UA55005A - Method for separation of high-purity standard of human thrombin - Google Patents
Method for separation of high-purity standard of human thrombin Download PDFInfo
- Publication number
- UA55005A UA55005A UA2002064794A UA200264794A UA55005A UA 55005 A UA55005 A UA 55005A UA 2002064794 A UA2002064794 A UA 2002064794A UA 200264794 A UA200264794 A UA 200264794A UA 55005 A UA55005 A UA 55005A
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- thrombin
- prothrombin
- thromboplastin
- carried out
- factor
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 title claims abstract description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title abstract 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims abstract description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 47
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 47
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 12
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 7
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 claims description 2
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 claims 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 abstract description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- MWAGUKZCDDRDCS-UHFFFAOYSA-N 1-nitro-4-(4-nitrophenoxy)benzene Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 MWAGUKZCDDRDCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000649938 Mus musculus Vacuolar protein sorting-associated protein 28 homolog Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 238000010266 Sephadex chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- OKBPCTLSPGDQBO-UHFFFAOYSA-L disodium;dichloride Chemical compound [Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-] OKBPCTLSPGDQBO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012622 synthetic inhibitor Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Опис винаходуDescription of the invention
Винахід стосується біотехнології і є способом виділення стандарту тромбіну людини. Одержаний фермент 2 може бути використаний в медицині, експериментальних дослідженнях та клінічній практиці. Зокрема, стандарт тромбіну необхідний, по-перше, для систематизованої характеристики цього ферменту, виділеного вченими багатьох груп причому різноманітними методами, з різноманітної сировини; по-друге, для ретельної перевірки терапевтичних препаратів, що містять протромбін, тому що навіть незначна лабільність препаратів визначається в одиницях тромбіну; по-третє, стандарт тромбіну необхідний для визначення одиниць активності природних 70 інгібіторів ферменту, таких як антитромбін ПІ і його кофактор гепарин.The invention relates to biotechnology and is a method of isolating a human thrombin standard. The obtained enzyme 2 can be used in medicine, experimental research and clinical practice. In particular, the thrombin standard is necessary, firstly, for the systematic characterization of this enzyme, isolated by scientists of many groups and by various methods, from various raw materials; secondly, to carefully check therapeutic drugs containing prothrombin, because even a slight lability of drugs is determined in units of thrombin; third, a thrombin standard is necessary to determine the activity units of natural 70 enzyme inhibitors, such as antithrombin PI and its cofactor heparin.
Тромбін - ключовий фермент системи гемостазу. Порушення регуляторної функції тромбіну відіграють важливу роль у розвитку хвороб серцево-судинної системи. Закупорення просвіту кровоносних судин тромбами, емболії і гемофільні розлади нерідко призводять до летального кінця.Thrombin is a key enzyme of the hemostasis system. Violations of the regulatory function of thrombin play an important role in the development of diseases of the cardiovascular system. Clogging of the lumen of blood vessels with blood clots, embolism and hemophilic disorders often lead to death.
За патологій такого типу використовують агенти, що стимулюють або пригнічують процес згортання крові, 12 або спричинюють лізис тромбу.For pathologies of this type, agents are used that stimulate or inhibit the blood coagulation process, 12 or cause thrombus lysis.
Протеоліз фібриногену тромбіном, що призводить до утворення фібринового згустку - найбільше досліджена біологічна функція тромбіну. Проте, на сьогодні відомо, що тромбін є ферментом, який здійснює багато функцій 1 - 10). Взаємодіючи з усіма ланками гемостазу - білками, клітинами крові і стінками судин, він бере участь у регуляції протилежно спрямованих процесів, пов'язаних як із згортанням крові, так і зберіганням її рідкого стану у кровоносному руслі |4 - 7). У плазмі тромбін активує і інактивує фактори М, МІ, ХІЇЇ та білок С. На клітинному рівні тромбін функціонує не тільки як селективний протеолітичний фермент, але також як гормон, дію якого опосередковано через специфічні рецептори. Він є потужним клітинним стимулятором індукції і секреції тромбоцитів, метаболізму арахідонової кислоти і митогенезу |2, 7, 8, 11, 121.Proteolysis of fibrinogen by thrombin, which leads to the formation of a fibrin clot, is the most studied biological function of thrombin. However, today it is known that thrombin is an enzyme that performs many functions 1 - 10). Interacting with all links of hemostasis - proteins, blood cells and vessel walls, it participates in the regulation of oppositely directed processes related to both blood coagulation and storage of its liquid state in the bloodstream |4 - 7). In plasma, thrombin activates and inactivates factors M, MI, HII and protein C. At the cellular level, thrombin functions not only as a selective proteolytic enzyme, but also as a hormone, the action of which is mediated through specific receptors. It is a powerful cellular stimulator of platelet induction and secretion, arachidonic acid metabolism, and mitogenesis |2, 7, 8, 11, 121.
