UA73922C2 - Human neurotrophic growth factor (enovin), nucleic acid molecule coding it, vector, plasmid, pharmaceutical composition (variants), antibody, a method for revealing growth factor, set, a method for identification of agonist or antagonist (variants) - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується нейротрофічного фактора та, зокрема, клонування та експресії нового члена 2 родини нейротрофічних факторів СОМЕ, який у даній заявці позначений як "еновін" (ЕММ).

Вступ

Нейротрофічні фактори втягнені у процеси диференціації, розвитку та підтримання діяльності нейронів. Ці білки можуть запобігати дегенерації та можуть сприяти виживанню різноманітних типів нейронних клітин і є, таким чином, потенційними терапевтичними агентами при лікуванні нейродегенеративних захворювань. 70 Нейротрофічний фактор, що походить від гліальної лінії клітин (ЗОМЕ), був першим членом підродини нейротрофічних факторів, що весь час збільшується, які структурно відрізняються від нейротрофінів. СООМЕ є представником трансформуючого ростового фактору Др (ТОБ-д) надродини ростових факторів, що характеризуються специфічною моделлю семи висококонсервативних цистеїнових залишків усередині амінокислотної послідовності (Кіпозіеу, 1994). (ЗОМЕ був спочатку очищений при використанні аналізу, що т грунтується на його здатності до підтримання виживання та функціонування ембріональних вентральних допамінергічних нейронів середнього мозку іп міо (Гіп еї аї., 1993). Інші типи нейронних клітин центральної (СМ5) або периферичної нервової систем (РМЗ) є також чутливими до впливу СООМЕ на процеси виживання

ІНепаегзоп еї аї.,, 1994, Виі-ВеМйо сеї аїЇ.,, 1995, Моипі еї аїЇ., 1995, Оррепіпейт сеї аї.,, 1995). СОМЕ продукується клітинами в неактивній проформі, яка розщеплюється специфічно у КХХК сайті впізнання фуріну для утворення активного (зрілого) ЗОМЕ |Сіп еї аІ., 1993). Екзогенне призначення ЗОМЕ демонструє потенційні нейропротективні ефекти на моделях тварин з хворобою Паркінсона, загальним нейродегенеративним розладом, що характеризується втратою більше 7095 допамінергічних клітин у чорній речовині мозку |Веск еї аї., 1995, Тотас еї аї., 1995, Саві еї аї., 1996, Споїі-І ипабего еї аї., 1997, Віїапо-Віенеї еї аї., 1997).

Нещодавно були відкриті додаткові нейротрофічні фактори родини ЗОМЕ. Неуртурін (МТМ) був очищений з с 29 умовного середовища, з культури клітин яєчника китайського хом'яка (СНО) при використанні методу, що Ге) грунтується на його здатності сприяти виживанню симпатичних нейронів у культурі (Кої26бацег еї аї., 19961.

Зрілий білок МТМ є на 5795 подібним до зрілого ОЗОМЕ. Персефін (РЗР) був відкритий шляхом клонування при використанні виродженого праймера ПЛР з геномною ДНК як шаблону. Зрілий РЗР, подібно до зрілого СООМЕ, сприяє виживанню вентральних допамінергічних нейронів середнього мозку та моторних нейронів у культурі сч

ІМІЇбгапай еї аї., 1998). Подібність зрілого білка РР до зрілого ООМЕ та МТМ складає приблизно 5095. Артемінй СУ (АКТМ) було відкрито шляхом дослідження бази даних ДНК, він є фактором виживання сенсорних та симпатичних нейронів у культурі ІВаїонй еї аї!., 199861. б

СОМЕ, МТМ, РОР та АКТМ вимагають гетеродимерного рецепторного комплексу для того, щоб виконувати со інтрацелюлярну сигнальну трансдукцію у прямому напрямку. СООМЕ зв'язується з субодиницею рецептора альфа 1 родини СОМЕ (СЕКо-1; СЕКо Комітет з номенклатури, 1997), (глікозил-РідІп5), зв'язаного з т глікозил-фосфатидил-інозітолом білка мембрани ЮМіпод еї аїЇ.,, 1996, Тгеапог еї аїЇ.,, 1996, Запісоїа еї аї., 1997). СОМЕКЗЕКоУ-1 комплекс далі зв'язується та активує СКЕТ протоонкоген, тирозин кіназу, зв'язану з мембраною |Ригрес еї а!., 1996, Тгирр еї а!., 1996), що приводить до фосфорилювання залишків тирозину у СКЕТ « 20 та подальшої активації шляхів сигнальної трансдукції у прямому напрямку |МУогру еї аї., 1996). Було -в охарактеризовано декілька інших членів родини СЕКо, рецепторів, що зв'язують ліганд ІВаїой еї аї., 1997, с запісоїа еї аї., 1997, КіІеїп еї аї!., 1997, Ви)-Веїо еї аЇ., 1997, Зумапо еї аі., 1997). СЕКо-2 та СЕКое-З Міпд еї :з» аі,, 1997, Мазиге еї аїЇ., 1998, МУору еї аїЇ.,, 1998, Мамейнат еї аїЇ.,, 1998, Ваюй еї аї., 1998а)| були ідентифіковані різними групами вчених. СОЕКо-1 та СЕКо-2 широко експресуються майже в усіх тканинах, та їх експресія може регулюватись на різних етапах розвитку |Запісоїа е! а!., 1997, УуідепгаїК еї а!., 1997). -І СЕКо-3 не експресується у центральній нервовій системі, що розвивається, або у центральній нервовій системі дорослого, але він інтенсивно експресується у декількох сенсорних та симпатичних гангліях о периферичної нервової системи, що розвиваються, або нервовій системі дорослого |МУідепіаї!кК еї аї., 1998, (Се) Мамеїйап еї а/!., 1998, Ван еї а/!., 1998а). Четвертий представник родини, СЕКо-4, був клонований з кДНК курки юю 5оОо |Потвгоп еї аї., 1998). бЕКа-1 є рецептором для ЗОМЕ, якому надається перевага, у той час як ОЕК 9-2 переважно зв'язується з МТМ |іпо еї аї., 1996, Тгеапог еї аї!., 1996, Кіеїп еї аі!., 1997). Курячий СЕК 7-4 утворює

Із функціональний рецепторний комплекс для РОР у комбінації з СКЕТ (ЕпокКідо еї аї!., 1998). Було показано, що клітини, які експресують як СЕК 9-3, так і СКЕТ, не відповідають ні ОЮОМЕ, ні МТМ, ні РР |(МУогбру еї аї., 1998,

Ван еї аї!., 199в8а). Нещодавно було показано, що АКТ посилає сигнал за допомогою СКЕТ, використовуючи СЗЕКо-3 як ліганд-зв'язуючий рецептор, якому надається перевага |Ваїй еї аї!., 19985). Взаємозв'язок між

ГФ) нейротрофічними факторами та СЕКо, можливий в умовах іп міго, так ЗОМЕ може зв'язуватись з ОЕКо-2 або

СЕКо-3 у присутності СКЕТ (|Запісоїа еї а|І., 1997, Тгирр еї аїЇ., 1998), а МТМ може зв'язуватись з ОЕК 9-1 з по низькою спорідненістю (КіІеїп еї аі., 1997). Таким чином, ЗОМЕ, МТМ, РЗР та АКТ є частиною нейротрофічної сигнальної системи, в якій різні ліганд-зв'язуючі субодиниці (ЗЕК 9-1 до -4) можуть знаходитись у взаємодії з бо тією самою тирозин-кіназною субодиницею (СКЕТ). Фізіологічне значення цих відкриттів, зроблених іп мікго, було нещодавно підтверджене у дослідженнях генних кноккоутів хогляд Козепіаї, 19991ї, що яскраво свідчить про те, що СОМЕ взаємодіє з ЗЕКо-1 іп мімо, у той час, як МТМ є лігандом для СЕКо-2, якому надається перевага.

Автори даного винаходу ідентифікували, клонували, експресували, показали хромосомну локалізацію та б охарактеризували еновін (ЕММ), четвертого представника родини СОМЕ. Знання про зрілий ЕММ білок було розширене завдяки відкриттю різних фукціональних та нефункціональних сплайсерних варіантів мРНК. Крім того,

ми представляємо дані стосовно експресії, зв'язування ЕММ з СОЕКо-3 та впливу ЕММ на ріст нейритів в умовах іп мйго та захист від індукованої таксолом нейротоксичності у стауроспорін-диференційованих ЗН-5У5У культурах клітин нейробластоми людини.

У даній заявці описана молекула нуклеїнової кислоти, що кодує новий людський нейротрофічний ростовий фактор, "еновін", експресійний вектор, що включає вказану молекулу нуклеїнової кислоти, хазяйська клітина, трансформована вказаним вектором, нейротрофічний ростовий фактор, що кодується вказаною молекулою нуклеїнової кислоти, ізольований еновін, сполуки, які діють як агоністи або антагоністи еновіну та фармацевтичні композиції, що містять нуклеїнову кислоту або білок еновіну або агоністи або антагоністи 7/0 останнього.

Згідно з першим аспектом даного винаходу він забезпечує молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує нейротрофічний ростовий фактор людини, позначений тут як еновін, що має амінокислотну послідовність, показану на Фігурі 21, або кодує функціональний еквівалент, похідну або біопопередник вказаного ростового фактору. Бажано, щоб вказана молекула нуклеїнової кислоти представляла собою ДНК, або навіть більш бажано 75 - молекулу КДНК.

Бажано, щоб нуклеїнова кислота згідно з винаходом включала послідовність від 81 до 419 позиції послідовності, представленої на Фігурі 1, більш бажано від 81 до 422 позиції, та більш бажано повну послідовність, представлену на Фігурі 1.

Передбачається, що молекула нуклеїнової кислоти від 81 до 419 позиції кодує послідовність зрілого білка го еновіну, одержаного після процесування проформи білка у ЕХХК процесуючому сайті, який присутній у стабільній проформі вказаного білка еновіну.

Винахід також забезпечує антисмислову молекулу, здатну до гібридизації з будь-якою послідовністю нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом, в умовах суворої жорсткості, що добре відомо спеціалісту у даній галузі. с

Жорсткість гібридизації у контексті даної заявки належить до умов, при яких полінуклеїнові кислоти є стабільними. Стабільність гібридів знаходить своє відображення у температурі плавлення (ТУ) гібридів. тя може о бути приблизно обчислена за такою формулою: 81,520-16,6(Іо910|Ма "140,41(900585С)-600/, в якій І представляє собою довжину гібридів у нуклеотидах. Тл зменшується приблизно на 1-1,590 з кожним С 195 зменшення гомології послідовності. сч

Бажано, щоб молекулу нуклеїнової кислоти згідно з винаходом можна було використовувати для експресії нейротрофічного ростового фактору людини згідно з винаходом, у хазяйській клітині тощо, при використанні Ге) придатного експресійного вектора. со

Експресійний вектор згідно з винаходом включає вектори, здатні до експресії ДНК, яка оперативно зв'язана з регуляторними послідовностями, такими як промоторні ділянки, що здатні впливати на експресію таких - фрагментів ДНК.

Регуляторні елементи, що необхідні для експресії, включають промоторні послідовності для зв'язування з

РНК-полімеразою та послідовності ініціації транскрипції для зв'язування з рибосомою. Наприклад, бактеріальний « експресійний вектор може включати промотор, такий як Іас-промотор та послідовність Шайно-Далгарно для ініціації транскрипції та стартовий кодон АОС. Подібно до цього, еукаріотичний експресійний вектор може - с включати гетерологічний або гомологічний промотор для РНК-полімерази ІІ, розміщений нижче сигнал и поліаденілування, стартовий кодон АОС, та кодон термінації для відокремлення від рибосоми. Такі вектори ,» можуть бути одержані комерційно або сконструйовані з описаних послідовностей методами, що добре знайомі у даній галузі.

Таким чином, експресійний вектор відноситься до рекомбінантної конструкції ДНК або РНК, такої як -і плазміда, фаг, рекомбінантний вірус або інший вектор, який після вбудовування у придатну хазяйську клітину сю приводить до експресії фрагментів ДНК або РНК. Придатні експресійні вектори добре знайомі спеціалістам у даній галузі та включають такі, що здатні до реплікації в еукаріотичних клітинах та/або прокаріотичних (се) клітинах та такі, що залишаються епісомальними, або такі, що вбудовуються в геном хазяйської клітини. 7 50 Антисмислова молекула, здатна до гібридизації з нуклеїновою кислотою згідно з даним винаходом, може бути використана як проба, або як ліки, або у фармацевтичній композиції. що) Молекули нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом можуть бути вбудовані в описані вектори в антисмисловій орієнтації для того, щоб забезпечити утворення антисмислової РНК. Антисмислова РНК або інші антисмислові нуклеїнові кислоти можуть бути одержані синтетичним методом.

Інший аспект даного винаходу включає хазяйську клітину, трансформовану, трансфіковану або інфіковану о експресійним вектором згідно з даним винаходом, бажано, щоб така клітина була еукаріотичною клітиною, та найбільш бажано - клітиною ссавця. іме) Вбудовування клонованої ДНК у прийнятний експресійний вектор для подальшої трансформації вказаної клітини та подальшої селекції трансформованих клітин добре відоме спеціалісту у даній галузі, як це описано у 60 |Затьгоок еї а/., (1989) Моіесшіаг Сіопіпоу, А Гарогагу Мапиаї, Соїа Зргіпуд Нагроиг І арогаюгу Ргеззі.

Ще один аспект даного винаходу включає молекулу нуклеїнової кислоти, що має, принаймі, 15 нуклеотидів молекули нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом, більш бажано від 15 до 50 нуклеотидів.

Такі послідовності можуть переважно використовуватись як проби або праймери для ініціації реплікації тощо. Такі молекули нуклеїнової кислоти можуть бути одержані згідно з методами, що добре відомі у даній 65 галузі такими як рекомбінантний або синтетичний методи. Вони можуть також використовуватись у діагностичних наборах чи пристроях або для методів визначення присутності нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом. Такі тести взагалі включають контакт проби зі зразком в умовах гібридизації та визначення присутності будь-якого подвійного утворення між пробою та будь-якою нуклеїновою кислотою у зразку.

Згідно з даним винаходом такі проби можуть бути прикріплені до твердої основи. Бажано, щоб вони були присутніми на основі у великій кількості так, щоб зразки мали змогу багатократно гібридизуватись з одним біологічним зразком. Проби можуть бути нанесені на основу або синтезуватись іп зіш на основі. Див. Іоснагі еї аїЇ., Маїшге Віоїесппоіоду, мої. 14, ЮОесетрег 1996 "Експресійний моніторінг шляхом гібридизації в олігонуклеотидних конструкціях високої щільності"|!. Одна конструкція може містити більше 100, 500 або навіть 1,000 різних проб у дискретних положеннях. 70 Молекули нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом можуть також бути одержані при використанні рекомбінантних та синтетичних методів, таких як, наприклад, використання методу ПЛР клонування, що загалом передбачає створення пари праймерів, які можуть мати розмір приблизно 10-50 нуклеотидів до ділянки гена, яка є бажаною для клонування, переведення праймерів у контакт з МРНК, кКДНК або геномною ДНК з людської клітини, проведення полімеразної ланцюгової реакції в умовах, які викликають ампліфікацію бажаної ділянки, 7/5 ізоляцію ампліфікованої ділянки або фрагменту та відновлення ампліфікованої ДНК. У загальних рисах такі методики, як зазначено вище, описані у |(Затргоок еї а!., (МоіІесшаг Сіопіпо, А І арогаїогу Мапиаї, 1989)|.

Нуклеїнові кислоти або олігонуклеотиди згідно з даним винаходом можуть нести мітку, що дає змогу їх виявляти. Прийнятні мітки включають радіоізотопи, такі як З2Р або 355, ферментні мітки або інші білкові мітки, такі як біотин або флуоресцентні маркери. Такі мітки можуть додаватись до нуклеїнових кислот або олігонуклеотидів згідно з винаходом та можуть виявлятись відомими методами рег зе.

Бажано, щоб людські алельні варіанти або поліморфізм молекули ДНК згідно з винаходом могли ідентифікуватись шляхом, наприклад, тестування кКДНК або геномних бібліотек з широкого інтервалу різних індивідуальних організмів, наприклад, з різних популяцій. Крім того, нуклеїнові кислоти та проби згідно з даним винаходом можуть використовуватись для секвенування геномної ДНК пацієнтів при використанні Га методів, добре знайомих у даній галузі, таких як Запдег метод дідеокси термінації ланцюга, який може переважно визначати будь-яку схильність пацієнта до певних розладів, асоційованих з ростовим фактором і) згідно з даним винаходом.

Даним винаходом забезпечується також трансгенна клітина, тканина або організм, що включає трансген, здатний до експресії людського нейротрофічного фактора еновіну згідно з даним винаходом. Ге

Термін "трансген, здатний до експресії" як такий, що використовується у даній заявці, означає прийнятну послідовність нуклеїнової кислоти, яка веде до експресії нейротрофічного фактору, що має такі самі функції с та/або активність, що і нейротрофічний фактор, згідно з даним винаходом. Трансген може включати, наприклад, Ге»! геномну нуклеїнову кислоту, ізольовану з клітин людини або синтетичну нуклеїнову кислоту, включаючи кДНК, інтегровану у хромосому або таку, що знаходиться у позахромосомному стані. о

Бажано, щоб трансген включав вектор згідно з даним винаходом, такий вектор містить молекулу нуклеїнової з кислоти, що кодує вказаний нейротрофічний фактор, або функціональний фрагмент вказаної молекули нуклеїнової кислоти. Термін "функціональний фрагмент" вказаної молекули може використовуватись для позначення фрагменту гена або кКДНК, що кодує вказаний нейротрофічний фактор або функціональний фрагмент « останнього, такий фрагмент здатний експресуватись для утворення функціонального нейротрофічного ростового фактора згідно з даним винаходом. Таким чином, наприклад, фрагменти нейротрофічного ростового фактора й) с згідно з винаходом, які відповідають специфічним амінокислотним залишкам, що взаємодіють з відповідним й рецептором, також утворюють частину даного винаходу, такі фрагменти можуть служити як агоністи, що "» активують відповідний рецептор ростового фактора згідно з даним винаходом так, що виявляють вплив на покращення росту та підтримання виживання клітин. Цей аспект винаходу також включає диференційно сплайсовані ізоформи та транскрипційні старти нуклеїнової кислоти згідно з винаходом. -І Згідно з даним винаходом вказана нуклеїнова кислота включає не тільки ідентичну нуклеїнову кислоту, але також будь-які мінорні варіації основ, що передбачають, зокрема, заміни в основах, що приводять до

Мамі синонимічного кодону (інший кодон, що кодує той самий амінокислотний залишок) завдяки виродженості коду у (Се) консервативних амінокислотних замінах. Термін "молекула нуклеїнової кислоти" також включає комплементарну будь-якому одному ланцюгу послідовність, наведену з врахуванням варіацій основ. ді Згідно ще з одним аспектом даний винахід забезпечує ізольований нейротрофічний ростовий фактор

Кз людини, що кодується молекулою нуклеїнової кислоти, як визначено у даній заявці. Бажано, щоб ростовий фактор включав амінокислотну послідовність від позиції 27 до позиції 139 амінокислотної послідовності, що представлена на Фігурі 1, або функціональний еквівалент, похідну або біопопередник останньої. "Функціональний еквівалент", як визначається у даній заявці, може використовуватись для позначення ростового фактору, який демонструє усі ростові властивості та функціональність, асоційовану з ростовим

Ф, фактором еновіном. Термін "похідна" еновіну, як визначається у даній заявці, використовується для визначення ко поліпептиду, в якому певні амінокислоти змінені, або ділетовані, або замінені іншими амінокислотами, при цьому цей поліпептид зберігає біологічну активність еновіну та/або цей поліпептид може реагувати з бо антитілами, одержаними при використанні еновіну згідно з даним винаходом як антигену, що викликає їх утворення.

Даний винахід охоплює також гібриди та модифіковані форми еновіну, включаючи злиті білки та фрагменти.

