UA69107A

UA69107A - A method for cultivation of surface-dependent cultures of animal and human cells

Info

Publication number: UA69107A
Application number: UA20031211040A
Authority: UA
Inventors: Iryna Volodymyrivna Dziublyk; Olena Petrivna Trokhymenko; Kateryna Mykhailivna Bilotkach; Anatolii Ivanovych Saliuk
Original assignee: Kyiv P L Shupyk Med Acad
Priority date: 2003-12-05
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2004-08-16

Abstract

A method for cultivation of surface-dependent cultures of animals and human cells by means of insertion of inoculate of this cells suspended in growing nutrient medium into the vessel for cultivation with following cultivation of the cells at 37 oC. As growth surface crushed polymeric film formed in structure with chaotically oriented and condensedtapes is used.

Description

Опис винаходуDescription of the invention

Винахід відноситься до біотехнології медицини та вірусології а саме до способу культивування 2 поверхневозалежних культур клітин тварин та людини, і може бути застосований у ветеринарії та медичній промисловості при отриманні вірусних вакцин, сироваток, а також біологічно-активних речовин (БАР): гормонів, цитокінів і факторів росту.The invention relates to the biotechnology of medicine and virology, namely to the method of cultivation of 2 surface-dependent cultures of animal and human cells, and can be used in veterinary medicine and the medical industry for the production of viral vaccines, serums, as well as biologically active substances (BAS): hormones, cytokines and growth factors.

Відомі способи культивування поверхневозалежних культур клітин у стаціонарних умовах на внутрішній поверхні спеціальних культуральних посудин. При цьому використовуються великі об'єми ростових живильних 70 середовищ, а кількість одержаних клітин обмежена площею поверхні їх росту. Для збільшення поверхні росту стаціонарних клітинних культур на практиці використовують спеціальні блоки з великою кількістю пластин, що значно збільшують її. Наприклад, блок А/8 МОМС має робочу поверхню 600 см, для культивування витрачають 2000 мл ростового середовища при загальному об'ємі посудини для культивування 12500 см З. Проте такі 75 блоки не доступні на ринку України, оскільки вони виключно іноземного виробництва, мають високу вартість і придатні тільки для одноразового використання.Known methods of cultivating surface-dependent cell cultures in stationary conditions on the inner surface of special culture vessels. At the same time, large volumes of growth nutrient 70 media are used, and the number of cells obtained is limited by the surface area of their growth. To increase the growth surface of stationary cell cultures, special blocks with a large number of plates are used in practice, which significantly increase it. For example, block A/8 MOMS has a working surface of 600 cm, 2000 ml of growth medium is used for cultivation with a total volume of the vessel for cultivation of 12500 cm 3. However, such 75 blocks are not available on the market of Ukraine, as they are exclusively foreign-made, have a high cost and are suitable for single use only.

Способи культивування клітин у бутлях, що обертаються (ролерне культивування), дозволяють значно підвищити вихід клітин за рахунок використання всієї площі внутрішньої поверхні бутилів та мінімізувати витрати ростових живильних середовищ. Ролерне культивування добре піддається автоматизації і широко го Застосовується при промисловому вирощувані поверхневозалежних клітинних культур з метою подальшого культивування в них вірусів, одержання вірусних антигенів та інших БАР.Methods of cultivating cells in rotating bottles (roller cultivation) allow to significantly increase the yield of cells due to the use of the entire area of the inner surface of the bottles and to minimize the consumption of growth nutrient media. Roller cultivation is well amenable to automation and is widely used in the industrial cultivation of surface-dependent cell cultures for the purpose of further cultivation of viruses in them, obtaining viral antigens and other BARs.

Проте обладнання для ролерного культивування має високу вартість і мало доступне на ринку України |11.However, equipment for roller cultivation has a high cost and is scarcely available on the market of Ukraine |11.