Нині вважається, що всі типи клітин ссавців (за винятком еритроцитів) чутливі до тромбіну. Це зокрема 29 доведено на епітеліальних та нервових клітинах, різноманітних типів лейкоцитах, клітинах гладенької « мускулатури і культивованих фібробластах |1 - 3, 111.It is now believed that all types of mammalian cells (except erythrocytes) are sensitive to thrombin. This, in particular, has been proven on epithelial and nerve cells, various types of leukocytes, smooth muscle cells and cultured fibroblasts |1 - 3, 111.
Відомий спосіб виділення тромбіну людини з фракції І за Коном плазми крові людини, описано у статті (Гепіоп 9. МУ., Базсо М. 9., З(асКгомж А. В. еї аІ. "Нитап (пготбіпв: Ргодисіоп, емаІцайоп апа ргорегіев оїThe well-known method of isolating human thrombin from fraction I according to Kon of human blood plasma is described in the article (Hepiop 9. MU., Bazso M. 9., Z(asKgomzh A. V. eyi aI. oh
А-готбріп" / 9. Віої. Спет. 1977. 252, Мо 11. Р. 3587 - 3598), що включає екстракцію тромбіну й інших о залежних від вітаміну К білкових факторів зсідання крові із плазми. Екстракцію проводять буфером, що містить: ав 0,02М трис; 0,02М хлорида натрію; 495 політиленгліколю (ПЕГ-60О00; рН 8,0), адсорбцію факторів протромбінового комплексу проводять на охолодженому 1М Васі», елюцію протромбінового комплексу о проводять сірчанокислим амонієм при рН 8,0, додаючи його краплями, осад Вабзо у, що утворився при цьому ою видаляють центрифугуванням при З00Ооб/хв. В надосадовій рідині рН доводять до 6,0 - 6,2, після чого 3о діалізують її проти 0,15М Масі при 4"С.Очищення протромбіну здійснюють за допомогою іонообмінної о хроматографії на амберліті СО-50. Для видалення супутніх білків фракцію протромбіну, одержаного після діалізу, пропускають через колонку з амберлітом СО-50, урівноважену 0,05М трис-НСІ-буфером (рН 8,0) з 015М масі. Активацію протромбіну на тромбін проводять розчином тромбопластину з додатковим внесенням джерела « фактора М при 25 - 37"С протягом 1 - Згод (об'ємне співвідношення протромбіну/тромбопластину - З : 1. Тромбін З виділяють сорбцією на другій колонці амберліту СО-50, урівноваженої 0,05М трис-НСІ-буфером (рН 8,0), що с містить 0,15М Масі з наступною елюцією 0,75М Масі при 4"С. Проби зберігають замороженими при 50 - 707С.A-gotbrip" / 9. Vioi. Spet. 1977. 252, Mo. 11. R. 3587 - 3598), which includes the extraction of thrombin and other vitamin K-dependent protein factors of blood clotting from plasma. The extraction is carried out with a buffer containing: av 0.02 M tris; 0.02 M sodium chloride; 495 polyethylene glycol (PEG-60O00; pH 8.0), adsorption of prothrombin complex factors is carried out on cooled 1 M Vasa", elution of the prothrombin complex is carried out with ammonium sulfate at pH 8.0, adding with its drops, the Vabzo precipitate formed during this process is removed by centrifugation at 300 rpm. In the supernatant, the pH is brought to 6.0 - 6.2, after which it is dialyzed for 3 hours against 0.15 M Mass at 4"C. Purification of prothrombin carried out using ion-exchange chromatography on CO-50 amberlite. To remove associated proteins, the fraction of prothrombin obtained after dialysis is passed through a column with amberlite CO-50, equilibrated with 0.05M Tris-HCl buffer (pH 8.0) with 015M mass. The activation of prothrombin to thrombin is carried out with a thromboplastin solution with the additional introduction of a source of "factor M" at 25 - 37"С for 1 - 1 h (volume ratio of prothrombin/thromboplastin - C: 1. Thrombin C is isolated by sorption on the second column of amberlite CO-50, balanced with 0.05M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.15M Mass followed by elution with 0.75M Mass at 4°C. Samples are stored frozen at 50 - 707°C.
