UA75865C2 - USE OF AGONIST OF TISSUE FACTOR FVII OR FVIIa FOR TREATING PATHOLOGIES ASSOCIATED WITH CELL MIGRATION OR CHEMOTAXIS - Google Patents
USE OF AGONIST OF TISSUE FACTOR FVII OR FVIIa FOR TREATING PATHOLOGIES ASSOCIATED WITH CELL MIGRATION OR CHEMOTAXIS Download PDFInfo
- Publication number
- UA75865C2 UA75865C2 UA2002010325A UA2002010325A UA75865C2 UA 75865 C2 UA75865 C2 UA 75865C2 UA 2002010325 A UA2002010325 A UA 2002010325A UA 2002010325 A UA2002010325 A UA 2002010325A UA 75865 C2 UA75865 C2 UA 75865C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- cells
- factor
- fibroblasts
- cell
- sugb1
- Prior art date
Links
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 title claims abstract description 170
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 title claims abstract description 170
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 239000000556 agonist Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 230000034196 cell chemotaxis Effects 0.000 title abstract description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 claims abstract description 8
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 123
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 81
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 16
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 14
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 13
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 13
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 claims description 5
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 claims description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000012760 regulation of cell migration Effects 0.000 claims description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000015167 regulation of chemotaxis Effects 0.000 claims description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 abstract 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 abstract 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 67
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 description 40
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 37
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 36
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 36
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 28
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 24
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 22
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 22
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N [(1S,2R,3S,4S,5R,6S)-2,3,5-trihydroxy-4,6-diphosphonooxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N 0.000 description 19
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 18
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 18
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 18
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 17
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 17
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 13
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 13
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 12
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 12
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 12
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 12
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 12
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 12
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 12
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 10
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 10
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 10
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 7
- 238000004453 electron probe microanalysis Methods 0.000 description 7
- UFZOPKFMKMAWLU-UHFFFAOYSA-N ethoxy(methyl)phosphinic acid Chemical compound CCOP(C)(O)=O UFZOPKFMKMAWLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 7
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 6
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 5
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 5
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 5
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 108010065972 tick anticoagulant peptide Proteins 0.000 description 5
- 102100026561 Filamin-A Human genes 0.000 description 4
- 101710091743 Filamin-A Proteins 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000013366 Filamin Human genes 0.000 description 3
- 108060002900 Filamin Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 3
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000015617 Janus Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010024121 Janus Kinases Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102100034937 Poly(A) RNA polymerase, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 102000041998 SCM family Human genes 0.000 description 2
- 108091079523 SCM family Proteins 0.000 description 2
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002506 anticoagulant protein Substances 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000007646 directional migration Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- XXZCIYUJYUESMD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-(morpholin-4-ylmethyl)pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C=1C(=NN(C=1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2)CN1CCOCC1 XXZCIYUJYUESMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910004709 CaSi Inorganic materials 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015225 Connective Tissue Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010039419 Connective Tissue Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 102000015554 Dopamine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050004812 Dopamine receptor Proteins 0.000 description 1
- 240000000279 Emilia sonchifolia Species 0.000 description 1
- 235000002139 Emilia sonchifolia Nutrition 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001631434 Ermia Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100390735 Mus musculus Figla gene Proteins 0.000 description 1
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 101150090068 PMII gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000006486 Phosphoinositide Phospholipase C Human genes 0.000 description 1
- 108010044302 Phosphoinositide phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710124239 Poly(A) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 1
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000613130 Tima Species 0.000 description 1
- WHKUVVPPKQRRBV-UHFFFAOYSA-N Trasan Chemical compound CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O WHKUVVPPKQRRBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039127 Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3 Human genes 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 108091000387 actin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 102000019997 adhesion receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010013985 adhesion receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 230000010002 chemokinesis Effects 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000000491 effect on chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000008622 extracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- -1 halomethyl ketone Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013038 irreversible inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 230000030505 negative regulation of chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000008692 neointimal formation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 150000002903 organophosphorus compounds Chemical class 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004963 pathophysiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000013155 positive regulation of cell migration Effects 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001480 pro-metastatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000003206 sterilizing agent Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- OBTWBSRJZRCYQV-UHFFFAOYSA-N sulfuryl difluoride Chemical compound FS(F)(=O)=O OBTWBSRJZRCYQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 1
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Опис винаходу
Було описано нову клітинорегулюючу активність фактора коагуляції МІ! (ЕМІІ) або антагоніста фактора 2 тканини, наприклад, інактивованого фактора коагуляції Ма (ЕМіІаї) клітин, які експресують фактор тканини (ТР). Даний винахід стосується способу регулювання міграції клітин або хемотаксису шляхом контактування клітини з ЕМіїа або іншим агоністом ТЕ, або ЕМііаї або іншим антагоністом ТЕ та визначення міграції вищезгаданої клітини. Винахід також стосується застосування ЕМІа або іншого агоніста ТЕ, або ЕМіІаії або іншого антагоніста ТЕ для одержання медикаменту для регулювання міграції клітин у пацієнта. Крім того, даний 70 винахід стосується способу лікування та способу виявлення активності сполук, зокрема випробуваних ліків, які взаємодіють з міграцією клітин.
Зовнішній шлях коагуляції крові починає діяти, коли ЕМіІіа, що циркулює у плазмі, зв'язується зі складовим білком мембрани, фактором тканини (ТЕ). Ролі ТЕ у коагуляції крові присвячено багато досліджень. Вважається, що участь ЕМііа як протеолітичного ферменту у послідовності коагуляції крові обмежується позаклітинним шаром 72 клітин, які експресують ТЕ. Про внутрішньоклітинну активність ЕМІІа, насамперед, ішлося, коли послідовність
ТЕ виявляла гомологію з надродиною цитокінових/інтерферонових або кровотворних рецепторів. Підклас родини кровотворних рецепторів включає рецептори для гормону росту, пролактину, інтерлейкіни з 1 по 7, фактори стимулювання колоній гранулоцитів-макрофагів, еритропоетин та тромбопоетин. Підклас ІІ включає ТЕ та рецептори для інтерферону а та Б.
Подібність ТЕ до цього класу рецепторів також підтверджувалася виглядом кристалічної структури.
Характерним для цього класу цитокінових рецепторів, який включає рецептори для інтерферону Б та д і 1-10, є те, що їх активація веде до швидкого тирозинового фосфорилування самих рецепторів, а також підгрупи внутрішньоклітинних білків. Через кілька хвилин після первинного тирозинового фосфорилування активується сукупність активованих мітогеном (Зег/Тйг) кіназ (МАРК). Ці кінази розташовані в кількох паралельних с 29 сигнальних шляхах. Ретельні дослідження потенційної здатності ЕМІІа до внутрішньоклітинного сигналізування Ге) показали, що він викликає мобілізацію внутрішньоклітинного вільного кальцію (Са?") в лінії клітин карциноми сечового міхура людини, У82, яка визначальним чином експресує ТЕ, та в ендотеліальних клітинах пупкової вени, які було попередньо оброблено інтерлейкіном-1 для експресії ТЕ, але не виявляє ніякої цитокіноподібної активації внутрішньоклітинних тирозинкіназ. Було зроблено висновок, що ЕМіІа, залежно від ТЕ, викликає о
Зо мобілізацію внутрішньоклітинного Са?" через активацію фосфоліпази С. Механізм, за допомогою якого ЕМІТа (Се) активує фосфоліпазу С, є невідомим, але активація тирозинкінази однозначно виключається. со
Останні повідомлення з багатьох лабораторій свідчать, що ТЕ може впливати на кілька важливих біологічних функцій, крім коагуляції, таких як ангіогенез, васкуляризація ембріонів та метастаз пухлин. Однак нині ів) залишається нез'ясованою роль ТЕ у цих біологічних процесах. Позаклітинний домен ТЕ складається з двох М модулів на зразок фібронектину ІІ типу, як у типовому позаклітинному домені цитокінового рецептора ІІ класу, завдяки чому існує ймовірність того, що ТЕ може відігравати роль у трансдукції сигналу, первинній функції цитокінового рецептора. Однак ТЕ має дуже короткий цитоплазматичний домен (довжиною лише в 21 амінокислотний залишок) і не має наближених до мембрани мотивів, які опосередковують зв'язування « 0 нерецепторних Янус-кіназ (ЧаКв) які є важливими для сигналу цитокінового рецептора. Незважаючи на це, кілька -о біохімічних відкриттів вказують на функцію трансдукції сигналу для ТЕ. Аналіз білкової послідовності ТЕ с людини вказує на можливий сайт фосфорилування в цитоплазматичному домені, який зберігається в ТЕ мишей, :з» щурів та кролів. Характерні серинові залишки у цитоплазматичному хвості ТЕ фосфорилуються в клітинах після стимуляції активатором протеїнкінази С. Цитоплазматичний хвіст ТЕ людини фосфорилується іп міго в кількох 415 місцях при інкубуванні з лізатами О087-МоО-клітин. На можливу роль цитоплазматичного домену ТЕ у трансдукції -1 сигналу також вказують результати досліджень, які показали, що прометастатична функція ТЕ критично залежить від цитоплазматичного домену ТЕ. Крім того, показано, що цитоплазматичний домен ТЕ взаємодіє з о актинозв'язувальним білком 280 (АВР-280) та підтримує зв'язування та міграції клітин через залучення АВР-280 о до ТЕ-опосередкованих адгезійних контактів.
Однак було також виявлено, що ТЕ бере участь у певних типах сигналу в клітинах як кофактор для (о) фізіологічного ліганда ЕМіІІа у позаклітинному сигналі через протеолітичний механізм. Наприклад, виявлено, що с зв'язування ЕМІїа з поверхнею клітин ТЕ викликає внутрішньоклітинну Са 2" осциляцію в багатьох клітинах, які експресують ТЕ, короткочасне фосфорилування тирозину в моноцитах, активацію МАР-кінази, зміни експресії гена у фібробластах та посилення експресії рецептора урокінази у клітинах пухлин. Каталітично неактивний ЕМіІа (ЕМіІаї) не здатен викликати багато з сигнальних реакцій, від осциляції Са 25 до активації МАР-кінази та відновлення генів, і, очевидно, каталітична активність ЕМіа може бути необхідною хоча б для якоїсь іФ) опосередкованої ТЕ-ЕМііа трансдукції сигналу. Нині ще мало відомо про сигнальний(і) шлях(и), які викликаються ко протеолітично активним ЕМііа, та про те, яким чином сигнали, викликані ЕМІПа, можуть брати участь в ангіогенезі та метастазі пухлин. во Для вивчення тимчасової програми транскрипції, яка лежить в основі викликаної ЕМііа реакції, у даному дослідженні автори розглянули реакцію фібробластів людини на ЕМіІіа, використавши мікромножину кДНК. Дані показали, що клітинна експресія кількох генів у фібробластах помітно змінювалася під дією ЕМІа. Одним з таких генів є Сугб1, проміжний ранній ген, який викликається фактором росту, продукт якого сприяє адгезії клітин, посилює викликаний фактором росту синтез ДНК та стимулює міграцію клітин у фібробластах та 65 ендотеліальних клітинах.
Даний винахід стосується застосування ЕМІІ та/або ЕМіІІа та/або іншого агоніста ТЕ та/або ЕМііІаі та/або іншого антагоніста ТЕ у терапевтичному лікуванні патологічних станів, які можуть бути пов'язані з міграцією клітин або які можна лікувати специфічним регулюванням міграції клітин або хемотаксису.
В іншому аспекті винахід стосується застосування ЕМІ! та/або РМІ! та/або іншого агоніста ТЕ та/або ЕМІІаї та/або іншого антагоніста ТЕ у терапевтичному лікуванні патологічних станів, які можуть бути пов'язані з регулюванням експресії принаймні одного гена у клітині, наприклад, Сугб1-гена.
В іншому аспекті винахід стосується способу викликання або посилення міграції клітин, який включає етап контактування вищезгаданих клітин з агоністом фактора тканини.
В одному з варіантів втілення агоністом фактора тканини є ЕМІІ або ЕМІІа. 70 В іншому аспекті винахід стосується способу зниження або інгібування міграції клітин, який включає етап контактування клітини з антагоністом фактора тканини.
В одному з варіантів втілення антагоніст фактора тканини є модифікований ЕМІІ.
В одному з варіантів втілення клітина є клітиною людини, що експресує фактор тканини, включаючи фібробласти, клітини гладенького м'яза, клітини пухлин, кровотворні клітини та епітеліальні клітини.
В одному з варіантів втілення модифікований фактор МІЇ вибирають з-поміж фактора МІЇ, модифікованого дансил-РПпе-Рго-Агд-хлорметилкетоном, дансил-СІШ-Сіу-Ага-хлорметилкетоном, дансил-Рпе-Рпе-Агд-хлорметилкетоном, РПе-РПпе-Агд-хлорметилкетоном, дансил-О-РПе-Рго-Агд-хлорметилкетоном, дансил-О-О1и-с1у-Агда-хлорметилкетоном, дансил-О-Рпе-Рпе-Агд-хлорметилкетоном та О-РПпе-Рпе-Агда-хлорметилкетоном.