Існує спосіб культивування поверхневозалежних клітинних культур на скляних трубках, що поєднує принципи стаціонарного і ролерного культивування. У бутель, що обертається вміщують пучок паралельних скляних ре трубок малого діаметру, розділених силіконовими прокладками або кільцями. При цьому додатково застосовують перфузію живильного середовища із зовнішнього резервуару |2). При використанні таких системи « можна, наприклад, одержати 3,27109 клітин Мего (2,37109 кл/см? поверхні росту) за умов культивування впродовж 6 діб та використання 6,5 л ростового живильного середовища. Обладнання для такого культивування виробництва фірми Веїсо Сіазз Іпс. має високу вартість і не доступне на ринку України. ї- зо Використання різних носіїв, що збільшують поверхню росту для культивування поверхневозалежних культур клітин дозволяє значно оптимізувати процеси як отримання самої біомаси клітин, так і продуктів, що о синтезуються ними: антитіл, антигенів, інших БАР та вірусів, при цьому досягається зниження трудомісткості «- біотехнологічного процесу в результаті того, що відношення поверхні росту до об'єму культивування значно збільшується, можливо автоматизувати контроль та керування процесом культивування. ме)There is a method of cultivation of surface-dependent cell cultures on glass tubes, which combines the principles of stationary and roller cultivation. A bunch of parallel glass tubes of small diameter, separated by silicone spacers or rings, are placed in the rotating bottle. At the same time, perfusion of the nutrient medium from the external tank is additionally used |2). When using such a system, it is possible, for example, to obtain 3.27109 Mego cells (2.37109 cells/cm of growth surface) under the conditions of cultivation for 6 days and the use of 6.5 liters of growth nutrient medium. The equipment for such cultivation is produced by Veiso Siazz Ips. has a high cost and is not available on the Ukrainian market. The use of various carriers that increase the growth surface for the cultivation of surface-dependent cell cultures allows to significantly optimize the processes of obtaining the biomass of cells themselves, as well as the products synthesized by them: antibodies, antigens, other BARs and viruses, while reducing labor intensity. - biotechnological process as a result of the fact that the ratio of the growth surface to the cultivation volume increases significantly, it is possible to automate the control and management of the cultivation process. me)

Відомі способи культивування клітин людини та тварин она частках спіненого еластичного «со полімерно-поліефірного поліуретану |З) та спосіб культивування клітин на нетканому розпушеному вуглецевому сорбенті. Перед інокуляцією клітин носії попередньо обробляють спеціальними розчинами для полегшення адгезії, прикріплення та розпластування клітин (4). Проте, суттєвими недоліками застосування цих способів культивування клітин є необхідність використання спеціально виготовлених матеріалів та додаткова модифікація « поверхні росту шляхом її обробки високо вартісними сполуками біологічного походження, що вимагають -о с спеціальної технології виготовлення.There are known methods of cultivating human and animal cells on particles of foamed elastic "co polymer-polyether polyurethane |Z) and a method of cultivating cells on a non-woven, loose carbon sorbent. Before cell inoculation, carriers are pretreated with special solutions to facilitate cell adhesion, attachment, and spreading (4). However, the significant disadvantages of using these methods of cell cultivation are the need to use specially manufactured materials and additional modification of the growth surface by treating it with high-value compounds of biological origin, which require a special manufacturing technology.

Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб культивування поверхневозалежних культур клітин :з» на волокнах з алюмоборосилікатного, натрієвоборосилікатного чи кварцового скла діаметром 5-45 мкм і насипною густиною 2-40 г/дм3, що обробляються стандартними методами підготовки скла до культивуванняThe closest to the claimed method is the method of cultivation of surface-dependent cell cultures: with" on fibers made of aluminoborosilicate, sodium borosilicate or quartz glass with a diameter of 5-45 μm and a bulk density of 2-40 g/dm3, which are processed by standard methods of preparing glass for cultivation

Клітин (скляні волокна промивають, знежирюють та стерилізують) |5).Cell (glass fibers are washed, degreased and sterilized) |5).