Із» Недоліками цього способу є: многостадійність і тривалість виділення тромбіну, а саме: екстракція протромбіну з плазми крові людини, адсорбція ферменту хлористим барієм, повторне осадження білка сірчанокислим амонієм, двоетапна хроматографія препарату на іонообміннику на амберліті - СО-50, -- що обумовлює втрату ферменту і знижує його вихід та якість препарату. Проте виділений тромбін є забрудненим, і-й тому що дуже нестійкий під час збереження і швидко автолізується (при 50 - 707С він стійкий тільки впродовж 4! двох місяців). Препарат негомогенний за електрофорезного дослідження в ПААГ, титр активного центру тромбіна становить лише 86 - 8895. Слід також зазначити, що у вихідній сировині у разі використання цього о способу виділення, повинно міститись дуже значна кількість тромбіну, інакше фермент не можливо буде (ав) 50 виділити: кг пасти ЦІЇ за Коном, виділеної із плазми крові людини, повинен містити 0,8 - 1,0:109 МІН, що буває сп дуже рідко. Крім того, режим регенерації амберліту СО-50 досить складний. Регенерувати його в колонці або на воронці Бюхнера важко через малі розміри часток, внаслідок чого він забиває пори фільтрів будь-яких розмірів і швидко ущільнюється на колонці. До того ж використані при виділенні тромбіну імпортні препарати тромбопластину, фактор М, амберліт СО-50 є дефіцитними. 59 Як прототип обрано спосіб виділення тромбіну з найбільш близького за джерелом сировини, тобто в. концентрату фактора ІХ (МіПег-Апдегезоп М., СапПпеу Р. 9., Зедпаїспіап М. 9. "Ргерагайоп апа віарійу ої а підніу ригйей питап (Пготбріп віапдага" // ТиготЬ. Кев. 1981. 20, Мо1. Р. 109 - 122), одержаного хроматографією на амберліті СО-50 і ЗР - сефадексі та аффінною хроматографією на гепарин-сефарозі, елюючи фермент лінійним градієнтом розчину хлориду натрію (0,1 - 1,0М) в 0,05М трис-буфері (рН 7,0). бо Проте відомий спосіб має такі недоліки: багатостадійність виділення тромбіну і тривалість очищення цільового продукту, внаслідок чого втрачається кількість ферменту і погіршується його якісний склад, що викликає значну лабільність препарату: тромбін стійкий тільки протягом 10 тижнів, причому за наявності в реактивному середовищі 195 сироваткового альбуміну. Слід зазначити, що амберліт СО-50, ЗР-Зерпадех, імідазол, сироватковий альбумін є дефіцитними. Крім того використано складний етап активації з використанням бо додатково фактора М та імпортного тромбопластину. Проведено повторний діализ після очищення тромбіну на амберліті СО-50, з метою звільнення від іонів кальцію, що зумовлює лабільність препарату.With" The disadvantages of this method are: the multi-stage and duration of thrombin release, namely: extraction of prothrombin from human blood plasma, adsorption of the enzyme with barium chloride, re-precipitation of the protein with ammonium sulfate, two-stage chromatography of the drug on an ion exchanger on amberlite - CO-50, which causes loss of the enzyme and reduces its yield and the quality of the drug. However, the isolated thrombin is contaminated, and because it is very unstable during storage and quickly autolyzes (at 50 - 707C it is stable only for 4! two months). The drug is inhomogeneous according to electrophoresis in PAAG, the titer of the active center of thrombin is only 86 - 8895. It should also be noted that in the case of using this method of isolation, the raw material must contain a very significant amount of thrombin, otherwise the enzyme will not be possible (ав) 50 isolate: a kg of the paste of CIIA according to Kohn, isolated from human blood plasma, should contain 0.8 - 1.0:109 MIN, which happens very rarely. In addition, the mode of regeneration of CO-50 amberlite is quite complex. It is difficult to regenerate in a column or on a Buchner funnel due to its small particle size, as a result of which it clogs the pores of filters of any size and quickly compacts on the column. In addition, the imported preparations of thromboplastin, factor M, and amberlite CO-50 used in the isolation of thrombin are in short supply. 59 As a prototype, the method of isolating thrombin from the closest raw material source, i.e. in of factor IX concentrate (MiPeg-Apdegesop M., SapPeu R. 9., Zedpaispiap M. 9. "Rgeragayop apa viariyu oi a podniu rigyei pitap (Pgotbrip viapdaga" // Tygot. Kev. 1981. 20, Mo1. R. 109 - 122), obtained by chromatography on amberlite CO-50 and ZR - sephadex and affinity chromatography on heparin-Sepharose, eluting the enzyme with a linear gradient of sodium chloride solution (0.1 - 1.0M) in 0.05M Tris buffer (pH 7.0 ), because the known method has the following disadvantages: the multi-stage thrombin extraction and the duration of the purification of the target product, as a result of which the amount of the enzyme is lost and its qualitative composition deteriorates, which causes significant lability of the drug: thrombin is stable only for 10 weeks, and in the presence of 195 of serum albumin. It should be noted that amberlite CO-50, ZR-Zerpadek, imidazole, serum albumin are deficient. In addition, a complex activation step was used with the additional use of factor M and imported thromboplastin. A repeated dialyzation was performed from after purification of thrombin on CO-50 amberlite, with the aim of freeing it from calcium ions, which causes the lability of the drug.