В іншому аспекті винахід стосується способу викликання або прискорення загоєння ран у пацієнта, який включає введення вищезгаданому пацієнтові ефективної кількості фармацевтичної композиції, яка включає фактор Мііа або фактор МІ! або інший агоніст фактора тканини чи їх комбінацію.
В іншому аспекті винахід стосується способу інгібування або зниження міграції клітин, інвазії, викликаної міграцією проліферації клітин або ангіогенезу у пацієнта, який має захворювання, пов'язане з небажаною сч ов Міграцією клітин, інвазією, викликаною міграцією проліферації клітин або ангіогенезом, який включає введення вищезгаданому пацієнтові ефективної кількості фармацевтичної композиції, яка включає антагоніст фактора і) тканини.
В одному з варіантів втілення хвороба або стан є розвитком первинної пухлини, інвазією пухлини або метастазом. ю зо В іншому аспекті винахід стосується застосування агоніста фактора тканини для одержання медикаменту для викликання або посилення міграції клітин. ісе)
В іншому аспекті винахід стосується застосування антагоніста фактора тканини для одержання медикаменту со для зниження або інгібування міграції клітин.
В іншому аспекті винахід стосується способу регулювання експресії принаймні одного гена у клітині, який о з5 Включає етап або контактування вищезгаданої клітини з агоністом фактора тканини, або контактування ча вищезгаданої клітини з антагоністом фактора тканини.
В одному з варіантів втілення ген є геном, що належить до родини ССІМ-генів.
В іншому варіанті втілення ген вибирають з групи, яка складається з Сугб1, СТЕРЕО, допамін-О2-рецептора,
ЕЗТ Іпсуїє РО 395116 або Р2 нуклеотидного рецептора. «
В одному з варіантів втілення ген є Сугб1-геном. з с В одному з варіантів втілення регулювання викликає або посилює експресію. В іншому варіанті втілення регулювання послаблює або інгібує експресію. ;» В одному з варіантів втілення ЕМІЇ або ЕМіїа або інший агоніст фактора тканини викликає або посилює експресію гена, а модифікований ЕМІ! або інший антагоніст фактора тканини послаблює або інгібує експресію
Гена, наприклад, якщо ген є геном, що належить до родини ССМ-генів, або ген вибрано з групи, яка складається -І з Сугб61, СТЕРЕО, допамін-О2-рецептора, ЕЗТ Іпсуїе РО 395116 або Р2 нуклеотидного рецептора.
В іншому варіанті втілення ЕМІЇ або ЕМІа або інший агоніст фактора тканини послаблює або інгібує о експресію гена, а модифікований ЕМІЇ або інший антагоніст фактора тканини викликає чи посилює експресію
Го! гена, наприклад, якщо ген являє собою ЕЗТРОб74714.
Хворобливими станами, які можуть бути піддані лікуванню, є такі патологічні стани, як, наприклад,
Ме, атеросклероз, ріст пухлин, інвазія пухлини, метастаз або ангіогенез. Іншими станами, які можуть бути піддані сп лікуванню, є, наприклад, загоєння ран, включаючи регенерацію стінок клітин та лікування опіків або запалень, або регулювання міграції клітин іп міго, наприклад, ріст тканини.
ОПИС ФІГУР (їта 6011) 5Б ФігЛА та 1Б: Проточний цитометричний аналіз експресії ТЕ у фібробластах (1А). Клітини забарвлювали або спряженим з моноклональним флуоресцеїнізотіоціанатом миші чи щура (РІТС) антитілом миші проти до
Ф) (незаповнена ділянка), яке застосовували як негативний контроль, або спряженим з моноклональним РІТС ка антитілом проти фактора тканини (ТЕ) (заповнена ділянка). На Фіг.1Б показано прокоагулянтну активність фібробластів. Фібробласти з експресією ТЕ викликали 10-разове збільшення РСА порівняно з моноцитами без бо експресії ТР.
Фіг2А: Вплив ЕМІа та ЕЕК-ЕМіїа на викликаний РОСЕ-ВВ хемотаксис у фібробластах людини. щ показує хемотаксичну реакцію фібробластів на різні концентрації РОСЕ-ВВ. Фібробласти, інкубовані з Л10О0нМ ЕМіа (ев) або 100НМ ЕРЕК-РМІІа (о), мігрували до іншої концентрації РОСЕ-ВВ. Результати є середніми значеннями та ЗЕМ трьох окремих експериментів. Р-значення, менші за 0,05," вважали статистично значущими (тест Ст'юдента). 65 ФігЗ А-Г. Вплив різних концентрацій ЕМІа або БЕК-ЕМіа на викликаний РОСБ-ВВ хемотаксис у фібробластах. щ показує міграцію фібробластів до інших концентрацій РОСЕ-ВВ. Клітини інкубували з 12,5(А),
25(Б), 50(В) та 100(Г)нМ ЕМІа (г) або РЕК-ЕМІа (о) і піддавали аналізові у камері Бойдена з різними концентраціями РОСЕ-ВВ. Результати є середніми значеннями та ЗЕМ трьох різних експериментів. "-р «0,05, тхкр«0,01 і и-р«0,001 за тестом Ст'юдента.
Фіг4АА: Суміш трьох моноклональних антитіл проти ТЕ блокує вплив ЕМіІїа та ЕЕК-ЕМіїа на викликаний
РОСРБЕ-ВВ хемотаксис у фібробластах. щ показує міграцію в напрямку РОСЕ-ВВ фібробластів без антитіл проти
ТЕ, (6) фібробласти попередньо інкубовані з антитілами проти ТЕ та 100нМ ЕМПа, та (0) фібробласти, попередньо інкубовані з антитілами проти ТЕ та 100нМ ЕЕК-ЕМіІІа. Результати є середніми значеннями та ЗЕМ трьох окремих експериментів.
Фіг5А та 5Б: Вплив ЕХа на хемотаксичну реакцію на РОСЕ-ВВ, викликану ЕМіІІа. Фібробласти попередньо інкубували з 200нМ ТАР (Фіг.БА) (ш) або з 0,2-2мММ ТАР (Фіг.5Б) (ш) а потім з Т00нНМ ЕМііа (0). ТАР був присутній весь час протягом експериментів. Хемотаксис викликався різними концентраціями РОСБЕ-ВВ (5А) та
О,Тнг/мл РОСБ-ВВ (5Б). Результати є середніми значеннями та 5О двох окремих експериментів.
ФігбА: Вплив тромбіну на хемотаксичну реакцію на РОСЕ-ВВ, викликану ЕМііа. Фібробласти попередньо 72 інкубували з Бод./мл (остаточна концентрація) гірудину, а потім з 100нМ Емііа. Гірудин був присутній весь час протягом експериментів. Хемотаксис викликався різними концентраціями РОСЕ-ВВ. ш експериментів.
Хемотаксис викликався різними концентраціями РОСЕ-ВВ. жд показує клітини, інкубовані лише гірудином, та є клітини з гірудином та ЕМіІіа. Результати є середніми значеннями та 5О двох окремих експериментів.
Фіг7А: Вплив інгібування РіЗ'-ікінази на хемотаксис у фібробластах, інкубованих з ЕМііа. Клітини попередньо інкубували зі змінюваними концентраціями І У294002 протягом ЗОхв. при 37 С, а потім з Л00нМ
ЕМіа (ш) або без ЕМіІа (2). Інгібітор був присутній весь час протягом хемотаксичного аналізу. Хемотаксис викликався 0,Тнг/мл РОСЕ-ВВ. Результати є середніми значеннями та 50 двох окремих експериментів.
Фіг.8А та 8Б: Вплив інгібування РІ С на хемотаксис у фібробластах, інкубованих з ЕМіІа. Клітини інкубували сч зі змінюваними концентраціями 073122 (активний інгібітор РІ С) (8А) або Ш73343 (неактивний контроль) (8Б) протягом ЗОхв. при 37 9С до інкубації з Л00НМ ЕМІа або без нього, а потім піддавали аналізові у камері (8)
Бойдена з градієнтом концентрації О,Тнг/мл РОСЕ-ВВ. Агенти були присутні весь час протягом експериментів. щ показує клітини з ШУЗ122 або лише 073343, є клітини з ОУЗ3122 або 073343 та ЕМІПа. Результати є середніми значеннями та ЗО двох окремих експериментів. ів)
Фіг.9: Вивільнення інозиттрифосфату (ІР з) з фібробластів, стимульованих ЕМІа, лише ЕЕК-ЕМіїа або у с комбінації з РОСБЕ-ВВ. Клітини мітили до наступного дня міо-| ЗНІ-інозитом, інкубували з 100нМ ЕМіа або
ЕЕК-ЕМіїа або без них за відсутності або у присутності ТОнг/мл або 10О0нг/мл РОСБ-ВВ. Клітини після цього со піддавали аналізові на вивільнення в ІР з. Незаштрихованими стовпчиками показано клітини без ЕМіїа або ю
ЕЕК-ЕМііа (контроль), заштрихованими стовпчиками показано клітини з РЕК-ЕМІа, і чорними стовпчиками показано клітини, інкубовані з ЕМІа. -
Фіг.10: Тирозинове фосфорилування РІ С-1 у відповідь лише на РОСЕБЕ-ВВ (контроль), ЕМПа або ЕЕК-ЕМіІІа у комбінації з РОСБЕ-ВВ. Клітини інкубували з ТЛ00НМ ЕМІПа або РЕК-ЕМПа протягом однієї години, а потім з
РОСБЕ-ВВ або без нього у зазначених концентраціях. Клітини піддавали лізисові і тирозинове фосфорилування «
РІ С-1 визначали, як описано для способів.
Фіг.1. Нозерн-блотинг на підтвердження даних, отриманих в аналізах з мікромножиною кДНК. Десять г повної - с РНК (з тих самих зразків РНК, які використовували для виділення полі--А)-РНК для утворення зондів для "з гібридизації мікромножини кКДНК) піддавали нозерн-блотингові й зондували ЗР-міченим Сугб1 (кДНК часткової " довжини від Сепотіс Зузіетв). Панель В. Сигнали гібридизації кількісно визначають за допомогою
Ріозріогітадег (МоіІесшаг бупатісв).
Фіг.2 та 2Б. Викликана залежним від часу фактором Мііа експресія Сугб1. Нерухомі моношари УМІ-38 клітин - обробляли фактором Мііа (5г/мл) (2А) або РОСБ-ВВ (1Онг/мл) (2Б) протягом різних періодів часу. Повну РНК «сл (10г) піддавали нозерн-блотингові й зондували радіоактивно міченим Сугб1. Забарвлення бромідом етидію 285 рибосомної РНК відповідної плями показано на нижній панелі як завантажувальний контроль РНК. со Фіг.3. Викликана залежним від дози фактором Мійіа експресія Сугб1. Нерухомі моношари клітин УМІ-38
Ф 20 обробляли різними дозами фактора Мііа, 0, 0,1, 0,5, 2,0 та 5,Ог/мл протягом 45хв. Повну РНК (10г) піддавали нозерн-блотингові й зондували радіаційно міченим Сугб1. Забарвлення бромідом етидію 285 рибосомної РНК сл відповідної плями показано на нижній панелі як завантажувальний контроль РНК.
Фіг.4. Каталітична активність фактора Мііа є необхідною для викликання експресії Суг61. Нерухомі моношари
УМІ-38 клітини обробляли контрольним середовищем без сироватки або середовищем без сироватки, що містило фактор Мііа (5г/мл) або інактивованим фактором Мііа активного сайта (Мііаі, 5г/мл) протягом 45хв. Повну РНК
ГФ) (10г) піддавали нозерн-блотингові й зондували радіоактивно міченим Сугб1. Забарвлення бромідом етидію 285 рибосомної РНК відповідної плями показано на нижній панелі як завантажувальний контроль РНК. ді Фіг.5. Викликана фактором Мііа експресія Сугб1 не анулюється специфічними інгібіторами фактора Ха та тромбіну. Нерухомі моношари УМІ-38 клітин обробляли контрольним середовищем або середовищем, що містило 60 фактор Мііа (5г/мл; 100НМ протягом 45хв. Клітини попередньо інкубували з 200НМ рекомбінантним ТАР, смуга 3) або гірудином (смуга 4) протягом ЗОхв. до піддання дії фактора Мііа протягом 45хв. Повну РНК (10г) піддавали нозерн-блотингові й зондували радіаційно міченим Сугб1. Забарвлення бромідом етидію 285 рибосомної РНК відповідної плями показано на нижній панелі як завантажувальний контроль РНК.
Фіг.6. Вплив актиноміцину-ЮО та циклогексіміду на рівень викликаної фактором Мііа Сугб1 мРНК у стійкому бо стані. Нерухомі моношари УМІ-38-клітин попередньо інкубували з контрольним носієм, актиноміцином О (10г/мл)
або циклогексімідом (1Ог/мл) протягом ЗОхв. до піддання клітин дії фактора Ма (5г/мл) протягом 45хв. Повну
РНК (10г) піддавали нозерн-блотингові й зондували радіаційно міченим Сугб1. Забарвлення бромідом етидію 285 рибосомної РНК відповідної плями показано на нижній панелі як завантажувальний контроль РНК.
