланцюга. Єдина точкова мутація у будь-якому з амінокислотних залишків 234-237 І|дДе1 значимо знижувала або виключала його активність. Була потрібна заміна всіх із залишків 234-237 ІдДС1 (Го) вArticle by Sparrei ei aI., Rgos Maya! Asai Zsi OBA 1991; 88(20):9036-40, incorporated herein by reference in its entirety, reports that cytophilic activity (901 is a property of the CH2 domain of its heavy chain. A single point mutation at any of amino acid residues 234-237 of I| dDe1 significantly reduced or eliminated its activity. It was necessary to replace all of the residues 234-237 of IdDS1 (Ho) in

Іде2 і Ід04 для відновлення повної активності зв'язування. Спостерігали, що антитіло ЇдД52, що містить повну послідовність ЕГІ ООР (залишки 233-238), є більш активним, ніж ІДС1 дикого типу.Ide2 and Ido4 to restore full binding activity. It was observed that the antibody IdD52, which contains the complete sequence of EGI OOR (residues 233-238), is more active than wild-type IDS1.

Стаття Ізаасз еї аї., У Іттипої. 1998; 161(8):3862-9, включена сюди як посилання в її повному вигляді, повідомляє, що мутації у мотиві, критичному для зв'язування Ес-гамма-К (глутамат 233 у пролін, лейцин/фенілаланін 234 у валін і лейцин 235 в аланін), повністю запобігали виснаженню клітин-мішеней.Article Izaasz ei ai., In Ittipoi. 1998; 161(8):3862-9, incorporated herein by reference in its entirety, reports that mutations in a motif critical for Es-gamma-K binding (glutamate 233 to proline, leucine/phenylalanine 234 to valine, and leucine 235 to alanine), completely prevented the depletion of target cells.

Мутація глутамату 318 в аланін елімінувала ефекторну функцію мишачого Ідс2р і також зменшувала активність ІдД4 людини.Mutation of glutamate 318 to alanine eliminated the effector function of mouse Ids2p and also reduced the activity of human Ids4.

Стаття Аптоитг еї аї., Мої! Іттипої. 2003; 40(9):585-93, включена сюди як посилання в її повному вигляді, ідентифікувала мутеїни ІдС1, які взаємодіють з активуючим рецептором, Ес-гамма-КІІа, щонайменше у 10 разів менш ефективно, ніж ІДО1 дикого типу, але їх зв'язування з інгібуючим рецептором, Ес-гамма-ВІЇ/б, зменшується тільки у 4 рази. Мутації були одержані в області амінокислот 233-236 і/або у положеннях амінокислот 327, 330 і 331. Див. також УМО 99/58572, включений сюди як посилання в його повному вигляді.Article Aptoitg ei ai., Moi! And so on. 2003; 40(9):585-93, incorporated herein by reference in its entirety, identified IDC1 muteins that interact with the activating receptor, Es-gamma-KIIa, at least 10-fold less efficiently than wild-type IDO1, but their binding to the inhibitory receptor, Es-gamma-HIV/b, decreases only 4 times. Mutations were obtained in the region of amino acids 233-236 and/or in the positions of amino acids 327, 330 and 331. See also UMO 99/58572, incorporated herein by reference in its entirety.

Стаття Хи еї аї., У Віої Спет. 1994; 269(5):3469-74, включена сюди як посилання в її повному вигляді, повідомляє, що мутування Рго331 Іде1 у 5ег помітно зменшувало зв'язування С14 і фактично елімінувало літичну активність. На відміну від цього, заміна Рго замість Зег331 в ІдД04 надавала часткову літичну активність (4095) мутеїну ЇД4 Рго331.The article of Kh ei ai., in Vioi Spet. 1994; 269(5):3469-74, incorporated herein by reference in its entirety, reports that mutating Pgo331 of Ide1 in 5eg markedly reduced C14 binding and virtually eliminated lytic activity. In contrast, replacing Zeg331 with Pgo in IdD04 conferred partial lytic activity (4095) to the YD4 mutein Pgo331.

Стаття Зспииптап еї аї., Мої Іттипої. 2001; 38(1):1-8, включена сюди як посилання в її повному вигляді, повідомляє, що мутування одного з цистеїнів шарнірної області, що бере участь в утворенні зв'язку між важкими ланцюгами, Суз226, у серин приводило до більш стабільного зв'язку між важкими ланцюгами.Article Zspiiptap ei ai., Moi Ittipoi. 2001; 38(1):1-8, incorporated herein by reference in its entirety, reports that mutating one of the hinge region cysteines involved in the formation of the bond between heavy chains, Suz226, to serine resulted in a more stable bond connection between heavy chains.

Мутування шарнірної послідовності Ід)54 Сув-Рго-Зег-Суз у шарнірну послідовність (Я1 Суз-Рго-Рго-Сув також помітно стабілізує ковалентну взаємодію між важкими ланцюгами.Mutation of the hinge sequence Id)54 Suv-Pho-Zeg-Suz into the hinge sequence (Y1 Suz-Pho-Pho-Suv also significantly stabilizes the covalent interaction between heavy chains.

Стаття Апааї еї аї., Мої Іттипої. 1993; 30(1): 105-838, включена сюди як посилання в її повному вигляді, повідомляє, що мутування серину у положенні амінокислоти 241 в Ідое4 у пролін (що виявляється у цьому положенні в ІдО1 і ІЇу052) приводило до одержання гомогенного антитіла, а також подовженого напівперіоду існування у сироватці і поліпшення розподілу у тканині у порівнянні з вихідним химерним Ідсаі.Article Apaai ei ai., Moi Ittipoi. 1993; 30(1): 105-838, incorporated herein by reference in its entirety, reports that mutating serine at amino acid position 241 in Idoe4 to proline (which is found at this position in Ido1 and IIu052) resulted in a homogeneous antibody, and prolonged half-life of existence in serum and improved distribution in tissue compared to the original chimeric Idsai.

Даний винахід розглядає також одержання молекул антитіл зі зміненою вуглеводною структурою, що приводить до зміненої ефекторної активності, у тому числі молекул антитіл з відсутнім або зменшеним фукозилюванням, які проявляють поліпшену активність АЮСС. У даній галузі відомі різні шляхи для виконання цього. Наприклад, ефекторна активність АЮСС опосередковується зв'язуванням молекули антитіла з рецептором ЕсукКІїї, яке, як було показано, залежить від вуглеводної структури М-зв'язаного глікозилювання при А5п-297 СН2-домену. Нефукозильоване антитіло зв'язує цей рецептор зі збільшеною афінністю і запускає ЕсуВІПІ-опосередковані ефекторні функції більш ефективно, ніж нативні, фукозильовані антитіла. Наприклад, рекомбінантне одержання нефукозильованого антитіла у клітинах СНО, в яких фермент альфа-1,6-фукозилтрансфераза був зруйнований нокаутом, приводить до антитіла зі збільшеною у 100 разів активністю АОСС |Матапе-ОНпикі еї а!., Віоїеснпо! Віоеєпдо. 2004 Зер 5; 87(5):614-22|. Подібні ефекти можуть бути одержані зменшенням активності цього або інших ферментів у шляху фукозилювання, наприклад, за допомогою 5івМА або обробки антисмисловою РНК, конструюванням клітинних ліній з нокаутом ферменту (ферментів) або культивуванням з селективними інгібіторами глікозилювання |Коттап еї а)., Мої Іттипої. 1989 Оес; 26(12):1113-23|. Деякі штами клітин-хазяїнів, наприклад, Гее13 або щуряча гібридомна клітинна лінія УВ2/0, продукують антитіла з більш низькими рівнями фукозилювання. 5Ппіеїй5 еї а!І., У Віої Спет. 2002 душ! 26; 277(30):26733-40; 5піпкама еї аї., ) Віої Снет. 2003 Чап 31; 278(5):3466-73.The present invention also considers the production of antibody molecules with a changed carbohydrate structure, which leads to a changed effector activity, including antibody molecules with absent or reduced fucosylation, which exhibit improved AYUSS activity. Various ways of doing this are known in the art. For example, the effector activity of AYUSS is mediated by the binding of an antibody molecule to the EsukKIi receptor, which, as it was shown, depends on the carbohydrate structure of M-linked glycosylation at the A5p-297 CH2 domain. Non-fucosylated antibody binds this receptor with increased affinity and triggers EsuVIP-mediated effector functions more effectively than native, fucosylated antibodies. For example, recombinant production of a non-fucosylated antibody in CHO cells, in which the enzyme alpha-1,6-fucosyltransferase has been destroyed by knockout, leads to an antibody with a 100-fold increase in AOSS activity. Vioepdo. 2004 Zer 5; 87(5):614-22|. Similar effects can be obtained by reducing the activity of this or other enzymes in the fucosylation pathway, for example, with the help of 5IVMA or treatment with antisense RNA, the construction of cell lines with a knockout of the enzyme(s), or cultivation with selective inhibitors of glycosylation |Kottap ei a)., Moi Ittipoi. 1989 Oes; 26(12):1113-23|. Some host cell strains, such as Gee13 or the rat hybridoma cell line UV2/0, produce antibodies with lower levels of fucosylation. 5Ppieiy5 ei a!I., In Vioi Spet. 2002 souls! 26; 277(30):26733-40; 5pipkama ei ai., ) Vioi Snet. 2003 Chap 31; 278(5):3466-73.

Було також визначено, що збільшення рівня розрізаного навпіл вуглеводу, наприклад, рекомбінантно одержаного антитіла у клітинах, які надекспресують фермент спі, збільшує активність АОСС. Отапа еї а!., Маї Віоїесппої!. 1999 Ребр; 17(2): 176-80. Було прогнозовано, що відсутність тільки одного з двох залишків фукози може бути достатньою для збільшення активності АОСС. Регтага еї аї., У Віої Спет. 2005 Оес 5;It has also been determined that increasing the level of a cleaved carbohydrate, such as a recombinantly produced antibody, in cells overexpressing the spi enzyme increases AOSS activity. Otapa ei a!., Mai Vioiesppoi!. 1999 Ribs; 17(2): 176-80. It was predicted that the absence of only one of the two fucose residues may be sufficient to increase the activity of AOSS. Regtaga ei ai., In Vioi Spet. 2005 Oes 5;

ІЕриб апеаай ої рігіпуЦ.IEryb apeaai oi rigipuTs.

Інші ковалентні модифікаціїOther covalent modifications

Ковалентні модифікації антитіла також включені в обсяг даного винаходу. Вони можуть бути виконані хімічним синтезом або ферментативним, або хімічним розщепленням антитіла, якщо можливо. Інші типи ковалентних модифікацій антитіла вводять у молекулу реакцією амінокислотних залишків-мішеней антитіла з органічним дериватизуючим агентом, який здатний реагувати з вибраними бічними ланцюгами або М-, абоCovalent antibody modifications are also included within the scope of this invention. They can be made by chemical synthesis or by enzymatic or chemical cleavage of the antibody, if possible. Other types of covalent modifications of the antibody are introduced into the molecule by the reaction of the target amino acid residues of the antibody with an organic derivatizing agent that is capable of reacting with selected side chains of either M- or

С-кінцевими залишками.C-terminal residues.

Цистеїнільні залишки найбільш часто реагують з о-галогенацетатами (і відповідними амінами), такими як хлороцтова кислота або хлорацетамід, з утворенням карбоксиметильних або карбоксіамідометильних похідних. Цистеїнільні залишки дериватизуються також реакцією з бромтрифторацетоном, альфа-бром-р- (5-імідозоїл)упропіоновою кислотою, хлорацетилфосфатом, М-алкілмалеімідами, З-нітро-2- піридилдисульфідом, метил-2-піридилсульфідом, п-хлорртутьбензоатом, 2-хлорртуть-4-нітрофенолом або хлор-7-нітробензо-2-окса-1,3-діазолом.Cysteinyl residues most often react with o-haloacetates (and corresponding amines), such as chloroacetic acid or chloroacetamide, to form carboxymethyl or carboxyamidomethyl derivatives. Cysteinyl residues are also derivatized by reaction with bromotrifluoroacetone, alpha-bromo-p-(5-imidozoyl)upropionic acid, chloroacetyl phosphate, M-alkylmaleimides, 3-nitro-2-pyridyl disulfide, methyl-2-pyridyl sulfide, p-chloromercury benzoate, 2-chloromercury- 4-nitrophenol or chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole.

Гістидильні залишки дериватизували реакцією з діетилпірокарбонатом при рН 5,5-7,0, оскільки цей агент є відносно специфічним стосовно гістидильного бічного ланцюга. Пара-бромфенацилбромід також застосовний; цю реакцію переважно проводять в 0,1 М какодилаті натрію при рН 6,0.Histidyl residues were derivatized by reaction with diethylpyrocarbonate at pH 5.5-7.0, since this agent is relatively specific for the histidyl side chain. Para-bromophenacyl bromide is also applicable; this reaction is preferably carried out in 0.1 M sodium cacodylate at pH 6.0.

Лізинільні і амінокінцеві залишки реагують з бурштиновим ангідридом або ангідридами інших карбонових кислот. Дериватизація цими агентами впливає на реверсію заряду лізинільних залишків. Інші придатні реагенти для дериватизації альфа-аміно-вмісних залишків включають імідоефіри, такі як метилпіколінімідат, піридоксальфосфат, піридоксаль, хлорборгідрид, динітробензолсульфонову кислоту, О- метилізосечовину, 2,4-пентандіон і реакцію з гліоксилатом, що каталізується трансаміназою.Lysinyl and amino-terminal residues react with succinic anhydride or anhydrides of other carboxylic acids. Derivatization by these agents affects the charge reversal of lysinyl residues. Other suitable reagents for derivatization of alpha-amino-containing residues include imido esters such as methyl picolinimidate, pyridoxal phosphate, pyridoxal, borohydride, dinitrobenzenesulfonic acid, O-methylisourea, 2,4-pentanedione, and the transaminase-catalyzed glyoxylate reaction.

Аргінільні залишки модифікують реакцією з одним або декількома загальноприйнятими реагентами, серед яких фенілгліоксаль, 2,3-бутандіон, 1,2-циклогександіон і нінгідрин. Дериватизація залишків аргініну потребує, щоб ця реакція проводилася у лужних умовах внаслідок високої рКа функціональної групи гуанідину. Крім того, ці реагенти можуть реагувати з групами лізину, а також епсилон-аміногрупою аргініну.Arginyl residues are modified by reaction with one or more commonly accepted reagents, including phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione and ninhydrin. The derivatization of arginine residues requires that this reaction be carried out under alkaline conditions due to the high pKa of the guanidine functional group. In addition, these reagents can react with lysine groups, as well as the epsilon-amino group of arginine.

Може бути проведена специфічна модифікація тирозильних залишків, з особливим інтересом стосовно введення спектральних міток у тирозильні залишки реакцією з ароматичними сполуками діазонію або тетранітрометану. Найбільш часто використовують М-ацетилімідазол і тетранітрометан для утворення О- ацетилтирозильних залишків і З-нітропохідних, відповідно. Тирозильні залишки йодинують з використанням 125) або 731| для одержання мічених білків для використання у радіоімуноаналізі.Specific modification of tyrosyl residues can be carried out, with particular interest in introducing spectral labels into tyrosyl residues by reaction with aromatic diazonium compounds or tetranitromethane. M-acetylimidazole and tetranitromethane are most often used for the formation of O-acetyltyrosyl residues and C-nitro derivatives, respectively. Tyrosyl residues are iodinated using 125) or 731| to obtain labeled proteins for use in radioimmunoassay.

Карбоксильні бічні групи (аспартил або глутаміл) селективно модифікують реакцією з карбодіімідами (в-м.ара.Сара.Мм-к), де ЕК і ЕЕ" є різними алкільними групами, такими як 1-циклогексил-3-(2-морфолініл-4- етил)карбодіїмід або 1-етил-3-(4-азоніа-4,4-диметилпентил)карбодіїмід. Крім того, залишки аспартилу і глутамілу перетворюють у залишки аспарагінілу і глутамінілу реакцією з іонами амонію.Carboxyl side groups (aspartyl or glutamyl) are selectively modified by reaction with carbodiimides (v-m.ara.Sara.Mm-k), where EC and EE" are different alkyl groups, such as 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl- 4-ethyl)carbodiimide or 1-ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimide In addition, aspartyl and glutamyl residues are converted into asparaginyl and glutaminyl residues by reaction with ammonium ions.

Залишки глутамінілу і аспарагінілу часто деамідують до відповідних залишків глутамілу і аспартилу, відповідно. Ці залишки деамідують за нейтральних і лужних умов. Деамідована форма цих залишків також включена в обсяг даного винаходу.Glutaminyl and asparaginyl residues are often deamidated to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, respectively. These residues are deamidated under neutral and alkaline conditions. The deamidated form of these residues is also included within the scope of this invention.

Інші модифікації включають гідроксилювання проліну і лізину, фосфорилування гідроксильних груп серильних або треонільних залишків, метилування альфа-аміногруп бічних ланцюгів лізину, аргініну і гістидину (Т. Е. Стеідппоп, Ргоїеїіп5: зігисішге апа Моїесціаг Ргорепіє5, М.Н. Егеетап 8. Со., зап Ргапсізсо, рр. 79-86 (1983)), адетилювання М-кінцевої аміногрупи і амідування будь-якої С-кінцевої карбоксильної групи.Other modifications include hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of seryl or threonyl residues, methylation of alpha-amino groups of side chains of lysine, arginine, and histidine (T. E. Steidpop, Rgoyeip5: zigisishge apa Moiesciag Rgorepie5, MN Egetap 8. So. , zap Rhapsizso, pp. 79-86 (1983)), adeethylation of the M-terminal amino group and amidation of any C-terminal carboxyl group.

Інший тип ковалентної модифікації включає хімічне або ферментативне зв'язування глікозидів з цим антитілом. Ці процедури є вигідними у тому розумінні, що вони не потребують одержання антитіла у клітині-Another type of covalent modification involves chemical or enzymatic binding of glycosides to this antibody. These procedures are advantageous in that they do not require the production of antibodies in the cell-

хазяїні що має здатності глікозилювання стосовно М-зв'язаного або О-зв'язаного глікозилювання. В залежності від використовуваного способу зв'язування, цукор (цукри) може бути приєднаний до (а) аргініну і гістидину, (Б) вільних карбоксильних груп, (с) вільних сульфгідрильних груп, таких як сульфгідрильні групи цистеїну, (4) вільних гідроксильних груп, таких як гідроксильні групи серину, треоніну або гідроксипроліну, (є) ароматичних залишків, таких як фенілаланін, тирозин або триптофан, або (7) амідної групи глутаміну. Ці способи описані у МО 87/05330, опублікованому 11 вересня 1987 року, і в Аріїп апа Му/гізїоп, СКС Стій. Кеум.a host having glycosylation capabilities for M-linked or O-linked glycosylation. Depending on the binding method used, the sugar(s) can be attached to (a) arginine and histidine, (b) free carboxyl groups, (c) free sulfhydryl groups such as cysteine sulfhydryl groups, (4) free hydroxyl groups , such as the hydroxyl groups of serine, threonine or hydroxyproline, (e) aromatic residues such as phenylalanine, tyrosine or tryptophan, or (7) the amide group of glutamine. These methods are described in MO 87/05330, published on September 11, 1987, and in Ariip apa Mu/gisiop, SKS Sty. Keum.

Віоспет., рр. 259-306 (1981).Viospet., pp. 259-306 (1981).

Видалення будь-яких вуглеводних частин молекул, присутніх на цьому антитілі, може виконуватися хімічно або ферментативно. Хімічне деглікозилювання потребує піддавання цього антитіла дії сполуки трифторметансульфонової кислоти або еквівалентної сполуки. Ця обробка приводить до розщеплення більшості або всіх цукрів, за винятком зв'язувального цукру (М-ацетилглюкозаміну або М- ацетилгалактозаміну), при тому, що це антитіло залишається інтактним. Хімічне деглікозилювання описанеRemoval of any carbohydrate moieties of the molecules present on this antibody can be performed chemically or enzymatically. Chemical deglycosylation requires exposure of this antibody to a compound of trifluoromethanesulfonic acid or an equivalent compound. This treatment results in cleavage of most or all of the sugars, except for the binding sugar (M-acetylglucosamine or M-acetylgalactosamine), while this antibody remains intact. Chemical deglycosylation is described

НакКітиадіп, еї аї. Агсп. Віоспет. Віорпу5. 259:52 (1987) і Едде еї аї. АпаїЇ. Віоспет., 118:131 (1981).NakKitiadip, ey ai. Agsp. Viospet. Viorpu5. 259:52 (1987) and Edde et al. Apayi Viospet., 118:131 (1981).

Ферментативне розщеплення вуглеводних частин антитіл може виконуватися з використанням різних ендо- і екзоглікозидаз, як описано ТПпоїакига еї аі. Ме. Епгутої. 138:350 (1987).Enzymatic cleavage of carbohydrate parts of antibodies can be performed using various endo- and exoglycosidases, as described by TPpoiakiga ei ai. Me. Epgutoi 138:350 (1987).

Інший тип ковалентної модифікації антитіла передбачає зв'язування антитіла з одним з різних небілкових полімерів, наприклад, поліетиленгліколем, поліпропіленгліколем, поліоксіетгилованими поліолами, поліоксіетилованим сорбітом, поліоксіетилованою глюкозою, поліоксіетилованим гліцерином, поліоксіалкіленами або полісахаридними полімерами, такими як декстран. Такі способи відомі у даній галузі, наприклад, див. патенти США з номерами 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192, 4179337, 4766106, 4179337, 4495285, 4609546 або ЕР 315456.Another type of covalent antibody modification involves linking the antibody to one of various non-protein polymers, for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyoxyethylated polyols, polyoxyethylated sorbitol, polyoxyethylated glucose, polyoxyethylated glycerol, polyoxyalkylenes, or polysaccharide polymers such as dextran. Such methods are known in this field, for example, see US Patent Nos. 4,640,835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192, 4179337, 4766106, 4179337, 4495285, 4609546 or EP 315456.

Кожна молекула антитіла може бути приєднана до однієї або декількох (тобто 1, 2, 3, 4, 5 або більше) полімерних молекул. Полімерні молекули переважно приєднують до антитіл лінксерними молекулами. Цей полімер може бути загалом синтетичним або природним полімером, наприклад, необов'язково заміщеним поліалкеном з прямим або розгалуженим ланцюгом, поліалкеніленовим або поліоксіалкіленовим полімером або розгалуженим, або нерозгалуженим полісахаридом, наприклад, гомо- або гетерополісахаридом.Each antibody molecule can be attached to one or more (ie, 1, 2, 3, 4, 5 or more) polymer molecules. Polymeric molecules are preferably attached to antibodies by linker molecules. This polymer can be a generally synthetic or natural polymer, for example, an optionally substituted polyalkene with a straight or branched chain, a polyalkenylene or polyoxyalkylene polymer, or a branched or unbranched polysaccharide, for example, a homo- or heteropolysaccharide.

Переважними полімерами є поліоксіетиловані поліоли і поліетиленгліколь (ПЕГ). ПЕГ розчинний у воді при кімнатній температурі і має загальну формулу: К(О-СН2-СН2)пО-Е, де Е може бути воднем або захисною групою, такою як алкільна або алканоїльна група. Переважно ця захисна група має 1-8 атомів вуглецю, більш переважно вона є метилом. Символ п є додатнім цілим числом, переважно між 1 і 1000, більш переважно між 2 і 500. ПЕГ має переважну середню молекулярну масу 1000-40000, більш переважно 2000- 20000, найбільш переважно 3000-12000. Переважно ПЕГ має щонайменше одну гідроксильну групу, більш переважно він має кінцеву гідроксильну групу. Саме ця гідроксигрупа переважно активується для реакції з вільною аміногрупою на інгібіторі. Однак, буде зрозуміло, що тип і кількість цих реактивних груп може варіюватися для досягнення ковалентно кон'югованого ПЕГ/антитіла за даним винаходом. Переважні полімери і способи приєднання їх до пептидів показані у патентах США з номерами 4766106; 4179337; 4495285 і 4609546, які включені сюди як посилання в їх повному вигляді.Preferred polymers are polyoxyethylated polyols and polyethylene glycol (PEG). PEG is soluble in water at room temperature and has the general formula: K(O-CH2-CH2)pO-E, where E can be hydrogen or a protecting group such as an alkyl or alkanoyl group. Preferably, this protective group has 1-8 carbon atoms, more preferably it is methyl. The symbol n is a positive integer, preferably between 1 and 1000, more preferably between 2 and 500. PEG preferably has an average molecular weight of 1000-40000, more preferably 2000-20000, most preferably 3000-12000. Preferably, PEG has at least one hydroxyl group, more preferably it has a terminal hydroxyl group. It is this hydroxy group that is preferentially activated to react with the free amino group on the inhibitor. However, it will be understood that the type and number of these reactive groups can be varied to achieve a covalently conjugated PEG/antibody of the present invention. Preferred polymers and methods of attaching them to peptides are shown in US Patent Nos. 4,766,106; 4179337; 4495285 and 4609546, which are incorporated herein by reference in their entirety.

Генна терапіяGene therapy

Доставка терапевтичного антитіла до придатних клітин може виконуватися за допомогою генної терапії ех мімо, іп зйши або іп мімо з використанням будь-якого придатного підходу, відомого у даній галузі, у тому числі з використанням фізичних способів перенесення ДНК (наприклад, ліпосомами або хімічними обробками) або з використанням вірусних векторів (наприклад, аденовірусу, аденоасоційованого вірусу або ретровірусу). Наприклад, для терапії іп мімо нуклеїнова кислота, що кодує бажане антитіло, або окремо, або у комбінації з вектором, ліпосомою або преципітатом, може бути ін'єктована безпосередньо у суб'єкта або у деяких випадках може бути ін'єктована у сайт, де є бажаною експресія сполуки антитіла. Для обробки ех мімо витягують клітини суб'єкта, нуклеїнову кислоту вводять у ці клітини, і модифіковані клітини повертають суб'єкту або безпосередньо, або, наприклад, інкапсульовані у пористих мембранах, які імплантують у пацієнта. Див., наприклад, патенти США з номерами 4892538 і 5283187. Є різні способи, доступні для введення нуклеїнових кислот у життєздатні клітини. Ці способи варіюються в залежності від того, чи переносять нуклеїнову кислоту у клітини, що культивуються, іп міо або іп мімо у клітини передбачуваного хазяїна. Способи, придатні для перенесення нуклеїнової кислоти у клітини ссавців іп мйго, включають в себе використання ліпосом, електропорацію, мікроін'єкцію, злиття клітин, ДЕАЕ-декстрановий спосіб і осадження фосфатом кальцію. Звичайно використовуваним вектором для доставки ех мімо нуклеїнової кислоти є ретровірус.Delivery of a therapeutic antibody to suitable cells can be performed by gene therapy ex mimo, ip zhysi, or ip mimo using any suitable approach known in the art, including using physical methods of DNA transfer (eg, liposomes or chemical treatments). or using viral vectors (eg, adenovirus, adeno-associated virus, or retrovirus). For example, for ip mimo therapy, a nucleic acid encoding a desired antibody, either alone or in combination with a vector, liposome, or precipitate, may be injected directly into a subject or, in some cases, may be injected into a site where expression of the antibody compound is desirable. To process ex mimo, the subject's cells are extracted, nucleic acid is injected into these cells, and the modified cells are returned to the subject either directly or, for example, encapsulated in porous membranes that are implanted in the patient. See, for example, US Patent Nos. 4,892,538 and 5,283,187. There are various methods available for introducing nucleic acids into viable cells. These methods vary depending on whether the nucleic acid is transferred into cultured cells, ip myo or ip mimo into cells of the intended host. Methods suitable for the transfer of nucleic acid into mammalian cells include the use of liposomes, electroporation, microinjection, cell fusion, the DEAE-dextran method, and precipitation with calcium phosphate. A commonly used vector for external nucleic acid delivery is a retrovirus.

Інші способи перенесення нуклеїнової кислоти іп мімо включають в себе трансфекцію вірусними векторами (такими як аденовірус, вірус простого герпесу І або аденоасоційований вірус) і системи на основі ліпідів. Нуклеїнову кислоту і агент трансфекції необов'язково асоціюють з мікрочастинкою. Приклади агентів трансфекції включають співосадження фосфатом кальцію або хлоридом кальцію, опосередковану ДЕАЕ- декстраном трансфекцію, амфіфільний ООТМА ((діолеоїлоксипропіл)утриметиламонійбромід четвертинного амонію, що продається у вигляді Ліпофектину СІВСО-ВНЇ|) (Ееїдпег еї а)ї., (1987) Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА 84, 7413-7417; Маюпе еї а!. (1989) Ргос. Маї! Асай. сі. ОБА 86 6077-6081); ліпофільні глутаматні діефіри з триметиламонієвими бічними ланцюгами (йо еї а). (1990) Віоспет. Віорпуз5. Асіа 1023, 124-132); метаболізовані вихідні ліпіди, такі як катіонний ліпід діоктадециламідогліцилспермін (0005, Тгапвтесіат,Other methods of transferring nucleic acid ip mimo include transfection with viral vectors (such as adenovirus, herpes simplex virus I or adeno-associated virus) and lipid-based systems. The nucleic acid and the transfection agent are not necessarily associated with the microparticle. Examples of transfection agents include co-precipitation with calcium phosphate or calcium chloride, DEAE-dextran-mediated transfection, the amphiphilic OOTMA ((dioleoyloxypropyl)utrimethylammonium bromide quaternary ammonium, sold as Lipofectin SIVSO-VNI|) (Eeidpeg ei a)i., (1987) Rgos. May). Asai. 5 OBA 84, 7413-7417; Mayupe eh!. (1989) Rgos. Mai! Asai. si. BOTH 86 6077-6081); lipophilic glutamate diesters with trimethylammonium side chains (yo ei a). (1990) Viospet. Viorpuz5. Asia 1023, 124-132); metabolized parent lipids, such as the cationic lipid dioctadecylamidoglycylspermine (0005, Tgapvtesiat,

Рготеда) і дипальмітот'лфосфатидилетаноламілспермін (ОРРЕБ) (9. Р. Вепг (1986) Теїапеайгоп Гей. 27, 5861-5864; 9. Р. Вепг еї а). (1989) Ргос. Май. Асад. сі. ОБА 86, 6982-6986); метаболізовані солі четвертинного амонію (0ООТВ, метилсульфат М-(1-(2,3-діолеоїлокси|пропіл)-М,М,М-триметиламонію (ООТАР) (Воепгіпдег Мапппеїт), поліетиленімін (РЕЇ), діолеоїлові ефіри, СпоТВ, СпозС, БО5С (і емепіїз еї а!. (1990) Віоспіт. Іпіег. 22, 235-241); Збета(М-(М';М'-диметиламіно-етан)карбамоїл|холестерин (00-Спої), діолеоїлфосфатидилетаноламін (ОРЕ)/Збета(М-(М',М'-диметиламіноетан)карбамоїл|холестерин ОС-Спої у сумішах 1:1 (Сао еї аї., (1991) Віоспіт. Віорпу5. Асіа 1065, 8-14), спермін, спермідин, ліпополіаміни (Вепйг еї а!., Віосоп|іидаге Спет, 1994, 5:382-389), ліпофільні полілізини (ГРІ) (2пои еї аї., (1991) Віоспіт. Віорпуз.Rgoteda) and dipalmitot'lphosphatidylethanolamylspermine (ORREB) (9. R. Vepg (1986) Therapeut Hei. 27, 5861-5864; 9. R. Vepg eii a). (1989) Rgos. May Asad si. OBA 86, 6982-6986); metabolised quaternary ammonium salts (0OOTV, M-(1-(2,3-dioleoyloxy|propyl)-M,M,M-trimethylammonium sulfate (OOTAR) (Voepgipdeg Mapppeit), polyethyleneimine (REI), dioleoyl ethers, SpoTV, SpozS, БО5С (and its emepiies and a!. (1990) Viospit. Ipieg. 22, 235-241); Zbeta(M-(M';M'-dimethylamino-ethane)carbamoyl|cholesterol (00-Spoi), dioleoylphosphatidylethanolamine (ORE) /Zbeta(M-(M',M'-dimethylaminoethane)carbamoyl|cholesterol OS-Spoi in mixtures 1:1 (Sao ei ai., (1991) Viospit. Viorpu5. Asia 1065, 8-14), spermine, spermidine, lipopolyamines (Vepig ei a!., Viosop|iidage Spet, 1994, 5:382-389), lipophilic polylysines (GRI) (2poi ei ai., (1991) Viospit. Viorpuz.

Асіа 939, 8-18), гідроксид (|(1,1,3,3-тетраметилбутил)крезокси|етокси|етил|Іуиметилбензиламонію (ОЕВОА гідроксид) з надлишком фосфатидилхоліну/холестерину (ВаїІаз еї аї., (1988) Віоспіт. Віорпув. Асіа 939, 8-Asia 939, 8-18), hydroxide (|(1,1,3,3-tetramethylbutyl)cresoxy|ethoxy|ethyl|Hymethylbenzylammonium hydroxide (EOVOA hydroxide) with an excess of phosphatidylcholine/cholesterol (Vailiaz ei ai., (1988) Viospit. Viorpuv Asia 939, 8-

18), суміші броміду цетилтриметиламонію (СТАВУСОРЕ (Ріппадиуаде еї аї., (1989) Віоспіт. Віорпу5. Асіа 985, 33-37), ліпофільного діефіру глутамінової кислоти (ТМАС) з ООРЕ, СТАВ, ОЕВОА, бромідом дидодециламонію (0ОСАВ) і стеариламін у суміші з фосфатидилетаноламіном (Козе еї аї., (1991)18), mixtures of cetyltrimethylammonium bromide (STAVUSORE (Rippadiuade et al., (1989) Viospit. Viorpu5. Asia 985, 33-37), lipophilic diester of glutamic acid (TMAS) with OORE, STAV, OEVOA, didodecylammonium bromide (0OSAV) and stearylamine in a mixture with phosphatidylethanolamine (Koze and AI., (1991)

Віоїесппідне 10, 520-525), ОБАВ/СОРЕ (Тгапе5тесіАСЕ, ВК), і ліпіди, що несуть олігогалактозу. Зразкові енхансерні агенти трансфекції, які збільшують ефективність перенесення, включають, наприклад, ДЕАЕ- декстран, полібрен, пептид, що руйнує лізосоми (Оптогі М. І. еї аІ., Віоспет Віорпуз Ке5 Соттип іт. 27, 1997; 235(3):726-9), протеоглікани на основі хондроїтану, сульфатовані протеоглікани, поліетиленімін, полілізин (Роїага Н. еї аї. У Віої Спет, 1998 273 (13):7507-11), інтегринзв'язувальний пептид СУСОКООТтР, лінійний декстрановий нонасахарид, гліцерин, холестерильні групи, приєднані до З-кінцевого міжнуклеозидного зв'язку олігонуклеотиду (Геїзіпдег, К. Г. 1989 Ргос Ман Асай 5сі ОБА 86:(17):6553-6), лізофосфатид, лізофосфатидилхолін, лізофосфатидилетаноламін і 1-олеоїллізофосфатидилхолін.Violyesppidne 10, 520-525), OBAV/SORE (Tgape5tesiACE, VK), and lipids carrying oligogalactose. Exemplary transfection enhancer agents that increase transfection efficiency include, for example, DEAE-dextran, polybrene, lysosome-destroying peptide (Optogi M.I. ei aI., Viospet Viorpuz Ke5 Sottip et al. 27, 1997; 235(3): 726-9), proteoglycans based on chondroitan, sulfated proteoglycans, polyethyleneimine, polylysine (Roiaga N. ei ai. In Vioi Spet, 1998 273 (13): 7507-11), integrin-binding peptide SUSOKOOTtR, linear dextran nonasaccharide, glycerin, cholesteryl groups attached to the C-terminal internucleoside bond of the oligonucleotide (Geizipdeg, K. G. 1989 Rgos Man Asai 5si OBA 86:(17):6553-6), lysophosphatide, lysophosphatidylcholine, lysophosphatidylethanolamine and 1-oleoylisophosphatidylcholine.

У деяких ситуаціях може бути бажаною доставка нуклеїнової кислоти агентом, що направляє вектор, який містить нуклеїнову кислоту, до клітин-мішеней. Такі «націлюючі» молекули включають антитіла, специфічні стосовно мембранного білка клітинної поверхні на клітині-мішені, або ліганд для рецептора на клітині-мішені. При використанні ліпосом, білки, які зв'язуються з мембранним білком поверхні клітини, асоційовані з ендоцитозом, можуть бути використані для націлювання і/або полегшення поглинання.In some situations, it may be desirable to deliver the nucleic acid by an agent that directs the vector that contains the nucleic acid to the target cells. Such "targeting" molecules include antibodies specific for a cell surface membrane protein on the target cell or a ligand for a receptor on the target cell. When using liposomes, proteins that bind to cell surface membrane proteins associated with endocytosis can be used to target and/or facilitate uptake.

Приклади таких білків включають капсидні білки і їх фрагменти, що викликають тропізм у конкретного типу клітин, антитіла для білків, які піддаються інтерналізації у циклічному процесі, і білки, які націлені на внутрішньоклітинне місце розташування і збільшують напівперіод існування всередині клітини. В інших варіантах здійснення може використовуватися опосередкований рецептором ендоцитоз3з. Такі способи описані, наприклад, у Уми єї аї!., 1987 або У/адпег еї а!., 1990. Стосовно огляду відомого у наш час мічення генів і протоколів генної терапії див. Апдегзоп 1992. Див. також М/О 93/25673 і посилання, що цитуються у ньому. Стосовно додаткових оглядів технології генної терапії див. Ргіедтапп, 5сієпсе, 244:1275-1281 (1989);Examples of such proteins include capsid proteins and fragments thereof that induce tropism in a specific cell type, antibodies to proteins that undergo cycling internalization, and proteins that target an intracellular location and increase half-life within the cell. In other embodiments, receptor-mediated endocytosis can be used. Such methods are described, for example, in Umy et al., 1987 or U/adpeg et al., 1990. Regarding the review of currently known gene labeling and gene therapy protocols, see Apdegzop 1992. See also M/O 93/25673 and references cited therein. For additional reviews of gene therapy technology, see Riedtapp, 5siepse, 244:1275-1281 (1989);

Апаегзоп, Машге, зирріетепі ю мо!. 392, по 6679, рр. 25-30 (1998); Мепта, Зсіепійс Атегісап: 68-84 (1990); іApaegzop, Mashge, zirrietepi yu mo!. 392, no. 6679, pp. 25-30 (1998); Mepta, Zsiepiis Ategisap: 68-84 (1990); and

Мійег, Макиге, 357:455-460 (1992).Miyeg, Makyge, 357:455-460 (1992).

Способи скринінгуMethods of screening

Інший аспект даного винаходу стосується способів ідентифікації антитіл, які модулюють (тобто зменшують) активність РКК, що передбачає контактування РЕ КЕ з антитілом і визначення, чи модифікує це антитіло активність цього РКІК. Активність у присутності тест-антитіла порівнюють з активністю за відсутності тест-антитіла. Якщо активність проби, що містить тест-антитіло, нижча, ніж активність у пробі, позбавленій цього тест-антитіла, це антитіло буде мати інгібовану активність. Ефективні терапевтичні засоби залежать від ідентифікації ефективних агентів, позбавлених значимої токсичності. Антитіла можуть бути піддані скринінгу на афінність зв'язування способами, відомими у даній галузі. Наприклад, можуть бути використані аналізи зсуву у гелі, Вестерн-аналізи, конкурентні аналізи з радіоактивною міткою, хроматографічне кофракціонування, копреципітація, зшивання, ЕГІЗА, резонанс поверхневих плазмонів (наприклад, ВіасогеФф), розділений у часі флуороімунологічний аналіз (наприклад, ОБЕЇ РІА) і т.п., які описані, наприклад, у Сшигтепі Ргоїосо!5 іп Моїесшіаг Віоіоду (1999), Сиггепі Ргоїосоїв5 іп Іттипоіоду (2007), дхдопп УМіеу 85 Боп5, МУ, які включені сюди як посилання в їх повному вигляді. Крім того, резонанс поверхневих плазмонів (наприклад, Віасогеф) може бути використаний для оцінки конкуренції між двома антитілами (див., наприклад, приклад 7 нижче). Розділена у часі флуорометрія (наприклад, ОЕЇ РІА) може бути також використана для оцінки рівня конкуренції між двома антитілами. Наприклад, аналіз конкурентного скринінгу на основі мікропланшетів ОЕЇ! РІАФ (Регкіп ЕІтег) може виконуватися на основі протоколів, забезпечених виробником.Another aspect of the present invention relates to methods of identifying antibodies that modulate (ie, reduce) the activity of RKK, which involves contacting RE KE with an antibody and determining whether this antibody modifies the activity of this RKK. The activity in the presence of the test antibody is compared with the activity in the absence of the test antibody. If the activity of a sample containing a test antibody is lower than the activity of a sample lacking that test antibody, that antibody will have inhibited activity. Effective therapeutics depend on the identification of effective agents without significant toxicity. Antibodies can be screened for binding affinity by methods known in the art. For example, gel shift assays, Western assays, radiolabeled competition assays, chromatographic cofractionation, coprecipitation, cross-linking, EGISA, surface plasmon resonance (eg, ViasogeFF), time-resolved fluoroimmunoassay (eg, OBEI RIA) and etc., which are described, for example, in Siggepi Rgoioso!5 ip Moiessiag Vioiodu (1999), Siggepi Rgoiosoiv5 ip Ittipoiodu (2007), dhdopp UMieu 85 Bop5, MU, which are incorporated herein by reference in their entirety. In addition, surface plasmon resonance (for example, Viasogef) can be used to assess competition between two antibodies (see, for example, Example 7 below). Time-resolved fluorometry (eg, OEI RIA) can also be used to assess the level of competition between two antibodies. For example, analysis of competitive screening based on OEI microplates! RIAF (Regkeep EITeg) can be performed on the basis of protocols provided by the manufacturer.

Для початкового скринінгу на антитіла, які зв'язуються з бажаним епітопом на антигені-мішені, може виконуватися рутинний аналіз перехресного зв'язування, такий як аналіз, описаний в Апііродіе5, АTo initially screen for antibodies that bind to the desired epitope on the target antigen, a routine cross-linking assay such as that described in Apirodie5, A

І арогаїюгу Мапиаї!, Соїй бргіпд Нагрог Гарогаюгу, Ед Нагіом/у апа Оамід Гапе (1988). Можуть бути також використані рутинні аналізи конкурентного зв'язування, в яких невідоме антитіло характеризують за його здатністю інгібувати зв'язування мішені з мішень-специфічним антитілом за винаходом. Можуть бути використані інтактний антиген, його фрагменти, такі як позаклітинний домен, або лінійні епітопи. Картування епітопів описане у Спатре еї аї., 9. ВіоїЇ. Спет. 270:1388-1394 (1995).And aroghaiyugu Mapiai!, Soii brgipd Nagrog Garogayugu, Ed Nagyom/u apa Oamid Gape (1988). Routine competitive binding assays can also be used, in which an unknown antibody is characterized by its ability to inhibit binding of a target with a target-specific antibody of the invention. Intact antigen, fragments thereof, such as the extracellular domain, or linear epitopes may be used. Mapping of epitopes is described in Spatre ei ai., 9. VioiYi. Spent 270:1388-1394 (1995).

В одній варіації аналізу зв'язування іп мійго винахід забезпечує спосіб, що передбачає стадії (а) контактування іммобілізованого РЕ Е з кандидатним антитілом і (Б) детектування зв'язування кандидатного антитіла з цим РКІК. В альтернативному варіанті здійснення кандидатне антитіло іммобілізують і детектують зв'язування РЕ. Іммобілізацію виконують з використанням будь-якого зі способів, добре відомих у даній галузі, що включають ковалентне зв'язування з носієм, гранулою або хроматографічною смолою, а також нековалентну, високоафінну взаємодію, таку як зв'язування антитіл, або застосування зв'язування стрептавідин/біотин, в якому іммобілізована сполука включає біотинову частину молекули.In one variation of the IP binding assay, my invention provides a method that involves the steps of (a) contacting the immobilized PE E with a candidate antibody and (b) detecting the binding of the candidate antibody to this RKIC. In an alternative embodiment, the candidate antibody is immobilized and PE binding is detected. Immobilization is performed using any of the methods well known in the art, including covalent binding to a support, bead, or chromatographic resin, as well as non-covalent, high-affinity interaction, such as antibody binding, or using streptavidin binding /biotin, in which the immobilized compound includes the biotin part of the molecule.

Детектування зв'язування може виконуватися (і) з використанням радіоактивної мітки на сполуці, яку не іммобілізують, (ії) з використанням флуоресцентної мітки на неіммобілізованій сполуці, (ії) з використанням антитіла, імуноспецифічного стосовно неіммобілізованої сполуки, (м) з використанням мітки на не іммобілізованій сполуці, що збуджує флуоресцентний носій, до якого приєднана іммобілізована сполука, а також інших способів, які добре відомі і рутинно практикуються у даній галузі.Detection of binding can be performed (i) using a radioactive label on the non-immobilized compound, (ii) using a fluorescent label on the non-immobilized compound, (ii) using an antibody immunospecific for the non-immobilized compound, (m) using a label on non-immobilized compound that excites the fluorescent carrier to which the immobilized compound is attached, as well as other methods well known and routinely practiced in the art.

Антитіла, які модулюють (тобто збільшують, зменшують або блокують) активність антигену-мішені, можуть бути ідентифіковані інкубуванням кандидатного антитіла з антигеном-мішенню (або клітиною, що експресує антиген-мішень) і визначенням дії цього кандидатного антитіла на активність або експресію антигену-мішені. Активність у присутності тест-антитіла порівнюють з активністю за відсутності тест- антитіла. Якщо активність проби, що містить це тест-антитіло, нижча, ніж активність у пробі, позбавленій цього тест-антитіла, це антитіло буде мати інгібовану активність. Селективність антитіла, що модулює активність поліпептиду або полінуклеотиду антигену-мішені, може оцінюватися порівнянням його дій на антиген-мішень з його дією на інші споріднені сполуки.Antibodies that modulate (ie, increase, decrease, or block) the activity of a target antigen can be identified by incubating a candidate antibody with a target antigen (or a cell expressing the target antigen) and determining the effect of that candidate antibody on the activity or expression of the target antigen . The activity in the presence of the test antibody is compared with the activity in the absence of the test antibody. If the activity of a sample containing that test antibody is lower than the activity of a sample lacking that test antibody, that antibody will have inhibited activity. The selectivity of an antibody that modulates the activity of a polypeptide or polynucleotide of a target antigen can be assessed by comparing its action on the target antigen with its action on other related compounds.

В особливо переважних варіантах здійснення припускається, що ці антитіла тестують на їх дію у системі клітин, що культивуються, для визначення їх здатності запобігати димеризації РКІК і/або нейтралізувати РЕК в індукції фосфорилування ЗТАТ5 і/або МАРК, і/або АКТ, або інших індикаторів передачі сигналу РЕ Е. Додатково, для оцінки конкретного антитіла проти РЕ Е, можуть бути використані клітинні аналізи, у тому числі аналізи проліферації, аналізи у м'якому агарі і/або аналізи цитотоксичності, описані тут.In particularly preferred embodiments, it is contemplated that these antibodies are tested for their activity in a cultured cell system to determine their ability to prevent RKIK dimerization and/or neutralize REK in the induction of phosphorylation of ZTAT5 and/or MAPK, and/or AKT, or other indicators PE E signal transduction. Additionally, cellular assays, including proliferation assays, soft agar assays, and/or cytotoxicity assays described herein, can be used to evaluate a specific anti-PE E antibody.

Біологічна активність конкретного антитіла або комбінації антитіл може оцінюватися іп мімо з використанням придатної моделі тварини. Наприклад, можуть бути використані моделі ксеногенного раку, в яких клітини раку людини вводять в імунодефіцитних тварин, таких як голі (безтимусні) миші або миші ЗСІЮ.The biological activity of a particular antibody or combination of antibodies can be assessed by immunoassay using a suitable animal model. For example, xenogeneic cancer models can be used, in which human cancer cells are injected into immunodeficient animals, such as nude (athymic) mice or SCI mice.

Ефективність може бути прогнозована з використанням аналізів, які вимірюють утворення пухлини, регресію пухлини або метастазування і т.п.Efficacy can be predicted using assays that measure tumor formation, tumor regression or metastasis, etc.

Даний винахід включає також високопродуктивні аналізи скринінгу (НТ) для ідентифікації антитіл, які взаємодіють з біологічною активністю або інгібують біологічну активність (тобто інгібують ферментативну активність, зв'язувальну активність, внутрішньоклітинну передачу сигналу і т.д.) антигену-мішені. АналізиThe present invention also includes high-throughput screening assays (HT) for the identification of antibodies that interact with the biological activity or inhibit the biological activity (ie, inhibit enzymatic activity, binding activity, intracellular signal transmission, etc.) of the target antigen. Analyzes

НТ допускають скринінг широкого ряду сполук ефективним чином. Системи НТ на основі клітин передбачаються для дослідження взаємодії між антигеном-мішенню і його партнерами зі зв'язування.NTs allow the screening of a wide range of compounds in an efficient manner. Cell-based NT systems are envisioned to study the interaction between a target antigen and its binding partners.

Аналізи НТ5 призначені для ідентифікації «хітів» або «сполук-прикладів», що мають бажану властивість, з яких можуть бути сконструйовані модифікації для поліпшення бажаної властивості.HT5 assays are designed to identify "hits" or "example compounds" that have a desired property, from which modifications can be constructed to improve the desired property.

В іншому варіанті здійснення використовують високопродуктивний скринінг на фрагменти антитіл або областей СОК з 1, 2, З або більше модифікаціями амінокислот в областях СОК, що мають придатну афінність зв'язування з поліпептидом антигену-мішені.In another embodiment, high-throughput screening is used for fragments of antibodies or regions of the SOC with 1, 2, C or more modifications of amino acids in the regions of the SOC, which have a suitable binding affinity to the target antigen polypeptide.

Комбінована терапіяCombined therapy

Після ідентифікації більш ніж одного антитіла, ефективного у моделі тварини, може бути, далі, переважним змішування двох або більше таких антитіл разом (антитіл, які зв'язуються з однаковими або різними антигенами-мішенями) для забезпечення ще більш поліпшеної ефективності. Композиції, що містять одне або декілька антитіл, можуть вводитися суб'єктам або ссавцям, які страждають від раку або схильні до виникнення раку. Спільне введення двох терапевтичних агентів не потребує, щоб ці агенти вводилися у той самий час або тим самим способом, доки є перекривання у періоді часу, під час якого ці агенти проявляють їх терапевтичну дію. Передбачається одночасне або послідовне введення, як і введення у різні дні або тижні.After identifying more than one antibody effective in an animal model, it may then be advantageous to mix two or more such antibodies together (antibodies that bind to the same or different target antigens) to provide even more improved efficacy. Compositions containing one or more antibodies can be administered to subjects or mammals suffering from cancer or susceptible to cancer. Co-administration of two therapeutic agents does not require that these agents be administered at the same time or in the same manner as long as there is an overlap in the time period during which these agents exert their therapeutic effect. Simultaneous or sequential administration is provided, as well as administration on different days or weeks.

Хоча лікування антитілами (пасивна імунотерапія) може бути корисним під час всіх стадій раку, лікування антитілами може бути особливо переважним у розвинутих (запущених) або метастатичних раках.Although treatment with antibodies (passive immunotherapy) can be helpful during all stages of cancer, treatment with antibodies may be especially preferable in advanced (advanced) or metastatic cancers.

Комбінування способу терапії антитілами зі схемою хіміотерапії або променевої терапії може бути переважним для пацієнтів, які не одержували хіміотерапевтичного лікування, тоді як лікування з використанням терапії антитілами може бути показане для пацієнтів, які одержували один або декілька хіміотерапевтичних засобів. Крім того, лікування антитілами може також дозволити застосування зменшених доз спільної хіміотерапії, особливо для пацієнтів, які погано переносять токсичність хіміотерапевтичного агента.Combining antibody therapy with a chemotherapy or radiation regimen may be preferable for chemotherapy-naïve patients, while treatment with antibody therapy may be indicated for patients who have received one or more chemotherapy agents. In addition, antibody treatment may also allow the use of reduced doses of concomitant chemotherapy, especially for patients who do not tolerate the toxicity of the chemotherapy agent.

Способи даного винаходу передбачають введення окремих антитіл, а також комбінацій, або «коктейлів», різних антитіл. Такі коктейлі антитіл можуть мати визначені переваги у вигляді того, що вони містять антитіла, які використовують різні ефекторні механізми або об'єднують безпосередньо цитотоксичні антитіла з антитілами, які базуються на імунній функціональності ефектора. Такі антитіла у комбінації можуть проявляти синергічні терапевтичні ефекти. Як приклад, способи даного винаходу розглядають введення антитіл до М-С5Е, ВАМКІ., Тахоїеге"м, Негсеріїп'м, Амавіїпім, Егрішхм або анти-ЕСЕВ-антитіл іThe methods of this invention involve the administration of individual antibodies, as well as combinations, or "cocktails", of different antibodies. Such antibody cocktails may have certain advantages in that they contain antibodies that use different effector mechanisms or combine directly cytotoxic antibodies with antibodies that are based on the immune functionality of the effector. Such antibodies in combination may exhibit synergistic therapeutic effects. As an example, the methods of the present invention contemplate the administration of antibodies to M-C5E, VAMKI., Tahoege"m, Negseriip'm, Amaviipim, Egriskhm or anti-ESEV-antibodies and

Татохігеп.Tatohigep.

Цитотоксичним агентом називають речовину, що інгібує або запобігає функції клітин і/або викликає деструкцію клітин. Припускається, що цей термін включає в себе радіоактивні ізотопи (наприклад, 1191, |125, 29 | Ве!86), хіміотерапевтичні агенти і токсини, такі як ферментативно активні токсини, що походять з бактерій, грибів, рослин або тварин, або синтетичні токсини або їх фрагменти. Нецитотоксичним агентом називають речовину, яка не інгібує або не запобігає функції клітин і/або не викликає деструкції клітин.A substance that inhibits or prevents cell functions and/or causes cell destruction is called a cytotoxic agent. This term is intended to include radioactive isotopes (eg, 1191, |125, 29 | Be!86), chemotherapeutic agents, and toxins, such as enzymatically active toxins derived from bacteria, fungi, plants, or animals, or synthetic toxins or their fragments. A non-cytotoxic agent is a substance that does not inhibit or prevent cell function and/or does not cause cell destruction.

Нецитотоксичний агент може включати в себе агент, що може бути активований, щоб стати цитотоксичним.A non-cytotoxic agent may include an agent that can be activated to become cytotoxic.

Нецитотоксичний агент може включати гранулу, ліпосому, матрикс або частинку (див., наприклад, публікації патентів США 2003/0028071 і 2003/0032995, які включені сюди як посилання). Такі агенти можуть бути кон'югованими, спряженими, зв'язаними або асоційованими з антитілом відповідно до даного винаходу.A non-cytotoxic agent may include a granule, liposome, matrix, or particle (see, for example, US Patent Publications 2003/0028071 and 2003/0032995, which are incorporated herein by reference). Such agents may be conjugated, conjugated, linked or associated with an antibody according to the present invention.

Протиракові хіміотерапевтичні агенти включають, без обмеження, алкілувальні агенти, такі як карбоплатин і цисплатин; алкілувальні агенти у вигляді азотних аналогів іприту; алкілувальні агенти у вигляді нітрозосечовини, такі як кармустин (ВСМУ); антиметаболіти, такі як метотрексат; фолінову кислоту; антиметаболіти у вигляді пуринових аналогів, меркаптопурин; антиметаболіти у вигляді піримідинових аналогів, такі як фторурацил (5-Е) і гемцитабін (сетлагФ); гормональні антинеопластичні засоби, такі як гозерелін, лейпролід і тамоксифен; природні антинеопластичні речовини, такі як альдеслейкін, інтерлейкін- 2, доцетаксел, етопозид (УР-16), інтерферон альфа, паклітаксел (Таксолоф)) і третиноїн (АТКА); антибіотичні природні антинеопластичні речовини, такі як блеоміцин, дактиноміцин, даунорубіцин, доксорубіцин, дауноміцин і мітоміцини, у тому числі мітоміцин С; і природні антинеопластичні речовини, такі як алкалоїдиAnticancer chemotherapeutic agents include, without limitation, alkylating agents such as carboplatin and cisplatin; alkylating agents in the form of nitrogen analogues of mustard; alkylating agents in the form of nitrosoureas, such as carmustine (VSMU); antimetabolites such as methotrexate; folinic acid; antimetabolites in the form of purine analogs, mercaptopurine; antimetabolites in the form of pyrimidine analogues, such as fluorouracil (5-E) and gemcitabine (setlagF); hormonal antineoplastic agents such as goserelin, leuprolide, and tamoxifen; natural antineoplastic agents such as aldesleukin, interleukin-2, docetaxel, etoposide (UR-16), interferon alfa, paclitaxel (Taxolof)) and tretinoin (ATKA); antibiotic natural antineoplastic agents such as bleomycin, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, daunomycin, and mitomycins, including mitomycin C; and natural antineoplastic agents such as alkaloids

Міпса, такі як вінбластин, вінкристин, віндезин; гідроксисечовина; ацеглатон, адріаміцин, іфосфамід, еноцитабін, епітіостанол, акларубіцин, анцитабін, німустин, прокарбазину гідрохлорид, карбоквон, карбоплатин, кармофур, хромоміцин АЗ, протипухлинні полісахариди, протипухлинні фактори тромбоцитів, циклофосфамід (ЦитоксинФ), Шизофілан, цитарабін (цитазинарабінозид), дакарбазин, тіоінозин, тіотепа, тегафур, доластатини, аналоги доластатину, такі як ауристатин, СРТ-11 (іринотекан), мітозантрон, вінорелбін, теніпозид, аміноптерин, карміноміцин, еспераміцини (див., наприклад, патент США Мо 4675187), неокарциностатин, ОК-432, блеоміцин, фуртулон, броксуридин, бусульфан, хонван, пепломіцин, бестатин (УбенімексФ), інтерферон-р, мепітіостан, мітобронітол, мелфалан, пептиди ламініну, лентинан, екстрактMips such as vinblastine, vincristine, vindesine; hydroxyurea; aceglaton, adriamycin, ifosfamide, enocitabine, epithiostanol, aclarubicin, ancitabine, nimustine, procarbazine hydrochloride, carboquone, carboplatin, carmofur, chromomycin AZ, antitumor polysaccharides, antitumor platelet factors, cyclophosphamide (CytoxinF), schizophyllan, cytarabine (cytazine arabinoside), dacarbazine, thioinosine , thiotepa, tegafur, dolastatins, dolastatin analogs such as auristatin, CPT-11 (irinotecan), mitozantrone, vinorelbine, teniposide, aminopterin, carminomycin, esperamycins (see, e.g., US Pat. Mo. 4,675,187), neocarcinostatin, OK-432, bleomycin, furtulon, broxuridine, busulfan, honvan, peplomycin, bestatin (UbenimexF), interferon-p, mepitiostan, mitobronitol, melphalan, laminin peptides, lentinan, extract

Согіоїш5 мегзісоїог, тегафур/урацил, естрамустин (естроген/меклоретамін).Sogioish5 megsisoiog, tegafur/uracil, estramustine (estrogen/mechlorethamine).

Крім того, додаткові агенти, використовувані у терапії для ракових пацієнтів, включають ЕРО, 5-С5БЕ, ганцикловір; антибіотики, лейпролід; меперидин; зидовудин (А27Т); інтерлейкіни 1-18, у тому числі мутанти і аналоги; інтерферони або цитокіни, такі як інтерферони о, ДВ і у, гормони, такі як рилізинг-фактор лютеїнізуючого гормону (НЕН) і аналоги, і гонадоліберин (гонадотропінвивільняючий гормон) (спе); фактори росту, такі як, трансформуючий фактор росту-р (ТОБ-Д), фактор росту фібробластів (ЕСЕ), фактор росту нервів (МОР), рилізинг-фактор гормону росту (ЗОН), епідермальний фактор росту (ЕОБ), гомологічний фактор росту фібробластів (ЕСЕНЕ), фактор росту гепатоцитів (НОР) та інсуліноподібний фактор росту (ІСЕ); фактор с; і Д некрозу пухлин (ТМЕ-о; і Д); фактор-2, що інгібує інвазію (ПЕ-2); білки 1-7, що беруть участь в остеогенезі (ВМР 1-7); соматостатин; тимозин-о-1; у-глобулін; супероксидисмутазу (500); антагоністи ЕСЕК (рецептора епідермального фактора росту), такі як, наприклад, Цетуксимаб іIn addition, additional agents used in therapy for cancer patients include EPO, 5-C5BE, ganciclovir; antibiotics, leuprolide; meperidine; zidovudine (A27T); interleukins 1-18, including mutants and analogues; interferons or cytokines, such as interferons o, DV and y, hormones such as luteinizing hormone releasing factor (LHR) and analogs, and gonadotropin-releasing hormone (gonadotropin-releasing hormone) (spe); growth factors, such as transforming growth factor-p (TGF-D), fibroblast growth factor (ESF), nerve growth factor (NGF), growth hormone releasing factor (GHR), epidermal growth factor (EGF), homologous growth factor fibroblasts (ESENE), hepatocyte growth factor (HOR) and insulin-like growth factor (ISE); factor c; and D tumor necrosis (TME-o; and D); factor-2, which inhibits invasion (PE-2); proteins 1-7 involved in osteogenesis (BMP 1-7); somatostatin; thymosin-o-1; y-globulin; superoxide dismutase (500); ESEK (epidermal growth factor receptor) antagonists, such as, for example, Cetuximab and

Гефітиніб; антагоністи РЕ (рецептора прогестерону) і модулятори, такі як Міфепристон і Онапристонтм; інгібітори ароматази, такі як, наприклад, Анастрозол, Екземестан і Летрозол; антиестрогенні агенти, антагоністи і модулятори рецептора естрогену, такі як, наприклад, Тамоксифен, Тореміфен і Фулвестрант; фактори комплементу; антиангіогенні фактори; антигенні речовини і проліки.Gefitinib; RE (progesterone receptor) antagonists and modulators such as Mifepristone and Onapristontm; aromatase inhibitors such as, for example, Anastrozole, Exemestane and Letrozole; anti-estrogenic agents, antagonists and modulators of the estrogen receptor, such as, for example, Tamoxifen, Toremifene and Fulvestrant; complement factors; antiangiogenic factors; antigenic substances and prodrugs.

Проліками називають форму попередника або похідного фармацевтично активної речовини, яка є менш цитотоксичною або нецитотоксичною для пухлинних клітин у порівнянні з вихідним лікарським засобом і здатна ферментативно активуватися і перетворюватися в активну або більш активну вихідну форму. Див., наприклад, Умітап, "Ргодгад5 іп Сапсег СпетоїШегару" Віоспетіса! босієїу Тгапзасійопв, 14, рр. 375-382, 615"? Мееііпод ВеїГазі (1986) і 5іеїЇа єї а!., "Ргодпдв: А Спетіса! Арргоасі ю Тагдеїєд Огид Оєїїмегу, "ОігесієйProdrugs are the form of a precursor or derivative of a pharmaceutically active substance that is less cytotoxic or non-cytotoxic to tumor cells compared to the original drug and is capable of being enzymatically activated and transformed into an active or more active original form. See, for example, Umitap, "Rgodgad5 ip Sapseg SpetoiShegaru" Viospetis! bosieiu Tgapsasiopv, 14, pp. 375-382, 615"? Meeiipod VeiGazi (1986) and 5ieiYa eyi a!., "Rgodpdv: And Spetisa! Arrgoasi yu Tagdeiied Ogyd Oeijimegu, "Oigesiye

Ота Оеїїмегу, Вогспагаї еї аї., (еа.), рр. 247-267, Нитапа Ргез5 (1985). Проліки включають, але не обмежуються ними, фосфатвмісні проліки, тіофосфатвмісні проліки, сульфатвмісні проліки, пептидвмісні пролікию, модифіковані О-амінокислотою проліки, глікозиловані проліки, р-лактамвмісні проліки, необов'язково заміщені феноксіацетамідвмісні проліки або необов'язково заміщені фенілацетамідвмісні проліки, 5-фторцитозин та інші 5-фторуридинвмісні проліки, які можуть бути перетворені у більш активний цитотоксичний вільний лікарський засіб. Приклади цитотоксичних лікарських засобів, які можуть бути дериватизовані у форму проліків для застосування тут, включають, але не обмежуються ними, хіміотерапевтичні агенти, описані вище.Ota Oeiimegu, Vogspagai ei ai., (ea.), pp. 247-267, Nytapa Rgez5 (1985). Prodrugs include, but are not limited to, phosphate-containing prodrugs, thiophosphate-containing prodrugs, sulfate-containing prodrugs, peptide-containing prodrugs, O-amino acid-modified prodrugs, glycosylated prodrugs, p-lactam-containing prodrugs, optionally substituted phenoxyacetamide-containing prodrugs, or optionally substituted phenylacetamide-containing prodrugs, 5- fluorocytosine and other 5-fluorouridine-containing prodrugs that can be converted into a more active cytotoxic free drug. Examples of cytotoxic drugs that can be derivatized into the form of prodrugs for use herein include, but are not limited to, the chemotherapeutic agents described above.

Введення і приготуванняIntroduction and preparation

Антитіла за винаходом можуть бути приготовані у вигляді фармацевтичних композицій, які містять носій, придатний для бажаного способу доставки. Придатні носії включають будь-який матеріал, що при об'єднанні з антитілами зберігає бажану активність цього антитіла і не є реактивним з імунною системою суб'єкта. Приклади включають, але не обмежуються ними, будь-який з ряду стандартних фармацевтичних носіїв, таких як стерильні забуферені фосфатом сольові розчини, бактеріостатична вода і т.п. Можуть бути використані різні водні носії, наприклад, вода, забуферена вода, 0,495 сольовий розчин, 0,390 гліцин і т.п., і вони можуть включати в себе інші білки для збільшення стабільності, такі як альбумін, ліпопротеїн, глобулін і т.д., піддані м'яким хімічним модифікаціям або т.п.Antibodies of the invention can be prepared in the form of pharmaceutical compositions that contain a carrier suitable for the desired method of delivery. Suitable carriers include any material that, when combined with an antibody, retains the desired activity of that antibody and is not reactive with the subject's immune system. Examples include, but are not limited to, any of a number of standard pharmaceutical carriers, such as sterile phosphate-buffered saline, bacteriostatic water, and the like. Various aqueous carriers may be used, such as water, buffered water, 0.495 saline, 0.390 glycine, etc., and may include other proteins to increase stability, such as albumin, lipoprotein, globulin, etc. , subjected to mild chemical modifications or the like.

Терапевтичні готові форми антитіла готують для зберігання змішуванням антитіла, що має бажаний ступінь чистоти, з необов'язковими фізіологічно прийнятними носіями, ексципієнтами або стабілізаторами (Ветіпдіоп'є Рпагтасешіїса! Зсіеєпсез 16!" еайіоп, О5ої, А. Еа. (1980)), у формі ліофілізованих готових форм або водних розчинів. Прийнятні носії, ексципієнти або стабілізатори є нетоксичними для реципієнтів при використовуваних дозах і концентраціях, і включають в себе буфери, такі як фосфат, цитрат та інші органічні кислоти; антиоксиданти, у тому числі аскорбінову кислоту і метіонін; консерванти (такі як хлорид октадецилдиметилбензиламонію; хлорид гексаметонію; хлорид бензалконію, хлорид бензетонію; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехін; резорцин; циклогексанол; З-пентанол і м-крезол); поліпептиди низької молекулярної маси (менше приблизно 10 залишків); білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, у тому числі глюкозу, манозу або декстрини; хелатоутворюючі агенти, такі як ЕДТА; цукри, такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солетворні протиіони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, комплекси 2п-білок); і/або неіоногенні поверхнево- активні речовини, такі як ТВІН"М, ПЛУРОНІКИ""м або поліетиленгліколь (ПЕГ).Therapeutic ready-made forms of antibodies are prepared for storage by mixing the antibody of the desired degree of purity with optional physiologically acceptable carriers, excipients or stabilizers (Vetipdiopye Rpagtaseshiisa! Zsieepsez 16!" eayiop, O5oi, A. Ea. (1980)), in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients at the doses and concentrations used and include buffers such as phosphate, citrate and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine ; preservatives (such as octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkylparabens such as methyl- or propylparaben; catechin; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol and m-cresol); polypeptides of low molecular weight (less than about 10 residues); proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic by limers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (for example, 2p-protein complexes); and/or nonionic surfactants, such as TWIN"M, PLURONICS""m or polyethylene glycol (PEG).

Готова форма може також містити більше однієї активної сполуки, якщо необхідно, для конкретного показання, що підлягає лікуванню, переважно сполуки з доповнюючими активностями, які не діють шкідливим чином одна на одну. Такі молекули переважно присутні у комбінації у кількостях, які ефективні для передбачуваної мети.The formulation may also contain more than one active compound, if necessary for the particular indication to be treated, preferably compounds with complementary activities that do not deleteriously interact with each other. Such molecules are preferably present in combination in amounts effective for the intended purpose.

Ці активні інгредієнти можуть бути також вміщені у мікрокапсулу, приготовану, наприклад, коацерваційними способами або міжфазовою полімеризацією, наприклад, гідроксиметилцелюлозну або желатинову мікрокапсулу і полі(метилметацилат)-мікрокапсулу, відповідно, у колоїдальних системах доставки лікарських засобів (наприклад, ліпосомах, альбумінових мікросферах, мікроемульсіях, наночастинках і нанокапсулах) або у макроемульсіях. Такі способи описані у Кетіпдіоп'є РпаптасецшіісаїThese active ingredients can also be encapsulated in a microcapsule prepared, for example, by coacervation methods or interfacial polymerization, for example, hydroxymethyl cellulose or gelatin microcapsule and poly(methyl methacylate) microcapsule, respectively, in colloidal drug delivery systems (e.g., liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or in macroemulsions. Such methods are described in Ketipdiopye Rpaptasecshiisai

Зсієпсев 16!" еайіоп, О5ої, А. Ей. (1980).Zsiepsev 16!" Eaiyop, O5oi, A. Ey. (1980).

Готові форми для застосування для введення іп мімо повинні бути стерильними. Це легко досягається фільтруванням через стерильні фільтраційні мембрани.Ready-made forms for use for the introduction of ip mimo should be sterile. This is easily achieved by filtering through sterile filter membranes.

Антитіло вводять будь-якими придатними способами, у тому числі парентеральним, підшкірним, внутрішньочеревинним, внутрішньолегеневим та інтраназальним введенням і, якщо бажано для локального лікування, введенням всередину ушкоджень. Парентеральні інфузії включають в себе внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревинне, внутрішньом'язове, інтрадермальне або підшкірне введення. Крім того, це антитіло переважно вводять імпульсною інфузією, зокрема, зі зменшуваними дозами антитіла. Переважно, дози вводять за допомогою ін'єкцій, найбільш переважно, внутрішньовенних або підшкірних ін'єкцій. Передбачаються й інші способи введення, у тому числі місцеве, зокрема, трансдермальне, трансмукозне, ректальне, пероральне або локальне введення, наприклад, через катетер, вміщений близько до бажаного сайту.The antibody is administered by any suitable route, including parenteral, subcutaneous, intraperitoneal, intrapulmonary, and intranasal administration and, if desired for local treatment, intralesional administration. Parenteral infusions include intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradermal, or subcutaneous administration. In addition, this antibody is preferably administered by pulse infusion, in particular, with decreasing doses of the antibody. Preferably, doses are administered by injection, most preferably intravenous or subcutaneous injection. Other methods of administration are contemplated, including local, in particular, transdermal, transmucosal, rectal, oral, or local administration, for example, via a catheter placed close to the desired site.

Для назального введення ці фармацевтичні готові форми і лікарські засоби можуть бути у вигляді спрею або аерозолю, що містить придатний розчинник (придатні розчинники) і необов'язково інші сполуки,For nasal administration, these pharmaceutical preparations and drugs can be in the form of a spray or aerosol containing a suitable solvent(s) and optionally other compounds,

такі як, але не тільки, стабілізатори, антимікробні агенти, антиоксиданти, модифікатори рН, поверхнево- активні речовини, модифікатори біодоступності і їх комбінації. Пропелент для аерозольної готової форми може включати в себе стиснене повітря, азот, діоксид вуглецю або низько киплячий розчинник на основі вуглеводню.such as, but not limited to, stabilizers, antimicrobial agents, antioxidants, pH modifiers, surfactants, bioavailability modifiers, and combinations thereof. The propellant for the aerosol formulation may include compressed air, nitrogen, carbon dioxide, or a low-boiling hydrocarbon-based solvent.

Ін'єктовані лікарські форми звичайно включають водні суспензії або масляні суспензії, які можуть бути приготовані з використанням придатного диспергуючого агента або зволожуючого агента і суспендуючого агента. Ін'єкційні форми можуть бути у фазі розчину або у формі суспензії, яку готують з розчинником або розріджувачем. Прийнятні розчинники або носії включають в себе стерилізовану воду, розчин Рінгера або ізотонічний водний сольовий розчин.Injectable dosage forms usually include aqueous suspensions or oil suspensions, which can be prepared using a suitable dispersing agent or wetting agent and suspending agent. Injectable forms can be in the solution phase or in the form of a suspension, which is prepared with a solvent or diluent. Acceptable solvents or carriers include sterilized water, Ringer's solution, or isotonic aqueous saline.

Для ін'єкції фармацевтична готова форма і/або лікарський засіб можуть бути порошком, придатним для відтворення з придатним розчином, як описано вище. їх приклади включають, але не обмежуються ними, ліофілізовані, висушені ротаційним сушінням або висушені розпиленням порошки, аморфні порошки, гранули, осади або тверді частинки. Для ін'єкції ці готові форми можуть необов'язково містити стабілізатори, модифікатори рН, поверхнево-активні речовини, модифікатори біодоступності і їх комбінації.For injection, the pharmaceutical formulation and/or drug may be a powder suitable for reconstitution with a suitable solution as described above. examples thereof include, but are not limited to, lyophilized, spin-dried, or spray-dried powders, amorphous powders, granules, precipitates, or solids. For injection, these ready-made forms may optionally contain stabilizers, pH modifiers, surfactants, bioavailability modifiers, and combinations thereof.