Ге») Спосіб виконують так. Оброблені волокна розміщують у посудину для культивування об'ємом 5 л. Суспензію с клітин ПО-2 (нирки вівці) або ПТ (нирки теляти) у посівній концентрації 1,2710 5-2,0109 клу/умл у ростовому живильному середовищі з 1095 сироватки великої рогатої худоби, об'ємом 1 л, вносять у посудину для - культивування. Клітини культивують 9б годин при 37"С, повністю замінюючи кожної доби середовище о 50 культивування на свіже. Після закінчення культивування, клітини, що виросли, знімають з поверхні волокон 0,259 розчином трипсину і підраховують їх кількість відомими методами. При цьому кількість одержаних клітин в що 10-15 разів перевищує початкову кількість клітин, взятих для культивування.Ge") The method is performed as follows. Processed fibers are placed in a vessel for cultivation with a volume of 5 liters. A suspension of PO-2 (sheep kidney) or PT (calf kidney) cells at a seed concentration of 1.2710 5-2.0109 clu/uml in a growth nutrient medium with 1095 bovine serum, volume 1 l, is introduced into a vessel for - cultivation. The cells are cultured for 9 hours at 37"C, completely replacing the culture medium every day with 50% culture. After the end of cultivation, the grown cells are removed from the surface of the fibers with a 0.259 solution of trypsin and their number is counted by known methods. At the same time, the number of cells obtained in each 10-15 times higher than the initial number of cells taken for cultivation.

Недоліками описаного способу культивування клітин є небезпека вдихання дрібнодисперсних скляних волокон під час їх підготовки, складність відмивання цих волоком від ростового живильного середовища, необхідність застосування додаткового фільтрування для відділення решток скляних волокон від цільового продукту, механічного травмування уламками волокон клітин під час маніпуляцій. » Задача винаходу полягає у підвищенні продуктивності систем культивування поверхневозалежних культур клітин тварин і людини шляхом застосування поширеного, дешевого і безпечного матеріалу у якості носія, спрощення стадій заміни культурального середовища та відмивання клітин від ростового середовища, що 60о містить сироватку, зменшенні вартості цільового продукту.The disadvantages of the described method of cell cultivation are the danger of inhaling finely dispersed glass fibers during their preparation, the difficulty of washing them with a strainer from the growth nutrient medium, the need to use additional filtering to separate the remains of glass fibers from the target product, mechanical injury by fragments of cell fibers during manipulation. » The task of the invention is to increase the productivity of cultivation systems of surface-dependent cultures of animal and human cells by using a common, cheap and safe material as a carrier, simplifying the stages of replacing the culture medium and washing cells from the growth medium containing 60% serum, reducing the cost of the target product.

Вирішення поставленої задачі досягається тим, що у запропонованому способі культивування поверхневозалежних культур клітин тварин та людини, шляхом внесення інокуляту цих клітин, суспендованих у ростовому живильному середовищі, у посудину для культивування з наступним їх культивуванням при 37 С, у якості носіїв використовують доступні дешеві полімерні матеріали та їх відходи, зокрема подрібнену полімерну 65 плівку, сформовану у структуру з хаотично орієнтованими та ущільненими стрічками, при цьому стрічки полімерної плівки мають довжину не менш ніж 20 мм і ширину не більше за 2 мм.The solution to the given problem is achieved by the fact that in the proposed method of cultivating surface-dependent cultures of animal and human cells, by introducing the inoculum of these cells, suspended in a growth nutrient medium, into a vessel for cultivation followed by their cultivation at 37 C, available cheap polymeric materials are used as carriers and their waste, in particular, crushed polymer 65 film formed into a structure with randomly oriented and compacted ribbons, the polymer film ribbons having a length of at least 20 mm and a width of no more than 2 mm.

Спосіб здійснюється наступним чином.The method is carried out as follows.

Полімерну плівку із поліетилену, поліпропілену або полістиролу подрібніють (нарізають) на стрічки довжиною не менш, ніж 20 мм та шириною до 2 мм. Стрічки промивають проточною водою і знежирюють у 20-4095 водному розчин сірчаної кислоти з додаванням біхромату калію впродовж хвилин 1-30 хвилин.A polymer film made of polyethylene, polypropylene or polystyrene is shredded (cut) into strips at least 20 mm long and up to 2 mm wide. The tapes are washed with running water and degreased in a 20-4095 aqueous solution of sulfuric acid with the addition of potassium dichromate for 1-30 minutes.

