UA154926U - Спосіб визначення оптимальних режимів кріоконсервування клітинних сфероїдів - Google Patents

Abstract

Спосіб визначення оптимальних режимів кріоконсервування клітинних сфероїдів включає створення багатоклітинного об'єкта методом культивування, визначення часу експозиції і коефіцієнтів проникності для молекул води і проникаючого кріопротектора - диметилсульфоксиду на різних термінах культивування за різних температур кріорозчину. Багатоклітинний об'єкт складається від 80 до 150 клітин, а коефіцієнти проникності для води і кріопротектора in toto визначають на 7, 14 і 21 добу культивування та за температур кріорозчину 10, 15, 25 °C за допомогою фізико-математичного моделювання. Додатково визначають тривалість процедури їх експозиції в одномолярному диметилсульфоксиді за тих же умов, осмотично-неактивний об'єм, значення енергії активації проникання молекул води і кріопротектора у тривимірному сфероїді за інтервалів температур кріорозчину 10-15 °C, 15-25 °C на 7, 14 і 21 добу культивування, оптимальну швидкість кріоконсервування і температуру охолодження для тривимірного сфероїду протягом охолодження.

Description

Корисна модель належить до галузі тканинної інженерії і може бути використана в фармакології, регенеративній і замісній клітинній терапії.

Важливим питанням є пошук методів кріоконсервування та довготривалого зберігання багатоклітинних тривимірних об'єктів. Існуючі на цей час протоколи кріоконсервування ізольованих клітин не є коректними для використання за умов кріоконсервування тривимірних сфероїдів (ТС), які мають тривимірну структурну організацію і складні міжклітинні взаємодії, характерні для тканин цілісного організму (1,2). ТС є потужним інструментом сучасних біомедичних досліджень, які спрямовані на пошук ефективних підходів для лікування тяжких захворювань, розробку нових біологічних тест-систем, отримання інноваційних біопрепаратів, клітинних трансплантатів та біоїнженерних конструкцій. Тому удосконалення протоколів кріоконсервування клітинних тривимірних сфероїдів є актуальним питанням сучасної кріобіології, вирішення якого у перспективі дозволить створення кріобанків для зберігання ТС і розширення спектра їх використання у різних галузях медицини, фармації, біології тощо.

На разі, основними підходами для кріоконсервування ТС є використання проникаючого кріопротектора диметилсульфоксиду (ДМСО) в концентрації від 5-155905 та повільних швидкостей охолодження |З,41.

Коефіцієнти проникності плазматичної мембрани для води та кріопротектора визначають часові характеристики проникнення сполук крізь клітинні мембрани, а отже, і ймовірність внутрішньоклітинної кристалізації, яка є вирішальною умовою виживання/загибелі клітини І5,6)|.

Оскільки структурна організація ТС є складнішою порівняно з ізольованою клітиною, параметри дифузії сполук, зокрема кріопротекторів і молекул води, у ТС будуть відрізнятися від таких для клітинної суспензії.

Розуміння осмотичної поведінки клітин і транспортних властивостей мембрани (коефіцієнта проникності для молекул води і кріопротектора), а також значень енергії активації є обов'язковим процесом на етапі кріоконсервування біологічних об'єктів для запобігання втрат функціональних властивостей після процесу кріоконсервування-відтаювання |5, 61.

Відомий спосіб визначення оптимальних режимів кріоконсервування ТС, який включає час експозиції ТС 10 хвилин у присутності 10 95 ДМСО, охолодження зі швидкістю 1 "С/хв до -80 "С і занурення в рідкий азот (ЗІ.

Зо Недоліком зазначеного способу є те, що час експозиції, швидкість і температура охолодження в роботі були емпіричними без застосування грунтовного підходу, заснованого на розумінні ролі проникності молекул води і кріопротектора крізь мембрани клітин у складі тривимірних сфероїдів, процесів протікання процесів масообміну між клітинами і середовищем на всіх етапах кріоконсервування.

Відомий спосіб визначення оптимальних параметрів кріоконсевування ембріонів миші (7, який включає створення багатоклітинного об'єкта методом культивування, визначення часу експозицію у гліцерин-сахарозному середовищі за зміною об'єму окремих клітин ембріона, визначення коефіцієнтів проникності для молекул води і кріопротектора.