Фіг.7. Фактор Ма викликає експресію СТОР.
Нерухомі моношари УУІ-38-клітин обробляли фактором Мііа (5г/мл) протягом різних періодів часу. Повну РНК (10г) піддавали нозерн-блотингові й зондували радіоактивно міченим СТОР. Забарвлення бромідом етидію 285 рибосомної РНК відповідної плями показано як завантажувальний контроль РНК.
Даний винахід стосується застосування ЕМІЇ або ЕМіа або іншого агоніста ТЕ для одержання 7/0 фармацевтичної композиції для викликання або посилення міграції клітин.
В іншому аспекті даний винахід стосується застосування ЕМІІ, ЕМІа або іншого агоніста ТЕ для одержання фармацевтичної композиції для викликання або прискорення загоєння ран або ангіогенезу.
У ще одному аспекті даний винахід стосується застосування ЕРМііаі або іншого антагоніста ТЕ для одержання фармацевтичної композиції для інгібування або запобігання міграції клітин.
В одному з варіантів втілення міграція клітин є предметом винаходу.
В іншому аспекті даний винахід стосується застосування ЕМііІаі або іншого антагоніста ТЕ для одержання фармацевтичної композиції для інгібування або запобігання ангіогенезові, метастазові, ростові пухлин або інвазії пухлини.
В іншому аспекті даний винахід стосується способу викликання або посилення міграції клітин у пацієнта, який включає введення ефективної кількості ЕМІЇ або ЕМіІІа або іншого агоніста ТЕ вищезгаданому пацієнтові.
У ще одному аспекті даний винахід стосується способу інгібування або запобігання міграції клітин у пацієнта, який включає введення ефективної кількості ЕМіїаї або іншого антагоніста ТЕ вищезгаданому пацієнтові.
У конкретному варіанті втілення ефективна кількість є денною дозою, яка становить приблизно від сч
Ббмг/кг/день до приблизно 5О0Омг/кг/день.
В іншому варіанті втілення антагоніст ТЕ включає модифікований ЕМіІа, наприклад, ЕЕК-ЕМІа. (8)
Даний винахід забезпечує механізм активності ЕМІЇ та/"або ЕМіІа, який стосується стимуляції міграції клітин. Такий механізм пропонує запровадження залучення ЕМІ! та/"або ЕМІа у патологічних станах, у яких беруть участь клітини, що експресують ТЕ, такі як ендотеліальні клітини, епітеліальні клітини, фібробласти, ю
Зо Клітини гладенького м'яза та моноцити/макрофаги. Винахід також пропонує основу для ідентифікації конкретних фармакологічних мішеней, які застосовують для терапевтичного втручання. ікс,
Таким чином, даний винахід стосується застосування ЕМІЇ та/або ЕМІа та/або ЕМіІаії у терапевтичному со лікуванні патологічних станів, які можуть стосуватися міграції клітин або виліковуватися специфічним регулюванням міграції клітин. о
В іншому аспекті даний винахід стосується способу виявлення можливих ліків, що регулюють міграцію клітин, ї- який включає а) культивування клітини, що експресує ТЕ; б) вимірювання міграції клітини; в) інкубування клітини з випробуваними ліками та « г) вимірювання міграції інкубованої клітини та визначення будь-якої зміни у рівні міграції порівняно з з с міграцією, виміряною на етапі (б), причому така зміна вказує на біологічну активність випробуваних ліків у вищезгаданій клітині. ;» Взагалі, компоненти крові, які беруть участь у так званому "каскаді" коагуляції, є проферментами або зимогенами, ферментативно неактивними білками, які перетворюються на протеолітичні ферменти під дією активатора, який сам є активованим фактором згортання. Фактори коагуляції, піддані такому перетворенню, -І мають загальну назву "активних факторів" і позначаються додаванням літери "а" до назви фактора коагуляції (наприклад, фактор Ма). о Термін "цинковий комплексон" означає сполуку, яка зв'язується з фактором Мііа і викликає заміщення іонів
Го! кальцію на іони цинку у факторі Ма, таким чином, інгібуючи активність фактора Ма або комплексу фактор во тканини-фактор Міта (ТЕ-ЕМІПа).
Ме. Придатним антагоністом ТЕ згідно з винаходом може бути сполука, яка утворює комплекси з цинком, с наприклад, дигідроксамат або дигідразид з гідроксаматною або гідразидною групами, розміщеними відносно одна одної в такій позиції, що вони здатні утворювати комплекс з іоном цинку. Сполука, яка утворює комплекси з цинком, діє у комбінації з ЕМІа. Іони 7п?" справляють свою інгібіторну дію у конкуренції зі стимулюючим впливом іонів Са?", Передбачається, що іони 7п2" зміщують іони Са?" з одного або кількох місць зв'язування кальцію з ЕМПа. Сполуки, які утворюють комплекси з цинком, наприклад, гідроксамати та гідразиди, здатні о діяти як потужні підтримувачі зв'язування іонів цинку у конкуренції з іонами кальцію. Специфічні сполуки, іме) таким чином, посилюють інгібування цинком активності комплексу фактор Мііа/фактор тканини. Активність фактора Мііа у комплексі з фактором тканини може інгібуватися через механізм, у якому цинковий комплексон 60о зв'язується з фактором Мііа і забезпечує заміщення Са?" на 7п27. Цим комплексон справляє модулюючий вплив на ТЕ при нормальній концентрації вільних іонів Са?" та 7п2" у крові.
Термін РМІ!" або "фактор МІ!" означає "одноланцюговий" (зимогенний) фактор коагуляції МІІ. Термін "Фактор
Ма" або "ЕМІПа" означає "дволанцюговий" активований фактор коагуляції МІЇ, розщеплений шляхом специфічного розщеплення у пептидному зв'язку Ага152-Пе153. ЕМІІ та ЕМІа очищують від крові або виробляють бо рекомбінантними способами. Зрозуміло, що практичне втілення описаних авторами способів не залежить від шляху отримання очищеного фактора МПа, а отже, даний винахід можна вважати таким, що охоплює застосування будь-яких препаратів фактора МІЇ або ЕМіІІіа, придатних для застосування. Перевагу віддають ЕМІІа людини. До ЕМІЇ або ЕМІПа також належать варіанти ЕМІЇ, у яких заміщено один або кілька амінокислотних залишків.
Термін "модифікований фактор МІ!І", "І(нактивований ЕММ" або "ЕМіІаї" означає ЕМІа, який має принаймні одну модифікацію в його каталітичному центрі, яка значною мірою інгібує здатність модифікованого ЕМІа до активації ЕХ та РІХ. Терміни можуть використовуватися переміжно. До таких модифікацій належать амінокислотне заміщення (або заміна) одного або кількох каталітичних тривалентних залишків Зег 344, Авр 142 /о та Нів 193, а також модифікація каталітичних тривалентних залишків інгібіторами серинпротеази, такими як органофосфорні сполуки, сульфанілфторид, пептидгалометилкетон або азапептид. РЕК-ЕМІПа є одним з прикладів похідної ЕМіІаї, яку одержують шляхом блокування активного центра ЕМіїа необоротним інгібітором, р-фенілаланін-! -фенілаланін-! -аргінінін-хлорметилкетоном (БЕК стК). Іншими придатними похідними ЕМііаі є інактивовані ЕМіа, одержані або одержувані шляхом блокування активного центра 75 І|-фенілаланін-І--фенілаланін-І -аргінінін-хлорметилкетоном, дансил-їі -фенілаланін-І -фенілаланін-і! -аргінінін-хлорметилкетоном, або дансил-О-фенілаланін-! -фенілаланін-! -аргінінін-хлорметилкетоном, причому перевагу віддають ЕГЕК-ЕМіІІа (ЕМіІпа, інактивований РЕК стк).
Термін "білкова кіназа" означає фермент, здатний фосфорилувати серин та/або треонін та/або тирозин у го пептидах та/або білках.
Термін "випробувані ліки" означає будь-який зразок, який має біологічну функцію або справляє біологічний вплив на клітинну систему. Цей зразок може бути зразком біологічного матеріалу, такого як мікробний або рослинний екстракт, або може бути зразком, який містить сполуку або суміш сполук, одержані шляхом органічного синтезу або генної інженерії. сч
Термін "агоніст ТЕ" охоплює сполуки, які включають а) трансдукцію сигналу шляхом прямого зв'язування з ТЕ (наприклад, ЕМІІа), і) б) стимуляцію МАРК-каскаду, с) відміну інгібування МАРК (наприклад, інгібіторів РТРази), агоністами яких є випробувані ліки, визначені вище. ю зо Термін "Антагоніст ТЕ" включає а) реагенти, які конкурують з ЕМііа у зв'язуванні з ТЕ без трансмісії, наприклад, ЕМІІаї, ісе) б) реагенти, які зв'язуються з ЕМіІіа і перешкоджають зв'язуванню з ТЕ, наприклад, гідроксамат цинку, со в) реагенти, які інгібують трансдукцію сигналу, перешкоджаючи елементам МАРК-каскаду, г) реагенти, які зв'язуються з ЕМІІа/ТЕ і перешкоджають трансмісії, о д) реагенти, які зв'язуються з ЕМІа/ТР/ЕХ і перешкоджають трансмісії, ї- е) реагенти, які блокують активацію фактора Х людини, каталізовану комплексом фактор тканини/фактор Ма, антагоністами яких є випробувані ліки, визначені вище.
Термін "фармакологічні мішені" означає білок, який може змінювати міграцію клітин, що експресують ТЕ.
Термін "ген-репортер" означає послідовність ДНК, яка, будучи транскрибованою, виробляє білок, який може « 70 бути виявлений. в с Термін "елемент ЗКЕ-промотора" означає послідовність ДНК, яка зв'язується з факторами транскрипції, викликаними компонентами, присутніми у сироватці. ;» Термін "клітина, що експресує ТЕ" означає будь-яку клітину ссавця, що експресує ТЕ.
Термін "фосфорилування білка" означає фосфорилування серину та/або треоніну та/або тирозину у пептидах та/або білках. -І Модуляцію або регулювання міграції клітин визначають як здатність ЕМіїа або іншого агоніста ТЕ, або
ЕМііві або іншого антагоніста ТЕ 1) збільшувати або зменшувати поточну, нормальну або аномальну міграцію о клітин, 2) викликати нормальну міграцію клітин та 3) викликати аномальну міграцію клітин.
Го! Модуляцію або регулювання експресії гена визначають як здатність ЕМіІіа або іншого агоніста ТЕ, або ЕМІІаї або іншого антагоніста ТЕ 1) збільшувати або зменшувати поточну, нормальну або аномальну міграцію клітин, 2)
Ме, викликати нормальну міграцію клітин та 3) викликати аномальну міграцію клітин. сп У цьому контексті термін "лікування" охоплює як профілактику негативного стану, так і регулювання вже існуючого стану з метою інгібування або мінімізації стану. Таким чином, профілактичне введення ЕМіІа або іншого агоніста ТЕ, чи РМііаі або іншого антагоніста ТЕ, охоплюється терміном "лікування".
У цьому контексті терміном "одна одиниця" визначають кількість фактора МІЇ, присутнього в їмкл нормальної плазми, яка відповідає приблизно 0,5мг білка. Після активації 50 одиниць відповідають приблизно мкг білка.
Ф) У цьому контексті терміном "пацієнт" визначають будь-яку тварину, зокрема, ссавця, наприклад, людину. ка Термін "суб'єкт" застосовується переміжно з терміном "пацієнт"
Скорочення 60
ТЕ фактор тканини
МІ фактор МІ! в його одноланцюговій, неактивованій формі
ЕМпа фактор МІ! в його активованій формі
КЕМПа рекомбінантний фактор МІ! в його активованій формі 65 ЕМіаї модифікований (інактивований) фактор МІЇ
ЕЕК-РміЇаі фактор МІІ, інактивований шляхом реакції з О-РНе-І-РНе-І -Ага-хлорметилкетоном
Фактор тканини (ТЕ) є клітинним рецептором для фактора ЕМііа (ЕМіІіа), і комплекс є основним ініціатором коагуляції крові. Авторами було досліджено вплив зв'язування ЕМііа зв'язування з ТЕ на міграцію клітин та трансдукцію сигналу фібробластів людини, що експресують велику кількість ТЕ. Фібробласти, інкубовані з ЕМІа, мігрували до градієнта концентрації РОСЕ-ВВ при концентрації, приблизно у сто разів нижчій, ніж потрібна для фібробластів, не зшитих з ЕМіІІа. Антитіла проти ТЕ інгібували збільшення хемотаксису, викликане ЕМПал/ТР.