Гібридні та модифіковані форми включають, наприклад, випадки, коли певні амінокислоти піддають деяким модифікаціям або замінам, наприклад, шляхом точкової мутації, таким, що приводять до утворення білка, що 65 Зберігає біологічну активність еновіну згідно з винаходом. Специфічні послідовності нуклеїнової кислоти можуть бути змінені спеціалістами у даній галузі для створення ростового фактору, що демонструє такі самі або суттєво такі самі властивості еновіну.

Як добре відомо у даній галузі, багато білків утворюються іп мімо з (пре) сигнальною послідовностю на

М-термінальному кінці білка. Крім того, такі білюим можуть включати також про- послідовності, що утворюють стабільний попередник зрілого білка. Такі пре- та про- послідовності взагалі не є необхідними для біологічної активності. Молекула еновіну згідно з даним винаходом включає не тільки послідовність повної довжини, показану на Фігурі 21, але також послідовність від положення 27 до положення 139, що йде за КЕХХК протеолітичним процесуючим сайтом, присутнім у ростових факторах цього типу та які, як вважають є зрілою послідовністю еновіну. 70 Визначений білок, поліпептид або амінокислотна послідовність згідно з винаходом включає не тільки ідентичну амінокислотну послідовність, але також ізомери останньої у доповнення до мінорних варіацій амінокислот природної амінокислотної послідовності, включаючи консервативні амінокислотні заміни (заміна амінокислотою, що є спорідненою з нею своїм бічним ланцюгом). Такий білок також включає амінокислотні послідовності, які відрізняються від природної амінокислотної послідовності у поліпептиді, що є імунологічно /5 ідентичним або подібним до поліпептиду, що кодується одержаною з природи послідовністю.

Білки або поліпептиди згідно з винаходом також передбачають варіації таких послідовностей, включаючи природно одержані алельні варіанти, які є суттєво гомологічними вказаним білкам або поліпептидам. У цьому контексті, суттєва гомологія розглядається як послідовність, яка має, принаймі, 7095, бажано 8095, 9095 або 95906-ну амінокислотну гомологію з білками або поліпептидами, що кодуються молекулами нуклеїнової кислоти

Згідно з даним винаходом.

Нейротрофічні ростові фактори, що експресуються хазяйськими клітинами згідно з винаходом, також охоплюються даним винаходом.

Даний винахід також спрямовано на інгібування нейротрофічного ростового фактора згідно з винаходом іп мімо при використанні антисмислової технології. Антисмислова технологія може використовуватись для сч об Контролю генної експресії через конструкцію потрійної спіралі або антисмислової ДНК або РНК, кожний з цих методів грунтується на зв'язуванні полінуклеотиду з ДНК або РНК. Наприклад, частина послідовності ДНК, що і) кодує зрілий білок згідно з даним винаходом, використовується для визначення антисмислового олігонуклеотиду

РНК довжиною від 10 до 50 пар основ. ДНК олігонуклеотид призначений бути комплементарним до ділянки гена, що втягнений у транскрипцію (потрійна спіраль - див. ее еї а). Мисі. Асіав. Кевз., 6: 3073 (1979); Соопеу еї с зо аі, Зсіепсе, 241: 456 (1988); ЮОегумап сеї аїЇ.,, Зсіепсе, 251: 1360 (1991)) таким чином, запобігаючи транскрипції та утворенню еновіну. Антисмисловий олігонуклеотид РНК гібридизується з мРНК іп мімо та блокує с трансляцію молекули мРНК в еновін. Ге!

Оскільки існує подібність послідовностей ростового фактору, описаного у даній заявці, і раніше ідентифікованих ростових факторів родини СОМЕ, еновін, як очікується, також буде здатним до покращення ме)

З5 Виживання клітин та їх росту при лікуванні розладів, що призводять до дефектів у функціонуванні або експресії ї- вказаного нейротрофічного фактора.

Молекули нуклеїнової кислоти або нейротрофічний фактор згідно з даним винаходом можуть, таким чином, використовуватись для лікування або запобігання нервових розладів у суб'єкта шляхом призначення вказаному суб'єкту певної кількості молекули нуклеїнової кислоти або ростового фактора згідно з даним винаходом у « достатній концентрації для того, щоб усунути або послабити симптоми вказаного розладу. Таким чином, в с молекули нуклеїнової кислоти згідно з винаходом можуть використовуватись для покращення процесу підтримання росту та виживання нервових клітин та для лікування нервових розладів або нейродегенеративних ;» симптомів, включаючи хворобу Паркінсона, хворобу Альцгеймера, периферичну нейропатію, аміотрофічний латеральний склероз, периферичні та центральні нервові травми або пошкодженя дією нейротоксинів.

Нейротрофічний ростовий фактор згідно з даним винаходом досліджували для того, щоб підтвердити -І нейротрофічний або нейропротективний впливи на нейронні клітини або популяцію клітин, зокрема, ті нейронні клітини або клітинні популяції, що були індуковані для піддання апопоптозу. Відповідно до цього нуклеїнова о кислота або ростовий фактор еновін згідно з даним винаходом можуть додатково використовуватись при со лікування нейродегенеративних розладів, таких як удари, хвороба Хантінгдона, периферична невропатія, гостре 5р пошкодження мозку, пухлини нервової системи, розсіяний склероз, аміотрофічний латеральний склероз, о периферична нервова травма, пошкодження від впливу нейротоксинів, розсіянна ендокринна неоплазія, сімейна

Ге хвороба Хіршспрунга, захворювання, асоційовані з Пріоном, хвороба Крейцфельда-Якобса, шляхом призначення пацієнту, що потребує цього, певної кількості вказаної нуклеїнової кислоти або еновіну у достатній концентрації для того, щоб знищити або попередити симптоми нервових розладів, описаних у даній ов Заявці.

Крім того, як буде описано в усіх деталях у прикладі нижче, було показано, що еновін прискорює

Ф) відновлення індукованого сенсорного дефіциту, що дає змогу ідентифікувати еновін як кандидата для лікування ка або полегшення больових синдромів з периферичним або центральним нейрогенним компонентом, ревматичних/запальних захворювань, порушення поведінки шляхом призначення пацієнту, що потребує цього, во достатньої кількості для зникнення або запобігання симптомів цих розладів.

Альтернативний метод лікування нервових розладів, описаних вище, передбачає імплантацію цільових клітин, що експресують нейротрофічний ростовий фактор згідно з винаходом, таких, як наприклад, трансгенні клітини, описані у даній заявці.

Молекули нуклеїнової кислоти та нейротрофічний ростовий фактор згідно з винаходом можуть також бути 65 включені у фармацевтичні композиції разом з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем або наповнювачем для останнього.

Антитіла до нейротрофічного фактора згідно з даним винаходом можуть, переважно, готуватись шляхом методів, які відомі у даній галузі. Наприклад, поліклональні антитіла можуть бути приготовані шляхом інокуляції хазяйського тваринного організму, такого, як миша, за допомогою ростового фактора або епітопа останнього, та одержання імуної сироватки. Моноклональні антитіла можуть бути приготовані згідно з відомими методами, такими як описані (Копіег К. та Міївівїп С, Майге (1975) 256, 495-497).

Антитіла згідно з винаходом можуть використовуватись у методі для визначення присутності ростового фактора згідно з винаходом, такий метод передбачає контакт антитіла зі зразком та ідентифікацію будь-якого білка, що зв'язується з вказаним антитілом. Винахід також стосується набору для забезпечення проведення /о вказаного методу, який включає антитіло згідно з винаходом та служить для проведення реакції антитіла з вказаним зразком.

Даний винахід також забезпечує набір або пристрій для визначення присутності нейротрофічного ростового фактора згідно з винаходом у зразку, що містить антитіло, яке описане вище, та служить для проведення реакції вказаного антитіла та вказаного зразка.

Білки, які взаємодіють з нейротрофічним фактором згідно з даним винаходом, таким, як наприклад, клітинний рецептор, що йому відповідає, можуть бути ідентифіковані шляхом дослідження білок-білкових взаємодій, при використанні двох-гібридної векторної системи, що добре відома спеціалістам з молекулярної біології (Гіеїд5 8

Зопа, Маїшге 340: 245 1989). Цей метод грунтується на функціональній перебудові іп мімо фактора транскрипції, який активує репортерний ген. Зокрема, метод передбачає забезпечення прийнятної хазяйської клітини з Конструкцією ДНК, що містить репортерний ген під контролем промотора, який регулюється транскрипційним фактором, що має ДНК-зв'язуючий домен та активуючий домен, експресуючи у хазяйській клітині першу гібридну послідовність ДНК, яка кодує злиття фрагменту, усієї послідовності нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, або вказаного ДНК-зв'язуючого домену, або вказаного активуючого домену фактора транскрипції, що експресує у хазяйській клітині, принаймі, одну з двох гібридних послідовностей ДНК, таку як бібліотека тощо, яка кодує с ов Ппутативні зв'язуючі білки, що досліджуються разом з ДНК-зв'язуючим або активуючим доменами фактора транскрипції, який не є вбудованим у першу злиту послідовність; визначення та зв'язування білків, що і) досліджуються, з білком згідно з даним винаходом шляхом визначення присутності будь-якого продукта репортерного гена у хазяйській клітині; необов'язкову ізоляцію другої гібридної послідовності ДНК, що кодує зв'язуючий білок. с зо Прикладом такого методу може бути метод на основі утилізації СЗА/4 білка у дріжджах. САЇ4 є транскрипційним активатором метаболізму галактози у дріжджах та має окремий домен для зв'язування з с активаторами вище від генів метаболізму галактози, а також від білок-зв'язуючого домену. Можуть бути Ге! сконструйовані нуклеотидні вектори, один з них включає залишки нуклеотидів, що кодують ДНК-зв'язуючий домен СА 4. Ці залишки зв'язуючого домену можуть бути злиті з відомою послідовністю, що кодує білок, такою і) з5 як наприклад, нуклеїнові кислоти згідно з даним винаходом. Інший вектор включає залишки, що кодують ча білок-зв'язуючий домен СА 4. Ці залишки зливають із залишками, що кодують тестовий білок, бажано з шляху сигнальної трансдукції хребетних. Будь-яка взаємодія між нейротрофічним фактором, що кодується нуклеїновою кислотою згідно з винаходом, та білком, який визначають, веде до транскрипційної активації репортерної молекули у клітині дріжджів, дефектній по транскрипції ЗА! -4, в яку трансформують вектор. Бажано, щоб « репортерна молекула, така як р-галактозидаза, активувалась при відновленні транскрипції генів метаболізму пт») с галактози дріжджів. й Рецептор для еновіну був ідентифікований авторами даного винаходу як СЕК 43. Таким чином, можуть бути "» проведені аналізи для ідентифікації агоністичних або антагоністичних сполук еновіну. Такий аналіз може також використовуватись у сукупності з іншими нейротрофічними факторами росту та їх відповідними рецепторами.

Сполуки, що ідентифікуються, можуть використовуватись для лікування або запобігання розладів, таких як -І хвороба Паркінсона, хвороба Альцгеймера, нейронні розлади, асоційовані з розширеними послідовностями поліглутаміну, такими як хвороба Хантінгдона, периферична невропатія, гостра травма мозку, пухлини нервової о системи, розсіяний склероз, аміотрофічний латеральний склероз, периферична нервова травма або (Се) пошкодження від впливу нейротоксинів, розсіяна ендокринна неоплазія та сімейна хвороба Хіршспрунга, хвороби, асоційовані з Пріоном, хвороба Крейцфельда-Якобса, удар, больові синдроми зі суттєво о периферичним або центральним нейрогенним компонентом, ревматичні/запальні хвороби, а також для

ІЗ запобігання порушень шляхом призначення пацієнту певної кількості вказаного агоністу або антагоністу у достатній концентрації для запобігання або лікування вказаних нервових розладів. Такі сполуки можуть також включатись у фармацевтичні композиції разом з прийнятним носієм, розріджувачем або наповнювачем останнього.

Агоністи або антагоністи фактора росту (такого як, наприклад, еновін) можуть бути ідентифіковані в одному і) втіленні даного винаходу шляхом приведення у контакт клітин тканини або організму, що експресує прийнятний ко рецептор, та СКЕТ зі сполукою, у якої очікуюють виявити таку активність, у присутності ростового фактора та порівняння рівнів активації КЕТ у вказаній клітині, тканині або організмі з контролем, який не був приведений бо У контакт з вказаною сполукою, що є кандидатом на виявлення такої активності.

Альтернативне втілення даного винаходу передбачає спосіб ідентифікації агоністів або антагоністів нейротрофічного ростового фактора, вказаний метод передбачає приведення у контакт клітини, тканини або організму, що експресує прийнятний рецептор вказаного ростового фактора, та СКЕТ зі сполукою, що є кандидатом на виявлення такої активності, у присутності вказаного ростового фактора, вимірювання рівня 65 активації сигнальної кінази у шляху сигнальної трансдукції, компонентом якої є вказаний прийнятний рецептор, наступне додання антитіла, специфічного до вказаної сигнальної кінази, що кон'югована з репортерною молекулою, порівняння з клітиною, тканиною або організмом, який не було приведено у контакт з вказаною сполукою.

Ще один аспект винаходу передбачає використання сполуки, що була ідентифікована як антагоніст згідно з винаходом для виробництва медикаментів для лікування шлунково-кишкових захворювань або симптомів, що опосередковані збільшенням перистальтичного руху кишечника.

Сполуки, ідентифіковані у аналізах згідно з даним винаходом, можуть переважно використовуватись для покращення шлунково-кишкової рухливості і, таким чином, можуть бути корисними при лікуванні симптомів, пов'язаних з гальмуванням або пошкодженням проходження через шлунково-кишковий тракт. 70 Таким чином, такі сполуки можуть бути корисними у лікуванні теплокровних тварин, включаючи людину, що страждають на симптоми, пов'язані з пошкодженням або гальмуванням випорожнення шлунку або більш загально, що страждають від симптомів, пов'язаних з пошкодженням або гальмуванням проходження через шлунково-кишковий тракт. Таким чином, спосіб лікування забезпечує полегшення для пацієнтів з симптомами, такими як, наприклад, гастроезофагальний рефлюкс, диспепсія, гастропарез, після-операційний ілеус, кишкова /5 псевдо-обструкція.

Диспепсія є пошкодженням функції перетравлювання, що виникає як симптом первинної шлунково-кишкової дисфункції, особливо шлунково-кишкової дисфункції, пов'язаної зі збільшенням м'язового тонусу або як ускладнення, що виникає на основі інших розладів, таких як апендицит, порушення функції жовчного міхура або недоїдання. Диспептичними симптомами є, наприклад, відсутність апетиту, відчуття переповнення, передчасна 2о насиченість, нудота, блювання та метеоризм.

Гастропарези можуть бути викликані ненормальністю у шлунку або як ускладнення хвороб, таких як діабети, прогресуючий системний склероз, анорексія, невроз та міотонічна дистрофія.

Пост-оперативний ілеус є обструкцією або кінетичним розладом у кишечнику, що виникає на основі порушення м'язового тонусу, що спричинений хірургічним втручанням. с

Псевдорозлади кишечника є симптомом, що характеризується запором, коліковою біллю та блюванням, але без видимого фізичного пошкодження. і)

Сполуки згідно з винаходом можуть, таким чином, використовуватись для того, щоб або позбавитись актуальної причини симптому, або для того, щоб полегшити симптоми.

Крім того, деякі сполуки, що є стимуляторами кінетичної активності ободової кишки, можуть бути корисними с

Зо для нормалізації або покращення проходження крізь кишковий тракт у суб'єктів, що страждають на симптоми, пов'язані з порушеням рухливості, тобто зменшенням перистальтики тонкого та товстого кишечника як такого с або у поєднанні з порушенням випорожнення шлунку. б

З огляду на використання сполук згідно з даним винаходом, для покращення кінетичних характеристик ободової кишки даний винахід забезпечує спосіб лікування теплокровних тварин, включаючи людину, що о з5 страждають на розлади рухливості кишкової системи, такі як, наприклад, запор, псевдообструкція, кишкова ча атонія, постоперативна кишкова атонія, синдром підвищеної кишкової подразливості (ІВ5) та затримання проходження їжі через шлунково-кишковий тракт, індуковане ліками.

Сполуки, ідентифіковані як антагоністи у аналізах згідно з даним винаходом, можуть також знайти потенціальне використання при лікуванні або профілактиці шлунково-кишкових симптомів, що походять від « Збільшеного перистальтичного руху у кишечнику, таких як діарея (включаючи секреторну діарею, бактеріально в с індуковану діарею, жовчну діарею, пронос з несподіваним початком, що специфічно виникає у мандрівників, та . психогенна діарея), хвороба Крона, спастична ободова кишка (ІВ5), діареяпредомінантний синдром кишкової а подразливості, шлунково-кишкова гіперчутливість. З огляду на використання сполук згідно з даним винаходом випливає, що даний винахід також забезпечує спосіб лікування теплокровних тварин, включаючи людину, що страждають на шлунко-кишкові симптоми, такі як синдром підвищеної подразливості кишечника (ІВ5), особливо -І діарейні аспекти ІВ5. Тому забезпечується спосіб лікування пацієнтів, що страждають на такі симптоми, як синдром підвищеної подразливості кишечника (ІВ5), діареяпредомінантний синдром підвищеної подразливості о кишечника, кишкова гіперчутливість та зняття болю, асоційованого з шлунково-кишковою гіперчутливістю. со Вказані сполуки можуть також знайти потенціальне використання при інших шлунково-кишкових розладах, бор таких як ті, що асоційовані з рухливістю верхнього відділу кишечника, як протиблювотні препарати для о лікування блювання, а також блювання, що індуковане медикаментозною цитотоксичністю та радіацією.

Ге Запальні кишкові захворювання включають, наприклад, виразкові коліти, хворобу Крона тощо.

Ще один аспект даного винаходу також включає спосіб лікування розладу, опосередкованого експресією еновіну згідно з даним винаходом, шляхом призначення пацієнту певної кількості антисмислової молекули або ов антагоністу останнього згідно з винаходом у достатній концентрації для зменшення або зняття симптомів вказаного розладу.

Ф) Розлади, опосередковані інактивацією або інгібуванням експресії еновіну, можуть також лікуватись шляхом ка призначення індивідуальній особі кількості сполуки, ідентифікованої як агоніст еновіну у достатній концентрації для зменшення або запобігання симптомів цього розладу. во В іншому аспекті винахід забезпечує спосіб виробництва фармацевтичної композиції для лікування хвороб, асоційованих з людським нейротрофічним фактором росту еновіном, вказаний метод передбачає селекцію сполуки-кандидата, ідентифікованої як агоніст або антагоніст еновіну згідно з винаходом, виробництво великих об'ємів вказаної сполуки та введення виробленої сполуки у композицію, що містить фармацевтично прийнятний носій. 65 Як можно побачити більш детально з прикладів, що наведені нижче, еновін є перспективним для зняття індукованої таксолом сенсорної недостатності. Еновін може, таким чином, грати певну роль у больових синдромах з суттєво периферичним та центральним нейрогенним компонентом, ревматичних захворюваннях, а також при порушеннях провідності може грати модуляторну роль у сенсорних процесах після трансдермального, місцевого, локально-центрального (такого як епідуральне, інтратекальне, ІСМ, внутрішньосуглобове, введення усередину сплетення, внутрішньонейронне), орального, ректального та систематичного застосування. Таким чином, у такий же спосіб, як описано у даній заявці для інших симптомів, що опосередковані еновіном, цих симптомів можна уникнути або навіть запобіти шляхом призначення або антисмислової молекули, або нуклеїнової кислоти, білка еновіну, фармацевтичної композиції, або сполуки, ідентифікованої як агоніст або антагоніст, в залежності від того, що є бажаним, згідно з даним винаходом у достатніх концентраціях для 7/0 Зменшення або запобігання симптомів вказаного розладу(ів).