Недоліком зазначеного способу є те, що 8 клітинний агрегат не має тривимірну структуру.

До того ж не визначені значення енергії активації, за якими визначають оптимальну швидкість охолодження і температуру.

Як близький аналог за більшою кількістю ознак вибрано останній аналог.

В основу корисної моделі поставлено задачу створити спосіб визначення оптимальних режимів кріоконсервування тривимірних клітинних сфероїдів (ТС), до складу якого входить від 80 клітин і більше, що дозволить визначати оптимальні режими кріоконсервування для багатоклітинних об'єктів на різних термінах культивування і за різних температур кріорозчину.

Поставлена задача вирішується тим, що у способі визначення оптимальних режимів кріоконсервування клітинних сфероїдів, який включає створення багатоклітинного об'єкта методом культивування, визначення часу експозиції і коефіцієнтів проникності для молекул води і проникаючого кріопротектора - диметилсульфоксиду на різних термінах культивування за різних температур кріорозчину, згідно з корисною моделлю, багатоклітинний об'єкт складається від 80 до 150 клітин, а коефіцієнти проникності для води і кріопротектора іп 0 визначають на 7, 14 їі 21 добу культивування та за температур кріорозчину 10, 15, 25 "С за допомогою фізико- математичного моделювання, також додатково визначають тривалість процедури їх експозиції в одномолярному диметилсульфоксиді за тих же умов, осмотично-неактивний об'єм, значення енергії активації проникання молекул води і кріопротектора у тривимірному сфероїді за інтервалів температур кріорозчину 10-15, 15-25 "С на 7, 14 і 21 добу культивування, оптимальну швидкість кріоконсервування і температуру охолодження для тривимірного сфероїду протягом охолодження.

Новим є те, що запропоновано алгоритм розрахунків, який буде застосовуватись для багатоклітинних об'єктів, що мають тривимірну структуру. Отримані результати можуть бути використані для визначення оптимальних режимів кріоконсервування ТС будь-якого діаметра, кількості і типів клітин, терміну культивування, температури кріорозчину і концентрації будь- якого проникаючого кріопротектора.

Використання методу чисельного моделювання процесів та явищ, що відбуваються при охолодженні та подальшому відтаюванні, дозволяє підвищити ефективність наукових досліджень на етапі розробки оптимальних способів кріоконсервування багатоклітинних біооб'єктів, результатом якої є скорочення витрат реактивів та часу.

Фізико-математична модель дозволяє проаналізувати осмотичну поведінку ТС на етапі охолодження за різних інтервалах температур 10-15, 15-25 70 і термінах культивування 7, 14 і 21-а доба. Температури 10, 15 і 25 "С вибрані експериментально.

Терміни культивування (7, 14 і 21-а доба) були вибрані експериментально і є оптимальними для дослідження параметрів проникності. Такі терміни були вибрані, базуючись на тому, що структура ТС протягом культивування змінюється.

На фіг. 1. наведено вплив оберненого осмотичного тиску фізіологічного розчину на відносний об'єм ТС іп'юїо на 7, 14 і 21-у добу культивування. Знаком """ позначено відмінності (р«е0,05, де р - рівень значущості, за яким вірогідність неправильності результатів менше 0,05) осмотично-неактивного об'єму порівняно з 7-ю добою культивування.

На фіг. 2 наведена залежність зміни відносного об'єму ТС у часі під час експозиції в 1М розчині ДМСО за різних температур (10, 15 та 25 "С) на різних термінах культивування: а - 7 діб; 6-14 діб; в - 21 доба.

На фіг. З наведена залежність зміни об'єму ТС за швидкостей охолодження 0,5, 1, 2, 5 "С/хв; за різних термінів культивування а - для ТС 7 діб; б - для ТС 14 діб; в - для ТС 21-а доба (при цьому стрілкою показана оптимальна швидкість охолодження).

На фіг. 4 наведена зміна об'єму ТС у часі за умов експозиції у кріозахисному середовищі з 1М ДМСО, деа -для 0 с; 6 - 300 с; в - 440 с.