Можуть бути приготовані препарати пролонгованої дії. Придатні приклади препаратів пролонгованої дії включають напівпроникні матрикси твердих гідрофобних полімерів, що містять антитіло, причому ці матрикси знаходяться у вигляді сформованих виробів, наприклад, плівок або мікрокапсул. Приклади матриксів пролонгованої дії включають поліефіри, гідрогелі (наприклад, полі(2-гідроксіетилметакрилат) або полівініловий спирт)), полілактиди (патент США Ме3773919), співполімери /-глутамінової кислоти і етилч-ї - глутамату, недеградовані співполімери етилену і вінілацетату, деградовані співполімери молочної кислоти і гліколевої кислоти, такі як Гиргоп ОЮОероїм (ін'єктовані мікросфери, що складаються зі співполімеру молочної кислоти і гліколевої кислоти і ацетату лейпроліду), і полі-0-(-)-3-гідроксимасляна кислота. Хоча такі полімери, як етилен-вінілацетат і молочна кислота-гліколева кислота здатні виділяти молекули протягом більше 100 днів, деякі гідрогелі вивільняють білки протягом більш коротких періодів часу. Коли інкапсульовані антитіла залишаються у тілі протягом довгого часу, вони можуть денатуруватися або агрегувати у результаті впливу вологи при 37"С, приводячи до втрати біологічної активності і можливих змін в імуногенності. Можуть бути створені раціональні стратегії для стабілізації в залежності від механізму, що бере участь. Наприклад, якщо виявлено, що механізмом агрегації є утворення міжмолекулярних зв'язків 5- за допомогою заміни тіол-дисульфід, стабілізація може бути досягнута модифікацією сульфгідрильних залишків, ліофілізацією з кислих розчинів, регуляцією вмісту вологи, з використанням придатних домішок і розробкою специфічних полімерних матриксних композицій. Можуть бути використані інші стратегії, відомі у даній галузі.Prolonged action preparations can be prepared. Suitable examples of long-acting preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing an antibody, and these matrices are in the form of formed products, for example, films or microcapsules. Examples of sustained-release matrices include polyesters, hydrogels (eg, poly(2-hydroxyethyl methacrylate) or polyvinyl alcohol)), polylactides (US patent Me3773919), copolymers of /-glutamic acid and ethyl glutamate, non-degraded copolymers of ethylene and vinyl acetate, degraded copolymers lactic acid and glycolic acid, such as Gyrgop OJUOeroim (injected microspheres consisting of a copolymer of lactic acid and glycolic acid and leuprolide acetate), and poly-0-(-)-3-hydroxybutyric acid. Although polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid are able to release molecules for more than 100 days, some hydrogels release proteins for shorter periods of time. When encapsulated antibodies remain in the body for a long time, they can denature or aggregate as a result of exposure to moisture at 37°C, leading to loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. Rational strategies for stabilization can be established depending on the mechanism involved For example, if the mechanism of aggregation is found to be the formation of intermolecular bonds 5- by means of thiol-disulfide substitution, stabilization can be achieved by modification of sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solutions, regulation of moisture content, the use of suitable additives, and the development of specific polymer matrices compositions Other strategies known in the art may be used.

Готові форми за винаходом можуть бути сконструйовані таким чином, що вони є формами короткої дії, швидкого вивільнення, тривалої дії або пролонгованого вивільнення, як описано тут. Таким чином, фармацевтичні готові форми можуть бути також приготовані для регульованого вивільнення або для повільного вивільнення.Formulations of the invention may be designed to be short-acting, immediate-release, long-acting, or sustained-release forms as described herein. Thus, pharmaceutical formulations can also be prepared for controlled release or for slow release.

Дані композиції можуть також містити, наприклад, міцели або ліпосоми, або деяку іншу інкапсульовану форму, або можуть вводитися у формі пролонгованого вивільнення для забезпечення пролонгованого зберігання і/або дії, що доставляє. Таким чином, фармацевтичні готові форми і лікарські засоби можуть бути спресовані у гранули або циліндри та імплантовані внутрішньом'язово або підшкірно у вигляді депо- ін'єкцій або у вигляді імплантатів, таких як стенти. Такі імплантати можуть використовувати інертні матеріали, такі як силікони і біодеградовані полімери.These compositions may also contain, for example, micelles or liposomes, or some other encapsulated form, or may be administered in a sustained release form to provide prolonged storage and/or delivery action. Thus, pharmaceutical formulations and drugs can be compressed into pellets or cylinders and implanted intramuscularly or subcutaneously as depot injections or as implants such as stents. Such implants can use inert materials such as silicones and biodegradable polymers.

Поряд з цими репрезентативними лікарськими формами, описаними вище, фармацевтично прийнятні ексципієнти і носії звичайно відомі кваліфікованим у даній галузі фахівцям і, отже, включені у даний винахід.Along with these representative dosage forms described above, pharmaceutically acceptable excipients and carriers are commonly known to those skilled in the art and are therefore included in the present invention.

Такі ексципієнти і носії описані, наприклад, у керівництві "Кетіпдіоп5 Рпаптасешіса! 5сіепсез" Маск Риб.Such excipients and carriers are described, for example, in the guide "Ketipdiop5 Rpaptaseshisa! 5siepsez" Musk Ryb.

Со., Мему дегзеу (1991), що включене сюди як посилання.Co., Memu degzeu (1991), incorporated herein by reference.

Конкретні дози можуть коригуватися в залежності від станів захворювання, віку, маси тіла, загального стану здоров'я, генотипу, статі і дієти суб'єкта, інтервалів доз, способів введення, швидкості екскреції і комбінацій лікарських засобів. Будь-які з наведених вище лікарських форм, що містять ефективні кількості, знаходяться у межах рутинного експериментування і, отже, знаходяться в обсязі даного винаходу.Specific doses may be adjusted depending on disease states, age, body weight, general health, genotype, sex and diet of the subject, dose intervals, methods of administration, rate of excretion and drug combinations. Any of the above dosage forms containing effective amounts are within the scope of routine experimentation and are therefore within the scope of this invention.

Антитіла за винаходом часто будуть готуватися без інших природних імуноглобулінів або інших біологічних молекул. Переважні антитіла будуть також проявляти мінімальну токсичність при введенні ссавцю, ураженому раком або схильному до виникнення раку.Antibodies of the invention will often be prepared without other natural immunoglobulins or other biological molecules. Preferred antibodies will also exhibit minimal toxicity when administered to a mammal affected by cancer or susceptible to cancer.

Композиції за винаходом можуть бути стерилізовані звичайними, добре відомими способами стерилізації. Одержані розчини можуть бути упаковані для застосування або відфільтровані в асептичних умовах і ліофілізовані, причому ліофілізований препарат об'єднують зі стерильним розчином перед введенням. Ці композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, необхідні для наближення до фізіологічних умов, такі як агенти, що коригують рН і забуферюють, агенти, що коригують тонічність, і т.п., наприклад, ацетат натрію, лактат натрію, хлорид натрію, хлорид калію, хлорид кальцію і стабілізатори (наприклад, 1-2095 мальтоза і т.д.).Compositions according to the invention can be sterilized by conventional, well-known methods of sterilization. The resulting solutions can be packaged for use or filtered under aseptic conditions and lyophilized, and the lyophilized drug is combined with a sterile solution before administration. These compositions may contain pharmaceutically acceptable excipients necessary to approximate physiological conditions, such as pH-adjusting and buffering agents, tonicity-adjusting agents, and the like, e.g., sodium acetate, sodium lactate, sodium chloride, chloride potassium, calcium chloride and stabilizers (for example, 1-2095 maltose, etc.).

Антитіла за винаходом можуть також вводитися за допомогою ліпосом, які є малими пухирцями, що складаються з різних типів ліпідів і/або фосфоліпідів, і/або поверхнево-активної речовини, які застосовні для доставки лікарського засобу (такого як описані тут антитіла і, необов'язково, хіміотерапевтичного агента). Ліпосоми включають емульсії, піноподібні речовини, міцели, нерозчинні моношари, фосфоліпідні дисперсії, ламелярні шари і т.п. і можуть служити як носії для націлювання антитіл на конкретну тканину, а також для збільшення напівперіоду існування цієї композиції. Доступні різні способи одержання ліпосом, описані, наприклад, у патентах США з номерами 4837028 і 5019369, які включені сюди як посилання.Antibodies of the invention may also be administered via liposomes, which are small vesicles composed of various types of lipids and/or phospholipids, and/or surfactants, which are suitable for drug delivery (such as the antibodies described herein and optionally necessarily, a chemotherapeutic agent). Liposomes include emulsions, foamy substances, micelles, insoluble monolayers, phospholipid dispersions, lamellar layers, etc. and can serve as carriers for targeting antibodies to a specific tissue, as well as to increase the half-life of this composition. Various methods of obtaining liposomes are available, described, for example, in US Patent Nos. 4,837,028 and 5,019,369, which are incorporated herein by reference.

Ліпосоми, що містять це антитіло, готують способами, відомими у даній галузі, такими як описані вLiposomes containing this antibody are prepared by methods known in the art, such as those described in

Ерзівїп вї а/., Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА 82:3688 (1985); Нуапо еї а!., Ргос. Маї! Асад. 5сі. ОБА 77:4030 (1980); і патентах США з номерами 4485045 і 4544545. Ліпосоми зі збільшеним часом циркуляції описані у патентіErzivyp vy a/., Rhos. May). Asad 5 BOTH 82:3688 (1985); Nuapo eyi a!., Rgos. Mai! Asad 5 OBA 77:4030 (1980); and US Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545. Liposomes with increased circulation time are described in Pat.

США Мо5013556. Особливо застосовні ліпосоми можуть бути генеровані способом випарювання з оберненою фазою з ліпідною композицією, що містить фосфатидилхолін, холестерин і ПЕГ- дериватизований фосфатидилетаноламін (ПЕГ-ФЕ). Ліпосоми екструдують через фільтри з визначеним розміром пор для одержання ліпосом з бажаним діаметром. Рар'-фрагменти антитіла за даним винаходом можуть бути кон'юговані з ліпосомами, як описано у Мапінп еї аї., 9. Віої. Спет. 257 :286-288 (1982), реакцією дисульфідного взаємообміну. Хіміотерапевтичний агент (такий як доксорубіцин) необов'язково міститься у ліпосомі Ідив., наприклад, Сабі2оп еї аї., У. Майопаї! Сапсег Іпв5ії. 81(19): 1484 (1989).USA Mo5013556. Particularly applicable liposomes can be generated by reverse phase evaporation with a lipid composition containing phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE). Liposomes are extruded through filters with a defined pore size to obtain liposomes with the desired diameter. Rar'-fragments of the antibody according to the present invention can be conjugated with liposomes, as described in Mapinp ei ai., 9. Vioi. Spent 257 :286-288 (1982), by a disulfide exchange reaction. A chemotherapeutic agent (such as doxorubicin) is optionally contained in a liposome. See, for example, Sabi2op ei ai., U. Maiopai! Sapseg Ipv5ii. 81(19): 1484 (1989).

Концентрація антитіла у цих композиціях може широко варіюватися, тобто від менше приблизно 1095, звичайно щонайменше приблизно 2595, до 7595 або 9095 за масою і буде вибиратися спочатку за обсягами рідини, в'язкістю і т.д., відповідно до конкретного вибраного способу введення. Фактичні способи приготування композицій, що вводяться перорально, місцево і парентерально, будуть відомі або очевидні кваліфікованим у даній галузі фахівцям і описані докладно у Ветіпдіоп'є Рпапгтасешііса! бсіепсе, 1917 єй.,The concentration of the antibody in these compositions can vary widely, that is, from less than about 1095, usually at least about 2595, to 7595 or 9095 by weight and will be selected first by liquid volumes, viscosity, etc., according to the particular method of administration selected. Actual methods of preparation of orally, topically, and parenterally administered compositions will be known or apparent to those skilled in the art and are described in detail in Vetipdiopie Rpagptaseshiisa! bsiepse, 1917

Маск Рибіїзпіпд Со., Еавюп, РА (1995), включеному сюди як посилання.Musk Rybiizpd So., Eavyup, RA (1995), incorporated herein by reference.

Визначення ефективної кількості композиції за винаходом для лікування захворювання у пацієнта може виконуватися стандартними емпіричними способами, які добре відомі у даній галузі.Determining an effective amount of a composition of the invention to treat a disease in a patient can be performed by standard empirical methods well known in the art.

Композиції за винаходом вводять ссавцю, який вже страждає від раку або схильний до раку, або, який знаходиться при ризику раку, наприклад, молочної залози, передміхурової залози або легені, у кількості, достатній для запобігання або щонайменше часткової затримки розвитку захворювання. Кількість, достатня для виконання цього, визначається як «терапевтично ефективна доза». Ефективні кількості антитіла будуть варіюватися в залежності від тяжкості захворювання і маси, і загального стану пацієнта, який підлягає лікуванню, але звичайно будуть знаходитися у діапазоні приблизно 1,0 мкг/кг - приблизно 100 мг/кг маси тіла. Зразкові дози можуть знаходитися у діапазоні приблизно 10 мкг/кг - приблизно ЗОмг/кг або приблизно 0,1 мг/кг - приблизно 20 мг/кг, або приблизно 1 мг/кг - приблизно 10 мг/кг на одне застосування. Антитіло може також вводитися у дозах на площу поверхні (наприклад, до 4,5 г/квадратний метр). Інші зразкові дози антитіла включають 8 г у цілому при однократному введенні (при масі тіла 80 кг або площі поверхні тіла 1,8 квадратних метрів).The compositions of the invention are administered to a mammal already suffering from or predisposed to cancer, or at risk of cancer, such as breast, prostate or lung, in an amount sufficient to prevent or at least partially delay the development of the disease. The amount sufficient to accomplish this is defined as a "therapeutically effective dose." Effective amounts of antibody will vary depending on the severity of the disease and the weight and general condition of the patient to be treated, but will usually be in the range of about 1.0 mcg/kg to about 100 mg/kg of body weight. Exemplary doses may range from about 10 μg/kg to about 30 mg/kg, or from about 0.1 mg/kg to about 20 mg/kg, or from about 1 mg/kg to about 10 mg/kg per administration. The antibody can also be administered in doses per surface area (eg, up to 4.5 g/square meter). Other exemplary antibody doses include a total of 8 g in a single administration (at a body weight of 80 kg or a body surface area of 1.8 square meters).

Введення може виконуватися будь-якими способами, відомими у даній галузі. Наприклад, антитіло може бути введене одним або декількома окремими болюсними введеннями або короткочасною або довгостроковою інфузією протягом періоду, наприклад, 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120 або більше хвилин. Після початкового періоду лікування і в залежності від реакції пацієнта і перенесення цієї терапії пацієнтом, можуть вводитися підтримуючі дози, наприклад, один раз на тиждень, один раз на два тижні, кожні З тижні, кожні 4 тижні, один раз на місяць, один раз на два місяці, кожні З місяці або кожні 6 місяців, якщо необхідно, для підтримки реакції пацієнта. Можуть бути необхідні більш часті дози, доки не відбувається бажана супресія симптомів захворювання, і дози можуть коригуватися у міру необхідності. Прогрес цієї терапії можна легко піддавати моніторингу загальноприйнятими способами і аналізами. Ця терапія може проводитися протягом визначеного періоду або може бути тривалою і тривати протягом періоду років, доки хвороба не прогресує або не наступає смерть.The introduction may be performed by any means known in the art. For example, the antibody can be administered by one or more separate bolus administrations or by short-term or long-term infusion over a period of, for example, 5, 10, 15, 30, 60, 90, 120 or more minutes. After the initial period of treatment and depending on the patient's response and the patient's tolerance of this therapy, maintenance doses may be administered, for example, once a week, once every two weeks, every 3 weeks, every 4 weeks, once a month, once a bimonthly, every 3 months, or every 6 months as needed to maintain the patient's response. More frequent doses may be required until the desired suppression of disease symptoms occurs, and doses may be adjusted as necessary. The progress of this therapy can be easily monitored by conventional methods and analyses. This therapy may be given for a specified period or may be prolonged and continue for a period of years until the disease progresses or death occurs.

Можуть проводитися однократні або множинні введення цих композицій з рівнями доз і схемами, що вибираються лікарем. Для попередження або лікування захворювання придатна доза антитіла буде залежати від типу захворювання, що підлягає лікуванню, як визначено вище, тяжкості і перебігу цього захворювання, від того, вводять це антитіло для превентивних або терапевтичних цілей, попередньої терапії, історії хвороби пацієнта і реакції на антитіло, і від думки лікаря. Антитіло придатним чином вводять пацієнту один раз або протягом ряду введень.Single or multiple administrations of these compositions may be administered at dosage levels and schedules selected by the physician. For the prevention or treatment of disease, the appropriate dose of antibody will depend on the type of disease to be treated as defined above, the severity and course of the disease, whether the antibody is being administered for preventive or therapeutic purposes, prior therapy, the patient's medical history, and response to the antibody. , and from the doctor's opinion. The antibody is suitably administered to the patient once or over a series of administrations.

У будь-якому випадку готова форма повинна забезпечувати кількість терапевтичного антитіла протягом часу, достатнього для прояву бажаної біологічної активності, наприклад, запобігання або мінімізації тяжкості раку. Композиції даного винаходу можуть вводитися окремо або у вигляді допоміжної терапії разом з іншими терапевтичними засобами, відомими у даній галузі для лікування таких захворювань.In any case, the finished form should provide an amount of the therapeutic antibody for a period of time sufficient to exert the desired biological activity, such as preventing or minimizing the severity of cancer. The compositions of this invention may be administered alone or as adjunctive therapy together with other therapeutic agents known in the art for the treatment of such diseases.

Композиція антитіл може бути приготована, дозована і введена відповідно до хорошої медичної практики. Фактори, які необхідно враховувати у цьому контексті, включають конкретний стан, що підлягає лікуванню, конкретного ссавця, який підлягає лікуванню, клінічний стан індивідуального пацієнта, причину порушення, місце доставки агента, спосіб введення, схему введення та інші фактори, відомі медикам- практикам. Терапевтично ефективна кількість антитіла, що вводиться, буде визначатися такими міркуваннями і є мінімальною кількістю, необхідною для профілактики, ослаблення або лікування мішень- опосередкованого захворювання, стану або порушення. Така кількість переважно менша кількості, що є токсичною або робить хазяїна більш чутливим до інфекцій.The antibody composition can be prepared, dosed and administered in accordance with good medical practice. Factors to be considered in this context include the particular condition to be treated, the particular mammal to be treated, the clinical condition of the individual patient, the cause of the disorder, the site of delivery of the agent, the method of administration, the schedule of administration, and other factors known to the medical practitioner. A therapeutically effective amount of antibody administered will be determined by such considerations and is the minimum amount necessary to prevent, attenuate, or treat a target-mediated disease, condition, or disorder. This amount is preferably less than the amount that is toxic or makes the host more susceptible to infection.

Антитіло готують іноді, але не в обов'язковому порядку, з одним або декількома агентами, використовуваними у наш час для профілактики або лікування порушення, що розглядається. Ефективна кількість таких інших агентів залежить від кількості антитіла, що присутнє у готовій формі, типу захворювання, стану або порушення та інших факторів, обговорюваних вище. їх звичайно використовують у тих самих дозах і з тими самими способами введення, які використовуються тут вище, або при приблизно 1- 99905 дотепер використовуваних доз.The antibody is sometimes, but not necessarily, prepared with one or more agents currently used to prevent or treat the disorder in question. The effective amount of such other agents depends on the amount of antibody present in the formulation, the type of disease, condition or disorder, and other factors discussed above. they are usually used in the same doses and with the same methods of administration as used hereinabove, or at approximately 1-99905 of the doses used heretofore.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу забезпечений виріб, що містить матеріали, застосовні для лікування розглянутого стану. Цей виріб включає контейнер і етикетку. Придатні контейнери включають, наприклад, склянки, флакони, шприци і тест-пробірки. Контейнери можуть бути виготовлені з різних матеріалів, таких як скло і пластик. Контейнер містить композицію, яка є ефективною для лікування розглянутого стану і може мати стерильний отвір доступу (наприклад, контейнер може бути мішком для внутрішньовенного розчину або флаконом, що має кришку, яка проколюється голкою для гіпотермічних ін'єкцій). Активним агентом у композиції є антитіло за даним винаходом. Етикетка на контейнері або зв'язана з контейнером вказує, що дану композицію використовують для лікування вибраного стану. Виріб може додатково містити другий контейнер, що містить другий терапевтичний агент (у тому числі будь-який з других терапевтичних агентів для обговорюваних тут або відомих у даній галузі захворювань). Виріб може додатково містити інший контейнер, що містить фармацевтично прийнятний буфер, такий як забуферений фосфатом сольовий розчин, розчин Рінгера або розчин декстрози, для відтворення ліофілізованої форми антитіла. Він може додатково містити інші матеріали, бажані з комерційної точки зору і з погляду користувача, у тому числі інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприци і вкладиші упаковки з інструкціями для використання.In another embodiment of the present invention, an article containing materials applicable to the treatment of the condition in question is provided. This product includes a container and label. Suitable containers include, for example, beakers, vials, syringes and test tubes. Containers can be made of different materials, such as glass and plastic. The container contains a composition that is effective in treating the condition in question and may have a sterile access port (eg, the container may be a bag for an intravenous solution or a vial having a cap that is pierced by a needle for hypothermic injections). The active agent in the composition is an antibody according to the present invention. A label on or associated with the container indicates that the composition is used to treat the selected condition. The article may further include a second container containing a second therapeutic agent (including any of the second therapeutic agents for diseases discussed herein or known in the art). The product may additionally contain another container containing a pharmaceutically acceptable buffer, such as phosphate-buffered saline, Ringer's solution, or dextrose solution, to reproduce the lyophilized form of the antibody. It may additionally contain other commercially and user desirable materials, including other buffers, diluents, filters, needles, syringes and package inserts with instructions for use.

ІмунотерапіяImmunotherapy

Антитіла, застосовні у лікуванні пацієнтів, які мають рак, включають антитіла, які здатні ініціювати сильну імунну реакцію проти пухлини, і антитіла, які здатні націлювати цитотоксичність. Антитіла, кон'юговані з цитотоксичними агентами, можуть бути використані для націлювання цитотоксичних агентів на пухлинні тканини, що експресують РКІК. Альтернативно, антитіла можуть індукувати лізис пухлинних клітин за допомогою механізмів комплемент-опосередкованої або антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АОСС), обидва з яких потребують інтактної Ес-частини молекули імуноглобуліну для взаємодії з Ес-рецепторними сайтами ефекторних клітин або білками комплементу. Крім того, антитіла, які проявляють пряму біологічну дію на ріст пухлин, застосовні у практиці даного винаходу. Потенційні механізми, за допомогою яких можуть діяти такі безпосередньо цитотоксичні антитіла, включають в себе інгібування росту клітин, модуляцію клітинного диференціювання, модуляцію профілів фактора ангіогенезу пухлини та індукцію апоптозу. Механізм, за допомогою якого конкретне антитіло проявляє свою протипухлинну дію, може оцінюватися будь-яким числом аналізів іп мійго, розроблених для визначенняAntibodies useful in the treatment of patients who have cancer include antibodies that are capable of initiating a strong immune response against the tumor and antibodies that are capable of targeting cytotoxicity. Antibodies conjugated to cytotoxic agents can be used to target cytotoxic agents to tumor tissues expressing RKIK. Alternatively, antibodies can induce tumor cell lysis through complement-mediated or antibody-dependent cellular cytotoxicity (AOSS) mechanisms, both of which require an intact Es portion of the immunoglobulin molecule to interact with Es receptor sites on effector cells or complement proteins. In addition, antibodies that have a direct biological effect on tumor growth are applicable in the practice of this invention. Potential mechanisms by which such directly cytotoxic antibodies may act include inhibition of cell growth, modulation of cellular differentiation, modulation of tumor angiogenesis factor profiles, and induction of apoptosis. The mechanism by which a particular antibody exerts its antitumor activity can be assessed by any number of immunoassays designed to determine

АрсСсС, АОММС, комплемент-опосередкованого лізису клітин і т.д., як звичайно відомо у даній галузі.ArsSsS, AOMMS, complement-mediated cell lysis, etc., as is commonly known in the art.

В одному варіанті здійснення імунотерапію проводять з використанням антитіл, які зв'язуються з РК К та інгібують активацію РЕ ЕК.In one embodiment, immunotherapy is carried out using antibodies that bind to RK K and inhibit the activation of RE EC.

Анти-РАЇ В-антитіла можуть вводитися в їх «голій» або некон'югованій формі або можуть бути кон'юговані безпосередньо з іншими терапевтичними або діагностичними агентами, або можуть бути кон'юговані безпосередньо з полімерами-носіями, що містять такі інші терапевтичні або діагностичні агенти.Anti-RAI B antibodies may be administered in their "naked" or unconjugated form, or may be conjugated directly to other therapeutic or diagnostic agents, or may be conjugated directly to carrier polymers containing such other therapeutic or diagnostic agents. diagnostic agents.

Антитіла можуть бути детектовано мічені з використанням радіоізотопів, афінних міток (таких як біотин, авідин і т.д.), ферментативних міток (таких як пероксидаза хрону, лужна фосфатаза і т.д.), флуоресцентних або люмінесцентних міток (таких як РІТС або родамін і т.д.), парамагнітних атомів і т.п. Процедури для виконання такого мічення добре відомі у даній галузі; наприклад, див. (Зіегпрегдег, Г.А. еї аї., У. Нізоспет.Antibodies can be detectably labeled using radioisotopes, affinity labels (such as biotin, avidin, etc.), enzymatic labels (such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), fluorescent or luminescent labels (such as RITS or rhodamine, etc.), paramagnetic atoms, etc. Procedures for performing such labeling are well known in the art; for example, see (Ziegpregdeg, G.A. ei ai., U. Nizospet.

Суюспет. 18:315 (1970); Вауег, Е.А. еї а)І., Мей. Епгут. 62:308 (1979); Еподмаї, Е. єї аї., Іттипої!. 109:129 (1972); Содіпо, УМ. У. Іттипої. Мей. 13:215 (1976)).Suyuspet 18:315 (1970); Vaueg, E.A. her a)I., May. Epgut. 62:308 (1979); Epodmai, E. eyi ai., Ittipoi!. 109:129 (1972); Sodipo, UM. U. Ittipoi. May 13:215 (1976)).

Кон'югація частин антитіл описана у патенті США Мо 6306393. Загальні способи описані також у Зпій еї а., Іпі. У. Сапсег 41:832-839 (1988); ПІП еї аї., Іпі. У. Сапсег 46:1101-1106 (1990); і піп еї аІ., патенті США Ме 5057313. Цей загальний спосіб включає в себе реакцію компонента-антитіла, що має окиснену вуглеводну частину, з полімером-носієм, який має щонайменше одну вільну амінокислотну групу і який завантажений множиною лікарських засобів, токсинів, хелаторів, борвмісних адендів (домішок) або іншим терапевтичним агентом. Ця реакція приводить до утворення початкового зв'язку основи Шифа (імінової), яка може бути стабілізована відновленням до вторинного аміну з утворенням кінцевого кон'югату.Conjugation of parts of antibodies is described in US patent No. 6306393. General methods are also described in Zpii ei a., Ipi. U. Sapseg 41:832-839 (1988); PIP ei ai., Ipi. U. Sapseg 46:1101-1106 (1990); and Pipei A.I., US Patent No. 5,057,313. This general method involves the reaction of an antibody component having an oxidized carbohydrate moiety with a carrier polymer that has at least one free amino acid group and that is loaded with a variety of drugs, toxins, chelators , boron-containing addends (admixtures) or another therapeutic agent. This reaction leads to the formation of the initial bond of the Schiff base (imine), which can be stabilized by reduction to the secondary amine to form the final conjugate.

Цей полімер-носій може бути, наприклад, амінодекстраном або поліпептидом щонайменше з 50 амінокислотних залишків. У даній галузі відомі різні способи кон'югації лікарського засобу або іншого агента з полімером-носієм. Поліпептидний носій може бути використаний замість амінодекстрану, але цей поліпептидний носій повинен мати щонайменше 50 амінокислотних залишків у ланцюзі, переважно 100- 5000 амінокислотних залишків. Щонайменше декілька амінокислот повинні бути залишками лізину або залишками глутамату, або аспартату. Аміногрупи бічних ланцюгів лізину і карбоксилати бічних ланцюгів глутаматних або аспартатних залишків зручні для приєднання лікарського засобу, токсину, імуномодулятора, хелатора, борвмісного аденду або іншого терапевтичного агента. Приклади придатних поліпептидних носіїв включають в себе полілізин, поліглутамінову кислоту, поліаспарагінову кислоту, їх співполімери і змішані полімери цих амінокислот та інших, наприклад, серпнів, для надання бажаних властивостей розчинності одержаному навантаженому носію і кон'югату.This carrier polymer can be, for example, aminodextran or a polypeptide of at least 50 amino acid residues. Various methods of conjugation of a drug or other agent with a carrier polymer are known in the art. A polypeptide carrier can be used instead of aminodextran, but this polypeptide carrier must have at least 50 amino acid residues in the chain, preferably 100-5000 amino acid residues. At least a few amino acids must be lysine residues or glutamate or aspartate residues. Amino groups of side chains of lysine and carboxylates of side chains of glutamate or aspartate residues are convenient for attaching a drug, toxin, immunomodulator, chelator, boron-containing addendum or other therapeutic agent. Examples of suitable polypeptide carriers include polylysine, polyglutamic acid, polyaspartic acid, their copolymers and mixed polymers of these amino acids and others, such as August, to provide the desired solubility properties to the resulting loaded carrier and conjugate.

Альтернативно, кон'юговані антитіла можуть бути одержані прямим кон'югуванням компонента-антитіла з терапевтичним агентом. Загальна процедура аналогічна непрямому способу кон'югації, за винятком того, що терапевтичний агент безпосередньо приєднують до окисненого компонента антитіла. Наприклад, вуглеводна частина антитіла може бути приєднана до поліетиленгліколю для подовження періоду напівжиття.Alternatively, conjugated antibodies can be obtained by direct conjugation of the antibody component with a therapeutic agent. The general procedure is similar to the indirect method of conjugation, except that the therapeutic agent is directly attached to the oxidized component of the antibody. For example, the carbohydrate part of the antibody can be attached to polyethylene glycol to extend the half-life period.

Альтернативно, терапевтичний агент може бути приєднаний до шарнірної області відновленого компонента-антитіла через утворення дисульфідного зв'язку або з використанням гетеробіфункціонального зшивального агента (крос-лінкера), такого як М-сукциніл-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (5РОР). Ми еї аї., п. 9.Alternatively, the therapeutic agent can be attached to the hinge region of the reconstituted antibody component through the formation of a disulfide bond or using a heterobifunctional crosslinker (crosslinker), such as M-succinyl-3-(2-pyridyldithio)propionate (5POP). We ei ai., p. 9.

Сапсег 56:244 (1994). Загальні способи такої кон'югації добре відомі у даній галузі. Див., наприклад, Ууопод,Sapseg 56:244 (1994). General methods of such conjugation are well known in the art. See, for example, Uuopod,

Спетівігу ОГ Ргоїєїп Сопіидайоп апа Стго55-Ііпкіпд (САС Ргез5 1991); Орезіасів еї аї., "Моайсайоп оїSpetivigu OG Rgoieip Sopiydayop apa Stgo55-Iipkipd (SAS Rgez5 1991); Oreziasov ei ai., "Moaisayop oi

Апіїродієх Бу Спетіса! Меїйоав", іп Мопосіопа! Апіїродієв: Ргіпсірієз апа Арріїсайопв, Вігсп еї а. (єдв.), раде5 187-230 (УМЛівєу-і ів5, Іпс. 1995); Ріісе, "Ргодисіоп апа Снагасіегігайноп ої 5упіпеїййс Реріїде-Оегмеа Апіїроадієв", іп Мопосіопа! Апіїродієв: Ргодисійп, Епіпеегппд апа Сіїпіса! Арріїсайоп, Нійег еї аїЇ. (едв5.), радез 60-84 (Сатбгіаде Опімег:йу Ргез5 1995). Різні біфункціональні агенти зв'язування білків відомі у даній галузі, такі як М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіол)пропіонат (5РОР), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоефірів (такі як диметиладипімідат-НСЇІ), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаровий альдегід), біс-азидосполуки (такі як біс-(п-азидобензоїл)гександіамін), похідні біс-діазонію (такі як біс-(п-діазонійбензоїл)етилендіамін), діїзоціанати (такі як толуол-2,6-дііззоціанат) і біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол).Apiirodiech Bu Spetis! Meiyoav", ip Moposiopa! Apiirodiev: Rgipsiriez apa Arriisaiopv, Vigsp ei a. (Jed.), rade5 187-230 (UMLiveu-i iv5, Ips. 1995); Riise, "Rhodisiop apa Snagasiegigainop oi 5upipeiiys Reriide-Oegmea Apiiroadiev", ip Moposiopa! Apiriodiev: Rhodisip, Epipeegppd apa Siipisa! Arriisaip, Niyeg ei aiY. (edv5.), radez 60-84 (Satbgiade Opimeg:yu Rgez5 1995). Various bifunctional protein binding agents are known in the art, such as M -succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate (5POP), iminothiolane (IT), bifunctional derivatives of imidoethers (such as dimethyl adipimidate-HCII), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis- azido compounds (such as bis-(p-azidobenzoyl)hexanediamine), bis-diazonium derivatives (such as bis-(p-diazoniumbenzoyl)ethylenediamine), diisocyanates (such as toluene-2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds ( such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene).

Нарешті, можуть бути сконструйовані злиті білки, які містять одну або декілька частин молекули анти-Finally, fusion proteins can be constructed that contain one or more parts of the anti-

РАЇ В-антитіла та інший поліпептид. Способи одержання злитих білків антитіл добре відомі у даній галузі.RAI B-antibodies and another polypeptide. Methods for obtaining antibody fusion proteins are well known in the art.

Див., наприклад, патент США Мо 6306393. Злиті білки антитіл, що містять інтерлейкін-2-частину молекули, описані Воїеїїі еї а!І., Апп. Опсої. 6:945 (1995), Місоїгеї еї аІ., Сапсег Сепе ТПег. 2:161 (1995), ВескКег еї а!., Ргос.See, for example, US patent No. 6,306,393. Antibody fusion proteins containing the interleukin-2 portion of the molecule are described in Voiely et al., App. Opsoi 6:945 (1995), Misoigei ei aI., Sapseg Sepe TPeg. 2:161 (1995), VeskKeg ei a!., Rhos.

Маї! Асад. сі. ОБА 93:7826 (1996), Напк еї а/!., Сіїп. Сапсег ВНез. 2:1951 (1996) і Ни ег а. Сапсег Ке5. 56:4998 (1996).Mai! Asad si. OBA 93:7826 (1996), Napk eyi a/!., Siip. Sapseg VNez. 2:1951 (1996) and Ny eg a. Sapseg Ke5. 56:4998 (1996).

В одному варіанті здійснення антитіла за винаходом використовують як радіосенсибілізатор. У таких варіантах здійснення ці антитіла кон'югують з радіосенсибілізуючим агентом. Термін «радіосенсибілізатор» у даному контексті визначається як молекула, переважно низькомолекулярна молекула, що вводиться тваринам у терапевтично ефективній кількості для збільшення чутливості цих клітин до перетворення у клітини, радіосенсибілізовані до електромагнітної радіації і/або до стимуляції лікування захворювань, які лікують електромагнітним випромінюванням. Захворювання, які можуть лікуватися електромагнітним випромінюванням, включають в себе неопластичні захворювання, доброякісні і злоякісні пухлини і ракові клітини.In one embodiment, the antibodies of the invention are used as a radiosensitizer. In such embodiments, these antibodies are conjugated with a radiosensitizing agent. The term "radiosensitizer" in this context is defined as a molecule, preferably a low molecular weight molecule, that is administered to animals in a therapeutically effective amount to increase the sensitivity of these cells to become cells radiosensitized to electromagnetic radiation and/or to stimulate the treatment of diseases that are treated with electromagnetic radiation. Diseases that can be treated with electromagnetic radiation include neoplastic diseases, benign and malignant tumors and cancer cells.

Терміни «електромагнітне випромінювання» і «випромінювання» включають, у даному контексті, але не обмежуються ним, опромінення, що має довжину хвилі 1020-1000 метрів. Переважні варіанти даного винаходу використовують електромагнітне випромінювання: гамма-випромінювання (1020-1073 м), рентгенівське випромінювання (1072-1093 м), ультрафіолетове світло (10 нм-400 нм), видиме світло (400 нм- 700 нм), інфрачервоне випромінювання (700 нм-1,0 мм) і мікрохвильове випромінювання (1 мм-30 см).The terms "electromagnetic radiation" and "radiation" in this context include, but are not limited to, radiation having a wavelength of 1020-1000 meters. Preferred variants of this invention use electromagnetic radiation: gamma radiation (1020-1073 m), X-ray radiation (1072-1093 m), ultraviolet light (10 nm-400 nm), visible light (400 nm-700 nm), infrared radiation ( 700 nm-1.0 mm) and microwave radiation (1 mm-30 cm).

Відомо, що радіосенсибілізатори збільшують чутливість ракових клітин до токсичних дій електромагнітного випромінювання. Багато протоколів лікування раку використовують у наш час радіосенсибілізатори, що активуються електромагнітним випромінюванням рентгенівських променів.It is known that radiosensitizers increase the sensitivity of cancer cells to the toxic effects of electromagnetic radiation. Many cancer treatment protocols nowadays use radiosensitizers activated by the electromagnetic radiation of X-rays.

Приклади радіосенсибілізаторів, що активуються рентгенівським випромінюванням, включають, але не обмежуються ними, наступні: метронідазол, мізонідазол, десметилмізонідазол, пімонідазол, етанідазол, німоразол, мітоміцин С, КО 1069, 5Е 4233, ЕО9, ЕВ 6145, нікотинамід, 5-бромдезоксіуридин (ШАР), 5- йоддезоксіуридин (Шк), бромдезоксицитидин, фтордезоксіуридин (Рак), гідроксисечовину, цисплатин і їх терапевтично ефективні аналоги і похідні.Examples of radiosensitizers activated by X-ray radiation include, but are not limited to, the following: metronidazole, misonidazole, desmethylmisonidazole, pimonidazole, etanidazole, nimorazole, mitomycin C, KO 1069, 5E 4233, EO9, EB 6145, nicotinamide, 5-bromodeoxyuridine (SHA ), 5- iododeoxyuridine (Shk), bromodeoxycytidine, fluorodeoxyuridine (Rak), hydroxyurea, cisplatin and their therapeutically effective analogs and derivatives.

Фотодинамічна терапія (РОТ) раку використовує видиме світло як радіаційний активатор сенсибілізуючого агента. Приклади фотодинамічних радіосенсибілізаторів включають, але не обмежуються ними: похідні гематопорфірину, Фотофрині(і), похідні бензопорфірину МРеб, олово-етіопорфірин (5пЕТ2), феоборбід-а, бактеріохлорофіл-а, нафталоціаніни, фталоціаніни, цинк-фталоціанін і їх терапевтично ефективні аналоги і похідні.Photodynamic therapy (PDT) of cancer uses visible light as a radiation activator of a sensitizing agent. Examples of photodynamic radiosensitizers include, but are not limited to: hematoporphyrin derivatives, Photophrin(s), MReb benzoporphyrin derivatives, tin-etioporphyrin (5pET2), pheoborbide-a, bacteriochlorophyll-a, naphthalocyanines, phthalocyanines, zinc phthalocyanine and their therapeutically effective analogs and derivatives

В іншому варіанті здійснення це антитіло може бути кон'юговане з рецептором (таким як стрептавідин) для використання у попередньому націлюванні на пухлину, в якому кон'югат антитіло-рецептор вводять пацієнту з подальшим видаленням незв'язаного кон'югату з кровотоку з використанням агента кліренсу і потім введенням ліганду (наприклад, авідину), що кон'югований з цитотоксичним агентом (наприклад, радіонуклідом). "Міткою" називають сполуку, що детектується, або композицію, що детектується, яка кон'югована прямо або опосередковано з антитілом. Ця мітка сама може бути детектована (наприклад, радіоізотопна мітка або флуоресцентні мітки) або, у випадку ферментної мітки, може каталізувати хімічну зміну субстратної сполуки або композиції, яка є такою, що детектується. Альтернативно, ця мітка може бути сама такою, що не детектується, але може бути елементом, що зв'язується іншим агентом, який є таким, що детектується (наприклад, міткою-епітопом або одним з пари партнерів зв'язування, такою як біотин-авідин, і т.д.). Таким чином, антитіло може містити мітку або "тег", які полегшують його виділення, і способи даного винаходу для ідентифікації антитіл включають в себе стадію виділення даного антитіла через взаємодію з цією міткою або тегом.In another embodiment, this antibody may be conjugated to a receptor (such as streptavidin) for use in pretargeting a tumor, in which the antibody-receptor conjugate is administered to the patient followed by removal of the unbound conjugate from the bloodstream using an agent clearance and then the introduction of a ligand (for example, avidin) conjugated with a cytotoxic agent (for example, a radionuclide). A "label" is a detectable compound or a detectable composition that is conjugated directly or indirectly to an antibody. This label can itself be detected (eg, a radioisotope label or fluorescent labels) or, in the case of an enzyme label, can catalyze a chemical change in a substrate compound or composition that is the one being detected. Alternatively, this tag may itself be undetectable, but may be an element that is bound by another agent that is detectable (eg, an epitope tag or one of a pair of binding partners such as biotin- avidin, etc.). Thus, the antibody may contain a label or "tag" that facilitates its isolation, and the methods of this invention for the identification of antibodies include the stage of isolation of this antibody through interaction with this label or tag.

Зразкові терапевтичні імунокон'югати містять описане тут антитіло, кон'юговане з цитотоксичним агентом, таким як хіміотерапевтичний агент, токсин (наприклад, ферментативно активний токсин бактеріального, грибного, рослинного або тваринного походження, або його фрагмент) або радіоактивний ізотоп (тобто радіокон'югат). Злиті білки описані більш докладно нижче.Exemplary therapeutic immunoconjugates comprise an antibody described herein conjugated to a cytotoxic agent, such as a chemotherapeutic agent, a toxin (e.g., an enzymatically active toxin of bacterial, fungal, plant, or animal origin, or a fragment thereof), or a radioactive isotope (i.e., a radioconjugate ). The fusion proteins are described in more detail below.

Хелатори для радіоактивних металів або посилювачі магнітного резонансу добре відомі у даній галузі.Radioactive metal chelators or magnetic resonance enhancers are well known in the art.

Типовими є похідні етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА) і діетилентриамінпентаоцтової кислоти (ДТПА). Ці хелатори звичайно мають групи на бічному ланцюзі за допомогою яких хелатор може прикріплюватися до носія. Такі групи включають, наприклад, бензилізотіоціанат, за допомогою якого ДТПА або ЕДТА можуть бути зв'язані з аміногрупою носія. Альтернативно, карбоксильні групи або аміногрупи на хелаторі можуть бути зв'язані з носієм активацією або попередньою дериватизацією і потім зв'язуванням, у кожному випадку добре відомими способами.Derivatives of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) are typical. These chelators usually have groups on the side chain by which the chelator can be attached to the carrier. Such groups include, for example, benzyl isothiocyanate, with the help of which DTPA or EDTA can be linked to the amino group of the carrier. Alternatively, carboxyl groups or amino groups on the chelator can be linked to the carrier by activation or prior derivatization and then binding, in each case by well-known methods.

Борвмісні оаденди, такі як карборани, можуть бути приєднані до компонентів-антитіл загальноприйнятими способами. Наприклад, карборани можуть бути одержані з карбоксильною групою на бічних ланцюгах, як добре відомо у даній галузі. Приєднання таких карборанів до носія, наприклад, амінодекстрану, може досягатися активацією карбоксильної групи карборанів і конденсацією з аміногрупами на носії для одержання проміжного кон'югату. Потім такі проміжні кон'югати приєднують до компонентів-антитіл з одержанням терапевтично застосовних імунокон'югатів, як описано нижче.Monovalent adducts, such as carboranes, can be attached to antibody components by conventional methods. For example, carboranes can be prepared with a carboxyl group on the side chains, as is well known in the art. Attachment of such carboranes to a carrier, for example, aminodextran, can be achieved by activation of the carboxyl group of carboranes and condensation with amino groups on the carrier to obtain an intermediate conjugate. Such intermediate conjugates are then attached to antibody components to produce therapeutically applicable immunoconjugates, as described below.

Замість амінодекстрану може бути використаний поліпептидний носій, але цей поліпептидний носій повинен мати щонайменше 50 амінокислотних залишків у ланцюзі, переважно 100-5000 амінокислотних залишків. Щонайменше деякі з цих амінокислот повинні бути залишками лізину або залишками глутамату, або аспартату. Аміногрупи бічних ланцюгів лізину і карбоксилати бічних ланцюгів глутаматних або аспартатних залишків зручні для приєднання лікарського засобу, токсину, імуномодулятора, хелатора, борвмісних адендів або іншого терапевтичного агента. Приклади придатних поліпептидних носіїв включають в себе полілізин, поліглутамінову кислоту, поліаспарагінову кислоту, їх співполімери і змішані полімери цих амінокислот та інших, наприклад, серпнів, для надання бажаних властивостей розчинності одержаному навантаженому носію та імунокон'югату.A polypeptide carrier can be used instead of aminodextran, but this polypeptide carrier must have at least 50 amino acid residues in the chain, preferably 100-5000 amino acid residues. At least some of these amino acids must be lysine residues or glutamate or aspartate residues. Amino groups of side chains of lysine and carboxylates of side chains of glutamate or aspartate residues are convenient for attaching a drug, toxin, immunomodulator, chelator, boron-containing addendum or other therapeutic agent. Examples of suitable polypeptide carriers include polylysine, polyglutamic acid, polyaspartic acid, their copolymers and mixed polymers of these amino acids and others, such as August, to provide the desired solubility properties to the resulting loaded carrier and immunoconjugate.

Кон'югацію проміжного кон'югату з компонентом-антитілом виконують окисненням вуглеводної частини компонента-антитіла і реакцією одержаних альдегідного (і кетонного) карбонілів з аміногрупами, що залишаються на носії після завантаження лікарським засобом, токсином, хелатором, імуномодулятором, борвмісним адендом або іншим терапевтичним агентом. Альтернативно, проміжний кон'югат може бути приєднаний до компонента окисненого антитіла через аміногрупи, які були введені у проміжному кон'югаті після завантаження терапевтичним агентом. Окиснення переважно виконують або хімічно, наприклад, з використанням Ма/О4 або іншого гліколітичного компонента реагенту, або ферментативно, наприклад, з використанням нейрамінідази і галактозооксидази. У випадку амінодекстранового носія не всі аміногрупи амінодексграну звичайно використовуються для завантаження терапевтичного агента. Аміногрупи амінодекстрану, що залишаються, конденсуються з окисненим компонентом антитіла з утворенням аддуктів основ ШифФфоа, які потім відновлювально стабілізують, звичайно відновлювальним боргідридним агентом.Conjugation of the intermediate conjugate with the antibody component is carried out by oxidation of the carbohydrate part of the antibody component and the reaction of the obtained aldehyde (and ketone) carbonyls with amino groups that remain on the carrier after loading with a drug, toxin, chelator, immunomodulator, boron-containing addendum or other therapeutic an agent Alternatively, the intermediate conjugate can be attached to the oxidized antibody component through amino groups that have been introduced into the intermediate conjugate after loading with the therapeutic agent. Oxidation is preferably carried out either chemically, for example, using Ma/O4 or another glycolytic component of the reagent, or enzymatically, for example, using neuraminidase and galactose oxidase. In the case of an aminodextran carrier, not all of the amino groups of the aminodextran are typically used to load the therapeutic agent. The amino groups of the remaining aminodextran condense with the oxidized component of the antibody to form Schiffphoa base adducts, which are then reductively stabilized, usually with a reducing borohydride agent.

Аналогічні процедури використовують для одержання імунокон'югатів відповідно до даного винаходу.Analogous procedures are used to obtain immunoconjugates according to this invention.

Навантажені поліпептидні носії переважно мають вільні залишки лізину, що залишаються для конденсації з окисненою вуглеводною частиною компонента-антитіла. Карбоксили на поліпептидному носії можуть бути, якщо необхідно, перетворені в аміногрупи, наприклад, активацією ОСС і реакцією з надлишком діаміну.Loaded polypeptide carriers preferably have free lysine residues remaining for condensation with the oxidized carbohydrate part of the antibody component. Carboxyls on the polypeptide carrier can be, if necessary, converted to amino groups, for example, by activation of OSS and reaction with an excess of diamine.

Кінцевий імунокон'югат очищають з використанням загальноприйнятих способів, таких як гель- фільтраційна (витісняюча) хроматографія на Сефакрилі 5-300 або афінна хроматографія з використанням одного або декількох епітопів СО8АНУ.The final immunoconjugate is purified using commonly accepted methods, such as gel filtration (displacement) chromatography on Sepacryl 5-300 or affinity chromatography using one or more epitopes of CO8ANU.

Альтернативно, імунокон'югати можуть бути одержані прямою кон'югацією компонента-антитіла з терапевтичним агентом. Загальна процедура аналогічна непрямому способу кон'югації, за винятком того, що терапевтичний агент безпосередньо приєднують до окисненого компонента-антитіла.Alternatively, immunoconjugates can be obtained by direct conjugation of an antibody component with a therapeutic agent. The general procedure is similar to the indirect method of conjugation, except that the therapeutic agent is directly attached to the oxidized antibody component.

Буде зрозуміло, що хелатори, описані тут, можуть бути замінені іншими терапевтичними агентами.It will be understood that the chelators described herein may be substituted for other therapeutic agents.

Фахівці з кваліфікацією у даній галузі зможуть створювати схеми кон'югації без надмірного експериментування.Those skilled in the art will be able to create conjugation schemes without undue experimentation.

Як додаткова ілюстрація, терапевтичний агент може бути приєднаний до шарнірної області відновленого компонента-антитіла через утворення дисульфідного зв'язку. Наприклад, можуть бути сконструйовані пептиди правцевого токсоїду з єдиним залишком цистеїну, що використовується для приєднання цього пептиду до компонента-антитіла. Як альтернатива, такі пептиди можуть бути приєднані до компонента-антитіла з використанням гетеробіфункпіонального зшивального агента (крос-лінкера). такого як М-сукциніл-3-(2-піридилдитіо)пропіонат (ЗРОР). Ми еї аї., Іпї. У. Сапсег 56:244 (1994). Загальні способи такої кон'югації добре відомі у даній галузі. Див., наприклад, МУопд, Спетівігу ОЇ Ргоївеіп Сопідайіоп апа Сто55-Ііпкіпд (САС Ргев5 1991); Оревіасів єї аї!., "Модійсайоп ої Апіїбодіеєз Бу Спетіса! Меїпоав", іпAs an additional illustration, the therapeutic agent can be attached to the hinge region of the reconstituted antibody component through the formation of a disulfide bond. For example, tetanus toxoid peptides can be designed with a single cysteine residue used to attach this peptide to the antibody component. Alternatively, such peptides can be attached to the antibody component using a heterobifunctional cross-linker. such as M-succinyl-3-(2-pyridyldithio)propionate (ZPOR). We are here, yes. U. Sapseg 56:244 (1994). General methods of such conjugation are well known in the art. See, for example, MUopd, Spetivigu OY Rgoiveip Sopidaiiop apa Sto55-Iipkipd (SAS Rgev5 1991); Oreviasiv eyi ai!., "Modiisayop oi Apiibodieez Bu Spetisa! Meipoav", ip

Мопосіопа! Апіїродієв: Рііпсірієв апа Арріїсайопв, Вігсп еї аї. (едв.), радез 187-230 (УМіеу-І ів5, Іпс. 1995);Moposiope! Apiirodiev: Riipsiriev apa Arriisaiopv, Vigsp ei ai. (Edv.), radez 187-230 (UMieu-I iv5, Ips. 1995);

Ріїсє, "Ргодисіоп апа СПНагасієгігайоп ої Зупіпеїїс Реріїде-Оєгмей Апіїродієв", іп Мопосіопа! Апіїбодієзв:Riisye, "Rgodisiop apa SPNagasiegigayop oi Zupipeiis Reriide-Oegmei Apiirodiev", ip Moposiopa! Apiibodiesv:

Ргодисійоп, Епіпеегппд апа Сіїпіса! Арріїсайоп, АЩег еї а!ї. (едв5.), радез 60-84 (Сатргідде Опімегейу Ргезв5 1995).Rhodisiop, Epipeegppd apa Siipisa! Arriisaiop, Ashcheg ei a!i. (edv5.), radez 60-84 (Satrgidde Opimegeyu Rgezv5 1995).

Кон'югати цього антитіла і цитотоксичного агента одержують з використанням різних біфункціональних агентів, що зв'язують білок, таких як М-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіол)пропіонат (5РОР), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоефірів (такі як диметиладипімідат-НСІ), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідилсуберат), альдегіди (такі як глутаровий альдегід), біс-азидосполуки (такі як біс-(п- азидобензоїл)гександіамін), похідні біс-діазонію (такі як біс-(п-діазонійбензоїл)етилендіамін), діїзоціанати (такі як толуол-2,6б-діїзоціанат) і біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол).Conjugates of this antibody and the cytotoxic agent are obtained using various bifunctional protein-binding agents, such as M-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionate (5POP), iminothiolane (IT), bifunctional derivatives of imidoesters (such as dimethyl adipimidate-HCI), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azido compounds (such as bis-(p-azidobenzoyl)hexanediamine), bis-diazonium derivatives (such as bis-(p- diazoniumbenzoyl)ethylenediamine), diisocyanates (such as toluene-2,6b-diisocyanate) and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene).

Наприклад, рициновий імунотоксин може бути одержаний, як описано у Міена еї а!І., 5сіепсе 238:1098 (1987). Вуглець-14-мічена 1-ізотіоціанатобензил-З3-метилдіетилентриамінопентацтова кислота (МХ-ОТРА) є зразковим хелатоутворюючим агентом для кон'югації радіонукліда з антитілом (див., наприклад, УМО 94/11026).For example, ricin immunotoxin can be prepared as described in Meena et al., 576 238:1098 (1987). Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminopentacetic acid (MH-OTRA) is an exemplary chelating agent for conjugation of a radionuclide with an antibody (see, for example, UMO 94/11026).

Як описано вище, для кон'югації терапевтичного агента можуть бути використані вуглеводні частини молекули в Ес-області антитіла. Однак Ес-область може бути відсутньою, якщо використовують фрагмент антитіла як компонент-антитіло імунокон'югату. Проте, можна ввести вуглеводну частину молекули у варіабельну область легкого ланцюга антитіла або фрагмента антитіла. Див., наприклад, Гешпао еї аї.,».As described above, for the conjugation of the therapeutic agent, the hydrocarbon parts of the molecule in the E region of the antibody can be used. However, the ES region may be absent if an antibody fragment is used as the antibody component of the immunoconjugate. However, it is possible to introduce the carbohydrate portion of the molecule into the variable region of the light chain of an antibody or antibody fragment. See, for example, Geshpao ei ai.,».

Іттипої. 154:5919 (1995); Напзеп еї аїЇ., патент США Ме 5443953. Потім цю сконструйовану вуглеводну частину молекули використовують для приєднання терапевтичного агента.And so on. 154:5919 (1995); U.S. Patent No. 5,443,953. This engineered carbohydrate portion of the molecule is then used to attach a therapeutic agent.

Крім того, кваліфікованим у даній галузі фахівцям будуть відомі численні можливі варіації способів кон'югації. Наприклад, вуглеводна частина молекули може бути використана для приєднання поліетиленгліколю для подовження напівперіоду існування інтактного антитіла або його антигензв'язувального фрагмента у крові, лімфі або інших позаклітинних рідинах. Крім того, можна сконструювати «двовалентний імунокон'югат» приєднанням терапевтичних агентів до вуглеводної частини молекули і до вільної сульфгідрильної групи. Така вільна сульфгідрильна група може бути розміщена у шарнірній області компонента-антитіла.In addition, numerous possible variations of conjugation methods will be known to those skilled in the art. For example, the carbohydrate part of the molecule can be used to attach polyethylene glycol to extend the half-life of an intact antibody or its antigen-binding fragment in blood, lymph, or other extracellular fluids. In addition, it is possible to construct a "bivalent immunoconjugate" by attaching therapeutic agents to the carbohydrate part of the molecule and to the free sulfhydryl group. Such a free sulfhydryl group can be placed in the hinge region of the antibody component.

Злиті (гібридні) білки антитілFusion (hybrid) antibody proteins

Даний винахід розглядає застосування злитих (гібридних) білків, що містять одну або декілька частин антитіла та інший поліпептид, такий як імуномодуляторна або токсинова частина молекули. Способи одержання злитих білків антитіл добре відомі у даній галузі. Див., наприклад, патент США Мо 6306393. Злиті білки антитіл, що містять інтерлейкін-2--астину молекули, описані Воїеїї еї аіІ., Апп. Опсої. 6:945 (1995),The present invention contemplates the use of fusion (hybrid) proteins containing one or more parts of an antibody and another polypeptide, such as an immunomodulatory or toxin part of the molecule. Methods for obtaining antibody fusion proteins are well known in the art. See, for example, US patent No. 6,306,393. Fusion proteins of antibodies containing interleukin-2-astin molecules, described in Voieii et al., App. Opsoi 6:945 (1995),

Місоїеї еї а!., Сапсег Сепе Тег. 2:161 (1995), ВескКег єї аі!., Ргос. Маї! Асад. 5сі. ОБА 93:7826 (1996), Напк єї аІ., Сіп. Сапсег Невз. 2:1951 (1996) і Ни еї аЇ., Сапсег Ке5. 56:4998 (1996). Крім того, Мапд еї аї., Нит.Misoiei ei a!., Sapseg Sepe Teg. 2:161 (1995), VeskKeg eyi ai!., Rgos. Mai! Asad 5 OBA 93:7826 (1996), Napk eyi AI., Sep. Sapseg Nevz. 2:1951 (1996) and Ny ei aY., Sapseg Ke5. 56:4998 (1996). In addition, Mapd ei ai., Nit.

Апіїродіеєх Нургідотаз 6:129 (1995), описують злитий білок, що включає в себе Е(ар)2-фрагмент і фактор некрозу пухлин альфа у вигляді частини молекули.Apiirodiech Nurgidotaz 6:129 (1995), describe a fusion protein that includes an E(ar)2 fragment and tumor necrosis factor alpha as part of the molecule.

Способи одержання злитих білків антитіло-токсин, в яких рекомбінантна молекула містить один або декілька компонентів-антитіл і токсин або хіміотерапевтичний агент, також відомі кваліфікованим у даній галузі фахівцям. Наприклад, злиті білки антитіло-екзотоксин А Рзхендотопах були описані Спацанпагу еї аї.,Methods of obtaining antibody-toxin fusion proteins, in which the recombinant molecule contains one or more antibody components and a toxin or chemotherapeutic agent, are also known to those skilled in the art. For example, fusion proteins antibody-exotoxin A Rzhendotopes were described by Spatsanpagu ei ai.,

Маїшге 339:394 (1989), Віпктапп еї а!., Ргос. Маї! Асай. 5сі. ОБА 88:8616 (1991), Ваїга вї аї., Ргос. Маї! Асаай.Maishge 339:394 (1989), Vipktapp ei a!., Rgos. Mai! Asai. 5 OBA 88:8616 (1991), Vaiga vy ai., Rhos. Mai! Asaay

Зсі. ОБА 89:5867 (1992), Рієдтап еї аї., У. Іттипої. 150:3054 (1993), Му/єїв5 еї аї., Іпї. У. Сап. 60:137 (1995),All together. OBA 89:5867 (1992), Riedtap eyi ai., U. Ittipoi. 150:3054 (1993), Mu/yeiv5 ei ai., Ipi. U. Sap. 60:137 (1995),

Еотіпауа еї аї., 9. Віої. Спет. 271:10560 (1996), Кциап еї а!., Віоспетівігу 35:2872 (1996) і 5сптіаї еї аї., ий. 9.Eotipaua ei ai., 9. Vioi. Spent 271:10560 (1996), Ktsiap ei a!., Viospetivhigu 35:2872 (1996) and 5sptiai ei ai., iy 9.

Сап. 65:538 (1996). Злиті білки антитіло-токсин, що містять дифтерійний токсин у вигляді частини молекули, були описані Кгейтап еї а!., Геикетіа 7:553 (1993), Міспої5 еї аї., у. Віої. Спет. 268:5302 (1993), Тпотрзоп еї аї., у. Віої. Спет. 270:28037 (1995) і Майега еї а!., Віоса 88:2342 (1996). Оеопагаїп еї аІ., Титог Тагдейпа 1:177 (1995), описували злитий білок антитіло-токсин, що має РНКазну частину молекул, тоді як І іпагаои еї а!., Сеї! Віорпуз. 24-25:243 (1994) одержали злитий білок антитіло-токсин, що містить ДНКаза І-компонент.Sap. 65:538 (1996). Antibody-toxin fusion proteins containing diphtheria toxin as part of the molecule have been described in Keitap et al., Geiketia 7:553 (1993), Mispoi5 et al., u. Vioi Spent 268:5302 (1993), Tpotrzop eyi ai., u. Vioi Spent 270:28037 (1995) and Maiega et al., Viosa 88:2342 (1996). Oeopagaip ei aI., Tytog Tagdeipa 1:177 (1995), described an antibody-toxin fusion protein having the RNase portion of the molecules, while I ipagaoi ei a!., Seii! Viorpuz. 24-25:243 (1994) obtained an antibody-toxin fusion protein containing a DNase I component.

Гелонін використовували як токсинову частину у злитому білку антитіло-токсин Улапод еї а!., АБзігасів ої те 20917 ДС5 Майопаї! Мееїіпд, Апанєїт, Саїїї, Арг. 2-6, 1995, Рай 1, ВІОТО05. Як наступний приклад, Оопівіеп еї аІ., Ргос. Майї! Асад. сі. ОБА 91:8945 (1994) повідомляли про злитий білок антитіло-токсин, що містить ентеротоксин-А Зіарпу!ососсив5.Gelonin was used as a toxin part in the fusion protein antibody-toxin Ulapod ei a!., ABzigasiv oi te 20917 DS5 Myopai! Meeiipd, Apaneit, Saiiii, Arg. 2-6, 1995, Paradise 1, VIOTO05. As the next example, Oopiviep eyi aI., Rgos. Maya! Asad si. OBA 91:8945 (1994) reported an antibody-toxin fusion protein containing enterotoxin-A of Ziarpu!osossiv5.

Ілюстративними токсинами, які переважно використовують у приготуванні таких кон'югатів, є рицин, абрин, рибонуклеаза, ДНКаза |, стафілококовий ентеротоксин-А, антивірусний білок фітолаккі американської, гелонін, дифтерійний токсин, екзотоксин Рзенпдотопа5 і ендотоксин Рзхепдотопав. Див., наприклад, Равзіап еї а!., Сеї! 47641 (1986) і соідепрегд, СА-А Сапсег доигпаї ог Сііпісіап5 44:43 (1994). Інші придатні токсини відомі кваліфікованим у даній галузі фахівцям.Illustrative toxins that are preferably used in the preparation of such conjugates are ricin, abrin, ribonuclease, DNase|, staphylococcal enterotoxin-A, anti-viral protein of Phytolacci americana, gelonin, diphtheria toxin, exotoxin Rzenpdotopa5 and endotoxin Rzhepdotopav. See, for example, Ravziap ei a!., Sei! 47641 (1986) and soidepregd, SA-A Sapseg doigpai og Siipisiap5 44:43 (1994). Other suitable toxins are known to those skilled in the art.

Антитіла за даним винаходом можуть бути також використані в АОЕРТ кон'югацією антитіла з проліки- активуючим ферментом, що перетворює проліки (наприклад, пептидил-хіміотерапевтичний агент, див.Antibodies of the present invention can also be used in AOERT by conjugating the antibody to a prodrug-activating prodrug-converting enzyme (eg, a peptidyl chemotherapeutic agent, see

УМО81/01145) в активний протираковий лікарський засіб. Див., наприклад, УУО88/07378 і патент США Мо 4975278.UMO81/01145) into an active anticancer drug. See, for example, US Pat. No. 88/07378 and US Pat. No. 4,975,278.

Ферментний компонент імунокон'югату, застосовний для АОЕРТ, включає в себе будь-який фермент, здатний діяти на проліки таким чином, що вони перетворюються в більш активну цитотоксичну форму.The enzyme component of the immunoconjugate applicable to AOERT includes any enzyme capable of acting on prodrugs in such a way that they are converted into a more active cytotoxic form.

Ферменти, які застосовні у способі за даним винаходом, включають, але не обмежуються ними, лужну фосфатазу, застосовну для перетворення фосфатвмісних пролікв у вільні лікарські засоби; арилсульфатазу, застосовну для перетворення сульфатвмісних проліків у вільні лікарські засоби; цитозиндеаміназу, застосовну для перетворення нетоксичного 5-фторцитозину у протираковий лікарський засіб, 5-фторурацил; протеази, такі як протеаза 5еїтайа, термолізин, субтилізин, карбоксипептидази і катепсини (такі як катепсини В і І), які застосовні для перетворення пептидвмісних проліків у вільні лікарські засоби; О-аланілкарбоксипептидази, застосовні для перетворення проліків, які містять О-амінокислотні замісники; ферменти, що розщеплюють вуглевод, такі як р-галактозидаза і нейрамінідаза, застосовні для перетворення глікозилованих проліків у вільні лікарські засоби; р-лактамазу, застосовну для перетворення лікарських засобів, дериватизованих р-лактамами, у вільні лікарські засоби; і пеніцилінамідази, такі як пеніцилін М-амідаза або пеніцилін С-амідаза, застосовні для перетворення лікарських засобів, дериватизованих при азотах їх аміногруп феноксіацетильними або фенілацетильними групами, відповідно, у вільні лікарські засоби. Альтернативно, антитіла з ферментативною активністю, також відомі у даній галузі як абзими, можуть бути використані для перетворення проліків за винаходом у вільні активні лікарські засоби (див., наприклад, Маззеу, Маїшге 328:457-458 (1987)). Кон'югати антитіло-абзим можуть бути одержані, як описано тут, для доставки абзиму у популяцію пухлинних клітин.Enzymes useful in the method of the present invention include, but are not limited to, alkaline phosphatase useful for converting phosphate-containing prodrugs into free drugs; arylsulfatase, applicable for converting sulfate-containing prodrugs into free drugs; cytosine deaminase, applicable for the conversion of non-toxic 5-fluorocytosine into an anticancer drug, 5-fluorouracil; proteases, such as protease 5eita, thermolysin, subtilisin, carboxypeptidases and cathepsins (such as cathepsins B and I), which are useful for converting peptide-containing prodrugs into free drugs; O-alanylcarboxypeptidases, applicable for the conversion of prodrugs that contain O-amino acid substituents; carbohydrate-splitting enzymes, such as β-galactosidase and neuraminidase, are useful for converting glycosylated prodrugs into free drugs; p-lactamase, applicable for the conversion of drugs derivatized with p-lactams into free drugs; and penicillin amidases, such as penicillin M-amidase or penicillin C-amidase, are applicable for the conversion of drugs derivatized at the nitrogens of their amino groups with phenoxyacetyl or phenylacetyl groups, respectively, into free drugs. Alternatively, antibodies with enzymatic activity, also known in the art as abzymes, can be used to convert prodrugs of the invention into free active drugs (see, eg, Mazzeu, Maischge 328:457-458 (1987)). Antibody-abzyme conjugates can be prepared as described herein to deliver abzyme to a population of tumor cells.

Ферменти за даним винаходом можуть бути ковалентно зв'язані з антитілами способами, добре відомими у даній галузі, такими як застосування гетеробіфункціональних зшивальних реагентів, обговорюваних вище. Альтернативно, злиті білки, які містять щонайменше антигензв'язувальну область антитіла за винаходом, зв'язану з щонайменше з функціонально активною частиною ферменту за винаходом, можуть бути сконструйовані з використанням способів рекомбінантних ДНК, добре відомих у даній галузі (див., наприклад, Мешибегодег еї а!., Майшге 312:604-608 (1984)).Enzymes of the present invention may be covalently linked to antibodies by methods well known in the art, such as the use of heterobifunctional crosslinking reagents discussed above. Alternatively, fusion proteins that comprise at least an antigen-binding region of an antibody of the invention linked to at least a functionally active portion of an enzyme of the invention can be constructed using recombinant DNA techniques well known in the art (see, e.g., Meshibegodegh ei a!., Myshge 312:604-608 (1984)).

Нетерапевтичні застосуванняNon-therapeutic uses

Антитіла за винаходом можуть бути використані як агенти афінного очищення для антигену-мішені або у діагностичних аналізах на антиген-мішень, наприклад, детектуванням його експресії у специфічних клітинах, тканинах або сироватці. Ці антитіла можуть бути також використані для іп мімо діагностичних аналізів. Звичайно для цих цілей антитіло мітять радіонуклідом (таким як "п, 99Тс, 140, 191), 125), ЗН, З2рР. або 3553), тому місце розташування пухлини може бути визначене імуносцинтиграфією.The antibodies of the invention can be used as affinity purification agents for the target antigen or in diagnostic assays for the target antigen, for example, by detecting its expression in specific cells, tissues or serum. These antibodies can also be used for IP beyond diagnostic assays. Usually, for these purposes, the antibody is labeled with a radionuclide (such as "n, 99Ts, 140, 191), 125), ZN, Z2rR. or 3553, so the location of the tumor can be determined by immunoscintigraphy.

Антитіла за даним винаходом можуть бути використані у будь-якому відомому способі аналізу, такому як аналізи конкурентного зв'язування, прямий і непрямий сендвіч-аналізи, такі як ЕГІЗА, і аналізи імунопреципітації. 20Їа, Мопосіопа! Апііродіе5: А Маппаї ої Тесппіднез, рр.147-158 (СКС Ргевз5, Іпс. 1987). Ці антитіла можуть бути також використані для мічення проб пухлин з використанням способів, відомих у даній галузі.Antibodies of the present invention can be used in any known assay method, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays such as EHIZA, and immunoprecipitation assays. 20 Yay, Moposiopa! Apiirodie5: A Mappai oi Thesppidnez, pp. 147-158 (SKS Rgevz5, Ips. 1987). These antibodies can also be used to label tumor samples using methods known in the art.

Для зручності, антитіло за даним винаходом може бути забезпечене у наборі, тобто упакованій комбінації реагентів у заздалегідь визначених кількостях з інструкціями для виконання діагностичного аналізу. Якщо антитіло мічене ферментом, цей набір буде включати в себе субстрати і кофактори, необхідні для цього ферменту (наприклад, попередник субстрату, що забезпечує хромофор або флуорофор, що детектується). Крім того, можуть бути включені інші домішки, такі як стабілізатори, буфери (наприклад, блокуючий буфер або лізисний буфер) і т.п. Відносні кількості цих різних реагентів можуть широко варіюватися для забезпечення концентрацій у розчині цих реагентів, які істотно оптимізують чутливість аналізу. Зокрема, реагенти можуть бути забезпечені у вигляді сухих порошків, звичайно ліофілізованих, у тому числі ексципієнтів, які після розчинення будуть забезпечувати розчин реагентів, що має придатну концентрацію.For convenience, the antibody of the present invention may be provided in a kit, i.e., a packaged combination of reagents in predetermined quantities with instructions for performing a diagnostic assay. If the antibody is labeled with an enzyme, this kit will include the substrates and cofactors required for that enzyme (eg, a substrate precursor that provides a detectable chromophore or fluorophore). In addition, other impurities such as stabilizers, buffers (eg, blocking buffer or lysis buffer) and the like may be included. The relative amounts of these different reagents can be varied widely to provide concentrations in the solution of these reagents that significantly optimize the sensitivity of the assay. In particular, reagents can be provided in the form of dry powders, usually lyophilized, including excipients, which after dissolution will provide a solution of reagents with a suitable concentration.

Винахід ілюструється наведеними нижче прикладами, які не призначені для того, щоб бути яким-небудь чином обмежувальними.The invention is illustrated by the following examples, which are not intended to be limiting in any way.

ПрикладиExamples

Приклад 1Example 1

Одержання фрагментів ЕСО, 51- і 82-доменів РК КObtaining ESO fragments, 51- and 82-domains of RK K

Рекомбінантну експресію і очищення фрагментів РЕ Е, що відповідають позаклітинному домену (ЕСО, амінокислоти 25-234 5ЕБЕО ІЮ МО:2), домену 51 (амінокислоти 25-125 5БО ІЮО МО:2) і домену 52 (амінокислоти 126-234 5ЕО ІО МО:2) РКК, проводили наступним чином. Експресійні конструкції для експресії комах ЕСО, 51 і 52, конструювали як показано у таблиці 2, і конструювали праймери для клонування цих фрагментів на основі їх відповідних амінокислотних послідовностей (показані у таблиці 3).Recombinant expression and purification of PE E fragments corresponding to the extracellular domain (ESO, amino acids 25-234 5EBEO IU MO:2), domain 51 (amino acids 25-125 5BO IUO MO:2) and domain 52 (amino acids 126-234 5EO IU MO :2) RKK, conducted as follows. Expression constructs for the expression of insect ESOs, 51 and 52, were constructed as shown in Table 2, and primers were designed to clone these fragments based on their respective amino acid sequences (shown in Table 3).