Задачею, що покладена в основу цього винаходу є: розробка простого і доступного способу виділення тромбіну людини, спрощення технології, максимальне скорочення тривалості очищення і запобігання втрати і ферментативної активності, а також ефективне підвищення якості препарату, підвищення його стабільності при збереженні у водно-сольових розчинах (-20"С) без використання дорогих імпортних стабілізаторів. Виходячи із ступеня чистоти та стійкості виділеного препарату, фермент можна рекомендувати як робочий стандарт тромбіну, який необхідний для вирішення багатьох питань експериментальних досліджень і клінічної практики.The task underlying this invention is: development of a simple and affordable method for the isolation of human thrombin, simplification of the technology, maximum reduction of the duration of purification and prevention of loss of enzymatic activity, as well as effective improvement of the quality of the drug, increase of its stability when stored in water-salt solutions (-20"С) without the use of expensive imported stabilizers. Based on the degree of purity and stability of the isolated preparation, the enzyme can be recommended as a working standard of thrombin, which is necessary for solving many questions of experimental research and clinical practice.
Для вирішення поставленої задачі концентрат фактору ІХ екстрагують (0,05М трис-НСІ буфер рН 74), 7/0 діалізують та активують протромбіновий комплекс. Зміна умов активації надало можливість використати вітчизняні препарати тромбопластину без додаткового внесення джерела фактора М. Активований протромбін розділяють одноетапно на аффінному сорбенті гепарин - агароза, при цьому домішки білків, різноманітні забруднення проходять через колонку при пропусканні О0,05М трис-НСІ буфер з рН 7,4. Після цього тромбін елюють ступеневим (а не градієнтним) способом за допомогою хлорид натрію і виділяють його за 0,45 - 0,5М /5 Хлорида натрію - хлорида натрію - і потім концентрують застосовуючи мембрани "Зресіга/Рог" фірми "Атісоп".To solve the problem, factor IX concentrate is extracted (0.05 M Tris-HCI buffer pH 74), 7/0 is dialyzed and the prothrombin complex is activated. The change in the activation conditions made it possible to use domestic preparations of thromboplastin without additional introduction of the source of factor M. Activated prothrombin is separated in one step on the affinity sorbent heparin - agarose, while protein impurities and various impurities pass through the column when O0.05M Tris-HCl buffer with pH 7 is passed through. 4. After that, thrombin is eluted in a stepwise (not gradient) way using sodium chloride and isolated in 0.45 - 0.5 M/5 sodium chloride - sodium chloride - and then concentrated using membranes "Zresiga/Rog" of the company "Artichoke".
Завдяки сукупності наведених вище умов, які розроблено, спосіб містить оптимальні умови для стабілізації тромбіну, який забезпечує виділення високоочищеного і стабільного препарату. Фермент гомогенний в ПААГ і має молекулярну масу ЗбкДа. Виділений тромбін містить 9795 активних центрів, якщо для аналізу використовують синтетичний субстрат М-ФНГБ (п-нітрофентовий ефір-п-гуанідинбензойної кислоти). Тромбін зберігає стабільність не менше року у разі збереження його у водно-сольових розчинах (-207С) без використання різноманітних добавок. Ефективне підвищення якості препарату дозволяє рекомендувати його як робочий стандарт, необхідний для експериментальних досліджень і клінічної практики.Due to the combination of the above conditions, which have been developed, the method contains optimal conditions for the stabilization of thrombin, which ensures the release of a highly purified and stable drug. The enzyme is homogeneous in PAGE and has a molecular weight of ZbkDa. The isolated thrombin contains 9795 active centers, if the synthetic substrate M-FNGB (p-nitrophenic ester-p-guanidinebenzoic acid) is used for analysis. Thrombin remains stable for at least a year if stored in water-salt solutions (-207С) without the use of various additives. Effective improvement of the drug's quality allows recommending it as a working standard necessary for experimental research and clinical practice.
Можливість здійснення способу підтверджена прикладами.The possibility of implementing the method is confirmed by examples.