У таблиці 1 наведені коефіцієнти проникності для води (Ір х 1077, м3/Н-с) та ДМСО (Кр х 107, м/с) у ТС іп юїйо різних термінів культивування за умов інкубації у кріозахисному середовищі за

Зо різних температур 10, 15 та 25 76.

У таблиці 2 наведено час, необхідний для досягнення рівноваги у системі ТС/кріозахисний розчин (1М ДМСО) залежно від термінів культивування ТС і температури інкубації.

У таблиці З наведена енергія активації проникання молекул води (Ір) у ТС на різних термінах культивування.

У таблиці 4 наведена енергія активації проникання молекул ДМСО (Кр) у ТС на різних термінах культивування.

Таблиця 1

Коефіцієнти

Доба проникності, культивування (Грх10'"м З/Н.с) 10 15 25

Кох107,м/с

Примітка: 1 - коефіцієнт проникності для води (Ір) для молекул води; статистично значуще відрізняється від показника для ТС на 7-му добу культивування (р « 0,05); 2 - коефіцієнт проникності для ДМСО (Кр) статистично значуще відрізняється від показника для ТС на 7-му добу культивування (р « 0,05).

Таблиця 2

ТС, доба ' 11251115 11111лос1

Примітка. (1) - показники значуще відрізняються порівняно з 7-ю добою культивування

СФ (р « 0,05).

Таблиця З

Примітка: 1 - показник значуще відрізняється порівняно з показником 14-ї доби (Р « 0,05); 2 - показник значуще відрізняється порівняно з показником 21-ї доби (р « 0,05).

Таблиця 4

Примітка: 1 - показник значуще відрізняється порівняно з показником 14-ї доби; (р « 0,05); 2 - показник значуще відрізняється порівняно з показником 21-ї доби; (р « 0,05).

Спосіб визначення оптимальних режимів кріоконсервування клітинних сфероїдів, що заявляється, ілюструється наступним прикладом.

Приклад. Спосіб визначення оптимальних режимів кріоконсервування клітинних сфероїдів

І 929.

ТС отримують з клітин лінії І 929 методом культивування на низькоадгезивній поверхні. Для цього чашки Петрі з площею поверхні 22,1 см? обробляють 295 розчином агару. Вихідну суспензію клітин у концентрації 2х107 клітин/мл переносять в підготовлені чашки Петрі та культивують у живильному середовищі ОМЕМ/Е12 з додаванням антибіотиків та 1095 фетальної телячої сироватки при 37 "С в атмосфері з 5 95 СО». Культивують ТС протягом 21-ї доби, кожну 3-ю добу здійснюють заміну живильного середовища.

На першому етапі для визначення коефіцієнтів проникності для молекул води і ДМСО у ТС визначають осмотично-неактивний об'єм (фіг. 1). Встановлено, що при збільшенні строків культивування осмотично неактивний об'єм (а) збільшується: для ТС на 7-у добу він становить а-0,41, на 14 добу культивування збільшується до значень а-0,47 і на 21-у добу культивування досягає значення а-0,54 (фіг. 1).

Для визначення об'ємних змін ТС у кріозахисному середовищі ТС із діаметром (80-100) мкм переносять у чашки Петрі з адгезивною поверхнею та культивують у вищевказаних умовах протягом 24 годин. Чашки Петрі переміщують до термостатованої камери, встановленої на предметному столику конфокального мікроскопа "Ахіо Орвегуег 21". Температуру у камері підтримують за допомогою водяної бані та реєструють за допомогою термопари. До ТС після видалення живильного середовища одразу додають кріозахисне середовище з 1М ДМСО, приготовлене на фізіологічному розчині, при температурах 10, 15 та 25 "С. Досліджують зміни об'єму ТС іп ою у часі, фіксують за допомогою фотозйомки з інтервалом 5 с (фіг 4).

За допомогою комп'ютерної програми "Ахіомізіоп Неї. 4.8" вимірюють діаметр (4). осмотично неактивний об'єм клітин лінії І 929 та ТС визначають за методом, описаним у роботі (8).

На основі зміни об'єму ТС (фіг. 2) визначають тривалість процедури їх експозиції у 1М

ДМСО ії коефіцієнти проникності для води та ДМСО у ТС іп ою різних діб культивування на різних строках культивування за температур (табл. 1 2).