Ущільнену масу стрічок полімерної плівки промивають від кислоти проточною, а потім дистильованою водою, стерилізують кип'ятінням, гама-опромінюванням чи автоклавуванням при 0,5 атм. Стрічки полімеру вміщують у посудину для культивування, формуючи просторову структуру із розвиненою поверхнею росту та хаотично орієнтованими ущільненими частками. 70 Суспензію клітин визначеної посівної концентрації у ростовому живильному середовищі вносять у посудину для культивування на підготовлені поліетиленові стрічки і культивують при 37"С впродовж 2 діб. Далі продовжують культивування ще З доби, повністю або частково замінюючи кожної доби середовище культивування на свіже.The compacted mass of ribbons of polymer film is washed from acid with running water and then with distilled water, sterilized by boiling, gamma irradiation or autoclaving at 0.5 atm. Polymer ribbons are placed in a vessel for cultivation, forming a spatial structure with a developed growth surface and randomly oriented compacted particles. 70 A suspension of cells of a certain seeding concentration in a growth nutrient medium is placed in a vessel for cultivation on prepared polyethylene tapes and cultivated at 37"С for 2 days. Then the cultivation is continued for another 3 days, completely or partially replacing the cultivation medium with fresh every day.

Після закінчення культивування стрічки полімеру промивають розчином Хенкса або фізіологічним розчином /5 Натрію хлориду і фарбують 0,295 розчином кристалічного фіолетового. Якість утвореного клітинного моношару оцінюють при мікроскопічному дослідженні.After the end of culturing, the polymer ribbons are washed with Hanks' solution or a physiological solution of /5 sodium chloride and stained with a 0.295 solution of crystal violet. The quality of the formed cell monolayer is assessed by microscopic examination.

Кількість одержаних живих клітин підраховують у гемоцитометрі після попереднього зняття їх з поверхні стрічок сумішшю розчинів Версену та трипсину та фарбування мортальним або вітальним барвниками.The number of live cells obtained is counted in a hemocytometer after previously removing them from the surface of the tapes with a mixture of Versen and trypsin solutions and staining with lethal or vital dyes.

Приклад 1.Example 1.

Полімерну плівку з поліетилену, поліпропілену, полістиролу із загальною площею поверхні росту 50 см нарізають на стрічки довжиною не меншою ніж 20 мм та шириною до 2 мм, промивають у проточній водопровідній воді і вмішують на 30 хв. у 20-4095 водний розчин сірчаної кислоти з додаванням біхромату калію.A polymer film made of polyethylene, polypropylene, polystyrene with a total growth surface area of 50 cm is cut into strips at least 20 mm long and up to 2 mm wide, washed in running tap water and mixed for 30 minutes. in 20-4095 an aqueous solution of sulfuric acid with the addition of potassium dichromate.

Стрічки полімерної плівки промивають від кислоти проточною, а потім дистильованою водою. Одержані стрічки вміщують у посудину для культивування, формуючи просторову структуру із розвиненою поверхнею росту та ов хаотично орієнтованими ущільненими частками носія. Посудину заповнюють 0,975 розчином натрію хлориду та стерилізують автоклавуванням при 0,5 атм. Після стерилізації розчин виливають а поверхню росту обробляють « ростовим живильним середовищем на основі середовищ ДМЕМ і 199 у рівних співвідношеннях з додаванням 590 сироватки крові ембріонів корів та антибіотиків (100 Од/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину).Strips of polymer film are washed from acid with running water and then with distilled water. The resulting ribbons are placed in a vessel for cultivation, forming a spatial structure with a developed growth surface and chaotically oriented compacted carrier particles. The vessel is filled with 0.975 sodium chloride solution and sterilized by autoclaving at 0.5 atm. After sterilization, the solution is poured out and the growth surface is treated with a growth nutrient medium based on DMEM and 199 media in equal proportions with the addition of 590 cow embryo blood serum and antibiotics (100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin).