Терапевтичні та фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом можуть бути призначені для введення будь-яким прийнятним шляхом, що відомий у даній галузі, включаючи, наприклад, внутрішньовенне, підшкірне, внутрішньом'язове, трансдермальне, внутрішньосуллобове або внутрішньоцеребральне введення, або призначення для клітин у прописах для лікування ех мімо. Призначення може бути або швидким як ін'єкція, або 7/5 протягом періоду часу шляхом повільної інфузії або призначення композиції, яка характеризується повільним вивільненням. Для лікування тканин центральної нервової системи, призначення може бути шляхом ін'єкцій або інфузії у цереброспінальну рідину (СЕ).

Еновін може також бути зв'язаним або кон'югованим з агентами, які забезпечують бажані фармацевтичні або фармакодинамічні властивості. Наприклад, він може бути злитим з будь-якою речовиною, що відома у даній 2о галузі для покращення пенетрації або транспорту через гемато-енцефалічний бар'єр, такий як антитіла для рецептора трансферріну, та призначені шляхом внутрішньовенної ін'єкції.

Еновін, антисмислові молекули або сполуки, ідентифіковані як агоністи або антагоністи еновіну згідно з даним винаходом, можуть використовуватись у формі фармацевтичної композиції, яку можна приготувати згідно з методами, що добре знайомі спеціалістам у даній галузі. Композиції, яким надається перевага, включають сч фармацевтично прийнятний вектор, розріджувач або наповнювач, такий як, наприклад, фізіологічний розчин.

Інші фармацевтично прийнятні носії, включаючи інші нетоксичні солі, стерильну воду, тощо, також можуть і) використовуватись. Прийнятний буфер може також бути присутнім у композиції, що дозволяє останній зберігатись у ліофілізованому вигляді у стерильних умовах до приготування до використання шляхом додання стерильної води для подальшого призначення. Введення еновіну у тверді або напівтверді біологічно сумісні с зо Мматрикси може бути виконане таким чином, що композиція буде імплантована у тканини, що потребують лікування. с

Носій також може містити інші фармацевтично прийнятні наповнювачі для модифікації інших умов, таких як Ге! рН, осмотичність, в'язкість, стерильність, ліпофільність, розчинність тощо. Фармацевтично прийнятні наповнювачі, що дозволяють підтримувати або сповільнювати вивільнення вказаних сполук, також можуть о

Зз5 Включатись у склад композиції. ї-

Білок еновіну, молекули нуклеїнової кислоти або сполуки згідно з винаходом можуть призначатися орально. У цьому втіленні вони можуть бути інкапсульовані або поєднані з прийнятними носіями у твердих дозованих формах, що добре відомі спеціалістам у даній галузі.

Як добре відомо спеціалісту у даній галузі, специфічний режим дозування може розраховуватись в « залежності від площі поверхні тіла пацієнта або об'єму простору, що займає, тіло, і залежить відособливостей пл») с способу введення, що використовується. Кількість композиції, що фактично призначається, буде, проте,

Й визначатись практикуючими медиками і базуватись на обставинах, що мають відношення до розладу, що и? лікується, таких як жорсткість симптомів, композиція, що призначається, вік, вага, відповідь індивідуального пацієнта та вибраний шлях введення.

Даний винахід може бути більш ясно зрозумілий з наступних прикладів та малюнків, що супроводжують опис: -І Фігура 1: частинна послідовність КДНК нейротрофічного фактора згідно з даним винаходом, позначеного як еновін. Консенсусна послідовність була одержана шляхом ПЛР ампліфікації з праймерами РМНе:гр3 та РМНар!1 і на різноманітних кКДНК та на геномній ДНК, одержаній шляхом клонування, секвенс-аналізу послідовності та со порівняння одержаних послідовностей. Передбачена амінокислотна послідовність, що зображена за допомогою 5р однолітерного коду, показана вище послідовності ДНК. Номера залишків нуклеотидів показані праворуч від ю послідовності ДНК, у той час як номера залишків амінокислот зображені праворуч від трансльованої білкової

Ге послідовності. Путативний КХХК сайт розщеплення для продомена чітко виділений і підкреслений. Путативний початок зрілого білка позначений стрілкою. Сім консервативних залишків цистеїну, що є характерними для усіх членів родини ТОЕ-р, виділені. Потенційний сайт М-глікозилування підкреслений двічі.

Фігура 2: вирівнювання передбачених послідовностей зрілих білків людських ЗОМЕ, МТМ, РБР та ЕММ.

Послідовності вирівнювали при використанні програми вирівнювання Сіивіа!1УУ. Залишки амінокислот, що є іФ) консервативними для усіх трьох білків, включені у чорні рамки. Залишки, що є консервативними для двох або ко трьох послідовностей, зображенії у сірому тоні. 7 консервативних залишків цистеїну, що характерні для членів родини ТОБ-р, зображені зірочкою над послідовністю. Залишки амінокислот пронумеровані праворуч. Тире бо позначає пробіли, позначені у послідовності для оптимізації вирівнювання.

Фігура 3: частинна послідовність КДНК еновіну. Консенсусна послідовність була одержана шляхом ПЛР ампліфікації (первинна ПЛР з праймерами РМН:зр1і та РМНар2 та подальшої ПЛР з праймерами РМН»р2 та

РМНар2) на різних кКДНК, одержаних шляхом клонування, секвенс-аналізу послідовності та порівняння одержаних послідовностей. Трансльована амінокислотна послідовність, зображена за допомогою однолітерного 65 Коду, для нуклеотидів від ЗО до 284 (рамка зчитування А) показана вище послідовності та пронумерована праворуч (від АТ до А85). Ця рамка зчитування містить амінокислотну послідовність, зображену за допомогою однолітерного коду, для нуклеотидів від 334 до 810 (рамка зчитування В) представлена вище послідовності та пронумерована направо (від ВІ! до В159). Ця рамка зчитування містить путативний АТО стартовий кодон трансляції. Трансльована амінокислотна послідовність, зображена за допомогою однолітерного коду, для нуклеотидів від 334 до 810 (рамка зчитування В) показана над послідовністю та пронумерована праворуч (від В1 до В159). Ця рамка зчитування містить ділянку, гомологічну СОМЕ, МТМ, РЗР. Номера залишків нуклеотидів показані праворуч від послідовності ДНК. Путативний КХХК сайт розщеплення для продомена виділено та підкреслено. Путативний початок зрілого білка позначений стрілкою. Сім залишків цистеїну, що є консервативними та характерні для усіх членів родини ТОРЕ- р, виділені. Потенційний сайт М-глікозилування 70 підкреслено двічі.

Фігура 4: ілюстрація хромосомної локалізації людського еновіну. (А) діаграма РІЗН картування дає результати для еновіну. Кожна точка представлює подвійні РІЗН-сигнали, визначені на людській хромосомі 1, ділянці р31.3-р32. (В) Приклад РІЗН-картування еновіну. Ліва панель показує РІЗН-сигнали у хромосомі 1. Права панель показує однакові мітотичні фігури, забарвлені за допомогою 4"-б-діамідино-2-феніліндолом для 75 ідентифікації хромосоми 1.

Фігура 5: є ілюстрацію експресії еновіну у різноманітних тканинах людини. (А), (В), (С) нозерн блоттінг-аналіз тканинної експресії еновіну. Експресію мРНК еновіну у різноманітних тканинах людини визначали при використанні зразка, що відповідає частині кодуючої ділянки еновіну (включаючи ділянку, що кодує зрілий білок еновін) для аналізу блотів людської РНК, збагаченої на роїу(А). (А) Тканинний нозерн-блот (МТМ); (В)

МТМ блот ІЇ) фетальний МТМ блот ІІ. Панель (0) показує авторадіографію людського РНК-мастер блота, що аналізується за допомогою того самого фрагменту ДНК еновіну. Панель (Е) показує локалізацію зразка мРНК у людських тканинах у РНК мастер-блоті з (0).

Фігура 6: є графічною ілюстрацією загального виживання ЗН-ЗУ5М клітин, нормалізованих до умов розчинника, після обробки протягом 72 годин 10-6М таксолом та впливу збільшених доз еновіну на це с виживання, ЗН-ЗУ5У клітини диференціюються через 5 днів з 25НМ стауроспоріну перед застосуванням таксолу.

Дані одержані з двох незалежних експериментів на планшеті, що містить 6 пробірок. Показані значення та о стандартний розподіл.

Фігура 7: є графічним відображенням впливу збільшених концентрацій еновіну протягом більше 48 годин на невритний ріст стауроспорін- диференційованих ЗН-5 У5 У клітин, нормалізованих до умов розчинника. ЗН-ЗУ5У су клітини диференціюються через 5 днів з 25нм стауроспоріну перед початком 48-годинного експерименту.

Позитивний контроль представлений диференціюючим впливом 25нНМ стауроспоріну. Довжина аксонів нервової с клітини підраховувалась на принаймі 5000 клітинах. Подані дані є результатом експерименту, що проводився у ду двократній повторності. Показані значення та стандартний розподіл.

Фігури з 8 по 18: є графічними відображеннями впливу еновіну на проліферацію різноманітних типів клітин. і.

Фігура 19: є графічним відображенням впливів еновіну на індуковану таксолом сенсорну недостатність при ї- використанні тесту уколом. Показані середні значення (-15Е)М) кумулятивних підрахунків протягом часу для пацюків, оброблених 2 різними дозами еновіну (23 або 13Омкг/мл; п-10 пацюків/група) або вектор/фізіологічний розчин (п-20 пацюків) після обробки таксолом. Еновін або фізіологічний розчин/вектор вводили в об'ємі 75мкл у « субплантарну ділянку правої задньої лапи.

Фігура 20: є графічним відображенням впливу еновіну на індуковану таксолом сенсорну недостатність при - с використанні тесту уколом. Подані середні значення (-15ЄЕМ) кумулятивних підрахунків протягом часу для а пацюків, оброблених 2 різними дозами еновіну (23 або 13Омкг/мл; п-10 пацюків/група) або вектор/фізіологічний "» розчин (п-20 пацюків) після обробки таксолом. Еновін або фізіологічний розчин/вектор вводили в об'ємі 75мкл у субплантарну ділянку правої задньої лапи.

Фігура 21: є послідовністю ДНК еновіну. Консенсусна послідовність була одержана шляхом ПЛР ампліфікації -і при використанні праймерів РМНегр5 та РМНар1 кДНК лобової частини кори головного мозку людини та людської о геномної ДНК, одержаної шляхом клонування, секвенування та порівняння одержаних послідовностей ДНК.

Передбачена амінокислотна послідовність наведена вище від послідовності ДНК тільки для одержаного (Се) сплайсованого варіанту функціонального білка еновіну після трансляції. Номер залишка нуклеотиду показаний юю 50 наліво від послідовності ДНК, у той час номер амінокислотного залишка показаний праворуч від трансльованої послідовності білка. 5' та 3 сайти сплайсингу, визначені шляхом порівняння секвенованих фрагментів кДНК з що) геномною послідовністю, позначені вертикальними лініями, що вигнуті ліворуч чи праворуч відповідно до нумерації. Путативний КХХК сайт розрізання фуріну для продомену виділено та підкреслено. Путативний початок зрілого білка позначено стрілкою. Сім консервативних залишків цистеїну, характерних для усіх членів родини ТОБЕ-Д, виділено. Потенційний М-зв'язаний сайт глікозилування підкреслено подвійною лінією 5' та З о сайти сплайсингу пронумеровані та обведені.

Фігура 22: є ілюстрацією експресії різноманітних сплайсинг-варіантів еновіну у тканинах людини. (А) їмо) схематична діаграма сплайсинг-варіантів еновіну, ідентифікованих шляхом КТ-ПЛР екпериментів з еновін-специфічними праймерами на РНК, що походить від різних тканин людини, одержаних клонуванням та 60о секвенс-аналізом продуктів ПЛР. Верхня лінія показує розмір (у п.о.). Друга лінія показує геномну послідовність еновіну. Позначені положення стартового кодону трансляції та стоп-кодону кодуючої послідовності попередньо одержаного та зрілого еновіну та 5' та 3' сайтів сплайсингу (див. Фігуру 21). Права частина фігури показує ПЛР-продукти, одержані шляхом КТ-ПЛР РНК з яєчника та лобної частини кори головного мозку разом з 100п.о. ладдерної ДНК. Положення різних варіантів мРНК показано разом з їх розміром (від стартового кодону б5 трансляції до стоп-кодону). Трансльовані білки показані з правої сторони. Бокси описаних ділянок подані у

КДНК. Пунктирні лінії показують сплайсовану геномну ДНК. Заштриховані ділянки відображують кодуючу послідовність зрілого еновіну. Точкові лінії помічають стартовий кодон кодуючої послідовності зрілого еновіну. Два транскрипти, здатні приводити до одержання функціонального білка еновіну, позначені зірочками з лівого боку. (В) Розподілення у тканинах основних сплайсованих варіантів. Фотографія показує фрагменти ПЛР, одержані шляхом КТ-ПЛР зі специфічними для еновіну праймерами на різних людських кКДНК людини. 4 основні сплайсинг-варіанти (від А до 0) позначені стрілками з лівого боку. Розміри, позначені з правого боку, грунтуються на 100п.о. ладдерної ДНК, що використовувалась як контроль розміру у гелі.

Фігура 23: передбачена послідовність білка довгого сплайсинг-варіанту еновіну, одержаного шляхом сплайсингу двох інтронів з послідовності ДНК Фігури 21. Сайти сплайсингу 5-1 та 3-1 використовувались для 7/0 вилучення першого інтрону, а сайти сплайсингу 5-2 та 3-3 використовувались для вилучення другого інтрону.

Це приводило до одержання послідовності кКДНК, яка мала відкриту рамку зчитування, що кодує 228 амінокислотних залишків білка, показаного вище.

Фігура 24: передбачена послідовність білка альтернативного (короткого) сплайсинг-варіанту еновіну, одержаного шляхом сплайсинга двох інтронів послідовності ДНК, зображеної на Фігурі 21. Сайти сплайсингу 5-1 /5 та 3-2 використовувались для вилучення першого інтрону, а сайти сплайсингу 5-2 та 3-3 використовувались для видалення другого інтрону. Це приводило до одержання послідовності КДНК, що мала відкриту рамку зчитування, яка кодує 220 амінокислотних залишків білка, показаного вище. У цій послідовності білка були відсутні 8 амінокислотних залишків порівняно з послідовністю, зображеною на Фігурі 23.

Фігура 25: є графічним відображенням результатів, одержаних з експериментів, призначених для порівняння рівнів експресії еновіну у нормальних та хворих тканинах. Еновін та САРОН експресія були представлені у тканині мозку відносно до розсіяного склерозу та хвороби Альцгеймера.

Фігура 26: є графічним зображенням результатів, одержаних для визначення рівнів експресії еновіну та

САРОН для хвороби Паркінсона та пухлин.

Депонування сч

Плазміда ЕММтауркЗЕТВ, яка включає послідовність ДНК, що кодує еновін, була депонована 6 травня 1999 року під депозитним номером І МВРЗ931 у Бельгійських координованих мікробіологічних колекціях (ВССМ) та і)

Лабораторії молекулярної колекції плазмід (І МВР) В9000, у Генті, Бельгія, згідно з положеннями Будапештського

Договору 28 квітня 1997 року.

Матеріали та методи с зо Матеріали

Нативна Тад-полімераза, ампіцилін, ІРТО (ізопропіл-Д-О-тіогалактозид), Х-здаї! с (5-бромо-4-хлоро-3-індоліл- Д-Ю-галактопіранози!) та усі ферменти рестрикції одержували з Берінгер Манхейм ду (Маппеїйп, Сегтапу). ТММ суміші ОМТР були придбані у Лайф Текнолоджіз (СайПегезриго, МО, ОБА). ТОРО-ТА клонуючий набір одержували з Інвітроген ВМ (І ееК, Меїпепіапаз). Плазмідний міні- або мідіднК очисний набір о Зіадеп, Оіаргер Зріп Міпіргер набір та Оіадціск набір для гель-екстракції одержували від Квіаген ГмбХ рч- (биззеїдоп, Сегтапу). Бібліотеки кКДНК, готові набори кКДНК Магаїйоптм, панелі людської кКДНК з різних тканин (МТС) | та ІІ, Нозерн-блоти різних тканин та Адуапіаде-СС набір КДНК ПЛР одержували з Клонеук Лебораторіз (Раїо Ай, СА, БА). Усі реакції ПЛР проводили у пристрої СепеАтр ПЛР-система 9600 (Регкіп ЕІтег, Ровіег «

СПУ, СА БА). І В (Лурія-Бертані) середовище складалося з 10г/л триптону, 5г/л дріжджового екстракту та 10г/л

Масі. Пластини 2х У Т/ампіцилін містили 16бг/л триптону, 1Ог/л дріжджового екстракту, 5г/л масі, 15г/л агару та - с 10Омг/л ампіциліну. и Дослідження послідовності на гомологію з послідовностями з бази даних є» Використовуючи повну людську гліальну клітинну лінію, що виробляє нейротрофічний фактор (СОМЕ; депозитний номер 099748), неуртурін (МТМ, депозитний номер РЗ9905) та персефін (РОР; депозитний номер АРО40962), послідовності білка, що походять від кДНК, як такі, що мають бути визначені, досліджували за -і допомогою ВІА5БТ (Вавіс І оса! Адптепі Зеагсп Тоо!; Аїеспці еї аїЇ.,, 32 1990) при використанні даних, що сю отримували кожного дня з ЕМВІ /ЗепрапкК стосовно цільових експресованих послідовностей (ЕЗТ) людини та даних з геномної бази даних. (се) Додаткові ВІ АЗТ-дослідження проводили при використанні геномної послідовності з депозитним номером 7 50 АСОО05038 та деякими Е5Т, що були присутніми у базі даних Сепрапк, при цьому виявляли гомологію до цих геномних послідовностей. що) Процент ідентичності та процент схожості між членами родини СОМЕ підраховували шляхом попарного порівняння послідовностей при використанні ВЕЗТЕРІТ програми (програмного забезпечення для аналізу послідовностей Сепеїййсв Сотршиіег (згоцр, версія 8.0, Університет штату Вісконсін, МІ, ОА). Вирівнювання послідовностей ДНК або послідовностей білка виконували за допомогою програми вирівнювання Сіивіаму о (ЕМВІ, Неїдеїбего, Сегтапу).

Олігонуклеотидний синтез за допомогою ПЛР та секвенування ДНК їмо) Усі олігонуклеотидні праймери замовляли з Еипгодепіес (Зегаіїпо, Веїдійт). Праймери, специфічні для послідовностей вставок (15- 16- мірні) та праймери для використання у реакціях ПЛР, визначали лабороторними бо методами. ДНК готували на Оіадеп-йр-20, або 100 аніонному обміннику, або ОіадцісК зріп колонках (Оіадеп

Стерн, Биззеїдоп, Септапу) знову вивільняли з колонок у ЗОмкл ТЕ-буфера (10ММ Трис-НСІ, їмММ ЕДТА (натрієва сіль), рН 8,0). Реакції секвенування виконували на обох ланцюгах, використовуючи АВІ ргізт Відбуе

Тептіпаюг Сусіе набір для клонування та розганяли на Арріїед Віозузіетвз 377 Хі. секвенсері (Регкіп ЕІтег, АВІ

Оімізіоп, Ровіег Спу, СА, БА). Програмне забезпечення бедцепспег тм використовували для поєднання 65 послідовностей та редагування (СепеСодевз, АппАгброг, МІ, О5А).