Таблиця 2 . Я пПРУЧННННTable 2 . I pPRUCHNNNNNN

ЕСО Ф шиси 52 1 234 во ши 125 234 1 126ЭСО Ф шиши 52 1 234 оши шиш 125 234 1 126

Нативнийї /-:/ (З ШNative /-:/ (From Sh

Ї сигнальний Нів-т: сіш-Тад пептид ї В ОSignaling Niv-t: sish-Tad peptide and B O

Таблиця 3Table 3

Використані ПЛР-Праймери Послідовності ПЛР-праймерів (Е-прямий; К-зворотний)Used PCR Primers Sequences of PCR primers (E-forward; K-reverse)

ЕІ 5ЕО І МО: 3 СОБАСААСТТТСТАСААААААССАСОСТАССААССАСАEI 5EO AND MO: 3 SOBASAASTTTSTASAAAAAAAASSASOSTASSAAASSASA

ТАТАСАТАТОСААОССААААТОТООСАТСТОСААTATASATATOSAAOSSAAAAATOTOOSATSTOSAA

КІ 5ЕО Ір МО: 4 СОбАССАСТТТОТАСААСАААОСТООСТТТААОСтТОССТОоKI 5EO Ir MO: 4 СОбАССАСТТТОТАСААААОСТОOSTTTTAАОStТОССТОo

АТООТОАТООТОАТОТОСТОСАТСАТТСАТОСТОААСТС в 5ЕО ІЮ МО: 5 СОСАСААСТТТСТАСААААААССАСОССТТССААОСАСАТАбААТООТОАТООТОАТОТОСТОСАТСАТСАТОСТОААСТС in 5ЕО ЙЮ МО: 5 СОСАСААСТTTСТСААААААААССОСССТССАОСАСАТАbA

АССАТСASSATS

ЕЗ 5ЕО ІЮ МО: 6 САСОСТІССААОбАСАТАСААССАТОДАОСААААТОТООССАТEZ 5EO IYU MO: 6 САСОСТИССААОбАСАТАСААССАТОДАОСАААААТОТООССАТ

СТОСААССSTOSAASS

5ЕО ІЮ МО: 7 СААССААААТОТОССАТСТОСААССОТТТТСАСТОСТОСТАСТТ тТтІСстТо5EO IYU MO: 7 SAASSAAAAATOTOSSATSTOSAASSOTTTTSASTOSTOSTOSTASTT tTTISstTo

ШИ 5ЕО І МО: 8 СОСТІТТСАСТСТОСТАСТТТТТСТСААСАССТОССТТСТОААТоSHY 5EO AND MO: 8 SOSTITTSASTSTOSTOSTASTTTTTTTSTSAASASSTOSSTTSTOAATo

САССАСSASSAS

Еб 5ЕО ІЮ МО: 9 СААСАССТОССТІСТОААТОСАОССАССАСАТСАССАТСАССАТEb 5EO IYU MO: 9 SAASASSTOSSTISTOOAATOSAOSSSASSASATSASSATSASSAT

САСОСАСSASOSAS

Е7 5ЕО 10 МО: 10 САСАТСАССАТСАССАТСАСОСАССТСАСТТАССТОСТОСАААE7 5EO 10 MO: 10 САСАССАССАССАССАССАССТСАТТАССТОСТОСААА

АССТОАб 1 5ЕО І МО: 11 СОСАССАСТІТОТАСААОАААОСТООСТТСАСТОААСТАТОТААСТСASSTOAb 1 5EO I MO: 11 СОСАССАСТИТОТАСААОААОСТОOSTTSСАСТОАСТАТОТААСТС

АССТССАСASSTSSAS

5ЕО ІР МО: 12 СОбСАСААСТТТОТАСААААААССАСОСТТСОААССАОСАТАСА5EO IR MO: 12 СОбСАСААСТТТОТАСААААААССАСОСТСОААССАОСАСТАСА

АССАТО во ЗЕОІЮ МО: 13 САСОСТІСОСААОСАСАТАСААССАТОААССАДАААТОТОСОСАТASSATO in ZEOIU MO: 13

СТОСАдССSTOSAdSS

ШИ 5ЕО Ір МО: 14 СААДОСААДААТОТООСАТСТОСААССОТТТТСАСТСТОСТАСТТ тТСтТСSHY 5EO IR MO: 14 СААДОСААДААТОТООСАТСТОСААССОТТТСАСТСТОСТАСТТ тТСтТС

І 5ЕО 10 МО: 15 СОТТТТСАСТСТОСТАСТТТТТСТСААСАССТОССТТСТОААТОI 5EO 10 MO: 15 СОТТТТСАСТСТОСТАТTTTTСААСАССТОССТСТОААТО

ТТСА ші 5ЕО ТО МО: 16 ТСТСААСАССТОССТТСТОААТОТТСАОССАСАСССТОСТТТО достоTTSA shi 5EO TO MO: 16 TSTSAAAASSSTOSSTTSTOAATOTTSAOSSASSASSSTOSTTTTO doso

І 5ЕО ІЮ МО: 17 СОТОСАТОСТОАТОСТОАТОТОСТОСАТСАТТСАТОСТОААСТСI 5EO IJU MO: 17 SOTOSATOSTOATOSTOATOTOSTOSATSATTSATOSTOAASTS

АСТАбО ши 5ЕО Ір МО: 18 СААСАААОСТОСОТТТААОСТОСОТОАТОСТОАТОСТОАТОТО стосASTABO shi 5EO Ir MO: 18 SAASAAAAOSTOSOTTTAAOSTOSOTOATOSTOATOSTOATOTO stos

ШИ 5ЕО Ір МО: 19 СООСАССАСТТТОТАСААСАААССТОСОТТТААОСТОСSHY 5EO IR MO: 19 СООСАССАСТТТОТАСАААААССТОСТТТААОСТОС

Для клонування доменів 51 і 52 використовували підхід ПЛР з вмонтованими праймерами для включення міток і для конструювання 3/5'-області. Для 51 є 6 прямих вмонтованих праймерів і 1 зворотний праймер для клонування. Для 52 є 5 прямих вмонтованих праймерів і З зворотних праймери для клонування.To clone domains 51 and 52, a PCR approach was used with built-in primers to include tags and to construct the 3/5' region. For 51, there are 6 forward inset primers and 1 reverse primer for cloning. For 52, there are 5 forward inset primers and 3 reverse primers for cloning.

Всі ПЛР-ампліфікації проводили з використанням вихідної суміші РіО Нгатм Ноївіай РОСА Мавіег Міх (Зігаїадепе) відповідно до рекомендацій виробника. Матрицею, використовуваною для ампліфікації, є фрагмент ЕСО РКІК, клонований у рОЕБЗТ3218 (дані не показані). ПЛР-продукт ЕСО клонують уAll PCR amplifications were carried out using the starting mixture RiO Ngatm Noyviai ROSA Mavieg Mih (Zigaiadepe) according to the manufacturer's recommendations. The template used for amplification is the ESO RKIK fragment cloned in rOEEBZT3218 (data not shown). The ESO PCR product is cloned in

ВіІсеВас4.5//5-Ніє5 ТОРО-ТА (Іпмігодеп) з використанням стратегії топоїзомеразного клонування. ПродуктиViIseVas4.5//5-Nie5 TORO-TA (Ipmigodep) using a topoisomerase cloning strategy. Products

ПЛР 51 ї 52 клонують з використанням Сагемжеу Тесппоіоду (Іпмігодеп) в адаптовану авторами плазміду рАСМРЗ. Кінцеві відібрані клони підтверджували двохланцюжковим секвенуванням. Для трансфекції комах одержували 10-20 мкг ДНК.PCR 51 and 52 are cloned using Sagemzeu Tesppoiod (Ipmigodep) into the pASMRZ plasmid adapted by the authors. The final selected clones were confirmed by double-stranded sequencing. For the transfection of insects, 10-20 μg of DNA was obtained.

Ці рекомбінантні конструкції використовували для експресії відповідних РЕІ К-фрагментів у клітинах комах наступним чином. Бакуловірус виділяли очищенням з бляшок котрансфекції плазмідної ДНК, що кодує позаклітинний домен РЕГЕ, з геномної ДНК Заррпігеїм Ашодгарпа саїйогпіса. Рекомбінантний вірус ампліфікували і використовували для інфікування клітин комах Тп5 при щільностях у діапазоні 1х106- 1,5х106 клітин/мл, діапазоні МОЇ 2-10 у хвильовому біореакторі на 10 л (робочий об'єм). Після 48-годинного інфікування клітини і супернатант збирали, центрифугували і супернатант готували для концентрування.These recombinant constructs were used to express the corresponding REI K-fragments in insect cells as follows. Baculovirus was isolated by purification from plaques of cotransfection of plasmid DNA encoding the extracellular domain of REGE from genomic DNA of Zarrpigeim Ashodharpa saiyogpis. The recombinant virus was amplified and used to infect Tp5 insect cells at densities in the range of 1x106-1.5x106 cells/ml, in the range of MOI 2-10 in a 10-liter wave bioreactor (working volume). After a 48-hour infection, the cells and supernatant were collected, centrifuged, and the supernatant was prepared for concentration.

Супернатант освітлювали на картриджі з порожніми волокнами 0,45 мкм перед 5-кратним концентруванням з використанням мембрани тангенціального потоку з межею відсікання ММУ 10 кДа. Перед очищенням білка супернатант стерилізували за допомогою фільтра з використанням вакуумних колб на 1 л з порами 0,2 мкм.The supernatant was clarified on a 0.45 μm hollow fiber cartridge before 5-fold concentration using a tangential flow membrane with a 10 kDa MMU cutoff. Before protein purification, the supernatant was filter sterilized using 1 L vacuum flasks with 0.2 μm pores.

Подібні способи використовували для експресії доменів 51 і 52 у клітинах комах, за винятком того, що фрагмент 51 не концентрували перед очищенням, а фрагмент 52 концентрували на картриджі МУУ 5 кДа.Similar methods were used to express domains 51 and 52 in insect cells, except that fragment 51 was not concentrated before purification, and fragment 52 was concentrated on a 5 kDa MUU cartridge.

РАЇ А-фрагменти очищали наступним чином. Культуральні супернатанти клітин комах, що містять експресовані ЕСО або субдомени РКІК, одержували з групи експресії, у нерозбавленому вигляді або концентрованому до 10х вигляді з використанням приладу з касетою складених у вигляді стопки мембран (Раї! Гійгоп) з номінальною межею молекулярної маси 1 або 5 кД. На практиці супернатанти фільтрували через фільтр 0,2 мікрон. Супернатанти наносили безпосередньо на зрівноважені ЗФР колонки.RAI A-fragments were purified as follows. Culture supernatants of insect cells containing expressed ESO or RKIK subdomains were obtained from the expression group, undiluted or concentrated up to 10x using a device with a stacked membrane cassette (Rai! Hyigop) with a nominal molecular weight cutoff of 1 or 5 kD . In practice, supernatants were filtered through a 0.2 micron filter. Supernatants were applied directly to equilibrated SFR columns.

Ніз-мічені білки очищали на колонках НізТгар (СЕ Неайсаге) на 1 або 5 мл при швидкостях потоку, що рекомендуються виробником. СіІи-мічений білок очищали на колонці з іммобілізованим анти-діи-антитілом, приготованій наступним чином: очищене моноклональне анти-діи-антитіло у ЗФР, при концентраціях 3-10 мг/мл, кон'югували з Апйі-де! 10 (Віо-Каа), активованим н-гідроксисукцинімідом агарозним гелем, відповідно до інструкцій виробника. Анти-діи-агарозу поміщали у колонку ХК 16 (СЕ Неайпсаге) і виконували очищення при лінійній швидкості потоку 15-30 см/год.Niz-tagged proteins were purified on 1 or 5 ml NizTgar (CE Neaisage) columns at flow rates recommended by the manufacturer. CII-labeled protein was purified on a column with immobilized anti-DII antibody, prepared as follows: purified monoclonal anti-DII antibody in SFR, at concentrations of 3-10 mg/ml, was conjugated with Apyi-de! 10 (Vio-Kaa), n-hydroxysuccinimide-activated agarose gel, according to the manufacturer's instructions. Anti-diy-agarose was placed in a column of ХК 16 (SE Neaipsage) and purification was carried out at a linear flow rate of 15-30 cm/h.

Елюцію білка з колонок НізТгар виконували градієнтною елюцією 20 колонковими об'ємами буфер А (ЗФР) - буфер В (ЗФРО25М імідазол (ІХ-0005, ЕМ Мегск) рН 7,4). Елюцію білка з колонки анти-дій виконували за допомогою ЗФР, що містить 0,1 мг/мл пептиду ЕУМРТО, що конкурує з епітопом Сін-С1и.Protein elution from NizTgar columns was carried out by gradient elution with 20 column volumes of buffer A (ZFR) - buffer B (ZFRO25M imidazole (IX-0005, EM Megsk) pH 7.4). Elution of the protein from the anti-action column was carried out using SFR containing 0.1 mg/ml of the EUMRTO peptide competing with the Sin-C1y epitope.

Фракції досліджували з використанням електрофорезу у ДСН-ПААГ і Вестерн-блоту або мас-спектрометрії і об'єднували придатним чином.Fractions were examined using SDS-PAGE electrophoresis and Western blot or mass spectrometry and combined as appropriate.

Об'єднані ЕСО або субдомени РЕК додатково очищали гель-фільтраційною хроматографією з використанням колонки Зирегдех 75 26/60 (ЗЕ Неакнпсаге), зрівноваженої у ЗФР, і використовували швидкість потоку 2,5 мл/хв. На ці колонки наносили не більше 10 мл. Фракції досліджували електрофорезом у ДСН/ПААГ і об'єднували придатним чином.The combined ESO or REC subdomains were further purified by gel filtration chromatography using a Ziregdeh 75 26/60 column (ZE Neaknpsage) equilibrated in SFR and using a flow rate of 2.5 ml/min. No more than 10 ml was applied to these columns. Fractions were examined by electrophoresis in SDS/PAGE and combined in a suitable manner.

Приклад 2Example 2

Виділення мішень-специфічних антитіл з бібліотек фагового дисплею антитіл людиниIsolation of target-specific antibodies from phage display libraries of human antibodies

Для виділення панелі антитіл, здатних нейтралізувати активність РКК людини, досліджували паралельно три бібліотеки фагового дисплею антитіл людини, що експресують 5сЕм-фрагменти.To select a panel of antibodies capable of neutralizing the activity of human RCC, three phage display libraries of human antibodies expressing 5cEm fragments were studied in parallel.

Використовуваною мішенню для пенінгу бібліотек був розчинний позаклітинний домен (ЕСО) рецептора пролактину (амінокислоти 25-234 рецептора пролактину людини), одержаний, як описано у прикладі 1. Цей рецептор біотинілювали (МНЗ-1 С біотин, Ріегсе) і розчинний пенінг виконували на біотинільованому ЕСО.The target used for penning the libraries was the soluble extracellular domain (ECD) of the prolactin receptor (amino acids 25-234 of the human prolactin receptor), obtained as described in Example 1. This receptor was biotinylated (MNZ-1C biotin, Riegse) and soluble penning was performed on biotinylated ESO

Відбір мішень-специфічного антитіла з фагового дисплею проводили відповідно до способів, описанихThe selection of target-specific antibodies from the phage display was carried out according to the methods described

Маїкз еї аї. (Мешоав» Мої! Вісі. 248:161-76, 2004). Коротко, бібліотеку фагового дисплею інкубували з 50 пмоль біотинільованого ЕСО при кімнатній температурі протягом 1 години, і потім утворений комплекс захоплювали 100 мкл суспензії стрептавідинових гранул (ОупареадзФ М-280 бігеріаміаіп, Іпмігодеп).Maikz ei ai. (Meshoav" My! Axis. 248:161-76, 2004). Briefly, the phage display library was incubated with 50 pmol of biotinylated ESO at room temperature for 1 hour, and then the complex formed was captured by 100 μl of a suspension of streptavidin beads (OupareadzF M-280 bigeriamiaip, Ipmigodep).

Неспецифічні фаги видаляли промиванням промивальним буфером (З3ФРя-59ю молоко). Зв'язані фаги елюювали 0,5 мл 100 нМ Триетиламіну (ТЕА) і відразу ж нейтралізували додаванням рівного об'єму 1МNon-specific phages were removed by washing with washing buffer (Z3Frya-59 milk). Bound phages were eluted with 0.5 ml of 100 nM Triethylamine (TEA) and immediately neutralized by adding an equal volume of 1M

ТРИС-СІ рН 7,4. Пул елюйованого фагу використовували для інфікування клітин Е. соїї ТО1, що ростуть у логарифмічній фазі росту, і фагміду рятували як описано (Меїпоаз Мої! Віої. 248:161-76, 2004). Відбір повторювали протягом у цілому трьох раундів. Окремі колонії, одержані з клітин ТО1, інфікованих елюйованим фагом з третього раунду пенінгу, піддавали скринінгу на зв'язувальну активність в аналізіTRIS-SI pH 7.4. A pool of eluted phage was used to infect E. soya TO1 cells growing in logarithmic phase growth, and the phagemid was rescued as described (Meipoase Moi! Vioi. 248:161-76, 2004). The selection was repeated for a total of three rounds. Individual colonies obtained from TO1 cells infected with eluted phage from the third round of penning were screened for binding activity in the assay

ЕПЗА. Коротко, окремі колонії, одержані з клітин ТО1, інфікованих елюйованим фагом, використовували для інокуляції середовищ у 96-ямкових планшетах. Мікрокультури вирощували до ОЮОвоо-0,6 і у цей момент індукували експресію розчинного фрагмента антитіла додаванням 1 мМ ІРТО після нічного культивування у струшуваному термостаті при 30"С. Бактерії викручували і одержували периплазматичний екстракт, і використовували його для детектування зв'язувальної активності антитіл стосовно ЕСО, іммобілізованого на 96-ямкових мікропланшетах (96-ямкових плоскодонних планшетах Іттипозого, Мипс) відповідно до стандартного протоколу ЕГІ5А, забезпеченого виробником.EPZA. Briefly, individual colonies obtained from TO1 cells infected with eluted phage were used to inoculate media in 96-well plates. The microcultures were grown to 0.6 OO, and at this point the expression of the soluble fragment of the antibody was induced by adding 1 mM IRTO after overnight cultivation in a shaking thermostat at 30°C. The bacteria were twisted and the periplasmic extract was obtained, and it was used to detect the binding activity of the antibodies in relation to ESO immobilized on 96-well microplates (96-well flat-bottom plates of Ittypozogo, Mips) according to the standard EGI5A protocol provided by the manufacturer.

Афінності антитіл проти рецептора пролактину (РКК) стосовно зв'язування з рекомбінантним позаклітинним доменом (ЕСО) визначали з використанням ВіасогеФ 2000 і використовували для ранжування афінності антитіл. Поверхню захоплення білка А/5 використовували для злиттів 5сСЕм-Ес людини, а поверхню захоплення кролячого антитіла проти мишачого Ідо-Ес (НАМ-Ес) використовували для антитіл, що продукуються гібридомами. Чіпи захоплення білка А/5 і ЕАМ-Ес були сенсорними чіпами СМ5 з максимальними рівнями захоплюючої молекули (або білка А/б, або КАМ-Ес), іммобілізованої на всіх чотирьох проточних комірках за допомогою стандартних способів зв'язування ЕОС-МН5-амін відповідно до рекомендованого протоколу з ВіасогеФ Іпс. Робочим буфером був НВ5-ЕР (ВіасогеФ, Іпс.), температуру встановлювали на 25"С, і швидкість потоку була спочатку 10 мкл/мл. Очищені антитіла розбавляли у НВ5-Affinities of antibodies against the prolactin receptor (PRK) in relation to binding to the recombinant extracellular domain (ESD) were determined using ViasogeF 2000 and used to rank the affinity of the antibodies. The A/5 protein capture surface was used for human 5cSEm-Es fusions, and the rabbit anti-mouse Ido-Es (NAM-Es) capture surface was used for hybridoma-produced antibodies. Protein A/5 and EAM-Es capture chips were CM5 sensor chips with maximal levels of capture molecule (either protein A/b or CAM-Es) immobilized on all four flow cells using standard EOS-MH5-amine binding methods in accordance with the recommended protocol with ViasogeF Ips. The working buffer was HB5-ER (ViasogeF, Ips.), the temperature was set at 25"С, and the flow rate was initially 10 μl/ml. Purified antibodies were diluted in HB5-

ЕР для наближення до концентрацій 1-3 мкг/мл та ін'єктували на захоплюючі чіпи протягом 1-2 хвилин.ER to approach concentrations of 1-3 μg/ml and injected onto capture chips within 1-2 minutes.

Швидкість потоку збільшували до 25-30 мкл/хв. Рекомбінантний ЕСО РКІК розбавляли до 1 мкг/мл та ін'єктували протягом 5-6 хвилин з 10-хвилинною дисоціацією.The flow rate was increased to 25-30 μl/min. Recombinant ESO RKIK was diluted to 1 μg/ml and injected within 5-6 minutes with a 10-minute dissociation.

Підгонки виконували з використанням програми ВІіАЄЕмаїчайоп і використовували для розрахунку кінетичних констант швидкості асоціації і дисоціації (Коп і Кох, відповідно). Модель взаємодії 1:1 Гапдтиіїг з корекцією перекосу мас використовували для виконання одночасної підгонки Ка/ка на кожній пробі. Декілька проб підганяли одночасно з параметрами Ктах, Коп і Коб, встановленими на її ІосаІ. При спостереженні дрейфу фону використовували модель з дрейфуючим фоном з встановленням величини дрейфу і вводили вручну. Величини дрейфу варіювалися від -0,03 до «0,05 КШ/сек.Fittings were performed using the VIiAEEEmaichayop program and were used to calculate the kinetic constants of association and dissociation rates (Kop and Koch, respectively). A 1:1 Gaptiiig interaction model with mass bias correction was used to perform a simultaneous Ka/ka fit on each sample. Several samples were fitted simultaneously with parameters Ktah, Kop and Kob set on its IosaI. When observing the drift of the background, a model with a drifting background was used with the setting of the drift value and entered manually. The drift values varied from -0.03 to "0.05 KSH/sec.

Зв'язування антитіл оцінювали також вимірюванням зв'язування з клітинами, що експресують рецептор пролактину, з використанням аналізу сортингу клітин зі збудженням флуоресценції (ГАС5) і способу флуометричного мікрооб'ємного аналізу (ЕМАТ) (Зулхагг тап еї аї., Апа! Віоспет. 271:143-51, 1999). Клони, які виявляли зв'язування в аналізах ГАС5З5 або ЕМАТ, секвенували, і клони, що кодують унікальні послідовності білків СОКЗ важкого ланцюга і СОКЗ легкого ланцюга, переформатували у формат 5сЕхм-Ес, як описано у прикладі З нижче. Ці 5сЕм-Ес випробовували на здатність інгібувати РЕ Е-індуковане фосфорилування ЕККТ/2 і РЕ К-індуковану проліферацію лінії клітин Вагз3/РЕГК, як описано у прикладах 5 і 6 нижче. Відібрані антитіла додатково характеризували на зв'язування з ЕСО, 51 і 52, а також на відносну конкуренцію між парами антитіл за зв'язування з ЕСО РЕ. ЕК, як описано у прикладі 7. Дані для відібраних антитіл представлені у таблиці 4.Antibody binding was also assessed by measuring binding to cells expressing the prolactin receptor using the fluorescence-excited cell sorting assay (HAS5) and the flowometric microvolume assay (EMAT) method (Zulhagg et al., Apa! Viospet. 271:143-51, 1999). Clones that showed binding in the GAS5Z5 or EMAT assays were sequenced, and clones encoding unique sequences of the heavy chain SOCZ and SOCZ light chain proteins were reformatted into 5cEhm-Es format as described in Example C below. These 5sem-Es were tested for the ability to inhibit PE E-induced phosphorylation of ECKT/2 and PE K-induced proliferation of the Vag3/REHK cell line, as described in examples 5 and 6 below. Selected antibodies were further characterized for binding to ESO, 51 and 52, as well as relative competition between pairs of antibodies for binding to ESO RE. EC as described in Example 7. Data for selected antibodies are presented in Table 4.

Таблиця 4 с. Афінність або Епітоп ріп (антитіла уTable 4 p. Affinity or Epitope rip (antibodies in

Антитіло інгібування поопіферяії дя рівноважна. . Домен- тому самому біпAntibody inhibition poopiferaii dya equilibrium. . The domain is the same beep

РЕВКІ/? вагз/РвІ до 0/ (Константа дисоціації, Іспецифічністьіконкурують за зв'язуванняREVKI/? vagz/PvI to 0/ (Dissociation constant, Ispecificity compete for binding

Ко (нМ) з РКГ-К)Co (nM) with RKG-K)

ХРА.06.158 | 001 | 006 2 | 07 | 58 | 45ХРА.06.158 | 001 | 006 2 | 07 | 58 | 45

ХРА.06.178 | 009 | 023 | 20 | 8 | 88 З хнАове83 | 01 | 01 | 77лод/ | 57 | 6 2 2щ:ь жкчЗ хнАовл8 | 02 | 015 | од | 81 | БО 38 щсуря хнАов.567 | 065 | 706 | (08 г | 52 | 65ХРА.06.178 | 009 | 023 | 20 | 8 | 88 From khnAove83 | 01 | 01 | 77 lod/ | 57 | 6 2 2sh:ь zhkchZ hnAovl8 | 02 | 015 | from | 81 | BO 38 shsurya khnAov.567 | 065 | 706 | (08 g | 52 | 65

Приклад ЗExample C

Нереформатування клонів у формат зсЕхм-ЕсNot reformatting clones into the zsEkhm-Es format

Для кожного унікального клону 5СЕм, ідентифікованого у прикладі 2, кКДНК, що кодує фрагмент 5сегУ, ампліфікують за допомогою ПЛР з вектора фагового дисплею і лігують в експресуючий вектор ссавців, що є модифікацією запатентованого ХОМА експресуючого вектора (описаного у УМО 2004/033693, що кодує гени константної області каппа (к), лямбда (Х) або гамма-2 (у2)), роблячи можливою експресію кожного антитіла в 5СЕМ-Ес, де Ес-частина цього білка представляє домени СНаІ2 і СНЗ молекули Іде1. Конструювання злитих білків зсЕм-Ес добре відоме у даній галузі, наприклад, див. ЕРгедегіск5 еї а!., Ргоївіп Епд Оез 5еї 2004 ап; 17():95-106, Ромегз еї а!., У Іттипо! Меїподв». 2001 Мау 1; 251(1-2):123-35, або Зпи еї аї!., Ргос. Маї. Асай.For each unique 5SEm clone identified in example 2, cDNA encoding a 5segU fragment is amplified by PCR from a phage display vector and ligated into a mammalian expression vector, which is a modification of the patented HOMA expression vector (described in UMO 2004/033693, which encodes genes of the constant region kappa (k), lambda (X) or gamma-2 (y2)), making possible the expression of each antibody in 5SEM-Es, where the Es-part of this protein represents the CNaI2 and SNZ domains of the Ide1 molecule. The construction of cSMS fusion proteins is well known in the art, for example, see ERgedegisk5 ei a!., Rgoivip Epd Oez 5ei 2004 ap; 17():95-106, Romegz ei a!., U Ittypo! Meipodv". 2001 Mau 1; 251(1-2):123-35, or Zpy ei ai!., Rhos. May Asai.

Зсі ОБА 1993, 90, 7995-7998. Патент США 5892019 також описує конструювання вектора Ес-злитого білка і експресію злитих білків 5сСЕм-Ес.Zsi OBA 1993, 90, 7995-7998. US patent 5892019 also describes the construction of an Es-fusion protein vector and the expression of 5cSem-Es fusion proteins.

Експресію цього злитого білка виконують трансфекцією суспензійних клітин 293Е з Ліпофектаміном 2000 (Іпмйгодеп) з використанням інструкцій виробника. Після п'яти днів ці клітини видаляють центрифугуванням, і злитий білок 5сЕм-Ес очищають з супернатанту з використанням білок А-сефарози (СЕExpression of this fusion protein is carried out by transfection of 293E suspension cells with Lipofectamine 2000 (Ipmygodep) using the manufacturer's instructions. After five days, these cells are removed by centrifugation, and the 5sEM-Es fusion protein is purified from the supernatant using protein A-sepharose (CE

Неаїсаге) відповідно до пропонованого виробником протоколу.Neaisage) according to the protocol proposed by the manufacturer.

Приклад 4Example 4

Ідентифікація мішень-специфічних антитіл, що секретуються мишачими гібридомамиIdentification of target-specific antibodies secreted by mouse hybridomas

Мишачі антитіла проти позаклітинного домену (ЕСО) рецептора пролактину людини (РКК) генерували наступним чином. Шість мишей ВаїЇр/С імунізували підшкірною ін'єкцією рекомбінантним позаклітинним доменом РКК (описаним вище). Миші одержували 10 ін'єкцій протягом 28-денного періоду. Через чотири дні після кінцевої ін'єкції мишей умертвляли і збирали дренуючі лімфатичні вузли. Після суспендування клітин з цих лімфатичних вузлів їх зливали з лінією клітин мієломи мишей РЗ3хА9д8.653 злиттям за допомогою електроелементу з використанням ВТХ ЕСМ2001 ЕІесіго-СеїЇ Мапіршаюг (Нагмага Аррагайив).Mouse antibodies against the extracellular domain (ECD) of the human prolactin receptor (HRC) were generated as follows. Six VaIr/C mice were immunized by subcutaneous injection with the recombinant extracellular domain of RKK (described above). Mice received 10 injections over a 28-day period. Four days after the final injection, mice were sacrificed and draining lymph nodes were collected. After suspension of cells from these lymph nodes, they were fused with the mouse myeloma cell line RZ3хА9д8.653 by fusion with the help of an electric element using the VTX ESM2001 EIesigo-Seiyi Mapirshayug (Nagmaga Arragaiiv).

Після злиття ці клітини висівали приблизно у 40 96-ямкових планшетів. Через 12 днів ці планшети піддавали скринінгу за допомогою ЕГІЗА проти рекомбінантного ЕСО і у ЕМАТ. Цей аналіз ЕМАТ використовував клітинну лінію СНО, трансфіковану для експресії високого рівня рецептора РК. Кк.After confluence, these cells were seeded into approximately 40 96-well plates. After 12 days, these tablets were screened using EGISA against recombinant ESO and in EMAT. This EMAT assay used a CHO cell line transfected to express high levels of the RK receptor. Kk

Відібрані гібридоми випробовували на здатність інгібувати РЕ Е-індуковане фосфорилування ЕККТ1/2 іThe selected hybridomas were tested for the ability to inhibit PE E-induced phosphorylation of EKKT1/2 and

РАЇ В-індуковану проліферацію клітинної лінії Ває3/РЕЇ ЕЕ, як описано у прикладах 5 і 6 нижче. Відібрані антитіла додатково характеризували на зв'язування з ЕСО, 51 і 52, а також на відносну конкуренцію між парами антитіл за зв'язування з ЕСО РЕК, як описано у прикладі 7. Дані для відібраних антитіл представлені у таблиці 4.RAI B-induced proliferation of the Vae3/RAI EE cell line as described in examples 5 and 6 below. Selected antibodies were further characterized for binding to ESO, 51 and 52, as well as relative competition between pairs of antibodies for binding to ESO REC as described in Example 7. Data for selected antibodies are presented in Table 4.

Приклад 5Example 5

Визначення дії антитіл на фосфорилування ЕКК1/2Determination of the effect of antibodies on EKK1/2 phosphorylation

Після 5-годинного сироваткового голодування клітини Т47О висівали у мікротитраційні планшети у повному середовищі для вирощування і вирощували протягом 24 годин при 37"С. Клітини промивали двічі забуференим фосфатом сольовим розчином (ЗФР) та інкубували з антитілами, розведеними у безсироватковому середовищі, що містить 0,195 БСА, протягом 30 хвилин при 37"С. Кінцева вихідна концентрація цих антитіл дорівнювала 40 мкг/мл. Середовище видаляли і пролактин, розведений у безсироватковому середовищі, що містить 0,195 БСА, додавали у кінцевій концентрації 30 нг/мл. Клітини інкубували з пролактином протягом 30 хвилин при 37"С з подальшими двома промиваннями охолодженим на льоді ЗФР. Для генерування лізатів клітин додавали стандартний лізисний буфер, що містить детергенти, хелатори і різні інгібітори протеази і фосфатази. Рівні фосфорилованого ЕКК1/2 (рЕЕКТ1Т/2) вимірювали з використанням стандартного ЕГІЗА відповідно до інструкцій ЮШОШОБЕТФ ІС РПпозрпо-After a 5-hour serum starvation, T47O cells were plated in microtiter plates in complete growth medium and grown for 24 hours at 37°C. Cells were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and incubated with antibodies diluted in serum-free medium containing 0.195 BSA, for 30 minutes at 37"С. The final initial concentration of these antibodies was equal to 40 μg/ml. The medium was removed and prolactin diluted in serum-free medium containing 0.195 BSA was added to a final concentration of 30 ng/ml. Cells were incubated with prolactin for 30 minutes at 37°C followed by two washes with ice-cold PBS. To generate cell lysates, a standard lysis buffer containing detergents, chelators, and various protease and phosphatase inhibitors was added. Levels of phosphorylated EKK1/2 (rEECT1T/2 ) were measured using the standard EGISA in accordance with the instructions of the Yushoshhobetf IS RPpozrpo-

ЕАКТ/ЕКК2, КО Зуєкіетв, Іпс. Результати репрезентативного аналізу представлені на Фігурах2, Зі4 а результати аналізу на відібрані антитіла, показані вище у таблиці 4.ЕАКТ/ЕКК2, КО Zuikeetv, Ips. The results of a representative analysis are presented in Figures 2 and 4, and the results of the analysis of selected antibodies are shown in Table 4 above.

Фігура 7А-7С показує амінокислотні послідовності МН і МІ. антитіл, які мали більш ніж 8095-е інгібування в аналізі РЕКК.Figure 7A-7C shows the amino acid sequences of MH and MI. of antibodies that had more than 8095th inhibition in the RECK assay.

Приклад 6Example 6

Визначення дії антитіл на проліферацію РЕ! -чутливих клітинних лінійDetermination of the effect of antibodies on the proliferation of RE! - sensitive cell lines

Клітини Ваг3/РКІК генерували електропорацією мишачої про-В-клітинної лінії Ває3 експресуючим вектором, що має касету повнорозмірного РКК людини і стійкість до неоміцину. Клітини відбирали протягом 7 днів у середовищах, доповнених 5418 (1 мг/мл) і гтіЇ-3 (10 нг/мл), з подальшим 7-денним періодом відбору в ГПРЕЇ. (1 мкг/мл) без 5418 або 1-3. Протягом 14-денного періоду концентрацію РЕ.Vag3/RKC cells were generated by electroporation of the murine pro-B cell line Vag3 with a vector expressing a full-length human RKK cassette and resistance to neomycin. Cells were selected for 7 days in media supplemented with 5418 (1 mg/ml) and gtiI-3 (10 ng/ml), followed by a 7-day selection period in GPREI. (1 μg/ml) without 5418 or 1-3. During the 14-day period, the concentration of RE.

середовища зменшували ступінчастим чином, доки не одержували підтримуючий рівень 50 нг/мл. У день експерименту ї1х107 клітин висівали у кожну ямку плоскодонного 96-ямкового планшету. Антитіла (у форматі злитого білка зсЕм-Ес) додавали в ямки у концентрації 10 мкг/мл, з 50 нг/мл гРЕЇГ. або без нього.medium was reduced stepwise until a maintenance level of 50 ng/ml was obtained. On the day of the experiment, 1x107 cells were seeded into each well of a flat-bottomed 96-well plate. Antibodies (in the form of a csEm-Es fusion protein) were added to the wells at a concentration of 10 μg/ml, with 50 ng/ml gREIG. or without it.

Планшети інкубували протягом 48 годин і аналізували з використанням реагенту СейПТйег (іо.Tablets were incubated for 48 hours and analyzed using the SeiPTyeg reagent (io.

Використовували проби у трьох повторах, агонізм оцінювали за проліферацією клітин, що індукується антитілами за відсутності РКГ,, тоді як антагонізм визначали за проліферацією клітин у присутності РЕ...Triplicate samples were used, agonism was assessed by antibody-induced cell proliferation in the absence of RKG, while antagonism was determined by cell proliferation in the presence of PE...

Результати цього аналізу проліферації для відібраних антитіл показані вище у таблиці 4.The results of this proliferation assay for selected antibodies are shown in Table 4 above.

Для аналізу РЕ -індукованої проліферації та інгібування проліферації анти-РВЇ В-антитілами клітиниFor the analysis of PE-induced cell proliferation and proliferation inhibition by anti-RVI B-antibodies

Т47О або МСЕ7-МСІ розділяли при щільності 1х1092 клітин/мл звичайного середовища (середовища ВЕРМІ, що не містить фенолового червоного/109о ФТС) у колбу 175 (загальний об'єм 12 мл). Через 72 години після розділення клітини трипсинізували, рахували і висівали при щільності 5К на ямку (Т470) або 20К на ямку (МСЕ7) у плоскодонний 96-ямковий планшет (100 мкл на ямку). Клітини МСЕ? висівали у безсироватковому і такому, що не містить фенолового червоного ЕРМІ, клітини Т470 висівали або у безсироватковому ЕРМІ, або в ЕРМІ, що містить 1095 очищену вугіллям сироватку. Через 24 години після висівання в ямки додавалиT47O or MSE7-MCI were separated at a density of 1x1092 cells/ml of normal medium (VERMI medium without phenol red/109o FTS) in flask 175 (total volume 12 ml). 72 hours after separation, cells were trypsinized, counted and seeded at a density of 5K per well (T470) or 20K per well (MCE7) in a flat-bottomed 96-well plate (100 μl per well). MSE cells? were seeded in serum-free and phenol red-free ERMI, T470 cells were seeded either in serum-free ERMI or in ERMI containing 1095 charcoal-purified serum. 24 hours after sowing, it was added to the wells

РЕ. і анти-РВІ В-антитіла (50 мкл, Зх концентровані). Після 72 годин інкубації у планшет додавали (ЗНІ- тимідин (1 мкКі на ямку) протягом щонайменше б годин у термостаті при 37"С. Клітини збирали з використанням трипсину і харвестера клітин Тотіес 96 для ямкових планшетів. Потім фільтри переносили у люмінометр Тих і аналізували (відрах. 1 хв.). Результати дослідження проліферації на Фігурі 5 показують, що 5сЕм інгібує опосередковане пролактином збільшення проліферації.RE. and anti-RVI B-antibodies (50 μl, Хх concentrated). After 72 hours of incubation, ZNI- thymidine (1 μCi per well) was added to the plate for at least two hours in a thermostat at 37"C. Cells were collected using trypsin and a Toties 96 cell harvester for well plates. Then the filters were transferred to a Tikh luminometer and analyzed (min. 1 min.) The results of the proliferation assay in Figure 5 show that 5cEm inhibits the prolactin-mediated increase in proliferation.

Приклад 7Example 7

Вимірювання афінності зв'язування і конкуренції за допомогою ВІАСОКЕMeasurement of binding affinity and competition using VIASOK

Аналіз ВІАСОКЕ, описаний вище у прикладі 2, повторювали для визначення відносного зв'язування відібраних антитіл з доменами ЕСО, 51 і 52 РЕ ЕК, як описано вище, за винятком того, що білки 51, 52 абоThe VIASOK assay described above in Example 2 was repeated to determine the relative binding of the selected antibodies to the ESO, 51, and 52 PE EC domains as described above, except that proteins 51, 52, or

ЕСО ін'єктували при 10 мкг/мл протягом 2 хвилин при 15 мкл/хв. Дані з цього аналізу збирали у вигляді повідомлених точок (резонансних одиниць (К)) з використанням контрольного програмного забезпеченняESO was injected at 10 μg/ml for 2 minutes at 15 μl/min. Data from this analysis were collected as reported points (resonance units (K)) using control software

ВіасогеФ, і нормалізували діленням кількості зв'язаного антигену на кількість захопленого антитіла. Дані показані у таблиці 5 нижче.ViasogeF, and normalized by dividing the amount of bound antigen by the amount of captured antibody. The data is shown in Table 5 below.

Таблиця 5Table 5

Нормалізоване зв'язування 51, 52 і ЕСО анти-РВІ В-антитілами 11111101 Зв'язанийфрагментРВІ В (зв'язані ВО/захопленіО).ї//-:/ /-/Normalized binding of 51, 52 and ESO by anti-RVI B-antibodies 11111101 Bound fragment of RVI B (bound VO/captured O).ъ//-:/ /-/

Афінності очищених антитіл визначали виконанням серії ін'єкцій на ВіасогеФ 2000. Генеровані афінність і константи швидкостей є релевантними стосовно зв'язування цими антитілами рекомбінантного позаклітинного домену (ЕСО) рецептора пролактину (РЕК) при 25"С у буферній системі НВ5З-ЕР. СМ5- сенсорний чіп з приблизно 5000-1000 КІ білка А/5 готували стандартними хімічними способами зв'язування ЕОС-МН5-аміну відповідно до рекомендованого протоколу з ВіасогефФ Іпс. і використовували для захоплення антитіл. Очищені антитіла розбавляли до приблизно 1 мкг/мл у буфері НВ5З-ЕР для захоплення. Визначали час ін'єкції необхідний для одержання 250 і 400 КО захоплення антитіла.The affinities of the purified antibodies were determined by performing a series of injections on ViasogeF 2000. The generated affinity and rate constants are relevant to the binding by these antibodies of the recombinant extracellular domain (ECD) of the prolactin receptor (REK) at 25"C in the HB5Z-ER buffer system. CM5- A sensor chip with approximately 5,000-1,000 CI of A/5 protein was prepared by standard EOS-MH5-amine binding chemistry according to the recommended protocol with ViasogefF IPS and used for antibody capture. Purified antibodies were diluted to approximately 1 μg/ml in HB5Z buffer. -ER for capture The injection time required to obtain 250 and 400 KO of antibody capture was determined.

Захоплення антитіл для кінетичного аналізу виконували ін'єкцією цих антитіл при 10 мкл/хв. протягом 1,5-3 хвилин, в залежності від результатів оптимізації рівня захоплення.Capture of antibodies for kinetic analysis was performed by injection of these antibodies at 10 μl/min. within 1.5-3 minutes, depending on the results of the capture level optimization.

Для кінетичного аналізу швидкість потоку встановлювали при 40 мкл/хв. Готували п'ять концентраційFor kinetic analysis, the flow rate was set at 40 μl/min. Five concentrations were prepared

ЕСО РЕЇГ Е у серійному розведенні 1:3 з 148 НМ (4 мкг/мл) або 37 НМ (1 мкг/мл). Кожну концентрацію плюс буферний контроль (концентрація нуль) ін'єкгували у двох повторах. Набори даних мали подвійний контроль і їх підганяли глобально з використанням моделі взаємодії зв'язування 1:1 Гапдтиїіг. Той самий аналіз виконували для Ід-переформатованої конструкції ХРА.0О6.167 як для ІдС1-, так і для Ідс2-конструкцій.ESO REIG E in a serial dilution of 1:3 with 148 NM (4 μg/ml) or 37 NM (1 μg/ml). Each concentration plus a buffer control (concentration zero) was injected in duplicate. Datasets were double-blinded and fitted globally using a 1:1 Gaptiiig binding interaction model. The same analysis was performed for the Id-reformatted construct XPA.0O6.167 for both the IdS1 and Ids2 constructs.

Кінетичні константи і афінності зв'язування відібраних антитіл з ЕСО РЕ. К зображені у таблиці 6 нижче.Kinetic constants and binding affinities of selected antibodies with ESO RE. K are shown in Table 6 below.

Таблиця 6Table 6

Подібні процедури використовували для визначення кінетичних констант і афінностей для додаткових антитіл (підсумованих у таблиці 7 нижче).Similar procedures were used to determine kinetic constants and affinities for additional antibodies (summarized in Table 7 below).

Таблиця 7 11111111 ЇГ111111пки Ї711171717171711слки | 77777171 ко 11111111 Г11111111пки Ї77111717171711лки | 77777717 коTable 7 77777171 ko 11111111 G11111111pki Y77111717171711lki | 77777717 ko

Відносну конкуренцію або інтерференцію між парами антитіл (наприклад, в аналізі спарювання) за зв'язування з РКК визначали наступним чином у стратегії серійного конкурентного аналізу. У цьому підході одне антитіло іммобілізують на сенсорному чіпі, або безпосередньо, або через захоплюючий агент, і дають зв'язувати ЕСО при ін'єкції його на це іммобілізоване антитіло. Коли необхідно, надлишковий захоплюючий агент блокують ін'єкцією високої концентрації іррелевантного до (наприклад, при тестуванні двох мишачих антитіл з використанням захоплюючої поверхні з кролячим антитілом проти мишачого Ід). Потім ін'єктують антитіло, що підлягає тестуванню на конкуренцію, і визначають його здатність зв'язуватися з ЕСО, захопленим першим антитілом. Якщо ці два антитіла зв'язуються з просторово розділеними епітопами наRelative competition or interference between pairs of antibodies (eg, in a pairing assay) for binding to RCC was determined as follows in a serial competitive assay strategy. In this approach, one antibody is immobilized on a sensor chip, either directly or via a capture agent, and allowed to bind ESO when injected onto this immobilized antibody. When necessary, the excess capturing agent is blocked by injection of a high concentration of an irrelevant to (for example, when testing two mouse antibodies using a capturing surface with a rabbit anti-mouse Id antibody). Then inject the antibody to be tested for competition and determine its ability to bind to ESO captured by the first antibody. If these two antibodies bind to spatially separated epitopes on

ЕСО, то друге антитіло повинно бути також здатне зв'язуватися з комплексом ЕСР/перше антитіло. Якщо ці два антитіла інтерферують або конкурують, то друге антитіло буде не здатне добре зв'язуватися або взагалі зв'язуватися з комплексом ЕСО/перше антитіло. Результати цього конкурентного аналізу зображені у таблиці 4 вище (якщо два антитіла мають той самий номер біп, вони будуть конкурувати один з одним за зв'язування з ЕСО, і вони будуть проявляти той самий характер зв'язування проти антитіл з інших біп).ESR, then the second antibody must also be able to bind to the ESR/first antibody complex. If these two antibodies interfere or compete, the second antibody will not be able to bind well or at all to the ESO/first antibody complex. The results of this competition analysis are shown in Table 4 above (if two antibodies have the same bip number, they will compete with each other for binding to ESO, and they will show the same binding pattern against antibodies from other bips).

Даний винахід конкретно розглядає ідентифікацію інших антитіл, які зв'язуються з тим самим епітопомThe present invention specifically contemplates the identification of other antibodies that bind to the same epitope

РЕГЕ, що і будь-яке з антитіл у Бріп, описаних тут, або які конкурують з такими антитілами за зв'язуванняREGE that any of the antibodies in Breep described herein or that compete with such antibodies for binding

ЕСО РАГВ.ESO RAHV.

Приклад 8Example 8

Дія на РЕГ!--індуковане фосфорилування РЕ КЕ, 5ТАТ5 і АКТ відповідно до Вестерн-блотингуAction on REG!-induced phosphorylation of RE KE, 5TAT5 and AKT according to Western blotting

Здатність відібраних антитіл інгібувати РЕЇ-індуковане фосфорилування ЗТАТ5 і АКТ визначали наступним чином. Клітини висівали протягом ночі у б-ямкові чашки при щільності 3х105 клітин/мл у середовищі КРМІ, що не містить фенолового червоного/1095 ФТС. Наступного дня середовище заміняли безсироватковим КРМІ і витримували протягом 30 хвилин. У деяких експериментах анти-РВЇ В-антитіла або неспецифічні контрольні антитіла інкубували з клітинами під час цього періоду сироваткового голодування. Потім в ямки додавали 50 нг/мл РЕГ. протягом 30 хв., після чого клітини промивали один раз уThe ability of the selected antibodies to inhibit REI-induced phosphorylation of ZTAT5 and AKT was determined as follows. Cells were seeded overnight in b-well dishes at a density of 3x105 cells/ml in a KRMI medium containing no phenol red/1095 FTS. The next day, the medium was replaced with serum-free infant formula and kept for 30 minutes. In some experiments, anti-RBV B antibodies or non-specific control antibodies were incubated with cells during this period of serum starvation. Then 50 ng/ml REG was added to the wells. for 30 min., after which the cells were washed once in

ЗФР і лізували у буфері, що складається з 50 мМ Трис-НСЇ, рН 7,4, 150 мМ Масі, 1 мМ ЕДТА, 195 МР-40, 1ZFR and lysed in a buffer consisting of 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM Mass, 1 mM EDTA, 195 MP-40, 1

ММ МазОМа:, 50 мМ Маг, 0,2595 дезоксихолату та інгібіторів протеаз. Пробірки центрифугували при 14000 об./хв. в охолоджуваній мікрофузі, і лізати визначали кількісно з використанням БСА -реагентів. 30 мкг лізату цілих клітин розділяли за допомогою електрофорезу у ДСН-ПААГ, і білки детектували з використанням фосфоспецифічних антитіл проти ЗТАТ5А/В (у694/у699, Орвіаге) або РКІК (У546/У611, власні) і ЕСІ.MM MazOMa:, 50 mM Mag, 0.2595 deoxycholate and protease inhibitors. The test tubes were centrifuged at 14,000 rpm. in a cooled microfuge, and lysates were quantified using BSA reagents. 30 μg of whole cell lysate was separated by electrophoresis in SDS-PAGE, and proteins were detected using phosphospecific antibodies against ZTAT5A/B (u694/u699, Orviage) or RKIK (U546/U611, own) and ESI.

Рівне нанесення білків визначали за забарвлюванням антитілами, специфічними стосовно загального 5ТАТ5 (ВО) або РЕ Е (7утед) або АКТ (передача сигналу клітини). Результати репрезентативного аналізу дії РК. К-специфічного антитіла на внутрішньоклітинне фосфорилування РЕ. К показані на Фігурі 6.The level of protein deposition was determined by staining with antibodies specific for total 5TAT5 (VO) or PE E (7uted) or AKT (cell signal transduction). The results of a representative analysis of the action of the RC. K-specific antibodies against intracellular phosphorylation of RE. K are shown in Figure 6.

Приклад 9Example 9

Гуманізація мишачих антитілHumanization of murine antibodies

Даний приклад представляє процедуру гуманізації мишачого анти-РВЇ В-антитіла.This example represents a procedure for humanizing a murine anti-RBV B antibody.

Конструювання генів для легкого і важкого ланцюгів гуманізованого РЕА В-антитілаConstruction of genes for light and heavy chains of humanized PEA B-antibody

Амінокислотні послідовності М. і МН для мишачих антитіл ХНА.06.983, ХНА.06б.275 і ХНА.06.642 представлені на Фігурі 10. Послідовність антитіла людини, ідентифіковану з використанням МаїопаїAmino acid sequences of M. and MN for murine antibodies ХНА.06.983, ХНА.06б.275 and ХНА.06.642 are presented in Figure 10. The sequence of the human antibody identified using Maiopaia

Віотедіса! Рошипаайоп Ргоїєїп Ідепіййсайоп АНезоцгсе або подібної бази даних, використовують для забезпечення каркасу цього гуманізованого антитіла. Для відбору послідовності гуманізованого важкого ланцюга мишачу послідовність важкого ланцюга порівнюють з послідовністю важкого ланцюга антитіла людини. У кожному положенні амінокислоту антитіла людини відбирають для гуманізованої послідовності, доки це положення не попадає у будь-яку з чотирьох категорій, визначених нижче, і у цьому випадку вибирають мишачу амінокислоту: (1) положення попадає в область, що визначає комплементарність (СОК), як визначено КаБбаї, 3.Viotedis! A Nesoztse database or similar database is used to provide the framework for this humanized antibody. To select the sequence of the humanized heavy chain, the sequence of the mouse heavy chain is compared with the sequence of the heavy chain of the human antibody. At each position, a human antibody amino acid is selected for humanized sequencing until the position falls into any of the four categories defined below, in which case a murine amino acid is selected: (1) the position falls within a complementarity-determining region (CDR), as defined by KaBbai, 3.

Іттипої, 125, 961-969 (1980); (2) амінокислота антитіла людини є рідкою для важких ланцюгів людини у цьому положенні, тоді як мишача амінокислота є звичайною для важких ланцюгів людини у цьому положенні; (3) положення є безпосередньо суміжним з областю СОР в амінокислотній послідовності мишачого важкого ланцюга; або (4) З-вимірне моделювання мишачого антитіла припускає, що ця амінокислота знаходиться фізично поблизу антигензв'язувальної області.Ittipoi, 125, 961-969 (1980); (2) the human antibody amino acid is rare for human heavy chains at this position, whereas the mouse amino acid is common for human heavy chains at this position; (3) the position is directly adjacent to the COP region in the amino acid sequence of the mouse heavy chain; or (4) 3-dimensional modeling of the murine antibody suggests that this amino acid is physically close to the antigen-binding region.

Для відбору послідовності гуманізованого легкого ланцюга мишачу послідовність легкого ланцюга порівнюють з послідовністю легкого ланцюга антитіла людини. Амінокислоту антитіла людини відбирають у кожному положенні для гуманізованої послідовності, доки це положення знову не попадає в одну з категорій, описаних вище і повторених нижче: (1) області СОБ; (2) мишача амінокислота, більш типова, ніж амінокислота антитіла людини; (3) поряд з областями СОК; абоTo select the sequence of the humanized light chain, the mouse light chain sequence is compared with the light chain sequence of the human antibody. The human antibody amino acid is selected at each position for the humanized sequence, until this position again falls into one of the categories described above and repeated below: (1) regions of SOB; (2) a murine amino acid that is more typical than a human antibody amino acid; (3) along with the areas of SOC; or

(4) можлива 3-вимірна близькість до області зв'язування.(4) possible 3-dimensional proximity to the binding region.

Фактичну нуклеотидну послідовність генів важкого і легкого ланцюга вибирають наступним чином: (1) нуклеотидні послідовності кодують амінокислотні послідовності, вибрані як описано вище; (2) 5 (ліворуч) від цих кодуючих послідовностей нуклеотидні послідовності кодують лідерну (сигнальну) послідовність. Ці лідерні послідовності вибирають як типові послідовності антитіл. (3) 3' (праворуч) від кодуючих послідовностей знаходяться послідовності, які йдуть за сегментом 95 мишачого легкого ланцюга і сегментом 92 мишачого важкого ланцюга, які є частиною мишачої послідовності. Ці послідовності включаються, оскільки вони містять донорні сигнали сплайсингу; і (4) на кожному кінці цієї послідовності знаходиться сайт Храї, що дозволяє розрізання у сайтах хХваї і клонування у сайт Хваї вектора.The actual nucleotide sequence of the heavy and light chain genes is selected as follows: (1) the nucleotide sequences encode the amino acid sequences selected as described above; (2) 5 (to the left) of these coding sequences, the nucleotide sequences encode the leader (signal) sequence. These leader sequences are chosen as typical antibody sequences. (3) 3' (to the right) of the coding sequences are sequences that follow segment 95 of the mouse light chain and segment 92 of the mouse heavy chain, which are part of the mouse sequence. These sequences are included because they contain donor splicing signals; and (4) at each end of this sequence is a Khrai site, which allows excision at the xXvai sites and cloning into the Xvai site of the vector.

Конструювання гуманізованих генів легкого і важкого ланцюгівConstruction of humanized light and heavy chain genes

Для синтезу важкого ланцюга синтезують чотири олігонуклеотиди з використанням ДНК-синтезатораFor the synthesis of the heavy chain, four oligonucleotides are synthesized using a DNA synthesizer

Арріїеа Віозубзіет5 3808. Два з цих олігонуклеотидів є частиною кожного тяжа важкого ланцюга, і кожний олігонуклеотид перекриває наступний олігонуклеотид приблизно 20 нуклеотидами для можливості відпалу.Arriea Viosubziet5 3808. Two of these oligonucleotides are part of each heavy chain backbone, and each oligonucleotide overlaps the next oligonucleotide by approximately 20 nucleotides to allow for annealing.

Разом ці олігонуклеотиди включають в себе всю гуманізовану варіабельну область важкого ланцюга з декількома зайвими нуклеотидами на кожній стороні для можливості розрізання у сайтах Хбаї. Ці олігонуклеотиди очищають з полі акрил амідних гелів.Together, these oligonucleotides include the entire humanized variable region of the heavy chain with a few redundant nucleotides on each side to allow for cleavage at the Hbay sites. These oligonucleotides are purified from poly acryl amide gels.

Кожний олігонуклеотид фосфорилують з використанням АТФ і полінуклеотидкінази Т4 стандартними процедурами (Мапіаїі5 еї а!., МоїІесшіаг СіІопіпд: А Гарогагу Мапаиаї, 279 еа., Соїа бріїпд Нагброг І арогаюгу,Each oligonucleotide is phosphorylated using ATP and polynucleotide kinase T4 by standard procedures (Mapiai5 ei a!., MoiIesshiag SiIopipd: A Garogagu Mapaiai, 279 ea., Soya briipd Nagbrog I arogayugu,

Соа 5ргіпд Нагрог, М.У. (1989)). Для відпалу цих фосфорилованих олігонуклеотидів, їх суспендують разом у 40 мкл ТА (33 мМ Трис-ацетат, рН 7,9, 66 мМ ацетат калію, 10 мМ ацетат магнію) при концентрації приблизно 3,75 мкМ (кожного), нагрівають до 957С протягом 4 хвилин і охолоджують повільно до 4"С. Для синтезу повного гена з цих олігонуклеотидів за допомогою синтезу протилежного тяжа кожного олігонуклеотиду у кінцевий об'єм 100 мкл додають наступні компоненти: мкл відпалених олігонуклеотидів 0,16 мм кожного дезоксирибонуклеотиду 0,5 мМ АТФ 0,5 мм ДТТ 100 мкг/мл БСА 3,5 мкг/мл білка д943 Т4 (ДНК-полімерази) мкг/мл білка 944/62 Т4 (допоміжного білка полімерази) 25 мкг/мл білка 45 (допоміжного білка полімерази)Soa 5rgipd Nagrog, M.U. (1989)). To anneal these phosphorylated oligonucleotides, they are suspended together in 40 μl TA (33 mM Tris-acetate, pH 7.9, 66 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate) at a concentration of approximately 3.75 μM (each), heated to 957C for 4 minutes and cooled slowly to 4"C. To synthesize a complete gene from these oligonucleotides using the synthesis of the opposite strand of each oligonucleotide, the following components are added to the final volume of 100 μl: μl of annealed oligonucleotides 0.16 mm of each deoxyribonucleotide 0.5 mM ATP 0 .5 mm DTT 100 μg/ml BSA 3.5 μg/ml d943 protein T4 (DNA polymerase) μg/ml protein 944/62 T4 (polymerase auxiliary protein) 25 μg/ml protein 45 (polymerase auxiliary protein)

Цю суміш інкубують при 37"С протягом 30 хвилин. Потім додають 10 мкг ДНК-лігази і інкубування при 37"С відновляють і продовжують протягом 30 хвилин. Полімеразу і лігазу інактивують інкубуванням цієї реакції при 70"С протягом 15 хвилин. Для розщеплення гена Хваї до реакційної суміші додають 50 мкл 2ХThis mixture is incubated at 37"C for 30 minutes. Then 10 μg of DNA ligase is added and incubation at 37"C is resumed and continued for 30 minutes. Polymerase and ligase are inactivated by incubating this reaction at 70"C for 15 minutes. To cleave the Khwai gene, add 50 μl of 2X to the reaction mixture

ТА, що містить БСА при 200 мкг/мл і ДТТ при 1 мМ, 43 мкл води і 40 мкл води і 50 мкг Храї у 5 мкл. Цю реакційну суміш інкубують протягом З годин при 37"С і потім очищають на гелі. ХрбаІ-фрагмент очищають з гелю і клонують у сайт Хра! плазміди риС19 стандартними способами. Плазміди очищають з використанням стандартних способів і секвенують з використанням дидезокси-способу.TA containing BSA at 200 µg/ml and DTT at 1 mM, 43 µl of water and 40 µl of water and 50 µg of Chrai in 5 µl. This reaction mixture is incubated for 3 hours at 37°C and then purified on a gel. The HrbaI fragment is purified from the gel and cloned into the Hra! site of the ryC19 plasmid by standard methods. Plasmids are purified using standard methods and sequenced using the dideoxy method.

Конструювання плазмід для експресії гуманізованих легкого і важкого ланцюгів виконують виділеннямConstruction of plasmids for the expression of humanized light and heavy chains is carried out by isolation

Храї!-фрагментів легкого і важкого ланцюгів з плазміди рОсС19, в яку вони були вставлені, та інсертуванням їх у сайт Храї придатного експресуючого вектора, який буде експресувати високі рівні повного важкого ланцюга при трансфекції у придатну клітину-хазяїна.Chrai!-fragments of the light and heavy chains from the pOsC19 plasmid into which they were inserted and inserting them into the Chrai site of a suitable expression vector that will express high levels of the complete heavy chain when transfected into a suitable host cell.

Синтез і афінність гуманізованого антитілаSynthesis and affinity of a humanized antibody

Експресуючі вектори трансфікують у клітини Зр2/0 миші, і клітини, які інтегруються у плазміди, відбирають на основі маркера, що селектується (маркерів, що селектуються), внесених експресуючими векторами, стандартними способами. Для підтвердження, що ці клітини секретували антитіло, що зв'язується з РКК, супернатант з цих клітин інкубують з клітинами, про які відомо, що вони експресуютьExpressing vectors are transfected into Zp2/0 mouse cells, and cells that integrate into plasmids are selected based on the selectable marker(s) introduced by the expression vectors by standard methods. To confirm that these cells have secreted an antibody that binds to RCC, the supernatant from these cells is incubated with cells known to express

РЕГЕ. Після промивання ці клітини інкубують з флуоресцеїн-кон'югованим козячим антитілом проти дО людини, промивають і аналізують на флуоресценцію на цитофлуорометрі РАСЗСАМ.REGGAE. After washing, these cells are incubated with fluorescein-conjugated goat antibody against human dO, washed and analyzed for fluorescence on a cytofluorometer РАСЗСАМ.

Клітини, що продукують гуманізоване антитіло, культивують іп міго. Гуманізоване антитіло очищають до істотної гомогенності з супернатантів клітин проведенням через афінну колонку білка А (Рго-Спет Іпс.,Humanized antibody-producing cells are cultured in vitro. The humanized antibody is purified to substantial homogeneity from cell supernatants by passage through an affinity column of protein A (Rgo-Spet Ips.,

І ішШейоп, МА або еквівалент) відповідно до стандартних способів. Афінність цього гуманізованого антитіла стосовно вихідного мишачого антитіла визначають відповідно до способів, відомих у даній галузі.And isSheyop, MA or equivalent) according to standard methods. The affinity of this humanized antibody to the original murine antibody is determined according to methods known in the field.

Приклад 10Example 10

Конструювання для людини (Нитап Епдіпеегіпд"") мишачих антитіл Цей приклад описує клонування і експресію сконструйованих для людини (Нитап Епдіпеегей'м) антитіл, а також очищення таких антитіл і випробовування на афінність зв'язування.Construction of Human (Nytap Epdipegipd"") Mouse Antibodies This example describes the cloning and expression of human (Nytap Epdipegym) antibodies, as well as purification of such antibodies and testing for binding affinity.

Сконструювані для людини Нитап Епдіпеегед'м послідовностіNitap Epdipeeged'm sequences designed for humans

Конструювання для людини! (Нитап Епдіпеегіпд!М) варіабельних доменів антитіл було описано зіцапіска (Див., наприклад, зішапіскКа еї аї. 0.5. Рагепі Мео5766886; ЗщапіскКа еї аї. Ргоївіп Епдіпеегіпд 7:805- 814 (1994))| як спосіб зменшення імуногенності при збереженні активності зв'язування молекул антитіл.Designing for people! (Nytap Epipehepd!M) variable domains of antibodies have been described in detail (See, for example, zishapiskKa ei ai. 0.5. Raghepi Meo5766886; ZschapiskKa ei ai. Rgoivip Epipeheipd 7:805-814 (1994))| as a way to reduce immunogenicity while maintaining the binding activity of antibody molecules.

Відповідно до цього способу кожній амінокислоті варіабельної області був приписаний ризик заміни.According to this method, each amino acid of the variable region was assigned a substitution risk.

Амінокислотні заміни відрізняються однією з трьох категорій ризику: (1) змінами низького ризику є зміни, які мають найвищий потенціал стосовно зменшення імуногенності з найнижчим шансом порушення зв'язування антигену; (2) змінами помірного (середнього) ризику є зміни, які можуть додатково зменшувати імуногенність, але мають більш високий шанс впливу на зв'язування антигену або укладання білка; (3) змінами високого ризику є зміни, які Є важливими для зв'язування або для підтримки структури антитіла і несуть найвищий ризик того, що зв'язування антигену або укладання білка будуть піддані впливу. Внаслідок тривимірної структурної ролі пролінів, модифікації у положеннях пролінів звичайно вважаються змінами щонайменше помірного ризику, навіть якщо це положення є звичайно положенням низького ризику. Фігура 10 показує амінокислотні послідовності варіабельної області важкого ланцюга мишачих антитіл ХНА.06.983,Amino acid substitutions fall into one of three risk categories: (1) low-risk changes are changes that have the highest potential for reducing immunogenicity with the lowest chance of disrupting antigen binding; (2) moderate (medium) risk changes are changes that may further reduce immunogenicity but have a higher chance of affecting antigen binding or protein folding; (3) high-risk changes are changes that are important for binding or for maintaining the structure of the antibody and carry the highest risk that antigen binding or protein folding will be affected. Due to the three-dimensional structural role of prolines, modifications in proline positions are generally considered to be changes of at least moderate risk, even if this position is typically a low-risk position. Figure 10 shows the amino acid sequences of the variable region of the heavy chain of murine antibodies ХНА.06.983,

ХНА.06.275 і ХНА.О0О6.642.ХНА.06.275 and ХНА.О0О6.642.

Варіабельні області легкого і важкого ланцюгів мишачих антитіл конструюють з використанням цього способу (Нитап Епдіпеегей"м), Амінокислотні залишки, які є кандидатами для модифікації відповідно до цього способу у положеннях низького ризику, ідентифікують порівнянням амінокислотних послідовностей мишачих варіабельних областей з послідовністю варіабельної області людини. Може бути використана будь-яка варіабельна область людини, у тому числі індивідуальна послідовність МН або Мі, або консенсусна область УН або Мі людини. Можуть бути змінені амінокислотні залишки у будь-якій кількості положень низького ризику або у всіх положеннях низького ризику.The variable regions of the light and heavy chains of murine antibodies are constructed using this method (Nitap Epdipeegeim). Amino acid residues that are candidates for modification according to this method in low-risk positions are identified by comparing the amino acid sequences of the murine variable regions with the sequence of the human variable region. Any human variable region can be used, including an individual MN or Mi sequence, or a human UN or Mi consensus region.Amino acid residues in any number of low-risk positions or in all low-risk positions can be changed.

Подібним чином, амінокислотні залишки, які є кандидатами для модифікації відповідно до цього способу у всіх положеннях низького і помірного ризику, ідентифікують порівнянням амінокислотних послідовностей мишачих варіабельних областей з послідовністю варіабельної області людини. Можуть бути змінені амінокислотні залишки у будь-якій кількості положень низького або помірного ризику або у всіх положеннях низького і помірного ризику.Similarly, amino acid residues that are candidates for modification according to this method in all positions of low and moderate risk are identified by comparing the amino acid sequences of the murine variable regions with the sequence of the human variable region. Amino acid residues in any number of low or moderate risk positions or in all low and moderate risk positions can be changed.

Одержання послідовностей сконструйованих для людини (Нитап Епдіпеегей м) антитілObtaining sequences of antibodies designed for humans (Nitap Epdipeegei m).

ДНК-фрагменти, що кодують сконструйовані для людини (Нитап Епдіпеегей м) послідовності М-області важкого і легкого ланцюгів разом з сигнальними послідовностями (наприклад, виробленими з антитіл сигнальними послідовностями), конструюють з використанням синтезу синтетичних нуклеотидів. ДНК, що кодує кожну з амінокислотних послідовностей У-області легкого ланцюга, описаних тут, інсертують у вектор, що містить константну область легкого ланцюга каппа або лямбда людини. ДНК, що кодує кожну з амінокислотних послідовностей М-області важкого ланцюга, описаних тут, інсертують у вектор, що містить константну область важкого ланцюга гамма-1, 2, З або 4 людини. Всі з цих векторів містять промотор (наприклад, промотор ПСММУ) і 3'-гсетрансльовану область (наприклад, 3'-нетрансльовану область легкого ланцюга каппа миші) разом з додатковими регуляторними послідовностями, в залежності від їх використання для транзиторної експресії або розвитку стабільної клітинної лінії (05 2006/0121604).DNA fragments encoding sequences of M-regions of heavy and light chains designed for humans (Nitap Epdipeegei m) together with signal sequences (for example, signal sequences produced from antibodies) are constructed using the synthesis of synthetic nucleotides. The DNA encoding each of the amino acid sequences of the B-region of the light chain described herein is inserted into a vector containing the human kappa or lambda light chain constant region. DNA encoding each of the amino acid sequences of the M region of the heavy chain described herein is inserted into a vector containing the human gamma-1, 2, 3 or 4 heavy chain constant region. All of these vectors contain a promoter (eg, the PSMMU promoter) and a 3'-translated region (eg, the 3'-untranslated region of the mouse kappa light chain) along with additional regulatory sequences, depending on their use for transient expression or development of a stable cell line (05 2006/0121604).

Для експресії сконструйованих для людини (Нитап Епдіпеегеа!м) антитіл з використанням згаданих вище векторів, що містять послідовності варіабельної області, щонайменше чотири варіанти можуть бути генеровані з різних комбінацій легкого ланцюга низького ризику, легкого ланцюга низькогонпомірного ризику, важкого ланцюга низького ризику і важкого ланцюга низькогонпомірного ризику. У випадках, коли зміни помірного ризику не включені ні в один, ні в обидва з легкого ланцюга або важкого ланцюга, відповідно, продукується менша кількість варіантів.For expression of engineered human (Nytap Epdipegea!m) antibodies using the above-mentioned vectors containing variable region sequences, at least four variants can be generated from different combinations of low risk light chain, low gonometric risk light chain, low risk heavy chain and heavy chain low-level risk. In cases where moderate-risk changes are not included in either the light chain or the heavy chain, respectively, fewer variants are produced.

Одержання експресуючих векторів для транзиторної експресіїObtaining expressing vectors for transient expression

Вектори, що містять гени або легкого, або важкого ланцюга, описані вище, конструюють для транзиторної (тимчасової) трансфекції. Крім сконструйованих для людини (Нитап Епдіпеегей м) послідовностей антитіл, промотору і 3'-нетрансльованої області легкого ланцюга, описаних вище, ці вектори переважно містять огіР вірусу Епштейна-Барр для реплікації у клітинах НЕК293, які експресують ядерний антиген вірусу Епштейна-Барр.Vectors containing the genes of either the light or heavy chain described above are designed for transient (temporary) transfection. In addition to the engineered human (Nitap Epdipeegei m) antibody sequences, promoter and 3'-untranslated region of the light chain described above, these vectors preferably contain the Epstein-Barr virus ogiR for replication in HEK293 cells that express the Epstein-Barr virus nuclear antigen.

Транзиторна експресія сконструйованого для людини (Нитап-Епдіпеегеа!м) РАЇ В-антитіла у клітинахTransient expression of RAI B-antibody engineered for humans (Nitap-Epdipeegea!m) in cells

НЕК29ЗЕNEK29ZE

Окремі вектори, кожний з яких містить огі? з вірусу Епштейна-Барр і гени легкого ланцюга і важкого ланцюга, описані вище, трансфікують транзиторно у клітини НЕК29ЗЕ, як описано у патенті США 2006/0121604. Транзиторно трансфікованим клітинам дають інкубуватися протягом до 10 днів, після чого супернатант видаляють і антитіло очищають з використанням білок А-хроматографії.Separate vectors, each of which contains ogi? from the Epstein-Barr virus and the light chain and heavy chain genes described above are transiently transfected into NEK29ZE cells as described in US Patent 2006/0121604. Transiently transfected cells are allowed to incubate for up to 10 days, after which the supernatant is removed and the antibody is purified using protein A chromatography.

Одержання експресуючих векторів для розвитку перманентної клітинної лініїObtaining expressing vectors for the development of a permanent cell line

Крім сконструйованих для людини (Нитап Епдіпеегей'мМ) послідовностей антитіл, промотору і 3- нетрансльованої області легкого ланцюга, описаних вище, вектори для розвитку перманентної клітинної лінії містять гени маркерів, що селектуються, такі як пео або піз для відбору С418- або гістидинол-стійких трансфектантів, відповідно. Конструюють кінцевий вектор, що містить одну копію кодуючої області важкого ланцюга і одну копію кодуючої області легкого ланцюга.In addition to the engineered human (Nitap Epdipeege'mM) antibody sequences, promoter, and 3-untranslated region of the light chain described above, vectors for the development of a permanent cell line contain selectable marker genes such as peo or pis for selection of C418- or histidinol- resistant transfectants, respectively. Construct a final vector containing one copy of the coding region of the heavy chain and one copy of the coding region of the light chain.

Розвиток перманентно трансфікованих клітин СНО-К1Development of permanently transfected CHO-K1 cells

Описані вище вектори, що містять одну копію кожного з генів легкого і важкого ланцюга разом, трансфікують в Ех-Сеї! 302-адаптовані клітини СНО-К1. Клітини СНО-КІ1, адаптовані до суспензійного росту у середовищі Ех-СеїЇ 302, звичайно трансфікують лінеаризованим вектором з використанням лінійного поліетиленіміну (РЕЇ). Ці клітини висівають у 96-ямкові планшети, що містять середовище Ех-Сеї! 302, доповнене 195 ФТС і 5418. Клони піддають скринінгу у 96-ямкових планшетах, і кращі -1095 клонів з кожної трансфекції переносять у 96- ямкові планшети з глибокими ямками, що містять середовище Ех-Сеї! 302, доповнене 5418.The vectors described above, containing one copy of each of the light and heavy chain genes together, are transfected into Ex-Sei! 302-adapted CHO-K1 cells. SHO-KI1 cells, adapted to suspension growth in Ex-SeiY 302 medium, are usually transfected with a linearized vector using linear polyethyleneimine (LEI). These cells are seeded into 96-well plates containing Ex-Sei! 302, supplemented with 195 FTS and 5418. Clones are screened in 96-well plates, and the best -1095 clones from each transfection are transferred to deep-well 96-well plates containing Ex-Sei medium! 302, supplemented by 5418.