Приклад 1. 100 мг концентрату фактора ЇХ суспендують протягом ЗОхв при перемішуванні в 12мл 0,05М ов трис-НСЇ буфері (рН 7,4) розчину, що екстрагує фермент, і ставлять на діаліз при температурі 4"С проти 0,05М трис-НСЇ - буфера (рН 74), розведеного вдвічі охолодженою дистильованою водою, змінюючи двічі розчин через « кожні три години, і лишають діаліз на ніч. Активацію комплексу перетворення протромбіну на тромбін проводять тромбопластином. Для цього 150мг тромбопластину з кадаверного мозку людини (препарат Львівського НДІ гематології і переливання крові) гомогенізують в 1,5мл 0,2М трис-НСІ-буфері (рН 7,4), що містить 0,25М Сасі». ю зо Потім до одного об'єму отриманого гомогенату додають шість об'ємів розчину протромбіну. Суміш інкубують при температурі 37"С протягом двох годин і центрифугують 20хв зі швидкістю б тис. об/хв, при температурі н2"с. оExample 1. 100 mg of factor IX concentrate is suspended for 30 minutes with stirring in 12 ml of 0.05 M tris-HCl buffer (pH 7.4) of the enzyme-extracting solution and dialyzed at a temperature of 4"C against 0.05 M tris- NSI - buffer (pH 74), diluted with doubly cooled distilled water, changing the solution twice every three hours, and leaving the dialysis overnight. The activation of the complex for the conversion of prothrombin to thrombin is carried out with thromboplastin. For this, 150 mg of thromboplastin from a human cadaver brain (a preparation of the Lviv Research Institute hematology and blood transfusion) are homogenized in 1.5 ml of 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.25 M Sasi". Then six volumes of prothrombin solution are added to one volume of the homogenate obtained The mixture is incubated at a temperature of 37°C for two hours and centrifuged for 20 minutes at a speed of 1,000 rpm at a temperature of 2°C.
Ступінь активації тестують за активністю, згортання фібриногену використавши 0,195 розчин. оThe degree of activation is tested by activity, coagulation of fibrinogen using a 0.195 solution. at
Хроматографію надосадової рідини проводять на аффінному сорбенті гепарин - агарозі. Спочатку колонку (1,5 х 5см) зрівноважують 0,05М трис-НСІ-буфером (рН 7,4). Після нанесення зразка на колонку її промивають о з5 Вихідним буфером, а потім проводять елюцію ступеневим способом, використовуючи розчини хлориду натрію в (У концентраціях 0,5М и 1,0М у вихідному буфері (рН 7,4). Швидкість елюції розчину становить 5Омл/год.Chromatography of the supernatant liquid is carried out on the affinity sorbent heparin - agarose. First, the column (1.5 x 5 cm) is equilibrated with 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 7.4). After applying the sample to the column, it is washed with 5% of the starting buffer, and then elution is carried out in a stepwise manner using solutions of sodium chloride in concentrations of 0.5M and 1.0M in the starting buffer (pH 7.4). The elution rate of the solution is 5Oml/ hours
Відбирають окремі фракції по 2 і бмл. У кожній з одержаних фракцій визначали згортальну активність, ідентифікуючи наявність у них тромбіну.Separate fractions of 2 and bml are selected. In each of the obtained fractions, the coagulation activity was determined, identifying the presence of thrombin in them.
Активність тромбіну визначали за часом згортання О,бмл 0,190-го розчину фібриногену в 0,04М « трис-НСІ-буфері (рН 7,36) з 0,1М Масі і 0,6695 ПЕГ при температурі 29"7С при додаванні в реакційну суміш 0,01 - "ву с 0,02мл розчину тромбіну.Thrombin activity was determined by the coagulation time of 0.bml of a 0.190% solution of fibrinogen in 0.04M Tris-HCl buffer (pH 7.36) with 0.1M Mass and 0.6695 PEG at a temperature of 29-7C when added to the reaction mixture 0.01 to 0.02 ml of thrombin solution.