Клонування нових гомологів ЗОМЕ

Ділянка ДНК у проміжку нуклеотидів від 67411 до 68343 депозитного номера ЕМВІ АСОО5038, послідовність трансльованого білка якої була гомологічною до зрілого МТМ та РОР, використовували для визначення олігонуклеотидних праймерів для ПЛР ампліфікації. Різноманітні праймери, що використовувались, наведені у

Таблиці 1. то 6

Праймери РМНар 1 та РМНар2 використовували для ампліфікації фрагменту розміром 502п.о. на кДНК, що походить від різних тканин людини (КДНК фетального мозку, плоду, простати або легенів Магап-Кеадутм (Сіопіесі! І арогаюгіев), лобної частини кори головного мозку, гіпокампуса, мозочка) та на людській геномній

ДНК. Грунтуючись на геномній послідовності з ЕМВІ /ЗепВапкК бази даних (депозитний номер АСОО5038), було передбачено, що фрагмент, який піддавали ампліфікації, мав вміст СС на рівні 7695. Таким чином, ампліфікацію проводили при використанні Адмапіаде-С кДНК набору для ПЛР (Сіопіесі І арогайгієв, Раю А, СА, О5А), що був оптимізований для ампліфікації багатих на СС послідовностей ДНК. Реакції ПЛР проводили у загальному об'ємі 5бОмкл, що містив ЇХОС буфер для реакцій ПЛР для 34 кКДНК, 0,2мМ амтР, М ОС МЕЇТ тм, 200нМ сч ов праймерів РМНгрЗ та РМНарі, їмкл Адмапіаде КіепТад полімеразну суміш та від 1 до 5мкл кКДНК або 0,5мкг геномної ДНК. Зразки нагрівали до 959 протягом 5 хвилин та цикл виконували протягом 45сек при 95 2, 1 і) хвилину при 5892 та 40Осек при 722 протягом 35 циклів, з кінцевим етапом 7 хвилин при 722С. У кінці зразки обробляли 2,5 одиницями нативної ДНК полімерази для додання А. Продукти ПЛР аналізували у 190 (вага/об'єм) агарозному гелі у їх ТАЕ буфері (40мМ Трис-ацетату, 1ММ ЕДТА (натрієва сіль), рн 8,3). Фрагменти «СМ

ПЛР очікуваного розміру (495п.0.) вирізували з геля та піддавали очистці за допомогою Оіадціск набору для гель-екстракції. Фрагменти ПЛР піддавали секвенуванню для підтвердження їх ідентичності та клонували у сч плазмідний вектор рСК2.1-ТОРО, використовуючи ТОРО ТА набір для клонування згідно з інструкціями Ге) виробника. Приблизно 20нг очищеного фрагменту поєднували з їмкл рСК2.1-ТОРО вектора у загальному об'ємі бмкл. Реакції проводили при кімнатній температурі (2022) протягом 5 хвилин. 2мкл продукту реакції о трансформували у ТОРТІОР компетентні клітини (Іпийгодеп ВМ), використовуючи трансформацію шляхом ї- теплового шоку, та поміщали на 2х УТ/ампіцилін середовище, збагачене на 10мМ ІРТО та 295 (вага/об'єм) Х-даї! для скрінінгу на білі та голубі колонії. Білі колонії після вирощування протягом ночі збирали з чашок, вирощували у 5мл середовища І В, збагаченого 100Омг/л ампіциліну та готували плазмідну ДНК, використовуючи «

Оіаргер Зріп Міпіргер набір. Присутність вставки очікуваного розміру підтверджували шляхом перетравлювання рестрикційним ферментом ЕсоКІ. Плазмідну вставку декількох позитивних клонів секвенували та одержані - с послідовності порівнювали, використовуючи СіивіаМУ програму для вирівнювання. а Для одержання додаткової кодуючої послідовності для нового гомологу СОМЕ фрагмент з очікуваним "» розміром 931п.0о., що грунтується на послідовності ЕМВІ /ЗепВапк (депозитний номер АСОО5038), ампліфікували шляхом ПЛР, використовуючи праймери РМНгер!1 та РМНар!. Реакції ПЛР проводили у загальному об'ємі 50мкл, що містить їх С кДНК реакційного буфера для реакції ампліфікації, 0,2мММ амтР, М ОС-МЕЇ ТТ м, 200нМ -і праймерів РМНгер1 та РМНарії, Тмкл Адмапіаде КіепТад полімеразної суміші та від 1 до бмкл кДНК з мозочка, сю лобної частини головного мозку або гіпокампуса або 0,5мкг геномної ДНК. Зразки нагрівали до 9592 протягом 5 хвилин та цикл виконували 45сек при 959, 1 хвилину при 5892С та 1 хвилину ЗОсек при 7290 35 циклів, з ік кінцевим етапом 7 хвилин при 722С. Продукти ПЛР аналізували у 195 (вага/об'єм) агарозному гелі у їх ТАЕ ко 20 буфері (40ММ трис-ацетату, їмМ ЕДТА (натрієва сіль), рн 8,3). Друге коло ампліфікації проводили з нестед-праймерами (РМНзр2 та РМНар2). тІмкл продукту реакції ампліфікації першого кола використовували у їз загальному об'ємі 5Омкл, що містить їх ЗС кДНК буфера для реакції ампліфікації, 0,2мМ амтР, 1М ОС-МЕЇ Т м, 20О0НМ праймерів РМН:р2 та РМНар2, 1Імкл Адмапіаде КіепТад полімеразної суміші. Зразки нагрівали до 9590 протягом 5 хвилин та цикл виконували 45сек при 952С, 1 хвилину при 582С та 1 хвилину ЗОсек при 722С протягом 59 35 циклів, з кінцевим етапом 7 хвилин при 722С. Продукти ПЛР аналізували у 195 (вага/об'єм) агарозному гелі у (Ф) їх ТАЕ буфері. Фрагменти ПЛР очікуваного розміру (870п.0.) вирізували з геля та піддавали очистці за г допомогою ОіадціскК набору для гель-екстракції. Фрагменти ПЛР секвенували для підтвердження їх ідентичності, оброблювали 2,5 одиницями ТАС-полімерази та клонували у плазмідний вектор рСК2.1-ТОРО, використовуючи во ТОРО ТА набір для клонування згідно з інструкціями виробника. Приблизно 2О0нг очищеного фрагменту поєднували з їмкл рСК2.1-ТОРО вектора у загальному об'ємі 5мкл. Реакції проводили при кімнатній температурі (2022) протягом 5 хвилин. 2мкл продукту реакції трансформували у ТОР1ТОР" компетентні клітини (Іпуийгодеп ВМ), використовуючи трансформацію шляхом теплового шоку, та поміщали на 2х УТГ/ампіцилін чашки, що містили середовище, збагачене 10мММ ІРТО та 295 (вага/об'єм) Х-да!І для скрінінгу на білі та голубі колонії. Білі в5 колонії після вирощування протягом ночі збирали з чашок, вирощували у 5мл середовища ІВ, збагаченого 10Омг/л ампіциліну, та готували плазмідну ДНК, використовуючи Оіаргер Зріп Міпіргер набір. Присутність вставки очікуваного розміру підтверджували шляхом перетравлювання рестрикційним ферментом Есокі.

Плазмідну вставку декількох позитивних клонів секвенували та одержані послідовності порівнювали, використовуючи СіивіаМу програму для вирівнювання.

Аналіз генної експресії еновіну шляхом КТ-РСкК-аналізу

Олігонуклеотидні праймери РМН:згрЗ3 та РМНарі (див табл. 1) використовували для специфічної ПЛР ампліфікації фрагменту еновіну розміром 502п.о. ПЛР ампліфікацію проводили на панелях мультиплетної людської КДНК (МТСтм), нормалізованих до експресійних рівнів мРНК б різних генів. Реакції ПЛР з еновін-специфічними праймерами проводили у загальному об'ємі 5Омкл, що містить 5мкл кКДНК, їх С буфер для 70 реакції ампліфікації КДНК, 0,2мМ амтР, 1М С-МЕТтм, 400НМ праймерів РМН:вр2 та РМНар2, Тмкл Адмапіаде

КіепТад полімеразної суміші. Зразки нагрівали до 952 протягом 30 хвилин та цикл виконували протягом ЗОсек при температурі 959С та ЗОсек при 682С. Зразки аналізували у 1,295 (вага/об'єм) агарозному гелі у їх ТАЕ буфері (40мМ Трис-ацетату, 1мМ ЕДТА (натрієва сіль), рН 8,3) та візуалізували за допомогою забарвлювання гелю бромідом етідіуму, забарвлені гелі одержували при використанні системи Еадіе Еуе І! Мідео (Зігаї(адепе, 75 Гадоїа, СА, ОА).

Дослідження на подібність зразків, які одержували кожного дня з бази даних ЕМВІ «зепВапк та людських білкових послідовностей неуртиріну та персефіну, дало змогу отримати геномну послідовність ДНК, що кодує путативний новий білок, подібний до нейротрофічних факторів ЗОМЕ, МТМ та РЗР, цей білок позначали як еновін (ЕММ). Додаткове дослідження гомології з послідовностями, отриманими з бази даних, при використанні геномної послідовності ДНК, що охоплює ділянку, яка кодує еновін, дало змогу одержати декілька клонів, що експресують послідовність (ад (ЕТ), що походить від різних тканин людини (епітелія передміхурової залози (депозитний номер ААБ5З33512 (101322952)), карциноми легені (депозитний номер АА9З1637) та пухлини паращитовидної залози (депозитний номер АА844072)). Ці клони містять послідовність ДНК за межами ділянки гомології з ЗОМЕ,

МТМ або РБ5БР, що підтверджує, що мРНК еновіну експресується у нормальних та пухлинних тканинах. Ге

Початкова ПЛР ампліфікація при використанні праймерів (РМН:грЗ3 та РМНарі!), що грунтується на геномній (5) послідовності, дала змогу одержати фрагмент кКДНК розміром 500п.о. з плоду, мозку плоду, передміхурової залози, лобної частини кори головного мозку, гіпокампуса, мозочка та з геномної ДНК, але не з ДНК легені.

Клонування та секвенування цих фрагментів дало змогу одержати послідовність ДНК розміром 474п.0., що транслювалась в очікувану білкову послідовність, яка містила 139 амінокислотних залишків, включаючи 7 с консервативних залишків цистеїну, що характерні для усіх членів родини білків трансформуючого фактора сч росту ВД (ТОБ-рД) (Кіпозіеу, 1994) (Фігура 1). Послідовність також містила КЕХХК ділянку для розщеплення продомену (ВААБ, амінокислотні положення з 23 до 26) (Ваїт, 1991). Подібний сайт розщеплення бувпприсутнійв (3

СОМЕ, МТМ та РБ5Р білкових послідовностях у відповідній позиції послідовності продомена. Передбачуване со розщеплення продомену еновіну мало місце у цьому сайті іп мімо, послідовність зрілого білка ЕУМ містила 113 амінокислотних залишків (залишки від 27 до 139 на Фігурі 1) та мала підраховану молекулярну масу 11965Дата ї- ізоелектричну точку 11,8. У зрілій послідовності був присутній тільки один потенційний сайт М-глікозилування (М5Т в амінокислотних положеннях 121-123). Крім того, декілька консервативних ділянок між зрілими формами відомих нейротрофічних факторів СОМЕ, МТМ та РБОР також були присутніми в еновіні (Фігура 2). Таблиця 2 « підсумовує результати порівняння послідовностей зрілого білка членів родини СОМЕ за допомогою програми ВЕБ5ТРЕЇТ. Представлені процент ідентичності та процент подібності. Зрілі послідовності СООМЕ, МТМ, Р5Р та - с еновіну, що використовувались у цьому порівнянні, починались на першому амінокислотному залишку, що йде ч» за ЕХХК сайтом розщеплення. п 1 - с

Ф юю 1» 39 З цього порівняння видно, що зрілий білок еновін більш тісно пов'язаний з персефіном та неуртуріном,

Ніж з БОМЕ.

Ампліфікація, клонування та секвенування більшого фрагменту послідовності ДНК еновіну з кДНК лобної долі о кори головного мозку при використанні праймерів, що грунтуються на геномній послідовності ЕМВІ Хзепрапк іме) (депозитний номер АСО0О5038), дало змогу одержати розміром 819п.о. (Фігура 3). Ця послідовність містила путативний АТО стартовий кодон у нуклеотидному положенні 30-32 та мала відкриту рамку зчитування (рамка 60 зчитування А на Фігурі 3), що простягається до стоп-кодону в нуклеотидному положенні 285-287. Трансльована білкова послідовність цієї ділянки не виявляла подібності до будь-якого відомого білка з бази даних.

Трансляція послідовності КДНК у другій рамці зчитування (рамка зчитування В на Фігурі 3) давала очікувану послідовність білка, що складалася з 159 амінокислотних залишків. Ця послідовність містила КЕХХК сайт розщеплення (від положення В43 до В46; нуклеотидне положення 460-471) та послідовність, яка відповідає 65 послідовності зрілого еновіну (положення від В47 до В159; нуклеотидне положення 472-810). Відкрита рамка зчитування, що містила КХХК сайт розщеплення та кодуючу послідовність зрілого еновіну, простягалась від нуклеотидного положення 334 (що передує стоп-кодону, який знаходиться у рамці) до стоп-кодону у положенні 811-813, але не містила кодону АТО для стартового залишку метіоніну. По аналогії з персефіном (Мібгапа еї аІ.,, 1998), ми запропонували гіпотезу, що несплайсований інтрон присутній у більшості транскриптів мРНК з

Тена ЕММ. СОМЕ та МТМ також мали інтрони у своїх відповідних кодуючих послідовностях продомену |Маївивзпйа еї аї., 1997, НеисКегоп еї аї., 19971.

Для оцінки існування різних мРНК транскриптів для еновіну проводили КТК-ПЛР експерименти при використанні праймерів, розташованих на 5-кінці кодуючої послідовності еновіну безпосередньо після АТО стартового кодону, розміщеного вище 5' (праймер РМН:гер5 (5-ССА АОС ТОоС СТО ААС дос дос О-3), та /о Нестед праймер РМН:зрб (5-55 05050 ОСА АСА ОСТ САА ТОо-3), та розташованих на 3' кінці (праймер

РМНар! та нестед праймер РМНар?2? (див. Таблицю 1). Експерименти проводили на панелі кДНК, одержаних з багатьох тканин людини (Сіопіеспй МТС панель І та ІІ) на бібліотеці КДНК фетального серця (Сіопіесі) та на

КДНК, що походить від мозочку людини, гіпокампуса або лобної долі кори головного мозку (Мавзиге еї аї!., 19981.

Первинні реакції ПЛР проводили з праймерами РМНегр5 та РМНар! в умовах збагачення СС (Адмапіаде СОС-РСК набір, Сіопіесп) протягом ЗО циклів (95922 - ЗОсек., 602С - ЗОсек., 7220 - 1 хвилина), як було описано. Нестед реакції ПЛР проводили на мкл первинного продукту ПЛР, використовуючи праймери РМНезрб та РМНара, у тих самих умовах протягом 30 циклів. Одержані продукти ПЛР аналізували у 1,595 агарозному гелі та розподіляли по розмірам від -350п.о. до -800п.о. Декілька смужок очищали з гелю та безпосередньо секвенували фрагменти

ПЛР. Кілька очищених продуктів ПЛР також клонували у вектор рСК2.1-ТОРО (ТОРО-ТА набір для клонування,

Іпмігодеп) та потім піддавали секвенуванню. Секвенування підтвердило існування різних молекул мРНК, що містили послідовність еновіну. Одержані фрагменти послідовності порівнювали з геномною послідовністю еновіну. Це дозволило нам ідентифікувати декілька можливих 5 та 3 сайтів сплайсингу, що відповідають консенсусним послідовностям для донорного та акцепторного сайтів сплайсингу |(Зепараїну, Р., ЗПпаріго, М.В. 5

Наїтів, М.І. (1990)), сплайсинг-з'єднання, гілку точкового сайту та екзони: статистику послідовності, Га ідентифікацію та застосування проводили відповідно до геномної програми. Меїйодіз Епгутої. 183, 252-278. Різні сплайсинг-варіанти еновіну були ідентифіковані, їх присутність у різних тканинах людини підсумована на Фігурі і) 22. Тільки два з п'яти секвенованих транскриптів давали функціональний білок еновіну при трансляції від АТО стартового кодону.

Ці два транскрипти кодують білки розміром 228 або 220 амінокислот, відповідно, з очікуваними сигнальними є пептидами, що складаються з 47 та 39 амінокислотних залишків. Очікувані білкові послідовності цих двох варіантів представлені на Фігурі 23 (довгий варіант) та Фігурі 24 (короткий варіант). Довгий варіант може с бути дедукований з послідовності ДНК на Фігурі 21 шляхом сплайсингу першого інтрону у положенні 5-1 та 3-1 Ге») та другого інтрону у положенні 5-2 та 3-3. Очікувана послідовність білка, представлена на Фігурі 23, була одержана шляхом трансляції відкритої рамки зчитування. Більш короткий варіант може бути дедукований з о 3Зз5 послідовності ДНК Фігури 21 шляхом сплайсингу першого інтрону у положенні 5-1 та 3-2 та другого інтрону у ч- положенні 5-2 та 3-3. Очікувана послідовність білка, представлена на Фігурі 24, була одержана шляхом трансляції відкритої рамки зчитування.

Найдовший транскрипт, який, як виявилось, представлено у меншій кількості у більшості тканин, про що « можна судити з інтенсивності смуги на Фігурі 228. Коротші транскрипти, що походять від заміни рамки, давали змогу одержувати трансльований білок, що мав неправильну амінокислотну послідовність, гомологічної до й с СОМЕ, МТМ та РЗР. Два найменших транскрипти, в яких була відсутня частина кодуючої послідовності еновіну, ц включали два з семи високо консервативних залишків цистеїну. Фігура 228 показує розподіл основних варіантів "» сплайсингу в різних тканинах людини. Фукціональну мРНК еновіну експресували у більшості тканин, що піддавали тестуванню, включаючи мозок, серце, нирку, печінку, легені, підшлункову залозу, скелетні м'язи, ободову кишку, тонкий кишечник, лейкоцити периферичної крові, селезінку, тімусу, передміхурову залозу, яєчко, -І яєчник, плаценту та фетальне серце. У деяких тканинах людини (наприклад, у мозочку, гіпокампусі) тільки нефункціональні транскрипти можна було ампліфікувати шляхом ПЛР. Згідно з нашими знаннями, випадковість

Мн нефункціональних транскриптів мРНК відносно до існуючих не була описана раніше. Біологічне значення цих (Се) відкриттів необхідно вивчати. Хоча експрсія МТМ та РЗР у різних тканинах не була охарактеризована повністю, їх експресійні рівні, як виявилось, набагато нижчі, та експресія більш обмежена у певних тканинах (Кограцег о еї а!., 1996, Міїбгапаї еї аї, 1998).

ІЗ Рекомбінантна експресія еновіну в Е.соїї. Конструювання плазміди для експресії еновіну

Фрагмент ПЛР розміром 414п.о. ампліфікували з людської геномної ДНК з праймерами РМНзр4 та РМНар2 (Таблиця 1) та клонували у вектор рСК2.1-ТОРО, використовуючи ТА-клонування (Іпмийгодеп). Послідовність вставки підтверджували секвенуванням. Один клон, що містив вставку з еновін-консенсусною послідовністю (клон 36), використовували для подальшого конструювання експресійної плазміди. Два праймери були о призначені для внесення прийнятних рестрикційних сайтів на своїх 5--кінцях. Передній праймер РМНехр-зрі ко (5-580С6 АТ ССО ОСТ об ос ССО ос А-3), містив Ватні рестрикційний сайт (підкреслений), зворотний праймер РМНехр-арі (ОСС ТСО АСТ САС ССС АСОо САС ССО САс О-3) містив Хпої! рестрикційний сайт бо (також підкреслений). Використовуючи ці праймери, фрагмент розміром 343п.о., що кодує зрілий еновін (положення 81 до 422 на Фігурі 1), ампліфікували з клону 36. Реакцію ПЛР проводили у загальному об'ємі 50мкл, що містить їх С буфера для ПЛР кКДНК, 0,2мМ амтР, 1М ОС-МЕЇ ТТ тм (200нМ праймерів РМНехр-5рі та

РМНехр-арі, Імкл Адмапіаде КіІепіад полімеразної суміші та 1ТОнг плазмі дної ДНК з клону 36). Зразки нагрівали до 942С протягом 5 хвилин та цикл виконували протягом 45сек при 952С, 1 хвилину при 582С та ЗОсек при 72920 65 протягом 25 циклів, з кінцевим етапом 7 хвилин при 7220. Одержані 5Омкл продукта очищали, використовуючи

Оціадціск ПЛР очисний набір (Оціадеп), та ДНК елюювали у ЗОмкл. 25мкл цього очищеного продукта потім перетравлювали у ЗОмкл реакційної суміші з Тбод. ВатНі та 1Оод. Хо! у 1х буфері В (Военгіпдег Мапппеїіт) протягом 1 години при 372. Після електрофорезу у 195 (вага/об'єм) агарозному гелі у їх ТАЕ буфері (40ммМ

Трис-ацетату, ММ ЕДТА (натрієва сіль), рн 8,3) очікувану смужку, що характерна для фрагменту розміром З5Зп.о., вирізали з гелю та піддавали очистці за допомогою СіадціскК набору для гель-екстракції. Одержаний фрагмент лігували у вектор РК5ЕТ В (Іпмігодеп), лінеаризували за допомогою Ватні та Хпої. Вставку одержаної плазмідної конструкції (ПЕММтаурк5БЕТВ) підтверджували повним аналізом послідовності. Одержана конструкція кодувала білок розміром 146 амінокислот з очікуваною молекулярною масою 15704Да, включаючи

МН-2 термінальний 6 х Ніз-іад, злитий у рамці з кодуючою послідовностю зрілого еновіну. МН-2 термінальна 7/0 амінокислотна послідовність одержаного білка була, таким чином,

МкОоЗННННННОМАЗМТОоСООМОКО!І мпрОрКОРАСОРОЗ (послідовність зрілого еновіну виділена, бх Нів (ад підкреслено).