Готують суспензію перещеплювальних клітин свинячої нирки ембріональної версенізованої (СНЕВ) у посівній М концентрації 1,5105 кл/мл у ростовому живильному середовищі зазначеного вище складу. Готову клітинну суспензію, об'ємом 40 мл, вносять у посудину для культивування, місткістю 100 см З і культивують при 377С о впродовж 2 діб без заміни ростового живильного середовища, а потім продовжують культивування ще 4 доби, «- при 37"С із заміною середовища культивування кожної доби. Тривалість культивування разом становить 6 діб.Prepare a suspension of transplantable cells of embryonic versenized porcine kidney (SNEV) in a seed M concentration of 1.5105 cells/ml in a growth nutrient medium of the above composition. The finished cell suspension, with a volume of 40 ml, is placed in a vessel for cultivation with a capacity of 100 cm C and cultivated at 377C for 2 days without replacing the growth nutrient medium, and then the cultivation is continued for another 4 days, "- at 37"C with replacement culture medium each day.The total duration of cultivation is 6 days.

Після закінчення культивування стрічки полімерної плівки, яку використовують у якості поверхні росту, Ф разом з клітинами, що виросли, двічі промивають фізіологічним розчином і фарбують впродовж 15 хвилин 0,295. .«О водно-спиртовим розчином кристалічного фіолетового. Одержані препарати досліджують під мікроскопом при збільшенні х80 та фотографують. На Фіг.1 показаний загальний вигляд полімерної плівки, що використовується у якості поверхні росту для культивування поверхневозалежних культур клітин тварин і людини. На Фіг.2. показано « формування моношару поверхневозалежної клітинної культури СНЕВ на поверхні поліетиленової плівки, що використовується у якості поверхні росту. Клітини прикріплюються, розпластуються та утворюють моношари, - с при мікроскопічному дослідженні яких не виявляється порушень цілісності клітинного моношару на появи вогнищ ч дегенерації клітин. Це свідчить про нетоксичність полімерної плівки для поверхневозалежних клітин тварин. -» Формування клітинних моношарів відбувається на обох поверхнях стрічок, клітини займають усі доступні площини, досягаючи у такий спосіб більшої концентрації біомаси на одиницю об'єму середовища культивування.After the cultivation of the strip of polymer film, which is used as a growth surface, F together with the grown cells, is washed twice with physiological solution and stained for 15 minutes with 0.295. .« About a water-alcohol solution of crystal violet. The obtained preparations are examined under a microscope at a magnification of x80 and photographed. Figure 1 shows a general view of a polymer film used as a growth surface for the cultivation of surface-dependent cultures of animal and human cells. In Fig.2. shows the formation of a monolayer of a surface-dependent SNEV cell culture on the surface of a polyethylene film used as a growth surface. Cells are attached, flattened and form monolayers, - microscopic examination of which does not reveal any violations of the integrity of the cell monolayer or the appearance of foci of cell degeneration. This indicates the non-toxicity of the polymer film for surface-dependent animal cells. -» The formation of cell monolayers occurs on both surfaces of the tapes, the cells occupy all available planes, thus achieving a higher concentration of biomass per unit volume of the culture medium.

Приклад 2. Спосіб виконують як у прикладі 1, але після закінчення культивування середовище росту (о) видаляють, стрічки полімерної плівки з клітинами двічі промивають розчином Хенкса. Потім їх переносять у іншу со посудину більшого об'єму, куди додають суміш 0,0295 розчину Версену і 0,2595 розчину трипсину у рівних співвідношеннях в об'ємі, рівному об'єму інокуляту (40 мл). Носій розпушують і витримуючи його 10-15 хв. при -й 372, періодично перемішуючи. В одержаній суспензії клітин підраховують їх кількість у гемоцитометрі після о 50 фарбування клітин 0,595 розчином мортального барвника трипанового синього. Підраховують загальну кількість клітин, одержаних при культивуванні. Результати виконання способу представлені в таблиці. "м Приклад 3. Спосіб виконують як у прикладі 2, але посівна концентрація клітин у інокуляті становить 2,5710 5 кл/мл. Результати виконання способу представлені в таблиці.Example 2. The method is carried out as in example 1, but after the end of cultivation, the growth medium (o) is removed, the ribbons of the polymer film with cells are washed twice with Hanks' solution. Then they are transferred to another vessel with a larger volume, where a mixture of 0.0295 Versen solution and 0.2595 trypsin solution is added in equal proportions in a volume equal to the volume of the inoculum (40 ml). The medium is loosened and kept for 10-15 minutes. at 372, stirring periodically. In the obtained suspension of cells, their number is counted in a hemocytometer after staining the cells with a 0.595% solution of the lethal dye trypan blue. Count the total number of cells obtained during cultivation. The results of the method are presented in the table. "m Example 3. The method is performed as in example 2, but the seed concentration of cells in the inoculum is 2.5710 5 cells/ml. The results of the method are presented in the table.