Крім того, з інгібованим в активній ділянці ЕМПа (РЕК-ЕМіІа) спостерігали помітне пригнічення хемотаксису, викликаного РОСЕ-ВВ. Виключалася можливість викликання гіперхемотаксису утворенням ЕХа та активністю тромбіну. то ЕМііа викликав вироблення інозит-1,4,5-трифосфату тією ж мірою, що й РОСЕ-ВВ; вплив ЕМІа та РОСЕ-ВВ був додатковим. ЕЕК-ЕМІа не викликав ніякого вивільнення інозит-1,4,5,-трифосфату. Реакція міграції клітин до РОСЕ-ВВ та ЕМііа повністю блокувалася інгібітором РІ С, що вказувало на те, що активація РІ С є важливою для реакції. Таким чином, зв'язування ЕМііа з ТЕ, незалежно від коагуляції, може модулювати клітинні реакції, такі як хемотаксис, і каталітична активність ЕМІа є необхідною. т5 Вважають, що ТЕ виконує свою функцію у метастазі клітин пухлин, але її механізм ще не відомий. Однак у зовсім новій роботі (ОЙ еї а.) було розпізнано актинозв'язувальний білок 280 (АВР-280) як ліганд для цитоплазматичного домену ТЕ, який забезпечує молекулярний шлях, яким ТЕ може підтримувати метастаз клітин пухлин. Однак молекулярні сигнали та біологічні функції, перетворені ЕМІа/ТтЕ, і досі є мало зрозумілими.
Фібробласти людини мають конститутивну експресію ТЕ. Ці клітини також експресують рецептори для тромбоцитарного фактора росту (РОСЕ). РОС викликає у клітинах-мішенях мітогенність, реорганізацію актинів та спрямовану міграцію клітин (хемотаксис). Раніше авторами було продемонстровано, що РОСБЕ-ВВ є ефективним хемотаксичним фактором для фібробластів людини, і що хемотаксична реакція опосередковується класом В-рецепторів. Таким чином, ці клітини було вибрано для дослідження ймовірної трансдукції сигналу та міграції клітин, викликаних зв'язуванням ЕМіа з ТЕ. сч
Нижче авторами вперше демонструється чіткий взаємозв'язок між сигналом, викликаним зв'язуванням ЕМіІа з Го)
ТЕ та клітинною реакцією на фактор росту. Авторами представлено дані, згідно з якими у фібробластах людини комплекс ЕМІПа/ТЕ веде до гіперхемотаксичної реакції на РОСЕ-ВВ. Крім того, інгібований в активній ділянці
ЕМПа (РЕК-ЕМІПа) залежно від дози пригнічує спрямовану міграцію до РОСЕ-ВВ. Шляхом застосування ю специфічних інгібіторів до РІС та фосфатидилінозит-3-кінази (РіІЗ'-кнази) також демонструється, що й й й й й гіперхемотаксична реакція на РОСЕ-ВВ, викликана сигналом ЕМІІа/ТЕ, залежить від активності фосфоліпази С (Се) (РІ С), але не залежить від РІЗ--кінази. ЕМІїа та РОСЕ-ВВ викликали вироблення інозит-1,4,5-трифосфату (ІР 5), со одного з других посередників, вивільнених після активації РІ С, адитивним шляхом.
ТЕ конститутивно експресується на плазматичній мембрані багатьох позасудинних клітин, таких як ІФ) фібробласти строми у судинній адвентиції та в фіброзних капсулах печінки, селезінки та нирок. Таким чином, м експресія ТЕ виявляється у місцях, які є фізично відокремленими від циркулюючої крові і забезпечують кровоспинну оболонку. Очевидно, у разі поранення цей бар'єр захищає організм від кровотечі. Однак ТЕ може індукуватися у моноцитах/макрофагах, судинних клітинах гладенького м'яза, ендотеліальних клітинах та у багатьох клітинах пухлин різними агентами, включаючи цитокіни та фактори росту. Індукція на транскрипційному « дю рівні швидко відбувається після стимуляції, вказуючи на ТЕ як на пов'язаний з ростом безпосередній ранній ген. -
У даному дослідженні автори вивчали роль ТЕ як сигнального рецептора. Було показано, що фібробласти с людини з конститутивною експресією ТЕ після зшивання ЕМііа мігрують до найнижчої концентрації РОСЕ-ВВ. :з» Лише ТР/РМііа не викликає підвищення спонтанної міграції, тобто безладної міграції. Таким чином, комбінація внутрішньоклітинної трансдукції сигналу через ЕМІа/ТЕ та фактора росту РОСЕ-ВВ була необхідною для досягнення реакції рухливості. Обов'язковим є не лише зв'язування з ТЕ, але й каталітична активність - 15 ТЕР/ЕМІа, оскільки інгібований в активній ділянці ЕМІа не викликав реакції міграції. Крім того, інгібіторні моноклональні антитіла перешкоджали посиленню хемотаксичної реакції з боку ЕМІЛа. Автори також виключили 1 можливість непрямого сигналу через ЕХа або тромбін, оскільки ТАР та гірудин не мають впливу на викликаний со ЕМІале хемотаксис. Натомість авторами було виявлено, що підвищення концентрації ЕЕК-ЕМіІ(а активно інгібує викликаний РОСЕ-ВВ хемотаксис. Фібробласти, інкубовані з ЕЕК-ЕМІа, демонстрували повністю нормальну (о) 20 безладну міграцію. Інгібіторний вплив РЕК-ЕМІа на викликаний РОСЕ-ВВ хемотаксис не спостерігався у сл присутності комбінації антитіла проти ТЕ, таким чином, виключаючи ймовірність токсичності ЕЕК-ЕМІа.
Результати свідчать, що не клітини, які експресують РОСЕ В-рецептори та ТЕ, а скоріше комплекс ЕМІПа/ТЕ є важливим для хемотаксичної реакції на РОСЕ-ВВ.
Виявлений авторами факт того, що ЕМіІіа збільшує вироблення ІР з, та раніше отримані дані щодо викликаної
ЕМПале осциляції Са 2 зокрема, у клітинах МОСК, є надійним підтвердженням ідеї, згідно з якою РІС (Ф) активується сигналом ЕМІІа/ТЕ у багатьох клітинах. До того ж, гіперхемотаксична реакція у фібробластах людини
ГІ на РОСЕ-ВВ, викликана ЕМіІа/ТЕ, блокувалася залежно від дози інгібітором РІС. Раніше авторами було виявлено подібну гіперхемотаксичну реакцію на РОСЕ-ВВ у мутантних клітинах РОСЕ В-рецептора У9ЗАЕ, які бор Виявляли підвищення фосфорилування та активацію Рі С-1. У цих клітинах підвищене фосфорилування РІ С-1 співвідносилося з утричі вищим виробленням ІР з порівняно з експресуючими РОСЕ В клітинами дикого типу.
Комбінація ЕМПа/ТЕ та РОСЕ-ВВ викликала приблизно подвійне підвищення вироблення ІР з у фібробластах людини. Однак викликане ЕМІІа/ТЕ вироблення ІР»з не співвідносилося з фосфорилуванням РІ С-1. Тирозинове фосфорилування РІ С-2, викликане ЕМІІа/ТЕ не можна виключати, але воно є малоймовірним, оскільки експресія 65 РІ С-2 у фібробластах людини є дуже низькою. Крім того, внутрішньоклітинна частина ТЕ не має власної активності тирозинкінази білка. Ці результати вказують на те, що ЕМіІІа/ТЕ викликає активацію В та/або у РІС ізомерів. В аналізі вивільнення ІР 3 середовище культури клітин доповнювали 0,190 ЕВ5, що містила лише приблизно 0,1нМ ЕХа. Авторами було виявлено, що для викликання вироблення ІР з є необхідною концентрація понад 20НМ ЕхХа. Механізм, через який активуються В або и РІС ізомери, залишається нез'ясованим. Можливо, активація пов'язана з взаємодією між ТЕ та домішковим білком мембрани.
Останнім часом було ідентифіковано зв'язок ТЕ з цитоскелетом. Було продемонстровано молекулярну взаємодію між цитоплазматичним доменом ТЕ та філаміновим білком АВР 280, що зв'язує актин. Крім того, було виявлено, що ТЕ перебуває у тісному контакті з актином та філаміновими білками, що зв'язують актин, такими як
А-актинін та АВР280 у ламелоподіях та гофрованих ділянках мембрани у поширенні епітеліальних клітин. АВР 70 280, член підродини філамінів, є необхідним для нормального функціонування ламелоподій, а отже, дуже важливим для рухливості клітин. РІЗ'-кіназа та РІ С ізоферменти беруть участь у хемотаксичних реакціях, таких як мобілізація актинозв'язувальних білків. У попередніх дослідженнях автори спостерігали, що шлях РіІЗ'-кінази у викликаному РОСЕ-В рецептором хемотаксисі, очевидно, є менш важливим у клітинах з надмірною експресією та підвищеною активністю РІ С-1 Це також стосувалося клітин з ЕМІа, зв'язаним із ТЕ. Це свідчить про те, що /5 величина активації РІЗ'-кінази та РІС ізоферментів визначає, який з цих шляхів домінуватиме. Зведені докупи, ці дані авторів показують, що міграція клітин є важливою морфогенною функцією, викликаною сигналом ЕМІПа/тЕ.
Хемотаксис відіграє вирішальну роль у загоєнні ран, ангіогенезі та метастазі. Хемотаксис також є важливим компонентом в утворенні атеросклеротичних бляшок. У цих процесах різні клітини експресують ТЕ, а також
РОСЕ та рецептори РОСБЕ.
Рестеноз є основним ускладненням, яке трапляється після процедури втручання в непрохідні артерії. РОСЕ бере участь у реакції стінок судин (утворенні неоінтими) на механічне пошкодження, опосередковуючи міграцію та проліферацію клітин гладенького м'яза та фібробластів. Авторами було вперше продемонстровано, що ЕМіІІа, який зв'язуєтья з експресуючими ТЕ клітинами виявляє підвищену хемотаксичну реакцію на РОСОБЕ, яка є незалежною від коагуляції. с
На даний час мало що відомо про сигнальні шляхи, викликані протеолітично активним Мііа, та про те, яким чином сигнали, викликані Ма, можуть брати участь у клітинних процесах. Можливо, ЕМІа здатен викликати о експресію регуляторів росту, які діють нижче для викликання клітинних процесів. Для дослідження цієї можливості у даній роботі авторами вивчалися зміни у транскрипційній програмі у фібробластах людини у відповідь на піддання дії Мііа з застосуванням мікромножини кКДНК, що містять понад 8000 окремих генів людини. ою
Авторами було вибрано фібробласти, оскільки ці клітини зазвичай контактують із сироваткою, що містить фактори росту та активовані фактори згортання у зв'язку з пошкодженням судин через фізичні (наприклад, о хірургію) та патофізіологічні умови. Тимчасова програма експресії гена, яку спостерігали в реакції на Ге) сироватку, свідчить про те, що фібробласти є запрограмованими на сприйняття різкої дії сироватки не як загального мітогенного подразника, а як специфічного фізіологічного сигналу. Характеризація транскрипційної о
Зз5 активації у реакції на сироватку та фактори росту також свідчить про те, що фібробласти є активними р учасниками діалогу між різними клітинами, які разом контролюють запалення, ангіогенез та загоєння ран.
Аналіз мікромножини кКДНК з мРНК, виділеною з фібробластів, підданих дії Ма протягом 9Охв., виявляє підвищувальну регуляцію Сугб1. Нозерн-блотинг підтверджував викликану Мііа експресію Сугб1 у фібробластах.
Хоча й не так сильно, як у фібробластах, Ма також посилює експресію Сугб1 у судинних клітинах гладенького « 70 м'яза. Викликання експресії Сугбб1 залежить від каталітичної активності ЕМіІа, оскільки ЕМіІІаї не здатен шщ с викликати експресію Сугб1. Хоча фактор Ха та тромбін також можуть викликати експресію Сугб1 (дані показано), й ці сполуки не беруть участі у викликаній ЕМІПа експресії Сугб1. Авторами не було виявлено жодних доказів «» утворення слідів фактора Ха та тромбіну в даній експериментальній системі. Крім того, специфічний інгібітор фактора Ха та тромбіну не мали значного впливу на викликану ЕМіІІа експресію Сугб1.
Сугб1 є безпосереднім раннім геном, який транскрипційно активується факторами росту сироватки у -І фібробластах. Він кодує багатий на цистеїн гепарин-зв'язаний білок масою 40ОкДа, який асоціюється з позаклітинним матриксом та поверхнями клітин. Сугбб! належить до родини виникаючих генів збережених та і-й модулярних білків, яка характеризується присутністю М-кінцевого секреторного сигналу, за яким ідуть чотири о модулярні структурні домени та 38 цистеїнових залишків, які значною мірою зберігаються серед членів родини.