Тест на продуктивність виконують у 96-ямкових планшетах з глибокими ямками у середовищі Ех-СеїЇ 302 для культур, вирощуваних протягом 14 днів, після чого культуральні супернатанти випробовують на рівні антитіла, що секретується, за допомогою аналізу імуноглобулінів ЕГІ5А для ІдО.The performance test is performed in 96-well deep-well plates in Ex-Seal 302 medium for cultures grown for 14 days, after which the culture supernatants are tested for secreted antibody levels using the EHI5A immunoglobulin assay for IOD.

Ці кращі клони переносять у колби, що струшуються, які містять середовище Ех-СеїЇ 302. Тести у колбах, що струшуються, виконують з цими клонами у середовищі Ех-Сеї! 302. Ці клітини ростуть протягом 14 днів у колбах Ерленмейєра на 125 мл, що містять 25 мл середовища. Рівні поліпептиду імуноглобуліну у культуральному середовищі визначають за допомогою ІдО-ЕГ ІА або ВЕРХ наприкінці періоду інкубації.These best clones are transferred to shake flasks containing Ex-Seal medium 302. Shake flask tests are performed with these clones in Ex-Seal medium! 302. These cells are grown for 14 days in 125 ml Erlenmeyer flasks containing 25 ml medium. Immunoglobulin polypeptide levels in the culture medium are determined by IDO-EG IA or HPLC at the end of the incubation period.

Множинні подальші трансфекції однієї і тієї ж клітинної лінії двома або трьома мультиодиничними векторами приводять до одержання клонів і клітинних ліній, які проявляють додаткові збільшення рівнів продукування імуноглобулінів, переважно до 300 мкг/мл або більше.Multiple subsequent transfections of the same cell line with two or three multiunit vectors result in clones and cell lines that exhibit additional increases in immunoglobulin production levels, preferably up to 300 μg/ml or more.

ОчищенняCleaning

Може бути створений спосіб очищення поліпептидів імуноглобуліну з векторів і всіх ліній відповідно до даного винаходу (див., наприклад, патент США 2006/0121604). Наприклад, відповідно до способів, добре відомих у даній галузі, клітини видаляють фільтруванням після термінації. Фільтрат наносять на Білок А- колонку (якщо необхідно, множинними пропусканнями). Колонку промивають і потім з колонки елююють експресовані і секретовані поліпептиди імуноглобуліну. Для одержання продукту-антитіла пул колонки БілкаA method for purifying immunoglobulin polypeptides from vectors and all lines according to the present invention can be created (see, for example, US Patent 2006/0121604). For example, according to methods well known in the art, cells are removed by filtration after termination. The filtrate is applied to the Protein A column (if necessary, by multiple passes). The column is washed and then expressed and secreted immunoglobulin polypeptides are eluted from the column. To obtain the antibody product, the protein column pool

А тримають при низькому рН (рн З протягом щонайменше 30 хвилин і максимально протягом однієї години) як стадію інактивації вірусу. Потім адсорбційну катіонообмінну стадію використовують для додаткового очищення цього продукту. Елюат з колонки адсорбційного розділення пропускають через фільтр утримання вірусу для забезпечення додаткового кліренсу потенційних вірусних частинок. Цей фільтрат додатково очищають пропусканням через аніонообмінну колонку, в якій цей продукт не зв'язується. Нарешті, процес очищення завершується перенесенням цього продукту у буфер для приготування за допомогою діафільтрації. Ретентат доводять до концентрації білка щонайменше 1 мг/мл і додають стабілізатор.A is kept at low pH (pH C for at least 30 minutes and maximum for one hour) as a stage of virus inactivation. Then, the adsorption cation exchange stage is used for additional purification of this product. The eluate from the adsorptive separation column is passed through a virus retention filter to provide additional clearance of potential viral particles. This filtrate is further purified by passing it through an anion exchange column in which this product does not bind. Finally, the purification process is completed by transferring this product to the preparation buffer by diafiltration. The retentate is adjusted to a protein concentration of at least 1 mg/ml and a stabilizer is added.

Зв'язувальна активністьBinding activity

РВАЇ А-зв'язувальну активність рекомбінантних сконструйованих для людини (Нитап Епдіпеегейм) антитіл оцінюють. Білок очищають з супернатантів культур у колбах, що струшуються, пропусканням через білок А-колонку з подальшим визначенням концентрації за Агво. Аналізи зв'язування виконують як описано в інших прикладах.RVAI A-binding activity of recombinant antibodies designed for humans (Nitap Epdipeegame) is evaluated. Protein is purified from culture supernatants in shake flasks by passing through a protein A column followed by determination of concentration by Agvo. Binding assays are performed as described in other examples.

Приклад 11Example 11

Сконструйовані для людини антитілаAntibodies engineered for humans

Три зі згаданих вище мишачих антитіл конструювали звичайно за способом одержання антитіл конструювання для людини Нитап Епдіпеегіпд""м, як описано у прикладі 10.Three of the above-mentioned murine antibodies were constructed in the usual way by the method of obtaining antibodies of the construction for humans Nitap Epdipegipd""m, as described in example 10.

Конструювання для людини (Нитап Епдіпеегіпд!М) антитіл до рецептора пролактину ХНА.О06.642 іConstruction of antibodies to the prolactin receptor KHNA.O06.642 and

ХНА.06.275HNA.06.275

Для ХНА.06.642 важкий ланцюг конструювали (Нитап Епдіпеегеа"м) або при 11 положеннях низького ризику, або при 13 положеннях низькогопомірного ризику; легкий ланцюг конструювали (НитапFor ХНА.06.642, a heavy chain was constructed (Nitap Epdipegea) either at 11 low-risk positions or at 13 low-moderate risk positions; a light chain was constructed (Nitap

Епдіпеегеа"м) тільки при положеннях низького ризику (14 змін), тому що всі положення помірного ризику вже були амінокислотами людини. Для ХНА.06.275 важкий ланцюг конструювали (Нитап Епдіпеегей м) або при 7 положеннях низького ризику, або при 11 положеннях низькогопомірного ризику; легкий ланцюг конструювали (Нитап Епдіпеегей!Мм) або при 8 положеннях низького ризику, або при 10 положеннях низькогопомірного ризику.Epdipeegea"m) only at low-risk positions (14 changes), because all moderate-risk positions were already human amino acids. For ХНА.06.275, the heavy chain was constructed (Nitap Epdipeegea m) either at 7 low-risk positions or at 11 low-moderate risk positions ; a light chain was constructed (Nitap Epdipeegei!Mm) either at 8 positions of low risk, or at 10 positions of low-moderate risk.

Амінокислотні послідовності сконструйованих для людини (Нитап-Епдіпеєегей"М) варіабельних областей, вироблених з ХНА.06.642, ХНА.06.275 і ХНА.06.983, показані нижче (області СОЕ підкреслені). Ці варіабельні області збирали у різних комбінаціях (наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 88 і 5ЗЕО ІО МО: 89; ЗЕО ІЮ МО: 88і5ЕОІО МО: 90; БЕО ІЮО МО: 91 ії 5ЕО ІС МО: 93; 5ЕО І МО: 91 і БЕО ІО МО: 94; 5ЕО ІЮО МО: 92 і БЕО ІЮThe amino acid sequences of the engineered human (Nytap-Epdipeegei"M) variable regions produced from ХНА.06.642, ХНА.06.275 and ХНА.06.983 are shown below (the SOE regions are underlined). These variable regions were assembled in various combinations (e.g. ZEO IU MO : 88 and 5ZEO IO MO: 89; ZEO IYU MO: 88 and 5EOIO MO: 90; BEO IYUO MO: 91 and 5EO IS MO: 93; 5EO I MO: 91 and BEO IO MO: 94; 5EO IYUO MO: 92 and BEO IYU

МО: 93 або ЗЕО ІО МО: 92 і 5ЕО ІЮО МО: 94) для генерування сконструйованих для людини (Нитап-MO: 93 or ZEO IO MO: 92 and 5EO IYUO MO: 94) for generating designed for humans (Nitap-

Епдіпеегеа м) антитіл пе.06.642-1, пе.06.642-2, пе.06.275-1, Не.06.275-2, пе.06.275-3, пе.06.275-4. пе.06.642 Варіабельна область І С, низький ризик (ЗЕО ІО МО: 88):Epdipeegea m) antibodies pe.06.642-1, pe.06.642-2, pe.06.275-1, Ne.06.275-2, pe.06.275-3, pe.06.275-4. pe.06.642 Variable area of IS, low risk (ZEO IO MO: 88):

ІМ ТО5РОБІ АМ5І СЕВАТІМСКАЗКОУЗТ ЗИМУ ТУМНУМООКСРООРРКО ІМ ГАЗМВЕЗОЕМРОВЕБОВИа5IM TO5ROBI AM5I SEVATIMSKAZKOUZT ZIMU TUMNUMOOKSROORRKO IM GAZMVEZOEMROVEBOVIia5

СТОР ТІ ТІБРМОАЕОМАТУУСОНЗОИЕЇ РРІЗЕСОСТКІ БІК пе.06.642 Варіабельна область НС, низький ризик (ЗЕО ІО МО: 89):STOR TI TIBRMOAEOMATUUSONZOIEI RRIZESOSTKI BIK pe.06.642 Variable region of NS, low risk (ZEO IO MO: 89):

ЕМО МЕЗО СОЇ МОРОСБІ ВІ ЗСАУЗаєТЕЗБУаМУУАВОАРОКАГ ЕМ МАТУЗЗССТУТУУРОЗУКО,ВЕТІВ вВОМЗКМТІ МІОМІ ВАЕОТАМУУСАВНВаМУУАТУУМАМОУУМСОСТІ МТУ пе.06.642 Варіабельна область НС, низький «помірний ризик (ЗЕО ІО МО: 90):EMO MEZO SOY MOROSBI VI ZSAUzaeTEZBUaMUUAVOAROKAG EM MATUZZSSSTTUUROZUKO,VETIV vVOMZKMTI MIOMI VAEOTAMUUSAVNvaMUUATUUMAMOUUMSOSTI MTU pe.06.642 Variable area of NS, low "moderate risk (ZEO IO MO: 90):

ЕМО МЕЗО ВСІ МОРОСБІ ВІ БСАУБаєТтТЕ5БУаМЗУМУАОАРОКОаЇ ЕМ МАТУЗЗОСТУТУУРОБУКОВЕТІВ вВОМЗКМТІ МІОМІ ВАЕОТАУУУСААВНАВОМУМАТУУМАМОУМ/СОСТІ МТУ пе.06.275 Варіабельна область І С, низький ризик (ЗЕО ІЮ МО: 91):EMO MEZO ALL MOROSBI V BSAUBayETtTE5BUaMZUMUAAOAROKOAY EM MATUZZOSTUTUUROBUKOVETIV vVOMZKMTI MIOMI VAEOTAUUUSAAAVNAVOMUMATUUMAMAMOUM/SOSTI MTU pe.06.275 Variable area I C, low risk (ZEO IYU MO: 91):

ОМОІТО5РББІ БАБРОЮВІТІ ТСВАБКМІУКМІ АМУМОЕКРОКТММО ІМ ИаЗТІ НОІРОВЕЗОВИаЗаИтовті ТІOMOITO5RBBI BABROYUVITI TSVABKMIUKMI AMUMOEKROKTMMO IM IAZTI NOIROVEZOVIiaZaItovti TI

ЗІ ОРЕОБЕАМУУСООНМОУРУТРИаОСТКІ БІК пе.06.275 Варіабельна область І С, низькийнпомірний ризик (ЗЕО ІЮО МО: 92):ZI OREOBEAMUUSOONMOURUTRYaOSTKI BIK pe.06.275 Variable area I C, low-moderate risk (ZEO IYUO MO: 92):

ОМОІТО5РББІ БАБРОЮВІТІ ТСВАБКМІУКМІ АММОЕКРОЇСАМКІ ГиЗОЗТІНЗаІРЗВЕЗОаЗаБОТОТІ ТІOMOITO5RBBI BABROYUVITI TSVABKMIUKMI AMMOEKROISAMKI HYZOZTINZAIRZVEZOaZABOTOTI TI

ЗІ ОРЕОБАМУУСООНМОУРУТРИаОСТКІ БІК пе.06.275 Варіабельна область НС, низький ризик (ЗЕО ІО МО: 93):ZI OREOBAMUUSOONMOURUTRYaOSTKI BIK pe.06.275 Variable area of NS, low risk (ZEO IO MO: 93):

ОМОГОЕБОРИОЇ МКРБОТІ БІ ТСТУТахБІТ5ОМАММУМІВОБєРЕККГ ЕМ МОМІЗУЗОаЗТЗУМРБІКАТІЗАОOMOHOEBORYI MKRBOTI BI TSTUTahBIT5OMAMMUMIVOBYEBEREKKG EM MOMIZUZOaAZTZUMRBIKATIZAO

Т5КМОЕБІ ОЇ М5УТААОТАТУЕСАНОМСО МеВ УМ СОСТТІ тУ55 пе.06.275 Варіабельна область НС, низький «помірний ризик (ЗЕО ІО МО: 94):T5KMOEBI OY M5UTAAOTATUESANOMSO MeV UM SOSTTI tU55 pe.06.275 Variable region of NS, low "moderate risk (ZEO IO MO: 94):

ОМОЇ ОББаРОЇМКРБОТІ БІ ТСТУБОаМ5ІТ5ОХАУММУМІВОгРаКагЕМУМСИМІВУЗОЗТЗМУМРБІ КЗВАІТІЗАОOMOI OBBROIMKRBOTI BI TSTUBOaM5IT5OHAUMMUMIVOgraKageMUMSIMIVUZOZTZMUMRBI KZVAITIZAO

Т5КМОЕБІ ОЇ М5МТААОТАУУЕСАНОМОУМЕрмМ пост ТУ пе.06.983 Варіабельна область І С, низький ризик (ЗЕО ІЮ МО: 95):Т5КМОЕБИ ОИ М5МТААОТАУЕСАНОМОУМЕРММ post TU pe.06.983 Variable area of IS, low risk (ZEO IYU MO: 95):

РІММТО5РОБІ АУЗАСЕВМТІМСКАЗОСУЗМОМАМ РЕООКРОЮОЗБРКИ ІМЗАЗТАУТОаМРєОВІ ЗаЗОЗОТОБТRIMMTO5ROBI AUZASEVMTIMSKAZOSUZMOMAM REOKROYUUZBRKY IMZAZTAUTOamReOVI ZaZOZOTOBT

ЕТІББМОАЕОМАМУЕСООЮХУТЗРТРСОСТКІ БІК пе.06.983 Варіабельна область І С, низький «помірний ризик (ЗЕО ІО МО: 96):ETIBBMOAEOMAMUESOOYUHUTZRTRSOSTKI BIK pe.06.983 Variable region I C, low "moderate risk (ZEO IO MO: 96):

РІММТО5РОБІ АМ5І СЕАМТІМСКАБОСУЗМОМАУМЕООКРООБРКИ ІМ5АБТАЕЗОаМРОВІ ЗаЗОБаТОБТRIMMTO5ROBI AM5I SEAMTIMSKABOSUZMOMAUMEOOKROOBRKI IM5ABTAEZOaMROVI ZAZABATOBT

ЕТІББМОАЕОМАМУЕСООЮУТЗРТРСОСТКІ БІК пе.06.983 Варіабельна область НС, низький ризик (ЗЕО ІО МО: 97): рМУОГ МЕЗГ2ЧаСаї МОРОСЗАВІ ЗСААБСОБАЕЗ5ЕВМОМ УВОАРОКаТгЕММАХІЗЗОЗЗТУМАОЮТУКОАВЕТІЗETIBBMOAEOMAMUESOOYUUTZRTRSOSTKI BIK pe.06.983 Variable area of NS, low risk (ZEO IO MO: 97): rMUOG MEZG2ChaSai MOROSZAVI ZSAABSOBAEZ5EVMOM UVOAROKaTgEMMAHIZZZOZZTUMAOYUTKOAVETIZ

ВОМРКМТІ МІОМІ ВАЕОТАМУУСУНЗИа ВОМУ СОСТІ МТУ55 пе.06.983 Варіабельна область НС, низький «помірний ризик (ЗЕО ІО МО: 98):VOMRKMTI MIOMI VAEOTAMUUSUNZIa VOMU SOSTI MTU55 pe.06.983 Variable region of NS, low "moderate risk (ZEO IO MO: 98):

ЕМОЇ МЕЗОСИЇ МОРОСЗАВІ ЗСААБИаБАЄ55ЕЯО МОМ УВОАРОКИаїЇ ЕМУМАХІЗ5Иа5ЗТУУАрБУКСО,ИВЕТІВEMOY MESOSIA MOROSZAVI ZSAABYABAYE55EYAO MOM UVOAROKIAII EMUMAKHIZ5IA5ZTUUArBUKSO,IVETIV

ВвВОМРКМТІ М ОММЗІГВАЕОТАУУУСУАНЗСОВОММ СОСТІ МТУVvVOMRKMTI M OMMZIGVAEOTAUUUSUANZSOVOMM SOSTI MTU

Приклад 12Example 12

Експресія і очищення антитіл пе.06.642 і пе.06.275Expression and purification of pe.06.642 and pe.06.275 antibodies

Сконструйовані для людини (Нитап Епдіпеегед!м) М-області легкого і важкого ланцюга Ппе.06.642 і пе.06.275 зливали з константними областями каппа-1 або гамма-1 людини, відповідно. Потім гени важкого ланцюга і легкого ланцюга зливали з сильним промотором і ефективною 3'-нетрансльованою областю і клонували у вектори транзиторної експресії, що містять сайт ініціації реплікації вірусу Епштейна-Барр.Engineered for humans (Nitap Epdipeeged!m) M-regions of the light and heavy chains of Ppe.06.642 and Ppe.06.275 were fused with human kappa-1 or gamma-1 constant regions, respectively. Then the heavy chain and light chain genes were fused with a strong promoter and effective 3'-untranslated region and cloned into transient expression vectors containing the Epstein-Barr virus replication initiation site.

Антитіла транзиторно експресували у клітинах НЕК293 з використанням окремих плазмід, що кодують послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга у різних комбінаціях низького або низькогонпомірного ризику, звичайно, як описано у прикладі 10. Співвідношення ДНК важкого ланцюга до ДНК легкого ланцюга дорівнювало 1:2. Трансфекцію клітин виконували з РЕЇ при співвідношенні ДНК:РЕЇ 12 і концентрації ДНК 1 мкг/мл. Щільність клітин була 8е5 клітин/мл. ДНК одержували з використанням стандартних наборів Оіадеп.Antibodies were transiently expressed in HEK293 cells using separate plasmids encoding the heavy chain and light chain sequences in various low or low-risk combinations, of course, as described in Example 10. The ratio of heavy chain DNA to light chain DNA was 1:2. Cells were transfected with REI at a DNA:REI ratio of 12 and a DNA concentration of 1 μg/ml. The cell density was 8e5 cells/ml. DNA was obtained using Oiadep standard kits.

Експресійні культури вирощували у середовищі І5293 (Ігміпе Зсіепійс)н195 ФтТС з низьким Ід (Нусіопе) у колбах на 2 л з 400 мл середовища на колбу. Умовами культивування були 37"С, 595 СО» і перемішування при 90-95 об./хв. Після 5-7 днів у культурі, культуральне середовище збирали і освітлювали як вихідний матеріал для очищення.Expression cultures were grown in medium I5293 (Igmipe Zsiepis) n195 FtTS with low Id (Nusiope) in 2 L flasks with 400 ml medium per flask. Cultivation conditions were 37"С, 595 СО" and stirring at 90-95 rpm. After 5-7 days in culture, the culture medium was collected and clarified as source material for purification.

Очищення химерних і сконструйованих для людини (Нитап Епдіпеегей м) версій згаданих вище антитіл досягалося в єдиній стадії пропусканням культурального супернатанту транзиторної експресії через колонку швидкого потоку рекомбінантного білка А (СЕ Неайпсаге). Елюція основного піку була при 0,1 мМ гліцині рН 3,5. Об'єднаний матеріал діалізували у ЗФР і концентрували у центрифугових концентраторах з номінальною межею молекулярної маси 30 кД. Кінцева чистота була 29595, і загальні виходи були приблизно 6095. Кінцеві пули аналізували на ендотоксин з використанням Епдозаїе РТ І АГ. цпії (Спагіе5Purification of the chimeric and engineered for humans (Nytap Epdipeegei m) versions of the above-mentioned antibodies was achieved in a single step by passing the culture supernatant of the transient expression through a fast-flow column of recombinant protein A (CE Neaipsage). Elution of the main peak was at 0.1 mM glycine pH 3.5. The combined material was dialyzed in SFR and concentrated in centrifugal concentrators with a nominal molecular weight cutoff of 30 kD. Final purity was 29595 and total yields were approximately 6095. Final pools were assayed for endotoxin using Epdosage RT AND AG. spies (Spagie5

Кімег) або аналізу кінцевої точки ОСІ -1000 Спготодепіс ГАЇ. Епароїіпі Авззау (І опа), і результати були «0,05 ЕЄШ/мг (нижче межі детектування) для всіх цих антитіл. Було визначено, що стан агрегації химерного антитіла пе.06.642-2 є мономерним відповідно до ЗЕС-хроматографії на колонці 10/300 с. З!ирегдех 200 (СЕ Неайнсагє).Kimeg) or analysis of the end point of the AXIS -1000 Spgotodepis GAI. Eparoiipi Awzzau (I opa), and the results were "0.05 EEU/mg (below the limit of detection) for all these antibodies. It was determined that the state of aggregation of chimeric antibody pe.06.642-2 is monomeric according to ZES chromatography on a 10/300 s column. Z!yregdeh 200 (SE Neainsagye).

СПХНА.06.642 виділяють до чистоти 29595 в єдиній хроматографічній стадії з подальшим діалізом для зміни буфера. спхХНА.06.642 розчинний у ЗФР при 3 мг/мл, і не були детектовані великі домішки або агрегація, відповідно до ЗЕС-хроматографії (гель-фільтраційної хроматографії).SPKHNA.06.642 is isolated to a purity of 29595 in a single chromatographic stage followed by dialysis to change the buffer. spkhHNA.06.642 is soluble in SFR at 3 mg/ml, and no major impurities or aggregation were detected, according to ZES chromatography (gel filtration chromatography).

Тестування сконструйованих для людини антитіл проти РЕК людини проточною цитометрієюFlow cytometry testing of human engineered anti-REK antibodies

Вихідні клітини СНО-КІ і клітини, що експресують рецептор пролактину людини (РЕК), збирали, центрифугували і ресуспендували при приблизно 5х10 клітин/мл в їх ЗФР, що містить 295 ФТС і 0,195 азид натрію (ГАС5-буфері). Сконструйовані для людини антитіла проти РЕК людини та ізотипічно подібні контрольні антитіла проти КІН розбавляли до 2х-кінцевої концентрації у ГАС5-буфері і додавали у відповідні ямки з пробами (50 мл на ямку). Для контролів вторинного антитіла і аутофлуоресценції у відповідні ямки додавали 50 мл ГАС5-буфера. У кожну ямку з пробою додавали 50 мл суспензії клітин.Source cells of CHO-KI and cells expressing the human prolactin receptor (REK) were collected, centrifuged and resuspended at approximately 5x10 cells/ml in their SFR containing 295 FTS and 0.195 sodium azide (GAS5-buffer). Engineered human antibodies against human REC and isotypically similar control antibodies against CIN were diluted to 2x final concentration in GAS5 buffer and added to the appropriate wells with samples (50 ml per well). For secondary antibody and autofluorescence controls, 50 ml of GAS5 buffer was added to the corresponding wells. 50 ml of cell suspension was added to each well with a sample.

Проби інкубували при 4"С протягом 1 години, промивали 2 рази холодним ГАС5-буфером і ресуспендували у ЕАС5-буфері, що містить РЕ-кон'юговані козячі антитіла проти (до людини (Часкзоп Іттипогезеагсп, М/евіSamples were incubated at 4"C for 1 hour, washed 2 times with cold GAS5 buffer and resuspended in EAS5 buffer containing RE-conjugated goat anti-human antibodies (Chaskzop Ittypogezeagsp, M/evi

Стоме, РА) при розведенні 1:100. Після 30-хвилинної інкубації при 4"С клітини промивали 2 рази холоднимStome, RA) at a dilution of 1:100. After a 30-minute incubation at 4"C, the cells were washed 2 times with cold water

ЕАС5-буфером, що містить 1 мг/мл йодиду пропідію (Іпийгодеп, Зап Оіедо, СА), і аналізували проточною цитометрією. Як показано у таблиці 7, анти-РВЇ В-антитіла зв'язуються з клітинами, що експресують РЕК, але не з вихідними клітинами.with EAS5 buffer containing 1 mg/ml propidium iodide (Ipigodep, Zap Oiedo, CA) and analyzed by flow cytometry. As shown in Table 7, anti-RBV B-antibodies bind to cells expressing REC, but not to original cells.

Таблиця 8Table 8

Лінія РЕСР-клітин, клон 155 Вихідна клітинна лінія СНО-КІ1The line of RESP cells, clone 155 is the original cell line ХНО-КИ1

Приклад 13Example 13

Афінність сконструйованих для людини (Нитап Епдіпеегей м) антитілAffinity of antibodies designed for humans (Nitap Epdipeegei m).

Афінність химерних і сконструйованих для людини (Нитап Епдіпеегеа"м) антитіл визначали аналізомAffinity of chimeric and designed for humans (Nitap Epdipegea) antibodies was determined by analysis

Віасоге. Коротко, сенсорний чіп СМ5 (Віасоге), іммобілізований Білком А/з (Ріегсе) через МНБЗ/ЕОС, використовували для захоплення приблизно 600 КИ антитіла на поверхні чіпу. П'ять концентрацій ЕСОViasoge. Briefly, a CM5 sensor chip (Viasoge) immobilized with Protein A/z (Riegse) via MNBZ/EOS was used to capture approximately 600 CI of antibody on the surface of the chip. Five concentrations of ESO

РЕГК, що починаються при 5 мкг/мл (185 НМ) і серійно розведених при 5-кратному розведенні до 0,3 нМ, ін'єктували від найнижчої концентрації до найвищої концентрації у режимі кінетичного титрування ін'єкцій і протягом 15 хвилин збирали дані дисоціації. Ці експерименти мали подвійний контроль, тобто реакція сусідньої проточної комірки віднімалася автоматично, і реакція з експерименту з ін'єкцією буфера віднімалася з набору експериментальних даних. Кінетичні і вироблені з них параметри (Ка, Ка і Ко) визначали підгонкою до 1:1 моделі І апдтиіг з використанням програми ВіаЕма!, спеціально розробленої для режиму кінетичного титрування ін'єкцій. Результати вимірювання афінності як химерного, так і сконструйованого для людини антитіла проти ЕСО РЕК людини і собакоподібної мавпи підсумовані у таблиці 9 і таблиці 10.REGCs starting at 5 μg/ml (185 nM) and serially diluted 5-fold to 0.3 nM were injected from the lowest concentration to the highest concentration in a kinetic titration injection mode and dissociation data were collected for 15 minutes . These experiments had a double control, that is, the response of the adjacent flow cell was subtracted automatically, and the response from the buffer injection experiment was subtracted from the experimental data set. Kinetic parameters and parameters produced from them (Ka, Ka and Ko) were determined by fitting to the 1:1 model I apdtiig using the ViaEma! program, specially developed for the regime of kinetic titration of injections. The results of the affinity measurement of both the chimeric and the engineered for humans antibodies against human and cynomolgus ESO REC are summarized in Table 9 and Table 10.

Таблиця 9 пе0б.275-длюдини.д 77777777 | 52ЕЛО | 32204 | б2Ею5 | 069 ЮКЯК(ф пиши шшнш 11111111 Проба! | КО | ка | ка | стеTable 9 pe0b.275-dludyny.d 77777777 | 52 ELO | 32204 | b2Eyu5 | 069 YUKYAK(f write shshsh 11111111 Try! | KO | ka | ka | ste

Таблиця 10Table 10

Для порівняння перехресної реактивності щура і миші з використанням ковалентно іммобілізованих антитіл, чіп СМА зв'язували з антитілами Ппе.06.642-2 і пе.06.275-4 за допомогою стандартних способів зв'язування ЕОС-МН5-амін відповідно до рекомендованого протоколу з ВіасогефФ Іпс. Ін'єкції ЕСО РЕК виконували при п'яти концентраціях у серії З-кратного титрування, що починається при 111 нМ і триває до 1,37 нМ. Регенерацію виконували з використанням гліцину рН 3,0. Афінність всіх НЕ-варіантів ХНА.0О6.642 іTo compare the cross-reactivity of rat and mouse using covalently immobilized antibodies, the SMA chip was bound to antibodies Ppe.06.642-2 and p.06.275-4 using standard binding methods of EOS-MH5-amine according to the recommended protocol with ViasogefF Ips . Injections of ESO REC were performed at five concentrations in a 3-fold titration series starting at 111 nM and continuing to 1.37 nM. Regeneration was performed using glycine pH 3.0. Affinity of all non-variants of ХНА.0О6.642 and

ХНА.06.275 є дуже подібною до афінності вихідного химерного антитіла. Антитіло пе.06.642-2 зв'язується зХНА.06.275 is very similar to the affinity of the original chimeric antibody. Antibody pe.06.642-2 binds to

РЕГЕ людини, миші і щура з еквівалентною афінністю. Воно зв'язується з РКІ К собакоподібної мавпи з афінністю, у 15 разів більш слабкою, ніж афінність стосовно РЕК людини. Антитіло пе.06.275-4 зв'язується з РЕК собакоподібної мавпи з афінністю, у 5 разів більш слабкою, ніж афінність стосовно РЕ Е людини.Human, mouse and rat REGE with equivalent affinity. It binds to cynomolgus monkey RKI K with an affinity 15 times weaker than that of human REC. The pe.06.275-4 antibody binds to canine monkey REK with an affinity 5 times weaker than the affinity for human PE E.

Антитіло пе.06.275-4 не зв'язується ефективно з мишачим або щурячим РЕ. ЕК. Ці результати підсумовані у таблиці 11.Antibody pe.06.275-4 does not bind effectively to mouse or rat PE. EC. These results are summarized in Table 11.

Таблиця 11Table 11

Аналіз перехресно-видової афінності відібраних НЕ-варіантів на ковалентно іммобілізованих антитілахCross-species affinity analysis of selected non-variants on covalently immobilized antibodies

Ппе.06.642-2 РезультатиPpe.06.642-2 Results

Ко Супо/Ко людини-15Co Supo/Co human-15

Ко миші/Ко людини: 1Co mouse/Co human: 1

Ко щура/Ко людини:0,75Co rat/Co human: 0.75

Ппе.06.275-4 Результати (пе.06.275-4 щура.д 7777 | 77 боб | боб | 071Ppe.06.275-4 Results (pe.06.275-4 shtura.d 7777 | 77 bob | bob | 071

Ко Супо/Ко людини:5Co Supo/Co human:5

Ко миші/Ко людини:13,548Mouse/Human: 13,548

Ко щура/Ко людини-Co rat/Co human-

Приклад 14Example 14

Інгібування проліферації і виживаності клітин Ваг/РКІК та інгібування РК К-індукованого фосфорилування ЕКК1/2Inhibition of proliferation and survival of Wag/RKIK cells and inhibition of RK K-induced phosphorylation of EKK1/2

Химерні тАб аналізували на їх здатність інгібувати проліферацію і виживаність клітин Ваг/РРЕЇІ КЕ |Фігура 11). Було виявлено, що всі тестовані химери зберігають їх ефективність стосовно їх відповідних гібридомних клонів. Справді, було виявлено, що ХНА.06.642 і ХНА.06.275 мають збільшену ефективність у цьому аналізі після химеризації. Для оцінки здатності химерних антитіл, що нейтралізує сигнал РКІ КЕ, у моделі молочної залози людини, клітини Т47О обробляли 1 мкг/мл тАБ протягом 30 хвилин перед РЕ -Chimeric tAbs were analyzed for their ability to inhibit the proliferation and survival of Wag/RREII KE cells (Figure 11). All chimeras tested were found to retain their efficacy relative to their respective hybridoma clones. Indeed, ХНА.06.642 and ХНА.06.275 were found to have increased efficacy in this assay after chimerization. To evaluate the ability of chimeric antibodies to neutralize the RKI KE signal in a human mammary gland model, T47O cells were treated with 1 μg/ml of TAB for 30 minutes before PE -

стимуляцією. У той же час, додаткові проби клітин інкубували тільки з антитілом для випробовування якого- небудь потенційного агонізму у результаті химеризації антитіл-кандидатів. Як можна бачити на фігурі 12, всі химерні антитіла зберігали їх здатність блокувати РЕЇ -індуковану передачу сигналу у ТА470, у той час як тільки антитіло СИХЕА.06.983 виявляло індукцію передачі сигналу РКІК, що детектується (невеликий, але відтворений ефект), представлену за допомогою фосфо-РКІЕ і фосфо-еаї5.stimulation At the same time, additional cell samples were incubated with antibody alone to test for any potential agonism resulting from chimerization of the candidate antibodies. As can be seen in Figure 12, all chimeric antibodies retained their ability to block REI-induced signaling in TA470, while only the antibody SYCHEA.06.983 showed a detectable induction of RCIC signaling (a small but reproducible effect) represented by phospho-RKIE and phospho-EAI5.

Визначення дії антитіла на фосфорилування ЕКК 1/2Determination of the effect of the antibody on the phosphorylation of EKK 1/2

Відібрані сконструйовані для людини (Нитап Епдіпеегеа" м) антитіла тестували на їх здатність інгібуватиSelected antibodies designed for humans (Nytap Epdipeegea" m) were tested for their ability to inhibit

РАЇ В-індуковане фосфорилування ЕККТ/2, як описано нижче і у прикладі 5 вище.RAI B-induced phosphorylation of ECCT/2 as described below and in Example 5 above.

Після 5-годинного сироваткового голодування клітини Т47О висівали у мікротитраційні планшети у повному середовищі для вирощування і вирощували протягом 24 годин при 37"С. Клітини промивали двічі забуференим фосфатом сольовим розчином (ЗФР) та інкубували з антитілами, розведеними у безсироватковому середовищі, що містить 0,196 БСА, протягом 30 хвилин при 37"С. Кінцева вихідна концентрація цих антитіл дорівнювала 40 мкг/мл. Середовище видаляли і пролактин, розведений у безсироватковому середовищі, що містить 0,190 БСА, додавали до кінцевої концентрації 30 нг/мл. Клітини інкубували з пролактином протягом 30 хвилин при 37"С з подальшими двома промиваннями охолодженим на льоді ЗФР. Для генерування лізатів клітин додавали стандартний лізисний буфер, що містить детергенти, хелатори і різні інгібітори протеази і фосфатази. Рівні фосфорилованого ЕКК1/2 (рЕКЕК1/2) вимірювали з використанням стандартного ЕГІЗА відповідно до інструкцій ЮООБЕТФ ІС РНозрпо-After a 5-hour serum starvation, T47O cells were plated in microtiter plates in complete growth medium and grown for 24 hours at 37°C. Cells were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and incubated with antibodies diluted in serum-free medium containing 0.196 BSA, for 30 minutes at 37"С. The final initial concentration of these antibodies was equal to 40 μg/ml. The medium was removed and prolactin diluted in serum-free medium containing 0.190 BSA was added to a final concentration of 30 ng/ml. Cells were incubated with prolactin for 30 minutes at 37°C followed by two washes with ice-cold PBS. To generate cell lysates, a standard lysis buffer containing detergents, chelators, and various protease and phosphatase inhibitors was added. Levels of phosphorylated EKK1/2 (rEKEK1/2 ) were measured using a standard EGISA in accordance with the instructions of the UOOBETF IS RNozrpo-

ЕККТ/ЕКК2, КО Зузіетв, Іпс. Результати репрезентативного аналізу представлені на Фігурі 13.EKKT/EKK2, KO Zuzietv, Ips. The results of a representative analysis are presented in Figure 13.

Приклад 15Example 15

А. Здатність тАБ-кандидатів опосередковувати АОСС проти РК К-експресуючих клітин-мішенейA. Ability of TAB candidates to mediate AOSS against RK K-expressing target cells

Одним з передбачуваних механізмів дії анти-РВАІ В-тАБ є здатність опосередковувати антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС). Для оцінки здатності стосовно АОСС антитіл-кандидатів, клітини ТА70О використовували як РКІ К-експресуючі епітеліальні мішені молочної залози. Як показано на Фігурі 14, два з химерних анти-РВАЇ В-тАБ здатні індукувати АОСС, опосередковану очищеними НК-клітинами людини. Було продемонстровано, що антитіло СИХНА.06.275 індукує приблизно 3095 специфічний лізис клітин-мішеней у межах 4 годин. Внаслідок пролонгованого часу генерування СсПХНА.06.642, цей кандидат не був включений у початкові аналізи АОСОС.One of the putative mechanisms of action of anti-RBAI B-tAB is the ability to mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity (ACC). To evaluate the AOSS-related ability of candidate antibodies, TA70O cells were used as RKI K-expressing epithelial targets of the mammary gland. As shown in Figure 14, two of the chimeric anti-RBAI B-tABs are able to induce AOSS mediated by purified human NK cells. It was demonstrated that the antibody SIKHNA.06.275 induces approximately 3095 specific lysis of target cells within 4 hours. Due to the prolonged generation time of SsPCHNA.06.642, this candidate was not included in the initial analyzes of AOSOS.

В. Дія анти-РВІ В-антитіла на рівні цитокінівB. Effect of anti-RVI B-antibody on the level of cytokines

Досліджували потенційну регуляцію цитокінів за допомогою РЕ у клітинах раку молочної залози. У цьому експерименті клітини МСЕ7 або Т470 піддавали дії РЕ з СПИХНА.06.642 або без спХнНА.06.642 протягом періоду 48 годин. Мультиплексний сендвіч-аналіз з Мезозса|е Оіадповіїс5 використовували для вимірювання дій СПИХНА.06.642 на потенційно РЕ! -регульовані цитокіни. Було виявлено, що РК. індукує секрецію МЕСЕ з клітин ТА70, і що ця дія повністю усувається додаванням антитіла СИХНА.0О6.642. У цих експериментах не була детектована значима регуляція І -1р, 1-6, 1-8, 11-10, 1-12 р70, ІЕМ-у, або ТМЕ-о; за допомогою РЕЇ або анти-РАЇ А-тАр. Ці результати припускають, що шлях РЕ /РВІ КЕ може сприяти ангіогенезу, а також росту і виживаності клітин у пухлинах молочної залози, і що інгібування цього МЕСЕ- регуляторного шляху може бути іншим потенційним механізмом дії іп ммо для терапевтичного анти-РНАЇ В- антитіла. б. Комбіновані дослідження іп міго з використанням анти-РАЇ А-тАБ і хіміотерапевтичних засобівThe potential regulation of cytokines by PE in breast cancer cells was studied. In this experiment, MCE7 or T470 cells were exposed to PE with or without spHnNA.06.642 for a period of 48 hours. Multiplex sandwich analysis with Mezossa|e Oiadpoviis5 was used to measure the actions of SPIKHNA.06.642 on potentially RE! - regulated cytokines. It was found that RK. induces the secretion of MESE from TA70 cells, and that this effect is completely eliminated by the addition of the antibody SIKHNA.0О6.642. In these experiments, no significant regulation of I -1p, 1-6, 1-8, 11-10, 1-12 p70, IEM-u, or TME-o was detected; with RAI or anti-RAI A-tAr. These results suggest that the PE/RVI KE pathway may promote angiogenesis, as well as cell growth and survival in breast tumors, and that inhibition of this MESE-regulatory pathway may be another potential mechanism of action of ip mmo for a therapeutic anti-RNAI B antibody. b. Combined studies of IP migo with the use of anti-RAI A-tAB and chemotherapeutic agents

Внаслідок можливості того, що потенційне терапевтичне анти-РВЇ В-антитіло може вводитися разом зі схемою введення цитотоксичного лікарського засобу у клініці, досліджували дії таких комбінованих терапій на виживаність клітин у культурі. Для цієї мети клітини Вагз3/РЕЇ Е обробляли антитілами СИХНА.06.642 абоBecause of the possibility that a potential therapeutic anti-RBV B antibody could be administered in conjunction with a cytotoxic drug regimen in the clinic, the effects of such combination therapies on cell survival in culture were investigated. For this purpose, Vagz3/REI E cells were treated with antibodies SIKHNA.06.642 or

СПХНА.06.275 при різних концентраціях паралельно з хіміотерапевтичними засобами протягом 5 днів, після чого виживаність клітин оцінювали з використанням СеїїТйег Сіо як маркера кількості клітин. У цьому аналізі використовували матрицю клінічно важливих і механістично різних цитотоксичних агентів: доксорубіцин (антрацикліновий інгібітор Торо Ії), Таксол (агент, що стабілізує мікротрубочки), флударабін (антиметаболіт) і цисплатин (лікарський засіб, що зшиває ДНК, на основі платини). Було виявлено, що СПИХНА.06.275 і більшою мірою сСпХНА.06.642 діють синергічно з доксорубіцином у посиленні смерті клітин у клітинахSPKHNA.06.275 at different concentrations in parallel with chemotherapeutic agents for 5 days, after which cell survival was evaluated using SeyTieg Sio as a marker of cell number. This analysis used a matrix of clinically important and mechanistically distinct cytotoxic agents: doxorubicin (an anthracycline Toro I inhibitor), Taxol (a microtubule-stabilizing agent), fludarabine (antimetabolite), and cisplatin (a platinum-based DNA-crosslinking drug). SPIKHNA.06.275 and to a greater extent cSpKHNA.06.642 were found to act synergistically with doxorubicin in enhancing cell death in cells

Ваг/РЕІ ЕК (|Див. Фігуру 15). Одержані відмінності у величинах ІСзо хіміотерапевтичних засобів з анти-РАЇ В- тА СПХНА.06.642 і СПИХНА.06.275 і без них підсумовані у таблиці 12.Vag/REI EC (|See Figure 15). The obtained differences in the values of ISzo of chemotherapeutic agents with anti-RAI V-tA SPKHNA.06.642 and SPYKHNA.06.275 and without them are summarized in Table 12.

Таблиця 12Table 12

О. Анти-РВІ А-функціональна активність анти-РАЇ А-тАБO. Anti-RVI A-functional activity of anti-RAI A-tAB

Антитіла оцінювали в аналізах модуляції і проліферації клітин. Фігура 16 зображує дію 2 концентрацій антитіл СПХНА.0О6.642 і сконструйованих для людини (Нитап Епдіпеегеа"м) антитіл пе.06.642-1 і пе.06.642-2 на РЕГ-індуковане фосфорилування 5їаї5 у клітинах Т47О0. Обидва зберігали сильні антагоністичні властивості, як показано повним усуненням сигналу р-зіаї5. Крім того, жодної агоністичної активності не проявляли ні антитіло, ні клітини, оброблені тільки тАбБ. Подібні результати були виявлені для варіантів сПХНА.О6.275. Таким чином, сконструйоване для людини антитіло не проявляє загалом жодних антагоністичних або агоністичних якостей цих антитіл.Antibodies were evaluated in cell modulation and proliferation assays. Figure 16 shows the effect of 2 concentrations of SPKHNA.0O6.642 antibodies and human-engineered (Nitap Epdipegea) antibodies pe.06.642-1 and pe.06.642-2 on REG-induced phosphorylation of 5yai5 in T47O0 cells. Both retained strong antagonistic properties, as shown by the complete elimination of the p-ZiaI5 signal. In addition, neither the antibody nor cells treated with tAbB alone exhibited any agonistic activity. Similar results were found for the cPCHNA.O6.275 variants. Thus, the humanized antibody shows no overall antagonistic or agonistic qualities of these antibodies.

Аналіз проліферації клітин ВагБ/РвіК використовували для визначення відносних величин ІСво химерних анти-РВ|І В-антитіл і сконструйованих для людини (Нитап Епдіпеегей м) антитіл |див. Фігуру 171.The analysis of the proliferation of WagB/RviK cells was used to determine the relative values of ISvo of chimeric anti-RV|I B-antibodies and antibodies designed for humans (Nitap Epdipeegei m) | see Figure 171.

У результаті цих експериментів було показано, що всі сконструйовані для людини (Нитап Епдіпеегеа"м) антитіла мали приблизно еквівалентні ефективності відносно мишачих копій цих антитіл.As a result of these experiments, it was shown that all the antibodies designed for humans (Nitap Epdipegea"m) had approximately equivalent efficiency relative to mouse copies of these antibodies.

Приклад 16Example 16

Оцінка протипухлинної активності анти-РВІ В-антитіла у моделі лімфоми щурів Мр2-С11Evaluation of the antitumor activity of anti-RVI B antibody in the Mr2-C11 rat lymphoma model

Дослідження з єдиною дозою РО проводили з СИХНА.06.642 у моделі пухлинного ксенотрансплантатуStudies with a single dose of PO were conducted with SIKHNA.06.642 in a tumor xenograft model

МЬ2-С11 для визначення, чи може анти-РАЇ В-тАБ досягати пухлини і блокувати передачу сигналу. У цьому дослідженні використовували антитіло СПИХНА.0О6.642 на основі його афінності стосовно РКК щура (описаної вище). Маркером РО, що піддається моніторингу, був р-ЗТАТ5, медіатор передачі сигналу РЕ! В далі по ходу процесу, що міг бути детектований з використанням імуноблотингу або ІНС. Оскільки фон рівнів р-ЗТАТ5 у пухлинних ксенотрансплантатах Мр2-С11 був занадто низьким для адекватного детектування, миші одержували стимуляцію екзогенним овечим (0)РЕКЇ для збільшення фону рівнів р- 5ТАТ5 і, отже, забезпечення більш придатного динамічного діапазону.Mb2-C11 to determine whether anti-RAI B-tAB can reach the tumor and block signal transduction. In this study, the SPIKHNA.0O6.642 antibody was used based on its affinity for rat RCC (described above). The RO marker that can be monitored was p-ZTAT5, a mediator of PE signaling! Further along the process, which could be detected using immunoblotting or ANN. Because the background levels of p-ZTAT5 in Mr2-C11 tumor xenografts were too low for adequate detection, mice were stimulated with exogenous ovine (0)REKI to increase the background levels of p-5TAT5 and thus provide a more suitable dynamic range.

Індукцію р-ЗТАТ5 детектували Вестерн- і ІНС-аналізами у тварин, які несуть пухлини Мр2-С11, ін'єктованих овечим РЕ, у порівнянні з контролем, ін'єккгованим сольовим розчином (див. Фігури 184А і ВІ.Induction of p-ZTAT5 was detected by Western and INS analyzes in animals bearing Mr2-C11 tumors injected with ovine PE compared with saline-injected controls (see Figures 184A and VI.

Інгібування р-5ТАТ5 спостерігали у мишах, оброблених 10 мг/кг СПИХНА.06.642 за 48 годин перед ін'єкцієюInhibition of p-5TAT5 was observed in mice treated with 10 mg/kg SPIKHNA.06.642 48 hours before injection

ОРРЕЇ, але не в оброблених анти-КІ Н-Ідс1 контрольних тваринах.ORREIA, but not in the treated anti-KI H-Ids1 control animals.

Для визначення, чи корелює інгібування передачі сигналу РК. /Е з інгібуванням росту пухлини МЬ2-С11, виконували багатодозове дослідження ефективності з введенням один раз на тиждень СПХНА.06.642 див.To determine whether signal transduction inhibition correlates with RC. /E with inhibition of tumor growth МБ2-С11, performed a multi-dose effectiveness study with the introduction once a week SPKHNA.06.642 see.

Фігури 19А і ВІ). Введення доз починали через 4 дні після імплантації клітин (до утворення пухлин, що пальпуються) з СПХНА.06.642 або КІ Н-Ідс1 при 10 мг/кг або контролем з сольовим розчином. Вводили чотири внутрішньочеревинних дози тАБ один раз на тиждень. Ця модель використовувала умовну виживаність або час до кінцевої точки прогресування, коли ці пухлини інвазують м'яз і, отже, роблять складним точне вимірювання за допомогою штангенциркуля. Пухлини в обробленій СИХНА.0О6.642 групі не детектувалися до приблизно 11 тижнів після імплантації (7,5 тижнів після 4-ої дози тАБб), коли дві з 15 тварин у цій групі піддалися обтяженості пухлиною. Медіанне виживання в оброблених сольовим розчином іFigures 19A and VI). Dosing began 4 days after cell implantation (before the formation of palpable tumors) with SPKHNA.06.642 or KI H-Ids1 at 10 mg/kg or saline control. Four intraperitoneal doses of TAB were administered once a week. This model used conditional survival or time to end point progression, when these tumors invade the muscle and therefore make accurate caliper measurement difficult. Tumors in the SYHNA.0O6.642-treated group were not detected until approximately 11 weeks post-implantation (7.5 weeks after the 4th dose of tABb), when two of 15 animals in this group succumbed to tumor burden. Median survival in treated with saline solution and

КІ Н-ІдДОе1 контрольних групах дорівнювало 20 дням після імплантації клітин (р«0,0001), і у цій точці тварин евтанізували через обтяженість пухлиною. Тварини в обробленій СиИХхНА.06.642 групі збільшували масу тіла, у той час як контрольні тварини зберігали або втрачали масу тіла, припустимо внаслідок обтяженості захворюванням.CI H-IdDOe1 in the control groups was equal to 20 days after cell implantation (p<0.0001), and at this point the animals were euthanized due to tumor burden. Animals in the SiIXhNA.06.642-treated group gained body weight, while control animals maintained or lost body weight, presumably due to disease severity.

У це дослідження було включене друге плече ефективності, в якому тварин з встановленими пухлинами вносили у це дослідження через 12 днів після імплантації пухлин Ідив. Фігуру 20А і В|. Середні об'єми пухлин дорівнювали 135 мм у момент початку введення доз. Тваринам вводили дози внутрішньочеревинно з 10 мг/кг один раз на тиждень або з СПХНА.06.642, або з контрольними антитіламиA second efficacy arm was included in this study in which animals with established tumors were entered into this study 12 days after tumor implantation. Figure 20A and B|. The average volumes of the tumors were equal to 135 mm at the time of the beginning of the introduction of doses. Animals were dosed intraperitoneally at 10 mg/kg once weekly with either SPKHNA.06.642 or control antibodies

КІ Н-ІдДО1 для 2 доз. Пухлини, очевидно, повністю поверталися до норми після 2 днів після 2-ої дози (3 тижні після імплантації). Однак, приблизно на два тижні пізніше пухлини почали знову з'являтися у цих мишей. У порівнянні з цим, контрольні тварини з КІН-Іде1 мали тяжку обтяженість пухлиною, яка мала середній об'єм 2600 мм3. Оскільки ці пухлини ростуть безпосередньо у м'яз, середній об'єм пухлини може бути більшим, ніж об'єм, зареєстрований вимірюваннями за допомогою штангенциркуля. Медіанна виживаність як у групі з сольовим розчином, так і у групі з КІН-ІДО1 дорівнювала 23 дням після імплантації клітин (р-0«0,0001). Як і у початковому дослідженні, тварини в обробленій СИХНА.06.642 групі збільшували масу тіла, у той час як контрольні тварини зберігали або втрачали масу тіла. Таким чином, СИХНА.06.642- тАбр було ефективним не тільки проти низької кількості пухлинних клітин (початок обробки через 4 дні після імплантації), але також було здатне повністю регресувати агресивні встановлені пухлини МЬ2-С11 протягом більш ніж 2 тижнів.KI H-IdDO1 for 2 doses. Tumors apparently completely returned to normal after 2 days after the 2nd dose (3 weeks after implantation). However, about two weeks later, tumors began to reappear in these mice. In comparison, control animals with KIN-Ide1 had severe tumor burden, which had an average volume of 2600 mm3. Because these tumors grow directly into the muscle, the average tumor volume may be larger than the volume recorded by caliper measurements. Median survival in both the saline group and the KIN-IDO1 group was 23 days after cell implantation (p-0,0.0001). As in the original study, animals in the SIKHNA.06.642-treated group gained body weight, while control animals maintained or lost body weight. Thus, SYHNA.06.642-tAbr was effective not only against a low number of tumor cells (start of treatment 4 days after implantation), but was also able to completely regress aggressive established Mb2-C11 tumors for more than 2 weeks.

Модель МбБ2-С11 продемонструвала, що анти-РВІ В-тАбБ має здатність ефективно діяти на антиген- експресуючі пухлини іп мімо, інгібувати передачу сигналу, що запускається РІ Е, у пухлині та індукувати вимірюваний результат у пухлинній масі, навіть коли тварина має агресивну встановлену пухлину.The MbB2-C11 model demonstrated that anti-RVI B-tAbB has the ability to effectively act on antigen-expressing tumors by IP mimo, inhibit RI E-triggered signaling in the tumor, and induce a measurable outcome in the tumor mass, even when the animal has an aggressive established a tumor

Приклад 17Example 17

Модель ТА70 раку молочної залози людини для оцінки РОTA70 model of human breast cancer for evaluation of RO

Дослідження з єдиною дозою РО проводили іп мімо з антитілом СПХНА.06.642, випробуваним у прикладі 16, з використанням клітин Т47О ракумолочної залози. Оцінювали здатність ОРКІ стимулювати передачу сигналу РЕГІ ЕК, а також здатність СИХНА.06.642 інгібувати цю передачу сигналу іп мімо. Тварини, яким імплантували пухлини, одержували внутрішньочеревинну ін'єкцію сольового розчину, контрольного тАБStudies with a single dose of PO were carried out i.p. mimo with the SPKHNA.06.642 antibody tested in example 16, using T47O breast cancer cells. The ability of ORKI to stimulate the transmission of the REGI EC signal, as well as the ability of SIKHNA.06.642 to inhibit this signal transmission by ip mimo, was evaluated. Animals implanted with tumors received an intraperitoneal injection of saline solution, control TAB

КІ Н-ІдОе1 або спхНА.06.642, а через 48 годин одержували ін'єкцію або сольового розчину, або 20 мкг ОР. болюсною ін'єкцією. Через 40 хвилин тканини пухлин збирали. Значиму індукцію р-ЗТАТ5 спостерігали у пухлинах з оброблених болюсною ін'єкцією ОРЕ тварин, але не у контрольних тварин, які одержували сольовий розчин, як було оцінено Вестерн-блотингом, хоча вона була злегка більш варіабельною при імуногістохімічному аналізі (ІНС) (Фігура 21). Рівні р-АКТ і р-ЕКК не збільшувалися стимуляцією ОРЕ. іп мімо. Важливо, що обробка спХхНА.06.642, але не контролем КІ Н-ІдДсС1 демонструвала сильне інгібування індукції р-зТАТ»5 після болюсної ін'єкції ОРЕ... ІНС-аналіз звичайно підтверджує цей результат. Важливо, що р-зТАТ5 був інгібований у пухлинах у 4 з 4 оброблених сПХхНА.06.642 тварин як у Вестерн-блотингу, такі вKI H-IdOe1 or sphNA.06.642, and after 48 hours they received an injection of either a saline solution or 20 μg of OR. bolus injection. After 40 minutes, tumor tissues were collected. Significant induction of p-ZTAT5 was observed in tumors from bolus-treated ORE animals, but not in saline-treated control animals, as assessed by Western blotting, although it was slightly more variable by immunohistochemistry (IHC) (Figure 21 ). p-ACT and p-ECK levels were not increased by OPE stimulation. ip passed It is important that the treatment of spXhNA.06.642, but not the control KI H-IdDSS1, showed a strong inhibition of the induction of p-zTAT»5 after a bolus injection of ORE... INS analysis certainly confirms this result. Importantly, p-zTAT5 was inhibited in tumors in 4 out of 4 animals treated with sPCxNA.06.642 both in Western blotting, in

ІнС-аналізах.InS-analyses.

Приклад 18Example 18

Експресія РЕК і кореляція експресії РКІ-К з експресією ЕК і Нег2-пейExpression of REK and correlation of expression of RKI-K with expression of EC and Neg2-pey

У нормальних тканинах експресія РКІ К, що визначається кількісно за допомогою ЗТ-ПЛР, є найвищою у молочній залозі і матці, потім у нирці, печінці, передміхуровій залозі і яєчнику. Рівні МРНК РКК є найнижчими у трахеї, головному мозку і легені (Ріегсе 5.К., еї аї., У Епаосг; 171 (1):К1-84 (2001)).In normal tissues, the expression of RKI K, determined quantitatively by RT-PCR, is highest in the mammary gland and uterus, then in the kidney, liver, prostate gland, and ovary. RCC mRNA levels are lowest in the trachea, brain, and lung (Riegse 5.K., ei ai., In Epaosg; 171 (1):K1-84 (2001)).

Імуногістохімічні (ІНС) аналізи можуть проводитися наступним чином. Заморожені проби тканини від ракових пацієнтів заливають у сполуку з оптимальною температурою різання (ОСТ) і швидко заморожують в ізопентані з сухим льодом. Кріозрізи нарізають з використанням мікротому Геіїса 3050 СМ при товщині 5 мкм і при відтаванні монтують на покритих вектабаундом предметних стеклах. Ці зрізи фіксують етанолом при -20"С і дають висихати на повітрі протягом ночі при кімнатній температурі. Фіксовані зрізи зберігають при -80"С до використання. Зрізи тканини дістають і спочатку інкубують у блокуючому буфері (ЗФР, 595 нормальна козяча сироватка, 0,195 Твін 20) протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, і потім інкубують з моноклональним антитілом, специфічним стосовно асоційованого з раком білка, і контрольними моноклональними антитілами, розведеними у блокуючому буфері (1 мкг/мл) протягом 120 хвилин. Потім ці зрізи промивають три рази блокуючим буфером. Зв'язані моноклональні антитіла детектують кон'югатом козяче антитіло проти мишачих ІдснаоаМ (На) Р(ар)»-пероксидаза і субстратом пероксидази діамінобензидином (1 мг/мл, Зідта кат.Ме ОО 5637) в 0,1М натрій-ацетатному буфері рН 5,05 ї 0,003905 пероксиді водню (Зідта кат.Ме Н 1009). Забарвлені зрізи контрастують гематоксиліном і досліджують під мікроскопом Мікоп.Immunohistochemical (INS) analyzes can be performed as follows. Frozen tissue samples from cancer patients are embedded in optimal cutting temperature (OCT) compound and flash-frozen in isopentane with dry ice. Cryosections are cut using a Geiss 3050 CM microtome at a thickness of 5 μm and, upon thawing, mounted on Vectabound-coated slides. These sections are fixed with ethanol at -20"C and allowed to air dry overnight at room temperature. The fixed sections are stored at -80"C until use. Tissue sections are removed and first incubated in blocking buffer (SFR, 595 normal goat serum, 0.195 Tween 20) for 30 minutes at room temperature, and then incubated with a monoclonal antibody specific for cancer-associated protein and control monoclonal antibodies diluted in blocking buffer (1 μg/ml) for 120 minutes. These sections are then washed three times with blocking buffer. Bound monoclonal antibodies are detected by conjugate of goat antibody against mouse IdsnaoaM (Na) P(ar)"-peroxidase and peroxidase substrate diaminobenzidine (1 mg/ml, Zidta cat. Me OO 5637) in 0.1 M sodium acetate buffer pH 5.05 and 0.003905 hydrogen peroxide (Zidta cat. Me H 1009). Stained sections are counterstained with hematoxylin and examined under a Mikop microscope.

Моноклональне антитіло проти асоційованого з раком білка (антигену) використовують для тестування реактивності з різними клітинними лініями з різних типів тканин. Клітини з різних встановлених клітинних ліній видаляють з поверхонь вирощування без застосування протеаз, упаковують і заливають в ОСт- сполуки. Клітини заморожують і роблять зрізи, потім забарвлюють з використанням стандартного ІНС- протоколу. Технологія СеПАггауїм описана у УМО 01/43869. Нормальну тканину (людини), одержану хірургічною резекцією, заморожують і готують препарати. Кріозрізи нарізають з використанням мікротомуA monoclonal antibody against a cancer-associated protein (antigen) is used to test reactivity with different cell lines from different tissue types. Cells from various established cell lines are removed from the growth surfaces without the use of proteases, packaged and poured into OSt compounds. Cells are frozen and sectioned, then stained using a standard ANN protocol. SePAggauim technology is described in UMO 01/43869. Normal tissue (human), obtained by surgical resection, is frozen and preparations are prepared. Cryosections are cut using a microtome

І еіса 3050 СМ при товщині 5 мкм і при відтаванні монтують на покритих вектабаундом предметних стеклах.And eisa 3050 CM at a thickness of 5 μm and when thawed are mounted on glass slides covered with vectabound.

Ці зрізи фіксують етанолом при -207С і дають висихати на повітрі протягом ночі при кімнатній температурі.These sections are fixed with ethanol at -207C and allowed to air dry overnight at room temperature.

Використовують набір для детектування РоїуУМІСА"м для визначення зв'язування моноклонального антитіла проти асоційованого з раком антигену з нормальною тканиною. Первинне моноклональне антитіло використовують при кінцевій концентрації 1 мкг/мл.A kit for detection of RoiuUMISA is used to determine the binding of a monoclonal antibody against a cancer-associated antigen to normal tissue. The primary monoclonal antibody is used at a final concentration of 1 μg/ml.

Для дослідження поширеності експресії РКК і її кореляції з експресією ЕВ і Нег2-пеим, 122 проби пацієнта з інвазивним раком молочної залози оцінювали з використанням імуногістохімії (ІНС). У цілому, 62 зі 122 (5095) проб експресували РЕ К, 58 зі 122 (4795) експресували ЕК і 32 зі 122 (2695) експресували Нег2- пеи. 96 (7895) з цих проб складалися з інвазивної протокової карциноми, з яких 48 (5095) експресувалиTo investigate the prevalence of RCC expression and its correlation with EB and Neg2-peim expression, 122 samples from patients with invasive breast cancer were evaluated using immunohistochemistry (INS). In total, 62 of 122 (5095) samples expressed PE K, 58 of 122 (4795) expressed EC, and 32 of 122 (2695) expressed Neg2-pey. 96 (7895) of these samples consisted of invasive ductal carcinoma, of which 48 (5095) expressed

РЕАГ.Е. Серед цих проб 24 з 48 (5095) експресували також ЕЕ. і 13 з 48 (2695) також Нег2-пеи.REAG.E. Among these samples, 24 out of 48 (5095) also expressed EE. and 13 out of 48 (2695) are also Neg2-pei.

Всі з патентів США, публікацій заявок на патенти США, заявок на патенти США, іноземних патентів, іноземних заявок на патенти і непатентних публікацій, що цитуються у даному описі і/або перераховані вAll of the US patents, US patent application publications, US patent applications, foreign patents, foreign patent applications and non-patent publications cited in this specification and/or listed in

Арріїсайоп бага зпееї, включені сюди як посилання в їх повному вигляді.Arrisaiop baga zpeei are incorporated herein by reference in their entirety.

З попереднього опису буде зрозуміло, що, хоча тут були описані конкретні варіанти здійснення даного винаходу для цілей ілюстрації, різні модифікації можуть бути зроблені без відхилення від ідеї і обсягу даного винаходу.It will be understood from the foregoing description that although specific embodiments of the present invention have been described herein for purposes of illustration, various modifications may be made without departing from the spirit and scope of the present invention.