Наведені в таблиці 2 дані свідчать про те, що температура кріозахисного середовища і строки культивування суттєво впливають на час експозиції ТС в кріопротекторному розчині. Так, час експозиції за температури 10 "С при збільшення терміну культивування ТС до 14 і 21 доби збільшувався у 3,3 і 6,8 разів відповідно. Аналогічна залежність зміни часу експозиції у кріозахисному середовищі для ТС на 14 і 21 добу культивування відбувалась і при температурах 15 і 25 С. Необхідно визначити той факт, що при збільшенні температури кріозахисного середовища до 25 "С час експозиції для ТС значуще (р « 0,05) зменшувався порівняно з температурами 15 і 10 "С незалежно від строку їхнього культивування.

На наступному етапі дослідження розраховують значення енергії активації проникання молекул води і ДМСО у ТС за методом |9| а різних строках культивування і інтервалах температур (табл. 3, 4). Збільшення термінів культивування сфероїдів з 7-ї до 14 та 21-ї доби призводить до підвищення значення енергії активації для молекул води в інтервалі температур (10-15У"С у 3,4 (14 доба) та 3,5 (21 доба); в інтервалі температур (10-25397С - у 1,9 (14 доба) та 1,8 (21 доба) рази; в інтервалі температур (15-2537С - у 1,4 (14 доба) та 1,5 (21 доба) рази відповідно. Значуще збільшення значення енергії активації для молекул ДМСО у 1,9 та 1,8 рази становить для сфероїдів 14 та 21-ї доби відповідно в інтервалі температур (10-25)"С, у 6,8 та 7,6 рази - в інтервалі температур (15-25376.

На основі розрахованих значень енергії активації і коефіцієнтів проникності молекул води і

ДМСО у ТС роблять прогнозування процесів зневоднення ТС протягом охолодження з різними швидкостями охолодження (|101. Згідно з результатами, представленими на фіг. 3, зневоднення

ТС суттєво відрізняється залежно від строків культивування. Мінімальне значення відносного об'єму при швидкості охолодження 1,3 град/хв. для ТС 7 діб культивування (фіг. За) досягає величин 0,48. За менших швидкостей охолодження об'єм ТС 7 діб культивування наближається до осмотично неактивного об'єму (а7-0,41). Таке зневоднення є критичним і може викликати

Зо суттєві пошкодження структури ТС. Для ТС 14 діб культивування (фіг. 36) та ТС 21 доби культивування (фіг. 3, Зв) відносний об'єм за цієї швидкості охолодження досягає величини 0,73 та 0,78 відповідно, що суттєво більше осмотично-неактивного об'єму для таких строків культивування (с:14-0,485, а21-0,54). Виходячи з кривих зневоднення ТС за різних швидкостей охолодження, можна зробити висновок, що для ТС 7 діб культивування оптимальні швидкості охолодження будуть знаходитись в інтервалі (1,5-2)"С/хв. Відносний об'єм ТС при цьому досягає значень 0,6-0,7 до температури від -60 до -80 "С. Такий рівень зневоднення суттєво знижує ймовірність внутрішньоклітинної кристалізації та не призводить до пошкоджень клітинних структур ефектами розчину. Для ТС 14 та 21 доби культивування відповідний рівень зневоднення (відносний об'єм 0,75) досягається за швидкості охолодження 0,5 "С/хв до температурного інтервалу від -40 до -50 "С. Більш високі швидкості охолодження не можуть забезпечити потрібне зневоднення ТС та низьку ймовірність внутрішньоклітинної кристалізації.

Таким чином, на основі аналізу осмотичної поведінки багатоклітинного ТС у кріопротекторному розчині за допомогою фізико-математичного моделювання осмотичної поведінки ТС були визначені і проаналізовані параметри проникності для молекул води і кріопротектора у ТС залежно від строків культивування і температури кріозахисного розчину.

Отримані результати свідчать про те, що процеси проникності для молекул води і ДМСО у ТС зі збільшенням строків культивування уповільнюються. Показано, що найбільш вагомі зміни наведених у роботі показників проникності відбуваються після 7 діб культивування ТС.