Ця родина білків нині складається з шістьох окремих членів, включаючи Сугб1, фактор росту сполучної тканини
Фо (СТОР) та пташиний протоонкопротеїн Мом (таким чином, названа ССМ-родиною) (ССМ-родину докладніше 4 описано у роботі Гай еї а. Ехр. СеїЇ Кез 248: 44-57, 19991). Виявлено, що Сугб1-білок (ї) стимулює приєднання та поширення ендотеліальних клітин приблизно так, як це робить фібронектин, (ії) посилює вплив
ЬБЕОЕ та РОСОБЕ на інтенсивність синтезу ДНК фібробластів та судинних ендотеліальних клітин, (ії) стимулює Міграцію клітин як у фібробластах, так і в ендотеліальних клітинах. Останні дослідження показують, що Сугб1 діє як ліганд на інтегрин АВ з, рецептор адгезії, який бере участь у сигналі, який регулює багато клітинних іФ) процесів, включаючи ангіогенез та метастаз пухлин. Очищений Сугб1-білок виявляв стимулюючу дію на ко спрямовану міграцію ендотеліальних клітин мікросудин людини у культурі залежним від АВз шляхом і викликає утворення нових судин рогівки щурів. Крім того, експресія Сугб1 у клітинах пухлин стимулює ріст пухлин та бо васкуляризацію.
На основі представлених даних, які показують, що ЕМІПа викликає експресію Сугб1 у фібробластах, можна твердити, що індукований ЕМіІа Сугб1, діючи через інтегрин АВз, відповідає за опосередковану ЕМіІІа міграцію клітин та метастаз пухлин. Таким чином, Сугб1 зв'язує ЕМІа-ТЕ протеолітичний сигнал з сигнальним шляхом інтегрину. Спостереження, згідно з якими каталітична активність Ма є необхідною для міграції клітин б5 гладенького м'яза та клітин пухлин і метастаз пухлин, не суперечать іншим спостереженням, згідно з якими каталітична активність ЕМіІІа є необхідною для індукції Сугб1.
Крім Сугб1, Ма також може індукувати інші регулятори, які можуть опосередковувати викликані ЕМІа біологічні реакції. Було виявлено, що зв'язування ЕМіа з ТЕ поверхні клітин у клітинах раку підшлункової залози здатні до селективної надмірної експресії ШРАК гена. Раніше автори з застосуванням технології диференціального показу продемонстрували підвищувальну регуляцію транскрипції гена полі(А)полімерази у фібробластах, підданих дії ЕМІПа. Хоча цікаво було б з'ясувати, чи фільтр не містить РАР кДНК, якщо мікромножина кКкДНК також виявляє диференціальну експресію РАР. Крім Сугб1, дана мікромножина кКДНК також виявляє диференціальну експресію чотирьох інших генів (див. результати), але коефіцієнт диференціальної експресії був дуже близьким до граничного значення. Оскільки у попередніх експериментах автори не могли 7/о підтвердити їх диференціальну експресію шляхом нозерн-блотингу, а також за відсутності будь-яких навідних даних щодо здатності цих генних продуктів опосередковувати викликані ЕМііа біологічні реакції, автори проаналізували їх експресію докладніше. Однак, оскільки СТОР є молекулою, структурно спорідненою з Сугбї1, і виявляє такі ж біологічні реакції, як і Сугб1, авторами було досліджено експресію СТОЕ навіть незважаючи на те, що відносний показник експресії СТОР в обробленому ЕМіІІа зразку порівняно з контрольним зразком у 7/5 Мікромножині кКДНК становить 1,8 (2 є оцінкою з завищеною похибкою для реальної величини у випробуванні).
Дані показали, що ЕМІа також викликав експресію СТОР, і динаміка викликаної Ма експресії СТОР була подібною до динаміки Сугб1.
Хоча СТОР поводить себе дуже схоже до Сугб1, між ними існують тонкі розбіжності. Наприклад, (а) СТОЕ виявляє природну мітогенність, а Сугб1 не має природної мітогенної активності, але посилює викликаний фактором росту синтез ДНК, (б) Суг61 стимулює хемотаксис, а СТОЕ стимулює і хемотаксис, і хемокінез, (в) хоча і Сугб1, і СТОР є ЕСМ-асоційованими сигнальними молекулами, СТОР секретується у середовище культури.
Таким чином, можливо, що ЕМііа регулює клітинні функції за місцем через Сугб1, хоча й діє на відстані від свого місцезнаходження через секрецію СТОР.
Режим для кожного пацієнта, який має бути підданий лікуванню ЕМііа або іншим агоністом ТЕ чи ЕМііаі або сч об іншим згаданим авторами антагоністом ТЕ, визначається спеціалістами. Денна доза, яка має вводитись при о терапії, визначається лікарем і залежить від конкретної застосовуваної сполуки, від шляху введення та від маси та стану пацієнта. Ефективною кількістю є відповідна денна доза приблизно від Бмг/кг/день до
Б5ООмг/кг/день, в оптимальному варіанті - приблизно від 1Омг/кг/день до ЗО0Омг/кг/день, ще краще - приблизно від 15мг/кг/день до 200мг/кг/день, найкраще - приблизно від 20мг/кг/день до 10Омг/кг/день. ю зо ЕМііа або інший агоніст ТЕ чи РМіІаі або інший антагоніст ТЕ вводять як одиничну дозу, але його також можуть вводити як багаторазові дози, в оптимальному варіанті - з інтервалами 4-6-12 годин, залежно від дози со та стану пацієнта. со
ЕМПа або інший агоніст ТЕ чи ЕМііІаії або інший антагоніст ТЕ вводять внутрішньовенно або шляхом безперервного чи пульсуючого вливання, або вводять прямо у відповідне місце, наприклад, шляхом ін'єкції о зв прямо у пухлину. ЕМііа або інший агоніст ТЕ чи ЕМііаі або інший антагоніст ТЕ в оптимальному варіанті вводять ї- шляхом внутрішньовенних ін'єкцій і у кількості приблизно 100-100000 одиниць на кг маси тіла, краще - у кількості приблизно 250-25000 одиниць на кг маси тіла, що відповідає приблизно 5-50Омкг/кг, дозі, яка може повторно вводитись 2-4 рази за 24 години.
Традиційні способи одержання фармацевтичних композицій, які можуть бути застосовані згідно з даним « винаходом, описано, наприклад, у Кетіпдіоп'є Рнпаптасешііса! Зсіепсевз, 1985. з с Композиції, застосовувані згідно з цим винаходом, одержують способами, які є зрозумілими спеціалістам. . Стисло кажучи, фармацевтичні композиції, придатні для застосування згідно з даним винаходом, одержують и? шляхом змішування ЕРМІЇ, ЕМііа або іншого агоніста ТЕ або РМііІаі або іншого антагоніста ТЕ, в оптимальному варіанті - в очищеній формі, з придатними ад'ювантами та придатним носієм або розріджувачем. До придатних фізіологічно прийнятних носіїв або розріджувачів належать стерильна вода та сольовий розчин. До придатних -І ад'ювантів у даному разі належать кальцій, білки (наприклад, альбуміни) або інші інертні пептиди (наприклад, гліцилгліцин) або амінокислоти (наприклад, гліцин або гістидин) для стабілізації очищеного фактора Міїіа. о Іншими фізіологічно прийнятними ад'ювантами є невідновлювальні цукри, поліспирти (наприклад, сорбіт, маніт о або гліцерин), полісахариди, такі як декстрини з низькою молекулярною масою, детергенти (наприклад, полісорбат) та антиоксиданти (наприклад, бісульфіт та аскорбат). Ад'юванти, як правило, є присутніми. у
Ме. концентрації від 0,001 до 4905 (маса/об'єм). Фармацевтична композиція також може містити інгібітори протеази, с наприклад, апротинін, та консерванти.
Композиції стерилізують, наприклад, шляхом фільтрування крізь фільтр, що затримує бактерії, шляхом включення до композицій стерилізуючих агентів, шляхом опромінення композицій або шляхом нагрівання композицій. Вони також можуть вироблятися у формі стерильних твердих композицій, які можуть бути розчинені у стерильній воді або якомусь іншому стерильному середовищі, придатному для ін'єкцій до або безпосередньо (Ф, перед застосуванням. ка В різних аспектах даний винахід стосується:
Способу регулювання експресії принаймні одного гена в клітині, який включає етапи: во а) контактування вищезгаданої клітини з фактором МІ! (а) або антагоністом фактора тканини, б) визначення експресії вищезгаданого гена у вищезгаданій клітині.
Вищезгаданого способу, в якому вищезгадана клітина є судинною клітиною людини, що експресує фактор тканини, включаючи фібробласти та клітини гладенького м'яза.
Способу, в якому вищезгаданий ген вибирають з групи, яка складається з Сугб1, СТЕРЕО, рецептора допаміну 65 02, ЕТ Іпсуїе РО 395116 або Р2) нуклеотидного рецептора.
Способу, в якому вищезгаданий антагоніст фактора тканини є модифікованим фактором МІ! (а), відомим як фактор Мііаі.
Способу, в якому експресію вищезгаданого гена посилюють.
Способу, в якому експресію вищезгаданого гена інгібують або мінімізують.
Способу посилення експресії вищезгаданого гена, який охоплює контактування клітини з фактором Ма.
Способу інгібування експресії вищезгаданого гена, який охоплює контактування клітини з модифікованим фактором МІЇ, відомим як ЕМІіаї.
Способу, в якому вищезгаданий ген є ЕТ РОб74714.
Способу регулювання міграції клітин, який включає етапи: 70 а) контактування вищезгаданої клітини з фактором Мііа або антагоністом фактора тканини; б) визначення міграції вищезгаданої клітини.
Способу, в якому вищезгадана клітина є клітиною людини, яка експресує фактор тканини, включаючи фібробласти, клітини гладенького м'яза, клітини пухлин, кровотворні клітини та епітеліальні клітини.
Способу, в якому антагоніст фактора тканини є модифікованим фактором Мііа, відомим як фактор Мііаі.
Способу, в якому модифікований фактор МІ вибирають з-поміж дансил-РНе-Рго-Агд-хлорметилкетону, дансил-СІШ-Сіу-Агда-хлорметилкетону, дансил-РПе-Рпе-Агд-хлорметилкетону та Рпе-РПпе-Агд-хлорметилкетону.
Способу посилення міграції клітин, який охоплює контактування клітини з ЕМІа або агоністом фактора тканини.
Способу зниження або інгібування міграції клітин, який охоплює контактування клітини з антагоністом фактора тканини.
Способу викликання або прискорення загоєння ран у пацієнта, який охоплює введення вищезгаданому пацієнтові ефективної кількості фармацевтичної композиції, яка включає фактор Мійїа або агоніст фактора тканини.
Способу інгібування інвазивності клітин пухлин, який охоплює контактування вищезгаданих клітин з сч ов ефективною кількістю антагоніста фактора тканини.
Способу інгібування міграції клітин, інвазії, викликаної міграцією проліферації клітин або ангіогенезу у і) пацієнта, який має захворювання або стан, пов'язані з небажаною міграцією клітин, інвазією, викликаною міграцією проліферації клітин, або ангіогенезом, який охоплює введення вищезгаданому пацієнтові ефективної кількості фармацевтичної композиції, яка включає а антагоніст фактора тканини. ю зо Способу, в якому хвороба або стан є розвитком первинної пухлини, інвазією пухлини або метастазом.
Способу, в якому антагоніст фактора тканини є модифікованим фактором МІЇ, відомим як ЕМІіІаї. ісе)
Застосування фактора Мііа або антагоніста фактора тканини для одержання медикаменту для регулювання со міграції клітин.
Застосування, згідно з яким фактор Мііїа використовують для одержання медикаменту для посилення міграції о клітин. ї-
Застосування, згідно з яким антагоніст фактора тканини використовують для одержання медикаменту для зниження або інгібування міграції клітин.
Способу, в якому антагоніст фактора тканини є модифікованим фактором Мііа, відомим як фактор Мііаі.
Застосування, згідно з яким модифікований фактор МІ вибирають з-поміж « дансил-Рпе-Рго-Агд-хлорметилкетону, дансил-с1и-с1у-Аго-хлорметилкетону, з с дансил-Рпе-Рпе-Агд-хлорметилкетону та Рпе-Рпе-Агд-хлорметилкетону.
Й Даний винахід далі пояснюється на нижчеподаних прикладах, які, однак, не можна вважати такими, що а обмежують обсяг захисту. Особливості, викладені у вищеподаному описі та у нижчеподаних прикладах, можуть як окремо, так і у їх комбінації, бути суттєвими для реалізації винаходу в його різноманітних формах.
ПРИКЛАДИ
-І Приклад 1
Одержання РМІЇ о Очищений фактор Міїа людини, придатний для застосування у даному винаході, в оптимальному варіанті
Го! одержують за технологією рекомбінантної ДНК, (наприклад, як описано в роботі Надеп еїш аї., бор Ргос.Ман.Асай.Зсі. ОА 83: 2412-2416, 1986, або як описано в Європейському патенті Мо200 421 (7утосСепеїісв))|.
Ме, Фактор МііІа, одержаний за рекомбінантною технологією, може бути автентичним фактором Мііа або більш або сп менш модифікованим фактором Мііа, за умови, що такий фактор Ма має практично таку ж саму біологічну активність щодо коагуляції крові, що й автентичний фактор Ма. Такий модифікований фактор Ма може бути одержаний шляхом модифікації послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує фактор МІІ, або шляхом зміни амінокислотних кодонів, або видалення деяких амінокислотних кодонів у нуклеїновій кислоті, що кодує природний РМІЇ відомими способами, наприклад, шляхом сайт-специфічного мутагенезу.