Експресія еновіну у ВІ 21(ОЕЗ) клітинах Е.соїї

Рекомбінантну продукцію білка еновіну проводили суттєво так, як описано для неуртиріну І(Стеедоп еї а). 75 (1997) з модифікаціями. Для продукції рекомбінантного білка еновіну плазміду пЕММтауркзЕТВ трансформували в Е.соїї штаму ВІ 21(ОЕЗ) (Момадеп) та вирощували на 2хХУТ/середовищі, що містить ампіцилін (1бг/л триптону, 10г/л дріжджового екстракту, 5г/л МасСі та 100мг/л ампіциліну) при 302С (225об/хв) та 372С (ЗОбоб/хв) до оптичної щільності 00600 приблизно 0,5 перед доданням ІРТО до кінцевої концентрації О0,2мММ для індукції експресії. Осади клітин збирали шляхом центрифугування, що проводили після 3-х годинної індукції, 20 промивали фізіологічним розчином, забуференим фосфатом, центрифугували та зберігали замороженими. Для очистки клітинні осади ресуспендували у буфері для ультразвукової обробки 20мММ Трис-НСІ, рН 8,0, ЗО0ММ масі, їмМ 2-меркаптоетанолу, інгібітори протеаз (Сотрієе(етм таблетки, що містили суміш протеазних інгібіторів (Воейгіпдег Мапппеійт, 1 таблетка на 5Омл буфера) та 1мг лізоциму на 500мг клітинного осаду).

Клітини руйнували шляхом обробки ультразвуком та тіла включення збирали центрифугуванням. Тілавключення С 25 розчиняли та інкубували у буфері А (8М сечовини, 20мМ Трис-НСЇ, рН 7,6, 200мМ масі, 1мМ 2-меркаптоетанолу) о протягом ЗО хвилин при 372 перед додаванням до Мі-МТА смоли (нікель нітрілотриоцтова кислота, Оіадеп).

Після 40 хвилин струшування при 372 зразки один раз промивали у буфері А та завантажували у 5мл МіІ-МТА колонку. Колонку промивали за допомогою буфера А у кількості 10 об'ємів колонки, буфером А з рН 7,2 у кількості 10 об'ємів колонки, та буфером А з рН 7,2, що містить 10ММ імідазолу у кількості 10 об'ємів ЄМ 30 колонки. Еновін елюювали з колонки при використанні буфера А, рН 7,2, що містить 200мММ імідазолу, у кількості сч 4 об'єми колонки.

Очищення еновіну проводили шляхом послідовного діалізу протягом ночі при 42С у ренатураційному буфері Ф) (01М фосфату натрію, 0,15М Масі, ЗмкМ цистеїну, 0,0290 Твіну-20, 1095 гліцеролу, 0,01М Трис-НСЇ, рН 8,3), що со містить кількості сечовини, що зменшуються на кожному етапі (від ЄМ до 4М до ЗМ до 2М до 1М до 0,5М до ОМ

Зо сечовини). Очищений білок аліквотували, зберігали при -202С та надалі використовували для функціональних в. аналізів.

Хромосомна локалізація гену еновіну

Фрагмент розміром 3,3кб гену еновіну був ампліфікований з кДНК мозочка при використанні праймерів ЕММ « (7)-врі (5-ТТО СО ТОТ СТА САА АСТ САА СТО СО-3)) та РМНар1 (5-ССА СБА АСА СС АСС ОСТ АдО О-3), 40 що походять від послідовності ЕМВІ. з депозитним номером АСО05038. Реакцію ПЛР проводили у загальному З с об'ємі 5Омкл, що містить їх Ехрапа Гопд Тетріаїе ПЛР реакційний буфер (Воепгіпдег МаппПеїт), 0,5ммМ амтРр, "з 1М ОС-МЕЇ Т (Сіопіесі І арогайогіеєв), 4Д00НМ праймерів ЕММ (7)-зрІ та РМНар1! та їмкл кДНК мозочка. Після " ініціації протягом 2 хвилин при температурі 94 С, додавали 0,75мкл Ехрапа /опд Тетріа(е полімерази (Воепгіпдег Мапппеійт) та цикл проводили протягом 1Осек при 942, ЗОсек при 582С та З хвилини при 682С протягом 10 циклів. Потім проводили 20 додаткових циклів, збільшуючи час експозиції при 682С на 20сек кожний їх цикл. У кінці проводили заключний цикл протягом 7 хвилин при 682С. Одержаний фрагмент розміром 3,3кб (65) очищали після електрофорезу у 0,895 агарозному/ТАЕ гелі та клонували у вектор рСК2.1-ТОРО, використовуючи с ТА-клонування (Іпийгодеп). Повний аналіз послідовності вставки 3,3кб одного клону підтвердив, що одержана послідовність КДНК відповідає геномній послідовності з бази даних ЕМВІ. (депозитний номер АСООБ5038). Ніяких 50. й й не ко інтронів не було сплайсовано у кКДНК, одержаній з кДНК мозочка.

КЗ Хромосомне картування виконували при використанні флуоресцентного іп зйи гібридизаційного (РІЗН) аналізу суттєво так, як описано |Непо еї аї!., 1992, Непд «5 Твиїі, 1993). Людські лімфоцити культивували при температурі 372С протягом 68-72 годин перед обробкою з 0,18мг/мл 5-бромо-2'і--деоксиуридину (Вга)) для синхронізації клітинних циклів у популяції клітин. Синхронізовані клітини промивали та рекультивували при 372 протягом б годин. Клітини збирали та готували мазки, використовуючи стандартну методику, що передбачає (Ф) гіпотонічну обробку, фіксацію та висушування на повітрі. Зразок З3,3кб еновіну піддавали біотинілуванню та ка використовували для визначення методом РІЗН. Мазки витримували при 552С протягом 1 години, оброблювали

РНКазою та денатурували у 70956 формаміді у 2х Масі/Сії (20х Масі/Сії, що містить ЗМ Масі, 0,3М дізодіум бо Ццитрату, рН 7,0) протягом 2 хвилин при 702С з подальшою дегідратацією етанолом. Після гібридизації протягом ночі, мазки промивали, сигнали РІЗН та 46-діамідіно-2-феніліндол зв'язані моделі розрізняли окремо на фотографічній плівці та дані РІЗН картування порівнювали з межами хромосоми, при цьому досягали суперімпозиції сигналів РІЗН з 4"б-діамідіно-2-феніліндол зв'язаних хромосом |Непуд 4 Твиці, 1993). В умовах, що використовувались, ефективність гібридизації була приблизно 72905 для цього зразка (серед 100 відібраних 65 Мітотичних фігур, 72 показали сигнали на одній парі хромосом). Оскільки -6-діамідіно-2-феніліндол зв'язування використовували для ідентифікації специфічної хромосоми, одержували вирівнювання між сигналом від зразка та короткою частиною хромосоми 1. Детальне розміщення далі визначали, базуючись на аналізі 10 фотографій (Фігура 4А). Не було знайдено додаткового локусу, визначеного за допомогою РІЗН-аналізу в умовах, що використовувались, таким чином, ми зробили висновок, що еновін знаходиться у хромосомі 1 людини, ділянка р31.3-р32. Приклад результатів картування представлено на Фігурі 48.

З даних генного картування Національного центру з біотехнологічної інформації «(«МСВІ, пЕр:/Лимлу. побрі.піт.пій.дом/депетар) було дедуковано, що геномний клон, який містить послідовність еновіну (ЕМВІ депозитний номер АСО0О5038), локалізовано у хромосомі 1, між маркерами 0152843 та 015417. Це відповідає хромосомі 1, ділянка р31.1 до р32.3, підтверджуючи дані, одержані за допомогою РІ5Н аналізу. 70 Розподіл еновіну у тканинах, визначений за допомогою нозерн-блотінг аналізу та доЇ-блоттінг аналізу

Нозерн-блоти, які містять 2мкг полі (А)-збагачених РНК, що походять з різних тканин людини (Сіопіесй

І арогаюгіез, Раїо Айо, СА, ОБА; МТМтм блот, МТМтм блот ІІ та фетальний МТМтм блот ІІ), гібридизували згідно з інструкціями виробника з (0-2Р-4СТР. рендомне-праймуюче мічення (НідпРгіте набір, Военгіпдег Мапппеїт) фрагментом еновіну розміром 897п.о. Цей фрагмент одержували шляхом ПЛР-ампліфікації з праймерами 75 РМНгр!1 та РМНар!1ї на кДНК лобної долі кори головного мозку та подальшого клонування у вектор рСК2.1-ТОРО.

Фрагмент містив 897п.о. послідовність еновіну вище від стоп-кодону та включав повну кодуючу послідовність зрілого білка еновіну.

МРНК еновіну визначали як основний транскрипт розміром приблизно 4,5Ккб (Фігура 5А-С). Еновін експресували у ряді тканин, особливо у тканинах серця, скелетних м'язів, підшлункової залози та передміхурової залози. Декілька транскриптів невеликого розміру були присутніми, наприклад, у плаценті (4кб, 2,4кб та 1,6кб) та передміхуровій залозі (4кб та 1,6кб). У фетальній тканині основний транскрипт розміром 2,4кб був присутній у печінці та у меншій кількості у легенях. Інші транскрипти були також присутніми у фетальній нирці, печінці, легенях та мозку.

У доповнення, РНК-мастер блоти (Сіопіесі І арогайогіев), що містили багату на полі(А) РНК з різних тканин Ге людини та на різних етапах розвитку, також гібридизували зі зразком еновіну розміром 897п.о. Збагачені на о полі(А) проби РНК, що використовували для створення цього блоту, нормалізували до рівнів експресії мРНК восьми генів, що мають походження від різноманітних тканин. мРНК еновіну експресували у всіх тканинах, але найвищі рівні мРНК були виявлені у передміхуровій залозі, гіпофізі, трахеї, плаценті, фетальних легенях, підшлунковій залозі та нирці (Фігура БОЖЕ). с

Конструювання СЕКа-Ідо-Ес злитих векторів

Ділянки КДНК СЕКо-1, СЕКо-2 та ОЕКо-3 (що кодують амінокислоти з 27 до 427, з 20 до 431 та з 28 до 371 с відповідно) за винятком послідовності, що кодує сигнальний пептид та СООН-термінальну гідрофобну ділянку, (о) втягнену у СОРІ-прикріплення, клонували у рамці в експресійний вектор Зідпаї! рід різ (КО Бувіетв Еийгоре Це). с

Одержані білки, експресовані з цих конструкцій, містили 17 амінокислот МНо-термінального СОЗЗ сигнального пептиду, ділянку СЕК у та 243 амінокислоти СООН-термінального ІдсС.-с злитого домену. СНО клітини /їч- трансфікували ЗЕКо, злитою конструкцією, стабільно трансфіковані клітини відбирали, використовуючи 500мкг 418. Стабільні клони відбирали, використовуючи Ес антитіло. Для очистки ЗЕК о злитих білків клітини вирощували на вільному від плазми середовищі та середовище збирали кожні З дні. Середовище « центрифугували та використовували для білкової А колонки (Ргоїеіп А Зерпагозе, Рпагтасіа Віоїесі). Зв'язаний білокелюювали за допомогою 0,1М цитрату натрію, рН 3,0, та збирали у 1М Трис-буфері, рН 8,4. Концентрацію З с білка оцінювали шляхом вимірювання поглинання при 28О0нм, використовуючи коефіцієнт екстинкції 1,5. Ці "» очищені розчинні СЕКо-1 до -3 Ес злиті білки використовували для подальшого вивчення зв'язування. " Поверхневий аналіз на основі плазмон-резонансу

Експерименти по поверхневому плазмон-резонансу (ЗРК) проводили при температурі 2523, використовуючи

ВіАсоге 3000 пристрій. Аналізи проводили з еновіном та МО як імобілізованими лігандами. Карбоксильований матрикс 1 сенсорного чіпа спочатку активували за допомогою 11 суміші 400ММ о М-етил-М-(диметиламінопропіл)-карбодіїміду та 100 мМ Бі-етил-БІ--диметиламінопротл)-карбодіїміду та 100ММ

М-гідрокси-сукциніміду протягом 10 хвилин. Потім рекомбінантний еновін та МОБ наносили на активовану ї-о поверхню у 10мММ ацетатному буфері, рН 4,5 при швидкості витікання бмкл/хв. Незв'язані реакційні групи ко 20 інактивували за допомогою 1М етаноламін гідрохлориду. Для експериментів по зв'язуванню розчинний "з СЕКо-1-3 Ес зливали при концентраціях 10-100НМ у НЕРЕ5 забуференому фізіологічному розчині (150мМ Масі,

З5ММ ЕДТА, 0,05956 Р-20, 10мММ НЕРЕБ5, рН 7,4) при швидкості витікання 1Омкл/хв. Асоціацію піддавали моніторингу протягом З хвилин та дисоціації протягом 1 хвилини, далі проводили регенерацію з 5ммМ Ммаон.

Дисоціацію ініцювали шляхом злиття з НЕРЕ5 забуференим фізіологічним розчином. ВІіАсоге програмне забезпечення оцінки, 3,0 використовували для обчислення значення асоціації (К 4), значення дисоціації (Ка) та

ГФ) константи рівноважної дисоціації Ку, що обчислювалась як Ка/Ку). з Результати

ЗРК використовували для вимірювання зв'язування розчинного СЕК /9-1-3 для імобілізації еновіну. во Специфічне зв'язування з еновіном може бути визначене тільки з розчинним СЕК 53. ЗЕКо-1 та ЗЕКо-2 не зв'язується з імобілізованим еновіном. Зв'язування, що спостерігали для СЕК 9-3, є специфічним, оскільки не спостерігали зв'язування з МОБ. В окремому контрольному експерименті специфічне зв'язування ТІкКА-Ес (рецептор МОБ) з імобілізованим МОБ визначали без зв'язування з імобілізованим еновіном.

З кривих зв'язування, одержаних при використанні трьох різних концентрацій СЕК о, були встановлені 65 наступні константи, наведені у Таблиці 3. Ці результати показують, що СЕКоЗ специфічно зв'язується з еновіном.

С Теомоу кою | емо

Оскільки СОМЕ, МТМ, та РБ5Р - усі сприяють існуванню та виживанню різних типів нейронних клітин, було передбачено, що еновін має такі самі біологічні ефекти на нервові клітини та, можливо, на інші типи клітин також. Таким чином, було передбачено, що еновін може бути корисним при лікуванні нервових розладів взагалі, включаючи хворобу Паркінсона, хворобу Альцгеймера, периферичну невропатію, аміотрофічний латеральний 70 склероз (АГ 5), хворобу Хантінгдона, гостре пошкодження мозку, пухлини нервової системи, розсіяний склероз, периферичну нервову травму та пошкодження від дії нейротоксинів.

Еновін може також бути корисним у різних аспектах нейропротекції. Зважаючи на його вплив на виживання різноманітних популяцій нейронних клітин та на протяжність аксонів нервових клітин, що спостерігали у нашій моделі ЗН5ЗУБУ клітин, ми запропонували, що ця сполука може мати нейропротективне та нейрогенеративне 7/5 застосування.

Це грунтується на наступних спостереженнях. Таксол-індукований нейронний апоптоз у

МОг-диференційованих РС12 клітинах феохромоцитоми пацюків (Миудепз еї аіІ., представлений до розгляду).

Таким чином, таксол-індукована цитотоксичність має риси нейронного апоптозу, як спостерігали при фрагментації ДНК, мічення за допомогою Аппехіп М та рсіІ-2 захисті. Таке подовження строку дії може бути дедуковане з того, що таксол індукує апоптоз у диференційованих ЗН-ЗУ5У клітинах. Еновін, як зараз показано, має здатність зменшувати загибель цих клітин та, таким чином, може сприяти зворотному розвитку нейронних апоптозів взагалі.

Сполука може, таким чином, бути корисною при таких нейродегенеративних симптомах, при яких спостерігається апоптоз, а саме удар (НаКкіт, 1998), хвороба Паркінсона (Магздеп еї аї!.,1998), хвороба Га

Альцгеймера (Маду еї аїІ., 1998), хвороба Хантінгдона (УМІїпдюп еї аїЇ.,, 1997), нейротравма (Зтігома еї аї., 1998), периферична нейропатія (5гіпімізап еї аї., 1998). і9)

Останніми клінічними випробуваннями ми показали, що цей нейротрофічний фактор фактично захищає диференційовані ЗН-5У5У клітини людської нейробластоми проти таксол-індукованої клітинної цитотоксичності.

Методика вимірювань життєздатності Ге

Клітинну життєздатність визначали шляхом додання до кожної пробірки 1ООмкл мг/мл розчину 2,3-біс|(2-метокси-4-нітро-5-сульфофеніл|-2Н-тетразоліум-5-карбоксаніліду (ХТТ, Зідта) у ОМЕМ (372С), с збагаченому 0,02мММ феназин метосульфату (РМ5, Зідта). Чашки потім інкубували при 372С протягом 2,5 Ге) годин. Оптичні щільності зчитували (молекулярні розподіли) при 45Онм, використовуючи б5Онм як контроль. с

ХТТ-аналіз базувався на перетворенні солі тетразолію ХТТ у продукт формазану, забарвлений у червоний колір.

Ця реакція відбувається за участю мітохондріальних ферментів. -

Методика нейронної диференціації 1. Диференціація клітин людської нейробластоми ЗНЗУБУ

ЗНЗУ5БУ клітини диференціювали протягом 5 днів з 25НМ стауроспоріну. Вплив еновіну визначали через 72 « години після початку експерименту (посилання ЙИалава та ін. "Протеїн-кіназний інгібітор стауроспорін індукує зрілий нейронний фенотип у ЗНЗУ5БУ клітинах людської нейробластоми шляхом а, Б, 2 РКС незалежного шляху" - с Уошгп. СеїЇ Рпузіо!. 155, 301-312 (1993)). и 2. Вимірювання протяжності аксонів нервових клітин ,» Морфологічні зміни у нейронах були автоматично кількісно оцінені як описано нижче. Стисло, у певний час, глютаральдегід додавали безпосередньо до середовища та залишали на 30 хвилин при кімнатній температурі.

Цим впевнювались, що морфологія клітин відображала реальну ситуацію на цей момент часу. Клітини -і спостерігали через модус, що передає світло, у Ахомегі мікроскоп (7еізв ОБрегкоспеп, Септапу), оснащений сю Маг2гпацвзег скануючим стейджем, що керується Іпау пристроєм (Зіїсоп (згарпісв, Моипіаіїйп Міем, ОЗА).

Зображення уловлювали, використовуючи МХ5 відеокамеру (НСЗ). Близько 3000 клітин оцінювали у 64 се) вистроєних у ряд зображень, що формували зображення площею 8 х8. Точне вирівнювання зображень 7 50 підтверджувало, що аксони нервових клітин можуть переходити з одного поля зображення на наступне.