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

«1105 Вейдіпдег, ей а1. «1205 РВІкК-специфічне антитіло і його застосуваня «1305 27527/43177 «1505 2 60/838648 «1515 2006-08-18 «1505» 60/946360 «1515 2007-06-26 «1605 98 «1705 Рабепстоп уегвіоп 3.4 «2105 1 «2115» 1846 «212» ДНК «213» Ното 5аріепв «4005 1 аєдааддааа агдєддсаєс гдсаассуєє ЕсСсасеЕСстус расЕЕесєсся саасасстгас бо сЕЕСсСєЧдааєд дасадесасс ЕЄсстеддаааа ссссачаєсс ссаааєдесу сСссесссаає 120 аадчааасає Ссасссуссо ссдчадудссе доаодасачаєсу чаддассеєсс стассааєсає 180"1105 Veydipdeg, ey a1. "1205 RVIkK-specific antibody and its application "1305 27527/43177 "1505 2 60/838648 "1515 2006-08-18 "1505" 60/946360 "1515 2007-06-26 "1605 98 "1705 Rabestop uegviop1 3.4 " 1 «2115» 1846 «212» ДНК «213» Ното 5аріепв «4005 1 аєдааддааа агдєддсаєс гдсаассуєє ЕсСсасеЕСстус расЕЕесєсся саасасстгас бо сЕЕСсСєЧдааєд дасадесасс ЕЄсстеддаааа ссссачаєсс ссаааєдесу сСссесссаає 120 аадчааасає Ссасссуссо ссдчадудссе доаодасачаєсу чаддассеєсс стассааєсає 180

Есаседасес ассасацода аддадачаса сесаєрудсаєд аасудєссада ссасаєсаасс 240 чзЧдЕодосссса асссстдсса ссссСуддсаауд садсасассо ссасосодад дасасасаєс 300 аєсаєдуєса асдссастаа ссачаєдоада адсадеЕсЕсь сддаєдаася Есаєдегддас 360Esasedases assasacoda addadachasa sesayerudsayed aasudyessada ssasayesaass 240 chzChdEodosssa asssstdssa ssssSuddsaaud sadsasasso ssasosodad dasasasayes 300 ayesaeduyesa asdssastaa ssachaedoada adsadeEsEs sddayedaasya Esayedegddas 360

ЧЕдчасстаса садієсадсс адасссіссї Есоддадсссо ссодєдчааус аааасадсса 420 чаачасадаа аассстасстї дЕочаєсааа содсссссас сстасссєдає; Сдасесаааа 180 астдаєтаЯадЕ Есасусєссє дсаєсдаааєс сдаєєаазас ссуадааадс адстдачЧчса 540 чачаєссасс ссоссудудуса дсавасачадчЧ Єссаадаєсс ссадсстаса сссадчасад Ге19)9) ааасасстсо ЕссЕддЕссу ссдсааасса сассаєддає ассдоадсдс асоддчадссса бо чсддасссеса Ессадасасс гадедасесс ассаєуааєу асасавассує чеддаєсься 720Чедчасстаса садиесадсс адасссіссы Esoddadssso ssodedchaaus aaaasadssa 420 чаачасадаа аассстассті dEochаесааа содсссссас сстассседае; Сдасесаааа 180 астдаєтаЯадЕ Есасусєссє дсаєсдаааєс сдаєєаазас ссуадааадс адстдачЧчса 540 чачаєссасс ссоссудудуса дсавасачадчЧ Єссаадаєсс ссадсстаса сссадчасад Ге19)9) ааасасстсо ЕссЕддЕссу ссдсааасса сассаєддає ассдоадсдс асоддчадссса бо чсддасссеса Ессадасасс гадедасесс ассаєуааєу асасавассує чеддаєсься 720

ЧеЕсоЧсеуссс ЄЕссСеостоє саєстоуеєссу аєсасьдесе ддддадсачстдуде сссодаадчос тво гасадсаєодд ЄдассеЕдсає сеЕссссосса деЕсссгадудс сааавасааа адсаєседчах 840 чдсссасстодс сгдоудадааддоо саадєстдуваа даастассуа діосстєудод асудссаацчас 300 гЕєсссссса сеЕсСседасста сЧчадддчасесда седдЕддачоі асссачаачс ачаєчасаді 960 чЧаччассаус абссаасуєсауурссастіса адзауаасасст сааоссаауу сабдаааттт З З 1 6029- асасасссуо аєссєдасас Сдасссауос сододудаосє дедасачссс сссссевесд 1080 єседаааадс дЕдаддаасс ссаддссаає сссессасає сстаєдаєсс Едаддесате 1140 чадаадссау ачааєссіда аасаасссас ассідддасс сссаусудсасє аадсаєсодаа 1200 дусааааєссс сстаєестса єудссадсдда сссааасуєє саасаєбадсс сесассасад 1260 сссадссадс асаассссад асссістстас сасаасаєса седчаєдедва Єдачсеєддсе 1320 чЧчЕдсудсссста садасосасс одссассісту Есдаасудаад садусааадча Соус сгаааа 1380 сессестісааа ссасєсаачсс стасадаачау дуааадусаа сссадсадачЧ чоадасадаа 14540 адсссссаєсу ссодадассда ссаодаєсасу ссстодссдс сдссссадда даваассссс 1500ЧеЕсоЧсеуссс ЄЕссСеостоє саєстоуеєссу аєсасьдесе ддддадсачстдуде сссодаадчос тво гасадсаєодд ЄдассеЕдсає сеЕссссосса деЕсссгадудс сааавасааа адсаєседчах 840 чдсссасстодс сгдоудадааддоо саадєстдуваа даастассуа діосстєудод асудссаацчас 300 гЕєсссссса сеЕсСседасста сЧчадддчасесда седдЕддачоі асссачаачс ачаєчасаді 960 чЧаччассаус абссаасуєсауурссастіса адзауаасасст сааоссаауу сабдаааттт З З 1 6029- асасасссуо аєссєдасас Сдасссауос сододудаосє дедасачссс сссссевесд 1080 єседаааадс дЕдаддаасс ссаддссаає сссессасає сстаєдаєсс Едаддесате 1140 чадаадссау ачааєссіда аасаасссас ассідддасс сссаусудсасє аадсаєсодаа 1200 дусааааєссс сстаєестса єудссадсдда сссааасуєє саасаєбадсс сесассасад 1260 сссадссадс асаассссад асссістстас сасаасаєса седчаєдедва Єдачсеєддсе 1320 чЧчЕдсудсссста садасосасс одссассісту Есдаасудаад садусааадча Соус сгаааа 1380 сессестісааа ссасєсаачсс стасадаачау дуааадусаа сссадсадачЧ чоадасадаа 14540 адсссссаєсу ссодадассда ссаодаєсасу ссстодссдс сдссссадда даваассссс 1500

ЕсЕоддссссу ссааасссої дуаєсаєчьуд дачаєссаса аддссаасаг ацасддсдса 1560EsEoddssssu ssaaasssoi duayesayechud dachayessasa addssaasag atsasddsdsa 1560

Есаєсаєсус гассааааса дададасаас адсудсаадс ссаадаадсс судадасесссЕ 1620 чадаасааса аддачьаєос саачуєдссс доаддаєсаєод асаасаасає сссддеєЧчесу 1680 дсдссадаєс сасасудстаа авасосодудсс содсссЄдаад аассадссаа ададдсссса 1740 ссаєсасссЧ аасачаасса адссддаздааа дссссудудсса ассссассдс аасаєсавадес 1800 аадедсаддс сссадсеЕдддчач ЕдЧЯсЕсЯадає сасссуддаєс ссддсає І 1846 «2105 2 «2115 622 «212» БІЛОК «2135 Ното зарієпз «4005 12Есаєсаєсус гассааааса дададасаас адсудсаадс ссаадаадсс судадасесссЕ 1620 чадаасааса аддачьаєос саачуєдссс доаддаєсаєод асаасаасає сссддеєЧчесу 1680 дсдссадаєс сасасудстаа авасосодудсс содсссЄдаад аассадссаа ададдсссса 1740 ссаєсасссЧ аасачаасса адссддаздааа дссссудудсса ассссассдс аасаєсавадес 1800 аадедсаддс сссадсеЕдддчач ЕдЧЯсЕсЯадає сасссуддаєс ссддсає І 1846 «2105 2 «2115 622 «212» БІЛОК «2135 Ното зарієпз « 4005 12

Меє Був бій АвБп Уа! Аїа Бек Аза ТПг Уа! Рібе ТПг ТГецп Гей Гей РБе 1 5 10 15Mee There was a battle AvBp Wow! Aia Bek Aza TPg Ua! Ribe TPg TGecp Gay Gay RBe 1 5 10 15

Те Азп ТПх Сув ГПецп Бей Авп о біу біп Пей Рго Рго б1іу Пуз Рго бійTe Azp TPh Suv GPecp Bey Aup o biu biu Pei Rgo Rgo b1iu Puz Rgo bii

І1їе Рбе Гув Сув Акуд Бек Рко АвБп Був б1п ТПг Рпе ТПх Суз Тгр ТгрI1ie Rbe Guv Suv Akud Bek Rko AvBp Buv b1p TPg Rpe TPh Suz Tgr Tgr

Акад Рхо б1у Тік Авр бі1у б1у Гей Рко ТПк АБп о Туг бек Ге ТіПг Туг зо 55 боAcad Rho b1u Tick Avr bi1u b1u Gay Rko TPk ABp o Tug bek Ge TiPg Tug zo 55 bo

Нів Акад б1ц с1у Січ Тк Бец Мес Ніє СсС1ц Суз Рко Авр Туг І1е ТЬг 65 70 75 8о б1у біу Рго Авп о бек Сув Нів Рів б1у Пув Сіп Тухг ТПх бек Меє Ттгр 85 90 35Niv Acad b1ts s1u Jan Tk Bec Mes Nie SsS1ts Suz Rko Avr Tug I1e Tg 65 70 75 8o b1u biu Rgo Avp o bek Suv Niv Riv b1u Puv Sip Tuhg TPh bek Mee Ttgr 85 90 35

Ак ТпгоТук І1їе Меє Мес Уа! А5зп Аза ТПг о А5зп о біп Меє біу бек бекг 100 105 110Ak TpgoTuk I1ie Mee Mes Ua! A5zp Aza TPg o A5zp o beep Mee biu bek bekg 100 105 110

Рпе б5ег Авр бі Гец Тук Уаі Авр Уаії ТБбк Тук тТ1е Уаї біп Рго Азр 115 120 125Rpe b5eg Avr bi Gets Tuk Uai Avr Uaiii TBbk Tuk tT1e Uai bip Rgo Azr 115 120 125

Рко Рго Пец біц бе Аїа Уаї бі Маї був біп Рко сій Ар Агуд Гув 130 135 140Rko Rgo Petz be Aia Uai bi Mai was beep Rko siy Ar Agud Guv 130 135 140

Ріо Тух Гей Тгр І1е Пуз Тгр бек Рго Рко ТПт Ге І16є АвБр Гец Гу 145 150 155 160Rio Tukh Gay Tgr I1e Puz Tgr bek Rgo Rko TPt Ge I16e AvBr Gets Gu 145 150 155 160

ТБг біу Ткгр Рпбе ТБї Іец Гец Тух СІ1ш І1е Акд Пец уз Рго бі Туз 165 170 175TBg biu Tkgr Rpbe TBi Iets Gets Tukh SI1sh I1e Akd Pecs uz Rgo bi Tuz 165 170 175

А1їа Аї1а сій Тгр бід І1е Зі5 Рпе Аїа біу сіп біп ТпЕ 50100 Рбе Гуз 180 185 190A1ia Ai1a siy Tgr bid I1e Zi5 Rpe Aia biu sip bip TpE 50100 Rbe Guz 180 185 190

Т1е Пец Бех Пеш Нів Рго с1іу сіп Був Туг Тейп УМа1 біп Уа! Акд Сув 195 200 205T1e Petz Beh Pesh Niv Rgo s1iu sip Buv Tug Teip UMa1 beep Ua! Akd Suv 195 200 205

Пув Рго Авр Нів б1іу Туг Тер бег Аїа Тгр бет Рго Аї1а ТПг Ріе Ії1є 210 215 220 сСіп І1е Рго бБег Авр Рбе ТПг Мес Авп Ар Тк ТПх Уа! Тгр т11е Бег 225 230 235 240Puv Rgo Avr Niv b1iu Tug Ter beg Aia Tgr bet Rgo Ai1a TPg Rie Ii1e 210 215 220 sSip I1e Rgo bBeg Avr Rbe TPg Mes Avp Ar Tk TPh Ua! Tgr t11e Beg 225 230 235 240

Ууаї Аїа Уа1ї Пецп бек Аї1а Уа! Т1е Суб5 Пец І1е І1їе Уа1 Тгр Аїа Уаї 245 250 255Uuai Aia Ua1i Pecp bek Ai1a Ua! T1e Sub5 Pet I1e I1ie Ua1 Tgr Aia Uai 245 250 255

А1а Гей їТує Ссі1у Туг бек Меє Уа! ТПх Суб І1е Рпе Рго Рго Уаї Ркго 260 265 270 с1іу Рко Ппуз Т1е був с01у Рпе АБр Ала Нів Пец Тїецй Сіц ПЦув5 С1у Гув 275 280 285A1a Gay eats Ssi1u Tug back Mee Ua! TPh Sub I1e Rpe Rgo Rgo Uai Rkgo 260 265 270 s1iu Rko Ppuz T1e was s01u Rpe ABr Ala Niv Pec Tietsy Sits PCuv5 S1u Guv 275 280 285

Бек бі бій Пец Гей бек Аїа Гєц с1у Суб біп Авр Рпе Рго Рго ТіПг 290 295 300 ех Авр Тух 614 АБр Пео Гей УМаі! біз Тут Пец бі Уаї Авр Авр 5ег 305 310 315 320 бій Авр біп піз Ппей Меє бек Уа! Нів Бек Пувз біц Ні Рко бек Ссіп 325 330 335 біу Меє пу Рко Ту Тук Гецп Авр Ркго Авр Тбх Ар бег СсС1у Акд Сс1у 340 345 350Bek bi bij Pec Gay bek Aia Gets s1u Sub beep Avr Rpe Rgo Rgo TiPg 290 295 300 eh Avr Tukh 614 ABr Peo Hey UMai! biz Tut Pec bi Uai Avr Avr 5eg 305 310 315 320 bij Avr beep piz Ppei Mee bek Ua! Niv Bek Puvz bets No Rko bek Ssip 325 330 335 biu Mee pu Rko Tu Tuk Getsp Avr Rkgo Avr Tbh Ar beg SsS1u Akd Ss1u 340 345 350

Беї Сув Авр бет Ркго бек Гей Геп бек Сіц Був СуБ бі Сі Рго сіп 355 360 365Bei Suv Avr bet Rkgo bek Gay Gap bek Sits Buv SuB bi Si Rgo sip 355 360 365

А1а Азп Рко бет ТБк Рпе Туг Авр Рго бі Уа! І1е бі був Рхто бі1ц 370 375 звоA1a Azp Rko bet TBk Rpe Tug Avr Rgo bi Ua! I1e bi was Rhto bi1ts 370 375 zvo

АвпоРко Сі Тк оТик о Нів ТК оТгр Авр Рго біп Сув І1е бБег Мек С17 385 390 395 400 сбіу пуз І1е Рго Тух Рпе Ніз А1ї1а Сіу сіу бек Був Сув бек Таг Тгр 405 410 415AvpoRko Si Tk oTik o Niv TK oTgr Avr Rgo bip Suv I1e bBeg Mek S17 385 390 395 400 sbiu puz I1e Rgo Tukh Rpe Niz A1i1a Siu siu bek Buv Suv bek Tag Tgr 405 410 415

Рко Гей Рго Сбіп Рко бБег біп Нів А5п Рко Акуд бек Бек Тук Нів Азп 420 425 430Rko Gay Rgo Sbip Rko bBeg beep Niv A5p Rko Akud bek Bek Tuk Niv Azp 420 425 430

І1е ТБк Авр Уаї Суб сій тей А1їа Уаї С1у Рго Аї1а сС1у Аза Рхго А1а 435 440 445I1e TBk Avr Uai Sub siy tey A1ia Uai S1u Rgo Ai1a sS1u Aza Rhgo A1a 435 440 445

ТпКорец Тгц Азп біц Аїа бі1у Гуз Азр Аїа Гєцй Буз бек бек біп ТТГ 450 455 460TpKorets Tgc Azp bits Aia bi1u Guz Azr Aia Getsy Buz back back beep TTG 450 455 460

І1Т1е Був Бех Аку сі бі сб1у Ппув Аза Тпг о Сіп сСіп Агд бі Уа! бій 465 470 475 480 бек Рпе Ніз бек бій ТПг Авр біп Авр Тк о Рго Тер Гей КГец Рго біп 485 490 495 біз пув Тпх Рго Рпе біу Бек А1їа Пув Рко Тео Авзр Тук Ма! Сі І1е 500 505 510I1T1e Buv Beh Aku si bi sb1u Ppuv Aza Tpg o Sip sSip Agd bi Ua! battle 465 470 475 480 bek Rpe Niz bek battle TPg Avr beep Avr Tk o Rgo Ter Gay KGec Rgo beep 485 490 495 biz puv Tph Rgo Rpe biu Bek A1ia Puv Rko Teo Avzr Tuk Ma! Si I1e 500 505 510

Нів Був Маії Авп о бубз Авр с1у А1їа Ге Бек Бец Іїец Рко ув біп Агд 515 520 325 біз Авп бек біу Ппув Рго Був Пув Рго б1у ТПк Рго Сі Авп АзпоГувз 530 535 540 біз Тук А1ї1а пув Уаї Бек Сс1у Уа1і Меє Авр Авп Авп І1е Гей Уа1ї Гей 545 550 555 560Niv Buv Maii Avp o bubz Avr s1u A1ia Ge Bek Bec Iiets Rko uv bip Agd 515 520 325 biz Avp bek biu Ppuv Rgo Buv Puv Rgo b1u TPk Rgo Si Avp AzpoGuvz 530 535 540 biz Tuk A1i1a puv Uai Bek Ss1u Ua1i Mee Avr Avp Avp I1e Gay Ua1i Gay 545 550 555 560

Уаї Рко Авр Рго Ніз Аїа Гуз А5п Уа1і Аїа Суб Рпе б1ц бі) бег Аїа 5:65 570 575Uai Rko Avr Rgo Niz Aia Guz A5p Ua1i Aia Sub Rpe b1c bi) beg Aia 5:65 570 575

Був біз Аза Рко Рго бек Тез біц біп АвБп біп Аїа січ Суб Аза Тец 580 585 550Was biz Aza Rko Rgo bek Tez bis bip AvBp bip Aia Jan Sub Aza Tets 580 585 550

А1а Азп Рре ТПг Аїа ТІПг бек бек Гуз Сув Агу Тед сіп Гїєи б1у б1У 5З5 (100) 605A1a Azp Rre TPg Aia TIPg bek bek Guz Suv Agu Ted sip Giyey b1u b1U 5З5 (100) 605

Тецш Авр Тук Гей Авр Рго Аза Суб РПе ТП Ні бек Ріе Ні 610 615 620 «2105 З «2115 70 «212» ДНК «2135 Ното заріепз «4005 З дочасаачес сдсасааада адсаддстас дааддачаса гасаєтаєсаа оодааваєдчед бо дсаєсссдсаа | 70 «210» 14Tetsh Avr Tuk Gay Avr Rgo Aza Sub RPe TP Ni bek Rie Ni 610 615 620 "2105 Z "2115 70 "212" DNA "2135 Noto zariepz "4005 Z dochasaaches sdsasaaada adsaddstas daaddachasa gasayetayesaa oodavaedched bo dsayesssdsaa | 70 "210" 14

«2115 79"2115 79

«2125» ДНК"2125" DNA

«2135 Ношо зарієпз"2135 Nosho zariepz

«4005 4 чуддассасеї: сосСасаачаа адсссЧчоудеьсс ааддссссоєоа асоЧчеЕдчасод сдасаЯасоссс 60 саєсаєесає ддеЕсвачес 79 2105 5"4005 4 chuddassasey: sosSasaachaa adsssChchoudess aaddssssoyeoa asoChcheEdchasod sdasaYasosss 60 sayesaeesae ddeEsvaches 79 2105 5

«2115 48"2115 48

«2125 ДНК"2125 DNA

«2135 Ното заріепз"2135 Noto zariepz

«4005 5 І чудасаацЕс Судсасааава ачдсадудсссс давадчачаса давассаєд 48 «2105 6"4005 5 I chudasaacEs Sudsasaaava achdsadudssss davadchachasa davassayed 48 "2105 6

«211» 50"211" 50

«2122 ДНК"2122 DNA

«213» Ношо заріепз"213" Nosho zariepz

«4005 6 садчоассссуа адчсачасача ассасудаачдчч ааааєсддсудос асссдсаасс 20 «2105 7 «211» 49"4005 6 sadchoassssua adchsachasacha assasudaachdchch aaaayesddsudos asssdsaass 20 "2105 7 "211" 49

«212» ДНК"212" DNA

«213» Ното зарієпв"213" Noto zariepv

«4005 17 чаасадаааає дсддсаєсстд савассдєєЕс сасеЕсеєдсста сЕссессес І 49 «2105 8"4005 17 chaasadaaaae dsddssayesstd savassdeeeEs saseEseyedssta sEssesses I 49 "2105 8

«2115 50"2115 50

«2125 ДНК"2125 DNA

«213» Ното зарієпе"213" Noto Zariepe

«4005 8 сасссссасс студсстасксє Сссссаасас седссссско аасодадчад 50 «2105 З"4005 8 ssssssss studsstasksye Sssssssas sedssssko aasodadchad 50 "2105 Z

«2115 50"2115 50

«2125 ДНК"2125 DNA

«2135 Ното заріепз"2135 Noto zariepz

«4005 139 - саасасстдс сссссЗдавсо даддадсаса сСсассаєсас саєсасоодаду 50 «2105 10"4005 139 - saasasstds sssssZdavso daddadsasa sSsassayesas sayesasoodadu 50 "2105 10

«211255 50 ,"211255 50,

«212» ДНК"212" DNA

«кі» Ноще шарів «дя пл чі 15 сазатовсеа їсазсавсве чистову сасотесбац паазососви зи «ій» 113 «Вів Ба «т18з ДНК ие МНемйс усе «їі Шепю двріваБ «Аза Ії чЧччцвспвостх бзррасавцавз адєскачактс есбозесквх збавсовсм соя Зх «Р ІЙ «ії» 48 свіх» ДНК"ki" Night of layers "dia pl chi 15 sazatovsea ysazsavsve chistovu sasotesbats paazososvy zi "iy" 113 "Viv Ba "t18z DNA ie MNemys all "iii Shepyu dvrivaB "Aza Ii chChchchcsvspvosth bzrrasavtsavz adjeskachakts esbozeskwh zhabsovsm soya Zh "R IY "ii" 48 svih" DNA

Баш Е - щі . «1Х» Номе заріспв «Зо» їх чозсзвзовачкі сусзсвазаа звосводсткс саводадака давссаку 48 сет 5 «іх 13 о я т сжії» 53 «жі» ДЕК «К13» Ново Барієспя «Оп 17 пводисунаа зоцацитада зесвеізаациа вазвабзснЗх абскосааве аа «сх 18 пери «а1ї» 4 теле пецрле «ві» ДНЕ «Ра» йожпо давполвпа че МАЬЮ ХЕ фЬКг я «00» 14 чЧавзовазах Ууводсасску савосУівЕ свобокоОста сив оки 8 «г1сз 18 «азів АВ «йїйх дИиЖ сиза» пото звріалпе «ах 15 слскттсасо скЗохтасих сосповзпаз суЗзсотІстз азбука В «ійх 36 «211» 48 ків» ДЕ сан Шен ше плям в нт АНІ ожовЕнК я «ах 16 тексвавивсю спосо ла аовксецес вазсисьсик Єкощедєке 3 вра» Са «ад Ії «їі ах «вір» ДЕК сг13» Мото дарізпеBash E-schi. "1X" Nome zarispv "Zo" their chozszvzovachki suszsvazaa zvosvodstks savodadaka davssaku 48 set 5 "ih 13 o i t szhii" 53 "zhi" DEC "K13" Novo Bariespya "Op 17 pvodisunaa zotsatcitada zesveizaatsia vazvabzsnZh abskosaave aa "sh 18 peri "a1i » 4 tele pecsrle "vi" DNE "Ra" yozhpo davpolvpa che MAYU ЭЭ fКg я "00" 14 chChavzovazah Uuvodsassku savosUivE svobokoOsta siv oky 8 "g1sz 18 "aziv AV "yiykh dIyJ siza" poto zvriaalpe "ah 15 slskttsaso skZohtasyh sospovzpaz suZzsotIstz alphabet In "iyh 36 "211" 48 kiv" DE san Shen she tm v nt ANI ozhovEnK i "ah 16 teksvavyvsyu sposo la aovksetses vazsissyk Yekoshchedieke 3 vra" Sa "ad Ii "ii ah "vir" DEC sg13" Moto darizpe

«4005 17 саєсдаєсддьо асодсдаєді дсіссаєсає єсабодЕдаа десассаду 49 «210» 18 Й «211» 47 «2125 ДНК «2135 Ношто заоіеп5в «400» 18 саацдааадсї дддЕссаадс сссоєЧчаєод гдасдуєдає дчеЕдсєссс 47 «2105 19 «211» 37 . «2125 ДНК «213» Ното заріепв «4005 19 чадчассасесї гдсасаавадаа адсЕдодсеє аадстсс 37 «210» 20 «211» 115 «212» БІЛОК «2135 Ношо зарієпз «4005 20"4005 17 sayesdayesddyo asodsdayedi dsissayesae yesabodEdaa desassadu 49 "210" 18 Y "211" 47 "2125 DNA "2135 Noshto zaoiep5v "400" 18 saatsdaaadsi dddEssaads sssoyeChchaeod gdasduedae dcheEdssess 47 "2105" 197 " "2125 DNA "213" Noto zariepv "4005 19 chadchassasesi gdsasaavadaa adsEdodseye aadstss 37 "210" 20 "211" 115 "212" PROTEIN "2135 Nosho zariepz "4005 20

Сі Уаї сбіп ей Геш бій бек біу б1іу б1у тей Уаїі біп Рго біу біу 1 5 10 15 бЗек еп Агу Гец бек Сув АЗїа Аза бек біу Рре бПг Рпе бегт Азп Туг с1іу Меє Ніз Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рко біу Пуз с1у Тез бі Тгр УаїSi Uai sbip ey Gesh bii bek biu b1iu b1u tey Uaii bip Rgo biu biu 1 5 10 15 bZek ep Agu Gets bek Suv AZia Aza bek biu Rre bPg Rpe begt Azp Tug s1iu Mee Niz Tgr Uai Agud sip Aza Rko biu Puz s1u Tez bi Tgr Uai

А1а Уаї Іїе Бек Туг Авр б1у бек Авп Був Тук Тук А1їа Авр Бех Уаї1 воA1a Uai Iie Bek Tug Avr b1u bek Avp Buv Tuk Tuk A1ia Avr Beh Uai1 vo

Був сіу Акуд Рпе ТПг о І1е Бех Акту Авр Ав5побет Був Ап ТПтх Пец Тукг 65 70 75 воBuv siu Akud Rpe TPg o I1e Beh Aktu Avr Av5pobet Buv Ap TPth Pec Tukg 65 70 75 vo

Тец біп Мес А5п бек Геш Аку Аза б14 Азр Тк Аза Уаї Тук Тукг Сув 85 , 50 95 діа ТПг Рго Уаі УМаі! Уаї Аїа Рко сбіу Тук Тер б1у сі1іп б1у ТВк Те 100 105 110Tets bip Mes A5p back Gesh Aku Aza b14 Azr Tk Aza Uai Tuk Tukg Suv 85 , 50 95 dia TPg Rgo Uai UMai! Uai Aia Rko sbiu Tuk Ter b1u si1ip b1u TVk Te 100 105 110

Уа1ї ТПпг Уа1ї 115 «2105 21 «2115 110Ua1i TPpg Ua1i 115 "2105 21 "2115 110

«212» БІЛОК «213» Ношо заріепз «4005 21 біп Бек Уа1і Гей ТПг обіп Рго Рго бБег А1їа бек СсС1у ТПУ Рго б1іу біп 1 в) 10 15"212" BILOK "213" Nosho zariepz "4005 21 beep Bek Ua1i Gay TPg obip Rgo Rgo bBeg A1ia bek SsS1u TPU Rgo b1iu beep 1 c) 10 15

Ат Маї ТІ І1їе Бег Сув бек сіу бек бБег Бех Авп І1е сС1у Бек АвпAt Mai TI I1ie Beg Suv bek siu bek bBeg Beh Avp I1e sS1u Bek Avp

Тр оУа1ї Азп Тер Туг біп біп Гео Рго сСіу Тіх Аза Рго Пуз Бей ГецйTr oUa1i Azp Ter Tug beep beep Geo Rgo sSiu Tih Aza Rgo Puz Bay Getsy

І1е Тукг АБр АБп о АБп Аб5п оАгу Рго бег С1у Ма1ї Рко Авр Агу Рое 5ег з5 60 сС1у бет ГПуз бек б1у Тік бек Аза бек Тен А1їа І1е бек с1у Тєцй Агд 65 70 75 80 зек бі Ар Сі Аза АБр Тугк Тукг Сув А1їа А1їа ТІгр АБр Авр бБеї Гей 85 90 35 бек б1у Рго Уаі Рпе сСі1у б1у Сбіу Тпг Гув Гей ТПг о Уа1і Тв 100 105 110 «2105 22 «2115» 114 «212» БІЛОК «2135 Ното заріепз «4005 22 біш Уаї сіп Гец Гей бій бек Ссіу біу б1у Пец Уаї сіп Рко б1у ЩУу 1 5 10 15 бек Ге Агуд Гецп Бек Сув Аїа Аїа бЗех б1у Ррпе ТпІ Рпе АвБр Ар Туг 20 25 30I1e Tukg ABr ABp o ABp Ab5p oAgu Rgo beg S1u Ma1i Rko Avr Agu Roe 5eg z5 60 sS1u bet GPuz bek b1u Tik bek Aza bek Ten A1ia I1e bek s1u Tetsy Agd 65 70 75 80 zek bi Ar Si Aza ABr Tugk Tukg Suv A1ia A1ia TIGR ABr Avr bBei Gay 85 90 35 bek b1u Rgo Uai Rpe sSi1u b1u Sbiu Tpg Guv Gay TPg o Ua1i Tv 100 105 110 "2105 22 "2115" 114 "212" BILOK "2135 Noto zariepz "4005 22 bish Uai biy Gets Gay bek Ssiu biu b1u Pecs Uai sip Rko b1u Shchuu 1 5 10 15 bek Ge Agud Gecp Bek Suv Aia Aia bZeh b1u Rrpe TpI Rpe AvBr Ar Tug 20 25 30

Сіу Меє бек Ттр Ма! Аку біп Азїа Рго Сі1іу Гуз СсС1іу Певи Сі Тгр Уаї 35 40 45Siu Mee back Ttr Ma! Aku bip Asia Rgo Si1iu Guz SsS1iu Pevy Si Tgr Uai 35 40 45

А1їа І1ї1е І1їе бек Тук АБр сСіу бек Тут Тіт Тук Тухт А1ї1а Аво бек УМаїA1ia I1i1e I1ie bek Tuk ABr sSiu bek Tut Tit Tuk Tukht A1i1a Avo bek UMai

БО 55 боBO 55 bo

Туз бІу Аг Рпє ТпПІ Іїе бех Аг9у АБр АБп беї ПувБ АБп ТПг о Геч Туг 65 70 75 8Ace bIu Ag Rpye TpPI Iie beh Ag9u ABr ABp bei PuvB ABp TPg o Gech Tug 65 70 75 8

Пец біп Ме Азп бек Тео Акуд Аїа бі Авр ТБг о Аза Уаї Тук Тук Сув 85 930 35Petz bip Me Azp bek Teo Akud Aia bi Avr TBg o Aza Uai Tuk Tuk Suv 85 930 35

А1а Аку Аза бек бек Тік бек Ар Тук Тер Сіу біп С1у Тк Ге Уа! 100 105 110A1a Aku Aza back back Tick back Ar Tuk Ter Siu beep S1u Tk Ge Ua! 100 105 110

ТнЕ Уаї «2105 23 «211» 110 «212» БІЛОК «213» Ното зарієпз «2205 «221» штівс Теасиге «222» (84)..(84) «223» Хаа може бути будь-якою природною амінокислотою «4005 23TnE Uai "2105 23 "211" 110 "212" PROTEIN "213" Noto zariepz "2205 "221" shtivs Teasige "222" (84)..(84) "223" Haa can be any natural amino acid "4005 23

Сіп бек Уаії Бечп Тк сб1п Рко Рко Бех Аза бек б1у Тпйг Рго С1у б1п 1 З 10 15Sip back Uaii Bechp Tk sb1p Rko Rko Beh Aza back b1u Tpyg Rgo S1u b1p 1 Z 10 15

Ака Уа1 Тс І1їе Бек Сувз бек біу Бек бек бек Аб5п Ііе б1у Ав5п Авп 10)Aka Ua1 Ts I1ie Bek Suvz bek biu Bek bek bek Ab5p Iie b1u Av5p Avp 10)

А1їа Уаі1 Авп Тур Туг сіп б1іп Гец Рко б1у ТПх Аза Ркго їуз Тецй ГейA1ia Uai1 Avp Tur Tug sip b1ip Gets Rko b1u Tph Aza Rkgo iuz Tetsy Gay

І1Те Тук Азр Авп Туг Агу Аку Рго Рго біу І1е Рго Авр Агу Ропе 5бег 60 біу Бек Пуз Бек біу Тік бБетг Аїа бек Пец Аза І1е бек сб1у Пец Агд 65 70 75 80 бек бійц Авр Хаа А1їа Авр Тук Тук Суз Аїа Уа1і Тгр Авр б1у Ага Гец 85 зо 25I1Te Tuk Azr Avp Tug Agu Aku Rgo Rgo biu I1e Rgo Avr Agu Rope 5beg 60 biu Bek Puz Bek biu Tik bBetg Aia bek Pecs Aza I1e bek sb1u Pecs Agd 65 70 75 80 bek biyts Avr Haa A1ia Avr Tuk Tuk Suz Aia Ua1i Tgr Avr b1u Aga Gets 85 of 25

Авпобіу Рго Уаі Рре сіу с1у с1у ТП Гуз пе ТПгоУаї Гецп 100 105 110 «210». 024 «2115 113 «212» БІЛОК Й «2135 Ношто заріепе «4005 274 й бій Уаі Сбіп о пец пе бій бег біу бі1у СІу Гей Уаї біп Рго Сіу СІу її - 5- пяти 10 ------500-50- 15 ---Avpobiu Rgo Uai Rre siu s1u s1u TP Guz pe TPgoUai Gecp 100 105 110 "210". 024 "2115 113 "212" BILOK Y "2135 Noshto zariepe "4005 274 and bij Uai Sbip o pet pe bij beg biu bi1u SIu Hey Uai bip Rgo Siu SIu her - 5- pyati 10 ------500-50- 15 ---

Зеї Іецш Аго Пейп б5ехг Сув Аїа Аза Бек Сіу Рпе ТПк Рбе Ар Азр Туг 20 25 30 ня ще хі лету и Мо хх О І я ї Жак Х ух а пану щі біу же Хах тТтр очах хо піп пів Река Бі Бу сіу цем бів Тхв очах де щ є а 8 і5 дек віж їі: йШек Тхр Аза ех біу Уві чЗаї дів Тух Аза Ахр бек Хі їуз ліу дкш о Бле ТВж бів пек Ахо др о Авв Зех бив Ба тТЗЕ бе тут в -я щеZei Ietssh Ago Peip b5ehg Suv Aia Aza Bek Siu Rpe TPk Rbe Ar Azr Tug 20 25 30 nya still hi letu i Mo xx O I i i Jak H uh a panu schi biu zhe Hah tTtr ochah ho pip piv Reka Bi Bu siu cem biv Tkhv ochah de sh is a 8 and 5 dek vizh yii: yShek Thr Aza eh biu Uvi chZai div Tukh Aza Ahr bek Hi yuuz liu dksh o Ble TVh biv pek Aho dr o Avv Zeh biv Ba tTZE be tut v -ya sce

Б та 5 но поза МОЖ вх. ей дітях Жоуче лбошаа дчння щі упік ке соч оди Туя вах ЧУ ій іп Мес зп бек ін вла Віз із ве Тву діа Уві ТУук тТуЖш Суд їй й аB and 5 but outside the Ministry of Internal Affairs, entrance. hey children Жоуче лбошаа дчня щи пик ке соч оди Tuya wah ХУ ий ip Mes zp bek in vla Viz ve Tvu dia Uvi TUuk tTuЖsh Court і і a

ВЕ зуо3 5VE zuo3 5

ТЕ ЖВЕ ТУК ві Во Тук Мат дкаб Тер ощіу Пік Зі ТвЖ їж Уді їпЕ іп 125 З1йTE ZHVE TUK vi Vo Tuk Mat dkab Ter oshchiu Peak Z TVЖ eat Udi ipE ip 125 Z1y

Уві ся -к «шо ЕВUvi sya -k "sho EV

БАЛИ ни «Кі іх 115 сеї БІЛОК се т га ї С соду зга м «вії» Косщо заршпа «о» иВ нн КУ 1 Мною г Ок З - ря дар І ха ни вия з бів Беж Уві Бей ТБж бів КхЗз КБжо дет бід ех їх) їх о Кко біз чаPOINTS "Ki ih 115 sei BILOK se t ga y S sodu zgam "vii" Kosscho zarshpa "o" iV nn KU 1 Mnoi g Ok Zrya dar I ha ni vya z biv Bezh Uvi Bey TBzh biv KhzZz KBjo det bid eh ikh) ikh o Kko biz cha

М З їо 15M Z io 15

М п Я ин, ті Єщрм брех яру Та їх обу Хкля Ж ще гот Фон дхкоа Уві Тнх бів бек Су бек о1у Бек Бек Шех Ап бів пір бех Ал а ка З теж їх - тоже брюки лір Фо Жах та» ріж їли лад їх Ж ххM p Ya in, those Yeshrm breh yaru And their obu Hklya Z still got Fon dhkoa Uvi Tnh biv bek Su bek o1u Bek Bek Sheh Ap biv pir beh Al a ka Z too them - too pants lir Fo Zah ta" cut their way Well xx

ТївеЕ Уві Аза те ТУух ія пів баб; Бкз Біу Твх вів уз Бе без беTyveE Uvi Aza te TUuh iya piv bab; Bkz Biu Tvh vyv uz Be without be

КЕ ик ФкKE ik Fk

Кк 40 Я дао фати пйшет Ще Лат Мих ес ст Ген У и Ок жк ле браKk 40 I dao fati pishet More Lat Mykh es st Gen U i Ok zhk le bra

Тіз ТУкЕ Веб лав» Ваз Був БХЗ Бк бі БіУу Уві Бо др о Ах Се 5еЄTiz TukE Web lav» Vaz Buv BHZ Bk bi BiUu Uvi Bo dr o Ah Se 5eE

Зо За 5Z Za 5

Зіу шеж Цуз шерБ сім так бек лів ше Без вів Кіє Бех сіу їі ВХ ба та за о ек пл дЕрв Зіш йівз Ав бух Ту Су ів Віа Ткр Аво облр мех бен ех зд яZiu shezh Tsuz sherB sim tak bek left she Bez viv Kie Beh siu yii VH ba ta za o ek pl dErv Zish yivz Av buh Tu Su iv Via Tkr Avo oblr meh ben eh zd ya

З Я МУZ I MU

Бех Біб Вже зеб Ба о біє Біб щіу ТБжЕ Би їзо тиж о Уді певBeh Bib Already zeb Ba o biye Bib schiu TBzhE Bi izo tizh o Udi pev

Іа Вася вIa Vasya v

Федик М «Ії» 115 шт шт» «йВйз БЕНОЕ «йИК3» Мово зашіедаFedyk M "Ii" 115 pc pc" "yVyz BENOE "yIK3" Language

«400» 26"400" 26

Сіц Уаї Сіп Те Гец біш бех Сіу сС1у с1у ТїТеш Ма! біп Рко б1у б1Уу 1 З 10 15 бек Гец Атд Пец бек Сув Аїа А1їа бБеїг с1у Рпе ТПх Рпе Авп Бех ТугSitz Uai Sip Te Gets bish beh Siu sS1u s1u TiTesh Ma! beep Rko b1u b1Uu 1 Z 10 15 bek Gets Atd Pec bek Suv Aia A1ia bBeig s1u Rpe TPh Rpe Avp Beh Tug

Рго Уаї Нів Тгр Маї Аку біп Аїа Рго б1у Пув б1у Пе бі Ткр УаїRgo Uai Niv Tgr Mai Aku bip Aia Rgo b1u Puv b1u Pe bi Tkr Uai

Азїа Ма1ї І1їе бБег Тук Авр с1у Авп ТПг оПувз Туг Туг Аза Авр бек Уаї 650Asia Ma1i I1ie bBeg Tuk Avr s1u Avp TPg oPuvz Tug Tug Aza Avr bek Uai 650

Був б1у Акту Рбе ТПк ТІ1е бек Агуд Авр Авп бек пув Авп Тпх Пец Тук 65 70 75 80 їец біп Мес Азп о бет пей Аку Аїа бі А5р ТОПг Азїа Уа1ії Тут Тук Суз 85 90 35Buv b1u Aktu Rbe TPk TI1e bek Agud Avr Avp bek puv Avp Tph Pec Tuk 65 70 75 80 iets bip Mes Azp o bet pey Aku Aia bi A5r TOPg Asia Ua1ii Tut Tuk Suz 85 90 35

Аїа Агу Авр о Абзп о Рго Рко Рбе Авзр Тух Тгр сіу Сіп СсС1у Тбтх Ге А1а 100 105 110Aia Agu Avr o Abzp o Rgo Rko Rbe Avzr Tukh Tgr siu Sip SsS1u Tbth Ge A1a 100 105 110

ТПхк Уаї «2105. 27 «2115» 112 «2125 БІЛОК «213» Ното зарієп5 . «4005 27 б1а бек Уаї Тео ТК оСіп Рко Рко бек Аїа Бех сіу Тіх Рго С1у сіп 1 5 10 15TPhk Uai "2105. 27 "2115" 112 "2125 PROTEIN "213" Noto zariep5 . "4005 27 b1a bek Uai Teo TK oSip Rko Rko bek Aia Beh siu Tih Rgo S1u sip 1 5 10 15

Акоа УМаі Тс І16е бБег Суз бБег біу Бек бБеїт бБеїт Азп І1е 01у Авп Авп 20 25 30)Akoa UMai Ts I16e bBeg Suz bBeg biu Bek bBeit bBeit Azp I1e 01u Avp Avp 20 25 30)

Тук Маїії бек Тктр Туг Сіп біп Тед Ркго с1у ТиПг А1їа Рко Гув Тез Іецй 35 40 45Tuk Maiii bek Tktr Tug Sip beep Ted Rkgo s1u TyPg A1ia Rko Guv Tez Ietsy 35 40 45

І1е Тук Авр Авп Авп оАзп Ак Рго бек б1у Ма1і Рго Азр Акуд РБе 5бег 50 55 60 й сСіу бек Туз бЗехг с1у ТПк бек АТїа бек Гец Аїа І1е бек СсС1у Ге Агд 65 70 75 оI1e Tuk Avr Avp Avp oAzp Ak Rgo bek b1u Ma1i Rgo Azr Akud RBe 5beg 50 55 60 and sSiu bek Tuz bZehg s1u TPk bek ATia bek Gets Aia I1e bek SsS1u Ge Agd 65 70 75 o

Зек бій Азр Сіц Аза АБр Тук Тук Сувз бід Аїа Тгр Авр АвБр ТПг Пец 85 Зо 35 щу ьиЯ х " Укл з гт- р б жа ау оф Х хлю Ж тля ЗвZek bij Azr Sits Aza ABr Tuk Tuk Suvz bid Aia Tgr Avr AvBr TPg Pec 85 Zo 35 schu yyYa x " Ukl z gtr b zha au of X hlyu Z tlia Zv

Вшв сін Бкоа біз Уві Заї вве піч Щ1у пб3У Тв Лууя бо Жах Зав їжи ек я е у іп зи 115 «ЖИМ В «ваїМ 16 пари тут мечу «іш БІЛОК 13 ке дару оща их п ша емо ся ле «ОПО» бWshv sin Bkoa biz Uvi Zai vve pich Sh1u pb3U Tv Luuya bo Zah Zavzhi ek i e u ip zy 115 "ZHIM V "vaiM 16 pairs here mechu "ish BILOK 13 ke daru oshcha ih p sha emo sya le "OPO" b

Еш у я че оо боту ях о я КАТ мера же зх их НН У АНТ сEsh u ya che oo botu yah o ya KAT mera same zh ikh NN U ANT p

Зіц жаї іп Бей без 5210 шщЩежЕ ЗіУу ші 01 ша ді бів ВБхЗз у Б1У в й щи якZits zhai ip Bay bez 5210 shshSchezhE ZiUu shi 01 sha di biv VBhZz in B1U in y shchi how

І 5 їй ІїAnd 5 to her

Фр вх Шк яву хх бч; п З- лук (сІ1х ЗЕки Ми Мне щік. ЖеСх сеFr вх Shk yavu xx bch; p Z- luk (sI1x ZEky Mi Mne shik. ZheSh se

Зх іше Во фс ех Су вів Аза Бех сіє Бае ТБжх Ре ех дай Бег тв «щ ВТ ру 5 за сітки но Машо т к-т и и ШК Хумиу У, толь ка зу ї те бунту У зіуУу мех Ні ТЕрд Узі ба ЗА Аза хо СіУ БоБ о щі» без бів Ткро Уві -т й Уа її іо ах т пі їх йо спання фл ШУ у баннер Тор тат сут Во ро еще зіа дів Кіз бек ТУуК йо обі беж АВа Буш Туш Туш Вів яз бак хвіZh ishe Wo fs eh Su viv Aza Beh siye Bae TBzhh Re eh dai Beg tv «sh VT ru 5 for nets no Masho t k-t i i ShK Khumiu U, only ka zu i te riot U ziuUu meh Ni Terd Uzi ba ZA Aza ho SiU BoB o shchi" without biv Tkro Uvi -t y Ua her io ah t pi ih yo sleep fl SHU u banner Tor tat sut Vo ro still zia div Kiz bek TUuK yo obi bej AVa Bush Tush Tush Vyaz bak hvi

І 2 Ех гI 2 Ex g

НЯ 5 шхNo. 5 shh

З зс кі йон ЇМ: СБ Ж ху Зате» Йочеут сот дя У жо Ж озуу фс ХЕ жі бакZ zs ki ion IM: SB Zh hu Zate" Yocheut sot dya U zho Z ozuu fs ХЕ zhi bak

МУ б1Уу ви бе ТаХ їі бек ХО Джо лап обех Був Ддяв тТпаг обем Тук ве -г не 5 їй Та шаMU b1Uu you be TaH ii bek HO Jo lap obeh Buv Ddyav tTpag obem Tuk ve -g not 5 her Ta sha

КУ : 3 За хк З - пе нн и ех У як Кр їх Мт бен їз сіп Ме АзпоЗек Сер Ак Аза сів бер оТвк Афз Уві Тех Жук СУБ ва Зо зу вінок той бог бан то ти паї й тую т іх ютя бло тиKU : 3 Za hk Z - pe nn y eh U yak Kr ih Mt ben iz sip Me AzpoZek Ser Ak Aza siv ber oTvk Afz Uvi Teh Zhuk SUB va Zo zu winok that god ban to ti pai y tuyu t ih yutia blo ty

Аїв вт Аівз дшроцек век ску ТПХх Уві перо твж їхр о зіу іп осіу ЇВК лек па тік 100 15 118Aiv tu Aivz dshrotsek vek sku TPHx Uvi pero tvj ihr o ziu ip osiu YVK lek pa tik 100 15 118

Жовч АЙ прі жд дЕУ Мая ТВвХ Уві 155 «від 98 свя лад «ії 19 «яїйз БО К хх ох я ден т-і3з Нота заріенле «ап» 23Bile AY pri zhd dEU Maya TVvH Uvi 155 "from 98 svya lad "ii 19 "yaiiiz BO K xx oh i den t-i3z Nota zarienle "ap" 23

Зіп ошех Ува Бей ТЕ бів БЕо хо Бек Міа Бех жі ЖлЕ Жою обу жд й ж Й щи і і 10 15 бух іх сн хе Ше кит - ЕЛ я бно раді де Тукях Не Унче еч мо душ вкз Уві Ти Ті беє су Шах шіу Щеж дяп Ббтехю Вжи Та їі Бек ВЕД 2 ж та гук їх В бути Ук тт Кот Сея их об Мо мо п Хл»ен тт ХоджіZip osheh Uva Bey TE biv BEo ho Bek Mia Beh zhi Zhle I live both zhd zh and zh y shchi i and 10 15 buh ih sn he She kit - EL I bno radi de Tukyah Ne Unche ech mo dush vkz Uvi Ti Ti bee su Shah shiu Shezh dyap Bbtehyu Vzhy Ta ii Bek VED 2 zh ta huk ih In be Uk tt Kot Seya ih ob Mo mo p Hl»en tt Hodzhi

Тмх Узі йхп о тх ТУх бій Ап ої Бко пі ЩТВХ Аіа хо Був бем БехTmh Uzi yhp o th TUh bij Ap oi Bko pi SHTVH Aia ho Buv bem Beh

Бе ЕКЗ жYes, IVF

З я У В « «сх в чн НН ЧИ Мдл жа щаех ках у а їі тТУх Бо Ав) о тужх АБв» о БКО Бо Бек ЗМУ Уві Бхо бар ка Бпе шехЗ я У В " "сх в чн НН ЧИ Mdl zha shchaeh kah u a ii tTUh Bo Av) o tuzhkh ABv" o BKO Bo Bek ZMU Uvi Bho bar ka Bpe sheh

50 58 що сСіу Беж Був Шбевке зЗіу ТБЕ бег Кіз беж Бей дів хі Бек сбіу Бей ха ж чия - 5 чу їй» ТЯ 5 о г ож Хх х зп Ве тую Ти зр ха що Волі Ю А Ко ке 5. ск чек муз Ав бів Аїв Ар ТУЮ ТУух буз Аква бів Тхр о АБроАжо Бех ех гЯ з з в зо З х СВК Хо ТЕ кіля т кт ть зв т ж щі дкіх50 58 that sSiu Bezh Buv Shbevke zZiu TBE beg Kiz bej Bey div hi Bek sbiu Bey ha zh chia - 5 chu her" TYA 5 o g zh Хх х zp Ve tuyu Ti zr ha cht Voli Yu A Ko ke 5. sk chek muz Av biv Aiv Ar TUYU TUuh buz Akva biv Thr o ABroAjo Beh eh gYa z z w zo Z x SVK Ho TE kylia t kt t zv t zh shchi dkih

Авпобіч дей Маії РБе бі бі біу ТВ Був Гея Так оУзлью їв зл Зп 1 0 ЗМУ 15 «вій каЕїї» КІЗ «ній» ІЛИК «кі» Яма звріспаAvpobich dey Maii RBe bbi biu TV Buv Geya So oUzlyu yiv zl Zp 1 0 ZMU 15 "vii kaEii" KIZ "nii" ILYK "ki" Yama zvrispa

Ка ря ЗУ «чай» За си г Сан Жах Ж Ккуче М Со дя й Хосе оч НИКА булу їі шт ьх за чаї тіл оїжно Бен ба хе ЗАМ Бу зу Ме УВА ЗМ бко Ку ау ; з і З і її чаш р г птахи - х дом сота БА лайно дак жKarya ZU "tea" Za sig g San Zah Z Kkuche M So dya i Jose och NIKA bulu ii shtkh for chai tel oijno Ben ba he ZAM Bu zu Me UVA ZM bko Ku au ; with and with and her cups r r birds - x dom sota BA shit dak same

Зех їзи вто Гб бак Суб діа діа бек о піу ВНе ТвЕт Бде дет бех тук жи 28 зе бле Ме вів ТЕвОоЗаз Акз бів Алв о вВЕз ОКУ Був Щ1У їж зчій жо УвіZeh ate Tue Gb bak Sat dia dia bek o piu VNe TvEt Bde det beh tuk zhi 28 ze ble Me viv TEvOoZaz Akz biv Alv o vVEz OKU Buv Sh1U eat zchii zho Uvi

Кк ї ХВKk and hv

Як а З гу я А тк стяг Зак «рр ях Зид Соя с тах - вд пе З су пх пек Аза тів щіу ЗУ Асщ б1у Уві йеж ТВ Туїх ТУуш лій АлрвоЗак УЗАYak a Z gu ya A tk flag Zak «rr yah Zyd Soya s tah - vd pe Z su ph pek Aza tiv shchiu ZU Assch b1u Uvi yezh TV Tuikh TUush liy AlrvoZak UZA

Я кв оI kv o

Буш зі Дка Бе тах ї3е Шек йку Аяр дай Бех їв Аль о Тахо б о ТКЕ та т5 тоBush from Dka Be tah i3e Shek yku Ayar dai Beh ate Al o Taho b o TKE ta t5 to

З Ж їх че Е їх ут ее в ОНЕУ НИ тва ектZ Z ih che E ih ut ee in ONEU NI tva ect

Ме 530 мех бе ошеї їм дл лів бід Ав Тк дів чУІі ТУк Туд шуй вів Акп бі Бех Вп о Тко Тох Ні Б5іа їжи йіУу КБ Алюв о Кхо ЖЕролію 1050 ние МІ аж сх КА ННЯ зи опа х х тло дів ЖЕ їжи Зак о твЕ УхMe 530 meh be oshei im dl liv bid Av Tk div chUIi Tuk Tud shuy viv Akp bi Beh Vp o Tko Toh Ni B5ia eat yiUu KB Aluv o Kho ZHERoliyu 1050 nie MI azh shh KA NNYA zi opa h x tlo div SAME eat Zak o tvE Uh

УКUK

«г . «ій» ЛІ с 1 «каз 1 «кіз» Ново взарівра Й"Mr. "iy" LI s 1 "kaz 1 "kiz" Novo vzarivra J

З - Я «ФО 31 діа дах удо Бей ТБ біл о Бжо ко бах лів бек о бфУу ТВ оБко Зі бів 4 х ща 15Z - I «FO 31 dia dah udo Bay TV bil o Bjo ko bach liv bek o bfUu TV oBko Zi biv 4 x shcha 15

Акад уаї Тпг о Т1е бек Сув бек Сіу бек Бех бек Авп І1е біу бек АзпAcad wai Tpg o T1e bek Suv bek Siu bek Beh bek Avp I1e biu bek Azp

ТБг Уаії Авп Тгр Туг Сбіп Сбіп Тїей Рго б1іу ТпПг Аза Рко Пув Пей ГейTBg Uaii Avp Tgr Tug Sbip Sbip Thiey Rgo b1iu TpPg Aza Rko Puv Pei Gay

І1е6 Тук біу Авп бБег Азп о Акуд Рго бек С1іу Уа! Рко Авр Агу Ре 5ег 5 60 с1у бек Гув бек сіу ТПг бек Аї1а бек Те Азїа І1е бек б1у Гей Агд 65 70 75 80 бек 611 Авр Сіш Аза Ар Туг Тук Суб Аза б1іу Тгр Ар б1у Агд Гец 85 90 95I1e6 Tuk biu Avp bBeg Azp o Akud Rgo bek S1iu Ua! Rko Avr Agu Re 5eg 5 60 s1u bek Guv bek siu TPg bek Ai1a bek Te Asia I1e bek b1u Gay Agd 65 70 75 80 bek 611 Avr Sish Aza Ar Tug Tuk Sub Aza b1iu Tgr Ar b1u Agd Gets 85 90 95

ІТ1е б1у Тгр Уа! Рбе с1іу с1іу б1у ТВЕ Пуб Пецп Тк Уаї Гей 100 105 110 «2105 32 «211» 116 «212» БІЛОК «213» Ното зарієпь «4005 32 біц Уаї сіп Пец Гец біц бек с1іу б1у б1у Гец Уа! біп Ркго б1іу с1у 1 5 10 15 бег Гей Ахд Бей бек Сув Аза А1їа бег б1іу Рпе ТПпх Рре Авр Авзр Туг 20 25 ЗоIT1e b1u Tgr Ua! Rbe s1iu s1iu b1u TVE Pub Petsp Tk Uai Gay 100 105 110 "2105 32 "211" 116 "212" BILOK "213" Noto zariep "4005 32 bit Uai sip Pets Gets bit bek s1iu b1u b1u Gets Ua! beep Rkgo b1iu s1u 1 5 10 15 beg Hey Ahd Bey bek Suv Aza A1ia beg b1iu Rpe TPph Rre Avr Avzr Tug 20 25 Zo

Сіу Мес бБег Тгр Маї Аку б1іп Аза Рго СсС1у Тув С1у Пец бі Ткгр Уа! 35 40 45 бек цей І1е бек Тгр Авр Сіу біу Бек ТПг Туг Туг А1а Авр бек Уаї 50 55 6о пув б1і1у Аху Рбе ТВг Т1е беї Акд АБр Ап обет був АвпотТВх Пес Тук 65 70 75 80Siu Mes bBeg Tgr Mai Aku b1ip Aza Rgo SsS1u Tuv S1u Pec bi Tkgr Ua! 35 40 45 bek this I1e bek Tgr Avr Siu biu Bek TPg Tug Tug A1a Avr bek Uai 50 55 6o puv b1i1u Ahu Rbe TVg T1e bei Akd ABr Ap obet was AvpotTVh Pes Tuk 65 70 75 80

Гей біп Мес Азп бек Гей Аку Аза бі Азр ТБ Аза Маі1і Тут Тук Суз 85 90 95Gay beep Mes Azp bek Gay Aku Aza bi Azr TB Aza Mai1i Tut Tuk Suz 85 90 95

Аїа тре бі тіе Аза Маї Аїа-біу Ріє Азр Ту Тер біу біп біу Тр 100 Й 105 МИ 110 рей Уаї Тік УаїAia tre bi tie Aza Mai Aia-biu Riye Azr Tu Ter biu biu biu Tr 100 Y 105 MY 110 rey Uai Tik Uai

«2105 33 «2115 110 . «212» БІЛОК «213» Ното зарієпв «4005 33 біп бек Уа1! Тец ТПг С1іп Рго Рго бег Аза бек Сіу Тіт Рхо с1у Сіп 1 5 10 І 15"2105 33 "2115 110 . "212" BILOK "213" Noto zariepv "4005 33 beep back Ua1! Tets TPg S1ip Rgo Rgo beg Aza bek Siu Tit Rho s1u Sip 1 5 10 I 15

Аху Уаї Тпг І1е бет Суз бек біу бек беї бег Авп о ї1іе біу бБехд АвпAhu Uai Tpg I1e bet Suz bek biu bei bei beg Avp o i1ie biu bBehd Avp

А1іа Уаї Авп Тгр Туг біп біп Гей Рхо б1іу ТБбк Аза Рго Пуз Геч ГеєцйA1ia Uai Avp Tgr Tug beep beep Gay Rho b1iu TBbk Aza Rgo Puz Gech Gayetsy

І1е Тухс Авр бек Авзп Гуз Акд Рто бехт біу Маії Ркго Азр Агу Ріе 5бег 60 с1у бек Пув бек б1у Тапг бек Аїа бег Ге Аіїа Іїе бег сСіу їєцй Аг9д 65 70 75 80 бек бій Азр бій АТїа Азр Тух Тухк Сув Аза Аза Тер Азр Азп бБег Геч 85 30 35I1e Tukhs Avr bek Avzp Guz Akd Rto bekht biu Maiii Rkgo Azr Agu Rie 5beg 60 s1u bek Puv bek b1u Tapg bek Aia beg Ge Aiia Iie beg sSiu yetsy Ag9d 65 70 75 80 bek bij Azr bij ATia Azr Tukh Tukhk Suv Aza Aza Ter Azr Azp bBeg Getch 85 30 35

Авп обіу Тер Уаі Рпе б1іу сіу біу Тк Пу5 Пец ТБті Уаї гей 100 105 110 «2105 34 «2115 114 «2125 БІЛОК «213» Ното зарієпв «4005 34 ! бій Уаї біп Пец Пей біо бек біу б1у біу Пец Уаі! біп Рго б1у б1Уу 1 5 10 15 бЗек Пец Агу Пец бек Сув АТїа Аза Бех С1і1у Рпе ТБг Рпе бет бек Тук 20 25 30Avp obiu Ter Uai Rpe b1iu siu biu Tk Pu5 Pec TBti Uai gay 100 105 110 "2105 34 "2115 114 "2125 PROTEIN "213" Noto zariepv "4005 34 ! fight Uai beep Pec Pei bio back biu b1u biu Pec Uai! beep Rgo b1u b1Uu 1 5 10 15 bZek Pec Agu Pec bek Suv ATia Aza Beh S1i1u Rpe TBg Rpe bet back Tuk 20 25 30

Сіу Месє Ніб5 тТкр Уаі Акд сіп Аїа Рго сіу пуз Сіу Гей сій Тгр Маї 35 40 45Siu Mesye Nib5 tTkr Uai Akd sip Aia Rgo siu puz Siu Hey siy Tgr Mai 35 40 45

Бек Тез І1е Бек Тер Авр Сіу Тук Агуд Тс Нівз Туг Аз1а Авр бБег Уа1 50 5 60Bek Tez I1e Bek Ter Avr Siu Tuk Agud Ts Nivz Tug Az1a Avr bBeg Ua1 50 5 60

Пув біу Агу Рпе ТПг о І1е бек Агу Азр о Азп бек лЛув Авоп ТБтї Гей Туг 65 70 75 воPuv biu Agu Rpe TPg o I1e bek Agu Azr o Azp bek lLuv Avop TBti Hey Tug 65 70 75 vo

Ів біп Мес Авп обек Пец Аг Аза 5134 Ар ТтТрг Аза Меє Тук Тук Сув 85 30 95Iv bip Mes Avp obek Petz Ag Aza 5134 Ar TtTrg Aza Mee Tuk Tuk Suv 85 30 95

ТпкЕ Тіт б1іу АТа бег Тук Нів Аза Пеп Тгтр С1у Сіп Сіу Тк Гец Уа1і 100 105 110TpkE Tit b1iu ATa beg Tuk Niv Aza Pep Tgtr S1u Sip Siu Tk Gets Ua1i 100 105 110

Тпк Уа1! «2105 35 «2115» 110 «2125 БІЛОК «2135» Нопо зарієпв «4005 35 с1іп Зек Уаї Пеп Тпкобіп Рко Рко бек Аза Бех б1у ТБг Рго С1у сіп 1 5 10 15Tpk Ua1! "2105 35 "2115" 110 "2125 PROTEIN "2135" Nopo zaryepv "4005 35 s1ip Zek Uai Pep Tpkobip Rko Rko bek Aza Beh b1u TBg Rgo S1u sip 1 5 10 15

Агу Уаіїі ТБї І1Те бек Сув бБех Сбіу бБег Агу бек АБп оІ1е бі1іу Авп АваAgu Uaiii TBi I1Te bek Suv bBeh Sbiu bBeg Agu bek ABp oI1e bi1iu Avp Ava

Тук Маі Бек Тгр Тук Сіп біп Гей Рго біу Тпк Аза Ркго Пу5 Гей Тецй 40. 45Tuk Mai Bek Tgr Tuk Sip bip Gay Rgo biu Tpk Aza Rkgo Pu5 Gay Tetsy 40. 45

ІІе Тук Авр Авзр І1е Гув Агу Рго бет біу Ма)! Рго Азр Агд Рбе бек 6оIIe Tuk Avr Avzr I1e Guv Agu Rgo bet biu Ma)! Rgo Azr Agd Rbe bek 6o

Сіу бек Гув Бек с1у ТіК бек Аїа бег Гей Аїа І1е бек сіу Гей Агд 65 70 75 воSiu bek Guv Bek s1u TiK bek Aia beg Gay Aia I1e bek Siu Gay Agd 65 70 75 vo

Зетх бій Авр Сі АТа Авр Тук Тук Суз А1а Тік Тктр Аб5р Авр бак Ге 85 30 95Zeth bij Avr Si ATa Avr Tuk Tuk Suz A1a Tik Tktr Ab5r Avr bak Ge 85 30 95

Авп оСіу Рго Маі1і Рбе Сіу біу біу ТПх Пув Пец ТПпг Уаї Те 100 105 110 «2105 36 «211» 112 Ії «212» БІЛОК «213» Ното варіепв «400» 36 біш УМаї б1іп Пец Ббеш б1п бек сіу біу б1у еп Уа! сіл Рго Ссіу біу 1 5 10 15 -дек пе Агд Пец. бетх Сує Аза діа Зег Сіу Ре Трх Ре бек Ар Тук 20 Й 25 Й ШО 30 б1і1у Меє Нів Тгр Уа1! Аку біп Аза Рко біу був сі1у без біз Ткр Уаї 35 40 45 з хе ж пед зх ч 223 Сн тла ною в ср ба ли ти тиAvp oSiu Rgo Mai1i Rbe Siu biu biu TPh Puv Pecs TPpg Uai Te 100 105 110 "2105 36 "211" 112 Ii "212" BILOK "213" Noto variepv "400" 36 bish UMai b1ip Pecs Bbesh b1p bek siu biu b1u ep Ua ! sat Rgo Ssiu biu 1 5 10 15 -dec fri Agd Pec. beth Suye Aza dia Zeg Siu Re Trh Re bek Ar Tuk 20 Y 25 Y SHO 30 b1i1u Mee Niv Tgr Ua1! Aku bip Aza Rko biu was si1u bez biz Tkr Uai 35 40 45 z he zh ped zhh h 223 Sn tla noy v sr ba ly ti ti

Аха би фіз бек Бе АвБорозіж зех Буд Тпо Ач бе ЗУ Зі БЕшб чад ща. - деAha would fiz bek Be AvBorozizh zeh Bud Tpo Ach be ZU Zi BEshb chad shcha. - where

Бе Бк во зі Бі Ак Ба ТВе їі Бех Ак дар дЕВ беж бій Ап тих Бей Тух мк - ад 85 то ЗЕ 85 - а ін Хо пт Лету - жду льш п, шу -к о Моя А аск я сни чн їжа 01 Мек Аа Зех Пес дже Аз пі Азов о ТвВх Вів Уві Тух Тук Су а що за «ее в як УТ с - ех Тож ЛЬ. пн кт ек ання чі 5 ток пт-ї Чек ує вищеBe Bk vo zi Bi Ak Ba TVe iii Beh Ak dar DEV bej biy Ap tih Bey Tukh mk - ad 85 to ZE 85 - a in Ho pt Letu - I am waiting lsh p, shu -k o My A ask i sny chn food 01 Mek Aa Zeh Pes je Az pi Azov o TvVh Viv Uvi Tukh Tuk Su a what for "ee in how UT s - eh Toh L. Mon Tue Waiting for 5 to 5 Fri Waiting for above

Хто АКО Му Бу Бе Зеров Хкв о біж баб Ку Трх без МА ТВ Уві гот ще їхWho AKO Mu Bu Be Zerov Hkv o bizh bab Ku Trh without MA TV Uvi got still them

КЕ НІЖ 112 «віп З «21312 108 сту шт пуд «183 БЕЛОК ня 00 фречепиу сту кох «Ех попе вЕраАФчиЕ «ЗМІ» 37KE NIZH 112 "vip Z "21312 108 st st pud "183 protein 00 frechepi st koh "Eh pope eraAFchiE "ZMI" 37

ТЕ з: ШЬАН 4 о бке мли ми Во бот ВЗ до км сті лу Че тм ПР ча КД я ії бе чаї їв Таж бір Бко Вко Бах діа шає Біу Тйх Бхб о Біз 5) х їк зе 1 5 о о поря к-т у В -о тя от ах тях Фет Ки уручну СТ А У дю ЕЕ, - лох дкс Уві Тахо ї1ів дах Сує Євж Пі бек обех Яех Аза їі піу Хок вай р 25 КаTE z: SHAN 4 o bke mly we Wo bot VZ to km st lu Che tm PR cha KD i iiy be chai yiv Tazh bir Bko Vko Bah dia shaye Biu Tykh Bhb o Biz 5) h ik ze 1 5 o o porya k- t u V -o tya ot ah tyh Fet Ky uruchnu ST A U du EE, - loh dks Uvi Taho i1iv dah Suye Yevzh Pi bek obeh Yaeh Aza iii piu Hok vai r 25 Ka

Таж хи бидло плярн г не Я од шче 3 сх іч 53 що жк ток То Ж кох їУК Узі тТУЄ тТкш о тую бів бій їн Рже Зі ЇВ Вів Бе Пух Бевоїно за ї гм 30. СеThat's why I'm the only one who is 3 years old.

Ізе Тух йво да взиа ГУ Ак Бхо пес щі» Уві Еко вв оакЯ Ба пе 5а 5 я ач док тло З хх ті пох «кт Т. з т Тов аг іл Ж оте Зк ваш мк МуБ мех піУ пу ех вів беж Бен Аза діє БЕК ів см висIze Tukh yvo da vzia GU Ak Bho pes shchi" Uvi Eko vv oakYA Ba pe 5a 5 i ach dok tlo Z khh ti poh "kt T. z t Tov ag il Zhote Zk vash mk MuB meh piU pu eh viv bej Ben Aza valid BEK iv cm height

БУ 16 мес ЕНBU 16 months EN

Шу Да ну; Жах. ла бе. муху Кави бід т. род, бус бога і г дід ток ак осів Зв ІЗ Аїз Ар о Тук ТУК Єжа лів Аза Ткф о БжЖО яр Бах цей шк - ах за з5Shu Yes, well; Horror. la be muhu Kavy bid t. rod, bus of God and g did tok ak osiv Zv IZ Aiz Ar o Tuk TUK Yezha liv Aza Tkf o BzhZHO yar Bach this shk - ah for z5

Був Вт Уві Ева сів біу Сб ТБжЖ Бема пеб Тк УВУ бвш поь. ке, 152 і ее й «их 38 «її 115 «війх БІЛОКWas Tue Uvi Eva sat biu Sat TBzhZ Bema peb Tk UVU ex po. ke, 152 and ee and "their 38 "her 115 "viykh BILOK

ЛУ флечити жу ті вату «2534» Ноще вто ск» жа ех Синя а у хх я Б ж ори тод (Я бо Же 4 Кай аLU flechit zhu ti watu "2534" Nosche tu to sk" zha eh Sinya a u xx i B zh ory tod (I bo Zhe 4 Kai a

Ма таї 5 їєцч Бе) біз Бек піт Бу БІ Без чаї БМ; Бк бі пу и 2 тт 1 5 15 АБ ин оц о а А і п А А и В и НН и и веж Ме ДКЗ Гви Шеж Суз діз Вів бек Сьу Бе ТЇТБхІ ТКБе Бех бех ух в ге: скMa tai 5 yeetsch Be) biz Bek sweat Bu BI Without tea BM; Bk bi pu i 2 tt 1 5 15 AB in ots o a A i p A A i V i NN i i vezh Me DKZ Gvy Shezh Suz diz Viv bek Syu Be TЙTBhI TKBe Beh beh uh v ge: sk

М 25 ЗоM 25 Zo

Сіу Меє бек Ттр Маі Акд Сіп Ала Рко С1у Буз біу Тецй біцй Тгр Уа! 35 40 45Siu Mee bek Ttr Mai Akd Sip Ala Rko S1u Buz biu Tetsy bitsy Tgr Ua! 35 40 45

А1їа Ріре І1ї1е Бек Тут Авр б1іу Авзп Пув б1іц бек Туг Аза Авр бек Уаї 50 з 60A1ia Rire I1i1e Bek Tut Avr b1iu Avzp Puv b1its bek Tug Aza Avr bek Uai 50 of 60

Тув б1у Аку Рбе Тік Іїе бек Акд Ар АвБп обБег Пув А5п оТВг Ге Тук 65 7о 75 воTuv b1u Aku Rbe Tik Iie bek Akd Ar AvBp obBeg Puv A5p oTVg Ge Tuk 65 7o 75 vo

Те біп Мес Азп обех Гео Аку Аза б1ц Авзр ТПпт Аза Уаї Туг Тук Сув 85 90 35Te bip Mes Azp obeh Geo Aku Aza b1ts Avzr TPpt Aza Uai Tug Tuk Suv 85 90 35

А1а пув сСіу сб1у Тук б1у Пец Рпе Авзр Тук Тгр б1у біп сС1у ТПг Гец 100 105 110A1a puv csiu sb1u Tuk b1u Pec Rpe Avzr Tuk Tgr b1u bip cS1u TPg Gets 100 105 110

Уаї тк Уа1 115 «2105 39 «2112 110 «212» БІЛОК І «213» Ното варіепз «4005 39 біп бек Уаї Ге Так о сСіп Рго Ркго бек А1їа бег біу ТпПг Рко с1у сіп 1 5 10 15Uai tk Ua1 115 "2105 39 "2112 110 "212" BILOK I "213" Noto variepz "4005 39 bip bek Uai Ge Tak o sSip Rgo Rkgo bek A1ia beg biu TpPg Rko s1u sip 1 5 10 15

Аг Маії ТіПг Т1е бег Сув Бек б1у Авп бек бек Авп Ії1е Сіу Бек АвпAg Maii TiPg T1e beg Suv Bek b1u Avp bek bek Avp Ii1e Siu Bek Avp

Тук Уа! Тук Тер Тук біп біп Гей Рко біу ТлЛЕ Аїа Рго Гуз Гей ГецWow! Tuk Ter Tuk beep beep Hey Rko biu TlLE Aia Rgo Guz Hey Gets

І1е Туг Авзр АБп о АБп олув Акад Рко бек сіу Ма1 Рго Авр Агу Рпе бег 60 біу бБег Пув бек б1у ТПтІ бехт Аза бег їєцд А1а т116є бек сбіу їєц Ак9д 65 70 75 80 зек бій Авр біц Аї1а Авр Тук Туг Суз Аї1а Аїа Тгр Азр Авзо бег Ге 85 з0 95 веї с0Ііу Ах уаї Рпе сту бІу Аку тп лу5 беп тп уаї бе З 100 105 110 «210» 40 «211» 118 «2125 БІЛОК мк Шуїикух мя ше че» жиди даеркетя «3055 4I1e Tug Avzr ABp o ABp oluv Akad Rko bek siu Ma1 Rgo Avr Agu Rpe beg 60 biu bBeg Puv bek b1u TPtI becht Aza beg yetsd A1a t116e bek sbiu yets Ak9d 65 70 75 80 zek bij Avr bis Ai1a Avr Tuk Tug Suz Ai1a Aia Tgr Azr Avzo beg Ge 85 z0 95 vei s0Iiu Ah uai Rpe stu bIu Aku tp lu5 bep tp uai be Z 100 105 110 "210" 40 "211" 118 "2125 BILOK mk Shuiikuh mya she che" Jews daerketya "3055 4

Як їх. ел ЖТощеня о Тож г ог я ду т х т шк п - пл ам і Ап обетй та Бій бек бі Бі 53 ес Уві біб го біу 51 ї з 16 їхLike them el ZhToschenya o Tozh g og ya du t h t shk p - pl am i Ap obety ta Bii bek bi Biu 53 es Uvi bib go biu 51 th of 16 them

Бех пе) дка4 із бек Су Аа Аза ех бі Ба ТК бе слу Бех ТЕ ди - -ї жо 25 0 лок сх Ко-ш М їхав оииє М Би хро дк с че ес дл ді хо ттBeh pe) dka4 iz bek Su Aa Aza eh bi Ba TK be slu Beh TE di - -i zho 25 0 lok sh Ko-sh M jedel oiiie M By hro dk s che es dl di ho tt

Сі Мі пів Тк Узі Ак О3в Аід хо Зі Був Пі би зав Тхвохаї я а Сея ет) УSi Mi piv Tk Uzi Ak O3v Aid ho Zi Buv Pi would zav Tvokhai i a Seya et) U

Яков Є т сем СТ т па т Френе кг плзкм М хг я дек цен Лів Бех ТЇхр Ар» сАУ бім ех Тдк тує Тук віза ако бек Уві по Е КунYakov Ye t sem ST t pa t Frene kg plzkm M hg i dec cen Liv Beh TХhr Ar» sAU bim eh Tdk tuye Tuk visa ako bek Uvi po E Kun

Ку 55 БО п хе чен ЖІНої пут зло Ме їн хо к сце и дет ЛУ ї єкра ба ужеKu 55 BO p he chen ZHINOI put zlo Mein ho k sce i det LU i ekra ba already

Був Віу Ах ЕвВе так Тіз беїх йка Ан Аза обевх Був Да ТБ іє тТУх 5 7 та но сич ки С З хо ун ЧИ еще КУ чо х ог с я Зо ловко рт їн: бій Меї бла хек Бей кдд дід 530 Аше ТЕЖ ліз таА бук ТУх Схв «ї «и сот, 85 За За т ско и Ж Са дія дід ВЕ плйю бля о токазо ху хг Чет 1 лей азьв ех шШек хів цех дів Афа Мія твЕ о біуУу Без дев тТУЄ ТІр щБіУу бУупBuv Viu Ah EvVe tak Tiz beih yka An Aza obevh Buv Da TB ie tTUh 5 7 ta no sich ky S Z houn CHI yet KU cho h ogs ia Zo lovko rt yin: biy Mei bla hek Bey kdd did 530 Ashe TOO liz taA buk TUh Shv «i «y sot, 85 Za Za t sko i Zh Sa dey dyd VE plyu blya o tokazo hu hg Chet 1 lei azv eh shShek hiv shop girls Afa Mia tvE o biuUu Bez dev tTUYE TIR shBiUu bUup

Кц 2 зKts 2 z

Ме іп5 М15 со на не НК а У бі Тнх Кей Уві Бах МакMe ip5 M15 so na ne NK a U bi Tnh Kay Uvi Bach Mak

МЕME

«жк 41 «іх 530 «ші БІЛЕ41 flats, 530 of which are WHITE

Ши ть Я Крило здо, Ії «гі3з Ново варісзпЕ «асо Її й с чо Ж ок сю в учи М За пуху су СІ селу 1 піз шшежх Уві їшиа ТВ обі ТткКОо Рро Зах Аба Заг обім тТВх БКко Бі сід ц х я 1 5 « 18 ї5Shi t Ya Krylo zdo, Ii "gi3z Novo variszpE "aso Her and s cho Z ok syu u uchi M Za puhu su SI selu 1 piz shshezhh Uvi yshia TV obi TtkKOo Rro Zah Aba Zag obim tTVh BKko Bi sid c h ya 1 5 "18th 5th

Жено вд ЖК тк мури кла Мухи п ан ни КК НИ сої ух дк т дк чав ТВвЕ Зі шеК ду Бак осіхж дек ТБ век бар о їЗзе бі3х йекЕ АвБаWife vd ZhK tk mury kla Muhy pan ny KK NI soi uh dk t dk chav TVve Z sheK du Bak osihzh dec TB vek bar o yiZze bi3h yekE AvBa

КІ 85 жо «Том Ж тину ва хх дк т о Жанну и що лани точи То том їйк Уві Ав оТкроТух бік сін іно Бгто ЗіУ Тк о Хаї РіО БУ бо наKI 85 zho "Tom Zh tynu va xx dk t o Zhannu and what lany tochi To tom ojk Uvi Av oTkroTuh bik syn ino Bgto ZiU Tk o Hai RiO BU bo na

Есо бів Жук піш Аяп о був Був Ак Ккхо бек о біу Уві го АБю БЕ ВБа ех ; Я К З Я ко що мEso beat Zhuk pish Ayap o was Buv Ak Kkho bek o biu Uvi go AByu BE WBa eh ; I K Z I who what m

КО Б ву же сх, шк сх Фюши т Кф ЖЕ я. Уж ся ше У. ке ха ті ли дує ЖК Тож ня піУу Беж Вуз йеж бі ТвЕж аж Аза Зах Бей дхз їі Зех Б1У лем хо х -к нт «5 То 15 ВО ке 1, Хот бі ах Да буси СЕ оо бнуж тих В Що бек ди шк шт « дех Зі Ази щі ліз Вер їх ТужЖ суї Зіз лів УКкв йяб Аве оЗех БевзKO B vu zhe sh, shk sh Fushy t Kf ZHE i. Uzh sya she U. ke ha ti ly due ZK Toj nya piUu Bezh Vuz yezh bi Tvezh azh Aza Zah Bey dhz yi Zeh B1U lem ho h -k nt «5 To 15 VO ke 1, Hot bi ah Da busy SE oo bnuzh tich В Что бек ды шк шт « дех З Aзы шли з Вер их ТужЖ sui Ziz liv UKkw yab Ave озех бевз

85 90 35 бек бі1у Тгр Уаі Рпе сіу б1у біу ТПг о Пувз Гем ТПтх Уаї Гей 100 105 110 «2105 42 «211» 119 «212» БІЛОК «213» Ното варієпв «4005 42 бій Уаї біп Гей Гєцп біц бек біу сіу біу еп Уаї біп Рго с1у бЩ1у 1 5 10 1585 90 35 bek bi1u Tgr Uai Rpe siu b1u biu TPg o Puvs Gem TPth Uai Gay 100 105 110 "2105 42 "211" 119 "212" BILOK "213" Noto variepv "4005 42 bij Uai bip Gay Getsp bis bek biu siu biu ep Uai bip Rgo s1u bSh1u 1 5 10 15

Рпе тей Акуд Гей бек Суз Аїа Аза бег б1іу Рпе ТП Рпе бех Бек Туг бек Мес Авзп Тгр Уа1! Акуд Сіп Аїа Рго б1іу був бі1у Бей бі Ткр УаїRpe tey Akud Hey bek Suz Aia Aza beg b1iu Rpe TP Rpe beh Bek Tug bek Mes Avzp Tgr Ua1! Akud Sip Aia Rgo b1iu was bi1u Bei bi Tkr Uai

А1а Рпе І1е Аку Тут Авр сС1іу бек Азп о Гуз Тут Ту Азїа Авр Зег Уаї з5 60 . пув б1у Акд Рпе Тис І1е бег Агу Авзр Авпобег Ппуз АзпоТВйт Пей Туг 65 70 75 80 їеп біп Ме Авзп бек Гей Аку Аїа бій Азр Тіт Аїа Уаї Туг Тук Суз 85 90 35A1a Rpe I1e Aku Tut Avr sS1iu bek Azp o Guz Tut Tu Asia Avr Zeg Uai z5 60 . puv b1u Akd Rpe Tys I1e beg Agu Avzr Avpobeg Ppuz AzpoTVyt Pay Tug 65 70 75 80 iep bip Me Avzp bek Gay Aku Aia bij Azr Tit Aia Uai Tug Tuk Suz 85 90 35

А1а тпг Агу Акуд Аза І1е Аза Уа! Аза біу А1ї1а Рпе Авзр І16є Тгр Сс1Уу 100 105 110 біп с1у ТпкК Гей Уа1! ТПг Уаї 115 «2105 а43 «2115 111 «2122 БІЛОК «2135 Ното зарієпв «4005» 43 б1іп бек Уаї їецй ТП о біп Рко Рго бек А1їа бек б1у ТПг Рко біу біп 1 5 10 15A1a tpg Agu Akud Aza I1e Aza Ua! Aza biu A1i1a Rpe Avzr I16e Tgr Ss1Uu 100 105 110 bip s1u TpkK Hey Ua1! TPg Uai 115 "2105 a43 "2115 111 "2122 BILOK "2135 Noto zariepv "4005" 43 b1ip bek Uai ietsy TP o bip Rko Rgo bek A1ia bek b1u TPg Rko biu biu bip 1 5 10 15

Ахкд Ма1 Трх ІтТїе бек Сув бБет біу бек Аза бек АБп І1е С1у І18 дв5п 20 25 30 бі1у Ма1 АБп Тгтр Тук біп біп Ге Рго с1іу Тпг Аза Рго Пув Гей Бей 35 40 45Ahkd Ma1 Trh ItTie bek Suv bBet biu bek Aza bek ABp I1e S1u I18 dv5p 20 25 30 bi1u Ma1 ABp Tgtr Tuk bip bip Ge Rgo s1iu Tpg Aza Rgo Puv Gay Bey 35 40 45