Ф) Фактор МІЇ також може бути одержаний способами, (описаними в роботах Вгоге апа Маїегив, 9У.ВіІоІЇ. Спет. ка 255 (4): 1242-1247, 1980, та Недпег апа Кізієї, 9У.Сііп.Іпмеві. 71: 1836-1841, 1983). Ці способи забезпечують фактор МІ! без помітної кількості інших факторів коагуляції крові. Можна одержати навіть ще більше очищений бо препарат фактора МІї, додавши гель-фільтрацію як остаточний етап очищення. Фактор МІ! після цього перетворюють на активований ЕМііа відомими засобами, наприклад, кількома різними білками плазми, такими як фактор ХіІпа, ЇХ а або Ха. В альтернативному варіанті, як (описано в роботі Віоет еї аї!. (Кезеагсп Оізсіовиге, 269 Беріетрег 1986, рр. 564-565)), фактор МІЇ може бути активований шляхом пропущення його через іонообмінну хроматографічну колонку, таку як Мопо ОЗ (Рпагтасіа їпе Спетіса!в) або іншим подібним способом. 65 Приклад 2
Одержання ЕМіІіаї
Модифікований фактор МІЇ, придатний для застосування у даному винаході, одержують, наприклад, як (описано у Міжнародних публікаціях МоМе92/15686, 94/27631, 96/12800 та 97/47651 7утосепеїйісв/Момо Могаїзк|.
Приклад З
Вплив ЕМіІІа та ЕЕК-ЕМіІІа на хемотаксичну реакцію фібробластів на РОСЕ-ВВ
Фібробласти, які експресують активний ТЕ (Фіг.1А та Фіг.18В) інкубували з Т0ОнНМ РМіга і висівали у верхній частині модифікованої камери Бойдена; водночас під фільтр з мікропорами 150мкм додавали середовища, які містили 10956 ЕВ5 та РОСБЕ-ВВ у різних концентраціях. Міграцію клітин в умовах додавання під фільтр середовища, яке містило 1095 ЕВ5 без РОСЕ-ВВ, використовували як міру безладної міграції і розраховували як 7/0 10090 міграцію. Значну міграційну реакцію реєстрували при концентрації О,О0їнг/мл РОСБЕ-ВВ у клітинах, стимульованих ЕМііа порівняно з Інг/імл РОСЕБЕ-ВВ для клітин, не зшитих з ЕМіІІа, тобто при 100-разовій різниці у концентрації (Фіг.2А). При 0,01-0,їнг/мл РОСБ-ВВ міграційна реакція на ЕМІїа посилювалася залежно від дози, починаючи з 25НМ, і з максимальним ефектом при 50-100нМ ЕМііа (Фіг.ЗзЗА-О0). Ніякого збільшення безладної міграції не спостерігали після активації за допомогою ЕМІа. Для того, щоб перевірити, чи є протеолітично активний ЕМіІа обов'язковим для гіперхемотаксичної реакції на РОСЕ-ВВ, фібробласти також інкубували з 100нМ
ЕЕК-РМіга і піддавали аналізові у камері Бойдена таким самим чином (Фіг.2А). Ніякого збільшення хемотаксису не спостерігали з ЕЕК-ЕМііа при низьких концентраціях РОСЕ-ВВ, 0,01-Тнг/мл. На відміну від цих концентрацій, досягали явного пригнічення хемотаксису, викликаного 10-БбОнг/ммл РОСЕ-ВВ, за допомогою 100НМ РЕК-ЕМІа (Фіг.2А та ЗА-Г). Коли фібробласти попередньо інкубували з сумішшю трьох різних антитіл проти ТЕ, а потім з ЕМіа або РЕК-РМіІга, міграційна реакція на РОСЕ-ВВ була ідентичною реакції фібробластів без присутності ліганда, зв'язаного з ТЕ (Фіг4А). Стороннє моноклональне антитіло проти дб не перешкоджало ні гіперхемотаксисові, викликаному ЕМіІа, ані інгібуванню міграційної реакції, викликаної РЕК-ЕМІа (дані не показано). Присутність антитіл до ДС антитіл або трьох антитіл проти ТЕ не змінювала безладної міграції фібробластів (дані не показано). с
Приклад 4
Гіперхемотаксична реакція не опосередковується ЕХа або тромбіном і)
Оскільки викликана ЕМіІіа трансдукція сигналу, що веде до гіперхемотаксичної реакції на РОСБЕ-ВВ, залежала від каталітичної активності ЕМІа, важливо було визначити, чи зустрічається сигнал безпосередньо, чи через
ЕХа або тромбін, генерований комплексом ЕМііа/ТЕ. Підвищена міграційна реакція, перетворена ЕМПале, ю зо блокувалася 0,2-10мкМ антикоагулянтного пептиду кліща (ТАР), який специфічно блокує активну ділянку ЕХа і перешкоджає подальшій активації каскаду коагуляції, що веде до утворення тромбіну (Фіг.5А, 5Б). Так само й ісе) додавання 5Бод./мл гірудину, специфічного інгібітора тромбіну не мало ніякого впливу на викликаний ЕМіІПа/ТЕ со гіперхемотаксис (ФігбА). ТАР та гірудин не впливали на міграцію фібробластів у реакції на РОСРЕ без присутності ЕМІа ліганда (Фіг.5А, 58, бА). о
Таким чином, видається малоймовірним, що вплив ЕМііа на хемотаксис є опосередкованим активацією ЕХ ї- або тромбіну.
Приклад 5
Гіперхемотаксична реакція на РОСЕ-ВВ залежить від РІ С-залежних шляхів, але не залежить від Р13'-кінази.
Останнім часом було виявлено, що активація РіІб'-кінази є важливою для викликаного РОСЕ В-рецептором « Ххемотаксису. Таким чином, авторами було досліджено, чи здатен І У294002, специфічний інгібітор РІЗ'кінази, пт») с блокувати хемотаксичну реакцію, викликану сигналом ЕМІа/ТЕ. Фібробласти попередньо обробляли І 294002 у . зазначених концентраціях протягом 30 хвилин при 37 «С перед додаванням Т100нНМ ЕМііа і піддавали аналізові у «» камері Бойдена, як було описано. Концентрацію РОСЕ-ВВ підтримували незмінною на рівні О,Тнг/мл протягом усього досліду, тобто на дуже низькому рівні, при якому ЕМІПа/ТЕ викликав значну хемотаксичну реакцію.
ЇМ294002 був присутній весь час протягом експериментів. На Фіг.7А показано, що міграційна реакція на -і РОСБЕ-ВВ, опосередкована сигналом ЕмІіа/ТЕ, не зазнавала впливу інгібування РІБ'-кінази.
Для того, щоб дослідити, чи бере участь викликана ЕМІІа/ТЕ хемотаксична реакція в активації специфічної іні до фосфатидилінозиту фосфоліпази С (РІС), автори попередньо інкубували фібробласти з різними о концентраціями 073122, специфічного інгібітора РІ С, протягом 30 хвилин при 37 2С до додавання ТОМ ЕМІІа; о 50 Клітини після цього піддавали аналізові хемотаксису у присутності інгібітора. Як негативний контроль використовували близький аналог, 073343, без впливу на РІ С. Концентрацію РОСЕ-ВВ підтримували незмінною сл на рівні О,Тнг/мл і в цих експериментах. Попередня обробка клітин активним інгібітором РІ С 073122 інгібувала гіперхемотаксичну реакцію на 0,їнг/мл РОСЕ-ВВ залежно від дози, з повним інгібуванням при 1мкМ (Фіг.вА та 8Б). При застосуванні неактивованого аналога 073343 не спостерігали ніякого впливу на хемотаксис.
Приклад 6
ЕМІале викликає активацію РІ С
Ф, Для подальшого дослідження значення активності РІС для гіперхемотаксичної реакції автори також ко аналізували прямий вплив ЕМіІІа/ТЕ на активність РІ С у фібробластах. Активація РІ С веде до вироблення двох інших посередників, інозит-1,4,5-трифосфату (ІРз) та діацилгліцерину. Фібробласти інкубували з 60 міо-ІЗНІ-інозитом до наступного дня, а потім з Л00НМ ЕМІа або ЕЕК-ЕМІа протягом 60 хвилин, після чого здійснювали інкубацію з РОСЕ-ВВ або без нього у зазначених концентраціях. Обробка 1Л00нНМ самого ЕМІа протягом 60 хвилин викликала вивільнення ІР з у фібробластах на тому самому рівні, що й при 1Онг/мл та 10Онг/мл самого РОСЕ-ВВ (Фіг.9). Крім того, комбінація 100нНМ ЕМіа та ТОнг/мл або 1ООнг/мл РОСЕ-ВВ подвоювала вивільнення Р. Інгібований в активній ділянці ЕМІІа не викликав вивільнення ІР з. Ці результати б5 явно свідчать, що РІ С активується після зв'язування ЕМіІа з ТЕ.
Приклад 7
Фосфорилування РІ С-1 не посилюється сигналом ТЕ/ЕМіІа у фібробластах
Для того, щоб визначити, чи відповідає ізоформ РіС-1, який активується певними рецепторами тирозинкінази, за підвищення активності РІ С, викликане ЕМІІа/ТЕ, досліджували тирозинове фосфорилування
РІ С-1. Фібробласти інкубували за відсутності або у присутності Л00НМ ЕМіа чи ЕРЕК-ЕМіІІа протягом однієї години, після чого стимулювали 0, 2, 10 або 10О0нг/мл РОСЕ-ВВ. Через 5 хвилин інкубації клітини піддавали лізисові і РІС-1 піддавали імунопреципітації, відокремлювали шляхом 5ЗО5-РАСЕ і піддавали імуноблот-аналізові антитілом проти фосфотирозину. Якщо при підвищенні концентрації РОСЕ-ВВ спостерігали значне підвищення фосфорилування РІ С-1 тирозином, то додавання самого ЕМііа до фібробластів не викликало 7/0 Ніякого фосфорилування РІС-1 тирозином (Фіг.10). Крім того, комбінація ЕМІПа та РОСБ-ВВ у різних концентраціях не викликала ніякого подальшого фосфорилування порівняно зі стимуляцією самим РОСЕ-ВВ (Фіг.10). РЕК-ЕМіІїа не мав ніякого впливу на фосфорилування РІ С-1 тирозином (Фіг.10). Таким чином, за підвищення активності РІ С після ЕМІа-стимуляції відповідають інші ізоформи РІ С, крім РІ С-1.
Приклад 8
Способи
Культури клітин. Фібробласти крайньої плоті людини, АС1518 та АС1523 вирощували до злиття у МЕМ Ігла з 1096 сироватки ембріона великої рогатої худоби (ЕВ5). Перед застосуванням клітини відщеплювали шляхом трипсинізації (2,5мг/мл протягом 1Охв. при 37 С), промивали у збалансованому соляному розчині Хенка і ресуспендували у МЕМ Ігла з 1095 ЕВ5 або у середовищі Хема з додаванням 0,195 ЕВ5.
Білки. ЕМПа людини (Момо МогаїзкК А/5, СепіоПе, Данія), експресували й очищали, як описано29. ЕЕК-ЕМІПа (Момо МогаїзкК) одержували шляхом блокування ЕМііа в активній ділянці О-РНе-І -Рпе-І -Ага-хлорметилкетоном.
Рекомбінантний антикоагулянтний пептид кліща (ТАР) було люб'язно надано доктором П. Власюком (Ог. Р.
Міазик), Согмаз (Сан-Дієго, Каліфорнія). Гірудин було придбано у бідта. І 294002, 073122 та 073343 було отримано від Віотої (Ріутоцій Меейпо, Пенсильванія). Моноклональні антитіла проти ТР, ТЕ8-5659, ТР9-587 та су
МТЕН-1 (Мотізвзеу, ..Н., Раї, 0.5., Еддіпдіп, Т.5. Мопосіопа! апіроду апаїузіз ої ригйвей ої апа сеїІ-аззосіаїед (ізвце Тасіог. Типготр. Кев. 52, 247-261 (1988)) було люб'язно надано доктором Джеймсом Г. о
Моріссеєм (Ог. датевз Н. Могтіззеу) з Організації медичних досліджень штату Оклахома (ОКіапота Меаісаї!
Кезеагсп Рошпааїйоп). Антитіло проти фосфотирозину, РУЗ99 було отримано із Санта-Круз, Каліфорнія.
Проточна цитометрія. Поверхневу експресію ТЕ аналізували шляхом імунофлуоресценції проточним ою цитометром (СоцМег Ерісв ХІ-МСІ, ВесКтап Сошц(ег, Ешіепоп, Каліфорнія, СоцМег ЕІесігопісвб, США).