Як стандарт для побудови калібрувальної кривої використовують тромбін людини фірми "Зідта" (США), ;» активність якого було раніше відкалібровано при використанні Міжнародного стандарту тромбіну (код РД Фракції, що викликають згортання фібриногену не більше 15с, в заданих умовах експерименту об'єднують і тестують електрофоретично в ПААГ з 0,195 Ов-Ма. Проби зберігають у водно-сольових розчинах (-207С). с Згідно з даними титрування ферменту п-нітрофеніловим ефіром п-гуанидинбензойної кислоти (М-ФНГБ) вміст активних центрів у препараті становить 9795. За допомогою методу електрофорезу в ПААГ за присутності Ов-Ма о виявлено функціональну гомогенність препарату з молекулярною масою ЗбкДа. Виділений фермент виявився о стабільним впродовж одного року при збереженні в водно-сольових розчинах без використання різноманітних 5р дорогих добавок (білків, пептидів та ін.). о Приклад 2. 100мг концентрату фактора ІХ суспендують і розділяють як показано в прикладі 1, сп використовуючи при цьому для екстракції буфер 0,05М трис-НСІ (рН 7,35), проводячи активацію комплексу протромбіну в такий спосіб: до одного об'єму одержаного гомогенату додають п'ять об'ємів розчину тромбіну.Human thrombin from Zidta (USA) is used as a standard for constructing a calibration curve. the activity of which was previously calibrated using the International Standard of Thrombin (code RD). 207C). c According to the titration data of the enzyme with p-nitrophenyl ether of p-guanidinebenzoic acid (M-FNGB), the content of active centers in the preparation is 9795. Using the electrophoresis method in PAAG in the presence of Ov-Ma, the functional homogeneity of the preparation with the molecular weight of ZbkDa was revealed The isolated enzyme was found to be stable for one year when stored in water-salt solutions without the use of various expensive additives (proteins, peptides, etc.). Example 2. 100 mg of factor IX concentrate is suspended and separated as shown in example 1, using at the same time, for extraction buffer 0.05M Tris-HCl (pH 7.35), activating the prothrombin complex as follows: to five volumes of thrombin solution are added to one volume of the obtained homogenate.
Хроматографію матеріалу проводять як у прикладі 1.Chromatography of the material is carried out as in example 1.
Якість виділеного тромбіну подібна до такої у прикладі 1.The quality of the isolated thrombin is similar to that in example 1.
Приклад 3. 100мг концентрату фактора ЇХ суспендують як показано в прикладі 1. Подібним способомExample 3. 100 mg of factor IX concentrate is suspended as shown in example 1. In a similar way
Р активують протромбіновий комплекс, а під час хроматографії на аффінному сорбенті використовують розчин, який одержано за елюції 0,04М трис-НСЇІ (рН 7,3), що містить 0,45М Масі. Швидкість елюції розчину становитьP activates the prothrombin complex, and during chromatography on an affinity sorbent, a solution obtained by elution with 0.04M tris-HCII (pH 7.3) containing 0.45M Mass is used. The elution rate of the solution is
ЗБмл/год. во Якість виділеного тромбіну є такою як і за аналізу в прикладі 1.ZBml/hour The quality of the isolated thrombin is the same as in the analysis in example 1.
Таким чином, перевагами запропонованого способу є спрощення, доступність виділення високоочищеного тромбіну із плазми крові людини. Запропоновано одноетапне хроматографічне очищення тромбіну. Повний цикл регенерації сорбенту і зрівноважування колонки відбувається впродовж 2,5 - Згод порівняно з 8 - 10год, необхідними для хроматографии тромбіну на амберліті СО-50. Ступінь очищення одержаних препаратів і їхня 65 якість значно вищі, що доведено електрофорезом в ПААГ, титруванням активного центру ферменту, його стабільністю під час зберігання.Thus, the advantages of the proposed method are simplification, availability of highly purified thrombin from human blood plasma. One-step chromatographic purification of thrombin is proposed. The complete cycle of regeneration of the sorbent and equilibration of the column takes place within 2.5 - 10 hours compared to 8 - 10 hours required for chromatography of thrombin on CO-50 amberlite. The degree of purification of the obtained drugs and their quality is much higher, which is proven by electrophoresis in PAAG, titration of the active center of the enzyme, and its stability during storage.
Запропонований спосіб виділення тромбіну містить оптимальні умови для стабілізації. Препарат зберігається у водно-сольовому розчині (-207"С) більше року без використання будь-яких домішок. Титр активного центру тромбіна становить 97905.The proposed method of thrombin release contains optimal conditions for stabilization. The drug is stored in a water-salt solution (-207"С) for more than a year without the use of any impurities. The titer of the active center of thrombin is 97905.
Висока функціональна гомогенність виділеного тромбіну, його стабільність дозволяють запропонувати цей засіб як робочий стандарт, що необхідно для експериментальних досліджень, клінічної практики. А також: по-перше, для систематизованої характеристики цього ферменту, виділеного вченими багатьох груп , різноманітними методами; по-друге, для ретельної перевірки терапевтичних препаратів, що містять протромбін, активність яких завжди виражають в одиницях тромбіну; по-третє, для виміру одиниць активності ряду 7/0 природних інгібіторів ферменту, таких як антитромбін ІІІ ії його кофактор гепарин.The high functional homogeneity of the isolated thrombin and its stability make it possible to offer this tool as a working standard, which is necessary for experimental research and clinical practice. And also: firstly, for the systematic characterization of this enzyme, isolated by scientists of many groups, using various methods; secondly, to carefully check therapeutic drugs containing prothrombin, the activity of which is always expressed in units of thrombin; thirdly, to measure units of activity of a series of 7/0 natural enzyme inhibitors, such as antithrombin III and its cofactor heparin.