І1е Туг Авр Авп Авп Гу Аку Ркго бек п1у Ма! Руто АБр Акуд Рпе 5ег 50 З5 60 с1у бек Ппув бек б1іу ТПг бБег Аїа бек Гей АТа І1е бек сС1іу Іей Агд 65 70 75 80 бек бі Азр бі Азїа Авзр Тук Тук Суз Аїа Аіїа Тгр Азр Азр бек Тец 85 90 95 бек біу біп Уаї Ма1і Рпе б1у сб1іу б1іу Тбг Гуз бе ТПг оУаї Гец 100 105 110 «2105 44 «2115 118 «212» БІЛОК «213» Нопо варієпв «400» 44I1e Tug Avr Avp Avp Gu Aku Rkgo bek p1u Ma! Ruto ABr Akud Rpe 5eg 50 Z5 60 s1u bek Ppuv bek b1iu TPg bBeg Aia bek Gay ATa I1e bek sS1iu Iey Agd 65 70 75 80 bek bi Azr bi Asia Avzr Tuk Tuk Suz Aia Aiia Tgr Azr Azr bek Tets 85 90 95 bek biu bip Uai Ma1i Rpe b1u sb1iu b1iu Tbg Guz be TPg oUai Gets 100 105 110 "2105 44 "2115 118 "212" PROTEIN "213" Nopo variepv "400" 44

Січ Маї Сіп Ге Тїец бій бек біу біу б1у Пеп Уа1! Сп Рго с1іу ШУ 1 5 10 15Sich Mai Sip Ge Tiets bii bek biu biu b1u Pep Ua1! Sp Rgo s1iu SHU 1 5 10 15

Бех Гец Агуд Гез бБетхт Суз Азїа Аїа бек сіу Рпе ТБг Рпе Авр Азр Туг 10)Beh Getz Agud Gez bBetht Suz Asia Aia bek siu Rpe TBg Rpe Avr Azr Tug 10)

Сіу Мес бет Ткгр Уаі Агу біп Уаї Рко С1у ГПув б1у Гей бі Ткр УаїSiu Mes bet Tkgr Uai Agu bip Uai Rko S1u GPuv b1u Hey bi Tkr Uai

Зек Гей тТ1е Зег Тер АБр с1у біу бет Тік Тух Тут Аза АБр бек Уа1ї 60 пув б1у Агуд Рпе ТПг І1е бек Акуд Авр Азп обБег Гуз АБп оТПх Бей Туг 65 70 75 воZek Gay tT1e Zeg Ter ABr s1u biu bet Tik Tukh Tut Aza ABr bek Ua1i 60 puv b1u Agud Rpe TPg I1e bek Akud Avr Azp obBeg Guz ABp oTPh Bey Tug 65 70 75 vo

Гей Сіп Меє Авзп бек Ів Акуд Аза біц Авр ТпгоАїа Уа! Тух Тук Сув 85 90 95Hey Sip Mee Avzp bek Iv Akud Aza bitz Avr TpgoAia Ua! Tuk Tuk Suv 85 90 95

А1а Агу Рго бек біу Аіїа Тук Рго ТБї Рко Рре АБр АБп Тетр Сіу біп 100 105 110 бС1у Тк Іеп Уаіїі Тк Уаї 115 «2105 45 «2115 110 «2125 БІЛОК «213» Ношо заріепвз «4005 45 біп Бех Маї реп Тк обіп Рко Рго бехт А1їа Бех С1у Тйхг Рго с1у б1іпA1a Agu Rgo bek biu Aiia Tuk Rgo TBi Rko Rre ABr ABp Tetr Siu bip 100 105 110 bS1u Tk Iep Uaiii Tk Uai 115 "2105 45 "2115 110 "2125 BILOK "213" Nosho zariepvz "4005 45 bip Beh Mai rep Tk obip Rko Rgo bekht A1ia Beh S1u Tykhg Rgo s1u b1ip

1 5 10 151 5 10 15

Аку Уаїі Тбг І16є Бек Сув Бек біу бег ТПг бБег Авп Т1е бі1у 5Зег АвпAku Uaiii Tbg I16e Bek Suv Bek biu beg TPg bBeg Avp T1e bi1u 5Zeg Avp

Тут Уаї Тугк Тер Тук біп біп Бей Рко сС1у ТПг А1їа Рго Пуз Гей ІгцTut Uai Tugk Ter Tuk beep beep Bey Rko sС1u TPg A1ia Rgo Puz Gay Igc

І1е Тук Авр Авп Авп Гуз Агу Рго бехт С1у Уа! Ркго Азр Агуд Рбе 5бег 60I1e Tuk Avr Avp Avp Guz Agu Rgo beht S1u Ua! Rkgo Azr Agud Rbe 5beg 60

С1іу бЗек Пув Бех б1у Тік бек Аїа бег Тед Аза І1е бег б1у Без АгдФ 65 70 75 80S1iu bZek Puv Beh b1u Tick back Aia beg Ted Aza I1e beg b1u Bez AgdF 65 70 75 80

Зех біц Авр бій АтТа Авр Тут Туг Сув Аза А1їа Тгр Авр Азр бек Гей 85 зо 95Zeh bets Avr bij AtTa Avr Tut Tug Suv Aza A1ia Tgr Avr Azr bek Gay 85 zo 95

Зетх біу Тгр Маї Рпе біу біу біу Тпхг Туз Цей Трг о Уаїії Гєц 100 105 110 «210» 46 «211» 114 «212» БІЛОК «213» Ното варієпз «4005 46 617 Уаї 013 Пемш їеп біз бек с1і1у б1у б1у Гез Уа1і сіп Рхо Сіу с1у 1 5 10 15 зек Гей Акуд Гей бек Суб А1їа А1їа бек б1у Рре Тих Рпе Тік бек С1Уу 20 25 30Zeth biu Tgr Mai Rpe biu biu biu Tphg Tuz This Trg about Uaiii Gets 100 105 110 "210" 46 "211" 114 "212" BILOK "213" Noto variepz "4005 46 617 Uai 013 Pemsh iep biz bek s1i1u b1u b1i1u Gez Ua sip Rho Siu s1u 1 5 10 15 zek Gay Akud Gay back Sub A1ia A1ia back b1u Rre Tyh Rpe Tick back S1Uu 20 25 30

Рго Мес бехг Тгр Маі Аго сіп Аза Рго с1іу Пув СсСі1у їец сі Тгр Уаї 35 40 45Rgo Mes behg Tgr Mai Ago sip Aza Rgo s1iu Puv SsSi1u iets si Tgr Uai 35 40 45

А1їа Уаї І1їе бек Тук Авр сіу бек АвзпоПувБ Тук Туїг А1Т1а Азр бек УаїA1ia Uai I1ie bek Tuk Avr siu bek AvzpoPuvB Tuk Tuig A1T1a Azr bek Uai

Зо 55 60From 55 to 60

Пув 01у Агд Рпе ТБхг І1е бек Аху Авр АБп Бех Гуз Авп Тік о Гец Туг 65 70 75 8о0Puv 01u Agd Rpe TBhg I1e bek Ahu Avr ABp Beh Guz Avp Tik o Gets Tug 65 70 75 8o0

Тец біп Меї Авп о бек Те Акуд Аза Січ Авр Тпк Атїа Уаї Туг Тук Сув 85 30 95Tets beep Mei Avp o bek Te Akud Aza Sich Avr Tpk Atia Uai Tug Tuk Suv 85 30 95

Аз1їа Акуд б1у Аїа бій І1е Рре Азр І1е Тхр бі1іу Сіп С1у ТПх Тез Уаї1ї 100 105 110Az1ia Akud b1u Aia bij I1e Rre Azr I1e Thr bi1iu Sip S1u Tph Tez Uai1i 100 105 110

ТЕ Маї ІTE Mai I

«2311» 115 кут зле «їй» БІЛОК"2311" 115 corner evil "her" BILOK

Каже « о га Я лют сх «ЖЕ» бово варіспя «а «7He says "oh ha I lyut skh "SHE" bovo varispya "a "7

Є ч й - ще Шен: Жгпу ід лу ліз тв Узяти Х1 лет зіз бек Уа іїжшча Тк пів Бко Бк Бех Аів Бех сбу ТЕЖ Іо хі уп ї 5 І 15 я граді Фран че й бшеє блт дит ті тю Р бко Уві ТВЕ Їіз Бех Сув Чек бі ех баж бах Але гї3зюв бЗіу Вау АЗа зр з з 2 25 іх й Я - - ше о селу йо В Тен Жхюво Ї куч жЖожьух, тТве Уаії дно ТЕ Тух Пів пій ізо Рто 53» Зх Аза Ро був їв ой 35 о СУ тік тв ти т що Тая Доти: я ж 1 жде об дже ек и я тів ТУх ЩБіу Ба ач Вар вк БІО Зах О1У Уві ко Ав дея Епа одех - Й вчу захYe h y - still Shen: Zhgpu id lu liz tv Uzyati X1 let ziz bek Ua iizhshcha Tk piv Bko Bk Beh Aiv Beh sbu TOO Io hi up y 5 I 15 i gradi Fran che y bsheye blt dit ti tyu R bko Uvi TVE Yiiz Beh Suv Chek bi eh bazh bah But gi3zyuv bZiu Wau AZa zr z z 2 25 ih y I - - she o selu yo V Ten Zhyuvo Y kuch zZhozhyuh, tTve Uaii dno TE Tukh Piv piy izo Rto 53» Zh Aza Ro was eating oi 35 o SU tik tv ti t that Taya Doty: I am 1 waiting for obje ek i yativ TUh ShBiu Baach Var vk BIO Zah O1U Uvi ko Av deya Epa odeh - Y chu zah

За 55 БЕ т т біс ек ик и І ча тів ши бляготви й бі бек муз ех ЗУ Тк йвс дія бек їм Дів 516 ес піу Мем дк т ІЧ ї - ча с ; т з 70 іш ЖЕFor 55 BE t t bis ek y y I cha tiv shi blyagotvy y bi bek muz eh ZU Tk yvs diya bek im Div 516 es piu Mem dk t ICH y - cha s ; t with 70 and the same

КО х ся жУЗ Млини Й Хе) вас В Фвуле же ок Трон ших їх век ші Ар щі ліз бБжо Тук Тух Су д3в беє ЖК БЮ Лавр обех Лев ок цк дк я ща 55 - з с т Ку г. Ук З и ж зу б ки Ж кві Пк 2210 іKO x sya zhUZ Mlyny Y He) vas V Fvule same ok Tron shih ikh vekshi Ar shchi liz bBjo Tuk Tukh Su d3v beye ZHK BYU Lavr obeh Lev ok ck dk i shacha 55 - z s t Ku g. Uk Z i zh zu b ki Zh kvi Pk 2210 i

Бек ожіу Уві Заї ЕБе Зла щі БЗіу Тк був Сем Тих Уаї Сей як п я 159 305 ВІЗBek ozhiu Uvi Zai EBe Zla shchi BZiu Tk was Sam Tikh Uai Sei as p i 159 305 VIZ

Учня «вій» 48 стул кшії» 351 кій БІЛОК кій Моз вагів «Зх ан я таз т т З ях За ов нь ШИ Ша На Жутиу й к УтPupil "eyes" 48 stul kshii" 351 kiy BILOK kiy Moz vagiv "Zh an y taz t t Z yah Za ov n ШY Sha Na Zhutiu y k Ut

Зі» уві З3в їм лю пБВіз век о жіУ БУ сі Бей Уві Біль Бко БА пАуZ" in Z3v im liu pBViz vek o zhiU BU si Bei Uvi Bil Bko BA pAu

Е хх 5 ї тк 1 КУ лу А я г даної : км и а ча и и и аE xx 5 th tk 1 KU lu A i g given: km i a cha i i i a

Жек о Пез Аа без джек Сув Аіз лів бек ді рпЄе ТВБХ Впе бо Бар отух я -к ча а У За їх к ше бу жо дат (33 - А іу піеечю їЗЗю Те (те б сут пі ежу Зіщ тіу Мах дШех Ткротаі дк щі Віа БЖ за Був Бау за оба ТК Ох ЗЕ з5 СЕН че, - тою ото шо ші ті в хи рю тер АЛ Ме би чх бат ів їіє бех Тур два ощ31У піт бар о ТаЄ Жук Тух Аза бар одех УдіJack o Pez Aa bez jack Suv Aiz liv bek di rpEe TVBH Vpe bo Bar otuh i -k cha a U For their k she bu zho dat (33 - A iu pieechyu yZZyu Te (te b sut pi ezhuz Zishch tiu Mah dSheh Tkrotai dk schi Via BZ za Buv Bau za both TK Oh ZE z5 SEN che, - tou oto sho shi ti in chy ryu ter AL Me would chh bat iv iiye beh Tour two osch31U pit bar o TaYE Zhuk Tukh Aza bar odeh Udi

Кк я щеI still am

Ж рову ГІ х хх я тех т х - до пам й Фев Тло Мих вд МZhrovu GI x xx i teh t x - do pam y Feb Tlo Myh vd M

Буш Зіу Аху Баз Ту За бЗех Ака дво обов Бех Був Ава ТЕ Бей Жук йо - те :ЩуBush Ziu Ahu Baz Tu Za bZeh Aka two obov Beh Was Ava TE Bey Zhuk yo - te :Schu

ГО МН Не воGO MN Not in

Тецш Сіп Меє АвБп бек Гец Акоа А1а 51й Авзр ТБПїх А1т1а Маї Тух Тук Суз 85 90 35Tetzsh Sip Mee AvBp bek Gets Akoa A1a 51st Avzr TBPikh A1t1a Mai Tukh Tuk Suz 85 90 35

ТВг Ака б1у Рбе АвБр Рго Тур біу біп б1у ТПк Пе Уа1і Тбхї Уава1 100 105 110 «210» 49 «2115 108 «212» БІЛОК «213» Ното заріепе «4005 49 б1іп бек Ма1! Гец ТП Сіп Рго Рко Бех А1їа бек 51у ТПг Рко б1у б1іп 1 5 19 15TVg Aka b1u Rbe AvBr Rgo Tur biu biu b1u TPk Pe Ua1i Tbhi Uava1 100 105 110 "210" 49 "2115 108 "212" BILOK "213" Noto zariepe "4005 49 b1ip bek Ma1! Gets TP Sip Rgo Rko Beh A1ia bek 51u TPg Rko b1u b1ip 1 5 19 15

Ак уа1 Тпх І1е бек Сув бег Сіу бек бех бек Авп І1е Сіу Бек Азп -20 25 зоAk ua1 Tph I1e bek Suv beg Siu back beh back Avp I1e Siu Bek Azp -20 25 zo

ТПг оУаі1і Авп оТкр Тук біп сСіп Тер Рко біу ТПг Аза Рго Пув Пей ПецTPg oUai1i Avp otkr Tuk bip sSip Ter Rko biu TPg Aza Rgo Puv Pay Pec

І1іе Тук Авр Авп Азп Сув Акгу Ркго бек біу Маї Рго Азр Аку Рре 5бег 60 б1іу Зек БПув бег с1іу ТПг бек Аза бек Іец Аза І1е бек б1у Пец АгдФ 65 70 75 80 бек біш Ар бі Ата АБр Тух Тук Сув Мес Т1е Тер Ркго бег Ап А1а 85 90 35I1ie Tuk Avr Avp Azp Suv Akgu Rkgo bek biu Mai Rgo Azr Aku Rre 5beg 60 b1iu Zek BPuv beg s1iu TPg bek Aza bek Iets Aza I1e bek b1u Pec AgdF 65 70 75 80 bek bish Ar bi Ata ABr Tukh Tuk Suv Mes T1e Ter Rkgo beg Ap A1a 85 90 35

Ткр Уа1 Рбе бі1іу бі1у Акад ТПт Пув Бпецп Трк Уаї Гецй 100 105 «2105 ч,50 «2112» 114 І «2125 БІЛОК «213» Нсто зарієепв «4005. 50 сі Маї біп тец їеш бі бек б01іу сС1у б1іу їеп Ма1ї Сбіп Рхо сСіу ЩУу 1 5 10 15 век Гец Аго Пец б5ехт Сув Аїа Азїа бек біу Ррпе ТБк Рпе Пуз Бек 5екг 29 25 30Tkr Ua1 Rbe bi1iu bi1u Acad TPt Puv Bpecp Trk Uai Getsy 100 105 "2105 h,50 "2112" 114 I "2125 BILOK "213" Nsto zariyeepv "4005. 50 si Mai bip tec yesh bi bek b01iu sS1u b1iu iep Ma1i Sbip Rho sSiu ShChUu 1 5 10 15th century Gets Ago Pecs b5echt Suv Aia Asia bek biu Rrpe TBk Rpe Puz Bek 5ekg 29 25 30

Рго Меє Еїіз Ткр Уаї Ак9у біп Аза Ркго б1у Ппуз біу бец бій Ткр Маї 35 40 45 бек біу Уаїі бек Тгр Ахп біу бек Аку Тпг Ніз Тук Уа! Азр бек Уаї 50 55 й 60 пув Аку Аку Рпе Тк о ТІ1еє Бех Аку АБр Азп о бек Пув АБп ТК Гей Туг 65 70 15 80Rgo Mee Eiiz Tkr Uai Ak9u bip Aza Rkgo b1u Ppuz biu bec bii Tkr Mai 35 40 45 bek biu Uaii bek Tgr Ahp biu bek Aku Tpg Niz Tuk Ua! Azr bek Uai 50 55 and 60 puv Aku Aku Rpe Tk o TI1ee Beh Aku ABr Azp o bek Puv ABp TC Gay Tug 65 70 15 80

Пец біп Меє А5п о бег Гец Акуд Аза Сі Ар Тіт Ата Уа! Тухк Тук Сув 85 90 95Petz beep Mee A5p o beg Getz Akud Aza Si Ar Tit Ata Ua! Tuk Tuk Suv 85 90 95

АтТа Агуд б1у АТа Рго Аїа РПе Азр ІТ1е Тго с1у біп біу Тпг Бпеа Уаї 100 105 110AtTa Agud b1u ATa Rgo Aia RPe Azr IT1e Tho s1u bip biu Tpg Bpea Uai 100 105 110

Тк Уа1 «2105 51 «211» 110 «212» БІЛОК «2135 Ното зарієпв «4005 51 біп бек Уаї Те ТПк о біп Ркго Рго Бех Азїа бег б1іу ТПг Рго СсС1у б1п 1 5 10 15Tk Ua1 "2105 51 "211" 110 "212" BILOK "2135 Noto zariepv "4005 51 bip bek Uai Te TPk o bip Rkgo Rgo Beh Asia beg b1iu TPg Rgo SsS1u b1p 1 5 10 15

Агуд Уа1ї ТБт Т1е бек Сув бек сО1у ТПг Тік бек бек І1е С1іу бек АвпAgud Ua1i TBt T1e bek Suv bek sO1u TPg Tick back bek I1e S1iu bek Avp

ТПтоУаї Азп о Тер Тук б1іп біп Пец Рго бі1у ТПпг Аза Рхо Пув Пец ТенTPtoUai Azp o Ter Tuk b1ip bip Pets Rho bi1u TPpg Aza Rho Puv Pets Ten

І1е Тук Авр АБп Авзп о Буз Агу Рго бек б1іу Маії Рго Авр Ака Рре 5бег 60 бСіу бек Пув бек Сіу ТіПг бек А1їа бек Гец Аїа Т1е бек с1у Геп Агд 65 70 175 80I1e Tuk Avr ABp Avzp o Buz Agu Rgo bek b1iu Maii Rgo Avr Aka Rre 5beg 60 bSiu bek Puv bek Siu TiPg bek A1ia bek Gets Aia T1e bek s1u Hep Agd 65 70 175 80

Бек Сіш Азр біц Аза Азр Тук Тук Сув А1ї1а АТа Тгр Азр Авр бек Тец 85 90 35Bek Sish Azr bitz Aza Azr Tuk Tuk Suv A1i1a ATa Tgr Azr Avr bek Tets 85 90 35

Азп бі1іу Уаї Уаії Рпе біу б1у б01у Тк Пуз Ппецш ТБкгоУаї Гей 100 105 110 «2105 52 «2115 118 «2125 БІЛОК «213» Ношо заріеп;. «4005 52Azp bi1iu Uai Uaiii Rpe biu b1u b01u Tk Puz Ppetsh TBkgoUai Gay 100 105 110 "2105 52 "2115 118 "2125 BILOK "213" Nosho zariep;. "4005 52

Сі Уаї сСіп реп Гей сій бек б1у б1іу с1у Пецп Маї біп Рго с1у б1у 1 З 10 15 пом т км ки чн а у а п а и и о і нн чи я пек їев дка лез дек Сув Від вів Яех сут бив Тв Ре дек ек ТЕSi Uai sSip rep Hey siy bek b1u b1iu s1u Petcp Mai bip Rgo s1u b1u 1 Z 10 15 pom t km ki chn a u a p a i i o i nn chi i pek yeev dka lez dec Suv Vid viv Yaeh sut biv Tv Re dec ek TE

КЕ 23 зо тої х. рр 7 дно Р з т тлу с Жнива птKE 23 of that house. yr 7 dno R z t tlu s Harvest Fri

Аіз Меї Бех Тхв о Маї йкоа бій біз Рко бі тя шу Кен ть) Тер Уві зв 40 45 дек ожіу Уві Бі Беж пах сіУ Уді Ба ЖВЕ ТуУуг ТУх ді бБр Зек ЧаїAiz Mei Beh Thw o Mai ykoa bij biz Rko bi tyashu Ken t) Ter Uvi zv 40 45 dec ozhiu Uvi Bi Bej pah siU Udi Ba ЖVE TuUug TUh di bBr Zek Chai

БО п БО г п ях - сь мін й С: 4 х, ж а з - ше Тр ПИBO p BO g pyah - s min y C: 4 x, zh a z - she Tr PY

Пув біу бло Ра ТБбх їі дек Ага бр Авп о дек Бус АВ оОжЖлпк ва Тух що туя й що ва їй 5 ВО т дя -х то З Вучу Жещш лі; шу чну щі ка оберт бує гук їжа бів Бек бал бек ої: Аж Віз з3а бБль тах Віа Уві Ту ТУК Сук яд за Ки ків вка Узі діа тах ех бек ТЕ Ні Бде взроїекЕ Ткропіу ЕВ їди 138 щоPuv biu blo Ra TBbh ii dek Aga br Avp o dek Bus AV oOzhZhlpk va Tuh that tuya and what va va 5 VO t dya -h to Z Vuchu Zheschsh li; shu chnu shchi ka rotation bue huk food biv Bek bal bek oi: Azh Viz z3a bBl tah Via Uvi Tu TUK Suk yad za Ki kiv vka Uzi dia tah eh bek TE Ni Bde vzroiekeE Tkropiu EV eat 138 what

Сім ТБк обо тві ТвковіSeven TBk about your Tvkovi

Ах «від» ахAh "from" ah

ІК су «ав 10 «вій» БІЛОК «Ії» Кожео зарішнв «ЗПП о 5 дів Бех УвА іа ТБжт бід Бко Бхо Хак Дів Зех с1у ТВх Ехо бау бів ї З 1 15IC su "av 10 "vii" BILOK "Ii" Kozheo concluded "ZPP o 5 div Beh UvA ia TBzht bid Bko Bho Hak Div Zeh s1u TVh Echo bau biv yi Z 1 15

ШИЯ ши жі о дщи б пу і дае вм це й ті тії, шою вк та уві ТЕ Її беж Сув Бех 01 бек Акад о Бав АБО Ті ЩіУу Жах Ваза й й й У ЗаSHIA shi zhi oh dschi b pu and dae vm this and those tii, shoyu vk ta in TE Her bej Suv Beh 01 bek Akad o Bav OR Ti ShchiUu Zah Vaza y y y U Za

ТнЕ Ма1і ДвОБ Тк Тух біб ЗРО Ге Бро ЗІіУ ТЕ Аза бо БМя ме) о 35 з 45TnE Ma1i DvOB Tk Tukh bib ZRO Ge Bro ZIiU TE Aza bo BMya me) o 35 of 45

Кі Тух Зкч Ави бів Ав ко Ко Зек сСіу Уві Рко АзроАко Бре петKi Tukh Zkch Ava biv Av ko Ko Zek sSiu Uvi Rko AzroAko Bre pet

За Но во піт бак Буз беж біу дек беж Вій Зак Бе. й1іа Тіє ЕЖшж РУ ей Ку жк ту зе дя їй її а бек озіс вхо зі ліз Ар Тух ТуУух був Вів Віа Тк Аве Зір ще биZa No vo pit bak Buz bej biu dek bej Viy Zak Be. y1ia Tiye EZHshzh RU ey Ku zhk tu ze dya her a bek ozis vho z liz Ar Tukh TuUuh was Viv Via Tk Ave Zir still would

ВЕ Безу щеVE Bezu still

Фі в що тим при бик тар 34 3 и тло Ж м вуFi in what tim pri bik tar 34 3 i tlo Zh m vu

Евх Віз Тер оМБі ЕМе Січ чів щіУу ЖВу Бух ей ТЕХ Уві леви па 155 116 ей 58 лі я 14 чеїу» В «12» БІЛОК ша Троя швея , «кіл поОте жархьвтя сао» еру тва що бою чищі» мавиш Тбедтиюе почуй, коту ой «ших 11535. .Щ(105Evh Viz Ter oMBi EMe Sich chiv shchiUu ZhVu Bukh ey TEH Uvi levi pa 155 116 ey 58 li i 14 cheiu" In "12" BILOK sha Troya sewa , "kil poOte zharkhvtya sao" eru tva that boju chischi" you have Tbedtiue hear, cat oh "shih 11535. .Ш(105

Фо х вдих Фулисю зем ла де стран сві тиме ти тк «неї» Ха може 2Ухи Зудае"нкою приредною амаунокисікажехк «аеЗц» 54 лі вд Зк зо Жде а ке хх ази ру Ту о У ри сах З ду іч зві бів йез бБеб д5ій бах ЕХ БІУ ЗЛУ їжи Мві піп о тбко Зі біу ї Кк чих з 5Fo x dykh Fulysyu zem la de stran svi time ti tk "her" Ha may 2Uhi Zudae"nkou predynnoy amaunokisikazehk "aeZts" 54 li vd Zk zo Zhde a ke xx azy ru Tu o U rys sah Z du ich zbiv yez bBeb d5iy bah EH BIU ZLU eat Mvi pip o tbko Zi biu i Kk chih z 5

Її раї НО ЇїHer paradise BUT Her

Тракт кс ки Ще суд жа мл 1 т ях ї сн Єр бич у ке пTract ks ky Still sud zha ml 1 tyah i sn Yerbych u ke p

Щек цем Акс їм бек бух АІВя Віз Звк бЗіш Бббе ТОПу РБе бек Зеї Ту о 25 зо ее пече А ША -ї чо дж чув Тов и Ж юку ну хх піт Ме Нзз ТІю УВІ Ахо зів Вів Бо бі Був Біу йей бье Туш чаї як Де м ах ЗО 45Shek tsem Aks im bek buh AIVya Viz Zvk bZish Bbbe TOPU RBe bek Zei Tu o 25 zo ee peche A SHA -i cho j heard Tov i Zh yuku nu xx pit Me Nzz TIyu UVI Aho ziv Viv Bo bi Buv Biu yei bie Tush chai as De m ah ZO 45

З ВЗ Ж жа тт 5114 Ми, Ви фія Тато Бу Шоу п діз Віа їз о сХак Тук біз ЗіЗіу бе ЖХвак був Бе Тук Лів Азвв бах Майї 5а З тож 0 зу дач 3 ех Я Ту Муз бр Дос й пд пкт ож ех Ж щі В. в»Ув і дЕЩ Ве ТЕ тів Бек дк АяроАви Бах Бу ба ТИЖ їм ТуЖ -щ Б ям Ок 53 ТО те БО т ер шк - слсх ч ше рань Ше ся ВО жи х ха ко беж їви біз Ме Ах бах Без ка Віа бі АвротвжІ дія Уві ТтУх ТуК Су но 53 зі у ся тю т НЧхаме бзчж т пітлу ме ях хо т. з же лк віз йеж зіб чУвЬ ТУХ Ту Хай СБРУу Ме Авв ові хр Бім Зіп обі Тах зв зак їй ї1щ50 ї1па 110Z VZ Ж жа tt 5114 We, You fiya Tato Bu Show p diz Via iz o sHak Tuk biz ZiZiu be Zhhwak was Be Tuk Liv Azvv bah Maiyi 5a Z tozh 0 zu dach 3 eh I Tu Mus br Dos y pd pkt oz eh Ж shchi V. v»Uv i deSH Ve TE tiv Bek dk AyaroAvy Bach Bu ba TIZH im TuZH -sh B yam Ok 53 TO te BO ter shk - slsh ch she ran She sya VO zhi h ha ko bezh yiv biz Me Ah bah Bez ka Via bi AvrotvjI deia Uvi TtUh TuK Su no 53 zi yusya tyut t NCHhame bzchzh t pitlum me yah ho t. z zhelk vizh ezh zib chuv TUH Tu Hai SBRUu Me Avv ovi hr Bim Zip obi Tah zv zak her i1sch50 i1pa 110

Жощої т са ЗЙт їн Маії Тит ЗІ 115 «Вій БУ суч з «кіди МІ «їй» БІЛОК «13» Номео шарів» карі» 5 я їх м. х 2. з її БІ Тит. лк, - се Тек Го се Тр юю В дн, же ій о бвк хаі ба ТІ бій жо ка МЕх Аза мак осзау їпбк ктІа ба бій « я - 1 Ко ко 15 а жтщ гр я Шо скін В - 3 г сер я маже її г33 че 16 ШИХ вка чаї Ту їз зе) бух Бех чу Бшх Так яех дз Ах БІ вах о оех кр БА й ее Їх тоZhoshchoi tsa ZYt yin Maii Tit ZI 115 "His BU such z "kidi MI "her" BILOK "13" Nomeo shariv" kari" 5 i ih m. x 2. z her BI Tit. lk, - se Tek Go se Tr yuyu V dn, zhey o bvk hai ba TI bij zho ka MEh Aza mak ossau ipbk ktIa ba bij « i - 1 Ko ko 15 a zhtsch gr i Sho skin B - 3 g ser i maje her g33 che 16 SHYH vka chai Tu iz ze) buh Beh chu Bshh Tak yaeh dz Ah BI wah o oeh kr BA y ee Their that

Сич тих ий, ши а АВ ШИ Ху лу як В ак не із Ві Жук ткрвожую Сів бій зе) ехо ЗАУ ТВ ВМ Вхо Межа Бев ей щк х з ї5 «о 4 т сх чі Фе шт коуч зи, с р хх Я щл шщех я жит ба йSich tih y, shi a AV SHY Hu lu as V ak ne iz Vi Zhuk tkrvozhyuu Siv bij ze) echo ZAU TV VM Vho Mezha Bev ey shk h z i5 "o 4 t sh chi Fe sht kouch zi, s r xx I shhl I live forever

Іів тут хв АБЮр ол Бвеви ДЗ РІЗ Бех Біт ча: Іо АЮ Аа РБе ЗвЕIiv tut hv ABYur ol Bvevy DZ RIS Beh Bit cha: Io AYU Aa RBe ZvE

5 БО5 BO

Зі Бех Буш Зах 01У ТрЬжк о сдеє Від пек Бе) дія їі вт БІ1У бе ДХЗ й та 75 яFrom Beh Bush Zach 01U TrЖhk o sdee From pek Be) action ii tu BI1U be DHZ y ta 75 i

Фен ат 73 ккя У З міч "баку бю ж бах Мох; бр ду Сл окоу шаг опіч бр озіц діз дев о їТУк Тук сСув Пій Зах ТУЖ баз олех Щек блиFen at 73 kkya U Z mich "baku byu z bah Moh; br du Sl okou shag opich br ozits diz dev o iTUk Tuk sSuv Piy Zach TUZH baz oleh Chek bly

Е че г ва по ав же ях ви 55 ех пеня їі мере Халл ї хр и, т ті і Тв Ма ББа бі щу сіУ ТБЕЖ Буд цем був отаї без 153 іп 115 «ті 55 «ха 416 «бів» БІЛОК про кн пиши «23» Кошти» чашеетья «ОЗ» Ба ен а нт а ан а ВА АНЯ са пк; Ж віх бщк й Ко узі; їію Майї біз леї без бід й пу 2 Бу У мев Чтв осів бтео А М ОЗАХШ ї : ; тE che g va po avzhe yah vi 55 eh penya ii mere Hall yi hr y, t ti i Tv Ma BBa bi schu siU TBEZH Bud cem was otai bez 153 ip 115 "ti 55 "ha 416 "biv" BILOK about kn write "23" Cash" chasheetya "OZ" Ba en a nt a an a VA ANYA sa pk; Same milestones and Ko uzi; iiyu Mayi biz leyi bez bid y pu 2 Bu U mev Chtv osiv bteo A M OZAHSHSH i : ; t

КУ Б 10 ї5 дек Кей Лют із Бву СУЯ бів Аза Беж сік Ре тво Брно бек бах Тух я т ж ва и дех Мат вав ТКЕр Уві Зк бів Аіз Бе о біУу Буд БІУ їв хай ТЕЖ Уві ще й ні 8 45 г ті й пед я п о А ша бів Ууаі їі бек тую бзрошіу Зах діт бух тТук ТУЮ Аза Мар мек аKU B 10 i5 Dec Kay Lut from Bvu SUYA biv Aza Bezh sik Re tvo Brno bek bah Tukh i t zh wa i deh Mat wav TKer Uvi Zk biv Aiz Be o biUu Bud BIU iv hai TOO Uvi still and no 8 45 g those and ped i p o A sha biv Uuai ii bek tuyu bzroshiu Zach dit buh tTuk TUYU Aza Mar mek a

Зо 55 Бо йпта йпіу тд Бо тах гів бех Яхо Авродап о йех Бе див ТИ Бев тую а то ї5 о неї сани щі а як я ех я сг тт й - Семи я баг еп біт Меї дзпобБех їй Атт Алла сіз Авро»отТНЕ Аіа Неї Тук Тух Суй я з ваZo 55 Bo ypta ypiu td Bo tah giv beh Yaho Avrodap o yeh Be div YOU Bev tuyu a to i5 o her sany shchi and how I eh I sg tt y - Semy I bag ep bit Mei dzpobBeh her Att Alla siz Avro»otTNE Aia To her Tuk Tuk Sui I'm with you

Зк али Х уз сх КЯ та Се її: лк Я ще Фея слимак іх а. гоZk aly X uz sh KYA and Se her: lk I still Feya slymak ih a. oh

Зів До Мей АБвобхо та бі дів вне дав Гіе Тк осі сію біу Так по їп5 115 їв очах Твк Уві плZiv Do Mei ABvobho and bi div vne gave Gie Tk osiu siu biu So po yp5 115 ate eyes Twk Uvi pl

Кен «гі» 57 ря ях «ТІ» МІ сту тя тет «ів БІЛОК шееудучу феио ежоков мл хиІЗЕ НЕО ЗББВІВИХ «Оп 57 піп Бек Уві це: ТОХ біб Кко вхо ех Ада мех піу ТБХ Бо жі біл "З ш Як є ї й їз х5Ken "gi" 57 rya yah "TI" MI stu tia tet "iv BILOK sheeuduchu feio ezhkov ml hiIZE NEO ZBBVIVYH "Op 57 pip Bek Uvi tse: TOH bib Kko vho eh Ada meh piu TBH Bo zhi bil "Z sh How is i and ride x5

У ся о ж їн В пт зер Щек о йди іш пі дех йог зга Уаі ТБх зл УшЕ Св бех ау АхЯ ек Щек два дів сау век й ди ее й у 25 ке т за пе не бік раї тету тер -ї іх й го б окіїх ТвU sya o zhin V pt zer Chek o ydi ish pi deh yog zga Uai TBh zl UshE Sv beh au AhYa ek Chek dva div sau vek y di ee y u 25 ke t za pe ne bik rai tetu ter -i ih y ho b okiih Tv

ТпЕ Уві де» тТхо Тук Зі о ЗіБ бло Вха біу ТВ ові Во Був дей ев ш її дк, ги «З ж т я г в о Ку де ще ая їх щ се пл й «їни МуTpE Uvi de" tTho Tuk Zi o ZiB blo Whab biu TV ovi Vo Buv dey ev sh her dk, gy "Z zh t i g v o Ku de still aya ih sh se pl y "iny Mu

Тіз Туж був Азп обча Сі Як та Бех біб ті Рко Аа Ага Раб МВЖTiz Tuzh was Azp obcha Si Yak ta Beh bib ti Rko Aa Aga Rab MVZH

К; т Кия що а х 5 с й : чи я шШау тм й тт сл стіах У дчеоя бі бат їх бек біс ти бек лоз бзх іш Аїв Тіз БЕ бБфУ Меч ди 7 й -- ппK; t Kiya that a x 5 s y: whether I shShau tm y tt sl stiah U dcheoya bi bat ikh bek bis ti bek loz bzh ish Aiv Tiz BE bBfU Mech di 7 y -- pp

Б КЕН ІЗ що - мя т се ; Мати утіх Зоря бек Мак р; дує брак бак піз дв піз лів Аво ТИЖ їЄкк Пе5 дів чаї ТЕр о ЯБО пІ ак бе й ще й СЯ аб,B KEN FROM what - mia t se ; Mother of comfort Zorya bek Mak r; blows lack bak piz dv piz liv Avo TYZH iEkk Pe5 div chai TER o YABO pI ak be and also SYA ab,

ВО за ЗЕ ст жк ру Я р аа г ха божа Мер о Тако Хо пк г д пах ам їхЮ віз Епе бі су йх Увх Бе Бей Тпточаб бев че где то і55 Т25 МІВ «ій» 58 суду 4 «115 135 ятки пеня «ВІ ОБІДОК «2133 Носюо карівтх «пох 58 дл Я се н ч Зах виє З ча 1 те ІЯ хі п Ук Я я ім хаії Сів бо без Бій Зех щіУу Б53іу Зі Пец ві ой шо зі іх х х Кея ії Е за В - - й Е п пік пьш о бтае ба ба аю ткVO za ZE st zhk ru Ya r aa g ha boza Mer o Tako Ho pk g d pah am ihYu viz Epe bi su ih Uvh Be Bey Tptochab bev che to i55 T25 MIV "iy" 58 sudu 4 "115 135 yatki penya " VI OBIDOK "2133 Nosyuo karivth "poh 58 dl I se n h Zah vie Z cha 1 te IYA hi p Uk I I im haiii Siv bo without Bii Zeh shchiUu B53iu Z Pec vi oi sho zi ih kh kh Keya ii E za B - - y E p peak psh o btae ba ba ayu tk

Зек Шк Зх їва Бек Суд А1з Аз бек біт вве тТВЕ Раз дяк Беж Ту ше Й тЕ " а за Ко -й3Zek Shk Zh yiva Bek Sud A1z Az bek bit vve tTVE Raz dyak Bezh Tu she Y tE " a za Ko -y3

СЯ К ; НЯ Ян ет що п. ся, Ж Я корови КІ ЗУ ля сь Ме бів Ткр Уві Ахя біп Влв Рхо шаАУ Був БМУу Гей БМ ТЕв чаї й «г г се Я ше ее ШНи хх Га г сб оби и чук бен ВЗ до фужер деяSYA K; NYA Yan et that p. sya, Z I cows KI ZU la s Me biv Tkr Uvi Ahya bip Vlv Rho shaAU Buv BMUu Hey BM TEv chai y "g g se I she ee ShNy xx Ga g sb obi i chuk ben VZ do glassware where am I

Хех їви ї1ів беж ТЖо даросіт ім ех ївЕ ТУукК Ту Зіз АворобЖах Уві ва Зк й щя 5 ей « ші : пд т Ша о бокст о мліч ват и няHeh yiv i1iv bej TJo darosit im eh yivE TUukK Tu Ziz AvorobZah Uvi wa Zk y shya 5 ey « shi : pd t Sha o boxt o mlich vat i nya

Муз сіу бка вна Тлх о їлє беж Ббжт Азродав о бик о бул Аза отвк пей тїухMus siyu bka vna Tlh o ilye bej Bbzht Azrodav o bik o bul Aza otwk pey tiuh

Й жкх гАКя в но КЕ ак ва мо о КО ч де -оазу їх х - ан, Мо тя б Ех Я пн т Хр де без біб Мек Ази бек мес вко Аза сум Аяр ївжЖ Аів Уві Тут Тух СхаY zhkh gAKya v no KE akva mo o KO ch de -oazu ikh h - an, Mo tya b Eh Ya pn t Hr de bez bib Mek Azy bek mes vko Aza sum Ayar yivzhZ Aiv Uvi Tut Tukh Sha

Я дух Бк 85 зо 35I am the spirit of Bk 85 of 35

Е їх их м Кк, пра Тент ж Ж Ж Мер оке пу Ко прах За віз втєа 3» ТЕО БП Ав ово Зх зу зів паж Тлх ме чаї Трлх ву ших суку щеE ikh ikh m Kk, pra Tent zh Z Z Mer oke pu Ko prah Za viz vteaa 3» TEO BP Av ovo Zkh zu ziv pazh Tlh mechai Trlh ear shih suku more

ТО ТМ ХОTO TM HO

«сВІрз 58 «а АЖ порча «кій» БЮ спла В коту «ша» ово вараепае"sVIrz 58 "a AZ corruption "kiy" BYU spla In cat "sha" ovo varaepae

«40025 59"40025 59

Сіп бек УМаі Пе Тргобіп Рко Рко бБег Аза бех б1у Трг Рго біу біп 1 5 10 15Sip back UMai Pe Trgobip Rko Rko bBeg Aza beh b1u Trg Rgo biu beep 1 5 10 15

Ако Уаї Ток І12 бехт Суз бек біу бек бек бек Азп І)1е Сбіу Бек АвпAko Uai Tok I12 becht Suz bek biu bek bek bek Azp I)1e Sbiu Bek Avp

Тук Маї Тук Ттр Тук біп б1п Гей Рго біу Тійх Аза Рко ГувБ Пецп ГейTuk Mai Tuk Ttr Tuk bip b1p Gay Rgo biu Tiyh Aza Rko GuvB Petcp Gay

І1е Тук Авр Авзп Азп оТубє Акуд Рго бех біу Уа! Рго Азр Ахд РбБе 5ег 6оI1e Tuk Avr Avzp Azp oTubie Akud Rgo beh biu Ua! Rgo Azr Ahd RbBe 5eg 6o

С1іу бБет Туз бек біу ТПх Бек Аіїа бех Гей А1ї1а їТ1е Бек С1у Ге АкКд 65 70 75 80 бек бій Авр бій Аза Азр Тут Тук Сув А1а Аза Ттр Азр б1у Бех Гей 85 з0 35S1iu bBet Ace bek biu TPh Bek Aiia beh Gay A1i1a iT1e Bek S1u Ge AkKd 65 70 75 80 bek bij Avr bij Aza Azr Tut Tuk Suv A1a Aza Ttr Azr b1u Beh Gay 85 z0 35

АБп обСіу Рко Уа! Рпе с1у біу с1іу Трх Буз Пец ТпкЕ Уаї Ге 100 105 110 «210» 60 «2115 111 «212» ВвБІЛОК «213» Ното зарієпз «4005 60 біц Уаї Сіл Пец пеп бі бек б1у Ссіу біу еп УМа1! біп Рго біу сС1у 1 5 10 15 бек Тен АгЯд Геп бек Сув АТа А1їа бек С1у Рбе Тпх Ре Ахуд АБп Туг 20 25 30ABp obSiu Rko Ua! Rpe s1u biu s1iu Trh Buz Pec TpkE Uai Ge 100 105 110 "210" 60 "2115 111 "212" VvBILOK "213" Noto zariepz "4005 60 bits Uai Sil Pec pep bi bek b1u Ssiu biu ep UMa1! beep Rho biu sS1u 1 5 10 15 back Ten AgYad Gap back Suv ATa A1ia back S1u Rbe Tph Re Ahud ABp Tug 20 25 30

Аїа Мес бек Тгтр Уаі Аку біп Аза Рго біу Гуз Сс1у Пей Сі Тгр Уаї 35 40 45 бек Сіу Маі бек Тер Азп о С1іу бек Ак ТПх Ніз Тук Аза Авр бек Уа1 50 55 боAia Mes bek Tgtr Uai Aku bip Aza Rgo biu Guz Ss1u Pei Si Tgr Uai 35 40 45 bek Siu Mai bek Ter Azp o S1iu bek Ak TPh Niz Tuk Aza Avr bek Ua1 50 55 bo

Тув біу Ак Рре ТЬк І1е бБег Акуд Авр Азп беї Пув АвпоТпх Гей Тукг 65 70 75 80Tuv biu Ak Rre Tk I1e bBeg Akud Avr Azp bei Puv AvpoTph Gay Tukg 65 70 75 80

Тец біп Меє Ап обек Гей Аку Аза С1й Ар ТБу Азїа Уа1ї Тук Тух Сув 85 90 35Tets beep Mee Ap obek Gay Aku Aza S1y Ar TBu Asia Ua1i Tuk Tukh Suv 85 90 35

Тик о Трг Уа! Бех Ге Тук Тгр С1іу біп біу ТПг Гей Уаї Тпх Уаї 100 105 110Tik o Trg Ua! Beh Ge Tuk Tgr S1iu bip biu TPg Gay Uai Tph Uai 100 105 110

«2105 61 «2112 111 «2122 БІЛОК «213» Нощшо варіепв «400» 61 сіб бек Уаї Пеп Тк о біп Ркго Рко бек Азїа бек б1іу ТПк Рго с1у Сіп 1 З 10 15"2105 61 "2112 111 "2122 BILOK "213" Noshsho variepv "400" 61 sib bek Uai Pep Tk o bip Rkgo Rko bek Asia bek b1iu TPk Rgo s1u Sep 1 Z 10 15

Ах Уаі ТБгоІч11е Бек Сув ТПг обіу бек бБег Бех А5п І1е С1у А1а С1УуAh Uai TBgoIch11e Bek Suv TPg obiu bek bBeg Beh A5p I1e C1u A1a C1Uu

ЗоZo

Тук Авр Уаі Нів Тер Тук біп біп Гей Рго біу ТЬг Аїа Рго ПЦуз Іецй теп І1їе Тук Авр Ап Ап Пув Акуд Рко бек біу Уаї Рго Азр Ага РіеTuk Avr Uai Niv Ter Tuk bip biu Gay Rgo biu Tg Aia Rgo PCuz Ietsy tep I1ie Tuk Avr Up Ap Puv Akud Rko bek biu Uai Rgo Azr Aga Rie

Зо 55 бо бек біу Бек Пуз бек с1у Тртх бВехг Аза Зехт Ге Аз1а Т1е Бех с1іу Тей 65 7о 75 80Zo 55 bo bek biu Bek Puz bek s1u Trth bVehg Aza Zeht Ge Az1a T1e Beh s1iu Tey 65 7o 75 80

Ату бБех сій Авр с10) Аза Авр Туг Тук Суз біп бБеї Туг АБр Бех 5ег 85 90 35Atu bBeh siy Avr c10) Aza Avr Tug Tuk Suz bip bBei Tug ABr Beh 5eg 85 90 35

Іецй бек Аг Тер Уаї Рпе сіу сіу сіу ТБх БПуб5 Пец Тк оУаї Гей 1600 105 110 «2105 6562 «211» 118 «212» БІЛОК «213» Ното варіепв «4005 62 бі уаі Сіп реп пеш Сб1іц бБег б1у с1у с1у Пе Уаї біп Рго сіу біу 1 5 10 15 бек Ге Акд теп бех Сув А1їа А1їа бек біу Рпе ТПУ Рпе бек бек Тук 20 25 зоIetsy bek Ag Ter Uai Rpe siu siu siu TBh BPub5 Pec Tk oUai Gay 1600 105 110 "2105 6562 "211" 118 "212" BILOK "213" Noto variepv "4005 62 bi uai Sip rep pesh Sb1its bBeg b1u s1u s1u Pe Uai bip Rgo siu biu 1 5 10 15 bek Ge Akd tep beh Suv A1ia A1ia bek biu Rpe TPU Rpe bek bek Tuk 20 25 zo

А1а Меє Ніз Тктр Уаі! Акуд Сіп Аза Рго б1іу Пуз б1у їей біз Тер Уаї1ї 35 40 45 бЗеї бек І1іїа бек бег бек бег Бех бек Ії Тут Туг А1а Азр бек Уаї1ї 60 пув сСі1у Акд Рле ТАК І1е бек Акуд АБр А5п б5ег ПЦув АБп о ТпПт Гей Туг 65 70 75 80 жо я 7 ЗШ Бе їх ях. І що й ех За у ж я бле ж еп осір Межї дай обехїх іже го віз ЗМ Зао ТВпх о дьа Уві ТУух ЗУ Су 85 зо 5A1a Mee Niz Tktr Uai! Akud Sip Aza Rgo b1iu Puz b1u iey biz Ter Uai1i 35 40 45 bZei bek I1iia bek beg back beg Beh bek Ii Tut Tug A1a Azr bek Uai1i 60 puv sSi1u Akd Rle TAK I1e bek Akud ABr A5p b5eg PCuv ABp o TpPt Gay Tug 65 70 75 80 zho i 7 ZSH Be ih yah. And what y eh Za y zh i ble zh ep osir Mezhyi give both ijhe ho vis ZM Zao TVph o dy Uvi TUuh ZU Su 85 zo 5

Мт Ку реж шо у нки и аь и Шан НД На ЕН ше зе Жблн Йду ме тах ж дів вк ші ОДУ шщіу о3позів Пез Біу Аів Бе Айу її6 ТЕр о Бу ша у лик пк що 155 113 кх тк, годе ЕК що сіу ТЕХ Гл Уві тв тУВЕ 115Mt Ku rezh sho u nki i ai i Shan ND Na EN she ze Zhbln I go me tah z div vk shi ODU shschiu o3posov Pez Biu Aiv Be Aiu heri6 TER o Busha u lyk pk that 155 113 kh tk, gode EK that siu TEH See Uvi TV tUVE 115

Ам «Вій» ахAm "Vii" ah

Клаь ока т «її» 0 шк ян шт три «їж» БІЛОК зач Ждтсі пл п «гії Мова звовізпз ач. зак «ОО 5 х ілек у У шлам, УА У що щі ж є М чу ее Жах Бк ско вій бсек Чаї б-ки Таж ЗІЗ ро Бро яв ді беж пі їн бо Зіш БІО й «й зх ї 5 їй 15 вже ча НН СКУ 9 їж Вау бі м о йт бух буму М тт ти г хгKla oka t "her" 0 shk yan sht three "food" BILOK zach Zhdtsi pl p "giyi Language zvovizpz ach. zak "OO 5 h ilek in U shlam, UA U shch zh is M chu ee Zah Bk sko viy bsek Chai b-ky Tazh ZIZ ro Bro yav di bej pi yn bo Zish BIO y "y zh yi 5 her 15 already cha NN SKU 9 eat Vau bi m o yt buh boomu M tt ti g hg

Вуз Уві ТБЖж о бте Бек Суж Хек зім пйех бек бех йап їі щЩіу бе Авдл за я па «М ЖІ ке ту. лиш ть тт й я ет а УЧ - Ва в ше В АНЯ їVuz Uvi TBZhj o bte Bek Suzh Hek zim pyeh bek beh yap ii shSchiu be Avdl za i pa «M ЖИ ke tu. lysh tt y i et a UCH - Va v she V ANYA y

Не оУві Таж Тхв о Тух Біб бій ее БкоОо бі тях дія го був Бем о бедNot oUvi Tazh Tkhv o Tukh Bib bij ee BkoOo bi tyh dey ho was Bem o bad

ФО «8 ке я Ха вх с свят чу Е с 3 ке см му поч Туя ази 1із тук пі Ахрп овчй Ав ку Рез Бак зі Уві Рус вв АК блю Бек ще шк - ви БА ЗУ) піт Бек пух щек бБіУ ТК Зех Афа бег дез Аі8 Лів Зв пі Пебй АКЕФ пк тр дк ЯFO «8 ke I Ha vh s svyat chu E s 3 ke sm mu poch Tuya azy 1iz tuk pi Ahrp ovchy Av ku Rez Bak zi Uvi Rus vv AK blue Bek ske shk - vy BA ZU) pit Bek puh shek bBiU TK Zeh Afa beg dez Ai8 Liv Zv pi Peby AKEF pk tr dk Ya

Бк т Та І. ж пт я ше пата І соки беж лет зх тк ВІ Мена дст Ж хг див То базу піч Азо Бін дія ваш ТУує Тук був вій А жо йдр о паАУ Мех бенBk t Ta I. zh pt i she pata I soky bej let zh tk VI Mena dst J hg see To base oven Azo Bin action your TUue Tuk was vii A zho ydr o paAU Meh ben

ЗУ щи ВЗ пазу т. маї двш біз пім піз ответ буму Жеує Зх йвт осі ТхроУаї ББа біу пі біу ТТН муз їн ТВБж Уві БехZU shchi VZ pazu t. mai dvsh biz pim piz otvet bumu Zheue Zh yvt osi ThroUai BBa biu pi biu TTN muz yin TVBzh Uvi Beh

Мо іп ії ре пе «діа» ке ах кс «ві1їх 117 «Фійз ВАІЛСК ся ДК ее ст х т кій Боже зарієвзЕ «а 4 г тя ОХ п Я лет суч бо ж поки Ж до г он х. лік т піс чаї пів ем ої біз Бах сзу пЕУ з3іу їм) Уві ЗМ бБко позу З ч ж, хи реMoipii re pe "dia" ke ah ks "vi1ih 117 "Fiyz VAILSK sia DK ee st kh t kiy Bozhe zarievzE "a 4 g tia OH p Ya let such bo zh until Zh do g on h. lik t pis chai pi em oyi biz Bach szu pEU z3iu im) Uvi ZM bBko pozu Z h zh, kh re

Кч - КЕ 15 сс Ж оаухт же щи под и в НН Не. якою дні ха оч ет ж їя АЖЯа бе) беж Суз фа Вів Беж спіу Вле о Тьх ЕБа дав АБ о Тук зи Хосе є БУ Уго ми их Ко Жбюеті Зі кю о Х л кх тк зр тео ву Ме Бех Тхв оМаї АкЯ шій Аза Кто спі у Біу Бе;п обіз Ттр Уві я зд 35 тя! ад ш (Я т Ствол Во як а о. дя ЛЕ. ч р ха уже В. я ла дів ТВі тіє Щех Тух Ар сіу Бех Ап Бу бух ТУкК вів АзроЖет Ма. ак, щ (чн во 28 по 4 «та З соЖіув веж тд Й че їз з тс ше Ж М» вн Ж а бахKch - KE 15 ss Z oauht same schi pod i in NN Ne. What day is it? Who sleeps in Biu Be;p obiz Ttr Uvi i zd 35 ty! ad sh (I t Stvol Vo as a o. dya LE. ch r ha already V. I la div TVi tie Shcheh Tukh Ar siu Beh Ap Bu buh TUkK viv AzroZhet Ma. ak, sh (chn vo 28 po 4 "ta Z soZhiuv towers td Y che iz z tsshe Zh M» vn Zh a bach

Муз Зі йжа ба ТБх їі Зех АхЗ Авр вяп ех ув Аа ТБ ай ТУЄ пе Та т щоMuz Zi yzha ba TBh ii Zeh AhZ Avr vyap eh uv Aa TB ay TUYE pe Ta t that

ХХ ла т У Хв Шви її МУ Ти за т гзк ТИ Же бУщМас бах лк ївиа зів Месє два бах бази па діа бій пд ТВЕ діз ТВі ТтЕ Туш Суд пе п дЕ ва Бе 55ХХ ла т У Хв Швы ей МУ Ты за t gzk TI Же бущМас bach lk yvia ziv Mesye two bach bases pa dia bij pd TVe diz TVi TtE Tush Sud pe p dE wa Be 55

Зі че іх Іза СОМ б. ку п КЯ 1. так З С тен сія УКZ che ikh Iza SOM b. ku p KYA 1. yes Z S ten sia UC

Вів Ух пів Бле ТЕ важ жов окр іа вна авш Аія їжхр мА б3й ау їдО п ІНК: їх дез Уві Твж Єві 15 ста «Кк «ій» Б сел х я «ї1ї»х 115 «кїйх БІЛОК «кій» Бощо башієтя ї «ВО» БЕ т З паї ст Ши як оч я Що що жучки З и з З зів Мак Уві Мен Тх сіб Ка бо яв Вів Чех БА так о Бко Бу зів ї З 10 15 о ЗХ зу МІ се зі у вч а Жашчю КВ Єсужж В КІ Га ще ще Для ха ТВі ТлЛх лі бек суд бер піу БЕБЇї ек бШех йзпобів піу Бек й и а За т ж 30 ща ее Чек 4. з тої Шини. їЗ1яю пе ЗІ ЇМО би У тт» ій Маї Аз Тер о Туг вів біз бе о бЕеа пі» лк діа Без Па їм БейViv Ukh piv Ble TE vaz zhov okr iavna avsh Aiya yzhhr ma b3y au idO p INK: ih dez Uvi Tvzh Yevi 15 sta "Kk "iy" B sel h i "i1i"h 115 "kiyh BILOK "kiy" Boscho bashietya y "VO" BE t Z pai st Shi as och i What what bugs Z i z Z ziv Mak Uvi Men Th sib Ka bo yav Viv Cheh BA tak o Bko Bu ziv i Z 10 15 o ЗХ zu MI se zi u vch a Zhashchyu KV Jesuzhzh V KI Ha still still For ha TVi TlLh li bek sud ber piu BEBYi ek bSheh yzpobiv piu Bek y i a For the same 30 shcha ee Chek 4. from that Tire. iZ1yayu pe ZI IMO would U tt» ii Mai Az Ter o Tug viv biz be o bEea pi» lk dia Bez Pa im Be

ЗЕ шZE sh

ЗБ 40 45 її Тук Тих дзб ТЕ два Аж рт бПех піу уві Бго Азр Ага Бе обЗех ще ке щк ву 5 ж ж ру Ж буру т Се же жіщ би аз те кат ст я зе бьу шевЕ Му ШеЖ Сеу ТВЕ ех АІЗ Бех Бен від фїе бек сАУЖ ем вх що ху ЧЕ вл аа т їх Зо г я баян Зк ах мч ЛПОегу Пчактє плат Я в ЗХ опту фуги Тез уд Не ек ові Ашр біс дів Явюо Тех ТУБ Суш Вів Вів ТК Ах ле щих їй ше дя єZB 40 45 her Tuk Tyh dzb TE two Azh rt bPeh piu in Bho Azr Aga Be obZeh sche ke shk vu 5 zh zh ru Ш buru t Se same zhishch bi az te kat st ia ze byu sheE Mu SheZ Seu TVE eh AIZ Beh Ben from fie bek sAUZH em vh kh hu CHE vlaa t ih Zo g ya bayan Zk ah mch LPOegu Pchaktye plat I in Х Х optu fugi Tez ud Ne ek ovi Ashr bis div Yavyuo Teh TUB Sush Viv Viv TK Ah le schikh her she dya

У зо зЗ5 дея Піч бюе Уа Вр обім піс бію ТЕ Гра їі; Тв Ммаї їхU zo zZ5 deya Pich buye Ua Vr obim pis biyu TE Gra ii; Tv Mmai them

ТУувТпо ау Ж жа ЕЛЕ бу соКУ ААУ ЇПЕ ж МБО ОфнНЖжЖ ві ва - т ой камTUuvTpo au Zha ELE bu soKU AAU YPE z MBO OfnNJzhZ vi va - t oi kam

МИ 15 ЗЕ єн» ЗЕ «21м 15 «81ЖХ» БІДОЖХ ре їх ни «ВІ» Комо вавранкя с - як «Оп» би січ Уаї біп Гец Гец Сі бек біу б1і1у сб1у Сец Уа! б1іп Рго б1у 51Уу 1 5 10 15WE 15 ZE yen" ZE "21m 15 "81ЖХ" BIDOZHH re ikh ni "VI" Komo vavrankya s - as "Op" bi sich Uai bip Gets Gets Si bek biu b1i1u sb1u Setc Ua! b1ip Rgo b1u 51Uu 1 5 10 15

Зег Гей Агу Те Бех Сув А1їа А1їа беї Ссіу Рое ТПх РПе 5Зеї Тук ТукZeg Hey Agu Te Beh Suv A1ia A1ia bei Ssiu Roe TPh RPe 5Zei Tuk Tuk

Рго Мес Тійг Тгр Маі Агу біп Аїа Рго біу Пуз б1у Гец бій Тгр Уа!Rgo Mes Tiig Tgr Mai Agu beep Aia Rgo biu Puz b1u Gets bij Tgr Ua!

А1їа Маї І1е Бех Тухк АБр А1їа бех Сіп ТПг Тухг Тукг АтТа б1іц Рго Уаї боA1ia Mai I1e Beh Tukhk ABr A1ia beh Sip TPg Tukhg Tukg AtTa b1its Rgo Uai bo

Був б1у Аку Рре ТБг І1е бег Агу Авр Авп обетгт Гуз Авп ТПг о Гецд Туг 65 7о 75 80Was b1u Aku Rre TBg I1e beg Agu Avr Avp obetgt Guz Avp TPg o Getsd Tug 65 7o 75 80

Тїем біп Меє А5п бек Теп Акд Аза бід Авр Тах АтТа Уа1ї Тух Тук Сув 85 30 з5Thiem beep Mee A5p bek Tep Akd Aza bid Avr Tah AtTa Ua1i Tukh Tuk Suv 85 30 z5

А1тїа Ака с1у ТПпк о Тук сіу Бецш Гей Авр Тук Тгр б1у біп б1у Тік Гей 100 105 110A1tia Aka s1u TPpk o Tuk siu Betsh Gay Avr Tuk Tgr b1u bip b1u Tik Gay 100 105 110

Уа1 Тк Уаї 115 «2105 67 «211» 109 «2125 БІЛОК «213» Ното зарієпв «220» «221» тівс Єеасихе «222» (10)..:510) «223» Хаа може бути будь-якою природною амінокислотою «220» «221» тівс Геасиге «222» (38)..(38) «223» Хаа може бути будь-якою природною амінокислотою «4005 67Ua1 Tk Uai 115 "2105 67 "211" 109 "2125 PROTEIN "213" Noto zariepv "220" "221" tivs Yeeasikhe "222" (10)..:510) "223" Haa can be any natural amino acid " 220" "221" Tivs Geasige "222" (38)..(38) "223" Haa can be any natural amino acid "4005 67

Сіп Бек Ма! Пей ТПпЕ біп Рго Рго бек Хаа бек біу ТіК Рго біу біп 1 5 10 15Sip Bek Ma! Pei TPpE beep Rgo Rgo bek Haa bek biu TiK Rgo biu beep 1 5 10 15

Ах Уаї Тр оІч11е Бек Сув Бек біу Бех бек бБет Авп о І1е б1у А5п Авп 20 25 30Ah Uai Tr oIch11e Bek Suv Bek biu Beh bek bBet Avp o I1e b1u A5p Avp 20 25 30

Тук Ма1! бек Тгр Тух Хаа біп Гей Рго б1у Тйт Аїа Рго Пу5 Пец їецй 35 40 45Tuk Ma1! bek Tgr Tukh Haa bip Hey Rgo b1u Tyt Aia Rgo Pu5 Pec ietsy 35 40 45

І1е Туг Авр Авп Азп гув Акуд Рго бБег спіу Уа1 Ркго АвБр Акд Рпе 5ег 50 з5 60 я е п А и па жін тіц г : : ще зі Беє Був Бек січ ТБх беж ВАлв Ше їео бів бів дек СУ Тез БЕЗ ск -в -к щеI1e Tug Avr Avp Azp guv Akud Rgo bBeg spiu Ua1 Rkgo AvBr Akd Rpe 5eg 50 z5 60 i e p A i pa zhint ts g : : more with Bee Buv Bek sich TBh bej VAlv She ieo biv biv dec SU Tez BEZ sk -v - to more

БІ го т Ба т т - А зх т дж пе бно М хо т. Тежеьє Йо божу бір Ж дВешж піз два біз Вій Явщ о Тук ТУ о Єма йдіз дід Ттр дво ХвБоЗах ви 85 З 5 чо же жк ж шля Ж но Моя рек, пи У ж й що т. «еBI ho t Ba t t - A zh t zh pe bno M ho t. Tezhye Yo bozu bir Z dVeshzh piz dva biz Viy Yavsh o Tuk TU o Yema ydiz did Ttr dvo HvBoZah vi 85 Z 5 cho zhek zh shlya Z no My rek, pi U same and what t. "e

Зах ім Зах пе Бі сі Зхл ТВ Був дна ТВХх Заі Бех при йZah im Zah pe Bsi Zhl TV Buv dna TVXh Zai Beh pri y

Фо 155 «как 5 «із 115 «Вій» кіІнНОоК «ії» Кошео варієпв «апп» ЯFo 155 "kak 5 "iz 115 "Viy" kiInNOok "ii" Kosheo variepv "app" I

КІ яд ж Хо тк мот я селах тряж 1-х зе 0 ху Як із За. біо без їжі з) бек спі Зі сі Пе чаї ій Рекс щЩіу бі й Е 4 Е ї З 18 ї5KI yad j Ho tk mot I selah trjaj 1-x ze 0 hu As from Za. bio without food z) back spi Zi si Pechai iy Rex sshSchiu bi i E 4 E i Z 18 i5

Фо й с « ще зак а х є ж х тд с Фін ще сякFo y s « still zak a x is same x td s Fin still syak

Шес їв Яка Бей бек Сув дів Віз Ббг 01іуу Ева тс рда шеж Аз тТук - ек - 2 25 Зо зЗіУ Же Ні Тжв Уві Аза піп Вів бго сі Був Зі Бей бі ТЖкр Уві ах «У 45 ик тп бок у ос рова и ня бу в Ятутгко бхлач В що пш з чіщ ек іа їі его тур обер осі бпіу Бек їж Тук Ту Аза дав ошах віShes yiv Yaka Bay bek Suv div Wiz Bbg 01iuu Eva ts rda shezh Az tTuk - ek - 2 25 Zo zZiU Zhe Ni Tzhv Uvi Aza pip Viv bgo si Buv Zi Bei bi TЖkr Uvi ah «U 45 ik tp bok u osrova i nya bu v Yatutgko bhlach In what psh z chisch ek ia ii ego tur ober osi bpiu Bek izh Tuk Tu Aza dav oshakh vi

За щоFor what

Ржгох й сао КУ СТ чи Ж га ко чт шт АН к не Товз туяRzhgoh and sao KU ST or Zh ha ko th sht AN k ne Tovz tuya

Гуз ші ху Бе тв Ті ех БТ Вр олЛяп о йек о був Ави ТвВх о їмо тух ба 70 т5 во - ЧНИХ ки см Жид Деу у А дя бах кош и ин о На ів вів Меї де» бах Мей Ака Мза Зі Ар тах бів У ТУк Жук Сув 85 о жу їле зу Зех Ткр Бе дво Рко Ткр о Сьу БіпосіУу ТБх Без Маї Твг ві її КУ х Заг я; їі05 ік «вій» 5 «її» 110 «еїї» БІЛОЮ сеї» Норю дашьегя чЕвЧе каві БАЗ КЕНЕ кЕййх ЇТВр..178, ел я тля дяк сих, дтпи ж оку Фрай. її мих укр тити Ки «шжЕі» Хаз може Бухи Зудь-фжою природною емінакносло мок «Ейпх сла сш бла кат Іо вахите кв до «Ед 1821. ІВи мук - х чаї Н жи зах стуки учи ее шемия пасік виття «тий Хаа може бути будь-якою призецдною маскиGuz shi hu Be tv Ti eh BT Vr olLyap o yek o was Avi TvVh o imomo tuh ba 70 t5 vo - ChNYH ki sm Yid Deu u A dya bah kosh i in o Na iv viv Mei de" bah Mei Aka Mza Zi Art tah biv U TUk Zhuk Suv 85 o zhu ate zu Zeh Tkr Be dvo Rko Tkr o Syu BiposiUu TBh Bez Mai Tvg vi her KU x Zag i; ii05 ik "vii" 5 "her" 110 "eiyi" BILOYU sei" Noryu dashyegya chEvChe kavi BAZ KENE kEyikh YTVr..178, el I tlia dyak sih, dtpy z oku Fry. Her moss hides Ky "shzhEi" Khaz can Bukhy Zud-fzhy natural eminaknoslo mok "Eyph sla ssh blakat Io wahite kv to "Ed 1821. IVy muk - kh chai N zhi zah knocks ui ee shemiya pasik howling "that Haa can be any kind of mask

«400» 69"400" 69

Сіп бек Уаі Пей ТПг біп Рго Рко бек Аїа бехт Сіу Так Рго сіу біп 1 5 10 15Sip back Uai Pei TPg beep Rgo Rko back Aia becht Siu Tak Rgo siu beep 1 5 10 15

Ако Ма1ї ТпПг оІ1е бек Сув бек біу бек бек бек Авп І1е біу Бек АзпAko Ma1i TpPg oI1e bek Suv bek biu back bek bek Avp I1e biu Bek Azp

ЗоZo

ТВг Уа1ї А5вп о Тгр Тук біп б1п Гецд Рес б1у Тк Атїа Рго Пуз Пей Гей 15TVg Ua1i A5vp o Tgr Tuk bip b1p Getsd Res b1u Tk Atia Rgo Puz Pay Gay 15

ІТїе Тук Авр АБп о Авр Агу Аку Ркго Гец біу Маї Рго Авр Акд Ре Бег 60ITie Tuk Avr ABp o Avr Agu Aku Rkgo Gets biu Mai Rgo Avr Akd Re Beg 60

С1у бек Гув бек 01у ТП бег Хаа бек Пец Аїа І1е бек с1у Гей Ага 65 70 75 80S1u bek Guv bek 01u TP beg Haa bek Pec Aia I1e bek s1u Hey Aha 65 70 75 80

Бек Хаа АвБр біц А1ї1а Авр Тук Туг Сув Аза Аї1а Тгр Авр Авзр Бек ТІей 85 з30 95 бек біу Уаї1ї Уа1і Рбе с1у с1у сі1у ТПх Ппув Пец ТПх Уаї Тец 100 105 110 «2105 70 «2115 116 «212» БІЛОК «2135 Ното зарієпз «4005 70 сі Маї біп реп гей Сі бек бі1у б1іу с1у Ге Уа1 сСіп Рго біу б1У 1 5 10 15Bek Haa AvBr bitz A1i1a Avr Tuk Tug Suv Aza Ai1a Tgr Avr Avzr Bek TIey 85 z30 95 bek biu Uai1i Ua1i Rbe s1u s1u si1u TPh Ppuv Pec TPh Uai Tets 100 105 110 «2105 70 «2115 116 «212» BILOK Noto «213 "4005 70 si My beep rap gay Si back bi1u b1iu s1u Ge Ua1 sSip Rgo biu b1U 1 5 10 15

Бек Ген АгЧд Тїеп бек СуБ АТа А1їа бех б1у Рпе Тк Рбе Авр Авзп Туг 20 25 30 бСі1іу Меє Бек Тгр Уаії Агуд сб1іп АТа Рго б1у Був СсС1у Тео Сі Тхтр Уа1! 35 40 45Bek Gen AgChd Tiep bek SuB ATa A1ia beh b1u Rpe Tk Rbe Avr Avzp Tug 20 25 30 bSi1iu Mee Bek Tgr Uaii Agud sb1ip ATa Rgo b1u Buv SsS1u Theo Si Thtr Ua1! 35 40 45

Атїа Уа1і І1е Бек Тук Авр с1іу бек Авп Гув5 Тут Тук Аіїа АБр бек Уаї1 50 55 60 пув б1у Ага Рпе ТПх І1е бех Агу Авр о Авп обех Гувз Азп ОТ Гей Туг 65 70 75 8о їец біп Меє Азп бех Геп Акд Аїа с010 Авзр Тк Аза Уа! Тук Тук Сув 85 90 35Atia Ua1i I1e Bek Tuk Avr s1iu bek Avp Guv5 Tut Tuk Aiia ABr bek Uai1 50 55 60 puv b1u Aga Rpe TPh I1e beh Agu Avr o Avp obeh Guvz Azp OT Hey Tug 65 70 75 8o yets bip Mee Azp beh Gep Akd Aia s010 Avzr Tk Aza Wow! Tuk Tuk Suv 85 90 35

А1т1а Бех Тер Гец біп Уа1! Авр Аза РіБе Ар Ге Тгр С1у біп с1у ТЕПх 100 105 110 я яті ря чІіщї зам отнвА КМ ЗХ кл я. у 1 есе яп «ЕВ ЗАо «кій ВЕЛО ше Тими зт вл «таз Моди вра євхA1t1a Beh Ter Gets beep Ua1! Avr Aza Ribe Ar Ge Tgr S1u bip s1u TEPh 100 105 110 i yaty rya chiishchi zam otnvA KM ZH kl i. in 1 essay, Yap "EV ZAO "kiy VELO she Timy zt VL "taz Mody vra evkh

ЦЕ 1 піз бе УЧре3 Жан бе пле Бка) бе зве Дія де щі пвеорказ ЗВУ п зів бек Уві фе ТАК осів Вко Ро Бех вів Бех 51 ЖДЕ Рко зіУ бід ї З їз їх вхоч Маї Тйх Кі бек Суз Сех Біб Зврошає бЗеу вай г3е біж дак дай - За ще о 25 З вич ШИЯ яр. и Чиж Я ко ЖЕ ях : З ЖІ си НА ЛЮ Фу» ї рокх їх іт УВІ їбУух ТЕШ Жук Біпв Бій бю кс о Зіу ТБт дів бхо БУуй бле Гай "А їх КкTHIS 1 piz be UCHre3 Zhan be ple Bka) be zve Diya de schi pveorkaz ZVU p ziv bek Uvi fe TAK osiv Vko Ro Beh viv Beh 51 ZHE Rko ziU bid i Z iz ih vhoch Mai Tyh Kih bek Suz Seh Bib Vroshaes bZeu wai g3e go and give - For more at 25 Z vych SHIA yar. и Чиж Я ко ЖЕ ях : Z ЖИ si NA ЛЮ Fu» и rokh ih it UVI ibUuh TESH Zhuk Bipv Biy byu ks o Ziu TBt div bho BUuy ble Gai "A ih Kk

З ЕН ба тп Сад ЖК Ме Ку - вт і я т. реч зак щі Беж т сх ти ла їїе ТЕ ОАУ Авпо Бек АБаи дкса хо дЕК обі Уах Зта АяровкЕт Розв шех че ях, щіZ EN ba tp Garden Residential Complex Me Ku - tu i i t. rech zak shchi Bezh t sh ti la iyee TE OAU Avpo Bek ABai dxa ho dEK obi Uah Zta AyarovkEt Rozv sheh che yah, schi

ВО 55 ви ще печах чи ни уча чн у и р а А и и і Жак о пув Шах піу ТпжЖ бак о ліх Хек бе діа ї3є бек Щ1У По лЕд що жк че І 65 з та о соя СТЬ 5 я чат ж Лю сх т. со вич х ке р кер, М. з Ло дек осід зв бій біз ЗБЕ о ЖУХ Тук Суг Аза ТЕ ТК БВ дБ оБаЕ їжу 0 з дл а вн г. в ре же чл а НА ст, ЩЕ Я и ШІ оре лаву Тр Уві ле бі сту ші ТВ Ба Бей Тпж Уві дейVO 55 are you still a student? t. lavu Tr Uvi le bi stu shi TV Ba Bey Tpzh Uvi dey

КЕ пн шкKE Mon Shk

У й 1 пЕ ях й «210 ЗЕ «21ї» 1ї5 сеї» БЕЖ ситу лу рили прути де ху хі Ноя явравтя кап» та теля ід ЕТ шо Жоккх са кв Ми лу У ли її пт ни пд як пом отаї пів Сез їжа Зім Зес Зьу ін із іш уві сій Бо щі зу : с чл хе ї їх 15 Ах пн ни и а и пи в и в и и А ЧО пост НегяU y 1 pE yah y "210 ZE "21st" 1st 5 sei" BEJ satu lu ryli pruty de hu hi Noya yavravtya kap" ta telya id ET sho Jokkh sa kv My lu U ly her pt ni pd as pom otai half Sez food Zim Zes Zyu in iz ish in sii Bo shchi zu : s chl he i ih 15 Ah pn ni i a i pi v i v i i A CHO post Negya

Зак їі йо їжи Бек Сув Аза із Зет 0іу ЕВ о трЕх Блз Берк ве тує дк зі ли що 25 т. сле лік хх ш- бПичим ЖЖ дрож п па ее сти точне зу тоді Кл роту а спі Мет іш ТЕВБ Уа лк СВ Ліз ЖЕО Зі Бу пу БББоіЯ ТЕ ОУаІ -Е Ут вхZak ii yo eat Bek Suv Aza from Zet 0iu EV o trEh Blaz Burke vet tue dk z li what 25 t. sle lik xx sh- bPychim ЖЖ drosh p pa ee sti exact zu then Kl rotu a spi Met ish TEVB Ualk SV Liz ZEO Z Bu pu BBBoiIA TE OUaI -E Ut vh

ЗУ 35 і Тема ТІ Шин ПЗ т пт с. Тбуж Ух де Зеже ул кю Сеня МАZU 35 and Topic TI Shin PZ t pt p. Tbuzh Uh de Zezhe ul kyu Senya MA

Віа без ЇХіе Бех рре Ар ліу бах Буш Таж Аз отТеж біт піу Рхо Заї ж хх п'я що ВО а біп сіу Аку Рпе Тік І1їе бет Агуд АБвр АБп бек Сід Азп ТБПх Гей Туг 65 70 75 80Via bez YHie Beh rre Ar liu bah Bush Tazh Az otTezh bit piu Rho Zai zh xx p'ya what VO a bip siu Aku Rpe Tik I1ie bet Agud ABvr ABp bek Sid Azp TBPh Gay Tug 65 70 75 80

Пец біп Меє Авп обег ІТец Агу Аза бій Азр ТБї А1їа Уаї Тух Тугк Сув 85 30 35Petz beep Mee Avp obeg ITets Agu Aza bij Azr TBi A1ia Uai Tukh Tugk Suv 85 30 35

ТБг Акуд с1іу Аза Рбе А5р ї11в Тгр біу Сіп Сб1іу Тпг Гей Уа1 ТПг Уаї 100 105 110 «2105 73 «211» 109 «2125 БІЛОК «2135 Ното 5аріепв «4005 73 сіп бек Маі1і ТїТецш ТБх б1іп Рко Рго бехг А1їа бек біу Тс Рго біу біп 1 5 10 15TBg Akud s1iu Aza Rbe A5r і11v Tgr biu Sip Sb1iu Tpg Gay Ua1 TPg Uai 100 105 110 «2105 73 «211» 109 «2125 BILOK «2135 Noto 5ariepv «4005 73 sip bek Mai1i TiTebek Rgo beg TBh b1ip Rko 1 Rgo biu beep 1 5 10 15

Ак Уа1ї Три І1е бек Суз бек сіу бек бек Бех АБп ої11е сіу бек АвпAk Ua1i Tri I1e bek Suz bek siu bek bek Beh ABp oi11e siu bek Avp

Тук Уа1і Тухк Тгр Туг Сіп біп Гецш Рго Сіу Тайг АТа Рго був Гей тейTuk Ua1i Tukhk Tgr Tug Sip bip Getsch Rgo Siu Taig ATa Rgo was Gay tey

І1Те Тук Азр Ап Авзп Гуз Акд Ркго бек С1іу Уа! Рго Авр Акту РБе 5екг зо з5 1219) с1у бек Був бек біу Тпг бБег Аза Бек Гей Аїа І1е Бех б1у Гец Акд 65 70 75 8о0I1Te Tuk Azr Ap Avzp Guz Akd Rkgo bek S1iu Ua! Rgo Avr Aktu RBe 5ekg zo z5 1219) s1u bek Buv bek biu Tpg bBeg Aza Bek Gay Aia I1e Beh b1u Gets Akd 65 70 75 8o0

Зек бі Авр бі Аза Ар Тук Тук Сув А1їа А1їа Тгр Авр Азр бек Тецй 85 90 95Zek bi Avr bi Aza Ar Tuk Tuk Suv A1ia A1ia Tgr Avr Azr bek Tetsy 85 90 95

ТПув Рго Уаі1і Рпе СсСі1іу бі1іу сіу ТБг Гуз Гей Тік Уа1ї Гей 100 105 «2105 74 «211» 115 «212» БІЛОК «213» Ното в5арієпв «4005 74 .TPuv Rgo Uai1i Rpe SsSi1iu bi1iu siu TBg Guz Gay Tick Ua1yi Gay 100 105 "2105 74 "211" 115 "212" BILOK "213" Noto v5ariepv "4005 74 .