Інструмент градуювали щодня за допомогою калібрувальних гранул Іттипо-Снеск або Ріом/ Спеск (Соцег). Для о експериментів непрямої імунофлуоресценції фібробласти АсС1518 або АС1523 двічі промивали РВ5, що містив Ге) 0,195 альбуміну сироватки великої рогатої худоби (ВЗА), інкубували протягом ЗОхв.-рз на льоді з міченим флуоресцеїн-ізотіоціанатом (РІТС) моноклональним антитілом ТЕ проти людини (4508С), Атегісап Оіадповіїса, о Сгеепмісп, Сі, США). Як негативний контроль, використовували моноклональним антитілом дсС!І проти р. аспергілонігерглюкозооксидази (Оакорайв). Для кожного зразка визначали середню інтенсивність флуоресценції (МЕЇ) та відсоток позитивних клітин.
Визначення активності ТЕ. Прокоагулянтну активність ТЕ визначали, (як описано в роботі І іпатагк еї аї. (іпатагк, Е., Теппо, Т., Спеп, 9., Зіедрапйп, А. 1/-10 іппірі І РоБ-іпдисей питап топосуїе і(іззце Тасіог « ехргеввіоп іп м/поїе ріоод. Вг. У. Наетаїйо!. 102, 597-604 (1998))Ї. Стисло кажучи, аліквоти, що містили 0,2105 с фібробластів Аб1518 або АсС1523, двічі промивали РВ5, поміщали у лунки 9б-лункового мікротитрувального й планшета (Мипс, КозвкКіїде, Данія). Прокоагулянтну активність вимірювали шляхом двоетапного амідолітичного «» аналізу, в якому хромогенний субстрат, 5-2222 (Спготодепіх, МоіІпаа!, Швеція), розщеплювали ЕхХа, який, у свою чергу, активували з ЕХ комплексом ТЕ/ЕМІПа. У лунки додавали реакційну суміш, що містила кінцеву
Концентрацію 0,бмМ 5-2222, 2мМ СасСі» та фактори коагуляції з концентрату фактора Ргоїпготріех-ї ТІМА -і (Вахіег, Відень, Австрія) у кінцевій концентрації Тод./мл ЕМІІ та 1,2од./мл ЕХ і визначали зміну оптичної густини при 405нм після З0-хвилинної інкубації при 372С. Вимірювання здійснювали тричі.
Мн Аналіз хемотаксису. Міграційну реакцію фібробластів піддавали аналізові за допомогою технології "Іеадіпа (ос) їопі" у модифікованій камері Бойдена, (як було описано раніше (Зіедрапп, А., Напітаснег, А., УУезіегтагк, В., Неїдіпй, С-Н. ОййбегепіаІ! еПесів ої (йе магіоиз ізоїогтв5 ої ріафеІе(-адегімей дгомлй Тасіог оп спетоїйахів ої б Тргоріазів, топосуїез, апа дгапицосуфев. 9. Сійп. Іпмеві. 85, 916-920 (1990) та Мівіег, М., Наттаснег, А., с Меївігот, К., Зіедрайп, А., Коппвігапа, |, МУевіептагк, В., Неїдіпї, С-Н. А діота-дегімеа РОСБЕА снНаїп
Потодітег паз айегепі Топсіопа! асімйевз їот а РОСЕ АВ Пеїйегодітег ригійвй їот Ппитап ріагереі5. Сеї 52, 791-799 (1988))). Фільтр з мікропорами (розмір пори 8мкм) тримали вкритим розчином колагену 1 типу при Кімнатній температурі до наступного дня. Фільтри висушували у повітряній сушарці протягом 30 хвилин безпосередньо перед використанням. Фібробласти крайньої плоті людини АсС1523 вирощували до злиття у МЕМ і) Ігла з додаванням 1095 ЕВ5. Клітини віддеплювали шляхом трипсинізації (2,5мг/мл протягом 10 хвилин при іме) 372) і суспендували у МЕМ Ігла з 1095 ЕВ5. Фібробласти перед аналізом інкубували протягом 10 хвилин з ЕМІїа або БЕЕК-ЕМПа або без них. На фільтри камери Бойдена поміщали сто мікролітрів суспензії клітин 60 (2105клітин/мл). РОСЕ-ВВ розводили у середовищі для аналізу (МЕМ Ігла з 1095 ЕВ5) і додавали під фільтр у камеру. Клітини інкубували протягом б годин при 372С у зволоженій камері, що містила 9595 повітря/595 СО ».
ЕМіа або ЕГЕК-РМІІа були присутні весь час протягом експерименту. Фільтри після цього забирали, фіксували в етанолі, забарвлювали барвником Мауегз Нетаїшп і вставляли. Міграцію вимірювали як відстань між двома найдальшими переміщеними ядрами фібробластів одного потужного поля (12,524) у центрі. Відстань міграції в бо кожному фільтрі розраховували як середнє значення замірів для принаймні трьох різних частин фільтра.
Експерименти здійснювали з двома-чотирма окремими фільтрами для кожної концентрації хемоатрактанта. Для кожної серії експериментів за контроль брали міграцію фібробластів до середовища для аналізу.
У випадках, коли використовували моноклональні антитіла проти ТЕ або інгібіторі фактора коагуляції, ТАР та гірудин, клітини попередньо інкубували протягом 10 хвилин з цими агентами, потім з ЕМІїТа або ЕЕК-ЕМІа або без них перед здійсненням аналізу хемотаксису. Антитіла, ТАР або гірудин також були присутні протягом усього експерименту з хемотаксисом. В експериментах, коли випробували вплив на міграційну реакцію різних інгібіторів, 294002, 073122 або 073343, клітини попередньо інкубували протягом 30 хвилин з інгібіторами у зазначених концентраціях, і інгібітори також були присутні весь час протягом експериментів. 70 Аналіз вивільнення інозиттрифосфату (ІР 3). Шестилункові планшети з напівзлитими культурами АС1518 фібробластів людини інкубували до наступного дня (приблизно 20 годин) 2мКі міо(ЗН)-інозиту (Атегепат) у 2мл
Е12 Хема з 0,195 ЕВ5. Середовище змінювали на Е12 Хема з 0,195 ЕВЗ (що містив 2мМ Сасіг) та 20мМ іс Її клітини інкубували протягом 15 хвилин при 37 2С. Клітини після цього інкубували за відсутності або у присутності Л00НМ ЕМіїа або 100НМ ЕРЕК-ЕМіІІа протягом однієї години. Додавали РОСБЕ-ВВ (0, 10 або 10Онг/мл), і 75 інкубація тривала протягом 10 хвилин при 37 С. Аналіз ІРз здійснювали, |Як було описано раніше у роботі
Еріксона та ін. (Егіквзоп, А., Мапрего, Е., Коппвзігапа, Її, Еподвігот, М., Неїтап, О., Кирр, Е., Сагрепівг, б., Неїдіпї, С-Н., СІаезвзоп-МУеівй, |. ЮОетопзігайоп ої Тпсіопайу айегепі іпіегасіопз /Бреїмееп рпозроїїразе С- апа (пе їмо (урез ої ріа(ееї-дегімейд дгоулй Тасіог гесеріогв. 9. Віоії. Спет. 270, 7773-7781 (1995))).
Аналіз викликаного агоністом фосфорилування Рі С-1. Напівзлиті культури АС1518 витримували з 20 сироваткою до наступного дня (приблизно 20 годин) у середовищі, яке містило 0,195 ЕВ5, а потім інкубували за відсутності або у присутності Л00НМ ЕМіїа або РЕК-РМіІа протягом однієї години, після чого інкубували з 0, 2, або 10Онг/мл РОСЕ-ВВ протягом 5 хвилин при 37 2С. Клітини піддавали лізисові і РІ С-1 осаджували практично так, |Як було описано раніше (Напзеп, К., дойппеїЇ, М., Зіедрайп, А., Когзтап, С, Еподвігот, |.,
МУетвівйді, С, Неїдіп, С-Н., Коппзігапа, Ї. Миїайоп ої а Згс рпозрпогуїайоп збе іп Ше РОС В-гесеріог Ієеадзї СМ 0 іпстеазеа РОСБЕ-віітицагєеай спетоїахів риї десгеазей тйодепезіз. ЕМВО 3). 15, 5299-5313 (1996) о антисироваткою проти РІ С-1, отриманою шляхом імунізації кролів пептидом, який відповідав карбокси-кінцеві великої рогатої худоби РІ С-1 (Апеда, С.Ї., доппзоп, М.О., Тоддегоа, с., СоПеу, К.)., Сагрепіег, с., Раде,
О.Ї ЕІемайей сопіепі ої (Ше (угозіпе Кіпазе зирзігаїе рпозрпоїїразе С-1 іп ргітагу питап бБгеаві сагсіпотав.
Ргос. Май). Асад. Ба. О5БА 88,10435-10439 (1991)). Зразки відокремлювали за допомогою 5О05-РАСЕ і піддавали ІФ) імуноблот-аналізові антитілом проти фосфотирозину РУЗ99. «со
Статистичний аналіз. Дані аналізували, використовуючи 5іаїізіса ТМ для пакета М/іпдом/в (Зіаібоїї, Тиїза,
Оклахома, США). Т-тест Ст'юдента для залежних зразків застосовували для визначення статистичної значущості 00 між різними наборами даних. Р-значення «0,05 вважали статистично значущими. ю
Білки. Рекомбінантний Мііа людини, отриманий у подарунок від МОМо МогаїзК (Сепіоїйе, Данія), відтворювали у стерильній воді у концентрації від 1 до 1,Змг/мл. Базові розчини Ма перевіряли на наявність слідів і - забруднення ендотоксином, застосовуючи лізат ІптиШв-амебоцитів (Віо МУпібакег), і їх виявлено не було (рівень виявлення ЗОпг). Рекомбінантний антикоагулянтний білок кліща (ТАР) було люб'язно надано Джорджем
Власюком (Сеогде Міазик) (Согуаз, Сан-Дієго, Каліфорнія), а рекомбінантний гірудин отримували від Зідта « (Сент-Луїс, Міссурі) або СаїЇріоспет (Сан-Дієго, Каліфорнія). Очищений фактор Ха людини та тромбін отримували від Епгуте Кезеагсі І арогайгієз (5оціпрепа, Індіана). ші с Мікромножина кДНК. Клітини УМІ-38 культивували до 8095 злиття, і сироватку відбирали протягом 24 годин м для досягнення нерухомого стану, як описано вище. Культуральне середовище заміняли свіжим ОМЕМ без я сироватки (з додаванням 5мММ Сасі») і залишали стабілізуватися на 2год. в інкубаторі. Після цього клітини обробляли очищеним рекомбінантним Мііа (5мкг/мл) протягом ЗОхв. Наприкінці 9Охв. обробки з необроблених (контрольних) та оброблених Мііа клітин видобували повну РНК, використовуючи ТгігоЇї (5ІВСО ВК). - Полі--А)З-РНК очищали подвійним пропущенням через колонку для виділення мРНК Оїїдо Тех, як описано в сл інструкції виробника (Оіадеп). Вісімсот нг (80Онг) високоочищеної полі--А)-РНК з контрольних та оброблених
Ма клітин відправляли на аналіз мікромножини кКДНК (Нитап ОпісЕеЕМ М тісгоатау, Сепоте бувіетв Іпс, (о) Сент-Луїс, Міссурі). бо 50 Нозерн-блотинг. Повну РНК одержували, застосовуючи реагент ТКІ2ОЇ. з нерухомого моношару клітин УМІ-38, які піддавали дії Мііа, та інші матеріали, як описано в Результатах. Нозерн-блотинг здійснювали, застосовуючи сл стандартну процедуру. Тобто, 10мкг повної РНК фракціонували за розміром шляхом гель-електрофорезу в гелях 195 агарози/695 формальдегіду і переносили на нітроцелюлозну мембрану шляхом капілярного блотингу.
Нозерн-блоти попередньо гібридизували при 422С з розчином, що містив 5095 формаміду, 55552, 5ОММ Ттгів. НСІ, го рН7,5, 0,195 пірофосфату натрію, 195 5О5, 195 полівінілпіролідону, 195 Рісої, 25МмМ ЕОТА, 10О0мкг/мл. ДНК (ФІ денатурованого молочка лосося та 195 В5А і гібридизували з зондом кКДНК З2Р-міченого Сугб1 (10берт/мл).
Гібридизовані мембрани експонували перед рентгенівською плівкою Юиропі МЕР або Рції ЕХ. Для кількісного о визначення мембрани експонували перед люмінофорним екраном протягом 1-4год. і експоновані екрани аналізували у пристрої РіозрПогітдег (МоіІесцаг бупатісв), застосовуючи програму "квантування зображення". 60 Для отримання середніх значень одиниці (результати підрахунків) різних експериментів нормалізували до зовнішнього контролю (результату для обробленого контролем зразка).
Хромогенний аналіз. Клітини У/І-38 культивували в 96-лунковому планшеті і забезпечували їх нерухомість, як описано вище. Після промивання клітин у лунки, що містили клітини, або лунки, вкриті буфером (без клітин), додавали ЕМіІІа (б5мкг/мл) у 1,00мкг кальційвмісного буфера. Після ЗОхв. інкубації у лунки додавали 25мкг бо хромогенних субстратів для фактора Ха та тромбіну, тобто, Спготогут Х та Спготогут ТН. Після Згод.