Список посилань 1. БРепіоп у). МУ., Оюзи Р. А., Мооп 0. 0., Магадапоге .). М. // Віоса Соадшіаї. Рібгіпої. 1991.2. Р. 69 - 75. 2. БЕепіоп У. МУ. // п Зегіпе Ргоїеазез апа (Пеїг Зегріпе Іппірйоге іп Мегмоиз Бувієет (Ревіой, В. МУ. ед.) Ріепит Ргезв, Мем/-ХогКк. 1990. Р. З - 7.List of references 1. Brepiop y). MU., Oyuzy R. A., Moop 0. 0., Magadapoge .). M. // Viosa Soadshiai. Ribhypoi 1991.2. R. 69 - 75. 2. BEepiop U. MU. // p Zegipe Rgoieazez apa (Peig Zegripe Ippirioge ip Megmoiz Buvieet (Revioi, V. MU. ed.) Riepyt Rgezv, Mem/-HogKk. 1990. R. Z - 7.
З. Репіоп 9. МУ. Тиготбіп Зресіїйіснцу // Апп. М.-У. Асад. сі. 1981. 370. Р. 468 - 495. 4. Кудряшов Б. А., Струкова С. М. Значение молекулярньїх особенностей тромбина во взаймодействий с рецепторньїми структурами в организме // Усп. совр. биол. 1984. 97, вьпп. 2. С. 193 - 207. 5. Серейская А. А., Струкова С. М. // ДАН СССР. 1985. 282, Мо2. С. 481 - 484. 6. Кудряшов Б. А. Проблема возбуждения противосвертьвающей системь! в организме // Усп. совр. биол. 1989, вьп. 1. С. 55 - 68. 7. Струкова С. М,, Серейская А. А., Осадчук Т. В. // Успехи соврем, биол. 1989. 107, вьіп. 1. С. 41 - 54. 8. Максименко А. В. Тромбин: Соотношение структура-функция в биохимических взаймодействиях//Биохимия. 1993. 58, вьіп. 9. С. 1373 - 1384. 9. Гершкович А. А. Индуцирование лигандами конформационньхх изменений в тромбине как способ гь регуляции его активности // Биохимия. 1996. 61, вьп. 7. С. 1139 - 1151. 10. Кибирев В. К, Гершкович А. А. Природнье и синтетические ингибиторь! тромбина // Укр. биохим. журн. « 1999. 71, Мо1. С. З - 26. 11. Репюоп .). МУ., Віпод 0. М. // Бетіп. Тиготь. Нетозві 1986. 5. Р. З - 27. 12. Гершкович А. А., Кибирев В. К. Хромогеннье и флуорогеннье пептиднье субстрать! протеолитических ю зо ферментов // Бисоорг. химия. 1988. 14, Мо11. С. 1461 - 1487. 13. Бепіоп У. МУ. Базсо М. ., 5іасКкгом/ А. В. еї аі. Нитап (ПготбБіпе: Ргодисіп, емаїчайоп апа о ргорегіїез ої А-«пготрбіп // 9. Віої. Спет. 1977. 252, Мо11. Р. 3587 - 3598. о 14. МіПег-Апдегзоп М., Сапйпеу Р. у., бЗедпаїснпіап М. 9. Ргерагайоп апа віарійу ої а Ппідпіу ригійвеа питап (Пготрбіп віапаага // Тиготь. Кез. 1981. 20, Мо1. Р. 109 - 122. що)Z. Repiop 9. MU. Tygotbip Zresiiiisntsu // App. M.-U. Asad si. 1981. 370. R. 468 - 495. 4. Kudryashov B. A., Strukova S. M. Importance of molecular features of thrombin in interaction with receptor structures in the body // Usp. modern biol. 1984. 97, vpp. 2. P. 193 - 207. 5. Sereyskaya A. A., Strukova S. M. // DAN USSR. 1985. 282, Mo2. P. 481 - 484. 6. Kudryashov B. A. The problem of excitation of anticoagulation systems! in the body // Usp. modern biol. 1989, vp. 1. P. 55 - 68. 7. Strukova S. M,, Sereyskaya A. A., Osadchuk T. V. // Modern successes, biol. 1989. 107, vyp. 1. P. 41 - 54. 8. Maksimenko A.V. Trombin: Structure-function relationship in biochemical interactions//Biochemistry. 1993. 58, issue 9. P. 1373 - 1384. 9. Hershkovich AA Induction of conformational changes in thrombin by ligands as a way of regulating its activity // Biochemistry. 1996. 61, vp. 7. P. 1139 - 1151. 10. Kybirev V. K., Hershkovich A. A. Natural and synthetic inhibitors! thrombin // Ukr. biochem. journal " 1999. 71, Mo1. S. Z - 26. 11. Repyuop.). MU., Vipod 0. M. // Betip. Tigot Netozvi 1986. 5. R. Z - 27. 12. Gershkovich A. A., Kybirev V. K. Chromogenic and fluorogenic peptide substrate! of proteolytic enzymes // Bysoorg. chemistry 1988. 14, Mo11. P. 1461 - 1487. 13. Bepiop U. MU. Bazso M. ., 5iasKkgom/ A. V. ei ai. Nytap (PgotbBipe: Rgodisip, emaichayop apa o rgoregiiez oi A-«pgotrbip // 9. Vioi. Spet. 1977. 252, Mo11. R. 3587 - 3598. o 14. MiPeg-Apdegzop M., Sapypeu R. u., bZedpaisnpiap M. 9. Rgeragayop apa viariyu oi a Ppidpiu rigiivea pitap (Pgotrbip viapaaga // Tygot. Kez. 1981. 20, Mo1. R. 109 - 122. that)