Приклад 4. Спосіб виконують як у прикладі 2, але посівна концентрація клітин у інокуляті становить 5,0710 9Example 4. The method is performed as in example 2, but the seed concentration of cells in the inoculum is 5.0710 9

Ккл/мл. р Приклад 5. Спосіб виконують як у прикладі 1, але загальна площа стрічок полімерної плівки становить 200Kcl/ml r Example 5. The method is performed as in example 1, but the total area of the polymer film strips is 200

СМ, Результати виконання способу представлені в таблиці.SM, The results of the method are presented in the table.

Приклад 6. Спосіб виконують як у прикладі 1, але загальна площа стрічок полімерної плівки становить 400 см2, Результати виконання способу представлені в таблиці. 60 Приклад 7. Спосіб виконують як у прикладах 2-6, але при цьому використовують клітини поверхневозалежної перещеплювальної культури клітин аденокарциноми гортані людини (НЕР-2). Результати виконання способу представлені в таблиці.Example 6. The method is performed as in example 1, but the total area of the polymer film tapes is 400 cm2. The results of the method are presented in the table. 60 Example 7. The method is performed as in examples 2-6, but at the same time cells of the surface-dependent transplantation culture of human larynx adenocarcinoma cells (HER-2) are used. The results of the method are presented in the table.

З результатів виконання способу, представлених в таблиці, випливає, що в усіх прикладах приріст клітин д5 становить від 1,9 до 5,8 разів; кількість одержаних клітин в перерахунку на 1 см? поверхні росту коливається в межах від 3,167105 до 9,010; в перерахунку на 1 мл використаного живильного середовища, кількість одержаних клітин в усіх прикладах знаходиться в межах від 1,395210 5 до 3,010, Ці показники залежать від кількості клітин в інокуляті, загальної площі поверхні росту стрічок полімерної плівки і виду використаних клітин. Проте вихід цільового продукту обмежений конструктивними особливостями посудини дляFrom the results of the method, presented in the table, it follows that in all examples the increase in d5 cells is from 1.9 to 5.8 times; the number of received cells in terms of 1 cm? growth surface ranges from 3.167105 to 9.010; in terms of 1 ml of the used nutrient medium, the number of cells obtained in all examples is in the range from 1.395210 5 to 3.010. These indicators depend on the number of cells in the inoculum, the total surface area of the growth of polymer film ribbons and the type of cells used. However, the output of the target product is limited by the design features of the vessel for

Культивування.Cultivation.

Література: 1. АІап Осуїе 85). Вгуап Сгінйнвг. СеїЇ апа Тіззвие СиЦиге: І арогаїгу Ргоседигез іп ВіоФїесппоіоду. - допйп М/Шеу КкReferences: 1. AIap Osuie 85). Vguap Sginynvg. Seyi apa Tizzvie SyCyge: I arogaigu Rgosedigez ip VioFiespppoiodu. - dopyp M/Sheu Kk