Найбільші відмінності часу експозиції ТС у кріопротекторному розчині, необхідного для досягнення рівноваги, при зміні температури спостерігався саме для ТС на 14 і 21 добу культивування, що пов'язано зі значним зменшенням коефіцієнтів проникності ТС для молекул води і кріопротектора. Такий суттєвий вплив часу культивування на приведені у роботі показники, очевидно, пов'язаний з особливостями формування сфероїдів, а саме з експресією міжклітинного матриксу, до складу якого входять речовини, що впливають на його гідрофільні характеристики. Збільшення кількості клітин у складі сфероїдів і як наслідок міжклітинного матриксу в часі можуть впливати на проникність ТС для проникаючих речовин.

На підставі теоретичних розрахунків було визначено оптимальні режими кріоконсервування у кріозахисному середовищі з ТМ ДМСО для ТС, отриманих з клітин лінії 1929 на різних термінах культивування (таблиця 5).

Підсумовуючи все вищесказане, можна зробити висновок про те, що використана фізико- математична модель дозволяє проаналізувати осмотичну поведінку ТС на етапі охолодження.

Запропоновано алгоритм розрахунку коефіцієнтів проникності та зміни об'єму ТС під час охолодження з різними швидкостями у кріозахисному середовищі. Отримані результати можуть бути використані для визначення оптимальних режимів кріоконсервування клітинних ТС різних за клітинним складом, розміром, терміном культивування у кріозахисних розчинах до складу яких входить проникаючий кріопротектор.

Джерела інформації: 1. Аспійї Т.М., Меуеєг 9., Могдап 9.8... Адмапсев5 іп Те Топтаїйоп, изе апа ипаегеїапаїнпу ої тийі-сеїїшіаг 5рпегоіїд5. Ехреп Оріпіоп оп Віоіодіса! Тнегару. - 2012. - 12(10). -1347-60. БОЇ: 10.1517/14712598.2012.707181 2. Кіт Т.У., Коїтоп С.М., Кіпуд М.Е., МаїКез А.В., ОКипааує А.О., Ои 2, еї аї. Оігесівйд Тивіоп ої сагаіас 5рпегоїде іпіо Іагдег НеїегосеїІшШаг тістоїїввице5 епарієб5 іпмевіїдайоп ої сагайас асіп роїепіїаї ргорадайоп міа сагаїас Тібгобіазіє. Ріо5 Опе. - 2018. - 13(5). - е0196714. ОЇ: 10.1371Лоштаї. ропе.01967141.

З. Ептан Р., 5спціг 9.С., Каївзеп-Сіоба А., Зпіпеу 5.2, Вешіег 0., Васі Е., ві аІ. А сотрагаїїме вішау ої Пеегіпу зіпдіє сеї5 апа 5рпегоїдв: Тожагі5 а пем/ тоде! зубієт ог оріїтігіпд пеегіпд ргоїосоїє Тог сгуобапКіпд ої питап їштоицг5. Стуобіоїоду. - 2009. - 58(2). - 1 19-27. БОЇ: 10.1016/.стуобіоі.2008.11.005 4. АІтаміві К.Р., Мапа Г.., Вгодавє!е2 С. еї а. Віоіодіса! їтеєгіпд ої питап айісшаг спопагосуїев5 // Овівосапнійй» Сапііаде. - 2001. - Мої. 9, Мо 4. - Р. 341-350 5. Согаізуепко О.І., КомаіїепКо 5.Уе., Комаїепко І.Р., Одийвома М.М., Тодіїп А.Р. Тнеогеїсаї езійтайоп ої Те оріїтит сооїїпа гаїєе ої а сеїЇ зизрепвіоп аї Іпеаг їтеегіпд тоде5 Бразей оп а їмо

Яїасіог Шеогу ої стуодатаде. Стус! ейег5. - 2018. - 39 (6). - 380-385. перз//рибтеа. пебі.піт.пій.дом/30963155/ б. Согаїєпко ОЇ, КомаїепкКо ІЕ, КомаіепкКо 5Ує, Киїезнома І С, Тодііп ОР. Тнеогеїїса! Евійтайоп ої Оріїта! Ііпеаг Сооїїпуд Ваїє її РК-15 СеїЇ БЗиврепвзіоп. Ргорієт5 ої Стуобіоісду апа