ІС в)IC c)
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UA2002064794A UA55005C2 (en) | 2002-06-11 | 2002-06-11 | Method for separation of high-purity standard of human thrombin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UA2002064794A UA55005C2 (en) | 2002-06-11 | 2002-06-11 | Method for separation of high-purity standard of human thrombin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA55005A true UA55005A (en) | 2003-03-17 |
| UA55005C2 UA55005C2 (en) | 2005-06-15 |
Family
ID=34884567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2002064794A UA55005C2 (en) | 2002-06-11 | 2002-06-11 | Method for separation of high-purity standard of human thrombin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA55005C2 (en) |
-
2002
- 2002-06-11 UA UA2002064794A patent/UA55005C2/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| UA55005C2 (en) | 2005-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Walker | Protein S and the regulation of activated protein C | |
| US6005082A (en) | Process for purification of factor VIII | |
| US5112949A (en) | Method of and apparatus for separating proteins | |
| AU2011247567B2 (en) | Purification method for divalent cation binding proteins on anion exchange resin | |
| BRPI0707268A2 (en) | Purification and use of a factor to help wound healing | |
| DePoli et al. | Thrombospondin interaction with plasminogen. Evidence for binding to a specific region of the kringle structure of plasminogen | |
| CN103328000A (en) | A process for reduction and/or removal of FXI and FXIa from solutions containing said coagulation factors | |
| AU2012252313B2 (en) | Methods to reduce adverse events caused by pharmaceutical preparations comprising plasma derived proteins | |
| MXPA06014318A (en) | Process for protein isolation. | |
| McCoy et al. | Preparation of bovine prothrombin complex and purified prothrombin | |
| UA55005A (en) | Method for separation of high-purity standard of human thrombin | |
| Walker et al. | The molecular mechanisms of heparin action: III. The anticoagulant properties of polyanetholesulfonate | |
| US5047506A (en) | Method for the purification of factor XIII by affinity chromatography | |
| CN108699133B (en) | Method for separating factor VIII from blood products | |
| JPH07508009A (en) | Purification of kringle-containing proteins and especially t-PA | |
| AU2021314917B2 (en) | A process for the purification of Prothrombin Complex Concentrate (PCC) and fix from complete plasma or cryo-poor plasma | |
| Özge-Anwar et al. | The Human Plasma Kinin System II. Contact Activation of Plasma Prekallikrein and Factor XI in Factor XII-Deficient Plasma | |
| Maimon et al. | Erythrocyte troponin inhibitor‐like protein: Isolation and characterization | |
| Ganrot et al. | Prothrombin derivatives in human serum. Isolation and some properties of the non-thrombin fragments | |
| Triantaphyllopoulos et al. | Increased prothrombin conversion: A new activity of lysed fibrinogen | |
| Ruttyn et al. | Chromatography of human plasma on aminohexyl sepharose: Separation of factor VIII/vWf and behaviour of factors II, VII, IX and X and antithrombin III | |
| US20110230645A1 (en) | Purification of factor v | |
| Honorato et al. | Importance of anticoagulant concentration for the activation of some human blood clotting factors | |
| McCaman et al. | Affinity binding of a vampire bat plasminogen activator to SEC resins | |
| Clement | Purification and Characterization of Guinea PIG Anti Thrombin III |