Сі Уаї біп Ге о леп бій бек б1іу біу біу Пец Уаі Сіп Рго б1у С1Уу 1 З 10 15 бЗег Гец Акд Гей бек Сув Аза Аза бек С1у Рбе ТПт Рпе бек Авп ТУуг 20 25 30 біу Меє Ніє Ттгр Маі Акд піп Аїа Рго с1у Пу5 б1іу тей бій Ттгр Уаї 35 40 45 зек Пец Ії бек Тгр Азр сіу Сіу Агд Тік бех Тух Трс АБр бек Уа1 50 зБ бо пу біу Акад Рпе ТпПг о І1е бек Агуд Ар Авп бег цЦув Авп ТЕ Гей Тухг 65 70 75 ВоSi Uai bip Ge o lep bii bek b1iu biu biu Pec Uai Sip Rgo b1u S1Uu 1 Z 10 15 bZeg Gets Akd Hey bek Suv Aza Aza bek S1u Rbe TPt Rpe bek Avp TUug 20 25 30 biu Mee Nie Ttgr Mai Akd pip Aia Rgo s1u Pu5 b1iu tey bij Ttgr Uai 35 40 45 zek Pec Ii bek Tgr Azr siu Siu Agd Tik beh Tukh Trs ABr bek Ua1 50 zB bo pu biu Akad Rpe TpPg o I1e bek Agud Ar Avp beg tsTsuv Avp TE Gay Tukhg 65 70 75 Vo

Тєї біп Ме Авп бек Пец Акуд Аза біц Авр Тк о АТа уа1ї Туг Тук Сув 85 90 95Tei bip Me Avp bek Petz Akud Aza bitz Avr Tk o ATa ua1i Tug Tuk Suv 85 90 95

А1а Акд с1іу Бей І1е С1у Авр АБп Тгр о Сіу біп С1іу ТБх Пец Уа1ї Таг 100 105 110A1a Akd s1iu Bay I1e S1u Avr ABp Tgr o Siu bip S1iu TBh Pec Ua1i Tag 100 105 110

Уаї бек бек 115 «2105 175 «2115 111 «2125 ВІЛОК «2135 Ното заріепв «4005 75Uai back back 115 "2105 175 "2115 111 "2125 FORK "2135 Noto zariepv "4005 75

С1іп Бек Уаї лей Трг о Сіп Рко Рко бек А1їа б5ег б1у ТПк Рго с1у Сіп 1 5 10 15S1ip Bek Uai ley Trg o Sip Rko Rko bek A1ia b5eg b1u TPk Rgo s1u Sip 1 5 10 15

Ак Уаї ТтТпг о Т1є Бек Сув ТтіПтІ Сіу бех бек бБег АБп ІЗїе біу Аза с1УуAk Uai TtTpg o T1e Bek Suv TtiPtI Siu beh bek bBeg ABp IZie biu Aza s1Uu

Тук Авр МУМаії Нів Ткр Тух Сіп біп ей Ркго біу ТПпк А1їа Рго Гуз ГейTuk Avr MUMaiii Niv Tkr Tukh Sip bip ey Rkgo biu TPpk A1ia Rgo Guz Gay

Тез Іїе Тук АБр Азп Авп Туз Аку Рго бЗеї біу Уаі Рко Азр Ах Рпе зо 55 бо бБех сіу бек Тув бБеї біу ТПї бек А1їа бБег Гей Віа ІчІ1е бех біу Гех 65 70 15 воTez Iie Tuk ABr Azp Avp Tuz Aku Rgo bZei biu Uai Rko Azr Ah Rpe zo 55 bo bBeh siu bek Tuv bBei biu TPi bek A1ia bBeg Gay Via IchI1e beh biu Geh 65 70 15 vo

Агу бек бій Авр бій Азїа Авр о Тух Тут Суз Аїа Ата Тгр Авр Авр 5ег 85 90 95Agu bek bij Avr bij Asia Avr o Tukh Tut Suz Aia Ata Tgr Avr Avr 5eg 85 90 95

Пец Авп о біу Тгр Уаі1і Рпе сіу біу сС1у Тк Ппув Пе ТбкгоУа1! Бей 100 105 110 «2105 76 й «211» 384 «2125 ДНК «2135 Ното зарієпв «4005 76 асдаауссас адасссасує сттсуграєстє стассосест осоєоєсіоу єдсссаєсо9о 60 звесастсктчсчв соасслвавое соссавеисє печсткакаи чтвосазвтача салат 1258 вЕзазстасв аочесвоцксв з скової забоавоєза сечо оОосв Зсадавуєтя І5О гир - сн г гір у но дих і ка и и и ННЯ я ху сцасеуїсво сказвсхеек свтіасвисої дсзуссвисо ссзїзсаскчо вБссосковЕ ай пу «нимиї гра тт визечухх ки Уч и НН ин зи шашсксвска дсзстсодвка копосзоолаб бссасктвся ссзтсазовВо соб овощих 320 даецассізча сазбукаєте сктосезова чаксвЕвесі сЕсоцпвоЗії сода 3 зссваостпа заватсвгазод час ЗЕ «вїі0ж 77 7 «ії» 335 я чит «жів ПЕ гер З х : кій Пошже здвівах как т аклтавиксса дастсавиці азс оКе ЧеосстідЕкЕк Кзавмачеко созепоиво що деучучотийж вих отут ри сур вуж ди ке ові рити же им ж ух ик дх дих чл пктопачсесУ Кордазкскчс сспабаспко чеасавосякО сасчачцтссой падає 125Pec Avp o biu Tgr Uai1i Rpe siu biu sS1u Tk Ppuv Pe TbkgoUa1! Бей 100 105 110 «2105 76 й «211» 384 «2125 ДНК «2135 Ното зарієпв «4005 76 асдаауссас адасссасує сттсуграєстє стассосест осоєоєсіоу єдсссаєсо9о 60 звесастсктчсчв соасслвавое соссавеисє печсткакаи чтвосазвтача салат 1258 вЕзазстасв аочесвоцксв з скової забоавоєза сечо оОосв Зсадавуєтя І5О гир - сн г гір у но дих і ка и и и ННЯ я ху сцасеуїсво сказвсхеек свтіасвисої дсзуссвисо ссзїзсаскчо вБссосковЕ ай пу «нимиї гра тт визечухх ки Уч и НН ин зи шашсксвска дсзстсодвка копосзоолаб бссасктвся ссзтсазовВо соб овощих 320 даецассізча сазбукаєте сктосезова чаксвЕвесі сЕсоцпвоЗії сода 3 зссваостпа заватсвгазод час ЗЕ « віі0ж 77 7 "иі" 335 I read "lived PE ger Z x: kiy Pozhje zdvivah kak t akltavikssa dastsavitsy azs oKe CheosstidEkEk Kzavmacheko sozepoivo that deuchuchotiyj vyh otut ry sur uzh di ke ovi ryti same uh ik dh dih chl pktopachsesU Kordazkskchs sspabaspko cheasavosiakO saschachtssoi falls 125

Косово сподзстсцче шККсацееЕ ЕКЕусплпваєце віза оВ саден іо зазавзусасо боЗаЗс оч: сзсвсвсвЕх зЗзсаатаоса поаовосах ствоївиоов 245 шк тич ща в. - о АНЯ ек їй Жотчих дфритше у сс Моя чи вує пар и ие НН цасасадєсса зачасстваси сзвсоссабобсос заадазсавсо спозвсайасво соц ссіа ЗО севзідавссва Чрсбваонооз сззазасвсос доСаехЗсзе: зоссоагутаза зхсосзодаои ко п нн и вена а а п о п п я пт зЗвскасепто чксазповаєс скевшеевксов збсесбостсе п «ій ТЕ - «311: 387 тлума тих «ші дик зар схжйате сиру се «ії» Ново зле епя таж ЗЕ зізвзаеноз зедЕтовчах пссЗзуацсео сопос3ссо зчагассвУч бососаася Б пен ин і ж чи нн пр па п ин сухий дих ла чеакфиснаса паасопадис поесвестову сксзееосак стсстчуцавзча вастактасе 12 се м каочх мурема цик мії хи им муз мг до и у п и їі й схзаїгкора зермадовна заасаптібви дазгависац сестзазкакся воуазаааассї Мо сечо сю у о ик що що срок де фронт уче ще лях ден я шов уче пр зліжечи й Ком чи се М ери ит ил чисзаввска збаасотшстї баксовстсЄ додав совссї БесзессссЗЗ ваваошсопасий ай с. єв яр ик дв я й кт су Моск ит Кок оди схо чут ог т ий зу ШОН вочІговота зсезстаЧавс сзчосасезв Ктсзошетса псазхсвасес ссодовох ди чзаззвіпісо свахлчс:всра стоксвасва освовзасшеск восссукбаєзе зебра ЗБ ропдраащащаєащарда анна чан поча о и пи ву я ах подасовачо Епуаавоваа ВМРЕ З «ЕКОк ТВ ей щ «ії» чп5 «тій ДИиК «г13з Нове ззшієва руч «апа» 5 с Арх фон и Кф де учи с я ок уж оилвулю Як ях сміх и дю дн сей у, туф их и аіцецнвохоє Зв естЕ Зк дсзпссевіо сеолувеслх айс 6 садссєсадоа адссудаасс сдосссодссо ааоссєсссс адсссссдес ссеісассодс 120 аседеЕсассд дстасссаає сассадедає сасдсстудуда аседодаєсся дсадеЕвссса 180 дугаасагас Содадсддчає ддоастасаєа адессасадід дсадрасстадч срасаассса 240Kosovo spodzstscche shKKsaceeE EKEusplpvaece visa oV saden io zazazzusaso boZaZs och: szsvsvsvEh zZzsaataosa poaovosah stovyivoov 245 shk tych shcha v. - o ANYA ek her Zhotchikh dfritshe u ss My chi vuye par i ie NN kasasasadessa zachastvasya szvsossasabobsos zaadazsavso spozvsayasvo soc ssia ZO sevzidavssva Chrsbvaonooz szzazassvsos doSaehZsze: zossoagutaza zhsoszodaoi ko p nn i vena a a p o p p ia pt zZvskasepto chksazpovaye zbost svevshe ii TE - "311: 387 tluma tih "shi dyk zar skhzyate siru se "ii" Novo zle epyatage ZE zizvzaenoz zedEtovchah pssSzuacseo sopos3sso zchagassvUch bososaasya B pen in i zh chin nn pr pa p in dry breath la cheakfisnasa paasopadis poesvestovu skszeeosak stsstchutsavzcha vastaktase 12 se m kaochh murema tsik miyhi im muz mg do i u p i ii y skhzaigkora zermadovna zaasaptibvy dazgavysat sestzazkaksya vouazaaaassi Mo secho syu u o ik what what term de front uche still lyakh day I shov uche pr lying down and Kom chi se M ery it il chyszavvska zbaasotshsti baksovstsE added sovssi BeszesssZZ vavaoshsopasyy ay s. ev yar ik dv i kt su Mosk it Kok ody scho chut og t y zu SHON vochIgovota zsezstaChavs szchosasezv Ktszoshetsa psazhsvases ssodovoh di chzazzzvipiso svahlchs:vsra stoksvasva ovovzasshesk vosssukbayeze zebra ЗB ropdraashashchaeasharda anna chan pocha o i pi vu i ah podasova VRE Mua Zavova " EKOK TV ey sh "ii" chp5 "tiy DYiK "g13z Nove zzshieva ruch "apa" 5 s Arkh fon i Kf de uchy s i ok uzih oilvulyu How yah smih i du dn sei u, tuf ih i aitscnvohoye Zv estE Zk dszpssevio seoluveslh ays 6 sadssesadoa adssudaass sdosssodsso aaossessss adsssssdes sseisasssods 120 asedeEsssd dstasssaae sssadedaye sasdsstududa asedodayessya dsadeEvsssa 180 dugaasagas Sodadsddchae ddoastasaea adessasadid dsadrasstadch srasaasssa 240

ЄсЕСссаааа дісдааєстс бсаєсасесда дасасаєсса адаассадеє сессссцдсад 300YesESssaaaa disdaayests bsayesasesda dasasayessa adaassadee sessscdsad 300

СсСоаасссстя соассассда ддасасаусс асасассссс дгдсаачада ссасодссас З6о0SsSoaasssstya soassassda ddasasauss asasasssss dgdsaachada ssasodssas Z6o0

ЧеЕсЕЕссасі ассоддудсеса аддсассаст стсасадеЕст ссіса 405 «2105 80 «211» 399 «212» ДНК «2135 Ношто зарівпе5 «4005 80 асддадасад асасассссс десасудоса стодссдсссс додуєЕсСссадаа сессаседаєе 6о часассдеЕдс єдасасадеіс ссседссссс ггадссдсає сеЕстддддса додадссасс 120 аєссесасуса доддссадсаа ааусдссаус асасседдссу абасссасає чсассдостас 180 саасадааас саддасадсс асссааассіс сеісаєстаєс сгдсаєссява сстадааєсе 240 чдаддасссстід ссадуєєссауд сСадсачсодду сСсебоддасад асессассостї саасаєссає 300 ссеЕссодаду аздсадчаєдус Сдсаассстає тасідссадс асадеуддоддда ссссссессс 360ЧеЕсЕЕссасі ассоддудсеса аддсассаст стсасадеЕст ссіса 405 «2105 80 «211» 399 «212» ДНК «2135 Ношто зарівпе5 «4005 80 асддадасад асасассссс десасудоса стодссдсссс додуєЕсСссадаа сессаседаєе 6о часассдеЕдс єдасасадеіс ссседссссс ггадссдсає сеЕстддддса додадссасс 120 аєссесасуса доддссадсаа ааусдссаус асасседдссу абасссасає чсассдостас 180 саасадааас саддасадсс асссааассіс сеісаєстаєс сгдсаєссява sstadaayese 240 chdaddasssstid ssadueessaud sSadsachsoddu sSseboddasad asessassosty saasaessaye 300 sseEssodadu azdsadchaedus Sdsaassstae tasidssads asadeuddoddda sssssessss 360

Есаєссодад додадассаа дсгдчЧчаааса ааасдадсс 399 «2105 81 «2115 429 «2125 ДНК «213» Бото зарієпв «4005 ві аєчаассєсу доасеЕСадсеє чаєссссссс дсссссацєсс саааадччєдчЕ ссачЕЧЧсдад 60 чзедсадстод єЯададсстод досадассса дсдаадссстд дачосссссії дчавасссссс 120 к9сдсадссе ссодудаєссас ссссадсадс басдодсаєде сссдучєєсу ссадасесса 180 часаачадос создачсдодс соосаассуєс адсадусучвєд осбасссасас стастаєсса 240 часадсдсда адоддудсудаєе сассаєсссс васадасавасуд ссаазаучадсас ссеосассвд Зоо сааахєдудадса дісідаадчіс сгдаудассса соссаєдбрассї астсасдсаау асасадодода 360 аастассаєд стаствєаєта стаєасьеаєу дасврассдда доссааддаас сесадессасс 2420 аЕСссСсісо 429 «-2105» 82 «211» 108 «212» БІЛОК «213» Ното Барієп5 . «400» 82 жо хе кН що що бренх, Ж кує У Жозе Ж че по то ех хіє Ув) Кеї ТЕХ біз Їх о Бжо Пцуш ре їв зво таі бег віз Шу дк же мих Фе т п зі бар піша тьмі 41 «ще панове акр йкс Мах тТнг їі ТВу Су бух Віз Бех бій щі» Уві бек й ДЕ «вк зе :Есаєссодад додадассаа дсгдчЧчаааса ааасдадсс 399 «2105 81 «2115 429 «2125 ДНК «213» Бото зарієпв «4005 ві аєчаассєсу доасеЕСадсеє чаєссссссс дсссссацєсс саааадччєдчЕ ссачЕЧЧсдад 60 чзедсадстод єЯададсстод досадассса дсдаадссстд дачосссссії дчавасссссс 120 к9сдсадссе ссодудаєссас ссссадсадс басдодсаєде сссдучєєсу ссадасесса 180 часаачадос создачсдодс соосаассуєс адсадусучвєд осбасссасас стастаєсса 240 часадсдсда адоддудсудаєе сассаєсссс васадасавасуд ссаазаучадсас ссеосассвд Зоо сааахєдудадса дісідаадчіс сгдаудассса соссаєдбрассї астсасдсаау асасадодода 360 аастассаєд стаствєаєта стаєасьеаєу дасврассдда доссааддаас сесадессасс 2420 аЕСссСсісо 429 «-2105» 82 «211» 108 «212» БІЛОК «213» Ното Барієп5 . "400" 82 жо хе кН что что бренх, Ж куе У Жозе Ж che po to eh хіе Uv) Kei TEH biz Their o Bjo Ptsush re yiv zvo tai beg viz Shu dk ze myh Fe t p zi bar pisha tmi 41 "more Messrs. Akr yks Mah tTng yii TVu Su buh Wiz Beh biy shchi" Uvi bek y DE "vk ze:

КУН ей за хі в лих Же п я ях Піх іван «о Бер їн тів чі вів ТІВ Бе ба біп був Бго жі лав о деж БжЖо Муж бев оляем Хі - г БKUN ey za hi v lyh Zhe p ia yah Pih ivan "o Ber yn tiv chi viv TIV Be ba bip was God zhi lav o dezh BzhZho Muzh bev oleam Hi - g B

ЗБ 40 35 паз бут т ен ее а се ОВ У В пт че ож: МИХ еВЗB 40 35 paz but t en ee a se OV U V pt che ozh: MYH eV

ТУух йех Зіа пек ЖБх бо ТМмк ТОЖ о Сьу Чаї БЕЗ А о Ако Мо їй осіх ще ве вTUuh yeh Zia pek ZHBh bo TMmk TOZ about Xu Chai WITHOUT A about Ako Mo her osih still ve in

В БО бе Кия стікчн ті поля СД, Фі у для я о тт жі ееIn BO be Kiya stikkhn ti field SD, Fi y for i o ttzhi ee

Чек біУ Ту зі Так ово гОПе ТИХ Рі Так о їзе дам о ТБХх Чві пп о АЗВ ще - -к щChek biU Tu z So ovo hOPE TIKH Ri So about food ladies about TBHh Chvi pp about AZV more - -k sh

БЕ ТВ їх Во п Хе бок й щш вдо ох ткуке Ж п М Пехуя кое Ше жеBE TV them Vo p He bok y shsh wdo oh tkuke Ш p M Pehuya koe She same

Ам ба о Бец! база чаї ТУХ гла Су Пій сій дво ТУЮ ТБх Шек БЖо ТБЕ ще ща 5 акне о и шок ке Шк пт х їня обр, 4Am ba o Betz! tea base TUH gla Su Pii siy two TUYU TBh Shek BZho TBE still scha 5 acne o i shock ke Shk pt h yinya abr, 4

Епе піт бі щіу Так б Бем бій: Т3іе Зув Ахя Вів зи 5Epe pit bi shiu Tak b Bem biy: T3ie Zuv Ahya Viv zi 5

МО 105 т З «їз» ца «гії» 354 іх БІЛЮОК проергци чия «33» Нющею варів «оз 85 жк Утиліта Саву 021 и сті З, Ти кі т Фкноє ті» дво уві Ав фбем чаї Зі бек пів спіу Бі йец Уві бій Бто пі біхж 1 З 15 15 ре и ее в а ка КН В КИ а а ст м НВ о НН шек ДЕ МУ їв пек Су Діва діз Беж ЗіІМ ЕН діз Ба о бел Бет Бае й -к 2MO 105 t Z "iz" tsa "gii" 354 ih BILUOK proergtsi whose "33" Nyushcheyu brewed "oz 85 zhk Utilita Savu 021 i sti Z, Ty ki t Fknoye ti" two in Av fbem chai Zi bek piv spiu Bi yets Uvi bij Bto pi bihzh 1 Z 15 15 re i ee v a ka KN V KI a a st m NV o NN shek DE MU yiv pek Su Diva diz Bej ZiIM EN diz Ba o bel Bet Bae y -k 2

М 25 зо 2 ло Ву пПпіє Тел баЗі йде пів 15 бе Тина бл Там 1 тат вM 25 zo 2 lo Vu pppie Tel baZi goes half 15 be Tina bl There 1 tat in

Зіу Ме пів Тквр саї дтя йпіа 13 та піз був сіу а сіб Ткр ЗЕ3 5 хх «, 5 4с яхZiu Me piv Tkvr sai dtya ypia 13 ta piz was siu a sib Tkr ZE3 5 xx «, 5 4s yah

Ме а се ШИ . ло ах Сич сл их Сокол ка годи Ба - маку щ Оп час діа тТужх Тіє Ббвж бЗег пі БОБ Жар ТБ і4зе Тує Тк Аза АвШОТЖАК чаї : пе ща 9 пай щеMe a se SHY. lo ah Sich slih Sokol ka gody Ba - maku sh Op chas dia tTuzhh Tiie Bbvj bZeg pi BOB Zhar TB i4ze Tuye Tk Aza AvSHOTZHAK chai : pe shcha 9 pay more

Х ах Хе ря рук шо Кл Фо - Хо бро жо сх Му Жов гаH ah Khe rya ruk sho Kl Fo - Ho bro jo sh Mu Zhov ha

Муш залу йхч БНе Так їі ес дк Ав Ба овто був два ОоТВХ без Єва ся ШО іх що 5 ТО 5 Ве тошіх бл Мк ж ню Сен ки зх бак М їй «ка сю і ма чи є фуMush zalu yhch BNe So ii es dk Av Ba ovto was two OoTVH without Eva sia SHO ih that 5 TO 5 Ve toshih bl Mk zh nyu Sen ky zh bak M her "ka syu and ma or is fu

Шев Су Меб Тк бек ієкх Ако бек оЗів Вр о їве Аза Мет тук ТУЮ СукShev Su Meb Tk bek yekh Ako bek oZiv Vr o yeve Aza Met tuk TUYU Suk

Моно чи ще ях я щеMono or still yah I still

Чаї Ак бек піФ йо йвроїТУЄ ТЕБ Бі біп пів тех дек Уді ТБк уді «отут тв 4 за 1025 116Chai Ak bek piF yo ivroiTUE TEB Bi bip piv teh dec Udi TBk udi "here tv 4 for 1025 116

Жах беTerrible

«210» 84 «211» 109 «2125 БІЛОК «213» Ното 5аріепе «4005 84"210" 84 "211" 109 "2125 BILOK "213" Noto 5ariepe "4005 84

Авр Уаї біп І1е ТПпх біп Бех Рго бек Тук Тецп АТїа Аза бек Рко С1у 1 5 10 15 бі Тпх Т1е ТйкК Пец Авп о Сув Акд АТїа бег Був Ап ої11е Тух Пув Туг зоAvr Uai bip I1e TPph bip Beh Rgo bek Tuk Tecp ATia Aza bek Rko S1u 1 5 10 15 bi Tph T1e TikK Pec Avp o Suv Akd ATia beg Buv Ap oi11e Tukh Puv Tug zo

Бей А1їа Тер Тук сій бій Пув Рко сіу Пув Тпг Авп Авп Бей Бпец ТіBey A1ia Ter Tuk siy bij Puv Rko siu Puv Tpg Avp Avp Bey Bpec Ti

Тух бек б1у Бег Тапг Пецй Нівз бек бСіу І1е Рго бег Агу Рпе бБег С1у 60Tukh bek b1u Beg Tapg Pecy Nivz bek bSiu I1e Rgo beg Agu Rpe bBeg S1u 60

Зек біу Бек б1іу Тпг Авр Рпе ТП Гей ТБІ І1е бег 5Зег Гей Авр Рго 65 70 75 во біц Азр Рре Аза Мес Туг Туг Сув б1п сС1п Ні Авп о АБр Тух Рко Туг 85 30 95Zek biu Bek b1iu Tpg Avr Rpe TP Gay TBI I1e beg 5Zeg Gay Avr Rgo 65 70 75 vo bis Azr Rre Aza Mes Tug Tug Suv b1p sS1p No Avp o ABr Tuh Rko Tug 85 30 95

ТПг Ре сіу Сіу б1іу Тйг Пув Тец бі ІТїе Гуз Ак9 А1а 100 105 «2105 985 «2115 117 «2122 БІЛОК «2135 Нопо заріепа: «4005 85TPg Re siu Siu b1iu Tig Puv Tec bi ITie Guz Ak9 A1a 100 105 "2105 985 "2115 117 "2122 PROTEIN "2135 Nopo zariepa: "4005 85

Азр Уаі біп Пецп б1п сій бек біу Рго С1у еп Уаі руб Рко бех біп 1 5 10 15 бек Пец бек Пеп Тк о Сув ТПг о УМаї Тс б1у Туг бег І1е Тс бек Азр 20 25 зоAzr Uai beep Pecp b1p siy bek biu Rgo S1u ep Uai rub Rko beh beep 1 5 10 15 bek Pec bek Pep Tk o Suv TPg o UMai Ts b1u Tug beg I1e Ts bek Azr 20 25 zo

Тухк А1ї1а Ткр Авп Тер Т1іе Агу б1п Ре Рго с1у АБп був Тез біц Тегр 35 40 45 мес Сіу Тух тТіе бБет Туг бек Сіу Бех Тпк б5ехк Тук Авп о Рхго Бех їей 0 55 60Tukhk A1i1a Tkr Avp Ter T1ie Agu b1p Re Rgo s1u ABp was Tez bis Tegr 35 40 45 mes Siu Tukh tTie bBet Tug bek Siu Beh Tpk b5ehk Tuk Avp o Rhgo Beh iey 0 55 60

МПув бег Аку ч11е бБег Іїе ТПг Агуд Авр ТБПкобек лЛув Азп біп Рпе Рпе 65 70 75 8о ока млн Ж я де «м ї зЕ- хи Й чх -- З що сб кру й де зкс зе ожій Бей блп БижЖ Заї Тк ТБІ ша бдав о жБхІ Аія ТБх жЖух Бе Су піз Ах засво Тук ЗКУ Тук чаї пе Алр оТух Тррозіу Бій біу ТЕ ТЕMPuv beg Aku ch11e bBeg Iie TPg Avr TBPkobek lLuv Azp bip Rpe Rpe 65 70 75 8o oka mln Zh i de «m i ze-hy Y chh -- From what sb kru y de zks ze ojij Bey blp BizhZ Zai Tk TBI sha bdav o zBhI Aiya TBh zZuh Be Su piz Ah zasvo Tuk ZKU Tuk chai pe Alr oTuh Trroziu Bii biu TE TE

Іпй 05 Мо їз ТЕ Уві) Жеху дет 1315 строп я «шій Ве «хі1їз 113 ста хе кеди «ях БІЛОК тт техн сли Я мая «ІМ йощо защрісойа «а0и» ВкIpy 05 Mo iz TE Uvi) Zhehu det 1315 strop i "shii Ve "hi1iz 113 sta he kedy "yah BILOK tt tehns sly I have "IM still zaschrisoya "a0y" Vk

Звротіз МВ) їз ТВт бі бах Бко Віа Шех Ббзи Аізв Уві бвжт о їжи біє й в й ск ії З 18 іZvrotiz MV) iz TVt bi bach Bko Via Sheh Bbzy Aizv Uvi bvzht o izhi biye y v y sk iiy Z 18 i

ЖК дл ІЗ пт п хна - Жук оце г й Ме о ШиZhK dl IZ pt p hna - Zhuk otse g y Me o Shi

БаАпошіуУ Аіа Тих жів бек Сув за Взв 5екр одчув Мак осві беж ТвЕ деЄ 28 5 9BaAposhiU Aia Tikh zhiv bek Suv for Vzv 5ekr felt Mak osvi bej Tve deE 28 5 9

М дк М ср 5; а жа є Злий те. г. зн КТ 3 з з вM dk M sr 5; but there is the Evil one. g. zn KT 3 z z v

БА тух їбйжх Тух Мет пів Тхо Тух зійп бУй Був РЕ о Зіу Бі КО ке ч8 45 зо 45 - їув ів ім Ів тТУух іні дів бак АвпоБен біс; баж бі Чі Бус дів у МВА Її ей 3 що ка бле Зех щі Бах піу Зек бі ТЕХ деб вйе ТЕ Пе) Ав о ті1є Ні ва о т5 оBA tuh yibyzhh Tuh Met piv Tho Tuh ziyp bUy Buv RE o Ziu Bi KO ke h8 45 zo 45 - iuuv iv im Iv tTUuh ini div bak AvpoBen bis; bazh bi Chi Bus div in MBA Her ey 3 that ka ble Zeh shchi Bach piu Zech bi TEH deb vye TE Pe) Av o ti1ye Ni wa o t5 o

Кко тва їі щам сі) Ан Алла Ака о тТвк от ТУуК Су 1 Ніз бек ойпхуKko tva ii sham si) An Alla Aka o tTvk ot TUuK Su 1 Niz bek oyphu

ЗЕ ща щаZE scha scha

СНИ хо У Сід бра бл аж її маше т нд нан НКИ Я тки от сії фа Бхо хо беж баба сіу сь БіУ ТВ о Бтш їж ій біб мух АКОSNY ho U Sid bra bl azh her mashe t nd nan NKY Ya tki ot sii fa Bho ho bej baba siu si BiU TV o Btsh izh iy bib muh AKO

ІН тих тійIN those that that

ІЙ 05 Ка х «жі» Я с Я ху «АХ ха «ій БЛОК хпій» ощюе здраштя «ах ву з х АНУ То шва ри Ха. ле ЕТ кн У пн ї- де сх са бів Уві віб меч Уві С3а Беж біу піу АБроБеє Уві пу Вхо сіє ПЗУ ї 5 за КЕИЙ 05 Ках "жи" Я s Я ху "АХ ха "ий BLOK хпий" oshchyue drashtya "ah vu z х ANU To shvara ry Ha. le ET kn U pn y-de sx sa biv Uvi vib mech Uvi S3a Bezh biu piu ABroBee Uvi pu Vho sie PZU i 5 for KE

Щех їз їв Без Бех Св дів Заї бек пбіу РНе ТЕХ рве беї бек ТехShcheh iz yiv Bez Beh Sv div Zai bek pbiu RNe TECH rve bei bey Tec

2 25 302 25 30

Тл,» Мав соду а т при я Оу кат - т яр бука Х о Брі тб ву бі Мес бех ТхроуУві асо сів ТВх Бка Аворобув Ака сво пін Тр оУві а я якTl» Had soda a t pri i Ou kat - t yar buka H o Bri tb vu bi Mes beh ThrouUvi aso siv TVh Bka Avorobuv Aka svo pin Tr oUvi a I how

Ка 3 5 і; що Ві Вин Ж 1 у с Муки п баки Мур Му Тех тв тKa 3 5 and; that Vi Vin J 1 u s Muki p baki Mur Mu Teh tv t

Аза Тье о саї бек бех Б1у іх ТЕ ОЛЖУХ Так о ТтТУує Ту Вго дев Бех За пк с ря мя Кер Ох ня ГУ ДК рі тету Фо боту сою Кут віх т Я зок енняAza Tye o sai bek beh B1u ih TE OLZHUH So o TtTUue Tu Who dev Beh Za pk s rya mia Ker Oh nya GU DK ri tetu Fo botu soyu Kut vyh t I zok enye

Був віу ха Бйе аг тів дак о Акту Азор ов вів Бу5 вза ОТвхХ їв туєBuv viu ha Bye ag tiv dak o Aktu Azor ov viv Bu5 vza OTvhH iv tuye

БО 7 за зо ета - В а ЯН ах с пря пе туя й жд пк дж тя ів жі Меї Жак аж Без бува бак бій Ав Бе віз Меб тую Ту був пк З вх аб 95 й ой Ще мою В щока тає их АН 7 тру Зоя Повх сш се ЗНИК о яка єежя Мі БЕ сла АВ Ту ТУухХ ВІВ ТБІ ТуУуг Тук ТУує Вів ат Вир лот дих ля шо г 115 яз бух ло шт Та у сію би Ма тка У тв теBO 7 za zo eta - V a YAN ah s prya pet tuya y zhd pk j tya iv zhi Mei Jak azh Bez buba bak biy Av Be viz Meb tuyu Tu buk pk Z vh ab 95 y oi Still moyu V choka taye ih AN 7 tru Zoya Povh ssh se DISAPPEARED o yak yeezhya Mi BE sla AV Tu TUuhH VIV TBI TuUug Tuk TUuye Viv at Vir lot dih la sho g 115 yaz bukh lo sht Ta u siyu b Mat tka U tv te

Тук їТхб піу бій щіу ТЕ бек уві тп оУаї бек бек ла Е п 115 135 «зі в кА пе шт лях «дії Вії рих п-ї Ех казав БІЛОК ще ч Мине Р Я екз ся кхиїї Ново вавізпз хіпох 88 кора и НИ НІ тхреяє Єжи без Же В кодек У вх ни Же схожеTuk yThb piu bij shchiu TE bek uv tp oUai bek bek la E p 115 135 "from in kA pesht lyah "dii Vii ryh p-i Eh kaz BILOK still ch Mine R Ya ekz sia khiiii Novo vavizpz hipoh 88 kora i NI NO Threyaye Jerzy without the same In the codec In the ears, the same is similar

Аврвохів Уаї без ТЗжЕ біб Беє Ко Зврохех без біз Уві Хек Бей ооку - 2 й сеAvrvohiv Uai without TZzhE bib Beye Ko Zvroheh without biz Uvi Hek Bei ooku - 2nd se

А я 18 ж ви Ум фах СК Я их т З їх з-д Ж х- ода Ж - біз Аку Віа ТБжЖ бів АзпосСуз Му Вів бек Мув бак Уві йевх Тк Бах пре ек -к и Ки а іл т но лях ППежрує фена ряото пу: тк пкт Ту бу Га НИ ах Жено ДрнаянихA I 18 zh vi Um fah SK Ya ikh t Z ikh z-d Z h- oda Z - biz Aku Via TBzhZ biv AzposSuz Mu Viv bek Muv bak Uvi yevh Tk Bach pre ek -k y Ky a il t no lyah PPezhruye fena ryaoto pu: tk pkt Tu bu Ha NI ah Wife of the Drnayans

Зіч Тук ТНт Тук Меб Маз ТкроТук сів б3іп о пуз хо бі Бій Бо ЕхоZich Tuk TNt Tuk Meb Maz TcroTuk siv b3ip o puz ho bi Bii Bo Echo

ЗЕ 4 35 40 45 ї-о Є пох уз З ев Мк Тухо В хни ве ло СУ а ІН шк тк пух їм Бе Ті Тух де Вій шекК Вже; Зку щВіц шеЕжЕ блАт Угі ЕХО де а їх БОZE 4 35 40 45 i-o Ye poh uz Z ev Mk Tuho V hny velo SU a IN shk tk puh im Be Ti Tuh de Viy shekK Already; Zku shVits sheEzhE blAt Ugi ECHO where and their BO

Дати ПУ Є гі й. кота Ж оє й я То лутюк С" коло и в ШаDates PU Ye gi y. the cat J oye and I To lutyuk S" kolo i in Sha

Мед о рпе Зех Сі деї зі Зеї Піу Таж Аврора ЇХ іеб ТЛХ тів ЗЕ ох, та пк рMed o rpe Zeh Si dei z Zei Piu Tazh Aurora THEIR ieb TLH tiv ZE oh, ta pk r

С ій та воS ii and vo

Чі кт почи Й іл Мет бат КЕ с уже бака бе чу Мт уч Зах їх УзА Бій Аза пі йвроУаї йзфа ВХ ТуУк Тух Сув сів ЯЗ бе буChi kt pochi Y il Met bat KE s already baka be chu Mt uch Zah ih UzA Biy Aza pi yvroUai yzfa VH TuUk Tuh Suv siv YAZ be bu

Зо ЗFrom Z

Фе їм ки ше кс фа 1 жа 1 нує тло Її Сх тю тумех із БеЯ ко РКО й спе сі Ззфв осіб тах бує ев о бів тів Був «пт хх латFe im ky she ks fa 1 zha 1 nuye tlo Her Shtyu tumeh with BeYa ko RKO and spe si ZZfv persons tah buye ev o biv tiv Buv «pt xx lat

Керн ї1205 115 «вій» ЯЗ - - т віх 25Kern 1205 115 "vii" YAZ - - t vih 25

«212» БІЛОК «2135 Ното зарієпз ' «400» 89 біч УМаї біп Тец Уа1ї! Сі бек сіу с1у сС1у Тецш Уа1 б1іп Рго Сі1у С1у 1 З 10 15 бек ГПецп Ага Тїецп бек Сух Аза Уа1ї бек С1у Рпе ТПг Ріпе бЗег бек Туг сіу Меє бек Ткр Маї Акад біп Ата Рко сбі1у Пузв Агу Пец бій Тгр Уаї"212" BILOK "2135 Noto zariepz ' "400" 89 beach UMai bip Tets Ua1i! Si bek siu s1u s1u Tetzsh Ua1 b1ip Rgo Si1u S1u 1 Z 10 15 bek GPetsp Aga Tietsp bek Suh Aza Ua1i bek S1u Rpe TPg Ripe bZeg bek Tug siu Mee bek Tkr Mai Akad bip Ata Rko sbi1u Puzv Agu Pec bij Tgr Uai

А1їа ТпПх Уаі бек бек бі1іу б1іу ТПх Тук Тик Тук Тук Рго Авр бек Ма1 60A1ia TpPh Uai back back bi1iu b1iu TPh Tuk Tik Tuk Tuk Rgo Avr bek Ma1 60

Тув біу Ату Рпе ТБх І1е бек Аку Авр Авп бек Був Ап оТПК БТец Туг 65 70 75 воTuv biu Atu Rpe TBh I1e bek Aku Avr Avp bek Buv Ap oTPK BTec Tug 65 70 75 vo

Пец біп Меє Авп бек Тед Ака Ата Сі Авр Ту АтТа Меє Ту Тух Сув 85 30 35Pec beep Mee Avp bek Ted Aka Ata Si Avr Tu AtTa Mee Tu Tuh Suv 85 30 35

А1їа Акад Ні Аку б1у АвпоТуг Туг Азїа Тіт Тук Тух Тук Ала Меє Ар 100 195 110A1ia Akad Ni Aku b1u AvpoTug Tug Asia Tit Tuk Tuk Tuk Ala Mee Ar 100 195 110

Тук Тер біу біп сіу Тс о їец Уа! ТП Уаї бек бехг 115 120 «2105 980 «2115 124 «2125 БІЛОК . «2135 Ното варігпз «4002 90Tuk Ter biu biu biu siu Ts o yeets Ua! TP Uai bek behg 115 120 "2105 980 "2115 124 "2125 PROTEIN . "2135 Noto varigpz "4002 90

Сі Уаї біп Гец Уа1! Сі бек сС1іу біу б1у Пец Уа1і Сіп Рго Сбі1іу ШЩ1у 1 5 10 15 бЗех Тем Агуд Тер бБег Сув Аза Уа1і Бех с1іу Рпе ТіПх Рре Бек бетг Тукг 20 25 30 біу Меє бех Тгр Уаі Агу сіп Аза Рго 51у Гуз сіу Гей бій Тгр Уа1ї 35 40 45Si Wai beep Gets Ua1! Si bek sS1iu biu b1u Pec Ua1i Sip Rgo Sbi1iu ShSH1u 1 5 10 15 bZeh Tem Agud Ter bBeg Suv Aza Ua1i Beh s1iu Rpe TiPh Rre Bek betg Tukg 20 25 30 biu Mee beh Tgr Uai Agu sip Aza Rgo 51u Guz siu Hey biy Tgr Ua1i 35 40 45

АтТа тт о Уаі бєт бЗет о б5іу зіу Тит тут ТпІ-Тут- Рух Рго Авр-Зех- туаї- 50 З 60 пув біу Агуд Рбе Тк І1е бек Аку Авр Авп обег Пуз Авп Тиг Гей Туг 65 70 75 воAtTa tt o Uai bet bZet o b5iu ziu Tit tut TpI-Tut- Rukh Rgo Avr-Zeh- tuai- 50 Z 60 puv biu Agud Rbe Tk I1e bek Aku Avr Avp obeg Puz Avp Tig Hey Tug 65 70 75 vo

Тео біп Меє Авп обБег Пец Аку Аза біц Авр ТпПг Ага Уа1і Тух Туг Сув 85 90 35Theo beep Mee Avp obBeg Petc Aku Aza bitz Avr TpPg Aga Ua1i Tukh Tug Suv 85 90 35

А1а Аку Бібв Акуд сСіу АвпоТух Туг Аза ТагоТуг Тух Тук Аза Меє Ар 100 105 110A1a Aku Bibv Akud sSiu AvpoTuh Tug Aza TagoTug Tuh Tuk Aza Mee Ar 100 105 110

Тук Тгр сС1у біп СсСі1іу ТПпх Пес Уаіїії Тпг Уаї бБег 5ег 115 120 -2105 191 «2115 107 «212» БІЛОК «2135 Ношто заріепз «40025 11Tuk Tgr sS1u bip SsSi1iu TPph Pes Uaiiiii Tpg Uai bBeg 5eg 115 120 -2105 191 "2115 107 "212" PROTEIN "2135 Noshto zariepz "40025 11

Авр Уаї біп І1е Тр обіп бБег Рко бек бек Темп Бек Аїа Бех Рхго 01у 1 5 10 15Avr Uai bip I1e Tr obip bBeg Rko bek bek Temp Bek Aia Beh Rhgo 01u 1 5 10 15

Авр Агу Т1е ТБ Тео ТП о Сув Акд Аза бех Був Авп Т1е Тух Чув ТугAvr Agu T1e TB Teo TP o Suv Akd Aza beh Buv Avp T1e Tukh Chuv Tugh

Бец А1а Тер Тук біп б) Був Рко сту Був ТЬк АБп Авп оТец Тец І1еBec A1a Ter Tuk bip b) Was Rko Stu Was Tk ABp Avp oTec Tec I1e

Тук Бек біу Бек ТрПх Пей Нів бет бі1у І1е Рго бек Акуд Рпе бек с1Уу 6о бек сіу бек біу ТВг Азр Рпе тік Ге ТПг І1е бек бек Пец біп Рго 65 70 75 80 сід Азр Рпе Ала Меє Тук Тук Суз біп біп Нів Авп Авр Тук Рко Туг 85 90 35Tuk Bek biu Bek TrPh Pay Niv bet bi1u I1e Rgo bek Akud Rpe bek s1Uu 6o bek siu bek biu TVg Azr Rpe tik Ge TPg I1e bek bek Pec bip Rgo 65 70 75 80 sid Azr Rpe Ala Mee Tuk Tuk Suz bip Niv Avp Avr Tuk Rko Tug 85 90 35

ТПг Рпе блу Сбіп б1у Тпг Пув їеп Сіц чІ1е Гу 100 105 «210» 22 «2115 107 «212» БІЛОК «213» Нопо варіепв «400» 92TPg Rpe blu Sbip b1u Tpg Puv iep Sits chI1e Gu 100 105 "210" 22 "2115 107 "212" PROTEIN "213" Nopo variepv "400" 92

Ар Уа1ї б1іп Т1е ТК бСіп бег Рко бек Бех Тец бег А1їа бех Рго б1уУ 1 З 10 15Ar Ua1i b1ip T1e TK bSip beg Rko bek Beh Tets beg A1ia beh Rgo b1uU 1 Z 10 15

АБр Акад Іїе ТВх Те ТП о Сув Ага Аїа бБег Пув Авп о Ії1е Туї Був Тукг 20 25 30ABr Acad Iie TVh Te TP o Suv Aga Aia bBeg Puv Avp o Ii1e Tui Buv Tukg 20 25 30

Тец Аза Тгр Тух біп б1іп Пув Рго б1і1у Був А1їа АвпоБув Тем Гей 11е 35 40 15Tets Aza Tgr Tukh bip b1ip Puv Rgo b1i1u Buv A1ia AvpoBuv Tem Gay 11e 35 40 15

Тухк бек біу бек ТпПх Ге Нів бек З1у І1е Рко бег Акуд Ррбе бек С1у 50 55 боTukhk bek biu bek TpPh Ge Niv bek Z1u I1e Rko beg Akud Rrbe bek S1u 50 55 bo

Зек біу бБет С1у ТБйх Авр Рбе Трт лей ТЬх І1е бБет бек Гей Сіп Рго 65 70 15 80 б15 АБр Рпе Аза Мебс Тук Тух Сув 51п сС1іп Нів Авп АБр Тух Рхго Туг 85 30 25Zek biu bBet S1u TByh Avr Rbe Trt ley Tx I1e bBet back Gay Sip Rgo 65 70 15 80 b15 ABr Rpe Aza Mebs Tuk Tukh Suv 51p sС1ip Niv Avp ABr Tukh Rhgo Tug 85 30 25

Тіх Рпе біу біп с1іу Тк Пув їеєцй сій І1е Був 100 105 «210» 93 «2115 117 «212» БІЛОК «213» Ното зарієпь «4005 193Those Rpe biu biu bip s1iu Tk Puv yeeyetsy siy I1e Buv 100 105 "210" 93 "2115 117 "212" BILOK "213" Noto zariep "4005 193

Авр Ма1ї біп Гей сіп Сі Бек б1у Рго б1іу Пеп Уаї Пув Рго бек біп 1 5 10 15Avr Ma1i beep Gay sip Si Bek b1u Rgo b1iu Pep Uai Puv Rgo back beep 1 5 10 15

Тпг Ге бек Теп Тік о Сув ТБг о Уаї Тпк б1у Туг бек І1е Тік бек АхрTpg Ge back Tep Tic o Suv TBg o Uai Tpk b1u Tug back I1e Tic back Ahr

Тут Аїа Тгр Авп Тгр І1е Аку біп Рбе Рго сСіу Ппуз уз Гвц сі Тгр - 35 10 15Tut Aia Tgr Avp Tgr I1e Aku bip Rbe Rgo sSiu Ppuz uz Gvts si Tgr - 35 10 15

Ме сіу Тук І1е бек Тук Бех біу бек ТПг бек Тук Авп РхІо бек ГейMe siu Tuk I1e bek Tuk Beh biu bek TPg bek Tuk Avp RhIo bek Gay

І 6о0And 6o0

Пуз бек Акуд Іїе ТПх І1е бБег Акд Авр Ту Бек Пуз Азп біп Рпе бег 65 70 75 оPuz bek Akud Iie TPh I1e bBeg Akd Avr Tu Bek Puz Azp bip Rpe beg 65 70 75 o

Тїеч біп Гецш Авзп о беїх Уаі ТБг Аза Аїа АБр ТПх Аїа ТПг Тує РбБе Сувз 85 90 З5Tiech bip Getsch Avzp o beih Uai TBg Aza Aia ABr TPh Aia TPg Tuye RbBe Suvz 85 90 Z5

Аза Агуд Ар Туг с1іу Тук Уа1 Рпе Авр Туг Тгр б1іу сіп Сс1у ТпПх Торг 100 105 110Aza Agud Ar Tug s1iu Tuk Ua1 Rpe Avr Tug Tgr b1iu sip Ss1u TpPh Trade 100 105 110

Тео ТвВх Уаї Бек бек 115 «2105 154 «211» 117 ! «2125 БІЛОК «-213»5 Ношто зарієпз «400» 94 са їх й КН з ж мя лю ту печу Є ї плн я аж М зі Маї бів їх) біл зі Як щі» Зо піу Бен чаї уз РТ Жет бі1В ї а їб 15Teo TvVh Uai Bek bek 115 "2105 154 "211" 117 ! "2125 BILOK "-213"5 Noshto zariepz "400" 94 sa ikh and KN with the same milled furnace Ye i pln i as M zi Mai biv ikh) bil zi Yak shchi" Zo piu Ben chai uz RT Jet bi1V i a ate 15

Хр х Брала Ж ну зн о пи і ОН г. па тода бдучи ях ж Ух А ра пк лез бек кец таАгохХув ТП Уві Чек бі ТУух Бек Ті тах бак Аве за т зп «У шо ЯHr x Brala Z well zn o pi and ON g. pa then bduci yah z Uh A ra pk lez bek kets taAgohKhuv TP Uvi Chek bi TUuh Bek Ti tah bak Ave za t zp "U sho Ya

ТЕ Дав о Ткв дао ТІВ о ків Ах сід баз РКО бЬУ Був Зам Мем аха ЕВTE Dav o Tkw dao TIV o kiv Ah sid baz RKO bYU Was Zam Mem aha EV

КИ зеKI ze

Шеї біу їУук Жіе Зех ТУук Жак пі Бек ТБ Шех ТУкК вах Во бе Зх щу ще, сShei biu yiUuk Jie Zeh TUuk Jacques pi Bek TB Sheh TUkK wah Wo be Zh schu still, s

З - оZ - o

Зовжаю о бод ля СКЛ ие ах сою В ЗМтюжє ую Ж хіх Ве хх Ту ЖI'm tired o bod la SKL ie ah soyu V ZMtyuzhe uyu Х хих Ве хх Tu Х

Був Зах КЗ Кі ТП Тіз бБеу Ме дДею тТпЕ ЗК Був Зп Біб пе ахWas Zach KZ Ki TP Tiz bBeu Me dDeyu tTpE ZK Was Zp Bib pe ah

Ха Тк пт Пух бас я те вх Ж жопу фр З ух Ка часHa Tk pt Puh bas I te vh J ass fr Z uh Ka chas

Бе іп Тс дзий бек Уві ТБт діа лів аБро ТБ від Уві теє Рна сСхв й о 35 зів Вс: Ав о жук Зіу Жух Уві ри Явв о тухк Тїжо піу Зій БКу ле ОТтнЕ іжез ТвВЕ Уві Бек деє евBe ip Ts dziy bek Uvi TBt dial liv aBro TB from Uvi tee Rna sShv y o 35 ziv Sun: Av o zhuk Ziu Zhuh Uvi ry Yavv o tukhk Tizho piu Ziy BKu le OTtnE izhez TvVE Uvi Bek deye ev

НН) «ід» 55 «51ї1їз 145 «кій БЕНОКNN) "id" 55 "51i1iz 145 "kiy BENOK

Квеее Мих соці кує тА» НоФфо шаЗрівдх «пс 5 у не м НЕ А с. ок ВУ стю Же г шк Я хі 1-6 йKveee Myh soci kuye tA" NoFfo shaZrivdh "ps 5 u ne m NE A p. ok VU styu Zhe g shk I hi 1-6 y

Аве їіз Уві Мет ТБ обій Зак Бус Азробет їши Дів бві бех Дів даю 1 а 18 15 т ж реч нн не Я тує ЛЯ шо бази 2 ж ут ях 3 Шах Мих октAve yiiz Uvi Met TV obei Zak Bus Azrobet eat Div bvi beh Div dayu 1 a 18 15 same thing nn ne I tue LIA sho bazi 2 same ut yah 3 Shah Myh oct

Зіз дха Мві ТБж Тіз вза Сув ГУБ дів Шек пів Бі Маії Бех дай ВВ и 28 ке ї ї ІК Тр » хе Х Я ях бен в бр ми - ТМ ді ТІ чаї Вів Же Бе зіп о зіб б Бго біт біп Шек Рко був ій іТши Тів за 40 45Ziz dha Mvi TBzh Tiz vza Suv GUB div Shek piv Bi Maii Beh dai VV i 28 ke yi ik Tr » he X Ya yah ben v br my - TM di TI chai Viv Zhe Be zip o zib b Bho bit bip Shek Rko was iy iTshi Tiv for 40 45

Ж як я Фе егчх х корч я ск що я м де Я те ЯHow am I?

Тух Яеж Аів Хек Тйх Вта Тух Тахо Оз Зах бко Авр ото фе Щщеж зЗку бах 0ІЇУ Бех січ ТЬх дДвробБпе Так Ра ТБт їі бдех Как Маїі біп А1в ще - х вх « Ек; 75 що бів дно о Уві Аза Уві Тук Рпе Су плв осів Язо Туг Так о шежк Без ТлЕ 85 за чеTukh Yaezh Aiv Hek Tykh Vta Tukh Taho Oz Zah bko Avr oto fe Shshchezh zZku bach 0IIU Beh sich Tkh dDvrobBpe Tak Ra TBt yii bdeh Kak Maiii bip A1v still - х вх « Ek; 75 that beat the bottom about Uvi Aza Uvi Tuk Rpe Su plv osiv Yazo Tug Yes o shezhk Bez TlE 85 for che

Жтрсто ал 1 зах ба т гу стаз ил М Ж ожеZhtrsto al 1 zah ba t gu staz il M Zhozhe

Ввт бу Біб ЗАу Тв о Муж о фе ОБО БВ утVvt bu Bib ZAU Tv o Muzh o fe OBO BV tu

100 105 «2105 96 «2115 106 «212» БІЛОК «213» Ното заріепз «4005 96100 105 "2105 96 "2115 106 "212" PROTEIN "213" Noto zariepz "4005 96

Авзр І1іе Маї Меє ТНт сіп бех Рко Авр бек їец Аза Уа1ї бек Гви С1у 1 5 10 15 бій Агу Маї Трг ІчІ1е Авп о Суз Гуз А1їа бек біп Сі1іу Уа! бек АБп АзрAvzr I1ie Mai Mee TNt sip beh Rko Avr bek yets Aza Ua1i bek Gvy S1u 1 5 10 15 bij Agu Mai Trg IchI1e Avp o Suz Guz A1ia bek beep Si1iu Ua! back ABp Azr

Ууаї А1а Ткр Рпе Сіп Сіп пув Рхо С1іу біп Бек Рго Губ5 Тез Те І1еUuai A1a Tkr Rpe Sip Sip puv Rho S1iu bip Bek Rgo Gub5 Tez Te I1e

Тук Бек Аїа бек ТПг Агуд біц бек біу УМаї Рко Авр Агд Тецп бек О1Уу 60 бБех б1у Бек сіу ТПК АвБр Рпе ТПт Рібе ТБкК І1їе бек бек Уаї біп Аїа 65 70 75 8о0 біб Авр Уаї Аїа Уаї Ту Рбе Сув біп б1п Авр Тук Тк бек Рго ТПг 85 90 35Tuk Bek Aia bek TPg Agud bec bek biu UMai Rko Avr Agd Tecp bek O1Uu 60 bBeh b1u Bek siu TPK AvBr Rpe TPt Ribe TBkK I1ie bek bek Uai bip Aia 65 70 75 8o0 bib Avr Uai Aia Uai Tu Rbe Suv bip b1p Avr Tuk Tk back Rgo TPg 85 90 35

Рпе С1іу б1п б1у ТПг Ппуз Тїеч біц Т1е Гу 100 105 «-2105 97 «2115 114 «212» БІЛОК «213» Ното зарієпз «4005 97Rpe S1iu b1p b1u TPg Ppuz Tiech bis T1e Gu 100 105 "-2105 97 "2115 114 "212" BILOK "213" Noto zariepz "4005 97

Ар Уа1! Сіп Гец уаї бі бек с1у б1у б1іу реп Уаії б1іп Рго с1іу с1у 1 5 10 15 бег Акуд Акад Тецй бек Сув Аза Аза бек біу Рре А1їа Рпе бек бек Ріе 20 28 30 сіу Месє б1п Ткгр Уаі Агу с1п Аза Рго сбіу Пу5 б1у Гей бі Тгр Уаї 35 40 45Ar Ua1! Sip Gets wai bi bek s1u b1u b1iu rep Uaii b1ip Rgo s1iu s1u 1 5 10 15 beg Akud Akad Tetsy bek Suv Aza Aza bek biu Rre A1ia Rpe bek bek Rie 20 28 30 siu Mesie b1p Tkgr Uai Agu s1p Aza Rgo sbiu Pu5 b1u Gay bi Tgr Uai 35 40 45

А1а Тук І1е бек Бех біу Бек бек ТПг І1є Тук Туг Аіїа Азр ТПг Уаї 50 55 60A1a Tuk I1e bek Beh biu Bek bek TPg I1e Tuk Tug Aiia Azr TPg Uai 50 55 60

Туз біу Ага РіПе ТЬх І1їіе Бех Агд АБр АБп о Ркго Гуз Авп оТПг о Геч Туг 65 70 75 оTuz biu Aga RiPe Tkh I1iie Beh Agd ABr ABp o Rkgo Guz Avp oTPg o Gech Tug 65 70 75 o

Пец біп Мес Азп бек Гец Акуд Аза бі Азр Тпї Аїа Меб Туг Тук Суз 85 90 95Pec beep Mes Azp bek Gets Akud Aza bi Azr Tpi Aia Meb Tug Tuk Suz 85 90 95

Мма1ї Акуд бек б1у Аку Ар Тук Ткр б1у біп б1у ТБг Ге Ма! Трг Уаї 100 105 110Mma1i Akud bek b1u Aku Ar Tuk Tkr b1u beep b1u TBg Ge Ma! Uai Square 100 105 110

Зет б5ег «210» 98 «2115 114 «212» БІЛОК «213» Ното варієпв «41005 98 бій УМаї С1п Іеш Уа1 бід бБег б1у б1у б1іу Гец Уа1і біп Рко бі1у СсС1у 1 5 10 15Zet b5eg "210" 98 "2115 114 "212" BILOK "213" Noto variepv "41005 98 bij UMai S1p Iesh Ua1 bid bBeg b1u b1u b1iu Gets Ua1i bip Rko bi1u SsS1u 1 5 10 15

Зек Агкд Акуд теп бек Су5 А1З1а Аїа бек СсС1у Рпе Аїа Рре бек бек РБПеZek Agkd Akud tep bek Su5 A1Z1a Aia bek SsS1u Rpe Aia Rre bek bek RBPe

Сіу Меє сіп Тгр Уа! Агд сіп Аза Рко Сс1у Пув С1у Бе сій Ткр Уа1Siu Mee sip Tgr Ua! Agd sip Aza Rko Ss1u Puv S1u Be siy Tkr Ua1

А1тїа Тук Іїе Бек бЗехг б1іу бек бек ТВх І1е Туг Тух Аїа Авр бек Уаї боA1tia Tuk Iie Bek bZehg b1iu bek bek TVh I1e Tug Tukh Aia Avr bek Uai bo

Був бі1іу Акуд Рпе ТПг оІ1е Бек Агу Авр Авп Рко Буз Азп оТпг оТей Туг 65 70 15 воWas bi1iu Akud Rpe TPg oI1e Bek Agu Avr Avp Rko Buz Azp oTpg oTey Tug 65 70 15 vo

Кей біп Месб Азп о бек їец Аку Аза бід Азр Тпг Аза Маї Тук Тук Сув 85 90 95Key beep Mesb Azp o bek yeets Aku Aza bid Azr Tpg Aza Mai Tuk Tuk Suv 85 90 95

Уаї Акуд бек бсіу Агуд Авр Тут Тер біу Сіп с1у ТПпг о Тец Уаі Тік Уаї1 100 105 110Uai Akud bek bsiu Agud Avr Tut Ter biu Sip s1u TPpg o Tets Uai Tik Uai1 100 105 110

Зек бБекгZeck bBekg

238 6848 181129) 38 (445) (тт) (80) | (010). (1059) (1894) 5Р З 32 ТМ Це) 622 Ас ав с ок са нь лава Пре) мовв ов Ди м а СКК С (АТС) ) (тод) двт(вооав) г 030 ДВ238 6848 181129) 38 (445) (tt) (80) | (010). (1059) (1894) 5R Z 32 TM Tse) 622 As av s ok sa n lava Pre) movv ov Dy m a SKK S (ATS) ) (tod) dvt(vooav) r 030 DV

АТО" Ф ТАATO" F TA

СТІ ПЕВНЕ неа св нсю тв ЧО НКИI'm SURE you don't know what's going on

Фе 91Fe 91

АТо САНИ тов аю 0) г) ве) І 4 5 8 (349) о оду Ся Дня й і (ізоформа) АТО КС з'а(втвав)|) т) 2) в) ясен і". у»ATO SANY tov ayu 0) d) ve) I 4 5 8 (349) o odu Sya Dnya y i (isoform) ATO KS z'a(vtvav)|) t) 2) c) yasen i". y"

Ате Я в'юговв ва) я) г) я 5-61 У у". оAte I vyugovv va) i) d) i 5-61 U u". o

АТО коATO co

Фіг. 1 1600 . 1400 ХРА 06.11 РЕ А-контроль а 06. в 1200 а ХРА.06.141 хЕБ БЕ 1000 "ж ХРА.06.147Fig. 1 1600. 1400 ХРА 06.11 RE A-control а 06. in 1200 а ХРА.06.141 хEB BE 1000 "ж ХРА.06.147

Б ет - ХРА.О6.158 « 8 800 ш тАБІ1167B et - ХРА.О6.158 « 8 800 ш таБИ1167

Е пе 600E pe 600

ЕЕ Ш де 400 ет ее 2004 «5 У ИШЗШЗЮ580 З-її- 4 ва 0EE Sh de 400 et ee 2004 «5 У ШЖШШЮ580 З-ий- 4 va 0

Кк КЗ «ееKk KZ "ee

Антитіло, мкг/млAntibody, μg/ml

Фігура 2: РКІ.К-специфічні антитіла інгібують фосфорилуванняFigure 2: RKI.K-specific antibodies inhibit phosphorylation

РЕКК1/2RECK1/2

Аналізи нейтралізації у клітинах Т470 ж 30 нг/мл РКІ,, 120 вимірювання РЕКК1/2Neutralization assays in T470 cells with 30 ng/ml RKI, 120 measurements of REKK1/2

РЕ К-контроль 100 ---52526И НИЦНННННІНННН8НУ,О НСШЦСТ6ЯТГ0ЗСТТЛ ЯСЯОСТЬТЛ Ь6ЬСТ Ьт 326 5 (Щ ( 6 -RE K-control 100 ---52526Y NICNNNNNNNNNN8NU,О НСШЦССТ6ЯТГ0ЗСТТЛ ЯСЯОСТТЛ Ь6ЬST Ьт 326 5 (Щ ( 6 -

Е во "7 ХРА.О6.167 (ЕСьо - 0.05 мкг/мл) 8 птн У ХРА.О06.167 (ЕСьо - 0.13 МКГ/МЛ) : їх що бо. Кз УE in "7 ХРА.О6.167 (ЭХО - 0.05 mcg/ml) 8 ptn In ХРА.О06.167 (ЭХО - 0.13 МКГ/ML) : their what bo. Kz In

І х г ім (2 МI x g im (2 M

Тільки клітини з сс пн дви о чуOnly cells with ss pn dvy o chu

М 5 ж ж М і: ;M 5 same same M i: ;

Антитіло, мкг/млAntibody, μg/ml

Фігура 3: РКІ.К-специфічні антитіла інгібують фосфорилуванняFigure 3: RKI.K-specific antibodies inhibit phosphorylation

РЕКК1/2RECK1/2

Аналізи нейтралізації у клітинах Т47І) - 30 нг/мл РКІ,, вимірювання рЕКК 1/2Analyzes of neutralization in T47I cells) - 30 ng/ml RKI, measurement of rECK 1/2

Ф ХНА.06.642 (ЕСво - 0.13 мкг/мл) 120 Х ХНА. О6.983 (ЕСво х 0.07 мкг/мл) о ХНА.О6.907 (ЕСео - 0.57 мкг/мл) 100 і РАІ В-контроль о ---- ся ц й УF HNA.06.642 (ESvo - 0.13 μg/ml) 120 X HNA. О6.983 (ESvo x 0.07 mcg/ml) o HNA. О6.907 (ESeo - 0.57 mcg/ml) 100 and RAI B-control o ---- sya ts y U

Б 80 ; х г УB 80; x g U

Е їEh

Е уU

С х ч 60 ; х ж У : Х ; . х х ій ще 5S x h 60; х ж У : Х ; . x x yy 5 more

Тільки клітини м 20 мовам нн по пп попів пон ваш детитнпицеOnly cells m 20 languages nn po pp popov pon your detitnpice

АAND

(6)(6)

М М к М кM M k M k

С ФУ Ф СУ їй суS FU F SU her su

ФУ Антитіло, мкг/млFU Antibody, μg/ml

Фігура 4: РКІ К-специфічні антитіла інгібують фосфорилуванняFigure 4: RKI K-specific antibodies inhibit phosphorylation

РЕКК1/2RECK1/2

МСЕ? (МСІ)ITU? (MSI)

Ж 25095F 25095

З 20095 23 15096 2 9 в 10095 о БОFrom 20095 23 15096 2 9 to 10095 o BO

ЩоWhat

Середовите! КІНО |ХРАО6.14Б|ХРА.06.147) КІНО |ХРА.06.145|ХРА.06.147 ль РВІ. (200 нг/мл) РВІ. (400 нг/мл)Average! CINEMA |ХРАО6.14Б|ХРА.06.147) CINEMA |ХРА.06.145|ХРА.06.147 l RVI. (200 ng/ml) RVI. (400 ng/ml)

Фігура 5: зсЕу при 5 мкг/мл інгібує проліферацію лінії пухлинних клітин о боFigure 5: cEU at 5 μg/ml inhibits the proliferation of tumor cell line o bo

УIN

59 лі Ка59 li Ka

Ав(бмемі 00-00 коюAv(bmemi 00-00 koy

РІ. (Бонтімл);RI. (Bontimle);

Ся НЕЮ ТИYou are her

Фігура 6: РКІ К-специфічні антитіла інгібують РКІ.-індуковане фосфорилування рецептораFigure 6: RKI K-specific antibodies inhibit RKI-induced receptor phosphorylation

5ЕО 10 МО: 205EO 10 MO: 20

ЕУОМ ЕБСОСІ МОРООВІ ВІ. 5СААЗОЕТЕЗМУОМИЖУВОАРОКОСІМ ЕМ АУІ5УПО5МКУУАОВУКОКРТІЗКОМУEUOM EBSOSI MOROOVI VI. 5SAAZOETESMUOMYZHUVOAROKOSIM EM AUI5UPO5MKUUAOVUKOKRITZKOMU

ЕМТІЛЛОММ5ІВАБОТАУУУСАТРУУУАРОУ УСОбТІ МТУ 5ЕО ІД МО:21EMTILLOMM5IVABOTAUUUUSATRUUUAROU USobTI MTU 5EO ID MO:21

О5УГТОРРУАЗОТРООКУ ТІЗС50555МІО5 МТУ МУ ООСРОТАРКІЛУ ОМММВРООУР ОАЕ О5КБОТВАВІ ЛІВОO5UGTORRUAZOTROOKU TIZS50555MIO5 MTU MU OOSROTARKILU OMMMVROOUR UAE O5KBOTVAVI LIVO

ІХЗЕРЕАрУУСААЖМОРБІДОРУКОСОТКІТУ, 5ЕО ДЮ МО: 22IHZEREArUUSAAZHMORBIDORUKOSOTKITU, 5EO DU MO: 22

ЕУОПЕЗСОбІМОРООВІ ВІ ЗСААЗСЕТЕРОУ СМ УУКОАРОК ОЇ ЕМУМ АПЗУРОЗУТУУАРЗУКОАЕТІЗКОМ5EUOPEZSObIMOROOVI V ZSAAZSETEROU CM UUKOAROK OY EMUM APZUROZUTUUARZUKOAETIZKOM5

КМТІУГОММ5ІААЕРТАМУУСАКАЗСТрУ УСОСТІ МТУ 5ЕО ІД МО:23KMTIUGOMM5IAAERTAMUUSAKAZSTRU USOSTI MTU 5EO ID MO:23

ОБМІ.ТОРРЗАЗОСТРООЕУТІЗС50555 МО ММАУМУХООІРОТАРКІ ЛУрРМУВАРРОІРОВЕЗО5КУОТЗАВІ. ЛІВОЇ.OBMI.TORRZAZOSTROOEUTIZS50555 MO MMAUMUKHOOIROTARKI LUrRMUVARROIROVEZO5KUOTZAVI. LEFT

В5ЕРХАВУУСАУМОСВІМОРУВССОТКІЛТУ, 5ЕО ІЮ МО: 24V5ERHAVUUSAUMOSVIMORUVSSOTKILTU, 5EO IYU MO: 24

ЕМОМ.ЕЗСОСІМОРООБІ КІ. ЗСААЗОЕТЕРОУ ОМ МУКОАРОКОІЕ МУЗИ УМЗОУ УАДУ АРЗУКОКЕТІЗАЮМEMOM. ESSOSIMOROOBI KI. ZSAAZOETEROU OM MUKOAROKOIE MUZOU UMZOU UADU ARZUKOKETIZAUM

КМТІЛІОММ5ІВАЕОТАУХУСТТУУРУЗВУСОСТІУТУ 5ЕО ГО МО: 25KMTILIOMM5IVAEOTAUCHUSTTUUURUZVUSOSTIUTU 5EO GO MO: 25

О5УТЛОРРУАБОТРООКУТІЗС50555М105МТУММГУ ООІРОТАРКІЛІУОММКЕРЕСУРОКЕБОЗК5ОТАБІАІЗОO5UTLORRUABOTROOKUTIZS50555M105MTUMMGU OOIROTARKILIUOMMKERESUROKEBOZK5OTABIAIZO

ІХ5ЕРЕАОУХСААМРОВІЗОРІЕСОСТКІТМІ, 5ЕО О КО: 26IH5EREAOUHSAAMROVISORIESOSTKITMI, 5EO O KO: 26

ЕМОПІ.ЕЗСОСІМОРОСБІ КІ ЗСААЗОРТЕМВУРУНУУКОАРОКОЇ ЕМ АУІЗУРОМТКУХАРЗУКОВЕТІЗКОМОEMOPI.EZSOSIMOROSBI KI ZSAAZORTEMVURUNUUKOAROKOI EM AUIZUROMTKUHARZUKOVETIZKOMO

КМТІУОММБІВАЕОТАУУУСАВОМРРЕВУ УСОСТЬАТУKMTIUOMMBIVAEOTAUUUSAVOMRREVU USOSTYATU

5ЕО 10 МО: 275EO 10 MO: 27

О5ХУІЛОРРЗАБОТРООВКУТІ5С50555МІСММУУ ЗМУ ОЇ РОТАРКІЛ ГУОМММЕРУСУРОВЕЗО5КЗОТВАВІ А 1Е5ЕРЕАОУУСЕАУВОТІМОРНУУВОСОТКІЛТУЇ. 5ЕО ІД МО: 28O5HUILORRRZABOTROOVKUTI5S50555MISMMMUU ZMU OY ROTARKIL GUOMMMERUSUROVEZO5KZOTVAVI A 1E5EREAOUUSEAUVOTIMORNUUVOSOTKILTUI. 5EO ID MO: 28

ЕМОМ.ЕЗОССІМОРОСБІ ЛІ 5САА5СЕТЕЗМЗОМНИУУВО АРОК ЕМУААІЗУРОЗМКУУАРЗУКСЕЕТІЗВОМЕEMOM.EZOSSIMOROSBI LI 5SAA5SETEZMZOMNIUUVO AROK EMUAAIZUROZMKUUARZUKSEETIZVOME

КМТ ОММ518АБРТАУУУСАВАРУЗСТУрУМУСОСТІ УТУ 5ЕО ІВ МО: 29KMT OMM518ABRTAUUUSAVARUZSTurUMUSOSTI UTU 5EO IV MO: 29

О5УГТОРРЗАЗСТРООКУТІЗСЗО5ММІО5МТУМУУООГРОТАРКІЛУРМУМЕРЗСУРОВЕЗО5КУОТЗАВІАІЗОО5UGTORRRZAZSTROOKUTIZSZO5MMIO5MTUMUUOOOGROTARKILURMUMERZSUROVEZO5KUOTZAVIAIZO

ІЕ5КРЕАВУУСААЖОрБІМОІУКООСТКІЛУІ. 5ЕО ТО МО: 30IE5CREAUVUUSAAZHOrBIMOIUKOOSTKILUI. 5EO TO MO: 30

ЕУОМ.ЕЗСОБІМОРООБІ КІ ЗСААЗОЕТЕ55УСМНУУКОАРОКОГЕМУ5АІЮСЕСУЗТУХАРЗУКОВЕТІЗВОМ5EUOM.EZSOBIMOROOBI KI ZSAAZOETE55USMNUUKOAROKOHEMU5AIYUSESUZTUHARZUKOVETIZVOM5

КМТІЛІОММ5ЗІВАЕОТАУУУСАКО5МУТНАСЕОРУСОСТІУТУ 5ЕО ІД МО: 31KMTILIOMM5ZIVAEOTAUUUSAKO5MUTNASEORUSOSTIUTU 5EO ID MO: 31

ОБУ ЛТОРРБАЗСТРООВУ ПСО МО5МТУ МУ ОО РОТАРКІ ЛУ СМОМВРУСУРОВКЕБО5КСТВАБІ ЛІВОЇ. «5ЕРЕАВУУСАОМРОВІОМУВОООТКІТМІ,OBU LTORRBAZSTROVU PSO MO5MTU MU OO ROTARKI LU SMOMVRUSUROVKEBO5KSTVABI LIVOI. "5EREAVUUSAOMROVIOMUVOOOTKITMI,

БЕО Ір МО: 32BEO Ir MO: 32

ЕМОМ.ЕЗООСІМОРОСБІВІ5СААЗОЕТЕрРУ ОМ УУКОАРОКОГЕМУЗЦУ МОСТУ УАОБУКОКЕТІЗЕОМEMOM.EZOOSIMOROSBIVI5SAAZOETERRU OM UUKOAROKOGEMUZTU MOSTU UAOBUKOKETIZEOM

КМТ УТОММ5ІВАЕОТАУУУСАТОИАУАСЕрУ МОСТІ МТУ 5ЕО Р МО: 33KMT UTOMM5IVAEOTAUUUSATOIAUASERU MOSTI MTU 5EO R MO: 33

О5У1ЛОРРУАЗОТРООКУ ТІЗС50555ЖМ1О5МАУМУХ ОЇ РОТАРКІЛЛУРУМКАРЯОУРОКЕЗО5КОТ5АБІАІВОЇ,О5У1LORRUAZOTROOKU ТИЗС50555ЖМ1О5MAUMUH ОИ ROTARKILLURUMKARYAOUROKEZO5KOT5ABIAIVOYI,

ВБЕОБАЮУУСААТОМ5ІМОУМЕСОСТКІТУЇ, 5ЕО І МО: 34VBEOBAYUUUSAATOM5IMOUMESOSTKITUI, 5EO AND MO: 34

ЕМОМ.Е5ОСОІ МОРОЗІ КІ ЗСААЗОЕТЕЗЗУ ОМАН УУКОАРОКОІЕЖМУЗІІ5УОХУЕТНУ АОБУКОВЕТІЗКОМ5EMOM.E5OSOI MOROZI KI ZSAAZOETEZZU OMAN UUKOAROKOIEZHMUZII5UOHUETNU AOBUKOVETIZKOM5

КМТГСУГОММІВАЕОТАМУУСТТОАбУНАІЛУСОСТІУТУ 5ЕО 10 МО: 35KMTSUGOMMIVAEOTAMUUSTTOAbUNAILUSOSTIUTU 5EO 10 MO: 35

О5МТОРРЗАЗОТРОСОВУТІЗС5О5В5МІОММУУЗУУООГРОТАРКІІУЮОІКАРУОУРОВЕЗОБК5ОТАВІ.АІБОЇ.О5МТОРРЗАЗОТРОСОВУТИЗС5О5В5MIOMMUUZUUOOOGROTARKIIUYUOIKARUOUROVEZOBK5OTAVI.AIBOI.