Автоматичне визначення протяжності аксонів нервових клітин, мічених поліклональними (аи-антитілами,

Із проводили, використовуючи детектор для кривих та лінійних структур, що не виявляє впливу (Зіедег, 1998). За допомогою аналітичного програмного забезпечення автоматично підраховували загальну площу клітини, число клітин та загальну довжину аксонів нервових клітин.

Для оцінки впливу еновіну на різні типи клітин, проводили два аналізи: аналіз синтезу ДНК та аналіз о хемотаксису.

Аналіз синтезу ДНК іме) Клітини, включаючи людські шкірні фібробласти (39К5), людські ендотеліальні клітини пуповинної вени (НОМЕС), людські клітини гладеньких м'язів (НЕМС), людські хондроцити та остеобласти пацюка поміщали у бо ОМЕМ, що містить 1095 ЕВ5 (39-5К, НЗМС, остеобласти пацюка), або спеціальне середовище (хондроцити та

НОМЕС) при 372С з 5956 СО» та 9595 повітря. Для аналізу синтезу ДНК клітини засівали у 96 пробірок для культури тканин при щільності 5,000 клітин/пробірка у ОМЕМ, що містить 1095 ЕВ5, та інкубували протягом 24 годин. Культуральне середовище потім вилучали з ОМЕМ, що містить різні концентрації еновіну та 0,195 ВБА (для 39-5К, остеобластів, НЗМС, хондроцитів) або ОМЕМ, що містить 0,595 ЕВ (для НОМЕС), та клітини бо інкубували протягом 24 годин. Далі культуральне середовище вилучали з 100мкл ОМЕМ, що містить 595 ЕВ5 та б,їмкСі ІЗНІ-тимідину. Після 2 годин пульсуючого мічення, клітини фіксували за допомогою суміші метанол/оцтова кислота (3:1, об'єм/об'єм) протягом 71 години при кімнатній температурі. Фіксовані клітини двічі промивали 8095 метанолом. Клітини витримували у 0,05950 трипсині (10Омкл на пробірку) протягом 30 хвилин, а потім у 0,590 505 (100мкл на пробірку) протягом додаткових 30 хвилин. Аліквоти клітинних лізатів (180мкл) поєднували з 2мл сцинтиляційної суміші та радіоактивність клітинних лізатів вимірювали при використанні лічильника для рідкої сцинтиляції (У/аМас 1409).

Аналіз хемотаксису

Клітини підтримували так, як описано у "Аналізі синтезу ДНК". Хемотаксичну активність еновіну 70 аналізували, використовуючи модифіковану камеру Бойдена на 12-пробірок |МсОицйШап, О.9У., Напаіеу, С..,

Сатрреїї, М.А., Воїїв, 5., Мім/ау, М.Е., Негіпдіоп, А.С., (1986), "Стимуляція біосинтезу протеоглікану у сироватці за допомогою подібного до інсуліну ростового фактора-І культивованих суглобових хрящах теляти",

Віоспет. 9. 240: 423-430). Клітини піддавали трипсинізації, використовуючи 0,0595 трипсин та О,5ММ ЕДТА та ресуспендували у ОМЕМ. У пробірки камери Бойдена додавали аліквоти 150мкл середовища, що містило різні 75 концентрації еновіну. Полікарбонатні мембрани (8мкм), вкриті О,їмг/мл колагеном типу І, вносили на дно пробірок, далі збирали верхній шар пробірок. До верхнього шару пробірок додавали аліквоти 10Омкл клітин (70,000 клітин/мл). Після б-годинного періоду інкубації апарат роз'єднували. Клітини, що залишались зверху мембрани, вилучали. Мембрани фіксували 1095 формальдегідом протягом 15 хвилин, далі забарвлювали сильним гемотоксиліном Гілла. Клітини підраховували під мікроскопом (250 х збільшення), а середнє значення для клітин розраховували з п'яти ділянок кожної використаної пробірки. Кожний дослід повторювали, принаймі, чотири рази. Результати порівнювали з контролем (ОМЕМ, що містить 0,195 ВБА).

Як представлено результатами на Фігурах з 8 до 18, еновін не має впливу на проліферацію кожного з типів клітин, що використовували, або на міграцію НОМЕС клітин (Фігура 14), як описано вище. Спостерігали вплив еновіну на ЗН-5У-5 У клітини нейробластоми. Це показало селективний вплив еновіну на нейронні клітини. Га

Було показано, що як СОМЕ, так і МТМ, передають сигнали шляхом сигналізуючих комплексів, що складаються з ліганд-зв'язуючої субодиниці, а також ЗЕК 91 або сЕКа?г, сигналізуючої субодиниці, СКЕТ білка о тирозин кінази. Передбачається, що еновін виявляє свій біологічний вплив через подібний сигналізуючий комплекс, що складається з (зЕКо-зв'язуючого партнера (ЗЕКо-1, СЕКоУ-2, або нещодавно охарактеризованого орфанового рецептора ЗЕКо-3, або іншого ще неохарактризованого члена родини СЕКо) у поєднанні з СКЕТ С або іншим сигналізуючим партнером. Дійсно, наші дані показали, що еновін може специфічно зв'язуватись з сч

СЕКа-3.

У людини мутації зародкової лінії у ЗОМЕ або скЕТ можуть приводити до фенотипів деяких хвороб, (2) включаючи розсіяну ендокринну неоплазію та сімейну хворобу Хіршспрунга (НЗСК) |(Котео еї аї., 1994, Едегу еї со аІ,, 1994, Апагізі ей аїЇ.,, 1996). Обидва ці захворювання асоційовані з розладом кишкової рухливості, з хворобою Хіршспрунга найбільш часто зв'язують природжену кишкову обструкцію у немовлят. Цікаво, що СООМЕ в. та СКЕТ кноккоут миші демонструє подібну патологію з нирковою агенезією та кишковим аганліозом ІЗапспез еї аІ,, 1996, Мооге еї аї!., 1996, Ріснеї! еї аІ., 1996). Еновін може бути втягнений у подібні розлади кишечника або нирки, оскільки він експресується у всіх типах тканин і може бути важливим у розвитку інших периферичних « органів у людини.

Взаємодія лігандів зі своїми рецепторами, взагалі, досягається шляхом дії специфічного зв'язку, що т с складається з особливих залишків в обох білках. Фрагменти білка можуть служити як агоністи, що активують "» рецептор, виявляючи свій вплив на ріст та підтримання виживання клітин. Частини еновіну або синтетичні " пептиди, що базуються на білковій послідовності еновіну, можуть, таким чином, бути корисними як агоністи або антагоністи для регуляції рецептора СЕКо-3.

Використовуючи синтез пептидів або техніку рекомбінації, можуть бути одержані гібридні ростові фактори, ш- що складаються з частин ЗОМЕ, МТМ, Р5Р, або будь-якого іншого нейротрофічного, або ростового фактора, з оо частинами еновіну, для отримання нового синтетичного ростового фактора з новими властивостями.

Ставили два досліди для визначення, чи здатний еновін змінювати індуковану таксолом сенсорну і, недостатність у пацюків після субплантарного введення пацюкам. У першому експерименті визначали, чи може

ГІ 20 лікування одним еновіном реверсувати індуковану таксолом сенсорну недостатність, у той час як другий дослід визначав, чи може еновін запобігти розвитку таксол-індукованої сенсорної недостатності. г» Зворотний розвиток індукованої таксолом сенсорної дисфункції

Процедура

Використовували самців Зргадце-Оаумлеу пацюків, вагою 300-340 грамів. Тварин поміщали окремо та 5о забезпечували їжею та водою, як було бажано. Перед початком експерименту тварин поміщали у стандартні

ГФ) клітки для спостереження та після періоду привчання протягом 15 хвилин оцінювали рефлекс за допомогою тесту уколом. Для цього поверхню підошви правої лапи тварин стимулювали за допомогою голки та реактивність де цього тесту визначали як наявну (показник!) або відсутню (показник-0). Протягом одного експерименту процедуру повторювали тричі з інтервалом часу 1 хвилина між 2 послідовними стимулами; такий тест уколом 60 складався з трьох вимірювань реактивності. Тільки пацюки, які мали нормальні реакції на З тести уколом, включались в експеримент.

У З наступні дні уранці тварини одержували ін'єкцію таксолу (Змг/мл паклітаксену, розчиненому у кремафорі та дегідратованому спирті плюс вода) у праву задню лапу. Наступним ранком рефлекс на укол повторно оцінювали та тварин, що не виявили реактивності до З стимулів відбирали. Цих тварин грубо розподіляли на бо підгрупи (п-10/група), їм субплантарно вводили у праву задню лапу 75мкл носія або фізіологічного розчину, 23 або 1ЗОмкг/мл еновіну. Оскільки не спостерігали ніякої різниці між результатами для тварин, оброблених носієм та фізіологічним розчином, обидві групи поєднували (контрольна група). Через 1, 4, 5 та 7 днів після останньої обробки тести уколом проводили як уранці (між 8 та 9 годинами ранку), так і ввечері (між 3.30 та 4.30 вечора). Через 8 днів останній тест уколом проводили уранці. Для кожної тварини одержували кумулятивні дані реактивності до уколу протягом часу. Оскільки загалом 9 тестів уколом (кожний з яких складався з З тестів) проводили після останньої обробки ліками, максимальне значення, що було досягнуте протягом усього періоду часу експерименту, дорівнювало 27.

Результати 70 Повторювані субплантарні ін'єкції таксолу протягом З наступних днів призводили до гострої запальної реакції з відсутністю відповіді на стимуляцію уколом у більшості тварин. Субплантарна ін'єкція фізіологічного розчину або носія не впливала на індуковану таксолом сенсорну недостатність. У першому вимірюванні тільки 4 з 20 контролів показали, принаймі, 1 реакцію до трьох тестів, середнє значення (ЗЕМ) контролів у першому вимірюванні було 0,25 (40,12); на противагу до початку експерименту, коли значення було 3,0 (0,0), оскільки 75 усі тварини відповідали на тест уколом. Навіть після 8 днів вимірювання реактивність у контролях була порушена в 11 з 20 пацюків, що відповідали, принаймі, один раз, а середнє значенням тесту було 0,75 (--0,18).

Усередині цієї контрольної групи жоден з пацюків не демонстрував нормальної реактивності до усіх трьох стимулів. Кумулятивне значення для контролю протягом часу представлено на Фігурі 19. Оскільки усі тварини тестувались 9 разів протягом восьмиденного періоду, максимальне значення було досягнуте у З тестах уколом зі значенням у кожному тесті 27. Як видно з графіка, субплантарна ін'єкція фізіологічного розчину або носія була не в змозі реверсувати індуковану таксолом сенсорну недостатність протягом періоду часу тестування. Середнє значення кумулятивних даних контролів у кінці експерименту було 5,10 ( -0,87), що складало 18,990 максимального значення, яке було досягнуто.

Єдина субплантарна ін'єкція 75мкл 2Змкг/мл еновіну приводила після першого вимірювання у 4 з 10 пацюків Ге до середнього значення 0,70 (0,33). Через 8 днів усі 10 тварин відповідали, принаймі, один раз на тест (5) уколом, а нормальна реактивність була наявна у 5 з 10 пацюків. Середнє значення цього тесту для даної групи через 8 днів було 2,20 (140,29). При порівнянні з контролями середнє кумулятивне значення значно підвищувалось у кінці 8 дня вимірюваня (Мапп-У/піпеу О-тест, двохвостовий, р 0,01), досягаючи середнього значення 14,50 (--1,96) (Фігура 19). Це складало 53,796 максимального значення. с

За допомогою субплантарної ін'єкцією 13Омкг/мл еновіну була покращена дієвість у порівнянні з контролями. с

При першому вимірюванні після введення 1З3Омк/мл еновіну 6 з 10 пацюків відповідали, принаймі, один раз зі середнім значенням тесту 1,10 ( -0,35). Через 8 днів, усі 9 тварин відповідали, принаймі, один раз зі ме) середнім значенням 2,60 (40,22). Нормальна реактивність до З тестів уколом була присутня у 8 з 10 пацюків. со

Середнє кумулятивне значення тесту у кінці експерименту цієї групи було 17,20 (-1,94). Це складало 63,795 від максимально можливого значення та було значно вищим порівняно з контрольною групою (р«0,01). -

Запобігання індукованої таксолом сенсорної недостатності

Процедура

Використовували самців Зргадце-Оаумлеу пацюків, вагою 300-340 грамів. Тварин поміщали окремо та « дю забезпечували їжею та водою, як було бажано. Перед початком експерименту тварин поміщали у стандартних -о клітках для спостереження та після періоду привчання протягом 15 хвилин, оцінювали рефлекс за допомогою с тесту уколом. Для цього поверхню підошви правої лапи тварин стимулювали за допомогою голки та реактивність :з» цього тесту визначали як наявну (показник!) або відсутню (показник-0). Протягом одного експерименту процедуру повторювали тричі з інтервалом часу 1 хвилина між 2 послідовними стимулами; такий тест уколом складався з трьох вимірювань реактивності. Тільки пацюки, які мали нормальні реакції на З тести уколом, -1 15 включались в експеримент.

У З наступні дні уранці тварини одержували ін'єкцію таксолу (Змг/мл паклітаксену, розчиненому у кремафорі (95) та дегідратованому спирті плюс вода) у праву задню лапу. Наступним ранком рефлекс на укол повторно со оцінювали та тварин, що не виявили реактивності до З стимулів, відбирали. Цих тварин грубо розподіляли на підгрупи (п-10/група), їм субплантарно вводили у праву задню лапу 75мкл носія або фізіологічного розчину, 23 ко 50 або 13Омкг/мл еновіну. Оскільки не спостерігали ніякої різниці між результатами для тварин, оброблених носієм "з та фізіологічним розчином, обидві групи поєднували (контрольна група). Через 1, 4, 5 та 7 днів після останньої обробки тести уколом проводили як уранці (між 8 та 9 годинами ранку), так і ввечері (між 3.30 та 4.30 вечора). Через 8 днів останній тест уколом проводили уранці. Для кожної тварини одержували кумулятивні дані реактивності до уколу протягом часу. Оскільки загалом 9 тестів уколом (кожний з яких складався з З 59 тестів) проводили після останньої обробки ліками, максимальне значення, що було досягнуте протягом усього

ГФ) періоду часу експерименту, дорівнювало 27. 7 Результати

Субплантарна ін'єкція фізіологічного розчину або носія перед введенням таксолу не запобігала індукованій таксолом сенсорній недостатності у тесті уколом. При першому тестуванні після введення таксолу 8 з 20 пацюків бо відповідали, принаймі, один раз на тест уколом, з середнім значенням 0,60 (0,18). Через 8 днів таксол-індукований дефіцит все ще був присутнім, тільки 8 з 20 тварин відповідали на подразнення та мали середнє значення тесту уколом 0,8 (40,23). У двох тварин був наявний нормальний рефлекс на укол. Протягом часу кумулятивне значення також знижувалось і досягало середнього значення 6,55 ( 41,08), що складало 24,390 д5 максимального значення (Фігура 20).

Попередня обробка 2Змкг/мл еновіну зменшувала таксол-індуковану сенсорну недостатність у тесті уколом.

Через один день 8 з 10 тварин відповідали, принаймі, один раз, а середнє значення тесту було 1,70 (--0,40).

Через 8 днів усі тварини відповідали на тест, а середнє значення складало 2,50 (0,27). При цьому 7 тварин виявляли нормальну реактивність в усіх дослідах. Беручи до уваги кумулятивні значення, одержані протягом усього часу (Фігура 20), середнє значення було суттєво вищим (р 0,01) порівняно з контрольним рівнем 18,40 (4-1,73); це складало 68,195 максимального значення.

Порівняні результати були одержані після попередньої обробки 13Омкг/мл еновіну. При цьому 6 з 10 тварин відповідали протягом першого тестування зі значенням тесту 1,70 ( 40,31). Через 8 днів усі тварини реагували, принаймі, один раз на стимуляцію зі середнім значенням 2,40 ( 40,22), та усі три реакції були нормальними у 70 половини тварин. Беручи до уваги кумулятивні значення, одержані протягом усього періоду часу, середнє значення, одержане через 8 днів, було 17,70 (4-1,92), що складало 65,595 від загального.

Дана серія експериментів показала, що єдина субплантарна ін'єкція еновіну здатна зменшити таксол-індуковану сенсорну недостатність, що було підтверджено за допомогою тесту уколом. Активність було продемонстровано, коли ліки вводили або перед, або після обробки таксолом.

Еновін є можливим кандидатом для лікування больових синдромів з переважно периферичним та центральним нейрогенним компонентом, ревматичних/запальних захворювань, а також порушень провідності та може грати модуляторну роль у сенсорних процесах після трансдермального, місцевого, локального, центрального (такого як епідуральне, введення усередину суглоба, тощо) та системного застосувань.

Крім того, він може використовуватись як діагностичне знаряддя для відбору на фізіопатологічні зміни у сферах, що зазначені вище.

Порівняння експресії мРНК еновіну у нормальних на хворих тканинах

Експресію мРНК еновіну кількісно аналізували, використовуючи АВІ Ргізт 7700 систему для виявлення послідовностей (ТадМап; Регкіп ЕІтег), використовуючи пріоритетну технологію, запропоновану, розвинену та виконану РНпагтадепе І арогайгіеєз Ца, Коувіоп, Опіей Кіпддот. Система служила як флуоресцентна проба для с генерації специфічних для послідовності флуоресцентних сигналів під час ПЛР. Зразок представляв собою Ге) олігонуклеотид з флуоресцентним детектором та приєднаним до нього гасником, він розміщувався між прямим та зворотним праймерами ПЛР. При взаємодії інтенсивність детектора флуоресценції супресувалась за допомогою гасника. Якщо зразок формував частину реплікаційного комплексу, флуоресцентний детектор піддавали розсіканню з гасника шляхом 5 до 3 екзонуклеазної активності, що притаманна Тад полімеразі. с

Збільшення флуоресцентного детекторного сигналу при реакції вимірювали безпосередньо шляхом акумуляції с продукту ПЛР. Початкова кількість копій мРНК цільової послідовності (Сп) виявлялась за допомогою визначенням номера фракційного циклу ПЛР (СО, при якій продукт ПЛР вперше визначається як точка, при якій б» флуоресцентний сигнал проходить Через поріг базової лінії. Кількісне визначення кількості цільової МРНК в с кожній пробі визначали за допомогою порівняння експериментальних значень Сі зі стандартними кривими. 3о Приготування РНК та якісний контроль -

Загальну РНК ізолювали з цілої та роздрібленої тканин, використовуючи Тгі-2о! реагент (Ге Тесппоіодіев,

Сайпегриго, МО, О5БА) згідно з прописом постачальника. Способи якісного контролю для усіх зразків РНК включали як оцінку цілісності (інтактні 185 та 285 рибосомальні РНК), так і визначення присутності високого « надлишку (актин) та низького надлишку (рецептор трансферіновий рецептор) транскриптів.

Визначення праймер/проба З с Пара праймерів та ТадМап зразок були призначені для ампліфікації специфічної послідовності еновіну "» Праймер 1: У АСОСТТСТОСАСОТОСТОТт 3 " Праймер 3: УТОСТОССОА СССАСО 3

Праймер 5: 5 СТАССДАОСООСТСТОоСТТСАТОСАСО 3

Крім того, пара праймерів та ТадМап зразок були призначені для визначення діапазона інтрона, який - ампліфікували як частину людського гена СОАРОН 2) Праймер 2: 5 САСАСТТААААССАССССтТОСТ 3 і, Праймер 4: ма 70 5Б' ЗАДОСТОАДАОСТСОСАСТСААС 3

Проба 6: їз 5 ТТТООСТоСОтТАТТОСОСОССТт З

Пробу 5 мітили фтор Рат, у той час як пробу 6 мітили фтор МІС.

Обробка ДНКазою загальної РНК

Для кожної тканини, яку піддавали тестуванню, 2,2мкг загальної РНК перетравлювали з 2 одиницями вільної

ГФ) від РНКази ДНКазою (сСірсо ВКІ) протягом 15 хвилин при кімнатній температурі у 20мкл об'єму 1 х ДНКазного буфера (Сірсо ВК). Реакцію зупиняли доданням 2мкл 25мММ розчину ЕДТА. Зразки потім інкубували при 6592С о протягом 10 хвилин для інактивації ферменту.