Бопвг.: Спіспевіег - Мем ХогкК -Уепнат - Вгізрапе - Зіпдароге - Тогопію. - 1998. - 332 р. 2. Фрешни Р. Культура животньх клеток: Методь!. - М.: Мир, 1989. - 332 с. 70 З. Патент РФ, КО 2014359 Трехмерньій биоактивньій носитель для культивирования животньїх клеток и тканей от 15.06.94., Бюл.Мо 11. 4. А. с. СССР, 5) 1578192, от 15.07.90., Бюл. Мо 26. 5. А. с. СССР, БУ 1182817, от 15.10.94., Бюл. Мо 19. ів перещеплювальних культур клітин тварин та людини поверхні росту, см клітин концентрація (культуральної |інокуляту кількість одержаних приріст одержаних (кількість у кл/мл посудини, мл |, мл клітин в. клітин клітин, клітин в затраченого перерахунку інокуляті разів перерахунку |ростового |на 1 мл на 1 живильного (ростового см? поверхні середовища живильного росту середовища 13117741 51811181 81961 2 « 8 в зо о во сНЕВ йBopvg.: Spispevieg - Mem HogkK - Uepnat - Vgizrape - Zipdaroge - Togopia. - 1998. - 332 p. 2. Freshny R. Culture of animal cells: Method!. - M.: Mir, 1989. - 332 p. 70 Z. Patent of the Russian Federation, KO 2014359 Three-dimensional bioactive carrier for the cultivation of animal cells and tissues dated 15.06.94., Byul.Mo 11. 4. A. p. USSR, 5) 1578192, dated 15.07.90, Bull. Mo. 26. 5. A. p. USSR, BU 1182817, dated 15.10.94, Bull. Mo 19. iv transplant cultures of animal and human cells growth surface, cm cells concentration (cultural | inoculum amount obtained increase obtained (amount in kl/ml vessel, ml |, ml cells in. cells cells, cells in spent count inoculated times count | growth |per 1 ml per 1 nutrient (growth cm? of the surface of the nutrient growth medium 13117741 51811181 81961 2 « 8 in zo o vo sNEV and

ФF

200 сНЕВО | лемоб 50 150 ловмо? товмов 0 чаво 0 вБМоб 600 18омоє оф ооавлоє 00800160 зивнот томове32я 0 6оомої 0060000 2бомої СЮ 7 оовме5 005 0150 твомот твомов о омо0воомоє | 600 0 зомов - неба 000лвмоє 00воо | ло оовмо? тивмов ит БІБМОЄ 6000 теомоб г» ооавмоє ов тво озлвмот тєвмов 4210 воомоє | 6000 оезмов оовлоб 00800150 твомої зивмов 3238 0 вивмоє 6000 вом200 SNEVO | lemob 50 150 lovmo? tovmov 0 chavo 0 vBMob 600 18omoye of ooavloe 00800160 zivnot tomove32ya 0 6oomoi 0060000 2bomoi SYU 7 oovme5 005 0150 tvomot tvomov o omo0voomoe | 600 0 orders - sky 000 levmoe 00voo | lo oovmo? tyvmov and BIBMOE 6000 teomob g» ooavmoe ov tvo ozlvmot tevmov 4210 voomoe | 6000 oezmov oovlob 00800150 your zivmov 3238 0 vymoe 6000 vom

Ф те нер т ШЕ ли ши нос весни шеисся - ДИ щоF te ner t SHE li shi nose of spring sheissya - DY what

РR

60 б5 і . - шля й щ- ЩО ; й ст М. Й Що у. й 70 ше Я Й Ко, ши НИК НИ: 1 Щ 7 -60 b5 and . - shlya and shh- WHAT; and St. M. And What in. и 70 ше I Y Ko, ш ник Ни: 1 Ш 7 -

Фіг. ин ! 2 НИНІ «Fig. that's it! 2 NOW «

ЗИ | ї- зо ре «в) ріг? (Се)ZY | iz- zo re "c) horn? (Se)

Claims

The formula of the invention

1. The method of cultivation of surface-dependent cultures of animal and human cells by introducing the inoculum - these cells, suspended in a growth nutrient medium, into a vessel for cultivation, followed by their cultivation at 37 "C, which differs in that crushed polymer is used as a growth surface with" a film formed into a structure with randomly oriented and compacted ribbons.

2. The method according to claim 1, which is characterized by the fact that the strips of polymer film have a length of not less than 20 mm and a width of not more than 2 mm. Ф Official Bulletin "Industrial Property". Book 1 "Inventions, useful models, topographies of integrated (Se) microcircuits", 2004, M 8, 15.08.2004. State Department of Intellectual Property of the Ministry of Education and Science of Ukraine. - In r g SHY that 60 b5