Стуотеадісіпе. - 2021. - 31(3). - 214-222. БОЇ: пирз //доїі.ога/10.15407/сгуо31.03.214 7. Смольянинова Е.Й., Хроменкова О.Б., Жерноклев Г.В., Пишко О.В. Влияние зквилибрации в среде замораживания на осмотическую устойчивость и жизнеспособность 8- клеточньїх змбрионов мьіши. Проблемьі криобиологии. - 2004. - 1. - 3-11, 8. Одипзома МУ.М., КомаіепКо 5.Уе., Комаїепко І.Р., СсогаіуепнКо О.І. Оєсіегтіпайоп ої озтоїїсанПу іпасіїме моїште ої тигіпе епієгосуїез. Ргобієтв ої Стуобіооду апа Стуотедісіпе. - 2016. - 261). - 93-7. БОЇ: 10.15407/сгуо26.01.093 9. Гордієнко Є.О., Гордієнко О.І., Марущенко В.В., Сакун О.В. Удосконалена модель пассивного массопереносу крізь плазматичну мембрану клітини. Біофізичний вісник. - 2008. - 21(2). - 75-80. 10. Тодііп А.Р., РорімпепКо І..І., КомаіепКо 5.Ме. Тпепторпузіса! ргорепієз ої стуоргоїесіапів. І.

Тетрегайцге апа Неаї ої тейіпд. Ргобієтв ої Стуобіоїоду апа Стуотедісіпе. 2009; 19(2): 163-76.

Амаїйаріє пот: пир//прим.дом.са/00ТІМ/КтіоВіо! 2009 19 2 7

Claims (1)

1. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ

   Спосіб визначення оптимальних режимів кріоконсервування клітинних сфероїдів, що включає 45 створення багатоклітинного об'єкта методом культивування, визначення часу експозиції і коефіцієнтів проникності для молекул води і проникаючого кріопротектора "«є4-

   диметилсульфоксиду на різних термінах культивування за різних температур кріорозчину, який відрізняється тим, що багатоклітинний об'єкт складається з від 80 до 150 клітин, а коефіцієнти проникності для води і кріопротектора іп ї0ю визначають на 7, 14 і 21 добу культивування та за 50 температур кріорозчину 10, 15, 25 "С за допомогою фізико-математичного моделювання, також додатково визначають тривалість процедури їх експозиції в одномолярному диметилсульфоксиді за тих же умов, осмотично-неактивний об'єм, значення енергії активації проникання молекул води і кріопротектора у тривимірному сфероїді за інтервалів температур кріорозчину 10-15, 15-257С на 7, 14 і 21 добу культивування, оптимальну швидкість 55 кріоконсервування і температуру охолодження для тривимірного сфероїду протягом охолодження.

   КЕ Ж й ов -« і х ж коша ди

   Е. в: е ой І ей Шк - ни й Я ян дит шт 7 зт т пря вом п. тлі м Я дій З хіжоава шкоердів 01 ДІВ 0-1 доби в з п вл аа Сер Ний смс век

   Фіг. 1 Е 9 2 кох НВК, й певних те З. див ВВ з хо Во м Е В 7 т 8 і ри Ж а я МЕ ООН о ояене«Нко і 5 ак ОО няню Е ПОВ нед - ах пеня фросснттннтттнтреннт ПІІ У се Як ще За Кк чаке а хі ху В і в.8 ще т МОЖ рі я уоніани фо х ї; ше й я я г В: я у ень пдв о ур с х З я з іБав хе Є вх ТИ рення - щи рон - ос Я в ож о-ї шо 18 БО 0сяне ще Я 4 З дала уВАХАУАХАКАХХМАХАККЬЬК пд ферит дня ут й г о а о вщ В Х т их ніідісяттенсювих х у х ож й у т х В ж 8 Е Я я я ов - . ВХ ох си и я БІ ре що я с 7 як 1 яр х т З ах. Я ; ДАК ву ГО ЕОо-а ор НИ ОБО 0 лено Ко : Ко о сіла Вр в он М я риття тут й що ЯН ВМ ЩЕ ЯК Чжле гріг. 2 б