Синтез першого ланцюга кДНК 60 Для кожної тканини, яку піддавали тестуванню, 1ООнг загальної РНК використовували як матрицю для синтезу першого ланцюга кДНК. РНК в об'ємі 4мл та в присутності БОНМ праймерів 1 та 2, 1 х буфер для ПЛР ІЇ (Регкіп ЕІтег) та 5мММ Маосі» підігрівали до 722С протягом 5 хвилин та повільно охолоджували до 5520. Після додання всіх реагентів бмл реакційної суміші інкубували при 482 протягом 30 хвилин, після чого проводили інактивацію ферменту за допомогою етапу прогрівання до 902С протягом 5 хвилин. Умови заключного етапу 65 були наступними: 1х буфер для ПЛР ІІ, 5хмМ Маосі», їмМ аАТР, аттР, астре, астр, 12,5 одиниць МиЇ М зворотної транскриптази (бібсо ВК).

ПЛР ампліфікація першого ланцюга продуктів КДНК

КДНК, що походить від 1ООнг загальної РНК, для кожного зразка піддавали ПЛР ампліфікації в єдиній реакції

Для ідентифікації як мішені, так транскриптів ЗАРОН. Кінцеві праймер/зразок концентрації для мішені були

ЗООНМ праймера 1, ЗООНМ праймера З та 200НМ зразка 5, те саме для ЗАРОН складало 20НМ праймера 2, 20нМ праймера 4 та 100нНМ зразка 6. Заключна концентрація інших реагентів у реакції складала наступною: 4,590 гліцеролу, 1 х ТадМап буфера А (Регкіп ЕІтег), 6,25ММ Маосі», 430ОМ ЗдАТР, ТР, асСТтР, астР, 2,5 одиниці

АтріїТад Соїд. ПЛР ампліфікацію виконували в АВІ 7700 системі для визначення послідовності, початковий етап 7/о інактивації ферменту проводили при 942С протягом 12 хвилин, після чого виконували 45 циклів при 9490 15 секунд та при 602С протягом 1 хвилини (мінімальний час).

Захворювання та тканини, що піддавали тестуванню

Транскрипцію мРНК еновіну порівнювали у тканинах, що походять від хворих пацієнтів та осіб, що були нормальним контролем (Фігури 25 та 26). Таблиця нижче показує захворювання та відповідні тканини, які 75 піддавали оцінці. Для кожних умов аналізували три зразка хворих та три контрольні проби.

Патологія Тканина 1 Тканина 2 Тканина З

Хвороба Темпоральна коркова речовина гіпокампус окципітальна коркова речовина

Альцгеймера

Розсіяний склероз спинний мозок перивентикулярна біла речовина мозочок

Хвороба Паркінсона чорна речовина Латерально розміщена частина сочевицеподібного мозочок ядра

Пухлина аденокарцинома ободової аденокарцинома грудної протоки сквамозні клітині карциноми кишки легенів с

Статистичний аналіз о

Для кожної групи з З тканин розраховували середнє значення та стандартне відхилення на Сі значеннях (які є нормально розподіленими), потім конвертували у Сп значення згідно з формулою Сп-10 «Сі-40,007/-3,625),

Аналіз варіації (АМОМА) виконували на Сі значеннях також для порівняння середнього значення експресійних рівнів еновіну у нормі проти хворих тканин. с

Фігури 25 та 26 показують середнє значення числа копій мРНК еновіну (450; п-3) у хворих тканинах проти сч контрольних тканин. Статистичний аналіз показав значне збільшення рівнів екпресії еновіну у перивентикулярній білій речовині у пацієнтів з розсіяним склерозом (р-0,013). Внутрішній ЗАРОН контроль не показав значної (22) різниці (р-0,79). Крім того, експресійний рівень еновіну у перивентикулярній білій речовині був значно нижчим со у нормальній тканині (при середньому значенні 270 копій на 10Онг загальної РНК проти 200000 копій САРОН),

Зо рівень був у три рази вищим (825) у пацієнтів з розсіяним склерозом. в.

Тільки одна з хворих тканин показала значну різницю проти нормального контролю: в аденокарциномі грудної протоки експресійний рівень мРНК еновіну був у б разів вищим (6000 проти 1000; р-0,007), але контрольне значення для САРОН було також дуже високим (165000 проти 440004 р-0,03), що дійсно представляло загальне « збільшення у рівнях мЕеНК.

Таким чином, ми знайшли, що рівні мРНК еновіну підвищуються у перивентикулярноїй білій речовині пацієнтів о) с з розсіяним склерозом. "» Фосфо-специфічного антитіла також можуть використовуватись у тесті ЕГІ5ЗА, що базується на використанні " клітин для відбору еновін-мімететичних на СЕКОУЗ/сСКЕТ рецепторного комплексу.

Метод може також використовуватись для ідентифікації агоністів або антагоністів інших нейротрофічних рецепторів, таких як СЕБо1, СЕБо2, СЕВой4, ТКА, ТгКв та ТКС. 7 Аналіз оз Використовуючи цей аналіз, ми можемо ідентифікувати агоністичні або антагоністичні сполуки нейротрофічного ростового фактору шляхом вимірювання активності ключових сигналізуючих кіназ, що о активуються у нейротрофічному шляху, або за допомогою вимірювання активації СКЕТ рецептора кінази. ка 20 Активація вимірюється шляхом визначення кількості фосфорильованої кінази або рецептора кінази при використанні фосфо-специфічних антитіл. Ми використовували МІН З3Т3З клітини, що експресують випадково або о постійно ТКА, ТтКкВ, ТКС, ЕКо1/скЕТ, СЕКог/сКЕТ, СЕКоЗ/сКЕТ або СЕКод/сКЕТ.

Активація р42/р44 МАР кінази, РКВ кінази, с-ї0п, СКЕВ, УМК/5АРК кінази та інших кіназ визначається при використанні комерційно доступних фосфо-специфічних антитіл. Крім того, СКЕТ активація може бути ділетована 99 при використанні фосфо-специфічного СКЕ Т-антитіла.

ГФ) Пропис, що використовували, полягає у наступному: з - Поміщали МІН ЗТ3З клітини у 96 пробірок з 1095 телячою сироваткою, клітини були на 8095 злитими перед стимуляцією. - Наступного дня замінювали середовище на вільне від сироватки середовище та виснажували клітини 60 протягом 18-24 годин. - Після голодування стимулювали клітини за допомогою сполук та нейротрофічних факторів як позитивний контроль (1Онг/мл для нейротрофічних факторів). - Фіксували клітини з 496 формальдегідом у РВЗ при 42С протягом 20 хвилин. - Промивали клітини Зх за допомогою 200мкл РВБЗ/О,195 Тритон протягом 5 хвилин. 65 - Насичували клітини за допомогою 1О0Омкл 0,695 Н2О» у РВЗ/О,196 Тритон протягом 20 хвилин.

- Промивали клітини Зх за допомогою 200мкл РВБЗ/О,195 Тритон протягом 5 хвилин. - Блокували клітини за допомогою 100мкл 1095 бичачої фетальної плазми у РВБЗ/0,196 Тритон протягом 60 хвилин. - Інкубували клітини з фосфо-специфічним антитілом у 5Омкл 595 ВБА// РВБ/О,195 Тритон протягом ночі при 49С. Розведення антитіл може бути експериментально визначене, найбільш бажане те, яке складає запропонований рівень 1:100-1:250. - Промивали клітини Зх за допомогою 200мкл РВЗ/0,196 Тритоном протягом 5 хвилин. - Інкубували клітини з вторинним антитілом, зв'язаним з НКР, у розведенні 1:100 у ббмкл ВЗА/РВЗ/О,190 70 Тритон протягом 1 години при кімнатній температурі. - Промивали клітини Зх за допомогою 200мкл РВБЗ/О,195 Тритон протягом 5 хвилин. - Розчиняли 1 таблетку ОРО (Зідта) у 25мл буфера (3,65г лимонної кислоти-НО та 5,9г МагНРО,-2Н.О у

О,51мл НО, рН 5,6) та додавали 12,5мкл Н»2О». Додавали 5Омкл до кожної пробірки та інкубували протягом 15 хвилин у шейкері (200об./хв), закритих алюмінієвою фольгою. - Зупиняли реакцію доданням 25мкл НьЗО»,. - Вимірювали оптичну щільність при довжині хвилі 490-65Она на пристрої для зчитування ЕГІ5А.

Мезенцефальна допамінергічна нейронна культура

Нейронна культура

Нейронні культури готували з вентрального середнього мозку зародка пацюка шляхом ферментативного та механічного роздрібнення. Тканину збирали, промивали в охолодженому за допомогою льоду вільному від Са?" та Ма?" забуференому фосфатом у фізіологічному розчині, що містить 0,696 глюкози (РВ5О) та інкубували протягом ЗО хвилин з РВ5О, що містить 0,190 трипсину при 372С. Клітинну суспензію поміщали при щільності 2,5х10Уклітин/см2 у 96 пробірочний МОМС планшет для культури тканин. Далі чашки з культурою покривали полі-І -орнітином та СОМ, що містить 1095 фетальної телячої плазми. Культури підтримували у хімічно чистому ЄМ середовищі (СОМ), що складалося з 1:1 суміші модифікованого Дюльбекко середовища Ігла та Е12 поживного о середовища, збагаченого глюкозою (0,690), глютаміном (2мМ), бікарбонатом натрія (ЗмМ), НЕРЕЗ (5ММ), інсуліном (25мкг/мл), людським трансферріном (10Омкг/мл), путресцином (бОмкг/мл), селенітом натрію (ЗОНМ), стрептоміцином (1ООмкг/мл) та пеніциліном (10010/мл).

Обробка нейротрофічними факторами с

Нейротрофіни розчиняли у 0,595 альбуміні бичачої сироватки. Нейротрофіни додавали через З години після с ініціюючого висаджування та через 5 днів культивування у культурі. Таку саму кількість 0,595 альбуміну бичачої сироватки додавали до контрольних пробірок. ме)

Високоафінне споживання допаміну со

Споживання допаміну вимірювали через 10 днів. Для цього клітини двічі промивали попередньо підігрітим

Зо РВ5, збагаченим глюкозою (5ММ), аскорбіновою кислотою (100мМ) і паргіліном (100ММ) та пре-інкубували - протягом 10 хвилин у тому самому розчині. Розчин для пре-інкубації замінювали тим самим розчином, що містить 5ОнНМ |ІЗНІДА та інкубацію продовжували протягом 15 хвилин при 372. Споживання зупиняли шляхом трьох швидких промивань охолодженим до нульової температури РВ5. Акумульований ІНІ допамін вивільняли « 20 інкубацією з підкисленим етанолом протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Радіоактивність визначали з після додання 4мл сцинтиляційної рідини (Раскага ишйіта дод ММ), використовуючи РасКага сцинтиляційний с лічильник. Неспецифічне споживання визначали шляхом додання 20мкМ кокаїну. ;» - с

Ф о де пз

Клітини вирощували протягом 10 днів у присутності або при відсутності еновіну. Необроблені контролі вв представляли як 10095. Результати були одержані у 1-5 незалежних експериментах.

Список скорочень (Ф; ВІ А5Т- базисний локальний метод дослідного вирівнювання г п.о. - пари основ

КДНК - комплементарна ДНК во ЦНО - центральна нервова система

Е5Т - експресована послідовність-мішень

ЕММ - еновін

СОМЕ - нейротрофічний фактор, що походить від гліальної лінії клітин

СЕК, - рецептор о для родини ООМЕ 65 ОРІ - глікозил фосфатидил інозітол

МТС - кДНК з різних тканин

МТМ - неуртурін

РОК - полімеразна ланцюгова реакція

РМЗ - периферична нервова система

Р5Р - персефін

КТ-ПЛР - зворотна ПЛР транскрипція

ТОР - трансформуючий ростовий фактор В

РІБН - флуоресцентна гібридизація іп ві

МТМ - нозерн з багатьох тканин 70 МО - нервовий ростовий фактор

ЗРК - поверхневий плазмон резонанс

Список посилань 1. Аїївспш, 5.Р., Сівй, МУ., МіШег, МУ., Муеге, Е.МУ. 5 ІГіртап, 0.3. (1990) Вавіс, Іоса! аїдптепі зеагсі (сої,

У. Мої. Віої. 215, 403-410. 2. Апагіві, М., Воїк, 5.,.НаїшзйКка, М., І арспак, Р.А. «5 СпакКгамагії, А. (1996) Сегтіїпе тшиайопз іп діа! сеї

Іпе-дегімей пеигоїгорпіс Тасіог (ЗОМЕ) апа КЕТ іп а Нігзсизргипд дізеазе райепі Майшге Сепеїйїсв 24, 341-344.

З. Вас, К.Н., Тапзеу, М.0., СоіІдеп, 9У.Р., Стеедоп, ОО.) НеисКегоїй, К.О., КескК, С.Ї., йітопіїс, О.В.

Рорезси, М.С., допйпзоп, Е.М. 5 Міїргапаї 9. (1997) ТтпК2, а поме! гесеріог (Шйаї тедіаєевз пешипигіп апа СОМЕ зідпаїїпу (пгоцд Кеї. Мешгоп 18, 793-802. 4. Ваїонй, К.Н., СогодіпезКу, А., СоіІдеп, 9У.Р., Тапзеу, М.б., Кеск, С.Ї., Рорезси, М.С., доппзоп, Е.М. «

МіїБгапає 3. (1998) СЕКаЗ ів ап огрпап тетрег ої (Ше СОМЕ/пешипигіп/регзерпіп гесеріог Тату. Ргос. Май.

Асаай. Зсі. ОБА 95, 5801-5806. 5. Ват, Р.). 1991 Маттаїап зиБбіівіпг: (пе Іопд-зоцдні аїбавіс ргосезвіпд епдоргоїеазевз. Сеї|. 66,1-3. 6. Веск, К.О., Маїмегає, .., АІехі, Т., Роцівзеп, К., МоїМаї, В., Мапаїіеп, КА., Козепіна!ї, А. 5 Нейі, Р. (1995) с Мезепсернаїїс доратіпегдієс пейгопз ргоїесієій Бу СОМЕ їот ахоїту-інпдисей дедепегайоп іп Ше айдишїє ргаїп.

Майшге 375, 339-341. о 7. Вііапо-ВіІецеї, А., Кеманй, Р., Соїіп, Р., Госацеї, І.., Кореп .9У., МайПеї, 9У. 5 НогеПои, Р. (1997) Іпігавігіайа! іпіесійоп ої апо адепомігаї месіог ехргезвіпуд // діїаІ-сеїІ-Іпе-дегімей пецгоїгорпіс Тасіог / ргемепів доратіпегдієс пейгоп дедепегайоп апа репаміога! ітраїптепі іп а гаї тоде! ої РагКіпвоп дівеавзе. Рос. Май. су

Асад. Зсі. ОБА 54, 8818-8823. 8. Виі-Вейо, А., Висптап, М.Г., Ногіоп, А., Козепійа!І, А. 5 ЮОаміез А.М. (19953 БОМЕ ів ап аде-зресійс с зигміма! Тасіог Тог зепзогу апа ашопотіс пешгопз Мешгоп 15, 821-828. Ф 9. Виі-Веїо, А. Ади, 9., Ріпоп, Г.О.Р., Ногіоп, А., Тпотрзоп, у., Козепіпаї!, А., Спіпспейги, М., Висптап, М... 5

Оаміез, А.М. (1997) Мешгіигіп гезропзімепевз5в гедцігез а ОРІ-йпКей гесеріог апа (пе Кеї гесеріог (уговіпе і.

Кіпазе. Маїиге 387, 721-724. ї- 10. Споі-Ї ипарего, О.Г., іп, О., Спапо, У.М., Спіапао, МУ.Г., Нау, СМ., Мопаїетгі, Н., Оамідзоп, В.Г. 5 Войпп, М.С. (1997) Ооратіпегдіс пейгопз ргоїесівед їот дедепегайоп бу СООМЕ депе (Пегару. Зсіепсе. 275, 838-841. 11. Сгеедоп, О0.)., Тапвеу, М.О., Ваїой, К.Н., ОзБрогпе, Р.А., Іатре, Р.А., Райгпег, Т.)., НеискКегоїйй,

Р.О., МіїЇргапаб У. 5 Оойпзоп, Е.М. (1997) Меипигіп 8зПпагез гесеріогз апа відпа! ігапздисіоп раїймжаув й « 0 Зіїа! сеї! Іпе-дегімей пепгокорпіс Тасюг іп зутравНеїйс пейгопв. Ргос. Май). Асад. зсі. ОЗА 94, 7018-7023. шщ с 12. ЮОигрес, Р., Магсовз-Сц(егте, С.М., КіКеппу, С, Огідогіош, М., УУапіомжаага, К., Зимапіо, Р., Зтйй, й О., Ропаег, В., Совіапііпі, Г., 5аагта, М., Загіоїа, Н. « Расіпів, м. (1996) СОМ відпаїйпо (годи (Ше КЕТ «» гесеріог іуговіпе Кіпазе. Маїиге 381, 789-793. 13. Едегу, Р., Гуоппеї, 5., МиїПдап, І.М., Реїеї, А ому, Е., Абеї Г., Ноїдег 5., Міпоці-РеКеїе, С, Ропаег, В.А. 5

Миппісн, А. (1994) Миїакопег ої (пе КЕТ ргою-опсодепе іп Нігеспзргипу з аізеазе. Маїцге 367, 378-380. -і 14. Сазп, О.М., 2папо, 7., Омадіа, А., Савзв, МУ.А., Мі, А Зіттегптап, І/., КизгзеїЇ, О., Мапіп, О., І арспак,

Р.А Соїіпв, Р., НоПег, В.У. 5 Сегпагаї, С.А. (1996) Рипсіопа! гесомегу іп рагкіпвопіап топКеуз ігеаіей м/п о СОМЕ. Маїшге 380, 252-255.

Те) 15. СгКа Мотепсіаїйге Соттшее (1997) Мотепсіацшге ої ОРІ-йпКей гесеріоге Тог Ше СОМЕ Іїдапа Тату.

Меншгоп 19, 485. де 16. НакКіт А "Івспетіс репитьга: (Пе (пегарешііс м/іпдом/" Мешигоіоду. 1998 Зер; 51 (З Биррі 3):5 44-6. з 17. Непаегзоп, С.Е., Рийірв, Н.5., РоїоскК, К.А., Юаміез, А.М., Іетецше, С, Аптапіпі, М., Зіттопв, Ї.,

Мопйеї, В., Мапаіеп, К.А., Коїїаїво5, М.Е. б Козепіпа!), А. (1994) СОМЕ: а роїепі зигмімаІ! Тасіопог тоїопеигопз ргезепі іп регірпега! пегуме апа тизсіе. Зсіепсе 266, 1062-1064. 18. Непо, Н.Н.О., Заціге, У. 8 Твиці, Ї.-С. (1992) Нідн гезоїшщіоп тарріпд ої таттаїййап депез ру іп віш

Нубгіаігавоп (юю їтее спготаїйп. Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА 89, 9509-9513. іФ) 19. Непо, Н.Н.О. 8 Твиії, Г.-С. (1993) Модез ої ОАРІ рапаїпод апа зітиМапеоиз іп зйши Пубгіаігакоп. ко Спготозота 102, 325-332. 20. НеисКегоїй, К.О., Кої2грацег, Р Сореїапа, М. йрег, 0.) ОепКіпв, М.А., 2ітопііс, О.В., Рорезси, во М.С., доппвоп, Е.М. 8 Міїбгапаєб 3. (1997) Меипигіп, а поме! пецйгоїгорніс Тасіог, із Іосаїйлей 0 тоизе спготозоте 17 апа питап спготозоте 19ріЗ.3. Сепотісв 44, 137-140. 21. діпду, 5., Меп, О., Ми, М., Ноївї Р.Ї., Го, МУ., Рапд, М, Татіг, К.. Апіопіо, Ї., Ни, -7, С.ирріев,

К., Гоців, 9У-С, Ни, 5., АйгосК, В.МУ. б Бох, .М. (1996) СОМЕ-іпдисей асіїмайоп ої (Ше геї ргоїеіп (угозвіпе

Кіпазе із тедіаєеай ру СООМЕК-а, а помеї гесеріог ог СОМЕ. Сеїї! 85, 1113-1124. 65 22. діпа, 5. Ми, У., Рапа, М, Ни. 72., Ноїві, Р. Воопе, Т., Оеєіапеу, 9У., Зспине, Н., 2пои, К. «5 Рох, О.М. 1997

СЕкКа-2 апа бЕКа-3 аге їмо пем/ гесеріогз ог Ідапаз ої (пе СООМЕ Татійу. У. Вісі. Спет. 272, 33111-33117.