КЗЕРБАРУХСАТМООВІМОРУЕСОСТКІТУЇ, 5ЕО 10 МО: 36KZERBARUHSATMOOVIMORUESOSTKITUI, 5EO 10 MO: 36

ЕМОМ.Е5ООСІЦМОРООБІ ДІ 5СААЗОЕТЕЗРУ СОМНУУКОАРОКОГЕЖММАЕРОЗКТМУОСРУОСКЕТІВКОМ5EMOM.E5OOSITSMOROOBI DI 5SAAZOETEZRU SOMNUUKOAROKOGEZHMMAEROZKTMUOSRUOSKETIVKOM5

ЕМТІ.ХУОММЗІЦААЕрРТАУУУСТЕСАКОГ УСОСТІУТУ 5ЕО Р МО: 37EMTI.HUOMMZITSAAErRTAUUUSTESAKOG USOSTIUTU 5EO R MO: 37

О5М .ТОРРЗАЗОТРООКУТІ5С505554105МУУ УМО РОТАРКІ ЛУ РММКВРУСУРОВЕЗО5КОСТ5АБІАІВО 185ЕОБАОУУСААЖООВІКРУКСОСТКІ ТУ,О5M .TORRZAZOTROOKUTI5S505554105MUU UMO ROTARKI LU RMMKVRUSUROVEZO5KOST5ABIAIVO 185EOBAOUUSAAZHOOVIKRUKSOSTKI TU,

Фіг. 7АFig. 7A

5ЕО р МО: 385EO r MO: 38

ЕМО Е5ООбІ МОРООБІВІ ЗСААЗСЕТЕ55Х ОМ УУВОАРОСКСЬЕМУ АБІЗУООСМКЕЗУ АОБУК ОКЕТІ5В ОМВКEMO E5OOBI MOROOBIVI ZSAAZSETE55H OM UUVOAROSKSYEMU ABIZUOOSMKEZU AOBUK OKETI5V OMVK

МТІМ1ОММ5ІЛАЕОТАМУХСАКОоСУСГЕрУМСОСТЬМТУ 5ЕО ІВ МО: 39MTIM1OMM5ILAEOTAMUHSAKOOoSUSGERUMSOSTMTU 5EO IV MO: 39

О5УГТОРРЗАБСТРООКУТІСЗОМ55 М О5МУУУ УХУООБРОТАРКИ ГУ РММКЕРЯСМУРОВЕЗО5К5ОТАВІ ЛІВОO5UGTORRZABSTROOKUTISZOM55 M O5MUUU UHUOOOBROTARKY GU RMMKERYASMUROVEZO5K5OTAVI LIVO

ІВБЕРЕАВУУСААМРОВІЗОВУЕССАТКІЛТУ. 5ЕО ПО МО: 40IVBEREAVUUSAAMROVISOVUESSATKILTU. 5EO PO MO: 40

ЕМОІ1 Е5бОБ1 МОРООЗІ ВІ ЗСААЗСРЕТЕО5УОМНУУВОАРОКОГВЕУУ З В МООО5ЗТУХАРЗУКОВАЕТІЗВОМОEMOI1 E5bOB1 MOROOZI V ZSAAZSRETEO5UOMNUUVOAROKOGVEUU Z V MOOO5ZTUHARZUKOVAETISVOMO

КМТ ОММ5ІЖАБОТАУУУСАББІЗАДАТОСОУЖМООСТІ МТМ 5ЕО 10 МО: 41KMT OMM5IZHABOTAUUUSABBIZADATOSOUZHMOOSTI MTM 5EO 10 MO: 41

О5УГТОРРБА5ОТРООКУТІ5С5О5Т5МІСЗМТУМУУ ОЮОБРОТУРКІЛІУЕМККАРБСМРОКЕЗО5К5ОТЗАВІ ЛІС,O5UGTORRBA5OTROOKUTI5S5O5T5MISZMTUMUU OYUOBROTURKILIUEMKKARBSMROKEZO5K5OTZAVI LIS,

ЕЗЕОЕАВУУСААУОЮОВІ ЗО МУВОССТКЬТУМІ, 5ЕО 10 МО: 42EZEOEAVUUSAAUOYUOVI ZO MUVOSTTKTUMI, 5EO 10 MO: 42

ЕМО ЕС МОРОК ВІ ЗСААБОЕТЕЗ5У МА МУУВОАРОКОЇ ЕМ АВІВУРОЗМКУУАОЗУКОКЕТІЗВОМ5EMO ES MOROC VI ZSAABOETEZ5U MA MUUVOAROKOY EM AVIVUROZMKUUAOZUKOKETIZVOM5

ЕМТІУТОММ5ІКАЕОТАМУУСАТЕВАІАУ АСАБОГУСОСТІ МТМ 5ЕО ІД МО: 43EMTIUTOMM5IKAEOTAMUUSATEVAIAU ASABOGUSOSTI MTM 5EO ID MO: 43

О5УГТОРРЗАБОТРООКУТІЗСВОЗАЗМІСІМОУМУУ ОО РОТАРКІ ПУ ДМК ВРЕОСМРОКЕБОЗКЗОТАБІ ЛІВОО5UGTORRZABOTROOKUTIZSVOZAZMISIMOUMUU OO ROTARKI PU DMK VREOSMROKEBOZKZOTABI LEFT

ІЯ5ЕОЕАрУУСААЖОВОВІ ЗСОУУЕСОСТКІТУЇ.IYA5EOEArUUSAAJOV ZSOUUESOSTKITUI.

БЕО ІЮ МО: 44BEO IU MO: 44

ЕМО. ЗО МОРОЗІ ВІЯСААЗОЕТЕО ОВУ ОМ МУВОМРОКОІ ЕМО МОБО5ТУУ АЛОБУКОКЕТІЗВОМ5EMO. ZO MOROZI VIYASAAZOETEO OVU OM MUVOMROKOI EMO MOBO5TUU ALOBUKOKETIZVOM5

КМТЛУТОММБІКАБРТАУУХСАКРЗОАУРТРЕОМ УООСТІУТУKMTLUTOMMBIKABRTAUUHSAKRZOAURTREOM UOOSTIUTU

5ЕО 10 МО: 455EO 10 MO: 45

О5УГТОРРЗАЗСТРООВУТІЗС5О5Т5МІ5МУМУУХУ ОСІ. РОТАРКІЛУДММКЕРЕОМРОКЕБОЗКОСТАБІАІЗОO5UGTORRZAZSTROOVUTIZS5O5T5MI5MUMUUHU AXIS. ROTARKILUDMMKEREOMROKEBOZKOSTABIAIZO

ІА5ЕОБАРУУСААМРОВІЗОМУВОССТКІ ТМ, 5ЕО І МО: 46IA5EOBARUUSAAMROVIZOMUVOSTKI TM, 5EO I MO: 46

ЕМО. Е56ОС1МОРООБІ КІ ЗСААЗОЕТЕТЗОРМУ МУ ВОАРОКОЇ ЕУМУ АХ ІЗХОСЗМКУУ АОЗУКОСЕЕТІЗКОМ5EMO. E56OS1MOROOBI KI ZSAAZOETETZORMU MU VOAROKOY EUMU AH IZHOSZMKUU AOZUKOSEETIZKOM5

КМТІХІОММ5ІААЕОТАУУУСАКСАВЕОГУСОСТЬУТУKMTIKHIOMM5IAAEOTAUUUSAKSAVEOGUSOSTUTU

БЕО І МО: 47BEO AND MO: 47

ОБУГТОРРЗАБОТРООВУТІ5С56555М1О5МТУММУ ООБРОТАРКІ ЛУ СМІММЕРУСУРОВЕБО5К5ОТЗАБІА ВОOBUGTORRZABOTROOVUTI5S56555M1O5MTUMMU OOBROTARKI LU SMIMMERUSUROVEBO5K5OTZABIA VO

ІВЗЕОБАРУХУСАЗУВОІВІЗОУУЕСОСТКІЛТУІ, 5ЕО ЮдД МО: 48IVZEOBARUHUSAZUVOIVIZOUUESOSTKILTUI, 5EO YudD MO: 48

ЕМОМІ.ЕЗСОСІ МОРОЗІ КІ ЗСААЗСЕТЕООУ ОМ УУВОАРОКОГЕМУ ЗІЗ УРООЗТУУАРЗМЕОКЕТІЗВОМ5EMOMI.EZSOSI MOROZI KI ZSAAZSETEOOU OM UUVOAROKOHEMU ZIZ UROOZTUUARZMEOKETIZVOM5

КМТІЛІ.ОММ5ІКАБОТАУУУСТЕСЕОРМУСОСТІУТМKMTILI.OMM5IKABOTAUUUSTESEORMUSOSTIUTM

БЕО Ір МО: 49BEO Ir MO: 49

О5УТОРРЗАЗОТРООВКУТІ5С5О585МІО5МТУМУУ ООСБРОТАРКІ ЛУ ЮММКВРЗОУРЮОКЕ5О5КУОСТЗАВІАІЗОО5УТОРРЗАЗОТРООВКУТИ5С5О585МИО5MTUMUU ООСБРОТАРКИ ЛУ ЮМКВРЗОУРУОКЕ5О5КУОСТЗАВИАИЗО

ІА5ЕОБАВУУСМГУРЗМАМУЕОСЕТКІ ТМ, 5ЕО ПО МО: 50IA5EOBAVUUSMGURZMAMUEOSETKI TM, 5EO PO MO: 50

ЕМО. ЕЗбОбБІ МОРООБІ КІ ЗСААЗСЕТЕКЗЗРМНУУКОАРСКОТ ЕУУЗОУЗУМОЗВІНУУРЗУКАВЕТІЗКРМEMO. EZbObBI MOROOBI KI ZSAAZSETEKZZRMNUUKOARSKOT EUUZOUZUMOZVINUURZUKAVETIZKRM

КМТІЛІОММБІКАЕОТАУУУСАКОСАРАЄДГУСОСТЦУТУKMTILIOMMBIKAEOTAUUUSAKOSARAYEDGUSOSTTSUTU

5ЕО Р МО: 515EO R MO: 51

О5МІТОРРЗАЗОТРООВУТІЗС5ОТТ55І05МТУМУУ ЧОЇ РОТАРКЛІХ ОМІІКВРЗОМРОВЕЗО5КОТ5АБІАІВОЇ,O5MITORRRZAZOTROOVUTIZS5OTT55I05MTUMUU CHOI ROTARKLIK OMIIKVRZOMROVEZO5KOT5ABIAIVOYI,

Е5ЕОЕАРУУСААМОрБІМОУУКСОСТКІТМІ, 5ЕО 10 МО: 52E5EOEARUUSAAMOrBIMOUUKSOSTKITMI, 5EO 10 MO: 52

ЕМОМ.ЕЗСОбІМОРОСБІКІ 5СААЗСЕТЕЗ5УАММУВОАРОКОЇ ЕМУЗОУО556УМТУУАОЗУКСЕЕТІЗКОМ5Emom

КМТІЛІОММ5ІЗАВОТАМУУСАКУСАТЗЗТНЕВУ МООСТУТУ 5ЕО І МО: 53KMTILIOMM5IZAVOTAMUUSAKUSATZZTNEVU MOOSTUTU 5EO AND MO: 53

ОБУГЛОРРЗАЗОТРОСОВКУ ТІЗСО5ВЕМІСЄМТУМУУ ОО РОТАРКІ МУ ВМЕМЕВРЯЗОУРОВЕЗОЗКЗО55АБІ АБО,OR

К5ЕОБАРУУСААМРОВЗІЗАЖУЕСОСТКІ ТМ, 5ЕО Ір МО: 54K5EOBARUUSAAMROVZIZAZHUESOSTKI TM, 5EO IR MO: 54

ЕМО .ЕЗСОбІМОРООЗІВІЗСААЗОЕТЕЗ5УСМНУУКОАРОКОІЕМУУ ААІЗУЕОЗТКЕУАОЗУКОВЕТІЗВОМ5EMO

КМТІМІ.ОММ5ІВАЕОТАУУУСАЗСУУУХОМОУМСОСТУТМ 5ЕО В МО: 55KMTIMI.OMM5IVAEOTAUUUSAZSUUUHOMOUMSOSTUTM 5EO IN MO: 55

О5УІЛТОРРЗАЗСТРОСОВУТІЗС565Т5 МОМ НУУМУООЇРОТАРКІЛУМОМІКРЗОСМРОВЕЗОЗКОТЗАБІАВОAbout

ІА5ЕОЕАрУУСОЗУРУЗШОУМЕСОСТКІКУЇ.IA5EOEARUUSOZURUZSHOUMESOSTKIKUI.

Фіг. 78Fig. 78

5ЕО І МО: 565EO AND MO: 56

ЕМО11 ЕЗОССІ МОРОСВІКІ5СААЗСЕТЕЗ5УЗММУМУКОАРОКОЦЕ МУ АУІЗУРОЗМКУХУ АОЗУКОВЕТІЗВОМеEMO11 EZOSSI MOROSVIKI5SAAZSETEZ5UZMMMUMUKOAROKOTSE MU AUIZUROZMKUHU AOZUKOVETIZVOMe

КМТІЛІОММБІВАЕЮТАМУУСАКІ ДІВ АОАЕОГУСОСТІУТУKMTILIOMMBIVAEYUTAMUUSAKI DIV AOAEOGUSOSTIUTU

БЕО І? МО: 57BEO And? MO: 57

О5УБТОРРЗАЗОСТРООКУ ТІ5С36В55МІСЗМТУМУУООЇ РОТАРКІ ГУК ММОВРЗОМУРОКЕЗО5К5ОТ5АБІ АЗС 1ІВ5ЕОЕАОХУСАУМРОЗІЗОМАКОСЕЛТКІЛТУЇ, 5ЕО Юр МО: 58O5UBTORRZAZOSTROOKU TI5S36В55MISZMTUMUUOOII ROTARKI HUK MMOVRZOMUROKEZO5K5OT5ABI AZS 1IV5EOEAOHUSAUMROZIZOMAKOSELTKILTUI, 5EO Yur MO: 58

ЕМОГІЕЗООСІМОРООБІКІЗСААБОЕТЕЗ5УСМНУУКОАРОКОГЕУУ ЗМО МРОО5ТУХАРЗУКОВЕТІЗВОМEMOGYEZOOSIMOROOBIKISSAABOETEZ5USMNUUKOAROKOGEUU ZMO MROO5TUHARZUKOVETIZVOM

КМУ ГОММ5ІДАБОТАУУУСАКОУЕРРУСОСТУТУ 5ЕО ГО МО: 59CMU GOMM5IDABOTAUUUSAKOUERRUSOSTUTU 5EO GO MO: 59

О5У1ТОРРЗАЗСТРООКУТІЗС5О555 МІ О5МУУУМУУООЇ РОТАРКІ ЛУ ДММКАРЗСУРОВЕЗО5К5ОТЗАВІАІО 1 В5ЕОБАВУУСААЖРОБІМОРУЄССОСТКІТУМІ. 5ЕО ТО МО: 60O5U1TORRZAZSTROOKUTIZS5O555 MI O5MUUUMUOOII ROTARKI LU DMMKARZSUROVEZO5K5OTZAVIAIO 1 V5EOBAVUUSAAZHROBIMORUESSOSTKITUMI. 5EO TO MO: 60

ЕМОІІ.Е5ОСОІУОРООБІ ВІ ЗСААБСЕТЕКМУАМ5МУКОАРОКОГЕМУВОУЗММОЗАТНУ АОБУКОКЕТІхВОМEMOII.E5OSOIUOROOBI V ZSAABSETEKMUAM5MUKOAROKOHEMUVOUZMMOZATNU AOBUKOKETIhVOM

З«КМТІЛУ1ТОММ5ЗІКАЕОТАУУУСТТУ ЗІ УМСОСТІ ТУЗ«КМТИЛУ1ТОММ5ЗИКАЕОТАУУУСТТУ WITH УМСОСТИ TU

БЕО 10 МО: 61BEO 10 MO: 61

ОБУГЛОРРЗАБОТРООКУТІСТО55БІМОАСУВУНУУООЇ РОТАРКІІЛУЮММКАВРОСУРОКЕЗО5К5ОТЗАВІ. АOBUGLORRRZABOTROOKUTISTO55BIMOASUVUNUOOOY ROTARKIILUYUMMKAVROSUROKEZO5K5OTZAVI. AND

СІДБЕРЕАЮУУСОЗУЮ5ЗВІЗВМУКОСОТКІТУЇ, 5ЕО 10 МО: 62SIDBEREAYUUUSOZUYU 5ZVIZVMUKOSOTKITUI, 5EO 10 MO: 62

ЕМОІ1.Е5СОСІМОРСОВІВІЗСААЗСЕТЕЗ5УАМНУУКОАРОКО УМ 515555551У У АРЗУКОСКЕТІЗВОМ5КМEMOI1.E5SOSIMORSOVIZSAAZSETEZ5UAMNUUKOAROKO UM 515555551U IN ARZUKOSKETIZVOM5KM

ТЕГ ОММ5ІКАЕОТАМУУСАВСИСООГСАВОГУСОСТІУТУ 5ЕО 19 МО: 63TEG OMM5IKAEOTAMUUSASAVSISOOGSAVOGUSOSTIUTU 5EO 19 MO: 63

О5УМТОРРЗАЗСТРООВУТІЗС5О555МІО5МЕУТУХУООЇ РОТАРКИ ЛУ СМММЕРБЗОУРОВЕЗО5ЗКООСТВАВІАТВОЇ,О5УМТОРРЗАЗСТРООВУТИЗС5О555МИО5МЕУТУХУООИ ROTARKA LU SMMMERBZOUROVEZO5ZKOOSTVAVIAATVOI,

ВЗЕОЕАРУУСААМОСВІЗОУУЕСОСТКІЛТМІ, 5ЕО ІВ МО: 64VZEOEARUUSAAMOSVIZOUUESOSTKILTMI, 5EO IV MO: 64

ЕМО. ЕЗООССІМОРООЗВІ. ВІ. ЗСАЛАБСЕТЕОРУ СМ УУКОАРОКОЇ ЕМ АУІ5УПО5МКУУАРЗУКОВЕТІЗКОМEMO. ESOOXIMOROOZVI. VI. ZSALABSETEORU SM UUKOAROKOI EM AUI5UPO5MKUUARZUKOVETIZKOM

КМТЛИОММБІЛАЕРТАУХУСАТАЕТОСРОДЕОГУСОСТІУТУKMTLYOMMBILAERTAUHUSATAETOSRODEOGUSOSTIUTU

5ЕО Ір МО: 655EO IR MO: 65

О5УГТОРРЗАЗСТРООВУТІЗСЕС555О5МАУМУУООЇГ РОТАРКІЛЛУТМТМАРОСУРО от.About

В5ЕОБАВУУСААМОрОБІМОМУКОСОТКІТУ, що кЕБОБК АБІ АІВОЇ, 5ЕО 10 МО: 66В5EOBAVUUSAAMOROBIMOMUKOSOTKITU that kEBOBK ABI AIVOI, 5EO 10 MO: 66

ЕМОІ1.Б5ООБІ МОРООВІ.ВІЗСААЗОЕТЕЗУУРМТУУКОАРОКСІЕУМ АУ15УРАЗОТУУ АЕРУКОВЕТІЗКОМ5EMOI1.B5OOBI MOROOVI.VIZSAAZOETEZUURMTUUKOAROXIEUM AU15URAZOTUU AERUKOVETIZKOM5

КМТУТОММ5ІВАЕРТАУУУСАКОТУСМДУМСОСТУТУ 5ЕО Ір МО: 67KMTUTOMM5IVAERTAUUUUSAKOTUSMDUMSOSTUTU 5EO Ir MO: 67

ОБУГТОРЕРЗХ5ОТРООКУ П5СЗб55МІОММУМ Б МУХОЇ РОТАРКІЛУОММКЕРУСУ ГІOBUGTORERZH5OTROOKU P5SZb55MIOMMUM B MUHOI ROTARKILUOMMKERUSU GI

ІН5БОЕАВУУСААМООВІЗСУКОСКТКАТМІ, її КЕБОЗКБОТЗАБІ ЛІВОIN5BOEAUVUUSAAMOOOVIZSUKOSKTKATMI, her KEBOZKBOTZABI LEFT

КО І МО: 68KO AND MO: 68

ЕМО .Е5БОСІ.УОРООБІ КІ ЗСААЗСЕТЕЗМУЄМНУУВОАРСКСІЕУУЗИЗУРСОЗТУУАРЗУКОВЕТІЗАОМеEMO .E5BOSI.UOROOBI KI ZSAAZSETEZMUYEMNUUVOARSKSKSIEUUZIZURSOZTUUARZUKOVETIZAOME

КМТ УТОММ5ІЛАЕОТАМУУСІСЗУЕОРУСОСТІ МТУ 5ЕО 10 МО: 69KMT UTOMM5ILAEOTAMUUSISZUEORUSOSTI MTU 5EO 10 MO: 69

О5УГТОРРЗАЗСТРООКУ ТІ5С56555М1О5МТУМУУ ОО РОТАРКІ ЛУ ДМОВЕРІОУРОКЕЗО5К5ОТУХВІ АО5УГТОРРЗАЗСТРООКУ ТИ5С56555М1О5MTUMUU OO ROTARKI LU DMOVERIOUROKEZO5K5OTUHVI A

ІВ5ХОЕАРУУСААМРОІВІЗОУУКООСТКІЛУЇ. 5ЕО 10 МО: 70IV5HOEARUUSAAMROIVIZOUUKOOSTKILUI. 5EO 10 MO: 70

ЕМО ЕЗБОбІМОРООВІВІ 5СААЗОЕТЕОМУОМОМУВОАРОКОЇ ЕМ АУІ5УРО5МКУУАРЗУКОКЕТІЗВОМ5EMO EZBObIMOROOVIVI 5SAAZOETEOMUOMOUVOAROKOY EM AUI5URO5MKUUARZUKOKETIZVOM5

КМТІЛІОММЗІКАЕОТАУУУСАВЗМГОУРАБОСУСОСТІУТУKMTILIOMMZIKAEOTAUUUSAVZMGOURABOSUSOSTIUTU

5ЕО 10 МО; 715EO 10 MO; 71

О5УЦТОРРЗАЗСТРООК УТІ5С565551О5МУ У У МУ ОО РОТАРКІЛІУ СМ5МАРЗСМРОКЕЗОЗКУОТ5АІ. АІС,O5UCTORRZAZSTROOK UTI5S565551O5MU U U MU OO ROTARKILIU SM5MARZSMROKEZOZKUOT5AI. AIS,

В5ЕРЕАРУУСАТМУРОЗИМОУУВСОСТКІ МІ,В5ЕРЕАРУУАСТМУРОЗИМОУУВСОСТКИ MI,

ЕОР МО: 72EOR MO: 72

ЕМОМЕЗОСОЇ МОРОЗІ ЗСААЗОЕТЕЗрРУЄМНУУКОАРОКСТЕЖУУАМЗЕОО5КТМУ ООРМОСВЕТІЗКОМ5EMOMEZOSOI FROSTS ZSAAZOETEZrRUYEMNUUKOAROKSTEZHUUAMZEOO5KTMU OORMOSVETIZKOM5

ЕМТІМЦОММЗІДАЕОТАМУУУСТКСАЕРІМСОСТІУТУEMTIMTSOMMZIDAEOTAMUUUSTKSAERIMSOSTIUTU

5ЕО ІРР МО: 735EO IRR MO: 73

О5ХТОРРЗАЗСТРООВУТІ5С5О555МІО5МУ МУ МУ ОС РОТАРКІ ЛУ ОММКЕРЗОМУРОВЕЗО5КОСТ5АВІАОО5ХТОРРЗАЗСТРООВУТИ5С5О555МИО5MU MU MU OS ROTARKI LU OMMKERZOMUROVEZO5KOST5AVIAO

ІА5ЕОВАрРУУСААМООСІКРУОССТКІТМІ.ІА5ЕОВАрРУUSAАМОСИКРУОССТКИТМИ.

Фіг. 7С 5ЕОІР МО: 74Fig. 7C 5EOIR MO: 74

ЕМО ЕЗ5СССІ МОРООБІ ВІ БСААЗСЕТЕЗМУЄМНУУКОАРОКОТ ЕМ УВІ 5 МОСК Т5УТОУКОВ.EMO EZ5SSSI MOROOBI VI BSAAZSETEZMUEMNUUKOAROKOT EM UVI 5 MOSK T5UTOUKOV.

ЕТІБАОМ5КМТІ У ОММВІВАБРТАУУУСАВОМСОМУМСОСТІУТУ 55 5ЕО ПО МО: 75ETIBAOM5KMTI IN OMMVIVABRTAUUUSAVOMSOMUMSOSTIUTU 55 5EO PO MO: 75

ОБУГТОРРЗАБСТРООВУТІЗСТОЗ5ВМІСАОУРУНИУУООГРОТАРКТЛ ТУ ОММКЕРЕСУРОКЕТОВК5OBUGTORRRZABSTROOVUTIZSTOZ5VMISAOURUNIUUOOOGROTARKTL TU OMMKERESUROKETOVK5

СТ5ЗАБІАІЗОІКЗЕРЕАРУУСААМООВІМОМУКОСОТКІ ТМ,ST5ZABIAIZOIKZEREARUUSAAMOOOVIMOMUKOSOTKI TM,

Фіг. 8Fig. 8

ХНА.06.9831,С варіабельна область (5ЕО ТО МО: 76) агбаарісасарасссарріснсріапісіасірсістві сі вістрі всісагвевсавіацяіва (расссарасісссазансстрстріаїсарсарравасарооНассаїаасстосвароссавіса вЕРІрІраріаагі ват ріарспевИссарсараарссароерсавісіссіааасірствасатасісї рсаїссасісесіасасіросавіссстраїсоосісасір сарі ра аірввасррацісаснса ссаїсаасасірірсаррсіраавассіресавйастсірісарсарранатассісіссвасьй сепірраррсассаарсі резааісаааср ресХНА.06.9831,С варіабельна область (5ЕО ТО МО: 76) агбаарісасарасссарріснсріапісіасірсістві сі вістрі всісагвевсавіацяіва (расссарасісссазансстрстріаїсарсарравасарооНассаїаасстосвароссавіса вЕРІрІраріаагі ват ріарспевИссарсараарссароерсавісіссіааасірствасатасісї рсаїссасісесіасасіросавіссстраїсоосісасір сарі ра аірввасррацісаснса ссаїсаасасірірсаррсіраавассіресавйастсірісарсарранатассісіссвасьй сепірраррсассаарсі резааісаааср рес

ХНА.06.983 НС варіабельна область (ЗО 10 КО:7 7) агерасіссарясісааі чав йссирісспаннаааароіріссарівівасрірсарсівеХНА.06.983 НС variable area (ЗО 10 КО:7 7) agerasissaryasisaai chav yssyrisspannaaaaroirissarivivasrirsarsive

Іррарісігереваресп в вірсарссіврарярісссерааасісіссірівсавссісіррайсяс псаріарінірваатрсаріревИсрісарвсіссарараарр рост в варів рісвсатацай аріаріресаріаріассвістастівірсарасасаріраарярссвайсассаісіссарарасаайс ссаараасасссірИссірсаватрассарісіваррістраррасасррссаїріацасіріріазя зістурларруасіасіррорісзарраассісарісассвісарсісаIrrarisigerevaresp in virsarssivraryaririssseraaasississirivsavssisirraysas psariarinirvaatrsarirevIsrisarvsissararaaraarr growth in vari risvsatatsai ariariresariariassvistastivirsarasasariraararyarssvaisassaissaissararasarais ssaaraasasssirIssirsavatrassarisivarristrarrrasassrrrssairiatsasirissarsarrissarvissarassariraas

ХНА.06.2751ЄС варіабельна область (КО Іо МО: 78) аграрейссарянсарв сів ре рсісснсі рсісів рагаісаррірсссаріріраїріссарагаасссарісіссаїсивіснрсї всаісісстерарааассаНасіснаанрсавресааріаараасаціасааатацшарссір ріаїсаарааааассірроававсії аагазассИсНагсіасістреаіссасцірсацстераайссаїсааррнсаріресаріррасірріасарагцісасісісассаїсаХНА.06.2751ЄС варіабельна область (КО Іо МО: 78) аграрейссарянсарв сів ре рсісснсі рсісів рагаісаррірсссаріріраїріссарагаасссарісіссаїсивіснрсї всаісісстерарааассаНасіснаанрсавресааріаараасаціасааатацшарссір ріаїсаарааааассірроававсії аагазассИсНагсіасістреаіссасцірсацстераайссаїсааррнсаріресаріррасірріасарагцісасісісассаїса

Ріарссірраїсстраарайн роза ріанастрісвасавсаїааєранасссяасасвисерагверерассаарсіррараа азасеевсіїRiarssirraisstraarain roza rianastrisvasavsaiaaaeranasssyaasasvyseragvererassaarsirraraa azaseevsii

ХНА.06.275 НС варіабельна область (5ЖО ТО МО: 79) аірарарірсівайсп рі рествисасарсстосірріаіссірісіваєрівсарсісаррарісьрассірросівріваарссХНА.06.275 NS variable region (5ХО TO MO: 79)

Нсісарісісірісссісассірсасі рісасіресіасісазісассаріванат росіреаасте раіссросаріссароазасава сіреаріррагввесіасагаарнасарірріаріасіарстасаасссасісісзазарісьаасісга(сасісварасасзіссааю зассарнсцссірсавнеавнсірірасіасіраррасасарссасата КН рі осааравасіаст ес(асрістрастасіррре, ссааресассасісісасарісіссісаNsisarisisirisssisassissirsasi risasiresiassisazisassarivanat rosireaaste raissrosarissaroazasava sirearirragvesiasagaarnasarirriariasiarsstaassssasissiszazarisyaasisga(sasisvarasaszissaayu sassarnscsssirsavneavnsirirasiasirasirassarssasata KN ri osaaravasiast es(assristrastasirresa, ssaarississas

ХНА.06.6421,С варіабельна область (5ЕО ТО МО: 80) агррарасарасасасіссірНаг ре асірсірсісгррессарриссасіррвівасай рівсірасасарісіссттсиссцар сіріаісістгрресагерерссассаїсісаїрсаррессарсаваарірісаріасаїсіросіа(аснатарсастротассзасар, азассаррасарссасссазасіссісаїсіаіст рсаїссвасстававісів ве рісссівссарвнсаріввсаріреістрява сарасіїсасссісазасаєссаїссіріерарраррарра(рсірсаасстацасірісарсасаріррерарсіссісссісрнсряа ререррассаарсірраваізазасьррсїХНА.06.6421,С варіабельна область (5ЕО ТО МО: 80) агррарасарасасасіссірНаг ре асірсірсісгррессарриссасіррвівасай рівсірасасарісіссттсиссцар сіріаісістгрресагерерссассаїсісаїрсаррессарсаваарірісаріасаїсіросіа(аснатарсастротассзасар, азассаррасарссасссазасіссісаїсіаіст рсаїссвасстававісів ве рісссівссарвнсаріввсаріреістрява сарасіїсасссісазасаєссаїссіріерарраррарра(рсірсаасстацасірісарсасаріррерарсіссісссісрнсряа ререррассаарсірраваізазасьррсї

ХНА.06.642 НС варіабельна область (520 Ю МО: 81) зірааснсе р рсісавсиваннсснроссісайНаазарріріссаріріраврірсарсіррірравіствериварасцавіра арссірваврнісссіразасісісстрірсарісістровисастісаріарсіагвоса(віснривпсессарасіссарасвара вРСІврарісввісрсаассяцаріавір вів етаснасасстастаєссарасарірірааррвесрайсассвісіссарарасза ірссаараасасссіртассірсаааі рарсарісіваарістраррасісарсса піаЦасірірсаарасаіавросааасасівіо сіасцацасіасрсіаг ррасіасіррерісаарраассісарісассрісіссісяХНА.06.642 НС варіабельна область (520 Ю МО: 81) зірааснсе р рсісавсиваннсснроссісайНаазарріріссаріріраврірсарсіррірравіствериварасцавіра арссірваврнісссіразасісісстрірсарісістровисастісаріарсіагвоса(віснривпсессарасіссарасвара вРСІврарісввісрсаассяцаріавір вів етаснасасстастаєссарасарірірааррвесрайсассвісіссарарасза ірссаараасасссіртассірсаааі рарсарісіваарістраррасісарсса піаЦасірірсаарасаіавросааасасівіо сіасцацасіасрсіаг ррасіасіррерісаарраассісарісассрісіссіся

Фіг. 9Fig. 9

ХНА.06-983 УТ. (5КО ТО МО: 82)HNA.06-983 UT. (5KO TO MO: 82)

БІУМТОТРКЕЕЦБАСОКУ ПТСКАЗОСУВНОМАМРООКРООЗРКІЛУБАЗТВУТОBIUMTOTRKEETSBASOKU PTSKAZOSUVNOMAMROOKROOZRKILUBAZTVUTO

УРОВІЛОЗСУСТОЕТЕПМТУОАДЕВТАУХУЕСООВУТ5РТЕСССТКГЕККА /" вночі тонніUROVILOZSUSTOETEPMTUOADEVTAUHUESOOOVUT5RTESSSTKGEKKA /" at night tons

ХНА.06.983 УН (ЗО 1 МО: 83)ХНА.06.983 УН (ЗО 1 MO: 83)

РУОІГУЕБЗБООССІМОРОСЗЕКІ5СААЗСЕАЕЗ5БЕСМОМУКОАРЕКСІ ЕММА УІ55055RUOIGUEBZBOOSSIMOROSZEKI5SAAZSEAEZ5BESMOMUKOAREXI EMMA UI55055

ТІУУАОТУКСЕЕТІВЕОМРЕМТІ ЕС ОМТ5ІКЕ5ЕОТАМУУСУВВОКОУ УСОСТУТУTIUUAOTUKSEETIVEOMREMTI ES OMT5IKE5EOTAMUUSUVVOKOU USOSTUTU

ХНА.06.275 У1, (БО ТО МО: 84)ХНА.06.275 У1, (BO TO MO: 84)

БУОЇТО5РУЗУТ ААЗРОЕТІТІ МСВАБКМУКУГАЖУОЕКРОКТММО ТУЗОВТІНВОЇР 5ВЕБС5О5ОТОЕТІЛІЗБОРЕОБАМУ У СООНМОУРУТЕСОСТКІ ВІККАBUOYITO5RUZUT AAZROETITI MSVABKMUKUGAZHUOEKROKTMMO TUZOVTINVOIR 5VEBS5O5OTOETYLISBOREOBAMU IN SOONMOURUTESOSTK VIKKA

ХНА.06.215 УНН (5КО 10 МО: 85)ХНА.06.215 UNN (5 KO 10 MO: 85)

РУОГОЕБОРОСІМУКРБОВІ ЗТ СТУТОСУВІТЗВУАММУМТКОВЕРОСМКІЕУМОХІВУБОВRUOGOEBOROSIMUKRBOVI ZT STUTOSUVITZVUAMMUMTKOVEROSMKIEUMOHIVUBOV

Т5УМРБІКЗАБІТКОТЗКМОЕВГ ОЇ МЗУТТЕОТАТУКСАКрУСУУВрУМСОСТТЛУ 55T5UMRBIKZABITKOTZKMOEVG OYI MZUTTEOTATUKSAKrUSUUVrUMSOSTTLU 55

ХНА-.06.642 УТ, (ЗЕО ТО МО: 86)ХНА-.06.642 UT, (ZEO TO MO: 86)

РІУГТО5РАВІА УВІ СОСАТІВСВАЗКЗУВТ5ОУТУМНУ УООКРСОРРКТІЛУТ АБМІ,RIUGTO5RAVIA UVI SOSATIVSVAZKZUVT5OUTUMNU UOOKRSORRKTILUT ABMI,

ЕБОУРАКЕ 505050Т0ЕТІМІНРУВЕЕРААТУУСОН5ЬСЕІРРЗЕСОСТКГ ВІККАEBOURAKE 505050T0ETIMINRUVEERAATUUSON5ШSEIRRZESOSTKG WIKKA

ХНА.06.642 УН (5ЕО І МО: 87)ХНА.06.642 UN (5EO AND MO: 87)

ЕМО УББОСРІУКРООБІ КІ ЗСАУВОКТЕ55УОМУУКОТРОКАГЕМУАТУВВОСТEMO UBBOSRIUKROOBI KI ZSAUVOKTE55UOMUUKOTROKAGEMUATUVVOST

УТУУРОЗУКСКЕТІВВОМАКМТУГЦОМ55ІКВЕРБАМУУСАКНЕОМУТУАТУУХАМUTUUROZUKSKETIVVOMAKMTUGTSOM55IKVERBAMUUSAKNEOMUTUATUUHAM

БУЖСОСТ5УТУВ5BUZHSOST5UTUV5

Фіг. 10Fig. 10

ІС50 кандидатних тАВ 20000 - - - кІн-с1 бооооо т - сИХНА.06.642 скін чел СЕ ---- СПХНА.06.983IS50 of candidate TAV 20000 - - - kIn-s1 booooo t - SYHNA.06.642 skin chel SE ---- SPHNA.06.983

У ак а с 1500000 - Ах м - - 2 СИХНА.06.275U ak a s 1500000 - Ah m - - 2 SIKHNA.06.275

Ох -167-01Oh -167-01

З КЗ: - 1000000 М ме з ІС50. мкг/мл НМWith short circuit: - 1000000 M me with IS50. μg/ml NM

КАХ СИХНА06.642 0671 4.56KAH SIKHNA06.642 0671 4.56

У Я СПХНА06.983 01690145 в САХНА.06.275 0.49 В 500000 - ВМО БІС! 0225153 ва о в Кх х, 0 ія м. -3 -2 щі 0 1 09 тА (мкг/мл)In I SPHNA06.983 01690145 in SAHNA.06.275 0.49 V 500000 - VMO BIS! 0225153 va o in Khx x, 0 ia m. -3 -2 schi 0 1 09 tA (μg/ml)

Фіг. 11Fig. 11

Без РАГ. «РАВ, шWithout RAG. "RAV, sh

Фо Ф с 4 є « 8 8 8 5 є 8 « « « ге є Ж - ру ш Ех х го с х х х б х х м х м т ж Б ж - я ге 5 о х 4 о о З ЕFo F s 4 is « 8 8 8 5 is 8 « « « ge is Ж - ру Ш Э х го s х х б х х m х m т ж B ж - я гe 5 о х 4 о о З E

Ревін БЕ на шин да о В и Кн в и ВК ЕК ВАК кН в ТК КЕ а ЯRevin BE na shin da o V i Kn v i VK EK VAK kN v TK KE a I

Ра ре, 5Ra re, 5

Пи Ин в НИ КК а А я о І каPi In v NI KK a A i o I ka

ЕВ в і КА ЕТ и и ЕЛЕEV in and KA ET and ELE

Кон а р и и ЖKonary and Zh

РІВ 1 5: іа ни. ол ІМ А спав в СИ А Й сь ИН ДН АСУ НА ОК Я у ИНRIV 1 5: ia ni. ol IM A slept in SY A Y s IN DN ASU NA OK I in IN

МК нн Я и и и жMK nn Ya i i i z

Фіг. 12Fig. 12

Аналізи нейтралізації у клітинах Т471-30 нг/мл РЕ, вимірювання РЕКК 1/2, Аналіз 59-А 5/22/07Assays of neutralization in cells T471-30 ng/ml RE, measurement of REKK 1/2, Analysis 59-А 5/22/07

ЕКСПЕРИМЕНТ 1 т СНО КІ Н2.1.806 о СНО КІН.с2-60 к пе.06.642-51 ІС50-0.11 мкг/мл о пе.06.642-52 ІС50-0.15бмкг/мл т СПХНА.06.642 1С50-00.04 мкг/мл 120EXPERIMENT 1 t SNO KI H2.1.806 o SNO KIN.s2-60 k pe.06.642-51 IS50-0.11 μg/ml o pe.06.642-52 IS50-0.15bmkg/ml t SPHNA.06.642 1С50-00.04 μg/ml 120

ЕIS

2 8 1002 8 100

Я аI a

ЕЕ м 80 в В. в 60EE m 80 in V. in 60

ВIN

Е Е 40E E 40

Е.IS.

В 20 0In 2000

САС ж СКУ БВSAS and SKU BV

Ко) с ке) с: мкг/млKo) s ke) s: μg/ml

Фіг. 13Fig. 13

4 години АРСС (Т470-12) 555 Т-666666.6:666666 6 -2- ---- о . - щТ8-2ИВ...26262Й-27-2ИЙЗШЙИЗ6267-2ШИШВЗШЗХВ 2ЗШ2ИШВШВЗВБВБВА Ж-ьЙАБА-ЄШВРБЄ-Є Л - | Г- вИБ- - 5 - 6 (|(я« ( « 11-33 Б-В Ж - '/-4 hours ARSS (T470-12) 555 T-666666.6:666666 6 -2- ---- about . - щТ8-2ЙВ...26262Й-27-2ИЙЗШЙИЗ6267-2ШШШВЗШШХВ 2ЗШ2ШШВШШВЗВБВБВА Ж-йАБА-ШШВРБЕ-Е Л - | G- vYB- - 5 - 6 (|(i« ( « 11-33 B-V Zh - '/-

А мо -- 35 ЗВБЗЖЖЖЖЙЙЖЖЙА-ШЗББЗЗИИИ 2 25 «РЦіГКБЗ- КБ |Ї-- -З бгевЗ- 65 5: 3 ГИ-ії ИШЗ---7 5 01 ИБШ-151И--4- ІЇМИ- 0И-ї 2-17 8 1001--2И25-4 2И--.2-і- 032--- 5-4 23 вт 07Ш7З1 БОЗШЗ-- 6777A mo -- 35 ЗВБЗЖЖЖЖЙЖЖЯ-ШЗББZZИИ 2 25 «RCiГКБЗ- КБ |Й-- -З бгевЗ- 65 5: 3 ГИ-ии ШЖ---7 5 01 ИБШ-151И--4- ИИМИ- 0И-и 2- 17 8 1001--2Й25-4 2Й--.2-и- 032--- 5-4 23 Tue 07Ш7З1 BOZZШЗ-- 6777

ЕЯ КІН () САХНА.06983 сАХНА.0б275 167-011 (1) Неге (1) тАб (мкг/мл)EYA KIN () SAHNA.06983 SAHNA.0b275 167-011 (1) Nege (1) tAb (μg/ml)

Фіг. 14Fig. 14

Ваг/РБЕЇ Е: Доксорубіцин 1 мкг/мл тАВ --КІН() 12095 і в 2 2 о ооо ер тVag/RBEI E: Doxorubicin 1 μg/ml tAV --KIN() 12095 and in 2 2 o ooo er t

Я боб ї я о «7I'm Bob and I'm at 7

Шу нинанн М Ч Я д тре ПО зр не З 09Є ї 0009 20009 400609 00800609Shu ninann M Ch Ya d tre PO zr ne Z 09E i 0009 20009 400609 00800609

Доксорубіцин (М)Doxorubicin (M)

Виживаність Ваг/РКІ К юю З 2 2 2 ех 6000000 тен СПХНА.06.642 ни. ПИШИ 5000000 Ше СТ спХНА.06.275 юю! ЕЕ | 003-255 урни ШИН ПИШИ 0-0 3000000------ ЕЕ д-йSurvival Weight/RCI K yuyu Z 2 2 2 ex 6000000 tons SPKHNA.06.642 ny. WRITE 5000000 She ST spHNA.06.275 yuyu! EE | 003-255 bins SHYN PYSHY 0-0 3000000------ EE d.

ОО є6єШЕВЩО | Б6БН ( 2000000 шани ша р шо ШИ Ше 1000000 ши нтиОО е6еШЕФШХХО | B6BN ( 2,000,000 shans sha r sho SHY She 1,000,000 shi nts

Носій Цисплатин (100 нМ)Carrier Cisplatin (100 nM)

Фіг. 15 мкг/мл 1 мкг/мл вк ЕН МЕ ЕЕFig. 15 μg/ml 1 μg/ml vk EN ME EE

Но в ж дви МІ. І ПЕН и и НО ЯBut in two MI. And PEN and and BUT I

Р. -5Баб і панк Же Би Ж ке ати ще. . 1 с ден я М ин НЕ а БАЛАМИR. -5Bab and punk Same would be more. . 1 s den i M in NE a BALAMY

КСО ТаХНАОЄНОЇ небом /пеоб вис. СХНАОВКЇ Неба | пеббетя.KSO Takhnaoenoi by the sky / peob high. SCHNAOVKII Neba | pebbetya

РЕ |х|-| я 5101-11 41-11RE |х|-| I am 5101-11 41-11

Ве КН НН ВИН с о а ва вівіб То ою сте и дя ля.Ve KN NN VYN s o a va vivib To oyu ste i dya lya.

Загальний З12ЕО «»» Над У ще вн інш и ЧО ЗК ян У о якоGeneral Z12EO """ Nad U still vn other i CHO ZK yan U o yako

В аЕ ПОВ ен ке мВ я Шк п йо я М Н Тоосвв нат в по ск щих М М ікри ННя Р-5І бек КА з б ЗАМ її. . ; сія - аб 1 мкг/мл СЙХНАОБОМ5 | пеобОВІ | пебботьо | дев | необ ря. ГУ 151-511 51-11 - 11V aE POV en ke mV i Shk p yo i M N Toosvv nat v psk shchih M Mikry NNya R-5I bek KA z b ZAM her. . ; sia - ab 1 μg/ml SYHNAOBOM5 | peobOVI | pebbotyo | dev | need GU 151-511 51-11 - 11

НКИ пра у он и ВИДИ де кю ВШ рин кчоку аа еозит Вой кри поети й кю «В Ко -- о ца м ту ноу и й ма М віджет в Загальний іаЇ5NKY pra u on i KINDS de kyu VSH ryn kchoku aa eozit Voy kri poeti i kyu "V Ko -- o tsa m tu nou i y ma M widget v General iaY5

ВЕН Ко а свя нки Й ша Н і : І геVEN Ko a svya nki Y sha N i : I ge

Я. її ! 1-5 і Н «Фавеі. т 10 мкг/мл ХНАОБОХ | небо | йеббово | пеббома Ї пебляI her ! 1-5 and H "Favei. t 10 μg/ml HNAOBOH | sky | yebbovo | pebboma Yi peblja

Р |к|І- я |-|5І-| 51-51 -| 1 -R |k|I- i |-|5I-| 51-51 -| 1 -

Да ужириа - ЯМ Я сили ЗЕ ОАМК КИИ .Yes uzhyria - YAM I forces ZE OAMK KII.

ДОД МИ А дк ко байк: КО М НВ йDOD MY A dk ko bike: KO M NV y

Кая ШК жу о НИК ренніKaya SHK zhu o NIK renny

Фіг. 16Fig. 16

А. 1250000.0 1000000.0A. 1250000.0 1000000.0

ЕСво щ 750000.0 --- є пе06642-1 03903 500000.0 «пе066422 05485 «и СИХНА. 06542 09841 250000.0 0.0 ех к ж ж іх сESvo sh 750000.0 --- is pe06642-1 03903 500000.0 "pe066422 05485 "and DRY. 06542 09841 250000.0 0.0

Фо мкг/мл АрFo μg/ml Ar

В. 1500000.0 па и ЕСво я п тя ш 07 ав роти с 1000000.0 сн с пев! 002546 т й «2 пе0б.275-2 03646V. 1500000.0 pa i ESvo i p ty s 07 avroti s 1000000.0 sn s pev! 002546 t and "2 pe0b. 275-2 03646

КУ ху Ме.06.275-3. 03745 500000.0 Х Фо пе06.275-44 0.2316 м со сИХНА.(06.275 08773 0.0 У даеKU hu Me.06.275-3. 03745 500000.0 X Fo pe06.275-44 0.2316 m so dry. (06.275 08773 0.0 U dae

С м НУ ми «б з: мкг/мл АрS m NU we "b with: μg/ml Ar

Фіг. 17Fig. 17

А.AND.

Обробка: КІ НАРВІ. | сихНА.06.6422РВІ.Processing: KI NARVI. | syhNA.06.6422RVI.

Поеми ще Ки укр ОРЕЛ ей Зоя Кі СЕУ ВИХ Ах УхPoems more Ki ukr EAGLE ey Zoya Ki SEU VYH Ah Uh

Р-Біаї5 -- Дік ша чий с жук МлЕмянххR-Biai5 -- Dik sha chi s bug MlEmyankh

Бедешни вв юш НК ОК доBedeshny vv yush NK OK to

А Ер я ле вий щи 5 кв вин пн і др Еш ес,A Er I left vy shchi 5 sq vin mon and dr Ash es,

В. сольовий розчин болюс ОРНІ.B. saline solution bolus ORNI.

Бі ак ув шо поети з па ЯНА ЖЕ Си Б ме ВД В пи а м их й п о Ні ГО и ре Ко кожи Ба ва теж ж ни и Ма у» КУ я Ак АН НИ : а ак и ееBi ak uv sho poets from pa YANA ZHE Si B me VD V p a m ih y p o Ni GO i re Ko kozhi Ba wa also ni i Ma u" KU i Ak AN NI : a ak i ee

Ди еВ Ум я я з жк о й іму м а М З ою я и знуеий ра ен о ки п веж я саке ші Шини в ти и ки ЯDi eV Um I z z h o i imu m a M Z oyu i i znueiy ra en o ki p vezh i sake shi Tires in ti ki I

Ви окисник Дт не АН о сяк щен зр Он но пес о я М скит ан с ик век дичні КА о окаYou are the oxidizer Dt ne AN o syak shchen z On no pes o i M skyt an s sik vec dicny KA o oka

З ле а КИ ви БІ А и по на в и пар ни во ШК есте й вна Бена Ан спи рати и ажWhy are you BI A and the new couple in ShK are you and Bena An spirat i az

МАЕ ри Я дк ккал сві ет о дл: Док ше В зMAE ry I dk kkal svi et o dl: Dok she V z

Ма кв в кя Де и а іч ВИН ВЕ ви ле и виMa kv v kya De i a ich VIN VE vi le i vi

ОРКІ. ж Ідб-контроль ОоРКІ. я спА.64 екс ува ВЕН тис тавия кни пре он 0 в о ен Й ен ун иа А иеORKS. same IDB-control of OORKI. I spA.64 ex uva VEN tys tavya kny pre on 0 v o en Y en un ia A ie

Я А Уа З в ау КІ ших ряI A Ua Z v au KI shih rya

Етітлу и сен яви ж інн ве сов о сао АНЯ а кс Ба у ЕН Те я ВИ ши, йо тки Не нн ев НЕ та рн пен ЕКОН екв ов джу в Я и у ни кр рі Ви ня НА Ноя Же пеня кох кошевEtitlu i sen yavi z inn ve sov o sao ANYA a ks Ba u EN Te i YOU shi, yo tki Ne nn ev NE ta rn pen ECON ekv ov ju v I i u ny kr ri Vi nya NA Noya Zhe penya koch koshev

Се оо а А ня неси р ку сн ЖЖ та НК пк ней про рення ха уки р Ка ка кн ДИ ЕНН и А Ач якиSe oo a A nya nesy rku sn ЖЖ and NK pk ney pro renya ha uky r Ka ka kn DY ENN and A Ach yaki

КЕ и й КІ сто ви он пев ВАТ: ТК правуKE and KI hundred you he pev OJSC: TK right

Фіг. 18 .Fig. 18.

Введення доз починали через 4 дні після імплантації; п-10-15/група; 9070 х 4 т9- Контроль іді31 10 мкг Р -к- СЕХНА 06.642 тАБ 10 мкг -- Сольовий розчин. |рDosing was started 4 days after implantation; n-10-15/group; 9070 x 4 t9- Control idi31 10 mcg R -k- SEHNA 06.642 tAB 10 mcg -- Saline solution. r

Перше дослідження дісвокThe first study of disvok

ІтЇ вItYi in

Б 100 В 100 щ ЗB 100 V 100 sh Z

ВО : воVO: vo

Ж що 60 ж ва в щ ї З во 40 5 «0 е з 20 е 20 ре 0 о в; 25 50 78 100 125 0 25 Бо 75 100 155 111 РуЖ что 60 ж ва в щ и З во 40 5 "0 е з 20 е 20 ре 0 о в; 25 50 78 100 125 0 25 Bo 75 100 155 111 Ru

Дні після імплантації Ї од Капк Теві Дні після імплантації ро: «0.0001 медіанна виживаність СЬЖХНА. Об. г: 88 днів медіаннавиживаність СПХНА.О06.бАХ з 93 дніDays after implantation Y od Kapk Tevi Days after implantation ro: "0.0001 median survival of SZHHNA. About. g: 88 days median survival SPHNA.О06.бАХ from 93 days

КНЕ 1961 з 20 днів КНІі іа хх 23 днKNE 1961 from 20 days KNIi ia xx 23 days

Фіг. 19 а Введення доз починали через 12 днів після імплантації, коли об'єми пухлин були у середньому 135 мм". .- У день 21 після імплантації об'єми пухлин в оброблених КІН мишах дорівнювали »600 мм", і пухлини регресували в оброблених СИХНА.06.642 пухлинах --- Контроль ІдС1 10 мг/кг ІР -а- СИХ НА.06.642 тдь 10 мг/кг ІР : ш 9 1000 100 ееFig. 19 a Dosing was started 12 days after implantation, when tumor volumes averaged 135 mm". .- On day 21 after implantation, tumor volumes in KIN-treated mice were equal to "600 mm", and tumors regressed in SIKHNA-treated mice .06.642 tumors --- Control IdS1 10 mg/kg IR -a- SYH NA.06.642 tdj 10 mg/kg IR: w 9 1000 100 ee

Е 800 Є 80 п-- й ко 500 8 50 2 400 "Шо яE 800 E 80 p-- and ko 500 8 50 2 400 "What I

Є 200 Е 20 г 5 - о то в о 40 20 30 а о 25 5о 75 100 в г йE 200 E 20 g 5 - o that in o 40 20 30 a o 25 5o 75 100 in g y

З Дні після імплантаціїFrom the day after implantation

Дні після імплантації медіанна виживаність СПХНА.06.642 2:59 днівDays after implantation, the median survival SPHNA.06.642 2:59 days

КНО 1961 2:23 дн р х 0.0001KNO 1961 2:23 p.m. x 0.0001

Фіг. 20Fig. 20

А. Сонвовий розчин 0 болюсогві. си Еш ; регеуних см вв в рома вх Я виш мне ная сольовий рози КЕнжови жВхнАВе я он ані 2 3 411 2 з аA. Sleep solution 0 boluses. you are Ash; regeunyh sm vv v roma vh I vish mne naya solo rozi KENzhovy zhVhnAVe i he ani 2 3 411 2 z a

Віз | знаю в а ан зно неVisa | I know, but I don't know

Р-АКТ (Бегат3) косі а В я,R-ACT (Begat3) oblique and V I,

Я ДОМЕН ВИКО К ріка татка аI DOMAIN VIKO K rika tatka a

АКТ ар нн мк ен аюAKT ar nn mk en ayu

В.IN.

Сетьовий розчин! | болюс ОРІ. по онов ОВ о ЗК оте фс ВNetwork solution! | bolus ORI. on the renewal of the OV about ZK ote fs V

Са С го и оте зх ЩІ Ше ля вий а Е п еищх. ще ж а : - пк и ех о ше ще іти еВ у І ее пе я голоSa S go i ote zh SCHI She la vyy a E p eishchh. still same a : - pk i eh oh she still go eV u I ee pe i holo

Пр им нен о оф ик внPr im nen o of ik vn

Ї шостий ве оон и ки и о КИ па их. ек ше ян з їту р. 1 пи ак винне ив я . СЯ и я Коко, КЕ гу Ге ту ок рн и В і ен се ве о ННЯ Ек о син ки и іо Предетанляє 53 праб... іх. Представляє З з 4 пробIt is the sixth ve oon i ki and o KI pa ih. ek she yan z itu r. 1 pi ak wine iv i . SYA and I Koko, KE gu Ge tu ok rn y V i en se ve o NNYA Ek o son ki i io Predetanlya 53 prab... ih. Represents C from 4 samples

ОРНІ я Ід контроль | ОР я свхнА.Ов.вагORNI I Id control | OR I svkhnA.Ov.vag

Ї кишка а; янв и 7 - акт н -- 7. ж мае їн Ух РИТИ о Її заз вон они о М х ОЦЕ «мі У о й ху Ух 7 ши 7 ія ся М г бе жк ях Ка ке щу Гея еква З МОН ем М. го мя. о кв ск в НІ нн в МУE gut a; January 7 - act n -- 7. zh mae yin Uh RYTI o Her bells o M h OCE "mi U o y hu Uh 7 shi 7 iya sia M g be zhk yah Ka ke schu Gaia equa Z MON em M . o kv sk in NI nn in MU

Ши св пилюки о хо СЕН Бе ооо: ШІ З пк а учи у ГОМ ун пи и ИН м о мож нак пу ет о З АВТ ». вх жо Я я з - х УхShi sv pilyuki o ho SEN Be ooo: SHI Z pk a uchi u GOM un pi i YN m o nak pu et o Z AVT ". вх жо I I z - х Uh

Нредвставляє У 34 проб | Представляє 4 34 пробRepresents in 34 samples Represents 4 34 samples

Фіг. 21Fig. 21

Claims (21)

1. Виділене антитіло, яке зв'язує позаклітинний домен РЕІ.К з 5ЕО ІЮ МО: 2 з рівноважною константою дисоціації (Ко) 107 М або більш низькою і яке містить (а) області, що визначають комплементарність (СК), які представлені в положеннях від 24 до 38, положеннях від 54 до 60 та положеннях від 93 до 101 амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО: 88, 1 (5) області СОК, які представлені в положеннях від 31 до 35, положеннях від 50 до 66 та положеннях від 99 до 113 5ЕО ІЮ МО: 90.1. An isolated antibody that binds the extracellular domain of REI.K to 5EO IU MO: 2 with an equilibrium dissociation constant (K0) of 107 M or lower and that contains (a) complementarity-determining regions (CD) that are presented in positions from 24 to 38, positions from 54 to 60 and positions from 93 to 101 of the amino acid sequence of 5EO IU MO: 88, 1 (5) regions of the SOC, which are represented in positions from 31 to 35, positions from 50 to 66 and positions from 99 to 113 5EO IU MO: 90. 2. Антитіло за п. |, яке є химерним антитілом, гуманізованим антитілом, сконструйованим для людини антитілом, антитілом людини, одноланцюжковим антитілом або фрагментом антитіла.2. The antibody according to p. |, which is a chimeric antibody, a humanized antibody, an antibody designed for humans, a human antibody, a single-chain antibody or an antibody fragment. 3. Антитіло за п. 1, яке містить константну область послідовності антитіла людини і одну або декілька варіабельних каркасних областей важкого ланцюга і легкого ланцюга послідовності антитіла людини.3. The antibody according to claim 1, which contains a constant region of a human antibody sequence and one or more variable framework regions of a heavy chain and a light chain of a human antibody sequence. 4. Антитіло за п. 3, в якому послідовність антитіла людини є індивідуальною послідовністю людини, консенсусною послідовністю людини, індивідуальною послідовністю зародкової лінії людини або консенсусною послідовністю зародкової лінії людини.4. The antibody according to claim 3, in which the human antibody sequence is an individual human sequence, a human consensus sequence, an individual human germline sequence, or a human germline consensus sequence. 5. Антитіло за п. І, в якому константна область важкого ланцюга є модифікованим або немодифікованим ІгО, ІМ, ІвсА, ІІ, ІвЕ, їх фрагментом або їх комбінаціями.5. Antibody according to clause I, in which the constant region of the heavy chain is a modified or unmodified IgO, IM, IvsA, II, IvE, their fragment or their combinations. б. Антитіло за п. 5, в якому константна область важкого ланцюга є модифікованим або немодифікованим Ів, ІєО2, ІєО3 або Ісб4.b. The antibody according to claim 5, in which the constant region of the heavy chain is modified or unmodified Iv, IeO2, IeO3 or Ib4. 7. Антитіло за п. І, що має рівноважну константу дисоціації (Ко) 107, 107 або 107 М або більш низьку відносно РВІ В.7. Antibody according to item I, which has an equilibrium dissociation constant (Ko) of 107, 107 or 107 M or lower relative to RVI B. 8. Антитіло за п. І, в якому константна область легкого ланцюга є модифікованою або немодифікованою константною областю легкого ланцюга лямбда, константною областю легкого ланцюга каппа, їх фрагментом або їх комбінаціями.8. The antibody according to item I, in which the light chain constant region is a modified or unmodified lambda light chain constant region, a kappa light chain constant region, a fragment thereof, or combinations thereof. 9. Антиптіло за п. 1, яке інгібує внутрішньоклітинне фосфорилування РКІ В.9. Antibody according to claim 1, which inhibits intracellular phosphorylation of RKI B. 10. Антитіло за п. 1, яке інгібує індукцію фосфорилування ва».10. The antibody according to claim 1, which inhibits the induction of phosphorylation of va". 11. Антитіло за п. 1, яке інгібує проліферацію ракової клітини молочної залози.11. The antibody according to claim 1, which inhibits the proliferation of breast cancer cells. 12. Антитіло за п. 1, яке кон'юговане з Іншим діагностичним або терапевтичним агентом.12. The antibody according to claim 1, which is conjugated with another diagnostic or therapeutic agent. 13. Антитіло за п. 1, яке очищене щонайменше до 95 905 гомогенності в розрахунку на масу.13. The antibody according to claim 1, which is purified to at least 95,905 homogeneity by weight. 14. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за п. 13 1 фармацевтично прийнятний носій.14. Pharmaceutical composition, which contains the antibody according to claim 13 1 pharmaceutically acceptable carrier. 15. Набір, який містить терапевтично ефективну кількість антитіла за п. І, упаковану у контейнер, причому зазначений набір містить другий терапевтичний агент, і додатково містить етикетку, прикріплену до контейнера або упаковану з контейнером, де етикетка описує вміст цього контейнера і забезпечує вказівки 1/або інструкції, що стосуються застосування вмісту цього контейнера для лікування раку молочної залози.15. A kit that contains a therapeutically effective amount of the antibody according to item I, packaged in a container, and said kit contains a second therapeutic agent, and further includes a label attached to the container or packaged with the container, where the label describes the contents of the container and provides instructions 1 /or instructions regarding the use of the contents of this container for the treatment of breast cancer. 16. Набір за п. 15, де контейнером є флакон або склянка, або попередньо заповнений шприц.16. The kit according to claim 15, where the container is a vial or glass, or a pre-filled syringe. 17. Виділене антитіло, яке зв'язує позаклітинний домен РКІКВ, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 88 1 амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 90.17. Isolated antibody that binds the extracellular domain of RKIKV, containing the amino acid sequence of the variable light chain 5EO IU MO: 88 1 amino acid sequence of the variable heavy chain 5EO IU MO: 90. 18. Антитіло за п. І, яке зв'язує позаклітинний домен РЕІЖ людини з рівноважною константою дисоціації (Ко) щонайменше у 10000-15000 разів більш низькою, ніж позаклітинний домен мишачого РКІ В.18. The antibody according to item I, which binds the extracellular domain of the human REIZ with an equilibrium dissociation constant (Ko) at least 10,000-15,000 times lower than the extracellular domain of the mouse RKI B. 19. Антитіло за п. 1, яке зв'язує позаклітинний домен РКІ.К людини, позаклітинний домен мишачого РЕК 1 позаклітинний домен РЕІ.К щура.19. Antibody according to claim 1, which binds the extracellular domain of human RKI.K, the extracellular domain of mouse REK 1, the extracellular domain of rat REI.K. 20. Антитіло за п. 19, яке зв'язує позаклітинний домен РКІВ миші і щура з рівноважною константою дисоціації (Ко) 107 М або більш низькою.20. The antibody according to claim 19, which binds the extracellular domain of mouse and rat RKIV with an equilibrium dissociation constant (Ko) of 107 M or lower. 21. Антитіло за п. 20, що зв'язує той самий епітоп, що і варіабельні області важкого ланцюга 1 легкого ланцюга антитіла Ппе.06.642-2.21. The antibody according to claim 20, which binds the same epitope as the variable regions of the heavy chain 1 of the light chain of the antibody Ppe.06.642-2.
UAA200902394A 2006-08-18 2007-08-17 Isolated antibody that binds the extracellular domain of prlr UA97484C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US83864806P 2006-08-18 2006-08-18
PCT/US2007/076160 WO2008022295A2 (en) 2006-08-18 2007-08-17 Prlr-specific antibody and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA97484C2 true UA97484C2 (en) 2012-02-27

Family

ID=52288524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA200902394A UA97484C2 (en) 2006-08-18 2007-08-17 Isolated antibody that binds the extracellular domain of prlr

Country Status (1)

Country Link
UA (1) UA97484C2 (en)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6621447B2 (en) Anti-CD38 antibody
DK2594590T3 (en) A process for the production of binding molecules to the human OX40-receptor
KR101314369B1 (en) Compositions and methods of use for therapeutic antibodies
EA017851B1 (en) Prlr-specific antibody and uses thereof
BR112020023872A2 (en) psma binding agents and their uses
UA125611C2 (en) Bispecific molecules having immunoreactivity in relation to pd-1 and ctla-4, and methods of their use
KR20200130831A (en) Anti-Claudin 18.2 antibody
UA127200C2 (en) Anti pd-1 and anti-lag3 antibodies for cancer treatment
UA118749C2 (en) Antibody constructs for cdh19 and cd3
UA104715C2 (en) Isolated anti-cxcr5 antibody
CN107743495A (en) Anti- CEACAM6 antibody and application thereof
EP3423493A2 (en) Anti-trem1 antibodies and methods of use thereof
UA103297C2 (en) Method of treating an immune related disorder by simultaneous targeting of il-17a and il-17f
CN101622275A (en) Method of providing disease-specific binding molecules and targets
UA120753C2 (en) Anti-cd3 antibodies and methods of use
UA123774C2 (en) Anti-c5 antibodies and methods of use
UA95775C2 (en) Antibody that specifically binds to p-cadherin
UA120247C2 (en) Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
EA029793B1 (en) Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
UA98762C2 (en) Monoclonal antibody which binds to tat226 and immunoconjugate
UA118961C2 (en) Antibodies that bind to tl1a and their uses
EA028202B1 (en) Anti-lrp5 antibodies and methods of use thereof
UA123773C2 (en) Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof
KR20120057563A (en) Composition and methods of use for therapeutic antibodies specific for the il-12 receptore betal subunit
KR20230051163A (en) Block TIGIT and CD112R