проявлення кольору планшети зчитували у рідері. Використовувані як контроль клітини інкубували зі слідовими концентраціями фактора Ха (від 50 до 0О,Мнг/мл) або тромбіну (від 0,1 до 0,002од./мл). Не спостерігали ніякої різниці в оптичній густині при 450НМ між Мііа, доданим до клітин або Ма, доданим у лунки, які не містили клітин. Показник зчитування був нижчим за показники, отримані при найнижчій концентрації фактора Ха або тромбіну, і він представляє хромогенну активність Ма.
Приклад 9
Мікромножина кДНК. Нерухомі фібробласти піддавали дії контрольного середовища без сироватки або середовища без сироватки з додаванням Мііа (бмкг/мл) протягом УОхв. (три колби Т-75 для кожної обробки). 7/0 Після обробки збирали повну РНК і виділяли полі--(А)-РНК. Шістсот нг мРНК мітили флуоресценцією СуЗ або
Суб, а потім гібридизували з Опібет Нитап У, що містив 8000 перевірених послідовністю ЕЗТ, які представляли до 5000 відомих генів людини (послуги було надано безкоштовно (зепоте Зузіет Іпс). Контрольний планшет, у якому відома концентрація контрольної КДНК вступала у реакцію генерації зонда, застосовується для вимірювання чутливості та відстеження реакції зворотної транскрипції, очищення та визначення ефективності гібридизації, і загальна картина якості та ефективності аналізу свідчили про успішність процесу гібридизації.
Загальний аналіз експериментальних даних виявив мінімальні розбіжності в сигналах гібридизації між контрольним та обробленим МІЇ зразками. Лише невелика кількість генів виявляла помірну диференціальну експресію. Авторами було виявлено підвищувальну регуляцію 5 генів (3,5-2-разове підвищення при обробці Мііа) в той час, як один ген виявляв знижувальну регуляцію після обробки Мііа (2,4-разове зниження) (7-2 є оцінкою го З завищеною похибкою для визначення мінімальної величини реальних коефіцієнтів). Ідентичність підданого 3,5-разовій підвищувальній регуляції гена не виявлялася через його природу. Іншими генами, підданими підвищувальній регуляції Ма, є Сугб1 (2,5-разова), рецептор допаміну 02 (2,2-разова), ЕТ Іпсуїе РО 395116 (2-разова) та Р2О нуклеотидний рецептор (2-разова). Цікаво зазначити, що СТОР, ген, який належить до родини
Сугб1, виявляв 1,8-разове підвищення в оброблених Мііа клітинах порівняно з контрольними клітинами. Підданим сч знижувальній регуляції транскриптом в оброблених Ма клітинах був ЕЗТРОб74714. Для подальшого аналізу авторами було вибрано Сугбе1. і)
Приклад 10
Підтвердження диференціальної експресії Сугб1. Для підтвердження даних, отриманих для мікромножини, автори піддавали зразок РНК з контрольних та оброблених Мііа клітин (ті ж самі зразки РНК, які ю зо Використовували для одержання полі«-А)-РНК для генерації зонда у мікромножині) нозерн-блотингові й зондували радіаційно міченим Сугб1 кДНК. Дані показують, що Сугб1 кКДНК зонд гібридизувався з окремим ісе) транскриптом (приблизно 2,0кб) РНК, виділеної з контрольних та оброблених Мііа клітин. Однак інтенсивність со сигналу гібридизації була значно вищою в РНК, виділеній з оброблених Мііа клітин (Фіг.1). Квантизація сигналу гібридизації виявила, що експресія Сугб1і була у 2,8 рази вищою в клітинах, підданих дії Міа, ніж в о оброблених контролем клітинах. ча
Приклад 11
Динаміка викликаної Мііа експресії Сугб1. Для визначення динаміки експресії Сугб1 нерухомі фібробласти обробляли протягом різних періодів часу 5мкг/мл Мііа. Видобували повну РНК і піддавали нозерн-блотингові. Як показано на Фіг.2, експресія Сугбб1 посилювалася залежно від часу в оброблених Мііа клітинах. Експресія « досягала піку приблизно на 45 хвилині, а після цього знижувалася до базового рівня за 2-Згод. Оскільки з с повідомлялося, що експресія Сугб1 у фібробластах миші після стимуляції сироваткою та фактором росту зберігалася протягом кількох годин (до 8-10год.), перш ніж відбувалося пригнічення, автори дослідили вплив ;» сироватки та РОСЕ на динаміку експресії Сугб1 в нерухомих фібробластах людини, УМІ-38. Як показано на Фіг.2Б,
Сугб1 експресується лише на короткий час після стимуляції РОСЕ і повністю пригнічується через 2год. після додавання стимулятора. Подібні результати було отримано для викликаної сироваткою експресії Сугб1 (дані не -І показано).
Приклад 12 1 Викликана фактором Ма залежно від дози експресія Сугб1. Для визначення залежності від дози Ма
Го! нерухомі фібробласти обробляли різними дозами ЕМііа (від 0,1 до бмкг/мл) протягом 45хв., а потім зразки повної РНК з клітин піддавали нозерн-блотингові. Як показано на Фіг.3, обробка фібробластів О,1мкг/мл ЕМІа
Ме, була достатньою для викликання експресії Сугб1, а концентрація у плазмі ЕМІ(а) (0О,5мкг/мл, ТОНМ в результаті с забезпечувала значну реакцію, наближену до максимальної.
Приклад 13
Каталітична активність фактора Мііа є необхідною для індукції Сугб1.
Для того, щоб перевірити, чи є каталітична активність Ма необхідною для індукції Сугб1, клітини УМІ-38 обробляли Мііа та інактивованим в активній ділянці ЕМІТа (ЕМіІаї) протягом 45хв., і шляхом нозерн-блотингу
Ф) визначали експресію Сугб1. Як показано на Фіг.4, ЕМііаі не викликав експресії Сугбб1, що свідчило про ка необхідність протеолітичної активності ЕМІІа. У цьому контексті важливо зазначити, що ЕМіІаі зв'язувався з ТЕ поверхні клітин з такою самою або вищою спорідненістю порівняно з ЕМІїа. Малоймовірно, що викликана Мііа бо експресія Сугб1 в даних експериментах була результатом генерації нижчерозташованих факторів коагуляції,
ЕХа та тромбіну. Через застосування чутливих хромогенних аналізів ми не виявили ніяких свідчень генерації фактора Ха та тромбіну в нашій експериментальній системі (чутливість виявлення 1Опг). Крім того, специфічні інгібітори фактора Ха та тромбіну, тобто, антикоагулянтний білок кліща та гірудин, відповідно, не могли відмінити викликану Мііа експресію Сугб1 (Фіг.5). 65 Приклад 14
Участь транскрипційного механізму у зумовленому Мііа рівні МРНК Сугб1 у стійкому стані. Для того, щоб дослідити, чи бере транскрипція участь в опосередкованому Мііа підвищенні рівня мРНК Сугб1 у стійкому стані, нерухомі клітини УМІ-38 інкубували з актиноміцином-О (1Омкг/мл) протягом ЗОхв. перед додаванням Мііа протягом 45хв. Як показано на Фіг.б, актиноміцин-О інгібував стимулюючий вплив Мііа. Ці дані вказують на транскрипційний механізм для індукції Сугб1.
Для того, щоб дослідити, чи є де помо синтез білка необхідним для індукції Субб1 пРНК з боку Міа, клітини УМІ-38 попередньо обробляли інгібітором синтезу білка циклогексімідом до піддання клітин дії МПа протягом 45хв. Як показано на Фіг.б, стимулюючий вплив Ма не блокувався циклогексімідом. Фактично, циклогексімід помітно збільшував викликаний Мііа рівень мРНК Сугб1 у стійкому стані.
Claims (2)
1. Застосування агоніста фактора тканини, що індукує трансдукцію сигналу шляхом прямого зв'язування з ТЕ, де зазначений агоніст фактора тканини являє собою ЕМІЇ або ЕМііа, або їх комбінацію, для одержання лікарського засобу для терапевтичного лікування патологічних станів, що можуть бути пов'язані з міграцією клітин або які можна лікувати специфічним регулюванням міграції клітин або хемотаксисом, причому патологічні стани вибрані зі списку, який включає атеросклероз, метастаз пухлини, ріст пухлини, інвазію пухлини, метастазування, ангіогенез, загоєння ран, включаючи регенерацію стінок судин, опіки та запалення.
2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що клітина являє собою клітину людини, яка експресує фактор тканини, включаючи фібробласти, клітини гладенького м'яза, клітини пухлин, кровотворні клітини, моноцити, макрофаги та епітеліальні клітини. с щі 6) ІФ) (Се) (ее) ІФ) і -
- . и? -і 1 (ее) (о) сл іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14830099P | 1999-08-11 | 1999-08-11 | |
| PCT/DK2000/000401 WO2001005353A2 (en) | 1999-07-14 | 2000-07-14 | USE OF FVIIa OR A TISSUE FACTOR ANTAGONIST FOR REGULATING GENE EXPRESSION AND CELL MIGRATION OR CHEMOTAXIS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA75865C2 true UA75865C2 (en) | 2006-06-15 |
Family
ID=37458638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2002010325A UA75865C2 (en) | 1999-08-11 | 2000-07-14 | USE OF AGONIST OF TISSUE FACTOR FVII OR FVIIa FOR TREATING PATHOLOGIES ASSOCIATED WITH CELL MIGRATION OR CHEMOTAXIS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA75865C2 (uk) |
-
2000
- 2000-07-14 UA UA2002010325A patent/UA75865C2/uk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gschwind et al. | TACE cleavage of proamphiregulin regulates GPCR‐induced proliferation and motility of cancer cells | |
| Ludwig et al. | Enhanced expression and shedding of the transmembrane chemokine CXCL16 by reactive astrocytes and glioma cells | |
| Haspel et al. | The rapid inactivation of nuclear tyrosine phosphorylated Stat1 depends upon a protein tyrosine phosphatase. | |
| US7829529B2 (en) | Use of factor VIIa or a tissue factor antagonist for regulating gene expression and cell migration or chemotaxis | |
| Ouedraogo et al. | Role of STAT3 in genesis and progression of human malignant gliomas | |
| Nimmanon et al. | The ZIP6/ZIP10 heteromer is essential for the zinc-mediated trigger of mitosis | |
| Thompson et al. | Therapeutic targeting of IRFs: pathway-dependence or structure-based? | |
| Whelan et al. | Notch‐1 signaling is lost in prostate adenocarcinoma and promotes PTEN gene expression | |
| Das et al. | Lymphotoxin‐β receptor‐NIK signaling induces alternative RELB/NF‐κB2 activation to promote metastatic gene expression and cell migration in head and neck cancer | |
| Jia et al. | The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells | |
| Henic et al. | EGF-stimulated migration in ovarian cancer cells is associated with decreased internalization, increased surface expression, and increased shedding of the urokinase plasminogen activator receptor | |
| Armbrust et al. | Early gene expression of hepatocyte growth factor in mononuclear phagocytes of rat liver after administration of carbon tetrachloride | |
| Allocca et al. | Serine 897 phosphorylation of EPHA2 is involved in signaling of oncogenic ERK1/2 drivers in thyroid cancer cells | |
| KR20160055923A (ko) | 암 전이 억제 | |
| Sanderson et al. | Hydrogen peroxide and endothelin‐1 are novel activators of betacellulin ectodomain shedding | |
| Cho et al. | Intramembrane proteolysis of an extracellular serine protease, epithin/PRSS14, enables its intracellular nuclear function | |
| UA75865C2 (en) | USE OF AGONIST OF TISSUE FACTOR FVII OR FVIIa FOR TREATING PATHOLOGIES ASSOCIATED WITH CELL MIGRATION OR CHEMOTAXIS | |
| JP2006518992A (ja) | 診断用および治療用標的としてのｓｇｋ１ | |
| Maruvada et al. | Increased transforming growth factor‐α levels in human colon carcinoma cell lines over‐expressing protein kinase C | |
| Hayakawa et al. | Transcriptional regulation of tissue-and urokinase-type plasminogen activator genes by thrombin in human fetal lung fibroblasts | |
| Mufson et al. | A Phosphatidylcholine Phospholipase C Inhibitor, D609, Blocks Interleukin-3 (IL-3)-Inducedbcl-2Expression But Notc-mycExpression in Human IL-3-Dependent Cells | |
| Krizsan | Selective Activation of Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor (TAFI) Attenuates Metastatic and Angiogenic Capabilities of Melanoma and Lung Carcinoma in vitro | |
| Golenar | Oncogenic Activity of Met Receptor Tyrosine Kinase Exon 14 Deletion Variant | |
| Hutchinson | Identification of novel protein kinase regulators of TGFβ signalling | |
| WO2010014643A1 (en) | Irak-1 as regulator of diseases and disorders |