23. Кіпозієу, О.М. (1994) Те ТОБ-рейа зирепатіу: пем/ тетрбегв5, пем/ гесеріогв, апа пем/ депеїйіс (евів ої

Типсфоп іп айегепі огдапізтв. Сепез 5 ЮемеІортепі 8, 133-146. 24. КіІвіп, К.О., Зпепгтап, О., Но, МУ-Н., ЗЮпе, ОО Веппей, .Ї., МоПаї, В.., Мапаієп, К., бБіттопе, ЇЇ си,

О., Нопдо, .-А., Юемаих, В., Роцівеп, К., Агтапіпі, М., Могакі, С, Аваї, М., Соадага, А., РпПйірв, К.,

Непдеггзоп, С.Е., Такапазнпі, М. « Козепінпа!Ї, А. (1997) А ОРІ-йпКей ргоїеіп (паї іпіегасів мйп Кеї Юю їогт а сапаїдаєе пешигпіигіп гесеріог Маїиге 387, 717-721. 25. Коіг6рацег, Р.Т., Ї атре, Р.А., НеисКегоїй, Р.О., Соїдеп, 9.Р., Стеедоп., Ю.)., допйпзоп, Е.М. 5 Міїргапаї, 9. (1996) Меигіигіп, а геіайме ої дііаІ-сеїІ-Іпе-дегімей пеигоїгорпіс Ттасіог. Майге 384, 467-470. 70 26. іп, Г-Р.Н.О, Оопепу, О.Н., Ше, 9У.О0., ВеКезви, 5. б Соїіпв, Р. (1993) СОМ: а діа! сеї! Іпе-дегімейд пешигоїгорпіс Тасіог Тог тідьгаіїп доратіпегдіс пешгопз Зсіепсе 260, 1130-1132. 27. Мапаєї, МК.)., Зргай, 5.К..Зпудег, К.О. й ей, 5.Е. (1997) Міадьгайїйп іпіесйоп ої гесотріпапі адепо-аззосіайвей мігоз епсодіпу гаї діїа! сеї Іпе-дегімей пецгоїгорпіс Тасіог ргоїесів підгаї пешгоп5 іп а ргодгеззіме 6-пудгохудоратіпе-іпдисед дедепегайоп тоде! ої РагКкіпвоп'з адівеазе іп гаїв. Ргос Масг2 Асад. 7/5 Зсі. ОА 94, 14083-14088. 28. Магедеп ей ан "Те сацйзев5, ої РагКіпзоп'є дізеазе аге Беїпуд ципгамеіей апа гайопа! пеийгоргоігесіїме

Іпегару із сіозе (о геаійу". Апп Меийгої!. 1998 Зер;44(3 5и,ррі. 1):5 189-96. 29. Мазиге, 5., Сік, М., Рапоа|оз, М.М., Вопамепінцге; Р., Мегпаззеї!, Р., І езаде, А.5., І еувеп, У.Е. 5 богдоп К.О. (1998) Моїесціаг сіопіпо, ехргезвіоп апа ііїзвце дівііршіоп ої дііаІ-сейІ-Іпле-дегімей пешгоіїгорпіс тТасіог 2о Татйу гесеріюг а-3 (5ЕКа-3). Ешг. у). Віоспет. 251, 622-630.

З0. Маївизпйа, М., Еційа, М., ТапаКа, М., Мадаїви, Т. 85 Кіиспі, К. (1997) Сіопіпд апа вігисішга| огдапігайоп ої (пе депе епсодіпд (Те тоизе діа! сеї Іле-дегімей пешигоїгорпіс Ттасіог, ЗОМЕ. Сепе 203, 149-157. 31. Міїргапаї, У. де Запймаде, БГ.)., Райпгпег, Т.)., Ваой, К.Н., Іейпег, М.Ї., Тапзеу, М.б., Іатре, Р.А.,

НеисКегоїй, К.О., Коїграцег, Р.Т., бітригдег, К.5., Соідеп, У.Р., ЮОаміез, 9У.А., Меізада, К., Ка, А.С. сч

Нупез, М., ЗПпегтап, О., Мівпітига, М., МУапо, Г.С., МапаІеп, К., Мойаї, В., Кієвїп, "К.О., Роцівзеп, К., Огау,

С, Сагсевз, А., Непдегвоп, С.Е., РПййїрв, Н.5. б доппзоп, Е.М. дуг. (1998) Регвгерпіп, а поме! пеигоїгорпіс Тасіог (8) геіаїед ю СОМЕ апа пеипигіп Мешйгоп 20, 245-253. 32. Мооге, М.МУ., КіІеіп, К.О., Рагіпавз, І., Бацег, Н., Аптапіпі, М., Рийірв, Н., Кеїіспагаб .Р., Куап,

А.М., Сагмег-Мооге, К. 5 Козепіпа!, А. (1996) Кепаї апа пешгопа! арпогтаїйіев іп тісе Іаскіпд СОМЕ Майшге с зо 382, 76-79. 33. Моипі, Н.Т., Оеап, О0.О., АїІрегсп, У, Огеутизв, С.г. б ВіасК, І.В. (1995) а! сеї| Ііпе-дегімей с пейгоїгорніс Тасіог рготоїез Ше зигмімаї апа тогрпоіодіс айегепнаноп ої Ригкіпіе сеїїв Ргос Май. Асай. ду

Зсі. ОБА 52, 9092-9096. 34. Маду 7. ей аі "Те сеї| аїмівіоп сусіе апа (Ше раїпорпузіоюду ої АІ2гПпеітегв аізеазе" Меийгозсіепсе. ме) з5 1998 Овес: 87(4):731-9. ча 35. Мамеїпап, Р., Вацаеї, С, Мікаєїв А., Зпеп, І. УМевірпа!, Н. 5 ЕЄтіогв, Р. (1998) Ехргезвіоп апа гедшайоп ої СЕКаз, а аа! сеї І пе-дегімед пеигоїгорпіс Тасіог Тату гесеріог. Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА 55, 1295-1300. 36. Миудепз К, Оіврегвуп б, Мап деп Кіероот б, Юе допуд М, Соппоге К, КатаекКегз Е, Вогдеге М, Сеегів Н "ВеІ-2 ргоїесів пешпигопаї! сеїЇв адаіпзі--ахоІ-іпдисейд ароріовіз Бу іпаисіпд тийі-писіеакоп", зибтінНеа. « 37. Орреппеїт, К.МУ., Ноцепои, І.)., доппвоп, 9У.Е., іп, С.Р., Гі, С, Го, А.С., Мемвоте, А.Ї., Ргемеце, О.М «к з с УУапао, 5. (1995) ЮОемеІоріпд тойог пешгопз гезсуед їот ргодгаттей апа ахоїту-іпдисей сеї! деайй ру СОМЕ.

Майшге 373, 344-346. з 38. РіспеІ У.0б., Зпеп, Ї., Зпепо, Н.2., ОСгаппоїт, А.С ЮОгадо, 9., Огіпрегд, А., ее, Е.)., Ниапо, З.Р.,

Заапта, М., НоїПег, В.9)., Загіоїа, Н. 5: МУевірнаї, Н. (1996) Оетесів іп епіегіс іппегмайоп апа Кідпеу демеюортепі іп тісе Іаскіпда СОМЕ. Маїшге 382, 73-76. -І 39. Котео, О., Копспено, Р., о, М., Вагопе, М., Зегі, М., СесспПегіпі, !., Равіпі, В., Воссіагаї, К.,

ІЇегопе, М., Каагіаїпеп, Н. еї аї. (1994) Роїпі тшайопз айпПесіїпд (Ше (уговіпе Кіпазе дотайїйп ої (Ше КЕТ о ргоїо-опсодепе іп Нігзспзргипу' з дізеазе. Маїшиге 5: 7,377378.

Ге) 40. Запспе, М.Р., 5йовз-Запііадо, І., Егізеп, у., Не, Б Гіга, 5.А. « Ваграсід, М. (1996) Кепаї! адепевзіз апа (ШТе арзепсе ої епіегіс пешгопв іп тісе І(аскіпда ЗОМЕ Маїшиге 382, 70-73. де 41. Запісоїа, М., Невзвіоп, С, МуУогіеу, О., Саптійо, Р ЕПгепіеів, С, УУаїш5, Ї., Кобріпзоп, 5., Чамогекі,

Ге б., МУеі Н., Тігага, МК. МУпіцу, А., РеріпзКу, К.В. 5 Саїе, К.І. (1997 МПа| сеї| Іпе-дегімей пеигоїгорпіс

Тасіог-дерепдепі КЕТ асіїмайоп сап Бе тедіагєйд ру йо айегепі сеї-зипасе ассезвогу ргоїеіпв. Ргос. Май.

Асай. Зсі. ОБА 94, 6238-6243. 42. Зтігпома ей а "Тиготріп ів ап ехігасеїШаг відпаІї (паї асіїмайез іпігасеїїшіаг деай ргоїеазе раїпжмауз іпдисіпд ароріовів іп тодеї! тоїог пейигопвг". ) Меийгобіо!. 1998 УиІ;36(1):64-80.

Ф) 43. Згіпімзап еї ан! "БЗегит їїот райепів м/ййп о їуре 2 адіарефев м/йй пецйгораїйу іпдисев ка сотріетепі-іпдерепадепі, саІсішт-дерепадепі ароріовів іп сийигей пешцгопа! сеїЇв". 9.СіІп. Іпмеві 1998 Осі 1; 102(7): 1454-62. во 44. З(едег С "Ап о ипріазей дефесіог ої сигмійпеаг вігисігез "СЕБЕ Ттапзасіопз оп рацЦегп апаїувзів таснпіпе іпіеїйїїдепсе", 20, 2, 113-125 (1998). 45. Зимапіо, Р., ММапіомаага, К., Гіпдані, М, Агитає, О., Мозппуаком, М, НогеїІї-Кийпеп, М. Аїігаквіпеп,

М.5. , Раїойе, А., Загіоїа, Н. 5 Заапта, М. (1997) Сіопіпд, тфМА аїзігіршщіоп апа спготозотаї! Іосайїізайоп ої

Ше де-пе їог діа! сеї| Іпле-дегімей пешйгоїгорпіс Тасіог гесеріог р, а Ппотоіодце о СОМЕкКа. Нитап Мо). 65 Зепеї. 6, 1267-1273. 46. Тотас, А., І іпддміві, Е., іп, .Р., Одгеп, 5.О0., Мошпо, О., Нопег, В.). 5 ОіІвоп, І. (1995) Ргоїесіоп апа гераїг ої (Не підговігіага! аоратіпегдіс зувіет Бу СОМЕ іп мімо. Маїиге 573, 335-339. 47. Тгеапог, 9У.3У.58., боодтап, Ї., де Запмаде Р., 5іопе О.М., Роцізеп, К.Т., Веск, СО., Сгау, С, Агтапіпі

М.Р., РоїйоскК, К.А., Нейі Р., РиШірв, Н.5., Содаага, А., Мооге М.МУ., Ви)і-В-ейо, А. , Оаміезв, А.М Аваї,

М., Такапазпі М., Мапаіеп, К, Непдегзоп, С Е 85 Козепіпа), А. (1996) СпПагасіегігайоп ої а тийісотропепі гесеріог ог ЗОМ. Майшге 382, 80-83. 48. Тгтирр М., Агепаз, БЕ., РаїпліЇрег, М., Міїввоп, А.5., Зіерег, В.А., Сгідогои, М., КіїКеппу, С

Заіагагогиево, Е., Расппів, М., Агитає, О., Загіоїа, Н., Заапта, М. 5 Ірапег, С.Е. (1996) Рипсіопа! гесеріог ог

СОМЕ епсодей ру (Пе с-геї ргоїо-опсодепе. Майте 382, 785-788 УММУейПпдюп еї аі "Тожага ипаегвіапаіїпд (Пе 7/0 тоїіесціаг раїпоіоду ої Нипііпдіюоп'в дізеазе" Вгаїп Раїпої. 1997 мі; 7(3): 979-1002. 49. М/ідептаІК, 9У., Мовзгаї, С, Тотас, А., МУевірпа!, Н., НоМег, В. 5 Оівоп, Ї. (1997) Мешпигіп апа діа! сеї

Іпе-дегімей пеийгоїгорпіс Тасіог гесеріог-? (БОМЕК-а), поме! ргоївеіпз геіаїеа ю СОМЕ апа сОМеЕмК-а мій зресіїс сеййшШаг райе-гпз ої ехргеззіоп зцПддевіїпо гоїез іп (Ше демеІоріпд апа адий пегмоиз зувіет апа іп регірпега! огдапв. у). Меишговсі. 27,8506-8519. 50. М/ідептаїК, 9У., Тотас, А., І іпадміві, Е., НопПег, В. 5 Оівоп, І. (1998) СЕКа-3, а ргоївіп геіаїей ю сгКа-1 ів ехргеззеай іп аемеіІоріпу регірнега! пепгопз апа епзпеаїййіпад сеїів. І г. 9). Мешговсі. 20,1508-1517. 51. Муогру, С.А., Меда, О.С., 2пао, М., Спао, Н. Н.-)., Зеазпоїй, А.Б. 5 Оіхоп, У.Е. (1996) Са! сеїЇ пе дегімей пецгоїгорпіс Тасіог зідпаіїєе (йгоцдпй ї(Ште КЕТ гесеріог апа асіїмаевз піодеп-асіїматей ргоївіп Кіпазе.

У. Вісі. Спет. 271, 23619-23622. 52. Могру, С.А., Меда, О.С., Спао, Н.Н.)., Зеазпоїї, А.Р., Тпотрзоп, К.С. 5 Оіхоп У.Е. (1998) Ідепійісабйоп апа спагасіегігайоп ої СгЕКа-3, а поме! со-гесеріог Беіопдіпд (о (Пе діа! сеї Іпе-дегімей пеигоїгорпіс гесеріог Тату. 9. Віої. Спет. 275, 3502-3508. 53. Мап, О., МаїШевзоп, С Ек І оре, О.Т. (1995) Іп мімо пеигоіїгорпіс еПесів ої СОМЕ оп пеопаїйїа| апа авдшї асіа! тоїог пешйгопе. Маїшге 373, 341-344, сч о

Claims (26)

Формула винаходу

1. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує нейротрофічний фактор росту людини (еновін) і має с зо Нуклеотидну послідовність, що відповідає амінокислотній послідовності, що показана на фіг. 1, або кодує послідовність, що має щонайменше 7095, а переважно 8095, 9095 або 9595 гомології з амінокислотною с послідовністю, що показана на фіг. 1. о

2. Молекула нуклеїнової кислоти за п.1, яка є молекулою ДНК.

3. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 1 або 2, яка є молекулою кКДНК. со 35

4. Молекула нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп.1-3, яка має послідовність нуклеїнової кислоти з чн положень 81-419 послідовності, що показана на фіг. 1.

5. Виділена молекула нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп.1-4, яка має послідовність нуклеїнової кислоти, що відповідає послідовності будь-яких сплайсированих варіантів у положенні від 5-1 до 3-1 або 3-2 і від 5-1 або 5-2 до 3-2 або 3-3 послідовності, що показана на фіг. 21. «

6. Молекула нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп.1-5, що має послідовність нуклеїнової кислоти, що з с показана на фіг. 21.

7. Виділений нейротрофічний фактор росту людини, що кодується молекулою нуклеїнової кислоти за :з» будь-яким з пп. 1-6.

8. Фактор росту за п./7, що містить амінокислотну послідовність із положень 27-139 амінокислотної послідовності, показаної на фіг. 1, або що має щонайменше 7095, а переважно 8095, 9095 або 9595 гомології з -І амінокислотною послідовністю, що показана на фіг.1.

9. Фактор росту за п.7 або 8, який містить амінокислотну послідовність, що показана на фіг.1. о

10. Фактор росту за п.7, що містить амінокислотні послідовності, що показані на фіг. 23 або 24. со

11. Експресійний вектор для експресії нейротрофічного фактора, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за п.1, яка функціонально пов'язана з регуляторними послідовностями. їмо)

12. Експресійний вектор за п. 11, що містить додаткову послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ГК репортерну молекулу.

13. Фактор росту за п.7, що експресується клітиною, яка містить експресійний вектор за п.11 або 12.

14. Фармацевтична композиція для лікування або профілактики порушень нервової системи, що містить експресійний вектор за п.11 або 12 разом з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем або наповнювачем. (Ф)

15. Фармацевтична композиція для лікування або профілактики порушень нервової системи, що містить ГІ фактор росту за будь-яким з пп.7-140 разом з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем або наповнювачем. во

16. Антитіло, отримане за допомогою фактора росту за п.7.

17. Спосіб виявлення наявності фактора росту в зразку, який передбачає взаємодію із зазначеним зразком антитіла, здатного зв'язуватися з фактором росту за п.7, і детектування зв'язування зазначеного антитіла із зазначеним фактором росту.

18. Спосіб за п.17, у якому зазначене антитіло кон'юговано з репортерною молекулою. 65

19. Набір або пристрій для виявлення наявності нейротрофічного фактора росту в зразку, що містить антитіло, здатне зв'язуватися з фактором росту за п.7, і пристрій для здійснення взаємодії зазначеного антитіла із зазначеним зразком.

20. Спосіб ідентифікації агоніста або антагоніста нейротрофічного фактора росту людини за п.7, що включає взаємодію клітини, тканини або організму, що експресують рецептор зазначеного фактора росту, зі сполукою, що випробовується, у присутності зазначеного фактора росту і порівняння рівнів активації білка-попередника протоонкогенного рецептора геї тирозинової протеїнкінази (СКЕТ) у зазначеній клітині, тканині або організмі з контрольним зразком, що не піддавали взаємодії із зазначеною сполукою, що випробовується.

21. Спосіб ідентифікації агоністів або антагоністів нейротрофічного фактора росту людини за п.7, що передбачає взаємодію клітини, тканини або організму, що експресують відповідний рецептор зазначеного 7/0 фактора росту і білка-попередника протоонкогенного рецептора геї тирозинової протеїнкінази (СКЕТ), зі сполукою, що випробовується, у присутності зазначеного фактора росту, вимірювання рівня активації сигнальної кінази в каскаді трансдукції сигналу, частиною якого є зазначений рецептор, після додавання антитіла, специфічного до зазначеної сигнальної кінази і кон'югованого з репортерною молекулою, у порівнянні з клітиною, тканиною або організмом, які не піддавали взаємодії із зазначеною сполукою.

22. Спосіб за п. 20 або 21, у якому зазначений нейротрофічний фактор росту є еновіном.

23. Спосіб за будь-яким з пп. 20-22, у якому зазначена клітина, тканина або організм є клітинами МІН 373.

24. Спосіб за будь-яким з пп. 21-23, у якому зазначений рецептор є СЕКАЇ, СЕКА 2, СЕКА З або СЕКА 4.

25. Спосіб за будь-яким з пп. 21-24, у якому зазначене антитіло є специфічним до кожної з МАР-кінази рі2/р44, РКВ-кінази, с-ї0п, СКЕВ, УМК/ЗАРІС-кінази.

26. Плазміда ЕММтауркЗЕТВ, що депонована в колекції І МВР під номером доступу І МВР 3931, яка кодує нейротрофічний фактор росту людини за п.7. с щі 6) с с (о) (зе) і - -

с . и? -І (95) се) іме) Ко) іме) 60 б5